KR101212548B1 - 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한 융기를 향한 치관 소낭 줄기세포 및 치근을 향한 치관 소낭 줄기세포와 개방된 치근단(opened root apex)을 별도로 갖춘 치아에서 분리한 치근 소낭 줄기세포를 분리하여 그의 특성을 치아 바이오공학의 세포 공급원으로 보고된 바 있는 치수 줄기세포의 특성과 비교한 결과 콜로니 형성 및 증식능이 우수하며 분화능을 가진 새로운 중간엽 줄기세포임을 확인하고 이들의 최적 성장을 위한 배양 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 치소낭 유래의 치아 줄기세포는 종래에 효과적인 공급원으로 알려진 치수 줄기세포에 비해 손상된 치아 조직의 수복 및 재생에 있어 더 높은 활용 가치가 있다.

치소낭, 치아 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 콜로니형성

Description

새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법{Novel dental stem cells from tooth follicles and the method for culturing them}

본 발명은 새로운 치소낭 유래의 치아 줄기세포 및 그의 배양 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한 융기를 향한 치관 소낭 줄기세포 및 치근을 향한 치관 소낭 줄기세포와 개방된 치근단(opened root apex)을 별도로 갖춘 치아에서 분리한 치근 소낭 줄기세포 및 그의 최적 성장을 위한 배양방법에 관한 것이다.

줄기세포는 조혈모계, 신경계, 장, 생식선, 피부, 후각 상피 및 치아를 포함한 여러 척추동물 조직에 존재한다. 통상적으로 줄기세포는 자가-재생력을 가지고 분화된 자손을 초래하는 세포로 정의된다. 또한, 치아로 구성된 치아 조직에서 분리한 치아 줄기세포의 발견은 치과 생물학의 최근 약진이다. 상피-간엽 상호작용 과정을 통해 발달된 치아는 법랑질, 상아질, 백악질 및 치수로 이루어져 있다. 치아는 발달 각 단계의 시기와 공간에서 조절되는 형태 형성 및 분화의 독특한 특성 을 가지고 있다. 치아 조직의 속성이 각 발달 단계에 따라 상이하므로 미성숙 치아와 성숙 치아로부터의 줄기 세포의 동정과 분리를 명확하게 하고 비교하는 것이 중요하다. 더욱이 전구세포/줄기세포가 대부분의 조직 형태의 연속적인 유지 및 수복과 관련이 있다는 것은 주지의 사실이다. 그러나 치아 발달과 전문화된 여러 치아-관련 세포 형태에 관해 널리 알려져 있음에도 불구하고, 후천적 유기체에 존재하는 세포군의 전구체의 특성 및 속성에 대하여 거의 알려지지 않았다.

일반적으로 치아는 순차적이고 상호적인 상피-간엽 상호작용이 신호 전달 경로를 통한 개시, 형태발생, 초기 상아질 형성 및 세포 분화를 조절하는 외배엽 기관으로서 발달한다. 형태학상 치아 발달은 상피 출아(bud)로 자라는 치판(dental lamina) 형성으로 시작한다. 출아 단계 이후, 상피 조직은 모자(cap)와 종(bell) 단계에서 특정한 주름이 형성된다. 종 후기 단계에서, 치아 줄기세포가 상피-간엽 경계면을 향하는 융기(cusp) 표면의 간엽세포, 상아질을 이루는 전상아질모세포(preodontoblast) 및 상아질모세포(odontoblast)로 분화한다. 치관은 종 후기 단계에 상피로 덮인다. 치관이 형성된 후 치근 발달이 일어나고 완전한 치아가 난다. 치아발달의 형태학적 단계-출아, 모자, 종 및 말단 분화-는 수십년간 알려져 있지만 치근 발달에 관한 뚜렷한 과정은 알려진 바 없다.

이에 본 발명자들은 치근 발달과 치근 재생을 조사하던 중 치관만을 갖춘 미성숙 치아와 개방된 치근단(opened root apex)을 별도로 갖춘 치아의 새로운 소낭 조직을 발견하고 이로부터 치아 줄기세포를 분리하여 속성을 확인한 결과 콜로니 형성 및 증식능이 우수하며 분화능을 가지고 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하 였다.

