HU222829B1 - Eljárás biológiailag aktív protein előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás dimer, biológiailag aktív ?-típusútranszformáló növekedési faktor (TGF-?)-szerű fehérje vagy sójaelőállítására. Az eljárást az jellemzi, hogy a (TGF-?)-szerű fehérjedenaturált, monomer formáját egy térszerkezet kialakítására alkalmas,detergens nélküli pufferrel kezelik, amely egy szerves oldószert,éspedig dimetil-szulfoxidot vagy dimetil-- formamidot, vagy ezektetszőleges keverékét tartalmazza körülbelül 10–körülbelül 50 tf/tf%koncentrációban, egy re- dukálószer mellett, és pH-értéke körülbelül7–körülbelül 10 közötti. A (TGF-?)-szerű fehérjék nagy hatású, sokféleterápiás célra felhasználható biológiai anyagok. ŕ

Description

KIVONAT

A találmány tárgya eljárás dimer, biológiailag aktív βtípusú transzformáló növekedési faktor (TGF-P)-szerű fehérje vagy sója előállítására.

Az eljárást az jellemzi, hogy a (TGF-p)-szerű fehérje denaturált, monomer formáját egy térszerkezet kialakítására alkalmas, detergens nélküli pufferrel kezelik, amely egy szerves oldószert, éspedig dimetil-szulfoxidot vagy dimetil-formamidot, vagy ezek tetszőleges keverékét tartalmazza körülbelül 10-körülbelül 50 tf/tf% koncentrációban, egy redukálószer mellett, és pH-értéke körülbelül 7-körülbelül 10 közötti.

A (TGF-P)-szerű fehéijék nagy hatású, sokféle terápiás célra felhasználható biológiai anyagok.

A leírás terjedelme 22 oldal

HU 222 829 B1

HU 222 829 Bl

A találmány tárgya háromdimenziós térszerkezetet kialakító (folding) eljárás biológiailag aktív, dimer TGFβ (β-típusú transzformáló növekedési faktor)-szerű protein előállítására egy detergenstől mentes foldingpufferben.

A TGF^-szerű, például a TGF-β főcsoportba tartozó proteinek sokféle biológiai szabályozási útvonalon, például az embrionális fejlődésben vagy a szövetregenerálásban központi szerepet játszanak. Ezek nagy hatású biológiai anyagok, amelyek sokféle terápiás célra felhasználhatók. A TGF-β főcsoport legismertebb tagjai maguk a TGF^-proteinek.

A TGF-β-ί eredetileg emberi trombocitából, emberi placentából és boíjúveséből nyerték homogenitásig végzett tisztítással, és körülbelül 25 000 Da molekulatömegű homodimer fehéijeként azonosították. Először azon képességével jellemezték, hogy az EGF-fel vagy TGFa-val szinergetikus hatást fejt ki a transzformálatlan NRK-sejtek beágyazódási helytől független szaporodására, újabban kimutatták, hogy a TGF-β a normális és daganatsejtek széles körében sokféle szabályozó hatást fejt ki, és ez mutatja, hogy ez a protein a sejtműködés többfunkciós regulátoraként milyen nagy jelentőségű. A szövet vagy sejt típusától és más növekedési faktorok esetleges jelenlététől függően a TGF-β a mitogenezist, a sejtszaporodást és -növekedést is stimulálhatja, vagy hatásosan gátolhatja ezeket a folyamatokat, vagy egyéb hatásokat is kifejthet, amilyen például az adipogenezis, myogenezis, chondrogenezis, osteogenezis (a zsír-, izom-, ízület- és csontképződés) vagy az immunsejtfünkciók szabályozása, a chemotaxis (kémiai vonzás) stimulálása, a differenciálódás indukciója vagy gátlása. A TGF^-nak sok olyan hatása van, amely a sejteknek és szöveteknek a stresszre vagy sérülésekre adott válaszával és az ebből eredő károsodás helyrehozásával kapcsolatos. Gyulladás után a TGF-β fontos szerepet játszik a sarjadzó szövetek képződésében, fokozza a gének expresszióját, amely kapcsolatban áll a sejtközi állomány, például fibronektin, kollagén és bizonyos proteázinhibitorok képződésével, és stimulálja a kollagén sejtközi állománynak a fibroblasztok hatására bekövetkező kontrakcióját (összehúzódás), amiből arra következtethetünk, hogy esetleg szerepe van a kötőszövet kontrakciójában is.

Eddig öt különböző, bár funkcionálisan és szerkezetileg egymáshoz nagyon hasonló TGF-β-ί írtak le: TGF-βΙ, TGF^2, ΤϋΡ-β3, TGF-βΛ és TGF^5. Az első hármat emberben is megtalálták.

Minden TGF-β-Ι 390-412 aminosavprekuizorként szintetizálnak, ezekből proteolízissel állítják elő az érett formákat, amelyek a 112 aminosavas C-terminálisból állnak. Érett, biológiailag aktív alakjukban a TGFβΐ—5 fehéqék két, egyenként 112 aminosavat tartalmazó polipeptidlánc sav- és hőálló diszulfidkötéses homodimeqei. A Dérynék, R. és munkatársai [Natúré 316, 701-705 (1985)] által leírt emberi, a szintén Derynck, R. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 261, 4377-4379 (1986)] által leírt patkány/egér-, valamint a Sharples, K. és munkatársai [DNS 6, 239-244] által leírt komplett majom-TGF-βΙ aminosavszekvenciák jelentős mértékű szekvenciamegőrzést mutatnak, mindössze egy aminosavban térnek el egymástól. A deMartin, R. és munkatársai [EMBO J. 6, 3673-3677 (1987)], valamint Marquardt, H. és munkatársai [J. Bioi. Chem., 262, 12 127-12 131 (1987)] által leírt emberi TGF-βΙ, emberi TGF^2 és a Ten Dijke, P. és munkatársai [PNAS 85, 4715-4719] által leírt emberi TGF^3 összehasonlításából kiderül, hogy ez a háromféle protein körülbelül 70-80%-os szekvenciaazonosságot mutat. Cheifetz, S. és munkatársai [Cell 48, 409-415 (1987)] sertéstrombocitából izolálták a heterodimer TGF-β 1.2-t, ez egy TGF^2 alegységhez diszulfidkötéssel kapcsolódó TGF-βΙ alegységből áll.

Ma olyan kísérletek folynak, amelyeknek célja, hogy a TGF^-kat ahelyett, hogy természetes forrásokból, például trombocitákból nyernék ki, rekombináns technikákkal állítsák elő, hogy különböző terápiás modellekben végzendő vizsgálatokhoz elegendő mennyiséget kapjanak. Rendkívül nehéznek bizonyult azonban a biológiailag aktív rekombináns TGF-β előállítása. Amint a szekvencialistán 1-6. szekvencia-azonosítószámon felsorolt szekvenciákból látható, a TGF-βΙ, TGF^2 és TGF^3 112 aminosav hosszúságú érett formái 9 ciszteint tartalmaznak. Schlunegger, Μ. P. és Gruetter, M. G. [Natúré, 358:430-434 (1992)] kimutatták, hogy a TGF^2-nél a 9 cisztein 4 láncközi és 1 láncon belüli diszulfidkötést képez. A TGF-β heterológ expressziója olyan terméket eredményezhet, amelynek bár elsődleges szerkezete korrekt, a kapcsolódásai nem megfelelők ahhoz, hogy a pontos, bonyolult elsődleges és másodlagos szerkezetet alakuljon ki, ezért biológiai aktivitást nem mutat.

Ami a természetes TGF-β molekulákat illeti, általában úgy tartják, hogy ezek mindegyike alkalmas arra, hogy magasabb rendű élő szervezetekből származó sejtekben a megfelelő TGF-β géneket expresszálja. A rekombináns TGF^-k expressziója eukariotikus rendszerekben megoldható, de a biológiailag aktív, pontos térszerkezetű anyag kihozatala távolról sem kielégítő.

Ezért próbálkoztak azzal, hogy biológiailag aktív TGF-β-ι egy mikrobiológiai gazdaszervezetben állítsanak elő. De például egy baktériumban a sejtközi körülmények nem segítik elő a pontos térszerkezet és a diszulfidkötések kialakulását, valamint a diszulfidkötésekkel stabilizált dimerizációt, amely az aktivitás szempontjából alapvető jelentőségű. Ezért csak nagyon kicsiny biológiai aktivitású TGF-β-ί nyertek ki a megfelelő génnek E. coliban, promoterrel szabályozott expressziója után; ennek leírása megtalálható az EP-A-0,268,561 számon közzétett európai szabadalmi bejelentésben. Egy másik, Urushizaki, Y. és munkatársai [Tumor Rés. 22, 41-55] által közölt jelentés egy TGF-β cDNS-nek trp promoterrel szabályozott expresszióját írja le, amely egy SDS poliakrilamidgél autodiagramjában egy 13 000 Da molekulatömegnél megjelenő radioaktív jelzéssel ellátott fehéijesávot eredményezne, de semmiféle radioaktivitást nem tapasztaltak.

Ha egy bakteriális (például E. coli) expressziós rendszerben nagy mennyiségben termelődnek rekombináns proteinek, ezek sokszor nagymértékben oldhatatlan zár2

HU 222 829 Bl ványtesteknek vagy refrakciós (fénytörő) testeknek nevezett sejtközi csapadék alakjában jelennek meg, amely fáziskontraszt-mikroszkóp alatt a sejtek által körülzárt térben csillogó foltok alakjában észlelhető. Ezek az oldható baktériumfehérjéktől könnyen elválasztható zárványtestek tartalmazzák a rekombináns fehéqét erősen denaturált és redukált formában, amely természetes ellenanyagával szemben nem mutat aktivitást, s amely ezért kereskedelmi terméknek nem alkalmas. Ezért általában egyetértenek abban, hogy a rekombináns fénytörő fehéqét szolubilizálni kell olyan körülmények között, amelyek alkalmasak arra, hogy denaturált formájában megtartsák, majd ezután ki kell alakítani a megfelelő térszerkezetet, hogy a denaturált, kötetlen alakból egy olyan megfelelő, funkcionálisan aktív háromdimenziós szerkezet jöjjön létre, amelyet viszonylag gyenge, atomok közötti erőhatások, például hidrogénhidak, hidrofób kölcsönhatások és töltések kölcsönhatásai stabilizálnak. Ciszteint tartalmazó fehérjéknél diszulfidkötések is képződhetnek. Ha a diszulfidkötések képződését kémiailag előmozdítjuk, akkor a nem megfelelő intramolekuláris és dimer vagy multimer fehéqék esetén intermolekuláris hidak képződését meg kell előzni, vagy legalábbis minimálisra kell csökkenteni, mert a nem kívánt, nem pontosan összekapcsolt izomerek inhomogén anyagot hozhatnak létre, így bonyolulttá teszik a kívánt szerkezetű fehéije további tisztítását, vagy csökkent aktivitású fehéqét eredményezhetnek.

A fehéqék térszerkezetének kialakítását általában több lépésből álló eljárással végzik, amely magában foglalja a fehérje szolubilizálását erősen denaturáló körülmények között, majd a chaotrop besűrítését, hogy a térszerkezet kialakulása végbemenjen. Ilyen eljárással azonban TGF-β térszerkezetének kialakítása nem járt sikerrel. Viszont az az EP-A-0,433,225 számon közzétett európai szabadalmi bejelentés egy sikeres eljárást ismertet biológiailag aktív dimer TGF^-szerű fehéije előállítására, ebben egy enyhe detergenst használnak, amely lehetővé teszi a TGF-β fehéqe térszerkezetének kialakulását, miközben a detergens jelen marad az e célra szolgáló (folding) oldatban.

Az irodalomból, például Tam és munkatársai közleményéből [J. Am. Che. Soc., 113: 6657-6662 (1991)] és az US 5 144 006 számú szabadalmi leírásból ismert, hogy dimetil-szulfoxid használható arra, hogy peptidekben előmozdítsa diszulfidkötések szelektív és hatékony kialakulását. Az eljárás szelektív, vagyis mellékreakcióktól mentes, és széles pH-tartományban alkalmazható. Pontos diszulfidhidak képződését azonban csak legfeljebb körülbelül 30 aminosavból álló peptideknél, 7 és 17 közötti aminosavmaradékból álló rövid peptideknél és nagyobb, körülbelül legfeljebb 120 aminosavmaradékból álló egyenes láncú peptideknél mutatták ki. A 4,731,440 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint dimetil-szulfont vagy dimetil-szulfon és karbamid keverékét használták zárványtestekből származó szomatotropin szolubilizálására. A szolubilizált fehéqe azután renaturálható volt oly módon, hogy a dimetil-szulfon-tartalmú fehéijeoldatot egy enyhe oxidálószerrel hozták érintkezésbe.

Most meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a TGFβ-szerű fehéqék térszerkezete visszaalakítható az aktív, dimer formába oly módon, hogy a szolubilizált monomert olyan, a térszerkezet kialakítására (folding) szolgáló, detergenstől mentes pufferrel kezeljük, amely egy szerves oldószert, például dimetil-szulfoxidot, dimetilformamidot, vagy dimetil-szulfoxid és dimetil-formamid elegyét tartalmazza.

