CN117157308A - 细胞穿膜肽变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞穿膜肽变体的伤口愈合用途，本发明的细胞穿膜肽具有提高细胞穿透、细胞增殖、细胞迁移及血管形成的效果，因此可以将其用作细胞穿透转运、伤口治愈及血管生成促进等用途，尤其，治疗顽固性糖尿病性伤口(溃疡)的效果优秀，因此可以有效用作伤口愈合用途。
Description
技术领域
本发明涉及细胞穿膜肽变体的伤口愈合用途。
背景技术
高等动物的细胞具有区分细胞内与外的细胞膜(plasma membrane)，起到彻底区分细胞间的物质移动的作用。细胞膜由磷脂双层(phospholipid bilayer)构成，由于这些脂质双层(lipid bilayer)所具有的疏水性，大部分肽、蛋白质、核苷酸、脂质体等几乎无法移动到细胞内。因此，可以说细胞膜在肽、蛋白质、化合物制剂药物或基因治疗剂移动到细胞内的过程中起到屏障的作用。为了克服这一问题，多使用阳离子脂质(cationic lipid)或聚乙烯亚胺(PEI，polyethyleneimine)，或者使用病毒载体(viral vector)或电穿孔法(electroporation)等方法。然而，这些方法因效率低、可应用的细胞受限、细胞内毒性等原因而具有局限性(Lindsay MA(2002)Peptide-mediated cell delivery：application inprotein target validation.Curr Opin Pharmacol 2：587-594,Green I,Christison R,Voyce CJ,Bundell KR,Lindsay MA(2003)Protein transduction domains：are theydelivering Trends Pharmacol Sci 24：213-215)。并且，随着疾病的发生及发展中起到重要作用的主要蛋白质的功能被查明，使用低分子化合物作为调节与疾病相关的蛋白质的主要药物，但已知低分子药物与蛋白质间大面积的相互作用部位结合而使其调节目标蛋白质活性的作用受限。为了克服这个问题，尝试开发了基于适合调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用的肽或蛋白质的药物。为了成功开发以调节存在于细胞内的目标蛋白质活性为目的的蛋白质药物，需要向细胞内传递及输送蛋白质，通常，已知难以向细胞内输送蛋白质。
为了克服这些缺点和限制，尝试使用了蛋白转导域(protein transductiondomain，PTD)，即，细胞穿透肽(cell-penetrating peptide，CPP)。细胞穿透肽(CPP)也称为蛋白转导域。细胞穿透肽为易位蛋白(translocatory protein)的一部分，屈指可数的代表性细胞穿透肽可以为作为存在于人成纤维细胞生长因子(human fibroblast growthfactor)4的信号序列(signal sequence)中的疏水性部分(hydrophobic region)的膜易位序列(MTS，membrane translocating sequence)和人获得性免疫缺陷病毒(HIV)的病毒蛋白(viral protein)之一的Tat蛋白的Tat-PTD(碱性氨基酸结构域(basic amino aciddomain))(Mann DA,Frankel AD(1991)Endocytosis and targeting of exogenous HIV-1Tat protein.EMBO J 10：1733-1739,Rojas M,Donahue JP,Tan Z,Lin YZ(1998)Geneticengineering of proteins with cell membrane permeability.Nat Biotechnol16：370-375)。
然而，尽管因膜易位序列(MTS)进入细胞内的效率十分突出而被认可为非常好的候选，但由于氨基酸序列大部分为带有疏水性的疏水性结构域(hydrophobic domain)，在用于生产的表达过程中可能产生不溶体(包含体(inclusion body))，具有为了表达及纯化还需经过更为复杂的步骤的缺点，即使经过纯化的蛋白质，也具有在保管过程中因疏水作用(hydrophobic interaction)引起蛋白质凝集(aggregation)而降低其活性的缺点(JoD,Nashabi A,Doxsee C,Lin Q,Unutmaz D,Chen J,Ruley HE(2001)Epigeneticregulation of gene structure and function with a cell-permeable Crerecombinase.Nat Biotechnol 19:929-933,DiGiandomenico A,Wylezinski LS,HawigerJ(2009)Intracellular delivery of a cell-penetrating SOCS1 that targets IFN-gamma signaling.Sci Signal 2：ra37)。相反，在主要存在碱性氨基酸的Tat-PTD等基本结构域(basic domain)的情况下，因亲水性而使用于生产的表达过程中形成不溶体的可能性降低，因此具有在细胞质中可以通过较为简单的方法纯化，在保管过程中可以在相对较长的期间内保持其活性的优点。此外，至今已报告有许多细胞转导域(PTD)(Lindgren M,Langel U(2011)Classes and prediction of cell-penetrating peptides.Methods MolBiol 683：3-19)。
这样，在世界范围内活跃地进行着寻找多个细胞穿透肽并查明其序列的研究，尽管Tat-PTD系列和膜易位序列系列都以直接治疗目的用作细胞穿透药物(drug)，但与基因治疗等其他治疗方法相比，仍处于效果微乎其微的状况。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供细胞穿膜肽。
并且，本发明的目的在于，提供细胞增殖及迁移促进用组合物。
并且，本发明的目的在于，提供细胞穿透转运体。
并且，本发明的目的在于，提供组织再生用组合物。
并且，本发明的目的在于，提供血管生成促进用组合物。
并且，本发明的目的在于，提供伤口治愈用药物组合物。
并且，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的药物组合物。
并且，本发明的目的在于，提供伤口治愈方法。
并且，本发明的目的在于，提供血管生成依赖性疾病的治疗方法。
并且，本发明的目的在于，提供伤口治愈用组合物的制备用途。
同时，本发明的目的在于，提供用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的组合物的制备用途。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供细胞穿膜肽。
并且，本发明提供包含细胞穿膜肽的细胞增殖及迁移促进用组合物。
并且，本发明提供包含细胞穿膜肽的细胞穿透转运体。
并且，本发明提供包含细胞穿透肽的组织再生用组合物。
并且，本发明提供包含细胞穿透肽的血管生成促进用组合物。
并且，本发明提供包含细胞穿透肽的伤口治愈用药物组合物。
并且，本发明提供包含细胞穿透肽的用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的药物组合物。
并且，本发明提供伤口治愈方法，包括向伤口给药药学上有效量的细胞穿膜肽的步骤。
并且，本发明提供血管生成依赖性疾病的治疗方法，包括向患有血管生成依赖性疾病的个体给药药学上有效量的细胞穿膜的步骤。
并且，本发明提供细胞穿透肽在制备细胞穿膜肽的伤口治愈用组合物中的用途。
同时，本发明提供细胞穿膜肽在制备用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的组合物中的用途。
发明的效果
本发明的细胞穿膜肽具有提高细胞穿透、细胞增殖、细胞迁移及血管形成的效果，因此可以将其用作细胞穿透转运、伤口治愈及血管生成促进等用途，尤其，治疗顽固性糖尿病性伤口(溃疡)的效果优秀，因此可以有效用作伤口愈合用途。
附图说明
图1为示出细胞穿透肽LPX的结构的图。
图2为确认LPX101肽的细胞穿透特性的图。
图3为确认LPX102及LPX103肽的细胞穿透特性的图。
图4为确认LPX101肽的细胞生长及迁移促进效果的图。
图5为确认LPX101、LPX102及LPX103肽的细胞迁移促进效果的图。
图6为确认LPX101肽的血管形成效果的图。
图7为确认通过LPX101、LPX102及LPX103肽来提高葡萄糖吸收能力的图。
图8为确认通过LPX101、LPX102及LPX103肽来提高葡萄糖代谢的图。
