JP2006508637A - 胎盤成長因子１型の変異タンパク質、その調製方法及び応用 - Google Patents

Abstract

本発明は、野生型タンパク質アミノ酸配列のシステイン残基が置換又は脱離した１型胎盤成長因子（ＰＬＧＦ−１）の化学的に安定な変異タンパク質、その調製、治療及び化粧へのその使用、並びに前記誘導体を含む医薬組成物及び化粧組成物に関する。本発明は、同様に、前記誘導体に対する抗体の産生、並びに腫瘍及び非腫瘍の病態の診断及び治療へのそれらの使用にも関係する。

Description

本発明は、１型胎盤成長因子（ＰＬＧＦ−１）の安定な変異タンパク質、その調製、治療及び化粧への使用、並びに前記誘導体を含有する医薬組成物及び化粧組成物に関する。本発明は、同様に、前記誘導体に対する抗体の産生、並びに腫瘍及び非腫瘍の病態の診断及び治療へのそれらの使用にも関係する。

１型胎盤成長因子（ＰＬＧＦ−１）は、血管形成性のホモ二量体グリコプロテインである。血管形成活性は、二量体と関係し、単量体は不活性である。ＰＬＧＦ−１タンパク質をコードする完全なポリヌクレオチド配列及びそのポリペプチド配列は、Ｍａｇｌｉｏｎｅ及びＰｅｒｓｉｃｏの欧州特許第０ ５５０ ５１９号（国際公開第９２／０６１９４号）に記載されている。

上記特許は、誘導発現系を用いて改変された細菌中でＰＬＧＦ−１を産生する方法を記載している。この方法は、誘導後に細菌を溶解させ、溶解溶液からタンパク質原料を直接抽出するものである。このようにして得られるタンパク質は生物活性が低い。

細菌中での発現によって得られる胎盤因子原料を抽出し精製する方法は、Ｍａｇｌｉｏｎｅ等の特許出願ＰＣＴ／ＩＴ０２／０００６５号に記載されている。この方法は、抽出、再生及び精製の一連の過程を必要とし、全体として、純粋なタンパク質を本質的に二量体として、すなわち、その最も活性な形として得ることができる。このタンパク質の単量体は生物学的に不活性であり、二量体に再生後初めて血管形成機能を獲得することが実際に知られている。

しかし、本発明者らは、二量体タンパク質がやや不安定であり、保存中又は加工中に、生物活性のより低い多量体を水溶液中で生じることを認めた。このため、二量体タンパク質は、用量及び生物活性が不確かになるので治療用途にはあまり適切ではない。

したがって、本発明の目的は、主に水溶液中で保存したときに認められるＰＬＧＦ−１の不十分な化学的／生物学的安定性の問題を解決することにある。

本発明は、そのポリペプチド配列が改変された、具体的には、少なくとも１個のシステイン残基が置換され又は脱離した天然のタンパク質ＰＬＧＦ−１の誘導体が、極めて高い化学的安定性を示し、同時に、その本来の生物活性を本質的に変わらずに維持していることを予期せず発見したことに基づいている。この発見に鑑みて、本願の第１の目的は、野生型タンパク質のポリペプチド配列において、その中に含まれる９個のシステイン残基（Ｃｙｓ）の少なくとも１個の置換又は脱離を含む１型ヒト又は動物胎盤成長因子（ＰＬＧＦ−１）の単量体の変異タンパク質である。前記置換又は脱離は、その生物学的に活性な形のタンパク質を得るために必須な二量体化プロセスに影響を及ぼさないが、単量体の多量化を阻止する。

様々なシステイン残基の中でも、Ｃ末端部分、具体的には完全なポリペプチド配列の１４２位にある残基の脱離又は置換、すなわち成熟ＰＬＧＦ−１タンパク質と対応するシグナルペプチドの両方を含むことが、特に有効であることが判明した。本発明の好ましい実施形態においては、Ｃｙｓ １４２残基は、グリシン残基（Ｇｌｙ）で置換される。この置換によって、二量体化能力が変わらないＰＬＧＦ−１単量体の変異タンパク質が産生されるが、基本的に多量体生成物が産生されることはない。上述の改変に加えて、本発明による変異タンパク質は、改変によって変異タンパク質自体の機能特性が変わらないことを条件に、１個又は複数の野生型タンパク質アミノ酸の脱離、置換又は付加をさらに含むことができる。

したがって、本発明の第２の目的は、好ましくは本質的に二量体のみを含むように精製された、ＰＬＧＦ−１因子の二量体変異タンパク質である。前記変異タンパク質は、成熟タンパク質でも、Ｎ末端部分にシグナルペプチドを含むタンパク質前駆体でも同様である。

本発明の別の目的は、適合する変異タンパク質をコードするＤＮＡを含むヌクレオチド配列である。この配列は、天然のＰＬＧＦ−１配列中のアミノ酸システインをコードするＴＧＣ若しくはＴＧＴコドンが脱離し、又は改変されたことを特徴とする。本発明の好ましい実施形態においては、システインに対応するコドンは、すべてアミノ酸グリシン（Ｇｌｙ）をコードするＧＧＣ、ＧＧＴ、ＧＧＡ又はＧＧＧコドンで置換される。グアニジン塩基（Ｇ）で置換されてＧＧＣコドンを生成するのは、配列番号１の配列の３８２位（ＴＧＣコドン）のチミジン塩基（Ｔ）であることが好ましい。

本発明の別の目的は、発現を制御し、調節する非翻訳配列が隣接した上記ヌクレオチド配列を含む発現系である。この系を、原核細胞、好ましくは細菌細胞中で誘導することができる。

発現は、誘導プロモーターの制御下にあり、適切な化合物によって誘導することができる。上記発現系を用いて改変された宿主細胞も本発明の目的である。これらは、原核細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞である。本発明は、ヌクレオチド配列を生成する方法も包含する。この方法においては、変異タンパク質をコードするＤＮＡは、野生型タンパク質配列が適切に改変されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される。配列番号３のオリゴヌクレオチドを５’−３’順方向プライマーとして使用し、配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを５’−３’逆方向プライマーとして使用することが好ましい。

本発明の別の目的は、変異タンパク質を産生し、抽出する方法である。この方法においては、本発明による発現系を用いて改変された宿主細胞、好ましくは細菌細胞を適切な培地中で培養し、タンパク質の発現を適切な誘導物質によって誘導し、細胞を単離して溶解させ、変異タンパク質をその溶解混合物から抽出する。発酵ステップ中、かつ発現ステップの誘導前に、培地の光学濃度（Ｏ．Ｄ．）が高くなるまで細胞を培養する。続いて、適切な誘導剤を添加してタンパク質発現を誘導する。後続ステップ中に、細胞を溶解して細胞内物質、具体的には核物質及び封入体を培地中に放出させ、後者を溶解し、このようにして得られたタンパク質を二量体に再生させる。抽出及び精製プロセスは、二量体タンパク質を精製するための追加の任意のステップを含むことができる。好ましい実施形態においては、このプロセスは、イオン交換又は逆相クロマトグラフィーによる少なくとも１つの追加の精製ステップを含む。別の実施形態においては、このプロセスは、最初の陰イオン交換クロマトグラフィー精製とそれに続く逆相クロマトグラフィーとを含む。

本発明による産生、抽出及び精製プロセスを用いて得られる変異タンパク質は、９８．５％以上の活性タンパク質と１．５％以下の単量体を含む。この活性型は本質的に二量体からなり、多量体をほんの微量しか含まない。安定性試験によれば、この二量体変異タンパク質に典型的な保存中及び加工中の高い安定性は明白である。

配列リスト：
配列番号１ シグナルペプチドのない野生型ＰＬＧＦ−１のヌクレオチド配列。
配列番号２ 天然のＰＬＧＦ−１のヌクレオチド配列。
配列番号３ ＰＣＲにおいて順方向プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド配列。
配列番号４ ＰＣＲにおいて逆方向プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド配列。

１４９アミノ酸のヒトＰＬＧＦ−１因子の完全なポリペプチド配列、及びＰＬＧＦ−１因子をコードする配列を含む１６４５ヌクレオチドのｃＤＮＡの断片は、欧州特許第０ ５５０ ５１９号に示されている。１６４５塩基のヌクレオチド配列を含む自由に入手可能なプラスミドは、ＡＴＣＣ登録番号４０８９２としてＡＴＣＣにも保存されている。

