KR20040111639A - 태반성장인자 타입 1 뮤테인의 제조방법 및 이의 사용방법 - Google Patents
태반성장인자 타입 1 뮤테인의 제조방법 및 이의 사용방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자연형 단백질의 아미노산 서열에서 시스테인 잔기를 치환 또는 제거한 화학적으로 안정적인 타입 1 태반성장인자(PLGF-1), 이의 제저방법, 이의 치료학적 및 미용학적 사용방법, 및 상기 유도물을 함유하는 약학 및 미용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 유도물에 대한 항체의 제조방법 및 종양 및 비종양성 병변의 진단 및 치료에서 이의 사용방법에 관한 것이다.
Description
타입 1 태반성장인자(PLGF-1)은 혈관신생에 관여하는 호모다이머(homodimer) 당단백질이다. 혈관신생 활성은 다이머 형태와 관련되며, 모노머 형태는 불활성 형태이다. 상기 PLGF-1 단백질의 폴리펩타이드 서열과 함께 이를 코딩하는 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열은 마그리온 및 페르시코의 유럽특허 제550-519호(WO-A-92/06194)에 개시되어 있다.
상기 특허는 유도가능한 발현 시스템을 사용한 변형 박테리아에서 PLGF-1을 제조하는 방법에 대해 기술하고 있는데, 상기 방법은 유도 후, 박테리아를 용균(lysis)시키는 단계 및 상기 용균 용액으로 부터 조(raw) 단백질을 추출하는 단계를 포함한다. 상기 방법으로 얻은 단백질은 생물학적 활성이 낮게 나타났다.
박테리아에서 발현시켜 얻은 조 태반인자의 추출 및 정제방법은 마그리온 등의 국제특허 출원 제PCT/IT02/00065호에 기술되어 있다. 상기 방법은 일련의 추출, 재생 및 정제 과정을 포함하며, 이를 통해서 실질적으로 다이머 형태인 순수 단백질을 얻을 수 있었으며, 최상의 활성 형태는 다이머 형태였다. 사실, 상기 단백질의 모노머 형태는 생물학적으로 불활성이었으며, 다이머 형태로 재생시킨 후에만 혈관신생 기능을 갖는 것으로 알려져 있다.
그러나, 본 발명의 발명자들은 다이머 형태의 단백질이 부분적으로 불안정하며, 수용액 상태에서 보관 또는 가공 과정시 생물학적 활성이 감소되는 멀티머 형태가 될 수 있으며 이러한 이유로 복용량 및 생물학적 활성이 불확실해져 치료시 사용하기에는 부적절함을 발견하였다.
따라서 본 발명의 목적은 수용액에 보전 시 주로 관찰되는 불충분한 PLGF-1의 화학적/생물학적 안정성 문제를 해결하고자 하는 것이다.
- 본 발명의 요약 -
본 발명은 폴리펩타이드 서열의 변형, 구체적으로 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 또는 제거를 포함하는 자연형(wild type) PLGF-1 단백질의 유도물이 상당히 증가된 화학적 안정성을 갖는 동시에, 고유의 생물학적 활성이 본질적으로 변화되지 않고 유지될 수 있다는 예상치못한 발견을 기초로 한다. 이러한 발견의 관점에서, 본 발명의 제1 목적은 자연형 단백질의 폴리펩타이드 서열에 함유된 9개의 시스테인(cys) 잔기 중 적어도 하나를 치환 또는 제거시킨 인간 또는 동물의 타입 1 태반성장인자(PLGF-1)의 모노머 형태 뮤테인(mutein)을 제공하는 데 있다. 상기 치환 또는 제거로 인해 생물학적 활성 형태의 단백질을 얻는 데 필수적인 이합체화(dimerisation)는 영향받지 않으나, 모노머 형태의 중합체 형성(multimerisation)은 방지되었다.
다양한 시스테인 잔기 중에서, C-말단 부분에 존재하는 잔기, 구체적으로 성숙(mature) PLGF-1 단백질 및 신호 펩타이드를 포함하는 완전한 폴리펩타이드 서열의 142번 위치의 잔기를 제거 또는 치환하는 것이 특히 효과적으로 나타났다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, Cys 142 잔기를 글리신(Gly) 잔기로 교체하였다. 상기 치환을 통해서 이합체화 능력은 변하지 않으나 기본적으로 중합체 생성은 불가능한 모노머 형태의 PLGF-1 뮤테인이 생성되었다. 상술한 변형 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 뮤테인은 하나 이상의 자연형 아미노산을 더욱 제거, 치환 또는 첨가시킬 수 있으며, 이러한 변형은 뮤테인 자체의 기능적 특징을 변화시키지는 않았다.
본 발명의 제2 목적은 필수적으로 다이머만을 포함하도록 바람직하게 정제시킨 다이머 형태의 인자 PLGF-1의 뮤테인을 제공하는 것이다. 상기 뮤테인은 N-말단 부분에 신호 펩타이드를 포함하는 성숙 단백질(mature protein) 또는 전-단백질(pre-protein)과 거의 동일하다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뮤테인을 코딩하는 DNA를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다. 상기 서열은 자연형 PLGF-1 서열에서 시스테인 아미노산을 코딩하는 TGC 또는 TGT 코돈이 제거 또는 변형된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 시스테인에 상응하는 상기 코돈은 GGC, GGT, GGA 또는 GGG 코돈으로 치환하였으며, 상기 코돈은 모두 글리신(Gly)을 코딩한다. 상기GGC 코돈을 생성시키기 위해서 서열번호 1로 표시되는 서열의 382번 위치(TGC 코돈)의 티미딘 염기(T)를 구아니딘 염기(G)로 교체하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적은 발현을 제어 및 조절하는 비번역 서열이 측면에 위치하는 상술한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 시스템을 제공하는 데 있다. 상기 시스템은 원핵 세포, 바람직하게 박테리아 세포에서 유도된다.
유도가능한 프로모터의 제어하에 발현되며 적당한 화합물에 의해 발현이 유도된다. 상기 발현 시스템을 사용하여 변형된 숙주 세포 또한 본 발명의 목적이다. 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 바람직하게는E. coli와 같은 박테리아 세포이다. 본 발명은 또한 자연형 단백질 서열에 대해 적절하게 변형된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)(PCR)을 통해 상기 뮤테인을 코딩하는 DNA를 제조하는 뉴클레오타이드 서열의 제조방법을 포함한다. 바람직하게 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드를 5'-3' 전방향 프리아머로 사용하고 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드를 5'-3' 역방향 프라이머로 사용한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 발현 시스템을 사용하여 변형시킨 숙주 세포, 바람직하게 박테리아 세포를 적절한 배양 배지에 배양시키고, 적절한 유도인자로 단백질 발현을 유도시켜서, 상기 세포를 분리하고 용균시켜서 용균 혼합물로 부터 뮤테인을 추출하는 뮤테인의 제조 및 추출 방법을 제공한다. 발효 배양 단계 시 및 발현 유도 단계 전에, 상기 세포는 배양 배지의 흡광도(O.D.)가 높아질때 까지 배양시킨다. 이후 단계에서 배양 배지로 세포내 물질, 구체적으로 핵산물질 및 불용성 응집체(inclusion bodies)가 방출되도록 상기 세포를 용균시키고, 상기 불용성 응집체를 용해시켜서 얻은 단백질을 다이머 형태로 재생시킨다. 상기 추출 및 정제 과정은 선택적을 상기 다이머 단백질의 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 과정은 이온 교환 또는 역상 크로마토그래피를 사용하는 적어도 하나의 추가적인 정제 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 과정은 초기에 음이온 교환 크로마토그래피 정제 후 역상 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 제조, 추출 및 정제 단계를 사용하여 얻은 뮤테인은 98.5% 이상의 활성 단백질을 함유하고 1.5% 미만의 모노머 형태를 함유한다. 상기 활성 형태는 필수적으로 다이머 형태로 이루어지고, 단지 소량의 멀티머 형태만을 함유한다. 안정성 테스트를 통해서 상기 다이머 형태의 뮤테인은 통상적인 보관 및 가공 과정 동안 높은 안정성을 분명하게 나타내었다.
본 발명은 타입 1 태반성장인자(PLGF-1)의 안정한 뮤테인(mutein), 이의 제조방법, 이의 치료 및 미용학적 사용방법 및 상기 유도물을 함유하는 약학 및 미용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 유도물에 대한 항체의 제조방법 및 종양 및 비종양성 병변의 진단 및 치료에서 이의 사용방법에 관한 것이다.
도 1은 20㎎/㎖으로 생리 식염수에 재현탁시키고 4-8℃에서 40일 동안 보관시킨 후의 PLGF-1CG의 SDS-PAGE 전기 영동 프로파일을 나타내는 도면이다. 상기 프로파일은 곧바로 용해시킨 뮤테인의 프로파일과 비교하였다.
(M)은 분자량 대조구를 나타내고; (1)은 20㎎/㎖의 농도로 생리 식염수에 용해시키고 동결시킨 PLGF-1CG(3마이크로그램)(대조구)을 나타내며; (2)는 20㎎/㎖의 농도로 생리 식염수에 용해시키고 4-8℃에서 40일간 보관한 PLGF-1CG(3마이크로그램)을 나타낸다.
도 2는 표 2의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 0.2㎎/㎖로 카보폴(Carbopol) 겔에 용해시키고 4-8℃에서 170일 간 보관한 뮤테인 PLGF-1CG의 SDS-PAGE 전기영동 프로파일을 나타내는 도면이다. (M)은 분자량 대조구를 나타내고; (1)은 0.2㎎/㎖의 농도로 카보폴(Carbopol) 겔에 용해시키고 4-8℃에서 170일 간 보관한 PLGF-1CG(2마이크로그램)을 나타내고; (2)는 0.2㎎/㎖의 농도로 카보폴(Carbopol) 겔에 용해시키고 동결시킨 PLGF-1CG(대조구)를 나타낸다.
