TWI749415B - 新型肽及包含其之醫藥組合物、醫藥外品組合物及保健功能食品組合物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及新型肽、對上述肽進行編碼的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表達載體、包含上述肽的藥學組合物、醫藥外品組合物以及保健功能性食品組合物。

Description

新型肽及包含其之醫藥組合物、醫藥外品組合物及保健功能食品組合物

本發明涉及新型肽，更具體地本發明涉及包含新型牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽、對上述肽進行編碼的多核苷酸、包含上述多核苷酸的表達載體及包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用藥學組合物、牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善用醫藥外品組合物及預防或改善用保健功能性食品組合物。

牙髓作為存在於牙齒內部的填滿牙髓腔的柔軟的結合組織，是指神經和血管分布得豐富，並且達到牙本質內側面的地方。在這種牙髓中產生的病變被稱為牙髓疾病。

牙髓疾病的原因非常豐富，在大部分的情況下，通過基於齲齒的細菌感染和牙齒的穿孔、斷裂、龜裂、牙周袋，來向牙髓內部產生感染而發生。並且，外傷、磨耗、牙齒龜裂及治療時在牙科用設備中產生的熱和摩擦等也可誘發牙髓疾病。基於細菌感染的牙髓炎可延伸為齒根端疾病和牙周疾病。當發生牙髓疾病時，按照牙髓充血、 牙髓炎、牙髓壞死的順序進行。在牙髓壞死的情況下，由於牙髓死亡，從而完全不能向牙髓供給血液，因此導致使整個牙周組織消失，來最終可導致齒根端疾病或整個牙齒的異常。

在牙髓、齒根端疾病的治療中使用牙髓復製劑和牙根管填充材料，通常使用氫氧化鈣、礦物三氧化物凝聚體(MTA,Mineral Trioxide Aggregate)、古塔膠(Gutta-percha)等。在礦物三氧化物凝聚體的情況下，具有密封力和生物體親和性，從而在治療中呈現效果，但是相對地，作為牙科治療劑產生高費用、變色，從而發生審美性問題。在古塔膠的情況下，費用經濟且流動性好，但是是導致喪失牙髓生活力的非生理性的治療方法。當前為止治療牙本質牙髓疾病的保守的治療方法而言，使治療的牙齒變弱或易碎，並且具有再感染的危險。

由此，活躍地進行用於開發可有效地治療上述牙本質疾病或牙髓疾病的治療劑的研究。例如，在韓國公開專利第2012-0089547號中公開包含成釉細胞、頂芽細胞或它們的培養液作為有效成分的硬組織形成及牙本質或牙髓組織再生用組合物，在韓國公開專利第2009-0033643號中公開有新型來源於牙囊的牙齒幹細胞及其培養方法。

本發明人為了開發更有效地治療牙本質疾病或牙髓疾病的製劑，銳意努力，其結果開發呈現牙髓組 織的再生促進用細胞治療及牙本質過敏癥治療效果的肽，並且完成了本發明。

本發明的一目的在於，提供促進新型牙本質或牙髓組織的再生及牙本質疾病或牙髓疾病的治療用肽。

本發明的再一目的在於，提供對上述肽進行編碼的多核苷酸。

本發明的另一目的在於，提供包含上述多核苷酸的表達載體。

本發明的還一目的在於，提供包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用藥學組合物。

本發明的又一目的在於，提供包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善用醫藥外品組合物。

本發明的又一目的在於，提供包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善用保健功能性食品組合物。

本發明的又一目的在於，提供包括將包含上述肽的組合物給藥到個體的步驟的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療方法。

本發明的又一目的在於，提供包括將包含上述肽的組合物給藥到個體的步驟的促進牙本質或牙髓組織的再生的方法。

本發明的又一目的在於，提供包含以下通式1的胺基酸序列的肽或包含上述肽的組合物的促進牙本質或牙髓組織的再生的用途、牙本質過敏癥的預防或治療用途及牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用途。

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (通式1)

上述通式1中，

R1為精胺酸R、賴胺酸K或谷胺醯胺Q；

R2為精胺酸R或谷胺醯胺Q；

R3、R4及R5分別為精胺酸R或賴胺酸K；

R6為天冬醯胺N或絲胺酸S；

R7及R8為賴胺酸K或酪胺酸Y。

本發明的另一目的在於，提供包含序列號1至序列號96中的任意一種胺基酸序列的肽或包含上述肽的組合物的促進牙本質或牙髓組織的再生的用途、牙本質過敏癥的預防或治療用途及牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用途。

本發明的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽呈現優秀的牙本質或牙髓組織的再生促進效果，因此可廣泛地用於用於治療與多種牙本質和牙髓相關的疾病的預防或治療的製劑的開發。

第1a圖為表示在本發明中提供的各個肽針對於作為 成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白(DSPP)的表達產生的影響按組進行比較的結果的圖表。

第1b圖為表示在處理本發明的肽的MDPC-23細胞中，對作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質涎磷蛋白基因的表達水平進行比較的結果的圖表。

第1c圖為表示在本發明的組11及組12的肽得到處理的MDPC-23細胞中，對作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質涎磷蛋白、Dmp1(牙本質基質蛋白1)及Nestin(巢蛋白)基因的表達水平進行比較的結果的圖表。

第1d圖為表示針對於與牙髓組織細胞有關的本發明的肽的細胞毒性進行評價的結果的圖表。

第2圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植之後，由此在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)的對照組的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分200μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分200μm、E部分100μm、F部分50μm)；G部分至I部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分200μm、H部分100μm、I部分50μm)；J部分至L部分為 表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：J部分200μm、K部分100μm、L部分50μm)。

第3圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行6週的移植來在生物體內中所生成的包含於牙本質/牙髓組織-類似組織的膠原蛋白的形成水平的顯微鏡照片，A部分至C部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：A部分500μm、B部分200μm、C部分50μm)，D部分至F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)，G部分至I部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：G部分500μm、H部分200μm、I部分50μm)，J部分至L部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：J部分500μm、K部分200μm、L部分50μm)。

第4圖為作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行6週的移植來在生物體內中所生成的包含於牙本質/牙髓組織-類似組織中，對作為成牙本質細胞特異性分化標誌基因的DSP和作為成骨細胞特異性分化標誌的BSP的表達水平進行評價的結果的免疫染色照片，A部分及E部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸 三鈣的對照組的移植物進行6週的移植的結果，B部分及F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行6週的移植的結果，C部分及G部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行6週的移植的結果，D部分及H部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行6週的移植的結果，A部分、B部分、C部分及D部分的箭頭表示在新形成的牙本質-類似組織中DSP被表達的部分，E部分、F部分、G部分及H部分的箭頭表示在新形成的骨頭類似組織中BSP被表達的部分。比例尺為50μm。

第5圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植之後，由此在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分500μm、B部分200μm、C部分50μm)；D部分至F部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)；G部分至I部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分500μm、H部分200μm、I部分50μm)；J部分至L部分為表示對包含牙髓組織細 胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(J部分500μm、K部分200μm、L部分50μm)。

第6圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植之後，包含於在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的膠原蛋白的形成水平的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：A部分500μm、B部分200μm、C部分50μm)，D部分至F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)，G部分至I部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：G部分500μm、H部分200μm、I部分50μm)，J部分至L部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：J部分500μm、K部分200μm、L部分50μm)。

第7圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植來在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織中，對作為成牙本質細胞特異性分化標誌基因的DSP和作為成骨細胞特異性分化標誌的BSP的表達水平進行評價的結果的免疫染色照片，A部分及E部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照 組的移植物進行12週的移植的結果；B部分及F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行12週的移植的結果；C部分及G部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行12週的移植的結果；D部分及H部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果；A部分、B部分、C部分及D部分的箭頭表示在新形成的牙本質-類似組織中DSP被表達的部分；E部分、F部分、G部分及H部分的箭頭表示在新形成的骨頭類似組織中BSP被表達的部分。比例尺為50μm。

第8圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植來在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的結構的掃描式電子顯微鏡照片，A部分及B部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：A部分50μm、B部分20μm)，C部分及D部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽(序列號96)的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：C部分50μm、D部分20μm)，E部分及F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：E部分50μm、F部分20μm)。

第9圖作為表示將包含本發明的肽的移植物移植到人類牙齒的牙根管之後，對由此形成的成牙本質細胞/牙髓組 織-類似組織進行分析的結果的顯微鏡照片及掃描式電子顯微鏡照片，A部分及B部分表示對移植有僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行染色的結果(比例尺：A部分500μm、B部分50μm)，C部分、D部分及D’部分表示對移植有包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽(序列號96)的移植物進行染色的結果，D部分為C部分的1號框的放大圖，D’部分為C部分的2號框的放大圖(比例尺：C部分500pm、D部分50μm、D’部分50μm)；E部分及F部分表示對移植有僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物利用掃描式電子顯微鏡進行拍攝的結果(比例尺：E部分50μm、F部分10μm)；G部分及H部分表示對移植有包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽(序列號96)的移植物利用掃描式電子顯微鏡進行拍攝的結果(比例尺：G部分50μm、H部分10μm)；P表示再生的牙髓組織，De表示現有的牙本質壁，DT表示現有的牙本質小管，Od表示成牙本質細胞，OP表示成牙本質細胞突起，位於D部分的箭頭表示與成牙本質細胞突起一同使成牙本質細胞-類似細胞再生。

第10圖作為在間接蓋髓術模型中的淺窩洞模型中，以組織學的方式分析新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生影響的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示在露出的牙本質部位的牙本質小管入口未塗敷任何物質的對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分500μm、B部分 100μm、C部分50μm)；D部分至F部分為在露出的牙本質部位的牙本質小管入口塗敷組11的肽(1.5μg)的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分100μm、F部分50μm)；G部分至I部分為在露出的牙本質部位的牙本質小管入口塗敷組12的肽(1.5μg)的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分500μm、H部分100μm、I部分50μm)。P表示牙髓(pulp)，D表示牙本質(dentin)，TD表示新形成的生理性牙本質(新形成的第三牙本質(newly formed tertiary dentin))。

