PL209955B1

PL209955B1 - Zmutowane białko łożyskowego czynnika wzrostu typu 1, sekwencja nukleotydowa zawierająca DNA kodujące zmutowane białko, system ekspresji, komórka gospodarza , sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej, sposób wytwarzania i ekstrakcji zmutowanego białka, zmutowane białko do zastosowania w sposobie leczenia, przeciwciało zdolne do rozpoznawania zmutowanego białka, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja kosmetyczna i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej lub kosmetycznej

Info

Publication number: PL209955B1
Application number: PL372492A
Authority: PL
Inventors: Domenico Maglione; Mauro Battisti; Ettore Conti; Giuseppe Salvia; Marina Tucci; Alberto Mion
Original assignee: Geymonat Spa
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2003-05-19
Publication date: 2011-11-30
Also published as: WO2003097688A2; ATE488590T1; KR20040111639A; ITRM20020277A1; ES2356360T3; ZA200409943B; CN1653177A; HRP20041178B1; ITRM20020277A0; KR101022934B1; CA2485587C; AU2003234066A1; AU2003234066B2; CY1111431T1; HRP20041178A2; WO2003097688A9; US20050176634A1; DE60334986D1; EP1506295A2; CN1323167C

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zmutowane białko łożyskowego czynnika wzrostu typu 1 w postaci monomerycznej, sekwencja nukleotydowa zawierająca DNA kodujące zmutowane białko, system ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej, sposób wytwarzania i ekstrakcji zmutowanego białka, zmutowane białko do zastosowania w sposobie leczenia, przeciwciało zdolne do rozpoznawania zmutowanego białka, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja kosmetyczna i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej lub kosmetycznej.

Niniejszy wynalazek dotyczy stabilnych zmutowanych białek łożyskowego czynnika wzrostu typu 1 (PLGF-1, ang. Placental Growth Factor Type 1), ich wytwarzania, ich zastosowania terapeutycznego i kosmetycznego oraz kompozycji farmaceutycznych i kosmetycznych je zawierających. Wynalazek dotyczy również wytwarzania przeciwciał przeciwko tym białkom i ich zastosowania w diagnozie i leczeniu patologicznych stanów nowotworowych i nienowotwórowych.

Stan techniki

Łożyskowy czynnik wzrostu typu 1 (PLGF-1) jest angiogenną homodimeryczną glikoproteiną. Aktywność angiogenna dotyczy postaci dimerycznej, podczas gdy postać monomeryczna jest nieaktywna.

Kompletna sekwencja polinukleotydowa kodująca białko PLGF-1, razem z jego sekwencją polipeptydową, została opisana przez Maglione i Persico w patencie EP-B-0550519 (WO-A-92/06194).

Powyższy patent opisuje sposób wytwarzania PLGF-1 w bakteriach zmodyfikowanych przy użyciu indukowalnego systemu ekspresji, przy czym sposób ten obejmuje, po indukcji, lizę bakterii i bezpośrednią ekstrakcję surowego białka z roztworu lizatu. Białko otrzymane w ten sposób wykazuje niskie poziomy aktywności biologicznej.

Sposób ekstrakcji i oczyszczania surowego czynnika łożyskowego, otrzymanego w wyniku ekspresji w bakteriach, jest opisany przez Maglione i wsp. w zgłoszeniu patentowym PCT/IT02/00065. Sposób obejmuje serię etapów ekstrakcji, renaturacji i oczyszczania, które wszystkie razem umożliwiają otrzymanie czystego białka w zasadniczo dimerycznej postaci, to znaczy w jego najbardziej aktywnej postaci. W rzeczywistości wiadomo, że postać monomeryczna białka jest biologicznie nieaktywna, a funkcje angiogenne uzyskuje dopiero po renaturacji do postaci dimerycznej.

Jednak, niniejsi twórcy zaobserwowali, że białko w postaci dimerycznej jest częściowo niestabilne i powoduje powstawanie w roztworze wodnym podczas przechowywania lub przetwarzania postaci multimerycznych, które wykazują mniejszą aktywność biologiczną i z tego powodu są mniej odpowiednie do zastosowania w terapii, ze względu na niemożność określenia dawek i aktywności biologicznej.

Celem niniejszego wynalazku jest zatem rozwiązanie problemu niskiej stabilności chemicznej/biologicznej PLGF-1, która jest obserwowana głównie wtedy, kiedy to ostatnie jest przechowywane w roztworach wodnych.

Streszczenie wynalazku

Wynalazek opiera się na nieoczekiwanym odkryciu, że pochodne naturalnego białka PLGF-1 z modyfikacjami w ich sekwencji polipeptydowej, obejmującymi specyficzne podstawienie lub eliminację przynajmniej jednej reszty cysteiny, wykazują znaczne zwiększenie stabilności chemicznej, zachowując jednocześnie ich oryginalną aktywność biologiczną zasadniczo niezmienioną.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest zatem zmutowane białko ludzkiego lub zwierzęcego łożyskowego czynnika wzrostu typu 1 (PLGF-1) w postaci monomerycznej, które zawiera podstawienie lub usunięcie w sekwencji polipeptydowej białka typu dzikiego przynajmniej reszty cysteiny (Cys) w pozycji 142 sekwencji polipeptydowej prebiałka, odpowiadającej cysteinie w pozycji 125 w SEK NR: 2. To podstawienie lub usunięcie nie wpływa na tworzenie się aktywnego biologicznie dimeru ale zapobiega multimeryzacji postaci monomerycznej.

Zauważono, że pośród różnych reszt cysteiny szczególnie skuteczna jest eliminacja lub podstawienie reszty obecnej w części C-końcowej, a szczególnie w pozycji 142 całkowitej sekwencji polipeptydowej, to znaczy zawierającej zarówno dojrzałe białko PLGF-1, jak i odpowiadający mu peptyd sygnałowy. W korzystnym wykonaniu wynalazku reszta Cys 142 zostaje zastąpiona przez resztę glicyny (Gly). To podstawienie wytwarza zmutowane białko w postaci monomerycznej PLGF-1, które ma niezmienioną zdolność do dimeryzacji, ale jest zasadniczo niezdolne do wytwarzania produktów multimeryzacji. Oprócz modyfikacji opisanych powyżej, zmutowane białka według wynalazku, mogą zawierać dalsze eliminacje, podstawienia lub dodania jednego lub więcej aminokwasów z białka typu

PL 209 955 B1 dzikiego, przy czym te dostarczone modyfikacje nie zmieniają właściwości angiogenicznej zmutowanego białka.

Zmutowane białko czynnika PLGF-1 w postaci dimerycznej, korzystnie jest oczyszczone w taki sposób, aby zasadniczo zawierało sam dimer. W bardziej korzystnej postaci realizacji wynalazku zmutowane białko zawiera przynajmniej 98,5% postaci dimerycznej.

Zmutowane białko według wynalazku może równie dobrze być dojrzałym białkiem lub prebiałkiem, zawierającym w części N-końcowej peptyd sygnałowy.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa zawierająca DNA kodujący zmutowane białko o pełnej długości. Sekwencja ta korzystnie charakteryzuje się tym, że kodon TGC lub TGT kodujący aminokwas cysteinę w naturalnej sekwencji PLGF-1 jest usunięty lub zmodyfikowany. W korzystnym wykonaniu wynalazku kodon odpowiadający cysteinie jest podstawiony kodonem GGC, GGT, GGA lub GGG, które to wszystkie kodony kodują aminokwas glicynę (Gly). Korzystnie to zasada tymidynowa (T) w pozycji 382 (kodon TGC) sekwencji SEK ID NR:1 jest zastąpiona przez zasadę guanidynową (G) w celu wytworzenia kodonu GGC.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest system ekspresji obejmujący sekwencję nukleotydowa według wynalazku oflankowaną nieulegającymi translacji sekwencjami kontrolującymi i regulującymi ekspresję. System ten można indukować w komórkach prokariotycznych, korzystnie w komórkach bakteryjnych.

Ekspresja znajduje się pod kontrolą indukowalnego promotora i może być indukowana przy użyciu odpowiednich związków. System ekspresji korzystnie jest systemem ekspresji polimerazy RNA faga

T7 i ekspresja ta jest indukowana przy użyciu laktozy, izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG).

Przedmiotem wynalazku są również transformowane komórki gospodarza zmodyfikowane przy użyciu przedstawionego powyżej systemu ekspresji. Są nimi komórki prokariotyczne, korzystnie komórki bakteryjne, takie jak E. coli.

Wynalazek obejmuje także sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej, w której DNA kodujący zmutowane białko jest wytwarzany w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR, ang. polymerase chain reaction) używając, jako starterów oligonukleotydów, które zostały odpowiednio zmodyfikowane względem sekwencji białka typu dzikiego. Korzystnie, oligonukleotyd z SEK ID NR:3 jest używany jako lewy starter 5'-3', a oligonukleotyd z SEK ID NR:4 jest używany jako prawy starter 5'-3'. Jako matrycę w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się w wynalazku sekwencję DNA kodującą białko PLGF-1 bez białka sygnałowego.

Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencja DNA otrzymana w łańcuchowej reakcji polimerazy jest poddana reakcji wypełniania wolnych końców, następnie trawiona odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i klonowana do odpowiedniego wektora.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania i ekstrakcji zmutowanego białka PGF-1, w którym komórki gospodarza, korzystnie bakteryjne, zmodyfikowane przy użyciu systemu ekspresji według wynalazku, hoduje się w odpowiedniej pożywce hodowlanej, ekspresję białka indukuje się przy użyciu odpowiedniego induktora, a komórki izoluje się i poddaje lizie a następnie zmutowane białko ekstrahuje się z mieszaniny po lizie.

Korzystnie pożywka hodowlana zawiera jeden lub więcej czynników selekcyjnych, ekstrakt drożdżowy, glicerol i sole amonu oraz jest wolna od substancji pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego.

Komórki korzystnie hoduje się przed etapem ekspresji dopóki gęstość optyczna (O.D.) pożywki hodowlanej przy 600 nm nie osiągnie wartości pomiędzy 0,2 a 50 jednostek.

Ekspresję białka indukuje się przez dodanie odpowiednich czynników indukujących. Korzystnymi czynnikami indukującymi ekspresję może być latoza lub izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG).

Lizę komórek korzystnie przeprowadza się przy użyciu zamrażania/rozmrażania, prasy francuskiej lub innych równoważnych technik.

W sposobie według wynalazku ciała inkluzyjne uwolnione podczas lizy izoluje się przy użyciu przynajmniej dwóch cykli wirowania i przemywania odpowiednim buforem.

Korzystnie w sposobie według wynalazku, ciała inkluzyjne rozpuszcza się w buforze denaturującym zawierającym mocznik, izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny lub inne środki denaturujące i opcjonalnie homogenizuje się lub sonikuje.

W kolejnej korzystnej realizacji sposobu według wynalazku po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych roztwór rozcieńcza się, a substancje białkowe renaturuje do postaci dimerycznej przez dodanie do

PL 209 955 B1 roztworu czynników oksydo-redukcyjnych i inkubację prowadzi się przez 10 do 30 godzin, korzystnie 18 do 20 godzin w temperaturze od 10°C do 30°C, korzystnie 20°C, mieszając.

Sposób według wynalazku obejmuje przynajmniej jeden etap oczyszczania białka dimerycznego, które to oczyszczanie w bardziej korzystnym wykonaniu przeprowadza się z użyciem chromatografii jonowymiennej.

Podczas kolejnych etapów komórki poddaje się lizie w celu uwolnienia substancji wewnątrzkomórkowych, szczególnie substancji nukleinowych i ciał inkluzyjnych, do pożywki hodowlanej, przy czym te ostatnie rozpuszcza się, a białko otrzymane w ten sposób renaturuje do postaci dimerycznej.

Proces ekstrakcji i oczyszczania może obejmować dodatkowe opcjonalne etapy oczyszczania białka dimerycznego.

W korzystnym. wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku roztwór z etapu renaturacji nanosi się na kolumnę anionowymienną o stosunku objętości nanoszenia/objętości kolumny od 1:1 do 10:1, korzystnie 10:1.

W dalszym korzystnym wykonaniu sposób obejmuje początkowe oczyszczanie przy użyciu chromatografii anionowymiennej, a następnie chromatografii z odwróconymi fazami.

