KR101590150B1 - 줄기세포 생착율 증강 약학 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

줄기세포 생착율 증강 약학 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 생착율 증강용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합하여 이식한 결과, 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 줄기세포 생착율 증강용 조성물 및 이의 제조 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 생착율 증강 약학 조성물 및 이의 제조 방법{Pharmaceutical composition for enhancing transplantation rate of stem cells and preparation method thereof}
본 발명은 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔, 상기 피브린 겔을 함유하는 스캐폴드, 이들의 제조 방법, 및 이들을 줄기세포 생착률 증강에 이용하는 용도에 관한 것이다.
일반적으로 화학이나 단백질 의약품의 역할은 발병의 결과인 증상을 완화시키는데 초점이 맞추어져 있으나 줄기세포를 중심으로 하는 세포치료제의 원리는 질환의 근본적인 원인을 치료하는데 있다. 줄기세포는 자기복제능력 (Self-renewal) 과 분화능력(Cell differentiation)의 두 가지 특징을 지니고 있으며 혈액, 신경, 지방, 골, 근육 세포 등 다양한 세포로 분화가 가능하여 다양한 임상실험을 통해 세포치료제로서의 가능성이 연구되어지고 있다. 대사성 질환, 퇴행성 질환 및 염증성 질환 손상된 조직의 복구 등 광범위한 분야들에 걸쳐 질병 치료 목적으로 이용될 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 특히 성체줄기세포(Adult stem cells)가 줄기세포 치료제의 개발 목적을 위해 활발하게 연구되어 지고 있다. 그러나 줄기세포의 생체투여 후의 세포 생착율은 10 % 미만인 것으로 보고되고 있으며 유효 용량의 줄기세포를 생체 내 적용하기 위해서는 다량의 세포를 반복투여 하여야 하는 단점이 있다. 그렇기 때문에 보조제를 사용하여 줄기세포 이식율을 증가시킬 수 있다면 생체 내로 투여할 줄기세포의 배양 시간 및 고가의 재료비를 절감할 수 있다.
현재까지는 줄기세포의 생착율 증가를 위해 상피세포 성장인자(epidermal growth factor), 섬유모세포 성장인자(fibroblast growth factor), 형질전환 성장인자(transforming growth factor), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor), 혈소판유래 성장인자(platelet derived growth factor), 신경세포 증식인자(nerve growth factor), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor), 간세포 증식인자(hepatocyte growth factor)와 같은 단백질 성장인자를 사용하여 세포수준의 생장을 촉진하는 연구가 이루어졌으나 이들은 단백질 성분이기 때문에 대량생산 및 품질관리에 고가의 비용이 소모되는 단점이 있다.
긴 펩타이드 서열로 이루어진 성장인자 대신 짧은 아미노산 서열로 구성된 기능성 펩타이드를 이용하여 줄기세포 생착율을 높이려는 연구도 진행되었다. 대표적으로 라미닌(Laminin), 피브로넥틴(Fibronectin)과 같은 세포외부매트릭스 단백질(Extracellular matrix proteins) 에서 세포 흡착 및 생장에 작용하는 서열의 펩타이드만 합성하여 줄기세포를 이식할 때 스캣폴드(scaffold)에 함께 섞어주어 생체 내 적용되고 있다. 또한 이러한 줄기세포 생착율을 높이기 위한 기능성 펩타이드들을 스캣폴드에 연결하여 이식 후 빠르게 방출되지 않고 지속적인 효과를 보이도록 고안한 줄기세포용 스캣폴드들도 제안되고 있으나 펩타이드가 연결된 스캣폴드의 합성 제조 및 품질 관리 또한 복잡한 공정을 거치고 합성 수율 및 비용을 고려하였을 때 경제성이 높은지 않는 등의 문제점들이 대두되고 있다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포의 생체투여 후, 세포 생착율이 낮으며 유효 용량의 줄기세포를 생체 내 적용하기 위해서는 다량의 세포를 반복투여 등의 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합하여 이식한 결과, 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 줄기세포 생착율 증강용 조성물 및 이의 제조 방법으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 생착율 증강용 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 줄기세포의 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐을 함유하는 피브린 젤 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) 서열번호 1 또는 서열번호 2 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드를 트롬빈과 혼합하는 단계; 및
ⅱ) 단계 ｉ)의 혼합물을 피브리노겐과 혼합하여 피브린 수호젤을 형성하는 단계를 포함하는 피브린 겔 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐을 함유하는 피브린 젤 조성물을 포함하는 스캐폴드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 카이머릭 펩타이드, 피브린 겔 조성물, 또는 스캐폴드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 생착율 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 카이머릭 펩타이드, 피브린 겔 조성물, 또는 스캐폴드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이식용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생착율 증강 방법을 제공한다.