본 발명의 목적은 우수한 콜로니 형성능, 증식능 및 분화능을 가진 새로운 치소낭 조직 유래의 치아 줄기세포 및 그의 최적 배양 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 융기를 향한 치관 소낭(crown follicle toward cusp, CCF), 치근을 향한 치관 소낭(crown follicle toward root, CRF) 또는 치근 소낭(root follicle, RPF)으로부터 분리한 치아 줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 성인 치아로부터 융기를 향한 치관 소낭, 치근을 향한 치관 소낭 또는 치근 소낭 조직을 분리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 소낭 조직을 분해하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 분해물을 여과하는 단계를 포함하는 융기를 향한 치관 소낭, 치근을 향한 치관 소낭 또는 치근 소낭 유래의 치아 줄기세포 분리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 치소낭 유래의 치아 줄기세포의 최적 성장을 위한 배 양 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 새로운 치소낭 조직 유래의 치아 줄기세포를 제공한다.

본 발명자는 성인의 세 번째 어금니에서 치관만을 갖춘 미성숙 치아와 개방된 치근단(opened root apex)을 별도로 갖춘 치아에서 새로운 소낭 조직을 발견하고 임의로 전자 소낭 조직을 치관부와 치근부로 나누고 융기를 향한 치관 소낭(crown follicle toward cusp, CCF) 및 치근을 향한 치관 소낭(crown follicle toward root, CRF)으로 각각 명명하였다. 후자 소낭 조직은 치근 소낭으로 명명하였다(root follicle, RPF). 이들로부터 치아줄기세포를 분리하여 그의 특성을 치아 바이오공학의 세포 공급원으로 보고된 바 있는 치수 줄기세포(dental pulp stem cells, DPSCs)의 특성과 비교하였다.

줄기세포 속성을 확인하기 위해 집락형성 분석법(clonogenic assay), 면역조직화학법, 지방세포 생성 및 석회화를 이용하였다. 조직 재생능을 측정하기 위해 인간 CCFSCs(crown follicle toward cusp stem cells, 융기를 향한 치관 소낭 줄기세포), CRFSCs(crown follicle toward root stem cells, 치근을 향한 치관 소낭 줄기세포), RPFSCs(root follicle stem cells, 치근 소낭 줄기세포) 및 DPSCs(dental pulp stem cells, 치수 줄기세포)를 면역저하 마우스(n=12)에 이식하였다.

먼저 집락형성 분석법과 STRO-1 분자의 발현 확인을 위한 면역조직화학법을 수행하여 본 발명의 치소낭 유래 치아 줄기세포가 줄기성(stemness)을 유지함을 확 인하였다. 배양시 연속 계대에 따른 다능성 유지는 세포 및 유전자 치료를 위한 증식된 치아 줄기세포의 이용에 있어 중요한 의미를 갖는다. 계대가 반복될 때 STRO-1 양성 세포는 상기 모든 치소낭 줄기세포에 있는 것으로 발견되었다. 또한 치소낭 유래 치아 줄기세포(CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs)가 DPSCs보다 다음 계대에서 콜로니 형성하고 증식하는 능력이 현저히 우수하였다. 구체적으로 기술하면 DPSCs에 비해 상기 치소낭 유래 치아 줄기세포는 동일수의 초기 부하 세포(initial loading cells)에 대해 2배 이상의 콜로니를 형성하였다.

더욱이, 본 발명의 치아 줄기세포가 조골세포와 같은 다른 세포 계통으로 분화하는 능력이 있는지를 평가하기 위해 석회화한 결과 CCFSCs 침전물이 접착층위로 드문드문 산재되어 있는 반면, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs는 유도 3주후에 층 전반에 걸쳐 더욱 광물화된 결절과 석회화된 침전물을 형성하였다. CCFSCs는 산재되어 있는 석회화된 결절을 형성하지만 미성숙 치아의 CCFSCs와 CRFSCs는 RPFSCs에 비해 더 빠르게 광물화된 매트릭스를 형성하였다. 따라서 조직원에 따라 분화 양상이 상이하긴 하지만 본 발명의 모든 치아 줄기세포가 조골세포와 같은 다른 세포 계통으로 분화할 수 있음을 알 수 있다.