도 4는 0.2㎎/㎖로 카보폴(Carbopol) 겔에 용해시키고 4-8℃에서 150일 간 보관한 원형(native form) PLGF-1의 SDS-PAGE 전기영동 프로파일을 나타내는 도면이다. (M)은 분자량 대조구를 나타내고; (1)은 0.2㎎/㎖의 농도로 카보폴(Carbopol) 겔에 용해시키고 4-8℃에서 150일 간 보관한 PLGF-1(2마이크로그램)을 나타내고; (2)는 0.2㎎/㎖의 농도로 카보폴(Carbopol) 겔에 용해시키고 동결시킨 PLGF-1(2마이크로그램)(대조구)을 나타낸다.
도 5는 PLGF-1CG로 명명한 PLGF-1 뮤테인을 코딩하는, 플라즈미드 pET3PLGF1CG의 제작 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 농도가 증가함에 따른 자연형 PLGF-1 및 뮤테인 PLGF-1CG의 혈관신생 활성을 나타내는 도면이다. bFGF(basic fibroblast growth factor)의 활성을 대조구로 나타내었다.
도 7은 이소프레날린-유발 허혈 손상을 유발시킨 토끼의 심장 조직에 대한 뮤테인 PLGF-1CG의 효과를 나타내는 도면이다. x축은 처리한 날을 날마다 ECG를 통해 확인한 곡선내에 총 면적을 나타내고 AUC 값이 포함된다.
서열 목록 :
서열번호 1 : 신호 펩타이드가 없는 자연형 PLGF-1의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 2 : 자연현 PLGF-1의 뉴클레오타이드 서열.
서열번호 3 : PCR에서 전방향 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 서열.
서열번호 4 : PCR에서 역방향 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 서열.
인자 PLGF-1을 코딩하는 서열을 포함하는 1645 뉴클레오타이드의 cDNA와 함께, 149아미노산의 인간 PLGF-1 인자의 완전한 폴리펩타이드 서열은 유럽 특허 제550-519호에 기술되어 있다. 자유롭게 이용할 수 있는 1645 염기의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라즈미드는 기탁번호 ATCC 40892로 ATCC에 기탁되어 있다.
전-단백질을 코딩하는 서열은 322번 내지 768번 위치를 포함하며 서열번호 1로 표시하였다.
전-단백질 형태의 자연형 PLGF-1은 N-말단 부분에 18개 아미노산의 신호 펩타이드를 포함하는 149개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이다. 19번 및 149번 위치로 정해진 성숙 단백질의 서열은 서열번호 2로 표시하였다. 상기 서열은 35, 60, 66, 69, 70, 77, 111, 113, 및 125 위치에 9개의 시스테인(Cys) 잔기를 포함한다.
본 발명에 따른 뮤테인은, 상기 시스테인 잔기 중 적어도 하나가 제거되었거나 다른 잔기로 치환되었으며, 이러한 돌연변이로 인해 생물학적 활성 및 치료학적으로 유용한 다이머 형태를 생성시킬 수 있는 모노머 형태의 뮤테인의 능력에 상당한 영향을 받거나 이러한 능력이 없어지지 않는다. 실험 자료에 의하면 제거되거나 치환된 잔기는 상기 단백질의 C-말단에 위치하는 것이 바람직하고, 본 발명의 목적을 위한 최적의 잔기는 125번 위치의 잔기이다.
자연형 태반성장인자의 뮤테인은 문헌을 통해 알 수 있는 폴리머 합성법을 통해 합성하여 제조할 수 있다. 그러나, 바람직한 방법은 유전적으로 변형시킨 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 것이다. 이러한 목적을 위해서 적절하게 변형시킨 PLGF-1 유전자에 해당하는 삽입물을 포함하는 클로닝 벡터 및/또는 발현 벡터를 도입시켜 숙주 세포를 형질전환시킨다.
본 발명에 따른 뮤테인을 코딩하는 DNA의 제조는 점-돌연변이 유발법(site-specific mutagenesis)을 통해 수행되었고 시스테인에 해당하는 코돈, 즉 TGC 또는 TGT 코돈에 점 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 돌연변이의 하향으로 해독 구조 이동(reading frame shift)없이, 하나이상의 염기를 삭제 또는 치환시키게 된다. 삭제시킨 경우는 완전한 코돈을 제거해야 한다. 바람직하게, 점-돌연변이 유발법은 새로운 코돈이 형성되도록 시스테인 코돈의 염기 하나를 치환시키는 것이다. 따라서 상기 돌연변이를 통해서 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
다양한 점-돌연변이 유발법을 사용하여 원하는 뮤테인을 코딩하는 cDNA를 제조할 수 있다.
예를 들어, 올리고뉴클레오타이드(Adelman et al. "DNA" 2:183, 1983), PCR 돌연변이 유발법(Leung et al. Technique 1:11-15, 1989) 또는 카세트-돌연변이 유발법(Wells et al. Gene 34:315, 1985)등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 돌연변이 DNA의 합성은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 돌연변이 유발법을 사용하여 수행된다. 문헌등에 기술된 유전자 코드의 변성에 의한 자연형 PLGF-1 인자를 코딩하는 cDNA를 PCR의 주형으로 사용하였다. 바람직하게, 신호 펩타이드를 가지거나 또는 없는 N-말단 위치에 메티오닌이 있는 단백질을 코딩하는 부분만을 사용하였는데; 예를 들어, 본 발명의 서열번호 1로 표시된 서열 또는 이의 동등물은 신호 펩타이드가 없는 단백질에 상응하며 발현 벡터 pET3PlGF-1에 포함되어 있다. 상기 단백질의 N-말단 부분을 코딩하는 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 5'-3'(전방향), 돌연변이시킬 시스테인 코돈을 포함하는 서열 영역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 5'-3'(역방향)을 PCR 프라이머로 사용하였다. 상기 역방향 올리고뉴클레오타이드는 원하는 돌연변이를 일으키기 위해 필요한 염기 치환 또는 치환을 함유하게된다. 사용된 프라이머는 돌연변이시킨 서열을 분리하고 정제하기에 적절한 제한 효소를 도입시키기 위해 5' 및/또는 3' 말단 영역에 추가적으로 염기를 동일하게 포함한다.
시스테인 잔기에 해당하는 코돈은 Ser, Thr, Gln, 또는 Asn과 같은 극성 아미노산, 또는 Gly, Ala, Val, Ile 또는 Leu과 같은 비극성 아미노산등, 모든 중성아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환될 수 있다. 바람직한 아미노산은 Gly 및 Ala이다.
바람직한 실시예에서 전방향 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 서열이며, 역방향 프라이머는 서열번호 4로 표시되는 서열이다. 역방향 프라이머는 서열번호 1로 표시되는 서열의 382번 위치의 T ->G 치환을 포함하며, 이러한 치환으로 서열번호 4로 표시되는 서열의 125번 위치의 시스테인 코돈인 TGC가 Gly 코돈에 해당되는 GGC로 전환된다.
적절하게 변형된 cDNA를 이후 절단하고 숙주 세포에서 사용가능한 적절한 유도 시스템의 조절하에 있는 발현 벡터에 삽입시킨다.
바람직하게, 원핵 세포에서 사용가능한 유도 발현 시스템을 사용하였다. 이이 예는 다음과 같다:
pBAD발현 시스템(In vitrogen BV) : 단백질 합성은araBAD프로모터 제어하에 위치하게 되며 아라비노스를 사용하여 다양한E.coli균주에서 단백질 발현을 유도시킬 수 있다;
T7발현 시스템(In vitrogen BV 또는 Promega) : 단백질 합성이 파지 T7의 RNA 폴리머라제 프로모터의 제어하에 있게 되며 락토스, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 이의 유도체 또는 이의 기능적으로 동등한 유사물을 사용하여 발현을 유도시킬 수 있다. 이 경우, 락토스-유도 프로모터의 조절하에 위치한 파지 T7 RNA 폴리머라제 유전자 카피를 함유하고 있는 DE3(BL21(DE3)) 또는 JM109(DE3)) 타입의E.coli유도체를 사용해야 한다;
Trc발현 시스템(In vitrogen BV) : 단백질 합성이 하이브리드(hybrid) 프로모터trc의 제어하에 위치하게 된다. 이 프로모터는trp프로모터와lac프로모터를 융합시킨 것으로 락토스 또는 이의 동등물(IPTG)을 통해 다양한E.coli균주에서 유도시킬 있다;
Tac발현 시스템(Amersham biosciences) : 단백질 합성이tac프로모터 제어하에 위치하게 된다. 이 시스템은, 락토스 또는 이의 동등물(IPTG)을 통해서E.coli lacIq(JM105 타입) 균주를 사용하여 단백질 합성을 유도시킨다;
P L 발현 시스템 : 단백질 합성이P L 프로모터의 제어하에 위치하며 트립토판을 첨가하여 유도될 수 있다. 이 경우 트립토판-유도 프로모터의 제어하에 있는 람다 파지의cI리프레서(repressor)를 코딩하는 유전자 카피를 함유하는E.coli유도체(GI724)가 요구된다.
효모 또는 다른 다세포 개체에서 유래된 진핵 숙주 세포에서 뮤테인을 코딩하는 변형 cDNA를 발현시킬 수도 있다. 이 경우 상기 세포에 적절한 발현 시스템을 선택하여 사용한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 단백질 발현은 T7 파지 RNA 폴리머라제 시스템의 제어하에서 수행되었고 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 사용하여 유도시켰다.
상기 발현 벡터는 또한 선별 마커(selection marker) 및 또는 폴리아데닐레이션 사이트(polyadenylation site) 및/또는 전사 조절 서열과 같이 클로닝, 선별및 발현에 필요한 정상적인 기능을 코딩하는 서열을 추가적으로 포함한다.
통상적인 방법을 사용하여 뮤테인을 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켰다. 상기 세포는 원핵, 진핵, 동물, 인간 또는 식물 세포일 수 있으며, 구체적으로는E.coli또는 바실러스(Bacillus)와 같은 박테리아 세포, 사카로마이세스(Saccharomyces)와 같은 효모 세포, 또는 Vero, HeLa, CHO, COS와 같은 동물 세포이다.