第11圖作為在間接蓋髓術模型中的深齲(深窩洞)模型中，以組織學的方式分析新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生影響的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示未塗敷任何物質且填充玻璃離子水門汀(Glass ionomer cement)的對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分500μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分表示塗敷組11的肽(1.5μg)且填充玻璃離子水門汀的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分100μm、F部分50μm)；G部分至I部分為塗敷組12的肽(1.5μg)且填充玻璃離子水門汀的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分500μm、H部分100μm、I部分50μm)。P表示牙髓(pulp)，D表示牙本質(dentin)，TD表示新形成的生理性牙本質(新形成的第三牙本質(newly formed tertiary dentin))。

第12圖作為在直接蓋髓術模型中，以組織學的方式分析新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生影響 的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示未塗敷任何物質且填充玻璃離子水門汀的對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分200μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分表示未塗敷任何物質且利用礦物三氧化物凝聚體密封之後利用玻璃離子水門汀覆蓋的陽性對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)；G部分至I部分為塗敷組11的肽(1.5μg)且利用礦物三氧化物凝聚體密封之後利用玻璃離子水門汀覆蓋的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分200μm、H部分100μm、I部分50μm)，J部分至L部分為塗敷組12的肽(1.5μg)且利用礦物三氧化物凝聚體密封之後利用玻璃離子水門汀覆蓋的結果的顯微鏡照片(比例尺：J部分500μm、K部分100μm、L部分50μm)。D表示牙本質(dentin)，OD表示骨性牙質(osteodentin)，TD表示新形成的生理性牙本質(新形成的第三牙本質)。

本發明人為了開發更有效地治療牙本質疾病或牙髓疾病的製劑，進行多種研究，最終開發了由10個胺基酸構成的新型肽。

開發的上述新型肽作為為取代可呈現牙本質疾病或牙髓疾病治療效果的肽的胺基酸序列的一部分而製備，並且確認了可增加作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白、Dmp1及Nestin基因的表達水平，從而既呈現促進牙本質再生的效果，又對於牙髓組織的細胞 未呈現任何細胞毒性。

並且，製備與牙髓組織細胞一同包含上述肽的移植物，並且將製備的上述移植物移植於免疫系統受損的小鼠的皮下組織，並且經過6週至12週之後，對被移植的組織進行分析，最終確認了如下：在生物體內形成與牙本質-牙髓組織最類似的形態的牙本質-牙髓類似組織，膠原蛋白的形成水平增加，作為成牙本質細胞特異性分化標誌基因的DSP的表達水平增加，相反地，作為成骨細胞特異性分化標誌的BSP的表達水平未特別地增加。

並且，通過電子顯微鏡對上述被移植的組織的形狀進行分析，其結果，確認了成牙本質細胞-類似細胞以柵欄狀排列方式存在於現有的牙本質壁上，它們的細胞突起與伸長的核一同，向現有的牙本質小管伸長。

並且，確認了在間接蓋髓術成犬模型及直接蓋髓術成犬模型中的上述肽的效果，最終確認了與在人的自然牙齒牙本質中可觀察的相同的生理性牙本質通過新型肽形成。

因此，可知本發明的肽呈現牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥的治療效果。到目前為止毫無報告呈現這種效果的本發明的肽，並且由本發明人最初開發。

作為用於實現上述目的的一實施方式，本發明提供包含以下通式1的胺基酸序列的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病的治療用肽。

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (通式1)

在上述通式1中，

R1為精胺酸R、賴胺酸K或谷胺醯胺Q；

R2為精胺酸R或谷胺醯胺Q；

R3、R4及R5分別為精胺酸R或賴胺酸K；

R6為天冬醯胺N或絲胺酸S；

R7及R8為賴胺酸K或酪胺酸Y。

本發明的術語“牙本質(dentine)”還被稱為牙質、象牙質，是指形成牙齒的大部分的、具有呈黃色的白色的堅硬的組織。上述牙本質在牙冠部中由牙釉質覆蓋，在齒根部中由牙骨質覆蓋，因此不露出於牙齒表面，但是隨著歲數大，若牙釉質磨損，則牙本質將暴露在牙冠的牙頸部或咬合面。上述牙本質雖然是一種骨組織，但是形成牙本質的細胞的本體位於牙髓內，並且僅其突起向牙本質內延伸，在上述方面上和通常的骨組織不同。

本發明的術語“牙髓組織(dental pulp)”還被稱為“牙髓”，是指存在於牙齒的內部的填滿牙髓腔的柔軟的結合組織。在解剖學上還可指豐富的神經和血管的分佈，並且達到牙本質的內側面的位置的區域。

在本發明中提供的肽既不呈現細胞毒性，又可使作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白、Dmp1及Nestin基因的表達水平增加，並且在與牙髓組織細胞一同移植於生物體內的情況下，上述牙髓組織細胞可呈現形成牙本質/牙髓組織-類似組織的特性。

在本發明中提供的肽只要能夠呈現牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病的治療效果，就會使具有構成上述的胺基酸序列和一種以上的胺基酸殘基具有不同的序列的突變體肽也包含於在本發明中提供的肽的範疇。

通常，在本發明所屬技術領域中公知在整體上未變更分子的活性的蛋白質及多肽中的胺基酸的交換。最普遍地發生的交換為胺基酸殘基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之間的交換。並且，通過胺基酸序列上的突變或修飾可包含與肽的熱、pH等有關的結構性穩定性增加或牙本質或牙髓組織的再生促進能力增加的肽。

例如，本發明中提供的作為位於序列號1的肽的3號的酸性胺基酸的谷胺醯胺即使被作為鹼性胺基酸的賴胺酸或精胺酸取代，也可直接顯示在本發明中提供的肽的效果；位於序列號1的肽的4號或5號的作為鹼性胺基酸的精胺酸即使被作為酸性胺基酸的谷胺醯胺或作為鹼性胺基酸的賴胺酸取代，也可直接顯示在本發明中提供的肽的效果；位於序列號1的肽的6號或7號或9號的作為鹼性胺基酸的賴胺酸即使被作為鹼性胺基酸的精胺酸或作為芳香族胺基酸的酪胺酸取代，也可直接顯示在本發明中提供的肽的效果；位於序列號1的肽的8號的作為酸性 胺基酸的天冬醯胺即使被作為中性胺基酸的絲胺酸取代，也可直接顯示在本發明中提供的肽的效果；位於位於序列號1的肽的10號的作為芳香族胺基酸的酪胺酸即使被作為鹼性胺基酸的賴胺酸取代，也可直接顯示在本發明中提供的肽的效果。

如上所述，在構成本發明的肽的酸性胺基酸、鹼性胺基酸或芳香族胺基酸分別被具有相同性質的胺基酸取代的情況下，當然即使分別被與此不同的酸性胺基酸、鹼性胺基酸、中性胺基酸或芳香族胺基酸取代，也可直接呈現在本發明中提供的肽的效果，因此，構成本發明的肽的胺基酸序列和一個以上的胺基酸殘基具有不同的序列的突變體肽也屬於在本發明。

並且，本發明的肽即使具有在它的N-末端或C-末端附加有任意胺基酸的形態，也可直接呈現在本發明中提供的肽的效果，因此包含於在本發明中提供的肽的範疇。作為一例，可成為在上述肽的N-末端或C-末端附加有1至300個的胺基酸的形態，作為另一例，可成為在上述肽的N-末端或C-末端附加有1至100個胺基酸的形態，又作為另一例，可成為在上述肽的N-末端或C-末端附加有1至24個胺基酸的形態。

為了從生物體內的蛋白質切割酶保護，並且增加穩定性，本發明的肽可以為它的N-末端和/或C-末端等由化學式修飾或利用有機端保護或在肽末端等中追加胺基酸來變形的形態。尤其在化學上合成的肽的情況下，由 於N-及C-末端帶電荷，因此，為了去除這種電荷可對N-末端進行乙醯化(acetylation)、對N-末端進行甲基化(Metylation)和/或對C-末端進行醯胺化(amidation)或可包括D-胺基酸導入、CH2-NH、CH2-S、CH2-S=O、CH2-CH2在內的肽鍵變形、主鏈變形、側鏈變形，但並不限定於此。製備肽模仿體化合物的方法作為在本發明技術領域中公知的方法，例如可參照Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Choplin Pergamon Press(1992)中記載的內容。

本發明的術語“主鏈變形”是指構成肽的胺基酸的主要部分的鏈形或環形的主鏈被稱為主鏈(主鏈：backbone)，並且將構成上述肽主鏈的胺基酸直接變形為胺基酸類似物的被稱為主鏈變形。胺基酸類似物是指胺基酸主鏈的氮或α-碳中，通過取代作用對氫原子進行變形的胺基酸。

本發明的術語“側鏈變形”是指從成為構成肽的胺基酸的主要部分的鏈形或環形主鏈如分枝延伸的原子團被稱為側鏈(側鏈：side-chains)，利用化學物質對這些側鏈進行變形的被稱為側鏈變形。作為肽側鏈變形的例包含：如還原烷基化反應；基於乙醯亞胺酸甲酯的醯胺化；基於乙酸酐的烷基化；基於氰酸的胺基的甲胺醯化；基於2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的胺基酸的三硝基芐基化；基於琥珀酸酐的胺基的烷基化；以及處理5-磷酸吡哆醛pyridoxal-5-phosphate後還原為NaBH4的如吡哆醛化(pyridoxylation)的胺基的變形等。