또한, CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs가 지방세포로 분화하는 능력을 조사하기 위하여 21일 동안 이들 세포군을 배양하고 지방세포 유도 배지로 교환하였다. 배양된 CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs는 오일 레드 O 양성 지질 덩어리로 발달하였다. 14일 후에 지질 액포(vacuoles)가 발견되었고, 세포 크기와 지질 액포수가 CCFSCs, CRFSCs에서 증가하였고 RPFSCs 및 DPSCs에서 지방세포 형성 유도 21일째에 더 적은 지질 액포가 존재하였다. 이는 CCFSCs와 CRFSCs가 발달 과정에 있는 조직이기 때문이다. 따라서 이들이 치수 및 치근 형태 형성과 전반적인 치아 형성에 더욱 활동적인 잠재효과를 가질 것이다.

또한, CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs가 기능적인 백악질모포(cementoblast)/조골세포로 분화하는 능력을 입증하기 위하여, 생체외 증식된 다양한 치소낭 줄기세포 및 DPSCs를 HA/TCP 파우더로 결합하여 면역저하 마우스에 이식하였다. 그 결과 치소낭 줄기세포는 생체 내에서 DSPCs가 하는 바와 같이 이식 후 6 내지 12주 후에 HA/TCP 입자 표면을 따라 상아질/치수-유사 복합체를 생성하였다. 또한 이식된 치아 줄기세포는 새롭게 형성된 백악질-유사 구조와 함께 상당한 양의 콜라겐 섬유질을 생성하였다. 이들 섬유아세포-유사 세포가 이차 이식에서 상아질 형성에 관여하는 더욱 원시적인 예비세포(primitive reserve cells)군에 속할 수 있다. 이러한 전구세포는 현재 사용하고 있는 치수 복조술(pulp capping treatment)과 같은 비가역적 신경치료(irreversible endodontic treatment)대신에 치수 조직의 재생능에 근거한 치료법을 개발할 수 있다. 한편, RPFSCs 및 CRFSCs는 다량의 백악질/치수-유사 조직을 생산함으로 치소낭 줄기세포의 사용은 백악질, 상아질 및 상단 치수 재생을 도울 것이라 생각된다. 종래 연구는 BMSSCs(Bone marrow derived stromal stem cells)가 또한 생체 내 이식 후에 신경-유사 세포로 분화할 수 있음을 증명하였다. 또한 치수 세포는 신경영양성 인자(neurotrophic factors)를 생산하고 척수 손상 후 운동뉴런을 치유하는 것으로 알려져 있다. 이들 증거는 비신경성 조직의 줄기세포가 신경 세포로 분화할 수 있다는 견해를 지지한 다. 따라서 치소낭 줄기세포가 신경능 세포(neural crest cell) 기원과 관련이 있음을 알 수 있다. 신경능 세포는 태아 발달에 중요한 역할을 하여 신경 세포, 색소 세포, 평활근, 두개안면 연골 및 뼈 등의 다양한 세포 형태를 초래한다.

상기의 결과로 본 발명의 새로운 치소낭 조직 유래의 치아 줄기세포가 광범위하게 증식하고 다능적으로 분화하는 후천적 줄기세포임을 알 수 있다.

줄기세포는 그들 집단의 생산 및 유지에 관여하지만 성인 조직에서 얻은 많은 줄기세포는 시험관내에서는 불충분하다. 실용적인 면에서 이들 소량의 줄기세포는 임상 적용에 한계가 있다. 또한 치아 재생 및 공학을 위한 증식과 분화 능력을 시험하여 다수의 줄기세포를 분리하여 이들 집단을 확보하는 것이 중요하다. 일반적으로 이들 치소낭 줄기세포는 증식능을 소실할 때까지 그들의 줄기세포 속성을 유지한다. 이들 치아 줄기세포의 축적된 총수는 장기의 배양 증식 동안에 감소하지만, 세포가 계대될 때 증식능(expandability)은 유지되었다. 치소낭 줄기세포는 DPSCs보다 다음 계대에서 콜로니를 형성하고 증식하는 것이 현저히 뛰어났다. 이러한 상황에서 치소낭에서 회수된 새로운 치아 줄기세포는 임상 적용에 충분한 적격과 가치를 가지며 본 발명에서 사용된 CCFSCs, CRFSCs 및 RPFSCs는 재생 치료에 유용한 자원으로 활용할 수 있는 DPSCs를 능가하는 줄기세포군을 의미할 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 성인 치아로부터 융기를 향한 치관 소낭, 치근을 향한 치관 소낭 또는 치근 소낭 조직을 분리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 소낭 조직을 분해하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 분해물을 여과하는 단계를 포함하는 융기를 향한 치관 소낭, 치근을 향한 치관 소낭 또는 치근 소낭 유래의 치아 줄기세포 분리 방법을 제공한다.