본 발명은 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 생착율 증강용 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합하여 이식한 결과, 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔, 상기 피브린 겔을 함유하는 스캐폴드, 이들의 제조 방법 및 이들을 줄기세포 생착율 증강에 이용하는 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 나타낸 모식도이다.
도 2 및 도 3은 인간 지방유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤의 세포 생장 촉진 효과를 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤의 세포 생장 촉진 효과를 나타낸 도이다.
도 6 및 도 7은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤의 세포 생장 촉진 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드의 비율이 세포 생장에 미치는 영향을 나타내는 도이다.
도 9는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드의 비율이 세포 생장에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 인간 골수유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드의 비율이 세포 생장에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 11은 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드의 비율이 세포 생장에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 줄기세포의 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤에 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드 제조를 하기 위하여 하기 [표 1]에 기재되어 있는 서열번호 1 및 서열번호 2를 이용하여 제조하였다(표 1 참조).
또한, P 물질(Substance P)과 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물 제조를 하기 위하여, 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 오스테오폰틴(Osteipontin) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드와 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 줄기 세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드, 피브린 젤에 부착능을 가진 펩타이드 및 본 발명의 카이머릭 펩타이드 이외에 알려진 줄기세포 생착율 증가 펩타이드를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 하기 [표 2]에 기재된 서열번호를 이용하여 제조하였다(표 2).
또한, 피브로넥틴(Fibronectin), 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 3)와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 4)와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, P 물질을 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 5)와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 오스테오폰틴 유래 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 6)와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 세포부착분자(Cell adhesion moleculs) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 7)와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 8)와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, P 물질 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 9) 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1 인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, P 물질 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 9) 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 오스테오폰틴 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 10) 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 카이머릭 펩타이드(서열번호 10) 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하였다.
또한, P 물질(Substance P) 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤의 세포 생착율 촉진 효과를 확인하기 위하여, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 젤, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 젤, 피브로넥틴, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 3)를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤, 피브로넥틴, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 4)를 포함하는 피브린 젤, 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)을 포함하는 피브린 젤 및 서열번호 6을 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포와 피하로 주입하여 24 및 48 시간 동안 세포의 생착율을 평가한 결과, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 젤, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 젤, 세포부착분자(Cell adhesion molecules)유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 7)를 포함하는 젤, 아데노 부속 바이러스 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 8)을 포함하는 피브린 젤, 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)을 포함하는 피브린 젤 및 서열번호 6을 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포와 피하로 주입하여 24 및 48 시간 동안 세포의 생착율을 평가한 결과, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 젤, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 젤, 피브로넥틴, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 3)를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤, 피브로넥틴, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 4)를 포함하는 피브린 젤, 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)을 포함하는 피브린 젤 및 서열번호 6을 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포와 피하로 주입하여 24 및 48 시간 동안 세포의 생착율을 평가한 결과, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 젤, 세포부착분자(Cell adhesion molecules)유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 7)를 포함하는 젤, 아데노 부속 바이러스 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 8)을 포함하는 피브린 젤, 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)을 포함하는 피브린 젤 및 서열번호 6을 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수유래 클론 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하한 결과, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 젤, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 젤, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 3)를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤, 피브로넥틴, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 4)를 포함하는 피브린 젤, 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)을 포함하는 피브린 젤 및 서열번호 6을 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입한 결과, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 상기 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 젤, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 젤, 세포부착분자(Cell adhesion molecules)유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 7)를 포함하는 젤, 아데노 부속 바이러스 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드(서열번호 8)을 포함하는 피브린 젤, 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)을 포함하는 피브린 젤 및 서열번호 6을 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 피브린 젤, 서열번호 10으로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1인 피브린 젤 및 서열번호 10으로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 2로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 피브린 젤, 서열번호 10으로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1인 피브린 젤 및 서열번호 10으로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 9 참조).