並且，本發明的肽可獨立使用，並且可以與如溶劑等接受的各種載體(cattier)混合使用，為了增大穩定性及功效還可包含碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖等；抗氧化劑(antioxidants)，如抗壞血酸(ascorbic acid)或谷胱甘肽(glutathione)等；螯合劑(chelating agents)；低分子蛋白質或其他穩定劑(stabilizers)等使用。

根據本發明的一實施例，合成相當於在本發明中提供的通式1的96種的肽，並檢驗上述合成的肽對作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白基因的表達水平產生的影響。其結果，確認了如下：與在未處理本發明的肽的MDPC-23細胞(對照組)中測定的作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸(mRNA)水平相比，處理上述96種的肽的MDPC-23細胞中，上述牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平均呈現1.3倍以上的值(表13至表24)。

根據當前為止的報告，眾所周知，若DSPP的信使核糖核酸的水平增加，則促進成牙本質細胞分化及牙本質再生，因此可知如下：呈現使上述牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平增加的上述96種的肽呈現促進成牙本質細胞分化及牙本質再生的效果(Taduru Sreenath et al,,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.278,No.27,Issue of July 4,pp.24874-24880,2003；William T.Butler et al,Connective Tissue Research,44(Suppl.1)：171-178、2003)。

作為另一實施方式本發明提供對上述肽進行編碼的多核苷酸。

上述多核苷酸可通過取代，缺失，插入或它們的組合進行突變。在化學合成核苷酸序列製備的情況下，可使用在本發明所屬領域中公知的合成法，例如在文獻(Engels and Uhlmann,Angew Chem IntEd Engl.,37：73-127,1988)中記載的方法，並且可利用三酯、亞磷酸鹽、亞磷醯胺及H-亞磷酸鹽方法、聚合酶鏈鎖反應(PCR)及其他自動引物方法，固體支撐物上的寡核苷酸合成法來合成。例如，對本發明的肽進行編碼的多核苷酸可包含序列4的鹼基序列。

作為另一實施方式，本發明提供利用包含上述多核苷酸的表達載體、包含上述表達載體的轉化體及上述轉化體來製備上述肽的方法。

本發明的術語“表達載體”是指作為在所目的的宿主細胞中可表達目的肽的重組載體，包含以能夠操作的方式相連接的必須的調節要素的基因製備物，從而表達基因插入物。上述表達載體包含公開密碼子、終結密碼子、啟動子、操縱等的表達調節要素，上述公開密碼子及終結密碼子通常被視為對多肽進行編碼的核苷酸序列的一部分，並且當給藥基因製備物時必須在個體呈現作用，並且位於編碼序列和框架(in frame)。載體的啟動子可以為結構性或誘導性啟動子。

本發明的術語“能夠操作的方式相連接 (operably linked)”是指以執行通常的功能的方式對核酸表達調節序列和目的的蛋白質或核糖核酸(RNA)進行編碼的核酸序列功能性地相連接(functional linkage)的狀態。例如，對啟動子和蛋白質或核糖核酸進行編碼的核酸序列以能夠操作的方式相連接來可對編碼序列的表達產生影響。可利用在本發明技術領域中公知的基因重組技術製備與表達載體的操作性相連接，作為部位-特異性脫氧核糖核酸(DNA)切割及連接可使用本發明所屬技術領域中通常公知的酶等。

並且，為了促進從細胞培養液的肽的分離，上述表達載體可包含用於排出上述肽的信號序列。還可在所插入的核酸序列的有效的翻譯中需要特異性公開信號。這些信號包含ATG公開密碼子及相鄰的序列。在有些情況下，需要提供可包含ATG公開密碼子的外因性翻譯調節信號。這種外因性翻譯調節信號及公開密碼子可以為多種天然及合成供給源。可通過適當的轉錄因子或翻譯強化因子的導入增加表達效率。

並且，為了使上述肽的檢測變得容易，上述表達載體還可包含可使用任意內肽酶去除的蛋白質標簽。

本發明的術語“標簽(tag)”是指呈現可進行定量的活性或特性的分子，可以為化學螢光物質(fluoracer)如螢光素等；螢光分子，如包含螢光蛋白或相關蛋白質的多肽螢光物質；還可以為Myc標簽、標誌(Flag)標簽、組 胺酸標簽、亮胺基酸標簽、免疫球蛋白G(IgG)標簽、鏈黴親和素標簽等的表位標簽。尤其，在使用表位標簽的情況下，較佳地由6個以上的胺基酸參加構成，更較佳地可使用由8個至50個胺基酸參加構成的肽標簽。

在本發明中，上述表達載體可包含對上述的本發明的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病的治療用肽進行編碼的核苷酸序列，此時所使用的載體只要能夠生產上述肽，就不特別限制於此，較佳地，可以為質粒脫氧核糖核酸、噬菌體脫氧核糖核酸，更較佳地可以為商業上開發的質粒(pUC18、pBAD、pIDTSAMRT-AMP等)、大腸桿菌來源的質粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草芽孢桿菌來源質粒(pUB110、pTP5等)、酵母-來源質粒(YEp13、YEp24、YCp50等)、噬菌體脫氧核糖核酸(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)、動物病毒載體(逆轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)等)、昆蟲病毒載體(桿狀病毒(baculovirus)等)。上述表達載體根據宿主細胞蛋白質的表達量和修飾等呈現得不同，因此較佳地選擇最適合與目的的宿主細胞而使用。

可向宿主導入在本發明中提供的上述表達載體來進行轉換，從而可製備本發明中提供的轉化體，通過使包含於上述表達載體的多核苷酸表達，來可使用於生產上述肽。可通過多種方法進行上述轉化，只要能夠生產上述肽，就並不特別限定於此，但是可使用CaCl2沈澱法、 在CaCl2沈澱法中使用被稱為二甲基亞碸(DMSO，dimethyl sulfoxide)的還原物質來提高效率的Hanahan方法、電穿孔法(electroporation)、磷酸鈣沈澱法、原生質融合法、使用碳化矽纖維的攪拌方法、農桿菌介導的轉化法、利用聚乙二醇(PEG)的轉化法、硫酸葡聚糖、脂質體及乾燥/抑制介導的轉化方法等。並且，使用於製備上述轉化體的宿主也只要能夠生產上述肽，就並不特別限定於此，但是可以為細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌、鼠傷寒沙門氏菌等；酵母細胞，如釀酒酵母、裂殖酵母；菌類細胞，如畢赤酵母等；昆蟲細胞，如果蠅、夜蛾Sf9細胞；動物細胞，如CHO、COS、NSO、293、bow melanoma細胞等；或植物細胞。

上述轉化體還可使用於生產本發明的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽的方法。具體地，生產本發明的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病治療用肽的方法可包括：步驟(a)：通過培養上述轉化體來獲得培養物；以及步驟(b)，從上述培養物回收本發明的肽。

本發明的術語“培養”是指使微生物在適當地人工調節的環境條件下生育的方法。在本發明中，作為培養上述轉化體的培養方法可利用在本發明所屬技術領域中國公知的方法進行。具體地，作為上述培養只要通過表達本發明的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病治療用肽，來可進行生產，就並不特別限定於此， 但是在分批補料工序或註入補料或反復註入分批補料工序(fed batch or repeated fed batch proess)中，可進行連續式培養。

使用於培養的培養基在包含碳源、氮源、胺基酸、維生素等的通常的培養基內，在好氣性條件下，調節溫度、pH等並且需要以適當的方式滿足特定菌株的條件。作為可使用的碳源將葡萄糖及木糖的混合糖用作主碳源，除此之外，包含：糖如蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉、纖維素等；以及油，如碳水化合物、大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等；以及脂肪酸，如脂肪、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；以及醇，如甘油、乙醇；以及有機酸，如醋酸等。這些物質可作為個別的或混合物使用。作為可使用的氮源可使用無機氮源，如胺、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨等；胺基酸，如谷胺酸、蛋胺酸、谷胺醯胺等；以及有機氮源，如蛋白腖、NZ-胺、肉類提取物、酵母提取物、麥芽提取物、玉米浸漬液、酪蛋白水解物、魚類或其分解生成產物、脫脂大豆餅或其分解產物等。它們的氮源可獨立或組合使用。在上述培養基中作為磷源可包含磷酸鉀、磷酸氫二鉀及相應的含鈉鹽。作為可使用的磷源包含磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽。並且作為無機化合物可使用氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳及碳酸鈣。最後，在上述物質上可加必須生長物質，如胺基酸及維生素等。

並且，在培養培養基中可使用適當的前 體。上述的原料在培養過程中可通過適當的方式以分批式、流加式或連續式添加於培養物，但並不限定於此。可通過以適當的方式使用基礎化合物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、胺等；酸化合物，如磷酸或硫酸等來調節培養物的pH。

並且，通過使用如脂肪酸聚乙二醇酯等消泡劑來可抑制氣泡生成。為了保持好氣狀態，向培養物內註入氧或含氧氣體(例如空氣)。較佳地，通常培養物的溫度為27℃至37℃，較佳地，是30℃至35℃。上述肽的生成量成為最大值為止一直進行培養。以這種目的通常在10小時至100小時內實現。

並且，可通過本發明所屬技術領域中公知的方法劑型從培養物回收上述肽的步驟。具體地，只要可適用於所生產的上述肽的回收，就並不特別限制上述回收方法，較佳地，可使用離心分離、過濾、提取、噴霧、乾燥、蒸發、沈澱、結晶化、電泳、分級溶解(例如，硫酸銨沈澱)，色譜(例如離子交換，親和性，疏水性和大小排出)等方法。