바람직한 미생물은 시판되는 균주 [B12(De3)pLysS](Promega Corporation USA)에 인간 PLGF-1 뮤테인을 융합(integration)시켜 얻었다.
상기 본 발명의 뮤테인을 제조하기 위해 사용되는 변형 세포는 사용전까지 동결 보관하여 발현능을 보존시켰다. 사용시, 상기 동결건조물을 적절한 완충용액을 사용하여 재용해시켰다.
상기 변형 숙주 세포는 액상 배양 배지에 배양하였다. 다양한 종류의 알려진 배양 배지들을 구입하여 효과적으로 사용할 수 있으나, 본 발명에 따른 발효배양 단계는 감염 위험을 피하기 위해서 동물 또는 인간 유래의 모든 물질이 없는 배양 배지에서 수행되었다. 하나 이상의 적절한 항생제가 첨가된 효모 추출물(Difco)이 가장 적절한 배지이다. 최적량의 미생물 세포 배양물을 얻기 위해서, 동결건조된 미생물을 배양 배지에 현탁시켜서 전-접종(pre-inoculation)하여 연속 배양하고 희석하는 단계가 상기 발효배양 단계 전에 선행된다.
발효배양은 상술한 배지에서, 미생물에 적절한 온도, 일반적으로 약 37℃의온도로, 포화 공기에 대해 20 내지 40%, 바람직하게는 30%의 용존 O2존재하에서 수행된다. 배양 동안의 pH는 사용되는 미생물에 대해 최적으로 유지하며, 일반적으로는 중성 또는 약산 또는 약 알칼리(6.4 내지 7.4)에서 유지된다. 또한, 발효배양은 교반시키면서 수행되며, 항-계면활성제(anti-surfactants)를 사용하는 것이 바람직하다.
발효배양이 진행되면, 배양 배지의 흡광도가 증가하게된다. 따라서, 600㎚에서 흡광도는 배양의 진행 과정을 모니터하기 위해 본 발명에서 사용하는 매개변수이다. 따라서 발현을 유도시킬 순간의 배양물의 세포 흡광도는 발현 단백질의 수율을 높힐 수 있을 정도로 충분히 높아야만 한다. 0.2보다 높은 600㎚에서의 흡광도(OD600)를 이미 사용하였으나, 사용된 배지에 따라 최대 50의 흡광도를 얻을 수 있다. 높은 뮤테인 생산율을 얻기 위해서 18을 초과하는 흡광도가 바람직하다. 16 내지 20의 흡광도로 최적의 결과를 얻을 수 있다. 발효배양은 상기 흡광도 값에 도달할때 까지 상기 조건으로 유지시킨 후, 단백질 발현을 유도시킨다.
사용되는 미생물 세포에서 이종의 뮤테인 발현 기전을 유도시킬 수 있는 모든 제제 또는 화학적-물리적 조건을 사용한다. T7 파지 프로모터를 함유하는 발현 플라즈미드로 변형시킨 박테리아 균주 BL21(DE3)pLysS를 사용하는 경우, 락토스 또는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)와 같은 락토스 유도체를 약 1mM의 적정 농도로 사용하여 발현을 유도시킨다. 좋은 결과를 얻기 위해서 수 시간, 바람직하게는 3 내지 4시간에 얻을 수 있고; 최적의 유도 가정을 약 10%의 용존 O2를 사용하여 3시간 20분 정도 유지시킨다.
유도 단계 전 후에 세포 샘플을 채취하여 유도 결과를 측정하기 위한 SDS-PAGE 전기영동등의 분석법에서 사용하였다.
단백질 발현 정도가 요구 수준에 도달하면, 세포를 원심 분리 등으로 배양 배지와 분리시키고 추출 과정을 수행한다.
추출 과정은 우선 세포 용균(lysis) 단계로 부터 시작된다. 박테리아에서 뮤테인을 발현되면, 불용성 응집체 형태로, 숙주 세포 내에서 격리되어 존재하게 된다. 상기 용균 과정은 적절한 농도의 계면활성제, 바람직하게 0.5 내지 1% 농도의 Triton X-100을 함유하는 용균 완충용액에서 동결/융해, 프렌치 프레스(French Press), 초음파처리(초음파법) 또는 통상적인 방법을 사용하여 수행할 수 있다. BL21(DE3)pLysS 박테리아 균주를 사용할 때는 동결/융해 방법이 바람직하며, 적어도 두번 연속 수행하는 것이 최적이다.
PLGF-1 뮤테인은 숙주 세포에서 발현된, 즉 생물학적 불활성 모노머 형태로 용균 배지에 방출되고, 적어도 부분적으로 모노머의 이합체화를 이루는 재생(regeneration) 단계를 용균 단계 이후에 수행하게 된다. 뮤테인의 재생은 적정 농도의 산화-환원쌍을 희석 용액에 첨가하고 10 내지 30시간, 바람직하게는 18 내지 20시간을 10 내지 30℃, 바람직하게는 20℃에서 교반시키면서 반응시켜 얻을 수 있다. 상기 산화-환원쌍의 예로는 시스틴/시스테인, 시스타민/시스티아민, 2-하이드록시에틸다이설파이드/2-머캅토에탄올 또는 산화 및 환원 형태의 글루타치온이 있다. 산화 및 환원 형태의 글루타치온이 바람직한 제제이며 환원 형태시에는 0.1 내지 2.5mM, 바람직하게는 0.5mM의 농도로, 환원 형태에서는 0.25 내지 6.25mM, 바람직하게는 1.25mM로 사용된다.
PLGF-1 뮤테인이 불용성 응집체 형태로 용균 배지로 방출되면, 재생 단계는 용해 과정 후에 수행된다. 불용성 응집체를 함유하는 분획을 우레아, 구아니딘, 이소티오시아네이트, 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 통상적은 변성제를 함유하는 변성 완충용액에 용해시킨다. 바람직하게, 상기 변성용액은 예를 들어 8M의 변성 농도의 우레아 용액이다. 상기 용해 과정을 촉진시키기 위해서, 상기 불용성 응집체를 함유하는 분획을 균질화(homogenisation) 또는 초음파 처리(sonication)하는 것이 바람직하다. 상기 단백질을 함유하는 용액을 이후 변성 완충용액 자체 또는 희석 용액으로 280㎚에서 측정한 흡광도가 약 0.5OD280에 도달할 때 까지 희석시킨다. 적절한 희석 용액은 염 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 함유하고 알칼리 pH(약 pH8)이다.
PLGF-1을 용균 배지로 방출시키는 단계는 미생물의 다양한 성분 및 세포내 물질, 무엇보다도 핵산 물질도 함께 방출된다. 이는 단백질 정제 과정에 영향을 주거나 방해가 될 수 있다. 이러한 문제를 피하기 위해서, 세포 용균으로 부터 직접적으로 얻은 현탁액/용액에서 상기 물질들을 분획화시키는 선택적이고 예비적인 단계를 더욱 수행할 수 있다. 이 단계는 DNAses(자연형 또는 재조합 벤조나제 등)와 같은 효소 제제, 데옥시콜린산과 같은 화학제제, 또는 초음파(초음파처리), 블렌더와 같이 블레이드(blade)를 이용한 빠른 교반과 같은 물리-기계적 제제를 통해 이러한 결과를 얻을 수 있다. DNA의 물리적 분획화를 킬레이팅(chelating) 제제 및 EDTA 및 Triton X-100과 같은 계면활성제를 함유하는 적정 부피의 세척 용액으로 수행하였으며, 불용성 응집체를 함유하는 분획에서 모든 세포 성분 또는 물질을 제거하기 위해서 바람직하게는 희석을 반복하면서, 원심분리 및 제거를 여러번 반복한다.
재생 단계 후 PLGF-1 뮤테인 자체를 쓸 수는 있으나, 당 분야에서 잘 알려진 단백질 물질의 정제에 사용되는 방법 중 하나를 사용하여 적어도 한번의 정제 단계를 수행하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해서, 상기 뮤테인을 겔-여과법(gel-filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 친화력(affinity) 크로마토그래피, HPLC, 역상 크로마토그래피 및/또는 겔 전기영동등을 수행할 수 있다. 바람직한 방법은 음이온 교환 및 역상 크로마토그래피이다. 치료학적 목적을 위해 적절할 만큼 충분히 고순도로 정제하기 위해서, 상술한 방법 중 적어도 두개를 연속적으로 사용한다.
부분적으로 재생된 뮤테인, 즉, 적어도 부분적으로 다이머 형태인 뮤테인을 함유하는 용액을 음이온 교양 수지에 로딩(loading)하여 박테리아 오염물 없이 상기 다이머 형태를 농축시켰다. 용량, 로딩(loading) 양 및 흐름 속도 특징이 산업적인 과정에 적합한 정도인 음이온 교환 크로마토그래피에 적절한 모든 시판되는 메트릭스를 사용할 수 있다. 바람직한 일 실시예에서는 고 유속 레진(resin), 예를 들어, Q-세파로스 패스트 플로우(Q-Sepharose fast flow)(Amersham bioscience) 또는 이의 동등물을 사용하였다. 상기 레진은 로딩시킬 단백질 용액의 부피를 1 : 1내지 10 : 1의 다양한 로딩 부피/컬럼 부피 비율로 사용할 수 있게 한다. 컬럼의 사용을 최적화하기 위해서 부피/부피 비율은 10 : 1에 가까운 것이 바람직하다. 전체 크로마토그래피 과정은 FPCL 디렉터 소프트웨어 시스템(Amersham bioscience)과 같은 적정 프로그램으로 제어되는 컴퓨터화 시스템을 통해 자동으로 수행되는 것이 바람직하다.
상술한 다양한 방법중, 부분적으로 재생된 뮤테인은 역상 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다.
