— 明 細 書 血管形成促進剤 技術分野
本発明は、 血管形成促進剤およびそれを用いた人工血管の製造方法、 並びに、 虚血性疾患の予防又治療剤及びそれを用いた虚血性疾患、 血管が過剰増殖する疾 患、 又は、 血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の診断方法に関する。 本 発明はまた、 血管形成促進剤、 虚血性疾患の治療若しぐは予防剤、 血管形成抑制 剤、 又は血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のス '· クリーニング方法に関する。 背景技術
血管は酸素をはじめとして養分やその他の分子及び免疫細胞を組織の局所に運 搬する重要な役目を持つことは周知である。 糖尿病や高脂血症、 高血圧などの生 活習慣病などによる血管の破綻は、 血流異常や血管内外の組織環境因子のホメォ スタシスの異常を来し最終的に局所的および臓器全体の不全に陥ることは周知で ある。 血管異常が急性に生じ、 致死にいたる危険性の高い脳梗塞や心筋梗塞が血 管異常の代表となる疾患である。 このような血管病を改善するには、 血管異常の 早期診断技術およびその抑制法、 あるいは破綻を生じた血管を修復する効率良い 血管再生医療が必要であり、 成熟した血管がいかなる分子機序で形成されるのか を解明することにより、 血管異常に応じた血管治療が可能になると考えられる。 近年、 血管形成における分子機序の解明が進み、 血管形成の促進因子を用いた遺 伝子治療やサイトカイン治療あるいは血管形成を促進する細胞を用いた細胞治療 が臨床の現場で行われている。 しかし、 現在未解決であるのが、 現行の治療法で は数 という極細の毛細血管の構築は誘導が可能でも、 ミリメートル単位の太い 血管形成を誘導できない点である。 その問題点を鑑み、 発明者は従来より、 血管 形成に関わる Tie2受容体型チロシンキナーゼの機能解析を詳細に実施してきた。 一方、 ホルモンなどの生理活性因子は、 細胞膜に存在する Gタンパク質共役型
— 受容体と総称される受容体に結合することにより、 様々な生理活性を示すことが 知られている。 A P Jはこのような Gタンパク共役型受容体の一種であるか、、 作 用する因子 (リガンド) が未知のいわゆるォ一ファン受容体として以前から知ら れていた。 最近になり、 A P J受容体はエイズウイルスの感染の際に重要な役割 を果たしている受容体の一つであることが明らかにされた。また APJは血管内皮細 胞ゃ血管壁細胞に発現することから、 血管形成に対する機能があることが示唆さ れてきた。 しかし、 A P J受容体のリガンドが不明なため、 A P J受容体が本来 どのような生理機能の調節に関与しているのかは不明であった。 近年 A P J受容 体の内因性リガンドの探索が進められた結果、 ゥシの胃よりリガンドとして働く ペプチドが精製単離し、 さらにこのペプチドをコードするゥシおよびヒト遺伝子 が同定された。 そして A P J受容体のリガンドは新規生理活性べプチドであるこ とが明らかにされ、 またこのペプチドは A P J受容体の内因性リガンド(A P J e ndogenous l igand)として機能することからァペリン(Apel in)と命名された。アベ リンは A P J受容体に結合することにより様々な作用を発揮するものと推定され てきているが、 まだその詳細は明らかとなっていない。
なおァペリンの用途に関しては例えば特許文献 1に記載されているが、 同文献 には、 血管形成に及ぼす作用については全く言及されていない。
特許文献 1 特開 2 0 0 3— 3 9 3 4 5 6号公報 発明の開示
本発明は、.血管形成を促進させる手段を提供することを目的とする。
従来の検討結果から、 血管内皮細胞に発現する Tie2受容体に対する結合因子 An giopoiet in-1 (以下 Angl) は、 内皮細胞の細胞死を抑制し、 内皮細胞と血管壁細 胞の細胞接着を誘導して血管腔の拡張の誘導や血管の安定化に寄与することが示 唆されてきた。 そこで、 本発明者は Tie2の活性化により、 いかなる分子が血管内 皮細胞で分泌が誘導され、 血管径の拡張に関与するのかを解明すべく、 Tie2が恒 常的に活性化する遺伝子を作成して、 この遺伝子導入された細胞において発現が 上昇する分子を単離してきた。 そこでこれらの遺伝子により、 ヒト臍帯静脈血管 内皮細胞を用いた試験管内血管形成解析法および発明者らが以前発明した P-Sp領
域を用いた試験管内血管形成解析法で血管形成を促進する分子をスクリーニング してきた。 そのなかで、 ァペリン分子が血管径を拡張させる可能性が示唆きれた そして、 本発明者は、 ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエス テル又はそれらの塩が血管形成 (典型的には血管新生 (例えば、 血管網の構築) 又は血管腔の拡張) を促進する作用を有することを見出し本発明を完成するに至 つた。
本発明は以下の発明を包含する。
(1) ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそれらの 塩を有効成分として含有する血管形成促進剤。
(2) ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそれらの 塩を有効成分として含有する虚血性疾患の予防又は治療剤。
(3) ァペリンをコードする遺伝子を含む血管形成促進剤。
(4) ァペリンをコードする遺伝子を含む虚血性疾患の予防又は治療剤。
(5) 血管新生促進剤である、 (1) 又は (3) に記載の血管形成促進剤。
(6) 血管腔拡張促進剤である、 (1) 又は (3) に記載の血管形成促進剤。
(7) ァペリンが配列番号 1で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一の アミノ酸配列を含有するペプチドである (1) 〜 (6) の何れかに記載の剤。
(8) ァペリンが配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配 列を含有するペプチドである (1) 〜 (6) の何れかに記載の剤。
(9) ァペリンが (a) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の 第 6番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (b)配列番号 5、 7
、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 40番目から第 77番目のアミノ酸配 列を有するペプチド、 (c) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列 の第 42番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (d)配列番号 5
、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 47番目から第 77番目のァミノ 酸配列を有するペプチド、 (e) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸 配列の第 61番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (f )配列番 号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 65番目から第 77番目のァ
ミノ酸配列を有するペプチド又はその N末端のアミノ酸 (G i n) がピ pグル夕 ミン酸化したアミノ酸配列を有するペプチド、 (g) 配列番号 5、 7、 9 Xta 1 1 で表されるアミノ酸配列の第 1番目から第 25番目のアミノ酸配列を有するぺプ チド、 (h) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 6番目から 第 25番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( i ) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1 で表されるアミノ酸配列の第 42番目から第 64番目のアミノ酸配列を有するぺ プチド、 (j ) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 61番目 から第 64番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (k) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 43番目から第 77番目のアミノ酸配列を有す るペプチド、 ( 1 ) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 41 番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (m) 配列番号 5、 7、 9 又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 66番目から第 77番目のアミノ酸配列を 有するペプチド、 (n) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 67番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (o) 配列番号 5、 7 、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 64番目から第 77番目のアミノ酸配 列を有するペプチド、 (P) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列 の第 63番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (q)配列番号 5 、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 65番目から第 76番目のァミノ 酸配列を有するペプチド又は (r) 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミ ノ酸配列の第 65番目から第 75番目のアミノ酸配列を有するペプチドである ( 1) 〜 (6) の何れかに記載の剤。
(10) ァペリンが配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 6 5番目から第 77番目のアミノ酸配列を含有するペプチドである (1) 〜 (6) の何れかに記載の剤。
(1 1) ァペリンが pG l u-Ar g-P r o-Ar g-L e u-S e r一 H i s -L y s -G 1 y— P r o— Me t— P r o— Ph eで表されるアミノ酸配列 を含有するペプチドである (1) 〜 (6) の何れかに記載の剤。
(12) ァペリンが配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第 4
2番目から第 77番目のアミノ酸配列を含有するペプチドである (1) 〜 (.6)
の何れかに記載の剤。
(13) ァペリンの修飾体が式:
X1— Ar g— P r o— Ar g— X2— S e r— H i s— X3— G l - P r o - X -X5 (I )
[式中、 X1は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていても よい 1〜25個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、 X2は 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示し、 X3は側鎖が置換されて いてもよい中性アミノ酸残基、 側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基 又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、 X4は結合手又は 側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、 X5は (ィ) 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はその C末端力ルポキシル基がヒド 口キシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (口)水酸基又は( ハ) 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいァ ミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はその C末端力ルポキシル基がヒドロ キシメチル基又はホルミル基に還元されたべプチド誘導体を示し、 式中の一 A r g— P r o— Ar g―、 — S e r— H i s—又は一 G 1 y - P r o—中の各アミ ノ酸残基の側鎖は置換されていてもよい。 但し、 X2が L e uを、 X3が Ly sを 、 X4が Me tを示し、 かつ X5が (ィ) P r o又は (口) P r o— P h eを示し 、 式中の— A r g— P r o— Ar g—が無置換の一 A r g— P r o— Ar g—を 、 - S e r -H i s—が無置換の一 S e r— H i s—を、 且つ一 G 1 y-P r o 一が無置換の _G 1 y-P r o_を示す場合を除く。]
で表される化合物である (1)、 (2)、 (5) 及び (6) の何れかに記載の剤。
(14) ァペリンの修飾体が式:
P1— Ar g— P r o— Ar g— L e u— Ph e— P2— P3— G l y— P r o— P4-P5 (I I )
[式中、 P 1は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていても よい 1〜25個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、 P2は 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい 塩基性アミノ酸残基を示し、 P 3は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残
基、 側鎖が置換されていてもよい芳香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていて もよい塩基性アミノ酸残基を示し、 P 4は結合手又は側鎖が置換されてい もよ い中性又は芳香性アミノ酸残基を示し、 P5は (ィ) 側鎖が置換されていてもよ いアミノ酸残基又はその c末端力ルポキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミ ル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (口) 水酸基又は (ハ) 側鎖が置換されていて もよぃァミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなる ジペプチド鎖又はその C末端力ルポキシル基がヒドロ.キシメチル基又はホルミル 基に還元されたペプチド誘導体を示し、 式中の— Ar g— P r o— Ar g— L e u_Ph e—又は一 G 1 y-P r o _中の各アミノ酸残基の側鎖は置換されてい てもよい。]
で表される化合物である (1)、 (2)、 (5) 及び (6) の何れかに記載の剤。
(1 5) ァペリンの修飾体が式:
Q1— Ar g— P r o— Ar g— L e u_S e r— A l a -Q2-G 1 y -Q5- Q3-Q4 (I I I )
[式中、 Q1は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていても よい 1〜25個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、 Q2は 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 側鎖が置換されていてもよい芳 香性アミノ酸残基又は側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示し、 Q 3は結合手又は側鎖が置換されていてもよい中性又は芳香性アミノ酸残基を示 し、 Q4は (ィ) 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基又はその C末端カル ポキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、
(口) 水酸基又は (八) 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換 されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖又はその C末端カル ポキシル基がヒドロキシメチル基又はホルミル基に還元されたペプチド誘導体を 示し、 Q5は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示し、 式中の _A r g-P r o-Ar g-L e u- S e r -A 1 a—中の各アミノ酸残基の側鎖は 置換されていてもよい。]
で表される化合物である (1)、 (2)、 (5) 及び (6) の何れかに記載の剤。
(1 6) ァペリンの修飾体が式:
R1— Ar g— P r o— Ar g_L e u— S e r— H i s -Ly s -G l. y-P r o- 2-P r o-R3 (I V) i [式中、 R1は水素原子又はそれぞれ同一又は異なって側鎖が置換されていても よい 1〜2 5個のアミノ酸からなるアミノ酸残基又はペプチド鎖を示し、 R2は 置換されていてもよい C h a、 置換されていてもよい Me t又は置換されていて もよい N l eを示し、 R3は置換されていてもよい P h e (C I )、 置換されてい てもよい Ph e、 置換されていてもよい Na 1 (2)、 置換されていてもよい Ch a又は置換されていてもよい Ty rを示し、 式中の一 Ar g_P r o— Ar g_ L e u-S e r -H i s -Ly s -G l y-P r o又は一 P r o—中の各ァミノ 酸残基の側鎖は置換されていてもよい。]
で表される化合物である (1)、 (2)、 (5) 及び (6) の何れかに記載の剤。
(1 7) (1)、 (3) 及び (5) 〜 (16) の何れかに記載の血管形成促進剤を用 いて、 血管系に分化可能な細胞から in vitroにおいて人工血管を製造する方法。
(1 8) 被験体から採取された検体中のァペリン濃度を測定し、 測定値を健常者 及び虚血性疾患患者の測定値と対比することにより虚血性疾患を診断する方法。
(1 9) 被験体から採取された検体中のァペリン濃度を測定し、 測定値を健常者 及び血管が過剰増殖する疾患の患者の測定値と対比することにより血管が過剰増 殖する疾患を診断する方法。
(20) 被験体から採取された検体中のァペリン濃度を測定し、 測定値を健常者 及び血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患の患者の測定値と対比することによ り血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患を診断する方法。
(2 1) (a) ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそ れらの塩、 及び 又は、 (b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列と同一若しくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するァペリン受容体、 その部分ペプチド若し くはその塩を用いることを特徴とする、 血管形成促進剤又は虚血性疾患の治療若 しくは予防剤のスクリーニング方法。
(22) (a) ァペリンをコードする DNAを含有する DNA、 及び Z又は、 (b
) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配 列.を含有するァペリン受容体若しくはその部分ペプチドをコードする DNAを含
有する DN Aを用いることを特徵とする、 血管形成促進剤又は虚血性疾患の治療 若しくは予防剤のスクリーニング方法。
(23) (a) ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそ れらの塩、 及び/又は、 (b)配列番号 3で表されるアミノ酸配列と同一若しくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するァペリン受容体、 その部分ペプチド若し くはその塩を用いることを特徴とする、 血管形成抑制剤又は血管怒張若しくは毛 細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法。
(24) (a) ァペリンをコードする DNAを含有する DNA、 及び/又は、 (b ) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するァペリン受容体若しくはその部分ペプチドをコードする DNAを含 有する DNAを用いることを特徴とする、 血管形成抑制剤又は血管怒張若しくは 毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤のスクリーニング方法。
(25) ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそれら の塩を虚血性疾患の予防又は治療を必要とする患者に投与することを含む、 虚血 性疾患の予防又は治療の方法。
(26) ァペリンをコードする遺伝子を虚血性疾患の予防又は治療を必要とする 患者に投与することを含む、 虚血性疾患の予防又は治療の方法。
(27) (1)、 (3) 及び (5) 〜 (16) の何れかに記載の血管形成促進剤を用 いて、 血管系に分化可能な細胞から in vivoにおいて血管を構築する方法。
(28) 血管形成促進剤の製造における、 ァペリン、 その修飾体、 それらのアミ ド、 それらのエステル又はそれらの塩の使用。
(29) 虚血性疾患の予防又は治療剤の製造における、 ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそれらの塩の使用。
(30) 血管形成促進剤の製造における、 ァペリンをコードする遺伝子の使用。 (31) 虚血性疾患の予防又は治療剤の製造における、 ァペリンをコードする遺 伝子の使用。
なお本明細書において、 「ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのェ ステル又はそれらの塩」 とは、 「ァペリン、 ァペリンの修飾体、 ァペリンのアミド
、 ァペリンのエステル、 ァペリンのアミドのエステル、 ァペリンの塩、 ァペリン
のアミドの塩、 ァペリンのエステルの塩、 ァペリンのアミドのエステル 塩、 ァ ペリン修飾体のアミド、 ァペリン修飾体のエステル、 ァペリン修飾体の ミドの エステル、 ァペリン修飾体の塩、 ァペリン修飾体のアミドの塩、 ァペリン修飾体 のエステルの塩、 又はァペリン修飾体のアミドのエステルの塩」 を意味する。 本明細書において、 「実質的に同一」 とはタンパク質の活性、 例えば、 リガンド と受容体の結合活性、 生理的な特性 (例、 血管形成促進作用) などが、 実質的に 同じことを意味する。 アミノ酸 (特に 1又は数個のアミノ酸) の置換、 欠失、 付 加あるいは挿入はしばしばポリベプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな 変化をもたらさないが、 こうした場合その置換、 欠失、 付加あるいは挿入を施さ れたポリペプチドは、 置換、 欠失、 付加あるいは挿入のされていないものと実質 的に同一であるとされる場合が多い。 該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同 一な置換物としては、 たとえばそのアミノ酸と同一のクラスに属する他のアミノ 酸類から選ぶことができる。 非極性 (疎水性) アミノ酸としては、 ァラニン、 口 イシン、 イソロイシン、 バリン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン 、 メチォニンなどが挙げられる。 極性 (中性) アミノ酸としてはグリシン、 セリ ン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなどが挙げ られる。 陽電荷をもつ (塩基性) アミノ酸としてはアルギニン、 リジン、 ヒスチ ジンなどが挙げられる。 負電荷をもつ (酸性) アミノ酸としては、 ァスパラギン 酸、 グルタミン酸などがあげられる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004- 300653号の明細書 および Ζまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ卜臍帯静脈血管内皮細胞を用い、 マトリゲル上で血管内皮細胞の管 腔形成を観察した結果を示す写真及び模式図である。 上が実際の顕微鏡下の観察 像、 下がその模式図。 コントロールの PBSに比べ、 ポジティブコントロールとして 用いた VEGFは血管網の形成を促進した。 ァペリンも VEGFと同様に管腔形成を促進 した。
図 2は、マウスの大腸ガン細胞である colon26にァペリンを遺伝子導入し、その
ァペリンの発現を RT- PCRにて確認した結果を示す写真である。 GAPDHはポ^ティブ コントロールである。 ァペリン遺伝子を導入した colon26細胞のみにァペリンの m RNAの発現が確認された。 , 図 3は、 ァペリンを発現させた colon26細胞と (破線)、 ァペリンを発現してい ない colon26細胞 (実線) を試験管内で培養したときの増殖曲線を示す図である。 ァペリンは腫瘍細胞の増殖には影響を与えないことが判る。
図 4は、 0P9ストロマ細胞上で胎児期の P- Sp領域を培養し、血管網の形成を観察 した結果を示す写真及び模式図である。 上が実際の顕微鏡下での観察像、 下がそ の模式図。 0P9細胞にァペリンを過剰発現したものでは、血管網を形成する内皮細 胞同士の接着により、 一本一本の血管網の径が太くなることが判明した。
図 5は、 ァペリンを発現させた colon26細胞 (右) と発現させていない colon26 細胞 (左) を Balb/cマウスに皮下移植し形成された腫瘍の外見の写真及び模式図 である。 上に実際の取り出された腫瘍を、 下にその模式図を示す。 ァペリンの導 入された colon26細胞による腫瘍では、 導入されていない colon26細胞による腫瘍 に比べ、 非常に太い血管が形成されているのが判る。
図 6は、 図 5で示した腫瘍組織の切片を CD31に対するモノクローナル抗体で染 色した結果を示す写真である。 上が弱拡大、 下が強拡大の写真である。 ァペリン を導入した colon26細胞による腫瘍組織内にはコントロールと比べ、血管径の太い 血管が形成されているのが判る。
図 7は、 ヒト前立腺がん細胞株である PC3にァペリンを遺伝子導入した細胞(右 ) と、 導入していない細胞 (左) を用い、 ヌードマウスに皮下移植した後に形成 された腫瘍組織の切片を CD31に対する抗体で染色し血管形成を観察した結果を示 す写真である。 矢印で示すように、 ァペリンを導入した腫瘍内では血管径の太い 血管が形成されている。
図 8は、 マウス角膜法を用い、 角膜に形成される新生血管の血管径を観察した 結果を示す写真である。 VEGF単独に比べ、 VEGFとァペリンの両方を投与すると血 管径が拡大するのが分かる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 - 本発明のァペリン (以下、 単にペプチドと略称する場合がある)、 その製造法お よび用途を以下にさらに詳細に説明する。 本発明で用いられるァペリンは、 A P
J (0' Dowd. B. F., et al. , Gene, 436, 355-359, 1993) に対し、 リガンド活性 を有するペプチドであれば、 如何なるものであってもよく、 具体的には、 例えば 配列番号 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する受容体タンパク質に結合能を有するポリペプチドなどがあげられる。 起源は特に限定されず、 ヒトゃ温血動物 (例えば、 モルモット、 ラット、 マウス
、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど) のあらゆる組織 (たとえば、 下垂体、 膝臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化 管、 血管、 心臓など) または細胞などに由来するものであってよい。
本発明で用いられるァペリンは、 具体的には、 配列番号 1で表わされるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するべプチドもしくは その部分ペプチド、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するァペリン前駆体の部分ペプチド、 配列番号 7で表 されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するアベ リン前駆体の部分べプチド、 配列番号 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するァペリン前駆体の部分ペプチド、 または 配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するアベリン前駆体の部分べプチドなどを含有するものであればよい。 例えば、 本発明のァペリンとしては、 配列番号 1で表わされるアミノ酸配列を含 有するペプチドなどの他に、 配列番号 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0〜9
9 . 9 % (好ましくは 7 0〜9 9 . 9 %、 より好ましくは 8 0〜9 9 . 9 %、 さ らに好ましくは 9 0〜9 9 . 9 %) の相同性を有するアミノ酸配列或いは配列番 号 1で表されるアミノ酸配列のうち 1又は数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付加又 は挿入されたアミノ酸配列を含有し、 且つ、 配列番号 1で表わされるアミノ酸配 列を含有するべプチドと実質的に同質の活性を有するぺプチド、 配列番号 5で表 されるァペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するペプチド、 配列番号 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列
を含有するァペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有す ぺプチ ド、 配列番号 9で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のア ノ酸 配列を含有するァペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活性を有するぺ プチド、 または配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するァペリン前駆体の部分ペプチドと実質的に同質の活 性を有するペプチド、 などが挙げられる。 実質的に同質の活性としては、 例えば レセプ夕一結合活性、 シグナル伝達活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 レセプ夕一結合活性などが性質的に同質であることを示す。 したがって、 レセプ ター結合活性の強さなどの強弱、 ペプチドの分子量などの量的要素は異なってい てもよい。
ァペリンとしては、 具体的には、 配列番号 1で表わされるアミノ酸配列もしく はその部分配列、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で 表されるァミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるアミノ酸配列の部分配 列、 配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列、 などで表わされるァミノ 酸配列を含有するマウス脳、 ラット脳、 ブタ脳、 ブ夕小腸、 ゥシ視床下部、 ゥシ 胃、 ヒト視床下部またはヒト肺由来のペプチドなどが挙げられる。 さらに、 配列 番号 1で表されるァミノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5で表されるァ ミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番 号 9で表されるアミノ酸配列の部分配列、 または配列番号 1 1で表されるァミノ 酸配列の部分配列などと同一のアミノ酸配列を含有するペプチドもしくはその部 分ペプチドに対して 1もしくは複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付加あるいは揷 入されているアミノ酸配列を含有するペプチドであって、 同一の活性 (例えば血 管形成促進作用、 レセプ夕一結合活性、 シグナル伝達活性など) を有するぺプチ ドは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとして挙げられる。 例えば
、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5で表さ れるァミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で表されるァミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるアミノ酸配列の部分配列、 または配列番号 1 1で表される ァミノ酸配列の部分配列中の 1個以上 7個以下、 好ましくは 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 或いは、
配列番号 1で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5 表され るアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配 列番号 9で表されるアミノ酸配列の部分配列、 または配列番号 1 1で表されるァ ミノ酸配列の部分配列に 1個以上 2 0個以下、 好ましくは 1個以上 1 5個以下、 より好ましくは 1個以上 1 0個以下のアミノ酸が付加した (または挿入された) アミノ酸配列、 或いは、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配 列、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で表されるアミ ノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるアミノ酸配列の部分配列、 または配 列番号 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列中の 1個以上 7個以下、 好ましく は 1個以上 5個以下、 より好ましくは 1個以上 3個以下のアミノ酸が他のアミノ 酸で置換されたアミノ酸配列を含有するペプチドであって、 同一の活性 (例えば 血管形成促進作用、 レセプ夕一結合活性、 シグナル伝達活性など) を有するぺプ チドなどである。 さらに、 ァペリンまたはその部分ペプチドには、 0 1 11の^^端 側が生体内で切断され、 該 G l nがピログルタミン酸化したものなども含まれる
。 ァペリンの前駆体とは、 ァペリンをその部分配列として含有するタンパク質で あればいかなるものであってもよく、 具体的には、 配列番号 5、 7、 9または 1
1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる (以下、 前記 のァペリンとァペリン前駆体を含めてァペリンと称することがある)。 また、 アベ リンの分子量は約 1 0 0 0〜 1 0 0 0 0ダルトン、 好ましくは約 1 0 0 0〜約 5
0 0 0ダルトン、 より好ましくは、 約 1 0 0 0〜約 3 0 0 0ダルトンである。 本明細書におけるペプチドはペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (アミ ノ末端)、 右端が C末端 (力ルポキシル末端) である。 配列番号 1で表されるアミ ノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5で表されるァミノ酸配列の部分配列
、 配列番号 7で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるァミノ 酸配列の部分配列、 または配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列など を含有するペプチドは、 C末端が通常力ルポキシル基(- C00H) またはカルポキシ レート(-C00—)であるが、 C末端がアミド (- C0NH2) またはエステル(- C00R)であ つてもよい。 エステルの Rとしては、 例えばメチル、 ェチル、 n—プロピル、 ィ ソプロピルもしくは n—ブチルなどの C i - eアルキル基、 シクロペンチル、 シク
口へキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 フエニル、 ひ—ナフチルな の C 6 _ 1 2ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリルなどのフエニル」 C丄 アルキル、 もしくは Q! —ナフチルメチルなどの α —ナフチルー C — 2アルキルな どの〇7 _ 1 4ァラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロィルォ キシメチルエステルなどが挙げられる。 配列番号 1で表されるアミノ酸配列もし くはその部分配列、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7 で表されるァミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるァミノ酸配列の部分 配列、 または配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列などを含有するべ プチドが C末端以外に力ルポキシル基またはカルポキシレートを有している場合 、 それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに 含まれる。 この時のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが 用いられる。 ァペリンの塩としては、 生理学的に許容される塩基 (例えばアル力 リ金属など) や酸 (有機酸、 無機酸) との塩が用いられるが、 とりわけ生理学的 に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 (例えば 、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸) との塩、 あるいは有機酸 (例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リ ンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸) との塩 などが用いられる。 ァペリンは、 ヒトゃ温血動物の組織または細胞からペプチド を精製する方法によって製造することもできるし、 後述のペプチド合成法に準じ て製造することもできる。 また、 後述するァペリンをコードする D N Aを含有す る形質転換体を培養することによつても製造することができる。 ヒトや温血動物 の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ温血動物の組織または細胞をホモジ ナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相 クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマト グラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離するこ とができる。
上記したようにァペリンは、 自体公知のペプチドの合成法に従って、 あるいは ァペリンを含有する前駆体を適当なぺプチダ一ゼで切断することによって製造す ることができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法の
いずれによっても良い。 すなわち、 ァペリンを構成し得る部分ペプチドもしくは アミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基 ¾脱離 することにより目的のぺプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護 基の脱離としてはたとえば、 以下の文献に記載された方法が挙げられる。 M. Bod anszkyおよび M. A. Ondet t i, ペプチド シンセシス (Pept ide Synthes is), Int ersc ience Publ i shers, New York (1966年)、 Schroederおよび Luebke、ザ ぺプチ ド(The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年)、 泉屋信夫他、 ペプチド 合成の基礎と実験、 丸善 (株) (1975年)、 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実 験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年)、 矢島治明監修、 続医薬品の開 発 第 14巻 ペプチド合成 広川書店。 また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶 媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグラフィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶な どを組み合わせて本発明のぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得 られるァペリンが遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換する ことができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換す ることができる。
ァペリンのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用い て製造することができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベ ンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4 _メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P
AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリア クリルアミド樹脂、 4一 (2 ' , 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル) フ エノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' -ジメトキシフエニル一 Fmocアミノエチル) フエノ キシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側 鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配列通りに、 自体 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からぺプチ ドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液中で分子内 ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のペプチドを取得する。 上記した保護 されたアミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を 用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド類とし