图9为确认通过LPX101肽的糖尿病模型小鼠的伤口治愈效果的图。
图10为以组织学来分析通过LPX101肽的糖尿病性伤口治愈效果的图。
图11为在糖尿病性伤口中确认通过LPX101肽再生的皮质的重塑加速化的图。
图12为在STZ诱发糖尿病小鼠模型中确认LPX101、LPX102及LPX103肽的伤口治愈能力提高效果的图。
图13为在糖尿病小鼠模型(db/db)中比较LPX101、LPX102及LPX103肽的伤口再生活性的图。
图14为处理LPX103或表皮生长因子(EGF)的糖尿病小鼠模型中通过组织学评估伤口治愈及血管形成效果的图。
图15为示出通过LPX101、LPX102及LPX103肽的再上皮化的组织学评估的图。
图16为确认并用处理LPX101、LPX102、LPX103肽以及表皮生长因子的效果的图。
图17为简要示出LPX肽在糖尿病性伤口中用来提高再生效果的作用方式的图。
图18为示出有关LPX肽的变体的氨基酸序列的图。
图19为示出有关LPX肽的变体的氨基酸序列的图。
图20为示出本发明的LPX肽变体的序列的图。
图21为示出LPX肽变体(细胞穿透肽区域变体)在生物体外(in-vitro)培养的细胞内的稳定性、对细胞的迁移及细胞生长的效果的图。
图22为确认用于内体逃逸的LPX肽变体(添加His标签的变体)的细胞内肽的稳定性、对细胞的迁移及细胞生长的效果的图。
图23为确认LPX肽变体(核糖核酸(RNA)结合部位及锌指序列变异)的细胞内稳定性的图。
图24为确认随着筛选的LPX103肽的残基变异的稳定化的图。
图25为针对蛋白质稳定性确认筛选的LPX103肽变体对细胞增殖及迁移的效果的图。
图26为以示意图示出的随着LPX肽的变异的活性变化的图。
图27为示出以生物活性提高的方式筛选的LPX105肽的图。
图28为确认随LPX105肽的变异的细胞迁移促进效果的图。
图29为确认随LPX105肽的变异的糖尿病性伤口治愈效果的图(A部分：确认糖尿病性伤口区域减少，B部分：确认第8天的伤口区域减少)。
具体实施方式
以下，通过本发明的实例详细说明本发明。但下述实例仅用于例示，本发明的范围不限定于这些实例，本发明在随附的发明要求保护范围的记载及由其解释的同等范畴内可以有多种变形及应用。
若无其他定义，则本申请中使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。可以在实行本发明的过程中使用任意与本申请中记述的相似或等价的方法或材料，但优选的材料及方法记述在本申请中。
在本说明书全文中，天然存在的氨基酸不仅可以使用通常的单字或三字的符号，还可以使用Aib(α-氨基异丁酸)、Sar(N-甲基甘氨酸(N-methylglycine))等有关其他氨基酸的通常可接受的三字符号。并且，本发明中以简写记录氨基酸根据IUPAC-IUB命名法来记载：丙氨酸：A，精氨酸：R，天冬酰胺：N，天冬氨酸：D，半胱氨酸：C，谷氨酸：E，谷氨酰胺：Q，甘氨酸：G，组氨酸：H，异亮氨酸：I，亮氨酸：L，赖氨酸：K，甲硫氨酸：M，苯丙氨酸：F，脯氨酸：P，丝氨酸：S，苏氨酸：T，色氨酸：W，酪氨酸：Y，缬氨酸：V。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含细胞穿透结构域及锌指结构域的细胞穿膜肽。
上述锌指结构域可以包含通式1的氨基酸序列。
X1-X2-X3-X4-G-X5-L-D-X6-H-A-K-E-X7(通式1，序列1)
在上述式中，X1为C或A；X2为Y或R；X3为N、R或D；X4为C或A；X5为G或E；X6为H或A；以及X7为C或A。
在一实例中，上述肽可以为第一锌指，更优选地，X1为C，X3为N，X4为C，X6为H，X7为C。
在一实例中，当X2为R，X5为E时，可以提高稳定性。
在一实例中，上述肽可以为从CYNCGGLDHHAKEC以提高稳定性的方式变形的CRNCGELDHHAKEC。
在一实例中，本发明的肽可以包含下述通式2的氨基酸序列。
G-X8-R-C-X2-N-C-G-X5-L-D-H-H-A-K-E-C-K-X9(通式2，序列2)
在上述式中，X8为D或R；X2为Y或R；X5为G或E；以及X9为L或W。
在一实例中，当上述通式2中的X8为R，X5为E，X9为W时，可以在细胞内提高稳定性。
在一实例中，上述通式2的肽可以为序列3的GDRCYNCGGLDHHAKECKL肽，其中，可以有D2R、C4A、Y5R、N6R、N6D、C7A、G9E、H12A、C17A及L19W的变异，变异D2R、Y5R、G9E、L19W可以提高稳定性，但变异C4A、N6R、N6D、C7A、H12A及C17A可能减少稳定性。
在一实例中，在通式2及序列2的肽中，X8、X5及X9可以为稳定性残基；第4位C、第7位C、第12位H及第17位C可以为锌指；第3位R、X2及第15位K可以为亲和性残基；以及第6位N可以为核糖核酸结合残基。
在一实例中，N-末端(氨基末端)可以进一步包含序列4的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的N-末端。上述序列4的氨基酸可以为细胞穿透肽结构域，可以将其变更为序列5或序列6。
在一实例中，N-末端可以进一步包含序列5的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的N-末端。
在一实例中，N-末端可以进一步包含序列6的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的N-末端。
在一实例中，N-末端可以进一步包含氨基酸E或GSE，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的N-末端。
在一实例中，N-末端可以进一步包含组氨酸标签，组氨酸标签可以为重复6个的6XHis，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的N-末端。
在一实例中，C-末端(羧基末端)可以进一步包含序列7的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的C-末端。
在一实例中，C-末端可以进一步包含序列8的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的C-末端。上述序列8的氨基酸序列可以为锌指(第二锌指)。
在一实例中，C-末端可以进一步包含序列9的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的C-末端。
在一实例中，C-末端可以进一步包含序列10的氨基酸序列，更优选地，添加在通式2及序列2的肽的C-末端。
在一实例中，为了在生物体内的蛋白裂解酶中得到保护并增加稳定性，上述肽可以修饰肽的氨基末端及羧基末端或者以多种有机基团来保护，例如，将C-末端酰胺化。
在一实例中，上述肽可以由序列37至序列40中的任一氨基酸序列组成(LPX105及其变体)。
在一实例中，上述肽可以为选自由序列11的氨基酸序列组成的LPX101、由序列12的氨基酸序列组成的LPX102、由序列13的氨基酸序列组成的LPX103及由序列14的氨基酸序列组成的LPX104组成的组中的一种以上肽变体。
在一实例中，上述LPX103肽变体可以为由选自由序列19、序列24、序列25、序列26、序列27、序列28、序列29、序列30、序列31、序列32、序列33、序列34、序列35及序列36组成的组中的一种以上氨基酸序列组成的肽变体。
在一实例中，上述LPX104肽变体可以为由选自由序列15、序列16、序列17、序列18、序列20、序列21、序列22及序列23组成的组中的一种以上氨基酸序列组成的肽变体。
在一实例中，上述细胞穿膜肽可以由序列37的氨基酸序列组成，还可以包含序列38的氨基酸序列、序列39的氨基酸序列及序列40的氨基酸序列。
上述保护基团起到从生物体内的蛋白裂解酶的攻击中保护本发明的肽的作用。并且，上述变形的肽因保护基团而表现出优秀的热稳定性，并且，对酸和碱等物理化学因子的稳定性也优秀。因此，本发明的肽可以变形为长期保存性突出的方式，从而可以有利地适用于药品、准药品、化妆品及口腔用品等需要长期储存的产品中。
上述氨基酸的变形(或者变异或突变)起到大幅改善本发明的肽的稳定性的作用，本发明中提及的术语“稳定性”不仅是指生物体内的稳定性，还指储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。
在本发明中，尽管记载为“由特定序列编号组成的肽”，但若具有与由相关序列编号的氨基酸序列组成的肽具有相同或相应的活性，则不排除在相关序列编号的氨基酸序列前后添加无意义的序列或可能自然发生的突变或沉默突变(silent mutation)的情况，这些序列添加或具有突变的情况也应包括在本申请的范围内。