치관만을 가지고 있는 미성숙 치아의 소낭 조직으로부터 융기를 향한 치관 소낭(CCF, crown follicle toward cusp) 및 치근을 향한 치관 소낭(CRF, crown follicle toward root)을 분리한다. 또한 개방된 치근단이 있는 치아에서 치근 소낭(RPF, root follicle)을 분리한다. 이들 조직을 1~10 mg/ml 콜라게나제 타입 Ⅰ 및 1~10 mg/ml 디스파제 용액에서 37℃, 2시간 이하, 바람직하게는 2~5 mg/ml 콜라게나제 타입 Ⅰ 및 2~5 mg/ml 디스파제 용액에서 37℃, 1 시간을 분해한다. 그런 다음 70㎛ 세포 여과체(Falcon, BD Labware, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)에 세포를 통과시킨 후 본 발명의 치소낭 유래 줄기세포의 단일 세포 현탁액을 얻는다.

또한, 본 발명은 상기 치소낭 유래의 치아 줄기세포의 최적 성장을 위한 배양 방법을 제공한다.

바람직하게 본 발명의 배양방법은 20% FCS(태아소혈청), 50~200 μM 아스코르브산, 1~10 mM/L 글루타민, 50~200 U/ml 페니실린 및 50~200 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 알파-MEM 배지, 바람직하게는 20% FCS, 150~200 μM 아스코르브산, 2~5 mM/L 글루타민, 80~120 U/ml 페니실린 및 80~120 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 알파-MEM 배지, 가장 바람직하게는 20% FCS, 200 μM 아스코르브산, 2 mM/L 글 루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 알파-MEM 배지에서 융기를 향한 치관 소낭 줄기세포(CCFSCs) 및 치근을 향한 치관 소낭 줄기세포(CRFSCs)를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 치소낭 유래의 줄기세포는 치아 바이오공학의 세포 공급원으로 보고된 바 있는 치수 줄기세포(dental pulp stem cells, DPSCs)에 비하여 우수한 콜로니 형성능, 증식능 및 분화능을 갖는 새로운 치아 중간엽 줄기세포로 손상된 치아 구조를 수복하고 치수 또는 상아질 재생을 유도하고 치주 질환을 치료하거나 임상 적용을 향상시킬 수 있는 줄기세포로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포 배양

대한민국, 서울, 서울대학교 치과병원에서 충분히 통지한 후 동의를 얻어 12명의 성인(18~35 살)으로부터 뽑아낸 정상적인 사람의 세 번째 어금니를 회수하였다. 실험과정은 병원의 임상시험심사위원회(IRB: Institutional Review Board)에 의해 승인되었다. CCF(crown follicle toward cusp) 및 CRF(crown follicle toward root)를 치관만을 가지고 있는 미성숙 치아의 소낭 조직으로부터 분리하였다. 개방된 치근단이 있는 치아에서 분리한 치근 소낭(RPF)을 치근 상아질에 붙어있는 부분에서 외과용 메스로 제거하였다. 멸균된 치과용 피서 버(fissure burs)로 백악-법랑 경계부(cemento-enamel junction)주위를 절단하여 드러난 치수실에서 치수를 분리하였다. 이들 조직을 3 mg/ml 콜라게나제 타입 Ⅰ 및 4 mg/ml 디스파제 용액에서 37℃, 1시간 동안 분해하였다. 70㎛ 세포 여과체(Falcon, BD Labware, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)에 세포를 통과시킨 후 단일 세포 현탁액을 얻었다.

줄기세포를 동정하기 위해, 단일세포 현탁액(1×10⁴ 세포)을 10% 태아소혈청(FCS:Gibco BRL), 100 μM/L 아스코르브산 2-포스페이트(Sigma, St. Louis, MO), 2 mM/L 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 첨가된 알파 변형의 Eagle's 배지(알파-MEM, GIBCO BRL, Carlsbad, CA, USA)를 첨가한 100-mm dish(NUNC, Denmark)에 분주한 후, 37℃, 5% 이산화탄소에서 배양하였다.

