JP2004512832A - 抗−血管新生ペプチド - Google Patents
抗−血管新生ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004512832A JP2004512832A JP2002523954A JP2002523954A JP2004512832A JP 2004512832 A JP2004512832 A JP 2004512832A JP 2002523954 A JP2002523954 A JP 2002523954A JP 2002523954 A JP2002523954 A JP 2002523954A JP 2004512832 A JP2004512832 A JP 2004512832A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- peptide
- vector
- amino acid
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 169
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 96
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 85
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 45
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 22
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 13
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 11
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 230000009435 amidation Effects 0.000 claims description 11
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- -1 alanine amino acid Chemical group 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 5
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 4
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 claims description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 102100025573 1-alkyl-2-acetylglycerophosphocholine esterase Human genes 0.000 claims description 2
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 claims description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 2
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 claims description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 claims description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 2
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 2
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 claims description 2
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 claims description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 2
- GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N mercaptopurine Chemical compound S=C1NC=NC2=C1NC=N2 GLVAUDGFNGKCSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 claims description 2
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 claims description 2
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 claims description 2
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims 1
- 229930189413 Esperamicin Natural products 0.000 claims 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims 1
- 190000008236 carboplatin Chemical compound 0.000 claims 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims 1
- LJQQFQHBKUKHIS-WJHRIEJJSA-N esperamicin Chemical compound O1CC(NC(C)C)C(OC)CC1OC1C(O)C(NOC2OC(C)C(SC)C(O)C2)C(C)OC1OC1C(\C2=C/CSSSC)=C(NC(=O)OC)C(=O)C(OC3OC(C)C(O)C(OC(=O)C=4C(=CC(OC)=C(OC)C=4)NC(=O)C(=C)OC)C3)C2(O)C#C\C=C/C#C1 LJQQFQHBKUKHIS-WJHRIEJJSA-N 0.000 claims 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 abstract description 32
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 abstract description 32
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 abstract description 32
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 32
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 31
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 22
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 22
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 20
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 20
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 16
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 2
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 102220480600 Dimethylglycine dehydrogenase, mitochondrial_R23A_mutation Human genes 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 2
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 2
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 2
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 102200027048 rs121908259 Human genes 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- HFEKDTCAMMOLQP-RRKCRQDMSA-N 5-fluorodeoxyuridine monophosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 HFEKDTCAMMOLQP-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 108010001463 Collagen Type XVIII Proteins 0.000 description 1
- 102000047200 Collagen Type XVIII Human genes 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 101800003778 Fibrinopeptide B Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- XXEWFEBMSGLYBY-ZETCQYMHSA-N N(6),N(6)-dimethyl-L-lysine Chemical compound CN(C)CCCC[C@H](N)C(O)=O XXEWFEBMSGLYBY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N N(6)-acetyl-L-lysine Chemical compound CC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- PQNASZJZHFPQLE-LURJTMIESA-N N(6)-methyl-L-lysine Chemical compound CNCCCC[C@H](N)C(O)=O PQNASZJZHFPQLE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-M [(4ar,6r,7r,7ar)-6-[6-(butanoylamino)purin-9-yl]-2-oxido-2-oxo-4a,6,7,7a-tetrahydro-4h-furo[3,2-d][1,3,2]dioxaphosphinin-7-yl] butanoate Chemical compound C([C@H]1O2)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006481 angiogenic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003527 anti-angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002482 anti-endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000015916 branching morphogenesis of a tube Effects 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003529 diazepam Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004207 fentanyl citrate Drugs 0.000 description 1
- IVLVTNPOHDFFCJ-UHFFFAOYSA-N fentanyl citrate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C=1C=CC=CC=1N(C(=O)CC)C(CC1)CCN1CCC1=CC=CC=C1 IVLVTNPOHDFFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 108010068611 fibrin fragment E-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- IRYFCWPNDIUQOW-UHFFFAOYSA-N fluanisone Chemical compound COC1=CC=CC=C1N1CCN(CCCC(=O)C=2C=CC(F)=CC=2)CC1 IRYFCWPNDIUQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005220 fluanisone Drugs 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004924 lung microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- A61K38/363—Fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/75—Fibrinogen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、フィブリノーゲンから誘導化される抗−血管新生ペプチド;該ペプチドを含む医薬組成物;該ペプチドをコードする核酸および、血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう疾患に罹っている動物、好ましくはヒト、を処置する方法に関する。
Description
【0001】
本発明は、フィブリノーゲンから誘導化されるペプチドの抗−血管新生効果に関する。
【0002】
血管新生、現存する血管床から新しい血管の発育、は、細胞外マトリックスの成分の分解に引き続く、細管および結局は新しい血管を形成する内皮細胞の遊走、増殖および分化を伴うところの複雑な多段階プロセスである。血管新生は、胚移植;胚形成および発育;ならびに創傷治癒を、例示としてそして限定としてではなく、含む、正常な生理プロセスにおいて重要である。過剰な血管新生はまた、腫瘍細胞生育のような病態異常ならびに新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症のような非−がん性異常に関与する。
【0003】
血管内皮は普通は静止性である。しかしながら、活性化すると内皮細胞は増殖しかつ遊走して、発育中の組織、勿論生長中の腫瘍、に血液を供給する毛細管床を究極的に形成するであろう微小管を形成する。内皮細胞を促進し/活性化して、血管新生を受ける、数多くの成長因子が同定されている。これらには、血管内皮成長因子(VEGF);形質変換成長因子(TGFb);酸性および塩基性の繊維芽細胞成長因子(aFGFおよびbFGF);および血小板誘導化成長因子(PDGF)が、例示としてそして限定としてではなく、挙げられる(1,2)。
【0004】
VEGFは、非常に特異的な活動部位、即ち、内皮細胞の増殖、遊走および分化の促進、を有するところの内皮細胞−特異的成長因子である。VEGFは、二つの同一な23kDのポリペプチドを含む二量複合体である。VEGFの単量形は、代わりにスプライスされたmRNAからそれぞれが誘導化される、異なる分子量を持つ四つの別なポリペプチドとして存在し得る。四つの単量体のうち、二つは膜結合VEGFとして存在しそして二つは可溶性である。VEGFは、胚性組織;増殖性角化細胞;マクロファージ;腫瘍細胞を含む多種の細胞/組織タイプによりにより発現される。研究(2)は、VEGFが、神経膠腫およびAIDS−関連カポジ肉腫を含む多くの腫瘍細胞株中で高度に発現されることを示している。VEGF活性は、内皮細胞および腫瘍細胞により発現される、VEGF特異的受容体により仲介される。事実、VEGF受容体は、腫瘍を浸潤する内皮細胞中で上方−調節されて、それにより腫瘍細胞の成長を促進する。
【0005】
bFGFは、繊維芽細胞および内皮細胞の増殖を刺激するように機能する、成長因子である。bFGFは16.5Kdの分子量を持つ単一ポリペプチド鎖である。それらのアミノ酸末端領域で長さの異なる、bFGFの幾つかの分子型が発見されている。しかしながら、種々の分子型の生物学的機能は同じように見える。bFGFは脳下垂体により生成され、そしてヒトの染色体4上に位置する単一遺伝子によりコード化される。