在本发明中，肽序列的变形可以通过一部分氨基酸的取代(substitution)、添加(addition)、删除(deletion)及修饰(modification)中的任一方法获这些方法的组合来变形。这样的变形包括：利用L型或D型氨基酸和/或非天然型氨基酸的变形；和/或通过天然型序列的变性的变形，例如，侧链官能团的变形，通过分子内共价键合的变形，例如通过侧链之间的环形成、甲基化、酰化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化等变性的变形。上述取代或附加的氨基酸不仅可以使用通常在人类蛋白质中观察到的20种氨基酸，还可以使用非典型或非自然发生的氨基酸。非典型氨基酸的商业出处包括西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)、ChemPep公司以及Genzyme pharmaceuticals公司。包含这些氨基酸的肽和典型的肽序列可以通过商业化的肽合成公司，例如美国的美国肽公司(American peptidecompany)或巴亨公司(Bachem)或者韩国的Anygen公司来合成及购买。
本发明中使用的术语“肽”是指氨基酸残基通过肽键结合形成的线性分子。本发明的肽可以根据本发明所属技术领域中公知的合成方法，尤其可以根据固相合成技术(solid-phase synthesis techniques)来制备(Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart,etal.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.：Rockford,111(1984))，也可以通过基因操作技术来生产。
具体地，本发明的肽可以通过标准合成方法、重组表达系统或任意其他相关领域的方法来制备。因此，本发明可以通过例如包括下述方法在内的多种方法来合成：方法(a)，使用固相或液相方法的手段以分步骤或片段组装的方式合成肽后，分离及纯化最终肽产物；或者方法(b)，在宿主细胞内表达编码肽的核酸构建体后，从宿主细胞培养物中回收表达产物；或者方法(c)，进行表达编码肽的核酸构建体的无细胞实验室内表达后，回收表达产物；或者通过方法(a)、方法(b)及方法(c)的任意组合获得肽的片段后，接着连接片段来获得肽后，回收相关肽的方法。
作为更具体的例，可以通过基因操作制备编码包含融合配偶体及本发明的肽的融合蛋白的融合基因并将其转化到宿主细胞后，表达为融合蛋白形态后，利用蛋白酶或化合物切割、分离融合蛋白来生产所希望的本发明的肽。为此，例如，可以将编码能够被Xa因子(Factor Xa)或肠激酶等蛋白酶、CNBr或羟胺等化合物切割的氨基酸残基的脱氧核糖核酸(DNA)序列插入于编码融合配偶体的核苷酸与编码本发明的肽的核苷酸之间。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及编码本发明的肽的多核苷酸、包含上述多核苷酸序列的载体或由上述载体转化的宿主细胞。
本发明中使用的术语“核苷酸”为以单链或双链形态存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，若无其他定义，则包括自然的核苷酸的类似物(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
本发明中使用的术语“载体”是指插入于宿主细胞与宿主细胞的基因组重组后插入的核酸或包含作为游离体的能够自我复制的感受态核苷酸序列的任意的核酸。这样的载体有线性核酸、质粒、噬菌体、粘粒、核糖核酸载体、病毒载体等。
本发明中使用的术语“宿主细胞”是指导入一种以上脱氧核糖核酸或载体的真核或原核细胞，不仅是指特定对象细胞，还应理解为是指其后代或潜在后代。上述后代可能因突变或环境影响发生某些变形，因此事实上上述后代可能与母细胞不同，但仍包括在本发明中使用的术语范畴内。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含本发明的肽的细胞增殖及迁移促进用组合物。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含本发明的肽的细胞穿透转运体。
在一实例中，本发明的细胞穿透转运体可以用作药物转运体。
通常，细胞穿透肽可以与目标物通过非共价键或共价键来连接构成。尤其优选地，细胞穿透肽与目标物通过化学交联(cross-linking)形成共价偶联物(Zatsepin,TS,etal.,Curr.Pharm.Des.,11：3639-3654(2005))。因此，本发明的肽可以发挥与目标物通过共价键或非共价键连接来向细胞或组织内转运的功能。
本发明中使用的术语“目标物(cargo of interest)”是指希望通过共价键或非共价键与本发明的肽形成偶联物来向细胞内转运的物质，例如，包括化学物质、纳米粒子、肽、多肽、反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸(siRNA)、短发夹核糖核酸(shRNA)、微小核糖核酸(miRNA)及肽核酸(PNA，peptide-nucleic acid)，但不限定于此。并且，在目标物为多肽的情况下，本发明的药物转运体可以在包含本发明的肽的细胞穿透转运体与目标物之间进一步包含接头。本发明中使用的接头可以使用本发明所属技术领域中公知的多种接头。为了使本发明肽的活性，即，细胞穿透活性最大化，上述接头可以具有特别选择的长度和/或序列。具体地，上述接头为由多个氨基酸残基形成的接头。由氨基酸序列组成的接头公开在Huston,et al.,Methods in Enzymology,203:46-88(1991),及Whitlow,et al.,ProteinEng.,6:989(1993))中，上述文献作为参考插入本发明中。
本发明的药物转运体能够以多重目的来使用。具体地，本发明的药物转运体可以在化学物质、核酸、纳米粒子等物质的转运中使用，上述核酸包括反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸、短发夹核糖核酸、微小核糖核酸及肽核酸，但不限定于此。并且，本发明的药物转运体可以根据转运对象物在疾病或疾患的治疗、特定细胞的检测、疾病(例如癌症)的诊断、特定细胞的位置追踪以及体内成像等中使用。本发明中使用的术语“核酸分子”具有包括脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)以及互补脱氧核糖核酸(cDNA)以及核糖核酸分子在内的含义，作为核酸分子中基本结构单位的核苷酸不仅包括自然的核苷酸，还可以包括糖或碱基部位变形的类似物(analogue)(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,NewYork(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
并且，对于构成本发明的药物转运体的肽及目标物，可以使用多种标记物质，例如，包括荧光物质(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC，fluoresein Isothiocyanate)、罗丹明6G(rhodamine 6G)、罗丹明B(rhodamine B)、6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA，6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)、Cy-3、Cy-5、德州红(Texas Red)、Alexa Fluor、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4,6-diamidino-2-phenylindole)及香豆素(Coumarin))、荧光蛋白(fluorescence protein；GFP、RFP、CFP、YFP、BFP、荧光素酶或其变体)、放射性同位素(例如，C14、I125、P32及S35)、化学物质(例如，生物素)、发光物质、化学发光物质(chemiluminescent)及荧光共振能量传递(FRET，fluorescence resonance energytransfer)。在本发明的药物转运体包含放射性同位素来构成的情况下(例如，本发明的肽及纳米粒子构成)，可以适用于单光子发射计算机断层成像(SPECT，Single PhotonEmission Computed Tomography)或正电子发射断层成像(PET,Positron EmissionTomography)来在组织的成像中使用。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含本发明的肽的组织再生用组合物。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含本发明的肽作为有效成分的血管生成促进用组合物。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含本发明的肽作为有效成分的伤口治愈用药物组合物。