タンパク質前駆体をコードする配列は３２２位と７６８位の間に含まれており、本願ではそれを配列番号１で示す。

タンパク質前駆体の形態をした野生型ＰＬＧＦ−１は、Ｎ末端部分に１８アミノ酸のシグナルペプチドを含む１４９アミノ酸を有するポリペプチドである。１９位と１４９位で区切られた成熟タンパク質の配列を本願では配列番号２で示す。前記配列は、３５、６０、６６、６９、７０、７７、１１１、１１３及び１２５位に位置する９個のシステイン残基（Ｃｙｓ）を含む。

本発明による変異タンパク質においては、生物活性を与え治療上有用な二量体を生成する変異タンパク質単量体の能力に変異が大きな影響を及ぼさず、又はその能力を損なわないことのみを条件として、前記システイン残基の少なくとも１個が脱離し、又は別の残基で置換される。実験データによれば、脱離又は置換残基はタンパク質のＣ末端部分に好ましくは位置し、本発明では最適な残基は１２５位の残基である。

野生型胎盤成長因子の変異タンパク質は、文献公知のポリマー合成技術を用いた合成によって産生することができる。しかし、好ましい方法は、遺伝子改変された宿主細胞におけるタンパク質の発現である。このため、適切な改変後にＰＬＧＦ−１遺伝子に対応する挿入断片を含むクローニングベクター及び／又は発現ベクターを導入することによって、宿主細胞を形質転換する。

本発明による変異タンパク質をコードするＤＮＡの調製は、部位特異的変異誘発によって実施され、システインに対応するコドン、すなわちＴＧＣ又はＴＧＴにおける点変異を意味する。これらの変異は、変異の下流で読み枠の移動を起こさない１個又は複数の塩基の欠失又は置換となり得る。したがって、欠失の場合、完全なコドンを除外しなければならない。部位特異的変異は、システインコドン中の塩基の点置換であり、その結果、新しいコドンが形成されることが好ましい。この意味で、変異によって、システイン残基は別のアミノ酸残基で置換される。

様々な既知の部位特異的変異誘発技術を使用して、必要な変異タンパク質をコードするｃＤＮＡを調製することができる。

使用可能な方法は、例えば、オリゴヌクレオチドを用いて得られる変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎ等「ＤＮＡ」２：１８３、１９８３）、ＰＣＲ変異誘発（Ｌｅｕｎｇ等 Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１〜１５、１９８９）又はカセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓ等 Ｇｅｎｅ ３４：３１５、１９８５）である。

本発明の好ましい実施形態においては、変異ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による変異技術を用いて合成される。文献に記載された野生型タイプＰＬＧＦ−１因子をコードするｃＤＮＡ、又は遺伝コードの縮退によってもたらされるその任意の等価物をＰＣＲ用鋳型として用いた。シグナルペプチドを含んでも含まなくてもよいＮ末端位のメチオニル化（ｍｅｔｈｉｏｎｉｌａｔｅｄ）タンパク質をコードする部分のみを使用することが好ましい。例えば、シグナルペプチドを含まないタンパク質に対応する発現ベクターｐＥＴ３ＰｌＧＦ−１に含まれる本出願の配列番号１の配列又はその等価物である。タンパク質のＮ末端部分をコードする領域に相補的なオリゴヌクレオチド５’−３’（順方向）、及び変異されるシステインコドンを含む配列領域に相補的なオリゴヌクレオチド５’−３’（逆方向）をＰＣＲ用プライマーとして使用した。後者のオリゴヌクレオチドは、必要な変異を導入するのに必要な塩基置換を含む。使用するプライマーは、変異配列を単離し精製するのに適切な制限酵素切断部位を導入するための追加の塩基を５’及び／又は３’末端領域に均等に含むことができる。

システイン残基に対応するコドンは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎなどの極性でも、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕなどの非極性でも、任意の中性アミノ酸をコードするコドンで置換することができる。好ましいアミノ酸はＧｌｙ及びＡｌａである。

好ましい実施形態においては、順方向プライマーは、配列番号３として特定される配列であり、逆方向プライマーは配列番号４の配列である。後者は、配列番号１の配列の３８２位にＴ→Ｇ置換を含む。これは、配列番号４の配列の１２５位のシステインのＴＧＣコドンをグリシンに対応するＧＧＣコドンに変換する置換である。

適切に改変されたｃＤＮＡは、続いて切断され、宿主細胞に適合した適切な誘導系の制御下にある発現ベクターに挿入される。

原核細胞に適合した誘導発現系を使用することが好ましい。これらの系の例は、
タンパク質合成がａｒａＢＡＤプロモーターの制御下に置かれ、様々な菌株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でアラビノースを用いて誘導することができるｐＢＡＤ発現系（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ）；
タンパク質合成がファージＴ７に対するＲＮＡポリメラーゼプロモーターによって制御され、ラクトース、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、又はその誘導体、又は機能的に等価なその類似体（ａｎａｌｏｇｏｕｓ）を用いて誘導することができるＴ７発現系（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ又はＰｒｏｍｅｇａ）。この場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のタイプＤＥ３（Ｂｌ２１（ＤＥ３）又はＪＭ１０９（ＤＥ３））誘導体、すなわち、ラクトース誘導プロモーターの制御下に置かれたファージＴ７ Ｒｎａポリメラーゼ遺伝子のコピーを含む誘導体を使用する必要がある；
タンパク質合成がハイブリッドプロモーターｔｒｃの制御下に置かれたＴｒｃ発現系（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ）。このプロモーターは、ｔｒｐプロモーターをｌａｃプロモーターと融合させて得られ、様々な菌株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でラクトース又はそれに類似した等価物（ＩＰＴＧ）によって誘導することができる；
タンパク質合成がｔａｃプロモーターの制御下に置かれたＴａｃ発現系（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。この系においては、タンパク質合成は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃＩｑ（タイプＪＭ１０５）菌株中でラクトース又はそれに類似した等価物（ＩＰＴＧ）によって誘導される。
タンパク質合成がＰ_Ｌプロモーターの制御下に置かれ、トリプトファンを添加して誘導することができるＰ _Ｌ 発現系。この場合、トリプトファン誘導プロモーターの制御下で、ラムダファージのｃＩリプレッサーをコードする遺伝子のコピーを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）誘導体（ＧＩ７２４）を使用する必要がある。

酵母又は多細胞生物に由来する真核生物宿主細胞中で変異タンパク質をコードする改変ｃＤＮＡを発現可能であることは明白である。この場合には、前記細胞に適合する発現系が選択される。

本発明の好ましい実施形態においては、発現はＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ系の制御下で起こり、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドによって誘導される。

発現ベクターは、選択マーカー及び／又はポリアデニル化部位及び／又は転写制御配列などのクローニング、選択及び発現に必要な通常の機能をコードする追加の配列も含む。

したがって、宿主細胞は、当業者に周知の標準技術を用いて、必要な変異タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換される。これらの細胞は、原核生物細胞、真核生物細胞、動物細胞、ヒト細胞又は植物細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの細菌細胞、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母細胞、又はＶｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＣＯＳなどの動物細胞とすることができる。

好ましい微生物は、市販のヒトＰＬＧＦ−１変異タンパク質由来の遺伝子菌株［Ｂ１２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ］（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＵＳＡ）に組み込むことによって得られる。

本発明による変異タンパク質を産生させるために使用される改変細胞は、その発現能力を持続させるために、使用するまで凍結乾燥して保存される。使用時に、適切な緩衝剤を用いて凍結乾燥材料を再溶解させる。

次いで、改変宿主細胞を液体培地で培養する。多種多様な既知の培地が市販され、効果的に使用することができるが、本発明による発酵ステップは、あらゆる感染の危険性を回避するために、動物又はヒト起源のあらゆる材料を含まない培地中で実施されることが好ましい。１種又は複数の適切な抗生物質を添加した酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）は、このプロセスには最も適切な培地である。発酵ステップの前に、培養で最適量の微生物細胞を得るために、凍結乾燥微生物を培地に懸濁させ、引き続きインキュベーション及び希釈ステップにかける前接種ステップがある。

発酵は、上述の培地中で、微生物に適切な温度、通常約３７℃で、空気で飽和したときの２０％〜４０％、好ましくは３０％の溶存Ｏ_２の存在下で実施される。培養中のｐＨは、使用する微生物に対して最適な値に維持され、通常、中性又はほんのわずかに酸性又はアルカリ性（６．４〜７．４）である。また、発酵プロセスは撹拌下で実施されるので、抗界面活性剤（ａｎｔｉ−ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を使用することが有利である。