Sposób według wynalazku może korzystnie obejmować dodatkowy etap ultrafiltracji, a następnie liofilizacji w obecności lub w nieobecności odpowiednich dodatków.

Zmutowane białko otrzymane przy użyciu sposobu wytwarzania, ekstrakcji i oczyszczania według wynalazku zawiera nie mniej niż 98,5% aktywnego białka i nie więcej niż 1,5% postaci monomerycznej. Aktywna postać zasadniczo składa się z postaci dimerycznej i zawiera tylko ślady postaci multimerycznej. Testy stabilności podkreślają wysoką stabilność podczas przechowywania i podczas przetwarzania typowego zmutowanego białka w postaci dimerycznej.

Przedmiotem wynalazku jest także zmutowane białko jak zdefiniowano powyżej do zastosowania w sposobie leczenia terapeutycznego. W korzystnym wykonaniu zmutowane białko według wynalazku jest do leczenia chorób niedokrwiennych.

Bardziej korzystnie zmutowane białko według wynalazku jest do leczenia niedokrwienia tkanki mięśnia sercowego, zawału mięśnia sercowego, udaru niedokrwiennego i przewlekłych chorób niedokrwiennych mięśnia sercowego, niedokrwienia mózgu i udaru niedokrwiennego, niedokrwienia jelit, niedokrwienia obwodowego kończyn.

Również korzystnie, zmutowane białko według wynalazku jest do leczenia twardziny skóry.

Także korzystnie, zmutowane białko jest do leczenia wrzodów skórnych, ran, oparzeń, w leczeniu pooperacyjnym, ewentualnie do leczenia naturalnego lub przedwczesnego starzenia się tkanek skóry, lub ewentualnie do leczenia naturalnej lub patologicznej utraty włosów.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało poliklonalne, monoklonalne lub jego funkcjonalnie aktywny fragment, zdolne do rozpoznawania zmutowanego białka według wynalazku, zdolne do reakcji krzyżowej z PLGF-1 dzikiego typu i do zobojętniania jego aktywności angiogenicznej.

Korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest lekiem do zobojętniania aktywności angiogenicznej endogennego PLGF-1 w leczeniu postaci patologicznych towarzyszących zaburzonemu wytwarzaniu PLGF-1, lub również korzystnie, jest do leczenia postaci nowotworu.

Przeciwciało według wynalazku jest korzystnie odczynnikiem w sposobie diagnozowania postaci patologicznych towarzyszących zaburzonemu wytwarzaniu endogennego PLGF-1.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera zmutowane dimeryczne białko według wynalazku lub przeciwciało według wynalazku również zdefiniowane powyżej i akceptowaną farmaceutycznie zaróbkę. Kompozycja ta, korzystnie jest odpowiednia do zastosowania pozajelitowego, miejscowego, doustnego, donosowego lub wszczepienia.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja kosmetyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera zmutowane białko w postaci dimerycznej i akceptowaną kosmetycznie zaróbkę.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kompozycji farmaceutyczne] według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej według wynalazku zdefiniowanych powyżej, polegający na tym, że zmutowane białko PLGF-1 wiąże się z farmaceutycznie lub kosmetycznie akceptowalną zaróbką i z innymi dodatkami.

Opis rysunków

Fig. 1: Rysunek pokazuje profil elektroforetyczny SDS-PAGE PLGF-1CG po ponownym rozpuszczeniu w roztworze fizjologicznym przy 20 mg/ml i przechowywaniu w 4-8°C przez 40 dni. Profil jest porównywany z profilem dla zmutowanego białka bezpośrednio po rozpuszczeniu.

PL 209 955 B1 (M) pokazuje odniesienia mas cząsteczkowych; (1) pokazuje PIGF-1CG (3 mikrogramy) rozpuszczone w roztworze fizjologicznym w stężeniu 20 mg/ml i zamrożone (kontrola); (2) pokazuje PlGF-1CG (3 mikrogramy) rozpuszczone w roztworze fizjologicznym w stężeniu 20 mg/ml i przechowywane w 4-8°C przez 40 dni.

Fig. 2: Rysunek pokazuje dane z tabeli 2 wyrażone w postaci graficznej.

Fig. 3: Rysunek pokazuje profil elektroforetyczny SDS-PAGE zmutowanego białka PLGF-1CG rozpuszczonego w żelu Carbopol przy 0,2 mg/ml i przechowywanego w 4-8°C przez 170 dni. (M) pokazuje odniesienia mas cząsteczkowych; (1) pokazuje P1GF-1CG (2 mikrogramy) rozpuszczone w ż elu Carbopol w stężeniu 0,2 mg/ml i przechowywane w 4-8°C przez 170 dni; (2) pokazuje PLGF-1CG (2 mikrogramy) rozpuszczone w żelu Carbopol w stężeniu 0,2 mg/ml i zamrożone (kontrola).

Fig. 4: Rysunek pokazuje profil elektroforetyczny SDS-PAGE postaci natywnej PLGF-1 rozpuszczonej w żelu Carbopol przy 0,2 mg/ml i przechowywanej w 4-8°C przez 150 dni. (M) pokazuje odniesienia mas cząsteczkowych; (1) pokazuje PLGF-1 (2 mikrogramy) rozpuszczone w żelu Carbopol w stężeniu 0,2 mg/ml i przechowywane w 4-8°C przez 150 dni; (2) pokazuje PlGF-1 (2 mikrogramy) rozpuszczone w żelu Carbopol w stężeniu 0,2 mg/ml i zamrożone (kontrola).

Fig. 5: Rysunek jest schematycznym przedstawieniem procesu konstruowania plazmidu pET3PLGFlCG, kodującego 5 zmutowane białko PLGF-1 określane, jako PLGF-ICG.

Fig. 6: Rysunek pokazuje aktywność angiogenną PLGF-1 dzikiego typu i zmutowanego białka PLGF-ICG we wzrastających stężeniach substancji. Jako odniesienie pokazana jest aktywność zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów bFGF.

Fig. 7: Rysunek pokazuje efekt zmutowanego białka PLGF-ICG na indukowane izoprenaliną uszkodzenie niedokrwienne tkanki serca u królików. Oś x pokazuje dni leczenia i wartości AUC reprezentowane przez całkowitą powierzchnię zawartą pod krzywą określoną przez codzienne wyniki ECG.

Lista sekwencji:

SEK ID NR:1 sekwencja nukleotydowa PLGF-1 dzikiego typu bez peptydu sygnałowego.

SEK ID NR:2 sekwencja nukleotydowa naturalnego PLGF-1.

SEK ID NR: 3 sekwencja oligonukleotydu używanego, jako lewy starter w PGR.

SEK ID NR:4 sekwencja oligonukleotydowa używanego jako prawy starter w PGR.

Szczegółowy opis wynalazku

Całkowita sekwencja polipeptydowa ludzkiego czynnika PLGF-1 o 149 aminokwasach razem z fragmentem cDNA o 1645 nukleotydach obejmują cym sekwencję koduj ą c ą czynnik PLGF-1 są pokazane w patencie EP-B-0550519. Łatwo dostępny plazmid zawierający sekwencję nukleotydowa o 1645 zasadach został takż e zarejestrowany w bazie ATCC pod numerem dostę pu ATCC 40892.

Sekwencja kodująca prebiałko jest zawarta między pozycjami 322 a 768 i jest pokazana w tym zgłoszeniu, jako I SEK ID NR:1.

PLGF-1 dzikiego typu w postaci prebiałka jest polipeptydem o 149 aminokwasach zawierającym peptyd sygnałowy o 18 aminokwasach w części N-końcowej. Sekwencja dojrzałego białka, którego granice wyznaczają pozycje 19 i 149, jest pokazana w tym zgłoszeniu jako SEK ID NR:2. Ta sekwencja zawiera 9 reszt cysteiny (Cys) usytuowanych w pozycjach 35, 60, 66, 69, 70, 111, 113 i 125.

W zmutowanych białkach według wynalazku przynajmniej jedna z tych reszt cysteiny jest usunięta lub podstawiona przez inną resztę, przy czym jedynym warunkiem jest, aby mutacja nie wpływała znacząco lub nie eliminowała zdolności zmutowanego białka w jego postaci monomerycznej do wytworzenia biologicznie aktywnej i terapeutycznie użytecznej postaci dimerycznej. Dane doświadczalne pokazały, że usunięta lub podstawiona reszta musi korzystnie być usytuowana w części C-końcowej białka i że optymalną resztą dla celów niniejszego wynalazku jest ta w pozycji 125.

Zmutowane białka łożyskowego czynnika wzrostu typu dzikiego można wytworzyć technikami syntezy znanymi z literatury. Jednak korzystnym sposobem jest ekspresja białka w genetycznie zmodyfikowanych komórkach gospodarza. W tym celu komórki gospodarza są transformowane przez wprowadzenie wektora do klonowania i/lub wektora ekspresyjnego zawierającego wstawkę, która odpowiada genowi PLGF-1 po odpowiedniej modyfikacji.

Przygotowanie DNA kodującego zmutowane białka według wynalazku przeprowadza się przy użyciu mutagenezy specyficznej dla miejsca i stosuje się mutację punktową w kodonach odpowiadających cysteinie, to znaczy TGC lub TGT. Te mutacje mogą być delecjami lub podstawieniami jednej lub więcej zasad, niepowodującymi przesunięcia ramki odczytu na prawo od mutacji. W przypadku delecji musi, zatem być usunięty cały kodon. Korzystnie, jeśli mutacja specyficzna dla miejsca jest

PL 209 955 B1 punktowymi podstawieniem zasady w kodonie cysteiny z powstawaniem w konsekwencji nowego kodonu. W tym sensie, wynikiem mutacji będzie podstawienie reszty cysteiny resztą innego aminokwasu.

W celu przygotowania cDNA kodują cego pożądane zmutowane biał ko moż na zastosować róż ne znane techniki mutagenezy specyficznej dla miejsca.

Sposobami, które można zastosować, są, na przykład, mutageneza uzyskana przy użyciu oligonukleotydów (Adelman i wsp. „DNA” 2:183, 1983), mutageneza przy użyciu PGR (Leung i wsp. Technique 1:11-15, 1989) lub mutageneza przy użyciu kasety (Wells i wsp. Gene 34:315, 1985).

W korzystnym wykonaniu wynalazku syntez ę zmutowanego DNA przeprowadza się techniką mutacji przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PGR). Jako matrycę do PGR zastosowano cDNA kodujący czynnik PLGF-1 typu dzikiego opisany w literaturze lub dowolny jego odpowiednik wytworzony w wyniku degeneracji kodu genetycznego. Korzystnie, zastosowana będzie tylko część kodująca białko z metionina w pozycji N-końcowej z lub bez peptydu sygnałowego; na przykład sekwencja opisywana w niniejszym zgłoszeniu, jako SEK ID NR: 1 lub jej odpowiedniki, zawarta w wektorze ekspresyjnym pET3PLGFl, odpowiadająca białku bez peptydu sygnałowego. Jako startery do PGR zastosowano oligonukleotyd 5'-3' (lewy) komplementarny do regionu kodującego N-końcową część białka i oligonukleotyd 5'-3' (prawy) komplementarny do regionu sekwencji zawierają cej kodon cysteiny, który ma być zmutowany. Ten drugi oligonukleotyd będzie zawierał podstawienie lub podstawienia zasady konieczne do wprowadzenia wymaganej mutacji. Zastosowane startery mogą równie dobrze zawierać dodatkowe zasady w regionach 5'- i/lub 3'-końcowych w celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych odpowiednich do wyizolowania i oczyszczenia sekwencji zmutowanej.

Kodon odpowiadający reszcie cysteiny można podstawić kodonem kodującym dowolny obojętny aminokwas, albo polarny, taki jak Ser, Thr, Gin lub Asn, albo niepolarny, taki jak Gly, Ala, Val, Ile lub Leu. Korzystnymi aminokwasami są Gly i Ala.

W korzystnym wykonaniu lewy starter jest reprezentowany przez sekwencję określoną jako

SEK ID NR: 3, podczas gdy prawy starter jest reprezentowany przez sekwencję SEK ID NR:4. Ten drugi zawiera podstawienie T G w pozycji 382 sekwencji SEK ID NR:1, podstawienie, które przekształca kodon TGC cysteiny w pozycji 125 sekwencji SEK ID NR:4 w kodon GGC odpowiadający glicynie.