在一实例中，伤口可以为未治愈的外伤性伤口、放射线照射引起的组织破坏、擦伤(abrasion)、骨坏疽、划伤(laceration)、撕裂伤(avulsion)、贯通伤(penetrated wound)、枪伤(gunshot wound)、切割伤、冻疮、挫伤(contusion or bruise)、皮肤溃疡、皮肤干燥、皮肤角化症、龟裂、爆裂、皮肤炎、皮肤真菌症引起的疼痛、手术伤、血管疾病伤口、角膜伤口等伤口、褥疮、卧疮、糖尿病性皮肤糜烂等有关糖尿病及循环不良的状态、慢性溃疡、整形手术后缝合部位、脊柱伤害性伤口、妇科伤口、化学伤口或痤疮。
在本发明的一实施方式中，本发明涉及包含本发明的肽作为有效成分的用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的药物组合物。
在一实例中，血管生成依赖性疾病可以为选自由缺血性疾病、伤口、烧伤、银屑病、慢性溃疡、心肌梗塞、心绞痛、褥疮、脱发、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、老年性黄斑变性、青光眼、糖尿病性溃疡、肺动脉高压及脑血管性痴呆组成的组中的一种以上。
在一实例中，缺血性疾病可以为选自由脑缺血、心肌缺血、糖尿病性心血管疾病血、心衰、心肌肥厚、视网膜缺血、缺血性大肠炎、缺血性急性肾衰竭、脑卒中、脑外伤及新生儿缺氧组成的组中的一种以上。
在本发明中，术语“预防”是指通过给药本发明的蛋白质或其片段或包含其的组合物来抑制或延迟血管生成依赖性疾病的发病、扩散及复发的所有行为。
本发明的组合物的治疗上有效的量可以根据多种因素，例如给药方法、目标部位、患者者的状态等的不同而不同。因此，在人体中使用时，给药量应在同时考虑安全性及有效性的前提下来确定适当量。也可以从通过动物实验确定的有效量来推算人使用的量。在确定有效量时考虑的诸多事项记录在例如Hardman and Limbird,eds.,Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.(2001),PergamonPress；及E.W.Martin ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.(1990),Mack Publishing Co.中。
本发明的药物组合物以药学上有效的量来给药。本发明中使用的术语“药学上有效的量”是指能够在医学治疗中适用的以合理的收益/风险比例治疗疾病的充分且不引起副作用的量，有效剂量水平可以根据包括患者的健康状态、疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、给药方法、给药时间、给药途径及代谢比例、治疗期间、配合或同时使用的药物在内的因素及其他医学领域中广为人知的因素来确定。本发明的组合物能够以单独治疗剂来给药或者与其他治疗剂联合给药，可以与现有的治疗剂依次给药或同时给药，可以单次或多次给药。重点在于，在考虑上述因素后，以无副作用的最少的量来获得最大效果的量来给药，相关领域的从业者可以轻松做出决定。
本发明的药物组合物可以包含生物制剂中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂或两种以上的组合。本发明中使用的术语“药学上可接受的”是指对暴露于上述组合物中的细胞或人不显出毒性的特性。上述载体只要是能够将组合物输送到生物体内的就不受特别限制，例如，可以使用Merck Index,13th ed.,Merck&Co.Inc.中记载的化合物、生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及混合以上成分中的一种以上来使用，可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、灭菌剂等其他通常的添加剂。并且，可以附加性地添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制为水溶液、悬混液、乳浊液等注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。进而，可以利用相关领域的适当方法或Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)中记载的方法根据各疾病或成分优选地配制。
在一实例中，上述药物组合物可以为选自包括口服剂型、外用剂、栓剂、灭菌注射溶液及喷雾剂的组中的一种以上剂型。
并且，本发明的组合物可以包含生物制剂中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂或两种以上的组合。药学上可接受的载体只要是能够将组合物输送到生物体内的就不受特别限制，例如，可以使用Merck Index,13th ed.,Merck&Co.Inc.中记载的化合物、生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及混合以上成分中的一种以上来使用，可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、灭菌剂等其他通常的添加剂。并且，可以附加性地添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制为水溶液、悬混液、乳浊液等注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。进而，可以利用相关领域的适当方法或Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)中记载的方法根据各疾病或成分优选地配制。
本发明的组合物中还可以含有一种以上示出相同或相似功能的有效成分。相对于组合物总重量，本发明的组合物包含0.0001重量百分比至10重量百分比的上述蛋白质，优选地，包含0.001重量百分比至1重量百分比。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的添加剂，在此情况下，药学上可接受的添加剂可以使用淀粉、明胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、麦芽糖、阿拉伯胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉末纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、淀粉乙醇酸钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖、葡萄糖、山梨糖醇及滑石粉等。相对于上述组合物，可以包含0.1重量份至90重量份的本发明的药学上可接受的添加剂，但不限定于此。
本发明的组合物可以根据所目标的方法来胃肠外给药(例如，静脉内、皮下、腹腔内或在局部应用)或口服给药，给药量的范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、代谢率及疾病的严重程度等的不同而多样。本发明的组合物的一日给药量为0.0001mg/ml～10mg/ml，优选地，为0.0001mg/ml～5mg/ml，更优选地，一天分为一次至数次来给药。
本发明的组合物的用于口服给药的液体制剂为悬混剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，通常，除用作单纯稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包含赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于胃肠外给药的制剂包括灭菌的水溶液、悬混剂、油剂、冷冻干燥制剂、栓剂等。
通过下述实施例更为详细地说明本发明。但下述实施例仅用于使本发明具体化，而不是由其来限定本发明。
实施例1.确认LPX肽的特性
1-1.细胞穿透效果
确认包含信号肽、核糖核酸结合亲和性残基(affinity residue)及核糖核酸残基(图1)并具有2个锌指基序的三种结构的穿透肽LPX101(序列11)、LPX102(序列12)及LPX103(序列13)的细胞穿透效果。具体地，为了测定细胞穿透效率，在NIH3T3细胞株及mMSCs(小鼠间充质干细胞)中采用Keplan group中使用的肝素胰蛋白酶洗涤法(Heparin&Trypsinwashing method)(Kaplan IM,Wadia JS,Dowdy SF(2005)Cationic TAT peptidetransduction domain enters cells by macropinocytosis.J Controlled release102：247-253)来去除可能附着在细胞膜表面的各种肽。然后，在LifeTein公司(美国(USA))分别将LPX101(20μg/ml)、LPX103及LPX102(0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml)肽合成为贴有异硫氰酸荧光素(FITC)的形态后，分别向培养各细胞的培养基中放入1μM浓度的各个肽并在37℃的温度下培养1小时。然后，使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞3次后，使用胰蛋白酶(Trypsin)使细胞脱落后进行荧光激活细胞分选(FACS)分析。并且，在处理肽18小时后，使用共聚焦显微镜确认各个肽是否确实存在于细胞内的细胞核内或细胞质内，对于膜结合，以PKH来标记。