A találmány tárgya javított eljárás biológiailag aktív dimer TGF^-szerű fehérjék előállítására denaturált vagy a természetestől más módon eltérő formájukból kiindulva. Ezt a célt azzal a meglepő felismeréssel érjük el, hogy számottevő mennyiségű kívánt dimer terméket kaphatunk váratlanul magas kihozatallal, ha a fehéqe monomer formáját egy detergenstől mentes, valamilyen szerves oldószert, például dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, vagy dimetil-szulfoxid és dimetil-formamid elegyét tartalmazó foldingpufferrel kezeljük.

Az alábbiakban a találmányt részletesen ismertetjük.

A találmány tárgya javított eljárás dimer, biológiailag aktív β-típusú transzformáló növekedési faktor fehérje (TGF^-szerű fehéqe) előállítására, amely abból áll, hogy a TGF^-szerű fehéqe denaturált, monomer formáját a térszerkezet kialakítására alkalmas, detergenstől mentes pufferrel kezeljük, amely egy szerves oldószert, így DMSO-t, DMF-et, vagy ezek tetszőleges keverékét tartalmazza körülbelül 10-körülbelül 50 tf/tf% közötti koncentrációban, a puffer még egy redukálószert is tartalmaz, és pH-értéke körülbelül 7-körülbelül 10 között van.

A leírásban a „TGF^-szerű fehéqe” kifejezés olyan fehéqét jelent, amelynek monomer alakban a szekvenciája legalább 75%-ban homológ a TGF-β főcsoport alábbi tagjai közül legalább egynek a monomer aminosavszekvenciájával:

TGF-βΙ, TGF-p2, TGF^3; egy növekedésgátló, a poliergin, amelyet Holley, R. W. és munkatársai [PNAS 77, 5989-5992 (1980)], valamint Ristow, H. J. [PNAS 83,5531-5533 (1980)] BSC-1 majomvesesejtek kondicionált közegéből izoláltak; a TGF-fi4, amit Jakowlew, S. B. és munkatársai [Molecular Endcrinology 2, 1186-1195 (1988)] csirkeembrió-chondrocitákból (porcsejtek) izoláltak; a Kondaiah, P. és munkatársai által [J. Bioi. Chem. 265, 1089-1093 (1990)] leírt TGFβ5 a Xenopus-Laevisből; a TGF-β-val rokon inhibinek és aktívinek (ivarmirigy-fehéijék, amelyek a tüsző nyálkakiválasztását szabályozzák); a Müller-féle inhibitor (MIS, amely a hím emlősembriókban a Müller-cső kialakulását megakadályozza); morfogén (alakfejlődési) csontfehéqék (BMP-k, a polipeptideknek a csontok és porcok kialakulásában szerepet játszó csoportja, közülük jelenleg ismertek a BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 és BMP-9); a Drosophila dekapentapleg génkomplexéből a légyembrióban a morfogenezist (alakfejlődést) szabályozó dpp-ből számazó transzkriptum (másolat); a Vg-1, a Xenopus transzkriptum terméke, amely az oociták (primitív petesejtek) szikpólusában van jelen; továbbá a Vg-1 és a hozzá hasonló emlősgének, amelyeket Mason, A. és

HU 222 829 Β1 munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Commun. 135, 957-964 (1986)], Cate, R. és munkatársai [Cell 45, 685-698 (1986)], Wozney, J. M. és munkatársai [Science 242, 1528-1534 (1988)]; Padgett, R. és munkatársai [Natúré 325, 81-84 (1986)]; Weeks, D. L. és Méltón, D. A. [Cell 51, 861-868 (1987)], valamint Lyons, K. és munkatársai [PNAS 86, 4554-4558 (1989)] ismertetnek.

A „TGF-p-szerű fehérje” kifejezés jelentése kiterjed továbbá a különböző TGF-p-szerű fehéqék alegységeit vagy az említett fehérjék olyan fragmentumait vagy mutánsait tartalmazó heterodimerekre, amelyek az eredeti molekulának egy- vagy többféle biológiai hatását megtartják.

A leírásban a „TGF-P-szerű fehérje” előnyösen a TGF-β főcsalád bármely tagját jelenti. Még előnyösebben ez a kifejezés egy, a TGF-β főcsalád következő tagjait tartalmazó csoportból választott fehérjét jelent: emlősökből, például emberből vagy állatokból, mint majom, patkány/egér, sertés, ló vagy szarvasmarha, származó, valamint heterodimer TGF^-k, amelyek két különböző, egyenként 112 aminosavat tartalmazó alegységből állnak, a TGF-β fragmentumai és mutánsai, beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-β fehérjék egyes részei ki vannak cserélve; a majomvesesejtek kondicionált közegéből izolált növekedésgátló, a poliergin; a ΤΰΡ-β4, amit csirkeembrió-chondrocitákból (porcsejtek) izoláltak; a Xenopus-Laevisből izolált TGF^5; a TGF^-val rokon inhibinek és aktivinek (ivarmirigy-fehéqék, amelyek a tüsző nyálkakiválasztását szabályozzák); a Müller-féle inhibitor (MIS, amely a hím emlősembriókban a Müller-cső kialakulását megakadályozza); morfogén (alakfejlődési) csontfehéijék (BMP-k, a polipeptideknek a csontok és porcok kialakulásában szerepet játszó csoportja, közülük jelenleg ismertek a BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 és BMP-9); a Drosophila dekapentapleg génkomplexéből a légyembrióban a morfogenezist (alakfejlődést) szabályozó dpp-ből származó transzkriptum; a Vg-1, a Xenopus transzkriptum terméke, amely az oociták (primitív petesejtek) szikpólusában van jelen; továbbá a Vgr-1, egy, a Vg-1-hez hasonló emlősgén. A „TGF^-szerű fehérje” kifejezés jelentése kiterjed továbbá a különböző TGF-3-szerű fehérjék alegységeit vagy az említett fehérjék olyan fragmentumait és mutánsait tartalmazó heterodimerekre, amelyek az eredeti molekulának egy vagy minden biológiai hatását megtartják.

Még előnyösebb TGF^-szerű fehérjék választhatók a TGF-pl-et, TGF-32-t, TGF-p3-at, a heterodimer TGF-β fehérjéket, ezek fragmentumait és mutánsait, beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-β fehérjék egyes részei ki vannak cserélve, a BMP-ket, inhibineket és aktivineket tartalmazó csoportból. Ezen belül még előnyösebbek a BMG-2, TGF-β 1, TGF^2, TGF-33 csoport tagjai közül választott fehérjék, ezek heterodimerjei, fragmentumai és mutánsai, beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-β fehérjék egyes részei ki vannak cserélve, különösen a TGF^l-3 hibrid, a TGFβ2—3 hibrid és a TGF^3-2 vagy TGF-β 1-2 hibrid, amely az N-terminálistól a C-terminális felé haladó sorrendben az N-terminális 44 humán TGF-β 1 aminosavát és a C-terminális 68 humán TGF^2 aminosavát tartalmazza. Még előnyösebbek az olyan TGF^-szerű fehérjék, amelyeknek aminosavszekvenciája a szekvencialistán 1., 3., 5., 7., 9. vagy 11. szekvencia-azonosítószámon szerepel. A legelőnyösebb TGF^-szerű fehérje a TGF^3.

A TGF-β biológiai aktivitását a találmány céljára az alábbi módszerek valamelyikével határoztuk meg:

- a TGF^-nak fibroblasztokra kifejtett, a sejtmigrációt elősegítő hatása a Postlethwaite, A. E. és munkatársai [J. Exp. Med. 165, 261 (1987)] által kidolgozott módszer Burk, R. [PNAS 70, 369 (1973)] szerinti módosítása,

- Brown, T. J. és munkatársai [J. Immunoi. 139, 2977 (1987)]: a TGF-β inhíbiáló hatása az emberi A 375 melanomasejtekre,

- Graycar, J. L. és munkatársai [molecular Endocrinology 3:1977-1986 (1989)]: CCL-64 sejtek inhibíciója, DNS-szintézises vizsgálati módszer vagy

- Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) folytonos nyérctüdőhámsejtvonal szaporodásának inhibíciója, amint azt a későbbiekben a példákban leírtuk.

A találmány szerinti térszerkezet-kialakítási eljárással bármilyen forrásból vagy módszerből származó monomer TGF^-szerű fehérje a megfelelő dimer, biológiailag aktív TGF^-szerű fehérjévé kapcsolható össze. A TGF^-szerű fehérje monomer alakja származhat például természetes forrásból, vagy előállítható rekombináns DNS-technikával vagy a szakmában jól ismert szintetikus módszerekkel. Ha a monomer a szennyezések miatt a térszerkezetnek in vitro végzett kialakítására nem alkalmas, akkor a szolubilizált és denaturált monomer kromatográfiával, például Sephacryl S-100 HR-en végzett molakulaszűrős kromatográfiával tisztítható.

A térszerkezet kialakítása előtt a monomer TGFβ-szerű fehérjének denaturált (vagyis térszerkezet nélküli), szolubilizált formában kell jelen lennie. A szakmában jól ismert, úgynevezett chaotrop szerek képesek a fehérjéket hatásosan denaturálni és szolubilizálni, ami vizes oldatban és alkalmas körülmények között a felületen végrehajtott változtatások a hidratációs állapot, az oldószerkömyezet vagy az oldószer és a felület közötti kölcsönhatás változtatása révén megváltoztatja a szóban forgó fehérje térbeli konfigurációját. Ilyen chaotrop vagy denaturálószer például a karbamid, a guanidin-hidroklorid, a nátrium-tiocianát körülbelül 4 és körülbelül 9 M közötti koncentrációban, továbbá detergensek, például az SDS, amely 0,01 és 2% közötti koncentrációkban kapható. A monomer denaturálását és szolubilizását eredményezi az is, ha a TGF-3-szerű fehérjét tartalmazó vizes oldatot például egy kis molekulatömegű, előnyösen 2, 3 vagy 4 szénatomos alifás szerves savval, még előnyösebben ecetsavval körülbelül 2 és körülbelül 4 közötti pH-értékre megsavanyítjuk, valamint bázisos körülmények, pél4

HU 222 829 Β1 dául 10 vagy magasabb pH és emelt hőmérséklet alkalmazása.

A monomert ezután „a térszerkezet kialakulását elősegítő körülmények” közé helyezzük, amelyek lehetővé teszik a biológiailag aktív dimer kialakulását. Ezek olyan körülmények, amelyek az intra- és intermolekuláris (molekulán belüli és kívüli) kötések létrejöttét elősegítik, és lehetővé teszik, hogy a denaturált monomer egy biológiai aktivitást mutató alakot vegyen fel. Ebben a folyamatban a monomer elsődleges szerkezete (vagyis az aminosavszekvencia) nem változik, viszont egy háromdimenziós szerkezetű, biológiailag aktív dimer termék alakul ki. A folyamat során diszulfidkötések jönnek létre, és a monomerek biológiailag aktív dimerré kapcsolódnak össze.

E célból a denaturált monomert a találmány szerinti eljárással egy szerves oldószert tartalmazó foldingpufferrel kezeljük. Szerves oldószerként alkalmazható a dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, vagy ezek bármely keveréke.

A térszerkezet kialakítását semleges vagy lúgos pH-értéken és valamilyen alkalmas, például körülbelül 0 °C és körülbelül 40 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. A pH előnyösen körülbelül 7 és körülbelül 10 közé, még előnyösebben dimetil-szulfoxid esetén körülbelül 9 és 9,5 közé esik, dimetil-formamid esetén pedig körülbelül 8,5.

A találmány szerint a térszerkezet kialakítására használhatók az olyan hagyományos pufferrendszerek, amelyek pH=7 és 10 között megfelelő pufferkapacitást nyújtanak. A találmány szerinti eljárásban minden olyan puffer alkalmazható, amely a fehérjék térszerkezetének kialakulását nem gátolja.

Pufferként használhatók például a Tris-, bisz-Trisvagy piperazinpufferek. A pufferek kívánt esetben tartalmazhatnak továbbá valamilyen sót és kívánt esetben egy bázisos aminosavat is.

A foldingpufferekben sóként alkalmazhatók például a nátriumnak, lítiumnak, káliumnak, ammóniának, magnéziumnak, kalciumnak vagy mangánnak klorid-, fluorid-, bromid-, jodid-, hidrogén-karbonát-, szulfát-, foszfát-, acetát-, cianát- vagy rodanidionnal képzett sói, vagy más alkálifémek vagy alkáliföldfémek halogénvagy pszeudohalogénvegyületei, legfeljebb 3 M koncentrációban. Előnyösen 1 -2 M nátrium-kloridot alkalmazunk.

A foldingpufferben bázisos aminosavként például arginint alkalmazhatunk, előnyösen 0,5 M koncentrációban.

A térszerkezet találmány szerinti kialakításához a dimetil-szulfoxidot körülbelül 10% és körülbelül 50% közötti, előnyösen körülbelül 20% és körülbelül 50% közötti, még előnyösebben körülbelül 30% és körülbelül 50% közötti, a legelőnyösebben körülbelül 40%-os koncentrációban alkalmazzuk.