콜로니 형성 효율을 측정하기 위해, 배양 10일째 70% 에탄올로 고정한 후 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 50 이상의 세포 집합체를 콜로니로 하였다. 배양 4, 7 및 10일째 줄기세포 증식율을 MTT 엣세이로 측정하였다.

그 결과 분리된 치소낭 줄기세포는 섬유아세포 유사 세포의 형태를 나타냈다. 또한, 치소낭 줄기세포(CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs)가 이전에 보고된 DPSCs보다 다음 계대에서 콜로니를 형성하고 증식하는 능력이 확실히 뛰어남을 보여준다. 소낭 유래 세포가 접착 콜론원성 세포 덩어리를 형성하는 능력은 저밀도에서 배양된 1,000 단일 세포에서 생성된 약 100-170 단일 콜로니 형성에 의해 증명된다. DPSCs에 비해, 소낭 유래 줄기세포는 동일수의 초기 부하 세포(initial loading cells)에 대해 2배 이상의 콜로니를 형성하였다. 또한 분리된 치아 줄기세포군의 콜로니는 10 계대를 넘어 쉽게 관찰되었다.

<실시예 2> 면역조직 화학법

광범위한 계대배양 이후에서도 줄기세포가 존재함을 증명하기 위하여 주지의 중간엽 줄기세포 마커인 STRO-1을 이용하여 면역조직화학을 수행하였다. STRO-1세포는 처음에 골수에서 분리된 콜로니 형성 골원성의 전구체로 동정되었다.

CCF, CRF, RPF 및 치수에서 분리된 추정 줄기세포를 투 챔버 슬라이드(2×10⁴ 세포/웰; NUNC, Denmark)에 분주하여 24시간 배양하였다. 인산염 완충식염수(PBS, pH 7.4)로 세척하고 2% ρ-포름알데히드로 15분간 고정한 후, 시료를 STRO-1 항체(1:200, R&D 시스템 인코포레이션, Minneapolis, MN, USA)로 3시간 반응시켰다. 그런 다음 세포를 항 마우스 IgG-Cy3의 염소 2차 항체(Zymed Laboratories, Carlsbad, CA, USA)로 1시간 반응시킨 후, 핵을 DAPI(1 ㎍/ml)로 30분간 염색하였다.

그 결과, 계대가 반복될 때 중간엽 줄기세포 표식인자인 STRO-1가 상기 모든 치소낭 줄기세포에서 발현되었다.

<실시예 3> 지방세포로의 분화

지방세포 분화를 위해, 5×10⁴ 세포를 60-mm 디쉬에 분주하여 최적의 배양 배지에서 3일간 배양하였다. 배지를 1　μM 덱사메타손, 0.1 mM 인도메타신, 0.5 mM 이소부틸메틸잔틴 및 10 μM 인슐린이 첨가된 최적의 배양 배지인 지방세포 배지(adipogenic culture)로 대체하였다. 지방세포 배지를 70% 에탄올에서 10 분간 고정하고 새로운 Oil Red-O 용액(시그마)으로 30분간 염색하였다.

그 결과, 배양된 CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs는 오일 레드 O 양성 지질 덩어리로 발달하였다. 14일 후에 지질 액포(vacuoles)가 발견되었고, 세포 크기와 지질 액포수가 CCFSCs, CRFSCs에서 증가하였으며 RPFSCs 및 DPSCs에서 지방세포 형성 유도 21 일째에 더 적은 지질 액포가 존재하였다.

< 실시예 4> 석회화

석회화를 위해, 1×10⁴ 세포를 60-mm 디쉬에 분주하여 최적의 배양 배지에서 3일간 배양하였다. 그런 다음 미네랄 형성을 유도하기 위해 5 mM β-글리세롤포스페이트 및 10 nM 덱사메타손(시그마)를 첨가한 최적의 배양 배지에서 배양하였다. 배양 3주 동안 결절 형성(nodule formation)을 관찰하였다. 광물화된 배지를 70% 에탄올로 10분간 고정하고, 50 rpm 진탕 인큐베이터에서 40mM 알리자린 레드(pH 4.2)로 30분간 염색하였다.