ては DCC、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν -ェチル -Ν' _ (3-ジメチレアミノ プロピル) カルポジイミドなどが挙げられる。 これらによる活性化にはラ1 ミ化 抑制添加剤 (例えば、 H0Bt、 HOOBtなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂 に添加するかまたは、対称酸無水物または HOBtエステルあるいは HOOBtエステルと してあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加すること ができる。 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒として は、 ぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう る。 たとえば N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、
N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハ ロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルス ルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなど の二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜 の混合物などが用いられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得るこ とが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適 宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられ る。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の 脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができ る。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセ チルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化して、 後の反応に影響を 及ぼさないようにすることができる。 原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては
、 たとえば、 Z、 Boc、 夕ーシャリーペンチルォキシカルポニル、 イソボルニルォ キシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカルポニル、 ( -Z、 Br- Z、 ァダマ ンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2— ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが挙げ られる。 力ルポキシル基の保護基としては、 たとえば Rとして上記した C^— 6ァ ルキル基、 C 3— 8シクロアルキル基、 C 7 _ 1 4ァラルキル基の他、 2—ァダマンチ ル、 4一二トロベンジル、 4ーメトキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナ シル基およびベンジルォキシカルポニルヒドラジド、 夕一シャリ一ブトキシカル
ポニルヒドラジド、 トリチルヒドラジドなどが挙げられる。 セリンおよびスレオ ニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはェ一テル化によって保護するととが できる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチル基などの低級アル力 ノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 エト キシカルポニル基などの炭素から誘導される基などが挙げられる。 また、 エーテ ル化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 ター シャリ一ブチル基などである。 チロシンのフエノ一ル性水酸基の保護基としては
、 たとえば Bz l、 Cl 2-Bz L 2—二トロベンジル、 Br- Z、 夕一シャリープチルなど が挙げられる。 .ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 Tos、 4 -メトキシ- 2, 3, 6-トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 Boc 、 Tr t、 Fmocなどが挙げられる。原料の力ルポキシル基の活性化されたものとして は、 たとえば対応する酸無水物、 アジド、 活性エステル [アルコール (たとえば 、 ペンタクロロフエノ一ル、 2, 4, 5-トリクロ口フエノール、 2, 4-ジニトロフエノ —ル、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H0NB、 N -ヒドロキシス クシミド、 N-ヒドロキシフタルイミド、 HOBt) とのエステル] などが挙げられる 。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミド が挙げられる。
保護基の除去 (脱離) 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触媒 の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホ ン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合 液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺ リジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによ る還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 2 0 〜 4 0 °C の温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チオアニソ一 ル、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1, 4-ブタンジチォ
—ル、 1, 2-エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また
、 ヒスチジンめイミダゾール保護基として用いられる 2, 4 -ジニトロフエ二ル基は チォフエノール処理により除去され、 トリプ卜ファンのインドール保護基として 用いられるホルミル基は上記の 1, 2-エタンジチオール、 1, 4 -ブタンジチオールな
どの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アン ΐニァな どによるアルカリ処理によっても除去される。 原料の反応に関与すべきで ¾:ぃ官 能基の保護および保護基、 ならびにその保護基の脱離、 反応に関与する官能基の 活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。 ァペリンのアミ ド体を得る別の方法としては、 まず、 力ルポキシル末端アミノ酸の 0;—力ルポキ シル基をアミド化した後、 アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後
、 該ぺプチド鎖の Ν末端のひーァミノ基の保護基のみを除いたぺプチドと C末端 の力ルポキシル基の保護基のみを除いたペプチド (またはアミノ酸) とを製造し
、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細に ついては上記と同様である。 縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、 上 記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ペプチドを得ることができる。 この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥す ることで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。 ァペリンのエステル体 を得るにはカルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコール類 と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチドのアミド体と同様にして所望のァ ペリンのエステル体を得ることができる。
ァペリンとしては、 上記した配列番号 1で表されるアミノ酸配列もしくはその 部分配列、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で表され るアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるアミノ酸配列の部分配列、 ま たは配列番号 1 1で表されるァミノ酸配列の部分配列などと同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドと同様の作用 (例、 血管形成促進作用 など) を有しているものであれば、 どのようなペプチドであってもよい。 このよ うなペプチドとしてはたとえば、 上記した配列番号 1で表されるァミノ酸配列も しくはその部分配列、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号
7で表されるァミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表されるァミノ酸配列の部 分配列、 または配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列などを有するぺ プチドから、 1個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するペプチドであ つて、 同様の活性 (例、 血管形成促進作用など) を有しているものを挙げること ができる。具体的には、 (1)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の第 1番目から第
1 2番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(2)配列番号 1で表されるアミノ酸配 列の第 1番目から第 1 3番目のアミノ酸配列を有するペプチド、(3)配列 ¾^号 1で 表されるアミノ酸配列の第 1番目から第 1 4番目のアミノ酸配列を有するぺプチ ド、(4)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の第 1番目から第 1 5番目のアミノ酸 配列を有するペプチド、(5)配列番号 1で表されるアミノ酸配列の第 1番目から第
1 6番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (6) 配列番号 5、 7、 9または 1 1 で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するぺプチドなどが好ましい。 なかでも
、 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列を有するぺ プチドなどが好ましい。
また、 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の部分配列を有 するペプチドとして具体的には、 (a ) 配列番号 5、 7、 9または 1 で表される アミノ酸配列の第 6番目から第 7 7番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (b ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 4 0番目から第 7 7 番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (c ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表 されるアミノ酸配列の第 4 2番目から第 7 7番目のアミノ酸配列を有するぺプチ ド、 (d ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 4 7番目か ら第 7 7番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (e ) 配列番号 5、 7、 9または
1 1で表されるアミノ酸配列の第 6 1番目から第 7 7番目のアミノ酸配列を有す るペプチド、 (f ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 6
5番目から第 7 7番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたはその N末端のアミ ノ酸 (G i n ) がピログルタミン酸化したもの、 (g ) 配列番号 5、 7、 9または
1 1で表されるアミノ酸配列の第 1番目から第 2 5番目のアミノ酸配列を有する ペプチド、 (h ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 6番 目から第 2 5番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( i ) 配列番号 5、 7、 9ま たは 1 1で表されるアミノ酸配列の第 4 2番目から第 6 4番目のアミノ酸配列を 有するペプチド、 (j ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の 第 6 1番目から第 6 4番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (k ) 配列番号 5、
7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 4 3番目から第 7 7番目のァミノ 酸配列を有するペプチド、 ( 1 ) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるァミノ
— 酸配列の第 41番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( )配列 番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 66番目から第 7 番目 のアミノ酸配列を有するペプチド、 (n) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表され るアミノ酸配列の第 67番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、
(o) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 64番目から 第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (p) 配列番号 5、 7、 9または 1
1で表されるアミノ酸配列の第 63番目から第 77番目のアミノ酸配列を有する ペプチド、 (Q) 配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 65 番目から第 76番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (r) 配列番号 5、 7、 9 または 11で表されるアミノ酸配列の第 65番目から第 75番目のアミノ酸配列 を有するペプチド、 などがあげられ、 なかでも配列番号 5、 7、 9または 1 1で 表されるアミノ酸配列の第 65番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するぺプ チドまたはその N末端のアミノ酸 (G i n) がピログルタミン酸化したものまた は配列番号 5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 42番目から第 7
7番目のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく用いられる。 特に、 配列番号
5、 7、 9または 1 1で表されるアミノ酸配列の第 65番目から第 77番目のァ ミノ酸配列で表わされるペプチドまたはその N末端のアミノ酸 (G i n) がピロ グルタミン酸化したもの(pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro
Phe) が好ましい。 さらに pGlu Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro
Pheで表されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列を有するペプチドもァペリンと して好ましく用いられる。
ァペリンをコードする DNAとしては、 具体的には、 前記した配列番号 1で表 されるァミノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5で表されるァミノ酸配列 の部分配列、 配列番号 7で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表さ れるアミノ酸配列の部分配列、 または配列番号 1 1で表されるアミノ酸配列の部 分配列で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するァペリンをコ一ドする DNAを含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した組織 -細 胞由来の cDNA、 前記した組織 ·細胞由来の cDNAライブラリ一、 合成 DN
Aのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは特に限定されず、 例え ばバクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれ *であつ てもよい。 また、 前記した組織 '細胞より RNA画分を調製したものを用.いて直 接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-P C R¾<h 略称する)によって増幅することもできる。より具体的には、配列番号 1で表され るァミノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5で表されるァミノ酸配列の部 分配列、 配列番号 7で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 9で表される アミノ酸配列の部分配列、 または配列番号 11で表されるアミノ酸配列の部分配 列を含有するマウス全脳、 ラット全脳、 ゥシ視床下部、 ゥシ胃由来、 ヒト視床下 部またはヒト肺由来のポリペプチドをコードする DN Aとしては、(1)配列番号 2 で表される塩基配列もしくはその部分配列、 配列番号 6で表わされる塩基配列の 部分配列、 配列番号 8で表される塩基配列の部分配列、 配列番号 10で表される 塩基配列の部分配列、 または配列番号 12で表される塩基配列の部分配列を有す る DNAを含有する DNA、 (2) (1)で規定された配列と相補的な塩基配列からな る DNAとス卜リンジェントな条件下でハイブリダィズする哺乳動物由来の DN
Aであって、 同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする DNA、 (3)遺伝 コードの縮重のため(1)および(2)に定められている配列とハイブリッド形成しな いが、 同一アミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする D N Aなどが用いられ る。 ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従 つて行うことができる。 上記ストリンジェン卜な条件としては、 例えば 42 、
50 %ホルムアミド、 4 XS S PE (1 X S S PE = 150mM NaCl, 10mM NaH2P04
•H20, lraM EDTA pH7.4)、 5Xデンハート溶液、 0. 1%SDSである。 上記配 列番号 2で表される塩基配列において、 Yは Tまたは Cを、 Nは T, C, Aまた は Gを、 Rは Aまたは Gを、 Mは Cまたは Aを、 Wは Tまたは Aを、 Sは Cまた は Gを示す。 また、 配列番号 1で表されるアミノ酸配列もしくはその部分配列、 配列番号 5で表されるアミノ酸配列の部分配列、 配列番号 7で表されるアミノ酸 配列の部分配列、 配列番号 9で表されるアミノ酸配列の部分配列、 または配列番 号 11で表されるァミノ酸配列の部分配列などを含有するポリペプチドをコード する DNAの中で例えば 6個以上 51個以下 (好ましくは 9個以上 30個以下、
さらに好ましくは 12個以上 30個以下) の部分塩基配列を含有する A断片 は DNA検出プローブとしても好ましく用いられる。 j ァペリンをコ一ドする DNAは以下の遺伝子工学的手法によっても製造するこ とができる。 ァペリンを完全にコードする DNAのクロ一ニングの手段としては 、 ァペリンの部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用いて自体公知の P CR法によって前記 DN Aライブラリ一等から目的とする DN Aを増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ D N Aを例えば本発明のポリペプチドの一部 あるいは全領域を有する DN A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものと のハイプリダイゼ一シヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼーシ ヨンの方法は、 例えば Molecular Cloning (2nd ed. ; J. Sambrook et al. , Co Id SpringHarbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行われる。 また 、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って 行う。 クローン化されたァペリンをコードする DNAは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用すること ができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての T A A、 TG Aまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプターを用いて付加することもできる。 ァペリンの発現ベクターは、 例えば 、 (ィ) ァペリンをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 (口 ) 該0 N A断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することに より製造することができる。 ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド (例、 p BR 322, p BR 325, pUC 12 , p U C 13 )、 枯草菌由来のプラスミ ド (例、 pUB 110, TP 5, p C 194)、 酵母由来プラスミド (例、 p S H19, pSH15)、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応し て適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 S V40由来のプロモータ
―、 レトロウイルスのプロモータ一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートシ
ョックプロモータ一、 サイ卜メガロウィルスプロモータ一、 SR aプロモーター などが利用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモし夕一
、 T 7プロモーター、 l a cプロモーター、 r e c Aプロモーター、 PLプロ モー夕一、 1 p pプロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P
〇 1プロモーター、 S P02プロモータ一、 : p e n Pプロモーターなど、 宿主が 酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモ 一夕一、 ADH1プロモ一夕一、 GALプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆 虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好 ましい。 発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシ ングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン (以 下、 S V40 o r iと略称する場合がある) などを含有しているものを用いるこ とができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 (以下、 d h f rと略称する場合がある) 遺伝子 〔メソトレキセート (MTX) 耐性〕、 アン ピシリン耐性遺伝子(以下、 Amp rと略称する場合がある)、 ネオマイシン耐性 遺伝子 (以下、 Ne oと略称する場合がある、 G41 8耐性) 等が挙げられる。 特に、 CH〇 (dh f r— ) 細胞を用いて D H F R遺伝子を選択マーカ一として 使用する場合、 チミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応 じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ポリペプチドまたはその部分ペプチドの N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 phoA 'シグナル配列
、 〇即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—ァミラ
—ゼ,シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である場 合は、 メイティングファクタ一 (MF a) ·シグナル配列、 インベルタ一ゼ 'シ グナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばインシュリン ·シグナ ル配列、 一インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などが それぞれ利用できる。 このようにして構築されたポリペプチドをコードする D N
Aを含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫または 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。 ェシエリヒア属菌としては、 ェシエリヒ ァ 'コリ (Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ.ザ .
ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス:!;一 (ΡΓ oc. Natl. Acad. Sci. USA), 60巻, 160 (1968)〕, Μ103¾〔ヌク ィレック ·ァシッズ · リサーチ (Nucleic Acids Research), 9巻, 309 (19
81)〕, J A221 〔ジャ一ナル ·ォブ ·モレキュラー 'バイオロジー (Jouma
1 of Molecular Biology)], 120巻, 517 (1978)〕, HB 101 〔ジャー ナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー, 41巻, 459 (1969)〕, C 60
0 〔ジェネティックス (Genetics), 39巻, 440 ( 1954)〕 などが用いられ る。 バチルス属菌としては、 たとえばバチルス ·サプチルス (Bacillus subtili s) M I 114 〔ジ一ン, 24巻, 255 (1983)〕, 207— 21 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリ一 (Journal of Biochemistry), 95巻, 87 (19
84)〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレビシェ (Saccaromyces cerevi siae) AH 22 , AH22R- , ΝΑ 87 - 11 A, DKD- 5 D, 20B— 1
2などが用いられる。 昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前 田ら、 ネイチヤー (Nature), 315巻, 592 (1985)〕。 昆虫細胞としては
、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 (Spodop tera frugiperda cell; S f細胞)、 Trichoplusia niの中腸由来の MG 1細胞、 T richoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Mamestrabrassicae由来の細胞ま たは Est igmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスが B mN P Vの場合 は、 蚕由来株化細胞 (Bombyx mori N; BmN細胞) などが用いられる。 該 S f細 胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) S f 2 1細胞 〔以上、 Vaugh n, J.L.ら、 イン 'ヴィ ト口 (in Vitro), 13巻, 213— 217頁 (1977 年)〕 などが用いられる。 動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞, Ve ro細胞, チャイニーズハムスター細胞 CHO, DHFR遺伝子欠損チャイニーズ ハムスター細胞 CHO (d h f r— CHO細胞), マウス L細胞, マウス 3 T 3細 胞、 マウスミエ口一マ細胞, ヒト ΗΕΚ293細胞、 ヒト FL細胞、 293細胞
、 C 127細胞、 BALB3T3細胞、 S ρ— 2 ΖΟ細胞などが用いられる。 ェ シエリヒア属菌を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナ ショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォプ ·ザ ·ユーエスエー (Proc
• Natl. Acad. Sci. USA), 69巻, 2110 ( 1972 )やジーン (Ge.ne), 1
7巻, 107 (1982)などに記載の方法に従って行なわれる。 バチルス属菌を 形質転換するには、 たとえばモレキュラー 'アンド 'ジェネラル ·ジエネティッ クス (Molecular & General Genetics), 168巻, 111 (1979)などに記 載の方法に従って行われる。 酵母を形質転換するには、 たとえばプロシージング ズ .ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ 'ザ .ュ
—エスエー(Pro Natl. Acad. Sci. USA), 75巻, 1929 (1978)に記 載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえばバイオ テクノロジー (Bi o/Tec nology) , 6巻, 47— 55頁(1988年) などに記載の方法に従って行 なわれる。 動物細胞を形質転換するには、 たとえばヴイロロジー (Virology), 5
2卷, 456 (1973)に記載の方法に従って行なわれる。 発現ベクターの細胞 への導入方法としては、 例えば、 リポフエクシヨン法 〔Felgner, P. L. et al. プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ
•ォブ ·ザ ·ュ一エスェ一 (Proceedings of the Nat inalAcademy of Sciences of the United States of America), 84巻, 7413頁 ( 1987年)〕、 リン 酸カルシウム法 〔Graham, F. L. and van der Eb, A. Lヴイロロジ一 (Virology
), 52巻, 456— 467頁 (1973年)〕、 電気穿孔法 〔Nuemann, E. et al
. ェンポ 'ジャーナル (EMBO J.), 1巻, 841 _ 845頁 (1982年)〕 等が 挙げられる。 このようにして、 本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有 する発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。 なお、 動物細胞を用 いて、 本発明のポリペプチド等を安定に発現させる方法としては、 上記の動物細 胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によつ て選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカーを指標にして形質転換 体を選択する。 さらに、 このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対 して、 繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポリペプチド等の高発 現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。 また、 dh f r遺伝子を選 択マーカーとして用いた場合、 MTX濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択 することにより、 dh f r遺伝子とともに、 本発明のポリペプチドまたはその部
分ペプチド等をコードする DN Aを細胞内で増幅させて、 さらに高発現の動物細 胞株を得ることもできる。 上記の形質転換体を本発明のポリペプチド等を 一ド する DN Aが発現可能な条件下で培養し、 本発明のポリペプチド等を生成、 蓄積 せしめることによって、 本発明のポリペプチド等を製造することができる。 宿主 がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に使用 される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に必 要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 たと えばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 た とえばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 カゼ イン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物 としてはたとえば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウム などが挙げられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよ い。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ 酸を含む M 9培地 〔ミラ一 (Miller), ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ -ィ ン ·モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments in Molecular
Genetics), 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 197
2〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモ一夕一を効率よく働かせるために、 た とえば 3 j8 _インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主が ェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時間行い、 必 要により、 通気や撹拌を加えることもできる。 宿主がバチルス属菌の場合、 培養 は通常約 30〜40 で約 6〜24時間行ない、 必要により通気や撹拌を加える こともできる。 宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たと えばバークホールダ一 (Burkholder)最小培地 〔Bostian, K. L ら、 プロシ一ジ ングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ ·ォプ ·ザ
-ュ一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77巻, 4505 (1980
)〕 や 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシージン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスェ一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81巻, 5330 ( 1984
)〕 が挙げられる。培地の pHは約 5~8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20°C〜35 で約 24〜72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加え ¾。 宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Inse ct Medium (Grace, T. C. C.,ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行 い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養 する際、 培地としては、 たとえば約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔 サイエンス (Seience), 122巻, 501 ( 1952 )〕, DME M培地 〔ヴイロ口 ジ一 (Virology), 8巻, 396 (1959)〕, RPMI 1640培地 〔ジャーナ ル ·ォブ ·ザ ·アメリカン .メディカル ·アソシエーション (The Jounal of th e American Medical Association) 199巻, 519 (1967)〕, 199培地 〔 プロシ一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メデ イスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73巻, 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は 通常約 30°C〜40でで約 15〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加え る。 特に CHO (dh f r一) 細胞および dhfr遺伝子を選択マ一カーとして用い る場合には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む D M E M培地 を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、 例えば下記の方法 により行なうことができる。 本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から 抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適 当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって 菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出 液を得る方法などが適宜用い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのた んぱく変性剤や、 トリ 卜ン X— 100 (登録商標。 以下、 TMと省略することが ある。)などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌 される場合には、 培養終了後、 自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分 離し、 上清を集める。 このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含
まれる本発明のポリペプチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合 わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩ネ jf*や溶媒 沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および
S D S一ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用す る方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ 二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体 クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法やクロ マトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 かくし て得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた 場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩 に変換することができる。 なお、 組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、 精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、 任意 に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 タンパク質 修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべ プチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられ得る。 かくし て生成する本発明のポリベプチドの存在は特異抗体を用いたェンザィムィムノア ッセィなどにより測定することができる。
次に、 ァペリンの修飾体について説明する。 本願明細書においてアミノ酸残基 とは、 アミノ酸が水分子を失ってペプチド結合を形成し、 タンパク質やペプチド 中に取り込まれた時の構造をいう。 例えば、 ひ—アミノ酸残基は、 タンパク質や ペプチド中に取り込まれた時の N末端もしくは C末端以外の部分において、 ひ一 アミノ酸 (H2NC (Rfl) (R COOH: RQおよび R1はそれぞれ同一または異なって、 任意 の置換基を示す) が水分子を失ってペプチド結合を形成して得られた- NHC (RQ) (R1