A dimetil-szulfoxidot a foldingpufferben helyettesíthetjük dimetil-formamiddal. A dimetil-formamidot körülbelül körülbelül 10% és körülbelül 50% közötti, előnyösen körülbelül 20% és körülbelül 50% közötti, még előnyösebben körülbelül 30% és körülbelül 50% közötti, a legelőnyösebben körülbelül 30% és körülbelül 40% közötti koncentrációban alkalmazzuk.

DMSO- és DMF-elegy is alkalmazható, a dimetilszulfoxid és dimetil-formamid elegye körülbelül 10% és körülbelül 50% közötti koncentrációban alkalmazható. A koncentrációérték a két oldószer elegyére vonatkozik.

A térszerkezet kialakításához használt puffer az eddigieken kívül egy redukálóanyagot is tartalmaz. Alkalmas redukálószer, amely fehérjékben vagy peptidekben elősegíti a diszulfidok képződését, lehet például egy kis molekulatömegű szulfhidrilreagens, éspedig glutation redukált alakban, ditiotreitol redukált alakban, -merkapto-etanol redukált alakban, merkapto-metanol redukált alakban, cisztein vagy cisztein-amin. A szulfhidrilreagens alkalmas koncentrációja körülbelül 1 és 100 mM közötti, előnyösen körülbelül 1 és 10 mM közötti, még előnyösebben körülbelül 2,5 mM. Előnyös redukált szulfhidrilvegyület a redukált glutation, cisztein, cisztein-amin vagy β-merkapto-etanol. A találmány szerinti eljárásban legelőnyösebb a glutation alkalmazása.

A térszerkezet kialakítását megfelelő, például körülbelül 0 °C és körülbelül 40 °C közötti, előnyösen 4 °C körüli hőmérsékleten és megfelelő, például körülbelül 2 és körülbelül 720 óra közötti idő alatt hajtjuk végre. Minthogy a térszerkezet kialakításának időtartama az alkalmazott hőmérséklettől függ, a hőmérsékletet optimalizálhatjuk tetszőleges kívánt reakcióidőhöz, vagy fordítva.

A dimer, biológiailag aktív TGF-p-szerű fehérje találmány szerinti előállítását végezhetjük egy lépésben, amikor is a fehérje monomerjét behelyezzük a foldingpufferbe, és a reakcióelegyet például 2 órától 7 napig terjedő vagy hosszabb időn át például 0 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 °C-on inkubáljuk, miközben a térszerkezet kialakulása és a dimerizálódás folyamatosan végbemegy. Nagy jelentőségű a fehérje koncentrációja a térszerkezet kialakulása során, mert ha túl nagy, a monomerek erősen aggregálódhatnak, ami nem kívánatos nagyságú oligomerek képződéséhez vezet. A dimer termék kihozatala növekszik, ha a fehérjekoncentráció 2 mg/ml-nél kisebb, az előnyös koncentrációk 0,01 és 0,05 mg/ml közé esnek.

A térszerkezet kialakítása után a biológiailag aktív dimert pufferoljuk, hogy eltávolítsuk belőle a nem pontos szerkezetű TGF-P-szerű fehérjét és a szennyezéseket, különösen a pirogéneket és más endotoxinokat, amelyek jelen lehetnek a készítményben, ha a polipeptidet egy mikrobiológiai gazdaszervezet sejtjeiben állítottuk elő. A dimer elválasztásához kromatográfiát, például gélkromatográfrával végzett méret szerinti frakcionálási, hidrofób kölcsönhatásos kromatográfiát vagy ioncserélő, például egy Mono S oszlopon végrehajtott vagy reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiát alkalmazunk.

A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti eljárással előállított dimer, biológiailag aktív TGF-P-szerű fehéijék, amelyek a terápiában sokféle módon alkalmazhatók.

HU 222 829 Bl

Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, annak oltalmi körét nem befolyásolják.

1. példa: TGF-βΙ, TGF-^2 és

TGF-fi3 expressziója E. coliban

IA. példa: Általános módszerek

Baktériumtörzs:

E. coli K12/LC BVíhtpR,,,,,, Ion_R9, Ia_cam, mal_am, trpam, pho_am, rspL, tsx: :TnlO, supC_te leírása megtalálható az alábbi szakirodalmi helyen: Goff és munkatársai [PNAS 81, 6647-6651 (1984)]

Plazmidok:

- A Buell, G. és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 13, 1923-1938 (1985)] által leírt pPLMu: ez a plazmid hordozza a bakteriofág lambda P_L promotert a phage Mu ner gén riboszómakötő hellyel, leírása megtalálható az alábbi helyen: Van Leerman és munkatársai [Virology 123,19-28 (1982)],

- a Remault és munkatársai [Gene 22, 103-113 (1983)] által leírt plc857:a termolabilis C1857 represszort (egy gén működését megakadályozó anyag) kódoló és a kanamicinnel szembeni ellenállást adó plazmid.

SDS gélelektroforézis:

Az SDS poliakrilamid-gélelektroforézist (SDS-PAGE) és a proteinszínezést a Laemmli, U. K. [Natúré 227, 680-685 (1970)] által ismertett, a fentiekben leírt módon, a BIORAD cégtől beszerzett Miniprotean II cella és 1 mm vastagságú 18%-os poliakrilamidgél alkalmazásával végezzük.

Hőindukció:

Egy 20 ml-es kémcsőben, amely 40 pg ampicillint és 40 pg kanamicint tartalmaz, 7 ml, Maniatis és munkatársai [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] által leírt LB- (ligációs puffer) közeget (LB/amp/kan) egy izolált teleppel beoltunk, és rázás közben egy éjszakán át 30 °C-on inkubáljuk. Ebből az egyéjszakás tenyészetből 15 ml-t adunk egy 100 ml-es Erlenmeyer-lombikba betöltött (LB/amp/kan) közeghez, és a lombikot egy 42 °C-os vízfürdős rázógépbe helyezzük. Egy 2 ml-es mintát veszünk a hőközlés előtt (indukciómentes körülmények), és egy 1 ml-es mintát 1 órával a hőközlés után (indukciós körülmények). A sejteket Eppendorf centrifugában 5 percig, 10 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással ülepítjük, a felülúszót elöntjük. Az üledéket 100 pl SDS-PAGE mintapufferben szuszpendáljuk, és 10 percig 90 °C-on melegítjük. 5 pl-es aliquot mintákkal elvégezzük a gélelektroforézist.

Kompetens sejtek előállítása:

A kompetens E. coli-sejteket a Maniatis és munkatársai [Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] által leírt kalcium-kloridos eljárással állíthatjuk elő. A sejthordozó plc857 plazmidot 30 °C-on szaporítjuk.

IB. példa: A pPLMu.hTGF-βΙ, a pPLMu.hTGFβ2 és a pPLMu.hTGF^3 expressziós vektor felépítése és a TGF-βΙ, TGF^2 és ΤΟΡ-β3 expressziója

A TGF^l-et, TGF^2-t, illetve TGF-33-at kódoló szekvenciákat (amelyek a szekvencialistán láthatók) PGem-5ZF(+) (Promega) plazmidba klónozzuk, Ncolgyel emésztjük, Calf Intestinal Alkaline Phoshatase-zal (a Boehringertől beszerzett lúgos boíjúbélfoszfatáz) foszformentesítjük, majd Klenow-polimerázzal (Gibco-BRL) kitöltjük. A kapott szerkezeteket pGKM 125-nek (TGFβΐ), pGKM 740-nek (TGF^2), illetve pGKM 126-nak (TGF^3) nevezzük, és a kompetens E. coli Y 1090 sejtek transzformálására használjuk. Azokat a kiónokat, amelyek a TGF^l-et, TGF^2-t, illetve TGF^3-at kódoló pontos inszerciókat hordozzák, E. coli Y 1090/pGKM 125 (TGF^l)-nek, E. coli Y 1090/pGKM 740 (TGF-p2)-nek, illetve E. coli Y 1090/pGKM 126 (TGF^3)-nak nevezzük.

Az E. coli Y 1090/pGKM 125, E. coli Y 1090/pGKM 740 és E. coli Y 1090/pGKM 126 sejteket LB közegben szaporítjuk, a DNS-plazmidot pedig a Bimbóim, H. C. és Doly, H. [Nucleic Acids Research 7. 1513 (1979)] által leírt módon állítjuk elő. Ehhez 50 μΐ restrikciós pufferben 5 pg plazmid DNS-t hasítunk Ncol és Sáli (pGKM 125) vagy Ncol és EcoRV (pGKM 740) vagy egymagában Ncol (pGKM 126) alkalmazásával, a szállító (Boehringer) utasításait követve. A DNS-t 5 pl 3 M nátrium-acetát, 100 mM magnézium-klorid és 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) hozzáadásával és 150 pl etanol hozzáadásával kicsapjuk. -70 °C-on végzett 15 perces inkubálás után a DNS-t Sorvall centrifugával, SS34 rotorban 13 000 gvel végzett 15 perces centrifugálással ülepítjük. A felülúszót elöntjük, az üledéket 80 pl 0,089 M TRISborátot, 0,089 M bórsavat, 0,002 M EDTA-t, 0,25% bróm-fenolkéket és 0,25% xilol-cianolt tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. Négyszer 20 pl-es mintákkal, TBE-pufferben 0,5 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó 1%-os agarózgélben 50 V feszültséggel addig végezzük a gélelektroforézist, míg a bróm-fenolkék-jelző a 10 cm hosszúságú és 0,8 cm vastagságú gél alját el nem éri. Az érett TGF^l-et, TGF^2-t, illetve TGF^3-at kódoló DNS-ffagmentumokat rövid hullámhosszú ultraibolya fénnyel láthatóvá tesszük, borotvapengével kivágjuk, és a géldarabról elektroelúcióval, Schleicher & Schüll Biotrap készülékkel, 1,5 órán át 200 mamp áram alkalmazásával leoldjuk. A leoldott DNS-ffagmentumokat a fenti módon kicsapjuk, majd 20 pl TE-ben reszuszpendáljuk.

pl pPLMu plazmidot Ncol és Sáli vagy Ncol és EcoRV vagy egymagában Ncol alkalmazásával végzett emésztéssel linearizálunk, és a gélt az előzőekben a DNS-fragmentumokra vonatkozóan leírt módon tisztítjuk. 100 ng linearizált és tisztított pPLMu vektorDNS-t és a megfelelő, tisztított DNS-fragmentum 3 mólekvivalensnyi mennyiségét 1 egység DNS-ligázt (Boehringer) tartalmazó 20 pl ligációs pufferben (70 mM pH=7,5-es TRIS/sósav, 10 mM magnéziumklorid, 5 mM DTT, 0,1 mM adenozin-trifoszfát) 4 °Con 15 órán át inkubáljuk.

A ligációs keverékből 10 pl-t hozzáadunk 200 pl hideg (4 °C-os), plc₈₅₇ plazmidot hordozó kompetens E. coli 137 sejthez. 30 perc múlva a sejteket 42 °C-os vízfürdőben 1,5 percen át végzett inkubálással hősokknak tesszük ki, majd a tenyészethez 2 ml ligációs puffért (LB) adunk, és 60 percig 30 °C-on rázzuk. Ezután

HU 222 829 Bl

200 μΐ-es aliquot részeket amplicillint és kanamicit tartalmazó LB lemezekre oltunk, és ezeket 22 órán át 30 °Con inkubáljuk. Izolált telepeket tenyésztünk, és a plazmid DNS-t elemezzük. A TGF-pi-et, TGF^2-t, illetve TGFp3-at kódoló DNS-fragmentumokat pPLMu-ban szubklónozzuk, így pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu.hTGF-p2, illetve pPLMu.hTGF*p3 plazmidot kapunk. A fenti szerkezeteket tartalmazó kiónokat E. coli 137/pPLMu.hTGF-pinek, E. coli 137/pPLMu.hTGF-p2-nek, illetve E. coli 137/pPLMu.hTGF-p3-nak nevezzük.

Az E. coli 137/pP.LMu.hTGF-pi, E. coli 137/pPLMu. hTGF-p2 és E. coli 137/pPLMu.hTGFβ3 sejteken az 1A. példa szerinti módon hőindukciót hajtjuk végre, és az expresszált fehérjéket SDS-PAGE módszerrel elemezzük. A hőindukció után 2 óra múlva a TGF-βΙ, TGF^2 és TGF^3 mindegyike megjelenik hőindukciós fehérjeként, amely fehérjék körülbelül 12 000 Da látszólagos molekulatömeggel vándorolnak.

IC. példa: A transzformánsok előállítása fermentálással

Az E. coli 137/pPLMu.hTGF^l, E. coli 137/pPLMu.hTGF-32 és E. coli 137/pPLMu.hTGFβ3 egyéjszakás tenyészeteit 750 ml LB közeget és 40 mg/ml amplicillint és kanamicit tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikokban 30 °C-on szaporítjuk. A 2 literes Erlenmeyer-lombikokban az említett antibiotikumokat tartalmazó 750 ml LB közeghez 300 ml-t adunk az egyéjszakás tenyészetekből, majd 65 °C-os vízfürdőben 42 °C-ra melegítve körülbelül 3,5 percig rázzuk. Ezután a lombikokat jégfürdővel 12 °C-ra hűtjük, és a sejteket GSA rotorban 8000 fordulat/perc sebességgel 10 percig végzett centrifugálással összegyűjtjük.