【0006】
血管新生の内因性阻害剤が数多く発見されているが、それらの例は、プラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIそれぞれのタンパク質分解切断により形成される、アンギオスタチンおよびエンドスタチンである。これらの因子の両方は、血管性のVEGFおよびbFGFのようなプロ−血管新生成長因子の活性を抑制すると示されている。両方共に、VEGFおよびbFGFに対する内皮細胞の反応をインビトロで抑制し、そして動物モデル中の実験腫瘍の血管化および成長を減少させる。
【0007】
フィブリノーゲン、フィブリンの可溶性の循環先駆体、は非−同一鎖(即ち、α−、β−およびγ−鎖)の対を含む二量体分子である。これらは、三つの別個のドメイン、二つの外側D−ドメインおよび中心E−ドメイン、として配列されている(4)。フィブリノーゲンはプラスミンもしくはトロンビンのどちらかにより消化され得る。
【0008】
フィブリノーゲンのプラスミン切断における第一ステップはα鎖C−末端ドメインの切断である。それから、プラスミンは、一つのE−ドメイン(ジスルフィド結合により一緒に保たれたα−、β−およびγ−鎖のNH2末端領域からなる)および小ペプチド、ベータ1−42(β−鎖のアミノ末端)を含む数多くのさらに小さいフラグメントから二つのD−ドメインを切断する(5)。他方において、トロンビンは一つのフィブリン単量体およびフィブリノペプチドAおよびBの二つのコピーを生成する(4)。フィブリノーゲンは、固形腫瘍中で漏れやすい血管の周りで蓄積すると示されている(5)。フィブリノーゲンはまた、宿主腫瘍の界面で重合して、内皮細胞の接着、遊走、増殖および分化を支持することにより腫瘍の血管新生を促進する、フィブリンネットワークを形成すると示されている(7)。
【0009】
フィブリンのタンパク質分解切断により生成される、フィブリンE−フラグメント(FnE−フラグメント)は、しょう尿膜アッセイで血管新生を刺激する(8)。さらに、浸入性乳がん腫に存在するこのタンパク質の量は腫瘍血管化度と正に相関する(5)。
【0010】
フィブリノーゲンの50kDaタンパク質分解フラグメントであるところの強力で、新しい血管新生阻害剤、フィブリノーゲンE、は、出典明示により本明細書の一部とする、我々の同時係属出願、PCT/GB01/02079、に開示されている。今や我々は、フィブリノーゲンEフラグメント内に、このはるかに大きいフィブリノーゲンEフラグメントと同じ抗−血管新生活性を有するドメインを同定している。このドメインはα鎖のアミノ末端に位置し、そしてα1−24と呼ばれる。このドメインから誘導化されるペプチドは抗−血管新生活性を有する。我々はまた、非修飾α1−24ペプチドの抗−血管新生活性を保持するところの修飾α1−24ペプチドを同定している。
【0011】
この発明の第一の態様にしたがい、以下のものからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する:
i)配列:
【表4】
〔配列中、Xは任意のアミノ酸残基である。〕
を有するペプチド;
ii)配列中アミノ酸残基Xが以下のグループ:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、から選択される、(i)で表されるペプチド;および
iii)抗−血管新生活性を有する、(i)もしくは(ii)で表されるペプチド。
【0012】
抗−血管新生活性への参照はここに開示するアッセイにより測定される。例えば、この発明のポリペプチドはインビトロアッセイにより試験されるが、これらとしては、内皮細胞仲介細管形成の阻害、内皮細胞遊走の阻害、VEGFおよびbFGF誘導の内皮細胞増殖の阻害ならびに内皮細胞細胞毒性のアッセイが挙げられる。ポリペプチドをまた、ここで開示されるように、マウスの腫瘍モデルを用いてインビボで試験することができる。
【0013】
この発明の好ましい実施態様において、該ポリペプチドは以下のグループから選択されるアミノ酸配列を含む:
【表5】
【0014】
この発明のさらに好ましい実施態様において、該ペプチドは、配列中Xはアラニンであるアミノ酸配列を含む。
この発明のなおさらに好ましい実施態様において、該ポリペプチドはアミノ酸配列:
【表6】
を含む。
【0015】
α1−24ペプチドへの参照は配列:
【表7】
を有するペプチド、または、少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されているこの配列から誘導化される活性なペプチドへの参照である。
【0016】
この発明の好ましい実施態様において、該ポリペプチドは長さで少なくとも24個のアミノ酸残基である。好ましくは、該ペプチドはアミノ酸配列ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERH、もしくはそのフラグメントからなる。
【0017】
フラグメントへの参照は、抗−血管新生活性を保持するα1−24ペプチドから誘導化されるペプチドへの参照である。そのようなフラグメントは長さで3個のアミノ酸であってもよい;好ましくは、該フラグメントは長さで、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23個のアミノ酸残基である。
【0018】
α1−24を含むポリペプチドのアミノ酸配列への修飾は、その標的配列に関してポリペプチドの結合および/もしくは安定性を増強できたことは当業者に明らかであるであろう。加えて、ポリペプチドの修飾はまた、ポリペプチドのインビボ安定性を増加し、それにより血管新生を阻害するために必要なポリペプチドの有効量を減少させる。これは、インビボで起り得る望ましくない副作用を有利に減少させるであろう。修飾にはアセチル化およびアミド化が、例示としてそして限定としてではなく、挙げられる。
【0019】
この発明の好ましい実施態様において、α1−24配列を含む該ポリペプチドがアセチル化される。好ましくは、該アセチル化は該ポリペプチドのアミノ末端にされる。さらに好ましくはなお、α1−24ペプチドのアミノ末端のアラニンアミノ酸がアセチル化される。
【0020】
この発明のさらに好ましい実施態様において、α1−24配列を含む該ポリペプチドがアミド化される。好ましくは、該アミド化は該ポリペプチドのカルボキシル末端にされる。さらに好ましくはなお、カルボキシル末端のヒスチジンアミノ酸がアミド化される。
【0021】
この発明のさらに好ましい実施態様において、α1−24ペプチド、もしくはそのフラグメント、はアセチル化およびアミド化の両方により修飾される。好ましくは、該アセチル化はα1−24ペプチドのアミノ−末端のアラニンアミノ酸にされ、そして、該アミド化はα1−24ペプチドのカルボキシル−末端のヒスチジンにされる。
【0022】
ここで開示されるようなα1−24ペプチドのフラグメントがアセチル化および/もしくはアミド化のような修飾を受けやすいことは当業者に明らかであるであろう。
これに代えてもしくは好ましくは、該修飾は、α1−24ペプチドを含むポリペプチドの組換えもしくは合成型の生成における修飾アミノ酸の使用を含む。
【0023】
修飾アミノ酸としては、4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリシン、N6−アセチルリシン、N6−メチルリシン、N6,N6−ジメチルリシン、N6,N6,N6−トリメチルリシン、シクロヘキシルアラニン、D−アミノ酸およびオルニチンが、例示としてそして限定としてではなく、挙げられることは当業者に明らかであるであろう。他の修飾としては、ハロゲン(例えば、F、Br、I)、ヒドロキシもしくはC1〜C4アルコキシから選択される、1、2もしくは3個の置換基により任意に置換されるC2、C3もしくはC4アルキルR基を持つアミノ酸が挙げられる。
【0024】
この発明のさらに好ましい実施態様において、ポリペプチドが、配列中Xは該修飾アミノ酸の位置を意味する、少なくとも一つの修飾アミノ酸を含むところのこの発明にしたがうポリペプチドを提供する。
修飾アミノ酸の組入れは、α1−24を含むポリペプチド上で有利な性質を授けるであろう。例えば、修飾アミノ酸の組入れは、ポリペプチドのその結合部位に対する親和性を増加させ得るか、もしくは修飾アミノ酸がポリペプチド上で増加したインビボの安定性を授け得て、かくして患者に投与する治療的ポリペプチドの有効量の減少を可能にする。
【0025】
抗−血管新生活性を保持するα1−24のフラグメントは、例えば、タンパク質分解酵素を用いる未変化のポリペプチドの分画により回収され得たことは当業者に明らかであるであろう。これに代えて、フラグメントを新規に合成し、そしてまた、例えば環化、により修飾することができた。環化は技術上公知である(Scott et al Chem Biol (2001), 8: 801−815; Gelleman et al J Peptide Res (2001), 57: 277−291; Dutta et al J Peptide Res (2000), 8: 398−412; Ngoka and Gross J Amer Soc Mass Spec (1999), 10: 360−363;を参照)。
【0026】
この発明の好ましい実施態様において、この発明にしたがうポリペプチドは環化により修飾される。
この発明のさらなる態様にしたがい、以下のものから選択されるDNA配列を含む核酸分子を提供する:
i)図5aで表されるようなDNA配列;
ii)この発明にしたがう修飾ペプチドをコードする、少なくとも一つのコドン内で少なくとも一つのヌクレオチド塩基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されている図5aで表されるようなDNA配列;
iii)抗−血管新生活性を有するペプチドをコードするところの図6に示される配列にハイブリダイズする、DNA配列;および
iv)(i)、(ii)もしくは(iii)で規定されるDNA配列への遺伝子コードの結果として縮重しているDNA配列。
【0027】
この発明の好ましい実施態様において、上の(i)、(ii)、(iii)もしくは(iv)で説明された配列へストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下でアニールするところの分離された核酸分子を提供する。
【0028】
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション/洗浄条件は技術上周知である。例えば、0.1×SSC、0.1%SDS中60℃で洗浄後安定である核酸ハイブリッドである。最適なハイブリダイゼーション条件は、核酸の配列が既知であれば、計算され得ることは技術上周知である。典型的に、ハイブリダイゼーション条件は、4〜6×SSPE(20×SSPEは、1リットルに溶かしそしてpHを7.4に調節した、NaCl 175.3g、NaH2PO4・H2O 88.2gおよびEDTA 7.4gを含有する);5〜10×デンハート溶液(50×デンハート溶液は5gのフィコール(400タイプ、Pharmacia)、ポリビニルピロリドン5gおよびウシ血清アルブミン5gを含有する);100μg〜1.0mg/mlの超音波処理したサケ/ニシンDNA;0.1〜1.0%ドデシル硫酸ナトリウム;任意に40〜60%の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は核酸標的配列のGC含量に依存して変わるであろうが、典型的には42〜65℃の間にあるであろう。
【0029】
この発明のさらなる態様にしたがい、α1−24ペプチド、もしくはその一部を含む医薬組成物を提供する。
投与されるときには、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される製剤で投与される。そのような製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリヤー、アジュバントおよびサイトカインのような補助的な免疫強化剤ならびに任意に化学療法剤のような治療剤を型通りに含有してもよい。
【0030】
この発明の医薬組成物は、注射を含むいかなる従来の経路によるか、もしくは経時的に徐々の点滴により投与され得る。この投与は、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下もしくは経皮であってもよい。
【0031】
この発明の組成物は有効量で投与される。“有効量”は、単独で、もしくはさらなる投薬と共に、望ましい応答を生じる組成物の量である。がんのような特定の疾患を処置する場合には、望ましい応答は疾患の進行を阻害することである。これは疾患の進行を一時的に遅くすることを伴ってもよいが、さらに好ましくは、それは疾患の進行を永久に停止させることを伴う。これは日常的な方法によりモニターされ得る。
【0032】
そのような量は、勿論、処置される特定の異常、異常の重篤度、年齢、物理的状態、身長および体重を含む個々の患者のパラメータ、処置の継続時間、併行する治療(もしあれば)の性質、投与の特異的経路ならびに健康医師の知識および専門的技術内の類似した要因に依存するであろう。これらの要因は通常の当業者に周知であり、そして単なる日常的な実験で検討され得る。
【0033】
前述の処置方法で使用される医薬組成物は、好ましくは、無菌でありそして、患者への投与に適する重量もしくは容量の一単位で望ましい応答を生じるための、α1−24ペプチドまたはα1−24ペプチドをコードする核酸を含有する。
【0034】
被験者に投与されるα1−24ペプチドまたはα1−24ペプチドをコードする核酸の投与量は、異なるパラメターにしたがい、特に用いる投与様式および被験者の状態で選択され得る。他の要因としては処置の望ましい期間が挙げられる。被験者中での応答が与えた始めの投与量で不十分な場合には、さらに高い投与量(もしくは異なる、さらに局部的な送達経路による効果的にさらに高い投与量)を患者の許容度が許す程度に使用してもよい。
【0035】
投与されるときには、本発明の治療製剤は治療的に許容される量でおよび薬学的に許容される組成物で与えられる。“薬学的に許容される”なる用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない無毒性な材料を意味する。そのような製剤は、塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリヤーおよび任意に他の治療剤を型通りに含有してもよい。薬に用いるときには、塩は薬学的に許容されるべきであるが、非−薬学的に許容される塩を便宜的に使用して、薬学的に許容されるそれらの塩を調製してもよく、そしてこの発明の範囲から除外するものではない。
【0036】
α1−24ペプチド組成物を、望ましくは、薬学的に許容されるキャリヤーと組合せてもよい。本明細書で使用される“薬学的に許容されるキャリヤー”なる語は、ヒトへの投与に適するところの、一つもしくはそれ以上の適合性の固体または液体の賦形剤、希釈剤もしくはカプセル化物質を意味する。用語“キャリヤー”は、活性成分がそれと組合わされて、施用を容易にするところの有機もしくは無機で天然もしくは合成の成分を意味する。
【0037】
医薬組成物は、塩での酢酸;塩でのクエン酸;塩でのホウ酸;および塩でのリン酸を含む、適当な緩衝剤を含有してもよい。
医薬組成物はまた、塩化ベンザルコニウム;クロロブタノール;パラベンおよびチメロサールのような適当な保存剤を、任意に、含有してもよい。
【0038】
医薬組成物は単位投与形で便宜的に提供されてもよく、そして製剤技術で周知の方法のいずれかにより調製されてもよい。全ての方法は、一つもしくはそれ以上の補助成分を構成するキャリヤーと活性剤を会合させるようにするステップを含む。一般的に、組成物は、活性剤を液体キャリヤー、細かく分割した固体キャリヤーもしくは両方と均一にかつ密接に会合させるようにし、それから、必要により生成物を成形することにより調製される。
【0039】
経口投与に適する組成物を、それぞれが予め決めた量の活性化合物を含む、カプセル、錠剤、トローチのような別個の単位として提供してもよい。他の組成物としては、水性液体もしくは非−水性液体中の懸濁剤、例えばシロップ剤、エリキシル剤または乳化剤が挙げられる。
【0040】
非経口投与に適する組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張であるところの、α1−24ペプチドもしくは核酸の水溶性または非−水溶性の無菌製剤を便宜的に含む。この製剤を適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の方法にしたがって処方してもよい。無菌の注射製剤はまた、無毒で非経口的に許容される希釈剤もしくは溶剤中の無菌の注射液または懸濁液、例えば、1,3−ブタンジオール溶液としてあってもよい。使用してもよいところの許容されるビヒクルおよび溶剤は、水、リンゲル液および等張食塩水である。これに加えて、無菌で不揮発性の油が溶剤もしくは懸濁媒体として便宜的に使用される。この目的のためには、合成のモノ−もしくはジ−グリセリドを含む、いかなる口当たりのよい不揮発性の油を使用してもよい。これに加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注射製剤に使用してもよい。