) C0-の構造を有する。 一方、 N末端の a—アミノ酸残基は H2NC (RQ) (R1) CO-, C末 端の α—アミノ酸残基は -NHC (RQ) (R COOHで示される。 また、 /3—アミノ酸残基 は、 タンパク質やペプチド中に取り込まれた時の N末端もしくは C末端以外の部 分において、 jS—アミノ酸 (H2NC (R°) (R1) C (R2) (R3) COOH: R。、 R'、 R2および R3は それぞれ同一または異なって、 任意の置換基を示す) が水分子を失ってペプチド
結合を形成して得られた- NHC (RD) (R1) C ( 2) (R3) CO-の構造を有する。 一方、. N末端 の j3 _アミノ酸残基は H2NC (R°) (R1) C (R2) (R3) CO-、 C末端の j3 _アミノ酸幾基は -
NHC (R°) (R1) C (R2) (R3) C00Hで示される。 また、 ァーアミノ酸残基は、 タンパク質や ペプチド中に取り込まれた時の N末端もしくは C末端以外の部分において、 了 _ アミノ酸 (H2NC (R°) (R1) C (R2) (R3) C (R4) (R5) COOH : R。、 R〗、 R2、 R3、 R4および R5は それぞれ同一または異なって、 任意の置換基を示す) が水分子を失ってペプチド 結合を形成して得られた- NHC (RQ) (R1) C (R2) (R3) C (R4) (R5) CO-の構造を有する。一方
、 N末端のァーアミノ酸残基は H2NC (Rfl) (R1) C (R2) (R3) C 4) (R5) CO-、 C末端のァ一 アミノ酸残基は- NHC (Rfl) (R1) C (R2) (R3) C (R4) (R5) COOHで示される。 さらに、 ε—ァ ミノ酸残基は、 タンパク質やペプチド中に取り込まれた時の Ν末端もしくは C末 端以外の部分において、 ε —アミノ酸 (H2NC (R°) (R1) C (R2) ( 3) C ( 4) ( 5) C (R6) (R7)
C (R8) (R9) COOH: R。、 R'、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R7、 R8および R9はそれぞれ同一また は異なって、 任意の置換基を示す) が水分子を失ってペプチド結合を形成して得 られた _NHC (Rfl) (R1) C (R2) (R3) C (R4) (R5) C (R6) (R7) C (R8) (R9) CO-の構造を有する。 一 方、 N末端の 8 一アミノ酸残基は H2NC (R°) (R1) C (R2) 3) C (R4) (R5) C (R6) (R7) C (R8) (
R9) CO-、 C末端の ε—アミノ酸残基は- NHC (R°) (R1) C (R2) (R3) C (R4) (R5) C (R6) (R7) C (
8) (R9) COOHで示される。
本明細書において、 アミノ酸としては、 天然または非天然のアミノ酸であって
、 D—体または L—体のいずれでもよく、 ひ一、 β—、 ァ—、 ε —型のいずれの ものでもよい。 α—アミノ酸、 3—アミノ酸、 ァーアミノ酸、 ε—アミノ酸の側 鎖を形成する基としては、 例えば(1) アルキル基 (例、 メチル、 ェチル、 η 一プロピル、 イソプロピル、 η—ブチル、 イソブチル、 s e cーブチル、 t e r t 一プチル、 n—ペンチルなど、 好ましくは C^ - sアルキルなど)、 (2)シァノ基
、 (3)ハロゲン (例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など)、 (4)ヒドロキシ—
6アルキル基 (例、 ヒドロキシメチル、 ヒドロキシェチルなど)、 (5) C i— 6アルコ キシ基 (例、 メトキシ、 エトキシ、 n—プロボキシ、 イソプロボキシ、 n—ブト キシ、 t e r t —ブトキシなど、 好ましくは — 3アルコキシなど)、 (6) 0 , _ 6 アルコキシ—力ルポニル基 (例、 メ卜キシカルポニル、 エトキシカルポニル、 ィ ソプロポキシ力ルポニル、 t e r t —ブトキシカルポニルなど、 好ましくは C i—
3アルコキシ—カルポニルなど)、 (7) ァシル基 (例、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 ブチリルなどのホルミルおよび C 2_4アルカノィルなど)、 ()ヒド ロキシ基、 (9)式: —S (0) a— R 2 1 (式中、 aは 0〜2の整数を、 R 2 1は( 一
6アルキル (具体例は、 上記と同様のものが挙げられる) を示す) で表わされる 基 (例、 メチルチオ、 メタンスルフィニル、 メタンスルホ二ル1、 ェチルチオ、 ェ 夕ンスルフィニル、 エタンスルホニルなど)、 (10)ベンジルォキシカルポニル、 (
11) トシル基、 (12)力ルバモイル基、 (13)メルカプト基、 (14)アミノ基、 (15)スル ホ基、 (16)ホスホノ基、 (17)ホスホ基、 (18) 力ルポキシル基、 (19) テトラゾリ ル基、 (20)アミノー 6アルキル基 (例、 アミノメチル、 アミノエチルなど)
、 (21)アミノアリル基、 (22)チアゾリル基、 (23)チェニル基、 (24)ォキサゾリル 基、 (25)フリル基、 (26)ビラ二ル基、 (27)ピリジル基、 (28)ビラジル基、 (29)ピ ラジニル基、 (30)ピリミジニル基、 (31)ピリダジニル基、 (32)インドリル基、 (3
3)インドジニル基、 (34)イソインドリル基、 (35)ピロリル基、 (36) イミダゾリル 基、 (37)イソチアゾリル基、 (38)ピラゾリル基、 (39)クロメニル基、 (40)プリ二 ル基、 (41)キノリジニル基、 (42)キノリル基、 (43)イソキノリル基、 (44)キナゾ リニル基、 (45)キノキサリニル基、 (46)シンノリニル基、 (47)モルホリニル基、 (
48)ベンゾチェ二ル基、 (49)ベンゾフラニル基、 (50) ベンズイミダソリル、 (51) ベンズイミダゾリル基、 (52) C 3 _ 8シクロアルキル基、 (53)上記(2)、 (3)、 (5
)から (17)、 (20)から(52)に記載の置換基で置換された — 4アルキル基、 (54) 上記(2)、 (3)、 (5)から (17)、 (20)から(52)に記載の置換基で置換されたホルミ ル、 C 2 _4アルカノィルなどの(^ _ 4ァシル基、 (55)上記(1)から(52)の記載の置 換基で置換されたフエニルなどの C 6 _ 1 0ァリール基(メシチル、 トリル、 キシリ ル、スチレニルなど)、 (56) 上記(1)から(52)の記載の置換基で置換されたべンジ ルなどの C 7_15ァラルキル基 (メチルペンジル、 メトキシベンジルなど)、 (57) C
7_15ァラルキル基(ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリル、 ナフチルメチルなど)
、 (58) C 6 _ 1 0ァリール基 (フエニル、 ナフチル、 インデニルなど)、 および(59
)水素原子などがあげられる。
また、 アミノ酸残基を形成する側鎖と窒素原子が結合し、 環を形成してもよく
(例、 プロリンなど)、 2つの側鎖が結合し環を形成してもよい (例、 3—ァミノ
ノルボルナンカルボン酸など)。 Q!—アミノ酸の例としては、 例えば、 グリシン, ァラニン, パリン, ロイシン, イソロイシン, セリン, スレオニン, シス Sティン , メチォニン, ァスパラギン酸, グルタミン酸, リジン, アルギニン, フ,ェニル ァラニン, チロシン, ヒスチジン, トリブトファン, ァスパラギン、 グルタミン
、 プロリン, ピペコリン酸、 ノルロイシン, ァーメチルロイシン, t e r t-ロイシン
, ノルパリン, ホモアルギニン, ホモセリン, Q!—ァミノイソ酪酸, ひーァミノ 酪酸, オル二チン、 a—ァミノアジピン酸、 フエニルグリシン、 チェニルダリシ ン、 シクロへキシルグリシン、 シクロへキシルァラニン、 チェ二ルァラニン、 ナ フチルァラニン、 ビフエ二ルァラニン、 p —ホスホノメチルフエ二ルァラニン、 ォク夕ハイド口インドールー 2 _カルポン酸、 O—ホスホチロシン、 ァダマンチ ルァラニン、 ベンゾチェ二ルァラニン、 ピリジルァラニン、 ピベリジルァラニン 、 ピラジルァラニン、 キノリルァラニン、 チアゾリルァラニン、 ホモシスティン 、 ホモフエ二ルァラニン、 シトルリン、 ホモシトルリン、 ォキシプロリン (ヒド ロキシプロリン)、 ひ、 j8—ジァミノプロピオン酸、 a、 了一ジァミノ酪酸、 アミ ノマロン酸、 1, 2, 3, 4-テトラヒドロイソキノリン- 3 -力ルボン酸、 ぺニシラミン、 シクロロイシン、 2 -ァミノ- 4-ペンテン酸などがあげられる。 )3 _アミノ酸の例と しては、 例えば、 β—了ラニン、 jS—ァミノ酪酸、 イソァスパラギン、 3-ァミノ アジピン酸、 3-ァミノフエ二ルプロピオン酸、 3 -ァミノ- 2 -ヒドロキシ- 4 -フエ二 ル酪酸、 3 -ァミノノルポルナンカルボン酸、 3 -アミノビシクロヘプタンカルボン 酸などがあげられる。 ァ—アミノ酸の例としては、 例えば、 ァ-ァミノ酪酸、 イソ グルタミン、 ス夕チン、 4-ァミノ- 3-ヒドロキシ- 5-シクロへキシルペンタン酸、 4 -ァミノ- 3 -ヒドロキシ- 5-フエ二ルペンタン酸、 6-アミノぺニシラン酸、 3 -ァミノ ァダマンタン- 1-カルボン酸などがあげられる。 ε —アミノ酸の例としては、 例え ば、 ε -アミノカプロン酸、 4 -アミノメチル-シクロへキサンカルボン酸などがあ げられる。
該天然のアミノ酸としては、 グリシン, ァラニン, バリン, ロイシン, イソ口 イシン, セリン, スレオニン, システィン, シスチン, メチォニン, ァスパラギ ン酸, グルタミン酸, リジン, アルギニン, フエ二ルァラニン, チロシン, ヒス チジン, トリブトファン, ァスパラギン, グルタミン, プロリン, オル二チン,
シトルリンなどが挙げられる。 非天然のアミノ酸としては、 ノルロイシ , r - メチルロイシン, tert-ロイシン, ノルパリン, ホモアルギニン, ホモセリ jン, ァ ミノイソ酪酸, アミノアジピン酸 (例、 ひーァミノアジピン酸)、 フエニルダリ シン、 チェニルダリシン、 シクロへキシルグリシン、 ァミノ酪酸、 j3—ァラニン
、 シクロへキシルァラニン、 チェ二ルァラニン、 ナフチルァラニン、 ァダマンチ ルァラニン、 ベンゾチェ二ルァラニン、 ピリジルァラニン、 ピベリジルァラニン
、 ピラジルァラニン、 キノリルァラニン、 チアゾリルァラニン、 イソァスパラギ ン、 イソグルタミン、 ホモシスティン、 ホモフエ二ルァラニン、 ホモシトルリン
、 ォキシプロリン (ヒドロキシプロリン)、 ジァミノプロピオン酸、 ジァミノ酪酸
、 ァミノ安息香酸、 前記天然アミノ酸、 非天然アミノ酸の N -メチル化体などが挙 げられる。 これらのアミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基の例として は、 (1) 6アルキル基 (例、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル
、 n —ブチル、 イソブチル、 s e cーブチル、 t e r t 一ブチル、 n—ペンチル など、 好ましくは アルキルなど)、 (2)シァノ基、 (3)ハロゲン (例、 フッ素
、 塩素、 臭素、 ヨウ素など)、 (4)ヒドロキシ一 ^— eアルキル基 (例、 ヒドロキ シメチル、 ヒドロキシェチルなど)、 (5) ^— 6アルコキシ基 (例、 メトキシ、 ェ 卜キシ、 n —プロポキシ、 イソプロポキシ、 n—プ卜キシ、 t e r t—ブ卜キシ など、 好ましくは アルコキシなど)、 (6) — 6アルコキシ一力ルポニル基
(例、 メトキシカルポニル、 エトキシカルボニル、 イソプロポキシ力ルポニル、 t e r t —ブトキシカルポニルなど、 好ましくは Cエ アルコキシ一力ルポニル など)、 (7) (^— 4ァシル基 (例、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリル などのホルミルおよび C 2— 4アルカノィルなど)、 (8)ヒドロキシ基、 (9)式:一 S
(O) a - R 2 1 (式中、 aは 0〜 2の整数を、 2 1は(:1—6ァルキル (具体例は、 上記と同様のものが挙げられる) を示す) で表わされる基 (例、 メチルチオ、 メ 夕ンスルフィニル、 メタンスルホニル、 ェチルチオ、 エタンスルフィエル、 エタ ンスルホニルなど)、 (10)ベンジルォキシカルボニル、 (1 1) トシル基、 (12)力ルバ モイル基、 (13)メルカプト基、 (14)アミノ基、 (15)スルホ基、 (16)ホスホノ基、 (
Π)ホスホ基、 (18) カルボキシル基、 (19) テトラゾリル基、 (20)アミノー(:
6アルキル基 (例、 アミノメチル、 アミノエチルなど)、 (21)アミノアリル基、 (2
2)チアゾリル基、 (23)チェニル基、 (24)ォキサゾリル基、 (25)フリル基、. (26)ピ ラニル基、 (27)ピリジル基、 (28)ピラジル基、 (29)ピラジニル基、 (30)ピりミジ ニル基、 (31)ピリダジニル基、 (32)インドリル基、 (33)インドジニル基、 (34)ィ ソインドリル基、 (35)ピロリル基、 (36) イミダゾリル基、 (37)イソチアゾリル基 、 (38)ピラゾリル基、 (39)クロメニル基、 (40)プリニル基、 (41)キノリジニル基 、 (42)キノリル基、 (43)イソキノリル基、 (44)キナゾリニル基、 (45)キノキサリ ニル基、 (46)シンノリニル基、 (47)モルホリニル基、 (48)ベンゾチェ二ル基、 (4 9)ベンゾフラニル基、 (50) ベンズイミダソリル、 (51)ベンズイミダゾリル基、 ( 52) C3_8シクロアルキル基、 (53)ォキソ基、 (54)上記(2)、 (3)、 (5)から (19)
、 (22)から(52)に記載の置換基で置換された アルキル基、 (55) 上記(2)、 (
3)、 (5)から (19)、 (22)から(52)に記載の置換基で置換されたホルミル、 C2— 4 アルカノィルなどの(^_4ァシル基、 (56)上記(1)から(52)の記載の置換基で置換 されたフエニルなどの C6_10ァリール基 (メシチル、 トリル、 キシリル、 スチレ ニルなど)、 (57)上記(1)から(52)の記載の置換基で置換されたべンジルなどの C7 _15ァラルキル基 (メチルペンジル、 メトキシベンジルなど)、 (58) C7— 15ァラルキ ル基(ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリル、 ナフチルメチルなど)、 (59) C6
。ァリール基 (フエニル、 ナフチル、 インデニルなど) などがあげられる。 本明細書において、 中性の置換基としては、 (1) アルキル基 (例、 メチ ル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチル、 イソブチル、 s e c— ブチル、 t e r t—ブチル、 n—ペンチルなど、 好ましくはじェ アルキルなど )、 (2)シァノ基、 (3)ハロゲン (例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など)、 (4)ヒド 口キシーじェ アルキル基 (例、 ヒドロキシメチル、 ヒドロキシェチルなど)、 (
5)ヒドロキシ基、 (6)力ルバモイル基、 (7)メルカプト基、 (8)式: — S (〇) a— R 21 (式中の各記号は前記と同意義)で表される基、 (9) C6_10ァリール基 (例フ ェニル、 ナフチル、 インデニル、 クロメニルなど)、 (10)チェニル基、 (11)ォキサ ゾリル基、 (12)フリル基、 (13)インドリル基、 (14)インドリジニル基、 (15)イソ インドリル基、 (16) C3_8シクロアルキル基、 (17)ォキソ基、 (18)上記(2), (3)
, (5)から(16)に記載の置換基で置換された C ^6アルキル、 (19) 上記(1)から(1
6)に記載の置換基で置換されたフエニル、 ナフチルなどの C6_10ァリール基(メ
シチル、 トリル、 キシリル、 スチレニルなど)、 (20) 上記(1)から(16)に記載の置 換基で置換されたべンジルなどの C 7—15ァラルキル基 (メチルペンジル、 メ卜シキ ベンジルなど) などがあげられる。 酸性の置換基としては、 それぞれカルボキシ ル基、 スルホ基、 テトラゾリル基等で置換された(^— 4アルキル基、 フエニル、 ナフチルなどの C 6 _ 1 ()ァリール基もしくはベンジルなどの〇7_15ァラルキル基、 力ルポキシル基などがあげられる。 塩基性の置換基としては、 (1)アミノー
6アルキル基 (アミノメチル、 アミノエチルなど)、 (2)アミノアリル基、 (3)ピリ ジル基、 (4)ピラジル基、 (5)ピラジニル基、 (6)ピリダジニル基、 (7) イミダゾ リル基、 (8)ピラゾリル基、 (9)ピラゾリル基、 (10)モルホリニル基、 (1 1)ァミノ 基、 (12)上記(3)から(10)に記載の置換基で置換された(^ _ 4アルキル基、 (13) 上記(1)から(1 1)に記載の置換基で置換されたべンジルなどの C 7_15ァラルキル基
、 (14)上記(1)から(1 1)に記載の置換基で置換されたフエニル、ナフチルなどの C
6— i。ァリール基などがあげられる。 本明細書において、 酸性アミノ酸としては、 具体的には、 たとえば、 側鎖に力ルポキシル基、 スルホ基、 テトラゾリル基のよ うな酸性基を有するアミノ酸があげられる。 その具体例としては、 グルタミン酸
、 ピログルタミン酸、 ァスパラギン酸、 システィン酸、 ホモシスティン酸、 3—
( 5—テトラゾリル) ァラニン、 2—ァミノ一 4— ( 5—テトラゾリル) 酪酸な どがあげられる。 本明細書において、 塩基性アミノ酸としては、 たとえば、 ヒス チジン、 アルギニン、 オルチニン、 リジン、 ジァミノプロピオン酸、 ジァミノ 酪酸、 ホモアルギニンなどがあげられる。 側鎖が置換された塩基性アミノ酸とし ては、 具体的には、 たとえば、 Ν α—ァセチルアルギニン、 Ν Ε—トシルアルギ ニン、 Ν Ε—ァセチルリジン、 Ν Ε—メチルリジン、 Ν Ε—トシルリジンなどがあ げられる。 本明細書において、 中性アミノ酸としては、 具体的には、 たとえば、 ァラニン、 パリン、 ノルパリン、 ロイシン、 イソロイシン、 ァロイソロイシン、 ノルロイシン、 ターシャリーロイシン、 ガンマメチルロイシン、 プロリン、 フエ ニルダリシン、 フエ二ルァラニン、 グルタミン、 ァスパラギン、 セリン、 スレオ ニン、 グリシン、 システィン、 メチォニン、 トリブトファン、 ォキシプロリン ( ヒドロキシプロリン)、 シクロへキシルァラニン、 などのアミノ酸があげられる。 側鎖が置換された中性アミノ酸としては、 具体的には、 たとえば、 ビフエニルァ
ラニンなどがあげられる。 ― 本明細書において、 芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基としては、 具 S体的に は、 たとえば、 トリブトファン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 1 _ナフチルァ ラニン、 2 一ナフチルァラニン、 2—チェ二ルァラニン、 ヒスチジン、 ピリジル ァラニン(2 _ピリジルァラニン)、 〇ーメチルチロシンなどがあげられる。 側鎖 が置換された芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基としては、 具体的には、 たと えば、 3—ョードチロシン、 P-ホスホノメチルフエ二ルァラニン、 O—ホスホチ 口シンなどがあげられる。 本明細書において、 ヒドロキシ基を側鎖に有するアミ ノ酸残基としては、 例えば、 セリン、 スレオニン、 チロシン、 ォキシプロリン ( ヒドロキシプロリン) などがあげられる。 本明細書におけるペプチドおよびぺプ チド鎖はペプチド標記の慣例に従って左端が N末端(ァミノ末端)、右端が C末端 (力ルポキシル末端) である。 本発明のペプチドおよびペプチド鎖は C末端が通 常力ルポキシル基 (- C00H) またはカルボキシレート(-C00_)であるが、 C末端が アミド (-C0NH2 ) またはエステル(-C00R)であってもよい。 エステルの Rとして は、 例えばメチル、 ェチル、 n —プロピル、 イソプロピルもしくは n —プチルな どの アルキル基、 シクロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロア ルキル基、 フエニル、 α —ナフチルなどの C 6— 1 2ァリール基、 ベンジル、 フエネ チル、 ベンズヒドリルなどのフエ二ルー C アルキル、 もしくは α—ナフチル メチルなどの α—ナフチルー C卜 2アルキルなどの C 7— 1 4ァラルキル基のほか、 本発明のペプチドが C末端以外に力ルポキシル基またはカルポキシレートを有し ている場合、 それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の ポリペプチドに含まれる。 この時のエステルとしては、 例えば上記した C末端の エステルなどが用いられる。 また、 本発明のペプチドまたはペプチド鎖には、 N 末端のアミノ酸残基のァミノ基が置換基 (例えば、 (1 ) ホルミル、 ァセチルなど の C 2— 6アルカノィル基、 グァニジノアセチル、 チェニルァクリリル、 ピリジル ァセチルなどの C ^ 8ァシル基、 (2 ) メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル
、 ブチル、 イソブチル、 sec—ブチル、 t e r t—ブチル、 ペンチル、 へキシルなどの
C i— 6アルキル基、 (3 ) フエニル、 ナフチルなど C 6— 1 0ァリール基またはベン
ジル、 フエネチルなどの C7_16ァラルキル基、 (4) トシル基、 (5) ベンジルォ キシカルポエル基、 (6) 式:— S (0) a_R22 (式中、 aは 0〜2の整数 、 R
22は ^ 6アルキル (具体例は、 上記と同様のものがあげられる) を示す) で表 される基 (例、 メチルチオ、 メタンスルフィニル、 メタンスルホニル、 ェチルチ ォ、 エタンスルフィニル、 エタンスルホニルなど)、 (7) t一ブトキシカルポ二 ル基、 (8) N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル基など) で置換されている もの、 生体内で切断されて生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口ダル夕ミン酸 化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば— OH、 一 SH、 アミ ノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 グァニジノ基など) が適当な保護基 (例 えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ^ 6アルカノィル基などの(^_6ァシル 基など) で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質 などの複合タンパク質なども含まれる。
ァペリンの修飾体 (I) は、 式 X1— Ar g— P r o— Ar g— X2— S e r—
H i s -X3-G 1 y-P r o—X4— X5で表され、 — Ar g— P r o— Ar g 一、 - S e r -H i s一および一 G 1 y-P r o—中の各アミノ酸残基の側鎖は 置換されていてもよく、 置換基としては、 上記の置換基などがあげられる。 本明 細書において、 X1は 「水素原子またはそれぞれ同一または異なって側鎖が置換 されていてもよい 1〜25個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖
」 を示す。 該 「側鎖が置換されていてもよい 1〜25個のアミノ酸」 における置 換基としては、 例えば、 上記の 「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換 基」 と同様のものなどがあげられる。 X1が 「側鎖が置換されていてもよいアミ ノ酸残基」 を示すときの好ましい例としては、 例えば、 置換されていてもよいピ 口グルタミン酸または側鎖が置換されていてもよいグルタミンなどがあげられ、 より好ましくは、 ピログルタミン酸またはグルタミンなどがあげられる。 該 「側 鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基」、 「置換されていてもよいピロダルタミ ン酸」、 「側鎖が置換されていてもよいグルタミン」 におけるアミノ酸残基の置換 基としては、 例えば、 上記の 「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基
」 と同様のものなどがあげられる。 また、 「置換されていてもよいピログルタミン 酸」 の好ましい置換基としては、 ベンジルォキシカルポニル基などがあげられる
—
。 X1が 「それぞれ同一または異なって側鎖が置換きれていてもよい 2〜2 5個 のアミノ酸からなるペプチド鎖」 を示すときの具体例としては、 例えば」式 Y1 一 Y2 (式中、 Y1はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていても.よい 1 〜1 7個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、 Y2はそれ ぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい 1〜 8個のアミノ酸からな るアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す) で表されるペプチドなどがあげられる 上記 Y1および Y2で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖中のアミノ酸残 基の側鎖の置換基としては、 例えば、 上記の 「アミノ酸残基の側鎖に置換してい てもよい置換基」 と同様のものなどがあげられる。 上記 Y1としての具体例とし ては、 例えば、 (a) 式 Ai—A2— A3— A4— A5_A6— A7— A8_A9— A10 一 A11— A12— A13— A14— A15— A16— A17 (式中、 八1〜 A 17はそれぞれ 同一または異なって側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示す)、 (b) 式
A
2 - -A
3— A
4— A
5— A
6— A
7_A
8— A
9— A
10— A
11— A
12- _
A 1 3 _
A 14 一 A 1 5 _ -A
16— A
17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す) 、 (c) 式 A
3_A
4 一 A 5 ― A
6— A
7— A
8— A
9 -
— A
14- _
A 1 5 _
A ! 6 一 A 1 7 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (d) 式 A
4 -A
5- — A
6— A
7_
A
8- -A
9一 A
10— A
11— A
12_A
13— A
14_A
15— A
16- -A
17 (式中、 各記 号は前記と同意義を示す)、 (e) 式 A
5— A
6— A
7_A
8—
— A
12_A
13— A
14— A
15— A
16_A
17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 ( f) 式 A
6— A
7— A
8— A
9—A
10—
— Α
13— A
14— A
15— A
16— A
17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (g) 式 A
7— A
8— A
9— A
1 Q— A
X 1-A
12-A
13-A
14-A
15-A
16-A
17 (式中、各記号は前記と同意義を示 す)、 (h) 式 A
8— A
9— A
1。一 A
11— A
12— A
13_A
14— A
15 - A
16— A
17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (i) 式 A
9— A
1 Q— A
11— A
12— A
1 3— A
14— A
15— A
16— A
17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (j) 式
A 1 0 _ A H _ A 12 _ A l 3 _ A 14 _ A l 5 _ A 1 6 _ A 1 7 (式中、 各記号は前記と 同意義を示す)、 (k) 式 A11— A12— A13_A14— A15— A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (1) 式 A12— A13— A14— A15— A16— A17
(式中、各記号は前記と同意義を示す)、 (m) 式 A13— A14— A15— A 6— A1
7 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (n) 式 A14— A15— A16— A¾7 (式 中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (0) 式 A15— A16— A17 (式中、 各記号 は前記と同意義を示す)、 (P) 式 A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示 す) または(Q) A17 (A17は前記と同意義を示す) で表されるアミノ酸残基また はペプチド鎖などがあげられる。
上記 A 1は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 芳香性の側鎖を有するアミノ酸残基、 より好ましくは、 芳香性の側鎖を有する L 一アミノ酸残基、 さらに好ましくは Lーチロシンなどを示す。 上記 A2および A3 はそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示 すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好まし くは、 側鎖が置換されていてもよい L一中性アミノ酸残基、 さらに好ましくは A
2としては L—ロイシンなど、 A3としては Lーバリンなどがあげられる。 上記 A
4は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置 換されていてもよい中性または塩基性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置 換されていてもよい L—中性または L一塩基性アミノ酸残基、 さらに好ましくは
L -リジンまたは N E—ァセチルリジンなどを示す。 上記 A 5は側鎖が置換されて いてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中 性アミノ酸残基、 より好ましくは、 置換されていてもよい L-プロリン、 さらに好 ましくは、 L-プロリンなどを示す。 上記 A 6および A 9はそれぞれ同一または異 なって、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖 が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置換され ていてもよい L—塩基性アミノ酸残基、 さらに好ましくは L—アルギニンなどを 示す。 上記 A7および A1Gは、 それぞれ同一または異なって側鎖が置換されてい てもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 ヒドロキシ基を側鎖に有するアミ ノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基などを示す。 A7 としては、 置換されていてもよいグリシン、 特にグリシンなどが好ましく用いら れる。 上記 A8は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましく は、 L-プロリンゃヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、 より好ましくは、
Lーセリン、 L—プロリンまたはォキシプロリン (ヒドロキシプロリン λなどを 示す。 上記 Α1 ΰとして好ましくは、 ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸 基ま たは側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好ましくはセリン、 ス レオニン、 ァスパラギンなどを示す。上記 Α 〜Α14はそれぞれ同一または異な つて、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が 置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好ましくは、 Α11としてはグリシ ン、 Α12としては L-プロリン、 Α13としてはグリシン、 Α14としては L-ァラ ニン、 L-プロリンなどがあげられる。 上記 Α15は側鎖が置換されていてもよい アミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基、 よ り好ましくは、 芳香族性の側鎖を有する L—アミノ酸残基、 さらに好ましくは L 一トリブトファンなどを示す。上記 A 16は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸 残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 よ り好ましくは、 力ルバモイル基を持つ中性 L一アミノ酸残基、 さらに好ましくは L -グルタミンを示す。力ルバモイル基を持つ中性 L—アミノ酸残基としては、例 えば L—グルタミン、 L—ァスパラギンなどがあげられる。 A 17は側鎖が置換さ れていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよ い中性アミノ酸残基、 より好ましくは、 グリシンなどを示す。
上記 Y2としての具体例としては、 例えば、 (1) 式 B1— B2— B3_B4— B 5— B6— B7— B8 (式中、 B 1〜B8はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換 されていてもよいアミノ酸残基を示す)、 (2) 式 B2— B3— B4— B5— B6— B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (3) 式 B3_B4— B5— B6 一 B7_B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (4) 式 B4— B5— B6— B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (5) 式 B5— B6— B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (6) 式 B6— B7— B8 (式中、 各記号 は上記と同意義を示す)、 (7) 式 B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示 す) または (8) 式 B8 (B8は上記と同意義を示す) で表されるアミノ酸残基 またはべプチド鎖などがあげられる。
上記 B1は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側 鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置換され
ていてもよい中性 L—アミノ酸残基、 さらに好ましくは、 置換されていてもよい グリシン、 最も好ましくは、 グリシンなどを示す。 上記 B2〜B4はそれぞれ同一 または異なって、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましく は、 側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が 置換されていてもよい塩基性 L一アミノ酸残基、 さらに好ましくは、 B2として は L一アルギニン、 B 3としては L一アルギニン、 B 4としては、 L—リジンなど を示す。 上記 B 5は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好まし くは、 芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基、 より好ましくは、 芳香族性の側鎖 を有する L—アミノ酸残基、 さらに好ましくは、 L一フエ二ルァラニンなどを示 す。 上記 B 6および B 7はそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換されていても よいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい塩基性ァ ミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ酸 残基、 さらに好ましくは、 L-アルギニンなどを示す。 上記 B8は側鎖が置換され ていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい グルタミン、 より好ましくは、 L -グルタミンなどを示す。
Y1と Y2の組み合わせとしては、 上記(a)で表される式 +上記 (1) で表され る式で表される場合 (即ち X1が、 A1— A2_A3— A4_A5— A6— A7— A8 一 A9— A10— A11— A12— A13_A14— A15— A16— A17— B1— B2— B
3— B4_B5— B6— B7— B8で表される場合:以下の組み合わせの説明におい ては省略する)、 上記(a)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合
、 上記(a)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(a)で表 される式 +上記(4) で表される式で表される場合、 上記(a)で表される式 +上記
(5) で表される式で表される場合、 上記(a)で表される式 +上記 (6) で表され る式で表される場合、 上記(a)で表される式 +上記(7) で表される式で表される 場合、 上記(a)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(b) で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される式 + 上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される式 +上記 (3) で表 される式で表される場合、 上記(b)で表される式 +上記(4) で表される式で表さ れる場合、 上記(b)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記
(b)で表される式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される 式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される式 +上言 δ (8) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記(1) で表される式で 表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(c)で表さ れる式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 ( 5) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (6) で表される 式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場 合、 上記(c)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(d)で 表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上 記 (2) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (3) で表さ れる式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記(4) で表される式で表され る場合、 上記(d)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記( d)で表される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (8) で 表される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記(1) で表される式で表 される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上 記(e)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(e)で表され る式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (5 ) で表される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (6) で表される式 で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合 、 上記(e)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表 される式 +上記(1) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表される式 +上記
(2) で表される式で表される場合、 上記(f)で表される式 +上記 (3) で表され る式で表される場合、 上記(ί)で表される式 +上記(4) で表される式で表される 場合、 上記(ί)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(f) で表される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表される式 + 上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表される式 +上記 (8) で表 される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記(1) で表される式で表さ
れる場合、 上記(g)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記
(g)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(g)で表きれる 式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記(6) で表される式で 表される場合、 上記(g)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、. 上記(g)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(h)で表さ れる式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(11)で表される式 +上記 (
2) で表される式で表される場合、 上記(li)で表される式 +上記 (3) で表される 式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上記(4) で表される式で表される場 合、 上記(li)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(li)で 表される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(li)で表される式 +上 記 (7) で表される式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上記 (8) で表さ れる式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記(1) で表される式で表され る場合、 上記(i)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記( i)で表される式 +上記(3) で表される式で表される場合、 上記(i)で表される式