2. példa: A TGF-§1, TGF-$2 és

TGF-$3 expressziója Saccharomyces cervisiae-ben

Az érett TGF^l-et, TGF^2-t és TGF^3-at kódoló szekvenciák expressziója Saccharomyces cervisiae-ben, savas élesztő-foszfatázzal (PH05) szabályozva megy végbe.

Az expressziós vektorokat két lépésben építjük fel:

A) a pJDB207/PH05-RIT 12 plazmid felépítése és

B) a pJDB207/PH05-TGF^l, a pJDB207/PH05-TGF^2 és a pJDB207/PH05-TGFβ3 plazmid felépítése, ahol az A) lépésben kapjuk az élesztővektort és a PH05 transzkripciós terminátort, a B) lépésben pedig a PH05 promoterrel szabályozott expressziós kazettákat egy-egy, az érett ΤΟΡ-βΙ-εΐ, TGF^2-t, illetve TGFβ3-8ΐ kódoló inszertummal.

2A. példa: A pJDB207/PH05-RIT 12 plazmid felépítése

Az EP 277313 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett p31 RIT 12 plazmidot Sáli restrikciós endonukleázzal kiegyenesítjük. Etidium-bromid jelenlétében végzett részleges HindlII-emésztéssel egy 1 kb-os Sall/HindlII fragmentumot kapunk, amely tartalmazza a 276 bp-os Sall/BamHI pBR322 szekvenciát, a PH05 savas élesztő-foszfatáz 534 bp-os promoterét, a 19 aminosavat kódoló élesztő invertáz szignálszekvenciát és a PH05 transzkripciós terminátort.

A p31 RIT 12 1 kb-os Sall/HindlII fragmentumát a Beggs, J. D. [Molecular Genetics in yeast, Alfréd Benzon Symposium 16, Copenhagen, 383-398 (1981)] által ismertetett, Sall-vel és HindlII-mal hasított pJDB207 élesztő-E. coli ingázó vektorba klónozzuk. Az így kapott, 1 kb-ot tartalmazó inszertumot pJBD207/PH05 RIT 12-nek nevezzük.

2B. példa: A pJDB207R/PH05-TGF^3 plazmid felépítése

A pGKM740 (TGF^3) plazmidot Ncol-gyel hasítjuk. A ragadós végeket Klenow DNS-polimerázzal végzett reakcióval kitöltjük. Ezután EcoRl linkért (57CCGGAATTCCGG; Biolabs) adunk hozzá, és a keveréket ligáljuk. A kapott cirkuláris plazmidot GKMA668 (TGF^3)-nak nevezzük, és EcoRI-gyel és Sall-vel hasítjuk. Egy 0,4 kb-os EcoRI/Sall fragmentumot izolálunk az agarózgélről, tisztítjuk, és steril vízben, 25 g/ml koncentrációban szuszpendáljuk. A fragmentum tartalmazza az érett TGF^3-at kódoló szekvenciát egy ATG-vel, az érett TGF^3 Alá aminosavát definiáló CGT kodonhoz való keretben.

A PH05 promotert a fenti p31 RIT plazmidból egy 534 bázispáros (bp) BamHI/EcoRI fragmentumon izoláljuk. A pJBD207/PH05 RIT 12 plazmidot BamHI-gyel és Xhol-gyel hasítjuk. A nagy, 6,8 kb-os BamHI/XhoI fragmentumot izoláljuk. A PH05 transzkripciós terminátor a fragmentumon marad. A BamHI/EcoRI PH05 promoter fragmentumot, a TGF^3-at kódoló EcoRI/Sall fragmentumot és a BamHI/XhoI vektorfragmentumot összekötjük. A pJDB207-be az óramutató járásával ellentétes irányban klónozással bevitt, a PH05 promoterrel szabályozott TGF^3 gént tartalmazó pontos kiónt pJDB207R/PH05-TGF^3-nak nevezzük.

Hasonlóképpen hajtjuk végre érett TGF-βΙ és TGF^2 expresszióját Saccharomyces cervisiae-ben. A TGF^l-et, illetve TGF^3-at kódoló szekvenciákat tartalmazó plazmidokat pGKM 125-nek, illetve pGKM 126-nak nevezzük. Ezeket a plazmidokat Ncol-gyel emésztjük, EcoRl linkereket adunk hozzá, összekapcsoljuk, és a kapott cirkuláris plazmidot EcoRI-gyel és Sall-vel hasítjuk. Az EcoRI/Sall fragmentumokat a fenti módon pJDB207-be klónozzuk. Az így kapott plazmidokat pJDB207R/PH05-TGFβΐ-nek, illetve pJDB207R/PH05-TGF^3-nak nevezzük.

2C. példa: A S. cervisiae GRF18 törzs transzformálása

Saccharomyces cervisiae GRF18 törzset (MATa, his3—11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can^R, DSM3665 a Hinnen, A. és munkatársai [PNAS 75,1929 (1978)] által leírt transzformációs eljárással, pJDB207R/PH05-TGF^l, pJDB207R/PH05-TGF^2 és pJDB207/PH05-TGF^3 plazmidokkal transzformálunk. A transzformált élesztősejteket leucinhiányos élesztő minimál táplemezeken választjuk szét. A transzformált különálló élesztőtelepeket izoláljuk, ezeket Saccharomyces cervisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-pi-nek, Saccharomyces cervisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF^2-nek, illetve

HU 222 829 Bl

Saccharomyces cervisiae GRF18/pJDB207/PH05-TGFP3-nak nevezzük.

2D. példa: Saccharomyces cervisiae transzformánsok tenyésztése és sejtkivonatok előállítása

Az élesztőtranszformánsok, mint mondtuk, olyan plazmidokat tartalmaznak, amelyekben PH05 promoterrel szabályozott expressziós kazetták vannak, ezért végre kell hajtani a TGF-βΙ-, TGF^2-, illetve TGF^3expresszió promoterének derepresszióját [a gén működését megakadályozó anyag (represszor) eltávolítása]. Mindegyik transzformánst két, egymást követő, 10, illetve 50 ml-es előtenyészetben a Difco Yeast Nitrogén Base recept alapján aminosavak nélkül készített, de az ammónium-szulfát helyett 10 g/liter L-aszparagint, továbbá 1 g/liter L-hisztidint és 20 g/liter glükózt tartalmazó, nagy ionkoncentrációjú élesztő minimál táptalajon szaporítjuk. A második előtenyészet sejtjeit 0,9%os nátrium-klorid-oldattal mossuk, és 100 ml, a Difco Yeast Nitrogén Base táptalajrecept alapján aminosavak nélkül készített, de 0,03 g/liter kálium-dihidrogén-foszfátot, 10 g/liter L-aszparagint, 1 g/liter L-hisztidint és 20 g/liter glükózt tartalmazó, kis ionkoncentrációjú minimál táptalajba oltjuk. A tenyészetet 30 °C-on 180 fordulat/perc sebességgel keveijük.

5,24, illetve 48 óra elteltével a sejteket 10-10 ml tenyészetből 3000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással kinyeijük, és 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal egyszer átmossuk. Ezután a sejteket 66 mM pH=7,4 -es kálium-foszfátot és 4 mM Zwittergentet (Calbiochem) tartalmazó lízis- (roncsoló) pufferben szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 8 g 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyöngyöt adunk, majd Vortex keverőben hidegen 4-5-ször 2 percig erőteljesen felrázzuk. A sejtkivonatot az üveggyöngytől dekantálással választjuk el. A kivonatból a sejttörmeléket 4 °C-on 3000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással kiülepítjük. A felülúszót az üledéktől elválasztjuk, és mindkettőt -20 °C-on tároljuk.

3. példa

3A. példa: Oldhatatlan TGF-P3 monomer kinyerése E. coliból

E. coli 137/pPLMu.hTGF^3 sejteket tenyésztünk az IC. példában leírt módon. A sejtek roncsolását és az oldhatatlan TGF^3 kinyerését 4 °C-on hajtjuk végre. Körülbelül 18 g nedves sejtet pH=8,3-as roncsolópufferben szuszpendálunk, amely 60 ml TRIS/sósavat, 10 mM EDTA-t és 1 mM fenil-metánszulfonil-kloridot (PMSF) tartalmaz. A sejteket egy Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) készüléken a gyártó utasításai szerint kétszer áteresztjük, majd a térfogatot a roncsolópufferrel 200 ml-re kiegészítjük. A szuszpenziót 15 000 gvel 20 percig centrifugáljuk. A kapott üledéket 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 100 ml roncsolópufferben szuszpendáljuk, és a fenti módon 10 percig centrifugáljuk. Ezután az üledéket 1% Triton Χ-100-at (Pierce) tartalmazó roncsolópufferben ismét szuszpendáljuk, majd újabb 10 percig centrifugáljuk a fenti módon. A mosott üledéket 20 ml TRIS/sósavat, 1 mM EDTA-t, 1 mM PMSF-et és 1% DTT-t tartalmazó 50 ml oldatban szuszpendáljuk, és egy teflonszitás őrlőgépben homogenizáljuk. Az így kapott szuszpenzió nyers monomer TGF^3-at tartalmaz oldhatatlan alakban.

3B. példa: A monomer TGF^3 szolubilizálása és tisztítása

A 3A. példa szerinti módon kapott 10 ml TGF^3szuszpenziót 10%-os ecetsavval pH=2,5-re megsavanyítunk, és Eppendorf centrifugában szobahőmérsékleten 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót 2,6x78 cmes Sephacryl S-100 oszlopon (Pharmacia) 10%-os ecetsavban 1,4 ml/perc áramlási sebességgel kromatografáljuk. [A kromatográfiához használhatunk Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) oszlopot is, és a futtatást 1%os ecetsavban vagy 5 mM sósavoldatban is végezhetjük]. A monomer, denaturált TGF^3-at tartalmazó, 190 és 220 perc között leoldódó frakciókat összegyűjtjük. Ezt az anyagot a biológiailag aktív, dimer TGFβ3 térszerkezetének kialakításához (4. példa) vagy további tisztítás után szerkezeti elemzéshez (3D. példa) használjuk.

3C. példa: A monomer TGF-33 kinyerése a Saccharomyces cervisiae-ből

Egy, a fenti módon végrehajtott 500 ml-es fermentálásból kapott, roncsolt sejtekből álló üledéket 4 M karbamidot, 0,1 M TRIS-t és 1% DTT-t tartalmazó 20 ml, pH=8,0 -as oldatban szuszpendálunk. A keveréket 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk, eközben 5 percenként Vortex keverővei megkeverjük. Az oldhatatlan részt 4 °C-on, 30 000 g-vel 30 percig végzett centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszó pH-ját ecetsavval 2,5-re állítjuk, és 5%-os ecetsavval szemben 4 °C-on egy éjszakán át extenzíven dializáljuk. Az oldatot a fenti módon centrifugáljuk, és a tiszta felülúszót YM 10 (Amicon) membránon át végzett ultraszűréssel 4 ml végtérfogatra sűrítjük. Ezután a mintát a 3. példa szerinti módon Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) oszlopon, 5%os ecetsavval kromatografáljuk, így megkapjuk a monomer TGF-33-at.

3D. példa: A monomer TGF^3 további tisztítása

A 3B. példában a Sephacryl S-100 oszlopról összegyűjtött frakciók aliquot részeit 4,6 χ 150 mm-es Vydac 214TP5415 reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon (The Separations Group, Hesperia, CA, USA) tisztítjuk. Az oszlopot 70% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat és 30% 0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldat elegyével egyenlítjük ki, és a terméket 30 perc alatt lineáris gradienssel, amelynek végső összetétele 55% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat és 45% 0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldat 1 ml/perc áramlási sebességgel oldjuk le. 216 mm-nél vizsgáljuk az eluátum fényelnyelését, és kézi úton gyűjtjük össze az ultraibolya fényelnyelés szerinti egyedi csúcsértékeihez tartozó frakciókat.

A denaturált monomer TGF^3 21,5 percnél oldódik le. Attól függően, hogy milyen reverz fázisú oszlopot használunk, ugyanez a TGF^3 készítmény 16, illetve 18 percnél oldódik le.

A TGF^3 frakciókat reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával, a fentivel azonos oszlop és oldószerelegy alkalmazásával elemezzük. A TGF^3-at

HU 222 829 Β1 percen át eluáljuk. egy olyan lineáris gradienssel, amely 100% 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldattal indul, és végső összetételében 30% vizes trifluor-ecetsav-oldatot és 70% 0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldatot tartalmaz. A TGF-P3 egyetlen csúcsként, 30,4 percnél oldódik le. Az alkalmazott oszlop típusától függően 29 perces, illetve 29,9 perces retenciós időt kapunk.

