CN1323167C

CN1323167C - 1型胎盘生长因子的突变蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1323167C
Application number: CNB038112043A
Authority: CN
Inventors: D·马格里奥纳; M·巴蒂斯蒂; E·孔蒂; G·萨尔维亚; M·蒂西; A·米翁
Original assignee: GHEMONA SpA
Current assignee: GHEMONA SpA; Geymonat SpA
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2003-05-19
Publication date: 2007-06-27
Anticipated expiration: 2023-05-19
Also published as: KR20040111639A; RU2004137000A; HRP20041178B1; JP4230450B2; CN1653177A; ES2356360T3; JP2006508637A; US20050176634A1; AU2003234066B2; ATE488590T1; PL209955B1; EP1506295A2; PT1506295E; RU2344172C2; WO2003097688A3; DE60334986D1; EP1506295B1; WO2003097688A2; ZA200409943B; DK1506295T3

Abstract

本发明涉及化学稳定并具有取代或消除野生型蛋白质氨基酸序列中半胱氨酸残基的1型胎盘生长因子(PLGF-1)突变蛋白、它的制备、它在治疗和化妆品中的用途，以及含有所述衍生物的药物和化妆品组合物。本发明也涉及针对所述衍生物的抗体的产生，以及它们在诊断和治疗肿瘤和非肿瘤疾病方面的应用。

Description

1型胎盘生长因子的突变蛋白及其制备方法和应用

发明领域

本发明涉及稳定的1型胎盘生长因子(PLGF-1)突变蛋白、它的制备、它在治疗和化妆品中的用途，以及含有所述衍生物的药物和化妆品组合物。本发明也涉及针对所述衍生物的抗体的产生，以及它们在诊断和治疗肿瘤和非肿瘤病理方面的应用。

本领域描述

1型胎盘生长因子(PLGF-1)是促血管生成的同源二聚体糖蛋白。促血管生成活力与二聚体形式有关，因为单体形式不具有活力。编码PLGF-1蛋白质的多核苷酸完全序列以及它的多肽序列由Maglione和Persico在Pat.EP-B-0 550 519(WO-A-92/06194)中描述。

以上专利描述了一种在经可诱导表达系统修饰的细菌中生产PLGF-1的方法，所述方法涉及在诱导之后裂解细菌，并直接从裂解溶液中提取粗蛋白质。用这种方法获得的蛋白质表现出低水平的生物活力。

在专利申请PCT/IT02/00065中，Maglione等人描述了一种提取和纯化来自细菌表达的胎盘因子粗制品的方法。该方法涉及一系列的提取、复性和纯化步骤，这些步骤的综合使得获得主要二聚体形式(即最具有活性的形式)的纯化蛋白质成为可能。事实上，已知单体形式的蛋白质不具有生物活性，只有在复性成为二聚体形式后才能获得促血管生成功能。

然而，本发明者发现二聚体形式的蛋白质存在部分的不稳定，在储存或处理过程的水溶液中，会形成表现出低生物活性的多聚体形式，由于这一原因它不适合治疗用途，因为剂量和生物活性的不确定。

因此，本发明的目的是解决主要在保存于水溶液中所观察到的PLGF-1低的化学/生物稳定性难题。

发明概述

本发明基于以下的意外发现：多肽序列被修饰的天然PLGF-1蛋白质衍生物，特别是至少一个半胱氨酸残基被取代或消除后，化学稳定性表现出大大增加，而同时它们原初的生物活性保持基本不变。根据这一发现，本申请的第一目的是包含至少取代或消除含于野生型蛋白质多肽序列的9个半胱氨酸残基(Cys)之一的人或动物1型胎盘生长因子(PLGF-1)单体形式突变蛋白。所述取代或消除不会影响获得蛋白质生物活性形式所必需的二聚化过程，但是会阻止单体形式的多聚化。

在各种半胱氨酸残基中，已知消除或取代位于C末端部分的残基，特别是位于多肽全序列(即包括成熟的PLGF-1蛋白质和相应信号肽的序列)142位点的残基特别有效。在本发明优选的实施方案中，Cys142残基被甘氨酸残基(Gly)取代。这一取代产生了二聚化能力不变的PLGF-1单体形式突变蛋白，但是基本上不能产生多聚体。除了以上描述的修饰以外，本发明的突变蛋白可能包含进一步的消除、取代或增加一个或多个野生型蛋白质氨基酸，只要所述修饰并不改变突变蛋白本身的功能特征。

因此，本发明的第二目的是PLGF-1因子二聚体形式的突变蛋白，优选的是经过纯化而基本上只含有二聚体。所述突变蛋白可以是成熟蛋白质或包含位于N端部分的信号肽的蛋白质前体。

本发明进一步的目的是包含编码相应突变蛋白的DNA的核酸序列。该序列特征在于消除和修饰编码天然PLGF-1序列中半胱氨酸的TGC或TGT密码子。在本发明优选的实施方案中，相应于半胱氨酸残基的密码子被编码甘氨酸(Gly)的GGC、GGT、GGA或GGG密码子所取代。优选的是位于序列SEQ ID NO：1中382位点(TGC密码子)的胸腺嘧啶碱基(T)被鸟嘌呤(G)所取代，产生GGC密码子。

本发明进一步的目的是包含上述核苷酸序列的表达系统，所述核苷酸序列的两侧连接控制和调节表达的非翻译序列。这一系统能够在原核细胞中被诱导，优选的是细菌细胞。

表达处于可诱导启动子的控制之下，并且可以被合适的化合物所诱导。用以上表达系统修饰的宿主细胞也是本发明的目的。这些是原核细胞，优选的是如大肠杆菌之类的细菌细胞。本发明也包括产生核苷酸序列的方法，其中使用相对于野生型蛋白序列具有合适修饰的寡聚核苷酸作为引物，通过聚合酶链式反应(PCR)产生编码突变蛋白的DNA。优选的，SEQ ID NO：3寡聚核苷酸被用作5′到3′正向引物，SEQ ID NO：4寡聚核苷酸被用作5′到3′反向引物。

本发明进一步的目的是在宿主细胞中产生和提取突变蛋白的方法，其中被本发明表达系统修饰的宿主细胞(优选细菌)被培养于合适的培养基中，用合适的诱导子诱导蛋白的表达，分离细胞并裂解，从裂解混合物中提取突变蛋白。在发酵步骤中，并在诱导表达步骤之前，细胞被培养到培养基达到高的光学密度(O.D.)。随后通过加入合适的诱导试剂诱导蛋白质的表达。在随后的步骤中细胞被裂解，以向培养基中释放胞内物质，特别是核物质和包涵体，后者被溶解，通过这种方式获得的蛋白质被复性成二聚体形式。提取和纯化的方法可能包含纯化二聚体蛋白质的附加的选择性步骤。在优选的实施方案中此方法至少包括一个附加的使用离子交换或反相层析的纯化步骤。在进一步的实施方案中，此方法包括先使用阴离子交换层析，然后是反相层析。

使用本发明的生产、提取和纯化方法获得的突变蛋白至少含有98.5％的活性蛋白质，并且不超过1.5％的单体形式。活性形式主要由二聚体形式组成，并且只含有痕量的多聚体形式。稳定性测试表明了以二聚体形式为特征的突变蛋白在储存和加工过程中的稳定性。

附图描述

图1：此图表示PLGF-1CG以20mg/ml重新溶解于生理溶液，并在4-8℃储存40天后的SDS-PAGE电泳结果。该结果与溶解后立即电泳的突变蛋白电泳结果相比较。

(M)表示分子量参考；(1)表示PLGF-1CG(3微克)以20mg/ml的浓度溶解于生理溶液并被冷冻(对照)；(2)表示PLGF-1CG(3微克)以20mg/ml的浓度溶解于生理溶液并于4-8℃储存40天。