Odpowiednio zmodyfikowany cDNA jest następnie cięty i wstawiany do wektora ekspresyjnego pod kontrolą odpowiedniego indukowalnego systemu zgodnego z komórką gospodarza.

Korzystnie, stosuje się indukowalne systemy ekspresji zgodne z komórkami prokariotycznymi. Przykładami takich systemów są:

System ekspresji pBAD (in vitrogen BV) , w którym synteza białka jest umieszczona pod kontrolą promotora araBADi może być indukowana w różnych szczepach E. coli przy użyciu arabinozy;

System ekspresji T7 (In vitrogen BV lub Promega), w którym synteza białka jest kontrolowana przez promotor polimerazy RNA faga T7 i może być indukowana przy użyciu laktozy, izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) lub pochodnych lub funkcjonalnych odpowiednich ich analogów. W tym przypadku konieczne jest użycie szczepów pochodnych E. coli typu DE3 (BL21(DE3) lub JM109(DE3)), to znaczy tych, które zawierają kopię genu polimerazy RNA faga T7 umieszczoną pod kontrolą promotora indukowanego laktozą;

System ekspresji Trc (In vitrogen BV), w którym synteza białka jest umieszczona pod kontrolą promotora hybrydowego trc. Promotor ten został otrzymany przez fuzję promotora trp z promotorami lac i może być indukowany w różnych szczepach E. coli przy użyciu laktozy lub podobnych jej odpowiedników (IPTG);

System ekspresji Tac (Amersham biosciences), w którym synteza białka jest umieszczona pod kontrolą promotora rac.

W tym systemie synteza białka jest indukowana w szczepach E. coli laclq (typ JM105) przy użyciu laktozy lub podobnych ]ej odpowiedników (IPTG);

System ekspresji PL, w którym synteza białka jest umieszczona pod kontrolą promotora PL i może być indukowana przez dodanie tryptofanu. W tym wypadku wymagane jest zastosowanie szczepów pochodnych E. coli (GI724) zawierających kopię genu kodującego represor cl faga Lambda pod kontrolą promotora indukowanego tryptofanem.

Oczywiście, możliwe jest poddanie ekspresji zmodyfikowanego cDNA kodującego zmutowane białko w eukariotycznych komórkach gospodarza pochodzących od drożdży lub od organizmów wielokomórkowych. W tym wypadku zostaną wybrane systemy ekspresji zgodne z tymi komórkami.

PL 209 955 B1

W korzystnym wykonaniu wynalazku ekspresję przeprowadza się pod kontrolą systemu polimerazy RNA faga T7 i indukuje izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydem.

Wektor ekspresyjny zawiera także dodatkowe sekwencje kodujące zwykłe funkcje konieczne do klonowania, selekcji i ekspresji, takie jak znaczniki selekcyjne i/lub miejsce poliadenylacji i/lub sekwencję regulującą transkrypcję.

Komórki gospodarza są, zatem transformowane przy użyciu standardowych technik dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie, przy czym wymagany jest wektor ekspresyjny zawierający cDNA kodujący zmutowane białko. Te komórki mogą być komórkami prokariotycznymi, eukariotycznymi, zwierzęcymi, ludzkimi lub roślinnymi, w szczególności komórkami bakteryjnymi, takimi jak E. coli lub Bacillus, komórkami drożdżowymi, takimi jak Saccharomyces, lub komórkami zwierzęcymi, takimi jak Vero, HeLa, CHO, COS.

Korzystny mikroorganizm uzyskuje się przez integrację do handlowo dostępnego szczepu [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) genu z ludzkiego zmutowanego białka PLGF-1.

Zmodyfikowane komórki zastosowane do wytworzenia zmutowanych białek według wynalazku przechowuje się przed użyciem w postaci liofilizowanej, aby zachować ich zdolność do ekspresji. W czasie stosowania substancję liofilizowaną ponownie rozpuszcza się przy użyciu odpowiedniego buforu.

Zmodyfikowane komórki gospodarza następnie hoduje się w ciekłej pożywce hodowlanej. Chociaż handlowo dostępny jest i może być skutecznie zastosowany szeroki wachlarz znanych pożywek hodowlanych, etap fermentacji według wynalazku korzystnie przeprowadza się w pożywce hodowlanej wolnej od jakichkolwiek substancji pochodzenia zwierzęcego bądź ludzkiego, aby uniknąć jakiegokolwiek ryzyka infekcji. Ekstrakty drożdżowe (Difco) z dodatkiem jednego lub więcej odpowiednich antybiotyków reprezentują najbardziej odpowiednią pożywkę do tego procesu. Etap fermentacji może być poprzedzony etapem wstępnego zaszczepienia, w którym rozpuszcza się liofilizowany organizm w pożywce hodowlanej i poddaje następnie inkubacji i etapom rozcieńczania, mającym na celu uzyskanie optymalnej ilości komórek mikroorganizmu w hodowli.

Fermentację przeprowadza się w pożywce hodowlanej przedstawionej powyżej w odpowiedniej dla mikroorganizmu temperaturze, zwykle około 37°C, w obecności zawartości procentowej rozpuszczonego O2, w odniesieniu do nasycenia powietrzem, pomiędzy 20% a 40%, korzystnie 30%. pH podczas hodowli jest utrzymywane przy wartościach optymalnych dla zastosowanego mikroorganizmu, które będzie zwykle obojętne lub bardzo nieznacznie kwaśne lub zasadowe (6,4 do 7,4). Ponadto, biorąc pod uwagę to, że proces fermentacji ma miejsce podczas mieszania, konieczne jest dodanie środków przeciw pienieniu się.

W czasie postępu fermentacji towarzyszy jej wzrost gęstości optycznej pożywki hodowlanej. Zatem gęstość optyczna przy 600 nm jest parametrem stosowanym według wynalazku do monitorowania postępu procesu. Gęstość komórkowa, a zatem i optyczna, osiągana w hodowli w czasie, gdy indukowana jest ekspresja, musi być wystarczająco wysoka, aby zapewnić wysoką wydajność białka ulegającego ekspresji. Chociaż można użyć już gęstości optycznych przy 600 nm (OD⁶⁰⁰) wyższych niż 0,2, dzięki zastosowanym pożywkom hodowlanym można uzyskać gęstości optyczne aż do 50. W celu otrzymania wysokich poziomów wytwarzania zmutowanego białka korzystne są gęstości przekraczające 18. Optymalne wyniki dały w rezultacie gęstości pomiędzy 16 a 20. Fermentację następnie utrzymuje się w warunkach przedstawionych powyżej do czasu osiągnięcia tych wartości gęstości optycznej, a następnie indukuje się ekspresję białka.

Można zastosować dowolny czynnik lub stan chemiczno-fizyczny zdolny do indukcji mechanizmów heterologicznej ekspresji zmutowanego białka w komórkach zastosowanych mikroorganizmów. W szczególnym wypadku, gdzie użyty jest szczep bakteryjny BL21(DE3)pLysS zmodyfikowany przy użyciu plazmidu ekspresyjnego zawierającego promotor faga T7, ekspresja jest indukowana laktozą lub jej pochodnymi, takimi jak izopropylo-e-tiogalaktopiranozyd (IPTG) w odpowiednim stężeniu, to znaczy około 1 mM. Czas trwania indukcji może się różnić w zależności od wymagań. Dobre wyniki otrzymano dla okresów kilkugodzinnych, korzystnie od 3 do 4 godzin; w optymalnym procesie indukcja jest utrzymywana przez 3 godziny i 20 minut przy zastosowaniu zawartości procentowej rozpuszczonego O2 równoważnej około 10%.

Próbki komórek pobiera się przed i po indukcji i poddaje obróbce przy użyciu kontrolnych technik analitycznych, takich jak elektroforeza SDS-PAGE, w celu określenia rezultatów indukcji.

Kiedy ekspresja białka osiągnie wymagany poziom, komórki wydziela się z pożywki hodowlanej, na przykład przez wirowanie, i poddaje procesowi ekstrakcji.

PL 209 955 B1

Proces ekstrakcji przewiduje początkowy etap lizy komórek. W efekcie, kiedy zmutowane białko ulega ekspresji w bakteriach, pozostaje ono oddzielone wewnątrz komórki gospodarza w postaci ciał inkluzyjnych. Proces lizy można przeprowadzić przy użyciu zamrażania/rozmrażania, prasy francuskiej, ultradźwięków (sonikacji) lub podobnych znanych technik w roztworach do lizy zawierających odpowiednie stężenia surfaktantów, korzystnie zawierających Triton X100 w stężeniach od 0,5% do 1%. Korzystną techniką, w przypadku użycia szczepu BL21 (DE3)pLysS, jest technika zamrażania/rozmrażania, która w optymalnym wykonaniu jest powtarzana przynajmniej przez dwa kolejne cykle.

Biorąc pod uwagę, że zmutowane białko PLGF-1 jest uwalniane do pożywki hodowlanej w takiej postaci, w jakiej ulega ekspresji przez komórkę gospodarza, to znaczy w biologicznie nieaktywnej postaci monomerycznej, po lizie następuje etap renaturacji, przynajmniej w części składający się z dimeryzacji monomeru. Renaturację zmutowanego białka uzyskuje się przez dodanie odpowiednich stężeń par środków oksydo-redukcyjnych do rozcieńczonego roztworu, po czym następuje okres inkubacji od około 10 do 30 godzin, korzystnie 18 do 20 godzin w temperaturze pomiędzy 10°C a 30°C, korzystnie 20°C podczas mieszania. Przykładami takich par są: cystyna/cysteina, cystamina/cysteamina, 2-hydroksyetylodwusiarczek/2-merkaptoetanol lub glutation w postaci utlenionej i zredukowanej. Ten ostatni przedstawia się jako korzystny środek i jest stosowany, w postaci utlenionej, w stężeniu od 0,1 do 2,5 mM, korzystnie 0,5 mM, a w postaci zredukowanej od 0,25 do 6,25 mM, korzystnie 1,25 mM.

W przypadku, gdzie ulegają ce ekspresji zmutowane biał ko PLGF-1 jest uwalniane do poż ywki do lizy w postaci ciał inkluzyjnych, etap renaturacji jest poprzedzony przez etap rozpuszczania. Frakcja zawierająca ciała inkluzyjne jest rozpuszczana w buforze denaturującym zawierającym znane środki denaturujące takie jak mocznik, izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny. Korzystnie, roztwór denaturujący jest roztworem mocznika w stężeniu denaturującym, na przykład 8 M. Aby przyspieszyć proces rozpuszczania, korzystne może być poddanie frakcji zawierającej ciała inkluzyjne homogenizacji lub ultradźwiękom (sonikacji). Roztwór zawierający białko jest następnie rozcieńczany samym buforem, denaturującym i/lub roztworem rozcieńczalnika do osiągnięcia gęstości optycznej mierzonej przy 280 nm około 0,5 OD²⁸⁰ Odpowiednie roztwory do rozcieńczania zawierają sole i polietylenoglikol (PEG) i mają pH zasadowe (pH około 8).

Uwolnieniu zmutowanego białka PLGF-1 do pożywki hodowlanej zwykle towarzyszy uwolnienie różnych składników i substancji wewnątrzkomórkowych z mikroorganizmu, przede wszystkim substancji nukleinowych, które mogą wpływać na lub przeszkadzać w procesie oczyszczania białka. Aby uniknąć tego problemu, zawiesinę/roztwór otrzymany bezpośrednio po lizie komórek można poddać dodatkowemu opcjonalnemu i wstępnemu etapowi obróbki, składającemu się z fragmentacji tych substancji. Ten efekt uzyskuje się przy użyciu czynników enzymatycznych, takich jak DNAzy (naturalne lub rekombinowane, takie jak Benzoase), czynników chemicznych, takich jak kwas deoksycholowy, lub czynników fizyczno-mechanicznych, takich jak ultradźwięki (sonikacja), szybkie mieszanie przy użyciu noży, na przykład w mikserze. Fragmentację fizyczną DNA przeprowadza się w odpowiednich objętościach roztworu do przemywania zawierającego środki chelatujące i detergenty, na przykład EDTA i Triton X¹⁰⁰, i korzystnie powtarza się ją przez pewną liczbę cykli kolejno rozcieńczania, wirowania i usuwania supernatantu w celu usunięcia wszystkich składników lub substancji komórkowych z frakcji zawierają cej ciał a inkluzyjne.

