NO317730B1 - Fremgangsmate for fremstilling av dimerisk, biologisk aktivt TGF-beta-lignende protein - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av dimerisk, biologisk aktivt TGF-beta-lignende protein Download PDFInfo
- Publication number
- NO317730B1 NO317730B1 NO19970326A NO970326A NO317730B1 NO 317730 B1 NO317730 B1 NO 317730B1 NO 19970326 A NO19970326 A NO 19970326A NO 970326 A NO970326 A NO 970326A NO 317730 B1 NO317730 B1 NO 317730B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tgf
- protein
- buffer
- concentration
- dimeric
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 49
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 73
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 30
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 6
- -1 sulfhydryl compound Chemical class 0.000 claims description 6
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 claims description 4
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 claims description 4
- 101000844802 Lacticaseibacillus rhamnosus Teichoic acid D-alanyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000488 activin Substances 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 claims description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 2
- GXDPEHGCHUDUFE-UHFFFAOYSA-N sulfanylmethanol Chemical compound OCS GXDPEHGCHUDUFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 19
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 19
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 9
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- HHVIBTZHLRERCL-UHFFFAOYSA-N sulfonyldimethane Chemical compound CS(C)(=O)=O HHVIBTZHLRERCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 5
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 4
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 3
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000007862 dimeric product Substances 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 108010049976 Bone Morphogenetic Protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 108010049974 Bone Morphogenetic Protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 102100022526 Bone morphogenetic protein 5 Human genes 0.000 description 2
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100022545 Bone morphogenetic protein 8B Human genes 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 2
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100040892 Growth/differentiation factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101000899368 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 8B Proteins 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 2
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010049951 Bone Morphogenetic Protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010006802 Burns second degree Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101100001670 Emericella variicolor andE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589538 Pseudomonas fragi Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101100218949 Rattus norvegicus Bmp3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 244000247617 Teramnus labialis var. labialis Species 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000037319 collagen production Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000318 mullerian duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000819 phase cycle Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000030503 positive regulation of chemotaxis Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 125000002577 pseudohalo group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000022379 skeletal muscle tissue development Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å fremstille biologisk aktivt protein. Spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse en foldings fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktiv, dimerisk TGF-B (transformerende vekstfaktor type fl)-lignende protein i en detergent-fri folde buffer.
TGF-B-lignende proteiner, dvs. proteiner fra TGF-B superfamilien spiller en sentral rolle i mange biologiske reguleringsveier så som embryonal utvikling eller regenerering av vev. De er meget potente biologiske stoffer som kan bli anvendt terapeutisk i en serie forskjellige formål. Det meste kjente medlemmet av TGF-B superfamilien er selve TGF-13.
TGF-B ble opprinnelig renset til homogenisitet fra humane blodplater, human placenta og bovine nyrer og identifisert som et homodimerisk protein med en molekylmasse på omtrent 25.000 Da. Det ble først karakterisert ved dets evne til å virke synergistisk med EGF eller TGF-cc for å indusere forankrings-uavhengig vekst av utransformerte NRK celler og nylig har TGF-B blitt vist å utvise en mengde regulatoriske effekter på mange forskjellige både normale og neoplastiske celler som indikerer viktigheten av dette proteinet som en multifunksjonell regulator av cellulær aktivitet. Avhengig av celle eller vevstype, og tilstedeværelse eller fravær av andre vektsfaktorer kan TGF-B enten stimulere mitogenesen, celleproliferasjonen og veksten, eller kan effektivt inhibere nevnte prosesser, eller kan utvise andre virkninger som for eksempel kontroll av adipogenesen, myogenesen, chondrogenesen, osteogenesen og immun cellefunksjonen, stimulering av kjemotaksen, eller induksjon eller inhibisjon av differensieringen. Mange av virkningene til TGF-B er relatert til responsen til celler eller vev overfor stress eller skade, og reparering av den resulterende skaden. Etter inflammasjon spiller TGF-B hovedrollen i dannelsen av granuleringsvev, øker ekspresjon av gener assosiert med ekstracellulær matriksdannelse så som fibronektin, kollagen og flere proteaseinhibitorer og stimulerer kollagen-matriks sammentrekningen til fibroblaster og dette tyder på en mulig rolle i sammentrekning av bindevev.