图2：此图以图的形式表示表2的数据。

图3：此图表示PLGF-1CG以0.2mg/ml溶解于Carbopol凝胶，并在4-8℃储存170天后的SDS-PAGE电泳结果。(M)表示分子量参考；(1)表示PLGF-1CG(2微克)以0.2mg/ml的浓度溶解于Carbopol凝胶，并于4-8℃储存170天；(2)表示PLGF-1CG(2微克)以0.2mg/ml的浓度溶解于Carbopol凝胶，并被冷冻(对照)。

图4：此图表示天然形式的PLGF-1以0.2mg/ml溶解于Carbopol凝胶，并在4-8℃储存150天后的SDS-PAGE电泳结果。(M)表示分子量参考；(1)表示PLGF-1(2微克)以0.2mg/ml的浓度溶解于Carbopol凝胶，并于4-8℃储存150天；(2)表示PLGF-1(2微克)以0.2mg/ml的浓度溶解于Carbopol凝胶，并被冷冻(对照)。

图5：此图是编码被命名为PLGF-1CG的PLGF-1突变蛋白的pET3PLGF1CG质粒构建方法的图示说明。

图6：此图表示野生型PLGF-1和PLGF-1CG突变蛋白在增加物质浓度的情况下的促血管生成活力。碱性成纤维细胞生长因子bFGF的活力被用作参考。

图7：此图表示PLGF-1CG突变蛋白对异丙肾上腺素(isoprenaline)引起的兔心脏组织缺血性损伤的效果。x轴表示治疗的天数，AUC值表示由每日ECG分数确定的曲线所包括的总面积。

序列表

SEQ ID NO：1表示无信号肽的野生型PLGF-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2表示天然PLGF-1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3序列表示用于PCR正向引物的寡核苷酸。

SEQ ID NO：4序列表示用于PCR反向引物的寡核苷酸。

发明详述

在专利BP-B-0 550 519中描述了149个氨基酸的人PLGF-1因子完全多肽序列，与包含编码PLGF-1因子的序列的1645核苷酸cDNA片段。含有此1645碱基的核苷酸序列的可自由获得的质粒已经保藏于ATCC，并且ATCC保藏号为40892。

编码蛋白质前体的序列被包含于322和768位点之间，并在此申请中被表示为SEQ ID NO：1。

前体蛋白质形式的野生型PLGF-1是N末端包含18个氨基酸信号肽的具有149个氨基酸的多肽。被限制于19到149位点的成熟蛋白质序列在此申请中被表示为SEQ ID NO：2。所述序列包含位于35、60、66、69、70、77、111、113和125位点的9个半胱氨酸(Cys)残基。

在本发明的突变蛋白中，至少有一个所述半胱氨酸残基被消除或被其它残基所取代，并且唯一的条件是该突变不会显著影响或消除单体形式的突变蛋白形成具有生物活性和治疗用途的二聚体形式。实验数据表明消除或取代的残基必须优选定位于蛋白质的C末端部分，适合本发明目的的最佳残基是125位点的残基。

野生型胎盘生长因子的突变蛋白可以通过使用文献中已知的聚合物合成技术合成产生。然而，优选的方法是在遗传修饰的宿主细胞中表达此蛋白质。为了这一目的，宿主细胞被转染引入一包含相应于PLGF-1基因并经适当修饰的插入片段的克隆和/或表达载体。

通过对相应于半胱氨酸密码子(即TGC或TGT)的位点专一性诱变和点突变，制备编码突变蛋白的DNA。这些突变可以是缺失或取代一个或多个碱基，而不引起突变下游的阅读框移动。因此，在缺失的情况下必须去掉一完整的密码子。优选的是，位点专一性突变是定点取代半胱氨酸密码子中的一个碱基，结果是形成一个新的密码子。在这种情况下突变将导致半胱氨酸残基被其它氨基酸残基所取代。

各种已知的位点专一性诱变技术可以被用来制备编码所需突变蛋白的cDNA。

举例说来，能够使用的方法有：利用寡核苷酸获得突变(Adelman等人，″DNA″2：183，1983)、PCR诱变(Leung等人，Technique 1：11-15，1989)或盒式诱变(Wells等人，Gene 34：315，1985)。

在本发明优选的实施方案中，使用通过聚合酶链式反应(PCR)的突变技术来合成突变体DNA。文献中描述的编码野生型PLGF-1因子的cDNA或通过简并遗传密码而获得的它的任何等价物被用作PCR模板。优选的是，只使用编码具有或不具有信号肽的甲硫胺酰化蛋白质N末端位置的部分；例如本申请中所报道的序列，如SEQ ID NO：1或它的等价物，包含于pET3P1GF-1表达载体中，相应于无信号肽蛋白质的序列。与编码蛋白质N末端部分的区域互补的5′-3′寡核苷酸(正向)，和与包含要被突变的半胱氨酸密码子的序列区域互补的5′-3′寡核苷酸(反向)被用作PCR引物。后一个寡核苷酸含有对引入突变所必要的一个或多个突变碱基。使用的引物可以在5′和/或3′末端区域相等的含有附加的碱基，以便引入适宜分离和纯化突变序列的限制性位点。

相应于半胱氨酸残基的密码子可以被任何编码中性氨基酸的密码子所取代，无论是如Ser、Thr、Gln或Asn之类的极性氨基酸，或如Gly、Ala、Val、Ile或Leu之类的非极性氨基酸。优选的氨基酸是Gly和Ala。

在优选的实施方案中，正向引物由被定义为SEQ ID NO：3的序列表示，而反向引物被序列SEQ ID NO：4表示。后者包含序列SEQ IDNO：1中382位点的T-＞G的取代，这一取代将位于SEQ ID NO：4序列125位点的半胱氨酸密码子TGC转变成相应于甘氨酸的密码子GGC。

合适的被修饰的cDNA随后被切割并插入到表达载体中，处于与宿主细胞兼容的合适的诱导系统控制下。

优选的是使用与原核细胞兼容的可诱导表达系统。这些系统的例子有：

pBAD表达系统(In vitrogen BV)，其中蛋白质的合成被置于araBAD启动子的控制之下，并可以使用阿拉伯糖在各种大肠杆菌菌株中被诱导；

T7表达系统(In vitrogen BV或Promega)，其中蛋白质的合成处于T7噬菌体RNA聚合酶启动子的控制之下，并且可以使用乳糖、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或它的衍生物或功能等价类似物诱导。在这种情况下必须使用大肠杆菌DE 3(B121(DE3)或JM109(DE3))衍生系，即包含一拷贝被置于乳糖诱导型启动子控制下的T7噬菌体RNA聚合酶基因的菌株；

Trc表达系统(In vitrogen BV)，其中蛋白质的合成被置于杂合启动子trc的控制之下。这一启动子是通过融合trp启动子和lac启动子而获得，并可以通过乳糖或它的相似等价物(IPTG)在各种大肠杆菌菌株中诱导。

Tac表达系统(Amersham biosciences)，其中蛋白质的合成被置于tac启动子的控制之下。在这一系统中，蛋白质的合成在大肠杆菌lacIq(JM105型)菌株中通过乳糖或它的相似等价物(IPTG)被诱导；

P_L表达系统，其中蛋白质的合成被置于P_L启动子的控制之下并可以通过加入色氨酸而被诱导。在这种情况下需要使用含有一拷贝处于色氨酸可诱导启动子控制之下的编码Lambda噬菌体cI阻遏子的基因的大肠杆菌衍生系(GI724)。