Chociaż zmutowane białko PLGF-1 po renaturacji może już być zastosowane w postaci, w jakiej ]e otrzymano, korzystnie poddaje się je przynajmniej jednemu etapowi oczyszczania przy użyciu jednej z technik oczyszczania substancji białkowych dobrze znanych specjaliście w tej dziedzinie. W tym celu zmutowane białko można poddać filtracji na żelu, chromatografii powinowactwa, HPLC, chromatografii z odwróconymi fazami i/lub elektroforezy na żelu. Korzystnymi technikami są chromatografia anionowymienna i z odwróconymi fazami. Kiedy konieczne jest otrzymanie niezwykle wysokich wydanności oczyszczania, na przykład takich odpowiednich do zastosowania terapeutycznego, przynajmniej dwie z wymienionych powyżej technik są połączone ze sobą w sekwencji.

Roztwór zawierający częściowo zrenaturowane zmutowane białko, to znaczy przynajmniej w części w postaci dimerycznej, moż na nanieść na zł o ż e anionowymienne w celu wzbogacenia mieszaniny w postać dimeryczną i uwolnić je od zanieczyszczeń bakteryjnych. Można zastosować dowolną handlowo dostępną matrycę odpowiednią do chromatografii anionowymiennej, jeśli tylko jej właściwości pojemności, prędkości nanoszenia i przepływu będą zgodne z procesem przemysłowym. W korzystnym wykonaniu stosuje się złoże o szybkim przepływie, na przykład Q-Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences) lub równoważną. Zastosowane złoża pozwalają na nanoszenie objętości próbek roztworu białka przy stosunkach objętości nanoszenia/objętości kolumny wahających się od

PL 209 955 B1

1:1 do 10:1. Korzystne są stosunki obj./obj. bliskie 10:1, ponieważ umożliwiają one użycie kolumny, którą można zoptymalizować. Cały proces chromatografii korzystnie można przeprowadzić automatycznie przy użyciu skomputeryzowanego systemu kontrolowanego przez odpowiedni program, na przykład systemu FPLC Director Software (Amersham biosciences).

W wariancie procesu przedstawionego powyż ej częściowo zrenaturowane zmutowane biał ko można oczyścić przy użyciu chromatografii z odwróconymi fazami.

W tym przypadku odpowiedni rozcień czony roztwór zawierają cy częściowo zrenaturowane zmutowane białko, to znaczy częściowo w postaci dimerycznej i częściowo w postaci monomerycznej, można nanieść na dowolną handlowo dostępną matrycę do chromatografii odpowiednią do wskazanych zastosowań. Korzystnie, stosowane jest złoże, które ma taką wielkość ziaren, aby zapewnić optymalne wykorzystanie pojemności absorpcyjnej matrycy razem z łatwym pakowaniem samej kolumny. Przykładami takich matryc są złoża RP Source 15 lub RP Source 30 (Amersham biosciences). Wszystkie roztwory do równoważenia, nanoszenia, przemywania złoża i wymywania są roztworami wodno-organicznymi zawierającymi różne zawartości procentowe rozpuszczalnika organicznego. Przykładami takich roztworów są roztwory zawierające etanol, metanol lub acetonitryl. Korzystnie, stosuje się roztwory wodno-alkoholowe zawierające wzrastającą zawartość procentową etanolu. Korzystnie, cały proces chromatografii z odwróconymi fazami przeprowadza się automatycznie przy użyciu skomputeryzowanego systemu działającego pod kontrolą odpowiedniego programu, np. FPLC Director Software (Amesham biosciences).

Kiedy stosuje się dwie lub więcej technik oczyszczania jedną po drugiej, można otrzymać zmutowane białko w wysoce oczyszczonej aktywnej postaci, to znaczy z białkiem zawartym zasadniczo w postaci dimerycznej, i bez jakiegokolwiek zanieczyszczenia postacią monomeryczną. Produkt uzyskany w ten sposób zawiera nie mniej niż 98,5% postaci aktywnej, korzystnie nie mniej niż 99,5%. Resztkowa postać monomeryczną nie przekracza 1,5%. Biorąc pod uwagę, że zmutowane białko jest chemicznie stabilnie, wszystkie produkty multimeryzacji są ograniczone do śladów. Czyste białko uzyskane według sposobu opisanego powyżej można poddać dalszym procesom obróbki, na przykład ultrafiltracji membranowej. W tym przypadku produkt przesącza się na membranie z ograniczeniem wielkości przesączanych cząsteczek (odcięciem frakcji cząsteczek o większych wymiarach) mniejszym lub równym 30 kD i poddaje się diafiltracji względem wody zakwaszonej TFA do osiągnięcia czynnika rozcieńczenia 1:10⁶. Końcowy produkt uzyskany w ten sposób można odpowiednio przygotować w postaci preparatu z dodatkami do liofilizacji i liofilizować w celu zachowania aktywności biologicznej na optymalnym poziomie.

W praktycznym wykonaniu wynalazku zmutowane białko można odpowiednio ekstrahować, izolować i oczyszczać zgodnie z procesem oczyszczania opisanym w międzynarodowym wniosku patentowym PCT/IT02/00065 (Geymonat) w celu oczyszczenia białka PLGF-1 dzikiego typu, zmieniając odpowiednio, jeśli to konieczne, warunki wykonywanych procedur.

Chemiczną stabilność zmutowanych białek PLGF-1 według wynalazku oszacowano w testach, w których liofilizowane zmutowane biał ko i biał ko PLGF-1 dzikiego typu rozpuszczono w roztworze soli fizjologicznej lub przygotowano w postaci preparatu w postaci żelu i przechowywano w temperaturze 4-8°C przez okres 40, 170 i 210 dni. Wyniki opisane poniżej wyraźnie wskazują, że zmutowane białko w jego aktywnej postaci dimerycznej jest stabilne we wszystkich analizowanych stężeniach (20, 5 11 mg/ml), w których nie ma ono tendencji do wytrącania się lub multimeryzacji, w rzeczywistości okazuje się, że stężenie pozostaje przy wartościach początkowych. Przeciwnie, stężenie postaci dimerycznej białka dzikiego typu obniża się drastycznie zaledwie po kilku dniach.

Zmutowane białka według wynalazku pokazują, oprócz polepszonej stabilności chemicznej/biologicznej, aktywność angiogenną porównywalną z tą białka PLGF-1 dzikiego typu. Ta aktywność czyni zmutowane białka PLGF-1 według wynalazku odpowiednimi dla wszystkich terapeutycznych i kosmetycznych zastosowań naturalnego PLGF-1 obecnie znanych z wcześniejszych badań.

Działanie angiogenne zmutowanych PLGF-1 według wynalazku zostało określone przy użyciu znanych technik, przeprowadzonych in vivo lub in vitro. W szczególności stosowano test rozwoju naczyń krwionośnych w rogówce królików lub test rozwoju naczyń krwionośnych w błonie kosmówki moczniowej (GAM), jak to opisano przez Maglione i wsp. „II Fάrmaco”, 55, 165-167 (2000).

Drugim sposobem stosowanym do oszacowania rozwoju naczyń krwionośnych w skórze jest skomputeryzowana analiza morfogenetyczna skóry zwierzęcej, jak to opisano przez Streita i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 21 grudnia, 96 (26), strony 14888-14893). Wycinki skóry wyizolowane ze zwierząt laboratoryjnych, leczonych lub nieleczonych według niniejszego wynalazku, wybarwiono imi10

PL 209 955 B1 nunohistochemicznie przy użyciu przeciwciał monoklonalnych anty-CD31 przeciwko zastosowanemu zwierzęciu. Wycinki leczone w ten sposób analizowano pod mikroskopem elektronowym w celu oszacowania liczby naczyń krwionośnych na mm², leń średnich rozmiarów i względnego obszaru zajmowanego przez nie. Efekt angiogenny zmutowanych białek na tkankę mięśnia sercowego, a w szczególności w przypadku niedokrwienia lub zawału mięśnia sercowego, oszacowano na zwierzęcym modelu niedokrwienia serca, jak to opisano przez Maglione i wsp. (powyżej).

Aktywność zmutowanych białek według wynalazku w leczeniu twardziny skóry oszacowano na modelu zwierzęcym, jak to opisano przez Yamamoto T. i wsp. w Arch. Dermatol. Res. Nov. 2000, 292 (11), strony 535 do 541. Stan twardziny skóry jest indukowany w myszach C3H bleomycyną (100 mcg/ml) wstrzykiwaną codziennie podskórnie przez 3 tygodnie. Po 3 tygodniach zwierzęta uśmierca się, a próbki skóry z traktowanych obszarów poddaje się analizie histologicznej.

Efekt leczenia podkreślają cechy histologiczne, które można przypisać stwardnieniu skóry indukowanemu bleomycyną a, w szczególności, pogrubieniu skóry i wysokim poziomem hydroksyproliny.

Wyniki opisane poniżej podkreślają skuteczność zmutowanych białek PLGF-1 według wynalazku w leczeniu wszystkich tych patologicznych lub naturalnych stanów degeneracyjnych, które polepszają stan obszaru dzięki wzrostowi rozwoju naczyń krwionośnych w zaangażowanym obszarze. Pierwszym zastosowaniem jest zapobiegawcze lub lecznicze traktowanie niedokrwienia i uszkodzeń następujących po wystąpieniu niedokrwienia. Stanami mogącymi być odpowiednimi do leczenia są niedokrwienie tkanki mięśnia sercowego, zawał mięśnia sercowego, udar niedokrwienny i przewlekłe choroby mięśnia sercowego, niedokrwienie mózgu i udar niedokrwienny, niedokrwienie jelit, niedokrwienie obwodowe kończyn. Drugim zastosowaniem terapeutycznym jest leczenie twardziny skóry. Jest to choroba, która angażuje system mikronaczyń krwionośnych, skórną i podskórną tkankę łączną i tkankę łączną narządów wewnętrznych. Choroba indukuje aktywację fibroblastów i nadmierne wytwarzanie tkanki i okołonaczyniowych złogów kolagenu, które przyczyniają się w znacznej mierze do powstawania zwłóknienia i obszarów zwapnienia, a zatem do pojawienia się objawów indukowanych przez chorobę. W szczególności, można zobaczyć w kapilaroskopii, że ogromne ilości stwardniałego kolagenu otaczają naczynia krwionośne skóry powodując ograniczenie światła naczyń krwionośnych. Można wyróżnić ograniczoną twardzinę skóry dotykającą tkankę skórną, charakteryzującą się stwardnieniem i pogrubieniem skóry ze względu na nadmierne i nieprawidłowe złogi kolagenu, oraz postępującą układową twardzinę skóry, w której naczynia krwionośne są związane ze zwłóknieniem skóry, razem z układowym stwardnieniem ze zmianami chorobowymi w narządach wewnętrznych. Obserwuje się stwardniałą, pogrubioną i obrzękniętą skórę, przede wszystkim palców i dłoni. Choroba występuje także na poziomie mięśnia sercowego w postaci niewydolności serca oraz na poziomie układu płucnego, żołądkowe-jelitowego, nerkowego i kostno-mięśniowego. U niektórych pacjentów rozwijają się także artropatie z nadżerką indukowane przez zwłóknienie skóry, który znacząco ograniczają ruchomość stawów. Maglione i wsp. opisali (włoski wniosek patentowy RM2002A000119) odnośnie czynnika PLGF-1 dzikiego typu, że sprzyjanie angiogenezie, w szczególności w skórze, jako wynik leczenia kompozycjami zawierającymi PLGF-1 ma korzystny efekt na stan ogólny indukowanego neomycyną stwardnienia u myszy. Te same wyniki obserwowano u zwierząt, u których wcześniej został indukowany stan twardziny skóry i leczony zmutowanymi białkami według wynalazku.

Trzecim zastosowaniem terapeutycznym jest leczenie wspierające procesy leczenia w przypadku oparzeń, wrzodów i wewnętrznych lub skórnych ran, w szczególności podczas etapów po operacji.