Frem til nå er det blitt beskrevet fem bestemte funksjonelt og strukturelt nært beslektede TGF-8s betegnet som TGF-B 1, TGF-B2, TGF-63, TGF-B4 og TGF-B5. De tre førstnevnte finnes også i mennesker.
Alle TGF-B blir syntetisert som 390 til 412 aminosyreforløpere som gjennomgår proteolytisk spaltning for å produsere de modne formene som består av C-terminale 112 aminosyrer. I deres modne, biologiske aktive former er TGF-B syre- og varme-stabile disulfid-koblede homodimerer av to polypeptidkjeder med hver 112 aminosyrer. De fullstendige aminosyresekvensene til human (Derynck, R. et al. (1985) Nature 316,701-70, murin (Derynck, R. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261,4377-4379) og simian TGF-B 1 (Sharples, K. et al. (1987) DNA 6,239-244) viser betydelig sekvenskonservering og er bare forskjellige i et enkelt aminosyreresidie. Sammenligning av aminosyresekvensen til human TGF-B 1, human TGF-B2 (deMartin, R. et al. (1987) EMBO J. 6, 3673-3677; Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262,12127-12131) og human TGF-B3 (Ten Dijke, P. et al. (1988) PNAS 85,4715-4719) har demonstrert at de proteinene utviser i deres modne former omtrent 70-80% sekvensidentitet. En heterodimerisk TGF-B 1-2 er blitt isolert fra blodplater fra griser og består av en enhetTGF-fll disulfid-koblet til en enhet TGF-B2 (Cheifetz, S. et al. (1987) Cell 48, 409-415).
Forsøk er nylig blitt gjennomgått for å produsere TGF-B ved hjelp av rekombinante teknikker i stedenfor isolering av disse faktorene fra naturlige kilder (for eksempel blodplater) for å oppnå tilstrekkelige mengder for testing i forskjellige terapeutiske modaliteter. Det har vist seg å være ekstremt vanskelig å oppnå biologisk aktiv rekombinant TGF-fl. Som det fremgår fra sekvensene angitt i sekvenslisten under SEQ JD NO: 1 til 6 inneholder 112 aminosyrer inneholdende modne former av TGF-Bl, TGF-B2 og TGF-B3 9 cysteinresidier. Som vist for TGF-B2 danner 9 cysteinresidier 4 intrakjede og 1 interkjede disulfidbindig [Schlunegger, M.P. and Gruetter, M.G., Nature 358:430-434 (1992)]. Heterolog ekspresjon av TGF-B kan føre til et produkt som til tross for at det har riktig primærstruktur, ikke foldes riktig for å produsere korrekte sekundære eller tertiære strukturer og som derfor mangler den biologiske aktiviteten.
Ved å ta hensyn til kompleksiteten til native TGF-B molekyler har det generelt blitt betraktet å være hensiktsmessig å uttrykke de respektive TGF-B genene i celler avledet fra høyerestående organismer. Til tross for at ekspresjon av rekombinant TGF-B kan bli oppnådd i eukaryote systemer er utbytte av biologiske aktive, korrekt foldede materialer fortsatt langt fra tilfredsstillende.
Det har derfor vært forsøkt å produsere biologisk aktiv TGF-B i en mikrobiell vert. I for eksempel bakterier er de intracellulære betingelsene ikke slik at det fører til korrekt folding, dvs. dannelse av disulfidbinding og disulfid-stabilisert dimerisering som sannsynligvis er essensielle for aktivitet. Bare meget lite biologisk aktiv TGF-B kunne bli oppnådd etter ekspresjon av det respektive genet i E. coli under kontroll av lambda-promoteren som beskrevet i europeisk patentsøknad EP-A-0 268 561. En annen rapport beskriver ekspresjon av et TGF-B cDNA i E. coli under kontroll av trp-promoteren som tilveiebringer et radioaktivt merket protein bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 13.000 Da i et autoradiogram av en SDS polyakrylamidgel, men ingen aktivitet ble målt (Urushizaki, Y. et al. (1987) Tumor Res. 22,41-55).