【0041】
経口的、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適するキャリヤーの処方を、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA、中に見ることができる。
この発明の好ましい実施態様において、該医薬組成物は血管新生を調整する。好ましくは、該調整は血管新生の阻害である。好ましくは、該阻害は内皮細胞で刺激される血管新生に関する。
【0042】
これに代えて、もしくは好ましくは、該阻害はマクロファージおよび/もしくは腫瘍細胞で刺激される血管新生の阻害である。
この発明のさらに好ましい実施態様において、該阻害はプロ−血管新生因子の阻害により仲介される。理想的には、これらは細胞内もしくは細胞表面の受容体のどちらかである。
さらに好ましくはなお、該阻害はプロ−血管新生成長因子の活性の阻害により仲介される。理想的には、該成長因子は、VEGF;bFGF;aFGF;TGFβ;PDGFから選択される。
【0043】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、がんの処置に用いる医薬品の製造におけるα1−24ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドの使用を提供する。
α1−24ペプチドを含むポリペプチドは、標準的なペプチド合成手法を用いるインビトロのペプチド合成により製造され得る。これに代えて、もしくは好ましくは、技術上周知である組換え手法により、ポリペプチドを製造することができる。
【0044】
この発明のさらなる態様にしたがい、ベクターを提供するが、そこでは該ベクターは、α1−24ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
これに代えて、α1−24ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸を含むところの一個以上のベクターを組換え発現に適応させることができる。
【0045】
この発明の好ましい実施態様において、該ベクターは原核もしくは真核細胞の発現に適応される発現ベクターである。好ましくは、該真核ベクターは遺伝子治療に適応される。
典型的に該適応は、細胞/組織特異的発現を仲介するところの転写制御配列(プロモーター配列)の規定を、例示としてそして限定としてではなく、含む。これらのプロモーター配列は細胞/組織特異的、誘導性もしくは構成的であってもよい。
【0046】
プロモーターは技術上認識された用語でありそして、はっきりさせるために、例示としてそして限定としてではなく提供される以下の特徴を含む。エンハンサー・エレメントは、遺伝子の転写開始部位に対してしばしば5’に見出される(エンハンサーはまた、遺伝子に対して3’に見出されるかイントロン配列にさえ位置し得るので、位置依存性である)、シスに作用する核酸配列である。エンハンサーは、それにエンハンサーが連結される遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー・エレメントに特異的に結合すると示されているところのトランスに作用する転写因子(ポリペプチド)に応答的である。転写因子の結合/活性(David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diegoによる「真核転写因子」を参照されたい)は、中間代謝物もしくは環境エフェクターを、例示としてそして限定としてではなく、含むところの数多くの環境合図に応答的である。
【0047】
プロモーター・エレメントはまた、所謂TATAボックスおよび、転写開始部位を選択するように機能するRNAポリメラーゼ開始選択(RIS)配列を含む。これらの配列はまた、RNAポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように、とりわけ、作用するポリペプチドに結合する。
【0048】
適応はまた、真核細胞もしくは原核宿主のどちらかの中で該ベクターの維持を一緒に容易にするところの選択可能マーカーおよび自律性反復配列を含む。自律的に維持されるベクターはエピソームベクターと呼ばれる。
【0049】
ベクターコード化遺伝子の発現を容易にする適応は転写終結/ポリアデニン化配列の規定を含む。これはまた、ビシストロニックもしくはマルチ−シストロニック発現カセット中に配置されたベクターコード化遺伝子の発現を最大にするように機能するところの内部リボソームエントリー部位(IRES)の規定を含む。
【0050】
これらの適応は技術上周知である。発現ベクター構築および組換えDNA技法一般に関する大量の出版文献がある。Sambrook et al (1989)、「分子クローニング:実験室マニュアル」、Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY およびその中の参考文献;Marston, F (1987)、「DNAクローンニング技法:実際的アプローチ」、Vol III IRL Press, Oxford UK;「DNAクローンニング」、F M Ausubel et al、「分子生物学における現行プロトコル」、John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【0051】
この発明のなおさらに好ましい実施態様において、この発明にしたがう核酸を含む遺伝子治療ベクターを提供する。
【0052】
遺伝子治療ベクターの内皮細胞もしくは腫瘍細胞のどちらかへの送達は腫瘍の周辺でのα1−24ペプチドを含むポリペプチドの生成に目標を向け、それによりα1−24を含むポリペプチドの抗−血管新生効果を増大することは当業者に明らかであるであろう。
【0053】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、この発明にしたがう核酸と形質転換/トランスフェクトされる細胞を提供する。理想的には、該核酸はこの発明にしたがうベクターである。
【0054】
この発明のさらに好ましい態様にしたがい、α1−24を含むポリペプチドの製造のための方法を提供するが、この方法は:
i)この発明にしたがう細胞を提供すること;
ii)α1−24を含むポリペプチドの製造に実施的な条件を提供すること;および
iii)該ポリペプチドを細胞から、もしくは細胞培養環境から精製すること、を含む。
【0055】
この発明のなおいっそうさらなる態様にしたがい、該動物がα1−24を含むポリペプチドをゲノム中にコードする核酸分子を組入れることを特徴とする非−ヒトの、形質転換動物を提供する。
【0056】
α1−24を含むポリペプチドをコードする一個以上のトランス遺伝子の規定により遺伝子的に修飾される非−ヒトの、形質転換動物の規定は活性ポリペプチドの代わりの供給源であることは当業者に明らかであるであろう。形質転換動物を使用して種々の治療ポリペプチドを作ることは技術上周知である。
【0057】
この発明の好ましい実施態様において、該トランス遺伝子はヒト起源である。
【0058】
この発明のさらなる態様において、血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法を提供するが、この方法は:
i)処置すべき動物に有効量のα1−24を含む薬剤を投与すること;および
ii) 血管新生の阻害への該薬剤の効果をモニターすることを含む。
【0059】
この発明の好ましい方法において、該処置は腫瘍の発育の阻害である。
【0060】
代わりの処置方法において、α1−24を含むポリペプチドは、ポリペプチドの抗−血管新生効果を増大させる薬剤に追加的に接合され、会合されもしくは架橋される。
【0061】
典型的に、この薬剤は細胞毒剤、もう一つの抗−血管新生剤、前駆薬剤活性化酵素、化学療法剤、プロ−凝固剤もしくは免疫調整剤であり得るであろう。
【0062】
これらの例は技術上周知であリ、例えば、そして限定としてではなく、リシンA−鎖もしくはジフテリア毒のような細胞毒である;腫瘍(例えば、VEGF、bFGF、TNFアルファ、PDGF)中において重要なプロ−血管新生因子のアンタゴニストとしては以下に挙げられる:これらの因子に対して中和する抗体もしくは受容体、またはそれらの受容体(例えば、VEGF受容体に対するSU5416、Flk−1/KDR)に対するチロシンキナーゼ阻害剤;全身投与時に前駆薬剤、ガンシクロビルを活性化する、ヒトのシンプレックスウイルス−チミジンキナーゼHSV−TK、のような前駆薬剤活性化酵素;ならびにネオカルジノスタチン;シスプラチン;カルボプラチン;シクロホスファミド;メルファラン;カルムスリン;メソトレキセート;5−フルオロウラシル;シタラビン;メルカプトプリン;ダウノルビシン;ドキソルビシン;エピルビシン;ビンブラスチン;ビンクリスチン;ダクチノマイシン;マイトマイシンC;タキソール;L−アスパラギナーゼ;G−CSF;チャリチアミシン(chalicheamicin)もしくはエスペラミシンのようなエンジイン;クロラムブシル;ARA−C;ビンデシン;ブレオマイシン;およびエトポシド、のような化学療法剤。
【0063】
これに加えて、もしくはこれに代えて、ヒト組織因子 (トランケートされた形態の組織因子(tTF)) の細胞表面ドメインはまたα1−24と会合し得るであろう。トランケートされたTFは、血行中で遊離しているときにはある程度の抗−内皮活性を有するが、腫瘍内皮細胞の表面へ目標を向けるときには効果的でかつ選択的なトロンボゲン(即ち、血管中で広大な血栓症と凝固を引き起こす)になる。
【0064】
免疫調整因子の例はヒトIgG1のFcエフェクタードメインである。これはナチュラルキラー(NK)細胞およびまた、補体カスケードを開始するClqタンパク質と結合する。それから、NK細胞および補体は標的の内皮細胞に対して強力な細胞溶解反応を活性化する。
【0065】
α1−24および治療剤の上の組合せはまた、血管新生に依存する他の異常/疾患の処置に関して恩恵を持つであろうことは明らかであるであろう。例えば、新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症である。
【0066】
なおさらなる代わりの処置方法において、該遺伝子治療ベクターは、α1−24の抗−血管新生効果を増大する薬剤をコードする核酸を含み、そしてそれ故にα1−24を含むポリペプチドをコードする該核酸はそれを支給される。
【0067】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、α1−24を含むイメージング剤を提供する。
【0068】
α1−24を含むポリペプチドを用いて、イメージング剤を、例えば、腫瘍に目標を向けて、発育する腫瘍を確認するかもしくは腫瘍の成長を阻害する処置の効果をモニターすることは当業者に明らかであるであろう。α1−24およびさらなる抗−血管新生剤の両方を含む組合せ治療組成物はイメージング剤とさらに会合して、組合せ治療組成物の分布をモニターし、そして/もしくは該組合せ組成物の有効性をモニターすることもまた明らかであるであろう。
【0069】
イメージング剤を検出するために用いる方法は技術上周知でありそして、F18およびC11化合物の陽電子放射断層撮影法の検出を、例示としてそして限定としてではなく、含む。
【0070】
ここで、この発明の実施態様を以下の図を参照して、単に例示として、説明する。
図1は、フィブリノーゲンEのα−β−γ−ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を表す。
【0071】
図2は、インビトロでHuDMECによる細管形成へのフィブリノーゲンEフラグメント(パネルA)おおびフィブリンEフラグメント(パネルB)の効果の比較を表す。VEGFもしくはbFGFの非存在下(空白バー)もしくは存在下(着色バー)における細管形成によりカバーされる平均(±SEM)面積である。それぞれの試験条件を3個の反復ウェル中で行い、全面積をの三つの無作為に選択した視野で測定した(n=9)。関連する対照群に関する*p<0.005である;
【0072】
図3は、抗−血管新生フィブリノーゲンEフラグメント(A)おおびプロ−血管新生フィブリンEフラグメント(B)間で構造の相違を示す概略図を表す。唯一の相違は、16個のアミノ酸のフィブリノペプチドAの存在(フィブリノーゲンEフラグメント)もしくは不存在(フィブリンEフラグメント)である;
【0073】
図4は、VEGFもしくはbFGFの非存在下もしくは存在下における、インビトロでSVEC4−10による細管形成へのα1−24(β−彎曲)の効果を表す。上部パネル(A):外因性因子(対照)(I)の非存在下または100nM α1−24 (II)、VEGF 10ng/ml(III)もしくは10ng/ml VEGF+100nM α1−24の存在下におけるGF−低減マトリゲルアッセイ(×40対物レンズ)での細管形成。下部パネル(B):VEGFもしくはbFGFの非存在下(空白バー)もしくは存在下(灰色バー)における細管形成の平均(±SEM)面積。n=9、関連する対照群に関する*p<0.03である;
【0074】
図5Aはα1−24ペプチドをコードする核酸配列である;図5Bはα1−24ペプチドの直線アミノ酸配列および種々の修飾α1−24ペプチドのアミノ酸配列を表す;
【0075】
図6は、マウス中の腫瘍成長に対する非修飾α1−24ペプチドのインビボの効果を図示する。Balb/cマウス中のCT26腫瘍の成長に対するPBS中25μg/kgのα1−24ペプチドもしくはPBS単独(対照)の毎日注射(腹腔内)の効果 (二つの別々の実験からのデータ) である;
【0076】
図7は、アルギニン23からアラニンへの置換(R23A)について抗−血管新生活性の比較を表す;α1−24対照ペプチドおよびトランケートされたα1−24(アミノ酸17〜24)である;
図8はアラニン置換α1−24ペプチド(G4A、G6A、G17A)の抗−血管新生活性を表す;
【0077】
図9はアラニン置換α1−24ペプチド(D7AおよびR19)ならびに(R16A)の抗−血管新生活性を表す;
【0078】
図10は、α1−24ペプチドへの末端修飾(アセチル化およびアミド化)の抗−血管新生活性を表す。インビトロでHuDMEC(10ng/ml VEGFの有無で)による細管形成へのアルファ1−24ペプチドの阻害効果に対する末端修飾(TMa)の効果である;ならびに
【0079】
図11は、インビトロでHuDMEC(10ng/ml VEGFの存在もしくは不存在下で)による細管形成に対する広い濃度範囲のアルファ1−24ペプチドの効果を表す。
【0080】
物質および方法
成人ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HuDMEC)を市販(TCS Biologicals, Buckinghamshire、英国)で入手して、微小血管内皮細胞育成培地(EGM)中で培養した。この培地は、ヘパリン(10ng/ml)、ヒドロコルチゾン、ヒト内皮成長因子(10ng/ml)、ヒト繊維芽細胞成長因子(10ng/ml)(このような内皮成長因子は、HuDMECの日常的継代培養に必要である)およびジブチリルサイクリックAMPを含む。これに、5%熱不活化FCS、50μg/mlゲンタマイシンおよび50ng/mlアンホテリシンB(TCS Biologicals, Buckinghamshire、英国)を補充した。マウス内皮細胞(SVEC4−10)をATCCから入手し、DMEM+10%FCS中で培養した。細胞を、37℃、100%加湿インキュベーターにて5%炭酸ガス気相中で育成させて、そしてマイコプラズマのスクリーニングを型通りに行った。以下に示すアッセイでそれらを使用する前に、80%密集度にまでHuDMECを育成させ、DMEM+1%FCS中で2時間インキュベートし、それから、0.05%トリプシン溶液で収穫し、2回洗浄しそしてそれぞれのアッセイに必要な細胞密度に再懸濁した(以下参照)。
【0081】
タンパク質およびペプチド
ヒトフィブリノーゲン(Fgn)Eフラグメントを、Diagnostica Stago, Asnieres、フランスより購入した。これは、フィブリノーゲンをプラスミンで切断して生成させ、そして電気泳動、免疫−電気泳動、イオン交換およびゲルろ過で精製されたものである。ヒトフィブリン(Fn)Eフラグメントを産生するために、以前記載されているように(10)、FgnEフラグメントをヒトトロンビン(Sigma−Aldrich Co, Dorset、英国)で消化した。我々のアッセイに及ぼすFnEフラグメント試料中の微量トロンビンの可能な効果を制御するために、同量のトロンビン(0.5U/ml)を加え、FnEフラグメントを用いる実験で使用する培地を制御した。HPLCで精製したFpAを、Bachem Ltd., Saffron Walden、英国から市販で入手した。このペプチドはFnEフラグメントの生成でFgnEフラグメントから切断されており、アッセイで微量に存在するであろうから、このペプチドをこの研究に含めた。FMOCアミノ酸と合成機を用いる標準的なペプチド合成法により、ベータ彎曲(α1−24)を産生させた。質量分析でペプチドの純度を点検した。