発酵が進むにつれ、培地の光学濃度が増加する。したがって、６００ｎｍにおける光学濃度は、プロセスの進行度をモニターするために本発明によって使用されるパラメータである。培養によって発現が誘導される時期に達した細胞、したがって光学濃度は、タンパク質が高収率で確実に発現されるように十分に高いものでなければならない。６００ｎｍの光学密度（ＯＤ^６００）が０．２よりも高ければ使用することができるが、使用した培地のために最高５０の光学密度を得ることが可能である。高い変異タンパク質産生レベルを得るためには１８を超える密度が好ましい。１６〜２０の密度が最適な結果をもたらした。次いで、発酵を、これらの光学濃度に達するまで上述の条件に維持し、次いで、タンパク質の発現を誘導する。

使用する微生物細胞において異種変異タンパク質発現機序をもたらし得るあらゆる薬剤又は化学的−物理的条件を使用することができる。Ｔ７ファージプロモーターを含む発現プラスミドを用いて改変した細菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを使用する特別な場合には、発現を、適切な濃度、すなわち約１ｍＭのラクトース、又はイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などその誘導体を用いて誘導する。誘導期間は要件に応じて変わり得る。良好な結果が数時間、好ましくは３〜４時間で得られた。最適プロセスにおいては、誘導は、約１０％の溶存Ｏ_２率で３時間２０分継続される。

誘導前及び誘導後に細胞試料を採取し、誘導の結果を明らかにするためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動などの対照分析技術にかける。

タンパク質の発現が、必要レベルに到達したときに、細胞を培地から、例えば遠心分離によって分離させ、抽出プロセスにかける。

抽出プロセスは、初期の細胞溶解ステップを見越したものである。実際、変異タンパク質が細菌中で発現されるときには、変異タンパク質は、宿主細胞内に封入体の形で隔離されたままである。溶解プロセスは、凍結／融解、フレンチプレス、超音波（超音波処理）、又は類似の既知の技術を用いて、適切な濃度の界面活性剤、好ましくは０．５％〜１％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む溶解溶液中で実施することができる。細菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを使用するときの好ましい技術は凍結／融解技術であり、最適実施形態においてはこれを少なくとも２サイクル連続して繰り返す。

宿主細胞によって発現されたままの、すなわち生物学的に不活性な単量体の形でＰＬＧＦ−１変異タンパク質が溶解培地に放出されることから、溶解後には、少なくとも部分的にはモノマーの二量体化にある再生ステップが続く。変異タンパク質の再生は、適切な濃度の酸化還元対をその希釈溶液に添加し、続いて温度１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃で撹拌下１０〜３０時間、好ましくは１８〜２０時間インキュベーションして行われる。これらの対の例は、シスチン／システイン、シスタミン／システアミン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド／２−メルカプトエタノール、又は酸化型及び還元型のグルタチオンである。後者は好ましい薬剤であり、酸化型は０．１〜２．５ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭの濃度で、還元型は０．２５〜６．２５ｍＭ、好ましくは１．２５ｍＭの濃度で使用される。

発現されたＰＬＧＦ−１変異タンパク質が封入体の形で溶解培地中に放出される場合、再生ステップは可溶化過程によって返還される。封入体を含む画分を、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンなどの既知の変性剤を含有する変性緩衝剤に溶解させる。変性用溶液は、変性濃度、例えば８Ｍの尿素溶液であることが好ましい。可溶化プロセスを促進するために、封入体を含む画分をホモジナイズ又は超音波（超音波処理）にかけることが有利なこともある。続いて、タンパク質を含有する溶液を、２８０ｎｍにおいて測定される光学濃度が約０．５ＯＤ^２８０に達するまで変性緩衝剤自体及び／又は希釈溶液で希釈する。適切な希釈溶液は、塩及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有し、そのｐＨはアルカリ性（ｐＨ約８）である。

溶解培地へのＰＬＧＦ−１変異タンパク質の放出は、通常、微生物からの様々な成分及び細胞内物質、なかでも核物質の放出を伴ない、タンパク質精製プロセスに影響を及ぼし、或いはタンパク質精製プロセスを妨害する恐れがある。この問題を回避するために、細胞溶解物から直接得られる懸濁液／溶液を、前記物質の断片化にあるさらなる任意かつ予備的な加工ステップにかけることができる。この結果は、ＤＮＡ分解酵素（天然、又はＢｅｎｚｏｎａｓｅなどの組換え）などの酵素薬剤、デオキシコール酸などの化学薬品、又は超音波（超音波処理）、例えばブレンダー中でのブレードによる高速撹拌などの物理的−機械的薬剤によって得られる。ＤＮＡの物理的断片化は、キレート化剤及び界面活性剤、例えばＥＤＴＡ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有する適切な体積の洗浄溶液中で実施され、好ましくは、封入体を含む画分からのあらゆる細胞成分又は物質を除去するために、希釈、遠心分離、及び上清の除去を交互に数サイクル繰り返す。

再生後のＰＬＧＦ−１変異タンパク質はそのまま使用することができるが、当業者に周知のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｃ）材料精製技術のいずれか１つを用いて少なくとも１回の精製ステップにかけることが好ましい。この目的で、変異タンパク質を、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィー及び／又はゲル電気泳動にかけることができる。好ましい技術は、陰イオン交換及び逆相クロマトグラフィーである。極めて高いレベルの精製、例えば治療用途に適切な精製を要するときには、上記技術の少なくとも２つを順次組み合わせる。

ある程度再生された、すなわち少なくとも一部は二量体の形の変異タンパク質を含有する溶液を、二量体を含み細菌汚染物質を含まない混合物を濃縮するために、陰イオン交換樹脂上に装入することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーに適切な任意の市販マトリックスを、その能力、負荷及び流速特性が工業プロセスに適合する程度に使用することができる。好ましい実施形態においては、高流動性樹脂、例えばＱ−セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は等価物を使用する。この樹脂を使用することによって、装入体積／カラム体積比１：１〜１０：１で十分な体積のタンパク質溶液を装入することが可能になる。カラムの使用を最適化できるので１０：１に近い体積／体積比が好ましい。クロマトグラフィープロセス全体を、適切なプログラム、例えばＦＰＣＬ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって制御されたコンピュータシステムによって自動的に有利に実行することができる。

上述したプロセスの変異体においては、ある程度再生された変異タンパク質を逆相クロマトグラフィーによって精製することができる。

この場合、ある程度再生された、すなわち一部は二量体であり一部は単量体である変異タンパク質を含有する適切に希釈された溶液を、例示した用途に適切な任意の市販クロマトグラフィーマトリックス上に装入することができる。マトリックス吸収能力の最適な利用とカラム自体の容易なパッキングとを確実にするような粒度分布（ｇｒａｎｕｌｏｍｅｔｒｙ）を有する樹脂を使用することが好ましい。これらのマトリックスの例は、樹脂ＲＰ Ｓｏｕｒｃｅ １５又はＲＰ Ｓｏｕｒｃｅ ３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。平衡用溶液、装入用溶液、樹脂洗浄用溶液及び溶出溶液はすべて、異なる割合の有機溶媒を含む親水性有機（ｈｙｄｒｏ−ｏｒｇａｎｉｃ）溶液である。これらの溶液の例は、エタノール、メタノール又はアセトニトリルを含む溶液である。高い割合のエタノールを含むアルコール水溶液を使用することが好ましい。逆相クロマトグラフィープロセス全体を、適切なプログラム、例えばＦＰＣＬ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって制御されたコンピュータシステムによって自動的に実行することが有利である。

２種類以上の精製技術を続けて使用するときには、変異タンパク質を、高い精製度の活性型で、すなわち本質的に二量体に含まれるタンパク質を含み、単量体によるコンタミネーションを含まずに得ることができる。このようにして得られた生成物は、９８．５％以上、好ましくは９９．５％以上の活性型を含む。残留単量体は１．５％以下である。変異タンパク質が化学的に安定であることから、全多量体生成物は極微量に制限される。上述した方法によって得られる純粋なタンパク質は、さらなる加工ステップ、例えば膜限外ろ過にかけることができる。この場合、生成物を、ろ過限界（カットオフ）が３０ｋＤ以下の膜でろ過し、希釈係数が１：１０^６になるまで、ＴＦＡで酸性を帯びた水によるダイアフィルトレーションにかける。このようにして得られる最終生成物は、生物活性を最適レベルで維持するために凍結乾燥添加剤及び凍結乾燥剤（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）とともに適切に処方することができる。本発明の実際的な実施形態においては、変異タンパク質を、適切に抽出し、単離し、野生型ＰＬＧＦ−１タンパク質を精製する国際特許出願ＰＣＴ／ＩＴ０２／０００６５号（Ｇｅｙｍｏｎａｔ）に記載された精製方法に従って必要に応じて操作条件を適合させて精製する。