CCFSCs 침전물이 접착층 위로 드문드문 산재되어 있는 반면, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs는 유도 3 주후에 층 전반에 걸쳐 더욱 광물화된 결절과 석회화된 침전물을 형성하였다. CCFSCs는 산재되어 있는 석회화된 결절을 형성하지만 미성숙 치아의 CCFSCs와 CRFSCs는 RPFSCs와 DPSCs에 비해 더 빠르게 광물화된 매트릭스를 형성하는 능력을 가지고 있었다. 또한, 동일한 기간에 CCFSCs와 CRFSCs의 지질 액포수가 RPFSCs와 DPSCs보다 훨씬 더 많았다. 이는 CCFSCs와 CRFSCs가 발달 과정에 있는 조직이기 때문이다

< 실시예 5> 조직 재생능을 측정하기 위한 이식

CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs 및 DPSCs가 기능적인 백악질모포(cementoblast)/조골세포로 분화하는 능력을 입증하기 위하여, 생체외 증식된 다양한 치소낭 줄기세포 및 DPSCs를 HA/TCP 파우더로 결합하여 면역저하 마우스에 이식하였다. HA/TCP는 그들의 생체적합성 때문에 뼈 대체물로 전세계적으로 성공적으로 사용되고 있다. 약 5×10⁶ 세포의 CCFSCs, CRFSCs 및 RPFSCs(제 3 계대)를 50 mg HA/TCP 세라믹 파우더(Zimmer, Warsaw, IN, USA)로 혼합한 후 전술한 바와 같이 6주령의 면역저하 베이지 마우스(NIH-bg-nu-xid, Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN, USA)의 등 표면에 피하 이식하였다. 동일한 수의 시험관내 증식된 DPSCs를 대조군으로 하였다. 이들 과정은 승인된 소동물 프로토콜(서울대학교 실험동물자원 연구소 SNU050512-11)의 명세서에 따라 수행되었다. 이식세포 이식후 6 내지 12주에 회수하여 4% 포르말린으로 고정하고, 10 % EDTA 완충액(pH 8.0)으로 석회질을 제거한 후 파라핀에 끼워 넣었다. 파라핀 블록은 5 μm로 분획하고 파라핀을 제거한 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다.

그 결과, 치소낭 줄기세포는 생체내에서 DSPCs가 하는 바와 같이 이식후 6 내지 12주 후에 HA/TCP 입자 표면을 따라 상아질/치수-유사 복합체를 생성할 수 있다. 각각의 픽셀에 포함된 색깔 정보를 적용한 포토샵에 기초한 이미스 분석을 이용하여 조직 표면을 덮고 있는 상아질/치수-유사 구조를 측정하였다. 이식 후 12주가 된 PAFSCs 이식체의 생체 내 발달 능력이 전체면의 20.9%를 차지하였고 별개의 조직으로 발달하는 능력이 현저히 우수하였다. 기타 치아 줄기세포 이식체-CCFSCs, CRFSCs 및 DPSCs는 각각 전체 공간의 2.06%, 10.7% 및 7.65%를 차지하였다. 이식된 모든 치아 줄기세포는 치수 구조와 유사한 응축된 희귀 세포(sparse cells)와 함께 콜라겐 섬유를 생성하였다.

< 실시예 6> 최적의 배양 조건

CCF, CRF, RPF 및 치수의 단일세포 현탁액(1×10³ 세포/웰)을 배지가 첨가된 96-웰 배양 플레이트(NUNC, Denmark)에 접종하였다. 배양 조건을 최적화하기 위해, 세 가지 형태의 배지를 이용하였다: 2 mmol/L 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco BRL)이 첨가된 RPMI, DMEM 및 알파-MEM. 소혈청 또는 태아소혈청(FCS:Gibco BRL)을 10 % 또는 20 % 농도로 첨가하고 아스코르브산의 상이한 농도를 테스트하였다(0, 50, 100 및 200 μM). 배지는 2-3일 간격으로 교환하였다.

CCFSCs 및 CRFSCs는 20% FCS, 200 μM 아스코르브산, 2 mM/L 글루타민, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 알파-MEM 배지에서 최적의 성장을 보였다. CCFSCs, CRFSCs, RPFSCs와 DPSCs를 비교한 결과 치소낭 유래 줄기세포가 더 높은 증식률과 더 많은 수의 군 배가(population doublings)를 보였다.

한편, RPFSCs 및 DPSCs는 Jo 등¹⁸ 에 의해 기술된 최적의 배양 조건에 따라 배양하였다(Jo YY, Lee HJ, Kook SY, Choung HW, Park JY, Chung JH, Choung YH, Kim ES, Yang HC, Choung PH. Isolation and characterization of postnatal stem cells from human dental tissues. Tissue Eng 2007 13: 767-73.)