3E. példa: A monomer TGF-P3 elemzése SDS-PAGE módszerrel

A 3B. példában a Sephacryl S-100 oszlopról vagy a 3C. példában a reverz fázisú oszlopról összegyűjtött frakciók aliquot részeit vákuumban szárítjuk, és Coomassie Blue R-250-nel színezett 15%-os poliakrilamidgél-lemezeken SDS-PAGE módszerrel vizsgáljuk. 12 000 Da látszólagos molekulatömegnél egy különálló sávot kapunk, amely megkülönböztethetetlen a redukált természetes sertés-TGF-p3-tól.

3F. példa: A monomer TGF-P3 N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározása

A 3B. példában kapott TGF-p3-at vákuumban bepároljuk, 25 1 0,1 M ecetsavban oldjuk, és 470A típusú gázfázisú proteinszekvenálóval (Applied Biosystems) meghatározzuk az aminosavszekvenciáját.

Az N-terminális aminosavszekvencia megegyezik a szekvencialista 6. azonosító számú szekvenciájával.

4. példa: A TGF-$3 térszerkezetének in vitro kialakítása dimetil-szulfoxidot tartalmazó pufferben

A fenti módon kapott TGF-p3 térszerkezetét 4 °Con, olyan pufferben alakítjuk ki, amely 0,1 M Tris-t, 1 M nátrium-kloridot, 0,5 M arginint, 5 mM redukált glutationt és 40 térfogat% dimetil-szulfoxidot tartalmaz. A puffer pH-ját nátrium-hidroxid-oldattal 9,5-re állítjuk. A TGF-p3 végső koncentrációja 0,1 mg/ml. 7 nap múlva az oldatot 4 °C-on tömény ecetsavval pH=3,5-re megsavanyítjuk, és Amicon vegyes cellás YM10 membránon (Amicon) át végzett ultraszűréssel körülbelül 10-szeres koncentrációra besűrítjük. A tömény oldatot 0,1 M ecetsavoldattal eredeti térfogatára hígítjuk, majd ismét besűrítjük. Ezt az eljárást kétszer megismételjük. Ezután az oldatot a későbbiekben leírt módon ioncserés kromatográfiával tisztítjuk.

5. példa: A TGF-P3 térszerkezetének in vitro kialakítása dimetil-formamidot tartalmazó pufferben

A fenti módon kapott TGF-P3 térszerkezetét 4 °Con, olyan pufferben alakítjuk ki, amely 0,1 M Tris-t, 1 M nátrium-kloridot, 0,5 M arginint, 5 mM redukált glutationt és 30 térfogat% dimetil-formamidot tartalmaz. A puffer pH-ját nátrium-hidroxid-oldattal 8,5-re állítjuk. A TGF-p3 végső koncentrációja 0,1 mg/ml. 7 nap múlva az oldatot 4 °C-on tömény ecetsavval pH=3,5-re megsavanyítjuk, és Amicon vegyes cellás YM10 membránon (Amicon) át végzett ultraszűréssel körülbelül 10-szeres koncentrációra besűrítjük. A tömény oldatot 0,1 M ecetsavoldattal eredeti térfogatára hígítjuk, majd ismét besűrítjük. Ezt az eljárást kétszer megismételjük. Ezután az oldatot a későbbiekben leírt módon ioncserés kromatográfiával tisztítjuk.

6. példa: A dimer, biológiailag aktív

TGF-$3 izolálása kationcserés kromatográfiával

A 4. vagy 5. példában kapott oldatot, amely körülbelül 10 és 50 mg közötti TGF-P3-at tartalmaz, 6 ml/perc sebességgel egy HiLoad 26/10 S-Sepharose High Performation (Pharmacia) oszlopra töltjük. Az oszlopot először egy pH=4-es, 20 mM nátrium-acetátot és 30% izopropil-alkoholt tartalmazó oldattal (A puffer) 5 percig mossuk, majd 45 percig eluáljuk egy lineáris gradienssel, amely 0,2 M nátrium-kloridot tartalmazó A pufferrel kezdődik, és 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó A pufferrel végződik. Az eluátumot 280 nm-nél vizsgáljuk, a frakciókat kézzel gyűjtjük. A frakciókat nemredukáló SDS-PAGE-vel vizsgáljuk TGF-p3-ra, a biológiai aktivitást pedig in vitro biológiai vizsgálattal mérjük.

7. példa: A TGF-$3 további tisztítása és jellemzése

7A. példa: Tisztítás reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával

A dimer, biológiailag aktív TGF-p3-at tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, azonos térfogatú 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldattal hígított 0,1 M ecetsavval szemben dializáljuk, majd 1x25 cm-es Vydac 214TP5415 oszlopon (The Separations Group, Hesperia, CA, USA) kromatografáljuk. Az oszlopot

4,5 ml/perc áramlási sebességű, 75% A oldószert (0,1%-os vizes trifluor-ecetsav-oldat) és 25% B oldószert (0,08%-os acetonitriles trifluor-ecetsav-oldat) tartalmazó eleggyel kiegyenlítjük. A minta feltöltése után az oszlopot egyensúlyi körülmények között addig mossuk, míg a 235 nm-nél mért abszorpció el nem éri az alapvonalat. Ezután az oszlopot 30 perc alatt lineáris gradienssel, amely az egyensúlyi állapottal kezdődik, végső összetétele pedig 45% A oldószer és 55% B oldószer, eluáljuk. Az eluátum frakcióit kézzel gyűjtjük, és nemredukáló SDS-PAGE-vel, valamint in vitro biológiai vizsgálattal elemezzük.

7B. példa: SDS-PAGE elemzés

A 7A. példában előállított tisztított TGF-p3 aliquot részeit vákuumban szárítjuk, és Coomassie Blue R-250-nel színezett 15%-os poliakrilamidgél-lemezeken SDS-PAGE módszerrel vizsgáljuk. A redukálatlan minták körülbelül 25 kDa látszólagos molekulatömegnél egy különálló sávot mutatnak, míg a redukált minták 12,5 kDa körüli értéknél mutatnak egy sávot.

7C. példa: A molekulatömeg meghatározása

A 7A. példában kapott tisztított TGF-p3-at elektrospray-ionizációs tömegspektrometriával (ESI-MS) elemezzük. A mért tömegösszeg nagyon közel áll az az elméletileg számítotthoz.

7D. példa: Aminosavanalízis

Az aminosavanalízist a Knecht, R. és Chang, J.-X. [Analytical Chemistry 58:2375-2379 (1986)] által leírt módon végezzük. Az eredmények az elméletiekkel jó egyezést mutatnak.

HU 222 829 Bl

7E. példa: Az N-terminális aminosavszekvencia meghatározása

A 7A. példában kapott TGF-p3-ból 10-20 g-ot vákuumban szárítunk, 25 ml 10 mM ecetsavoldatban oldunk, és 477A típusú gázfázisú szekvenálóval (Applied Biosystems) meghatározzuk az aminosavszekvenciáját. Az első 10 meghatározott aminosavszekvenciája az elméletivel azonos volt.

7F. példa: Proteolitikus ffagmentálás Asp-N-proteázzal pg (6,7 nmol) TGF-P3-at redukálunk, a kapott anyagot 4-vinil-piridil-etilezzük, vákuumcentrifugálással szárítjuk, és ismét feloldjuk 200 μΐ 5 mM sósavoldatban. Hozzáadunk 200 μΐ pH=7,8-es 0,2 M Tris-acetát-puffert, amely 10 mM Zwittergent 3-12 detergenst (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA) tartalmaz, és összekeveijük vele. A hasítást 50 μΐ vízben oldott 2 pg endoproteináz Asp-N-nel (forrás: Sequence Grade, a németországi Boehringer Mannheim Biochemica cégtől beszerzett Pseudomonas fragi mutant) 37 °C-on végezzük. 13 óra múlva 50 pl 10 térfogat%-os trifluor-ecetsav-oldatot adunk hozzá, és a keveréket 4,6 mm χ 150 mm-es Vydac 218TP5415 oszlopon (The Separations Group) nagynyomású folyadékkromatográfiával, 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsav-oldatban 5-45 térfogat% acetonitrilt tartalmazó, 0,1 ml/perc áramlási sebességű lineáris gradienssel 40 perc alatt elválasztjuk. Az izolált peptideket elektrospray-ionizációs tömegspektrometriával (ESIMS) elemezzük. Az így meghatározott molekulatömegek az Asp-N-fragmentumokra számított értékekkel jó egyezést mutatnak.

Az azonosított fragmentumok a teljes aminosavszekvenciát lefedik az 1. és 2. aminosav kivételével, Ezeket az aminosavakat a teljes protein N-terminális aminosavszekvenciájának meghatározásával és a V8 fragmentumok elemzésével azonosítjuk.

7G. példa: Proteolitikus ffagmentálás V8 proteázzal

Az Asp-N-proteázzal végzett kísérlethez hasonló módon 4-vinil-piridinezett TGF-p3-at V8 proteázzal emésztünk, a fragmentumokat nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk el, és ESI-MS-sel elemezzük. Az így kapott molekulatömeg-értékek az elméletileg számítottakkal jól egyeznek, ez alátámasztja a TGF-P3 azonosítását. Az azonosított fragmentumok a teljes, 112 aminosavból álló szekvenciát lefedik.

8. példa: A háromdimenziós térszerkezetű TGF-β in vitro aktivitásának mérése nyérctüdőhámsejt (Mv-l-Lu) savas foszfatázos vizsgálatával TGF-p-t vagy hibrid TGF-P-t szkrínelünk egy sejtbiológiai vizsgálattal, amelyben azt méijük, hogy a vegyület milyen mértékben képes inhibiálni egy folytonos nyérctüdő-hámsejtvonal, az Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) szaporodását. Az Mv-l-Lu sejtvonal érzékeny jelzőnek bizonyult a TGF-ek biológiai vizsgálatában: Tucker és munkatársai [Science 226, 705-707 (1984)], Absher és munkatársai [J. Immunoi. Methods 138:301-303 (1991)], valamint Danielpour és munkatársai [J. Cell Physiol. 138:79-86 (1989)] szerint szigmoid alakú koncentráció-választ ad, EC₅₀ értéke körülbelül 10-50 pg/ml. Kelley és munkatársai [Exp. Lung Rés. 18:877-887 (1992)], valamint Meager [J. Immunoi. Methods 141:1-14 (1991)] az Mv-l-Lu sejteket, amelyeknek szaporodását a TGF-β erősen gátolja, tartják jelenleg a legalkalmasabb sejtvonalnak egy, erre a citokinre vonatkozó biológiai analitikai vizsgálat kidolgozásához. A vizsgálatot 96 lyukú mikrotiterlemezeken, az American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA-tól eredetileg megkapott sejtekkel végezzük. A sejteket kis sűrűsséggel (lyukanként 5000 sejt) oltjuk be a tenyésztőközegbe (minimum esszenciális közeg 5 térogat% boíjúmagzatszérummal), amely egy TGF-p-összehasonlító vagy minta sorozathígításait tartalmazza. A vizsgált mintákat ezután egy nedvesített, 5% szén-dioxidot tartalmazó légterű inkubátorban 72 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A sejtszaporodás gátlását egy érzékeny enzimes sejtfestési eljárással határozzuk meg (amely kolorimetriás úton megadja az egyes lyukakban termelt savas foszfatáz mennyiségét), az elszíneződés arányos az egyes lyukakban jelen lévő sejtek számával. Az egyes lyukak abszorbanciáját 405 nm-nél méijük, a mért adatokat ábrázoljuk, és egy alkalmas PC szoftverrel elemezzük. Ebben a vizsgálatban az aktivitás egysége (U) a TGF-P-nak azon mennyisége, amely az Mv-l-Lu sejtek szaporodását a maximális érték felével gátolja.

9. példa: A háromdimenziós térszerkezetű TGF-β in vivő aktivitási vizsgálatai

9A. példa: Öreg egerek közepesen mély sebeinek gyógyulása

Grove, G. L. és munkatársai [Arch. Dermatol. Rés. 272; 381 (1982)] leírják, hogy a sebgyógyulási folyamatok a kor előrehaladásával romlanak, és ez a geriátriai gyógyászatban nagy problémákat okoz. Ezért vizsgáljuk a háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGFβ3 in vivő biológiai hatását másodfokú égéssel létrehozott közepesen mély sebek gyógyulására részlegesen hiányos vagy leromlott gyógyulási helyzetben, nevezetesen öreg állatoknál az alábbi, Schultz, G. S. és munkatársai [Science, 235:350 (1987)] által leírthoz hasonló módszer alkalmazásával.