【0082】
細管形成アッセイ
30μl/ウェルの成長因子低減(GF低減)Matrigel(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)で24ウェルプレートを被覆した。このマトリックス上で平板培養された内皮細胞は遊走し、以前記載されているように(14)、平板培養の6時間以内に細管に分化する。4×104細胞/mlの密度でHuDMECもしくはSVEC4−10細胞を接種し、DMEM+1%FCS単独(コントロール)、またはこの培地±10ng/mlのVEGFもしくはbFGFのどちらかの、500μl中で、フィブリノーゲンEフラグメント、フィブリンEフラグメント、FpAもしくはα1−24の存在下もしくは非存在下で、6時間インキュベートした。細管形成の評価は、70%エタノール中、4℃で15分間の細胞試料の固定、PBS中でのすすぎそしてヘマトキシリンおよびエオシンによる染色を伴った。それぞれの試験条件について3個の反復ウェルでの三つの無作為視野を低倍率(×40倍率)下で視覚化し、そしてペンチナムIIIコンピュータ(フレームグラバーボードを含む)に連結したフジデジタルカメラを用いてカラーイメージを捕獲した。Scion Imageの提供する画像解析ソフトを用いて、細管分枝数およびそれぞれの視野の中で細管によりカバーされている全面積を計数して、細管形成を評価した。
【0083】
遊走アッセイ
Boydenチェンバー手法を(13)から適応しそして使用して、VEGF(10ng/ml)もしくはbFGF(10ng/ml)のいずれかの濃度勾配に向いて多孔質膜を横断するHuDMECの遊走を評価した。Neuro Probe 48ウェル ミクロ走化性チェンバー(Neuro Probe Inc, Cabin John, MD)を、100μg/mlコラーゲンIV型で被覆した孔径8μmのポリカーボネート膜(Neuro Probe Inc, Cabin John, MD)と共に用いた。10ng/mlのVEGFもしくはbFGFを単独で、または種々の濃度のフィブリノーゲンEフラグメント、フィブンEフラグメント、FpAもしくはα1−24と一緒で、DMEM+1%FCS中に溶解し、下部のウェルに入れた。それから、この上にコラーゲンで被覆した膜を置き、そして25×104個のHuDMEC/ml(1%FCS含有DMEM中で)の50μlを上部のチェンバーに加えた。それから、チェンバーを37℃で4.5時間インキュベートした。それから、チェンバーを取り外し、膜を取り除いて未遊走の細胞を上部表面から擦り落とした。下部表面上の遊走した細胞をメタノールで固定し、Hema Gurr’迅速染色キット(Merck, Leics、英国)で染色し、そして光学顕微鏡(×160倍率)を用いてウェル当たり三つの無作為視野で計数した。3〜6個の反復ウェル中でそれぞれの試験条件を実施し、そしてそれぞれの実験を三回反復した。
【0084】
増殖アッセイ
以前記載(12)されているように、MTT(臭化3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)アッセイを用いて、フィブリノーゲンEフラグメント、フィブリンEフラグメント、FpAもしくはα1−24の非存在下もしくは存在下で、VEGFもしくはbFGFによって誘導されるHuDMECの増殖を評価した。96ウェルマイクロタイタープレート内に試験溶液中において、DMEM+1%FCS±10ng/mlのVEGFもしくはbFGF中で、3×104細胞/100μlのHuDMECを、4.5および6時間で接種した。これらの時点で、MTT溶液(2mgMTT/mlPBS)の四分の一容量をそれぞれのウェルに加え、それぞれのウェルを4時間、37℃でインキュベートして不溶性の紫色ホルマザン生成物を得た。培地を吸引し、そして沈殿をpH10.5に緩衝化したDMSO100μlに溶解した。それから、Dynex ELISA プレートリーダーで540nmにて吸光度を読み取った。
【0085】
細胞毒性アッセイ
フィブリノーゲンEフラグメント、フィブリンEフラグメント、FpAもしくはα1−24の非存在下もしくは存在下で、24ウェル−プレート中にウェル当たり1〜2×105細胞の密度で、HuDMECを接種した。6時間後、生存(トリプシン化による除去の後)および死滅(浮遊)細胞を収穫し、488nmにおいて15mWの青色レーザー励起を装備したFACScan(Becton Dickinson)を用いて、処置毎に三組の試料のそれぞれにおいて、5000個の細胞の沃化プロピジウム染色を用いて、存在する全細胞の細胞生存率を評価した。データを収集し、Cell Questソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて解析した。
【0086】
α1−24ペプチドのインビボ効能
Sheffield Field Laboratoriesから入手した体重15gの6週令Balb/Cマウスで、実験を実施した。すべての実験は、Home Office Project Licence Number PPL50/1414により承認された。
【0087】
腫瘍細胞培養
10%ウシ胎児血清、ならびに1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコの最少イ−グル培地中で、CT26細胞株をインビトロ継代により維持し、37℃にて空気中5%炭酸ガスの加湿雰囲気中で維持した。細胞株を型通りに点検し、マイコプラズマが無いことを確認した(マイコプラズマ迅速検出システム、Gena−Probe Incorporated、米国)。
【0088】
皮下腫瘍移植
ジアゼパム(0.5mg/ml,Dumex Ltd.)およびヒプノルム(0.0315mg/mlクエン酸フェンタニルおよび1mg/mlフルアニゾン,Janssen Pharmaceutical Ltd.)を1:1の比率で、0.1ml/200g体重の容量にて、必要な場合は十分な麻酔を維持するために補充して、動物を麻酔した。未投薬Balb/Cマウスを、毛皮の除去後、皮下的に右側腹部で免疫した。無血清培地100μlに懸濁した動物当たり3×105個の生存可能CT26細胞の濃度で、腫瘍細胞を注射した。それから、動物を回復させた。腫瘍の成長および動物重量を毎日モニターした。
【0089】
ペプチドα1−24の投与
腫瘍成長を毎日測定し、群中の大多数の動物が、100mm3以上/350mm3以下の腫瘍体積を有したとき、動物を実験および対照群に分けた。これは、腫瘍細胞懸濁液を移植後14日と18日の間で起きた。それから、動物は、活性薬剤(100mMペプチドα1−24;100μl)もしくはビークル(リン酸緩衝生理食塩液、100μl)のいずれかの腹腔内(ip)注射を受けた。対照動物における腫瘍成長がHome Office法で許容される最大負荷に達するまで、毎日の注射を継続した。
【0090】
腫瘍成長の評価
垂直直径のキャリパー測定により腫瘍体積を評価し、そして次式を用いて体積を推定した:
体積=(a2×b)/2
式中、aは小直径でありそしてbは大直径である。
毎日の基準で動物を重量計測し、一般的な良好な生活状態をモニターした。
【0091】
統計的解析
すべての実験を少なくとも三回実施し、そして解析されているデータ中でGaussian分布を仮定しない非パラメータ検定である、Mann−Whitney U検定を用いて、データを解析した。P≦0.05を有意とした。
【0092】
残存レベルの成長因子がこのマトリックス中に存在していることは注目すべきであるが、内皮細胞が伸長しそしてGF−低減Matrigel上で外因性刺激の非存在下にて細管を形成し始めるように見えた。それ故に、このアッセイは、血管新生経路における主要なステップの一つ、分化のモデルとして使用される。分枝数は同様な図的様式を生み出すけれども(データ表示せず)、引き続く細管形成を、細管によりカバーされる面積として測定する。この分化過程は、このアッセイシステム内の培養培地にVEGF(10ng/ml)もしくはbFGF(10ng/ml)のいずれかの添加で有意に(P<0.001)増強された。このシステムへのα1−24(β彎曲)の添加は、図4に示すように成長因子の非存在下および存在下の両方で、細管形成を有意に(P<0.03)低減した。
【0093】
図4に示した結果から、我々はペプチドα1−24がフィブリノーゲンEフラグメントの活性部位を含むと結論する。24個のアミノ酸ペプチドは、恐らくさらに複雑なポリペプチド構造のフィブリノーゲンEフラグメントよりもより大きな治療的有用性を有するであろうが、これは後者は血液から誘導化されるフィブリノーゲンの切断によって作られるべきであるからである。対照的に、α1−24は合成的もしくは組換え手法によって作成できる、さらに小さいペプチドである。また、がんもしくは他の血管新生依存性疾患の処置のための遺伝子治療プロトコルの一部として、これを使用することも可能であり得る。そこで、我々はα1−24ペプチドのインビボ有効性を測定した。
【0094】
α1−24ペプチドのインビボ有効性
実施例1
実験動物(n=6)を腹腔内によりα1−24で、対照動物(n=7)を腹腔内によりビークルで毎日処置した。開始した腫瘍体積は両群の動物で同様であった(実験対対照、235±30対198±28mm3)。対照群の腫瘍は、14日間にわたり着実な速度で成長し続け、最終腫瘍体積は2245±371mm3に達した。対照的に、実験群における腫瘍は、4日目までは同様な成長速度を有し、そこで成長が低減した。それから、7日目で腫瘍は対照と同様な速度で成長を続けたが、体積は低減していた。10日目までに腫瘍成長は再び安定し14日目に到り、最終腫瘍体積は1341±145mm3であった(P<0.001)。
【0095】
実験動物(n=7)を腹腔内によりα1−24で、対照動物(n=7)を腹腔内によりビークルで毎日処置した。開始した腫瘍体積は両群の動物で同様であった(実験対対照、338±39対300±65mm3)。対照群の腫瘍は、12日間にわたり着実な速度で成長し続け、最終腫瘍体積は3072±255mm3に達した。対照的に、実験群における腫瘍は7日目までは対照群と同様な成長速度を有し、そこで成長は、動物を12日目で屠殺するまで安定し、最終腫瘍体積は2029±504mm3であった(P<0.001)。
【0096】
それ故にこのデータ、図6参照、はインビボでの抗−血管新生剤としてのペプチドα1−24の潜在力を実証している。さらに、α1−24のペプチド変異体も、非修飾α1−24と同様な阻害活性を示す、図7〜9参照。また、アセチル化およびアミド化によるα1−24の修飾は、抗−血管新生効果に影響を与えない。
【0097】
(参考文献)
1. Folkman J、「がん、血管系、リウマチ様およびその他の疾患における血管新生」、Nature Medicine, 1: 27−31, 1995.
2. Leek R, Harris AL, and Lewis CE、「固形ヒトがんにおけるサイトカインネットワーク:血管新生の制御」、J. Leuk. Biol., 56: 423−35, 1994.
3. Cao Y、「内因性血管新生阻害剤:アンジオスタチン、エンドスタチン、およびその他のタンパク質分解フラグメント」、Prog Mol Subcell Biol., 20: 161−76, 1998.
【0098】
4. Doolittle R、「フィブリノーゲンおよびフィブリン」、Scientific American, 245: 92−101, 1981.
5. Costantini V, Zacharski LR, Memoli VA, Kisiel W, Kudryk BJ, and Rousseau SM、「原発性ヒト乳がん組織におけるトロンビン産生を伴わないフィブリノーゲン沈着」、Cancer Res., 51: 349−53, 1991.
6. Dvorak HF, Nagy JA, Feng D, Brown LF, and Dvorak AM、「血管透過性因子/血管内皮成長因子および血管新生における微小血管過透過性の意義」、Curr Top Microbiol Immunol, 237: 97−132, 1999.
【0099】
7. Thompson WD, Wnag JEH, Wilson SJ, and Ganesalingham N、「ヒト乳がんにおける血管新生およびフィブリン分解」、Angiogenesis:Molecular Biology, Clinical Aspects, 245−251, 1994.
8. Thompson WD, Smith EB, Stirk CM, Marshall FI, Stout AJ, and Kocchar A、「フィブリン分解生成物の血管新生活性はフィブリンフラグメントE中に位置する」、J. Pathol, 168: 47−53, 1992.
9. Malinda KM, Ponce L, Kleinman HK, Shackelton LM, and Millis AJ、「Gp38K、血管平滑筋細胞により合成されるタンパク質、はヒト臍帯静脈内皮細胞の方向性遊走を刺激する」、Exp Cell Res 250: 168−73, 1999.
【0100】
10. Shen J, Ham RG, Karmiol S、「培養ヒト肺微小血管内皮細胞における接着分子の発現」、Microvasc Res., 50: 360−72, 1995.
11. Liu J, Kolath J, Anderson J, Kolar C, Lawson TA, Talmadge J, and Gmeiner WH、「ヒト直腸がん細胞増殖の阻害における5−FUとFdUMP[10]間の正の相互作用」、Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9(5): 481−6, 1999.
12. Dejano E, Languino LR, Polentarutti N, Balconi G, Ryckewaert JJ, Larrieu MJ, Donati MB, Mantovani A, and Marguerie G、「フィブリノーゲンと培養内皮細胞間の相互作用」、J. Clin. Invest., 75: 11−18, 1985.
【0101】
13. Bootle−Wilbraham CA, Tazzyman S, Marshall JM, Lewis CE、「フィブリノーゲンEフラグメントは、インビトロでヒト皮膚微小血管内皮細胞の遊走と細管形成を阻害する」、Cancer Research (2000) 60: 4719−4724.
14. Marsh HC, Meinwald YC, Lee S, Martinelli RA, Scheraga HA、「フィブリノーゲンに対するトロンビンの作用機構:フィブリノーゲンAアルファGly(P5)−Gly(P4)におけるもしくは近傍におけるベータ彎曲についてNMR的証拠」、Biochemistry (1985) 24: 2806−2812.
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、フィブリノーゲンEのα−β−γ−ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を表す。
【図2】図2は、インビトロでHuDMECによる細管形成へのフィブリノーゲンEフラグメント(パネルA)おおびフィブリンEフラグメント(パネルB)の効果の比較を表す。
【図3】図3は、抗−血管新生フィブリノーゲンEフラグメント(A)おおびプロ−血管新生フィブリンEフラグメント(B)間で構造の相違を示す概略図を表す。唯一の相違は、16個のアミノ酸のフィブリノペプチドAの存在(フィブリノーゲンEフラグメント)もしくは不存在(フィブリンEフラグメント)である。
【図4】図4は、VEGFもしくはbFGFの非存在下もしくは存在下における、インビトロでSVEC4−10による細管形成へのα1−24(β−彎曲)の効果を表す。
【図5A】図5Aはα1−24ペプチドをコードする核酸配列である。
【図5B】図5Bはα1−24ペプチドの直線アミノ酸配列および種々の修飾α1−24ペプチドのアミノ酸配列を表す。
【図6】図6は、マウス中の腫瘍成長に対する非修飾α1−24ペプチドのインビボの効果を表す。
【図7】図7は、アルギニン23からアラニンへの置換(R23A)について抗−血管新生活性の比較を表す。
【図8】図8はアラニン置換α1−24ペプチド(G4A、G6A、G17A)の抗−血管新生活性を表す。
【図9】図9はアラニン置換α1−24ペプチド(D7AおよびR19)ならびに(R16A)の抗−血管新生活性を表す。
【図10】図10は、α1−24ペプチドへの末端修飾(アセチル化およびアミド化)の抗−血管新生活性を表す。