作為另一實施方式，本發明提供包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用藥學組合物。

如上所示，在與牙髓組織細胞一同向生物體內移植本發明的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽的情況下，上述牙髓組織細胞可促進形成牙本質/牙髓組織-類似組織，並且通過在損傷的牙本質部位或牙髓部位塗敷上述肽，來可形成與在人的自然牙齒牙本質中可觀察到的相同的牙本質，因此，可用作因牙本質 或牙髓組織損傷而發生的牙本質疾病或牙髓疾病治療用藥學組合物的有效成分。

包含於上述藥學組合物的肽還能夠以肽獨立的形態使用，還能夠以由上述肽反復連接2次以上而成的多肽的形態使用，還能夠以呈現牙本質疾病或牙髓疾病治療效果的藥物與上述肽的N-末端或C-末端相結合的復合形態使用。

本發明的術語“牙本質疾病”或“牙髓疾病”是指因上述牙本質及牙髓組織的損傷，引起使牙髓組織和與此相結合的牙本質損傷而發病的全部疾病。

在本發明中，上述牙本質疾病或牙髓疾病只要是基於本發明的肽呈現治療效果，就並不特別限定於此，但是作為一例可以為牙本質過敏癥、牙髓充血、牙髓炎、牙髓變性、牙髓的壞死及壞疽癥等。

本發明的術語“預防”是指通過包含本發明的肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用藥學組合物的給藥，來抑制或延遲牙本質疾病或牙髓疾病的發生的全部行為。

本發明的術語“治療”是指將包含本發明的肽作為有效成分的藥學組合物給藥到需要治療牙本質疾病或牙髓疾病的個體，來促進牙本質或牙髓組織的再生，從而進行牙本質疾病或牙髓疾病的治療的全部行為。

本發明的藥學組合物可製備成在上述肽中還包含在藥學組合物的製備中通常所使用的適當的載體 (天然的或天然的載體)、賦形劑或稀釋劑的牙本質疾病或牙髓疾病治療用藥學組合物的形態。具體地，上述藥學組合物可劑型化為可分別按通常的方法給藥到誘發牙本質疾病或牙髓疾病的部位的滅菌注射液的形態來使用。在本發明中作為可包含於上述藥學組合物的載體、賦形劑及稀釋劑可例舉乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯橡膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯，羥基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸鎂，礦物油，膠原蛋白等。在製劑化的情況下，可使用通常使用的填充劑、增亮劑、結合劑，潤濕劑，崩解劑，表面活性劑等稀釋劑或賦形劑來製備。尤其是，滅菌水溶液，非水性溶劑、懸浮劑，乳劑，冷凍乾燥劑，坐劑，軟膏劑(例如，牙髓移裝材料等)。作為非水性溶劑、懸浮劑可使用植物性油，如丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄欖油等；能夠注射的酯，如油酸乙酯等。作為坐劑的基劑可使用witepsol、聚乙二醇、吐溫(tween)61、可可脂、肉食樹、甘油明膠等。

包含於本發明的藥學組合物的上述肽的含量並不特別局限於此，但是以最終組合物總量為基準，可包含0.0001重量百分比至50重量百分比的上述肽，更較佳地可包含0.01至20重量百分比的上述肽。

能夠以藥劑學上有效的量給藥上述本發明的藥學組合物，本發明的術語“藥劑學上有效的量”是指以 能夠適用於醫學治療或預防的合理的受益/風險比率，針對於疾病的治療或者預防充分的量，可根據疾病的嚴重度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對藥物的敏感度、所使用的本發明組合物的給藥時間、給藥途徑及排出比率治療期間、所使用的本發明的組合物配合或包含同時使用的藥物的要素及其他在醫藥領域中公知的要素確定有效用量水平。本發明的藥學組合物可獨立給藥或與公知的牙本質疾病或牙髓疾病治療用藥學組合物並用給藥。最重要的是均考慮上述要素來給藥無副作用以最少的量可取得最大效果的量。

本發明所屬技術領域的普通技術人員可考慮使用目的、疾病中毒程度、患者的年齡、體重、性別、既往癥或作為有效成分使用的物質的種類等來確定本發明的藥學組合物的給藥量。例如，每一名成人可給藥0.1ng至約100mg/kg的本發明的藥學組合物，較佳地，能夠以1ng至約10mg/kg給藥，本發明組合物的給藥頻度並不特別限定於此，但是可以1天給藥一次或分割用量來給藥幾次。上述給藥量在任意方面並不限定本發明的範圍。

本發明作為再一實施方式，提供牙本質疾病或牙髓疾病治療方法，上述牙本質疾病或牙髓疾病治療方法包括以藥劑學上有效的量將上述藥學組合物給藥到除了牙本質疾病或牙髓疾病發生的人之外的個體的步驟。

本發明的術語“個體”是指可無限制地包括包括需要治療牙本質疾病或牙髓疾病的小鼠、家畜等的哺 乳動物，但是在發生上述疾病的個體中排除人。

本發明的牙本質疾病或牙髓疾病治療用藥學組合物的給藥途徑只要是可達到目的組織，就還可通過任意通常的路徑來給藥。本發明的藥學組合物並不特別限定於此，但是可根據目的通過口腔內給藥或口腔內注射等的路徑來給藥。

作為另一實施方式，本發明提供包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善用醫藥外品組合物。

本發明的術語“改善”是指與所治療的病癥相關的參數，例如，至少減少癥狀的程度的全部行為。

在本發明中，上述改善可如下解釋：將包含本發明的肽作為有效成分的藥學組合物給藥到需要治療牙本質疾病或牙髓疾病的個體，來促進牙本質或牙髓組織的再生，從而使牙本質疾病或牙髓疾病的癥狀好轉或有利的全部行為。

本發明的術語“醫藥外品”是指在以對人或動物的疾病進行診斷、治療、改善、減輕、處置或預防的目的使用的物品中，與醫藥品相比作用輕微的物品，例如根據藥師法，醫藥外品是指排除作為醫藥品的用途使用的物品，用於治療人、動物的疾病或用於預防的纖維、橡膠產品、對人體的作用輕微或不直接作用且器具或不是機械的和與此類似的、用於防止感染病的殺菌、殺蟲劑等包含於此。

在本發明中，並不特別限定包含上述肽的醫藥外品組合物的種類，但是作為一例，可以為口腔用消毒清潔劑，口腔清潔用品，牙膏，牙線，口腔用軟膏等。

作為另一實施方式，本發明提供包含上述肽的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善用保健功能性食品組合物。

作為本發明的術語“食品”有乳濃製品，包括肉類、香腸、麵包、巧克力、糖果類、快餐類、餅乾類、比薩、速食麵、其他麵類、口香糖類、冰淇淋；各種湯；飲料；茶；保健飲料；酒精飲料；維生素複合劑；保健功能食品及保健食品等，包括常規意義上的所有食品。

上述保健功能(性)食品(functional food)是指作為和特定保健用食品(food for special health use、FoSHU)相同的術語，除了營養供給之外，還以可有效地呈現生物體調節功能的方式加工的醫學、醫療效果高的食品。其中，“功能(性)”是指對人體的結構及功能調節營養素或如生理學作用等在保健用途中取得有用的效果。可通過本發明所屬技術領域中通常所使用的方法製備本發明的食品，製備上述保健功能(性)食品時可添加通常所添加的原料及成分來製備。並且，作為上述食品的劑型而言，只要是認定為食品的劑型，就可無限制地使用。本發明的食品用組合物具有如下優點：能夠製備成多種形態的劑型，與普通藥品不同，將食品作為原料，從而無當長期服用藥品時可發生的副作用等，並且便攜性優秀，因此本發明的 食品可作為用於增進牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善的效果的輔助劑來攝取。

上述保健食品(health food)是指與普通食品相比，具有積極的保持健康或增進健康的效果的食品，保健輔助食品(health supplement food)是指健康輔助目的的食品。根據情況，可混用保健功能食品、保健食品、保健輔助食品的術語。

具體地，上述保健功能食品是指將本發明的肽添加於飲料，茶類，香料、口香糖類、餅乾類等食品材料或作為利用膠囊化、粉末化、懸浮液等製備的食品，在攝取上述食品的情況下，在健康方面帶來特定的效果，但是與普通藥品不同將食品作為原料，從而具有當長期服用藥品時無可發生的副作用的優點。

本發明的食品組合物可日常攝取，因此針對於牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善可期待高效果，由此可非常有用地使用。

上述食品組合物還可包含在生理上接受的載體，並不特別限制載體的種類，只要是在本發明所屬技術領域中通常所使用的載體，就都可使用。

並且，上述食品組合物可包含通常適用於食品組合物來可提高氣味、味道、視覺等的追加成分。例如，可包含維生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、煙酸(niacin)、生物素(biotin)、葉酸(folate)、泛酸(pantothenic acid)等。並且，可包含鋅(Zn)、鐵(Fe)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、 鎂(Mg)、錳(Mn)、銅(Cu)、鉻(Cr)等的礦物質。並且，可包含賴胺酸、色胺酸、半胱胺酸、纈胺酸等的胺基酸。

並且，上述食品組合物可包含食品添加劑(food additives)如防腐劑(山梨酸鉀、苯甲酸鈉、水楊酸、脫氫醋酸鈉)、殺菌劑(漂白粉與高效漂白粉、次氯酸鈉等)、抗氧化劑(丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)等)、著色劑(如焦油色素)、發色劑(亞硝酸鈉、亞醋酸鈉等)、漂白劑(亞硫酸鈉)、調料(MSG谷胺酸鈉等)、甜味劑(甘素、環磺酸鹽、鄰苯甲醯磺醯亞胺、鈉等)、香料(香草醛、內酯等)、膨脹劑(明礬、D-酒石酸氫鉀等)、強化劑、乳化劑、增稠劑(糊料)、被膜劑、膠基礎劑、泡沫抑製劑，溶劑，改良劑等。可根據食品的種類篩選上述添加物，並使用適當的量的上述添加物。