또한, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 피브린 젤, 서열번호 9로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1 내지 1:1인 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입한 결과, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 피브린 젤로 처리한 세포의 생착율은 서열번호 9로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1 내지 1:1인 피브린 젤을 처리한 세포 생착율 보다 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 피브린 젤, 서열번호 9로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1 내지 1:1인 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 지방 유래 클론 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입한 결과, 서열번호 1로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1, 4:1 및 8:1인 피브린 젤로 처리한 세포의 생착율은 서열번호 9로 기재된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1 내지 1:1인 피브린 젤을 처리한 세포 생착율 보다 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 11 참조).
따라서, 본 발명의 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합하고 이식한 후, 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 줄기세포 생착율 증강용 조성물 및 이의 제조 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐을 함유하는 피브린 젤 조성물을 제공한다.
상기 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐은 2:1 내지 8:1의 몰 비율로 구성된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합한 뒤 이식하여 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
ｉ) 서열번호 1 또는 서열번호 2 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드를 트롬빈과 혼합하는 단계; 및
ⅱ) 단계 ｉ)의 혼합물을 피브리노겐과 혼합하여 피브린 수호젤을 형성하는 단계를 포함하는 피브린 겔 조성물의 제조 방법을 제공한다.
상기 카이머릭과 피브리노겐은 2:1 내지 8:1의 몰 비율로 혼합되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합한 뒤 이식하여 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔 조성물의 제조 방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐을 함유하는 피브린 젤 조성물을 포함하는 스캐폴드를 제공한다.
본 발명의 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합한 뒤 이식하여 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔 조성물을 유효성분으로 함유하는 스캐폴드로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 카이머릭 펩타이드, 피브린 겔 조성물, 또는 스캐폴드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 생착율 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 카이머릭 펩타이드, 피브린 겔 조성물, 또는 스캐폴드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이식용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 줄기세포는 골수 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합한 뒤 이식하여 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔 또는 상기 피브린 겔을 함유하는 스캐폴드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 생착율 증강 및 이식용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생착율 증강 방법을 제공한다.
상기 줄기세포는 골수 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드에 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 연결한 카이머릭 펩타이드를 합성하여 줄기세포와 피브린 젤을 혼합한 뒤 이식하여 피브린 젤에서 생체내 생리활성 펩타이드의 소실이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 줄기세포 생착률을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드, 상기 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 겔 또는 상기 피브린 겔을 함유하는 스캐폴드를 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 생착율 및 이식용 조성물을 줄기세포의 생착율 증강 방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤에 부착 능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드 제조
줄기세포의 생착율을 증가시키는 것으로 알려진 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤에 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 하기 [표 1]에 기재된 서열번호를 이용하여 제조하였다.
카이머릭 펩타이드의 서열
이름 아미노산 서열
서열번호1 NQEQVSPGGGGSRPKPQQFFGLM-NH2
서열번호2 NQEQVSPGGGSGRGDSVVYGLR
실시예 2. P 물질( Substance P)과 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카 이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물 제조
<2-1> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조를 하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 1에 기재되어 있는 서열번호 1의 펩타이드는 20 mg/ml의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 2:1이였다. 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
<2-2> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율을 4:1로 제조하였다. 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
<2-3> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에 기재된 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율을 8:1로 제조하였다. 상기 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 실시예 3> 오스테오폰틴 ( Osteipontin ) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머 릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물 제조
<3-1> 카이머릭 펩타이드와 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드와 피브리노겐의 몰비율이 2:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 1에 기재되어 있는 서열번호 2의 펩타이드는 10 mg/ml의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 2:1이였다. 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 1로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
<3-2> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4: 1 인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드와 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 4:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 상기 실시예 <3-1>에 기재된 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율을 4:1로 제조하였다. 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 2로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
<3-3> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8: 1 인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드와 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 8:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 상기 실시예 <3-1>에 기재된 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율을 8:1로 제조하였다. 상기 서열번호 2로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 2로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 1> 줄기 세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 , 피브린 젤에 부착능을 가진 펩타이드 및 카이머릭 펩타이드의 제조
줄기 세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드, 피브린 젤에 부착능을 가진 펩타이드 및 카이머릭 펩타이드를 제조하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, 줄기세포의 생착율을 증가시키는 것으로 알려진 생리활성 펩타이드, 피브린 젤에 부착능을 가진 펩타이드 및 상기 <실시예 1>이외에 알려진 줄기세포 생착율 증가 펩타이드를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 [표 2]에 기재된 서열번호를 이용하여 제조하였다.
