JP2024515250A - 細胞透過性ペプチド変異体およびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、細胞透過性ペプチド変異体の傷治癒用途に関し、本発明に係る細胞透過性ペプチドは、細胞透過、細胞増殖、細胞移動および血管形成を向上する効果があり、これを細胞透過伝達、傷治癒および血管新生促進用途で利用することができ、特に、難治性である糖尿病性傷（潰瘍）の治療効果に優れるので、傷治癒用途で有用に利用することができる。【選択図】図１８
Description
本発明は、細胞透過性ペプチド変異体の傷治癒用途に関する。
高等動物の細胞は、細胞内とその外を区分する細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）があり、細胞間の物質移動を徹底的に区分する役割をする。細胞膜は、リン脂質二重層（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ）で構成されており、これらの脂質二重層（ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ）が有している疎水性によって大部分のペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、リポソームなどが細胞内に移動することはほとんど不可能である。よって、細胞膜は、ペプチドやタンパク質、あるいは化合物製剤薬物や遺伝子治療剤を細胞内に移動させるのに当たり、障害物役割をすると言える。これを克服するために、カチオン性脂質（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ）あるいはＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を使用するか、ウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）または電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いる方法などが多く用いられている。しかし、これらの方法は、低い効率、適用可能な細胞の制限、細胞内の毒性などでその限界があると言える（Ｌｉｎｄｓａｙ ＭＡ（２００２）Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２：５８７－５９４、Ｇｒｅｅｎ Ｉ、Ｃｈｒｉｓｔｉｓｏｎ Ｒ、Ｖｏｙｃｅ ＣＪ、Ｂｕｎｄｅｌｌ ＫＲ、Ｌｉｎｄｓａｙ ＭＡ（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｒｅ ｔｈｅｙ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２４：２１３－２１５）。また、疾病の発生および進行に重要な役割をする主要タンパク質の機能が明らかになり、細胞内の疾患関連タンパク質を調節できる物質として低分子化合物が主要薬物として利用されているが、広い面積のタンパク質間の相互作用部位は、低分子薬物が結合して標的タンパク質の活性を調節するには限界があることが知られていた。これを克服するために、タンパク質とタンパク質との間の相互作用を調節するのに適したペプチドやタンパク質基盤の薬物開発が試みられている。細胞内に存在する標的タンパク質の活性調節を目的とするタンパク質薬物の成功的な開発のためには、タンパク質の細胞内伝達および輸送が必須に要求されるが、一般的にタンパク質の細胞内の輸送は難しいと知られていた。
このような短所と限界を克服するために、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）、すなわち細胞－透過ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）を使用する試みが行われている。ＣＰＰは、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）とも呼ばれる。ＣＰＰは、ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎの一部分であるが、代表的に挙げられるのがヒト線維芽細胞成長因子（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）４のｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅに存在する疎水性部分（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）であるＭＴＳ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とＨＩＶのｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎのうち一つであるＴａｔタンパク質のＴａｔ－ＰＴＤ（ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｏｍａｉｎ）が挙げられる（Ｍａｎｎ ＤＡ、Ｆｒａｎｋｅｌ ＡＤ（１９９１）Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＨＩＶ－１ Ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＥＭＢＯ Ｊ １０：１７３３－１７３９， Ｒｏｊａｓ Ｍ、Ｄｏｎａｈｕｅ ＪＰ、Ｔａｎ Ｚ、Ｌｉｎ ＹＺ（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３７０－３７５）。
しかし、ＭＴＳの場合、細胞内に入る効率が非常に優れており、良い候補としては認められているが、アミノ酸配列の大部分が疎水性を帯びる疎水性ドメイン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｏｍａｉｎ）であるため、生産のための発現過程で不溶体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）が生成される可能性があり、発現および精製のためにより複雑なステップを経なければならない短所があり、精製を経たタンパク質であっても、保管中に疎水性作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によってタンパク質が凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）されてその活性に落ちることができる短所がある（Ｊｏ Ｄ、Ｎａｓｈａｂｉ Ａ、Ｄｏｘｓｅｅ Ｃ、Ｌｉｎ Ｑ、Ｕｎｕｔｍａｚ Ｄ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｒｕｌｅｙ ＨＥ（２００１）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：９２９－９３３、ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ Ａ、Ｗｙｌｅｚｉｎｓｋｉ ＬＳ、Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ（２００９）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ＳＯＣＳ１ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２：ｒａ３７）。これに対し、塩基性アミノ酸が主に存在するＴａｔ－ＰＴＤのような基本ドメイン（ｂａｓｉｃ ｄｏｍａｉｎ）のような場合、親水性であるため生産のための発現過程で不溶体が形成される可能性が低く、細胞質で比較的に容易な方法で精製が可能であり、保管過程でもその活性を相対的に長期間維持させ得る長所がある。これ以外にも、今まで数多くのＰＴＤが報告されている（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｍ、Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２０１１）Ｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６８３：３－１９）。
このように複数個の細胞透過ペプチドを捜し出し、その配列を明らかにする研究が世界的に活発に進行されており、Ｔａｔ－ＰＴＤ系列とＭＴＳ系列の両方とも直接治療目的の細胞透過薬物（ｄｒｕｇ）として使用されているが、遺伝子治療などの他の治療方法と比較すると、その効果が微々たる状況である。
（Ｌｉｎｄｓａｙ ＭＡ（２００２）Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２：５８７－５９４、Ｇｒｅｅｎ Ｉ、Ｃｈｒｉｓｔｉｓｏｎ Ｒ、Ｖｏｙｃｅ ＣＪ、Ｂｕｎｄｅｌｌ ＫＲ、Ｌｉｎｄｓａｙ ＭＡ（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｒｅ ｔｈｅｙ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２４：２１３－２１５）
（Ｍａｎｎ ＤＡ、Ｆｒａｎｋｅｌ ＡＤ（１９９１）Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＨＩＶ－１ Ｔａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．ＥＭＢＯ Ｊ １０：１７３３－１７３９， Ｒｏｊａｓ Ｍ、Ｄｏｎａｈｕｅ ＪＰ、Ｔａｎ Ｚ、Ｌｉｎ ＹＺ（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３７０－３７５）
（Ｊｏ Ｄ、Ｎａｓｈａｂｉ Ａ、Ｄｏｘｓｅｅ Ｃ、Ｌｉｎ Ｑ、Ｕｎｕｔｍａｚ Ｄ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｒｕｌｅｙ ＨＥ（２００１）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：９２９－９３３、ＤｉＧｉａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ Ａ、Ｗｙｌｅｚｉｎｓｋｉ ＬＳ、Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ（２００９）Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ＳＯＣＳ１ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔｓ ＩＦＮ－ｇａｍｍａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２：ｒａ３７）