Når rekombinante proteiner blir produsert i høye nivåer i bakterielle (så som E. coli) ekspressjonssystemer fremkommer de ofte i form av sterkt uoppløselige intracellulære presipitater betegnet som inklusjonslegemer eller refraktile legemer som kan bli gjenkjent som lysende flekker synlige innenfor cellene under et fasekontrastmikroskop. Disse inklusjonslegemene, som lett kan bli separert fra oppløselige bakterielle proteiner, inneholder det rekombinante proteinet i en for det meste denaturert og redusert form som ikke utviser den funksjonelle aktiviteten til dets naturlige motpart og som derfor ikke kan anvendes som et kommersielt produkt. Det er derfor generelt akseptert at rekombinant refraktilt protein må bli oppløst under betingelser som er egnede for å opprettholde det i dets denaturerte form og må deretter bli foldet for å gjennomgå overgangen fra denaturert ufoldet form til viktig, funksjonell aktiv tre-dimensjonal struktur i det konformasjonen blir stabilisert av relativt svake interatomiske krefter så som hydrogenbinding, hydrofobe interaksjoner og ladningsinteraksjoner. Når det gjelder cysteininneholdende proteiner kan denne prosessen også innbefatte dannelsen av disulfidbindinger. Når dannelsen av disulfidbindinger blir fremmet kjemisk bør dannelsen av ukorrekte intramolekylære og, når det gjelder dimeriske eller multimeriske proteiner, intramolekylære broer bli unngått eller i det minste minimalisert på grunn av at dannelsen av uønskede, ukorrekt foldede isomerer kan tilveiebringe ikke-homogent materiale som følgelig kompliserer den ytterligere rensningen av proteinet som har den ønskede strukturen, eller kan danne et protein med redusert aktivitet.
Folding av proteiner blit vanligvis utført i en flertrinns fremgangsmåte som omfatter solubilisering av proteinet under sterkt denaturerende betingelser, og deretter redusering av konsentrasjonen av chaotropen for å muliggjøre folding av proteinet. En slik metode svikter derimot ved folding av TGF-B. I europeisk patentsøknad EP-A-0 433 225 er en vellykket fremgangsmåte for produksjon av biologisk aktivt, dimerisk TGF-B lignende protein beskrevet hvor en svak detergent som muliggjør folding av TGF-B lignende protein anvendes, mens detergenten er tilstede i foldebufferen.
Det er kjent fra tidligere teknikk (Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 113:6657-6662, 1991) at dimetylsulfoksid (DMSO) kan bli anvendt for å fremme en selektiv og effektiv dannelse av dilsulfidbindinger i peptider. Fremgangsmåten er selektiv, dvs. uten sidereaksjoner, og et stort pH område kan bli anvendt. Korrekt disulfldbrodannelse ble derimot bare vist for peptider opp til omtrent 30 aminosyrer. I en annen publikasjon (Bentle et al., US-PS 4.731.440) ble dimetylsulfon eller en blanding av dimetylsulfon og urea anvendt for solubilisering av somatotropin fra inklusjonslegemer. Solubilisert protein kunne deretter bli renaturert ved å bringe den dimetylsulfoninneholdende oppløsning av proteinet i kontakt med et svakt oksydasjonsmiddel.
Det ble overraskende oppdaget at TGF-B-lignende proteiner kan bli refoldet til en aktiv, dimerisk form ved behandling av den solubiliserte monomeren med en detergent-fri foldebuffer som omfatter et organisk oppløsningsmiddel så som for eksempel DMSO, DMF eller en blanding av DMSO og DMF.
Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for produksjon av biologisk aktivt, dimerisk TGF-B lignende protein fra dets denaturerte eller ellers ikke-native form. Denne hensikten blir oppnådd ved det uventede funnet som omfatter at betraktelige mengder av det ønskede dimeriske produktet kan bli oppnådd i et uventet ubytte når den monomeriske formen av nevnte protein blir behandlet med en detergentfri foldebuffer som omfatter et organisk oppløsningsmiddel så som for eksempel DMSO, DMF eller en blanding av DMSO og
DMF.
Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type B (TGF-B)-lignende protein omfattende å utsette den denaturerte, monomeriske formen av nevnte TGF-B-lignende protein for detergentfrie foldebetingelser.
I særdeleshet vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgagnsmåte for fremstilling av dimerisk, biologisk aktiv transformerende vekstfaktor type p (TGF-p)-lignende protein, kjennetegnet ved å behandle den denaturerte monomeriske formen av nevnte TGF-P-lignende protein med en detergentfri buffer som omfatter et organisk oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av DMSO, DMF og en hvilken som helst blanding derav, i en konsentrasjon på omtrent 10 til omtrent 50%, der bufferen i i tillegg inneholder en reduserende forbindelse og der bufferen har en pH mellom ca. 7 og c. 10.
Betegnelsen "TGF-B-lignende protein" i foreliggende oppfinnelse betyr et protein som i dets monomeriske form har en sekvens med minst 75% homologi med minst et av aminosyresekvensene til en monomer av følgende medlemmer av TGF-B superfamilien: TGF-B 1, TGF-B2, TGF-B3; en vekstinhibitor isolert fra kondisjonert medium til BSC-1 apenyre celler (dvs. polyergin; Holley, R.W. et al. (1980) PNAS 77, 5989-5992; Ristow, HJ. (1986) PNAS 83, 5531-5533); TGF-B4 fra kyllingembryo chondrocytér (Jakowlew, S.B. et al. (1988) Molecular Endocrinology2,1186-1195); TGF-B5 fra Xenopus-Laevis (Kondaiah, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265,1089-1093); TGF-B5-relaterte inhibiner og aktiviner (gonadale proteiner som regulerer hypofysesekresjon av follikel stimulerende hormon); Mullerian inhiberende forbindelse (MIS, som inhiberer utviklingen av Mullerian kanalen i pattedyrembryoer fra hankjønn); benmorfogeniske proteiner (BMP, en gruppe polypeptider involvert i induksjon av cartilage og bendannelse; medlemmer av denne gruppen som er kjent i dag er BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 og BMP-9); transkriptet fra dekapentaplegisk genkompleks til Drosophilia (dpp, som kontrollerer morfogenesen i flueembryoer); Vg-1 (produktet av Xenopus transkriptet som er tilstede i vegetal pole til oocyter); og Vgr-1. et Vg-1 relatert pattedyrgen (Mason, A. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135, 957-964; Cate, R. et al. (1986) Cell 45,685-698; Wozney, J.M. et al. (1988) Science 242,1528-1534; Padgett, R. et al. (1986) Nature 325, 81-84; Weeks, D.L. and Melton, D.A. (1987) Cell 51,861-868; Lyons, K. et al. (1989) PNAS 86,4554-4558).
Også innbefattet innenfor betydningen "TGF-B-lignende protein" er heterodimerer inneholdende subenheter av forskjellige TGF-B-lignende proteiner, eller fragmenter og mutanter av ovennevnte proteiner som har beholdt en eller den totale biologiske aktiviteten til opphavsmolekylet.
I en foretrukket betydning angir betegnelsen "TGF-B-lignende protein" i foreliggende oppfinnelse et hvilket som helst protein av TGF-B superfamilien. I en mer foretrukket betydning representerer det et protein valgt fra gruppen bestående av følgende proteiner fra TGF-B superfamilien: TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 av pattedyr så som fra human eller opprinnelse fra dyr, for eksempel simian, munn, gris, hest eller bovin, samt heterodimeriske TGF-B bestående av to forskjellige subenheter med 112 aminosyrer hver, og fragmenter og mutanter av en TGF-B inkludert hybridmolekyler hvor deler av forskjellige TGF-B er utvekslet; en vekstinhibitor isolert fra kondisjonert medium til BSC-1 apenyreceller (dvs. polyergin); TGF-B4 fra kyllingembryo chondrocytér; TGF-B5 fra Xenopus-Laevus; TGF-B-relaterte inhibiner og aktiviner (gonadalproteiner som regulerer hypofyse sekresjonen av folikkelstimulerende hormon); Mullerian inhibierende forbindelse (MIS, som inhiberer utviklingen av Mullerian kanalen i pattedyr hannembryoer), benmorfogene proteiner (BMP, en gruppe av polypeptider involvert i induksjon av brusk og bendannelse; medlemmer av denne gruppen som er kjent i dag er BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 og BMP-9); transkriptet fra dekapentaplegisk genkompleks til Drosophila (dpp. som virker slik at det kontrollerer morfogenesen i flueembryo); Vg-1 (produktet av Xenopus transkriptet som er tilstede i vegetal pole til oocyter); og Vgr-1, et Vg-1 relatert pattedyrgen. Også innbefattet innenfor betydningen av "TGF-B-lignende protein" er heterodimerer inneholdende subenheter av forskjellige TGF-B-lignende proteiner, eller fragmenter og mutanter av ovennevnte proteiner som har beholdt en eller alle de biologiske aktivitetene til opphavsmolekylet.