+上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (5) で 表される式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (6) で表される式で表 される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上 記(i)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(j)で表され る式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記 (2
) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記 (3) で表される式 で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記(4) で表される式で表される場合
、 上記(j)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(j)で表 される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記
(7) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記 (8) で表され る式で表される場合、 上記(k)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される 場合、 上記(k)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(k) で表される式 +上記(3) で表される式で表される場合、 上記(k)で表される式 + 上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(k)で表される式 +上記 (5) で表
される式で表される場合、 上記(k)で表される式 +上記(6) で表される式で表さ れる場合、 上記(k)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場^、 上記
(k)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される 式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記(3) で表される式で 表される場合、 上記(1)で'表される式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(1)で表さ れる式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 ( 7) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (8) で表される 式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場 合、 上記(m)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(m)で 表される式 +上記(3) で表される式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上 記 (4) で表される式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上記 (5) で表さ れる式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上記 (6) で表される式で表され る場合、 上記(m)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記( m)で表される式 +上記(8) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (2) で 表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記(3) で表される式で表 される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上 記(n)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(n)で表され る式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (7 ) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (8) で表される式 で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合 、 上記(0)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(0)で表 される式 +上記(3) で表される式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記
(4) で表される式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記 (5) で表され る式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記(6) で表される式で表される 場合、 上記(0)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(0) で表される式 +上記(8) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +
上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記 (2) で表 される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記(3) で表される式^表さ れる場合、 上記(p)で表される式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記 (P)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(P)で表される 式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記 (8) で表される式で 表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表さ れる式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 ( 4) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (5) で表される 式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記(6) で表される式で表される場 合、 上記(Q)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 および上記 (Q)で表される式 +上記(8) で表される式で表される場合があげられるが、 なか でも、 上記(a)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(b) で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 + 上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (1) で表 される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記(1) で表される式で表さ れる場合、 上記 )で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記 (g)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(li)で表される 式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記(1) で表される式で 表される場合、 上記(k)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(m)で表さ れる式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(11)で表される式 +上記 ( 1) で表される式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記 (1) で表される 式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場 合、 および上記( で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合が好ま しい。
なかでも、 上記(a)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合およ
— び上記(b)で表される式 +上記( 1 )で表される式で表される場合がより好ましい 例としてあげられる。 上記(a)で表される式 +上記(1) で表される式で表 5される 場合および上記(Wで表される式 +上記( 1 )で表される式で表される場合の更に 好ましい具体例を以下に示す。 上記(b)で表される式 +上記 (1) で表される式で 表される場合とは、 X1が式 A2— A3— A4— A5— A6— A7—A8_A9— Α1Ό 一 Β6— Β7— Β8 (式中、 Α2〜Α17および Bi B8は上記と同意義を示す) で 表される場合のことをいうが、 この場合の好ましい具体例としては、 A2および
A3がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよい L一中性アミ ノ酸残基、 好ましくは A2としては L—ロイシンなど、 A3としては L—バリンな どであり、 A 4が側鎖が置換されていてもよい L一中性または L一塩基性ァミノ 酸残基、 好ましくは L—グルタミン、 L-リジンまたは Νε_ァセチルリジンな どであり、 Α5が側鎖が置換されていてもよい L-プロリン、 好ましくは、 L-プ 口リンなどであり、 Α6および Α9がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換さ れていてもよい L—塩基性アミノ酸残基、 好ましくは L—アルギニンなどであり
、 Α7が置換されていてもよいグリシン、 好ましくはグリシンなどであり、 Α8が
L -プロリンまたはヒドロキシ基を側鎖に有するァミノ酸残基、好ましくは、 L— セリン、 L一プロリンまたはォキシプロリン (ヒドロキシプロリン) などであり
、 A1 Qが、 ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換されてい てもよい中性アミノ酸残基、 好ましくは L—セリン、 L—スレオニン、 Lーァス パラギンなどであり、 A11がグリシン、 A12が L-プロリン、 A13がグリシン、
A 14が L -ァラニンまたは L -プロリンなどであり、 A 15が芳香族性の側鎖を有す る L—アミノ酸残基、 好ましくは L—トリブトファンなどであり、 A16が力ルバ モイル基を持つ中性 L一アミノ酸残基、 好ましくは L-グルタミンであり、 A17 が中性アミノ酸残基、 好ましくは、 グリシンなどであり、 B1が側鎖が置換され ていてもよい中性 L—アミノ酸残基、 好ましくは、 置換されていてもよいグリシ ン、 より好ましくは、 グリシンなどであり、 B2〜B4がそれぞれ同一または異な つて、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ酸残基、 好ましくは、 B2 としては L一アルギニン、 B3としては L一アルギニン、 B4としては、 L—リジ
ンなどであり、 B5が芳香族性の側鎖を有する L—アミノ酸残基、 好まレくは、
L一フエ二ルァラニンなどであり、 B 6および B 7がそれぞれ同一または異なつて
、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L一アミノ酸残基、 好ましくは、 L-アルギ ニンなどであり、 B8が側鎖が置換されていてもよいグルタミン、 好ましくは、
L -グルタミンなどである場合などがあげられる。
上記(a)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合とは、 X1が式
A1— A2— A3— A4— A5— A6— A7— A8— A9— A —A11— A12_A13 一 A14— A15— A16— A17— B1— B2— B3— B4— B5_B6— B7— B8 (式 中、 八ェ〜八17および B1〜: B8は上記と同意義を示す) で表される場合のことを いうが、 この場合の好ましい具体例としては、 A1が芳香性の側鎖を有する L一 アミノ酸残基、 より好ましくは Lーチロシンなどであり、 A2および A3がそれぞ れ同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよい L一中性アミノ酸残基、 好 ましくは A 2としては L—ロイシンなど、 A3としては L—バリンなどであり、 A
4が側鎖が置換されていてもよい L—中性または L—塩基性アミノ酸残基、 好ま しくは L一グルタミン、 L-ひアミノアジピン酸、 L-リジンまたは Νε—ァセチ ルリジンなどであり、 Α5が置換されていてもよい L-プロリン、 好ましくは、 L
-プロリンなどであり、 Α6および Α9がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置 換されていてもよい L一塩基性アミノ酸残基、 好ましくは L—アルギニンなどで あり、 Α7が置換されていてもよいグリシン、 好ましくはグリシンなどであり、
A 8が L -プロリンまたはヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、 好ましくは
、 L—セリン、 L_プロリンまたはォキシプロリン (ヒドロキシプロリン) など であり、 A 1 Qがヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換され ていてもよい中性アミノ酸残基、 好ましくは L—セリン、 L—スレオニン、 L一 ァスパラギンなどであり、 A11がグリシン、 A12が L-プロリン、 A13がグリシ ン、 A14が L-ァラニンまたは L-プロリンなどであり、 A15が芳香族性の側鎖を 有する L一アミノ酸残基、 好ましくは L—トリブトファンなどであり、 A16が力 ルバモイル基を持つ中性 L—アミノ酸残基、好ましくは L -グルタミンであり、 A
17が中性アミノ酸残基、 好ましくは、 グリシンなどであり、
B1が側鎖が置換されていてもよい中性 L一アミノ酸残基、 好ましくは、 置換さ
れていてもよいグリシン、 より好ましくは、 グリシンなどであり、 8 2〜;6 4がそ れぞれ同一または異なつて、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L一アミ 酸残 基、 好ましくは、 B 2としては L一アルギニン、 B 3としては L一アルギニン、 B 4としては、 L一リジンなどであり、 B 5が芳香族性の側鎖を有する L一アミノ酸 残基、 好ましくは、 L—フエ二ルァラニンなどであり、 B 6および B 7がそれぞれ 同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ酸残基、 好 ましくは、 L -アルギニンなどであり、 B 8が側鎖が置換されていてもよいグル夕 ミン、 好ましくは、 L -グルタミン L -ピログルタミン酸などである場合などがあ げられる。
X 1として、 より具体的な好ましい例として、 (1) 水素原子、 (2) Leu-Val-Gln -Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Phe -Arg- Arg- Gln、 (3) pGlu、 (4) Leu-Val-Adi (NH2) -Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly -Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-P e-Arg-Arg-Gln 、 (5) Leu-Val-L ys (Ac) -Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro-Gly-Ala-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-L ys-Phe-Arg-Arg-Gln 、 (6) Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro - Gly- Ala - Trp- Gln-Gly - Gly- Arg- Arg- Lys-Phe- Arg- Arg - Gin 、 および(7) Z-pGlu などがあげられる。
本明細書において、 X 2は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示 すが、 好ましくは側鎖が置換されていてもよい L一口イシン、 側鎖が置換されて いてもよい L一ノルロイシン、 より好ましくは、 L一口イシンまたは L—ノル口 イシンなどがあげられる。
本明細書において、 X 3は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基また は側鎖が置換されていてもよい塩基性ァミノ酸残基を示す。 塩基性アミノ酸残基 の側鎖への置換基としては、 例えば 0^ - 4ァシル基、 トシル基、 (^ _ 6アルキル 基などがあげられる。 — 4ァシル基としては、 例えばホルミル、 ァセチル、 プ 口ピオニル、 プチリルなどのホルミルおよび C 2 _ 4アルカノィルなどがあげられ る。 C i _ 6アルキル基としては、 例えばメチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピ ル、 ブチル、 イソブチル、 sec—プチル、 tert—ブチル、 ペンチル、 へキシルなど があげられる。 X 3として好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい L—リジン
、 側鎖が置換されていてもよい L一ノルロイシン、 または側鎖が置換されていて もよい L—アルギニンなどがあげられ、 より好ましくは、 側鎖が アレル基 (例、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリルなどのホルミルおよび C 2 _ 4アルカノィルなど)、 (^— 6アルキル基 (例、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソ プロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 ペンチル、 へキシ ルなど) またはトシル基で置換されていてもよい L一リジン、 L—ノルロイシン または L—アルギニンなどがあげられ、 さらに好ましくは、 L一リジン、 Lーノ ルロイシン、 L—アルギニン、 Ν ε—ァセチルリジン、 Ν Ε—メチルリジン、 Ν ε -トシルリジン、 Ν ε -トシルアルギニンなどがあげられる。
本明細書において、 X 4は結合手または側鎖が置換されていてもよい中性また は芳香性アミノ酸残基を示す。 X 4として好ましくは、 結合手、 側鎖が置換され ていてもよい L一ノルロイシン、 側鎖が置換されていてもよい Lーメチォニン、 側鎖が置換されていてもよい L _メチォニンスルフォキシドまたは側鎖が置換さ れていてもよい L—ァラニンなどがあげられ、 より好ましくは結合手、 L一ノル ロイシンまたは L一メチォニン、 L一メチォニンスルフォキシド、 L—シクロへ キシルァラ二ンなどがあげられる。
本明細書において、 X 5は (1 ) 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基ま たはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元さ れたアミノ酸誘導体、 (2 ) 水酸基または (3 ) 側鎖が置換されていてもよいアミ ノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基が結合してなるジペプチド 鎖またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に 還元されたペプチド誘導体を示す。 X 5として好ましくは、 (1 ) 側鎖が置換され ていてもよい中性アミノ酸残基またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシメ チル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (2 ) 水酸基または (3 ) 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよい芳 香族性の側鎖を有するアミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖またはその C末 端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたぺプチ ド誘導体などがあげられる。 X 5としてさらに好ましくは、 (1 ) 側鎖が置換され ていてもよい L一プロリンまたはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメチル
基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (2 )側鎖が置換されていても よい 4一クロ口フエ二ルァラニンまたはその C末端力ルポキシル基がヒド tiキシ メチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (3 )側鎖が置換されて いてもよい 2—ナフチルァラニンまたはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシ メチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (4 )側鎖が置換されて いてもよいシクロへキシルァラニンまたはその C末端力ルポキシル基がヒドロキ シメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (5 )水酸基または (
6 )置換されていてもよい L一プロリンと(a)側鎖が置換されていてもよい Lーフ ェニルァラニン、 (b)側鎖が置換されていてもよい Lーチロシン、 (c)側鎖が置換 されていてもよい L— 2—チェ二ルァラニン、 (d) 側鎖が置換されていてもよい
L—フエニルダリシンもしくは(e)側鎖が置換されていてもよい L— 2—ピリジ ルァラニンが結合してなるジペプチド鎖、 またはその C末端カルポキシル基がヒ ドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体などがあげら れる。 X 5としてさらに好ましくは、 (1) L一プロリンまたはその C末端カルボキ シル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (2
) 4—クロ口フエ二ルァラニンまたはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメ チル基またばホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、(3) 2—ナフチルァラニン またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元 されたアミノ酸誘導体、(4)シクロへキシルァラニンまたはその C末端カルポキシ ル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (5) 水酸基、(6) L—プロリンと L—フエ二ルァラニンが結合してなるジペプチド鎖ま たはその C末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元 されたペプチド誘導体、(7) L—プロリンと L—チロシンが結合してなるジぺプチ ド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基 に還元されたペプチド誘導体、(8) L—プロリンと L一 2—チェ二ルァラニンが結 合してなるジペプチド鎖またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシルメチル 基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(9) L一プロリンと L一フエ二 ルグリシンが結合してなるジぺプチド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒド 口キシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、 (10) L—プロ
リンと 4一クロ口フエ二ルァラニンが結合してなるジペプチド鎖またはその C末 端カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元された ;ぺプチ ド誘導体、 (11) L一プロリンと 2—ナフチルァラニンが結合してなるジペプチド 鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に 還元されたべプチド誘導体、 (12) L—プロリンと 3—ョ一ドチロシンが結合して なるジぺプチド鎖またはその C末端カルポキシル基がヒドロキシルメチル基また はホルミル基に還元されたべプチド誘導体、 (13) L—プロリンと O—メチルチ口 シンが結合してなるジぺプチド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシ ルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、 または(14) L一プロ リンと L— 2—ピリジルァラニンが結合してなるジペプチド鎖またはその C末端 カルボキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド 誘導体などがあげられる。
「― X 4— X 5」 として、 特に好ましくは、 (1) -Nle-Pro-Phe, (2) -Nle-Pro-T yr、 (3) -Nle-Pro, (4) - Nle、 (5) -Met-Pro-P e, (6) -Nle-Pro-Thi, (7) -Nle
-Pro- Phg、 (8) - Nle- Pro_Pya (2)、 (9) -Met (0) , (10) -Met-Phe (CI) , (11) -Met
- Pro- Phe (Cl)、 (12) - Me t- Pro- Nal (2)、 (13) -Met- Nal (2)、 (14) -Me t-Cha, (15
) - Cha- Pro- Phe、 (16) - Cha、 (17) -Met - Pro - Tyr (I)、 および(18) -Met-Pro-Tyr
(Me)などがあげられる。
ァペリンの修飾体 (I ) の具体例としては、 例えば、 (1) Leu-Val-Gln-Pro-Ar g-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Arg-Arg-Lys-Plie-Arg-Ar g- Gin- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- His- Lys_Gly- Pro- Nle- Pro- Phe (配列番号 1 3 )、 (
2) Leu-Val-Gln-Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-A rg - Arg- Lys - Phe - Arg - Arg - Gin - Arg_Pro - Arg - Leu - Ser - Hi s - Lys-Gly - Pro- Nle - Pro- T yr (配列番号 1 4 )、 (3) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nle- Pro
-Phe (配列番号 1 5 )、 (4) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys-Gly-Pro-Nle-P ro-Tyr (配列番号 1 6 )、 (5) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle
-Pro (配列番号 1 7 )、 (6) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- Hi s- Lys- Gly- Pro- Nle
(配列番号 1 8 )、 (7) Ac- Arg- Pro- Arg- Leu_Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nl e- Pro- Tyr
(配列番号 1 9 )、 (8) Ac- Arg- Pro- Arg- Leu_Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nl e- Pro (配
列番号 2 0 )、 (9) Ac- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nle (配列番号 2 1 )、 (10) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu-Ser- His- Lys (Ac) -Gly- Pro- Me t- Pro- Phe 1 (配列 番号 2 2 )、 (11) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys (Me) -Gly-Pro-Me t-Pro-Phe (配列番号 2 3 )、 (12) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu-Ser- Hi s- Lys (Ac) - Gly- Pro- Nle- P ro-Phe (配列番号 2 4 )、 (13) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- Hi s- Lys (Me) -Gly - Pr o-Nle-Pro-Phe (配列番号 2 5 )、 (14) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys (Tos ) -Gly-Pro-Nle-Pro-Phe (配列番号 2 6 )、 (15) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His - Arg (Tos) -Gly- Pro- Nle- Pro- Phe (配列番号 2 7 )、 (16) pGlu-Arg-Pro-Arg-Nle - Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nle- Pro-Phe (配列番号 2 8 )、 (17) pGlu- Arg- Pro- Arg - Nle- Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nle- Pro- Tyr (配列番号 2 9 )、 (18) pGlu-Arg-Pro-A rg-Leu- Ser- Hi s- Lys- Gly- Pro- Nle- Pro- Thi (配列番号 3 0 )、 (19) pGlu-Arg-Pr o-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phg (配列番号 3 1 )、 (20) pGlu-Arg - Pro- Arg- Leu- Ser-His- Lys- Gly - Pro- Nle- Pro - Pya (2) (配列番号 3 2 )、 (21) Ar g- Pro - Arg - Leu_Ser_His- Lys- Gly- Pro - Nle - Pro - Tyr (配列番号 3 3 )、 (22) Leu - Val-Adi (NH2) -Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Asn-Gly-Pro-Gly-Pro-Trp-Gln-Gly-Gly-Ar g - Arg - Lys - Phe - Arg - Arg - Gin - Arg- Pro - ArgHLeu - Ser - Hi s- Lys - Gly - Pro - Nle - Pro - Ph e (配列番号 3 4 )、 (23) Leu-Val-Lys (Ac) -Pro-Arg-Thr-Ser-Arg-Thr-Gly-Pro- Gly- Ala- Trp- Gin- Gly- Gly- Arg- Arg- Lys- Phe- Arg- Arg- Gin- Arg- Pro_Arg- Leu- Ser- His- Lys- Gly- Pro- Nle- Pro- Tyr (配列番号 3 5 )、 (24) Tyr-Leu-Val-Lys-Pro-Ar g - Thr- Ser- Arg- Thr-Gly- Pro- Gly-Ala- Trp- Gin- Gly- Gly- Arg- Arg- Lys- Phe- Arg- Ar g-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Phe (配列番号 3 6 )、 ( 25) Z-pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- His- Lys (Ac) - Gly- Pro- Nle-Pro- Phe (配列番号 3 7 )、 (26) Arg - Arg- Gin - Arg - Pro- Arg - Leu- Ser - His- Lys- Gly - Pro - Me t (0) (配列 番号 3 8 )、 (27) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro- Tyr (配列番号 3 9 )、 (28) pGlu- Arg- Pro-Arg- Leu- Ser- Hi s- Lys- Gly- Pro- Me t - P he (CI) (配列番号 4 0 )、 (29) pGlu-Arg-Pro-Arg- Leu- Ser- His- Lys- Gly - Pro - Me t-Pro-Phe (CI) (配列番号 4 1 )、 (30) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro- Me t-Pro-Nal (2) (配列番号 4 2 )、 (31) Arg - Pro-Arg - Leu- Ser- His- Lys- Gly- Pro
-Me t-Nal (2) (配列番号 4 3 )、 (32) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys-Gly-Pro-Me
t-Pro-Phe (CI) (配列番号 44)、 (33) Arg- Pro- Arg - Leu-Ser- His- Lys - Gly- Pro - Met-Phe (CI) (配列番号 45)、 (34) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Me t-Cha (配列番号 46)、 (35) p Glu-Arg - Pro - Arg- Leu_Ser- His - Lys - Gly - Pro- Ch a-Pro-Phe (配列番号 47)、 (36) Arg- Arg-Gln-Arg- Pro- Arg- Leu - Ser - His-Lys- Gly-Pro-Cha (配列番号 48)、 (37) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Ly s-Gly-Pro-Met-Pro-Phe (CI) (配列番号 49)、 (38) Arg- Arg- Gin- Arg- Pro - Arg- Leu_Ser- His-Nle- Gly- Pro- Met - Pro - Phe(Cl) (配列番号 50)、 (39) Arg- Arg - Gl n - Arg- Pro- Arg_Leu- Ser- His- Nle_Gly- Pro- Met- Pro- Tyr(I) (配列番号 5 1)、 お よび(40) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Nle-Gly-Pro-Met-Pro-Tyr (Me) (配列番号 52) などがあげられる。
ァペリンの修飾体 (II) は、 式 P i— A r g— P r o—A r g— L e u— P h e _P2— P3— G l y— P r o— P4— P5で、 ァペリンの修飾体 (III) は、 式
Q1— Ar g— P r o— Ar g— L e u— S e r -A 1 a— Q2— G l y— Q5—
Q3_Q4で、 ァペリンの修飾体 (IV) は、 式 R1— A r g— P r o—A r g_L e u - S e r -H i s— Ly s— G l y— P r o— R2— P r o— R3で表され、 式中の各アミノ酸残基 (の側鎖) は置換されていてもよく、 置換基としては、 上 記の置換基などがあげられる。 本願明細書において、 P1 (^ュぉょび ま 「水 素原子またはそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい 1〜25 個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖」 を示す。 該 「側鎖が置換 されていてもよい 1〜25個のアミノ酸」 における置換基としては、 例えば、 上 記の 「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」 と同様のものなどがあ げられる。 P 。ェぉょび ェが 「側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基」 を示すときの好ましい例としては、 例えば、 置換されていてもよいピロダルタミ ン酸または側鎖が置換されていてもよいグルタミンなどがあげられ、 より好まし くは、 ピログルタミン酸またはグルタミンなどがあげられる。 該 「側鎖が置換さ れていてもよいアミノ酸残基」、 「置換されていてもよいピログルタミン酸」、 「側 鎖が置換されていてもよいグルタミン」 におけるアミノ酸残基の置換基としては
、 例えば、 上記の 「アミノ酸残基の側鎖に置換していてもよい置換基」 と同様の ものなどがあげられる。 また、 「置換されていてもよいピログルタミン酸」 の好ま
しい置換基としては、 ベンジルォキシカルボニル基などがあげられる。 Pノ、 Q1 および R1が 「それぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい 〜 2
5個のアミノ酸からなるペプチド鎖」 を示すときの具体例としては、 例えば、 式 Y1— Y2 (式中、 Y1はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよ い 1〜1 7個のアミノ酸からなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示し、 Y2は それぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい 1〜 8個のアミノ酸か らなるアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す) で表されるペプチドなどがあげら れる。上記 Y1および Y2で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖中のアミノ酸 残基の側鎖の置換基としては、 例えば、 上記の 「アミノ酸残基の側鎖に置換して いてもよい置換基」 と同様のものなどがあげられる。
上記 Y1としての具体例としては、 例えば、 (a) 式 A1— A2— A3— A4— A5 一 A6— A7_A8— A9— A10— A11— A12— A13_A14_A15— A16— A1 7 (式中、 A1〜 17はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換されていてもよい アミノ酸残基を示す)、 (b) 式 A2— A3— A4— A5— A6— A7— A8— A 9—A1 0— A11— A12— A13— A14-— A15— A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意 義を示す)、 (c) 式 A3— A4— A5_A6—A7— A8_A9— A^— A11— A12 _A13— A14— A15— A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (d) 式 A4— A5— A6_A7 - A8_A9 - A10— A11— A12 - A13 - A14— A15 -A16-A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (e) 式 A5— A6— A7— A8_A9— A10— A11— A12_A13— A14— A15— A16_A17 (式中、 各記 号は前記と同意義を示す)、 (f) 式 A6— A7— A8— A9_A1 Q— A11— A12_
A 1 3 _ A 14 _A 1 5 _ A 16 _ A 1 7 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (g) 式 A7— A8— A9— A1。一 AH_A12—A13— A14— A15— A16— A17 (式 中、各記号は前記と同意義を示す)、 (h) 式 A8— A9— A1 Q— A11— A12— A1 3— A14— A15— A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (i) 式
A 9 _ A 10 _ A 1 1 _ A X 2 _A 13 _ A 14 _ A 15 _ A 16 _ A 1 7 (式中、 各記号は前 記と同意義を示す)、 (j) 式 A10— A11— A12— A13— A14— A15_A16— A 17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (k) 式 A11— A12— A13— A14— A i 5 _ A i 6 _ A i 7 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (1) 式 A12— A13
一 A14— A15— A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (m) .式 A1 3— A14— A15— A16— A17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (ή) 式
Α 14 _ Α 1 5 _Α 1 6 _ Α 17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (0) 式, Α15 一 Α16— Α17 (式中、 各記号は前記と同意義を示す)、 (Ρ) 式 Α16— Α17 (式 中、 各記号は前記と同意義を示す) または(Q) A17 (Α17は前記と同意義を示す
) で表されるアミノ酸残基またはペプチド鎖などがあげられる。
上記 A 1は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 芳香性の側鎖を有するアミノ酸残基、 より好ましくは、 芳香性の側鎖を有する L 一アミノ酸残基、 さらに好ましくは L—チロシンなどを示す。 上記 A2および A3 はそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示 すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好まし くは、 側鎖が置換されていてもよい L一中性アミノ酸残基、 さらに好ましくは A
2としては L—ロイシンなど、 A3としては L—パリンなどがあげられる。 上記 A
4は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置 換されていてもよい中性または塩基性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置 換されていてもよい L一中性または L—塩基性アミノ酸残基、 さらに好ましくは