（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｍ、Ｌａｎｇｅｌ Ｕ（２０１１）Ｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６８３：３－１９）
本発明の目的は、細胞透過性ペプチドを提供することである。
また本発明の目的は、細胞増殖および移動促進用組成物を提供することである。
また本発明の目的は、細胞透過伝達体を提供することである。
また本発明の目的は、組織再生用組成物を提供することである。
また本発明の目的は、血管新生促進用組成物を提供することである。
また本発明の目的は、傷治癒用薬学的組成物を提供することである。
また本発明の目的は、血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
また本発明の目的は、傷治癒方法を提供することである。
また本発明の目的は、血管新生依存性疾患の治療方法を提供することである。
また本発明の目的は、傷治癒用組成物の製造用途を提供することである。
併せて、本発明の目的は、血管新生依存性疾患の予防または治療用組成物の製造用途を提供することである。
前記課題を解決するために、本発明は、細胞透過性ペプチドを提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを含む細胞増殖および移動促進用組成物を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを含む細胞透過伝達体を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを含む組織再生用組成物を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを含む血管新生促進用組成物を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを含む傷治癒用薬学的組成物を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを含む血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを薬学的に有効な量で傷に投与するステップを含む傷治癒方法を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドを薬学的に有効な量で血管新生依存性疾患を有する個体に投与するステップを含む血管新生依存性疾患の治療方法を提供する。
また本発明は、細胞透過性ペプチドの傷治癒用組成物の製造に使用するための用途を提供する。
併せて、本発明は、細胞透過性ペプチドの血管新生依存性疾患の予防または治療用組成物の製造に使用するための用途を提供する。
本発明に係る細胞透過性ペプチドは、細胞透過、細胞増殖、細胞移動および血管形成を向上する効果があり、これを細胞透過伝達、傷治癒および血管新生促進用途で利用することができ、特に、難治性である糖尿病性傷（潰瘍）の治療効果に優れるので、傷治癒用途で有用に利用することができる。
以下、本発明の具現例で本発明を詳しく説明することにする。ただし、下記具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであって、これにより本発明が制限されることはなく、本発明は、後述する特許請求の範囲の記載およびそれから解析される均等範疇内で多様な変形および応用が可能である。
別に正義されない限り、本願において使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者が通常的に理解するものと同一の意味を有する。本願に記述されたものと類似するか等価である任意の方法および材料が本発明をテストするための実行で使用できるが、好ましい材料および方法が本願で記述される。
本明細書の全般を通じて、天然的に存在するアミノ酸に対する通常の１文字および３文字コードが使用されるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソブチル酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字コードが使用される。また本発明において略語で言及されたアミノ酸は、下記のようにＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法によって記載された：
アラニン：Ａ、アルギニン：Ｒ、アスパラギン：Ｎ、アスパラギン酸：Ｄ、システイン：Ｃ、グルタミン酸：Ｅ、グルタミン：Ｑ、グリシン：Ｇ、ヒスチジン：Ｈ、イソロイシン：Ｉ、ロイシン：Ｌ、リシン：Ｋ、メチオニン：Ｍ、フェニルアラニン：Ｆ、プロリン：Ｐ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、トリプトファン：Ｗ、チロシン：Ｙおよびバリン：Ｖ。
アラニン：Ａ、アルギニン：Ｒ、アスパラギン：Ｎ、アスパラギン酸：Ｄ、システイン：Ｃ、グルタミン酸：Ｅ、グルタミン：Ｑ、グリシン：Ｇ、ヒスチジン：Ｈ、イソロイシン：Ｉ、ロイシン：Ｌ、リシン：Ｋ、メチオニン：Ｍ、フェニルアラニン：Ｆ、プロリン：Ｐ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、トリプトファン：Ｗ、チロシン：Ｙおよびバリン：Ｖ。
一側面において、本発明は、細胞透過性ドメインおよびジンクフィンガードメインを含む細胞透過性ペプチドに関する。
前記ジンクフィンガードメインは、一般式１のアミノ酸配列を含むことができる。
前記式において、
Ｘ１はＣまたはＡであり；
Ｘ２はＹまたはＲであり；
Ｘ３はＮ、ＲまたはＤであり；
Ｘ４はＣまたはＡであり；
Ｘ５はＧまたはＥであり；
Ｘ６はＨまたはＡであり；および
Ｘ７はＣまたはＡである。
Ｘ１はＣまたはＡであり；
Ｘ２はＹまたはＲであり；
Ｘ３はＮ、ＲまたはＤであり；
Ｘ４はＣまたはＡであり；
Ｘ５はＧまたはＥであり；
Ｘ６はＨまたはＡであり；および
Ｘ７はＣまたはＡである。
一具現例において、前記ペプチドは、第１ジンクフィンガーであってよく、Ｘ１はＣ、Ｘ３はＮ、Ｘ４はＣ、Ｘ６はＨおよびＸ７はＣであることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｘ２はＲおよびＸ５はＥである場合、安定性が向上することができる。
一具現例において、前記ペプチドは、ＣＹＮＣＧＧＬＤＨＨＡＫＥＣで安定性が向上するように変形されたＣＲＮＣＧＥＬＤＨＨＡＫＥＣであってよい。
一具現例において、本発明のペプチドは、下記一般式２のアミノ酸配列を含んでよい：
前記式において、
Ｘ８がＤまたはＲであり；
Ｘ２はＹまたはＲであり；
Ｘ５はＧまたはＥであり；および
Ｘ９がＬまたはＷである。
Ｘ８がＤまたはＲであり；
Ｘ２はＹまたはＲであり；
Ｘ５はＧまたはＥであり；および
Ｘ９がＬまたはＷである。
一具現例において、前記一般式２におけるＸ８がＲであり、Ｘ５がＥであり、Ｘ９がＷであれば、細胞内で安定性が向上することができる。
一具現例において、前記一般式２のペプチドは、配列番号３のＧＤＲＣＹＮＣＧＧＬＤＨＨＡＫＥＣＫＬペプチドであってよく、ここで、Ｄ２Ｒ、Ｃ４Ａ、Ｙ５Ｒ、Ｎ６Ｒ、Ｎ６Ｄ、Ｃ７Ａ、Ｇ９Ｅ、Ｈ１２Ａ、Ｃ１７ＡおよびＬ１９Ｗの変異があることがあり、変異Ｄ２Ｒ、Ｙ５Ｒ、Ｇ９Ｅ、Ｌ１９Ｗは安定性を向上するが、変異Ｃ４Ａ、Ｎ６Ｒ、Ｎ６Ｄ、Ｃ７Ａ、Ｈ１２ＡおよびＣ１７Ａは安定性が減少されることがある。
一具現例において、一般式２および配列番号２のペプチドでＸ８、Ｘ５およびＸ９は、安定性残基であり；４番目Ｃ、７番目Ｃ、１２番目Ｈおよび１７番目Ｃは、ジンクフィンガーであり；３番目Ｒ、Ｘ２および１５番目Ｋは、親和性残基であり；および６番目Ｎは、ＲＮＡ結合残基であってよい。
一具現例において、Ｎ－末端（アミノ末端）に配列番号４のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＮ－末端に追加されることがさらに好ましい。前記配列番号４のアミノ酸は、ＣＰＰドメインであってよく、これを配列番号５または６に変更することができる。
一具現例において、Ｎ－末端に配列番号５のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＮ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｎ－末端に配列番号６のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＮ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｎ－末端にアミノ酸ＥまたはＧＳＥをさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＮ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｎ－末端にＨｉｓタグをさらに含んでよく、Ｈｉｓタグは６繰り返した６ＸＨｉｓであってよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＮ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｃ－末端（カルボキシ末端）に配列番号７のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＣ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｃ－末端に配列番号８のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＣ－末端に追加されることがさらに好ましい。前記配列番号８のアミノ酸配列は、ジンクフィンガー（第２ジンクフィンガー）であってよい。
一具現例において、Ｃ－末端に配列番号９のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＣ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、Ｃ－末端に配列番号１０のアミノ酸配列をさらに含んでよく、一般式２および配列番号２のペプチドのＣ－末端に追加されることがさらに好ましい。
一具現例において、前記ペプチドは、生体内のタンパク質切断酵素から保護して安定性を増加させるためにペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端を変形するか、複数の有機端で保護させることができ、その例として、Ｃ－末端がアミド化されたものであってよい。
一具現例において、前記ペプチドは、配列番号３７～４０のうちいずれか一つのアミノ酸配列からなるものであってよい（ＬＰＸ１０５およびその変異体）。