이 경우, 부분적으로 재생된 뮤테인, 즉, 부분적으로 다이머 형태이고 부분적으로 모노머 형태인 뮤테인을 함유하는 적절하게 희석된 용액을 사용에 적절한 모든 시판중인 크로마토그래피 메트릭스에 로딩시킬 수 있다. 바람직하게, 컬럼 자체의 팩킹(packing)이 용이하며 메트릭스 흡착능도 최적으로 보장하기 위해서 입도측정(granulometry)을 갖는 레진을 사용한다. 이러한 메트릭스의 예로는 레진 RP 소스 15 또는 RP 소스 30(Amersham bioscience)가 있다. 밸런싱(balancing), 로딩, 레진 세척 및 용리 용액은 모두 다른 비율의 유기용매를 포함하는 하이드로-유기 (hydro-organic)용액이다. 이러한 용액의 예로는 에탄올, 메탄올 또는 아세토니트릴을 포함하는 용액이다. 바람직하게 증가 비율의 에탄올을 포함하는 하이드로알콜성 용액을 사용한다. 바람직하게, 전체 역상 크로마토그래피 과정은 FPCL 디렉터 소프트웨어 시스템(Amersham bioscience)과 같은 적절한 프로그램의 제어하에 작동되는 컴퓨터화된 시스템을 통해 자동으로 수행된다.
두 가지 이상의 정제 방법을 하나씩 사용할 때, 상기 뮤테인을 높은 순도의활성 형태, 즉, 실질적으로 다이머 형태를 포함하고 모노머 형태가 오염되지 않은 단백질로 얻을 수 있다. 이러한 방식으로 얻은 생산물은 98.5% 이상의 활성 형태, 바람직하게는 99.5% 이상을 포함한다. 잔여 모노머 형태는 1.5%를 초과하지 않는다. 상기 뮤테인은 화학적으로 안정하고, 모든 중합체화된 산물은 매우 소량으로 제한된다. 상술한 방법에 따라 얻은 순수한 단백질은 막 한외여과법(membrane ultrafiltration)과 같은 과정을 더욱 수행할 수 있다. 이 경우 상기 생산물을 30kD 미만의 여과 한계를 갖는 막으로 여과시키고 1 : 106으로 희석될 때 까지 TFA로 산성화시킨 물로 투석(diafiltration)시킨다. 이렇게 얻은 최종 산물은 최적 수준으로 생물학적 활성을 보존하도록 동결건조 첨가제와 함께 동결건조시키고 제제화시킨다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 뮤테인은 필요하다면 자연형 PLGF-1을 정제하기 위한 국제특허출원 제PCT/IT02/00065호(게이모나트)에 기술된 정제 과정에 따라 적절하게 추출, 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명에 따른 PLGF-1 뮤테인의 화학적 안정성은 동결건조한 뮤테인 및 자연형 PLGF-1 단백질을 식염수에 용해시키거나 겔에 제제화시키고 4-8℃의 온도에서 40, 170 및 210일 동안 보관한 후 평가하였다. 그 결과 활성 다이머 형태의 뮤테인은 분석한 모든 농도(20, 5 및 1㎎/㎖)에서 안정하였으며, 침전되거나 중합체를 형성하지 않았고, 농도도 초기 값을 유지하고 있었다. 반면, 자연형 단백질의 다이머 형태의 농도는 단지 수 일에도 급격하게 감소되었다.
본 발명에 따른 뮤테인은 자연형 PLGF-1 단백질과 비교하여 화학적/생물학적안정성이 향상되고 혈관신생 활성도 향상되었다. 상기 활성으로 인해 본 발명에 따른 PLGF-1 뮤테인은 당 분야에서 알려진 자연형 PLGF-1의 치료학적 및 미용학적 적용분야에 적절하다.
본 발명의 PLGF-1의 혈관신생 작용은 생체내 또는 시험관내에서 수행되는 통상적은 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 마그리온 등의 "Il Farmaco", 55, 165-167(2000)에 기술된 토끼 각막 혈관생성 테스트 또는 CAM(chicken chorioallantoid membrane vascularization) 테스트를 사용하였다.
피부의 혈관생성을 평가하기 위해 사용된 두 번째 방법은 스트라이트 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, December 12, 96(26), p 14888-14893)이 기술한 동물 피부 샘플의 컴퓨터 형태학적 분석법이다. 본 발명에 따라 처리 또는 비처리한 실험용 동물로 부터 분리한 피부 부분을 동물용 단일클론 항-CD31 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 염색하였다. 이와 같이 처리한 부분을 전자현미경으로 분석하여 ㎟ 당 혈관 수, 혈관의 평균 크기 및 혈관이 차지하고 있는 상대적인 면적을 측정하였다. 심근 조직 및 구체적으로 허혈 또는 심근 경색에 대한 뮤테인의 혈관신생 효과를 마그리온 등이 기술한 심장 허혈 동물 모델에서 평가하였다.
피부경화증 치료에서 본 발명에 따른 뮤테인의 활성을 야마모토 등(Arch. Dermatol. Res. NO. 2000, 292(11), p535-541)이 기술한 동물 모델에서 평가하였다. 피부경화 상태는 3주간 날마다 블레오마이신(100mcg/㎖)을 C3H 쥐에 피하 주사하여 유발시켰다. 3주 후, 상기 동물을 희생시키고 처리 부위의 피부 샘플을 조직분석하였다. 블레오마이신으로 유발시킨 피부의 경화증에 대한 처리 효과는 피부의비대화(thickening) 및 높은 하이드록시프로핀 수준의 조직학적 결과로 나타났다.
다음의 결과는 혈관생성이 증가하여 모든 병변 또는 자연적인 퇴행상태의 치료에서 본 발명의 PLGF-1 뮤테인의 효과를 보여준다. 첫번째 응용분야는 허혈 및 허혈 후 손상의 방지 또는 치료분야이다. 치료에 적절한 조건은 심근 조직의 허혈, 심근 경색, 허혈성 발작(ictus) 및 만성 심근 질싸, 대뇌 혀혈 및 허혈성 발작, 장 허혈, 사지의 말초 허혈이다. 두번째 치료 응용분야는 피부 경화의 치료이다. 이들 질병은 미세혈관 시스템, 피부 및 피하 연결 조직 및 내부 장기의 연결조직을 포함하는 질병이다. 상기 질병은 섬유화 및 석회화 영역을 형성시킬 수 있는 섬유모세포(fibroblast)의 활성화 및 콜라겐의 과도한 생성 및 조직 및 혈관주변의 콜라겐 축적을 야기하게 되고 상기 질병에 의해 유발되는 징후가 나타나게 된다. 구체적으로 피부 혈관에 다량의 경화성 콜라겐이 둘러싸고 있음이 혈관촬영술(capillaroscopy)로 확인되며, 이는 혈관내의 제한을 야기한다. 피부가 관여하는 국한 피부경화증은 과도하고 부적절한 콜라겐의 축적에 의한 피부의 경화 및 비대화로 특징되며, 전신피부경화증은 내장의 전신 경화와 함께 혈관이 피부 섬유증과 연관되어 있다. 손가락 및 손의 모든 피부는 경화되고, 비대화되어 부종oedemotous)으로 나타난다. 상기 질병은 또한 기능이 부족한 심장의 심근, 폐, 위장, 신장, 및 골근 시스템에도 존재한다. 일부 환자는 피부 섬유증에 의해 유발되는, 관절의 이동을 매우 악화시키는 침식성 관절증이 진행된다. 마그리온 등은 혈관신생을 촉진시키는 자연형 PLGF-1에 대해 기술하였는데(이탈리아 특허출원 제RM2002A000119호), 구체적으로, 피부에서, PLGF-1을 함유하는 조성물을 처리한 결과 쥐에서 네오마이신-유발 피부경화증의 상태를 호전시키는 효과를 나타내었음을 보고하였다. 사전에 피부경화를 유발시킨 동물에 본 발명의 뮤테인을 처리하여 동일한 결과를 관찰하였다.
세번째 응용분야는 화상, 궤양 및 내부 또는 피부 상처, 구체적으로 수술 후 치유 과정의 치료를 보조하는 것이다.
본 발명의 응용분야는 또한 피부 노화의 통상적인 증상의 치료에 관한 것이다. 비록 이 분야는 미용 분야이나 장기간의 태양 조사 노출(광 노화), 다른 종류의 조사 또는 공격적인 환경/대기 인자에 의한 피부 조직의 조기 악화와 관련된 치료 분야에 사용할 수 있다.
전자 현미경으로 광-손상 피부 샘플을 관찰한 결과 병변적으로 팽창되고 엘라스틴으로 둘러싸여 있거나 조밀한 무정형 물질로 둘러싸여있는 모세혈관이 존재하는 통상적인 미세혈관 형태가 관찰되었다. 자연적으로 및 조기 노화된 피부에서 새로운 피부 혈관생성의 촉진은 피부 색조 및 두께에 관여하는 세포 외 메트릭스에 대한 효과가 조절됨이 관찰되었다. 모세혈관의 생성 증가는 섬유모 세포의 증가 및 새로운 콜라겐의 생성을 수반하고, 이후 피부 형태가 전반적으로 개선된다.
본 발명의 화합물을 사용할 수 있는 분야는 또한 머리털 손실에 관련된 분야다.
피부 혈관생성을 향상시키는 효과, 구체적으로 소포주변부에서의 혈관생성 향상 효과는 머리털 손상을 방지하고 이의 재생을 촉진시키는 방향으로 피부 부착물(머리털, 신체털 등)의 성장을 조절하게 된다. 머리털 성장기에 머리털 소포의혈관생성은 자연적으로 증가한다. 국소 머리털 성장 작용은 이러한 혈관 증가를 촉진히키고 결과적으로 머리털이 자라게 된다. 본 발명의 조성물을 처리한 동물의 소포에 근접한 피수 부위를 컴퓨터화 형태분석한 결과 머리털내강의 크기 및 머리털 밀도가 증가하여 소포주위 혈관생성도 일반적으로 증가할 뿐만 아니라, 머리털 망울의 크리 및 머리털 자체의 직경도 증가시킴을 볼 수 있었다.