L -リジンまたは Νε—ァセチルリジンなどを示す。 上記 Α5は側鎖が置換されて いてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中 性アミノ酸残基、 より好ましくは、 置換されていてもよい L-プロリン、 さらに好 ましくは、 L-プロリンなどを示す。 上記 Α6および Α9はそれぞれ同一または異 なって、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖 が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置換され ていてもよい L一塩基性アミノ酸残基、 さらに好ましくは L一アルギニンなどを 示す。 上記 Α7および A1 Qは、 それぞれ同一または異なって側鎖が置換されてい てもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 ヒドロキシ基を側鎖に有するアミ ノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基などを示す。 A7 としては、 置換されていてもよいグリシン、 特にグリシンなどが好ましく用いら れる。 上記 A8は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましく は、 L-プロリンゃヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、 より好ましくは、
Lーセリン、 L—プロリンまたはォキシプロリン (ヒドロキシプロリン). などを 示す。 上記 A1Qとして好ましくは、 ヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸 基ま たは側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好ましくはセリン、 ス レオニン、 ァスパラギンなどを示す。上記 A^〜A14はそれぞれ同一または異な つて、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が 置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好ましくは、 A11としてはグリシ ン、 A12としては L-プロリン、 A13としてはグリシン、 A14としては L-ァラ ニン、 L -プロリンなどがあげられる。 上記 A15は側鎖が置換されていてもよい アミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基、 よ り好ましくは、 芳香族性の側鎖を有する L一アミノ酸残基、 さらに好ましくは L 一トリブトファンなどを示す。上記 A 16は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸 残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 よ り好ましくは、 力ルバモイル基を持つ中性 L_アミノ酸残基、 さらに好ましくは L -グルタミンを示す。力ルバモイル基を持つ中性 L一アミノ酸残基としては、例 えば L一グルタミン、 Lーァスパラギンなどがあげられる。 A17は側鎖が置換さ れていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよ い中性アミノ酸残基、 より好ましくは、 グリシンなどを示す。
上記 Y2としての具体例としては、 例えば、 (1) 式 Bi— B2— B3— B4— B 5— B6— B7— B8 (式中、 Bi B8はそれぞれ同一または異なって側鎖が置換 されていてもよいアミノ酸残基を示す)、 (2) 式 B2— B3_B4— B5_B6_ B7-B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (3) 式 B3— B4— B5_B6 一 B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (4) 式 B4— B5— B6— B7-B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (5) 式 B5_B6— B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示す)、 (6) 式 B6— B7— B8 (式中、 各記号 は上記と同意義を示す)、 (7) 式 B7— B8 (式中、 各記号は上記と同意義を示 す) または (8) 式 B8 (B8は上記と同意義を示す) で表されるアミノ酸残基 またはべプチド鎖などがあげられる。
上記 B 1は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置換さ
れていてもよい中性 L一アミノ酸残基、 さらに好ましくは、 置換されて てもよ いグリシン、 最も好ましくは、 グリシンなどを示す。 上記 B2〜B4はそれぞれ同 一または異なって、 側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好まし くは、 側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖 が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ酸残基、 さらに好ましくは、 B2とし ては L—アルギニン、 B3としては L一アルギニン、 B4としては、 L—リジンな どを示す。 上記 B 5は側鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ま しくは、 芳香族性の側鎖を有するアミノ酸残基、 より好ましくは、 芳香族性の側 鎖を有する L—アミノ酸残基、 さらに好ましくは、 L—フエ二ルァラニンなどを 示す。 上記 B 6および B 7はそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換されていて もよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 アミノ酸残基、 より好ましくは、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ 酸残基、 さらに好ましくは、 L-アルギニンなどを示す。 上記 B 8は側鎖が置換さ れていてもよいアミノ酸残基を示すが、 好ましくは、 側鎖が置換されていてもよ いグルタミン、 より好ましくほ、 L-グルタミンなどを示す。
Y1と Y2の組み合わせとしては、 上記(a)で表される式 +上記 (1) で表され る式で表される場合 (即ち X1が、 A1— A2— A3— A4_A5_A6—A7— A8
_ A 9 _ A 1 0 _ A 1 1 _ A 1 2 _ A 1 3 _ A 14 _ A 1 5 _ A 1 6 _ A 1 7 _ B 1 _ B 2 _ B
3— B4_B5— B6_B7_ B 8で表される場合:以下の組み合わせの説明におい ては省略する)、 上記(a)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合
、 上記(a)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(a)で表 される式 +上記(4) で表される式で表される場合、 上記(a)で表される式 +上記
(5) で表される式で表される場合、 上記(a)で表される式 +上記 (6) で表され る式で表される場合、 上記(a)で表される式 +上記(7) で表される式で表される 場合、 上記(a)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(b) で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される式 + 上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される式 +上記 (3) で表 される式で表される場合、 上記(b)で表される式 +上記(4) で表される式で表さ れる場合、 上記(b)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記
(b)で表される式+上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される 式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(b)で表される式 +上言 δ (8) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記(1) で表される で 表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (2) で表される式で表.される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(c)で表さ れる式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 ( 5) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記 (6) で表される 式で表される場合、 上記(c)で表される式 +上記(7) で表される式で表される場 合、 上記(c)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(d)で 表される式 +上記(1) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上 記 (2) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (3) で表さ れる式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記(4) で表される式で表され る場合、 上記(d)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記( d)で表される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (8) で 表される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記(1) で表される式で表 される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上 記(e)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(e)で表され る式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (5 ) で表される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記 (6) で表される式 で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記(7) で表される式で表される場合 、 上記(e)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記 )で表 される式 +上記(1) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表される式 +上記
(2) で表される式で表される場合、 上記(f)で表される式 +上記 (3) で表され る式で表される場合、 上記 )で表される式 +上記(4) で表される式で表される 場合、 上記(ί)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(f) で表される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表される式 + 上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(ί)で表される式 +上記 (8) で表 される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記(1) で表される式で表さ
れる場合、 上記(g)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記
(g)で表される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(g)で表される 式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記(6) で表される式で 表される場合、 上記(g)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(g)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(h)で表さ れる式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上記 (
2) で表される式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上記 (3) で表される 式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上記(4) で表される式で表される場 合、 上記(h)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(h)で 表される式 +上記(6) で表される式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上 記 (7) で表される式で表される場合、 上記(h)で表される式 +上記 (8) で表さ れる式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記(1) で表される式で表され る場合、 上記(i)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記( i)で表される式 +上記(3) で表される式で表される場合、 上記(i)で表される式
+上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (5) で 表される式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記(6) で表される式で表 される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上 記(i)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(j)で表され る式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記 (2
) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記 (3) で表される式 で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記(4) で表される式で表される場合
、 上記(j)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(j)で表 される式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記
(7) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記 (8) で表され る式で表される場合、 上記(k)で表される式 +上記(1) で表される式で表される 場合、 上記(k)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(k) で表される式 +上記(3) で表される式で表される場合、 上記(k)で表される式 + 上記 (4) で表される式で表される場合、 上記 (k)で表される式 +上記 (5) で表
される式で表される場合、 上記(k)で表される式 +上記(6) で表される式で表さ れる場合、 上記(k)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合 上記
(k)で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される 式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記(3) で表される式で 表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(1)で表さ れる式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 ( 7) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (8) で表される 式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場 合、 上記(m)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(m)で 表される式 +上記(3)で表される式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上 記 (4) で表される式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上記 (5) で表さ れる式で表される場合、 上記(m)で表される式 +上記(6) で表される式で表され る場合、 上記(m)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記( m)で表される式 +上記(8) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (2) で 表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記(3) で表される式で表 される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上 記(n)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(n)で表され る式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (7 ) で表される式で表される場合、 上記(II)で表される式 +上記 (8) で表される式 で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合 、 上記(0)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記(0)で表 される式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記
(4) で表される式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記 (5) で表され る式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記(6) で表される式で表される 場合、 上記(0)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(0) で表される式 +上記 (8) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +
上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記 (?) で表 される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記(3) で表される式^表さ れる場合、 上記(p)で表される式 +上記 (4) で表される式で表される場合、 上記
(P)で表される式 +上記 (5) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される 式 +上記 (6) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記 (8) で表される式で 表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (2) で表される式で表される場合、 上記( で表さ れる式 +上記 (3) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (
4) で表される式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記 (5) で表される 式で表される場合、 上記(Q)で表される式 +上記(6) で表される式で表される場 合、 上記(Q)で表される式 +上記 (7) で表される式で表される場合、 および上記
(Q)で表される式 +上記(8) で表される式で表される場合があげられるが、 なか でも、 上記(a)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(b) で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合、 上記(c)で表される式 + 上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(d)で表される式 +上記 (1) で表 される式で表される場合、 上記(e)で表される式 +上記(1) で表される式で表さ れる場合、 上記(f)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記
(g)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記 0ι)で表される 式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(i)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(j)で表される式 +上記(1) で表される式で 表される場合、 上記(k)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(1)で表される式 +上記 (1 ) で表される式で表される場合、 上記 (m)で表さ れる式 +上記 (1) で表される式で表される場合、 上記(n)で表される式 +上記 (
1) で表される式で表される場合、 上記(0)で表される式 +上記 (1) で表される 式で表される場合、 上記(p)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場 合、 および上記(Q)で表される式 +上記(1) で表される式で表される場合が好ま しい。 なかでも、 上記(a)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合 および上記(b)で表される式 +上記( 1 )で表される式で表される場合がより好ま
しい例としてあげられる。 上記(a)で表される式 +上記 (1) で表される式で表さ れる場合および上記(b)で表される式 +上記( 1 )で表される式で表される場合の 更に好ましい具体例を以下に示す。 上記(b)で表される式 +上記 (1) で表される 式で表される場合とは、 P1 Q1および/または R1が
式 A2— A3— A4— A5— A6— A7— A8_A9_A10— A11— A12— A13—
A 14 _ A 15 _ A 16 _ A 1 7 _ B 1 _ B 2 _ B 3 _ B 4 _ B 5 _ B 6 _ B 7 _ B 8 (式中 、 A2~A17および Bi B8は上記と同意義を示す) で表される場合のことをい うが、 この場合の好ましい具体例としては、 A2および A3がそれぞれ同一または 異なって、 側鎖が置換されていてもよい L一中性アミノ酸残基、 好ましくは A2 としては L一口イシンなど、 A3としては Lーバリンなどであり、 A4が側鎖が置 換されていてもよい L一中性または L一塩基性アミノ酸残基、 好ましくは L—グ ルタミン、 L -リジンまたは NE—ァセチルリジンなどであり、 A 5が側鎖が置換 されていてもよい L-プロリン、 好ましくは、 L-プロリンなどであり、 A6およ び A9がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよい L—塩基性 アミノ酸残基、 好ましくは L一アルギニンなどであり、 A7が置換されていても よいグリシン、 好ましくはグリシンなどであり、 A8が L-プロリンまたはヒドロ キシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、 好ましくは、 L—セリン、 L—プロリンま たはォキシプロリン (ヒドロキシプロリン) などであり、 A1 Qが、 ヒドロキシ基 を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残 基、 好ましくは Lーセリン、 L—スレオニン、 L—ァスパラギンなどであり、 A
11がグリシン、 A12が L-プロリン、 A13がグリシン、 A14が L-ァラニンまた は L-プロリンなどであり、 A 15が芳香族性の側鎖を有する L一アミノ酸残基、 好ましくは L一トリブトファンなどであり、 A 16が力ルバモイル基を持つ中性 L 一アミノ酸残基、 好ましくは L -グルタミンであり、 A17が中性アミノ酸残基、 好ましくは、 グリシンなどであり、 B1が側鎖が置換されていてもよい中性 L_ アミノ酸残基、 好ましくは、 置換されていてもよいグリシン、 より好ましくは、 グリシンなどであり、 B 2〜: B 4がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換され ていてもよい塩基性 L一アミノ酸残基、 好ましくは、 B2としては L一アルギニ ン、 B 3としては L一アルギニン、 B4としては、 L一リジンなどであり、 B5が
芳香族性の側鎖を有する L一アミノ酸残基、 好ましくは、 L一フエ二ルァラニン などであり、 B6および B7がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置換さ ^れてい てもよい塩基性 L—アミノ酸残基、 好ましくは、 L-アルギニンなどであり、 B8 が側鎖が置換されていてもよいダル夕ミン、好ましくは、 L -ダル夕ミンなどであ る場合などがあげられる。
上記(a)で表される式 +上記 (1) で表される式で表される場合とは、 X1が式
Ai—AS—A3— A4— A5— A6— A7— A8_A9 - A10— A _A12— A13
— A
14— A —
— B
1— B
2— B
3— B
4 - B
5— B
6— B
7— B
8 (式 中、 八ェ〜八
17および B i B
8は上記と同意義を示す) で表される場合のことを いうが、 この場合の好ましい具体例としては、 A
1が芳香性の側鎖を有する L一 アミノ酸残基、 より好ましくは Lーチロシンなどであり、 A
2および A
3がそれぞ れ同一または異なって、 側鎖が置換されていてもよい L一中性アミノ酸残基、 好 ましくは A
2としては L一口イシンなど、 A
3としては L—バリンなどであり、 A
4が側鎖が置換されていてもよい L一中性または L一塩基性アミノ酸残基、 好ま しくは L—グルタミン、 L-ひアミノアジピン酸、 L-リジンまたは Νε_ァセチ ルリジンなどであり、 Α5が置換されていてもよい L-プロリン、 好ましくは、 L
-プロリンなどであり、 Α6および Α9がそれぞれ同一または異なって、 側鎖が置 換されていてもよい L—塩基性アミノ酸残基、 好ましくは L—アルギニンなどで あり、 Α7が置換されていてもよいグリシン、 好ましくはグリシンなどであり、
A 8が L -プロリンまたはヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基、 好ましくは
、 Lーセリン、 L一プロリンまたはォキシプロリン (ヒドロキシプロリン) など であり、 A 1 Qがヒドロキシ基を側鎖に有するアミノ酸残基または側鎖が置換され ていてもよい中性アミノ酸残基、 好ましくは L—セリン、 L—スレオニン、 L— ァスパラギンなどであり、 A11がグリシン、 A12が L-プロリン、 A13がグリシ ン、 A 14が L-ァラニンまたは L-プロリンなどであり、 A 15が芳香族性の側鎖を 有する L一アミノ酸残基、 好ましくは L—トリブトファンなどであり、 A16が力 ルバモイル基を持つ中性 Lーァミノ酸残基、好ましくは L -ダル夕ミンであり、 A
17が中性アミノ酸残基、 好ましくは、 グリシンなどである、 B1が側鎖が置換さ れていてもよい中性 L—アミノ酸残基、 好ましくは、 置換されていてもよいダリ
シン、 より好ましくは、 グリシンなどであり、 B2〜B4がそれぞれ同一または異 なって、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ酸残基、 好ましくほ、 B
2としては L一アルギニン、 B3としては L一アルギニン、 B4としては、 L—リ ジンなどであり、 B5が芳香族性の側鎖を有する L_アミノ酸残基、 好ましくは
、 L一フエ二ルァラニンなどであり、 B6および B7がそれぞれ同一または異なつ て、 側鎖が置換されていてもよい塩基性 L—アミノ酸残基、 好ましくは、 L-アル ギニンなどであり、 B 8が側鎖が置換されていてもよいグルタミン、 好ましくは
、 L-グルタミン L-ピログルタミン酸などである場合などがあげられる。
P Q1および R1として、 好ましい具体例としては、 (1)水素原子、 (2〉Arg -
Gin, (3) Arg, (4) Gin, (5)pGlu、 または(6) Arg- Arg- Ginなどがあげられる。 さら に、 P1としては、 水素原子、 p G 1 uまたは Arg- Arg- Ginがより好ましく、 Q1 としては、 水素原子、 pG 1 uまたは Arg- Arg- Ginがより好ましく、 R1としては
、 水素原子、 pGluまたは Arg- Arg- Gin (さらには水素原子または Arg- Arg- Gin) が より好ましい。 本明細書において、 P 2は側鎖が置換されていてもよい中性アミ ノ酸残基または側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示すが、 好ま しくは (側鎖が) 置換されていてもよい L—ァラニン、 (側鎖が) 置換されていて もよい L一ヒスチジンなどがあげられる。 本明細書において、 P 3および Q2は側 鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基、 側鎖が置換されていてもよい芳香 性アミノ酸残基、 または側鎖が置換されていてもよい塩基性アミノ酸残基を示す
。 塩基性アミノ酸残基の側鎖への置換基としては、 例えば ァシル基、 トシ ル基、 Ci— eアルキル基などがあげられる。 ァシル基としては、 例えばホ ルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリルなどのおよび C2_4アルカノィルな どがあげられる。 (^ - 6アルキル基としては、 例えばメチル、 ェチル、 プロピル
、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 ペンチル、 へキシルなどがあげられる。 P3および Q2として好ましくは、 側鎖が置換されて いてもよい L一リジン、 側鎖が置換されていてもよい L—ノルロイシン、 または 側鎖が置換されていてもよい L一アルギニンなどがあげられ、 より好ましくは、 側鎖が ^— 4ァシル基 (例、 ホルミル、 ァセチル、 プロピオニル、 プチリルなど のおよび C2_4アルカノィルなど)、 (:卜6アルキル基 (例、 メチル、 ェチル、 プ
口ピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 sec—ブチル、 tert—プチル、 ペン チル、 へキシルなど) またはトシル基で置換されていてもよい L一リジン ·! L- ノルロイシンまたは L—アルギニンなどがあげられ、 さらに好ましくは、 Lーリ ジン、 L—ノルロイシン、 L—アルギニン、 NE—ァセチルリジン、 Νε—メチル リジン、 ΝΕ—トシルリジン、 Ντ—トシルアルギニンなどがあげられる。 さら に、 Ρ3および Q2としては、 置換されていてもよい L一アルギニンまたは置換さ れていてもよい L一リジンが好ましい。 本明細書において、 Ρ4および Q3は結合 手または側鎖が置換されていてもよい中性または側鎖が置換されていてもよい芳 香性アミノ酸残基を示す。 Ρ4および Q3として好ましくは、 結合手、 側鎖が置 換されていてもよい L一ノルロイシン、 側鎖が置換されていてもよい L _メチォ ニン、 側鎖が置換されていてもよい L _メチォニンスルフォキシドまたは側鎖が 置換されていてもよい Lーァラニンなどがあげられ、 より好ましくは結合手、 L
—ノルロイシン、 L—メチォニン、 L_メチォニンスルフォキシドまたは L—シ クロへキシルァラニンなどがあげられる。 さらに、 P4としては、 L—ノルロイ シン、 L—メチォニンまたは L—シクロへキシルァラニンなどが特に好ましい。 また、 Q3としては、 結合手、 L—メチォニンまたは L—シクロへキシルァラニ ンなどが特に好ましい。 本明細書において、 P5および Q4は (1) 側鎖が置換さ れていてもよいアミノ酸残基またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメチ ル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (2)水酸基または (3)側 鎖が置換されていてもよいアミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよいアミノ酸 残基が結合してなるジぺプチド鎖またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシ ルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体を示す。
P5および Q4として好ましくは、 (1) 側鎖が置換されていてもよい中性アミ ノ酸残基またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル 基に還元されたアミノ酸誘導体、 (2)水酸基または (3)側鎖が置換されていて もよい中性アミノ酸残基と側鎖が置換されていてもよい芳香族性の側鎖を有する アミノ酸残基が結合してなるジペプチド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒ ドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体などがあげら れる。 P5および Q4としてさらに好ましくは、 (1) 側鎖が置換されていてもよ
い L一プロリンまたはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメチル基またはホ ルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (2 )側鎖が置換されていてもよい s4—ク ロロフエ二ルァラニンまたはその C末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基ま たはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (3 )側鎖が置換されていてもよい
2—ナフチルァラニンまたはその C末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基ま たはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (4 )側鎖が置換されていてもよい シクロへキシルァラニンまたはその C末端カルポキシル基がヒドロキシメチル基 またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (5 ) 水酸基または (6 ) 置換さ れていてもよい L一プロリンと(a)側鎖が置換されていてもよい L—フエニルァ ラニン、 (b)側鎖が置換されていてもよい L—チロシン、 (c)側鎖が置換されてい てもよい L一 2—チェ二ルァラニン、 (d) 側鎖が置換されていてもよい L一フエ ニルダリシンもしくは(e)側鎖が置換されていてもよい L _ 2—ピリジルァラニ ンが結合してなるジペプチド鎖、 またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシ ルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体などがあげられる。 P
5および Q 4としてさらに好ましくは、 (1) L一プロリンまたはその C末端力ルポ キシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、(
2) 4一クロ口フエ二ルァラニンまたはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシメ チル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (3) 2—ナフチルァラニン またはその C末端カルボキシル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元 されたアミノ酸誘導体、(4)シクロへキシルァラニンまたはその C末端カルボキシ ル基がヒドロキシメチル基またはホルミル基に還元されたアミノ酸誘導体、 (5) 水酸基、(6) L—プロリンと L一フエ二ルァラニンが結合してなるジペプチド鎖ま たはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元 されたぺプチド誘導体、(7) L—プロリンと Lーチロシンが結合してなるジぺプチ ド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基 に還元されたペプチド誘導体、(8) L—プロリンと L— 2—チェ二ルァラニンが結 合してなるジぺプチド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル 基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、(9) L一プロリンと L一フエ二 ルグリシンが結合してなるジぺプチド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒド
口キシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド誘導体、 (10) 一プロ リンと 4—クロ口フエ二ルァラニンが結合してなるジぺプチド鎖またはそ toe末 端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたぺプチ ド誘導体、 (11) L一プロリンと 2—ナフチルァラニンが結合してなるジペプチド 鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に 還元されたペプチド誘導体、 ( 12) L—プロリンと 3—ョードチロシンが結合して なるジペプチド鎖またはその C末端力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基また はホルミル基に還元されたペプチド誘導体、 (13) L—プロリンと〇ーメチルチロ シンが結合してなるジぺプチド鎖またはその C末端カルポキシル基がヒドロキシ ルメチル基またはホルミル基に還元されたべプチド誘導体、 または(14) L -プロ リンと L一 2—ピリジルァラニンが結合してなるジぺプチド鎖またはその C末端 力ルポキシル基がヒドロキシルメチル基またはホルミル基に還元されたペプチド 誘導体などがあげられる。
「一 P4— P5」 および 「― Q3— Q4」 として、 特に好ましくは、 (1) -Nle-Pr
0 - Phe、 (2) - Nle- Pro - Tyr、 (3) -Nle-Pro, (4) _Nle、 (5) - Met- Pro-Phe、 (6) -
Nle - Pro- Thi、 (7) -Nle-Pro-Phg, (8) - Nle- Pro- Pya (2)、 (9) -Met (0) , (10) - M et-Phe(Cl), (11) -Met-Pro-Phe (CI), (12) - Met- Pro- Nal (2)、 (13) -Met-Nal (2
)、 (14) -Met-Cha, (15) -Cha-Pro-Phe, (16) - Cha、 (17) -Met-Pro-Tyr (I) , (1
8) -Cha- Pro- Phe(Cl)、 (19) -Cha-Phe (CI), (20) - Nle- Pro- Tyr (I)、 (21) -Nle-
Ptie (CI)、 (22) - Cha- Pro - Tyr (I)、 (23) - Cha-Tyr (I)、 (24) -Cha-Phe, (25) -Me t- Phe、 (26) -Met- Pro- Tyr (Me)、 (27) - 0H、 (28) -Met, (29) -Met-Pro-Phe, お よび(30) -Ala- Pro_Plie (CI)などがあげられる。 また、 「一 P4— P5」 としては、
(1) - Cha - Pro- Phe(Cl)、 (2) -C a-Pro-Phe (3) - Met-Pro-Phe (CI)、 (4) -Met-P ro-P e (5) -Clia- Phe、 および(6) - Met- Pheが好ましく、 (1) -C a-Pro-Phe (CI), (
2) -Cha-Pro-Phe, (3) - Met- Pro- Phe (CI)、および(4) -Met- Pro- Pheが特に好まし い。 さらに、 「― Q 3— Q4」 としては、 (1) -Met-Pro-Phe (CD, (2) -Cha-Phe (
Cl)、 (3) -Cha-Pro-Phe (CI), (4) - Cha、 (5) -Cha-Pro-Phe, (6) -OH, (7) -Met
、 (8) - Met- Pro- Phe、 および(9) -Ala-Pro- Phe (CI)が特に好ましい。
本明細書において、 Q 5は側鎖が置換されていてもよい中性アミノ酸残基を示
し、 好ましくは、 置換されていてもよい L—プロリン、 置換されていて!)よい L 一ダリシンまたは置換されていてもよい L—ァラニンを示す。 Q 5とし 特に好 ましくは、 L—プロリン、 L一グリシンまたは Lーァラニンを示す。 本明細書に おいて、 R 2は置換されていてもよい Lーシクロへキシルァラニンを示し、 好ま しくは Lーシクロへキシルァラニンを示す。 本明細書において、 R 3は置換され ていてもよい L一フエ二ルァラニン、 置換されていてもよい L一 2—ナフチルァ ラニン、 置換されていてもよい Lーシクロへキシルァラニンまたは置換されてい てもよぃチロシンを示し、 好ましくは L一 4一クロ口フエ二ルァラニン、 L一 2 一ナフチルァラニン、 L—シクロへキシルァラニン、 L一フエ二ルァラニンまた は Lーチロシンを示す。
ァペリンの修飾体 (I I) の具体例としては、 例えば、 (1) Arg- Arg- Gin- Arg - Pr o - Arg- Leu_Ser - Ala- Arg - Gly - Pro - Met - Pro- Phe (CI)、 (2) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-A rg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Cha-Pro-P e (CI) , (3) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Al a-
Arg-Gly-Pro-Met-Pro-Phe (CI)、 (4) Arg - Pro- Arg- Leu- Ser- Ala- Arg- Gly-Pro- Cha
- Phe (CI)、 (5) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Ala-Arg-Gly-Pro-C a-Pro-Phe (CI) , (6) A rg- Arg - Gin- Arg - Pro - Arg - Leu_Ser - Ala- Arg-Gly- Pro - Cha、 (7) Arg- Pro- Arg - Leu -
Ser- His- Lys - Gly- Pro - Cha - Pro- Phe (CI)、 (8) Arg- Pro- Arg- Leu_Ser_His - Lys - Gly
-Pro- Me t- Pro- Pile (CI)、 (9) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- His- Lys- Gly- Pro- Clm - P ro-Phe、 (10) pGlu- Arg Pro- Arg- Leu- Ser- Hi s- Lys- Gly- Pro- Met- Pro- Phe (CI)、 (