Dalsze zastosowanie według wynalazku dotyczy leczenia zjawisk typowych dla starzenia się skóry. To leczenie, chociaż uważane zasadniczo, jako kosmetyczne, ma implikacje terapeutyczne, kiedy się weźmie pod uwagę przedwczesne pogorszenie się tkanki skórnej pod wpływem długotrwałej ekspozycji na światło słoneczne (fotostarzenie), promieniowania innych typów lub agresywnych czynników środowiskowych/atmosferycznych.

Badanie próbek skóry uszkodzonej pod wpływem światła pod mikroskopem elektronowymi ujawnia typową morfologię mikronaczyń, która charakteryzuje się, między innymi, obecnością naczyń włosowatych, które są patologicznie rozszerzone i owinięte elastyną lub otoczone gęstą substancją amorficzną. Obserwowano, że stymulacja rozwoju naczyń w nowej skórze wywiera, zarówno w przypadku skóry postarzałej naturalnie, jak i przedwcześnie, efekt modulujący na macierz zewnątrzkomórkową odpowiedzialną za odcień skóry i grubość. Zwiększonemu rozwojowi naczyń włosowatych towarzyszy rozwój fibroblastów i wzrost wytwarzania nowego kolagenu, a następnie ogólne polepszenie wyglądu skóry.

Dalsze zastosowanie związków według wynalazku dotyczy utraty włosów.

PL 209 955 B1

W rezultacie, polepszonemu rozwojowi naczyń krwionoś nych w skórze, szczególnie w obszarze okołomieszkowym, towarzyszy modulacja wzrostu przydatków skóry (włosów na głowie, włosów na ciele, itp.) w sensie zapobiegania utracie włosów i sprzyjania ich regeneracji. Fazie anagenicznej, która odpowiada fazie wzrostu włosa, towarzyszy naturalny wzrost rozwoju naczyń krwionośnych mieszków włosowych. Miejscowe działanie angiogenne sprzyja temu wzrostowi naczyń i w konsekwencji wzrostowi włosa. Skomputeryzowana analiza morfogenetyczna wycinków skóry proksymalnych do wytwarzających włos mieszków włosowych zwierząt leczonych kompozycjami według wynalazku pokazała nie tylko wzrost rozmiarów światła włosa i gęstości włosów, a zatem ogólny wzrost okołomieszkowego rozwoju naczyń, ale także wzrost rozmiarów buławki włosa i średnicy samego włosa.

Efekt zapobiegania utracie włosów związany z przyczynianiem się do ponownego wzrostu mnożna zastosować nie tylko w przypadku naturalnej utraty, ale także w przypadku utraty następującej w wyniku klinicznie znaczących stanów, takich jak łysienie, zaburzenia hormonalne, chemioterapia, radioterapia lub podawanie leków.

Wyżej określone wskazania terapeutyczne dotyczą bezpośredniego, układowego lub miejscowego podania zmutowanego białka czynnika PLGF-1. Jednak, zmontowane białka według wynalazku można także zastosować w celu wytworzenia przeciwciał, poliklonalnych, monoklonalnych lub funkcjonalnie aktywnych fragmentów zdolnych do rozpoznawania endogennego czynnika PLGF-1, szczególnie tych regionów sekwencji aminokwasowej zawierającej miejsce wiązania dla PLGF-1 i receptora. Przeciwciała tego typu są zdolne do zobojętniania aktywności angiogennej PLGF-1 i znajdują zastosowanie w leczeniu wszystkich tych stanów charakteryzujących się patologiczną angiogenezą. Przykładami tych stanów są zaburzenia zapalne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów lub astma, obrzęk, nadciśnienie płucne oraz tworzenie się i rozwój tkanki rakowej. Same przeciwciała można zastosować, jako odczynniki immunodiagnostyczne w sposobach jakościowego i ilościowego oznaczania endogennego wytwarzania PLGF-1. Te odczynniki znajdują zastosowanie w diagnozie wszystkich tych stanów patologicznych, którym towarzyszy nieprawidłowe wytwarzanie PLGF-1, takich jak tworzenie i rozwój tkanki nowotworowej.

Przeciwciała lub ich fragmenty zdolne do rozpoznawania zmutowanych białek PLGF-1 przygotowuje się technikami znanymi specjaliście w tej dziedzinie, np. według technik opisanych we wniosku WO-A-01/85796 do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla białka PLGF-1 dzikiego typu.

Niniejszy wynalazek podobnie dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających zmutowane białka opisane powyżej lub odpowiadające im zobojętniające przeciwciała, jako składniki aktywne lub jako odczynniki diagnostyczne.

Według wynalazku można zastosować dowolny preparat odpowiedni do podania układowego lub miejscowego. W szczególności, czynnik PLGF-1 można podać pozajelitowe ze skutkiem układowym lub lokalnym lub miejscowo na skórę lub błony śluzowe ze skutkiem głównie lokalnym. Skutek układowy uzyskuje się głównie przez podanie dożylne, chociaż możliwe jest także podanie dootrzewnowe lub domięśniowe. Skutek lokalny uzyskuje się przez podanie miejscowe lub pozajelitowe domięśniowe, podskórne, śródstawowe. Zmutowane białka PLGF-1 podobnie można podać na poziomie lokalnym poprzez elektrotransport jonoforetyczny, Podobnie można zastosować podskórne implanty tam, gdzie wymagane jest opóźnione uwalnianie przez pewien okres czasu. Doustne podanie czynnika jest także możliwe, chociaż jest mniej zalecane ze względu na delikatną naturę aktywnego produktu.

Kompozycje do układowego lub lokalnego zastosowania pozajelitowego obejmują roztwory, zawiesiny, zawiesiny liposomów, emulsje W/O lub O/W. Kompozycje do zastosowania miejscowego obejmują roztwory, płyny do zmywania, zawiesiny, zawiesiny liposomów, emulsje W/O, O/W, W/O/W, O/W/O, żele, maści, kremy, pomady i pasty. W korzystnym wykonaniu substancja aktywna jest przygotowywana w postaci preparatu w postaci liofilizowanej, zmieszana z odpowiednimi dodatkami do liofilizacji i gotowa do ponownego rozpuszczenia przy użyciu akceptowanych terapeutycznie rozcieńczalników. Dodatkami do liofilizacji, które można zastosować są: bufory, polisacharydy, sacharoza, mannitol, inozytol, polipeptydy, aminokwasy i dowolne inne dodatki zgodne z substancją aktywną. W korzystnym wykonaniu wynalazku substancję aktywną rozpuszcza się w buforze fosforanowym (NaH2PO4/H2O Na2HPO4/2H2O) w ilości takiej, że stosunek zmutowanego białka/fosforanu po liofilizacji zawiera się pomiędzy 1:1 a 1:2. Odpowiednimi rozcieńczalnikami do zastosowania pozajelitowego są: woda, roztwór soli fizjologicznej, rozwory cukru, roztwory wodno-alkoholowe, rozcieńczalniki olejowe, poliole, takie jak glicerol, glikol etylenowy lub polipropylenowy, lub dowolny inny rozcieńczalnik zgodny ze sposobem podania pod względem sterylności, pH, siły jonowej i lepkości.

PL 209 955 B1

W przypadku emulsji lub zawiesin kompozycja może zawierać odpowiednie środki będące surfaktantami typu niejonowego, jonu obojnaczego, anionowego lub kationowego powszechnie stosowane w przygotowaniu preparatów leków.

Emulsje hydrofilowe O/W lub W/O/W korzystne są do podania pozajelitowego/układowego, podczas gdy emulsje lipofilowe W/O lub O/W/O korzystne są do zastosowania lokalnego lub miejscowego.

Ponadto, kompozycje według wynalazku mogą zawierać opcjonalne dodatki, takie jak środki izotoniczne, takie jak cukry lub polialkohole, bufory, środki chelatujące, przeciwutleniacze, środki przeciwbakteryjne.

Kompozycje do zastosowania miejscowego obejmują postacie ciekłe lub półstałe. Te pierwsze obejmują roztwory lub płyny do zmywania. Mogą one być wodne, wodno-alkoholowe, takie jak etanol/woda, lub alkoholowe i uzyskuje się je przez rozpuszczenie substancji liofilizowanej.

Inaczej, roztwory substancji aktywnej można przygotować jako żele przez dodanie znanych środków żelujących, takich jak: skrobia, gliceryna, glikol polietylenowy lub polipropylenowy, poli(met)akrylan, alkohol izopropylowy, hydroksystearynian, CAR30P0L®.

Innymi typami kompozycji do zastosowania miejscowego są emulsje lub zawiesiny w postaci pomad, past i kremów. Korzystne są emulsje W/O, ponieważ zapewniają one szybszą absorpcję. Przykładami zarobek lipofilowych są: ciekła parafina, bezwodna lanolina, biała wazelina, alkohol cetylowy, alkohol stearylowy, oleje roślinne, oleje mineralne. Korzystnie można zastosować środki, które zwiększają przepuszczalność skóry tak, aby ułatwić absorpcję. Przykładami takich środków są akceptowane fizjologicznie dodatki, takie jak alkohol poliwinylowy, polietylenoglikol lub dimetylosulfotlenek (DMSO).

Innymi dodatkami stosowanymi w kompozycjach miejscowych są środki izotoniczne, takie jak cukry lub polialkohole, bufory, środki chelatujące, przeciwutleniacze, środki przeciwbakteryjne, środki zagęszczające, środki dyspergujące.

Również można zastosować kompozycje do zastosowania miejscowego lub układowego z opóźnionym uwalnianiem w pewnym okresie czasu i mogą one obejmować polimery, takie jak polimleczan, poli (met) akrylan, poliwmylo-pirolidon, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza i inne substancje znane w tej dziedzinie. Można także zastosować kompozycje o powolnym uwalnianiu w postaci podskórnych implantów opartych, na przykład, na polimleczanie lub innych biodegradowalnych polimerach.

Chociaż substancja aktywna jest już sama stabilna i korzystnie jest zapakowana w formę zliofilizowaną, kompozycje farmaceutyczne korzystnie mogą zawierać substancje dodatkowo stabilizujące zmutowane białka PLGF-1 w aktywnej postaci dimerycznej. Przykładami takich substancji są: cysteina, cysteamina lub glutation.

Dawkowanie zmutowanych białek zależy od drogi podawania i od wybranej postaci preparatu. W przypadku podania pozajelitowego ilości wahają się od 1 mcg/kg/dzień do 500 mcg/kg/dzień, korzystnie od 10 mcg/kg/dzień do 200 mcg/kg/dzień. To podawanie jest realizowane przy użyciu kompozycji farmaceutycznych zawierających od 50 mcg do 30 mg na dawkę jednostkową, korzystnie od około 500 mcg do 10 mg na dawkę. W przypadku terapeutycznej aplikacji miejscowej korzystne okazały się ilości wahające się od 0,1 mg do 10 mg na gram kompozycji. Lokalne kompozycje kosmetyczne do leczenia starzenia się skóry lub utraty włosów zawierają korzystnie od 0,01 mg do 0,09 mg substancji aktywnej na gram kompozycji.

Czas trwania leczenia zmienia się w zależności od stanu patologicznego lub pożądanego efektu. W przypadku leczenia twardziny skóry okres aplikacji waha się od 1 dnia do 12 miesięcy, w zależności od ciężkości stanu patologicznego. W przypadku leczenia naturalnego lub przedwczesnego starzenia się skóry okres aplikacji waha się od 1 do 400 dni, korzystnie przez przynajmniej 30 dni. W przypadku leczenia w celu zapobiegnięcia utracie włosów lub w celu przyczynienia się do ponownego wzrostu włosów okres aplikacji podobnie waha się od 1 do 400 dni.

Wynalazek opisany jest poniżej za pomocą przykładów, których cel jest jedynie obrazujący, a nieograniczają cy.

P r z y k ł a d 1:

Synteza cDNA kodującego zmutowane białko.

Zmutowane białko PlGF-1, które nazwaliśmy PIGF-1CG, wytworzono przez mutację tymidyny (T) nr 382 (sekwencja SEK ID NR:1) w guanidynę (G) . W ten sposób kodon TGC, nukleotydy 382-384 wskazanej powyżej sekwencji, kodujący cysteinę przekształcono w GGC kodujący glicynę.