可直接添加本發明的肽或可與其他食品或食品成分一同使用。可按照通常的方法適當地使用。可根據其使用目的(預防、健康或治療性處置)適當地確定有效成分的混合量。通常，當製備食品或飲料時，相對於食品或飲料，可添加50重量份以下的本發明的食品組合物，具體地，可添加20重量份以下的量。但是，在以健康及衛生為目的長時間攝取的情況下，可包含上述範圍以下的量，並且在安全性方面無任何問題，因此作為有效成分還可使用上述範圍以上的量。

作為本發明的食品組合物的一例，可用作保健飲料組合物，在上述情況下，與通常的飲料相同可含 有多種調味劑或天然碳水化物等作為追加成分。上述天然碳水化合物可以為單糖，如葡萄糖，果糖等；二糖，如麥芽糖、蔗糖等；多糖，如糊精、環糊精等；糖醇，如木糖醇、山梨醇、赤蘚糖醇等。甜味劑可使用天然甜味劑，如奇異果甜蛋白、甜葉菊提取物等；合成甜味劑，如、鄰苯甲醯磺醯亞胺、阿斯巴甜等。作為上述天然碳水化合物的比率，每100mL的本發明的保健飲料組合物可以為約0.01g至0.04g，具體地可以為約0.02g至0.03g。

除了上述之外，保健飲料組合物還可包含多種營養劑、維生素、電解質、風味劑、著色劑、果膠酸、果膠酸鹽、海藻酸、海藻酸鹽、有機酸、保護性膠體增稠劑、pH調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、乙醇或碳酸化劑等。除此之外，還可包含用於製備天然果汁、果汁飲料或蔬菜飲料的果肉。這種成分可獨立使用或混合使用。這種添加劑的比率並不特別重要，但是通常相對於100重量份的本發明的保健飲料組合物，在0.01重量份至0.1重量份的範圍下選擇。

若本發明的食品組合物可呈現牙本質疾病或牙髓疾病的預防或改善效果，就能夠以多種重量百分比包含本發明的食品組合物，具體地，相對於食品組合物的總重量，可包含0.00001重量百分比至100重量百分比或0.01重量百分比至80重量百分比的本發明的肽，但是並不限定於此。

作為本發明的再一實施方式，提供包括將 包含上述肽的組合物給藥到個體的步驟的牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療方法。

作為另一實施方式，本發明提供包括將包含上述肽的組合物給藥到個體的步驟的促進牙本質或牙髓組織的再生的方法。

作為本發明的再一實施方式，提供包含以下通式1的胺基酸序列的肽或包含上述肽的組合物的促進牙本質或牙髓組織的再生的用途、牙本質過敏癥的預防或治療用途及牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用途。

K-Y-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 (通式1)

上述通式1中，

R1為精胺酸R、賴胺酸K或谷胺醯胺Q；

R2為精胺酸R或谷胺醯胺Q；

R3、R4及R5分別為精胺酸R或賴胺酸K；

R6為天冬醯胺N或絲胺酸S；

R7及R8為賴胺酸K或酪胺酸Y。

作為本發明的另一實施方式，本發明提供包含序列號1至序列號96中的任意一種胺基酸序列的肽或包含上述肽的組合物的促進牙本質或牙髓組織的再生的用途、牙本質過敏癥的預防或治療用途及牙本質疾病或牙髓疾病的預防或治療用途。

以下通過實施例對本發明進行詳細的說明。但是這些實施例只用於例示性地說明本發明，本發明的範圍並不局限於此。

實施例1：牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽的合成

本發明人通過9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl,Fmoc)方法合成呈現牙本質或牙髓組織的再生促進效果的肽(序列號1)，並且取代合成的上述肽的胺基酸來合成了各組的肽(表1至表12)。

N-KYQRRKKNKY-C(序列號1)

首先，利用賴胺酸或精胺酸取代上述序列號1的肽或上述序列號1的肽的5號至7號的胺基酸來合成了組1的肽(表1)。

然後，利用賴胺酸或精胺酸取代上述序列號1的肽的5號至7號的胺基酸，並利用絲胺酸取代8號 胺基酸來合成了組2的肽(表2)。

然後，利用賴胺酸或精胺酸取代序列號1的肽的5號至7號胺基酸，利用酪胺酸取代9號胺基酸來合成了組3的肽。

然後，利用賴胺酸或精胺酸取代序列號1的肽的5號至7號胺基酸，利用絲胺酸取代8號胺基酸，利用酪胺酸取代9號胺基酸，利用賴胺酸取代10號胺基酸來合成了組4的肽(表4)。

然後，利用精胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸來合成了組5的肽(表5)。

然後，利用精胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸，利用絲胺酸取代8號胺基酸來合成了組6的肽(表6)。

然後，利用精胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸，利用酪胺酸取代9號胺基酸，利用賴胺酸取代10號胺基酸來合成了組7的肽(表7)。

然後，利用精胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸，利用絲胺酸取代8號胺基酸，利用酪胺酸取代9號胺基酸，利用賴胺酸取代10號胺基酸來合成了組8的肽(表8)。

然後，利用賴胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸來合成了組9的肽(表9)。

然後，利用賴胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸，利用絲胺酸取代8號胺基酸來合成了組10的肽(表10)。

然後，利用賴胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸，利用酪胺酸取代9號胺基酸，利用賴胺酸取代10號胺基酸來合成了組11的肽(表11)。

最後，利用賴胺酸取代序列號1的肽的3號胺基酸，利用谷胺醯胺取代4號胺基酸，利用賴胺酸或精胺酸取代5號至7號胺基酸，利用絲胺酸取代8號胺基酸，利用酪胺酸取代9號胺基酸，利用賴胺酸取代10號胺基酸來合成了組12的肽(表12)。

實施例2：利用成牙本質細胞的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽的效果驗證

實施例2-1：對牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein)啟動子活性產生的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽的影響

首先，在包含10%的胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)的培養基中，以5%的C02及37℃的條件培養了作為小鼠來源成牙本質細胞的MDPC-23細胞。

然後，以每孔細胞數量為5×104的方式將培養的上述MDPC-23細胞細胞接種於24孔板，並且培養24小時之後，利用脂質體Plus^TM試劑，向培養的上述細胞 導入牙本質涎磷蛋白啟動子和螢光素酶基因導入pGL3載體而成的重組載體來進行了轉化。對上述轉化的MDPC-23細胞分別處理在上述實施例1中合成的組1至12的肽，並培養48小時之後，在上述各個轉化的MDPC-23細胞中測定螢光素酶活性，並比較了按組計算的平均水平(第1a圖)。在上述情況下，作為對照組使用了未處理本發明的肽的轉化的MDPC-23細胞。

第1a圖為表示在本發明中提供的各個肽針對於作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白的表達產生的影響按組進行比較的結果的圖。如第1a圖所示，確認了如下：本發明中提供的各個肽在整體上呈現在對照組中所測定的螢光素酶活性水平的約1.3倍以上的值，但是按組呈現差異，組12的肽呈現最高水平的螢光素酶活性。呈現下一個高的水平的螢光素酶活性的肽為組11的肽。

因此，可知在本發明中提供的肽呈現激活牙本質涎磷蛋白啟動子的效果。

實施例2-2：對作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白基因的表達水平產生的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病治療用肽的影響

對在上述實施例2-1中培養的MDPC-23細胞處理在上述實施例1中合成的各個組的肽，並培養48小時之後，測定在上述MDPC-23細胞中表達的作為成牙本質細胞分化 標誌基因的牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平，並且利用在對照組中測定的與牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平相關的相對比率換算上述測定的各個牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平(表13至表24)。並且，按組比較根據各組的肽測定的牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平的平均值(第1b圖)。在上述情況下，作為對照組使用未處理本發明的肽的MDPC-23細胞。

通過反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)及實時聚合酶鏈鎖反應(PCR)分析，來測定了上述牙本質涎磷蛋白基因的表達水平：具體地，利用TRIzol試劑從上述MDPC-23細胞分離了總(total)核糖核酸(RNA)。利用2μg的總核糖核酸、1μl的逆轉錄酶及0.5μg的多聚胸腺嘧啶(oligo；dT)合成了互補脫氧核糖核酸(cDNA)。將合成的互補脫氧核糖核酸利用於實時聚合酶鏈鎖反應。利用以下各個引物和SYBR GREEN PCR Master Mix(Takara，日本)，在ABI PRISM 7500序列檢測系統(sequence detection system)(Applied Biosystems)中進行了實時聚合酶鏈鎖反應。以94℃ 1分鐘；95℃ 15秒鐘-60℃ 34秒種反復40個循環(cycles)的條件進行了實時聚合酶鏈鎖反應。作為結果分析，利用comparative cycle threshold(CT)方法進行了評價。在上述情況下，作為內部對照組使用Gapdh基因，作為測定值進行3次重複實驗之後，使用了其的平均值及標準偏差值。

牙本質涎磷蛋白_R：5’-CTGTTGCTAGTGGTGCTGTT-3’(序列號97)

Dmp1_F：5’-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3’(序列號98)

Gapdh_F：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’(序列號99)

Gapdh_R：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’(序列號100)

如上述表13至表24所示，確認了如下：與在未處理本發明的肽的MDPC-23細胞(對照組)中測定的作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平相比，在處理本發明的肽的情況下，上述牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平均呈現1.3倍以上的值。

尤其，確認了如下：組11的全部肽與牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平相比，呈現3倍以上的值，組12的的全部肽與牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平相比呈現3.8倍以上的值。

第1b圖為表示在處理本發明的肽的MDPC-23細胞中，對作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質 涎磷蛋白基因的表達水平進行比較的結果的圖。如第1b圖所示，確認了如下：在處理本發明的肽的情況下，作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平增加，與第1a圖相似地，呈現在對照組中測定的牙本質涎磷蛋白基因信使核糖核酸水平的約1.3倍以上的值。