재성장을 촉진하여 머리털 손실을 방지하는 효과는 자연 손실뿐만 아니라, 탈모증, 호르몬 이상, 화학요법, 방사선요법 또는 약물 투여등의 임상 상태 이후의 머리털 손실에도 적용할 수 있다.
상기의 치료학적 결과는 PLGF-1 뮤테인의 직접적, 전신 또는 국소 투여에 의한다. 그러나, 본 발명의 뮤테인은 또한 내생 PLGF-1 인자, 구체적으로 PLGF-1 및 이의 수용체가 결합 부위를 함유하는 아미노산 서열 영역을 인지할 수 있는 항체, 폴리클로날, 모노클로날 또는 기능적으로 활성이 있는 단편을 제조하는 데 사용할 수 있다. 상기 타입의 항체는 PLGF-1의 혈관신생 활성을 중화시킬 수 있어서 병변성 혈관신생 조건의 치료 분야에 사용할 수 있다. 상기 조건의 예로는 류마티스성 관절염, 천식, 부종, 폐동맥 고혈압 및 종양 조직의 형성과 전개와 같은 염증성 질병이 있다. 항체 자체는 생성되는 내생 PLGF-1의 양과 질을 측정하기 위한 방법에서 면역-진단제로 사용될 수 있다. 상기 면역-진단제를 종양 조직의 형성 및 전개와 같은 PLGF-1의 이상 생성과 관련된 병변 상태를 진단하기 위한 분야에서 사용할 수 있다.
PLGF-1 뮤테인을 인지할 수 있는 항체 또는 단편의 제조는 공개특허 제WO-A-01/85796호에 기술된 자연형 PLGF-1 단백질의 특이적 항체를 제조하는 방법과 같이 당 분야에서 알려진 방법으로 수행된다.
본 발명은 활성제 또는 진단제로 상술한 뮤테인 또는 중성화 항체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
전신 또는 국소 투여에 적절한 모든 제법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 구체적으로, PLGF-1 인자를 전신 또는 국소 효과를 위해 비경구 투여하거나, 주로 국소 효과를 위해 피부 또는 점막에 국부적으로 투여할 수 있다. 전신 효과는 주로 정맥 투여를 통해 얻을 수 있으나, 복강 또는 근육 투여도 가능하다. 국소 효과는 국부, 또는 근육, 피하, 관절 비경구 투여를 통해 가능하다. PLGF-1 뮤테인은 이온 삼투요법(ionophoresis)의 전자전달법(electrotransport)으로 국소 투여될 수 있다. 기간에 걸쳐 방출을 지연시킬 필요가 있을 경우 피하 이식물을 또한 사용할 수 있다. 상기 활성 물질의 미묘한 특징으로 인해 강력히 권하지는 않으나, 경구 투여도 가능하다.
전신 또는 국소 비경구 사용을 위한 조성물은 용액, 현탁액, 리포좀 현탁액, W/O 또는 O/W 에멀젼을 포함한다. 국부용 조성물은 용액, 로션, 현탁액, 리포좀 현탁액, W/O, O/W, W/O/W, O/W/O 에멀젼, 겔, 연고, 크림, 포마드(pomades) 및 페이스트(pastes)를 포함한다. 바람직한 실시예에서 상기 활성 물질은 적절한 동결건조 첨가제와 혼합되어 치료학적으로 허용가능한 희석제로 재용해시킬 수 있는 동결건조 형태로 제제화된다. 상기 동결건조 첨가제는 완충용액, 다당류, 사카로스, 만니톨, 이노시톨, 폴리펩타이드, 아미노산 및 다른 활성 성분과 호환가능한 첨가제이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 활성 성분은 동결건조 후에 상기 뮤테인/인산염 비율이 1 : 1 및 1 : 2로 포함되는 양으로 인산염 완충용액(NaH2PO4/H2O-Na2HPO4/2H2O)에 용해된다. 비경구용으로 적절한 희석제는 물, 식염수, 설탕용액, 하이드로-알콜 용액, 기름성 희석제, 글리세롤, 에틸렌 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리오일, 또는 멸균정도, pH, 이온 강도 및 점도등 투여 방법에 적절한 다른 희석제이다.
에멀젼 또는 현탁액의 경우 상기 조성물은 비이온, 양성이온(zwitterionic), 음이온 또는 양이온 타입의 약물 제법에서 통상적으로 사용되는 적절한 계면활성제를 함유할 수 있다. 친수성 O/W 또는 W/O/W 에멀젼은 비경구/전신용으로 바람직한 반면, 친유성 W/O 또는 O/W/O 에멀젼은 국소 또는 국부용으로 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물은 설탕 또는 폴리알콜과 같은 등장성 제제, 완충용액, 킬레이팅(chelating) 제제, 항산화제, 항박테리아 제제같은 첨가물을 선택적으로 함유할 수 있다.
국부용 조성물은 액상 또는 반고상 형태를 포함한다. 전자는 용액 또는 로션을 포함한다. 이들은 수용성이거나 에탄올/물 또는 알콜과 같이 하이드로-알콜일 수 있으며 동결건조된 물질을 용해시켜 얻어진다.
선택적으로, 활성 물질 용액에 녹말, 글리세린, 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌렌 글리콜, 폴리(메타)크릴레이트, 이소프로필 알콜, 하이드록시스테아레이트, CARBOPOL?과 같은 겔화제를 첨가하여 겔로 제제화시킬 수 있다.
국부용 조성물의 다른 타입은 포마드, 페이스트 및 크림 형태의 에멀젼 또는 현탁액이다. W/O 에멀젼이 빠르게 흡수되므로 바람직하다. 친유성 첨가제의 예로는 액상 파라핀, 무수 라롤린, 백색 바세린, 세틸릭알콜, 스테아릴릭 알콜, 식물성 기름, 미네랄 오일이 있다. 흡수를 촉진시키기 위해 피부 투과도를 증가시키는 제제를 사용할 수 있다. 이의 예로는 폴리비닐알콜, 폴리에닐렌글리콜 또는 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 생리적으로 허용가능한 첨가물이다.
국부용 조성물에 사용되는 다른 첨가물은 설탕, 폴리알콜, 완충용액, 킬레이팅 제제, 항산화제, 항박테리아제제, 농후제, 분산제과 같은 등장성 제제가 있다.
시간 기간에 걸쳐 방출을 지연시켜서 사용되는 국소 또는 전신용 조성물을 동등하게 사용할 수 있으며, 이들은 폴리락테이트, 폴리(메타)아크릴레이트, 폴리비닐-피롤리돈, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀루로스와 같은 폴리머 및 당 분야에서 알려진 다른 물질을 포함한다. 피하 이식 형태의 서방형 조성물은 예를 들어, 폴리락테이트 또는 다른 생분해성 폴리머 계의 조성물을 또한 사용할 수 있다.
상기 활성 물질이 자체적으로 안정하고 동결건조 형태로 포장되는 것이 바람직하나. 약학 조성물에 활성 다이머 형태로 PLGF-1을 안정화시킬 수 있는 물질을 추가적으로 포함시킬 수 있다. 이러한 물질의 예로는 시스테인, 시스티아민, 또는 글루타치온이 있다. 뮤테인의 복용량은 투여 경로 및 선택된 제제에 따라 다르다. 비경구 투여의 경우 1 내지 500mcg/㎏/day, 바람직하게는 10 내지 200mcg/㎏/day이다. 상기 양으로 투여하기 위해서 약학 조성물은 50mcg 내지 단위 용량 당 30㎎, 바람직하게 50 mcg 내지 용량 당 10㎎을 포함한다. 치료용 국부 적용량은 조성물그램 당 0.1 내지 10㎎이 효과적이었다. 피부 노화 또는 머리털 손실을 치료하기 위한 국소 미용 조성물은 바람직하게 조성물 그램 당 0.01 내지 0.09㎎의 활성 물질을 포함한다.
치료 기간은 병변 또는 요구되는 효과에 따라 다양하다. 피부경화증의 치료 경우 적용 기간은 병변의 심각한 정도에 따라 1일 내지 12개월로 다양하다. 자연 또는 조기 피부 노화의 치료 경우, 적용 기간은 1 내지 400일, 바람직하게는 적어도 30일로 다양하다. 머리털 손질을 방지하거나 머리털의 재성장을 촉진시키기 위한 치료의 경우 적용 기간은 유사하게 1 내지 400일로 다양하다.
본 발명을 이하 실시예를 통해 좀 더 구체적으로 설명하나, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
뮤테인을 코딩하는 cDNA의 합성
382번 위치(서열번호1의 서열)의 티미딘(T)을 구아니딘(G)로 돌연변이 유발시켜서 PLGF-1 뮤테인, 즉 PLGF-1CG를 제조하였다. 이렇게 시스테인을 코딩하는 상술한 서열의 382-384 뉴클레오타이드의 TGC 코돈이 글리신을 코딩하는 GGC로 변형되었다.
뮤테인 PLGF-1CG에서 시스테인을 글리신으로 돌연변이된 아미노산은 서열번호 2로 표시되는 서열의 125번 위치이다.
뮤테인을 코딩하는 DNA의 합성을 위해서, PCR(Polymerase chain reaction) 방법을 사용하엿다. 신호 펩타이드가 없는 메티오닌 PLGF-1 단백질을 코딩하는 발현벡터 pET3PLGF1(EP-A-0 550 519)을 PCR 주형으로 사용하였다. 실질적으로 18개 아미노산(신호 펩타이드)가 없고 1번 위치(N-말단)에 메티오닌이 있는 자연형 PLGF-1 단백질(서열번호 2)이다. 다음의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하였다:
올리고 1(전방 프라이머)는 5'-CTGGCGCAT ATG CTGCCTGCTGTGCCC-3' 서열을 갖는다. 상기 올리고 1은 Nde I 부위(밑줄친 부분) 및 개시 코돈(굵게 표시)을 함유한다;
올리고 2(역방향 프라이머)는 5'-GGTTACCTCCGGGGAACAGCATCGCCGC C CC-3' 서열을 갖는다. 상기 올리고 2는 시스테인을 코딩하는 TGC 코돈을 글리신을 코딩하는 GGC 코돈(굵게 표시)으로 변형시킨 T -> G(밑줄치고 굵게표시) 돌연변이를 함유한다.