PL 209 955 B1

Z aminokwasowego punktu widzenia cysteina zmutowana w glicynę w zmutowanym białku PlGF-1CG znajduje się w pozycji 125 sekwencji SEK ID NR:2.

Do syntezy DNA kodującego zmutowane białko zastosowano technikę PGR (łańcuchową reakcję polimerazy). Jako matrycę do PGR zastosowano wektor ekspresyjny pET3PLGFl kodujący białko PlGF1 z metionina, bez peptydu sygnałowego (EP-A-0550519). W praktyce jest to białko PLGF-1 dzikiego typu bez pierwszych 18 aminokwasów (peptydu sygnałowego) i z metionina w pozycji 1 (N-końcowej) (SEK ID NR:2). Oligonukleotydy zastosowane jako startery są następujące: oligol (lewy starter) mający sekwencję 5'-CTGGCGCATATGCTGCCTGCTGTGCCC-3'. Zawiera on miejsce Ndel (podkreślone) i kodon start (pogrubiony);

oligo2 (prawy starter) ma sekwencję 5'-GGTTACCTCCGGGGAACAGCATCGCCGCCCC-3'. Zawiera on mutację T->G (nukleotyd podkreślony i pogrubiony), która przekształca kodon TGC, kodujący cysteinę, w kodon GGC (pogrubiony) kodujący glicynę.

Łańcuch nukleotydowy otrzymany po technice PGR przeprowadzonej przy użyciu BioRad Gene Cycler poddano reakcji uzupełnienia nukleotydami wolnych końców (wypełnienia) , a następnie trawieniu enzymem restrykcyjnym Ndel. Uzyskany fragment z „tępymi” końcami/Ndel sklonowane w odpowiadające im. „tępe” końce/Ndel prokariotycznego wektora ekspresyjnego pET3 według standardowych protokołów. W ten sposób został wytworzony plazmid pETSPLGFlCG kodujący zmutowane biało PLGF-i zwane PLGF-1CG.

Ten plazmid zastosowano zgodnie ze znanymi technikami w celu przekształcenia szczepu E. coli [B12(DE3)pLysS] (Promega Corporation USA) i wytworzono szczep gospodarza [B12(DE3)pLysS PLGF-1CG].

Technika konstruowania zastosowana w przypadku tego plazmidu jest przedstawiona na rysunku 5.

P r z y k ł a d 2:

Wytwarzanie, ekstrakcja i oczyszczanie zmutowanego białka PLGF-1CG.

Mikroorganizm [B121DE3)pLysS PLGF-1CG] hodowano w fermentatorze przy użyciu jako pożywki hodowlanej roztworu SBM zawierającego:

Roztwór A (na 1 litr) ekstrakt drożdżowy Bacto (Difco) 34 g siarczan amonu 2,5 g glicerol 100 ml

H2O do: 900 ml

Roztwór B (10 X) (na 100 ml) KH2PO4 1,7 g

KH2PO4 - 3H2O 20 g lub

KH2PO4 15,26 g

H2O do: 100 ml

Roztwory A i B miesza się sterylnie w czasie użycia.

Ekspresję indukuje się przy użyciu IPTG (izopropylo-e-D-tiogalaktopiranozydu) 1 mM.

Fermentację poprzedza etap wstępnego zaszczepienia. Bierze się probówkę z liofilizowanym mikroorganizmem i zawiesza w 1 ml SBM + 100 μg/ml ampicyliny + 34 μg/ml chloramfenikolu, zawiesinę następnie się rozcieńcza i inkubuje w 37°C przez jedną noc. Po rozcieńczeniu tym samym roztworem SBM z dodatkiem ampicyliny i chloramfenikolu wstępny inokulat dzieli się na 4 kolby Erlenmeyera.

Zawartość każdej kolby Erlenmeyera inkubuje się w 37°C przez 24 godziny. Zawartość 4 kolb Erlenmeyera miesza się i odczytuje OD⁶⁰⁰, rozcieńczając wodą 1/20 (50 μl + 950 μl wody).

Ustaloną objętość wstępnego inokulatu następnie się wiruje przez 10 min w 7500 x g w 4°C w sterylnych probówkach. Bakterie następnie się ponownie zawiesza w 20 ml SBM + 200 μg/ml ampicyliny + 10 μg/ml chloramfenikolu na litr fermentacji mieszając przy 420 rpm w temp. pokojowej przez 20 minut.

Fermentację przeprowadza się w roztworze SBM zawierającym 200 μg/ml ampicyliny, 10 μg/ml chloramfenikolu i odpowiedniej ilości środka przeciw pienieniu się w temperaturze 31°C i w obecności (30%) rozpuszczonego O2 oraz wartości pH pomiędzy 6,4 a 7,4.

Indukcję rozpoczyna się, kiedy pożywka hodowlana osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm. (OD⁶⁰⁰) pomiędzy 16-20 jednostek.

Stosowanym czynnikiem indukującym jest IPTG 1 mM w obecności 10% rozpuszczonego O2 (w odniesieniu do nasycenia powietrzem). Czas trwania indukcji wynosi około 3 godzin. Indukcję kontroluje

PL 209 955 B1 się przez wykonanie elektroforezy SDS-PAGE, nanosząc 20 μΐ uprzednio zagotowanego roztworu przed i po indukcji.

Pożywkę hodowlaną zawierającą indukowane bakterie następnie się wiruje przy 7500 x g przez 10 min lub przy 3000 x g przez 25 min w 4°C, a supernatant się wylewa.

Komórki bakteryjne poddaje się następnie lizie i następującej potem ekstrakcji i oczyszczaniu ciał inkluzyjnych. Lizę bakteryjną przeprowadza się przy użyciu 2 cykli zamrażania/rozmrażania w -80/37°C w roztworze do lizy zawierającym 1 mM MgSO4 + 20 mM Tris-HCl pH 3 + 1% Triton X100.

Mieszaninę lityczną inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 30 min mieszając (250 RPM), a następnie przelewa się do miksera o odpowiedniej pojemności rozcieńczając ilością roztworu do przemywania, zawierającego 0,5% Triton X100 + 10 mM EDTA pH 8, równoważną 3 ml na 450 OD⁶⁰⁰bakterii.

Jeśli to konieczne, do każdego mililitra próbki dodaje się 0,4 μΐ nierozcieńczonego środka przeciw pienieniu się.

Roztwór miksuje się przy maksymalnej szybkości przez 1 minutę lub dopóki próbka nie będzie homogenna. Zawartość miksera następnie przenosi się do pojemnika o odpowiedniej pojemności, odpowiednio rozcieńcza 6,5 ml roztworu do przemywania na każde 450 OD⁶⁰⁰ bakterii, zawiesinę otrzymaną w ten sposób wiruje się przy 13000 x g przez 45 min w 25°C, a supernatant wylewa się.

Cały proces przemywania powtarza się przez szereg cykli dopóki nie uzyska się końcowego osadu zawierającego ciała inkluzyjne z ulegającym ekspresji białkiem.

Potem, osad zawierający ciała inkluzyjne rozpuszcza się w 7 ml buforu denaturującego BD (8 M mocznik, 50 mM Tris pH 8, etylenodiamina 20 mM), następnie roztwór rozcieńcza się tak, aby doprowadzić do końcowego stężenia mocznika 5 M. Renaturację białka przeprowadza się na roztworze w ten sposób uzyskanym przez dodanie zredukowanego glutationu (stężenie końcowe równoważne 1,25 mM) i utlenionego glutationu (stężenie końcowe równoważne 0,5 mM) i inkubację w 20°C przez 18-20 godzin mieszając.

Po zakończeniu okresu inkubacji wiruje się przez 10 min w 20°C, 10000 x g i sączy przez filtry 0,45 lub 0,8 μm.

Zmutowane białko w postaci zrenaturowanej, tj. w postaci dimerycznej, poddaje się oczyszczaniu przy użyciu chromatografii anionowymiennej.

Roztwór zmutowanego białka nanosi się na złoże Q-Sepharose Fast Flow (Amersham biosciences) zrównoważone buforem A (20 mM etanoloamdny-HCl pH 8,5) i wymywa, po przemyciu, 20% buforem B (bufor A + 1 M NaCl), odpowiadającym, stężeniu NaCl 200 mM.

Częściowo oczyszczone zmutowane białko uzyskuje wyższy stopień czystości w wyniku chromatografii z odwróconymi fazami. W tym celu wyeluowany z chromatografii jonowymiennej pik rozcieńcza się roztworem zawierającym TFA i etanol tak, aby próbka była rozcieńczona 1,5 raza i zawierała 15% etanolu i 0,3% TFA. Dodanie tych substancji zwiększa wiązanie się zmutowanego białka do złoża z odwróconymi fazami.

Roztwór nanosi się na złoże RP Source (Amersham-Bioscience) o średniej średnicy 15 lub 30 mikronów zrównoważone roztworem zawierającym 40% etanolu i 0,1% TFA. Roztwór przemywający usuwa postać monomeryczną zmutowanego białka, podczas gdy postać dimeryczna wymywana jest wzrastającym gradientem etanolu do osiągnięcia zawartości procentowej etanolu 70%.

Chromatograficzny proces oczyszczania monitoruje się kontrolując absorpcję wyeluowanych frakcji przy 280 nm.

Roztwór dimeru uzyskany w ten sposób przechowuje się w -20°C, a następnie ultradiafiltruje i liofilizuje zgodnie ze znanymi technikami.

P r z y k ł a d 3:

I Badania stabilności zmutowanego białka PLGF-1CG niosącego podstawienie Cys 125 Gly.

Zmutowane białko rozpuszczono w roztworze soli fizjologicznej przy stężeniu teoretycznym 20, 5 i 1 mg/ml. Równocześnie białko PlGF-1 (bez mutacji) także rozpuszczono w roztworze soli fizjologicznej w stężeniu 20 mg/ml. Wszystkie próbki przechowywano w chłodziarce (4-8°C) do 40 dni.

Rzeczywiste stężenie określono przez obliczenie średnich wartości uzyskanych z 3 odpowiednich niezależnych rozcieńczeń. Zastosowano sposób spektrofotometryczny używając długość fali 280 nm i wiedząc, że absorbancja 1 OD (gęstości optycznej), mierzona w kuwecie o standardowej 1 cm. drodze optycznej, odpowiada stężeniu PlGF-1 i PIGF-1CG równoważnemu 1 mg/ml. Podczas dni następujących po rozpoczęciu doświadczenia (czas 0 w tabeli 1), przed przeprowadzeniem odpowiednich rozcieńczeń w celu określenia stężenia, każdą próbkę wirowano przy 13000 rpm w mikrowirówce ALG

PL 209 955 B1

4212 przez 10 minut, a supernatant stosowano do następującej potem analizy. W ten sposób usunięto możliwe osady i, w konsekwencji, wyniki odnosiły się tylko do białka pozostającego w roztworze.

Wyniki tych badań przedstawione są w tabeli 1 i wyraźnie pokazują, że zmutowane białko we wszystkich analizowanych stężeniach (20, 5 i 1 mg/ml) i przynajmniej do 40 dni jest stabilne, to znaczy nie ma tendencji do wytrącania się tak bardzo, że stężenie okazuje się pozostawać przy wartościach początkowych. Vice versa, tylko po 4 dniach przechowywania tylko 7,3% białka bez mutacji, przechowywanego w stężeniu 20 mg/ml w tych samych warunkach co zmutowane białko, pozostaje w roztworze. Ta wartość spada jeszcze bardziej (5,5%) po 12 dniach. Ważne jest, by zauważyć, że nawet po 24 godzinach przechowywania w 4-8°C zauważa się obfite wytrącanie białka PlGF-1 bez mutacji.

T a b e l a 1.

Czas przechowywania w 4-8°C (dni)	Średnie stężenie (mg/ml)
PIGF-1CG 20 mg/ml	S.D.	PIGF-1CG 5 mg/ml	S.D.	PIGF-1CG 1 mg/ml	S.D.	PlGF-1 20 mg/ml	S.D.
0	20,38	1,00	5,43	0,04	1,07	0, 02	20,14	0,18
4	19, 69	0,57	5,25	0,27	0,98	0,08	1,57	0,10
12	20,46	0,54	5,28	0,19	1,00	0,01	1,11	0,01
26	20,72	0,33	N. A.		N.A.		N.A.
40	20, 32	0,75	N. A.		N.A.		N.A.