一具現例において、前記ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列からなるＬＰＸ１０１、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＬＰＸ１０２、配列番号１３のアミノ酸配列からなるＬＰＸ１０３および配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬＰＸ１０４からなる群より１以上選択されたペプチド変異体であってよい。
一具現例において、前記ＬＰＸ１０３ペプチド変異体は、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６からなる群より選択されたアミノ酸配列からなるペプチド変異体であってよい。
一具現例において、前記ＬＰＸ１０４ペプチド変異体は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群より１以上選択されたアミノ酸配列からなるペプチド変異体であってよい。
一具現例において、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列からなるものであってよく、配列番号３８のアミノ酸配列、配列番号３９のアミノ酸配列および配列番号４０のアミノ酸配列をさらに含んでよい。
上述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。また、前記変形されたペプチドは、保護基により優れた熱安定性を示し、また酸とアルカリなどの物理化学的因子に対する安定性に優れる。よって、本発明のペプチドは、長期保存性に優れるように変形され得るので、医薬品、医薬外品、化粧品および口腔用品のような長期間保存が要求される製品に有利に適用されることができる。
上述したアミノ酸の変形（または変異または突然変異）は、本発明のペプチド安定性を大きく改善する作用をし、本発明において言及される用語「安定性」は、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性だけでなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。
本発明において、「特定配列番号で構成されるペプチド」と記載されているとしても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、該当配列番号のアミノ酸配列前後の無意味な配列追加または自然に発生し得る突然変異、あるいはその潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くものではなく、このような配列追加あるいは突然変異を有する場合にも、本願の範囲内に属することが自明である。
本発明において、ペプチド配列の変形は、一部アミノ酸が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、追加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）、除去（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）および修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のうちいずれか一つの方法またはこのような方法の組み合わせを通じて変形されたものであってよい。このような変形は、Ｌ－型あるいはＤ－型アミノ酸、および／または非－天然型アミノ酸を利用した変形；および／または天然型配列を改質、例えば、側鎖官能基の変形、分子内共有結合、例えば、側鎖間環形成、メチル化、アシル化、ユビキチン化、リン酸化、アミノヘキサン化、ビオチン化などのように改質することで変形することをすべて含む。前記置換されるか追加されるアミノ酸は、ヒトタンパク質で通常的に観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型または非－自然的発生アミノ酸を使用することができる。非定型アミノ酸の商業的出処には、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐとＧｅｎｚｙｍｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。このようなアミノ酸が含まれたペプチドと定型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、または韓国のＡｎｙｇｅｎを通じて合成および購買可能である。
本発明において使用する用語「ペプチド」は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されることができ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ、ｅｔ ａｌ．、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ．ｅｄ．、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１１（１９８４））、遺伝子操作技術によって生産することもできる。
具体的に、本発明のペプチドは、標準合成方法、組換え発現システム、または任意の他の当該分野の方法によって製造されることができる。よって、本発明に係るペプチドは、例えば、下記を含む方法を含む多数の方法で合成されることができる：
（ａ）ペプチドを固体状または液体状方法の手段で段階的にまたは断片組み立てによって合成し、最終ペプチド生成物を分離および精製する方法；または
（ｂ）ペプチドをエンコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；または
（ｃ）ペプチドをエンコードする核酸作製物の無細胞試験管内の発現を遂行し、発現生成物を回収する方法；または
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせでペプチドの断片を修得し、次いで断片を連結させてペプチドを修得し、当該ペプチドを回収する方法。
（ａ）ペプチドを固体状または液体状方法の手段で段階的にまたは断片組み立てによって合成し、最終ペプチド生成物を分離および精製する方法；または
（ｂ）ペプチドをエンコードする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；または
（ｃ）ペプチドをエンコードする核酸作製物の無細胞試験管内の発現を遂行し、発現生成物を回収する方法；または
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせでペプチドの断片を修得し、次いで断片を連結させてペプチドを修得し、当該ペプチドを回収する方法。
より具体的な例として、遺伝子操作を通じて、融合パートナーおよび本発明のペプチドを含む融合タンパク質をコードする融合遺伝子を製造し、これを宿主細胞に形質転換させた後、融合タンパク質形態で発現し、タンパク質分解酵素または化合物を利用して融合タンパク質から本発明のペプチドを切断、分離して所望する本発明のペプチドを生産することができる。そのために、例えば、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａやエンテロキナーゼのようなタンパク質分解酵素、ＣＮＢｒまたはヒドロキシルアミンのような化合物によって切断できるアミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列を融合パートナーと本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドとの間に挿入することができる。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチド配列を含むベクターまたは前記ベクターに形質転換された宿主細胞に関する。
本発明において使用される用語「ヌクレオチド」は、単一鎖または二本鎖の形態で存在するジオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、他に特に言及されていない限り、自然のヌクレオチドの類似体を含む（Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３－５８４（１９９０））。
本発明において使用される用語「ヌクレオチド」は、単一鎖または二本鎖の形態で存在するジオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、他に特に言及されていない限り、自然のヌクレオチドの類似体を含む（Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３－５８４（１９９０））。
本発明において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞に挿入されて宿主細胞ゲノムと組換えられ、これに挿入されるか、またはエピゾームとして自発的に複製するコンピタントヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味する。このようなベクターとしては、線形核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどがある。
本発明において使用される用語「宿主細胞」は、一つ以上のＤＮＡまたはベクターが導入される真核または原核細胞を指し、特定対象細胞だけでなく、その子孫あるいは潜在的な子孫までも指すものと理解されなければならない。ある変形が突然変異あるいは環境的影響のために後続世代に起きることができるため、実際には前記子孫は親細胞と同一ではないが、本発明において使用されたように、前記用語の範疇内で依然として含まれる。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを含む細胞増殖および移動促進用組成物に関する。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを含む細胞透過伝達体に関する。
一具現例において、本発明の細胞透過伝達体は、薬物伝達体として使用されることができる。
通常的に、細胞透過性ペプチドは、目的カーゴと非共有結合または共有結合を通じて連結されて構成されることができる。特に、細胞透過性ペプチドと目的カーゴが化学的交差－連結（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）を通じて共有結合コンジュゲートを形成することが好ましい（Ｚａｔｓｅｐｉｎ、ＴＳ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．、１１：３６３９－３６５４（２００５））。よって、本発明のペプチドは、目的カーゴと共有結合または非共有結合的に連結されて細胞または組織内に伝達させる機能をすることができる。