이름 아미노산 서열
서열번호3 NQEQVSPGGGGSGRGDS
서열번호4 NQEQVSP
서열번호5 RPKPQQFFGLM-NH2
서열번호6 GRGDSVVYGLR
서열번호7 NQEQVSPGGGGSNLIKQDDGGSPIRHY
서열번호8 NQEQVSPGGGGSNLHSPPA
서열번호9 NQEQVSPGGGGSRPKPQQFFGLM-NH2
서열번호10 NQEQVSPGGGSGRGDSVVYGLR
< 비교예 2> 피브로넥틴 ( Fibronectin ), 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
피브로넥틴(Fibronectin), 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 3의 펩타이드는 10 mg/ml의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 3으로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 3으로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 8:1이였다. 상기 서열번호 3로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 3으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 3> 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 4의 펩타이드는 20 mg/ml의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 4로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 4로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 8:1이였다. 상기 서열번호 4로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 4로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 4> P 물질을 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
P 물질을 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, P 물질을 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 5의 펩타이드는 5 mM의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 5로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 5로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 8:1이였다. 상기 서열번호 5로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 5로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 5> 오스테오폰틴 유래 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
오스테오폰틴 유래 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 오스테오폰틴 유래 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 6의 펩타이드는 10 mg/ml의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 6으로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 6으로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 8:1이였다. 상기 서열번호 6으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 6으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 6> 세포부착분자( Cell adhesion moleculs ) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
세포부착분자(Cell adhesion moleculs) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 상기 <비교예 5>와 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 서열번호 7로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율을 8:1로 제조하였다. 상기 서열번호 7로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 7로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 7> 아데노 부속 바이러스( Adeno - associated virus ) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 상기 <비교예 5>와 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 서열번호 8로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율을 8:1로 제조하였다. 상기 서열번호 8로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 8로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 8> P 물질 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
<8-1> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5: 1 인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 9의 펩타이드는 20 mg/ml의 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml의 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 9로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 6으로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 0.5:1이였다. 상기 서열번호 9로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 9로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
<8-2> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 상기 비교예 <8-2>와 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 서열번호 9로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 9로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 비교예 9> 오스테오폰틴 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
<9-1> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 0.5:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 칼슘클로라이드(CaCl2)를 2.8 내지 3.1 mg/ml의 농도로 제조하였다. 그런 다음, 분리 정제되어 분자량이 확인된 줄기세포 부착능을 가진 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 10의 펩타이드는 10 mg/ml 농도로 제조하여 준비하였고, 트롬빈은 멸균된 칼슘클로라이드(CaCl2) 용액을 이용하여 200 IU/ml 농도로 준비하였다. 상기 서열번호 10으로 기재된 펩타이드를 트롬빈 60 ul와 혼합한 후, 칼슘클로라이드(CaCl2)로 희석하여 140 ul가 되도록 하였다. 피브리노겐은 멸균된 아프로티닌 용액에 40 mg/ml의 농도로 용해시켜 준비하였다. 상기 서열번호 10으로 기재된 펩타이드와 피브리노겐의 몰 비율은 0.5:1이였다. 상기 서열번호 10으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 10으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
<9-2> 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물의 제조
카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐의 몰비율이 1:1인 줄기세포 이식용 피브린 젤 조성물을 제조하기 위하여, 상기 비교예 <9-1>과 동일한 방법으로 줄기세포 부착능을 가진 서열번호 10으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul에 피브리노겐 60 ul을 첨가한 후, 37℃에 방치하여 형성된 피브리 수화젤을 수득하였다. 생체내(in vivo) 실험시 서열번호 10으로 기재된 펩타이드 및 트롬빈을 혼합한 혼합물 140 ul와 피브리노겐 60 ul를 각각 다른 실린지를 이용하고, 피하로 주입하여 피브린 수화젤을 형성하였다.
< 실험예 1> 세포배양
인간 지방 유래 중간엽 세포(Adipose-derived mesenchymal stem cells)인 PCS-500-011(ATCC, USA) 세포주 및 인간 제대혈 유래 줄기세포(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells)인 PCS-500-010(ATCC, USA) 세포주를 세포주를 10% FBS(Gibco-BRL, Grand Island, NY), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Gibco-BRL, Grand Island, NY) 배지에서 배양하였다. 인간 골수유래 클론 중간엽 줄기세포(Bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells)의 세포주는 골수 추출물을 2시간 동안 배양한 후, 상기 세포의 상층액을 새로운 디쉬(dish, D1)에 옮긴 다음, 2시간 후에 다시 상층액을 이동시키고(dish, D2) 하루에 한번씩 동일한 방법으로 세 번 더 반복하였다(dish, D3 내지 D5). 상기 D3 내지 D5 디쉬로부터 수득한 클론 중간엽 줄기세포 라이브러리를 계속 배양하였다.