11) Arg_Pro - Arg- Leu - Ser - Al a - Arg - Gly - Pro_Cha - Pro - Phe、 (12) Arg- Pro - Arg - Le u- Phe - A l a- Arg - Gly- Pro- Cha- Pro - Phe (CI)、 (13) Arg-Pro-Arg-Leu-Phe-Hi s-Lys-
Gly- Pro- Cha- Pro- Phe (CI)、 (14) Arg- Arg- Gin - Arg- Pro- Arg - Leu- Ser- Hi s- Lys - Gl y - Pro- Nle- Pro- Tyr、 (15) Arg- Pro- Arg- Leu- Phe- Hi s- Lys- Gly- Pro-Cha- Pro- Phe
、 (16) Arg - Pro- Arg- Leu- Phe- His- Lys - Gly- Pro- Me t-Pro- Phe (CI)、 (17) Arg- Arg
- Gin - Arg - Pro- Arg - Leu - Ser - Ala - Arg - Gly - Pro - Met - Pro - Phe、 (18) Arg - Arg - Gin - A rg - Pro - Arg- Leu-Ser-Ala - Arg_Gly - Pro - Met、 (19) Arg - Arg - Gin - Arg - Pro - Arg - Leu
- Ser- Al a-Arg- Gly- Pro、 (20) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Hi s-Lys-Gly-P ro-Me t (0)、 (21) Arg - Arg - Lys (Arg - Arg) - Arg - Pro - ArgHLeu - Ser - Hi s - Lys - G - Pr o - Met - Pro-Phe、 (22) Arg - Arg_Arg- Arg- Pro- Arg - Leu - Ser- His- Lys - Gly - Pro- Me t-
ggygggygA? arGClNMerAuserlArGlM ArGlnAproArLeAar-—Jl——————---—
yggggrrl seHislpreALeuGoMetproGlrArLeusph ArArnApro———-—--l———---- gggyy Pro ()eupArserHLLeuisLsGltGluArproArproMeprochEU50 ——l----—l—--—--- gg Pg () ()ye, Ar Ph48GuArrophe,49lproALeusHisplproMetprerheG-—l—---—---- yygygg (LsM)Met isGlproetNArGpoal4proupheAlalr7 ArArLe--—l—-l——-i---- ggyy Pgo () prArerserHLeusHisLGl^GuoArLeusproMech4lArprt6--—-l—-----—-l- g Pgg Pyy ()ArGluAproArlp4GlurLeupieHissGlpMetrophe5Lro-—ll——l——————- Pg {)gyy (e etprop43GMehheluArproeuseLsGlprotpropArLrphel-————--————-- gyggy Pgg ()M ArGletproproMprophe4ALeupheArGl2GlurproArAr—-—-l-----—-l-- g gygyg P ()LeusArerHisLsGloMe ,uArproArLeuserprtNal41Gl——-—ll-—--ll-l-
Pgggyy ()oArGluArAr4rproLeuserHisLsproMroNal ,0 ArpGletpl—l———---l---- P (ggy ()r ()y9 hclo3e38GluAroArereuGlproMetprpheprLeusLLs——-——————--- yyyggyapiL,chHsGlproMe tpropheHi SsGlprocha ArArLeuL- —--——il-l-—--I- gggyygspuer rroArusesGMetproArLeLerHisLlprophe Ar——llll—-———-——
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rg - Gin- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- Ala- Arg-Gly- Pro-Me t- Pro- Phe (CI) - NH2、 (60) Arg - Pro- Arg- Leu- Ser- Al a- Arg- Gly- Pro- Cha- Pyn、 (61) Arg-Pro-Arg-Leu-Se^Ala-A rg-Gly-Pro-Cha-Pro-Pyn, (62) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Ala-Arg-Gly -Gly-Cha, (63) Arg-Pro-Lys (Me) 2- Leu - Ser- Al a - Arg- Gly - Pro - Me卜 Pro- Phe、 (64 ) Arg - Pro - Arg- Leu - Ser - Ala - Lys (Me) 2_Gly - Pro - Me t - Pro - Phe、 (65) Arg- Pro - Arg -Leu-Ser-Dap-Arg-Gly-Pro-C a-Pro-Phe (CI)、 (66) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Dap (A c) -Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (C I)、 (67) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Dap (C6) -Arg-Gly -Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 および (68) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Dap (Adi) -Arg-Gly-Pr o - Cha - P r o- Phe (C 1 )などがあげられる。
ァペリンの修飾体 (I I I) の具体例としては、 (1 ) Arg- Pro- Arg- Leu- Phe- Al a -Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 ( 2 ) Arg- Pro- Arg- Leu- Phe- Hi s- Lys- Gly- Pro - C ha- Pro- Phe (CI)、 (3 ) Arg-Pro-Arg-Leu-Phe-His-Lys-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe, ( 4 ) Arg - Pro - Arg_Leu - Phe - His - Lys- Gly - Pro- Me t - Pro - Phe (CI)、 (5 ) Arg - Pro- Arg - Leu-Phe-Al a-Arg-Gly-Pro-Me t-Pro-Phe, ( 6 ) Arg-Pro-Arg-Leu-Phe-Hi s-Lys-Gl y-Pro-Cha-Phe (CI)、 ( 7 ) pGl.u- Arg_Pro- Arg- Leu- Phe_Arg- Arg- Gly-Pro- Me t- Pro -Phe, ( 8 ) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Phe_Hi s- Lys- Gly- Pro-Met- Pro-Phe、 ( 9 ) Ar g - Pro- Arg- LeiHPhe- Al a_Arg- Gly- Pro- Met- Pheで表されるぺプチドもしくはその エステルまたはその塩などがあげられる。
ァペリンの修飾体 (IV) の具体例としては、 (i) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Le u-Ser_Al a - Arg - Gly - Pro - Me t - Pro - Phe (CI)、 (i i) Arg - Pro- Arg - Leu - Ser - Ala - Arg -
Gly- Pro- Met-Pro- Phe (CI)、 (i i i) Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- Al a_Arg- Gly- Pro- Cha- P he (CI) , (iv) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Ala-Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI) , (v) Ar g - Arg - Gin - Arg - Pro - Arg - Leu_Ser - Al a - Arg - Gly- Pro - Cha、 (vi) Arg-Pro-Arg-Leu-
Ser - Ala - Arg - Gly - Pro - Cha - Pro - Phe、 (vi i) Arg - Arg - Gin Arg - Pro - Arg -: Leu - Ser - A la- Arg - Gly - Pro - Me t- Pro - Phe、 (vi i i) Arg-Arg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Ala-A rg - Gly- Pro - Me t、 (ix) Arg - Arg - Gin - Arg - Pro- Arg- Leu - Ser - Al a - Arg - Gly - Pro、 (x
) Arg - Pro - Arg - Leu - Ser- Al a - Arg - Gly- Pro- Me t - Pro - Phe、 (xi) pGlu-Arg-Pro-Arg
-Leu-Se r-Al a-Arg-Gly-Pro-Me t-Pro-Phe, ( i i) Arg - Pro - Arg - Leu - Ser - Ala - Arg -
Gly-Pro-Met、 (xi i i) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu - Ser- Al a- Lys- Gly- Pro- Met- Pro- Phe
、 (xiv) Arg- Pro- Arg_Leu- Ser-Ala- Arg- Gly - Pro- Ala - Pro - Pile (CI)、 (xv) Arg-Pr o-Arg-Leu-Ser-Ala-Arg-Gly-Gly-Met-Pro-Phe (CI)、 (xvi) Arg-Pro-Arg-Le^u-Ser - Ala-Arg-Gly Me-Ala-Met-Pro-Plie (CI)、 (xvii) Arg- Pro- Arg- Leu- Ser - Al,a-Arg - Gl y- P ro- Cha- Pyn、 (xviii) Arg-Pro-Arg-Leu-S e r-A 1 a-Arg-G 1 y-Pro-Cha-Pro-Py n、 (xix) Arg- Arg- Gin- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser- Ala- Arg- Gly- Gly-Cha、 または(xx) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Ala-Lys (Me) 2- Gly- Pro- Met- Pro- Phe、 で表されるぺプチド もしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。
ァペリンの修飾体 (IV) の具体例としては、 (1) Arg- Arg- Gin- Arg- Pro- Arg-L eu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-C a-Pro-Phe (CI)、 (2) Arg- Pro- Arg- Leu- Ser-His- Lys -Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 ( 3 ) Arg_Pro- Arg- Leu- Ser- His- Lys- Gly- Pro-Met- P ro-Phe (CI), (4) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu_Ser- His- Lys- Gly- Pro- Cha- Pro- Phe、 ( 5) pGlu - Arg- Pro- Arg-Leu- Ser-His- Lys_Gly - Pro-Met- Pro - Phe (CI)、 (6) Arg-A rg-Gln-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Nle-Pro-Tyr, ( 7 ) Arg - Pro - Arg -Leu-Ser- His- Lys- Gly- Pro- Met- Pro- Nal (2)、 (8) pGlu- Arg- Pro- Arg- Leu- Ser - H is- Lys- Gly - Pro- Met- Pro - Nal (2)、 (9) Arg - Pro- Arg - Leu - Ser- Hi s_Lys- Gly - Pro- Me t - P ro- Chaで表されるペプチドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげ られる。
さらに、 (i) Arg- Arg- Gin - Arg- Pro - Arg_Leu - Ser - His- Lys - Gly - Pro - Met (0)、 (i i) Arg- Arg- Lys (Arg - Arg) - Arg_Pro - Arg- Leu - Ser - His - Lys - G - Pro - Met - Pro - Phe
、 (iii) Arg Arg - Arg- Arg- Pro - Arg-Leu- Ser - His - Lys- Gly - Pro - Met- Pro - Plie、 (iv
) Arg - Arg - Lys - Arg - Pro- Arg - Leu- Ser - His- Lys- Gly - Pro - Met - Pro - Phe、 (v) Arg-A rg - Ala - Arg - Pro - Arg - Leu - Ser - His - Lys - Gly - Pro_Me卜 Pro - Phe、 (vi) Arg - Pro - Arg
HLeu - Ser - His - Lys - Gly - Pro- Met - Phe (CI)、 (vii) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Arg
HLys - Gly - Pro - Met - Pro - Plie、 (viii) Arg - Arg - Phe - Arg - Pro - Arg- Leu - Ser- His -: Lys
- Gly - Pro - Met - Pro - Phe、 (ix) pGlu- Arg - Pro- Arg - Leu- Ser - His - Arg - Gly- Pro - Met -
Pro- Phe、 (x) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Phe (CI) , (xi)
Arg - Pro- Arg - Leu - Ser- His - Lys - Gly - Pro - Met - Cha、 (xii) pGlu - Arg - Pro - Arg - Leu -
Ser -] ^euHLys - Gly - Pro - Met - Pro - Phe、 (xiii) Arg - Pro - Arg- Leu - Ser - His- Lys - Gly -
Pro— Met - Nal (2)、 (xiv) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Arg-Arg-Gly-Pro-Met-Pro-P
he、 (xv) pGlu-Arg - Pro - Arg- Leu - Ser - Phe - Lys - Gly - Pro - Met - Pro - Phe、 (xyi) pGl u - Arg - Pro-Arg - Leu - Ser - His - Lys - Gly - Pro - Met - Cha、 (xvii) pGlu-Arg-Pro-^-Arg-L eu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Nal (2)、 (xviii) pGlu - Arg - Pro - Arg - Leu - Ser - His - Phe-Gly-Pro-Met-Pro-Phe, (xix) pGlu-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Leu-Gly-Pro- Met - Pro - Phe、 (xx) A r g-A r g-G 1 n- A r g-P r o - A r g-L e u- S e r- A 1 a- A r g-G 1 y-NMe 2 ¾ (x i ) Arg - Arg - Gin - Arg - Pro - Arg - Leu - Ser - Ma - Arg- Gly_Mor、 (xxii) Arg-Pro-Arg-Le u-Ser-His-Ala-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 (xxiii) Arg- Pro- Arg- Ala- Ser- His - L ys-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 (xxiv) Arg-Pro-Lys (Me) 2-Leu- Ser- Ala- Arg- Gly- Pro- Met - Pro-Phe、 (xxv) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Dap-Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (C 1)、 (xxvi) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Dap (Ac) c-Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI) > (xx vii) Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-Dap (C6) -Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 (xxvi i i) A rg - Pro- Arg- Leu- Ser-Dap (Adi) -Arg-Gly-Pro-Cha-Pro-Phe (CI)、 または (xxix) Ar g-Pro-Ala-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-C a-Pro-Phe (CI)、で表されるぺプチドもし くはそのエステルまたはその塩などにも用いることができる。 ァペリンの修飾体 ( I) 〜 (IV) をはじめとするアベリンの修飾体は、 前記したァペリンと同様に 、 アミド体、 エステル体であってもよい。
ァペリンの修飾体 (I) 〜 (IV) の塩としては、 生理学的に許容される塩基 ( 例えばアルカリ金属など) や酸 (有機酸、 無機酸) との塩が用いられるが、 とり わけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無 機酸 (例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸) との塩、 あるいは有機酸 (例 えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホ ン酸) との塩などが用いられる。 ァペリンの修飾体 (I) は、 WO00/187 93号公報に記載されている公知化合物であり、 WO00Z18793号公報に 記載の方法で製造することができる。 ァペリンの修飾体 (II) 〜 (IV) は、 WO 0 1 /70769号公報に記載されている公知化合物であり、 WO0 1/707 69号公報に記載の方法で製造することができる。 以下、 ァペリンの修飾体、 そ の部分ペプチド、 そのアミドもしくはエステルまたはその塩を含めて、 ァペリン の修飾体と略記する場合がある。
ァペリン受容体、 その部分ペプチドまたはその塩としては、 WO 0 0 1 8 7 9 3号公報に記載されている公知のものを使用することができる。 すなわち、 ァ ペリン受容体としては、 ヒトゃ温血動物 (例えば、 哺乳温血動物 (例、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕)、 鳥類 (例、 二 ヮトリ、 ゾヽト、 ァヒル、 ガチョウ、 ゥズラ) など) のあらゆる組織 (例えば、 下 垂体、 膝臓、 脳、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管、 血管、 心臓など) または細胞などに由来する受容体であって、 配列番号 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。 すなわち、 ァペリン受 容体としては、 配列番号 3で表わされるァミノ酸配列を含有する夕ンパク質など の他に、 配列番号 3で表わされるアミノ酸配列と約 9 0〜 9 9 . 9 %の相同性を 有するァミノ酸配列を含有し、 配列番号 3で表わされるァミノ酸配列からなる夕 ンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが挙げられる。 これらの タンパク質が示す活性としては、 例えばリガンド結合活性、 シグナル伝達などが 挙げられる。 実質的に同質とは、 リガンド結合活性などが性質的に同質であるこ とを示す。 したがって、 リガンド結合活性の強さなどの強弱、 レセプ夕一タンパ ク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 さらに、 ァペリン受容体に は、 N末端の Metが保護基 (例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの(^ _ 6ァシル 基など) で保護されているもの、 G 1 nの N端側が生体内で切断され、 該 G 1 n がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基 (例え ば、 ホルミル基、 ァセチル基などの ^ 6ァシル基など) で保護されているもの 、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含 まれる。 ァペリン受容体の塩としては、 上記したァペリンの塩と同様のものが挙 げられる。
ァペリン受容体の部分ペプチドとしては、 例えば、 ァペリン受容体分子のうち
、 細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。 すなわちァペリン受容体の 疎水性プロット解析において細胞外領域 (親水性 (Hydrophi l ic) 部位) であると 分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 (Hydrophobic) 部位を一部 に含むぺプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含むぺプ
チドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。 アベ リン受容体の部分ペプチドの塩としては、 上記したァペリンの塩と同様のものが 用いられる。 , ァペリン受容体をコードする DNAとしては、 配列番号 3のアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するァペリン受容体をコードする 塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム D NA、 ゲノム DNAライブラリ一、 組織 ·細胞由来の c DNA、 組織 ·細胞由来 の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用す るべクタ一はパクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどい ずれであってもよい。 また、 組織 ·細胞より RNA画分を調製したものを用いて 直接自体公知の RT-P CR法によって増幅することもできる。具体的には、配列 番号 3のアミノ酸配列からなるァペリン受容体をコードする DNAとしては、 配 列番号 4で表わされる塩基配列からなる DNAなどが用いられる。 ァペリン受容 体、 その部分ペプチドまたはその塩、 およびァペリン受容体またはその部分ぺプ チドをコードする DNAは、 WOO 0Z1 8793号公報に記載されている方法 で製造 ·調整することができる。
以下に、 ァペリンまたはその修飾体、 ァペリンをコードする DNAなどの用途 について、 具体的に説明する。
( 1 ) ァペリン若しくはその修飾体又はァペリンをコードする遺伝子を含有する 医薬組成物
ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステル又はそれらの塩は 、 血管形成促進作用を有している。 したがって、 ァペリン、 その修飾体、 それら のアミド、 それらのエステル又はそれらの塩は、 例えば、 虚血性疾患の予防又は 治療剤として使用することができる。 ァペリンをコードする遺伝子 (通常は、 ァ ペリンをコードする DNAを含有する DNA) もまた血管形成促進剤として使用 することができ、 したがって、 ァペリンをコードする遺伝子は、 例えば、 虚血性 疾患の予防又は治療剤として使用することができる。
本発明において 「血管形成」 とは脈管形成及び血管新生の双方を包含する概念 である。 本発明の血管形成促進剤は、 血管形成のあらゆる態様、 例えば血管新生
(より具体的には、 血管網 (特に毛細血管網) の構築又は形成)、 血管腔 CD拡張な どを促進することができる。 特に血管腔の拡張を促進する因子として有用 ¾である ことは特筆すべき点であり、 本発明により、 太い血管の形成を in vi tro 又は in vivoにおいて誘導する技術が提供される。
本発明により予防又は治療され得る虚血性疾患としては、 血管の破綻により組 織の虚血症状を呈する疾患、 例えば脳梗塞、 心筋梗塞、 動脈硬化症 (特に、 上下 肢の慢性閉塞動脈硬化症)、 血栓性動脈閉塞症、 慢性動脈硬化による腎硬化症、 パ 一ジャー病、 種々のアレルギー及び自己免疫疾患により血管狭小を伴う血管障害 、 もしくは種々の病態に伴う心肺機能低下による末梢循環不全などがあげられる 。 「虚血症状」 とは、 血管の破綻に起因する組織の低酸素状態だけでなく低栄養状 態をも意味する。
上記の通りァペリンは血管腔の拡張を促進する因子として有用であることから 、 ァペリンを患者に投与して血管拡張を誘導することにより、 上記虚血性疾患の うち、 血管新生療法では血流を回復するのに有効な血管新生ができないため予防 または治療できない症例を予防または治療することが可能となる。 また、 ァペリ ンを患者に投与することにより、 血管新生療法を必要とするわけではないが血管 の狭小化が病態悪化の原因となっている例えば以下の病気
1 ) 膠原病、 高安病など血管炎で生じる血管狭小化
2 )さまざまな原因による腎硬化症による血管狭小化
3 ) 体表の慢性色素性紫斑にともなう血管狭小化
4 ) 血管狭小化を伴う網膜症
5 ) 血管狭小化が病態悪化の現因と考えられる網膜色素変性症
6 ) その他、 原因不明の血管狭小化
の予防または治療が可能となる。
ァペリンまたはその修飾体、 ァペリンをコードする遺伝子の上述の医薬として の使用は常套手段に従って行うことができる。 例えば、 必要に応じて糖衣や腸溶 性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとし て経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶 液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に (例えば静脈内投与により)
使用できる。 また局所への直接投与などあらゆる投与法が使用できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 ベ tクル 、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される 単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤におけ る有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。 また医薬として有用な他の成分 (例えば血管治療薬) と共に併用することも可能 である。
ァペリンをコードする遺伝子 (通常は、 ァペリンをコードする D N Aを含有す る D N A) はいわゆる遺伝子治療の手法により投与することが可能である。 例え ばァペリンをコードする D N Aは、 (ィ)ァペリンをコードする D NAを該患者に 投与し発現させることによって、 あるいは (口) 細胞などにァペリンをコードす る D N Aを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植することなどによって 、 該患者の細胞におけるァペリンの量を増加させ、 ァペリンの作用を充分に発揮 させることができる。 ァペリンをコードする D N Aの投与は、 該 D N Aを単独ま たはプラスミドベクター、 レトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシェ一テツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入 した後、 常套手段に従って実施することができる。
また、 ァペリンまたはその修飾体、 ァペリンをコードする遺伝子を投与するの と併せて、 ァペリン受容体をコードする遺伝子 (通常は、 ァペリン受容体をコ一 ドする D NAを含有する D N A) をァペリンの作用の増強が望まれる細胞で発現 させれば、 ァペリンの作用をより高めることができる。 ァペリン受容体をコード する遺伝子の導入方法はァペリンをコードする遺伝子の導入方法と同様であって よい。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セ ルロ一スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような 膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカ リンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤 などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料
にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成 物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのよう ¾:天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方 することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖や その他の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビト一ル、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど) などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール
(たとえばエタノール)、 ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、 ポリ エチレングリコール)、非ィオン性界面活性剤(たとえばポリソルベー卜 80 ( T M)、 HC〇一 50) などと併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油など があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併 用してもよい。 また、 緩衝剤 (例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液 )、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど)、 安定剤 ( 例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど)、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノ一ルなど)、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製 された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製 剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒ卜ゃ哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラッ卜 、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 マ ントヒヒ、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 ァペリン、 アベ リンをコードする DNAまたはァペリン受容体をコードする DNAの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人の虚血性疾患患者
(体重 60 k gとして) においては、 一日につき約 0. 1〜 10 Omg、 好ましく は約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に 投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに よっても異なるが、 たとえば注射剤の形では成人の虚血性疾患患者 (体重 6 O k gとして) への投与においては、 一日につき約 0. 0 1〜30mg程度、 好まし くは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静脈注 射あるいは局所注射や塗布により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も 、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 人工血管の製造方法
本発明の血管形成促進 は、 上記の通り優れた血管新生促進作用 (例 ば血管 網構築作用) 及び血管腔拡張作用を有することから、 血管系に分化可能な細胞か ら in vi t roにおいて人工血管 (いわゆるバイオ人工血管) を製造する方法におい て有利に使用することができる。 血管系に分化可能な細胞としては、 例えば、 生 体内の血管内皮細胞そのもの、 および胚性幹細胞 (ES細胞)、 成体幹細胞,間葉系 幹細胞、 血管内皮前駆細胞、 血液細胞、 神経系細胞などがあげられる。 こうして 得られた人工血管は、 従来の人工血管と比較して非常に太い血管径 (典型的には 内径 以上)を有する。本発明により製造される人工血管の内径に上限はない が、 最も太いヒトの大動脈の内径が 3 c mであることから、 通常は内径 3 c m以 下である。
人工血管の形成には VEGF, bFGF, HGF, PDGF, EGF, angiopoiet in, angio tens i n、 SCF、 M- CSFなど、 およびこれら受容体のァゴニスト、 またへパリン、 血清等 、 一種類あるいは複数のカクテルの添加によりより好ましい製造条件が付加され る。
( 3 ) 疾患の診断方法
被験体から採取された検体中のァペリン濃度を測定し、 測定値を健常者及び虚 血性疾患患者の測定値と対比することにより上述の虚血性疾患を診断することが 可能である。
被験体から採取された検体中のァペリン濃度が、 健常者に比べて統計的に有意 に低値、 あるいは高値の場合、 ネガティブおよびポジティブフィードバック機構 によって、 ァペリン濃度が変動していると考えられ、 体内に虚血病変があること の補助診断となる。
また、 被験体から採取された検体中のァペリン濃度を測定し、 測定値を健常者 及び血管が過剰増殖する疾患の患者の測定値と対比することによりこのような疾 患を診断することが可能である。 血管が過剰増殖する疾患としては、 例えばがん 、 糖尿病性網膜症、 膠原病などによる局所炎症 (例えばリウマチ性関節炎など) などの病態があげられる。
被験体から採取された検体中のァペリン濃度が、 健常者に比べて統計的に有意 に低値、 あるいは高値の場合、 ネガティブおよびポジティブフィードバック機構
によって、 ァペリン濃度が変動していると考えられ、 体内に血管が過剰に増殖す る病変があることの補助診断となる。 * 更にまた、 被験体から採取された検体中のァペリン濃度を測定し、 測定値を健 常者及び血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患の患者の測定値と対比すること により血管怒張又は毛細血管拡張を呈する疾患を診断することが可能である。 血 管怒張を呈する疾患としては典型的には、 食道静脈瘤、 下肢静脈瘤が挙げられる
。 血管拡張を呈する疾患としては、 例えば毛細血管拡張性運動失調病 (AT: Atax ia telaigiectagia) などの遺伝病があげられる。
被験体から採取された検体中のアベリン濃度が、 健常者に比べて統計的に有意 に低値、 あるいは高値の場合、 ネガティブおよびポジティブフィードバック機構 によって、 ァペリン濃度が変動していると考えられ、 体内に血管怒張又は毛細血 管拡張を呈する病変があることの補助診断となる。
被験体としては、 例えばヒトゃ哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラッ卜、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーなど) があげられる。
検体としては、 例えば血液、 尿のほか、 血清、 血漿、 腹水、 胸水、 髄液、 リン パ液、 唾液等の体液があげられる。
ァペリン濃度の測定方法は特に限定されず、 通常のクロマトグラフィーの手法 を用いて測定することができる。 また、 ァペリンの発現量を測定することにより 、 ァペリン濃度の測定を間接的に評価することも可能である。 発現量の測定方法 としては、 免疫化学的方法などの公知の方法や、 ァペリンをコードする m R N A をノーザンハイブリダィゼーション法、 R T— P C Rや T a Q M a n P C R法を 用いて、 公知の方法により測定することもできる。
( 4 ) スクリーニング方法
本発明はまた、 (a ) ァペリン、 その修飾体、 それらのアミド、 それらのエステ ル又はそれらの塩、 及びノ又は、 (b )配列番号 3で表されるアミノ酸配列と同一 若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するァペリン受容体、 その部分ぺプ チド若しくはその塩を用いることにより、 或いは、
( a ) ァペリンをコードする D N Aを含有する D N A、 及びノ又は、 (b ) 配列
番号 3で表されるアミノ酸配列と同一若しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有するァペリン受容体若しくはその部分べプチドをコードする D N Aを含 s有する D NAを用いることにより、 ,
( 1 ) ァペリンまたはその修飾体とァペリン受容体との結合性を変化させる物 質、 または (2 ) ァペリン及び Z又はァペリン受容体の発現を調節する物質など の物質をスクリーニングする方法を提供する。 これらの物質は、 例えば、 血管形 成促進剤又は虚血性疾患の治療若しくは予防剤、 或いは、 血管形成抑制剤又は血 管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤として利用する ことができる。
まず、 ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質のスクリーニン グ方法について説明する。 ァペリン受容体を用いるか、 または組換え型ァペリン 受容体の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いる ことによって、 ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質をスクリ 一二ングすることができる。 このような物質には、 ァペリン受容体を介して細胞 刺激活性を有する物質 (すなわち、 ァペリン受容体ァゴニスト) と該細胞刺激活 性を有しない物質 (すなわち、 ァペリン受容体アン夕ゴニスト) などが含まれる 。 「ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる」 とは、 ァペリンとァペリ ン受容体との結合を阻害する場合と、 ァペリンとァペリン受容体との結合を促進 する場合の両方を包含するものである。 細胞刺激活性としては、 例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細 胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内タンパク 質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制 する活性などが挙げられるが、 なかでも細胞内 c AM P生成の抑制活性が好まし い。
すなわち、 本発明は、 ( i ) ァペリン受容体にアベリンまたはその修飾体を接触 させた場合と (i i ) ァペリン受容体にアベリンおよび試験化合物を接触させた場 合との比較を行なうことを特徴とするァペリンとァペリン受容体との結合性を変 化させる物質のスクリーニング方法を提供する。 本発明のスクリーニング方法に おいては、 ( i ) ァペリン受容体にァペリンを接触させた場合と (i i ) ァペリン受
容体にァペリンおよび試験化合物を接触させた場合における、 例えばァ リン受 容体に対するァペリンの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較する 本発明のスクリーニング方法は、 具体的には、 ,
(A) 標識したァペリンまたはその修飾体をァペリン受容体に接触させた場合と 、 標識したアベリンまたはその修飾体および試験化合物をァペリン受容体に接触 させた場合における、 標識したァペリンまたはその修飾体のァペリン受容体に対 する結合量を測定し、 比較することを特徴とするァペリンとァペリン受容体との 結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、
( B ) 標識したァペリンまたはその修飾体をァペリン受容体を含有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したァペリンまたはその修飾体およ び試験化合物をァペリン受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させ た場合における、 標識したァペリンまたはその修飾体の該細胞または該膜画分に 対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするァペリンとァペリン受容体と の結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、
( C ) 標識したァペリンまたはその修飾体を、 ァペリン受容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したァペリン受 容体に接触させた場合と、 標識したァペリンまたはその修飾体および試験化合物 をァペリン受容体をコードする D NAを含有する形質転換体を培養することによ つて細胞膜上に発現したァペリン受容体に接触させた場合における、 標識したァ ペリンまたはその修飾体の該ァペリン受容体に対する結合量を測定し、 比較する ことを特徴とするァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質のスク リーニング方法、