【図11】図11は、インビトロでHuDMEC(10ng/ml VEGFの存在もしくは不存在下で)による細管形成に対する広い濃度範囲のアルファ1−24ペプチドの効果を表す。
本発明は、フィブリノーゲンから誘導化されるペプチドの抗−血管新生効果に関する。
【0002】
血管新生、現存する血管床から新しい血管の発育、は、細胞外マトリックスの成分の分解に引き続く、細管および結局は新しい血管を形成する内皮細胞の遊走、増殖および分化を伴うところの複雑な多段階プロセスである。血管新生は、胚移植;胚形成および発育;ならびに創傷治癒を、例示としてそして限定としてではなく、含む、正常な生理プロセスにおいて重要である。過剰な血管新生はまた、腫瘍細胞生育のような病態異常ならびに新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症のような非−がん性異常に関与する。
【0003】
血管内皮は普通は静止性である。しかしながら、活性化すると内皮細胞は増殖しかつ遊走して、発育中の組織、勿論生長中の腫瘍、に血液を供給する毛細管床を究極的に形成するであろう微小管を形成する。内皮細胞を促進し/活性化して、血管新生を受ける、数多くの成長因子が同定されている。これらには、血管内皮成長因子(VEGF);形質変換成長因子(TGFb);酸性および塩基性の繊維芽細胞成長因子(aFGFおよびbFGF);および血小板誘導化成長因子(PDGF)が、例示としてそして限定としてではなく、挙げられる(1,2)。
【0004】
VEGFは、非常に特異的な活動部位、即ち、内皮細胞の増殖、遊走および分化の促進、を有するところの内皮細胞−特異的成長因子である。VEGFは、二つの同一な23kDのポリペプチドを含む二量複合体である。VEGFの単量形は、代わりにスプライスされたmRNAからそれぞれが誘導化される、異なる分子量を持つ四つの別なポリペプチドとして存在し得る。四つの単量体のうち、二つは膜結合VEGFとして存在しそして二つは可溶性である。VEGFは、胚性組織;増殖性角化細胞;マクロファージ;腫瘍細胞を含む多種の細胞/組織タイプによりにより発現される。研究(2)は、VEGFが、神経膠腫およびAIDS−関連カポジ肉腫を含む多くの腫瘍細胞株中で高度に発現されることを示している。VEGF活性は、内皮細胞および腫瘍細胞により発現される、VEGF特異的受容体により仲介される。事実、VEGF受容体は、腫瘍を浸潤する内皮細胞中で上方−調節されて、それにより腫瘍細胞の成長を促進する。
【0005】
bFGFは、繊維芽細胞および内皮細胞の増殖を刺激するように機能する、成長因子である。bFGFは16.5Kdの分子量を持つ単一ポリペプチド鎖である。それらのアミノ酸末端領域で長さの異なる、bFGFの幾つかの分子型が発見されている。しかしながら、種々の分子型の生物学的機能は同じように見える。bFGFは脳下垂体により生成され、そしてヒトの染色体4上に位置する単一遺伝子によりコード化される。
【0006】
血管新生の内因性阻害剤が数多く発見されているが、それらの例は、プラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIそれぞれのタンパク質分解切断により形成される、アンギオスタチンおよびエンドスタチンである。これらの因子の両方は、血管性のVEGFおよびbFGFのようなプロ−血管新生成長因子の活性を抑制すると示されている。両方共に、VEGFおよびbFGFに対する内皮細胞の反応をインビトロで抑制し、そして動物モデル中の実験腫瘍の血管化および成長を減少させる。
【0007】
フィブリノーゲン、フィブリンの可溶性の循環先駆体、は非−同一鎖(即ち、α−、β−およびγ−鎖)の対を含む二量体分子である。これらは、三つの別個のドメイン、二つの外側D−ドメインおよび中心E−ドメイン、として配列されている(4)。フィブリノーゲンはプラスミンもしくはトロンビンのどちらかにより消化され得る。
【0008】
フィブリノーゲンのプラスミン切断における第一ステップはα鎖C−末端ドメインの切断である。それから、プラスミンは、一つのE−ドメイン(ジスルフィド結合により一緒に保たれたα−、β−およびγ−鎖のNH2末端領域からなる)および小ペプチド、ベータ1−42(β−鎖のアミノ末端)を含む数多くのさらに小さいフラグメントから二つのD−ドメインを切断する(5)。他方において、トロンビンは一つのフィブリン単量体およびフィブリノペプチドAおよびBの二つのコピーを生成する(4)。フィブリノーゲンは、固形腫瘍中で漏れやすい血管の周りで蓄積すると示されている(5)。フィブリノーゲンはまた、宿主腫瘍の界面で重合して、内皮細胞の接着、遊走、増殖および分化を支持することにより腫瘍の血管新生を促進する、フィブリンネットワークを形成すると示されている(7)。
【0009】
フィブリンのタンパク質分解切断により生成される、フィブリンE−フラグメント(FnE−フラグメント)は、しょう尿膜アッセイで血管新生を刺激する(8)。さらに、浸入性乳がん腫に存在するこのタンパク質の量は腫瘍血管化度と正に相関する(5)。
【0010】
フィブリノーゲンの50kDaタンパク質分解フラグメントであるところの強力で、新しい血管新生阻害剤、フィブリノーゲンE、は、出典明示により本明細書の一部とする、我々の同時係属出願、PCT/GB01/02079、に開示されている。今や我々は、フィブリノーゲンEフラグメント内に、このはるかに大きいフィブリノーゲンEフラグメントと同じ抗−血管新生活性を有するドメインを同定している。このドメインはα鎖のアミノ末端に位置し、そしてα1−24と呼ばれる。このドメインから誘導化されるペプチドは抗−血管新生活性を有する。我々はまた、非修飾α1−24ペプチドの抗−血管新生活性を保持するところの修飾α1−24ペプチドを同定している。
【0011】
この発明の第一の態様にしたがい、以下のものからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する:
i)配列:
【表4】
〔配列中、Xは任意のアミノ酸残基である。〕
を有するペプチド;
ii)配列中アミノ酸残基Xが以下のグループ:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、から選択される、(i)で表されるペプチド;および
iii)抗−血管新生活性を有する、(i)もしくは(ii)で表されるペプチド。
【0012】
抗−血管新生活性への参照はここに開示するアッセイにより測定される。例えば、この発明のポリペプチドはインビトロアッセイにより試験されるが、これらとしては、内皮細胞仲介細管形成の阻害、内皮細胞遊走の阻害、VEGFおよびbFGF誘導の内皮細胞増殖の阻害ならびに内皮細胞細胞毒性のアッセイが挙げられる。ポリペプチドをまた、ここで開示されるように、マウスの腫瘍モデルを用いてインビボで試験することができる。
【0013】
この発明の好ましい実施態様において、該ポリペプチドは以下のグループから選択されるアミノ酸配列を含む:
【表5】
【0014】
この発明のさらに好ましい実施態様において、該ペプチドは、配列中Xはアラニンであるアミノ酸配列を含む。
この発明のなおさらに好ましい実施態様において、該ポリペプチドはアミノ酸配列:
【表6】
を含む。
【0015】
α1−24ペプチドへの参照は配列:
【表7】
を有するペプチド、または、少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されているこの配列から誘導化される活性なペプチドへの参照である。
【0016】
この発明の好ましい実施態様において、該ポリペプチドは長さで少なくとも24個のアミノ酸残基である。好ましくは、該ペプチドはアミノ酸配列ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERH、もしくはそのフラグメントからなる。
【0017】
フラグメントへの参照は、抗−血管新生活性を保持するα1−24ペプチドから誘導化されるペプチドへの参照である。そのようなフラグメントは長さで3個のアミノ酸であってもよい;好ましくは、該フラグメントは長さで、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23個のアミノ酸残基である。
【0018】
α1−24を含むポリペプチドのアミノ酸配列への修飾は、その標的配列に関してポリペプチドの結合および/もしくは安定性を増強できたことは当業者に明らかであるであろう。加えて、ポリペプチドの修飾はまた、ポリペプチドのインビボ安定性を増加し、それにより血管新生を阻害するために必要なポリペプチドの有効量を減少させる。これは、インビボで起り得る望ましくない副作用を有利に減少させるであろう。修飾にはアセチル化およびアミド化が、例示としてそして限定としてではなく、挙げられる。
【0019】
この発明の好ましい実施態様において、α1−24配列を含む該ポリペプチドがアセチル化される。好ましくは、該アセチル化は該ポリペプチドのアミノ末端にされる。さらに好ましくはなお、α1−24ペプチドのアミノ末端のアラニンアミノ酸がアセチル化される。
【0020】
この発明のさらに好ましい実施態様において、α1−24配列を含む該ポリペプチドがアミド化される。好ましくは、該アミド化は該ポリペプチドのカルボキシル末端にされる。さらに好ましくはなお、カルボキシル末端のヒスチジンアミノ酸がアミド化される。
【0021】
この発明のさらに好ましい実施態様において、α1−24ペプチド、もしくはそのフラグメント、はアセチル化およびアミド化の両方により修飾される。好ましくは、該アセチル化はα1−24ペプチドのアミノ−末端のアラニンアミノ酸にされ、そして、該アミド化はα1−24ペプチドのカルボキシル−末端のヒスチジンにされる。
【0022】
ここで開示されるようなα1−24ペプチドのフラグメントがアセチル化および/もしくはアミド化のような修飾を受けやすいことは当業者に明らかであるであろう。
これに代えてもしくは好ましくは、該修飾は、α1−24ペプチドを含むポリペプチドの組換えもしくは合成型の生成における修飾アミノ酸の使用を含む。
【0023】
修飾アミノ酸としては、4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリシン、N6−アセチルリシン、N6−メチルリシン、N6,N6−ジメチルリシン、N6,N6,N6−トリメチルリシン、シクロヘキシルアラニン、D−アミノ酸およびオルニチンが、例示としてそして限定としてではなく、挙げられることは当業者に明らかであるであろう。他の修飾としては、ハロゲン(例えば、F、Br、I)、ヒドロキシもしくはC1〜C4アルコキシから選択される、1、2もしくは3個の置換基により任意に置換されるC2、C3もしくはC4アルキルR基を持つアミノ酸が挙げられる。
【0024】
この発明のさらに好ましい実施態様において、ポリペプチドが、配列中Xは該修飾アミノ酸の位置を意味する、少なくとも一つの修飾アミノ酸を含むところのこの発明にしたがうポリペプチドを提供する。
修飾アミノ酸の組入れは、α1−24を含むポリペプチド上で有利な性質を授けるであろう。例えば、修飾アミノ酸の組入れは、ポリペプチドのその結合部位に対する親和性を増加させ得るか、もしくは修飾アミノ酸がポリペプチド上で増加したインビボの安定性を授け得て、かくして患者に投与する治療的ポリペプチドの有効量の減少を可能にする。
【0025】
抗−血管新生活性を保持するα1−24のフラグメントは、例えば、タンパク質分解酵素を用いる未変化のポリペプチドの分画により回収され得たことは当業者に明らかであるであろう。これに代えて、フラグメントを新規に合成し、そしてまた、例えば環化、により修飾することができた。環化は技術上公知である(Scott et al Chem Biol (2001), 8: 801−815; Gelleman et al J Peptide Res (2001), 57: 277−291; Dutta et al J Peptide Res (2000), 8: 398−412; Ngoka and Gross J Amer Soc Mass Spec (1999), 10: 360−363;を参照)。
【0026】
この発明の好ましい実施態様において、この発明にしたがうポリペプチドは環化により修飾される。
この発明のさらなる態様にしたがい、以下のものから選択されるDNA配列を含む核酸分子を提供する:
i)図5aで表されるようなDNA配列;
ii)この発明にしたがう修飾ペプチドをコードする、少なくとも一つのコドン内で少なくとも一つのヌクレオチド塩基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されている図5aで表されるようなDNA配列;
iii)抗−血管新生活性を有するペプチドをコードするところの図6に示される配列にハイブリダイズする、DNA配列;および
iv)(i)、(ii)もしくは(iii)で規定されるDNA配列への遺伝子コードの結果として縮重しているDNA配列。
【0027】
この発明の好ましい実施態様において、上の(i)、(ii)、(iii)もしくは(iv)で説明された配列へストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下でアニールするところの分離された核酸分子を提供する。
【0028】
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション/洗浄条件は技術上周知である。例えば、0.1×SSC、0.1%SDS中60℃で洗浄後安定である核酸ハイブリッドである。最適なハイブリダイゼーション条件は、核酸の配列が既知であれば、計算され得ることは技術上周知である。典型的に、ハイブリダイゼーション条件は、4〜6×SSPE(20×SSPEは、1リットルに溶かしそしてpHを7.4に調節した、NaCl 175.3g、NaH2PO4・H2O 88.2gおよびEDTA 7.4gを含有する);5〜10×デンハート溶液(50×デンハート溶液は5gのフィコール(400タイプ、Pharmacia)、ポリビニルピロリドン5gおよびウシ血清アルブミン5gを含有する);100μg〜1.0mg/mlの超音波処理したサケ/ニシンDNA;0.1〜1.0%ドデシル硫酸ナトリウム;任意に40〜60%の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は核酸標的配列のGC含量に依存して変わるであろうが、典型的には42〜65℃の間にあるであろう。
【0029】
この発明のさらなる態様にしたがい、α1−24ペプチド、もしくはその一部を含む医薬組成物を提供する。
投与されるときには、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される製剤で投与される。そのような製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリヤー、アジュバントおよびサイトカインのような補助的な免疫強化剤ならびに任意に化学療法剤のような治療剤を型通りに含有してもよい。
【0030】
この発明の医薬組成物は、注射を含むいかなる従来の経路によるか、もしくは経時的に徐々の点滴により投与され得る。この投与は、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下もしくは経皮であってもよい。
【0031】
この発明の組成物は有効量で投与される。“有効量”は、単独で、もしくはさらなる投薬と共に、望ましい応答を生じる組成物の量である。がんのような特定の疾患を処置する場合には、望ましい応答は疾患の進行を阻害することである。これは疾患の進行を一時的に遅くすることを伴ってもよいが、さらに好ましくは、それは疾患の進行を永久に停止させることを伴う。これは日常的な方法によりモニターされ得る。
【0032】
そのような量は、勿論、処置される特定の異常、異常の重篤度、年齢、物理的状態、身長および体重を含む個々の患者のパラメータ、処置の継続時間、併行する治療(もしあれば)の性質、投与の特異的経路ならびに健康医師の知識および専門的技術内の類似した要因に依存するであろう。これらの要因は通常の当業者に周知であり、そして単なる日常的な実験で検討され得る。
【0033】
前述の処置方法で使用される医薬組成物は、好ましくは、無菌でありそして、患者への投与に適する重量もしくは容量の一単位で望ましい応答を生じるための、α1−24ペプチドまたはα1−24ペプチドをコードする核酸を含有する。
【0034】
被験者に投与されるα1−24ペプチドまたはα1−24ペプチドをコードする核酸の投与量は、異なるパラメターにしたがい、特に用いる投与様式および被験者の状態で選択され得る。他の要因としては処置の望ましい期間が挙げられる。被験者中での応答が与えた始めの投与量で不十分な場合には、さらに高い投与量(もしくは異なる、さらに局部的な送達経路による効果的にさらに高い投与量)を患者の許容度が許す程度に使用してもよい。
【0035】