显然，可以在来自酵母或多细胞生物的真核宿主细胞中表达编码突变蛋白的修饰的cDNA。在这种情况下将选择与所述细胞兼容的表达系统。

在本发明优选的实施方案中，表达在T7噬菌体RNA聚合酶系统的控制下进行，并使用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导。

表达载体也包含编码克隆、筛选和表达所必需的正常功能的附加序列，如筛选标记和/或聚腺苷酸化位点和/或转录调节序列。

使用本领域技术人员所熟知的标准技术将含有编码所需突变蛋白的cDNA的表达载体转化入宿主细胞。这些细胞可以是原核细胞、真核细胞、动物、人或植物细胞，特别是细菌细胞，如大肠杆菌或芽孢杆菌，酵母细胞，如糖酵母，或动物细胞，如Vero、HeLa、CHO、COS。

将人PLGF-1突变蛋白基因整合到可商业获得的菌株[B12(DE3)pLysS](Promega Corporation USA)，从而获得优选的微生物。

用于产生本发明突变蛋白的被修饰细胞在使用前以冻干的形式被储藏，以保持它们的表达能力。在使用时，使用合适的缓冲液重新溶解冻干的材料。

然后，被修饰的宿主细胞被培养于液体培养基。虽然，大量的已知培养基是可商业获得的，并可以被有效的使用，本发明的发酵步骤优选在不含有任何来源于人或动物的材料的培养基中进行，以避免任何感染的危险。添加一种或多种合适的抗生素的酵母提取物(Difco)是这一方法最合适的培养基。发酵步骤之前可以进行一预接种步骤，其中冻干的微生物被悬浮于培养基，并经连续的孵育和稀释步骤，目的是在培养物中获得最大数量的微生物细胞。

在适合微生物的温度下(通常约37℃)，于以上培养基中进行发酵，溶解氧相对于空气饱和度的百分数介于20％到40％，优选的为30％。培养物中的pH保持在所用微生物所需的最佳值，通常会是中性或极轻微的酸性或碱性(6.4到7.4)。此外，如果发酵过程处于搅拌之中，则使用抗表面活性剂有利于发酵。

随着发酵进行，培养基光密度增加。因此，根据本发明，600nm处的光密度是用来监控此过程进度的参数。在表达被诱导的时候，培养物中的细胞和由此产生的光密度必须足够高，以确保表达的蛋白质的高产率。虽然600nm光密度(OD⁶⁰⁰)高于0.2已经可以被使用，根据使用的培养基可以获得达到50的光密度。优选的是密度超过18，以便获得高的突变蛋白产物水平。介于16到20的密度获得了最佳的结果。在达到这些光密度值之前，发酵一直被保持在上述条件，然后诱导蛋白的表达。

可以使用任何能够在所使用的微生物细胞中诱导异源突变蛋白表达机制的物质或理化条件。在一个特定的实施例中使用了用含有T7噬菌体启动子的表达质粒修饰的BL21(DE3)pLysS菌株，则用乳糖或它的衍生物，如合适浓度的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(即大约1mM)诱导表达。诱导的持续时间可以根据需要而变化。持续几小时获得了良好的结果，优选为3到4小时；在最佳方法中，诱导持续3小时20分钟，溶解氧百分比约等于10％。

在诱导前后取细胞样品，经SDS-PAGE电泳之类的对照分析技术测定诱导的结果。

当蛋白质的表达达到了所需的水平，则从培养基中分离细胞(例如经过离心)，再经提取。

提取过程有一最初的细胞溶解步骤。实际上，当突变蛋白在细菌中被表达时，它以包涵体的形式在宿主细胞中保持隔离状态。裂解过程可以使用冻/融、弗氏压碎器(French Press)、超声或类似的已知技术，在含有合适浓度的表面活性剂，优选为含有0.5％到1％浓度的Triton X100的裂解溶液中进行。当使用BL21(DE3)pLysS细菌菌株的时候，优选的是冻/融技术，在一最佳的实施方案中它被重复至少两个连续循环。

假如宿主细胞表达的PLGF-1突变蛋白以不具生物活性的单体形式释放到裂解介质中，则裂解之后即是复性步骤，至少包含部分单体的二聚体化。通过向稀释的溶液中加入适当浓度的氧化-还原对，并在10-30℃(优选为20℃)下搅拌10-30小时(优选为18-20小时)，从而获得突变蛋白的复性。这些氧化-还原对有：胱氨酸/半胱氨酸、胱胺/半胱胺、2-羟乙基二硫化物/2-巯基乙醇或氧化和还原型谷胱甘肽。后者为优选的试剂，并被使用，氧化形式的浓度为0.1到2.5mM(优选为0.5mM)，还原形式的浓度为0.25到6.25mM(优选为1.25mM)。

如果表达的PLGF-1突变蛋白以包涵体的形式释放到裂解介质中，则在复性步骤之前还有一溶解步骤。含有包涵体的部分被溶解于含有如尿素、异硫氰酸胍、盐酸胍之类的已知变性剂的变性缓冲液中。优选的变性溶液是含有变性浓度尿素(如8M)的溶液。将含有包涵体的部分进行匀浆或超声(sonication)有利于加速溶解过程。随后用变性缓冲液本身和/或稀释溶液将含有蛋白质的溶液稀释到280nm光密度约为0.5 OD²⁸⁰。合适的稀释缓冲液含有盐和聚乙二醇(PEG)，并且具有碱性pH(pH约为8)。

PLGF-1突变蛋白向裂解介质的释放通常伴随微生物的各种组分和胞内物质的释放，尤其是核物质，它会影响或干扰蛋白质的纯化过程。为了避免这些难题，直接来自细胞裂解的悬浮液/溶液可以经受附加的选择性和初级加工步骤，如使所述物质片段化。这一结果得自使用酶试剂，如DNAses(天然或重组的，如Benzonase)，化学试剂，如脱氧胆酸，或物理-机械试剂，如超声(sonication)、用叶片迅速搅拌(如使用搅拌器)的方法。DNA的物理片段化在适当体积的含有鳌合剂和去污剂(如EDTA和Triton X100)的洗涤溶液中进行，优选的是重复若干次的循环，并与稀释、离心和除去上清交替进行，以便除去含有包涵体部分中的各种细胞组分或物质。

虽然复性后的PLGF-1突变蛋白已经可以被直接使用，优选的是使用本领域技术人员所熟知的任何一种纯化蛋白质材料的技术进行至少一个纯化步骤。为此目的，突变蛋白可以经过凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、HPLC、反相层析和/或凝胶电泳。优选的技术是阴离子交换和反相层析。当有必要获得极度高水平的纯化时(例如适合治疗使用)，要依次结合至少两种以上提及的技术。

含有部分复性突变蛋白的溶液(即至少部分是以二聚体形式)可以上样到阴离子交换树脂，以便使混合物富集二聚体形式，并除去细菌污染物。任何可商业获得的适合阴离子交换层析的基质都可以被使用，只要它的容量、上样和流速特性与工业方法兼容。在一优选的实施方案中使用了一高流速树脂，如Q-sepharose Fast Flow(Amershambiosciences)或其等价物。所使用的树脂允许足够体积的蛋白质溶液被上样，具有从1∶1到10∶1变化的上样体积/柱体积比例。优选的是体积/体积接近10∶1的比例，因为这一点允许柱的使用最优化。整个层析过程可以通过由适当程序控制的计算机系统方便的自动操作，如FPCL Director Software系统(Amersham biosciences)。