结果，可以确认LPX101在2μM及5μM的浓度下都表现出高的细胞穿透率，大部分LPX101存在于细胞质内(图2)。并且，可以确认LPX102及LPX103在2μM以上的浓度下都表现出与LPX101(2μM)相似程度的高的细胞穿透率以及与LPX101(2μM)相似的细胞内残存(图3)。
1-2.细胞生长及迁移促进效果
在NIH3T3细胞株中确认LPX101肽给细胞生长带来的影响，在作为糖尿病细胞株的糖尿病人表皮角质形成细胞(DHEK，Diabetic human epidermal keratinocyte)中确认LPX101、LPX102及LPX103肽给细胞迁移带来的影响。具体地，对mMSC或NIH3T3细胞处理LPX101肽并培养1小时后洗涤。测量处理3天后细胞的数量并与对照组相比以％计算相对增殖的比例来确认因处理LPX引起的细胞生长的％增加(n＝3)。并且，为了确认细胞迁移效果，向DHEK细胞分别处理LPX101、LPX102及LPX103肽并培养1小时后洗涤。然后，在处理72小时后测量越过划开的界限的细胞的迁移。通过使用ImageJ的图像分析来测量越过划痕线的细胞的数量。
结果，观察到LPX101肽在2μM及5μM浓度下都促进细胞生长，都促进DHEK细胞的迁移(图4)。并且，观察到LPX102及LPX103肽在更低的浓度下表现出与LPX101相似程度的促进细胞迁移的现象(图5)。
1-3.血管形成促进效果
将人脐静脉内皮细胞(Huvec，Human umbilical vein endothelial cells)分注到无细胞因子的基质胶并处理LPX101一天(n＝3，1expt)。然后，19天后使用显微镜观察血管形成，定量包括结节(nodules)的数量、血管内连接(junctions)的数量及主段(mastersegment)的数量在内的血管形成参数(parameter)。
结果，内皮细胞表现出在通过处理LPX101肽形成更为成熟的毛细血管环(图6)。
实施例2.确认LPX肽的抗糖尿病效果
2-1.葡萄糖吸收能力提高效果
将人皮肤成纤维细胞株HDF(Human dermal fibroblasts(人真皮成纤维细胞))及糖尿病细胞株DHEK在无葡萄糖的培养基中培养24小时后，处理2μM(20μg/ml)的LPX101、1μM的LPX102或1μM的LPX10318小时后，处理2-脱氧葡萄糖(2DG，2-deoxyglucose)。使用发光试剂盒(luminiscemce kit)(普洛麦格公司(promega))反应后使用Spectra MaxL设备在470nm的波长处测定吸收的葡萄糖的量来测量相对的葡萄糖吸收量(平均值标准误差(SEM)，n＝3，*：p<0.05，**：p<0.01)。
结果，LPX肽在包括糖尿病细胞株在内的多种哺乳动物细胞中都表现出提高葡萄糖的吸收(图7)。
2-2.糖酵解(glycolysis)提高效果
将NIH3T3细胞在无葡萄糖的培养基中培养1天后，依次处理葡萄糖、寡霉素及2-DG，利用细胞外流量(XF，Seahorse extrqacellular flux)分析仪测定产生的乳酸盐来测量细胞外酸化率(ECAR，extracellular acidification rate)，在处理LPX肽的细胞中确认细胞外酸化率的定量及概况(平均值标准误差，n＝3，*：p<0.05)。
结果，LPX101、LPX102及LPX103肽表现出促进葡萄糖代谢(糖酵解)(图8)。
2-4.糖尿病性伤口治愈效果
2-4-1.确认糖尿病性伤口治愈效果
使用直径为8mm的打孔器在野生型(WT)小鼠及糖尿病模型小鼠(db/db)(分别n＝14)的皮肤打孔后，每天处理LPX101(2mg/ml，20ul)或磷酸盐缓冲溶液并实施伤口敷料共14天。使用ImageJ分析初始伤口区域及再上皮化区域来确认伤口治愈效果(平均值标准误差，n＝3，*：p<0.05)。并且，组织学评估处理LPX101的伤口的伤口治愈效果。具体地，分别在诱导糖尿病小鼠(db/db)的伤口诱导7天及14天后进行苏木精伊红(H/E)或三色染色后，使用显微镜确认，利用ImageJ定量再上皮化及颗粒化的组织(n＝3，***：p<0.001)。同时，对db/db小鼠的伤口处理LPX101，14天后组织学分析组织表皮。
结果，LPX101肽表现出加速WT小鼠的伤口治愈，在db/db小鼠模型中表现出更为显著地加速糖尿病性伤口的治愈(图9)。并且，由于LPX101肽的处理，在糖尿病小鼠模型中诱导的伤口在第7天(治愈过程的中间)表现出诱发颗粒化组织的早期形成，在第14天(治愈过程的结束)表现出诱发颗粒化组织的早期收缩(重塑)(图10)。同时，组织学分析第14天的表皮的结果，表现出以处理LPX101而在早期减少角化过度(hyperkeratosis)、角化不全(parakeratosis)及棘皮病(acanthosis)，再生的伤口上皮的重塑被加速(图11)。
2-4-2.链脲霉素(STZ)诱导糖尿病的小鼠模型中的伤口治愈效果
在链脲霉素诱导糖尿病的小鼠模型中确认LPX101、LPX102及LPX103的伤口治愈效果。具体地，向小鼠注射链脲霉素(STZ，streptozotocin)5天来诱导糖尿病，因此而发生高血糖症。然后，按照图12的A部分所示的时间表分别处理磷酸盐缓冲溶液(阴性对照组)、50μg/ml的表皮生长因子(阳性对照组)、2mg/ml(20μl)的LPX101、LPX102及LPX103(2mg/ml(20μl))后，通过图像、再上皮化及糖尿病表现型(高血糖症及葡萄糖耐性检查(IPGTT，impairedglucose tolerance test))来确认诱发糖尿病的小鼠模型的伤口治愈效果(各组n＝10，*：p<0.05)。并且，为了比较LPX肽对糖尿病小鼠模型的再生活性，确认到通过相对于初始伤口区域的％非上皮化区域测定的伤口治愈动力学(相对于各组，n＝8)及使用相对于初始伤口部位的再上皮化面积的％分析的再上皮化的定量化。
结果，LPX肽在由链脲霉素诱导的糖尿病性伤口模型(筛选出明确的高血糖症的小鼠)中都表现出比表皮生长因子更为提高的伤口治愈效果，尤其，LPX102及LPX103表现出比LPX101更为优秀的效果(图12)。并且，在伤口治愈动力学及定量再上皮化的结果中，LPX102及LPX103在db/db小鼠模型中也表现出比LPX101更优秀的糖尿病性伤口治愈效果(图13)。
2-4-3.通过促进血管形成的糖尿病性伤口治愈效果
糖尿病溃疡因血管生成障碍及缺血性坏死引起的血管供应不足而难以治疗，因此，确认LPX肽是否在糖尿病性伤口治愈中为血管形成做出贡献。具体地，在糖尿病模型小鼠(db/db)中形成伤口后，每天处理一次LPX103或表皮生长因子，在第7天对血管生成的恢复进行分析，为了使组织内红细胞的血管外流出可视化，放大各组的伤口及入口(红色虚线框)来确认图像。
结果，处理LPX103的组表现出比处理表皮生长因子的组形成更为成熟的毛细血管，形成更少的出血(hemorrhage)(红细胞(RBC)的血管外流出)(图14)。
2-4-4.通过LPX肽的再上皮化的组织学评估
为了在组织学上评估通过LPX肽101、LPX肽102及LPX肽103的糖尿病小鼠的伤口再上皮化，在初始损伤后第10天使用苏木精伊红染色通过各LPX治疗的糖尿病小鼠(db/db)伤口组织并使用显微镜(50×及100×)确认。
结果，LPX肽101、LPX肽102及LPX肽103都表现出显著提高糖尿病性伤口的再上皮化(图15)。
2-4-5.联合给药
确认通过联合处理LPX肽与表皮生长因子的糖尿病性伤口治愈效果。具体地，以8mm的直径打孔在糖尿病小鼠模型(db/db)形成伤口后，按照图15的A部分所示的方案以LPX肽(LPX肽101、LPX肽102或LPX肽103)和/或表皮生长因子的组合来处理，使用显微镜观察其图像来确认发生初始伤口后对于再上皮化的效果。
结果，LPX101、LPX102及LPX103在与表皮生长因子联合处理时都表现出提高糖尿病性伤口治愈效果(图16)。
通过该结果可知，LPX肽多重地提高目前难以治疗的糖尿病性伤口(溃疡)的再生(图17)。
实施例3.确认随着LPX肽的变形的活性
3-1.制备肽变体