(D ) ァペリン受容体を活性化する化合物 (例えば、 ァペリンまたはその修飾体 ) をァペリン受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 ァペリン受容体を活性 化する化合物および試験化合物をァペリン受容体を含有する細胞に接触させた場 合における、 ァペリン受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特 徴とするァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質のスクリーニン グ方法、
( E ) ァペリン受容体を活性化する化合物 (例えば、 ァペリンまたはその修飾体
) をァペリン受容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養す ことに よって細胞膜上に発現したァペリン受容体に接触させた場合と、 ァペリン受容体 を活性化する化合物および試験化合物をァペリン受容体をコードする D N Aを含 有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したァペリン受容体に 接触させた場合における、 ァペリン受容体を介する細胞刺激活性を測定し、 比較 することを特徴とするァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質の スクリーニング方法、
( F ) 試験化合物をァペリン受容体を含有する細胞に接触させた場合における、 ァペリン受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴とするアベ リン受容体ァゴニス卜のスクリーニング方法、
( G) 試験化合物をァペリン受容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を 培養することによって細胞膜上に発現したァペリン受容体に接触させた場合にお ける、 ァペリン受容体を介する細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徵とす るァペリン受容体ァゴニス卜のスクリーニング方法などである。
本発明のスクリーニング方法においては、 リガンドとしては、 ァペリンを使用 する代わりに、 ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる化合物 (例え ば、 低分子合成化合物、 好ましくは低分子合成ァゴニスト) またはその塩を用い ることもできる。 このァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる化合物 またはその塩は、 例えば、 リガンドとしてァペリンを用いて本発明のスクーニン グ方法を実施することによって得ることができる。 具体的には、 上記したァペリ ン修飾体などを用いることができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。 まず、 本発明のス クリ一ニング方法に用いるァペリン受容体としては、 前記したァペリン受容体を 含有するものであれば何れのものであってもよいが、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜 画分などが好適である。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なこと から、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大量発現さ せたァペリン受容体などが適している。 本発明のスクリーニング方法において、 ァペリン受容体を含有する細胞または該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調 製法に従えばよい。 ァペリン受容体を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダル
タルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公 知の方法に従って行うことができる。 ァペリン受容体を含有する細胞とし tは、 ァペリン受容体を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸 菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが挙げられる。 膜画分としては、 細 胞を破碎した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のこ とをいう。 細胞の破碎方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで細胞 を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリ トロン (Kinematica社製) による 破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズル から噴出させることによる破碎などが挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心 分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 (500 r pm〜 3000 r pm) で短時間 (通常、 約 1分〜 10分) 遠心し、 上清をさらに高速 (15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中 には、 発現したァペリン受容体と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成 分が多く含まれる。 該ァペリン受容体を含有する細胞や膜画分中のァペリン受容 体の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜10
7分子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド 結合活性 (比活性) が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になる ばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質をスクリーニングする 前記の A〜Cを実施するためには、 適当なァペリン受容体画分と、 標識したアベ リンまたはその修飾体が用いられる。 ァペリン受容体画分としては、 天然型のァ ペリン受容体画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え型ァペリン受容体 画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性などを 示す。 標識したァペリンまたはその修飾体としては、 標識したリガンド、 標識し たリガンドアナログ化合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕、 〔125 I〕、 〔14C
〕、 〔35S〕 などで標識されたァペリンまたはその修飾体などを利用することがで きる。 具体的には、 ァペリンまたはその修飾体とァペリン受容体との結合性を変 化させる物質のスクリーニングを行うには、 まずァペリン受容体を含有する細胞
または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファーに懸濁する とによ りレセプ夕一標品を調製する。 バッファーには、 ρΗ4〜1 0 (望ましくは ρΗ
6〜8) のリン酸バッファ一、 トリス—塩酸バッファーなどのァペリンとァペリ ン受容体との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特 異的結合を低減させる目的で、 CHAP S、 Twe e n— 80TM (花王一アト ラス社)、ジギトニン、デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加える こともできる。 さらに、 プロテア一ゼによるァペリン受容体ゃァペリンまたはそ の修飾体の分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研 究所製)、 ぺプスタチンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0.
0 1 m 1〜 10 m 1の該ァペリン受容体溶液に、 一定量 ( 5000 c p m〜 50
O O O O c pm) の標識したァペリンまたはその修飾体を添加し、 同時に 1 0一4
〜10— の試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 (NSB) を知るため に大過剰の未標識のァペリンまたはその修飾体を加えた反応チューブも用意する
。 反応は約 0°C〜約 50°C、 望ましくは約 4で〜約 37°Cで約 20分〜約 24時 間、 望ましくは約 30分〜約 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シ ンチレ一シヨンカウンターまたはァ—カウン夕一で計測する。 拮抗する物質がな い場合のカウント(BQ)から非特異的結合量 (NS B) を引いたカウント (B。一
NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 (B— NSB) が例えば 50%以下 になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。 ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質をスクリーニングする 前記の D〜Gの方法を実施するためには、 ァペリン受容体を介する細胞刺激活性 を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的 には、 まず、 ァペリン受容体を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養す る。 スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性 を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時間イン キュべ一卜した後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産物をそれ ぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 (例えば、 ァラキ ドン酸、 c AMPなど) の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な
— 場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよ 。 また
、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の j基礎的 産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができ る。 細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なァペリン受容 体を発現した細胞が必要である。 本発明のァペリン受容体を発現した細胞として は、 前述の組換え型ァペリン受容体発現細胞株などが望ましい。 試験化合物とし ては、 例えばペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産 物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物は 新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 また、 試験化合 物としては、 ァペリン受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合ポケット の位置に基づいて、 リガンド結合ポケッ卜に結合するように設計された化合物が 好ましく用いられる。 ァペリン受容体の活性部位の原子座標およびリガンド結合 ポケッ卜の位置の測定は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法を用いて行うこ とができる。
ァペリンとァペリン受容体との結合性を変化させる物質のスクリーニング用キ ットは、 ァペリン受容体、 ァペリン受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分 、 及び Z又はアベリンまたはその修飾体を含有するものである。 スクリーニング 用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
(a) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco社製) に、 0. 05%のゥシ血清アルブ ミン (シグマ社製) を加えたもの。 孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
(b) ァペリン受容体標品
ァペリン受容体を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
(c) 標識リガンド
〔3H〕、 〔125 I〕、 〔14C〕、 〔35S〕 などで標識したァペリンまたはその修飾 体適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、
用時に測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。 .
(d) リガンド標準液 ' ァペリンまたはその修飾体を 0. 1 %ゥシ血清アルブミン(シグマ社製) を含む P B Sで ImMとなるように溶解し、 ― 20°Cで保存する。
2. 測定法
(a) 12穴組織培養用プレートにて培養したァペリン受容体を発現させた細胞を 、 測定用緩衝液 lm 1で 2回洗浄した後、 490 ^ 1の測定用緩衝液を各穴に加 える。
(b) 1 0— 3〜1 0_ 1 0Mの試験化合物溶液を 1加えた後、 標識したアベ リンまたはその修飾体を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合 量を知るためには試験化合物のかわりに 10— 3 Mのリガンドを 5 1加えてお
(c) 反応液を除去し、 lm 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標 識ァペリンまたはその修飾体を 0. 2 N N a〇H— 1 %SD Sで溶解し、 4m l の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製) と混合する。
(d) 液体シンチレーシヨンカウン夕一 (ベックマン社製) を用いて放射活性を測 定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕
PMB= [(B-NS B) / (B。― NS B)] X 1 00
PMB: Percent Maximum Binding
B :検体を加えた時の値
NSB: Non-specific Binding (非特異的結合量)
B Q :最大結合量
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 物質は、 ァペリンとァペリン受容体との結合を変化させる (結合を阻害または促 進する) 物質であり、 具体的にはァペリン受容体を介して細胞刺激活性を有する 物質 (いわゆるァペリン受容体ァゴニスト) または該剌激活性を有しない化合物
(いわゆるァペリン受容体アンタゴニスト) である。 該物質は、 前記した試験化 合物から選ばれるペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵
生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、.公知の 化合物であってもよい。 ァペリン受容体ァゴニストであるか、 アン夕ゴニ^トで あるかの具体的な評価方法は以下の (〖) または (Π) に従えばよい。 .
( i ) 前記 A〜(:のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツセィを 行い、 ァペリンまたはその修飾体とァペリン受容体との結合性を変化させる (特 に、 結合を阻害する) 物質を得た後、 該物質が上記したァペリン受容体を介する 細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する物質はアベ リン受容体ァゴニストであり、 該活性を有しない物質はァペリン受容体アン夕ゴ ニス卜である。
( i i ) (a)試験化合物をァペリン受容体を含有する細胞に接触させ、上記アベリン 受容体を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する物質はァペリン 受容体ァゴニストである。
(b)ァペリン受容体を活性化する化合物(例えば、ァペリンまたはその修飾体など ) をァペリン受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 ァペリン受容体を活性 化する化合物および試験化合物をァペリン受容体を含有する細胞に接触させた場 合における、 ァペリン受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する。 ァペリ ン受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る物質はァペリン 受容体アン夕ゴニストである。 指標とする細胞刺激活性としては、 例えば、 細胞 内 c AM P生成の抑制活性が好ましい。
該ァペリン受容体ァゴニストは、 ァペリンが有する生理活性と同様の作用を有 しているので、 ァペリンまたはその修飾体と同様に安全で低毒性な医薬として有 用である。 逆に、 ァペリン受容体アン夕ゴニストは、 ァペリンが有する生理活性 を抑制することができるので、 ァペリンまたはその修飾体の活性を抑制する安全 で低毒性な医薬として有用である。
ァペリン受容体ァゴニストは、 ァペリンと同様に、 血管形成促進剤を有し、 虚 血性疾患の予防又は治療剤として有用である。
ァペリン受容体アン夕ゴニス卜は、 血管形成抑制作用を有し、 血管怒張若しく は毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは治療剤として有用である。 血管怒張 を呈する疾患としては典型的には、 食道静脈瘤、 下肢静脈瘤が挙げられる。 血管
拡張を呈する疾患としては、 例えば毛細血管拡張性運動失調病 (AT: Ataxia tel amgiectagia)などの遺伝病があげられる。ァペリン受容体アン夕ゴニストほまた
、 静脈奇形の治療剤としても有用である。 また腫瘍組織における血管新生を抑制 することができることから、 抗腫瘍剤としても有用である。 ァペリン受容体アン 夕ゴニストはまた、 血管が過剰増殖する疾患、 例えばがん、 糖尿病性網膜症、 膠 原病などによる局所炎症 (例えばリウマチ性関節炎など) などの病態の予防又は 治療剤としても有用である。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物 質は塩を形成していてもよく、 例えば、 薬学的に許容可能な塩などが用いられる
。 具体的には、 無機塩基との塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩
、 塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。 無機塩基との塩の好適な 例としては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩、 カルシゥ ム塩、 マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、 ならびにアルミニウム塩、 ァ ンモニゥム塩などがあげられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例えばト リメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2, 6—ルチジン、 エタノールァミン、 ジェタノ一ルァミン、 トリエタノールァミン、 シクロへキシ ルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N, N ' —ジベンジルエチレンジァミンな どとの塩あげられる。 無機酸との塩の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素 酸、 硫酸、 リン酸などとの塩があげられる。 有機酸との塩の好適な例としては、 例えばギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 安息 香酸などとの塩があげられる。 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例え ばアルギニン、 リジン、 オルチニンなどとの塩があげられ、 酸性アミノ酸との好 適な例としては、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩があげられる
。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を上述の治療 ·予防剤と して使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例えば、 前記した ァペリンまたはその修飾体を含有する医薬組成物と同様にして、 錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすること ができる。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ
トまたは温血動物 (例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥ マ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど) に対して投与すること-ができ る。 該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル —トなどにより差異はあるが、 例えば、 ァペリン受容体ァゴニストを経口投与す る場合、 一般的に成人 (体重 60 k g当たり) においては、 一日につき該化合物 を約 0. 1〜: L 00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投 与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 ァペリン受容体ァゴニスト を注射剤の形で通常成人 (60 k g当たり) に投与する場合、 一日につき該化合 物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射あるいは局所注射や塗布により投与す るのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与す ることができる。
次に、 ァペリン及び/又はァペリン受容体の発現を調節する物質のスクリ一二 ング方法について説明する。 本発明のスクリーニング方法は、 具体的には、 (1)
( i ) ァペリンを発現し得る細胞または組織を、 試験化合物の存在下および非存 在下で培養した場合における、 それぞれのァペリンの発現量またはァペリンをコ 一ドする mRNA量を測定し、 比較することを特徵とするァペリンの発現を促進 または阻害する物質のスクリーニング方法、 (2) ( i) ァペリン受容体を発現し 得る細胞または組織を、 試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合にお ける、 それぞれのァペリン受容体の発現量またはァペリンをコードする mRNA 量を測定し、 比較することを特徴とするァペリン受容体の発現を促進または阻害 する物質のスクリーニング方法である。 ァペリンまたはァペリン受容体を発現し 得る細胞または組織としては、 ヒトゃ温血動物 (例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等) の細胞 (例えば、 神 経細胞、 内分泌細胞、 神経内分泌細胞、 グリア細胞、 膝臓 jS細胞、 骨髄細胞、 肝 細胞、 脾細胞、 メサンギゥム細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞
、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 (例、 マクロファージ、 T細胞、 B細 胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球、 樹状
細胞)、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン^胞等) 、 もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部.位 (例 、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳) 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎 、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 (例、 大腸、 小腸)、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 唾液腺 、 末梢血、 前立腺、 睾丸 (精巣)、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 軟骨、 関節、 骨格筋等 を用いても良い。 その際、 株化細胞、 初代培養系を用いてもよい。 また、 前記し たァペリンまたはァペリン受容体をコードする D N Aを含有する組換えベクター で形質転換された形質変換体を使用してもよい。 ァペリンまたはァペリン受容体 を発現し得る細胞の培養方法は、 前記した形質変換体の培養法と同様である。 試 験化合物としては、 前記の試験化合物の他、 D NAライプラリーなどを用いるこ とができる。
ァペリンまたはァペリン受容体の発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法な どの公知の方法により測定することもできるし、 ァペリンをコードする m R N A をノーザンハイプリダイゼーシヨン法、 R T— P C Rや T a q M a n P C R法を 用いて、 公知の方法により測定することもできる。 m R N Aの発現量の比較をハ イブリダイゼーシヨン法によって行うには、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Samb rook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法等に従って行 なうことができる。 具体的には、 ァペリンまたはァペリン受容体をコードする m
R N Aの量の測定は、 公知の方法に従って細胞から抽出した R N Aと、 ァペリン またはァペリン受容体をコードする D N Aもしくはその一部またはァペリンもし くはァペリン受容体のアンチセンス ·ポリヌクレオチドとを接触させ、 ァペリン またはァペリン受容体をコードする D N Aもしくはその一部またはァペリンもし くはァペリン受容体のアンチセンス ·ポリヌクレオチドと結合した m R N Aの量 を測定することによって行われる。 ァペリンまたはァペリン受容体をコードする
D N Aもしくはその一部またはアベリンもしくはァペリン受容体のァンチセンス
•ポリヌクレオチドを、 例えば放射性同位元素、 色素などで標識することによつ
て、 ァペリンまたはァペリン受容体をコードする DNAもしくはその一部または ァペリンもしくはァペリン受容体のアンチセンス 'ポリヌクレオチドに結^した mRNAの量が容易に測定できる。 放射性同位元素としては、 例えば32 P、,3Hな どが用いられ、 色素としては、 例えば fluorescein, F AM (PE Biosystems社製
), JOE (PE Biosystems社製)、 TAMRA (PE Biosystems社製)、 ROX (P
E Biosystems社製)、 C y 5 (Amersham社製)、 C y 3 (Amerslmm社製) などの蛍 光色素が用いられる。 また、 mRNAの量は、 細胞から抽出した RNAを逆転写 酵素によって c DNAに変換した後、 ァペリンまたはァペリン受容体をコードす る DNAもしくはその一部またはァペリンもしくはァペリン受容体のアンチセン ス ·ポリヌクレオチドをプライマ一として用いる PCRによって、 増幅される c
DNAの量を測定することによって行うことができる。 このように、 ァペリンま たはァペリン受容体をコードする mRNAの量を増加させる試験化合物を、 ァぺ リンもしくはァペリン受容体の発現を促進する活性を有する物質として選択する ことができ、 また、 ァペリンまたはァペリン受容体をコードする mRNAの量を 減少させる試験化合物を、 ァペリンまたはァペリン受容体の発現を阻害する活性 を有する物質として選択することができる。
さらに、 本発明は、 (ii)ァペリンまたはァペリン受容体をコードする遺伝子の プロモーター領域またはェンハンサ一領域の下流にレポ一ター遺伝子を連結した 組換え DN Aで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で 培養した場合における、 それぞれのレポ一夕一活性を測定し、 比較することを特 徴とする当該プロモー夕一活性を促進または阻害する物質のスクリーニング方法 を提供する。 レポ一夕一遺伝子としては、 例えば、 l ac Z (j3_ガラクトシダ
—ゼ遺伝子)、 クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ(CAT)、 ルシフ エラ一ゼ、 成長因子、 /3 -ダルク口ニダ一ゼ、 アルカリホスファターゼ、 Green f luorescent protein (GFP)、 j3-ラクタマ一ゼなどが用いられる。 レポーター遺伝 子産物 (例、 mRNA、 タンパク質) の量を公知の方法を用いて測定することに よって、 レポ一夕一遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のペプチド のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御 (特に促進) する作用を有す る化合物、 すなわちァペリンまたはァペリン受容体の発現を促進する活性を有す
る物質として選択できる。 逆に、 レポーター遺伝子産物の量を減少させ ¾試験化 合物をァペリンまたはァペリン受容体のプロモーターもしくはェンハンザ一の活 性を制御 (特に阻害) する作用を有する物質、 すなわちァペリンまたはァ,ペリン 受容体の発現を阻害する活性を有する物質として選択することができる。 試験化 合物としては、 前記と同様のものが使用される。 形質転換体の培養は、 前記の形 質転換体と同様にして行うことができる。 レポーター遺伝子のベクター構築ゃァ ッセィ法は公知の技術に従うことができる (例えば、 Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999)。
ァペリンまたはァペリン受容体の発現を促進する活性を有する物質は、 ァペリ ンが有する生理活性を促進する作用を有しているので、 ァペリンと同様に安全で 低毒性な医薬として有用である。 逆に、 ァペリンまたはァペリン受容体の発現を 阻害する活性を有する物質は、 ァペリンが有する生理活性を抑制することができ るので、 ァペリンの活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
具体的には、 ァペリンまたはァペリン受容体の発現を促進する活性を有する物 質は、 血管形成促進剤を有し、 · 虚血性疾患の予防又は治療剤として有用である。 ァペリンまたはァペリン受容体の発現を阻害する活性を有する物質は、 血管形 成抑制作用を有し、 血管怒張若しくは毛細血管拡張を呈する疾患の予防若しくは 治療剤として有用である。 血管怒張を呈する疾患としては典型的には、 食道静脈 瘤、 下肢静脈瘤が挙げられる。 血管拡張を呈する疾患としては、 例えば毛細血管 拡張性運動失調病(AT: Ataxia telamgiectagia) などの遺伝病があげられる。 ァ ペリンまたはァペリン受容体の発現を阻害する活性を有する物質はまた、 静脈奇 形の治療剤としても有用である。 また腫瘍組織における血管新生を抑制すること ができることから、 抗腫瘍剤としても有用である。 ァペリンまたはァペリン受容 体の発現を阻害する活性を有する物質はまた、 血管が過剰増殖する疾患、 例えば がん、 糖尿病性網膜症、 膠原病などによる局所炎症 (例えばリウマチ性関節炎な ど) などの病態の予防又は治療剤としても有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、 例えば、 ペプチド、 夕 ンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出 液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物である。 該化合物の塩として
は、 前記したァペリンの塩と同様のものが用いられる。 本発明のスクリーニング 方法を用いて得られる化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 j常套手 段に従って実施することができる。 例えば、 前記したァペリンまたはその修飾体 を含有する医薬組成物と同様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイク 口カプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。 このようにして 得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは温血動物 (例えば 、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サ ル、 チンパンジーなど) に対して投与することができる。 該化合物またはその塩 の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はある が、 例えば、 ァペリンの発現を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成 人(体重 60 k g当たり) においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜 1 00m g、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与す る。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患な どによっても異なるが、 例えば、 ァペリンの発現を促進する化合物を注射剤の形 で通常成人 (6 O k g当たり) に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 l〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射あるいは局所注射や塗布により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができ る。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC- I UB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
DNA :デォキシリポ核酸
c DNA :相補的デォキシリポ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グァニン
C :シ卜シン
Y :チミンまた
Ν :チミン、 シトシン、 アデニンまたはグァ R :アデニンまたはグァニン
Μ :シトシンまたはアデニン
W :チミンまたはアデニン
S :シトシンまたはグァニン
RNA : リポ核酸
mRNA :メッセンジャーリポ核酸 d ATP :デォキシアデノシン三リン酸 dTTP :デォキシチミジン三リン酸 d GTP :デォキシグアノシン三リン酸 dCTP :デォキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジァミン四酢酸
S D S ドデシル硫酸ナトリウム
T F A トリフルォロ酢酸
E I A
G 1 yまたは G ダリシン
A 1 aまたは A ァラニン
V a 1または V バリン
L e uまたは L ロイシン
I 1 eまたは I イソロイシン
S e rまたは S セリン
Th rまたは T スレオニン
C y sまたは C
Me tまたは M メチォニン
G 1 uまたは E グルタミン酸
As または D ァスパラギン酸
L y sまたは K : リジン
A r gまたは R :アルギニン
H i sまたは H : ヒスチジン
Ph eまたは F : フエ二ルァラニン
Ty rまたは Y :チロシン
T r pまたは W : 卜リブ卜ファン
P r oまたは P :プロリン
八5 11または :ァスパラギン
G 1 nまたは Q :グルタミン
p G 1 u : ピログルタミン酸
Me :メチル基
E t :ェチル基
B u :ブチル基
P h :フエニル基
N 1 e : ノルロイシン
T h i : 2—チェ二ルァラニン
P h g : フエニルダリシン
P y a (2) : 2—ピリジルァラニン
Ad i (NH2) : 2—ァミノアジピン酸一 6アミド
Hyp :ォキシプロリン (ヒドロキシプロリン)
A c - A r g : Να—ァセチルアルギニン
L y s (Ac) : NE—ァセチルリジン
L y s (Me) : Νε—メチルリジン
L y s (To s) : NE—トシルリジン
A r g (To s) : NE—トシルアルギニン
Ph e (C 1 ) : 4—クロ口フエ二ルァラニン
N a 1 (2) : 2—ナフチルァラニン
C h a : シクロへキシルァラニン
Me t (〇) :メチォニンスルフォキシド
Ty r (Me) : O—メチルチロシン
Ty r ( I ) : 3—ョードチロシン
TC :チアゾリジン一 4 (R) —力ルポキサミド基
B om :ベンジルォキシメチル
NMP : N—メチルピロリドン
PAM : フエ二ルァセ卜アミドメチル
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s : p—トルエンスルフォニル
HONB : N—ヒドロキシ— 5—ノルポルネン一 2, 3—ジカルポキシイミド
B z 1 :ベンジル
Z :ベンジルォキシカルボニル
C 1— Z : 2—クロルべンジルォキシカルボニル
B o c : t一ブチルォキシカルボニル
HOB t : 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
TFA: トリフルォロ酢酸
Fmo c : N— 9 _フルォレニルメトキシカルポニル
DNP :ジニトロフエニル
B urn:ターシャリ一ブトキシメチル
T r t : トリチル
Me B z 1 : 4一メチルベンジル
L y s (A r g-A r g) : N ε—アルギニルアルギニルリジン
AM:アミノメチル
P y n : 1ーピレニルァラニン
Mo r :モルホリン
N-Me A 1 a : N—メチルァラニン
Ly s (Me) 2 : NE—ジメチルリジン
D p :ジァミノプロピオン酸
Mm t : 4—メトキシトリチル
Ad i :アジボイル
D ap (C6) : N0—へキサノィルジァミノプロピオン酸
D I PCD I : N, N' —ジイソピロピルカルノジイミド
NMe 2 :ジメチルァミン
D a p (Ac) : —ァセチルジァミノプロピオン酸
D a (Ad i ) : Νβ—アジボイルジァミノプロピオン酸
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
配列番号 1
ゥシ型ァペリンのアミノ酸配列 (Ν末端から 17配列) を示す。
配列番号 2
配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するゥシ型ァペリンをコードする c D ΝΑの塩基配列を示す。
配列番号 3
ァペリン受容体 c DNAにコードされるァペリン受容体の全アミノ酸配列を示 す。
配列番号 4
ァペリン受容体 c DNAの全塩基配列を示す。
配列番号 5
マウス型ァペリンをコ一ドする c DNAにコードされるアミノ酸配列を示す。 配列番号 6
マウス型ァペリンをコ一ドする c DNAの塩基配列を示す。
配列番号 7
ラット型ァペリンをコードする c DNAにコードされるアミノ酸配列を示す。 配列番号 8
ラッ卜型ァペリンをコードする c DNAの塩基配列を示す。
配列番号 9
ヒト型ァペリンをコードする cDN Αにコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号 10
ヒト型ァペリンをコードする c DNAの塩基配列を示す。
配列番号 1 1
ゥシ型ァペリンをコードする c DNAにコードされるアミノ酸配列を示す。 配列番号 12
ゥシ型ァペリンをコードする c DN Aの塩基配列を示す。
配列番号 13〜 52
ァペリン修飾体 (I) の具体的なペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号 53〜; 1 1 9
ァペリン修飾体 (Π) 〜 (IV) の具体的なペプチドのアミノ酸配列を示す。 配列番号 120〜 1 24
実施例で用いたプライマ一の塩基配列を示す。
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明は実施例により制限さ れるものではない。
( 1 ) リコンビナントァペリンによる血管形成の試験管内観察
ァペリンが血管内皮細胞の管腔形成に影響を与えるかを検討するため、 Matrig el (BD Bioscience社製)上での血管内皮細胞の管腔形成への効果を解析した。ヒト 臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC; KURAB0社製) は HuMedia- EG2 (KURAB0社製)にて培 養し、 継代回数が 10回以内のものを実験に使用した。 HuMedia- EG2にて培養した H
UVEC細胞の培地をサイトカインの入っていない HuMedia- EB20OJRAB0社製)に交換 し、 37°Cで 2時間培養した。 培養後、 細胞を回収し、 Matrigel (BD Bioscience社製
) 250 1にてコートした 24 well plateに 5xi04cells/wellを播種し、 (pyr1) -ape lin-13 (BACHEM社製、 配列番号 5、 7、 9又は 1 1で表されるアミノ酸配列の第
65番目から第 77番目のアミノ酸配列を有するペプチドの N末端のアミノ酸 (
G i n) がピログルタミン酸化したアミノ酸配列を有するペプチド) 100ng/mlま たは VEGF(DIACLONE research社製) 30ng/mlの存在下で 37°Cにて 9時間培養後、 顕 微鏡にて観察した。 コントロールの PBS (リン酸緩衝液、 137mM NaCl, 2.7mM KC1
, 4.3mM Na2HP04 - 7H20, 1.4mM KH2P04) に比べ、 ポジティブコントロールとして 用いた VEGFは血管網の形成を促進した。 ァペリンも VEGFと同様に管腔形成を促進
した (図 1)。
(2) ァペリンを発現する 0P9細胞、 colon26マウス大腸がん細胞、 PC3ヒト M立腺 がん細胞の調製
マウス全長アベリン遺伝子は GenBanK BC020015の遺伝子配列を参考に、 センス プライマ一 5' ggaattcgggaccatgaatctgaggctct 3'およびアンチセンスプライマ 一 5' ggaat tcac t tggcgagccc t tcaatc 3'の PCRプライマーを作成して単離した。マ ウス脳微小血管内皮細胞株である bEND3細胞から IS0GEN (二ツボンジーン社製)を 用いて total RNAを抽出し、 Superscriptn (invitrogen社製) で逆転写し cMAを 合成した。 これを铸型に上記の PCRプライマーを用いて cDNA (配列番号 6) を増幅 した。 これをエタノール沈澱後、 EcoRI (TAKARA社製) で制限酵素消化を行った後 、pcDNA3.1 (invitrogen社製)の EcoRIサイトに挿入して細胞に対する遺伝子導入プ ラスミドを作成した。
0P9細胞 (Takakura N. Immunity 9: 677-686 , 1998) は 20%牛血清を含む αΜ
EM培地(GIBC0社製)にペニシリン (lOOim it/ml) とストレプトマイシン (100/xg/ ml) (いずれも GIBC0製)を添加した培養液を用いて継代した。 colon26 (Asao T. et al. Cancer Lett. 78:57-62, 1994) および PC3細胞 (Rodan S. B. et al. J.