在上述方法的一种改变中，部分复性的突变蛋白可以通过反相层析被纯化。

在这种情况下，含有被部分复性的突变蛋白(即部分是二聚体形式，部分是单体形式)的适当稀释的溶液可以被上样到任何商业可获得的适合所述用途的层析基质中。优选的是使用具有粒度测定的树脂，以保证最大化利用基质的吸收容量和柱本身的包装简易性。这些基质的例子有RP Source 15或RP Source 30树脂(Amersham biosciences)。所有的平衡、上样、树脂洗涤和洗脱溶液是含有不同比例有机溶剂的水-有机溶液。这些溶液的例子有包含乙醇、甲醇或乙腈的溶液。优选的是使用含有增加乙醇比例的水醇溶液。整个层析过程可以通过由适当程序控制的计算机系统方便的自动操作，如FPCL DirectorSoftware系统(Amersham biosciences)。

当依次使用两种或更多的纯化技术时，可以获得高纯化活性形式的突变蛋白，即蛋白质基本上是二聚体形式，不含任何单体形式的污染。用这一方法获得的产品含有不低于98.5％的活性形式，优选的不低于99.5％。残余的单体形式不超过1.5％。如果突变蛋白是化学稳定的，则所有的多聚产物被限定在痕量水平。根据上述方法获得的纯蛋白质可以经过进一步的加工步骤，如膜超滤。在这种情况下，产品经一过滤极限(截止点)低于或等于30KD的膜过滤，并用被TFA酸化的水进行透析，直到稀释比例达到1∶10⁶。用这种方式获得的终产物足以配以冻干辅料冻干以保持生物活力处于最佳水平。在本发明的实施方案中，可以根据纯化野生型PLGF-1蛋白质的国际专利申请PCT/IT02/00065(Geymonat)的纯化方法来适当的提取、分离和纯化突变蛋白质，如果需要，可以对操作条件进行改变。

已通过测试评估了本发明PLGF-1突变蛋白的化学稳定性，在测试中冻干的突变和野生型PLGF-1蛋白质被溶解于盐溶液或配成凝胶，于4-8℃分别储存40、170和210天。以下报导的结果清楚的表明活性二聚体形式的突变蛋白在各种分析浓度(20、5和1mg/ml)下都是稳定的，表现为突变蛋白没有沉淀或多聚化的趋向，事实上发现其浓度保持在初始值。相反，野生型蛋白质二聚体形式的浓度在仅仅经过几天后便猛烈下降。

本发明突变蛋白除了提高的化学/生物稳定性外，也表现出与野生型PLGF-1蛋白质相当的促血管生成活力。这一活力使本发明PLGF-1突变蛋白适合目前现有技术已知的天然PLGF-1的治疗和化妆品应用。

本发明PLGF-1突变蛋白的促血管生成作用已经被已知技术在体内或体外所测定。特别使用了Maglione等人描述的兔角膜血管生成测试或鸡尿囊绒膜(chorioallantoid membrane)血管生成测试(″IlFarmaco″，55，165-167(2000))。

另一个用来评估皮肤血管生成的方法是Streit等人描述的动物皮肤样本的计算机形态测量分析(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,December 21，96(26)，pages 14888-14893)。使用适于所用动物的抗CD31单克隆抗体免疫组化染色根据本发明处理或未处理的分离自实验动物的皮肤切片。在电子显微镜下分析用这种方法处理的切片，以评估每mm²的血管数目，它们的平均大小(dimensions)和所占有的相对面积。在Maglione等人描述的心脏缺血动物模型(前述)中评估了突变蛋白对心肌组织的促血管生成效果，特别是在缺血或心肌梗塞情况下的效果。

本发明突变蛋白对于治疗硬皮病的活力被评估于Yamamoto T等人描述的动物模型(Arch.Dermatol.Res.Nov.2000，292(11)，535到541页)。通过持续3周的每日皮下注射博来霉素(100mcg/ml)，在C3H小鼠中诱导出硬皮病症状。3周后动物被处死，处理区域的皮肤样本被用来组织分析。处理的效果突出了可以被归因于博来霉素诱导的皮肤硬化的组织事件，特别是皮肤加厚和高羟脯氨酸(hydroxiproline)水平。

以下报道的结果突出了本发明PLGF-1突变蛋白治疗一些区域的病理或天然衰退状态的效果，这些区域的改善涉及血管形成的增加。第一个应用是在缺血事件发生后对缺血和损伤的阻止或治疗。适合治疗的病症有心肌组织缺血、心肌梗塞、缺血性发作和慢性心肌疾病、脑缺血和缺血性发作、肠缺血、肢体外周缺血。第二个治疗应用是治疗硬皮病。这是一涉及微血管系统、皮肤、皮下结缔组织和内脏结缔组织的疾病。该疾病诱导成纤维细胞的激活以及胶原的过度产生和在组织和血管周围的沉积，这会导致纤维化和钙化区的严重形成，并因此表现出这一疾病所诱导的症状。特别是在毛细显微镜下可以看到大量硬化胶原围绕皮肤血管，限制管腔。涉及皮肤的局限性硬化症具有由于胶原储存过度和不足所导致的皮肤变硬和加厚的特征，因此其与进行性系统硬化症不同，在后者中血管与皮肤纤维化有关，并伴随对内脏造成损害的系统硬化。皮肤(主要是手指和手)看起来变硬、变厚并水肿。此疾病也在心机能不全中表现在心肌水平以及肺、胃肠、肾和骨骼肌系统水平。一些病人也发展成由皮肤纤维化诱导的侵蚀性关节病，这恶化了关节的移动性。Maglione等人根据野生型PLGF-1因子能够促进血管形成，特别是皮肤血管形成，报道了使用含有PLGF-1的组合物对新霉素诱导的小鼠硬化症的一般状况具有有利效果的治疗结果(意大利专利申请RM2002A000119)。在先前被诱导成硬化症并被本发明突变蛋白所治疗的动物中也观察到了同样的结果。

第三个治疗应用是烧伤、溃疡、内脏或皮肤受伤的治疗支持性恢复过程，特别是处于术后阶段。

本发明进一步的应用涉及治疗皮肤老化的典型现象。当考虑到过长的暴露于阳光(光老化)、其它类型的辐射或刺激性的环境/气体试剂而导致的皮肤组织过早老化时，这一治疗(虽然主要考虑为化妆品)便具有治疗的含义。

在电子显微镜下对光损伤皮肤样本的检查揭示出典型的微血管形态，其特征是毛细血管被病态的扩大并被弹性蛋白缠绕或被浓密的无定形物质所包围。在天然和早老性皮肤中都发现刺激皮肤血管生成会对负责皮肤弹性(tone)和厚度的胞外基质产生调节作用。增加的毛细血管纤维化伴随成纤维细胞的增加和新胶原的产生，随之而来的是皮肤外观的整体改善。

本发明化合物的进一步应用涉及脱发。

改善皮肤血管生成的作用(特别是在毛囊区域)伴随皮肤附属物(头发、体毛等)生长的调节，即阻止脱发并促进它的再生。再生阶段(相应于头发生长阶段)伴随毛囊血管的自然增加。局部的血管发生行为促进了血管的增加并导致了毛发的生长。用本发明组合物处理的动物接近毛囊的皮肤切片的计算机形态测量分析显示不仅发腔的尺度和发密度有所增加(因此总的毛囊血管生成有所增加)，而且毛球的尺度和毛发的直径也有所增加。

阻止脱发并促进再生的作用不仅可以被用于自然脱发，也可以用于重大的慢性状况如秃头症、激素紊乱、化疗、放疗和药物使用。

以上的治疗应用涉及直接、系统或局部施用PLGF-1因子突变蛋白。而本发明突变蛋白也可被用于生产抗体，多克隆、单克隆或能够识别内源PLGF-1生长因子的功能活性片段，特别是包含PLGF-1和受体的结合位点的氨基酸序列区域。