按照图18所示的方式制备上述LPX肽的多种变体。具体地，在图19所示的LPX101的结构中附加多种变异(细胞穿透肽区域的取代、核糖核酸结合部分及锌指结构的氨基酸变异以及添加组氨酸标签)来制备多种构造(包括101在内共26种)(图20)。进一步地，比较LPX101、LPX102、LPX103及LPX104(序列14)对NIH3T3细胞的细胞迁移效果的结果如下述表1所示，表现出相似的水平。
表1
3-2.确认随着细胞穿透肽区域取代的活性变化
为了确认随细胞穿透肽区域序列的取代的生物活性变化，如图21的A部分所示，在包含锌指2区域中包含核糖核酸结合位置的序列7的LPX104(#4)中，使用人获得性免疫缺陷病毒(HIV)的TAT或Arg重复(R9)序列取代细胞穿透肽区域后(分别为TAT-104及R9-104)，比较对于NIH3T3细胞的细胞穿透效果、细胞穿透24小时后的肽的稳定性、细胞迁移效果及细胞生长效果。
结果，在LPX肽中，细胞穿透肽区域的TAT或Arg(9)残基的取代对于细胞穿透、细胞增殖及细胞迁移的效果，与原来LPX104的效果相似(图21的B部分)，但与现有的LPX104相比，肽的稳定性显著高(图21的C部分)。
3-3.确认随着HIS标签插入的活性变化
为了筛选通过内体逃逸提高稳定性的突变，如图22的A部分所示，在LPX肽的细胞穿透肽区域的N-末端添加重复HIS标签的序列(6XHis)(LPH103或LPX104)，比较它们穿透细胞24小时后的稳定性、细胞迁移促进效果及细胞生长促进效果。
结果，在向LPX肽添加6XHis标签的情况下，表现出因有助于内体逃逸而显著增加细胞内稳定性(图22的B部分)。并且，还表现出增加细胞增殖及细胞迁移效果(图22的C部分至图22的D部分)。
3-4.确认随着核糖核酸结合区域及锌指区域变异的活性变化
确认具有核糖核酸结合区域及锌指区域的变异的变体的蛋白质稳定性。具体地，分别向NIH3T3细胞处理细胞迁移时用于核糖核酸结合的氨基酸残基发生变异的LPX103变体1天后，在72小时后基于分子建模程序分析个肽的细胞内稳定化效果，确认各氨基酸残基的突变能量，选择可能因取代引起小于-1Kcal/mol的变体作为能够增加稳定性及活性的沉默突变(图23及图24)。在NIH3T3细胞中确认选择的变体对细胞增殖及细胞迁移的效果(图25)，通过此可以确认提高或减少细胞内肽的稳定性的核糖核酸结合区域及锌指区域上的变异(图26)。于是，选定确认稳定性和生物活性高的LPX103、LPH103及LPS1O3。
通过上述实施例，能够相似地保持或提高LPX肽的生活活性的残基的沉默取代如下：1)在N-末端添加组氨酸反复序列为提高稳定性；2)细胞穿透肽的TAT或R9的取代为同等效果；3)引起蛋白质的稳定化的残基变异(突变能量小于-1Kcal/mole)为D16R、Y19R、N20R、G23E、L33E及L33W(参照图26)；以及4)源自其他种类的残基的任意组合。
并且，应在LPX肽变体中保留下述能够引起生物活性减少的残基：1)锌指基序的18C、21C、26H及31C(以序列11的LPX101为基准)；以及2)核糖核酸结合区域的20N(以序列11的LPX101为基准)。
通过此，可以确认因与LPX肽的稳定性及生物学活性同等或增加而可以替代(取代)或添加的氨基酸残基以及因减少稳定性及生物活性而应保留的残基。
实施例4.确认随着LPX105肽的变异的活性
4-1.制备LPX105肽变体
利用上述实施例3中记载的方法制备LPX105变体。具体地，为了确认随着序列37的LPX105的锌指区域的变异及组氨酸标签(Histidine tag)插入的效果，通过LPX105的锌指区域变异和插入组氨酸标签来制备LPS105(序列38)、LPH105(序列39)及LPHS105(序列40)(图27)。
4-2.确认LPX105变体的细胞迁移促进效果
利用上述实施例1-2中记载的方法来确认LPX105、LPH105及LPHS105的细胞迁移促进效果。具体地，为了确认细胞迁移效果，向作为成纤维细胞的3T3细胞分别处理LPX105、LPH105及LPHS105并培养1小时后洗涤。然后，在处理72小时后测量越过划开的界限的细胞的迁移。通过使用ImageJ的图像分析来测量越过划痕线的细胞的数量。
结果，通过与作为对照组的磷酸盐缓冲溶液比较确认到LPX105显著促进细胞迁移，确认到与LPX105相比，作为LPX105的变体的LPH105及LPHS105增加细胞迁移(图28)。
4-3.LPX105变体的糖尿病性伤口治愈效果
利用上述实施例2-4中记载的方法评估LPX105、LPH105及LPHS105的糖尿病性伤口治愈效果。详细地，使用直径为8mm的打孔器在糖尿病模型小鼠(db/db)(分别n＝14)的皮肤打孔后，每天处理LPX105、LPH105及LPHS105(3μg)或磷酸盐缓冲溶液并实施伤口敷料共10天。使用ImageJ分析初始伤口区域及再上皮化区域来确认伤口治愈效果(平均值标准误差，n＝3，*：p<0.05)。
结果，与作为对照组的磷酸盐缓冲溶液相比，LPX105在db/db小鼠模型中表现出加速糖尿病性伤口的治愈。并且，确认到与LPX105相比，作为LPX105变体的LPH105及LPHS105显著加速糖尿病性伤口的治愈(图29)。
<110> 礼赞伊诺制药株式会社
<120> 细胞穿膜肽变体及其用途
<130> P23117638WP
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZF1
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Leu Asp Xaa His Ala Lys Glu Xaa
1 5 10
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2XR, 2XD, 4XY, 4XR, 9XG, 9XE, 19XL或9XW
<400> 2
Gly Xaa Arg Cys Xaa Asn Cys Gly Xaa Leu Asp His His Ala Lys Glu
1 5 10 15
Cys Lys Xaa
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZF1 变体
<400> 3
Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu
1 5 10 15
Cys Lys Leu
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CPP 区
<400> 4
Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT
<400> 5
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R9
<400> 6
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZF1 变体
<400> 7
Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
1 5
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZF2
<400> 8
Cys His Phe Cys Gln Ser Ile Ser His Met Val Ala Ser Cys
1 5 10
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZF2变体
<400> 9
Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His Phe Cys Gln Ser Ile Ser His Met
1 5 10 15
Val Ala Ser Cys Pro Leu
20
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZF2 变体2
<400> 10
Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His Phe Cys Gln Ser Ile Ser His Met
1 5 10 15
Val Ala Ser Cys Pro Leu Lys Ala Gln Gln Lys
20 25
<210> 11
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPX101
<400> 11
Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly Asp
1 5 10 15
Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys
20 25 30
Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His Phe Cys Gln Ser Ile Ser His
35 40 45