本発明によるＰＬＧＦ−１変異タンパク質の化学的安定性を、凍結乾燥変異タンパク質及び野生型ＰＬＧＦ−１タンパク質を食塩水溶液に溶解させ、又はゲルに処方し、温度４〜８℃で４０、１７０及び２１０日間保存する試験によって評価した。以下に報告する結果は、その活性二量体の形の変異タンパク質が、分析したすべての濃度（２０、５及び１ｍｇ／ｍｌ）で安定であり、沈殿又は多量化し難く、実際、濃度は初期値のままであることが判明したことを明白に示している。これに対し、野生型タンパク質の二量体濃度はわずか数日で急激に減少した。

本発明による変異タンパク質は、化学的／生物学的安定性の向上とともに、野生型ＰＬＧＦ−１タンパク質のそれに匹敵する血管形成活性を示す。この活性によって、本発明によるＰＬＧＦ−１変異タンパク質は、従来技術から現在知られている天然ＰＬＧＦ−１のすべての治療用途及び化粧用途に適切である。

本発明のＰＬＧＦ−１変異タンパク質の血管形成作用は、インビボ又はインビトロで実施される既知の技術を使用して明らかになった。特に、Ｍａｇｌｉｏｎｅ等「Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ」、５５、１６５〜１６７（２０００）に記載されたウサギ角膜血管新生試験又はヒヨコ絨毛尿膜血管新生試験（ＣＡＭ）を用いた。

皮膚血管新生の評価に使用される第２の方法は、Ｓｔｒｅｉｔ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２１、９６（２６）、１４８８８〜１４８９３ページ）によって記述された動物皮膚試料のコンピュータ形態計測分析である。実験動物から単離され、本発明によって処理された皮膚切片、又は未処理の皮膚切片を、使用した動物のモノクローナル抗ＣＤ３１抗体を用いて免疫組織化学的に着色した。このようにして処理した切片を電子顕微鏡で分析して、ｍｍ^２当たりの血管数、それらの平均寸法、及びそれらが占める相対面積を評価した。心筋組織に対する変異タンパク質の血管形成効果、特に虚血又は心筋梗塞の場合における心筋組織に対する変異タンパク質の血管形成効果を、Ｍａｇｌｉｏｎｅ等（上記）によって記述された心臓虚血の動物モデルを用いて評価した。

強皮症の治療における本発明の変異タンパク質の作用を、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔ．等、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．Ｎｏｖ．２０００、２９２（１１）、５３５〜５４１ページに記載の動物モデルで評価した。強皮症の状態は、３週間毎日ブレオマイシン（１００ｍｃｇ／ｍｌ）を皮下注射したＣ３Ｈマウスにおいて誘導される。３週間後、動物を屠殺し、治療域から得た皮膚試料を組織学的分析にかける。治療の効果は、ブレオマイシンによって引き起こされる皮膚の硬化、特に、皮膚の肥厚及び高ヒドロキシプロリンレベルに起因し得る組織学的現象を明白にするものである。

以下に報告する結果によれば、関係する領域の血管新生が増加した後に改善されやすいすべての病理学的又は自然の変性状態の治療において、本発明によるＰＬＧＦ−１変異タンパク質の有効性は明白である。第１の適用例は、虚血、及び虚血現象後の損傷の予防処置又は治療処置である。処置が適切と考えられる病態は、心筋組織の虚血、心筋梗塞、虚血性発作（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｃｔｕｓ）及び慢性心筋疾患、脳虚血及び虚血性発作、腸の虚血、四肢末梢虚血である。第２の治療上の適用例は、強皮症の治療である。これは、微小血管系、皮膚及び皮下結合組織、並びに内蔵結合組織を含む疾患である。この疾患は、コラーゲンの繊維芽細胞及び過剰産生及び組織及び血管周囲付着の活性化を誘発し、線維症及び石灰沈着域形成の大きな一因となり、したがってその疾患によって引き起こされる症状が出現する大きな一因となる。特に、毛細血管顕微鏡検査法では、多量の硬化したコラーゲンが皮膚の血管を囲んで、血管管腔を拘束しているのを観察することができる。皮膚が関与する限局性強皮症は識別することができ、過剰及び不適切なコラーゲン付着による皮膚の硬化及び肥厚、並びに皮膚線維症と病変部が内臓に及ぶ全身性硬化症とに血管が関連する進行性の全身的な強皮症を特徴とする。皮膚、なかでも指及び手の皮膚には、硬化、肥厚化、むくみが認められる。この疾患は、心不全の心筋レベルでも、肺、胃腸、腎臓及び骨筋肉系のレベルでも現れる。一部の患者は、皮膚線維症によって引き起こされるびらん性の関節症にも罹る。これは、関節の動きを著しく悪化させる。Ｍａｇｌｉｏｎｅ他（伊国特許出願第ＲＭ２００２Ａ０００１１９号）は、野生型ＰＬＧＦ−１因子に関して、ＰＬＧＦ−１を含有する組成物による治療の結果、血管形成促進、特に皮膚における血管形成促進によって、マウスにおいてネオマイシンによって誘導される硬化症の一般的な状態に対して有益な効果がもたらされることを報告している。同じ結果が、強皮症の状態をあらかじめ引き起こし、本発明による変異タンパク質を用いて治療した動物でも認められた。

第３の治療適用例は、火傷、潰よう、内傷又は皮膚の傷の治癒プロセス、特に術後の治癒プロセスを補助する治療である。

本発明による別の適用例は、皮膚の老化に典型的な現象の治療に関係する。この治療は本質的に化粧と考えられるが、太陽光（老化）、他のタイプの放射、又は刺激の強い環境物質／大気物質に長時間曝されたために皮膚組織が早期に劣化したことを考慮すると治療上の意味合いもある。

光による損傷を受けた皮膚試料を電子顕微鏡で調べると、とりわけ、病的に拡大し、エラスチンで包まれた、又は高密度のアモルファス材料で包囲された毛細血管の存在によって特徴づけられる典型的な微小血管の形態が明らかになる。新しい皮膚血管新生の刺激によって、自然に老化した皮膚と早期に老化した皮膚の両方において、皮膚のはりと厚みをもたらす細胞外マトリックスに対して調節効果が得られることが認められた。毛細血管新生が増加すると、繊維芽細胞及び新しいコラーゲンの産生が増大して、皮膚の外観が全般的に改善される。

本発明の化合物の別の適用例は、脱毛に関係する。

実際、皮膚血管新生の改善、特に毛包周囲の皮膚血管新生の改善は、脱毛予防及びその再生促進の意味で皮膚付属器（頭髪、体毛など）の成長の変化を伴なう。毛髪の増殖期に相当する成長期（ａｎａｇｅｎｉｃ ｐｈａｓｅ）は、毛包の血管新生の自然増を伴なう。局所的血管形成作用によってこの血管の増加が促進され、その結果毛髪が成長する。本発明の組成物を用いて治療した動物の毛包の近位にある皮膚切片のコンピュータ形態計測分析によって、毛髪管腔の寸法及び毛髪密度が増加し、したがって毛包周囲の血管新生が全般的に増加するだけでなく、毛球の寸法及び毛髪自体の直径も増加することが判明した。

再生を促進させる脱毛防止効果は、天然の脱毛だけでなく、脱毛症、ホルモン障害、化学療法、放射線療法、医薬品投与などの臨床的に重要な状態に続く脱毛の場合にも利用することができる。

上で明らかになった治療上の効能は、ＰＬＧＦ−１因子の変異タンパク質の直接投与、全身投与又は局所投与に関係する。しかし、本発明の変異タンパク質は、内因性ＰＬＧＦ−１因子、具体的にはＰＬＧＦ−１の結合部位を含むアミノ酸の配列領域及び受容体を認識可能な抗体、ポリクローナル、モノクローナル又は機能的に活性な断片を産生させるために使用することもできる。このタイプの抗体は、ＰＬＧＦ−１の血管形成活性を中和し、病的血管形成を特徴とするすべての病態の治療に適用することができる。これらの病態の例は、リウマチ様関節炎などの炎症性障害、又は喘息、浮腫、肺高血圧症、並びに腫瘍組織の形成及び成長である。抗体自体を、内因性ＰＬＧＦ−１産生の定性方法及び定量方法における免疫診断薬として使用することができる。これらの試薬は、腫瘍組織の形成及び成長などＰＬＧＦ−１の異常産生を伴なうあらゆる病的状態の診断に適用される。

ＰＬＧＦ−１変異タンパク質を認識可能な抗体又はその断片は、当業者に周知の技術、例えば、野生型ＰＬＧＦ−１タンパク質に特異的な抗体の産生についての国際公開第０１／８５７９６号に記載されている技術に従って調製される。