實施例2-3：對作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白、Dmp1及Nestin基因的表達水平產生的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病治療用肽的影響

從上述實施例2-2的結果確認了如下：本發明的肽可使牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平增加，尤其，組11及組12的肽可使牙本質涎磷蛋白基因的信使核糖核酸水平增加3倍以上。

由此，確認了如下：上述組11及組12的肽是否還可使作為成牙本質細胞分化標誌基因的Dmp1及Nestin基因的信使核糖核酸水平也增加。

大致地使用以下各個引物，除了作為肽使用組11及組12的肽之外，進行與上述實施例2-2相同的方法，來測定對Dmp1及Nestin基因的表達水平產生的本發明的肽的效果，並比較了按各組計算的平均水平(第1c圖)。在上述情況下，作為對照組使用未處理本發明的肽的MDPC-23細胞，作為比較組使用了牙本質涎磷蛋白基因的 信使核糖核酸水平。

Dmp1_F：5’-CATTCTCCTTGTGTTCCTTTGGG-3’(序列號101)

Dmp1_R：5’-TGTGGTCACTATTTGCCTGTG-3’(序列號102)

Nestin_F：5’-CCCTGAAGTCGAGGAGCTG-3’(序列號103)

Nestin_R：5’-CTGCTGCACCTCTAAGCGA-3’(序列號104)

第1c圖為表示在處理本發明的組11及組12的肽的MDPC-23細胞中，對作為成牙本質細胞分化標誌的牙本質涎磷蛋白、Dmp1及Nestin基因的表達水平進行比較的結果的圖。如第1c圖所示，確認了如下：若處理本發明的肽，則作為成牙本質細胞分化標誌基因的牙本質涎磷蛋白、Dmp1及Nestin基因的表達水平均增加，但是按各個基因在增加水平上呈現差異，與組11的肽相比組12的肽以更高的水平增加。

眾所周知，上述各個分化標誌基因為參與成牙本質細胞分化和牙本質的石灰化過程的基因，因此，分析為在本發明中提供的肽呈現促進象牙質的再生的效果。

實施例2-4：與牙髓組織細胞相關的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病治療用肽的細胞毒性評價

首先，人牙髓幹細胞而言，在首爾大學牙科醫院，在 10名成人(18-22歲)的智齒中分離了牙髓組織細胞。具體地，全部實驗得到臨床研究評審委員會(醫院機構審查委員會(hospital’s Institutional Review Board))的承認後，得到患者的同意來進行實驗，根據Jung HS et al(J Mol Histol.(2011))的方法切割智齒來使牙髓露出，從而利用鑷子分離了牙髓組織。利用兩面刀細切分離的上述牙髓組織，並放入60mm碟子，利用蓋玻片覆蓋之後，在達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)中進行培養，從而獲得了經培養的牙髓組織細胞。

然後，在96孔板中，以細胞數量為每孔3×103的方式接種，並培養24小時之後，以10μg/ml或50μg/ml的濃度進行處理，然後再次培養了1天、3天或5天。在上述培養結束之後，利用磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗培養的細胞，並加入20μl的MTT溶液，之後在37℃的溫度下進行4小時的反應。反應結束之後去除MTT溶液，並加入100μl的二甲基亞碸之後，在540nm波長下測定了吸光度(第1d圖)。在上述情況下，作為對照組使用了未處理上述肽培養的牙髓組織細胞。

第1d圖為表示針對於與牙髓組織細胞有關的本發明的肽的細胞毒性進行評價的結果的圖。如第1d圖所示，確認了即使加入本發明的肽，牙髓組織細胞的生存率也呈現出與對照組相同的水平。

實施例3：在生物體內中對牙本質/牙髓組織類似組織的形 成產生的牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質疾病或牙髓疾病治療用肽的影響

實施例3-1：來源於飼育6週的動物的移植組織的形態分析

在細胞數量為2×106的牙髓組織細胞中加入100mg的牙本質代用品，並與0.5%的纖維蛋白凝膠混合來製備了移植物，在上述情況下，作為上述牙本質代用品使用羥基磷灰石(hydroxy apatite)/磷酸三鈣(HA/TCP)陶瓷粉(美國捷邁公司(Zimmer,USA))，以包含10μg的組11的肽(序列號87)、組12的肽(序列號96)或2μg的BMP-2的方式製備了上述纖維蛋白凝膠。將製備的上述移植物移植於免疫系統受損的小鼠(NIH-bg-nu-xid；Harlan Laboratories,Indianapolis,IN)的皮下組織，並且將上述小鼠飼育6週之後，提取從移植物形成的牙本質/牙髓組織-類似組織。將提取的組織固定於4%多聚甲醛，並在10%的乙二胺四乙酸(EDTA)(pH7.4)中進行脫鈣，包埋於石蠟，利用蘇木精一伊紅(H-E)(Vector Labs)染色，來評價了上述牙本質/牙髓組織-類似組織的水平(第2圖)。在上述情況下，作為對照組使用移植有不包含本發明的肽的移植物的組織。

第2圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植之後，由此在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行6週的移植的結果的顯微 鏡照片(比例尺：A部分200μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分200μm、E部分100μm、F部分50μm)；G部分至I部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分200μm、H部分100μm、I部分50μm)；J部分至L部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行6週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：J部分200μm、K部分100μm、L部分50μm)。

如第2圖所示，在移植包含本發明的肽或不包含本發明的肽的移植物的情況下(A部分至I部分)，確認了在羥基磷灰石/磷酸三鈣粒子的周圍產生了牙本質-牙髓類似組織，但是在移植包含rhBMP-2的比較組的移植物的情況下(J部分至L部分)，確認了在羥基磷灰石/磷酸三鈣粒子的周圍產生了骨頭-類似石灰化的組織和骨髓類似組織。

並且，確認了如下：與移植不包含本發明的肽的移植物的情況(A部分至C部分)相比，在移植包含本發明的肽的移植物的情況下(D部分至I部分)，以相對高的水平形成與生物體內牙本質-牙髓組織最類似的形態的牙本質-牙髓類似組織。

實施例3-2：來源於飼育6週的動物的移植組織的膠原蛋白染色分析

眾所周知，膠原蛋白為在牙本質和骨頭中豐富地存在的有機基質(organic matrix)，並收容沈著的無機質來在牙本質的再生中進行重要的作用。

由此，為了確認在上述實施例3-1中提取的各個組織中膠原蛋白的蛋白質的形成水平，將上述組織作為對象利用Polysciences公司的馬松三色染色試劑盒(Masson’s Trichrome Stain Kit)(Cat.25088-100)進行了膠原蛋白染色(馬松三色染色(Masson’s Trichrome Stain))(第3圖)。在上述情況下，作為對照組使用移植有不包含本發明的肽的移植物的組織。

第3圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行6週的移植來在生物體內中所生成的包含於牙本質/牙髓組織-類似組織的膠原蛋白的形成水平的顯微鏡照片，A部分至C部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：A部分500μm、B部分200μm、C部分50μm)，D部分至F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)，G部分至I部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：G部分500μm、H部分200μm、I部分50μm)， J部分至L部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行6週的移植的結果(比例尺：J部分500μm、K部分200μm、L部分50μm)。

如第3圖所示，確認了如下：與移植對照組的移植物的結果相比，在移植包含本發明的肽的移植物的情況下，膠原蛋白的形成水平增加。

實施例3-3：來源於飼育6週的動物的移植組織的免疫染色分析

在上述實施例3-1中提取的各個組織中，為了對作為成牙本質細胞特異性分化標誌基因的DSP和作為成骨細胞特異性分化標誌的BSP的表達水平進行評價，進行了免疫染色分析。

大致地，將提取的組織固定於4%的多聚甲醛，並在10%的乙二胺四乙酸(pH7.4)中進行脫鈣，包埋於石蠟之後，通過使用第一次抗原以1：150稀釋的抗-DSP和抗-BSP抗體來進行免疫染色之後，利用第二次抗體進行生物素標簽的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(Vector Labs)進行免疫反應，來測定了DSP和BSP的水平(第4圖)。在上述情況下，作為對照組使用移植有不包含本發明的肽的移植物的組織。

第4圖為作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行6週的移植來在生物體內中所生成的包含於牙本質/牙髓組織-類似組織中，對作為成牙本質 細胞特異性分化標誌基因的DSP和作為成骨細胞特異性分化標誌的BSP的表達水平進行評價的結果的免疫染色照片，A部分及E部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行6週的移植的結果，B部分及F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行6週的移植的結果，C部分及G部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行6週的移植的結果，D部分及H部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行6週的移植的結果，A部分、B部分、C部分及D部分的箭頭表示在新形成的牙本質-類似組織中DSP被表達的部分，E部分、F部分、G部分及H部分的箭頭表示在新形成的骨頭類似組織中DSP被表達的部分。比例尺為50μm。

如第4圖所示，確認了如下：在移植有對照組的移植物的情況下，在新形成的牙本質/牙髓-類似組織中以低水平表達DSP(A部分)，但是在移植有包含組11或組12的肽的移植物的情況下，在新形成的石灰化的組織中相對地以非常高的水平表達了DSP(B部分及C部分)，但是在移植包含rhBMP2的移植物的情況下幾乎未表達DSP。

並且，確認了如下：在移植有包含對照組的移植物(E部分)、包含組11的肽的移植物(F部分)或包含組12的肽的移植物(G部分)的情況下，在所形成的石灰 化的組織中以低水平表達BSP，但是在移植有包含rhBMP2的移植物(H部分)的情況下，在所形成的石灰化的組織和陷入與石灰化的組織的骨細胞類似細胞中，以非常高的水平表達BSP。