Met Val Ala Ser Cys Pro Leu Lys Ala Gln Gln Lys
50 55 60
<210> 12
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPX102
<400> 12
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys
20 25 30
Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His Phe Cys Gln Ser
35 40 45
Ile Ser His Met Val Ala Ser Cys Pro Leu
50 55
<210> 13
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPX103
<400> 13
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys
20 25 30
Glu Cys Lys Leu
35
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPX104
<400> 14
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40
<210> 15
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TAT104
<400> 15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys
1 5 10 15
Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Lys Cys His
35
<210> 16
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R9-104
<400> 16
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys
1 5 10 15
Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Lys Cys His
35
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HTAT-104
<400> 17
His His His His His His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40
<210> 18
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HR9-104
<400> 18
His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40
<210> 19
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPH-103
<400> 19
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu
35
<210> 20
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-104
<400> 20
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40 45
<210> 21
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-104-1
<400> 21
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Arg Cys Gly Gly Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40 45
<210> 22
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-104-2
<400> 22
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Arg Asn Cys Gly Gly Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40 45
<210> 23
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H-104-3
<400> 23
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Arg Arg Cys Gly Gly Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys Cys His
35 40 45
<210> 24
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-A1
<400> 24
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Tyr Arg Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu
<210> 25
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-A2
<400> 25
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Arg Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu
<210> 26
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-A3
<400> 26
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Arg Arg Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu
<210> 27
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-S1
<400> 27
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Arg Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu
<210> 28
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPS-103
<400> 28
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Leu
<210> 29
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-S1 #19
<400> 29
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Trp
<210> 30
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-AS1
<400> 30
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Arg Arg Cys Arg Arg Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Trp
<210> 31
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-AS1 #21
<400> 31
Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly
1 5 10 15
Arg Arg Cys Arg Arg Cys Gly Glu Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys
20 25 30
Lys Trp
<210> 32
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-N1
<400> 32
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Ala Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys
20 25 30
Glu Cys Lys Leu
35
<210> 33
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-N2
<400> 33
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Ala Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys
20 25 30
Glu Cys Lys Leu
35
<210> 34
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-N3
<400> 34
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp Ala His Ala Lys
20 25 30
Glu Cys Lys Leu
35
<210> 35
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-N4
<400> 35
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys
20 25 30
Glu Ala Lys Leu
35
<210> 36
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 103-N5
<400> 36
Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser
1 5 10 15
Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asp Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys
20 25 30
Glu Cys Lys Leu
35
<210> 37
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPX105
<400> 37
Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly Asp
1 5 10 15
Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys
20 25 30
Leu
<210> 38
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPS105
<400> 38
Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly Asp
1 5 10 15
Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys
20 25 30
Leu
<210> 39
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPH105
<400> 39
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu
35
<210> 40
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LPHS105
<400> 40
His His His His His His Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser Met Gln Lys
1 5 10 15
Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Glu Leu Asp His
20 25 30
His Ala Lys Glu Cys Lys Leu
35
Claims (24)
1.一种细胞穿膜肽，其特征在于，包含细胞穿透结构域及锌指结构域。
2.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，
上述锌指结构域为下述通式1的氨基酸序列，
通式1，序列1：
X1-X2-X3-X4-G-X5-L-D-X6-H-A-K-E-X7
在上述式中，
X1为C或A；
X2为Y或R；
X3为N、R或D；
X4为C或A；
X5为G或E；
X6为H或A；以及
X7为C或A。
3.根据权利要求2所述的细胞穿膜肽，其特征在于，在锌指结构域的N-末端添加有G-X8-R，在上述式中，X8为D或R。
4.根据权利要求2所述的细胞穿膜肽，其特征在于，在上述锌指结构域的C-末端添加有K-X9，在上述式中，X9为L或W。
5.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，上述细胞穿透结构域为序列4至序列6的氨基酸序列中的任一序列。
6.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，上述细胞穿膜肽由序列37的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，上述细胞穿膜肽由序列38的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，上述细胞穿膜肽由序列39的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，上述细胞穿膜肽由序列40的氨基酸序列组成。
10.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，上述细胞穿膜肽由序列11至序列36的氨基酸序列中的任一序列组成。
11.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，在上述细胞穿透结构域的N-末端还包含氨基酸E、GSE或组氨酸标签。
12.根据权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，在上述锌指结构域的C-末端还包含序列7至序列10的氨基酸序列中的任一序列。
13.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1所述的细胞穿膜肽。
14.一种载体，其特征在于，包含权利要求13所述的多核苷酸。
15.一种宿主细胞，其特征在于，由权利要求14所述的载体转化。
16.一种伤口治愈用药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的细胞穿膜肽作为有效成分。
17.根据权利要求16所述的伤口治愈用药物组合物，其特征在于，伤口为选自由未治愈的外伤性伤口、放射线照射引起的组织破坏、擦伤、骨坏疽、划伤、撕裂伤、贯通伤、枪伤、切割伤、冻疮、挫伤、皮肤溃疡、皮肤干燥、皮肤角化症、龟裂、爆裂、皮肤炎、皮肤真菌症引起的疼痛、手术伤、血管疾病伤口、角膜伤口、褥疮、卧疮、包括糖尿病性皮肤糜烂的糖尿病及循环不良相关的状态、慢性溃疡、整形手术后缝合部位、脊柱伤害性伤口、妇科伤口、化学伤口及痤疮组成的组中的伤口。
18.一种用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的细胞穿膜肽作为有效成分。
19.根据权利要求18所述的用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的药物组合物，其特征在于，血管生成依赖性疾病为选自由缺血性疾病、伤口、烧伤、银屑病、慢性溃疡、心肌梗塞、心绞痛、褥疮、脱发、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、老年性黄斑变性、青光眼、糖尿病性溃疡、肺动脉高压及脑血管性痴呆组成的组中的一种以上。
20.根据权利要求19所述的用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的药物组合物，其特征在于，缺血性疾病为选自由脑缺血、心肌缺血、糖尿病性心血管疾病血、心衰、心肌肥厚、视网膜缺血、缺血性大肠炎、缺血性急性肾衰竭、脑卒中、脑外伤及新生儿缺氧组成的组中的一种以上。
21.一种伤口治愈方法，其特征在于，包括向伤口给药药学上有效量的权利要求1所述的细胞穿膜肽的步骤。
22.一种血管生成依赖性疾病的治疗方法，其特征在于，包括向患有血管生成依赖性疾病的个体给药药学上有效量的权利要求1所述的细胞穿膜肽的步骤。
23.一种包含细胞穿透结构域及锌指结构域的细胞穿膜肽在制备伤口治愈用组合物中的用途。
24.一种包含细胞穿透结构域及锌指结构域的细胞穿膜肽在制备用于预防或治疗血管生成依赖性疾病的组合物中的用途。
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