Claims (17)

1. 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한, 융기 방향에 존재하는 치관 소낭(crown follicle toward cusp, CCF) 또는 치근 방향에 존재하는 치관 소낭(crown follicle toward root, CRF), 또는 개방된 치근단(opened root apex)을 별도로 갖춘 치아에서 분리한 치근 소낭(root follicle, RPF) 유래의 치아 줄기세포.
2. 제 1항에 있어서, 중간엽 줄기세포의 표식인자인 STRO-1을 발현하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
3. 제 1항에 있어서, 동일수의 초기 부하 세포(initial loading cells)를 배양할 경우 치수 줄기세포(DPSCs)에 비해 2배 이상의 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
4. 제 1항에 있어서, 10 계대 이상 콜로니를 형성하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
5. 제 1항에 있어서, 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한, 융기 방향에 존재하는 치관 소낭 또는 치근 방향에 존재하는 치관 소낭 유래의 줄기세포가 개방된 치근단을 별도로 갖춘 치아에서 분리한 치근 소낭 유래의 줄기세포에 비해 미네랄 형성 유도 배지에서 더 빠르게 광물화된 매트릭스를 형성하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
6. 제 5항에 있어서, 미네랄 형성 유도 배지는 치아 줄기세포 배양 배지에 1~10 mM 베타-글리세롤포스페이트 및 1~50 nM 덱사메타손을 첨가하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
7. 제 1항에 있어서, 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한, 융기 방향에 존재하는 치관 소낭 또는 치근 방향에 존재하는 치관 소낭 유래의 줄기세포가 개방된 치근단을 별도로 갖춘 치아에서 분리한 치근 소낭 유래의 줄기세포보다 지방세포 형성 유도 배지에서 지질 액포가 많이 형성되는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
8. 제 1항에 있어서, 배양에 의해 백악질모세포(cementoblast), 상아질모세포(odontoblast), 조골세포, 지방세포, 신경세포, 색소 세포, 평활근, 두개안면 연골 또는 뼈의 다양한 세포 형태로 분화되는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
9. 제 1항에 있어서, 면역저하 마우스에 이식할 경우 상아질 또는 치수 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
10. 제 1항에 있어서, 손상된 치아 구조 수복, 치수 또는 상아질 재생 또는 치주 질환 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포.
11. 1) 성인 치아로부터 치관만을 갖춘 미성숙 치아 또는 개방된 치근단을 별도로 갖춘 치아를 분리하는 단계;

    2) 상기 단계 1)의 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 융기 방향에 존재하는 치관 소낭 또는 치근 방향에 존재하는 치관 소낭 조직을 분리하거나, 또는 개방된 치근단을 별도로 갖춘 치아에서 치근 소낭 조직을 분리하는 단계;

    3) 상기 단계 2)의 소낭 조직을 분해하는 단계; 및

    4) 상기 단계 3)의 분해물을 여과하는 단계를 포함하는, 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한, 융기 방향에 존재하는 치관 소낭 또는 치근 방향에 존재하는 치관 소낭, 또는 개방된 치근단을 별도로 갖춘 치아에서 분리한 치근 소낭 유래의 치아 줄기세포의 분리 방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. 제 11항에 있어서, 1~10 mg/ml 콜라게나제 타입 Ⅰ 및 1~10 mg/ml 디스파제 용액에서 37℃, 2시간 이하 소낭을 분해하는 것을 특징으로 치아 줄기세포 분리 방법.
15. 제 11항에 있어서, 세포 여과체에 세포를 통과시킨 후 단일 세포 현탁액을 얻는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포 분리 방법.
16. 20% FCS(태아소혈청), 50~200 μM 아스코르브산, 1~10 mM/L 글루타민, 50~200 U/ml 페니실린 및 50~200 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 알파-MEM 배지에서 치관만을 갖춘 미성숙 치아에서 분리한, 융기 방향에 존재하는 치관 소낭 또는 치근 방향에 존재하는 치관 소낭 유래의 줄기세포를 배양하는 방법.
17. 제 1항의 치아 줄기세포에 1~10 mM 베타-글리세롤포스페이트 및 1~50 nM 덱사메타손을 첨가하는 것을 특징으로 하는 치아 줄기세포의 미네랄 형성 유도 방법.