< 실험예 2> P 물질( Substance P) 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤의 세포 생착율 촉진 효과 확인
<2-1> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative real-time PCR, qPCR)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>에 기재된 방법으로 배양한 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 200000개가 되도록 카운팅(counting)하고 상기 실시예 <2-1>, 실시예 <3-1>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 갖는 피브린 젤과 상기 <비교예 2>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 갖는 피브린 젤, 상기 <비교예 3>에서 제조한 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 4>에서 제조한 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호 5)를 함유하는 피브린 젤 및 상기 <비교예 5>에서 제조한 펩타이드(서열번호6)를 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 24 및 48시간 경과 후 상기 세포의 생착율을 평가하였다. 세포 생장 평가는 상기 마우스로부터 젤을 수득하여 DNA를 추출하고 정량적 실시간 qPCR 방법을 사용하였다. 각 샘플에 대하여 20 ng의 DNA을 인간 Alu element에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 와 중합효소, SYBR green, dNTP 및 MgCl2(LightCycler FastStart DNA Master SYBRGreen I, Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany)를 함께 첨가하여 94℃에서 10분간 변성(denaturation) 시켜준 후, 94℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초 씩 45 싸이클(cycle)을 반복하여 반응한 후 얻은 Cp값을 통해 인간 DNA의 양을 계산하였다. 하기 [표 3]에 기재된 인간 Alu 프라이머의 서열을 사용하였다. 대조군으로는 줄기세포를 함유하는 피브린 젤을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 2).
이름 서열
Human Alu_F(서열번호 11) 5′-GCCTGTAATCCCAGCACTTT-3′
Human Alu_R(서열번호 12) 5′-CACTACGCCCGGCTAATTT-3′
<2-2> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <3-2>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 6>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤, 상기 <비교예7>에서 제조한 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 4>에서 제조한 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호5)를 함유하는 피브린 젤 및 상기 <비교예 5>에서 제조한 펩타이드(서열번호6)를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3).
<2-3> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-3>, 상기 실시예 <3-3>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤, 상기 <비교예 2>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 3>에서 제조한 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 4>에서 제조한 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호5)를 포함한 피브린 젤 및 상기 <비교예 5>에서 제조한 펩타이드(서열번호6)를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 4).
<2-4> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 6>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 7>에서 제조한 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기<비교예 4>에서 제조한 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호5)를 포함하는 피브린 젤 및 상기<비교예 5>에서 제조한 펩타이드(서열번호6)를 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수유래 클론 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 5).
<2-5> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <3-2>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 비교예 2에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 2>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤, 상기 <비교예 3>에서 제조한 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 갖는 피브린 젤, 상기 <비교예 4>에서 제조한 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호5)를 포함하는 피브린 젤 및 상기 <비교예 5>에서 제조한 펩타이드(서열번호6)를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 6).
<2-5> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-3>, 상기 실시예 <3-3>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 6>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 7>에서 제조한 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 4>에서 제조한 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드(서열번호5)를 포함하는 피브린 젤, 상기 <비교예 5>에서 제조한 펩타이드(서열번호6)를 포함하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤에 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함한 카이머릭 펩타이드를 함유한 피브린 젤 처리 군에서 상기 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 7).
< 실험예 3> 오스테오폰틴 ( Osteipontin ) 유래 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드를 포함하는 피브린 젤의 세포 생착율 촉진 효과 확인
<3-1> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <3-1>, 상기 실시예 <3-2>, 상기 실시예 <3-3>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 10>, 상기 <비교예 11>에서의 비율로 제조한 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 상기 실시예 <3-1>, 상기 실시예 <3-2> 및 상기 실시예 <3-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 상기 실시예 <3-1>, 상기 실시예 <3-2> 및 상기 실시예 <3-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 포함한 젤로 처리한 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 8).