通常的に、細胞透過性ペプチドは、目的カーゴと非共有結合または共有結合を通じて連結されて構成されることができる。特に、細胞透過性ペプチドと目的カーゴが化学的交差－連結（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇ）を通じて共有結合コンジュゲートを形成することが好ましい（Ｚａｔｓｅｐｉｎ、ＴＳ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．、１１：３６３９－３６５４（２００５））。よって、本発明のペプチドは、目的カーゴと共有結合または非共有結合的に連結されて細胞または組織内に伝達させる機能をすることができる。
本発明において使用される用語「目的カーゴ（ｃａｒｇｏ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」は、共有結合または非共有結合を通じて本発明のペプチドとコンジュゲートを成して細胞内に運搬されようとする物質を意味し、例えば、化学物質、ナノ粒子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を含むが、これに限定されるものではない。また、目的カーゴがポリペプチドである場合、本発明の薬物伝達体は、本発明のペプチドを含む細胞透過伝達体と目的カーゴとの間にリンカーをさらに含むことができる。本発明において利用されるリンカーとしては、当業界に公知の多様なリンカーを利用することができる。前記リンカーは、本発明ペプチドの活性、すなわち細胞透過活性を最大化するために特に選択された長さおよび／または配列を有することができる。具体的には、前記リンカーは、複数のアミノ酸残基からなるリンカーである。アミノ酸配列からなるリンカーは、Ｈｕｓｔｏｎ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６－８８（１９９１）、およびＷｈｉｔｌｏｗ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、６：９８９（１９９３））に開示されており、前記文献は、本発明に参照として挿入される。
本発明の薬物伝達体は、多様な目的で利用されることができる。具体的には、本発明の薬物伝達体は、化学物質、核酸、ナノ粒子などの物質の運搬に利用されることができ、前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＰＮＡを含むが、これに限定されるものではない。また本発明の薬物伝達体は、運搬対象のカーゴによって、疾病または疾患の治療、特定細胞の検出、疾病（例えば、癌）の診断、特定細胞の位置追跡およびｉｎ ｖｉｖｏイメージングなどに利用されることができる。本発明において使用される用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含むことができる（Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３－５８４（１９９０））。
また本発明の薬物伝達体を構成するペプチドおよび目的カーゴに対して多様な標識物質が利用されることができ、例えば、蛍光物質［例えば、フルオレセイン、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン６Ｇ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇ）、ローダミンＢ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）、ＴＡＭＲＡ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＤＡＰＩ（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）およびＣｏｕｍａｒｉｎ］、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ルシフェラーゼまたはその変異体）、放射性同位体（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２およびＳ３５）、化学物質（例えば、ビオチン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）およびＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含む。本発明の薬物伝達体が放射性同位体を含んで構成される場合（例えば、本発明のペプチドおよびナノ粒子構成）、単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ、Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）に適用されて組織のイメージングに利用されることもできる。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを含む組織再生用組成物に関する。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含む血管新生促進用組成物に関する。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含む傷治癒用薬学的組成物に関する。
一具現例において、傷は、非－治癒外傷性傷、放射線照射による組織の破壊、擦過傷（ａｂｒａｓｉｏｎ）、骨壊死、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）、剥離創（ａｖｕｌｓｉｏｎ）、穿通創（ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ ｗｏｕｎｄ）、銃創（ｇｕｎｓｈｏｔ ｗｏｕｎｄ）、切り傷、凍傷、打撲傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ ｏｒ ｂｒｕｉｓｅ）、皮膚潰瘍、皮膚乾燥、皮膚角化症、割れる、裂ける、皮膚炎、皮膚糸状菌症による痛み、手術傷、血管疾患傷、角膜傷などの傷、褥瘡、臥瘡、糖尿性皮膚びらんのような糖尿病および循環不良に関わる状態、慢性潰瘍、整形手術後の縫合部位、脊椎傷害性傷、産婦人科的傷、化学的傷またはにきびであってよい。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含む血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
一側面において、本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含む血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物に関する。
一具現例において、血管新生依存性疾患は、虚血性疾患、傷、火傷、乾癬、慢性潰瘍、心筋梗塞、狭心症、褥瘡、脱毛、糖尿網膜症、未熟児網膜症、年齢関連黄斑変性症、緑内障、糖尿性潰瘍、肺高血圧および脳血管性認知症からなる群より選択される一つ以上であってよい。
一具現例において、虚血性疾患は、脳虚血、心臓虚血、糖尿病性血管心腸疾患、心不全、心筋肥大症、網膜虚血、虚血性大腸炎、虚血性急性腎不全、脳卒中、脳外傷および新生児低酸素症からなる群より選択される一つ以上であってよい。
本発明において、用語「予防」とは、本発明に係るタンパク質またはその断片、またはこれを含む組成物の投与によって血管新生依存性疾患の発生、拡散および再発を抑制または遅延させる全ての行為を意味する。
本発明の組成物の治療的に有効な量は、いくつかの要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって変わり得る。したがって、人体に使用する際の投与量は、安全性および効率性を一緒に考慮して適正量で決定しなければならない。動物実験を通じて決定した有効量から、ヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮されるべきこれらの事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において使用される用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険比率で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味し、有効用量水準は、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、配合または同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られた要素に基づいて決定することができる。本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤と順次にまたは同時に投与されることができ、単一または多重投与されることができる。前記要素をいずれも考慮して、副作用なく最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定され得る。
本発明の薬学組成物は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤、または２つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。本発明において使用される用語「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出する細胞やヒトに毒性がない特性を示すことを意味する。前記担体は、組成物を生体内伝達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうちの１成分以上を混合して利用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。
一具現例において、前記薬学組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液および噴霧剤を含む群から選択される１つ以上の剤形であってよい。
本発明の組成物はまた、生物学的製剤に通常的に使用される担体、希釈剤、賦形剤、または２つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、組成物を生体内伝達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうちの１成分以上を混合して利用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような、注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。