바이오라드 진 사이클러(BioRad Gene Cycler)로 PCR을 수행하여 얻은 뉴클레오사이드 사슬을 완전 반응(fill-in)시키고, 이후, Nde I 제한효소로 절단하였다. 일반적인 방법에 따라서 NdeI/"블런트(blunt)" 말단을 갖는 단편을 원핵세포용 발현 벡터 pET3의 NdeI/"블런트" 말단에 클로닝하였다. 이러한 방식으로 PLGF-1CG로 명명한 PLGF-1 뮤테인을 코딩하는 플라스미드 pET3PLGF1CG을 제조하였다.
통상적인 방법에 따라E.coli[B12(DE3)pLysS](Promega Corporation USA) 균주를 상기 플라스미드로 형질전화시켜서 숙주 균주인 [B12(DE3)pLysSPLGF-1CG]를 제조하였다.
상기 플라스미드 제작 방법은 도 5에 나타내었다.
실시예 2
뮤테인 PLGF-1CG의 제조, 추출 및 정제
상기 미생물[B12(DE3)pLysSPLGF-1CG]을 상기 SBM 배양 배지를 사용하여 발효기에서 배양하였다.
용액 SBM은 다음을 포함한다:
용액 A(1리터 당)
박토 효모 추출물(Difco) 34g
암모늄 설페이트 2.5g
글리세롤 100㎖
H2O q.s. to : 900㎖
용액 B (10×)(100㎖ 당)
KH2PO41.7g
K2HPO4-3H2O 20g
또는
K2HPO415.26g
H2O q.s. to : 100㎖
상기 용액 A 및 B를 사용시 멸균 형태로 혼합하였다.
발현을 1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)로 유도하였다.
발효 배양 단계 전에 전 접종 단계가 선행되었다. 동결건조 형태의 미생물이 들어있는 튜브에 1㎖의 SBM + 100㎍/㎖ 앰피실린 + 34㎍/㎖ 클로람페니콜을 넣어 미생물을 현탁시키고, 상기 현탁액을 더욱 희석시키고 37℃에서 밤새 배양하였다.앰피실린 및 클로람페니콜을 첨가한 동일한 SBM 용액으로 희석시킨 후, 상기 전-접종물을 4개의 엘렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flasks)에 나누었다.
각 엘렌메이어 플라스크의 내용물을 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 상기 4개의 엘렌메이어 플라스크의 내용물을 혼합하고 물에 1/20배로 희석(50㎕ + 950㎕물)하여 OD600을 측정하였다.
적정한 전 접종 부피를 멸균된 튜브에 넣고 10분간 7,500×g로 4℃에서 원심분리하였다. 상기 박테리아를 이후 발효배양 리터 당 20㎖ SBM + 200㎍/㎖ 앰피실린 + 10㎍/㎖ 클로람페니콜에 재현탁시키고, 420rpm로 RT에서 20분간 교반시켰다.
상기 발효배양은 37℃의 온도에서 용존 O2존재(30%)하에서 6.4 내지 7.4의 pH로 200㎍/㎖ 앰피실린, 10㎍/㎖ 클로람페니콜 및 적정량의 거품억제제를 함유하는 SBM 용액에서 수행하였다.
배양 배지의 600㎚에서의 흡광도(OD600)가 16 내지 20이 되면 발현 유도를 시작하였다.
10%의 용존 O2(포화 공기에 대해)의 존재하에서 1mM의 IPTG를 유도 물질로 사용하였다. 발현 유도 기간은 약 3시간이었다. 상기 발현 유도는 미리 끓여놓은 전, 후-유도 용액 20㎕를 로딩(loading)한 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 제어하였다.
발현 유도시킨 박테리아를 함유하는 배양 배지를 7,500×g에서 10분간 또는3000×g에서 25분간, 4℃에서 원심분리시켜서 상층액을 버렸다.
상기 박테리아 세포를 이후 불용성 응집체를 추출 및 정제하기 위해 용균시켰다. 박테리아 용균은 1mM Mg2SO4+ 20mM Tris-HCl pH8 + 1% Triton X100을 함유하는 용균 용액에서 -80/37℃로 2회의 동결/용해 방법을 통해 수행하였다.
상기 용균 혼합물을 상온에서 30분간 교반시키면서(250rpm) 반응시키고, 450 OD600의 박테리아 당 3㎖과 같게, 0.5% triton X100 + 10mM EDTA pH8을 함유하는 세척 용액으로 희석하여, 적절한 용량의 블렌더에 부었다.
필요하면, 희석하지 않은 0.4㎕의 거품억제제를 샘플 밀리리터당 첨가하였다.
상기 용액을 최대 속도로 1분간 또는 샘플이 균질화될 때 까지 혼합하였다. 상기 블렌더의 내용물을 적정량의 컨테이너로 옮기면, 각각 450 OD600의 박테리아가 6.5㎖의 세척 용액으로 희석되었고, 상기 현탁액을 13,000×g에서 45분간 25℃로 원심분리시키고 상층액을 버렸다.
발현된 단백질의 불용성 응집체를 함유하는 최종 펠렛(pellet)을 얻을 때까지 전체적인 세척 과정을 몇 번 반복하였다.
이후, 상기 불용성 응집체를 함유하는 펠렛을 7㎖의 변성 완충용액 BD(8M 우레아, 50mM Tris pH 8, 에틸렌디아민 20mM)에 용해시키고, 상기 용액을 최종 우레아 농도가 5M이 될 때까지 희석하였다. 단백질의 재생은 상술한 용액에 환원 굴루타치온(최종 농도 1.25mM) 및 산화 글루타치온(최종 농도 0.5mM)을 첨가하여 20℃로 18 내지 20시간 동안 교반시키면서 수행하였다.
상기 반응 종결 시, 10분간 20℃에서, 10,000×g로 원심분리하고, 0.45 또는 0.8㎛의 필터를 통해 여과시켰다.
재생 형태, 즉, 다이머 형태의 뮤테인을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다.
뮤테인 용액을 완충용액 A(20mM 에탄올아민-HCl, pH8.5)로 평형화시킨 Q-세파로스 패스트 플로우 레진(Amersham-bioscience)에 로딩시키고 세척 후, 200mM의 NaCl 농도를 갖는 20% 완충용액 B(완충용액 A + 1M NaCl)로 용리시켰다.
부분 정제된 뮤테인을 역상 크로마토그래피를 통해서 고 순도로 정제하였다. 이러한 목적을 위해서 이온 교환 크로마토그래피 용리 피크를 TFA 및 에탄올을 함유하는 용액을 희석하여 상기 샘플이 1.5배 희석되었고 15% 에탄올 및 0.3% TFA를 함유하였다. 상기 물질의 첨가로 역상 레진에 결합하는 뮤테인의 결합력이 향상되었다.
상기 용액을 평균 직경이 15 또는 30마이크론이며 40% 에탄올 및 0.1% TFA를 함유하는 용액으로 평형화시킨 RP 소스 레진(Amersham-Bioscience)에 로딩시켰다. 세척 용액으로 뮤테인의 모노머 형태를 제거시킨 반면, 다이머 형태는 70%의 에탄올 비율에 도달할 때까지 에탄올 농도 구배를 증가시키면서 용리시켰다.
용리 분획을 280㎚에서 흡광도를 제어하면서 상기 크로마토그래피 정제과정을 모니터하였다.
상기 방법을 통해 얻은 다이머 용액을 -20℃에 보관하였고, 통상적인 방법으로 한외여과(ultradiafilter) 및 동결건조하였다.
실시예 3
Ⅰ. Cys125Gly 치환된 PLGF-1CG 뮤테인의 안정성 실험
PLGF-1CG 뮤테인을 20, 5 및 1㎎/㎖의 이론적 농도로 식염수에 용해시켰다. 동시에 PLGF-1 단백질(돌연변이 없음)을 20㎎/㎖의 농도로 식염수에 용해시켰다. 모든 샘플을 냉장기(4 -8℃)에 40일간 보관하였다.
각각 3번의 적절한 희석을 통해 얻은 평균값을 산출하여 실제 농도를 측정하였다. 상기 사용된 방법은 280㎚의 파장을 사용하고 1㎎/㎖에 해당하는 PLGF-1 및 PLGF-1CG의 농도에 해당하는 기본 1㎝ 광로를 갖는 큐벳(cuvette)으로 측정된 1 OD의 흡수성(흡광도)를 알 수 있는 분광기(spectrophotometry)를 사용하였다. 실험 시작 일 동안(표 1의 0시간), 농도를 측정하기 위해 희석시키기 전에, 각 샘플의 분취물(aliquot)을 13,000rpm으로 ALC 4212 마이크로센트리퓨즈(microcentrifuge)에서 10분간 원심분리하고 상층액을 이후 분석에 사용하였다. 생성될 수 있는 침전물은 제거하며, 결과적으로 단백질은 용액에만 존재하게 된다.