<3-2> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <3-1>, 상기 실시예 <3-2>, 상기 실시예 <3-3>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 <비교예 10>, 상기 <비교예 11>에서의 비율로 제조한 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 인간 제대혈 중간엽 줄기세포를 상기 실시예 <3-1>, 상기 실시예 <3-2> 및 상기 실시예 <3-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 상기 실시예 <3-1>, 상기 실시예 <3-2> 및 상기 실시예 <3-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 포함한 젤로 처리한 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 9).
<3-3> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-1>, 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <2-3>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 비교예 <8-1>, 상기 비교예 <8-2>에서의 비율로 제조한 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 인간 골수 유래 클론 중간엽 줄기세포를 상기 실시예 <2-1>, 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <2-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 상기 실시예 <2-1>, 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <2-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 포함한 젤로 처리한 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 10).
<3-4> qPCR 을 이용한 세포 생착율 촉진 효과 측정
인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 줄기세포 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가진 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드를 포함하는 피브린 젤이 세포 생착율에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 상기 실험예 <2-1>와 동일한 방법으로 상기 실시예 <2-1>, 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <2-3>에서 제조한 카이머릭 펩타이드를 포함한 피브린 젤, 상기 비교예 <8-1>, 상기 비교예 <8-2>에서의 비율로 제조한 카이머릭 펩타이드를 함유하는 피브린 젤을 각각 마우스에 인간 골수유래 중간엽 줄기세포와 함께 피하로 주입하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였고, 상기 표 3에 기재되어 있는 인간 Alu 프라이머 서열을 사용하여 대조군과 비교하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포를 상기 실시예 <2-1>, 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <2-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 처리하여 대조군과 세포의 생착율을 비교하였을 때, 상기 실시예 <2-1>, 상기 실시예 <2-2>, 상기 실시예 <2-3>에서의 비율로 제조된 카이머릭 펩타이드를 포함한 젤로 처리한 세포의 생착율이 거의 동일한 수준으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 11).
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for enhancing transplantation rate of stem cells and preparation method thereof <130> 13P-11-31 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 1 <400> 1 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Lys Pro 1 5 10 15 Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 2 <400> 2 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Leu Arg 20 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 3 <400> 3 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Gly Asp 1 5 10 15 Ser <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 4 <400> 4 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 5 <400> 5 Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 6 <400> 6 Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 7 <400> 7 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asn Leu Ile Lys 1 5 10 15 Gln Asp Asp Gly Gly Ser Pro Ile Arg His Tyr 20 25 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 8 <400> 8 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asn Leu His Ser 1 5 10 15 Pro Pro Ala <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 9 <400> 9 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Lys Pro 1 5 10 15 Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met 20 <210> 10 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric protein 10 <400> 10 Asn Gln Glu Gln Val Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 10 15 Val Val Tyr Gly Leu Arg 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Alu_F <400> 11 Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Cys Thr Thr Thr 20 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Alu_R <400> 12 Cys Ala Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ala 1 5 10 15 Thr Thr Thr

Claims (11)

  1. 줄기세포의 생착율을 증가시키는 생리활성 펩타이드 및 피브린 젤 부착능을 가지는 펩타이드로 구성된 카이머릭 펩타이드로서,
    상기 카이머릭 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것인 카이머릭 펩타이드.
  2. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐을 함유하는 피브린 젤.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐은 2:1 내지 8:1의 몰 비율로 구성된 것을 특징으로 하는 피브린 젤.
  4. ｉ) 서열번호 1 또는 서열번호 2 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드를 트롬빈과 혼합하는 단계; 및
    ⅱ) 단계 ｉ)의 혼합물을 피브리노겐과 혼합하여 피브린 수호젤을 형성하는 단계를 포함하는 피브린 겔 조성물의 제조 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 카이머릭과 피브리노겐은 2:1 내지 8:1의 몰 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피브린 겔 조성물의 제조 방법.
  6. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 카이머릭 펩타이드 및 피브리노겐을 함유하는 피브린 젤을 포함하는, 스캐폴드.
  7. 제 1항의 카이머릭 펩타이드를 생체 외에서 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생착율 증강 방법.
  8. 제 2항의 피브린 젤을 생체 외에서 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생착율 증강 방법.
  9. 제 6항의 스캐폴드를 생체 외에서 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생착율 증강 방법.
  10. 삭제
  11. 제 7항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 골수 유래 줄기세포, 지방 유래 줄기세포 및 제대혈 유래 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 줄기세포의 생착율 증강 방법.










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