这种类型的抗体能够中和PLGF-1的血管生成活力并且被用于治疗所有以病态血管生成为特征的病症。这些病症的例子有炎性病症(如类风湿性关节炎)或哮喘、水肿、肺动脉高压和肿瘤组织的形成和发展。这些抗体本身可以被用作在定性和定量测定内源PLGF-1产生的方法中的免疫诊断试剂。这些试剂应用于与PLGF-1异常产生相关的所有病态状况，如肿瘤组织的形成和发展。

根据本领域技术人员所熟知的技术(如申请WO-A-01/85796中所描述的制备专一于野生型PLGF-1蛋白质的抗体的技术)制备了识别PLGF-1突变蛋白的抗体或抗体片段。

本发明也涉及含有以上描述的突变蛋白或相应中和抗体作为活性试剂或诊断试剂的药物组合物。

根据本发明可以使用任何适合系统或局部施用的配方。特别是，PLGF-1因子可以经肠胃外施用而获得系统或局部的效用，或局部施用于皮肤或粘膜主要产生局部效果。虽然也可以通过腹膜内或肌肉内施用，系统的效果主要通过静脉内施用获得。局部效果是通过局部、肌肉内、皮下、关节间肠胃外施用获得。PLGF-1突变蛋白也可以通过离子电泳作用的电转移在局部水平施用。当需要持续一段时间的延迟释放时，可以使用皮下植入物。该因子也可以被口服，虽然考虑到活性产品的脆弱本性，这一方法并不被强烈推荐。

系统或局部肠胃外施用的组合物包括溶液、悬浮液、脂质体悬浮液、W/O或O/W乳剂。局部使用的组合物包括溶液、洗液、悬浮液、脂质体悬浮液、W/O、O/W、W/O/W、O/W/O乳剂，凝胶、软膏、霜剂、润发油(pomade)和糊剂。在优选的实施方案中，活性物质与适当的冻干辅料混和，以冻干的形式被配制，并易于使用药物可接受的稀释剂再溶解。可以使用的冻干辅料有：缓冲剂、多糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、多肽、氨基酸和任何与活性物质兼容的其它辅料。在本发明优选的实施方案中，活性物质以一定的量溶解于磷酸缓冲液(NaH₂PO₄/H₂O-Na₂HPO₄/2H₂O)，以致于冻干后突变蛋白与磷酸的比例介于1∶1到1∶2。适于肠胃外用途的稀释剂有：水、盐溶液、糖溶液、水-醇溶液、油性稀释剂、polyoils(如甘油、乙二醇或聚丙二醇)，或任何与施用方法在无菌性、pH、离子强度和粘度方面兼容的其它稀释剂。

在乳剂或悬浮液的情况下，所述组合物可以含有通常用于配制药物的适当非离子、两性离子、阴离子或阳性离子型表面活性剂。对于肠胃外/系统用途优选的是亲水的O/W或W/O/W乳剂，而局部或表面施用优选的是亲脂的W/O或O/W/O乳剂。

此外，本发明的组合物可以含有一些选择性辅料，如等渗试剂(如糖或多元醇)、缓冲剂、鳌合剂、抗氧化剂、抗菌剂。

表面使用的组合物包括液体或半固体形式。前者包括溶液或洗液。这些可以是水性的、水-醇性的(如乙醇/水)或醇性的，并通过溶解冻干物质获得。

可另选的是，活性物质的溶液可以通过添加已知的凝胶试剂，如淀粉、甘油、聚乙二醇或聚丙二醇、聚(甲基)丙烯酸、异丙醇、羟基硬脂酸、CARBOPOL，而配制成凝胶。

其它形式的表面(topical)使用的组合物有润发油、糊剂和霜剂形式的乳剂或悬浮液。优选的是W/O乳剂，因为它们能提供快速吸收。亲脂性赋形剂的例子有：液体石蜡、无水羊毛酯、白色凡士林、十六烷醇、十八烷醇、植物油、矿物油。增加皮肤渗透性，以便于吸收的试剂可以被有利的使用。这些试剂的例子有生理可接受的辅料，如聚乙烯醇、聚乙二醇或二甲亚砜(DMSO)。

用于表面组合物的其它辅料有等渗试剂，如糖类或多元醇、缓冲剂、鳌合剂、抗氧化剂、抗菌剂、增稠剂、分散剂。

局部或系统使用的能持续一段时期延迟释放的组合物可以被同等的使用，这些组合物包括聚合物，如聚乳酸、聚(甲基)丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素和其它本领域已知的物质。也可以使用皮下植入物形式的缓慢释放的组合物，如基于聚乳酸或其它生物可降解聚合物的。

虽然活性物质自身已经是稳定的并且优选的是以冻干的形式被包装，但是药物组合物可以有利的包含附加的活性二聚体形式的PLGF-1突变蛋白的稳定物质。这些物质的例子有：半胱氨酸、半胱胺或谷胱甘肽。

突变蛋白的剂量依赖于给药途径和所选择的配方。肠胃外给药的量从1mcg/Kg/天到500mcg/Kg/天变化，优选的是从10mcg/Kg/天到200mcg/Kg/天。这些给药通过每单位剂量包含50mcg到30mg的药物组合物来实现，优选的是每单位剂量约500mcg到10mg。用于表面治疗的数量从每克组合物0.1mg到10mg变化被证明为有效的。治疗皮肤衰老或脱发的局部化妆品组合物，优选的为每克组合物包含0.01mg到0.09mg活性物质。

治疗持续的时间根据病理或所需要的效果而变化。在治疗硬皮病的情况下，根据病理的严重性，应用时间从1天到12月变化。在治疗自然或过早的皮肤老化时，应用时期从1到400天变化，优选的为至少30天。在治疗脱发或促进头发再生的情况下，应用时期也从1到400天变化。

以下通过实施例的方式描述本发明，其目的仅仅是示例而不是限制。

实施例1：

编码突变蛋白的cDNA的合成

PLGF-1突变蛋白(我们称为PLGF-1CG)，是通过将胸腺嘧啶(T)N°382(序列SEQ ID NO：1)突变成鸟嘌呤(G)而产生。通过这种方式，编码半胱氨酸的TGC密码子(上述序列的382-384核苷酸)被转变成编码甘氨酸的GGC。

从氨基酸位点来看，PLGF-1CG突变蛋白中突变成甘氨酸的半胱氨酸位于序列SEQ ID NO：2的125位点。

为了合成编码突变蛋白的DNA，应用了PCR(聚合酶链式反应)技术。编码无信号肽的甲硫胺酰化PLGF-1蛋白质(EP-A-0 550 519)的表达载体pET3PLGF1被用作PCR模板。事实上这是不具有开始的18个氨基酸(信号肽)并在位点1为甲硫胺酸(N端)的野生型PLGF-1蛋白质(SEQ ID NO：2)。用作引物的寡核苷酸如下：

寡核苷酸1(正向引物)，具有序列5′-CTGGCG CATATGCTGCCTGCTGTGCCC-3′。这包含一NdeI位点(下划线)和一起始密码子(斜体)；

寡核苷酸2(反向引物)，具有序列5′-GGTTACCTCCGGGGAACAGCATCGCCGC CCC-3′。这包含一个将编码半胱氨酸的TGC密码子转变成编码甘氨酸的GGC密码子(斜体)的T->G突变(下划线并斜体表示的核苷酸)。

用BioRad Gene Cycler完成PCR后获得的核苷酸链经过完全反应(填补空缺)，随后用限制性酶NdeI消化。按照标准操作，获得的具有NdeI/“平”末端的片段被克隆进原核表达载体pET3的相应NdeI/“平”末端。通过这种方式创造了编码已知为PLGF-1CG的PLGF-1突变蛋白的质粒pET3PLGF1CG。