本発明は、同様に、活性薬剤若しくは診断試薬として上記変異タンパク質、又は対応する中和抗体を含む医薬組成物にも関係する。

全身投与又は局所投与に適切なあらゆる処方を、本発明にしたがって使用することができる。特に、全身的若しくは局所的効果を有するＰＬＧＦ−１因子を非経口投与することができ、又は主に局所的効果を有するＰＬＧＦ−１因子を皮膚若しくは粘膜に局所的に投与することができる。全身作用は、主に静脈内投与によって得られるが、腹腔内投与又は筋肉内投与も可能である。局所的効果は、局所投与、又は筋肉内投与、皮下投与、関節間非経口投与によって得られる。ＰＬＧＦ−１変異タンパク質を、イオン泳動の電気輸送（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｒｔ）によって局所的レベルで同様に投与することができる。ある期間にわたる徐放性が必要なときには皮下埋込体を同様に使用することができる。ＰＬＧＦ−１因子の経口投与も可能であるが、活性生成物の性質が変わり易いことからあまり勧められない。

全身的又は局所的非経口用途の組成物には、溶液、懸濁液、リポソーム懸濁液剤、Ｗ／Ｏ又はＯ／Ｗエマルジョンなどがある。局所的用途の組成物には、溶液、ローション、懸濁液、リポソーム懸濁液、Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、Ｗ／Ｏ／Ｗ、Ｏ／Ｗ／Ｏエマルジョン、ゲル、軟膏、クリーム、ポマード、ペーストなどがある。好ましい実施形態においては、活性物質を、適切な凍結乾燥添加剤と混合した凍結乾燥体として処方し、治療上許容される希釈剤を用いて容易に再溶解することができる。使用可能な凍結乾燥添加剤は、緩衝剤、多糖、ショ糖、マンニトール、イノシトール、ポリペプチド、アミノ酸、及び活性物質に適合する他のあらゆる添加剤である。本発明の好ましい実施形態においては、活性物質を、凍結乾燥後の変異タンパク質／リン酸塩比が１：１〜１：２になるような量で、リン酸塩緩衝剤（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ２Ｏ−Ｎａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ）に溶解させる。非経口用途に適切な希釈剤は、水、食塩水溶液、糖溶液、アルコール水溶液、油状希釈剤、グリセリン、エチレン、ポリプロピレングリコールなどのポリオイル（ｐｏｌｙｏｉｌ）、又は無菌、ｐＨ、イオン強度及び粘度の点で投与方法に適合する他のあらゆる希釈剤である。

エマルジョン又は懸濁液の場合、組成物は、薬物処方に一般に使用される非イオン、双性イオン、陰イオン又は陽イオンタイプの適切な界面活性剤を含むことができる。親水性Ｏ／Ｗ又はＷ／Ｏ／Ｗエマルジョンは、非経口／全身用に好ましく、親油性Ｗ／Ｏ又はＯ／Ｗ／Ｏエマルジョンは局部又は局所用に好ましい。

また、本発明の組成物は、糖、ポリアルコールなどの等張剤、緩衝剤、キレート化剤、酸化防止剤、抗菌剤などの添加剤を任意に含むことができる。

局所用組成物は、液体又は半固体の形を含む。前者は、溶液又はローションを含む。これらは、水性、エタノール／水などの水アルコール、又はアルコール性とすることができ、凍結乾燥物質を溶解して得られる。

或いは、活性物質溶液を、でんぷん、グリセリン、ポリエチレン又はポリプロピレングリコール、ポリ（メタ）アクリレート、イソプロピルアルコール、ヒドロキシステアレート、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などの既知のゲル化剤を添加してゲルとして処方することができる。

局所用の他のタイプの組成物は、ポマード、ペースト及びクリームの形のエマルジョン又は懸濁液である。Ｗ／Ｏエマルジョンは、吸収が速いので好ましい。親油性賦形剤の例は、流動パラフィン、無水ラノリン、白色ワセリン、セチルアルコール、ステアリルアルコール、植物油、鉱物油である。吸収を促進するために皮膚透過性を増大させる薬剤を有利に使用することができる。これらの薬剤の例は、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの生理学的に許容される添加剤である。

局所組成物に使用される他の添加剤は、糖、ポリアルコールなどの等張剤、緩衝剤、キレート化剤、酸化防止剤、抗菌剤、増粘剤、分散剤である。

ある期間にわたって徐放性を有する局所又は全身用組成物を同様に使用することができ、これらには、ポリ乳酸、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー、及び当分野で既知の他の物質がある。例えば、ポリ乳酸又は他の生分解性ポリマーに基づく皮下埋込体の形の徐放性組成物も使用することができる。

活性物質は、それ自体すでに安定であり好ましくは凍結乾燥体にパックされるが、医薬組成物は、活性二量体の形のＰＬＧＦ−１変異タンパク質用安定化物質をさらに含むことが有利なこともある。これらの物質の例は、システイン、システアミン又はグルタチオンである。

変異タンパク質の投与量は、選択した投与経路及び処方によって決まる。非経口投与の場合、その量は１ｍｃｇ／Ｋｇ／日〜５００ｍｃｇ／Ｋｇ／日であり、好ましくは１０ｍｃｇ／Ｋｇ／日〜２００ｍｃｇ／Ｋｇ／日である。これらの投与は、単位用量当たり５０ｍｃｇ〜３０ｍｇ、好ましくは用量当たり約５００ｍｃｇ〜１０ｍｇを含む医薬組成物を用いて得られる。局所的な治療用途では、組成物１グラム当たり０．１ｍｇ〜１０ｍｇの量が有効であることが判明した。皮膚老化又は脱毛治療用の局所化粧組成物は、好ましくは組成物１グラム当たり０．０１ｍｇ〜０．０９ｍｇの活性物質を含む。

治療期間は、症状又は必要な効果によって変わる。強皮症の治療の場合、適用期間は、症状の重篤度に応じて１日〜１２ヶ月である。自然又は早期の皮膚老化の治療の場合、適用期間は１〜４００日、好ましくは少なくとも３０日である。脱毛防止又は毛髪再生促進の治療の場合、適用期間は、同様に１〜４００日である。

本発明を実施例によって以下に説明するが、その目的は単に説明のためであって、限定するためではない。

変異タンパク質をコードするｃＤＮＡの合成
本発明者らはＰｌＧＦ−１ＣＧと呼ぶＰｌＧＦ−１変異タンパク質を、チミジン（Ｔ）Ｎ°３８２（配列番号１）のグアニジン（Ｇ）への変異によって産生させた。このようにして、システインをコードする上記配列のＴＧＣコドン、ヌクレオチド３８２〜３８４を、グリシンをコードするＧＧＣに変換した。

アミノ酸からみると、変異タンパク質ＰｌＧＦ−１ＣＧのグリシンに変異したシステインは、配列番号２の１２５位である。

変異タンパク質をコードするＤＮＡを合成するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を利用した。シグナルペプチドのないタンパク質メチオニルＰｌＧＦ−１をコードする発現ベクターｐＥＴ３ＰＬＧＦ１（欧州特許公開第０ ５５０ ５１９号）をＰＣＲ用鋳型として使用した。実際、これは、第１の１８アミノ酸（シグナルペプチド）を含まず１位（Ｎ末端）のメチオニンを含む野生型ＰＬＧＦ−１タンパク質（配列番号２）である。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。

のオリゴ１（順方向プライマー）。これは、ＮｄｅＩ部位（下線部）及び開始コドン（太字）を含む。

のオリゴ２（逆方向プライマー）。これは、システインをコードするＴＧＣコドンを、グリシンをコードするＧＧＣコドン（太字）に変換した変異Ｔ→Ｇ（下線部と太字のヌクレオチド）を含む。

ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｅｒを用いて実施したＰＣＲ後に得られたヌクレオチド鎖を完了反応（ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（平滑化（ｆｉｌｌ−ｉｎ））に供し、続いて、制限酵素ＮｄｅＩを用いて消化する。得られたＮｄｅＩ／「平滑」末端を有する断片を、原核生物発現ベクターｐＥＴ３の対応するＮｄｅＩ／「平滑」末端に標準手順に従ってクローン化した。このようにして、ＰＬＧＦ−１ＣＧとして知られるＰＬＧＦ−１変異タンパク質をコードするプラスミドｐＥＴ３ＰＬＧＦ１ＣＧを作製した。

このプラスミドを既知の技術に従って使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）［Ｂ１２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ］菌株（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＵＳＡ）を形質転換し、宿主菌株［Ｂ１２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ＰＬＧＦ−１ＣＧ］を生成させた。