實施例3-4：來源於飼育12週的動物的移植組織的形態分析

除了對移植有移植物的小鼠進行12週的飼育之外，進行上述實施例3-1的方法來評價了牙本質/牙髓組織-類似組織的水平(第5圖)。

第5圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植之後，由此在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分500μm、B部分200μm、C部分50μm)；D部分至F部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)；G部分至I部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分500μm、H部分200μm、I部分50μm)；J部分至L部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及 rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果的顯微鏡照片(J部分500μm、K部分200μm、L部分50μm)。

如第5圖所示，確認了如下：在移植後進行12週的飼育的情況下，在移植包含本發明的肽或不包含本發明的肽的移植物的情況下(A部分至I部分)，與移植之後進行6週的飼育的情況類似地，在羥基磷灰石/磷酸三鈣粒子的周邊產生牙本質-牙髓類似組織和成牙本質細胞突起，但是在移植包含rhBMP-2的移植物的情況下(J部分至L部分)，在羥基磷灰石/磷酸三鈣粒子的周邊產生在基質陷入有細胞的骨頭-類似組織和骨髓類似組織。

並且，確認了如下：與移植不包含本發明的肽的移植物的情況(A部分至C部分)相比，在移植包含本發明的肽的移植物的情況下(D部分至I部分)，形成與生物體內的類似性高的成牙本質細胞和牙本質/牙髓組織復合物。

實施例3-5：來源於飼育12週的動物的移植組織的膠原蛋白染色分析

為了確認在上述實施例3-4中提取的各個組織中膠原蛋白的蛋白質的形成水平，將上述組織作為對象利用Polysciences公司的馬松三色染色試劑盒(Masson’s Trichrome Stain Kit)(Cat.25088-100)進行了膠原蛋白染色(馬松三色染色)(第6圖)。在上述情況下，作為對照組使用移植有不包含本發明的肽的移植物的組織。

第6圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植之後，包含於在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的膠原蛋白的形成水平的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：A部分500μm、B部分200μm、C部分50μm)，D部分至F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)，G部分至I部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：G部分500μm、H部分200μm、I部分50μm)，J部分至L部分為表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：J部分500μm、K部分200μm、L部分50μm)。

如第6圖所示，確認如下：與移植對照組的移植物的結果相比，在對包含本發明的肽的移植物進行12週的移植的情況下，與進行6週的移植的情況類似地膠原蛋白的形成水平增加。

實施例3-6：來源於飼育12週的動物的移植組織的免疫染色分析

除了替代在上述實施例3-1中提取的各個組織，使用在上述實施例3-4中提取的各個組織之外，根據上述實施 例3-3的的方法來進行了免疫染色分析(第7圖)。在上述情況下，作為對照組使用移植有不包含本發明的肽的移植物的組織。

第7圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植來在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織中，對作為成牙本質細胞特異性分化標誌基因的DSP和作為成骨細胞特異性分化標誌的BSP的表達水平進行評價的結果的免疫染色照片，A部分及E部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果；B部分及F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組11的肽的移植物進行12週的移植的結果；C部分及G部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽的移植物進行12週的移植的結果；D部分及H部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果；A部分、B部分、C部分及D部分的箭頭表示在新形成的牙本質-類似組織中DSP被表達的部分；E部分、F部分、G部分及H部分的箭頭表示在新形成的骨頭類似組織中DSP被表達的部分。比例尺為50μm。

如第7圖所示，與進行6週的移植的情況類似地，在進行12週的移植的情況下，還在移植包含對照組的移植物(A部分)或rhBMP2的移植物(D部分)的情況下，在新形成的牙本質/牙髓組織-類似組織中以低水平表 達DSP，但是在移植包含組11或組12的肽的移植物(B部分及C部分)的情況下，在新形成的石灰化的組織中，相對地以非常高的水平表達DSP。

並且，確認了如下：在移植對照組的移植物(E部分)、包含組11的肽的移植物(F部分)或包含組12的肽的移植物(G部分)的情況下，在所形成的石灰化的組織中以低水平表達BSP，但是在移植包含rhBMP2的移植物(H部分)的情況下，在所形成的石灰化的組織和陷入於石灰化的組織的骨細胞類似細胞中以相對非常高的水平表達BSP。

因此，可知本發明的肽呈現促進牙本質/牙髓組織復合物再生的效果。

實施例3-7：向移植組織的成牙本質細胞的分化分析

利用掃描電子顯微鏡確認了在述實施例3-4中提取的各個組織中，包含於移植物的牙髓組織細胞是否分化為成牙本質細胞(第8圖)。在上述情況下，作為對照組使用移植有不包含本發明的肽的移植物的組織。

大致地，將上述各個組織浸漬於2.5%的戊二醛/0.1M的二甲砷酸鹽緩衝液(Cacodylate buffer)來固定30分鐘，並且在包含1%的四氧化鋨的二甲砷酸鹽緩衝液中將固定的組織浸漬1小時來進行了反應。接著，將上述組織浸漬於乙醇來進行脫水及乾燥之後，利用金塗敷乾燥的組織，並利用掃描式電子顯微鏡(日本東京日立S-4700 (S-4700，HITACHI,Tokyo,Japan))進行拍攝。

第8圖作為表示對包含牙髓組織細胞和多種成分的移植物進行12週的移植來在生物體內中所生成的牙本質/牙髓組織-類似組織的結構的掃描式電子顯微鏡照片，A部分及B部分表示對僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：A部分50μm、B部分20μm)，C部分及D部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽(序列號96)的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：C部分50μm、D部分20μm)，E部分及F部分表示對包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及rhBMP-2的比較組的移植物進行12週的移植的結果(比例尺：E部分50μm、F部分20μm)。

如第8圖所示，在移植有對照組的移植物(A部分及B部分)的情況下，在所形成的硬組織周圍中觀察到形成有成牙本質細胞突起的成牙本質細胞-類似細胞，在移植有包含本發明的肽的移植物(C部分及D部分)的情況下，根據所形成的硬組織觀察到很多數的成牙本質細胞-類似細胞，並且確認了成牙本質細胞突起也向所形成的硬組織方向擴大，但是在移植有包含rhBMP-2的比較組的移植物(E部分及F部分)的情況下，確認了呈現在所形成的硬組織的表面附著有立方形細胞的典型的成骨細胞特征。

因此，可知本發明的肽能夠更有效地形成牙本質細胞。

實施例4：在人的牙齒中牙本質或牙髓組織的再生促進及牙本質過敏癥治療用肽的效果

據已知，自然牙齒的牙本質壁及空的牙髓空間對基於牙髓細胞的牙本質/牙髓類似組織的再生創造特異性局部環境(Huang GT,et al.(2010)Tissue engineering.Part A 16(2)：605-615)。據此來評價齒根管空間中的牙本質/牙髓組織類似組織的形成。

具體地，在上述實施例3-1中製備的各個移植物中，在作為人類牙齒部分的根管空間的齒根管空間(root canal space)中，對對照組的移植物或以10μg/ml的濃度包含組12的肽(序列號96)的移植物分別進行6週的移植，將在各個移植物中形成的牙本質/牙髓組織-類似組織作為對象，根據實施例3-1的方法利用蘇木精-伊紅(H-E)進行染色，並且根據實施例3-7的方法利用掃描電子顯微鏡進行拍攝(第9圖)。

第9圖作為表示將包含本發明的肽的移植物移植到人類牙齒的牙根管之後，對由此形成的成牙本質細胞/牙髓組織-類似組織進行分析的結果的顯微鏡照片及掃描式電子顯微鏡照片，A部分及B部分表示對移植有僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物進行染色的結果(比例尺：A部分500μm、B部分50μm)，C部分、D部分及D’部分表示對移植有包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽(序列號96) 的移植物進行染色的結果，D部分為C部分的1號框的放大圖，D’部分為C部分的2號框的放大圖(比例尺：C部分500pm、D部分50μm、D’部分50μm)；E部分及F部分表示對移植有僅包含牙髓組織細胞及羥基磷灰石/磷酸三鈣的對照組的移植物利用掃描式電子顯微鏡進行拍攝的結果(比例尺：E部分50μm、F部分10μm)；G部分及H部分表示對移植有包含牙髓組織細胞、羥基磷灰石/磷酸三鈣及組12的肽(序列號96)的移植物利用掃描式電子顯微鏡進行拍攝的結果(比例尺：G部分50μm、H部分10μm)；P表示再生的牙髓組織，De表示現有的牙本質壁，DT表示現有的牙本質小管，Od表示成牙本質細胞，OP表示成牙本質細胞突起，位於D部分的箭頭表示與成牙本質細胞突起一同使成牙本質細胞-類似細胞再生。

如第9圖所示，確認了在移植有包含對照組的移植物和組12的肽的移植物的牙根管內部中均形成血管發達的牙髓組織-類似組織。

但是，在移植有包含本發明的組12的肽的移植物的情況下，成牙本質細胞-類似細胞以柵欄狀排列方式存在於現有的牙本質壁上，它們的細胞突起與增加的核一同，向現有的牙本質小管擴張，並且在現有的牙本質壁上存在形成有新的牙本質的組織(C部分、D部分及D’部分)

尤其，如掃描式電子顯微鏡照片(E部分至H部分)所示，確認了如下：與移植有對照組的移植物(E部分及F部分)的情況相比，在移植有包含組12的肽的移 植物(G部分及H部分)的情況下，成牙本質細胞-類似細胞以柵欄狀排列方式存在於現有的牙本質壁，它們的細胞突起與增加的核一同，向現有的牙本質小管擴張。

實施例5：在間接蓋髓術成犬模型中新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生的影響

為了確認在間接蓋髓術模型中，新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生的影響，評價牙本質再生能力。