按照已知技术，用这一质粒转化大肠杆菌[B12(DE3)pLysS]菌株(Promega Corporation USA)，产生[B12(DE3)pLysS PLGF-1CG]宿主菌株。用于这一质粒的构建技术概述于图5。

实施例2：PLGF-1CG突变蛋白的产生、抽提和纯化。

微生物[B121(DE3)pLysS PLGF-1CG]被培养在发酵罐中，用作培养基的溶液SBM包含：

溶液A(每升)

Bacto酵母提取物(Difco) 34g

硫酸胺 2.5g

甘油 100ml

H₂O 适量至：900ml

溶液B(10X)(每100ml)

KH₂PO₄ 1.7g

K₂HPO₄-3H₂O 20g

或

K₂HPO₄ 15.26g

H₂O 适量至：100ml

溶液A和B在使用时以无菌形式被混合。

通过1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达。

发酵之前有一预接种步骤。取一试管冻干的微生物，悬浮于1mlSBM+100μg/ml氨苄青霉素+34μg/ml氯霉素，悬浮液被进一步稀释并于37℃孵育一夜。在用添加氨苄青霉素和氯霉素的同样的SBM溶液稀释之后，预接种物被分入4个Erlenmeyer烧瓶。

每一个Erlenmeyer烧瓶的内容物于37℃孵育24小时。混和4个烧瓶的内容物并读取OD⁶⁰⁰值，在水中稀释成1/20(50μl+950μl水)。

确定体积量的预接种物在无菌试管中于7,500xg、4℃离心10分钟。细菌被重新悬浮于每升含20ml SBM+200ug/ml氨苄青霉素+10ug/ml氯霉素的发酵液中，于420rpm(室温)搅拌20分钟。

发酵在37℃、含有200ug/ml氨苄青霉素、10ug/ml氯霉素的SBM溶液中进行，并含有适当量的消泡剂，溶解O₂为30％，pH值介于6.4到7.4。

当培养基达到600 nm光密度(OD⁶⁰⁰)介于16-20单位时开始诱导。

使用1mM IPTG作为诱导试剂，诱导时存在10％的溶解氧(相当于空气饱和度)。诱导持续约3小时。通过SDS-PAGE检验诱导，上样20μl经预煮的诱导前后的溶液。

随后含有被诱导细菌的培养基在4℃于7,500xg被离心10分钟，或3000xg离心25分钟，弃去上清。

随后裂解细菌细胞，并抽提和纯化包涵体。细菌的裂解是通过在-80/37℃的两次冻/融循环而完成，裂解液含有1mM Mg₂SO₄+20mMTris-HCl(pH8)+1％Triton X100。

裂解混合物在搅拌下(250 RPM)于室温孵育30分钟，然后倒入一适当容量的搅拌器，用一定量的含有0.5％triton X100+10mM EDTApH 8的洗涤溶液稀释，每450 OD⁶⁰⁰的细菌相对于3ml。

必要的话，每毫升样品中加入0.4μl未稀释的消泡剂。

在最大速度混合溶液1分钟，或直到样品均匀。搅拌器的内容物被转移到一适当容量的容器中，每OD⁶⁰⁰450的细菌用6.5ml洗涤溶液充分稀释，用此法得到的悬浮液于25℃、13,000xg离心45分钟，弃上清。

完全的洗涤方法被重复若干循环，直到最终获得含有表达的蛋白质的包涵体沉淀。

接下来含有包涵体的沉淀被溶解于7ml BD变性缓冲液(8M尿素、50mM Tris pH 8、乙二胺20mM)，然后将溶液稀释到尿素终浓度为5M。通过加入还原型谷胱甘肽(终浓度为1.25mM)和氧化型谷胱甘肽(终浓度为0.5mM)，并在搅拌下于20℃孵育18-20小时，从而使蛋白质的复性在以这种方式获得的溶液中进行。

在孵育结束时期于20℃、10,000xg离心10分钟，并通过0.45或0.8μm的滤器过滤。

复性形式(即二聚体形式)的突变蛋白经阴离子交换层析纯化。

突变蛋白溶液被上样到缓冲液A(20mM盐酸乙醇胺，PH8.5)平衡的Q-sepharose Fast Flow树脂(Amersham-biosciences)，洗涤之后用20％的缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl，相当于200mM浓度的NaCl)洗脱。

部分纯化的突变蛋白通过反相层析获得更高的纯度。为了这一目的用含有TFA和乙醇的溶液稀释离子交换层析的洗脱峰，以便样品被稀释1.5倍，并含有15％的乙醇和0.3％的TFA。这些物质的加入增加了突变蛋白与反相树脂的结合。

溶液被上样到用含有40％乙醇和0.1％TFA的溶液平衡的平均直径为15或30微米的RP Source树脂(Amersham-Bioscience)。洗涤溶液除去单体形式的突变蛋白，而二聚体形式在增加的乙醇梯度中被洗脱，直到达到70％的乙醇。

通过检测洗脱组分在280nm的吸收而监控层析纯化过程。

以这种方式获得的二聚体溶液被储存于-20℃，并随后按已知的技术超渗和冻干。

实施例3：携带Cys 125 Gly取代的PLGF-1CG突变蛋白的稳定性研究。

PLGF-1CG突变蛋白于20、5和1mg/ml的理论浓度溶解于盐溶液。同时，PLGF-1蛋白质(未经突变)以20mg/ml的浓度溶解于盐溶液。所有样品被储存于冰箱(4-8℃)达40天。

实际的浓度通过计算来自3个适当的独立稀释液的平均值而决定。使用的方法是波长在280nm的分光光度法，已知在一具有标准1cm光路的比色皿中，10D(光密度)的吸收相应于1mg/ml浓度的PLGF-1和PLGF-1CG。从实验的开始(表1中的0天)，到进行适当的稀释以测定浓度之前，每一样品的等分在ALC 4212微型离心机中于13,000rpm离心10分钟，上清被用于随后的分析。通过这种方式排除了可能的沉淀，因此结果只涉及保持在溶液中的蛋白质。

这一研究的结果表示于表1，它清楚的表明在所有的分析浓度(20、5和1mg/ml)下，突变蛋白至少在40天是稳定的(没有形成沉淀的趋向)，如此稳定以致于发现浓度保持在初始值。反之，与突变蛋白在相同条件下以20mg/ml的浓度储存的未突变蛋白质，在储存仅4天后仅有7.8％保留在溶液中。在12天之后这一值进一步下降(5.5％)。值得注意的是，甚至是在4-8℃储存24小时之后，已经可以看见未突变的PLGF-1蛋白质的大量沉淀。

表1

4-8℃下的保存时间(天)	平均浓度(mg/ml)
	平均浓度(mg/ml)								PlGF-lCG20mg/ml	S.D.	PlGF-1CG5mg/ml	S.D.	PlGF-1CG1mg/ml	S.D.	PlGF-120mg/ml	S.D.
	04122640	20.3819.6920.4620.7220.32	1.000.570.540.330.75	5.435.255.28N.A.N.A.	0.040.270.19	1.070.981.00N.A.N.A.	0.020.080.01	20.141.571.11N.A.N.A.	PlGF-lCG20mg/ml	S.D.	PlGF-1CG5mg/ml	S.D.	PlGF-1CG1mg/ml	S.D.	PlGF-120mg/ml	S.D.	0.180.100.01

S.D.＝标准差

N.A.＝未分析

PLGF-1CG突变蛋白的电泳图(单体-二聚体-多聚体组合物)(图1)在上述条件下也是充分稳定的。事实上，以20mg/ml溶解于盐溶液并冷冻(对照，图1泳道1)或储存于4-8℃达40天(样品，图1泳道2)的PLGF-1CG非还原条件下的SDS-PAGE电泳充分揭示出最小程度的变化，表现为极小量的单体部分的消失和极低量的三聚体的形成(小于二聚体的0.5％)。