このプラスミドに使用した構築技術を図５に概説する。

変異タンパク質ＰＬＧＦ−１ＣＧの産生、抽出及び精製
微生物［Ｂｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ ＰＬＧＦ−１ＣＧ］を、培地として以下を含む溶液ＳＢＭを使用して発酵槽中で培養した。
溶液Ａ（１リットル当たり）
バクト（Ｂａｃｔｏ）酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ） ３４ｇ
硫酸アンモニウム ２．５ｇ
グリセリン １００ｍｌ
Ｈ_２Ｏ 適量（計９００ｍｌ）
溶液Ｂ（１０Ｘ）（１００ｍｌ当たり）
ＫＨ_２ＰＯ_４ １．７ｇ
Ｋ_２ＨＰＯ_４−３Ｈ_２Ｏ ２０ｇ
又は
Ｋ_２ＨＰＯ_４ １５．２６ｇ
Ｈ_２Ｏ 適量（計１００ｍｌ）

溶液Ａ及びＢを使用時に無菌の形で混合する。

ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）１ｍＭを用いて発現を誘導する。

発酵前に前接種ステップがある。凍結乾燥微生物の管を取り出し、ＳＢＭ１ｍｌ＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ＋クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌに懸濁させ、この懸濁液をさらに希釈し、３７℃で１晩インキュベートする。アンピシリン及びクロラムフェニコールを添加した同じＳＢＭ溶液で希釈した後、前接種液（ｐｒｅ−ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）を４個の三角フラスコに分割する。

各三角フラスコの内容物を３７℃で２４時間インキュベートする。４個の三角フラスコの内容物を混合し、ＯＤ^６００を読み取り、水で１／２０（５０μｌ＋９５０μｌ水）に希釈する。

次いで、確定した前接種液を無菌管中７，５００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離する。次いで、細菌を、発酵１リットル当たりＳＢＭ ２０ｍｌ＋アンピシリン２００μｇ／ｍｌ＋クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌ中に、室温で２０分間４２０ｒｐｍで撹拌して再懸濁させる。

発酵を、アンピシリン２００ｕｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌ及び適切な量の消泡剤を含有するＳＢＭ溶液中、温度３７℃で（３０％）溶存Ｏ_２の存在下ｐＨ６．４〜７．４で実施する。

培地の６００ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ^６００）が１６〜２０単位に達したときに誘導を開始する。

使用する誘導剤は、（空気飽和に対して）１０％溶存Ｏ_２の存在下でＩＰＴＧ １ｍＭである。誘導期間は約３時間である。あらかじめ沸騰させた誘導前溶液及び誘導後溶液２０μｌを装入して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を実施することによって誘導を制御する。

次いで、誘導された細菌を含む培地を７，５００ｘｇで１０分間、又は３０００ｘｇで２５分間４℃で遠心分離し、上清を廃棄する。

続いて、細菌細胞を溶解させ、封入体を抽出し、精製する。１ｍＭ Ｍｇ_２ＳＯ_４＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８＋１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含有する溶解溶液中で−８０／３７℃の凍結／融解を２サイクル実施して細菌を溶解させる。

この溶解混合物を撹拌（２５０ＲＰＭ）下室温で３０分間インキュベートし、次いで適切な能力のブレンダーに注ぎ、４５０ ＯＤ^６００の細菌当たり３ｍｌに等しい量の０．５％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８を含有する洗浄溶液で希釈する。

必要に応じて、試料１ミリリットルに対して０．４μｌの未希釈消泡剤を添加する。

この溶液を最大速度で１分間、又は試料が均一になるまで混合する。次いで、ブレンダーの内容物を適切な容量の容器に移し、４５０ ＯＤ^６００の細菌当たり６．５ｍｌの洗浄溶液で適切に希釈し、このようにして得られた懸濁液を２５℃で４５分間１３，０００ｘｇで遠心分離し、上清を廃棄する。

この洗浄プロセス全体を、発現されたタンパク質の封入体を含む最終ペレットが得られるまで数サイクル繰り返す。

この後、封入体を含むペレットを、変性緩衝剤ＢＤ（８Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２０ｍＭエチレンジアミン）７ｍｌに溶解させ、次いでその溶液を希釈して最終尿素濃度を５Ｍにする。このようにして得られた溶液に、還元型グルタチオン（最終濃度１．２５ｍＭ）及び酸化型グルタチオン（最終濃度０．５ｍＭ）を添加し、撹拌下２０℃で１８〜２０時間インキュベーションしてタンパク質を再生させる。

インキュベーション期間の最後に、２０℃で１０分間１０，０００ｘｇで遠心分離し、０．４５又は０．８μｍフィルターをとおしてろ過する。

再生された形、すなわち二量体の変異タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する。

この変異タンパク質溶液を、緩衝剤Ａ（２０ｍＭエタノールアミン−ＨＣｌ ｐＨ８．５）を用いて平衡にしたＱ−セファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に装入し、洗浄後、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭに相当する２０％緩衝剤Ｂ（緩衝剤Ａ＋１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出させる。

ある程度精製された変異タンパク質を、逆相クロマトグラフィーによってさらに高純度にする。このために、イオン交換クロマトグラフィー溶出ピークを、試料が１．５倍に希釈され１５％エタノールと０．３％ＴＦＡを含有するように、ＴＦＡとエタノールを含有する溶液で希釈する。これらの物質を添加すると逆相用樹脂に対する変異タンパク質の結合が強化される。

この溶液を、４０％エタノールと０．１％ＴＦＡを含有する溶液で平衡にした平均直径１５又は３０ミクロンのＲＰ Ｓｏｕｒｃｅ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に装入する。洗浄溶液によって変異タンパク質の単量体が除去されるのに対し、二量体はエタノールの割合が７０％に達するまでエタノール勾配を増加させると溶出する。

クロマトグラフィー精製プロセスを、溶出画分の２８０ｎｍにおける吸収を制御しながらモニターする。

このようにして得られる二量体溶液を−２０℃で保存し、続いてウルトラダイアフィルトレーションをして（ｕｌｔｒａｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）、既知の技術に従って凍結乾燥させる。

置換Ｃｙｓ １２５ Ｇｌｙを有するＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の安定性試験Ｉ
ＰｌＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質を食塩水溶液に理論濃度２０、５及び１ｍｇ／ｍｌで溶解させた。同時に（変異のない）ＰＬＧＦ−１タンパク質も食塩水溶液に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶解させた。すべての試料を冷蔵庫（４〜８℃）に最高４０日間保存した。

実際の濃度を、３個の適切な個別の希釈液から得られた値の平均を計算して求めた。使用した方法は、波長が２８０ｎｍであり、標準１ｃｍ光路のキュベットで測定して１ ＯＤ（光学濃度）の吸光度が濃度１ｍｇ／ｍｌのＰｌＧＦ−１及びＰｌＧＦ−１ＣＧに対応することが既知である分光測光法であった。実験開始（表１の時間０）後の期間、濃度を測定するために適切な希釈を行う前に、一定分量の各試料をＡＬＣ ４２１２マイクロ遠心分離器で１０分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を後続の分析に使用した。このようにして、沈殿剤をできるだけ除去し、その結果、タンパク質は溶液中にしか残留しなかった。

この試験の結果を表１に示す。変異タンパク質は、分析したすべての濃度（２０、５及び１ｍｇ／ｍｌ）で少なくとも最高４０日間沈殿し難く、濃度は初期値のままであり、安定であることは明白である。これに対し、変異タンパク質と同じ条件で濃度２０ｍｇ／ｍｌで保存した変異を含まないタンパク質は、わずか４日保存しただけで７．８％しか溶液中に残らない。この値は１２日後にはさらに低下する（５．５％）。４〜８℃で２４時間保存した後でさえ、変異を含まないＰＬＧＦ−１タンパク質の多量の沈殿がすでに見られることは重要である。

ＰｌＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の電気泳動プロファイル（単量体−二量体−多量体組成物）（図１）も上記条件下で実質的に安定である。実際、食塩水溶液に２０ｍｇ／ｍｌで溶解させ凍結させたＰｌＧＦ−１ＣＧタンパク質（対照、図１のライン１）、又は４〜８℃で４０日間保存したＰｌＧＦ−１ＣＧタンパク質（試料、図１のライン２）の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、ごくわずかの単量体部分の消失と、きわめて少量の三量体（二量体の＜０．５％）の形成とによって示されるほんの最小限の変化しか実質的に示さなかった。

ゲル処方のＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の安定性試験ＩＩ
ＰｌＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質及び非変異ＰＬＧＦ−１タンパク質を濃度０．２ｍｇ／ｍｌで以下の組成のゲル中に溶解した。
ＣＡＲＢＯＰＯＬ ９４０＝ １％Ｐ／Ｖ
酢酸ナトリウム ｐＨ４．４＝ １５ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ未調製（ｎｏｎ ｐＨａｔｅｄ）二ナトリウム塩＝０．０４％Ｐ／Ｖ
メチルパラベン＝ ０．０５％Ｐ／Ｖ