Clin. Invest. 72:1511-1515, 1983) は 1 0 %牛血清を含む RPMI1640培地 (GIBC
0社製) にペニシリン (100unit/ml) とストレプトマイシン (100 /g/ml) (いずれ も GIBC0製)を添加した培養液を用いて継代した。 遺伝子導入はリポフエクシヨン 法 (lipofectamine2000; invitrogen製) を用いた。遺伝子導入細胞は上記の培養 液に 7日間 G418 (GIBC0製) を 500 g/mlの最終濃度で添加して、 生存細胞を遺伝 子導入細胞とした。 これらの細胞を 96穴培養プレートの一穴に一個一個の細胞を 播種し、増殖した細胞を 10cmの培養皿に移し、培養皿中細胞が 8割を占拠するに至 つた培養皿から Tripsin- EDTA (GIBC0社製)を用いて細胞を回収し、 一部を細胞培 養を継続するとともに、残りの細胞から IS0GEN (二ツボンジーン)を用いて RNAを抽 出した。 マウスァペリン遺伝子が導入されているかどうかはマウスァペリンの RT
—PCR用プライマー;センスプライマ一 (5, -ggaat tcgggaccatgaatctgaggctct-3' ) とアンチセンスプライマー (5' -acttggcgagcccttcaatc-3' )を用いて PCRを 35サ ィクル行い、 ァペリンの発現を検討した。 またポジティブコントロールとしてセ
ンスプライマ一(5, -accacagtccatgccatcac-3' )とアンチセンスプライマ-一(5, - tccaccaccctgttgctgta-3' )を用いて PCRを 27サイクル行い、 GAPDHの発現を ¾認し た。 PCRには ex TaQ(TAKARA)を用いた。 RT - PCRによって得られた遺伝子産物を 0.8 %ァガロース (SIGAM社製) に泳動し、 得られた産物の確認を行った。 結果を図 2 に示す。
ァペリン遺伝子を導入した 0P9細胞、 colon26細胞、 PC3細胞およびァペリンを発 現しない 0P9細胞、 colon26細胞、 PC3細胞をそれぞれ 5xl03個ずつ 12穴の培養皿に 播種し、 上記の培養液にて 6日間培養をおこない、 細胞数を計測した。 その結果 ァペリンの発現は細胞増殖には影響を与えないことが判明した。 colon26細胞につ いての結果を図 3に示す。
(3) P-Sp培養を用いた血管形成におけるァペリンの機能解析
マウス傍大動脈臓側板中胚葉 (para-aortic splanchnopleural mesoderm; P-S p) 領域を用いた 0P9ストロマ細胞上での培養により、 血管内皮細胞による血管形 成が観察される (Takakura N. et al. Cell 102:199-209, 2000)。
妊娠 9.5日目のマウス (ICR; SLC社製) からマウス胎仔を実体顕微鏡 (Leica社 製)下にて P-Sp領域の外植体を取り出し、パスツールピぺットを用いて 0P9細胞あ るいは実施例 (2) で作成したァペリンを発現させた 0P9(0P9/apelin) 上に播種 した。 これらを 10 %牛血清を含む RPMI1640培地 (GIBC0社製) にペニシリン (1
00unit/ml) とストレプトマイシン (100 zg/ml) (いずれも GIBC0製)、 2- ME (最終 濃度 5xl0—¾ ; ' GIBC0社製).、 及び stem cell factor (SCF、 最終濃度 50ng/ml ; GI
BC0社製)とエリスロポエチン(最終濃度 2imit/ml; GIBC0社製) を添加した培養液 にて 5 %C02, 37°Cの条件で 7日間培養した。 培養された細胞は、 パラホルムアル デヒド(Wako社製)を 4%の濃度で含む PBSに 10分室温で浸透して組織を固定した
。 パラホルムアルデヒドの入った PBSを除去し、 培養細胞を PBSで 10分室温で PBS に浸透して洗浄した。 培養細胞は 0.6%の過酸化水素 (WAK0社製) と 0.2%のアジ 化ナトリウム (SIGMA社製) を含む PBSに室温で 30分間浸透し、 内因性のペルォ キシダーゼの不活化を行った。 これらの溶液を捨て、 続いて培養細胞に 5 %ャギ 血清および 1 %牛血清アルブミン (BSA; SIGMA社製) を含む PBS (ブロッキング液
) をのせ室温で 30分浸透させ、 2次抗体のブロッキングを行づた。 ブロッキン
グ液を捨て、 抗 CD31抗体(Phaoiingen社製) を最終濃度 0.卜 5 g/mlにブロッキン グ液で希釈して、 6〜1 2時間室温あるいは 4 °Cで反応させた。 抗体溶液 すて 、 0. 05%Tween20を含む PBS (洗浄液) 中に 4 °Cで 1 0分浸透させ、 洗浄液を捨てた 。 この操作を 3回繰り返した。 ペルォキシダーゼ標識ャギ抗ラットイムノグロブ リン(Biosource社製) を 100分の 1〜500分の 1の濃度にプロッキング液で希釈し 、 培養細胞にのせ、 室温で 1時間反応させた。 2次抗体を捨て、 洗浄液で上記と同 様培養細胞を 3回洗浄した。 培養細胞にディアミノべンジディン (DAB ;同人化学 社製) を 250 ^ g/mlの濃度で PBSに溶解した DAB溶液 l mlに対して、 1. 5 %過酸化水 素を 5 1添加した溶液を発色液として用いて、 CD31抗体による血管内皮細胞の発 現を解析した。結果を図 4に示す。 図に示すように、 0P9細胞にァペリンを過剰発 現したもの (0P9/ape l in) では、 血管網を形成する内皮細胞同士の接着により、 一本一本の血管網の径が太くなることが判明した。
( 4 ) 成体内でアベリンが血管形成に与える影響の解析
i) colom26および colon26/apel inを用いた血管形成におけるァペリンの解析
実施例 (2 ) で作成した colon26細胞、 およびァペリンを発現させた colon26細 胞 (colon26/apel in) を 100 1の PBSに l x 106細胞を混和し、 BALB/cマウス(6週齢
、 メス、 SLC社製)各々 4匹の背部に皮下投与により移植し、 移植後 14日目マウスの 皮下に形成された腫瘍を回収し、 外見を観察した。 実施例を図 5に示す。 ァペリ ンの導入された colon26細胞による腫瘍では、 導入されていない colon26細胞によ る腫瘍に比べ、 非常に太い血管が形成されていることが判明した。 実際に組織学 的に血管径の太い血管が形成されているか否かを解析するために、 腫瘍の組織切 片を用いて血管内皮細胞特異的マーカーによる免疫学的染色を行った。 腫瘍組織 はパラホルムアルデヒド(Wako社製)を 4 %の濃度で含む PBSに 2時間 4 °Cで浸透 して組織を固定した。 パラホルムアルデヒドの入った PBSを除去し、 腫瘍組織を P
BSで 2時間 4 °Cで PBSに浸透して洗浄した。腫瘍組織は 4 0 %メタノール、 7 0 % メタノールを含む PBS、 100%メタノールでそれぞれ 4でで 20分脱水させた。腫瘍を カッターを用いて細切し、 5 0 %ポリエステルワックス (第一化学社製) を含む メタノール溶液、 1 0 0 %ポリエステルワックスでそれぞれ 4 2 °Cで 3 0分〜 4 時間ワックスを浸透した。 さらにこの組織をカセット内でワックスに包埋し、 ミ
クロトーム (ャマト科学社製) を用いて 5〜8 mに薄切し、 スライドグラス上で 固定、 乾燥させた。 このようにして作成した組織切片を 1 0 0 %のェタノしルで 脱ワックスを行い、 0. 6 %の過酸化水素と 0. 2 %のアジ化ナトリウムを含むメタノ ールに室温で 3 0分間浸透し、 内因性のペルォキシダーゼの不活化を行った。 続 いて 7 0 %メタノールを含む PBS, PBSの順にそれぞれ 5分間静置して、 親水した 。 組織切片に 5 %ャギ血清および 1 %BSAを含む PBS (ブロッキング液) をのせ室 温で 3 0分浸透させ、 2次抗体のブロッキングを行った。 ブロッキング液を捨て 、 抗 CD31抗体 (Pharmingen社製) を最終濃度 0· l〜5 g/mlにブロッキング液で希 釈して、 6〜 1 2時間室温あるいは で反応させた。 抗体をすて、 0. 05%Tween 20を含む PBS (洗浄液) 中に 4 °Cで 1 0分浸透させ、 洗浄液を捨てた。 この操作を 3回繰り返した。 ペルォキシダーゼ標識ャギ抗ラットイムノグロブリン (B iosou rce社製)を 100分の 1〜500分の 1の濃度にブロッキング液で希釈し、組織切片に のせ、 室温で 1時間反応させた。 2次抗体を捨て、 洗浄液で上記と同様切片を 3回 洗浄した。 組織切片にディアミノべンジディン (DAB ;同人化学社製) を 250 g/m 1の濃度で PBSに溶解した DAB溶液 l mlに対して、 1. 5 %過酸化水素を 5 ^ 1添加した 溶液を発色液として用いて、 抗 CD31抗体による血管形成の様子を解析した。 結果 を図 6に示す。ァペリンを導入した colon26細胞による腫瘍組織内にはコントロー ルと比べ、 血管径の太い血管が形成されているのが判る。 実施例 (2 ) (図 3 ) の 結果を鑑みれば、 ァペリンを発現させた細胞では細胞数の増加が誘導されるわけ でなく、 ァペリンは個体において血管新生時の血管の血管拡張を誘導するといえ る。
i i) PC3および PC3/apel inを用いた血管形成におけるァペリンの解析
上記実施例 (4 ) i)で示した結果が用いた細胞特異的でないことを証明するた めに実施例 (2 ) で作成した PC3細胞、 およびァペリンを発現させた PC3細胞 (PC
3/apel in) を 100 1の PBSに I X 106 細胞を混和し、 ヌードマウス(6週齢、 メス、 S
LC社製)各々 4匹の背部に皮下投与により移植し、 移植後 14日目マウスの皮下に形 成された腫瘍を回収し、 組織学的に血管径の太い血管が形成されているか否かを 解析するために、 腫瘍の組織切片を上記 i)と同様の実験^喿作を用いて血管内皮細 胞特異的マーカーである抗 CD31抗体による免疫学的染色を行った。 結果を図 7に
示す。 colon26細胞を使用した際と同様、 ァペリンを導入した PC3細胞 (P.C3/ape l in)による腫瘍内では、ァペリンを導入していない PC3細胞により形成され sた腫瘍 内と比べ血管径の太い血管が形成されていることが判明した。 .
以上より、 成体で生じる血管新生において、 ァペリンは血管径の太い血管を形 成することが確認された。
i i i) ァペリンを用いた角膜における新生血管の解析
0. 34匪 X 0. 34龍に細切した親水性ポリマーをコ一ティングしたショ糖アルミ ニゥムペレット (Bukh Med i tec社製) に実施例 (1 ) で用いたのと同じァペリン (2 g) と VEGF (lng) を、 単独あるいは両者を混合して浸透させた。
このペレットを C57BL/6マウス (SLC社製) マウスの角膜と結膜の連接部より角 膜部側に l mm離れた部位に移植した。 ペレツトの移植の後 6日目に角膜を回収し 、 実施例 (4 ) i)と同じ手順にて、 角膜の組織切片を作成し、 抗 CD31抗体で染色 して、 角膜に新しく形成された血管の血管径を観察した。 結果を図 8に示す。 VEG F単独に比べて VEGFとァペリンの両者を混合させた場合に角膜に形成される新生 血管の血管径が著明に拡大することが確認された。 産業上の利用可能性
本発明の血管形成促進剤は、 特に血管新生 (例えば、 血管網の構築) 及び血管 腔の拡張を促進する作用を有する。 本発明の血管形成促進剤を用いて人工血管を 製造することにより、 従来実現できなかった径の太い血管の形成が可能となる。 本発明によればまた、 血管の破綻により組織の虚血症状を呈する、 脳梗塞、 心 筋梗塞、 慢性動脈硬化による腎硬化症、 下肢の慢性閉塞性動脈硬化症、 バージャ 一病などの虚血性疾患の予防又は治療剤が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 3 ~ 1 1 9 :合成べプチド
配列番号 1 3〜1 4 : X a aは N l eを意味する。
配列番号 1 5〜18 : 1番目の Xa aは pG 1 uを意味し、 1 1番目の X a a は N 1 eを意味する。
配列番号 19, 20, 2 1 : 1番目の X a aは Ac—A r gを意味し、 1 0番 目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 22 : 1番目の Xa aは pG 1 uを意味し、 8番目の Xa aは Ly s (Ac) を意味する。
配列番号 23 : 1番目の Xa aは pG 1 uを意味し、 8番目の Xa aは Ly s (Me) を意味する。
配列番号 24 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 8番目の Xa aは Ly s (Ac) を意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 25 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 8番目の Xa aは Ly s (Me) を意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 26 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 8番目の Xa aは Ly s (To s) を意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 27 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 8番目の Xa aは A r g (To s) を意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 28, 29 : 1番目の; a aは p G 1 11を意味し、 5番目の Xa aは N l eを意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 30 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 1 1番目の Xa aは N 1 eを意味し、 13番目の X a aは Th iを意味する。
配列番号 31 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 1 1番目の Xa aは N 1 eを意味し、 13番目の Xa aは Ph gを意味する。
配列番号 32 : 1番目の X a aは p G 1 uを意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味し、 13番目の X a aは Py a (2) を意味する。
配列番号 33 : 10番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 34 : 3番目の X a aは Ad i (NH2) を意味し、 34番目の & aは N 1 eを意味する。
配列番号 35 : 3番目の X a aは Ly s (Ac) を意味し、 34番目の Xa a は N 1 eを意味する。
配列番号 36 : 35番目の X a aは N 1 eを意味する。 .
配列番号 37 : 1番目の Xa aは Z— pG l uを意味し、 8番目の X は L y s (Ac) を意味し、 1 1番目の X a aは N 1 eを意味する。 ' 配列番号 38 : 13番目の X a aは Me t (〇) を意味する。
配列番号 39 : 13番目の X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 40 : 1番目の Xa aは pG 1 uを意味し、 12番目の & 3は?11 e (C 1 ) を意味する。
配列番号 41 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し、 13番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 42 : 12番目の X a aは Na 1 (2) を意味する。
配列番号 43 1 1番目の Xa aは Na l (2) を意味する。
配列番号 44 13番目の Xa aは P h e (C 1 ) を意味する。
配列番号 45 1 1番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 46 1 1番目の X a aは C h aを意味する。
配列番号 47 1番目の X a aは p G 1 uを意味し、 1 1番目の Xa aは Ch aを意味する。
配列番号 48 13番目の Xa aは Ch aを意味する。
配列番号 49 1 5番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 50 10番目の X a aは N 1 eを意味し、 1 5番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 5 1 : 10番目の X a aは N 1 eを意味し. 5番目の X a aは Ty r (I) を意味する。
配列番号 52 : 10番目の X a aは N 1 eを意味し. 15番目の X a aは Ty r (Me) を意味する。
配列番号 53 : Xa aは Ph e (C I ) を意味する,
配列番号 54 : 13番目の X a aは C h aを意味し- 1 5番目の X a aは P h e (C 1 ) を意味する。
配列番号 55 : X a aは P h e (C 1 ) を意味する(
配列番号 56 : 10番目の Xa aは Ch aを意味し, 番目の X a aは P h
e (C 1) を意味する。
配列番号 57 : 10番目の X a aは Ch aを意味し 、 12番目の X a aほ P h e (C 1 ) を意味する。
配列番号 58 : Xa aは Ch aを意味する。
配列番号 59 : 10番目の X a aは C h aを意味し 、 12番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 60 : Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する
配列番号 6 1 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し 、 1 1番目の X a aは C h aを意味する。
配列番号 62 : 1番目の X a aは p G 1 uを意味し、 13番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 63 : X a aは Ch aを意味する。
配列番号 64 , 65 : 10番目の Xa aは Ch aを意味し、 12番目の Xa a は P h e (C I ) を意味する。
配列番号 66 : X a aは N 1 eを意味する。
配列番号 67 : X a aは Ch aを意味する。
配列番号 68 : Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 72 : Xa aは Me t (O) を意味する。
配列番号 73 : Xa aは Ly s (A r g -A r g) を意味する。
配列番号 78 : X a aは p G 1 uを意味する。
配列番号 80 : Xa aは Ph e (C I ) を意味する。
配列番号 8 1 , 82 : Xa aは pG l ιιを意味する。
配列番号 84 : Xa aはNa l (2) を意味する。
配列番号 85 : X a aは p G 1 uを意味する。
配列番号 87 : 1番目の X a aは p G 1 uを意味し、 12番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 88 : X a aは C h aを意味する。
配列番号 89 : 10番目の Xa aは Ch aを意味し、 1 1番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 90 : X a aは p G 1 uを意味する。
配列番号 91 : 1番目の X a aは p G 1 uを意味し 3番目の X a akN a
1 (2) を意味する。
配列番号 92 : X a aは N a 1 (2) を意味する。
配列番号 93〜96 : Xa aは pG l uを意味する
配列番号 97 : 1番目の X a aは p G 1 uを意味し 2番目の Xa aは Ch aを意味する。
配列番号 98 : 1番目の Xa aは pG l uを意味し 2番目の X a aは N a
1 (2) を意味する。
配列番号 1 0 0 : X a aは p G 1 tiを意味する。
配列番号 1 0 1 : Xa aは Ch aを意味する。
配列番号 1 0 2 : X a aは p G 1 uを意味する。
配列番号 1 0 3 : X a aは NM e 2を意味する。
配列番号 1 04 : X a aは Mo rを意味する。
配列番号 1 0 5 , 106 : X a aは P h e (C I ) を意味する。
配列番号 1 0 7 : 9番目の Xa aは N— Me A 1 aを意味し、 12番目の Xa aは P h e (C I ) を意味する。
配列番号 108, 109, 1 10 : 10番目の X a aは Ch aを意味し、 1 2 番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 1 1 1 : 10番目の Xa aは Ch aを意味し、 1 1番目の Xa aは P y nを意味する。
配列番号 1 12 : 10番目の Xa aは Ch aを意味し、 12番目の Xa aは P y nを意味する。
配列番号 1 13 : 1 3番目の Xa aは Ch aを意味する。
配列番号 1 14 : 3番目の Xa aは Ly s (Me) 2を意味する。
配列番号 1 1 5 : 7番目の X a aは L y s (Me) 2を意味する。
配列番号 1 16 : 6番目の X a aは D a pを意味し、 10番目の Xa aは Ch aを意味し、 1 2番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。 '
配列番号 1 1 7 : 6番目の X a aは D a p (Ac) を意味し、 10番目の: a
— aは Ch aを意味し、 1 2番目の Xa aは Ph e (C I ) を意味する。 .
配列番号 1 18 : 6番目の X a aは D a p (C 6) を意味し、 10番目 'の X a aは Ch aを意味し、 12番目の & &は?116 (C 1 ) を意味する。 , 配列番号 1 19 : 6番目の X a aは D a p (Ad i ) を意味し、 1 0番目の X a aは Ch aを意味し、 12番目の Xa aは Ph e (C 1 ) を意味する。
配列番号 120〜: L 24 :合成 DNA