本発明の組成物にさらに同一または類似する機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。本発明の組成物は、組成物総重量に対して前記タンパク質を０．０００１～１０重量％で、好ましくは０．００１～１重量％を含む。
本発明の薬学組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダル二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファー化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどが使用されることができる。本発明に係る薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部～９０重量部含まれることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、目的とする方法によって非経口投与（例えば静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などにより、その範囲が多様である。本発明に係る組成物の一日投与量は、０．０００１～１０ｍｇ／ｍ であり、好ましくは、０．０００１～５ｍｇ／ｍ であり、一日一回～数回に分けて投与することがさらに好ましい。
本発明の組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが一緒に含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。
発明の実施のための形態
下記の実施例を通じて、本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであって、これにより本発明が限定されるものではない。
下記の実施例を通じて、本発明をより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は、本発明の内容を具体化するためのものであって、これにより本発明が限定されるものではない。
実施例１．ＬＰＸペプチドの特性確認
１－１．細胞透過効果
シグナルペプチド、ＲＮＡ結合親和性残基（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｄｕｅ）およびＲＮＡ結合残基を含み（図１）、２個のジンクフィンガーモチーフを有する３種の構造の浸透性ペプチドＬＰＸ１０１（配列番号１１）、ＬＰＸ１０２（配列番号１２）およびＬＰＸ１０３（配列番号１３）の細胞透過効果を確認した。具体的に、細胞透過効率を測定するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株およびｍＭＳＣｓ（マウス間葉系幹細胞）にＫｅｐｌａｎ ｇｒｏｕｐで使用したＨｅｐａｒｉｎ ＆ Ｔｒｙｐｓｉｎ ｗａｓｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ［Ｋａｐｌａｎ ＩＭ、Ｗａｄｉａ ＪＳ、Ｄｏｗｄｙ ＳＦ（２００５）Ｃａｔｉｏｎｉｃ ＴＡＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｅｎｔｅｒｓ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ １０２：２４７－２５３］を適用して細胞膜表面に付いていることもある各ペプチドを無くした。その後、ＬＰＸ１０１（２０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＸ１０３およびＬＰＸ１０２（０、０．１、１、２、４μｇ／ｍｌ）ペプチドをそれぞれＬｉｆｅＴｅｉｎ（ＵＳＡ）でＦＩＴＣを付けた形態で合成した後、各細胞を育てる培地に１μＭの濃度で各ペプチドを入れて、１時間の間３７℃でインキュベーションした。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄してトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）で細胞を取り外してＦＡＣＳ分析を遂行した。また、それぞれのペプチドが実際に細胞内の核内または細胞質内に存在するかをペプチド処理１８時間後に共焦点顕微鏡で確認し、膜結合に対してＰＫＨで標識した。
１－１．細胞透過効果
シグナルペプチド、ＲＮＡ結合親和性残基（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｓｉｄｕｅ）およびＲＮＡ結合残基を含み（図１）、２個のジンクフィンガーモチーフを有する３種の構造の浸透性ペプチドＬＰＸ１０１（配列番号１１）、ＬＰＸ１０２（配列番号１２）およびＬＰＸ１０３（配列番号１３）の細胞透過効果を確認した。具体的に、細胞透過効率を測定するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株およびｍＭＳＣｓ（マウス間葉系幹細胞）にＫｅｐｌａｎ ｇｒｏｕｐで使用したＨｅｐａｒｉｎ ＆ Ｔｒｙｐｓｉｎ ｗａｓｈｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ［Ｋａｐｌａｎ ＩＭ、Ｗａｄｉａ ＪＳ、Ｄｏｗｄｙ ＳＦ（２００５）Ｃａｔｉｏｎｉｃ ＴＡＴ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｅｎｔｅｒｓ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ １０２：２４７－２５３］を適用して細胞膜表面に付いていることもある各ペプチドを無くした。その後、ＬＰＸ１０１（２０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＸ１０３およびＬＰＸ１０２（０、０．１、１、２、４μｇ／ｍｌ）ペプチドをそれぞれＬｉｆｅＴｅｉｎ（ＵＳＡ）でＦＩＴＣを付けた形態で合成した後、各細胞を育てる培地に１μＭの濃度で各ペプチドを入れて、１時間の間３７℃でインキュベーションした。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄してトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）で細胞を取り外してＦＡＣＳ分析を遂行した。また、それぞれのペプチドが実際に細胞内の核内または細胞質内に存在するかをペプチド処理１８時間後に共焦点顕微鏡で確認し、膜結合に対してＰＫＨで標識した。
その結果、ＬＰＸ１０１の場合、２μＭおよび５μＭ濃度の両方で高い細胞透過率を示し、大部分のＬＰＸ１０１が細胞質内に存在していることを確認することができた（図２）。また、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３の両方とも２μＭ以上の濃度でＬＰＸ１０１（２μＭ）と類似した程度で高い細胞透過率とともに類似した細胞内残存を確認することができた（図３）。
１－２．細胞生長および移動促進効果
ＬＰＸ１０１ペプチドが細胞生長に及ぼす影響をＮＩＨ３Ｔ３細胞株で確認し、ＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３ペプチドが細胞移動に及ぼす影響を糖尿病細胞株であるＤＨＥＫ（Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）で確認した。具体的に、ｍＭＳＣまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞にＬＰＸ１０１ペプチドを処理して１時間の間培養した後、洗浄した。処理３日後、細胞の数字を測定して対照群対比相対的増殖割合を％で計算することで、ＬＰＸ処理による細胞成長の％増加を確認した（ｎ＝３）。また、細胞移動効果を確認するために、ＤＨＥＫ細胞にＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３ペプチドをそれぞれ処理し、１時間の間培養した後、洗浄した。その後、スクラッチされた境界を横切る細胞の移動を処理後７２時間に測定した。スクラッチラインを横切って移動した細胞の数は、ＩｍａｇｅＪを使用したイメージ分析で測定した。
ＬＰＸ１０１ペプチドが細胞生長に及ぼす影響をＮＩＨ３Ｔ３細胞株で確認し、ＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３ペプチドが細胞移動に及ぼす影響を糖尿病細胞株であるＤＨＥＫ（Ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）で確認した。具体的に、ｍＭＳＣまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞にＬＰＸ１０１ペプチドを処理して１時間の間培養した後、洗浄した。処理３日後、細胞の数字を測定して対照群対比相対的増殖割合を％で計算することで、ＬＰＸ処理による細胞成長の％増加を確認した（ｎ＝３）。また、細胞移動効果を確認するために、ＤＨＥＫ細胞にＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３ペプチドをそれぞれ処理し、１時間の間培養した後、洗浄した。その後、スクラッチされた境界を横切る細胞の移動を処理後７２時間に測定した。スクラッチラインを横切って移動した細胞の数は、ＩｍａｇｅＪを使用したイメージ分析で測定した。
その結果、ＬＰＸ１０１ペプチドは、２μＭおよび５μＭ濃度の両方で細胞生長を促進させ、ＤＨＥＫ細胞の移動を促進させることが示された（図４）。また、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３ペプチドはさらに低い濃度でＬＰＸ１０１と類似した程度で細胞の移動を促進させることが示された（図５）。
１－３．血管形成促進効果
Ｈｕｖｅｃ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）をサイトカイン－無しマトリゲルに分注し、ＬＰＸ１０１を一日間処理した（ｎ＝３、１ｅｘｐｔ）。その後、１９日後に血管形成を顕微鏡で確認し、結節（ｎｏｄｕｌｅｓ）の数、血管内連接（ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）の数およびマスターセグメント（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ）の数を含む血管形成変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を定量した。