S.D.= odchylenie standardowe N.A.= nie analizowano

Profil elektroforetyczny (zawartość monomeru-dimeru-polimeru) dla zmutowanego białka PIGF-1CG (Fig. 1) także jest zasadniczo stabilny w warunkach wskazanych powyżej. W rezultacie, elektroforeza SDS-PAGE w warunkach nieredukujących białka PlGF-1CG, rozpuszczonego w roztworze soli fizjologicznej przy 20 mg/ml i zamrożonego (kontrola, ścieżka 1 na fig. 1) lub przechowywanego w 4-8°C przez 40 dni (próbka, ścieżka 2 na fig. 2), zasadniczo ujawnia tylko minimalne zmiany, reprezentowane przez zniknięcie niewielkiej części monomerycznej i przez utworzenie niezwykle małej ilości trimeru (<0,5% dimeru).

P r z y k ł a d 4:

II Badania stabilności zmutowanego białka PLGF-ICG przygotowanego w postaci żelu.

Zmutowane białko PlGF-1CG i niezmutowane białko PlGF-1 rozpuszczono w stężeniu 0,2 mg/ml w żelu, który składa się z:

CARBOPOL 940 = 1% P/V octan sodu pH 4,4 = 15 mM sól disodowa EDTA bez ustalonego pH = 0,04% P/V paraben metylowy = 0,05% P/V pH doprowadzono do wartości pomiędzy 5,5 a 6 przy użyciu NaOH/kwas octowej.

żele przechowywano w 4-8°C. W różnym czasie pobrano część, w dwóch powtórzeniach, z 2 żeli (około 0,2 ml) i zważono na wadze analitycznej.

Do zważonych próbek dodano objętość, wyrażoną w mikrolitrach, nieredukującego buforu do próbek 2x równoważną masie, wyrażonej w miligramach, części żelu.

Po mieszaniu z wytrząsaniem przez 10 minut i wirowaniu przy 13000 rpm (mikrowirówka ALC 4214) przez dalsze 10 minut supernatant usunięto. Pozostałość wirowano ponownie i usunięto nowy supernatant. Część tego ostatniego osadu, razem ze standardami wielkości, analizowano przy użyciu densytometru w celu znalezienia stężenia postaci dimerycznej w analizowanych próbkach.

Wyniki uzyskane w różnym czasie i wyrażone, jako zawartość procentowa dimeru względem tej występującej w czasie zero są przedstawione w tabeli 2 i wyrażone w postaci graficznej na fig. 2. Na podstawie tych danych można zauważyć, że podczas gdy ilość dimeru PIGF-1CG pozostaje stała do końca analizowanego okresu 170 dni, ilość PlGF-1 spada do 71% po 150 dniach i do 55% po 210 dniach.

Profil elektroforetyczny (zawartość monomeru-dimeru-polimeru) także pokazuje, że zmutowane białko PlGF-1CG jest zasadniczo stabilne w warunkach wskazanych powyżej (fig. 3). W rezultacie,

PL 209 955 B1 elektroforeza SDS-PAGE w warunkach nieredukujących białka P1GF-1CG, rozpuszczonego w żelu carbopol w 0,20 mg/ml i zamrożonego (kontrola, ścieżka 2 na fig. 3) lub przechowywanego w 4-8°C przez 170 dni (próbka, ścieżka 1 na fig. 3), nie wykazuje żadnych zjawisk polimeryzacji. Vice versa, te zjawiska polimeryzacji są wyraźnie widoczne w przypadku niezmutowanego białka PlGF-1, jak to przedstawiono na fig. 4 (porównaj ścieżkę 1 - białko przechowywane w 4-8°C przez 150 dni ze ścieżką 2 zamrożone białko).

Tabela 2.

Czas przechowywania w 4-8°C (dni)	% dimeru
Żel z PIGF-1CG (zmutowane białko)	Żel z PlGF-1
0	100,00	100,00
30	108,00	N.A.
57	N.A.	83,40
119	N.A.	72,70
133	98,70	N.A.
150	N.A.	71,10
170	101,50	N.A.
210	N.A.	54,90

N.A.= nie analizowano

P r z y k ł a d 5:

Oszacowanie aktywności angiogennej zmutowanego białka PLGF-1CG.

Aktywność angiogenną zmutowanego białka PLGF-ICG, czynnika PLGF-1 dzikiego typu i, jako kontroli pozytywnej, zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) porównywano przy użyciu testu rozwoju naczyń krwionośnych w błonie kosmówki omoczniowej (GAM, ang. chorioallantoid membranę) opisanego już przez Maglione i wsp. („II Farmaco” powyżej). Absorbowano różne ilości zmutowanego białka i czynnika dzikiego typu (pomiędzy 0 a 3 mcg/gąbkę) na 1 mm³ gąbki żelatynowej, wszczepianej następnie na powierzchnię GAM. Po 12 dniach regiony GAM pozostające w kontakcie z próbkami wycięto, wybarwiono i oszacowano ilościowo efekt angiogenny przy użyciu techniki morfogenetycznej znanej, jako „liczenie punktów”. W szczególności, wycinki GAM analizowano pod mikroskopem na siatce z 144 punktami przecięcia, a wyniki wyrażono, jako zawartość procentowa punktów przecięcia zajmowanych przez naczynia włosowate w przekroju poprzecznym (zawartość procentowa obszaru, na którym rozwijają się naczynia krwionośne). Wyniki, przedstawione na fig. 6, pokazują zasadniczo równoważną aktywność angiogenną dla zmutowanego białka i czynnika typu dzikiego.

P r z y k ł a d 6:

Oszacowanie efektu zmutowanego białka PLGF-1CG na niedokrwienie serca indukowane izoprenaliną.

Wpływ zmutowanego białka PLGF-1CG na niedokrwienie serca i zawał oszacowano na przykładzie niedokrwienia indukowanego w modelu zwierzęcym za pomocą izoprenaliny, jak to opisano przez Maglione i wsp. (powyżej), w porównaniu z czynnikiem dzikiego typu. Doświadczenie przeprowadzono na królikach, które leczono pojedynczą dzienną dawką 160 mcg/kg zmutowanego białka lub równoważnymi objętościami samej zarobki, podawanej dożylnie w dniach 1 do 5. Izoprenalinę podano podskórnie w dniach 1 i 2. Cechy charakterystyczne typowe dla elektrokardiogramu (EKG) wskazującego na centralne uszkodzenie niedokrwienne, takie jak odwrócenie fali T, poszerzenie fali S i uwypulkenie fali Q, są zdecydowanie bardziej zaznaczone, po zbadaniu, u zwierząt leczonych samą zaróbką w porównaniu ze zwierzętami leczonymi zmutowanym białkiem. Wariacje w EKG zwierząt leczonych i nieleczonych oszacowano w skali punktowej o zakresie od zera do sześciu, jak to przedstawiono poniżej: 0, żadnych zmian; 1, uwypuklenie fali S; 2, uwypuklenie fali T; 3, obniżenie się ramienia opadającego fali T; 4, poszerzenie fali S; 5, odwrócenie fali T; 6, uwypuklenie fali Q. Całkowity obszar pod krzywą określony przez punkty EKG podczas pięciu dni testowania został obliczony podobnie dla zwierząt leczonych i nieleczonych. Wyniki są przedstawione na fig. 7 i pokazują znaczące

PL 209 955 B1 zmniejszenie uszkodzenia niedokrwiennego u zwierząt leczonych zmutowanym białkiem PLGF-1. Wyniki podkreślone przez profil elektrokardiograficzny zostały potwierdzone przez obserwacje makroi mikroskopowe tkanek z niedokrwieniem. To badanie pokazuje obecność zmian niedokrwiennych i zmian histologicznych o umiarkowanej ciężkości w porównaniu z tymi obserwowanymi w tkance sercowej zwierząt leczonych samą zaróbką.

P r z y k ł a d 7:

Oszacowanie efektu zmutowanego białka PLGF-1CG na twardzinę skóry indukowaną neomycyną.

W tym badaniu zastosowano zwierzęcy model twardziny skóry opisany przez Yamamoto i wsp. (powyżej).

Pierwszą grupę myszy C3H leczono bleomycyną (100 mcg/ml) wstrzykiwaną podskórnie codziennie przez 3 tygodnie. Trzy inne grupy myszy C3H leczono podobnie jak powyżej, ale do codziennego zastrzyku dodano odpowiednio 0,1, 1 i 10 mcg/ml zmutowanego białka PlGF-1CG. Po 3 tygodniach leczenia zwierzęta uśmiercono i pobrano próbki skóry z leczonych obszarów i poddano je analizie histologicznej. Efekt leczenia PlGF-1CG przy 1 i 10 mcg/ml, ale nie przy 0,1 mcg/ml, podkreśla znaczące zmniejszenie cech histologicznych, które można przypisać stwardnieniu skóry indukowanemu bleomycyną. W szczególności, pogrubienie skóry i poziom hydroksyproliny były znacząco zmniejszone w porównaniu z myszami leczonymi samą bleomycyną.

P r z y k ł a d 8:

Kompozycje farmaceutyczne

i) Roztwór do zastosowania pozajelitowego:

miligramów liofilizowanego zmutowanego białka, zawierającego 25 mg/ml czystego PLGF-1CG i 33 mg buforu fosforanowego (10 mg NaH2PO4/H2O i 23 mg Na2HPO4/2H2O) i około 125 ml roztworu soli fizjologicznej do zastosowania pozajelitowego pakuje się oddzielnie do fiolek przygotowanych tak, aby pozwolić na mieszanie się liofilizowanego produktu z rozcieńczalnikiem bezpośrednio przed użyciem. Stężenie substancji aktywnej otrzymane po rozpuszczeniu wynosi około 0,2 mg/ml.

ii) Kompozycja do zastosowania miejscowego w postaci żelu:

Ilość liofilizowanej substancji zawierająca 10 mg substancji aktywnej rozprowadza się w 20 ml 10% etanolowego roztworu wodno-alkoholowego zawierającego 20% DMSO. Do roztworu następnie dodaje się odpowiednią zaróbkę żelową zawierającą następujące składniki: 1% Carbopol 940, octan sodu 15 mM (pH 4,4), 0,04% p/v dwusodowej soli EDTA, 0,05% p/v parabenu metylowego o końcowym pH zawartym pomiędzy 5,5 a 6.

PL 209 955 B1

LISTA SEKWENCJI

Geymonat S.r.L.

Zmutowane białko PLGF-1 BW285R

Patent w wersji 3.1

418

DNA

Homo sapiens <11O <120>

<130 <160>»' <170 <210 <211>

<212>

<213>

<220>

<221> CDS <222> (10)..(408) <223> Sekwencja bez DNA kodującego peptyd sygnałowy białka dzikiego typu. Nukleotydy IU-408 kodują aminokwasy 19-149 białka opisanego w zastrz. 1 EP 0550519.