ＮａＯＨ／酢酸を用いてｐＨ５．５〜６にした。

２種類のゲルを４〜８℃で保存した。時間を変えて、２種類のゲルの一部（約０．２ｍｌ）を採取し、化学天秤で計量した。

計量した試料を、ゲル部分のミリグラム表示の重量に等しいマイクロリットル表示の体積の非還元性２ｘ試料緩衝剤とともに添加した。

１０分間ボルテックス撹拌し、さらに１０分間１３，０００ｒｐｍ（ＡＬＣ ４２１４マイクロ遠心分離器）で遠心分離した後、上清を取り出した。これを再度遠心分離して、新しい上清を取り出した。後者の一部を、定量標準とともに、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。着色後、電気泳動ゲルをデンシオメータ（ｄｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ）を用いて分析して、分析試料の二量体濃度を確認した。

異なる時間で得られ、時間ゼロに存在した二量体に対する二量体の割合として表した結果を表２及び図２のグラフに示す。このデータから、ＰｌＧＦ−１ＣＧ二量体の量が、分析した１７０日の最後まで一定であるのに対し、ＰｌＧＦ−１のそれは、１５０日後に７１％に、２１０日後に５５％に低下したことがわかる。

電気泳動プロファイル（単量体−二量体−多量体組成）から、ＰｌＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質は、上記条件下では実質的に黒い（ｓａｂｌｅ）ことも示された（図３）。実際、非還元条件において、ｃａｒｂｏｐｏｌゲルに０．２０ｍｇ／ｍｌで溶解させ凍結させたＰｌＧＦ−１ＣＧタンパク質（対照、図３のライン２）、又は４〜８℃で１７０日間保存したＰｌＧＦ−１ＣＧタンパク質（試料、図３のライン１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、多量化現象を何ら示さなかった。これに対し、これらの多量化現象は、図４（ライン１−４°〜８℃で１５０日間保存したタンパク質と、ライン２−凍結タンパク質を比較されたい）に示すように、非変異ＰｌＧＦ−１タンパク質では明白である。

ＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の血管形成活性の評価
野生型ＰＬＧＦ−１因子のＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の血管形成活性と、正の基準としての塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の血管形成活性を、Ｍａｇｌｉｏｎｅ等（「Ｉｌ Ｆａｒｍａｃｏ」上記）によってすでに記述されたヒヨコ絨毛尿膜血管新生試験（ＣＡＭ）によって比較した。異なる量の変異タンパク質及び野生型因子（０〜３ｍｃｇ／スポンジ）を１ｍｍ^３ゼラチンスポンジに吸収させ、続いてＣＡＭの表面に埋め込みした。１２日後、試料と接触しているＣＡＭ領域を切片にし、着色させ、「点計数」として知られる形態計測技術によって血管形成効果を定量した。具体的には、１４４個の交点を有するグリッド上でＣＡＭ切片を顕微鏡で分析し、その結果を、横断面上で毛細血管が占める交点の割合として表した（血管面積（ｔｈｅ ａｒｅａ ｔｈａｔ ｉｓ ｖａｓｃｕｌｉｓｅｄ）割合）。図６に示した結果によれば、変異タンパク質と野生型因子の血管形成活性は本質的に同じである。

イソプレナリンによって誘導される心臓虚血に対するＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の効果の評価
心臓の虚血及び梗塞に対するＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の効果を、野生型因子に関してＭａｇｌｉｏｎｅ等（上記）によって記述されたように、動物モデルにおいてイソプレナリンによって誘導された虚血について評価した。毎日１６０ｍｃｇ／Ｋｇの単一用量の変異タンパク質、又は同じ体積の賦形剤のみを１〜５日静脈内投与して処置したウサギで実験を行った。１日及び２日目にイソプレナリンを皮下投与した。Ｔ波の反転、Ｓ波の拡幅、Ｑ波の隆起など主要な虚血性損傷を示す心電図（ＥＣＧ）の典型的な特性は、試験変異タンパク質で処置した動物よりも、賦形剤のみで処置した動物において明らかに顕著である。処置動物及び未処置動物のＥＣＧの変化を、以下の０〜６の点数で評価した。０、病変なし；１、Ｓ波の隆起；２、Ｔ波の隆起；３、Ｔ波下行部の低下；４、Ｓ波の拡幅；５、Ｔ波の反転；６、Ｑ波の隆起。５日間の試験中のＥＣＧポイントによって定義される全曲線下面積も同様に処置動物及び未処置動物に対して計算された。結果を図７に示す。ＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質で処置した動物の虚血性損傷がかなり減少した。心電図プロファイルによって明らかなこの結果は、虚血組織の巨視的観察及び微視的観察によって確認された。前記試験は、賦形剤のみで処置した動物の心臓組織において観察されるものと比べ、程度が軽い虚血病変部及び組織変化が存在することを示している。

ネオマイシンによって誘導される強皮症に対するＰＬＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質の効果の評価
この試験では、Ｙａｍａｍｏｔｏ等（上記）によって記述された動物強皮症モデルを使用した。

第１のＣ３Ｈマウス群に、ブレオマイシン（１００ｍｃｇ／ｍｌ）を３週間毎日皮下注射した。他の３つのＣ３Ｈマウス群に、それぞれ０．１、１及び１０ｍｃｇ／ｍｌのＰｌＧＦ−１ＣＧ変異タンパク質を毎日の注射に添加した以外は上と同様に処置した。３週間の処理後、動物を屠殺し、治療域から皮膚試料を採取し、組織学的分析に供した。０．１ｍｃｇ／ｍｌではなく、１及び１０ｍｃｇ／ｍｌのＰｌＧＦ−１ＣＧによる処置の効果によって、ブレオマイシンによって誘導される皮膚硬化に起因し得る組織学的な現象がかなり低下した。特に、皮膚肥厚及びヒドロキシプロリンレベルは、ブレオマイシンのみで処置したマウスよりもかなり減少した。

医薬組成物
ｉ）非経口用溶液
非経口用の、純粋なＰＬＧＦ−１ＣＧ２５ｍｇとリン酸塩緩衝剤（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｈ２Ｏ １０ｍｇ及びＮａ２ＨＰＯ４／２Ｈ２Ｏ ２３ｍｇ）３３ｍｇを含む凍結乾燥変異タンパク質５８ミリグラム、及び食塩水溶液約１２５ｍｌを、凍結乾燥生成物を希釈剤と使用直前に混合できるように準備されたバイアルに別個に装入する。溶解後に得られた活性物質の濃度は約０．２ｍｇ／ｍｌである。

ｉｉ）局所用ゲル組成物
活性物質１０ｍｇを含有するある量の凍結乾燥物質を、２０％ＤＭＳＯを含む１０％エタノールアルコール水溶液２０ｍｌに入れる。次いで、その溶液を、以下の成分を含有する適切なゲル賦形剤とともに添加する。１％Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９４０、酢酸ナトリウム１５ｍＭ（ｐＨ４．４）、０．０４％ｐ／ｖ二ナトリウムＥＤＴＡ、０．０５％ｐ／ｖメチルパラベン。最終ｐＨ５．５〜６。

生理溶液に２０ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、４〜８℃で４０日間保存した後のＰＬＧＦ−１ＣＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動プロファイルである。そのプロファイルを、可溶化直後の変異タンパク質のプロファイルと比較する。（Ｍ）は基準分子量を示し、（１）は生理溶液に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶解させ凍結させたＰｌＧＦ−１ＣＧ（３マイクログラム）（対照）を示し、（２）は生理溶液に濃度２０ｍｇ／ｍｌで溶解させ４〜８℃で４０日間保存したＰｌＧＦ−１ＣＧ（３マイクログラム）を示す。 表２のデータをグラフ化したものである。 Ｃａｒｂｏｐｏｌゲルに０．２ｍｇ／ｍｌで溶解させ、４〜８℃で１７０日間保存した変異タンパク質ＰＬＧＦ−１ＣＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動プロファイルである。（Ｍ）は基準分子量を示し、（１）はＣａｒｂｏｐｏｌゲルに濃度０．２ｍｇ／ｍｌで溶解させ４〜８℃で１７０日間保存したＰｌＧＦ−１ＣＧ（２マイクログラム）を示し、（２）はＣａｒｂｏｐｏｌゲルに濃度０．２ｍｇ／ｍｌで溶解させ凍結させたＰｌＧＦ−１ＣＧ（２マイクログラム）（対照）である。 Ｃａｒｂｏｐｏｌゲルに０．２ｍｇ／ｍｌで溶解させ、４〜８℃で１５０日間保存した未変性ＰＬＧＦ−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のプロファイルである。（Ｍ）は基準分子量を示し、（１）はＣａｒｂｏｐｏｌゲルに濃度０．２ｍｇ／ｍｌで溶解させ４〜８℃で１５０日間保存したＰＬＧＦ−１（２マイクログラム）を示し、（２）はＣａｒｂｏｐｏｌゲルに濃度０．２ｍｇ／ｍｌで溶解させ凍結させたＰｌＧＦ−１（２マイクログラム）（対照）を示す。 ＰＬＧＦ−１変異タンパク質ＰＬＧＦ−１ＣＧをコードするプラスミドｐＥＴ３ＰＬＧＦ１ＣＧを構築する方法の概略図である。 物質濃度を増加させた野生型ＰＬＧＦ−１及び変異タンパク質ＰＬＧＦ−１ＣＧの血管形成活性を示す図である。塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦの活性を基準として示す。 イソプレナリンによって誘導されるウサギ心臓組織の虚血性損傷に対する変異タンパク質ＰＬＧＦ−１ＣＧの効果を示す図である。ｘ軸は、治療日数、及び毎日のＥＣＧスコアによって求められる曲線内の全面積であるＡＵＣ値を示す。