실험 결과는 표 1에 나타내었으며, 분석한 모든 농도(20, 5 및 1㎎/㎖)에서 적어도 최대 40일에 뮤테인은 안정하였으며, 침전이 생성되지 않았고, 초기 농도로 유지되었다. 이와 반대로, 뮤테인과 동일한 조건에서 20㎎/㎖ 농도로 보관한 돌연변이가 없는 단백질은 4일 보관 후, 단지 7.8%만이 용액에 남았다. 상기 값은 12일 후에는 더욱 감소하였다(5.5%). 돌연변이가 없는 PLGF-1 단백질은 4-8℃에서 24시간 보관한 후 상당량의 침전물이 또한 관찰되었음을 주지해야한다.
| 4-8℃에서 보관한 시간(일) | 평균 농도 (㎎/㎖) | |||||||
| PLGF-1CG20㎎/㎖ | S.D. | PLGF-1CG5㎎/㎖ | S.D. | PLGF1CG1㎎/㎖ | S.D. | PLGF-120㎎/㎖ | S.D. | |
| 04122640 | 20.3819.6920.4620.7220.32 | 1.000.570.540.330.75 | 5.435.255.28N.A.N.A. | 0.040.270.19 | 1.070.981.00N.A.N.A. | 0.020.080.01 | 20.141.571.11N.A.N.A. | 0.180.100.01 |
S.D. = 표준편차
N.A. = 분석하지 않음
PLGF-1CG 뮤테인의 전기영동 프로파일(모노머-다이머-폴리머 조성물)(도 1)은 또한 실질적으로 상술한 조건에서 안정하였다. 사실상, 비환원 조건에서의 식염수에 20㎎/㎖의 농도로 용해시키고 냉동시킨(도 1의 라인 1, 대조구) PLGF-CG1 단백질 또는 4-8℃에서 40일간 보관시킨 PLGF-1CG 단백질(도 1의 라인 2 샘플)의 SDS-PAGE는 실질적으로 소량의 모노머 부분이 사라지고 매우 소량의 트리머(다이머의 <0.5%) 형성과 같은 단지 최소의 변화만 나타났다.
실시예 4
Ⅱ. 겔로 제제화된 PLGF-1CG 뮤테인의 안정성 실험
PLGF-1CG 뮤테인 및 돌연변이시키지 않은 PLGF-1 단백질을 다음과 같은 조성의 겔에 0.2㎎/㎖ 농도로 용해시켰다:
CARBOPOL940 = 1% P/V
소듐 아세테이트 pH 4.4 = 15mM
EDTA pH 조절하지 않은 디소듐 염 = 0.04% P/V
메틸 파라벤 = 0.05% P/V
NaOH/아세트산을 사용하여 5.5 내지 6으로 pH를 조절하였다.
두개의 겔을 4-8℃에서 보관하였다. 다양한 시간에 두 겔의 일부(약 0.2㎖)를 이중으로 취하여 분석 저울로 무게를 측정하였다.
무게를 잰 샘플에 마이크로리터 부피로, 밀리그램으로 표시되는 겔 무게와 동등한 비 환원 2×샘플 완충용액을 첨가하였다.
10분간 볼텍스(vortex) 교반시키고 13,000rpm 에서 10분간 더욱 원심분리(ALC 4214 마이크로센트리퓨즈)시키고, 상층액을 버렸다. 원심분리를 다시 수행하고 다시 새로운 상층액을 제거하였다. 후자의 일부를 비환원 SDS-PAGE로 분석하였다. 염색을 한 후, 분석 샘플의 다이머 형태의 농도를 확인하기 위해서 농도계(densiometer)를 사용하여 전기영동 겔을 분석하였다.
다양한 시간 및 0시간에 존재하는 다이머를 %로 표시하여 표 2에 나타내었으며, 도 2에 그래프로도 나타내었다. 표 2에 나타난 결과에서 알 수 있듯이, PLGF-1CG 다이머의 양은 170일에도 일정하게 유지되는 반면, PLGF-1은 150일 후 71%로 감소하였고, 210일 후에는 55%로 떨어졌다.
전기영동 프로파일(모노머-다이머-폴리머 조성물)은 또한 PLGF-1CG 뮤테인이 상술한 조건에서 실질적으로 안정함을 보여주었다(도 3). 사실, 0.20㎎/㎖의 농도로 carbopol 겔에 용해시키고, 동결시키거나(대조구, 도 3의 라인 2), 또는 4-8℃에서 170일 동안 보관한 PLGF-1CG 단백질(샘플, 도 3의 라인 1)을 비환원 조건으로SDS-PAGE 전기영동한 결과는 어떠한 중합체 형성을 나타내지 않았다. 반대로 도 4에 나타낸 돌연변이가 없는 PLGF-1 단백질의 경우 중합체 형성 현상이 분명하게 나타났다(라인 1의 4-8℃에서 150일간 보관한 단백질과 라인 2의 동결 단백질 비교).
| 4-8℃에서 보관한 시간(일) | % 다이머 | |
| 겔 PLGF-1CG (뮤테인) | 겔 PLGF-1 | |
| 03057119133150170210 | 100.00108.00N.A.N.A.98.70N.A.101.50N.A. | 100.00N.A.83.4072.70N.A.71.10N.A.54.90 |
N.A. = 분석하지 않음.
실시예 5
PLGF-1CG 뮤테인의 혈관신생 활성 평가
PLGF-1CG 뮤테인, 자연형 PLGF-1 인자 및, 양성 대조구인 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 혈관신생 활성을 마그리온 등("Il Farmaco")이 기술한 CAM(chicken chorioallantoid membrane vascularization) 테스트를 통해서 비교하였다. 다양한 양의 뮤테인 및 자연형 인자(0 내지 3mcg/스폰지)를 1㎣ 젤라틴 스폰지에 흡착시키고, CAM 표면에 이식하였다. 12일 후, 상기 샘플과 접촉한 CAM 여역을 회수하고 염색하여 "포인트 카운팅(point counting)"의 형태학적 방법을 사용하여 혈관신생 효과를 양적으로 측정하였다. 구체적으로, CAM 부위를 144개의 교차점이 있는 격자상의 현미경으로 분석하고 그 결과를 횡단면상의 모세혈관이 차지하는 교차점의 비율로 나타내었다(혈관이 있는 면적의 비율). 그 결과를 도 6에 나타내었으며, 뮤테인과 자연형 인자의 혈관신행 활성이 실질적으로 동일함을 알 수 있다.
실시예 6
이소프레날린-유발 심장 허혈에 대한 PLGF-1CG 뮤테인의 효과 평가
심장 허혈 및 발작에서 PLGF-1CG 뮤테인의 효과를 측정하기 위해서 자연형 인자에 대해 마그리온 등이 기술한 바와 같이 이소프레날린을 이용하여 동물 모델에 허혈을 유발시켰다. 본 실험은 1 내지 5일간 160mcg/㎏의 단일 일일 용량으로 뮤테인을 정맥 투여하여 처리하거나 동량의 첨가물만을 처리한 토끼에서 수행하였다. 상기 이소프레날린은 1 및 2일에 피하 투여하였다. T 파장의 전도, S 파장의 확장 및 Q 파장의 돌출과 같은 주 허혈 손상을 나타내는 심전도(electrocardiogram)(ECG)의 통상적인 특징이 뮤테인을 처리한 동물에 비해서 첨가물 단독 처리 동물에서 보다 두드러지게 나타났다. 처리 및 비처리 동물의 ECG에서의 변이를 다음에 기록한 바와 같이 0 내지 6의 범위로 표시하였다: 0, 환부(lesion)없음; 1, S 파장의 돌출; 2, T 파장의 돌출; 3, T 파장의 하강 가지(arm)의 침하(depression); 4, S 파장의 확장; 5, T 파장의 전도; 6, Q 파장의 돌출. 처리 및 비처리 동물에 대해서 테스트 5일 간 ECG 점에 의해 한정된 곡선의 총 면적을 산출하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었고 PLGF-1CG 뮤테인으로 처리한 동물에서 허혈 손상이 상당히 감소하였다. 심전도 프로파일을 통해 나타낸 결과는 허혈성 조직을 육안 관찰 및 현미경 관찰을 통해서 확인하였다. 상기 실험은 첨가물 단독으로 처리한 동물의 심장 조직에서 관찰된 것과 비교하여 허혈 환부 및 조직학적변형의 심한 정도가 덜 하였다.
실시예 7
네오마이신-유발 피부경화증에 대한 PLGF-1CG 뮤테인의 효과 평가
야마모토 등이 기술한 동물 피부경화증 모델을 사용하였다.
제1 그룹의 C3H 쥐에 3주간 날마다 블레오마이신(100mcg/㎖)을 피하 주사하였다. 세개의 다른 그룹의 C3H 쥐를 상술한 바와 같이 처리하고, 각각 0.1, 1 및 10mcg/㎖의 PLGF-1CG 뮤테인을 날마다 주사하였다. 3주의 처리 후, 상기 동물들을 희생시키고 처리부위에서 피부 샘플을 채취하고 조직 분석하였다. 1 및 10mcg/㎖의 농도로 PLGF-1CG를 처리한 경우 블레오마이신에 의해 유발된 피부 경화증과 관련된 조직학적 이벤트가 상당히 감소되었으나, 0.1mcg/㎖에서는 효과가 없었다. 구체적으로, 피부 비대증 및 하이드록시프로린의 농도가 블레오마이신만을 처리한 쥐보다 상당히 감소하였다.
실시예 8
약학 조성물
i) 비경구용 용액:
25㎎의 순수한 PLGF-1CG 및 33㎎의 인산염 완충용액(10㎎ NaH2PO4/H2O 및 23㎎ Na2HPO4/2H2O)을 함유하는 53밀리그램의 동결건조 뮤테인, 경구용의 약 125㎖의 식염수를 각각 바이알(vials)에 포장하여 사용 직전에 상기 희석제와 동결건조된 제조물을 혼합하여 사용하도록 제조하였다. 용해 후 활성 물질의 농도는 약 0.2㎎/㎖이다.
ii) 겔 형태의 국부 조성물:
10㎎의 활성 물질을 함유하는 동결건조 물질을 20% DMSO를 함유하는 10% 에탄올 하이드로-알콜성 용액 20㎖에 넣었다. 상기 용액에 다음의 성분을 함유하는 적절한 겔 첨가물을 첨가하였다: 1% Carbopol 940, 소듐 아세테이트 15mM(pH 4.4), 0.04% p/v 디소듐 EDTA, 0.05% p/v 메틸 파라벤, 5.5 내지 6의 최종 pH.