实施例4：II配成凝胶的PLGF-1CG突变蛋白的稳定性研究PLGF-1CG突变蛋白和非突变的PLGF-1蛋白质以0.2mg/ml的浓度被溶解于如下组成的凝胶：

CARBOPOL 940＝ 1％P/V

醋酸钠(pH 4.4)＝ 15mM

EDTA non pHated二钠盐＝ 0.04％P/V

对羟基苯甲酸甲酯＝ 0.05％P/V

使用NaOH/醋酸将pH调到介于5.5到6。

两凝胶被储存于4-8℃。在各时间点取出两凝胶的一部分(两份)(约0.2ml)，在分析天平上称重。

称重的样品被加入体积(以微升表示)相当于所述凝胶部分重量(以毫克表示)的非还原性2x样品缓冲液。

振荡器振荡10分钟后，于13,000 rpm(ALC 4214微型离心机)进一步离心10分钟，回收上清。再次离心并取走新的上清。后者的一部分以及量化标准被非还原性SDS-PAGE电泳分析。染色后，使用光密度计分析电泳凝胶，以分析被分析样品的二聚体形式的浓度。

所得的各个时间点的结果，以及表述成相对于零时间点所存在的二聚体百分数被示于表2，并以曲线表示于图2。从这些数据可以看到，PLGF-1CG二聚体的数量保持稳定，直到170天的分析结束，而150天后，PLGF-1下降到了71％，210天后下降到了55％。

电泳图(单体-二聚体-多聚体组合物)也表示PLGF-1CG突变蛋白在上述条件下是十分稳定的(图3)。事实上，以0.20mg/ml溶解于carbopol胶并冷冻(对照，图3泳道2)或储存于4-8℃170天(样品，图3泳道1)的PLGF-1CG蛋白质非还原条件下的SDS-PAGE电泳并没有揭示出任何多聚化现象。反之，如图4所表示的，非突变的PLGF-1蛋白质的多聚化现象则显而易见(比较在4-8℃储存150天的泳道1蛋白质和冻存的泳道2蛋白质)。

表2

4-8℃下的保存时间(天)	％二聚体
	％二聚体		GEL PlGF-1CG(突变蛋白)	GEL PlGF-1
	03057119133150170210	100.00108.00N.A.N.A.98.70N.A.101.50N.A.	GEL PlGF-1CG(突变蛋白)	GEL PlGF-1	100.00N.A.83.4072.70N.A.71.10N.A.54.90

N.A.＝未分析

实施例5：PLGF-1CG突变蛋白的促血管生成活力评估

使用Maglione等人描述(前述″I1 Farmaco″)的鸡尿囊绒膜血管生成测试(CAM)比较了PLGF-1CG突变蛋白和野生型PLGF-1因子以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(作为阳性参照)的促血管生成活力。不同量的突变蛋白和野生型因子(介于0到3mcg/海绵)被1mm³明胶海绵所吸收，随后置于CAMs表面。12天后，与样品接触的CAM区被制成切片，并染色，使用已知为“点计数”的细胞形态技术定量促血管生成效果。特别的，CAM切片在具有144个交点的格子上，于显微镜下分析，结果被表示成被横切切片上毛细血管占据的交点的百分数(血管化面积的百分数)。示于图6的结果表明突变蛋白和野生型蛋白具有基本上相等的促血管生成活力。

实施例6：PLGF-1CG突变蛋白对异丙肾上腺素诱导的心脏缺血疗效的评估

根据Maglione等人关于野生型因子的描述(前述)，在异丙肾上腺素诱导的缺血动物模型上评估了PLGF-1CG突变蛋白对心脏缺血和梗塞的疗效。实验在兔子上进行，从第1至5天，它们每天被静脉内施用单次160mcg/Kg剂量的突变蛋白或仅仅是相等体积的赋形剂。在第1和第2天皮下施用异丙肾上腺素。通过检查，与突变蛋白治疗的动物相比，在仅使用赋形剂治疗的动物中，心电图(ECG)的典型特征表明主要缺血性损伤(如T波倒置、S波变宽和Q波突出)无疑更加明显。治疗和未治疗动物的ECG变化以0到6的点刻度被评估，如下所述：0表示无损伤；1表示S波突出；2表示T波突出；3表示T波下行段的下降；4表示S波变宽；5表示T波倒置；6表示Q波突出。同样也计算5天的测试中治疗和未治疗动物ECG点所定义的曲线下的总面积。结果被示于图7，它表明用PLGF-1CG突变蛋白治疗的动物在缺血性损伤方面有显著的降低。心电图强调的结果被缺血组织宏观和显微的观察所证实。与在用赋形剂治疗的动物的心脏组织中观测到的相比，所述检查表明缺血性损伤的存在以及严重性被缓和的组织改变。

实施例7：PLGF-1 CG突变蛋白对新霉素诱导的硬皮病疗效的评估。

在此研究中使用了Yamamoto等人描述的动物硬皮病模型(前述)。

第一组C3H小鼠被连续3周每日皮下注射博来霉素(100mcg/ml)处理。另3组C3H小鼠也被类似处理，但是增加了每日分别注射0.1、1和10mcg/ml的PLGF-1CG突变蛋白。在处理3周后，处死动物并取下处理区域的皮肤样本进行组织分析。用1和10mcg/ml的PLGF-1CG(而不是0.1mcg/ml)的治疗效果表现出可以被归于博来霉素诱导的皮肤硬化症的组织事件的显著减少。特别是相对于只被博来霉素处理的小鼠，皮肤加厚和羟脯氨酸水平显著降低。

实施例8：药物组合物

i)肠胃外施用溶液：

含有25mg纯PLGF-1CG和33mg磷酸缓冲剂(10mgNaH₂PO₄/H₂O和23mg Na₂HPO₄/2H₂O)的58毫克冻干的突变蛋白，以及约125ml肠胃外施用盐溶液被分别包装于小药瓶中，以便能在使用前立即用稀释液混和冻干产品。溶解后产生的活性物质的浓度约为0.2mg/ml。

ii)凝胶形式的表面组合物：

20ml含有20％DMSO的10％乙醇、水-醇溶液中溶入含10mg活性物质的冻干物质。溶液被加入含如下成分的适当凝胶赋形剂：1％Carbopol 940、乙酸钠15mM(pH 4.4)、0.04％p/v EDTA二钠、0.05％p/v对羟基苯甲酸甲酯(最终pH为5.5到6)。

序列表

<110>Geymonat S.r.L.

<120>1型胎盘生长因子的突变蛋白及其制备方法和应用

<130>BW285R

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>418

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(10)..(408)