【配列表】

Claims (51)

1. ヒト又は動物の１型胎盤成長因子（ＰＬＧＦ−１）の単量体の変異タンパク質であって、野生型タンパク質ポリペプチド配列中の少なくとも１個のシステイン残基（Ｃｙｓ）の置換又は脱離を含み、前記置換又は脱離は、生物学的に活性な二量体の形成に影響を及ぼさないが、前記単量体の多量化を防止することを特徴とする変異タンパク質。
2. 前記置換又は脱離したＣｙｓ残基が、前記タンパク質ポリペプチド配列のＣ末端部分に位置することを特徴とする、請求項１記載の変異タンパク質。
3. 変異タンパク質が、配列番号２の１２５位にあるシステインに対応する、タンパク質前駆体ポリペプチド配列の１４２位にあるＣｙｓ残基の置換又は脱離を含むことを特徴とする、請求項２記載の変異タンパク質。
4. １４２位にある前記Ｃｙｓ残基がグリシン残基（Ｇｌｙ）で置換されたことを特徴とする、請求項３記載の変異タンパク質。
5. タンパク質前駆体又は成熟タンパク質の形態をした、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
6. 前記野生型タンパク質のさらに１個又は複数のアミノ酸が、前記変異タンパク質の機能特性を変えずに除去され、置換され、又は付加された、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
7. 二量体の形態をした、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質。
8. 少なくとも９８．５％の前記二量体を含む、請求項７記載の変異タンパク質。
9. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異タンパク質をコードするＤＮＡを含むヌクレオチド配列。
10. 前記野生型ＰＬＧＦ−１をコードする配列中のＴＧＣ又はＴＧＴコドンが脱離した、又は改変されたことを特徴とする、請求項９記載のヌクレオチド配列。
11. ＴＧＣ又はＴＧＴコドンがＧＧＣ、ＧＧＴ、ＧＧＡ又はＧＧＧコドンで置換された、請求項１０記載のヌクレオチド配列。
12. 配列番号１の配列、又は前記ＤＮＡの縮退によって生じるその誘導体の３８２位にあるチミジン塩基がグアニジン塩基で置換された、請求項１１記載のヌクレオチド配列。
13. 発現の制御及び調節のための非翻訳配列が隣接した、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む発現系。
14. 発現系が、細菌細胞中で誘導され得る発現系であることを特徴とする、請求項１３記載の発現系。
15. 前記発現が誘導プロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１２又は１４に記載の発現系。
16. Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ発現系であり、発現がラクトース、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、又は機能的に等価な類似体によって誘導されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の発現系。
17. 請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の発現系によって形質転換された宿主細胞。
18. 細胞が細菌細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞。
19. 細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株に由来することを特徴とする、請求項１８記載の細菌細胞。
20. 前記変異タンパク質をコードする前記ＤＮＡが、前記野生型ヌクレオチド配列を適切に改変したオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成されることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列の生成方法。
21. 配列番号３の配列のオリゴヌクレオチドを５’−３’（順方向）プライマーとして使用し、配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを５’−３’（逆方向）プライマーとして使用する、請求項２０記載の方法。
22. シグナルタンパク質を含まない前記ＰＬＧＦ−１タンパク質をコードする前記ＤＮＡ配列を、前記ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用する、請求項２１記載の方法。
23. 前記ポリメラーゼ連鎖反応において得られるＤＮＡ配列を完了反応に供し、次いで適切な制限酵素で消化し、適切なベクターにクローン化する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の宿主細胞を適切な培地で培養し、前記タンパク質の発現を適切な誘導物質を用いて誘導し、前記細胞を単離して溶解させ、前記変異タンパク質を前記溶解混合物から抽出することを特徴とする、前記ＰＬＧＦ−１因子の変異タンパク質の生成及び抽出方法。
25. 前記培地が、１個又は複数の選択剤、酵母抽出物、グリセリン及びアンモニウム塩を含み、動物又はヒト起源の材料を含まない、請求項２４記載の方法。
26. 前記発現誘導ステップの前に、前記培地の６００ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）が０．２〜５０単位に達するまで前記細胞を培養する、請求項２４又は２５に記載の方法。
27. ラクトース、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、又は機能的に等価な類似体を用いて発現を誘導する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記細胞溶解を凍結／融解、フレンチプレス、又は他の等価な技術によって実施する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 溶解中に放出された封入体を、遠心分離と適切な緩衝剤による洗浄との少なくとも２回のサイクルによって単離する、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記封入体を、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、又は他の変性剤を含有する変性緩衝剤中に溶解させ、場合によってはホモジナイズ又は超音波処理する、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記封入体の溶解後、溶液を希釈し、前記溶液への酸化還元剤の添加と、撹拌下１０〜３０時間、好ましくは１８〜２０時間で、温度１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃でのインキュベーションとによってタンパク質材料を二量体に再生する、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 二量体タンパク質精製の少なくとも１つのステップを含む、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記精製ステップがイオン交換クロマトグラフィーからなる、請求項３２記載の方法。
34. 前記再生ステップから得られる溶液を陰イオン交換カラム上に装入体積／カラム体積比１：１〜１０：１、好ましくは１０：１で装入する、請求項３２又は３３に記載の方法。
35. 逆相クロマトグラフィーによるカラム精製ステップを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
36. 追加の限外ろ過と、それに続く適切な添加剤の存在下又は非存在下での凍結乾燥を含む、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 治療処置方法に使用される、請求項７又は８に記載の変異タンパク質。
38. 虚血疾患の治療における、請求項３７記載の変異タンパク質。
39. 心筋組織の虚血、心筋梗塞、虚血性発作及び慢性虚血性心筋疾患、脳虚血及び虚血性発作、腸の虚血、四肢末梢虚血の治療における、請求項３８記載の変異タンパク質。
40. 強皮症の治療における、請求項３７記載の変異タンパク質。
41. 皮膚潰よう、傷、火傷の治療、術後治療における、請求項３７記載の変異タンパク質。
42. 皮膚組織の自然又は早期の老化の治療における、請求項３７記載の変異タンパク質。
43. 自然又は病的脱毛の治療における、請求項３７記載の変異タンパク質。
44. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異タンパク質を認識可能であり、前記野生型ＰＬＧＦ−１と交差反応可能であり、その血管形成活性を中和可能である、ポリクローナル、モノクローナル抗体、又はその機能的に活性な断片。
45. ＰＬＧＦ−１の異常産生を伴なう病態の治療において、内因性ＰＬＧＦ−１の血管形成活性を中和する医薬品としての請求項４４記載の抗体。
46. 各種の腫瘍の治療における請求項４４記載の抗体。
47. 内因性ＰＬＧＦ−１の異常産生を伴なう病態の診断方法における試薬としての請求項４４記載の抗体。
48. 請求項７若しくは８に記載の変異タンパク質、又は請求項４４記載の抗体、及び薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
49. 非経口、局所、経口、経鼻又は埋め込みに適切な請求項４８記載の医薬組成物。
50. 請求項７又は８に記載の変異タンパク質及び化粧料として許容される賦形剤を含む化粧組成物。
51. 請求項４８記載の医薬組成物又は請求項５０記載の化粧組成物の調製方法であって、前記ＰＬＧＦ−１変異タンパク質が、薬理学的に又は化粧料として許容される賦形剤、及び他の一般的な添加剤を伴なう方法。

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