投与されるときには、本発明の治療製剤は治療的に許容される量でおよび薬学的に許容される組成物で与えられる。“薬学的に許容される”なる用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない無毒性な材料を意味する。そのような製剤は、塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリヤーおよび任意に他の治療剤を型通りに含有してもよい。薬に用いるときには、塩は薬学的に許容されるべきであるが、非−薬学的に許容される塩を便宜的に使用して、薬学的に許容されるそれらの塩を調製してもよく、そしてこの発明の範囲から除外するものではない。
【0036】
α1−24ペプチド組成物を、望ましくは、薬学的に許容されるキャリヤーと組合せてもよい。本明細書で使用される“薬学的に許容されるキャリヤー”なる語は、ヒトへの投与に適するところの、一つもしくはそれ以上の適合性の固体または液体の賦形剤、希釈剤もしくはカプセル化物質を意味する。用語“キャリヤー”は、活性成分がそれと組合わされて、施用を容易にするところの有機もしくは無機で天然もしくは合成の成分を意味する。
【0037】
医薬組成物は、塩での酢酸;塩でのクエン酸;塩でのホウ酸;および塩でのリン酸を含む、適当な緩衝剤を含有してもよい。
医薬組成物はまた、塩化ベンザルコニウム;クロロブタノール;パラベンおよびチメロサールのような適当な保存剤を、任意に、含有してもよい。
【0038】
医薬組成物は単位投与形で便宜的に提供されてもよく、そして製剤技術で周知の方法のいずれかにより調製されてもよい。全ての方法は、一つもしくはそれ以上の補助成分を構成するキャリヤーと活性剤を会合させるようにするステップを含む。一般的に、組成物は、活性剤を液体キャリヤー、細かく分割した固体キャリヤーもしくは両方と均一にかつ密接に会合させるようにし、それから、必要により生成物を成形することにより調製される。
【0039】
経口投与に適する組成物を、それぞれが予め決めた量の活性化合物を含む、カプセル、錠剤、トローチのような別個の単位として提供してもよい。他の組成物としては、水性液体もしくは非−水性液体中の懸濁剤、例えばシロップ剤、エリキシル剤または乳化剤が挙げられる。
【0040】
非経口投与に適する組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張であるところの、α1−24ペプチドもしくは核酸の水溶性または非−水溶性の無菌製剤を便宜的に含む。この製剤を適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の方法にしたがって処方してもよい。無菌の注射製剤はまた、無毒で非経口的に許容される希釈剤もしくは溶剤中の無菌の注射液または懸濁液、例えば、1,3−ブタンジオール溶液としてあってもよい。使用してもよいところの許容されるビヒクルおよび溶剤は、水、リンゲル液および等張食塩水である。これに加えて、無菌で不揮発性の油が溶剤もしくは懸濁媒体として便宜的に使用される。この目的のためには、合成のモノ−もしくはジ−グリセリドを含む、いかなる口当たりのよい不揮発性の油を使用してもよい。これに加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注射製剤に使用してもよい。
【0041】
経口的、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適するキャリヤーの処方を、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA、中に見ることができる。
この発明の好ましい実施態様において、該医薬組成物は血管新生を調整する。好ましくは、該調整は血管新生の阻害である。好ましくは、該阻害は内皮細胞で刺激される血管新生に関する。
【0042】
これに代えて、もしくは好ましくは、該阻害はマクロファージおよび/もしくは腫瘍細胞で刺激される血管新生の阻害である。
この発明のさらに好ましい実施態様において、該阻害はプロ−血管新生因子の阻害により仲介される。理想的には、これらは細胞内もしくは細胞表面の受容体のどちらかである。
さらに好ましくはなお、該阻害はプロ−血管新生成長因子の活性の阻害により仲介される。理想的には、該成長因子は、VEGF;bFGF;aFGF;TGFβ;PDGFから選択される。
【0043】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、がんの処置に用いる医薬品の製造におけるα1−24ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドの使用を提供する。
α1−24ペプチドを含むポリペプチドは、標準的なペプチド合成手法を用いるインビトロのペプチド合成により製造され得る。これに代えて、もしくは好ましくは、技術上周知である組換え手法により、ポリペプチドを製造することができる。
【0044】
この発明のさらなる態様にしたがい、ベクターを提供するが、そこでは該ベクターは、α1−24ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
これに代えて、α1−24ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸を含むところの一個以上のベクターを組換え発現に適応させることができる。
【0045】
この発明の好ましい実施態様において、該ベクターは原核もしくは真核細胞の発現に適応される発現ベクターである。好ましくは、該真核ベクターは遺伝子治療に適応される。
典型的に該適応は、細胞/組織特異的発現を仲介するところの転写制御配列(プロモーター配列)の規定を、例示としてそして限定としてではなく、含む。これらのプロモーター配列は細胞/組織特異的、誘導性もしくは構成的であってもよい。
【0046】
プロモーターは技術上認識された用語でありそして、はっきりさせるために、例示としてそして限定としてではなく提供される以下の特徴を含む。エンハンサー・エレメントは、遺伝子の転写開始部位に対してしばしば5’に見出される(エンハンサーはまた、遺伝子に対して3’に見出されるかイントロン配列にさえ位置し得るので、位置依存性である)、シスに作用する核酸配列である。エンハンサーは、それにエンハンサーが連結される遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー・エレメントに特異的に結合すると示されているところのトランスに作用する転写因子(ポリペプチド)に応答的である。転写因子の結合/活性(David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diegoによる「真核転写因子」を参照されたい)は、中間代謝物もしくは環境エフェクターを、例示としてそして限定としてではなく、含むところの数多くの環境合図に応答的である。
【0047】
プロモーター・エレメントはまた、所謂TATAボックスおよび、転写開始部位を選択するように機能するRNAポリメラーゼ開始選択(RIS)配列を含む。これらの配列はまた、RNAポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように、とりわけ、作用するポリペプチドに結合する。
【0048】
適応はまた、真核細胞もしくは原核宿主のどちらかの中で該ベクターの維持を一緒に容易にするところの選択可能マーカーおよび自律性反復配列を含む。自律的に維持されるベクターはエピソームベクターと呼ばれる。
【0049】
ベクターコード化遺伝子の発現を容易にする適応は転写終結/ポリアデニン化配列の規定を含む。これはまた、ビシストロニックもしくはマルチ−シストロニック発現カセット中に配置されたベクターコード化遺伝子の発現を最大にするように機能するところの内部リボソームエントリー部位(IRES)の規定を含む。
【0050】
これらの適応は技術上周知である。発現ベクター構築および組換えDNA技法一般に関する大量の出版文献がある。Sambrook et al (1989)、「分子クローニング:実験室マニュアル」、Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY およびその中の参考文献;Marston, F (1987)、「DNAクローンニング技法:実際的アプローチ」、Vol III IRL Press, Oxford UK;「DNAクローンニング」、F M Ausubel et al、「分子生物学における現行プロトコル」、John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
【0051】
この発明のなおさらに好ましい実施態様において、この発明にしたがう核酸を含む遺伝子治療ベクターを提供する。
【0052】
遺伝子治療ベクターの内皮細胞もしくは腫瘍細胞のどちらかへの送達は腫瘍の周辺でのα1−24ペプチドを含むポリペプチドの生成に目標を向け、それによりα1−24を含むポリペプチドの抗−血管新生効果を増大することは当業者に明らかであるであろう。
【0053】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、この発明にしたがう核酸と形質転換/トランスフェクトされる細胞を提供する。理想的には、該核酸はこの発明にしたがうベクターである。
【0054】
この発明のさらに好ましい態様にしたがい、α1−24を含むポリペプチドの製造のための方法を提供するが、この方法は:
i)この発明にしたがう細胞を提供すること;
ii)α1−24を含むポリペプチドの製造に実施的な条件を提供すること;および
iii)該ポリペプチドを細胞から、もしくは細胞培養環境から精製すること、を含む。
【0055】
この発明のなおいっそうさらなる態様にしたがい、該動物がα1−24を含むポリペプチドをゲノム中にコードする核酸分子を組入れることを特徴とする非−ヒトの、形質転換動物を提供する。
【0056】
α1−24を含むポリペプチドをコードする一個以上のトランス遺伝子の規定により遺伝子的に修飾される非−ヒトの、形質転換動物の規定は活性ポリペプチドの代わりの供給源であることは当業者に明らかであるであろう。形質転換動物を使用して種々の治療ポリペプチドを作ることは技術上周知である。
【0057】
この発明の好ましい実施態様において、該トランス遺伝子はヒト起源である。
【0058】
この発明のさらなる態様において、血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法を提供するが、この方法は:
i)処置すべき動物に有効量のα1−24を含む薬剤を投与すること;および
ii) 血管新生の阻害への該薬剤の効果をモニターすることを含む。
【0059】
この発明の好ましい方法において、該処置は腫瘍の発育の阻害である。
【0060】
代わりの処置方法において、α1−24を含むポリペプチドは、ポリペプチドの抗−血管新生効果を増大させる薬剤に追加的に接合され、会合されもしくは架橋される。
【0061】
典型的に、この薬剤は細胞毒剤、もう一つの抗−血管新生剤、前駆薬剤活性化酵素、化学療法剤、プロ−凝固剤もしくは免疫調整剤であり得るであろう。
【0062】
これらの例は技術上周知であリ、例えば、そして限定としてではなく、リシンA−鎖もしくはジフテリア毒のような細胞毒である;腫瘍(例えば、VEGF、bFGF、TNFアルファ、PDGF)中において重要なプロ−血管新生因子のアンタゴニストとしては以下に挙げられる:これらの因子に対して中和する抗体もしくは受容体、またはそれらの受容体(例えば、VEGF受容体に対するSU5416、Flk−1/KDR)に対するチロシンキナーゼ阻害剤;全身投与時に前駆薬剤、ガンシクロビルを活性化する、ヒトのシンプレックスウイルス−チミジンキナーゼHSV−TK、のような前駆薬剤活性化酵素;ならびにネオカルジノスタチン;シスプラチン;カルボプラチン;シクロホスファミド;メルファラン;カルムスリン;メソトレキセート;5−フルオロウラシル;シタラビン;メルカプトプリン;ダウノルビシン;ドキソルビシン;エピルビシン;ビンブラスチン;ビンクリスチン;ダクチノマイシン;マイトマイシンC;タキソール;L−アスパラギナーゼ;G−CSF;チャリチアミシン(chalicheamicin)もしくはエスペラミシンのようなエンジイン;クロラムブシル;ARA−C;ビンデシン;ブレオマイシン;およびエトポシド、のような化学療法剤。
【0063】
これに加えて、もしくはこれに代えて、ヒト組織因子 (トランケートされた形態の組織因子(tTF)) の細胞表面ドメインはまたα1−24と会合し得るであろう。トランケートされたTFは、血行中で遊離しているときにはある程度の抗−内皮活性を有するが、腫瘍内皮細胞の表面へ目標を向けるときには効果的でかつ選択的なトロンボゲン(即ち、血管中で広大な血栓症と凝固を引き起こす)になる。
【0064】
免疫調整因子の例はヒトIgG1のFcエフェクタードメインである。これはナチュラルキラー(NK)細胞およびまた、補体カスケードを開始するClqタンパク質と結合する。それから、NK細胞および補体は標的の内皮細胞に対して強力な細胞溶解反応を活性化する。
【0065】
α1−24および治療剤の上の組合せはまた、血管新生に依存する他の異常/疾患の処置に関して恩恵を持つであろうことは明らかであるであろう。例えば、新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症である。
【0066】
なおさらなる代わりの処置方法において、該遺伝子治療ベクターは、α1−24の抗−血管新生効果を増大する薬剤をコードする核酸を含み、そしてそれ故にα1−24を含むポリペプチドをコードする該核酸はそれを支給される。
【0067】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、α1−24を含むイメージング剤を提供する。
【0068】
α1−24を含むポリペプチドを用いて、イメージング剤を、例えば、腫瘍に目標を向けて、発育する腫瘍を確認するかもしくは腫瘍の成長を阻害する処置の効果をモニターすることは当業者に明らかであるであろう。α1−24およびさらなる抗−血管新生剤の両方を含む組合せ治療組成物はイメージング剤とさらに会合して、組合せ治療組成物の分布をモニターし、そして/もしくは該組合せ組成物の有効性をモニターすることもまた明らかであるであろう。
【0069】
イメージング剤を検出するために用いる方法は技術上周知でありそして、F18およびC11化合物の陽電子放射断層撮影法の検出を、例示としてそして限定としてではなく、含む。
【0070】
ここで、この発明の実施態様を以下の図を参照して、単に例示として、説明する。
図1は、フィブリノーゲンEのα−β−γ−ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を表す。
【0071】
図2は、インビトロでHuDMECによる細管形成へのフィブリノーゲンEフラグメント(パネルA)おおびフィブリンEフラグメント(パネルB)の効果の比較を表す。VEGFもしくはbFGFの非存在下(空白バー)もしくは存在下(着色バー)における細管形成によりカバーされる平均(±SEM)面積である。それぞれの試験条件を3個の反復ウェル中で行い、全面積をの三つの無作為に選択した視野で測定した(n=9)。関連する対照群に関する*p<0.005である;
【0072】
図3は、抗−血管新生フィブリノーゲンEフラグメント(A)おおびプロ−血管新生フィブリンEフラグメント(B)間で構造の相違を示す概略図を表す。唯一の相違は、16個のアミノ酸のフィブリノペプチドAの存在(フィブリノーゲンEフラグメント)もしくは不存在(フィブリンEフラグメント)である;
【0073】
図4は、VEGFもしくはbFGFの非存在下もしくは存在下における、インビトロでSVEC4−10による細管形成へのα1−24(β−彎曲)の効果を表す。上部パネル(A):外因性因子(対照)(I)の非存在下または100nM α1−24 (II)、VEGF 10ng/ml(III)もしくは10ng/ml VEGF+100nM α1−24の存在下におけるGF−低減マトリゲルアッセイ(×40対物レンズ)での細管形成。下部パネル(B):VEGFもしくはbFGFの非存在下(空白バー)もしくは存在下(灰色バー)における細管形成の平均(±SEM)面積。n=9、関連する対照群に関する*p<0.03である;
【0074】
図5Aはα1−24ペプチドをコードする核酸配列である;図5Bはα1−24ペプチドの直線アミノ酸配列および種々の修飾α1−24ペプチドのアミノ酸配列を表す;
【0075】
図6は、マウス中の腫瘍成長に対する非修飾α1−24ペプチドのインビボの効果を図示する。Balb/cマウス中のCT26腫瘍の成長に対するPBS中25μg/kgのα1−24ペプチドもしくはPBS単独(対照)の毎日注射(腹腔内)の効果 (二つの別々の実験からのデータ) である;
【0076】
図7は、アルギニン23からアラニンへの置換(R23A)について抗−血管新生活性の比較を表す;α1−24対照ペプチドおよびトランケートされたα1−24(アミノ酸17〜24)である;