<110> Geymonat S.p.A.
<120> Mutein of placental growth factor type 1, preparation method and
application thereof
<130> geymonat-04-11-17
<150> IT RM2002A000277
<151> 2002-05-17
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 418
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (10)..(405)
<223> Sequence without the DNA encoding the wild type protein signal
peptide. Nucleotide 10 to 408 code for amino acids 19-149 of the
protein described in claim 1 of EP 0 550 519.
<400> 1
ctggcgcat atg ctg cct gct gtg ccc ccc cag cag tgg gcc ttg tct gct 51
Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala
1 5 10
ggg aac ggc tcg tca gag gtg gaa gtg gta ccc ttc cag gaa gtg tgg 99
Gly Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp
15 20 25 30
ggc cgc agc tac tgc cgg gcg ctg gag agg ctg gtg gac gtc gtg tcc 147
Gly Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser
35 40 45
gag tac ccc agc gag gtg gag cac atg ttc agc cca tcc tgt gtc tcc 195
Glu Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser
50 55 60
ctg ctg cgc tgc acc ggc tgc tgc ggc gat gag aat ctg cac tgt gtg 243
Leu Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val
65 70 75
ccg gtg gag acg gcc aat gtc acc atg cag ctc cta aag atc cgt tct 291
Pro Val Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser
80 85 90
ggg gac cgg ccc tcc tac gtg gag ctg acg ttc tct cag cac gtt cgc 339
Gly Asp Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg
95 100 105 110
tgc gaa tgc cgg cct ctg cgg gag aag atg aag ccg gaa agg tgc ggc 387
Cys Glu Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly
115 120 125
gat gct gtt ccc cgg agg taacc caggatcc 418
Asp Ala Val Pro Arg Arg
130
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly Asn
1 5 10 15
Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly Arg
20 25 30
Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu Tyr
35 40 45
Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu Leu
50 55 60
Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asn Leu His Cys Val Pro Val
65 70 75 80
Glu Thr Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Leu Lys Ile Arg Ser Gly Asp
85 90 95
Arg Pro Ser Tyr Val Glu Leu Thr Phe Ser Gln His Val Arg Cys Glu
100 105 110
Cys Arg Pro Leu Arg Glu Lys Met Lys Pro Glu Arg Cys Gly Asp Ala
115 120 125
Val Pro Arg Arg
130
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward Primer for amplification of the human PLGF-1 protein
<400> 3
ctggcgcata tgctgcctgc tgtgccc 27
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse Primer for amplification of the human PLGF-1 protein
<400> 4
ggttacctcc ggggaacagc atcgccgccc c 31
Claims (51)
- 자연형 단백질(wild type protein) 폴리펩타이드 서열의 적어도 한 시스테인 잔기(Cys)를 치환 또는 제거하고, 상기 치환 또는 제거로 인해 생물학적 활성 다이머의 형성은 영향받지 않으나 모노머 형태의 중합체 형성은 방지되는 것을 특징으로 하는 인간 또는 동물의 타입 1 태반성장인자(PLGF-1)의 모노머 형태 뮤테인(mutein).
- 제1항에 있어서, 상기 치환 또는 제거된 Cys 잔기는 단백질 폴리펩타이드 서열의 C-말단 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제2항에 있어서, 상기 뮤테인은 서열번호 2로 표시되는 서열의 125번 위치의 시스테인에 해당되며, 전-단백질(pre-protein) 폴리펩타이드 서열의 142번 위치의 Cys 잔기가 치환 또는 제거된 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제3항에 있어서, 상기 142번 위치의 Cys 잔기는 글리신 잔기(Gly)로 대체되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤테인은 전-단백질 또는 성숙 단백질 형태인 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤테인은 기능적 특징의 변화없이 하나 이상의 자연형 단백질의 아미노산을 더욱 제거, 치환 또는 첨가시킨 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뮤테인은 다이머 형태인 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제7항에 있어서, 상기 뮤테인은 적어도 98.5%의 다이머 형태를 포함하는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 코딩하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제9항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 자연형 PLGF-1을 코딩하는 서열에서 TGC 또는 TGT 코돈이 제거 또는 변형된 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제10항에 있어서, 상기 TGC 또는 TGT 코돈은 GGC, GGT, GGA, 또는 GGG 코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
- 제11항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 DNA 변성에 의해 야기된 서열번호 1로 표시되는 서열 또는 이의 유도체의 382번 위치의 티미딘 염을 구아니딘 염으로 치환시킨 것을 특징으로 하는 뉴클레오타이드 서열.
- 발현 제어 및 조절을 위한 비해독 서열이 측면에 위치하는 것을 특징으로 하는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 시스템.
- 제13항에 있어서, 상기 발현 시스템은 박테리아 세포에서 유도가능한 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제12항 또는 제14항에 있어서, 상기 발현 시스템의 발현은 유도가능 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 시스템은 T7 파지 RNA-폴리머라제 발현 시스템이고, 상기 시스템의 발현은 락토스, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 기능적으로 이의 동등물에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 발현 시스템을 통해 형질전환되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제17항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제18항에 있어서, 상기 박테리아 세포는E. coli균주로 부터 유래된 것을 특징으로 하는 박테리아 세포.
- 자연형 뉴클레오타이드 서열에 대해 적절하게 변형시킨 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 뮤테인을 코딩하는 DAN를 생성시키는 것을 특징으로 하는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레오타이드의 제조방법.
- 제20항에 있어서, 상기 방법은 서열번호 3으로 표시되는 올리고뉴클레오타이드 서열을 5'-3'(전방) 프라이머로 사용하고 서열번호 4로 표시되는 올리고뉴클레오타이드 서열을 5'-3'(역방향) 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응의 주형은 신호 단백질이 없는 PLGF-1을 코딩하는 DNA 서열을 사용하는 것을 특징으로 방법.
- 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응으로 얻은 DNA 서열은 완전 반응이 수행되고, 적절한 제한 효소로 분해되어 적절한 벡터에 클로닝되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 적절한 배양 배지에서 배양하는 단계, 적절한 유도인자를 사용하여 단백질 발현을 유도시키는 단계, 상기 세포를 분리 및 용균(lysis)시키는 단계, 및 상기 용균물(lysate)로 부터 뮤테인을 추출하는 것을 특징으로 하는 세포 PLGF-1 인자의 뮤테인을 생산 및 추출하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 배양 배지는 하나 이상의 선별제제, 효모 추출물, 글리세롤 및 암모늄 염을 포함하고, 동물 또는 인간 유래의 물질이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 세포는 발현 유도 단계 전에, 배양 배지의 흡광도(O.D.)가 600㎚에서 0.2 내지 50 유니트(units)에 도달할 때까지 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 단계는 락토스, 이소프로필-β-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 기능적으로 이의 동등물을 사용하여 유도시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 용균은 동결/융해법, 프렌치 프레스 또는 다른 이와 동등항 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용균 단계는 용균단계 동안 방출되는 불용성 응집체(inclusion body)를 적어도 두번의 원심분리 및 적절한 완충용액으로 세척하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 응집체는 우레아, 구아니딘 이소티오시아네이트, 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 다른 변성제를 함유하는 변성 완충용액에 용해시키고, 선택적으로 균질화 또는 초음파처리시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불용성 응집체의 용해 단계 후, 상기 용액을 희석하고 산화-환원제를 첨가하고 10 내지 30분간, 바람직하게는 18 내지 20시간 동안 10 내지 30℃, 바람직하게는 20℃에서 교반시키면서 항온배양시켜 단백질성 물질을 다이머 형태로 재생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 한번 다이머 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 전제 단계는 이온 교환 크로마토그래피로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 재생 단계에서 얻은 용액을 1 : 1 내지 10 : 1, 바람직하게 10 : 1의 로딩 부피/컬럼 부피 비율을 갖는 음이온 교환 컬럼에 로딩시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항 또는 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 역상 크로마토그래피를 통한 컬럼 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항 내지 제35중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 추가적인 한외여과법과 적절한 첨가제의 존재 또는 부재하에서 동결건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 치료학적 방법에 사용하는 것을 특징으로 하는 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인.
- 제37항에 있어서, 상기 뮤테인은 허혈성 질병에 사용되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제38항에 있어서, 상기 뮤테인은 심근 조직, 심근 경색, 허혈성 발작(ictus) 및 만성 허혈성 심근 질병, 뇌허혈 및 허혈성 발작, 장허혈, 사지의 말초 허혈증의 허혈 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제37항에 있어서, 상기 뮤테인은 피부경화증에 사용되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제37항에 있어서, 상기 뮤테인은 피부 궤양, 상처, 화상, 수술 후 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제37항에 있어서, 상기 뮤테인은 피부 조직의 자연 또는 조기 노화의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 제37항에 있어서, 상기 뮤테인은 자연적 또는 병변성 머리털 손실의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 뮤테인.
- 자연형 PLGF-1과 교차반응할 수 있고 이의 혈관신생 활성을 중화시킬 수 있는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 인지할 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리클로날, 모노클로날 항체, 또는 이의 기능적 활성 단편.
- 제44항에 있어서, 상기 항체는 PLGF-1의 이상 생성을 수반하는 병변을 치료하기 위해 내생 PLGF-1의 혈관신생 활성을 중화시키는 약물인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제44항에 있어서, 상기 항체는 종양을 치료하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제44항에 있어서, 상기 항체는 내생 PLGF-1의 이상 생성에 의한 병변의 진단 방법에 사용되는 제제인 것을 특징으로 하는 항체.
- 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인 또는 제44항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 약학 조성물은 비경구용, 국소용, 경구용, 코 또는 이식용으로 적절한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인 및 미용학적으로 허용가능한첨가제를 함유하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물.
- PLGF-1을 약학적 또는 미용학적으로 허용가능한 첨가제 및 다른 일반적인 첨가물과 혼합시키는 것을 특징으로 하는 제48항에 따른 약학 조성물 또는 제50항에 따른 미용 조성물의 제조방법.
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