450 napos vagy idősebb C57/BL6 egerek hátát leborotváljuk, és egy kommersz szőrtelenítőkrémmel depiláljuk, majd érzéstelenített állapotban a mellkas dorsalis részén egy 80 °C-os vízfürdőben egyensúlyig felmelegített lxl cm-es, 8 g-os vörösréz lapka egyszeri, 10 másodperces alkalmazásával egyszerű middermális égési sebeket hozunk létre. Az ebből eredő hólyagot sebészeti úton eltávolítjuk, és az égéseket 5 napon át naponta egyszer 25 μΐ, 10 mM hisztidin és 140 mM nátrium-klorid pH=7,4-es oldatában 0,8 g/100 ml hidroxipropil-cellulózt tartalmazó steril közegű pufferoldat helyi alkalmazásával, amely változó mennyiségű (500 ng, 100 ng vagy 10 ng) háromdimenziós térszerkezetű TGF-P-t tartalmaz, vagy csak magával a pufferoldattal kezeljük vagy kezeletlenül hagyjuk. Minden helyileg alkalmazott anyag steril, endotoxin- és pirogénmentes, és a kísérlet idején minden egeret külön ketrecben tartunk. Az egyes kísérleti csoportok 5-5 állatból állnak.

HU 222 829 Bl

TGF-p3-mal 5 napig végzett kezelés után az egereket érzéstelenítjük, az esetleg jelen lévő hólyagokat sebészeti úton eltávolítjuk, és a sebeket lefényképezzük. A gyógyult hámmal borított égési területeket filmvetítőhöz való, egyenletes vastagságú átlátszó filmre felrajzoljuk, és planimetriásan kiszámítjuk az egyes égési területek gyógyult részeinek százalékos arányát. Az eredményeket összehasonlítjuk az olyan fiatal (56-84 napos) C57/BL6 egerek azonos middermális égési sebeinél megfigyelt hámgyógyulási eredményekkel, amelyeket a kísérlet során nem kezeltünk.

A planimetriás elemzési eredmények azt mutatják, hogy a háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-p3-nak egy megfelelő pufferoldatban 5 napon át naponta végzett helyi alkalmazása dózisfiiggő módon stimulálja és gyorsítja öreg egerek részlegesen mély sebeinek hámgyógyulását a csak pufferoldattal kezelt vagy kezeletlen sebekhez viszonyítva. A fiatal egerek TGF-P3 helyi alkalmazása nélkül is képesek a sebek hámszöveteinek megújítására. A szövettani elemzés azt mutatja, hogy a hámszövet helyreállításának folyamata gyors elszarusodás kíséretében a TGF^3-mal kezelt sebeknél a 6. napon gyorsul fel.

9B. példa: Mély sebek gyógyulása kifejlett patkányoknál

A háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGFP3-nak a sebgyógyulásra kifejtett biológiai hatásait egy másik in vivő modellen, nevezetesen felnőtt patkányokon sebészeti bemetszéssel ejtett teljes mélységű sebek gyógyulásán is vizsgáltuk a Mustoe, T. A. és munkatársai [Science 237:1333 (1987)] által leírtakhoz hasonló módon.

Pentobarbitonnal érzéstelenített, 300-350 g-os hím Wistar-patkányoknál, amelyeknek hátát leborotváltuk, és egy kommersz szőrtelenítőkrémmel depiláltuk, sebészeti ollóval a hátközépvonaltól mindkét oldalon

1,5 cm-re teljes mélységű, 5 cm hosszú egyenes bemetszéseket végzünk. A kísérleti csoportokban a (felülről nézve) bal oldali bemetszések széleit egyszeri helyi alkalmazásban 100 ml, 10 mM hisztidin és 140 mM nátrium-klorid pH=7,4-es oldatában 0,8 g/100 ml hidroxipropil-cellulózt és változó mennyiségű (2 pg, 1 pg, 0,1 pg vagy 0,01 pg) háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-p3-at tartalmazó steril pufferoldattal kezeljük. A szemközti (jobb oldali) bemetszések széleit azonos mennyiségű ugyanilyen pufferoldatban placebo összehasonlító anyaggal (marhaszérum-albumin) kezeljük, a kontrollállatokon ejtett bemetszések széleit a bal oldali bemetszéseknél magával a pufferoldattal kezeljük, a jobb oldali bemetszések pedig semmiféle kezelést nem kapnak. Minden helyileg alkalmazott anyag steril, endotoxin- és pirogénmentes. Ezután mindegyik seb széleit összefogjuk 5 egyenletesen elosztott, szaggatott, vízszintes matracvarrattal. Az állatokat elkülönített ketrecekbe tesszük, és a sebeket a kezelés után különböző időtartamokig, legfeljebb 21 napig gyógyulni hagyjuk. Ezután az állatokat leöljük, teljes hátbőrüket leválasztjuk, a bőrök hátoldaláról az összes bőr alatti zsírt sebészeti csontkaparóval gondosan eltávolítjuk. Ezután egy két, egymástól 8 mm-es távolságban elhelyezett sebészeti pengét tartalmazó kivágósablonnal csíkokat hasítunk a bőrből (a bemetszések varratai között) a szakítószilárdság méréséhez. Mindegyik bemetszés egyik végéből mintát veszünk szövettani vizsgálathoz. A kimetszett bőrminták által elviselt maximális terhelést Zwick (Ulm, Németország) Universal Tensile Strenght Machine Model 144501 típusú szakítógépen méijük. A méréseket hidraulikus befogópofák közé erősített és a szakadásig 10 mm/perc sebességgel nyújtott 30 mm χ 8 mm-es csíkokon végezzük, miközben a maximális terhelést egy diagramíró rögzíti. Minden sebből 3 mintát vizsgálunk, és minden kísérleti csoportban 4 állat van. Az elfertőződött vagy erős vérzés nyomait mutató sebeknél (ez az általunk vizsgált sebek 3%-át tette ki) szakítószilárdságot nem mérünk.

A mérési eredmények azt mutatják, hogy egy alkalmas pufferben oldott háromdimenziós térszerkezetű aktív dimer TGF-P3 egyszeri helyi alkalmazása a 21 napos gyógyulási időszak alatt a kontrollcsoporthoz viszonyítva kétszeresre növeli a szakítószilárdságot, és dózisfiiggően meggyorsítja felnőtt patkányok teljes bőrmélységű sebeinek gyógyulását. A szövettani elemzés azt mutatja, hogy a TGF-p3-mal 21 napig kezelt sebekben a kontrolisebekhez képest jelentősen megnövekszik a monocelluláris sejtek beáramlása, a fibroblasztés kollagéntermelés. A TGF-p3-mal 21 napig kezelt sebeknél 14 nap után elszarusodás is jelentkezett.

10. példa: Szolubilizált monomer hibrid TGF-$ fehérjék előállítása ml pPLMu plazmidot Ncol-gyel és Sall-vel végzett emésztéssel kiegyenesítünk, és elvégezzük rajta a fentiekben a DNS-fragmentumokra leírt géltisztítást. 100 ng linearizált és tisztított pPLMu DNS-vektort és a megfelelő, a szekvencialistán szereplő tisztított DNSfragmentumból amely a hibrid TGF-p3-at, TGFp2-3-at, illetve TGF-p3-2-t kódolja, 3 mólekvivalensnyit 4 °C-on 15 órán át 20 ml, 1 egység DNS-ligázt (Boehringer) tartalmazó ligációs pufferben (70 mM TRIS-sósav, 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT és 0,1 mM adenozin-trifoszfát) inkubálunk. A ligációs keverékből 10 ml-t hozzáadunk 200 ml hideg (4 °C-os), plc₈₅₇ plazmidot hordozó kompetens E. coli 137 sejthez. 30 perc múlva a sejteket 42 °C-os vízfürdőben

1,5 percen át végzett inkubálással hősokknak tesszük ki, majd a tenyészethez 2 ml ligációs puffért (LB) adunk, és 60 percig 30 °C-on rázzuk. Ezután 200 1-es aliquot részeket amplicillint és kanamicit tartalmazó LB lemezekre oltunk, és ezeket 22 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Izolált telepeket tenyésztünk, és a plazmid DNS-t elemezzük. A TGF-pi-et, TGF-P2-t, illetve TGF-p3-at kódoló DNS-ffagmentumokat pPLMu-ban szubklónozzuk, így pPLMu.TGF-pi(44/45)b3, pPLMu.TGFp2(44/45)b3, illetve pPLMu.TGF-P3(44/45)b2 plazmidot kapunk. A fenti szerkezeteket tartalmazó kiónokat E. coli 137/pPLMu.TGF-pi(44/45)b3-nak, E. coli 137/pPLMu.TGF-p2(44/45)b3-nak, illetve E. coli 137/pPLMu.TGF-33(44/45)b2-nek nevezzük.

Az E. coli 137/pPLMu.TGF-pl(44/45)b3-at, E. coli 137/pPLMu.TGF-p2(44/45)b3-at és E. coli

HU 222 829 Bl

137/pPLMu.TGF-p3(44/45)b2-t a 3A. példában leírt módon hővel indukáljuk, és az expresszált fehérjéket SDS-PAGE módszerrel elemezzük. A hőindukció után 2 óra múlva a TGF-βΙ, TGF-p2 és TGFβ3 mindegyike megjelenik hőindukciós fehéqeként, amelyek körülbelül 12 000 Da látszólagos molekulatömeggel vándorolnak.

Az E. coli 137/pPLMu.TGF^l(44/45)b3-at, az E. coli 137/pPLMu.TGF^2(44/45)b3-at és az E. coli 137/pPLMu.TGF^3(44/45)b2-t 2 literes Erlenmeyerlombikokban, 40 mg/1 amplicillint és kanamicit tartalmazó 750 ml LB közegben 30 °C-on éjszakán át szaporítjuk. Az egyéjszakás tenyészetből 300 ml-t 2 literes Erlenmeyer-lombikokba töltünk, amelyek 750 ml LB közegben a fenti antibiotikumokat tartalmazzák, és 65 °C-os vízfürdőben körülbelül 3,5 percig rázva 42 °C-ra melegítjük. Ezután a lombikokat 42 °C-os rázógépbe tesszük, 3 órán át inkubáljuk, majd jégfürdővel 12 °C-ra hűtjük, és a sejteket GSA rotorban (Sorvall) 10 percig, 8000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással összegyűjtjük.

A szolubilizált monomer TGF^l-3 hibrid előállításának alábbi módszere a TGF^2-3 és a TGF-P3-2 szolubilizálására is alkalmas.

E. coli 137/pPLMu.TGF^l(44/45)b3 sejteket tenyésztünk a fenti módon, és zárványtesteket állítunk elő a következőképpen. A sejtek elroncsolását és a zárványtestek kinyerését 4 °C-on hajtjuk végre. Körülbelül 18 g nedves sejtet pH=8,3-es roncsolópufferben szuszpendálunk, amely 60 ml TRIS/sósavat, 10 mM EDTA-t és 1 mM fenil-metánszulfonil-kloridot (PMSF) tartalmaz. A sejteket egy Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) készüléken a gyártó utasításai szerint kétszer áteresztjük, majd a térfogatot a roncsolópufferrel 200 ml-re kiegészítjük. A szuszpenziót 15 000 gvel 20 percig centrifugáljuk. A kapott üledéket 1 M nátrium-kloridot tartalmazó 100 ml roncsolópufferben szuszpendáljuk, és a fenti módon 10 percig centrifugáljuk. Ezután az üledéket 1% Triton Χ-100-at (Pierce) tartalmazó roncsolópufferben szuszpendáljuk, majd újabb 10 percig centrifugáljuk a fenti módon. A mosott üledékből 0,3 g-ot 20 ml TRIS/sósavat, 1 mM EDTA-t, 1 mM PMSF-et és 1% DTT-t tartalmazó 10 ml pH=8,0 -es oldatban szuszpendálunk, és a szuszpenziót mágneses keverővei 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a minta pH-ját tömény ecetsavval 2,5-re állítjuk, a mintát teflonszitás őrlőgépben homogenizáljuk, és Centricon H-401 centrifugával (Kontron Instruments), egy rögzített szögű A.8.24. rotorral 60 percen át 15 °C-on, 12 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk. A tiszta felülúszó ecetsavtartalmát 10 mM sósavoldatra cseréljük oly módon, hogy az oldatot Amicon 8010 vegyes cellás YM05 szűrőn betöményítjük, 10 mM sósavoldattal meghígítjuk, és ezt a két műveletet többször megismételjük.

11. példa: Kísérletsorozat a térszerkezet visszaállítására különböző TGF-Q-kkal és TGF-β hibridekkel

A találmány sokoldalúságát és széles körű felhasználhatóságát az alábbi kísérletsorozat eredményein keresztül mutatjuk be. A fehérjék térszerkezetének in vitro visszaállítására irányuló kísérletekben alkalmazott speciális körülményeket és fehéijetípusokat megadjuk. Az egyéb kísérleti körülmények megegyeznek a 4. példában megadottakkal. A biológiai aktivitást a térszerkezet in vitro kialakításának megkezdése után 3 és 7 nap múlva mértük.