具體地，為了利用間接蓋髓術確立牙本質損傷成犬模型，使用牙科用毛刺在生後12個月的成犬的小臼齒中去除齒頸部的牙釉質的一部分。根據露出牙本質的程度將牙本質削去得薄，從而確立了形成窩洞的淺窩洞模型(Shallow cavity model)及以雖然從外部可見牙髓，但是未露出於外部的狀態削去牙本質的深窩洞模型(Deep cavity model)。對上述模型進行分別處理對照組、組11的肽或組12的肽的實驗之後，3週後使成犬安樂死來拔出牙齒。

在4%的多聚甲醛中將拔出的上述牙齒固定24小時之後，利用磷酸鹽緩衝液(pH7.4)清洗數次，然後利用10%的甲酸(formic acid)進行脫鈣。利用石蠟包埋脫鈣的牙齒來製備了組織切片。組織切片而言，利用蘇木精/伊紅(H&E)染色，通過組織學分析評價了牙本質再生能力。

第10圖作為在間接蓋髓術模型中的淺窩洞模型中，以組織學的方式分析新型肽對生理性牙本質(第三 期牙本質)形成產生影響的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示在露出的牙本質部位的牙本質小管入口未塗敷任何物質的對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分500μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分為在露出的牙本質部位的牙本質小管入口塗敷組11的肽(1.5μg)的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分100μm、F部分50μm)；G部分至I部分為在露出的牙本質部位的牙本質小管入口塗敷組12的肽(1.5μg)的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分500μm、H部分100μm、I部分50μm)。P表示牙髓(pulp)，D表示牙本質(dentin)，TD表示新形成的生理性牙本質(新形成的第三牙本質(newly formed tertiary dentin))。

在對照組的損傷的牙本質部位中未呈現任何變化(第10圖的A部分-C部分)。但是在處理組11(第10圖的D部分-F部分)及組12(第10圖的G部分-I部分)的肽的組中，在存在於損傷的牙本質的現有的牙本質的下側部位中觀察到形成與現有的牙本質的成牙本質細胞突起呈現連續性的生理性牙本質(TD)。

並且，第11圖作為在間接蓋髓術模型中的深窩洞模型中，以組織學的方式分析新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生影響的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示在露出的牙本質部位的牙本質小管入口未塗敷任何物質且填充作為牙科用填充劑的玻璃離子水門汀(GI cement)(Glass Ionomer Cement,Fuji II LC,GC America Inc., Alsip,IL,USA)的對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分500μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分表示在露出的牙本質部位的牙本質小管入口塗敷組11的肽(1.5μg)且填充玻璃離子水門汀的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分100μm、F部分50μm)；G部分至I部分為表示在露出的牙本質部位的牙本質小管入口塗敷組12的肽(1.5μg)且填充玻璃離子水門汀的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分500μm、H部分100μm、I部分50μm)。P表示牙髓(pulp)，D表示牙本質(dentin)，TD表示新形成的生理性牙本質(新形成的第三牙本質)。

在深的窩洞模型中還觀察到與淺的窩洞模型類似的結果。在對損傷的牙本質部位處理作為牙科用填充材料的玻璃離子水門汀的對照組中未呈現任何變化(第11圖的A部分-C部分)。但是，在同時處理組11(第11圖的D部分-F部分)、組12(第11圖的G部分-I部分)的肽及玻璃離子水門汀的處理組中，在存在於損傷的牙本質的現有的牙本質的下側部位中觀察到形成與現有的牙本質的成牙本質細胞突起呈現連續性的生理性牙本質(TD)。

實施例6：在直接蓋髓術成犬模型中新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生的影響

為了確認在直接蓋髓術模型中，新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生的影響，評價牙本質再生能力。

具體地，為了利用直接蓋髓術確立牙本質 損傷成犬模型，使用牙科用毛刺在生後12個月的成犬的小臼齒中去除齒頸部的牙釉質和牙本質，從而使牙髓向外露出。對上述模型進行分別處理對照組、組11的肽或組12的肽的實驗之後，3周後使成犬安樂死來拔出牙齒。

在4%的多聚甲醛中將拔出的上述牙齒固定24小時之後，利用磷酸鹽緩衝液(pH7.4)清洗數次，然後利用10%的甲酸(formic acid)進行脫鈣。利用石蠟包埋脫鈣的牙齒來製備了組織切片。組織切片而言，利用蘇木精/伊紅(H&E)染色，通過組織學分析評價了牙本質再生能力。

第12圖作為在直接蓋髓術模型中，以組織學的方式分析新型肽對生理性牙本質(第三期牙本質)形成產生影響的顯微鏡照片，A部分至C部分為表示在露出的牙髓部位未塗敷任何物質且填充玻璃離子水門汀的對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：A部分200μm、B部分100μm、C部分50μm)；D部分至F部分為表示在露出的牙髓部位未塗敷任何物質且利用作為牙科用修復材料的礦物三氧化物凝聚體(Mineral trioxide aggregate,ProRoot MTA,Dentsply Tulsa Dental,Tulsa,OK,USA)密封之後利用填充玻璃離子水門汀覆蓋的陽性對照組的結果的顯微鏡照片(比例尺：D部分500μm、E部分200μm、F部分50μm)；G部分至I部分為表示在露出的牙髓部位塗敷組11的肽(1.5μg)且利用礦物三氧化物凝聚體密封之後利用填充玻璃離子水門汀覆蓋的結果的顯微鏡照片(比例尺：G部分 200μm、H部分100μm、I部分50μm)，J部分至L部分為表示在露出的牙髓部位塗敷組12的肽(1.5μg)且利用礦物三氧化物凝聚體密封之後利用填充玻璃離子水門汀覆蓋的結果的顯微鏡照片(比例尺：J部分500μm、K部分100μm、L部分50μm)。D表示牙本質(dentin)，OD表示骨性牙質(osteodentin)，TD表示新形成的生理性牙本質(新形成的第三牙本質)。

在處理玻璃離子水門汀的對照組中在損傷的牙本質的牙髓部位中未呈現任何變化(第12圖的A部分-C部分)。礦物三氧化物凝聚體為當前在牙本質形成及再生中廣泛使用的牙科用修復材料。但是，眾所周知，由礦物三氧化物凝聚體製備的硬組織的細胞包埋於石灰化的組織，並且呈現未觀察到作為牙本質的重要結構要素的牙本質小管，呈現出與骨頭類似的骨性牙質的形態。在本結果中在處理礦物三氧化物凝聚體的組中，還觀察到如下：沿著殘留於露出的牙髓的上側和下側部位的現有牙本質，細胞包埋於石灰化的組織的骨性牙質(OD)的形態(第12圖的D部分-F部分)。但是與礦物三氧化物凝聚體一同處理組11(第12圖的G部分-I部分)和組12(第12圖的J部分-L部分)的肽的組中，沿著殘留於露出的牙髓的上側和下側部位的現有牙本質，形成與現有牙本質的成牙本質細胞突起呈現連續性的新的生理性牙本質(TD)。

綜合上述實施例的結果，可知如下：本發明中提供的肽是作為成牙本質細胞特異性分化標誌基因的 牙本質涎磷蛋白、Dmp1及Nestin基因的表達水平增加，並且在與牙髓組織細胞一同移植於生物體的情況下，促進成牙本質細胞的形成，尤其，在移植於牙根管空間的情況下，呈現促進使上述牙髓組織細胞形成為牙本質/牙髓組織-類似組織。並且，可知如下：由新型肽形成與人的自然牙齒牙本質中可觀察到的相同的生理性牙本質。

因此，可知在本發明中提供的肽可使用於治療牙本質疾病或牙髓疾病。

此研究為基於2017年度產業通商資源部及產業技術評價管理院(KEIT)研究費支援的研究(‘10078369’)。

<110> 海森斯柏奧股份有限公司(HYSENSBIO CO.,LTD.)

<120> 新型肽及包含其之醫藥組合物、醫藥外品組合物及保健功能性食品組合物

<130> KPA161103-KR

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<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 88

<210> 89

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 89

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 90

<210> 91

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 91

<210> 92

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 92

<210> 93

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 93

<210> 94

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 94

<210> 95

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 95

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 新型肽

<400> 96

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 97

<210> 98

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 98

<210> 99

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 99

<210> 100

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 100

<210> 101

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 101

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 102

<210> 103

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 103

<210> 104

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 104

Claims (9)

1. 一種醫藥組合物，用於預防或治療牙本質疾病或牙髓疾病，包含肽，其中，上述肽係由SEQ ID NO：1至96的任何胺基酸序列所組成。
2. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其中，上述醫藥組合物包含由上述肽重複連接而成的多肽。
3. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其中，上述醫藥組合物包含呈現牙本質疾病或牙髓疾病治療效果的藥物與上述肽相結合的復合物。
4. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其中，上述醫藥組合物還包含藥學上接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
5. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組合物，其中，上述牙本質疾病或牙髓疾病為牙本質過敏癥、牙髓充血、牙髓炎、牙髓變性或牙髓的壞死及壞疽癥。
6. 一種醫藥外品組合物，用於預防或改善牙本質疾病或牙髓疾病，包含肽，其中，上述肽係由SEQ ID NO：1至96的任何胺基酸序列所組成。
7. 如申請專利範圍第6項所述的醫藥外品組合物，其中，上述醫藥外品組合物為口腔用消毒清潔劑、口腔清潔用品、牙膏、牙線或口腔用軟膏劑。
8. 一種保健功能性食品組合物，用於預防或改善牙本質疾病或牙髓疾病組合物，包含肽，其中，上述肽係由SEQ ID NO：1至96的任何胺基酸序列所組成。
9. 如申請專利範圍第8項所述的保健功能性食品組合物，其中，上述保健功能性食品組合物用於製備飲料、茶類、香辛料、口香糖類或餅乾類。

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