<223>不具有编码野生型蛋白信号肽的DNA的序列。核苷酸10-408编码EP 0 550 519的权利要求1中所描述蛋白质的19-149氨基酸。

<400>1

ctggcgcat atg ctg cct gct gtg ccc ccc cag cag tgg gcc ttg tct gct 51

Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala

1 5 10

ggg aac ggc tcg tca gag gtg gaa gtg gta ccc ttc cag gaa gtg tgg 99

Gly Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp

15 20 25 30

ggc cgc agc tac tgc cgg gcg ctg gag agg ctg gtg gac gtc gtg tcc 147

Gly Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser

35 40 45

gag tac ccc agc gag gtg gag cac atg ttc agc cca tcc tgt gtc tcc 195

Glu Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser

50 55 60

ctg ctg cgc tgc acc ggc tgc tgc ggc gat gag aat ctg cac tgt gtg 243

Leu Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val

65 70 75

ccg gtg gag acg gcc aat gtc acc atg cag ctc cta aag atc cgt tct 291

Pro Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser

80 85 90

ggg gac cgg ccc tcc tac gtg gag ctg acg ttc tct cag cac gtt cgc 339

Gly Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg

95 100 105 110

tgc gaa tgc cgg cct ctg cgg gag aag atg aag ccg gaa agg tgc ggc 387

Cys Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly

115 120 125

gat gct gtt ccc cgg agg taa cccaggatcc 418

Asp Ala Val Pro Arg Arg

130

<210>2

<211>132

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn

1 5 10 15

Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg

20 25 30

Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr

35 40 45

Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu

50 55 60

Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val

65 70 75 80

Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp

85 90 95

Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu

100 105 110

Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala

115 120 125

Val Pro Arg Arg

130

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增人类PLGF-1蛋白质所用的正向引物

<400>3

ctggcgcata tgctgcctgc tgtgccc 27

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>扩增人类PLGF-1蛋白质所用的反向引物

<400>4

ggttacctcc ggggaacagc atcgccgccc c 31

Claims

1.单体形式的人或动物1型胎盘生长因子(PLGF-1)突变蛋白，其特征在于它至少涉及野生型蛋白质多肽序列中位于蛋白质前体多肽序列142位点的Cys残基的取代或消除，其中所述142位点的Cys残基相应于SEQ ID NO：2中125位点的半胱氨酸，所述取代或消除并不会影响具生物活性的二聚体的形成，但是会阻止所述单体形式的多聚化。

2.根据权利要求1的突变蛋白，其特征在于142位点的Cys残基被甘氨酸残基(Gly)所取代。

3.根据权利要求1的突变蛋白，其特征在于其以蛋白质前体或成熟蛋白质形式存在。

4.根据权利要求1的突变蛋白，其中野生型蛋白质被进一步消除、取代或增加一个或多个氨基酸，而不改变突变蛋白的功能特征。

5.二聚体形式的权利要求1的突变蛋白。

6.根据权利要求5的突变蛋白，其至少含有98.5％的二聚体形式。

7.根据权利要求5或6的突变蛋白，用于治疗方法。

8.根据权利要求7的突变蛋白，用于治疗缺血性疾病。

9.根据权利要求8的突变蛋白，用于治疗心肌组织缺血、心肌梗塞、缺血性发作和慢性缺血性心肌疾病、脑缺血和缺血性发作、肠缺血、肢体外周缺血。

10.根据权利要求7的突变蛋白，用于治疗硬皮病。

11.根据权利要求7的突变蛋白，用于治疗皮肤溃疡、外伤、烧伤、术后治疗。

12.根据权利要求7的突变蛋白，用于治疗自然的或过早的皮肤组织老化。

13.根据权利要求7的突变蛋白，用于治疗自然的或病理的脱发。

14.含有编码根据权利要求1的突变蛋白的DNA的核苷酸序列。

15.根据权利要求14的核苷酸序列，其特征在于编码野生型PLGF-1的序列中的TGC或TGT密码子被消除或修饰。

16.根据权利要求15的核苷酸序列，其中TGC或TGT密码子被GGC、GGT、GGA或GGG密码子取代。

17.根据权利要求16的核苷酸序列，其中序列SEQ ID NO：1中382位点的胸腺嘧啶碱基或由DNA简并性所导致的它的衍生物被鸟嘌呤碱基取代。

18.含有根据权利要求14-17中任一项的核苷酸序列的表达载体，其中所述核苷酸序列两侧具有控制和调节表达的非翻译序列。

19.根据权利要求18的表达载体，其特征在于它是在细菌细胞中可诱导的表达系统。

20.根据权利要求18的表达载体，其特征在于表达处于可诱导启动子的控制之下。

21.根据权利要求18的表达载体，其特征在于它是T7噬菌体RNA聚合酶表达系统，并且其表达是通过乳糖或异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的。

22.被根据权利要求18的表达载体转化的宿主细胞。

23.根据权利要求22的宿主细胞，其特征在于它是细菌细胞。

24.根据权利要求2 3的宿主细胞，其特征在于它来自于大肠杆菌菌株。

25.产生根据权利要求14到17中任一项的核苷酸序列的方法，其特征在于通过聚合酶链式反应(PCR)产生编码所述突变蛋白的DNA，其中使用相对于野生型核苷酸序列进行了适当修饰的寡核苷酸作为引物。

26.根据权利要求25的方法，其中寡核苷酸序列SEQ ID NO：3被用作5′-3′正向引物，寡核苷酸序列SEQ ID NO：4被用作5′-3′反向引物。

27.根据权利要求25的方法，其中编码无信号肽的PLGF-1蛋白质的DNA序列被用作聚合酶链式反应的模板。

28.根据权利要求25的方法，其中聚合酶链式反应获得的DNA序列经完全反应，再被适当的限制性酶消化，并克隆到合适的载体。

29.产生和提取PLGF-1因子的突变蛋白的方法，其特征在于根据权利要求22到24中任一项的宿主细胞被培养在合适的培养基中，使用适当的诱导子诱导蛋白表达，分离和裂解细胞，并从裂解混和物中提取突变蛋白。

30.根据权利要求29的方法，其中所述培养基包含一种或多种筛选试剂、酵母提取物、甘油和铵盐，并且不含来自动物或人的材料。

31.根据权利要求29的方法，其中在诱导表达步骤之前，培养细胞直至培养基在600nm的光密度(O.D.)介于0.2到50单位之间。

32.根据权利要求29的方法，其中使用乳糖或异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。

33.根据权利要求29的方法，其中使用冻融、弗氏压碎器或超声裂解细胞。

34.根据权利要求33的方法，其中在裂解过程中释放的包涵体通过至少两个循环的离心和适当缓冲液洗涤进行分离。

35.根据权利要求34的方法，其中包涵体被溶解于含有尿素、异硫氰酸胍或盐酸胍的变性缓冲液，并被匀浆或超声处理。

36.根据权利要求35的方法，其中包涵体被溶解后，溶液被稀释并通过向溶液中加入氧化-还原试剂，并在10-30℃下搅拌10-30小时从而使蛋白材料被复性成二聚体形式。

37.根据权利要求29的方法，包含至少一步二聚体蛋白质纯化步骤。

38.根据权利要求37的方法，其中纯化步骤由离子交换层析组成。

39.根据权利要求36的方法，其中来自复性步骤的溶液以上样体积与柱体积的比例介于1∶1到10∶1被上样到阴离子交换柱上。

40.根据权利要求38的方法，包含通过反相层析的柱纯化步骤。

41.根据权利要求29到40中任一项的方法，包含附加的超滤步骤，之后在具有或不具有适当辅料的情况下冻干。

42.能够识别根据权利要求1到8中任一项的突变蛋白的多克隆或单克隆抗体，它们能够与野生型PLGF-1交叉反应并中和它的促血管生成活性。

43.根据权利要求42的抗体，在治疗伴随PLGF-1产生异常的病理形式中作为中和内源PLGF-1的促血管生成活性的药物。

44.根据权利要求42的抗体，用于治疗肿瘤形式。

45.根据权利要求42的抗体，作为诊断伴随内源PLGF-1产生异常的病理形式的方法中的试剂。

46.含有根据权利要求5或6的突变蛋白或根据权利要求42的抗体和药物可接受的赋形剂的药物组合物。

47.根据权利要求46的药物组合物，其适合肠胃外、局部、口腔、鼻腔或植入使用。

48.含有根据权利要求5或6的突变蛋白和化妆品可接受的赋形剂的化妆品组合物。

49.制备根据权利要求47的药物组合物的方法，其中PLGF-1突变蛋白与药物可接受的赋形剂组合。

50.制备根据权利要求48的化妆品组合物的方法，其中将PLGF-1突变蛋白与化妆品可接受的赋形剂组合。