A térszerkezet in vitro kialakítása szerves oldószerben detergens nélkül - biológiai vizsgálati eredmények

	Szám	RSH	DMSO	DMF	PH	TGF-β	Aktivitás
1.	2,5 mM GSH	10%		9,5	β3	+
2.	2,5 mM GSH	20%		9,5	β3	+
3.	2,5 mM GSH	30%		8,0	β3	+
4.	2,5 mM GSH	30%		9,5	β3	+
5·	2,5mMGSH	40%		9,5	β3	+ +
6.	2,5 mM GSH	50%		9,5	β3	+ +
7.	2,5 mM GSH	40%		6,5	β3	+
8.	2,5 mM GSH	40%		7,5	β3	+
9.	2,5 mM GSH	40%		8,5	β3	+
10.	2,5 mM GSH	40%		10,5	β3	+ +
11.	0,0 mM GSH	40%		9,5	β3	+
12.	2,5 mM GSH	40%		9,5	β2	+
13.	2,5 mM GSH	40%		9,5	β1-3	+
14.	2,5 mM GSH	40%		9,5	β3—2	+
15.	2,5 mM GSH	40%		9,5	β2-3	+
16.	2,5 mM GSH		10%	9,5	β3	+

HU 222 829 Bl

Táblázat (folytatás)

Szám	RSH	DMSO	DMF	pH	TGF-p	Aktivitás
17.	2,5 mM GSH		20%	9,5	β3	+ +
18.	2,5 mM GSH		30%	9,5	p3	+ +
19.	2,5 mM GSH		40%	9,5	p3	+
20.	2,5 mM cisztein	40%		9,5	P3	+
1 21·	2,5 mM ciszteamin		40%	9,5	p3	+

RSH=a táblázatban megadott szulfhidrilreagens

GSH=redukált glutation

DMSO=dimetil-szulfoxid

DMF=dimetil-formamid b3=TGF-p3;

b2=TGF-p2;

bl-3=TGF-pi-3 hibrid;

b3-2=TGF-p3-2 hibrid;

b2-3=TGF-p2-3 hibrid aktivitás: +=közepes aktivitás a 8. példa szerinti biológiai vizsgálatban + + =nagy aktivitás a 8. példa szerinti biológiai vizsgálatban

A mikroorganizmusok deponálása 25 Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig

Az alábbi mikroorganizmusokat deponáltuk a (NSZK):

Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél (DSM), mikroorganizmus

E. coli 137/pPLMu.hTGF-pi E. coli 137/pPLMu.hTGF-32 E. coli 137/pPLMu.hTGF-p3 Saccharomyces cervisiae GRF18 deponálás dátuma 1989. november 28 1989. november 28 1989. november 28, 1986. március 4.

azonosító szám DSM 5656 DSM 5657 DSM 5658 DSM 3665

A leírásban a következő védjegyek és bejegyzett védjegyek szerepelnek: Monos, Miniprotean II, SS34 rotor, Biotrap, GSA rotor, Difco Yeast Nitrogén Base, Zwittergent, Triton X-100, Teflon, Sephacryl S-100, Sepha35 cryl S-100 HR, YM10 filter, Vydac 214 P5415, Coomassie Blue R-250, 477A gázfázisú szekvencia, 5OEthilon, 144501 univerzális szakítószilárdság-mérő berendezés, Frenchpress, Centricon H-401 és YM05 filter.

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő:

(A) Név: Ciba-GeigyAG (B) Utca: Klybeckstr. 141 (C) Város: Bázel (E) Ország: Svájc (F) Irányítószám: (ZIP), 4002 (G) Telefonszám: +41 61 69 11 11 (H) Telefaxszám: +41 61 696 79 76 (I) Telexszám: 962 991 (ii) A találmány címe: Új eljárás biológiailag aktív proteinek előállítására (iii) Szekvenciák száma: 12 (v) Komputerrel olvasható forma:

(A) Eszköz típusa: Floppy disk (B) Komputer: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentln Release #10, Version #1.30 (EPO) (2) Információ az 1. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszú szál: 339 bázispár

HU 222 829 Bl (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (iii) Feltételezett: nincs (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-betal (DMS 5656) (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1... 336 (D) Más információ: (termék=„human TGF-β” (xi) Szekvencialeírás: 1. azonosító számú szekvencia:

GCC

CTG

GAC

ACC

AAC

TAT

TGC

TTC

AGC

TCC

ACG

GAG

AAG

AAC

TGC

TGC

Al a 1

Leu

Asp

Thr

Asn 5

Tyr

Cys

Phe

Ser

Ser 10

Thr

G1 u

Ly s

Asn

Cy s 15

Cys

GTG

CGG

CAG

CTG

TAC

ATT

GAC

TTC

CGC

AAG

GAC

CTC

GGC

TGG

AAG

TGG

Val

Arg

Gin

Leu 20

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg 25

Ly s

As p

Leu

Gly

Trp 30

Ly s

Trp

ATC

CAC

GAG

CCC

AAG

GGC

TAC

CAT

GCC

AAC

TTC

TGC

CTC

GGG

CCC

TGC

Ile

Hi s

G1 u 35

Pro

Lys

Gly

Tyr

Hi s 40

Al a

Asn

Phe

Cy s

Leu 45

Gly

Pro

Cys

CCC

TAC

ATT

TGG

AGC

CTG

GAC

ACG

CAG

TAC

AGC

AAG

GTC

CTG

GCC

CTG

Pro

Tyr 50

Ile

Trp

Ser

Leu

Asp 55

Thr

Gin

Tyr

Ser

Ly s 60

Val

Leu

Al a

Leu

TAC

AAC

CAG

CAT

AAC

CCG

GGC

GCC

TCG

GCG

GCG

CCG

TGC

TGC

GTG

CCG

Tyr 65

Asn

Gin

Hi s

Asn

Pro 70

Gly

Al a

Ser

Al a

Al a 75

Pro

Cys

Cy s

Val

Pro 80

CAG

GCG

CTG

GAG

CCG

CTG

CCC

ATC

GTG

TAC

TAC

GTG

GGC

CGC

AAG

CCC

Gin

Al a

Leu

G1 u

Pro 85

Leu

Pro

Ile

Va 1

Tyr 90

Tyr

Va 1

Gly

Arg

Lys 95

Pro

AAG

GTG

GAG

CAG

CTG

TCC

AAC

ATG

ATC

GTG

CGC

TCC

TGC

AAG

TGC

AGC

Lys

Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Arg

Ser

Cys

Ly s

Cys

Ser

100 105 110

144

192

240

288

336

TGA (2) Információ a 2. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein

339

(xi

í) Szék

vencial

leírás:

2. azoi

nősítő:

számú

szekvencia:

Al a

Leu

Asp

Thr

Asn

Tyr

Cys

Phe

Ser

Ser

Thr

Glu

Ly s

Asn

Cys

Cys

1

5

10

15

Val

Arg

Gin

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Lys

Asp

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

Ile

Hi s

Glu

Pro

Lys

Gly

Tyr

Hi s

Al a

Asn

Phe

Cy s

Leu

Gly

Pro

Cys

35

40

45

Pro

Tyr

Ile

Trp

Ser

Leu

Asp

Thr

G1 n

Tyr

Ser

Lys

Val

Leu

Al a

Leu

50

55

60

HU 222 829 Bl

Tyr 65

Asn Gin

Hi s

Asn

Pro 70

Gly

Al a

Ser

Al a

Al a 75

Pro

Cy s

Cy s

Val

Pro 80

Gin

Al a

Leu

Glu

Pro

Leu

Pro

Ile

Val

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Lys

Pro

85

90

95

Lys

Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Arg

Ser

Cy s

Ly s

Cy s

Ser

100 105 110 (2) Információ a 3. azonosító számú szekvenciához :

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 339 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNSmRNS-hez (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-pi (DSM5657) (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1...336 (D) Más információ: (termék=„humán TGF-p2” (xi): Szekvencialeírás: 3. azonosító számú szekvencia

GCT Al a

TTG Leu

GAT Asp 115

GCG GCC

TAT Tyr

TGC Cy s

TTT Phe 120

AGA AAT GTG CAG

GAT AAT TGC TGC

48

Al a

Al a

Arg Asn Val

Gin

Asp 125

Asn

Cy s

Cy s

CTA

CGT

CCA

CTT

TAC

ATT

GAT

TTC

AAG

AGG

GAT

CTA

GGG

TGG

AAA

TGG

96

Leu

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Lys

Arg

Asp

Leu

Gly

Trp

Ly s

Trp

130

135

140

ATA

CAC

GAA

CCC

AAA

GGG

TAC

AAT

GCC

AAC

TTC

TGT

GCT

GGA

GCA

TGC

144

Ile

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Asn

Al a

Asn

Phe

Cy s

Al a

Gly

Al a

Cy s

145

150

155

160

CCG

TAT

TTA

TGG

AGT

TCA

GAC

ACT

CAG

CAC

AGC

AGG

GTC

CTG

AGC

TTA

192

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser

Ser

Asp

Thr

Gin

Hi s

Ser

Arg

Val

Leu

Ser

Leu

165

170

175

TAT

AAT

ACC

ATA

AAT

CCA

GAA

GCA

TCT

GCT

TCT

CCT

TGC

TGC

GTG

TCC

240

Tyr

Asn

Thr

Ile

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser

Pro

Cy s

Cy s

Val

Ser

180

185

190

CAA

GAT

TTA

GAA

CCT

CTA

ACC

ATT

CTC

TAC

TAC

ATT

GGC

AAA

ACA

CCC

288

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Gly

Ly s

Thr

Pro

195

200

205

AAG

ATT

GAA

CAG

CTT

TCT

AAT

ATG

ATT

GTA

AAG

TCT

TGC

AAA

TGC

AGC

336

Lys

Ile

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Ly s

Ser

Cy s

Lys

Cy s

Ser

210

215

220

TAA 339 (2) Információ a 4. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein

HU 222 829 Bl (xi) Szekvencialeírás: 4. azonosító számú szekvencia

Alá 1 Leu

Leu Asp

Al a Leu 20

Al a 5 Tyr

Tyr Ile

Cys Asp

Phe Arg Asn Val 10

Gin Asp Asn Cys

Cys Trp

Arg

Pro

Leu

Gly

Trp 30

15 Lys

Phe

Ly s 25

Arg

As p

Ile

Hi s

Glu

Pro

Lys

Gly

Tyr

As n

Al a

Asn

Phe

Cys

Al a

Gly

Al a

Cys

35

40

45

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser

Ser

Asp

Thr

Gin

Hi s

Ser

Arg

Val

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Thr

Ile

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Se r

Pro

Cy s

Cy s

Val

Ser

65

70

75

80

Gin

As p

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Gly

Ly s

Thr

Pro

85

90

95

Lys

Ile

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Lys

Ser

Cys

Lys

Cys

Ser

100

105

110

(2) Információ az 5. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 339 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNSmRNS-hez (vii) Közvetlen forrás :

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-p3 (DSM 5658) (xi) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1.. .336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-P3” (xi) Szekvencialeírás: 5. azonosító számú szekvencia

GCT Al a

TTG Leu

GAC Asp 115

ACC AAT

TAC Tyr

TGC TTC CGC AAC

TTG GAG GAG AAC

TGC Cys

TGT Cys

48

Thr

Asn

Cy s

Phe 120

Arg

Asn

Leu

Glu

Glu 125

Asn

GTG

CGC

CCC

CTC

TAC

ATT

GAC

TTC

CGA

CAG

GAT

CTG

GGC

TGG

AAG

TGG

96

Val

Arg 130

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp 135

Phe

Arg

Gin

Asp

Leu 140

Gly

Trp

Lys

Trp

GTC

CAT

GAA

CCT

AAG

GGC

TAC

TAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

144

Val 145

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly 150

Tyr

Tyr

Alá

Asn

Phe 155

Cy s

Ser

Gly

Pro

Cy s 160

CCA

TAC

CTC

CGC

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

192

Pro

Tyr

Leu

Arg

Ser 165

Al a

Asp

Thr

Thr

Hi s 170

Ser

Thr

Val

Leu

Gly 175

Leu

TAC

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

GTG

CCC

240

Tyr

Asn

Thr

Leu 180

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser 185

Al a

Ser

Pro

Cys

Cy s 190

Val

Pro

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

288

Gin

Asp

Leu 195

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile 200

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly 205

Arg

Thr

Pro

HU 222 829 Bl

AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Me t Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser

210 215 220

TGA 339 (2) Információ a 6. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 6. azonosító számú szekvencia

Al a 1

Leu Asp Thr

Asn 5

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn 10

Leu

Glu

Glu

Asn

Cy s 15

Cys

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Gin

Asp

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

Val

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Tyr

Al a

Asn

Phe

Cy s

Ser

Gly

Pro

Cy s

35

40

45

Pro

Tyr

Leu

Arg

Ser

Alá

Asp

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr

Val

Leu

Gly

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Alá

Ser

Pro

Cy s

Cy s

Val

Pro

65

70

75

80

Gin

As p

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr

Pro

85

90

95

Lys

Val

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Ly s

Ser

Cys

Ly s

Cys

Ser

100

105

110

(2) Információ a 7. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás: desc=,,TGF-P és TGF-P3 DNS rekombináns hibrid DNS-e” (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.TGF-P(44/45)P3 (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 1...132 (D) Más információ : termék=„humán TGF-β 44 N-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptide (B) Elhelyezkedés: 133...336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-33 68 C-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1.. .336 (D) Más információ: termék=„hibrid TGF-β, amit TGF^3-nak nevezünk.