<400> 1 ctggcgcat atg ctg cct gct gtg ccc ccc cag cag tgg gcc ttg tct gct Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gin Gin Trp Ala Leu Ser Ala 15 10

ggg aac

ggc

tcg

tca

gag

gtg

gaa

gtg

gta

ccc

ttc

cag

gaa

gtg

tgg

Gly Asn

Gly

Ser

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Phe

Gin

Glu

Val

Trp

15

20

25

30

ggc

cgc

agc

tac

tgc

cgg

gcg

ctg

gag

agg

ctg

gtg

gac

gtc

gtg

tcc

Gly

Arg

Ser

Tyr

Cys

Arg

Ala

Leu

Glu

Arg

Leu

Val

Asp

Val

Ser

35

40

45

147

gag

tac

ccc agc

gag

gtg

gag

cac

atg

ttc

agc

cca

tcc

tgt

gtc

tcc

Glu

Tyr

Pro Ser

Glu

Val

Glu

His

Met

Phe

Ser

Pro

Ser

Cys

Val

Ser

50

55

60

195

ctg

cgc

tgc

acc ggc

tgc

ggc

gat

gag

aat

ctg

cac tgt

gtg

Leu

Arg

Cys

Thr Gly

Cys

Gly

Asp

Glu

Asn

Leu

His Cys

Val

65

70

75

243

PL 209 955 B1

ccg Pro

gtg Val 80

gag Glu

acg gcc

aat Asn

gtc Val 85

acc Thr

atg Met

cag Gin

ctc Leu

eta Leu 90

aag Lys

atc Ile

cgt Arg

tet Ser

291

Thr

Ala

ggg

gac

cgg

ccc

tcc

tac

gtg

gag

ctg

acg

ttc

tet

cag

cac

gtt

ege

339

Gly

Asp

Arg

Pro

Ser

Tyr

Vąl

Glu

Leu

Thr

Phe

Ser

Gin

His

Val

Arg

95

100

105

110

tgc

gaa

tgc

cgg

cct

ctg

cgg

gag

aag

atg

aag

ccg

gaa

agg

tgc

ggc

387

Cys

Glu

Cys

Arg

Pro

Leu

Arg

Glu

Lys

Met

Lys

Pro

Glu

Arg

Cys

Gly

115

120

125

gat

gct

gtt

ccc

cgg

agg

taa

cccaggatcc

418

Asp

Ala

Val

Pro

Arg

130

<210>	2
<211>	132
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	2

Met 1

Leu

Pro

Ala Val 5

Pro

Gin

Trp 10

Ala

Leu Ser Ala

Gly 15

Asn

Gly

Ser

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Phe

Gin

Glu

Val

Trp

Gly

Arg

20

25

30

Ser

Tyr

Cys

Arg

Ala

Leu

Glu

Arg

Leu

Val

Asp

Val

Ser

Glu

Tyr

35

40

45

Pro

Ser

Glu

Val

Glu

His

Met

Phe

Ser

Pro

Ser

Cys

Val

Ser

Leu

50

55

60

Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val 65 70 75 30

PL 209 955 B1

Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gin Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp 85 90 95

Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gin His Val Arg Cys Glu 100 105 110

Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala 115 120 125

Val Pro Arg Arg 130 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Lewy starter do namnażania ludzkiego białka PLGF-1 <400> 3 ctggcgcata tgctgcctgc tgtgccc <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Prawy starter do namnażania ludzkiego białka PLGF-1 <400> 4 ggttacctco ggggaacagc atcgccgccc c

Claims

1. Zmutowane białko ludzkiego lub zwierzęcego łożyskowego czynnika wzrostu typu 1 (PLGF-1, ang. type 1 Placental Growth Factor) w postaci monomerycznej, znamienne tym, że posiada podstawienie lub usunięcie w sekwencji polipeptydowej białka typu dzikiego przynajmniej reszty cysteiny (Cys) w pozycji 142 sekwencji polipeptydowej prebiałka, odpowiadającej cysteinie w pozycji 125 w SEK ID NR: 2, i że to podstawienie lub eliminacja nie wpływa na tworzenie się biologicznie aktywnego dimeru, ale zapobiega multimeryzacji tej postaci monomerycznej.

2. Zmutowane białko według zastrz. 1, znamienne tym, że reszta Cys w pozycji 142 jest zastąpiona przez resztę glicyny (Gly).

3. Zmutowane białko według zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że jest w postaci prebiałka lub białka dojrzałego.

4. Zmutowane białko według zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że następny lub następne aminokwasy białka typu dzikiego jest usuwanych, zastępowanych lub dodawanych bez zmiany aktywności angiogenicznej zmutowanego białka.

5. Zmutowane białko według zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że jest w postaci dimerycznej.

6. Zmutowane białko według zastrz. 5, znamienne tym, że zawiera przynajmniej 98,5% postaci dimerycznej.

7. Sekwencja nukleotydowa zawierająca DNA kodujący zmutowane białko zdefiniowane w zastrz. 1 do 4.

8. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 7, znamienna tym, że kodon TGC lub kodon TGT w sekwencji kodującej PLGF-1 typu dzikiego jest usunięty lub zmodyfikowany.

9. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 8, znamienna tym, że kodon TGC lub TGT jest podstawiony przez kodon CCC, GGT, GGA lub GGG.

10. Sekwencja nukleotydowa według zastrz. 9, znamienna tym, że zasada tymidynowa w pozycji 382 sekwencji SEK ID NR:1 lub jej pochodna, otrzymana w wyniku degeneracji DNA, jest podstawiona przez zasadę guanidynową.

11. System ekspresji obejmujący sekwencję nukleotydowa zdefiniowaną w zastrz. 7 do 10, oflankowaną sekwencjami nieulegającymi translacji służącymi do kontroli i regulacji ekspresji.

12. System ekspresji według zastrz. 11, znamienny tym, że jest systemem ekspresji indukowalnym w komórkach bakteryjnych.

13. System ekspresji według zastrz. 10 lub 12, znamienny tym, że ekspresja jest pod kontrolą indukowalnego promotora.

14. System ekspresji według zastrz. 11 do 13, znamienny tym, że jest systemem ekspresji polimerazy RNA faga T7 i że ta ekspresja jest indukowana przy użyciu laktozy, izopropylo-e-Dtiogalaktopiranozydu (IPTG).

15. Komórka gospodarza transformowana przy użyciu systemu ekspresji jak zdefiniowano w zastrz. 11 do 14.

16. Komórka według zastrz. 15, znamienna tym, że jest komórką bakteryjną.

17. Komórka bakteryjna według zastrz. 16, znamienna tym, że pochodzi ze szczepu E. coli.

18. Sposób wytwarzania sekwencji nukleotydowej jak zdefiniowano w zastrz. 7 do 10, znamienny tym, że DNA kodujący zmutowane białko jest wytwarzany w wyniku łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) przy użyciu, jako starterów oligonukleotydów, które zostały odpowiednio zmodyfikowane w porównaniu z sekwencją nukleotydową typu dzikiego.

19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako starter 5'-3' (lewy) stosuje się oligonukleotyd o sekwencji SEK ID NR:3 i jako starter 5'-3' (prawy) stosuje się oligonukleotyd o sekwencji SEK ID NR:4.

20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako matrycę w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się sekwencję DNA kodującą białko PLGF-1 bez białka sygnałowego.

21. Sposób według zastrz. 17 do 20, znamienny tym, że sekwencja DNA otrzymana w łańcuchowej reakcji polimerazy jest poddana reakcji wypełniania wolnych końców, następnie trawiona odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i klonowana dc odpowiedniego wektora.

22. Sposób wytwarzania i ekstrakcji zmutowanego białka czynnika PLGF-1, znamienny tym, że komórki gospodarza zdefiniowanej w zastrz. 15 do 17 hoduje się w odpowiedniej pożywce hodowlanej, ekspresję białka indukuje się przy użyciu odpowiedniego induktora, a komórki izoluje się i poddaje lizie a następnie zmutowane białko ekstrahuje się z mieszaniny po lizie.

PL 209 955 B1

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że pożywka hodowlana zawiera jeden lub więcej czynników selekcyjnych, ekstrakt drożdżowy, glicerol i sole amonu oraz jest wolna od substancji pochodzenia zwierzęcego lub ludzkiego.

24. Sposób według zastrz. 22 lub 23, znamienny tym, że komórki hoduje się przed etapem indukcji ekspresji, dopóki gęstość optyczna (O.D.) pożywki hodowlanej przy 600 nm nie osiągnie wartości pomiędzy 0,2 a 50 jednostek.

25. Sposób według zastrz. 22 do 24, znamienny tym, że ekspresję indukuje się przy użyciu laktozy lub izopropylo-(3-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG).

26. Sposób według zastrz. 22 do 25, znamienny tym, że lizę komórek przeprowadza się przy użyciu zamrażania/rozmrażania, prasy francuskiej lub innych równoważnych technik.

27. Sposób według zastrz. 24 do 28, znamienny tym, że ciała inkluzyjne uwolnione podczas lizy izoluje się przy użyciu przynajmniej dwóch cykli wirowania i przemywania odpowiednim buforem.

28. Sposób według zastrz. 22 do 27, znamienny tym, że ciała inkluzyjne rozpuszcza się w buforze denaturującym zawierającym mocznik, izotiocyjanian guanidyny, chlorowodorek guanidyny lub inne środki denaturujące i opcjonalnie homogenizuje się lub sonikuje.

29. Sposób według zastrz. 22 do 28, znamienny tym, że po rozpuszczeniu ciał inkluzyjnych roztwór rozcieńcza się, a substancje białkowe renaturuje do postaci dimerycznej przez dodanie do roztworu czynników oksydo-redukcyjnych i inkubację prowadzi się przez 10 do 30 godzin, korzystnie 18 do 20 godzin w temperaturze od 10°C do 30°C, korzystnie 20°C, mieszając.

30. Sposób według zastrz. 22 do 29, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej jeden etap oczyszczania białka dimerycznego.

31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że etap oczyszczania składa się z chromatografii jonowymiennej.

32. Sposób według zastrz. 30 lub 31, znamienny tym, że roztwór z etapu renaturacji nanosi się na kolumnę anionowymienną o stosunku objętości nanoszenia/objętości kolumny od 1:1 do 10:1, korzystnie 10:1.

33. Sposób według zastrz. 30 lub 31, znamienny tym, że obejmuje etap oczyszczania na kolumnie przez chromatografię z odwróconymi fazami.

34. Sposób według dowolnego z zastrz. 22 do 33, znamienny tym, że obejmuje dodatkowy etap ultrafiltracji, a następnie liofilizacji w obecności lub w nieobecności odpowiednich dodatków.

35. Zmutowane białko zdefiniowane w zastrz. 5 lub 6 do zastosowania w sposobie leczenia terapeutycznego.

36. Zmutowane białko według zastrz. 35, znamienne tym, że jest do leczenia chorób niedokrwiennych.

37. Zmutowane białko według zastrz. 36, znamienne tym, że jest do leczenia niedokrwienia tkanki mięśnia sercowego, zawału mięśnia sercowego, udaru niedokrwiennego i przewlekłych chorób niedokrwiennych mięśnia sercowego, niedokrwienia mózgu i udaru niedokrwiennego, niedokrwienia jelit, niedokrwienia obwodowego kończyn.

38. Zmutowane białko według zastrz. 35, znamienne tym, że jest do leczenia twardziny skóry.

39. Zmutowane białko według zastrz. 35, znamienne tym, że jest do leczenia wrzodów skórnych, ran, oparzeń, w leczeniu pooperacyjnym.

40. Zmutowane białko według zastrz. 35, znamienne tym, że jest do leczenia naturalnego lub przedwczesnego starzenia się tkanek skóry.

41. Zmutowane białko według zastrz. 35, znamienne tym, że jest do leczenia naturalnej lub patologicznej utraty włosów.

42. Przeciwciało poliklonalne, monoklonalne lub jego funkcjonalnie aktywny fragment, zdolne do rozpoznawania zmutowanego białka zdefiniowanego w zastrz. 1 do 6, zdolne do reakcji krzyżowej z PLGF-1 dzikiego typu i do zobojętniania jego aktywności angiogenicznej.

43. Przeciwciało według zastrz. 42, znamienne tymi, jest lekiem do zobojętniania aktywności angiogenicznej endogennego PLGF-1 w leczeniu postaci patologicznych towarzyszących zaburzonemu wytwarzaniu PLGF-1.

44. Przeciwciało według zastrz. 42, znamienne tym, że jest do leczenia postaci nowotworu.

45. Przeciwciało według zastrz. 42, znamienne tym, że jest odczynnikiem w sposobie diagnozowania postaci patologicznych towarzyszących zaburzonemu wytwarzaniu endogennego PLGF-1.

46. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera zmutowane białko zdefiniowane w zastrz. 5 lub 6 lub przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 42 i akceptowaną farmaceutycznie zaróbkę.

PL 209 955 B1

47. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 46, znamienna tym, że jest odpowiednia do zastosowania pozajelitowego, miejscowego, doustnego, donosowego lub wszczepienia.

48. Kompozycja kosmetyczna, znamienna tym, że zawiera zmutowane białko zdefiniowane w zastrz. 5 lub 6 i akceptowaną kosmetycznie zaróbkę .

49. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zdefiniowanej w zastrz. 46 lub kompozycji kosmetycznej zdefiniowanej w zastrz. 48, znamienny tym, że zmutowane białko PLGF-1 wiąże się z farmaceutycznie lub kosmetycznie akceptowaną zaróbką i z innymi zwykłymi dodatkami.