Ｈｕｖｅｃ（Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）をサイトカイン－無しマトリゲルに分注し、ＬＰＸ１０１を一日間処理した（ｎ＝３、１ｅｘｐｔ）。その後、１９日後に血管形成を顕微鏡で確認し、結節（ｎｏｄｕｌｅｓ）の数、血管内連接（ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ）の数およびマスターセグメント（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ）の数を含む血管形成変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を定量した。
その結果、内皮細胞は、ＬＰＸ１０１ペプチド処理によってより成熟した毛細血管輪を形成することが示された（図６）。
実施例２．ＬＰＸペプチドの抗－糖尿効果確認
２－１．グルコース吸収能向上効果
ヒト皮膚線維芽細胞株ＨＤＦ（Ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）および糖尿病細胞株ＤＨＥＫをグルコースがない培地で２４時間の間培養した後、２μＭ（２０μｇ／ｍｌ）のＬＰＸ１０１、１μＭのＬＰＸ１０２または１μＭのＬＰＸ１０３を１８時間の間処理した後、２ＤＧ（２－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）を処理した。吸収されたグルコースの量をｌｕｍｉｎｉｓｃｅｍｃｅ ｋｉｔ（ｐｒｏｍｅｇａ）で反応させた後、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭａｘＬ装備を使用して４７０ｎｍで測定することで、相対的なグルコース吸収量を測定した（平均ＳＥＭ、ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
２－１．グルコース吸収能向上効果
ヒト皮膚線維芽細胞株ＨＤＦ（Ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）および糖尿病細胞株ＤＨＥＫをグルコースがない培地で２４時間の間培養した後、２μＭ（２０μｇ／ｍｌ）のＬＰＸ１０１、１μＭのＬＰＸ１０２または１μＭのＬＰＸ１０３を１８時間の間処理した後、２ＤＧ（２－ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）を処理した。吸収されたグルコースの量をｌｕｍｉｎｉｓｃｅｍｃｅ ｋｉｔ（ｐｒｏｍｅｇａ）で反応させた後、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭａｘＬ装備を使用して４７０ｎｍで測定することで、相対的なグルコース吸収量を測定した（平均ＳＥＭ、ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。
その結果、ＬＰＸペプチドは、糖尿病細胞株を含む様々な哺乳動物細胞でいずれもグルコース吸収を向上することが示された（図７）。
２－２．解糖（ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）向上効果
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をグルコース－無し培地で１日間培養した後グルコース、オリゴマイシンおよび２－ＤＧを順次に処理し、ＸＦ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ ｅｘｔｒｑａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｘ）分析器を利用してラクテート生産の測定としてＥＣＡＲ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を測定し、ＬＰＸペプチドが処理された細胞でＥＣＡＲの定量およびプロファイルを確認した（平均ＳＥＭ ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５）。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をグルコース－無し培地で１日間培養した後グルコース、オリゴマイシンおよび２－ＤＧを順次に処理し、ＸＦ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ ｅｘｔｒｑａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｌｕｘ）分析器を利用してラクテート生産の測定としてＥＣＡＲ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を測定し、ＬＰＸペプチドが処理された細胞でＥＣＡＲの定量およびプロファイルを確認した（平均ＳＥＭ ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５）。
その結果、ＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３ペプチドは、グルコース代謝（解糖）を促進することが示された（図８）。
２－４．糖尿病性傷治癒効果
２－４－１．糖尿病性傷治癒効果確認
野生型（ＷＴ）マウスおよび糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）（それぞれｎ＝１４）の皮膚を８ｍｍ直径のパンチャーでパンチングし、１４日間毎日ＬＰＸ１０１（２ｍｇ／ｍｌ、２０ｕｌ）またはＰＢＳを処理し、傷ドレッシングを実施した。傷治癒効果は、初期傷領域および再－上皮化領域をＩｍａｇｅＪを使用して分析して確認した（平均ＳＥＭ ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５）。また、ＬＰＸ１０１が処理された傷における傷治癒効果を組織学的に評価した。具体的に、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）を傷誘導７日および１４日後、Ｈ／Ｅまたはトリクロームで染色した後、顕微鏡で確認し、ＩｍａｇｅＪを利用して再－上皮化および顆粒化組織を定量した（ｎ＝３、＊＊＊；ｐ＜０．００１）。併せて、ｄｂ／ｄｂマウスの傷にＬＰＸ１０１処理し、１４日後の組織表皮を組織学的に分析した。
２－４－１．糖尿病性傷治癒効果確認
野生型（ＷＴ）マウスおよび糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）（それぞれｎ＝１４）の皮膚を８ｍｍ直径のパンチャーでパンチングし、１４日間毎日ＬＰＸ１０１（２ｍｇ／ｍｌ、２０ｕｌ）またはＰＢＳを処理し、傷ドレッシングを実施した。傷治癒効果は、初期傷領域および再－上皮化領域をＩｍａｇｅＪを使用して分析して確認した（平均ＳＥＭ ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５）。また、ＬＰＸ１０１が処理された傷における傷治癒効果を組織学的に評価した。具体的に、糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）を傷誘導７日および１４日後、Ｈ／Ｅまたはトリクロームで染色した後、顕微鏡で確認し、ＩｍａｇｅＪを利用して再－上皮化および顆粒化組織を定量した（ｎ＝３、＊＊＊；ｐ＜０．００１）。併せて、ｄｂ／ｄｂマウスの傷にＬＰＸ１０１処理し、１４日後の組織表皮を組織学的に分析した。
その結果、ＬＰＸ１０１ペプチドは、ＷＴマウスの傷治癒を加速化させ、ｄｂ／ｄｂマウスモデルで糖尿病性傷の治癒を顕著にさらに加速化させることが示された（図９）。また、ＬＰＸ１０１ペプチドの処理により糖尿病性マウスモデルに誘導された傷が７日目（治癒過程の中間）に顆粒化組織の早期形成を誘発し、１４日目（治癒過程の終わり）に顆粒化組織の早期収縮（リモデリング）を誘発することが示された（図１０）。併せて、１４日目の表皮を組織学的に分析した結果、ＬＰＸ１０１処理により過角化症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）、不全角化症（ｐａｒａｋｅｒａｔｏｓｉｓ）および棘細胞症（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）が早期に減少したことが示され、再生された傷上皮のリモデリングが加速化された（図１１）。
２－４－２．ＳＴＺ－誘導糖尿病マウスモデルで傷治癒効果
ＳＴＺ－誘導糖尿病マウスモデルでＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３の傷治癒効果を確認した。具体的に、マウスにＳＴＺ（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を５日間注射して糖尿病を誘発し、これにより高血糖症が発生した。その後、図１２Ａに示したスケージュールでＰＢＳ（陰性対照群）、ＥＧＦ（陽性対照群）５０μｇ／ｍｌ、ＬＰＸ１０１ ２ｍｇ／ｍｌ（２０μｌ）、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３（２ｍｇ／ｍｌ（２０μｌ））をそれぞれ処理した後、イメージ、再上皮化および糖尿病表現型（高血糖症およびブドウ糖耐性検査ＩＰＧＴＴ（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ））を通じて糖尿病が誘発されたマウスモデルにおける傷治癒効果を確認した（各群当たりｎ＝１０、＊；ｐ＜０．０５）。また、ＬＰＸペプチドの糖尿病マウスモデルに対する再生活性を比較するために、初期傷領域に対する％非－上皮化領域によって測定された傷治癒動力学（各グループに対して、ｎ＝８）、および初期傷部位に対する再上皮化面積の％で分析された再－上皮化の定量化を確認した。
ＳＴＺ－誘導糖尿病マウスモデルでＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３の傷治癒効果を確認した。具体的に、マウスにＳＴＺ（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を５日間注射して糖尿病を誘発し、これにより高血糖症が発生した。その後、図１２Ａに示したスケージュールでＰＢＳ（陰性対照群）、ＥＧＦ（陽性対照群）５０μｇ／ｍｌ、ＬＰＸ１０１ ２ｍｇ／ｍｌ（２０μｌ）、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３（２ｍｇ／ｍｌ（２０μｌ））をそれぞれ処理した後、イメージ、再上皮化および糖尿病表現型（高血糖症およびブドウ糖耐性検査ＩＰＧＴＴ（ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ））を通じて糖尿病が誘発されたマウスモデルにおける傷治癒効果を確認した（各群当たりｎ＝１０、＊；ｐ＜０．０５）。また、ＬＰＸペプチドの糖尿病マウスモデルに対する再生活性を比較するために、初期傷領域に対する％非－上皮化領域によって測定された傷治癒動力学（各グループに対して、ｎ＝８）、および初期傷部位に対する再上皮化面積の％で分析された再－上皮化の定量化を確認した。