(xi) Szekvencialeírás: 7. azonosító számú szekvencia:

GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC 48

Alá Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys

10 15

HU 222 829 Β1

GTG

CGG

CAG

CTG

TAC

ATT

GAC

TTC

CGC

AAG

GAC

CTC

GGC

TGG

AAG

TGG

Val

Arg

Gin

Leu 20

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg 25

Lys

Asp

Leu

Gly

Trp 30

Lys

Trp

ATC

CAC

GAG

CCC

AAG

GGC

TAC

CAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

Ile

Hi s

Glu 35

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Hi s 40

Al a

Asn

Phe

Cy s

Ser 45

Gly

Pro

Cys

CCA

TAC

CTC

CGC

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

Pro

Tyr 50

Leu

Arg

Ser

Al a

Asp 55

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr 60

Val

Leu

Gly

Leu

TAC

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

GTG

CCC

Tyr 65

Asn

Thr

Leu

Asn

Pro 70

Glu

Al a

Ser

Alá

Ser 75

Pro

Cys

Cy s

Val

Pro 80

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr 90

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr 95

Pro

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

GTG

GTG

AAG

TCT

TGT

AAA

TGT

AGC

Lys

Va 1

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Lys

Ser

Cys

Ly s

Cys

Ser

100 105 110

144

192

240

288

336 (2) Információ a 8. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein

(x) Szekvencialeírás:

8. azonosító számú szekvencia

Ly s

Asn

Cy s 15

Cys

Al a 1

Leu

Asp

Thr

Asn Tyr 5

Cys

Phe

Ser

Ser 10

Thr

Glu

Val

Arg

Gin

Leu 20

Tyr Ile

Asp

Phe

Arg 25

Lys

As p

Leu

Gly

Trp 30

Ly s

Trp

Ile

Hi s

Glu 35

Pro

Lys Gly

Tyr

Hi s 40

Al a

Asn

Phe

Cys

Ser 45

Gly

Pro

Cys

Pro

Tyr 50

Leu

Arg

Ser Alá

Asp 55

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr 60

Va 1

Leu

Gly

Leu

Tyr 65

Asn

Thr

Leu

Asn Pro 70

Glu

Al a

Ser

Alá

Ser 75

Pro

Cys

Cys

Val

Pro 80

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro Leu 85

Thr

Ile

Leu

Tyr 90

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr 95

Pro

Lys

Val

Glu

Gin 100

Leu Ser

Asn

Me t

Val 105

Val

Lys

Ser

Cys

Lys 110

Cys

Ser

(2) Információ a 9. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: nukleinsav (A) Leírás: desc=„hibrid TGF-p2-3-at kódoló rekombináns hibrid DNS”

HU 222 829 Bl (vi) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.TGF-p2(44/45)p3 (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 1...132 (D) Más információ: termék=„humán TGF-P2 44 N-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 133...336 (D) Más információ: termék=„humán TGF-P3 68 C-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1...336 (D) Más információ: termék „hibrid TGF-P2-3” (xi) Szekvencialeírás: 9. azonosító számú szekvencia

GCT

TTG

GAT

GCG

GCC

TAT

TGC

TTT

AGA

AAT

GTG

CAG

GAT

AAT

TGC

TGC

48

Al a 1

Leu

Asp

Al a

Al a 5

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn 10

Val

Gin

Asp

As n

Cy s 15

Cys

CTA

CGT

CCA

CTT

TAC

ATT

GAT

TTC

AAG

AGG

GAT

CTA

GGG

TGG

AAA

TGG

96

Leu

Arg

Pro

Leu 20

Tyr

Ile

Asp

Phe

Lys 25

Arg

Asp

Leu

Gly

Trp 30

Lys

Trp

ATA

CAC

GAA

ccc

AAA

GGG

TAC

AAT

GCC

AAC

TTC

TGC

TCA

GGC

CCT

TGC

144

Ile

Hi s

Glu 35

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Asn 40

Alá

Asn

Phe

Cys

Ser 45

Gly

Pro

Cys

CCA

TAC

CTC

CGC

AGT

GCA

GAC

ACA

ACC

CAC

AGC

ACG

GTG

CTG

GGA

CTG

192

Pro

Tyr 50

Leu

Arg

Ser

Al a

As p 55

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr 60

Va 1

Leu

Gly

Leu

TAC

AAC

ACT

CTG

AAC

CCT

GAA

GCA

TCT

GCC

TCG

CCT

TGC

TGC

GTG

CCC

240

Tyr 65

Asn

Thr

Leu

As n

Pro 70

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser 75

Pro

Cy s

Cy s

Val

Pro 80

CAG

GAC

CTG

GAG

CCC

CTG

ACC

ATC

CTG

TAC

TAT

GTT

GGG

AGG

ACC

CCC

288

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr 90

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr 95

Pro

AAA

GTG

GAG

CAG

CTC

TCC

AAC

ATG

GTG

GTG

AAG

TCT

TGT

AAA

TGT

AGC

336

Ly s

Va 1

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Ly s

Ser

Cys

Lys

Cys

Ser

100 105 110 (2) Információ a 10. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás : 10. azonosító számú szekvencia

Al a

Leu

Asp

Al a

Al a

Tyr

Cys

Phe

Arg

Asn

Val

Gin

Asp

Asn

Cy s

Cys

1

5

10

15

Leu

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Lys

Arg

Asp

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

Ile

Hi s

Glu

Pro

Lys

Gly

Tyr

Asn

Alá

Asn

Phe

Cys

Ser

Gly

Pro

Cys

35

40

45

Pro

Tyr

Leu

Arg

Ser

Al a

As p

Thr

Thr

Hi s

Ser

Thr

Val

Le u

Gly

Leu

50

55

60

HU 222 829 Bl

Tyr 65

As n

Thr

Leu

Asn

Pro 70

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser 75

Pro

Cys

Cy s

Val

Pro 80

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Val

Gly

Arg

Thr

Pro

85

90

95

Lys

Va 1

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Val

Val

Lys

Ser

Cy s

Ly s

Cys

Ser

100

105

110

(2) Információ all. azonosító számú szekvenciához (i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 336 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Lánctípus: kétfonalas (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás desc=„rekombináns hibrid DNS, ami hibrid TGF-P3-at kódol” (vii) Közvetlen forrás:

(B) Klón: E. coli LC137/pPLMu.TGF-p3(44/45)p2 (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptid (B) Elhelyezkedés: 1...132 (D) Más információ: termék=„humán TGF-p3 44 N-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: mat_peptide (B) Elhelyezkedés: 133.. .336 (D) Más információ: termék=TGF-p2 68 C-terminális aminosava” (ix) Jellemzők:

(A) Név/kulcsszó: CDS (B) Elhelyezkedés: 1.. .336 (D) Más információ termék=„hibrid TGF-p3-2” (ix) Szekvencialeírás: 11. azonosító számú szekvencia

GCT Al a 1

TTG Leu

GAC ACC

AAT TAC TGC

TTC Phe

CGC Arg

AAC Asn 10

TTG GAG GAG AAC

TGC Cys 15

TGT Cys

48

Asp

Thr

Asn 5

Tyr

Cys

Leu

Glu

Glu

Asn

GTG

CGC

ccc

CTC

TAC

ATT

GAC

TTC

CGA

CAG

GAT

CTG

GGC

TGG

AAG

TGG

96

Val

Arg

Pro

Leu 20

Tyr

Ile

As p

Phe

Arg 25

Gin

As p

Leu

Gly

Trp 30

Lys

Trp

GTC

CAT

GAA

CCT

AAG

GGC

TAC

TAT

GCC

AAC

TTC

TGT

GCT

GGA

GCA

TGC

144

Val

Hi s

Glu 35

Pro

Lys

G1 y

Tyr

Tyr 40

Al a

Asn

Phe

Cy s

Al a 45

Gly

Al a

Cys

CCG

TAT

TTA

TGG

AGT

TCA

GAC

ACT

CAG

CAC

AGC

AGG

GTC

CTG

AGC

TTA

192

Pro

Tyr 50

Leu

Trp

Ser

Ser

As p 55

Thr

Gin

Hi s

Ser

Arg 60

Val

Leu

Ser

Leu

TAT

AAT

ACC

ATA

AAT

CCA

GAA

GCA

TCT

GCT

TCT

CCT

TGC

TGC

GTG

TCC

240

Tyr 65

Asn

Thr

Ile

Asn

Pro 70

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser 75

Pro

Cys

Cys

Val

Ser 80

CAA

GAT

TTA

GAA

CCT

CTA

ACC

ATT

CTC

TAC

TAC

ATT

GGC

AAA

ACA

CCC

288

Gin

Asp

Leu

Glu

Pro 85

Leu

Thr

Ile

Leu

Tyr 90

Tyr

Ile

Gly

Ly s

Thr 95

Pro

AAG

ATT

GAA

CAG

CTT

TCT

AAT

ATG

ATT

GTA

AAG

TCT

TGC

AAA

TGC

AGC

336

Lys

Ile

Glu

Gin 100

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile 105

Val

Ly s

Ser

Cy s

Ly s 110

Cys

Ser

HU 222 829 Β1 (2) Információ a 12. azonosító számú szekvenciához:

(i) Szekvenciajellemzők:

(A) Hosszúság: 112 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: protein (xi) Szekvencialeírás: 12. azonosító számú szekvencia

Al a 1

Leu Asp Thr

Asn 5

Tyr

Cy s

Phe

Arg

Asn 10

Leu

Glu

Glu

Asn

Cy s 15

Cy s

Val

Arg

Pro

Leu

Tyr

Ile

Asp

Phe

Arg

Gin

As p

Leu

Gly

Trp

Lys

Trp

20

25

30

Val

Hi s

Glu

Pro

Ly s

Gly

Tyr

Tyr

Al a

Asn

Phe

Cy s

Al a

Gly

Al a

Cy s

35

40

45

Pro

Tyr

Leu

Trp

Ser

Ser

As p

Thr

Gin

Hi s

Ser

Arg

Val

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Thr

Ile

Asn

Pro

Glu

Al a

Ser

Al a

Ser

Pro

Cy s

Cy s

Val

Ser

65

70

75

80

Gin

As p

Leu

Glu

Pro

Léu

Thr

Ile

Leu

Tyr

Tyr

Ile

Gly

Ly s

Thr

Pro

85

90

95

Ly s

Ile

Glu

Gin

Leu

Ser

Asn

Me t

Ile

Val

Ly s

Ser

Cy s

Ly s

Cy s

Ser

100

105

110

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (14)

1. Eljárás dimer, biológiailag aktív β-típusú transzformáló növekedési faktor (TGF^)-szerű fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a (TGF^)-szerű fehéije denaturált, monomer formáját egy detergenstől mentes pufferrel kezeljük, amely egy szerves oldószert, éspedig dimetil-szulfoxidot vagy dimetil-formamidot, vagy ezek tetszőleges keverékét körülbelül 10-körülbelül 50 tf/tf% koncentrációban tartalmazza, ahol a puffer még egy redukálószert is tartalmaz, és a puffer pHértéke körülbelül 7 és körülbelül 10 közötti.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert körülbelül 20% és körülbelül 50% közötti koncentrációban alkalmazzuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert körülbelül 30% és körülbelül 50% közötti koncentrációban alkalmazzuk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert körülbelül 30% és körülbelül 40% közötti koncentrációban alkalmazzuk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves oldószert körülbelül 40% koncentrációban alkalmazzuk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a TGF^-szerű fehérjét a TGF-β 1-et, TGF^2-t, TGF^3-at, a heterodimer TGF^-kat, a TGF-β fragmentumait és mutánsait, beleértve az olyan hibrid molekulákat, amelyekben a különböző TGF-fl-k egyes részei ki vannak cserélve, a BMP-ket, inhibineket és aktivineket tartalmazó csoport tagjai közül választjuk.

7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a TGF^-szerű fehéqét a TGF^2-t, TGF-P3-at, TGF-β 1-2 hibridet, TGF-β 1-3 hibridet, TGF^2-3 hibridet, TGF^3-2 hibridet és a ΒΜΡ-2-t tartalmazó csoport tagjai közül választjuk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy TGF^-szerű fehérjeként TGF^3-at alkalmazunk.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy körülbelül 0 °C és körülbelül 40 °C közötti hőmérsékletű puffért alkalmazunk.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy redukálószerként egy redukált szulfhidrilvegyületet alkalmazunk.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet a redukált alakú glutationt, a redukált alakú β-merkapto-etanolt, a re21

HU 222 829 Bl dukált alakú merkapto-metanolt, a ciszteint, ciszteinamint és a redukált alakú ditiotreitolt tartalmazó csoportból választjuk.

12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet körülbelül 5 1 és 100 mM közötti koncentrációban alkalmazzuk.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet körülbelül 1 és 10 mM közötti koncentrációban alkalmazzuk.

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a redukált szulfhidrilvegyületet körülbelül 2,5 mM koncentrációban alkalmazzuk.

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest

A kiadásért felel: Törőcsik Zsuzsanna főosztályvezető-helyettes

Windor Bt., Budapest