図8はアラニン置換α1−24ペプチド(G4A、G6A、G17A)の抗−血管新生活性を表す;
【0077】
図9はアラニン置換α1−24ペプチド(D7AおよびR19)ならびに(R16A)の抗−血管新生活性を表す;
【0078】
図10は、α1−24ペプチドへの末端修飾(アセチル化およびアミド化)の抗−血管新生活性を表す。インビトロでHuDMEC(10ng/ml VEGFの有無で)による細管形成へのアルファ1−24ペプチドの阻害効果に対する末端修飾(TMa)の効果である;ならびに
【0079】
図11は、インビトロでHuDMEC(10ng/ml VEGFの存在もしくは不存在下で)による細管形成に対する広い濃度範囲のアルファ1−24ペプチドの効果を表す。
【0080】
物質および方法
成人ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HuDMEC)を市販(TCS Biologicals, Buckinghamshire、英国)で入手して、微小血管内皮細胞育成培地(EGM)中で培養した。この培地は、ヘパリン(10ng/ml)、ヒドロコルチゾン、ヒト内皮成長因子(10ng/ml)、ヒト繊維芽細胞成長因子(10ng/ml)(このような内皮成長因子は、HuDMECの日常的継代培養に必要である)およびジブチリルサイクリックAMPを含む。これに、5%熱不活化FCS、50μg/mlゲンタマイシンおよび50ng/mlアンホテリシンB(TCS Biologicals, Buckinghamshire、英国)を補充した。マウス内皮細胞(SVEC4−10)をATCCから入手し、DMEM+10%FCS中で培養した。細胞を、37℃、100%加湿インキュベーターにて5%炭酸ガス気相中で育成させて、そしてマイコプラズマのスクリーニングを型通りに行った。以下に示すアッセイでそれらを使用する前に、80%密集度にまでHuDMECを育成させ、DMEM+1%FCS中で2時間インキュベートし、それから、0.05%トリプシン溶液で収穫し、2回洗浄しそしてそれぞれのアッセイに必要な細胞密度に再懸濁した(以下参照)。
【0081】
タンパク質およびペプチド
ヒトフィブリノーゲン(Fgn)Eフラグメントを、Diagnostica Stago, Asnieres、フランスより購入した。これは、フィブリノーゲンをプラスミンで切断して生成させ、そして電気泳動、免疫−電気泳動、イオン交換およびゲルろ過で精製されたものである。ヒトフィブリン(Fn)Eフラグメントを産生するために、以前記載されているように(10)、FgnEフラグメントをヒトトロンビン(Sigma−Aldrich Co, Dorset、英国)で消化した。我々のアッセイに及ぼすFnEフラグメント試料中の微量トロンビンの可能な効果を制御するために、同量のトロンビン(0.5U/ml)を加え、FnEフラグメントを用いる実験で使用する培地を制御した。HPLCで精製したFpAを、Bachem Ltd., Saffron Walden、英国から市販で入手した。このペプチドはFnEフラグメントの生成でFgnEフラグメントから切断されており、アッセイで微量に存在するであろうから、このペプチドをこの研究に含めた。FMOCアミノ酸と合成機を用いる標準的なペプチド合成法により、ベータ彎曲(α1−24)を産生させた。質量分析でペプチドの純度を点検した。
【0082】
細管形成アッセイ
30μl/ウェルの成長因子低減(GF低減)Matrigel(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA)で24ウェルプレートを被覆した。このマトリックス上で平板培養された内皮細胞は遊走し、以前記載されているように(14)、平板培養の6時間以内に細管に分化する。4×104細胞/mlの密度でHuDMECもしくはSVEC4−10細胞を接種し、DMEM+1%FCS単独(コントロール)、またはこの培地±10ng/mlのVEGFもしくはbFGFのどちらかの、500μl中で、フィブリノーゲンEフラグメント、フィブリンEフラグメント、FpAもしくはα1−24の存在下もしくは非存在下で、6時間インキュベートした。細管形成の評価は、70%エタノール中、4℃で15分間の細胞試料の固定、PBS中でのすすぎそしてヘマトキシリンおよびエオシンによる染色を伴った。それぞれの試験条件について3個の反復ウェルでの三つの無作為視野を低倍率(×40倍率)下で視覚化し、そしてペンチナムIIIコンピュータ(フレームグラバーボードを含む)に連結したフジデジタルカメラを用いてカラーイメージを捕獲した。Scion Imageの提供する画像解析ソフトを用いて、細管分枝数およびそれぞれの視野の中で細管によりカバーされている全面積を計数して、細管形成を評価した。
【0083】
遊走アッセイ
Boydenチェンバー手法を(13)から適応しそして使用して、VEGF(10ng/ml)もしくはbFGF(10ng/ml)のいずれかの濃度勾配に向いて多孔質膜を横断するHuDMECの遊走を評価した。Neuro Probe 48ウェル ミクロ走化性チェンバー(Neuro Probe Inc, Cabin John, MD)を、100μg/mlコラーゲンIV型で被覆した孔径8μmのポリカーボネート膜(Neuro Probe Inc, Cabin John, MD)と共に用いた。10ng/mlのVEGFもしくはbFGFを単独で、または種々の濃度のフィブリノーゲンEフラグメント、フィブンEフラグメント、FpAもしくはα1−24と一緒で、DMEM+1%FCS中に溶解し、下部のウェルに入れた。それから、この上にコラーゲンで被覆した膜を置き、そして25×104個のHuDMEC/ml(1%FCS含有DMEM中で)の50μlを上部のチェンバーに加えた。それから、チェンバーを37℃で4.5時間インキュベートした。それから、チェンバーを取り外し、膜を取り除いて未遊走の細胞を上部表面から擦り落とした。下部表面上の遊走した細胞をメタノールで固定し、Hema Gurr’迅速染色キット(Merck, Leics、英国)で染色し、そして光学顕微鏡(×160倍率)を用いてウェル当たり三つの無作為視野で計数した。3〜6個の反復ウェル中でそれぞれの試験条件を実施し、そしてそれぞれの実験を三回反復した。
【0084】
増殖アッセイ
以前記載(12)されているように、MTT(臭化3−[4,5−ジメチルチアゾール−2−イル]−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)アッセイを用いて、フィブリノーゲンEフラグメント、フィブリンEフラグメント、FpAもしくはα1−24の非存在下もしくは存在下で、VEGFもしくはbFGFによって誘導されるHuDMECの増殖を評価した。96ウェルマイクロタイタープレート内に試験溶液中において、DMEM+1%FCS±10ng/mlのVEGFもしくはbFGF中で、3×104細胞/100μlのHuDMECを、4.5および6時間で接種した。これらの時点で、MTT溶液(2mgMTT/mlPBS)の四分の一容量をそれぞれのウェルに加え、それぞれのウェルを4時間、37℃でインキュベートして不溶性の紫色ホルマザン生成物を得た。培地を吸引し、そして沈殿をpH10.5に緩衝化したDMSO100μlに溶解した。それから、Dynex ELISA プレートリーダーで540nmにて吸光度を読み取った。
【0085】
細胞毒性アッセイ
フィブリノーゲンEフラグメント、フィブリンEフラグメント、FpAもしくはα1−24の非存在下もしくは存在下で、24ウェル−プレート中にウェル当たり1〜2×105細胞の密度で、HuDMECを接種した。6時間後、生存(トリプシン化による除去の後)および死滅(浮遊)細胞を収穫し、488nmにおいて15mWの青色レーザー励起を装備したFACScan(Becton Dickinson)を用いて、処置毎に三組の試料のそれぞれにおいて、5000個の細胞の沃化プロピジウム染色を用いて、存在する全細胞の細胞生存率を評価した。データを収集し、Cell Questソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて解析した。
【0086】
α1−24ペプチドのインビボ効能
Sheffield Field Laboratoriesから入手した体重15gの6週令Balb/Cマウスで、実験を実施した。すべての実験は、Home Office Project Licence Number PPL50/1414により承認された。
【0087】
腫瘍細胞培養
10%ウシ胎児血清、ならびに1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコの最少イ−グル培地中で、CT26細胞株をインビトロ継代により維持し、37℃にて空気中5%炭酸ガスの加湿雰囲気中で維持した。細胞株を型通りに点検し、マイコプラズマが無いことを確認した(マイコプラズマ迅速検出システム、Gena−Probe Incorporated、米国)。
【0088】
皮下腫瘍移植
ジアゼパム(0.5mg/ml,Dumex Ltd.)およびヒプノルム(0.0315mg/mlクエン酸フェンタニルおよび1mg/mlフルアニゾン,Janssen Pharmaceutical Ltd.)を1:1の比率で、0.1ml/200g体重の容量にて、必要な場合は十分な麻酔を維持するために補充して、動物を麻酔した。未投薬Balb/Cマウスを、毛皮の除去後、皮下的に右側腹部で免疫した。無血清培地100μlに懸濁した動物当たり3×105個の生存可能CT26細胞の濃度で、腫瘍細胞を注射した。それから、動物を回復させた。腫瘍の成長および動物重量を毎日モニターした。
【0089】
ペプチドα1−24の投与
腫瘍成長を毎日測定し、群中の大多数の動物が、100mm3以上/350mm3以下の腫瘍体積を有したとき、動物を実験および対照群に分けた。これは、腫瘍細胞懸濁液を移植後14日と18日の間で起きた。それから、動物は、活性薬剤(100mMペプチドα1−24;100μl)もしくはビークル(リン酸緩衝生理食塩液、100μl)のいずれかの腹腔内(ip)注射を受けた。対照動物における腫瘍成長がHome Office法で許容される最大負荷に達するまで、毎日の注射を継続した。
【0090】
腫瘍成長の評価
垂直直径のキャリパー測定により腫瘍体積を評価し、そして次式を用いて体積を推定した:
体積=(a2×b)/2
式中、aは小直径でありそしてbは大直径である。
毎日の基準で動物を重量計測し、一般的な良好な生活状態をモニターした。
【0091】
統計的解析
すべての実験を少なくとも三回実施し、そして解析されているデータ中でGaussian分布を仮定しない非パラメータ検定である、Mann−Whitney U検定を用いて、データを解析した。P≦0.05を有意とした。
【0092】
残存レベルの成長因子がこのマトリックス中に存在していることは注目すべきであるが、内皮細胞が伸長しそしてGF−低減Matrigel上で外因性刺激の非存在下にて細管を形成し始めるように見えた。それ故に、このアッセイは、血管新生経路における主要なステップの一つ、分化のモデルとして使用される。分枝数は同様な図的様式を生み出すけれども(データ表示せず)、引き続く細管形成を、細管によりカバーされる面積として測定する。この分化過程は、このアッセイシステム内の培養培地にVEGF(10ng/ml)もしくはbFGF(10ng/ml)のいずれかの添加で有意に(P<0.001)増強された。このシステムへのα1−24(β彎曲)の添加は、図4に示すように成長因子の非存在下および存在下の両方で、細管形成を有意に(P<0.03)低減した。
【0093】
図4に示した結果から、我々はペプチドα1−24がフィブリノーゲンEフラグメントの活性部位を含むと結論する。24個のアミノ酸ペプチドは、恐らくさらに複雑なポリペプチド構造のフィブリノーゲンEフラグメントよりもより大きな治療的有用性を有するであろうが、これは後者は血液から誘導化されるフィブリノーゲンの切断によって作られるべきであるからである。対照的に、α1−24は合成的もしくは組換え手法によって作成できる、さらに小さいペプチドである。また、がんもしくは他の血管新生依存性疾患の処置のための遺伝子治療プロトコルの一部として、これを使用することも可能であり得る。そこで、我々はα1−24ペプチドのインビボ有効性を測定した。
【0094】
α1−24ペプチドのインビボ有効性
実施例1
実験動物(n=6)を腹腔内によりα1−24で、対照動物(n=7)を腹腔内によりビークルで毎日処置した。開始した腫瘍体積は両群の動物で同様であった(実験対対照、235±30対198±28mm3)。対照群の腫瘍は、14日間にわたり着実な速度で成長し続け、最終腫瘍体積は2245±371mm3に達した。対照的に、実験群における腫瘍は、4日目までは同様な成長速度を有し、そこで成長が低減した。それから、7日目で腫瘍は対照と同様な速度で成長を続けたが、体積は低減していた。10日目までに腫瘍成長は再び安定し14日目に到り、最終腫瘍体積は1341±145mm3であった(P<0.001)。
【0095】
実験動物(n=7)を腹腔内によりα1−24で、対照動物(n=7)を腹腔内によりビークルで毎日処置した。開始した腫瘍体積は両群の動物で同様であった(実験対対照、338±39対300±65mm3)。対照群の腫瘍は、12日間にわたり着実な速度で成長し続け、最終腫瘍体積は3072±255mm3に達した。対照的に、実験群における腫瘍は7日目までは対照群と同様な成長速度を有し、そこで成長は、動物を12日目で屠殺するまで安定し、最終腫瘍体積は2029±504mm3であった(P<0.001)。
【0096】
それ故にこのデータ、図6参照、はインビボでの抗−血管新生剤としてのペプチドα1−24の潜在力を実証している。さらに、α1−24のペプチド変異体も、非修飾α1−24と同様な阻害活性を示す、図7〜9参照。また、アセチル化およびアミド化によるα1−24の修飾は、抗−血管新生効果に影響を与えない。
【0097】
(参考文献)
1. Folkman J、「がん、血管系、リウマチ様およびその他の疾患における血管新生」、Nature Medicine, 1: 27−31, 1995.
2. Leek R, Harris AL, and Lewis CE、「固形ヒトがんにおけるサイトカインネットワーク:血管新生の制御」、J. Leuk. Biol., 56: 423−35, 1994.
3. Cao Y、「内因性血管新生阻害剤:アンジオスタチン、エンドスタチン、およびその他のタンパク質分解フラグメント」、Prog Mol Subcell Biol., 20: 161−76, 1998.
【0098】
4. Doolittle R、「フィブリノーゲンおよびフィブリン」、Scientific American, 245: 92−101, 1981.
5. Costantini V, Zacharski LR, Memoli VA, Kisiel W, Kudryk BJ, and Rousseau SM、「原発性ヒト乳がん組織におけるトロンビン産生を伴わないフィブリノーゲン沈着」、Cancer Res., 51: 349−53, 1991.
6. Dvorak HF, Nagy JA, Feng D, Brown LF, and Dvorak AM、「血管透過性因子/血管内皮成長因子および血管新生における微小血管過透過性の意義」、Curr Top Microbiol Immunol, 237: 97−132, 1999.
【0099】
7. Thompson WD, Wnag JEH, Wilson SJ, and Ganesalingham N、「ヒト乳がんにおける血管新生およびフィブリン分解」、Angiogenesis:Molecular Biology, Clinical Aspects, 245−251, 1994.
8. Thompson WD, Smith EB, Stirk CM, Marshall FI, Stout AJ, and Kocchar A、「フィブリン分解生成物の血管新生活性はフィブリンフラグメントE中に位置する」、J. Pathol, 168: 47−53, 1992.
9. Malinda KM, Ponce L, Kleinman HK, Shackelton LM, and Millis AJ、「Gp38K、血管平滑筋細胞により合成されるタンパク質、はヒト臍帯静脈内皮細胞の方向性遊走を刺激する」、Exp Cell Res 250: 168−73, 1999.
【0100】
10. Shen J, Ham RG, Karmiol S、「培養ヒト肺微小血管内皮細胞における接着分子の発現」、Microvasc Res., 50: 360−72, 1995.
11. Liu J, Kolath J, Anderson J, Kolar C, Lawson TA, Talmadge J, and Gmeiner WH、「ヒト直腸がん細胞増殖の阻害における5−FUとFdUMP[10]間の正の相互作用」、Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9(5): 481−6, 1999.