その結果、ＬＰＸペプチドは、いずれもＳＴＺによって誘導された糖尿病性傷モデル（明白な高血糖症であるマウス選別）でＥＧＦよりも傷治癒効果が向上したことが示され、特に、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３はＬＰＸ１０１よりさらに優れた効果を示した（図１２）。また、傷治癒動力学および再－上皮化を定量した結果においても、ＬＰＸ１０１よりＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３がｄｂ／ｄｂマウスモデルで糖尿病性傷治癒効果に優れることが示された（図１３）。
２－４－３．血管形成促進を通じた糖尿病性傷治癒効果
糖尿病性潰瘍は、血管新生障害および虚血性壊死による血管供給不足のために治療が難しいことから、ＬＰＸペプチドが糖尿病性傷治癒で血管形成に寄与するかを確認した。具体的に、糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）に傷をつけた後、ＬＰＸ１０３またはＥＧＦを毎日１回ずつ処理し、傷発生７日目に血管新生の回復に対して分析し、組織内赤血球の血管外の流出を視覚化するために、各グループの傷および入口（赤色点線ボックス）を拡大してイメージを確認した。
糖尿病性潰瘍は、血管新生障害および虚血性壊死による血管供給不足のために治療が難しいことから、ＬＰＸペプチドが糖尿病性傷治癒で血管形成に寄与するかを確認した。具体的に、糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）に傷をつけた後、ＬＰＸ１０３またはＥＧＦを毎日１回ずつ処理し、傷発生７日目に血管新生の回復に対して分析し、組織内赤血球の血管外の流出を視覚化するために、各グループの傷および入口（赤色点線ボックス）を拡大してイメージを確認した。
その結果、ＬＰＸ１０３を処理した群は、ＥＧＦを処理した群よりさらに成熟した毛細血管形成を示し、さらに少ない出血（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）（ＲＢＣの血管外流出）を形成した（図１４）。
２－４－４．ＬＰＸペプチドによる再－上皮化の組織学的評価
ＬＰＸペプチド１０１、１０２および１０３による糖尿病マウスの傷の再－上皮化を組織学的に評価するために、それぞれのＬＰＸによって治療された糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）傷組織を初期損傷後１０日目にＨ／Ｅ染色して顕微鏡（５０Ｘおよび１００ｘ）で確認した。
ＬＰＸペプチド１０１、１０２および１０３による糖尿病マウスの傷の再－上皮化を組織学的に評価するために、それぞれのＬＰＸによって治療された糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）傷組織を初期損傷後１０日目にＨ／Ｅ染色して顕微鏡（５０Ｘおよび１００ｘ）で確認した。
その結果、糖尿病性傷の再－上皮化をＬＰＸペプチド１０１、１０２および１０３の両方が顕著に向上することが示された（図１５）。
２－４－５．併用投与
ＬＰＸペプチドとＥＧＦとの併用処理による糖尿病性傷治癒効果を確認した。具体的に、糖尿病マウスモデル（ｄｂ／ｄｂ）を８ｍｍ直径でパンチングして傷をつけ、ＬＰＸペプチド（１０１、１０２または１０３）および／またはＥＧＦの組み合わせで図１５Ａに示したスケージュールで処理し、そのイメージを顕微鏡で観察し、初期傷発生後、再－上皮化に対する効果を確認した。また、
ＬＰＸペプチドとＥＧＦとの併用処理による糖尿病性傷治癒効果を確認した。具体的に、糖尿病マウスモデル（ｄｂ／ｄｂ）を８ｍｍ直径でパンチングして傷をつけ、ＬＰＸペプチド（１０１、１０２または１０３）および／またはＥＧＦの組み合わせで図１５Ａに示したスケージュールで処理し、そのイメージを顕微鏡で観察し、初期傷発生後、再－上皮化に対する効果を確認した。また、
その結果、それぞれのＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２およびＬＰＸ１０３は、いずれもＥＧＦとの併用処理時に糖尿病性傷治癒効果が向上することが示された（図１６）。
これを通じて、ＬＰＸペプチドが既存に治療が難しかった糖尿病性傷（潰瘍）の再生を多層的に向上することが分かった（図１７）。
実施例３．ＬＰＸペプチドの変形による活性確認
３－１．ペプチド変異体作製
前記ＬＰＸペプチドの多様な変異体を図１８のように作製した。具体的に、図１９のＬＰＸ１０１の構造で多様な変異（ＣＰＰ領域の置換、ＲＮＡ結合部分およびジンクフィンガー構造のアミノ酸変異、およびＨｉｓタグ追加）を付加して多様なコンストラクト（１０１含む２６種）を作製した（図２０）。さらに、ＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２、ＬＰＸ１０３およびＬＰＸ１０４（配列番号１４）のＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する細胞移動効果を比較した結果、下記表１のように互いに類似した水準であることが示された。
３－１．ペプチド変異体作製
前記ＬＰＸペプチドの多様な変異体を図１８のように作製した。具体的に、図１９のＬＰＸ１０１の構造で多様な変異（ＣＰＰ領域の置換、ＲＮＡ結合部分およびジンクフィンガー構造のアミノ酸変異、およびＨｉｓタグ追加）を付加して多様なコンストラクト（１０１含む２６種）を作製した（図２０）。さらに、ＬＰＸ１０１、ＬＰＸ１０２、ＬＰＸ１０３およびＬＰＸ１０４（配列番号１４）のＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する細胞移動効果を比較した結果、下記表１のように互いに類似した水準であることが示された。
３－２．ＣＰＰ領域置換による活性変化確認
ＣＰＰ領域配列の置換による生物学的活性変化を確認するために、図２１Ａのようにジンクフィンガー２領域のうちＲＮＡ結合位置を含む配列番号７を含むＬＰＸ１０４（＃４）でＣＰＰ領域をＨＩＶのＴＡＴまたはＡｒｇ繰り返し（Ｒ９）配列で置換した後（それぞれＴＡＴ－１０４およびＲ９－１０４）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する、細胞透過効果、細胞透過２４時間後のペプチドの安定性、細胞移動効果および細胞生長効果を比較した。
ＣＰＰ領域配列の置換による生物学的活性変化を確認するために、図２１Ａのようにジンクフィンガー２領域のうちＲＮＡ結合位置を含む配列番号７を含むＬＰＸ１０４（＃４）でＣＰＰ領域をＨＩＶのＴＡＴまたはＡｒｇ繰り返し（Ｒ９）配列で置換した後（それぞれＴＡＴ－１０４およびＲ９－１０４）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する、細胞透過効果、細胞透過２４時間後のペプチドの安定性、細胞移動効果および細胞生長効果を比較した。
その結果、ＬＰＸペプチドでＣＰＰ領域のＴＡＴまたはＡｒｇ（９）残基への置換は、細胞－浸透、細胞増殖および細胞移動に対しては、本来のＬＰＸ１０４と類似した効果を示したが（図２１Ｂ）、ペプチドの安定性は、既存のＬＰＸ１０４に比べて顕著に高く示された（図２１Ｃ）。
３－３．ＨＩＳタグ挿入による活性変化確認
エンドソーム脱出を通じた安定性が向上した突然変異を選別するために、図２２ＡのようにＬＰＸペプチドのＣＰＰ領域のＮ－末端にＨＩＳタグが繰り返した配列（６ＸＨｉｓ）を追加し（ＬＰＨ１０３またはＬＰＸ１０４）、その細胞浸透後、２４時間後の安定性、細胞移動促進効果および細胞生長促進効果を比較した。
エンドソーム脱出を通じた安定性が向上した突然変異を選別するために、図２２ＡのようにＬＰＸペプチドのＣＰＰ領域のＮ－末端にＨＩＳタグが繰り返した配列（６ＸＨｉｓ）を追加し（ＬＰＨ１０３またはＬＰＸ１０４）、その細胞浸透後、２４時間後の安定性、細胞移動促進効果および細胞生長促進効果を比較した。
その結果、ＬＰＸペプチドに６ＸＨｉｓタグを追加すると、エンドソーム脱出を助けて細胞内安定性が顕著に増加されることが示された（図２２Ｂ）。また、細胞増殖および細胞移動効果も増加させることが示された（図２２Ｃ～図２２Ｄ）。
３－４．ＲＮＡ結合領域およびジンクフィンガー領域変異による活性変化確認
ＲＮＡ結合領域およびジンクフィンガー領域における変異を有する変異体のタンパク質安定性を確認した。具体的に、細胞移動時にＲＮＡ結合のためのアミノ酸残基が変異されたＬＰＸ１０３変異体をそれぞれＮＩＨ３Ｔ３細胞に１日間処理し、分子モデリングプログラムに基づいて各ペプチドの細胞内安定化効果を７２時間後に分析し、各アミノ酸残基の突然変異エネルギーを確認し、置換で＜－１Ｋｃａｌ／ｍｏｌを引き起こすことができる変異体をペプチドの安定性および活性を増加させることができる潜在的な突然変異として選択した（図２３および２４）。選択した変異体の細胞増殖および細胞移動に対する効果をＮＩＨ３Ｔ３細胞で確認し（図２５）、これを通じて、細胞内ペプチドの安定性を向上するか減少させるＲＮＡ結合領域およびジンクフィンガー領域上の変異を確認することができた（図２６）。よって、安定性と生物学的活性が高いことと確認されたＬＰＸ１０３、ＬＰＨ１０３およびＬＰＳ１Ｏ３を選定した。
ＲＮＡ結合領域およびジンクフィンガー領域における変異を有する変異体のタンパク質安定性を確認した。具体的に、細胞移動時にＲＮＡ結合のためのアミノ酸残基が変異されたＬＰＸ１０３変異体をそれぞれＮＩＨ３Ｔ３細胞に１日間処理し、分子モデリングプログラムに基づいて各ペプチドの細胞内安定化効果を７２時間後に分析し、各アミノ酸残基の突然変異エネルギーを確認し、置換で＜－１Ｋｃａｌ／ｍｏｌを引き起こすことができる変異体をペプチドの安定性および活性を増加させることができる潜在的な突然変異として選択した（図２３および２４）。選択した変異体の細胞増殖および細胞移動に対する効果をＮＩＨ３Ｔ３細胞で確認し（図２５）、これを通じて、細胞内ペプチドの安定性を向上するか減少させるＲＮＡ結合領域およびジンクフィンガー領域上の変異を確認することができた（図２６）。よって、安定性と生物学的活性が高いことと確認されたＬＰＸ１０３、ＬＰＨ１０３およびＬＰＳ１Ｏ３を選定した。
前記実施例を通じて、ＬＰＸペプチドの生物学的活性を類似して維持するか、向上することができる残基の潜在的置換は、下記のとおりである：
１）Ｎ－末端のヒスチジン繰り返し配列追加は、安定性向上；
２）ＣＰＰのＴＡＴまたはＲ９への置換は同等な効果；
３）タンパク質の安定化を引き起こす残基変異（突然変異エネルギー＜－１Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）はＤ１６Ｒ、Ｙ１９Ｒ、Ｎ２０Ｒ、Ｇ２３Ｅ、Ｌ３３ＥおよびＬ３３Ｗである（図２６参照）；および
４）他のカテゴリー由来残基の任意の組み合わせ。
１）Ｎ－末端のヒスチジン繰り返し配列追加は、安定性向上；
２）ＣＰＰのＴＡＴまたはＲ９への置換は同等な効果；
３）タンパク質の安定化を引き起こす残基変異（突然変異エネルギー＜－１Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）はＤ１６Ｒ、Ｙ１９Ｒ、Ｎ２０Ｒ、Ｇ２３Ｅ、Ｌ３３ＥおよびＬ３３Ｗである（図２６参照）；および
４）他のカテゴリー由来残基の任意の組み合わせ。
また、生物学的活性の減少を引き起こすことができる下記の残基は、ＬＰＸペプチド変異体で保存されなければならない：
１）ジンクフィンガーモチーフの１８Ｃ、２１Ｃ、２６Ｈおよび３１Ｃ（配列番号１１のＬＰＸ１０１基準）；および
２）ＲＮＡ結合領域の２０Ｎ（配列番号１１のＬＰＸ１０１基準）。
これを通じて、ＬＰＸペプチドの安定性および生物学的活性が同等であるか、増加するため、代替（置換）または追加され得るアミノ酸残基と、安定性および生物学的活性を減少させるため、保存されなければならない残基を確認することができた。
１）ジンクフィンガーモチーフの１８Ｃ、２１Ｃ、２６Ｈおよび３１Ｃ（配列番号１１のＬＰＸ１０１基準）；および
２）ＲＮＡ結合領域の２０Ｎ（配列番号１１のＬＰＸ１０１基準）。
これを通じて、ＬＰＸペプチドの安定性および生物学的活性が同等であるか、増加するため、代替（置換）または追加され得るアミノ酸残基と、安定性および生物学的活性を減少させるため、保存されなければならない残基を確認することができた。
実施例４．ＬＰＸ１０５ペプチドの変形による活性確認
４－１．ＬＰＸ１０５ペプチド変異体作製
前記実施例３に記載された方法を用いて、ＬＰＸ１０５変異体を作製した。具体的に、配列番号３７のＬＰＸ１０５のジンクフィンガーの領域変異およびヒスチジンタグ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）挿入による効果を確認するために、ＬＰＸ１０５のジンクフィンガー領域変異と、Ｈｉｓタグを挿入して、ＬＰＳ１０５（配列番号３８）、ＬＰＨ１０５（配列番号３９）およびＬＰＨＳ１０５（配列番号４０）を作製した（図２７）。
４－１．ＬＰＸ１０５ペプチド変異体作製
前記実施例３に記載された方法を用いて、ＬＰＸ１０５変異体を作製した。具体的に、配列番号３７のＬＰＸ１０５のジンクフィンガーの領域変異およびヒスチジンタグ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）挿入による効果を確認するために、ＬＰＸ１０５のジンクフィンガー領域変異と、Ｈｉｓタグを挿入して、ＬＰＳ１０５（配列番号３８）、ＬＰＨ１０５（配列番号３９）およびＬＰＨＳ１０５（配列番号４０）を作製した（図２７）。
４－２．ＬＰＸ１０５変異体の細胞移動促進確認
前記実施例１－２に記載された方法を用いて、ＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５の細胞移動促進を確認した。具体的に、細胞移動効果を確認するために、線維芽細胞である３Ｔ３細胞にＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５ペプチドをそれぞれ処理し、１時間の間培養した後、洗浄した。その後、スクラッチされた境界を横切る細胞の移動を処理後、７２時間に測定した。スクラッチラインを横切って移動した細胞の数は、ＩｍａｇｅＪを使用したイメージ分析で測定した。
前記実施例１－２に記載された方法を用いて、ＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５の細胞移動促進を確認した。具体的に、細胞移動効果を確認するために、線維芽細胞である３Ｔ３細胞にＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５ペプチドをそれぞれ処理し、１時間の間培養した後、洗浄した。その後、スクラッチされた境界を横切る細胞の移動を処理後、７２時間に測定した。スクラッチラインを横切って移動した細胞の数は、ＩｍａｇｅＪを使用したイメージ分析で測定した。
その結果、対照群であるＰＢＳと比較して、ＬＰＸ１０５は細胞移動を有意に促進させることを確認し、ＬＰＸ１０５の変異体であるＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５がＬＰＸ１０５より細胞移動を増加させることを確認した（図２８）。
４－３．ＬＰＸ１０５変異体の糖尿病性傷治癒効果
前記実施例２－４に記載された方法を用いて、ＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５の糖尿病性傷治癒効果を評価した。詳細には、糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）（それぞれ、ｎ＝１４）の皮膚を８ｍｍ直径のパンチャーでパンチングし、１０日間毎日ＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５（３μｇ）またはＰＢＳを処理して傷ドレッシングを実施した。傷治癒効果は、初期傷領域および再－上皮化領域をＩｍａｇｅＪを使用して分析して確認した（平均ＳＥＭ ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５）。
前記実施例２－４に記載された方法を用いて、ＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５の糖尿病性傷治癒効果を評価した。詳細には、糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂ）（それぞれ、ｎ＝１４）の皮膚を８ｍｍ直径のパンチャーでパンチングし、１０日間毎日ＬＰＸ１０５、ＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５（３μｇ）またはＰＢＳを処理して傷ドレッシングを実施した。傷治癒効果は、初期傷領域および再－上皮化領域をＩｍａｇｅＪを使用して分析して確認した（平均ＳＥＭ ｎ＝３、＊；ｐ＜０．０５）。
その結果、対照群であるＰＢＳと比較して、ＬＰＸ１０５がｄｂ／ｄｂマウスモデルで糖尿病性傷の治癒をさらに加速化させることが示された。また、ＬＰＸ１０５変異体であるＬＰＨ１０５およびＬＰＨＳ１０５がＬＰＸ１０５よりさらに顕著に糖尿病性傷の治癒を加速化させることを確認した（図２９）。
Claims (24)
- 細胞透過性ドメインおよびジンクフィンガードメインを含む、細胞透過性ペプチド。
- 前記ジンクフィンガードメインは、
Ｘ１はＣまたはＡであり；
Ｘ２はＹまたはＲであり；
Ｘ３はＮ、ＲまたはＤであり；
Ｘ４はＣまたはＡであり；
Ｘ５はＧまたはＥであり；
Ｘ６はＨまたはＡであり；および
Ｘ７はＣまたはＡである、アミノ酸配列であることである、請求項１に記載のペプチド。 - ジンクフィンガードメインのＮ－末端にＧ－Ｘ８－Ｒが追加され、前記式においてＸ８がＤまたはＲである、請求項２に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記ジンクフィンガードメインのＣ－末端にＫ－Ｘ９が追加され、前記式においてＸ９がＬまたはＷである、請求項２に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ドメインは、配列番号４～６のアミノ酸配列のうちいずれか一つの配列であることである、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ペプチドは、配列番号１１～３６のアミノ酸配列のうちいずれか一つの配列からなる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記細胞透過性ドメインのＮ－末端にアミノ酸Ｅ、ＧＳＥまたはＨｉｓタグをさらに含む、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 前記ジンクフィンガードメインのＣ－末端に配列番号７～配列番号１０のアミノ酸配列のうちいずれか一つの配列を含む、請求項１に記載の細胞透過性ペプチド。
- 請求項１に記載のペプチドを暗号化する、ポリヌクレオチド。
- 請求項１３に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- 請求項１４に記載のベクターに形質転換された、宿主細胞。
- 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む、傷治癒用薬学的組成物。
- 傷は、非－治癒外傷性傷、放射線照射による組織の破壊、擦過傷（ａｂｒａｓｉｏｎ）、骨壊死、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）、剥離創（ａｖｕｌｓｉｏｎ）、穿通創（ｐｅｎｅｔｒａｔｅｄ ｗｏｕｎｄ）、銃傷（ｇｕｎｓｈｏｔ ｗｏｕｎｄ）、切り傷、凍傷、打撲傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ ｏｒ ｂｒｕｉｓｅ）、皮膚潰瘍、皮膚乾燥、皮膚角化症、割れる、裂ける、皮膚炎、皮膚糸状菌症による痛み、手術傷、血管疾患傷、角膜傷、褥瘡、臥瘡、糖尿性皮膚びらんのような糖尿病および循環不良に関わる状態、慢性潰瘍、整形手術後の縫合部位、脊椎傷害性傷、産婦人科的傷、化学的傷およびにきびからなる群より選択された傷である、請求項１６に記載の傷治癒用薬学的組成物。
- 請求項１に記載のペプチドを有効成分として含む、血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 血管新生依存性疾患は、虚血性疾患、傷、火傷、乾癬、慢性潰瘍、心筋梗塞、狭心症、褥瘡、脱毛、糖尿網膜症、未熟児網膜症、年齢関連黄斑変性症、緑内障、糖尿性潰瘍、肺高血圧および脳血管性認知症からなる群より選択される一つ以上である、請求項１８に記載の血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 虚血性疾患は、脳虚血、心臓虚血、糖尿病性血管心腸疾患、心不全、心筋肥大症、網膜虚血、虚血性大腸炎、虚血性急性腎不全、脳卒中、脳外傷および新生児低酸素症からなる群より選択される一つ以上である、請求項１９に記載の血管新生依存性疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 請求項１に記載の細胞透過性ペプチドを薬学的に有効な量で傷に投与するステップを含む、傷治癒方法。
- 請求項１に記載の細胞透過性ペプチドを薬学的に有効な量で血管新生依存性疾患を有する個体に投与するステップを含む、血管新生依存性疾患の治療方法。
- 傷治癒用組成物の製造に使用するための細胞透過性ドメインおよびジンクフィンガードメインを含む、細胞透過性ペプチドの用途。
- 血管新生依存性疾患の予防または治療用組成物の製造に使用するための細胞透過性ドメインおよびジンクフィンガードメインを含む、細胞透過性ペプチドの用途。
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