12. Dejano E, Languino LR, Polentarutti N, Balconi G, Ryckewaert JJ, Larrieu MJ, Donati MB, Mantovani A, and Marguerie G、「フィブリノーゲンと培養内皮細胞間の相互作用」、J. Clin. Invest., 75: 11−18, 1985.
【0101】
13. Bootle−Wilbraham CA, Tazzyman S, Marshall JM, Lewis CE、「フィブリノーゲンEフラグメントは、インビトロでヒト皮膚微小血管内皮細胞の遊走と細管形成を阻害する」、Cancer Research (2000) 60: 4719−4724.
14. Marsh HC, Meinwald YC, Lee S, Martinelli RA, Scheraga HA、「フィブリノーゲンに対するトロンビンの作用機構:フィブリノーゲンAアルファGly(P5)−Gly(P4)におけるもしくは近傍におけるベータ彎曲についてNMR的証拠」、Biochemistry (1985) 24: 2806−2812.
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、フィブリノーゲンEのα−β−γ−ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を表す。
【図2】図2は、インビトロでHuDMECによる細管形成へのフィブリノーゲンEフラグメント(パネルA)おおびフィブリンEフラグメント(パネルB)の効果の比較を表す。
【図3】図3は、抗−血管新生フィブリノーゲンEフラグメント(A)おおびプロ−血管新生フィブリンEフラグメント(B)間で構造の相違を示す概略図を表す。唯一の相違は、16個のアミノ酸のフィブリノペプチドAの存在(フィブリノーゲンEフラグメント)もしくは不存在(フィブリンEフラグメント)である。
【図4】図4は、VEGFもしくはbFGFの非存在下もしくは存在下における、インビトロでSVEC4−10による細管形成へのα1−24(β−彎曲)の効果を表す。
【図5A】図5Aはα1−24ペプチドをコードする核酸配列である。
【図5B】図5Bはα1−24ペプチドの直線アミノ酸配列および種々の修飾α1−24ペプチドのアミノ酸配列を表す。
【図6】図6は、マウス中の腫瘍成長に対する非修飾α1−24ペプチドのインビボの効果を表す。
【図7】図7は、アルギニン23からアラニンへの置換(R23A)について抗−血管新生活性の比較を表す。
【図8】図8はアラニン置換α1−24ペプチド(G4A、G6A、G17A)の抗−血管新生活性を表す。
【図9】図9はアラニン置換α1−24ペプチド(D7AおよびR19)ならびに(R16A)の抗−血管新生活性を表す。
【図10】図10は、α1−24ペプチドへの末端修飾(アセチル化およびアミド化)の抗−血管新生活性を表す。
【図11】図11は、インビトロでHuDMEC(10ng/ml VEGFの存在もしくは不存在下で)による細管形成に対する広い濃度範囲のアルファ1−24ペプチドの効果を表す。
Claims (40)
- Xがアラニンである、請求項1もしくは2に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが長さで少なくとも24個のアミノ酸残基である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドが24個のアミノ酸ポリペプチドの活性フラグメントである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドがアミノ酸配列ADSGEGDFLAEGGGVRGPRVVERHからなる、請求項5に記載のポリペプチド。
- ポリペプチドがアセチル化されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 該アセチル化が該ポリペプチドのアミノ末端にされている、請求項8に記載のポリペプチド。
- α1−24ペプチドのアミノ末端アラニンアミノ酸がアセチル化されている、請求項9に記載のポリペプチド。
- 該ポリペプチドがアミド化されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 該アミド化が該ポリペプチドのカルボキシル末端にされている、請求項11に記載のポリペプチド。
- α1−24ペプチドのカルボキシル−末端ヒスチジンアミノ酸がアミド化されている、請求項12に記載のポリペプチド。
- 該ポリペプチドがアセチル化およびアミド化の両方により修飾されている、請求項8〜13いずれか1項に記載のポリペプチド。
- 該アセチル化がα1−24ペプチドのアミノ末端アラニンアミノ酸にされそして該アミド化がα1−24ペプチドのカルボキシル−末端ヒスチジンにされている、請求項14に記載のポリペプチド。
- 該ポリペプチドが環化により修飾されている、請求項1〜15いずれか1項に記載のポリペプチド。
- 以下のグル−プ:
i)図6で表されるようなDNA配列;
ii)請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチドをコードする、少なくとも一つのコドン内で少なくとも一つのヌクレオチド塩基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されている、図6で表されるようなDNA配列;
iii)抗−血管新生活性を有するペプチドをコードするところの図6に示される配列にハイブリダイズする、DNA配列;および
iv)(i)、(ii)もしくは(iii)で規定されるDNA配列への遺伝子コードの結果として縮重しているDNA配列、から選択されるDNA配列を含む核酸分子。 - 該核酸分子がストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下でアニールする、請求項17に記載の核酸分子。
- ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件が:4〜6×SSPE;5〜10×デンハート溶液;100μg〜1.0mg/mlの超音波処理したサケ/ニシンDNA;0.1〜1.0%ドデシル硫酸ナトリウム;40〜60%の脱イオンホルムアミド;および42〜65℃の間の温度、を含む請求項18に記載の核酸分子。
- 少なくとも一つのα1−24ペプチド、もしくはその部分を含む医薬組成物。
- 図5Bで表されるアミノ酸配列により表されるような少なくとも一つのα1−24ペプチドからなる、請求項20に記載の医薬組成物。
- 少なくとも一つのα1−24ペプチドを含みそして少なくとも一つの化学療法剤をさらに含む医薬組成物。
- 該薬剤が、ネオカルジノスタチン;シスプラチン;カルボプラチン;シクロホスファミド;メルファラン;カルムスリン;メソトレキセート;5−フルオロウラシル;シタラビン;メルカプトプリン;ダウノルビシン;ドキソルビシン;エピルビシン;ビンブラスチン;ビンクリスチン;ダクチノマイシン;マイトマイシンC;タキソール;L−アスパラギナーゼ;G−CSF;チャリチアミシンもしくはエスペラミシンのようなエンジイン;クロラムブシル;アラ−C;ビンデシン;ブレオマイシン;およびエトポシド:からなるグル−プから選択される、請求項22に記載の医薬組成物。
- がんの処置に使用するための医薬品の製造におけるα1−24ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドの使用。
- α1−24ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む、ベクター。
- 該ベクターが原核の発現ベクターである、請求項25に記載のベクター。
- 該ベクターが真核の発現ベクターである、請求項25に記載のベクター。
- 該ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項27に記載のベクター。
- 該遺伝子治療ベクターが以下のウイルス:アデノウイルス;アデノ−関連ウイルス;ヘルペスウイルス;レンチウイルス;ワクチニアウイルス;バキュロウイルス、から選択されるウイルスベースのベクターである、請求項28に記載のベクター。
- 請求項17〜19のいずれか1項に記載の核酸もしくは請求項25〜29のいずれか1項に記載のベクターと形質転換またはトランスフェクトされる、細胞。
- i)請求項30にしたがう細胞を提供すること;
ii)α1−24を含むポリペプチドの製造に実施的な条件を提供すること;および
iii)該ポリペプチドを細胞から、もしくは細胞培養環境から精製すること:を含む、α1−24を含むポリペプチドの製造のための方法。 - 該動物がα1−24を含むポリペプチドをコードする核酸分子をそのゲノム内に組入れることを特徴とする非−ヒトの、形質転換動物。
- トランス遺伝子はヒトの起源である、請求項32に記載の非−ヒトの形質転換動物。
- i)処置すべき動物にα1−24を含む薬剤の有効量を投与すること;および
ii)血管新生の阻害への該薬剤の効果をモニターすること:を含む血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法。 - i)処置すべき動物に請求項20もしくは21に記載の医薬組成物の有効量を投与すること;および
ii)血管新生の阻害への該組成物の効果をモニターすること:を含む血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法。 - α1−24ペプチドを含むポリペプチドが、化学療法剤に接合され、会合されもしくは架橋される、請求項34もしくは35に記載の方法。
- i)請求項17〜19のいずれか1項に記載の核酸または請求項28もしくは29に記載のベクターの有効量を投与すること;および
ii)血管新生の阻害への(i)における核酸のトランスフェクションの効果をモニターすること:を含む血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法。 - 該処置が腫瘍の発育の阻害である、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 該動物はヒトである、請求項34〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 検出可能な標識と接合させるか、会合させるかもしくは架橋させたα1−24ポリペプチドを含む、イメージング剤。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0021475A GB0021475D0 (en) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | Anti-aniogenic peptides |
GB0027395A GB0027395D0 (en) | 2000-11-09 | 2000-11-09 | Anti-angiogenic peptides |
US25289600P | 2000-11-27 | 2000-11-27 | |
GB0117737A GB0117737D0 (en) | 2001-07-23 | 2001-07-23 | Modified peptides |
PCT/GB2001/003926 WO2002018440A1 (en) | 2000-09-01 | 2001-09-03 | Anti-angiogenic peptides |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004512832A true JP2004512832A (ja) | 2004-04-30 |
Family
ID=27447880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002523954A Pending JP2004512832A (ja) | 2000-09-01 | 2001-09-03 | 抗−血管新生ペプチド |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1315755A1 (ja) |
JP (1) | JP2004512832A (ja) |
CN (1) | CN1592755A (ja) |
AU (1) | AU2001284235A1 (ja) |
BR (1) | BR0113674A (ja) |
CA (1) | CA2420765A1 (ja) |
IL (1) | IL154609A0 (ja) |
WO (1) | WO2002018440A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010523628A (ja) * | 2007-04-11 | 2010-07-15 | ジェネ シグナル インターナショナル エスエー | 抗腫瘍薬、医薬品、組成物、及びその使用 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1478665A2 (en) * | 2002-02-19 | 2004-11-24 | Novartis AG | Organic compounds having anti-angiogenic activity |
GB0217018D0 (en) * | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Bioacta Ltd | Peptide 1 |
FR2846659B1 (fr) * | 2002-10-30 | 2005-02-18 | Centre Nat Rech Scient | Fragments peptidiques du facteur harp inhibant l'angiogenese |
US7785601B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
DE602007009797D1 (de) * | 2007-04-11 | 2010-11-25 | Gene Signal Int Sa | Antitumorheilmittel, Medikament, Zusammensetzung und Verwendung davon |
US8372810B2 (en) | 2007-04-11 | 2013-02-12 | Gene Signal International Sa | Anti-tumor drug, medicament, composition, and use thereof |
CN107973839B (zh) * | 2017-12-11 | 2020-09-04 | 暨南大学 | 抑制恶性肿瘤并增强化药疗效的活性肽及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5639940A (en) * | 1994-03-03 | 1997-06-17 | Pharmaceutical Proteins Ltd. | Production of fibrinogen in transgenic animals |
AU3199999A (en) * | 1998-03-24 | 1999-10-18 | Children's Medical Center Corporation | Endostatin derived peptides with anti-angiogenic and anti-cancer activity |
-
2001
- 2001-09-03 IL IL15460901A patent/IL154609A0/xx unknown
- 2001-09-03 AU AU2001284235A patent/AU2001284235A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-03 CA CA002420765A patent/CA2420765A1/en not_active Abandoned
- 2001-09-03 WO PCT/GB2001/003926 patent/WO2002018440A1/en active Search and Examination
- 2001-09-03 JP JP2002523954A patent/JP2004512832A/ja active Pending
- 2001-09-03 EP EP01963204A patent/EP1315755A1/en not_active Withdrawn
- 2001-09-03 CN CNA018166830A patent/CN1592755A/zh active Pending
- 2001-09-03 BR BR0113674-7A patent/BR0113674A/pt not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010523628A (ja) * | 2007-04-11 | 2010-07-15 | ジェネ シグナル インターナショナル エスエー | 抗腫瘍薬、医薬品、組成物、及びその使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL154609A0 (en) | 2003-09-17 |
CA2420765A1 (en) | 2002-03-07 |
AU2001284235A1 (en) | 2002-03-13 |
EP1315755A1 (en) | 2003-06-04 |
BR0113674A (pt) | 2003-06-03 |
WO2002018440A1 (en) | 2002-03-07 |
CN1592755A (zh) | 2005-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7045133B2 (en) | VEGF-D/VEGF-C/VEGF peptidomimetic inhibitor | |
JP6002727B2 (ja) | 末梢循環への骨髄由来多能性幹細胞動員薬 | |
US20030125537A1 (en) | Vascular endothelial growth factor D(VEGF-D) antibodies and vectors, and methods of use | |
US20060003932A1 (en) | Method for promoting neovascularization | |
KR20090005300A (ko) | 펩티드 및 펩티드 유도체와 이들을 함유하는 약학적 조성물 | |
JP2004203890A (ja) | マクロファージ炎症蛋白変種 | |
US20210040179A1 (en) | Methods and compositions for the treatment of wounds | |
US20030045489A1 (en) | Methods for modulating angiogenesis | |
JP2004512832A (ja) | 抗−血管新生ペプチド | |
WO2006041205A1 (ja) | 血管形成促進剤 | |
US20040039157A1 (en) | Anti-angiogenic peptides | |
WO1993000357A1 (en) | Therapeutic polypeptides based on von willebrand factor | |
US6835381B1 (en) | Methods for modulating angiogenesis by using the anti-angiogenic angiotensin-7 and polynucleotides encoding therefor | |
US20050118598A1 (en) | Organic compounds | |
US20060019897A1 (en) | Anti-angiogenic polypeptides | |
AU2006200576A1 (en) | Anti-angiogenic peptides | |
US20170198023A1 (en) | Compounds and methods of modulating angiogenesis | |
WO1999055863A1 (fr) | Nouveau polypeptide, adnc le codant et son utilisation | |
EP0648268A1 (en) | Therapeutic fragments of von willebrand factor | |
WO2009116529A1 (ja) | ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物 | |
US20060105942A1 (en) | Inhibition of cell division based use of analogs of neuropeptide y | |
AU2001254967A1 (en) | Anti-angiogenic polypeptides | |
JP2024515250A (ja) | 細胞透過性ペプチド変異体およびその用途 | |
WO2004009128A1 (en) | Anti-angiogenic peptides | |
KR20010030984A (ko) | 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 및이들의 용도 |