Ytterligere mer foretrukne TGF-B-lignende proteiner blir valgt fra gruppen bestående av TGF-B 1, TGF-B2, TGF-B3 heterodimeriske TGF-6, fragmenter og mutanter av en TGF-B inkludert hybridmolekyler hvor deler av forskjellige TGF-B er utvekslet, BMP, inhibiner og aktiviner. Ytterligere mer foretrukket er BMP-2, TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-63 og heterodimerer og fragmenter og mutanter derav inkludert hybridmolekyler hvor deler av forskjellige TGF-B er utvekslet, fortrinnsvis hybrid TGF-B1-3, hybrid TGF-B2-3 og hybrid TGF-B3-2 bestående, i N- til C-terminal rekkefølge, av N-terminale 44 aminosyrer av human TGF-B1 og C-terminale 68 aminosyrer av TGF-B2. Ytterligere mer foretrukket er TGF-B lignende proteiner som har aminosyresekvensene angitt i sekvenslisten under SEQ ED NO: 1,3, 5,7,9 eller 11. Den mest foretrukne TGF-B-lignende proteinet er TGF-B3. Den biologiske aktiviteten til TGF-B for formålet heri er definert som enten
- cellemigreringsfremmende aktivitet til TGF-B på fibroblaster, (Postlethwaite, A. E. et al. (1987) J. Exp. Med. 165,251, modifisert ifølge Burk, R. (1973) PNAS 70,369), - inhibitorisk effekt av TGF-B på veksten av humane A 375 melanomaceller (Brown, T.J. et al. (1987) J. frnmunol. 139, 2977), - inhibisjon av CCL-64 celle DNA synteseanalyse (Graycar, J.L. etal., (1989) Molecular Endocrinology 3:1977-1986)
eller
- inhibisjon av veksten til en kontinuerlig mink lunge epitelcellelinje Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) som beskrevet i eksemplene nedenfor.
Monomerisk TGF-B protein avledet fra en hvilken som helst kilde eller fremgangsmåte kan bli foldet til det korresponderende dimeriske, biologiske aktive TGF-B-lignende proteinet ifølge foreliggende fremgangsmåte. For eksempel kan den monomeriske formen av det DTG-B lignende proteinet bli avledet fra en naturlig kilde eller produsert ved hjelp av rekombinant DNA teknologi eller syntetisk ifølge fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet. Når det gjelder monomeren er den ikke egnet for in vitro folding på grunn av kontaminanter, og den solubiliserte og denaturerte formen kan bli renset ved kromatografi, for eksempel ved størrelseseksklusjonskromatografi på for eksempel Sephacryl S-100 HR.
Før den blir foldet må det monomeriske TGF-B lignende proteinet være tilstede i en denaturert (dvs. ufoldet), solubilisert form. Med evne til effektiv denaturering og solubilisering av proteiner er såkalte kaotropiske midler som er velkjente innenfor fagområdet, som, i vandig oppløsning og i egnede konsentrasjoner, forandrer den romlige konfigurasjonen til det respektive proteinet gjennom endring av overflaten derav, enten gjennom endring av hydreringstilstanden, oppløsningsmiddelmiljøet, eller oppløsningsmiddel-overflate interaksjonen. Eksempler på slike kaotropiske midler eller denatureringsmidler innbefatter urea, guanidin, hydroklorid, natriumtiocyanat i konsentrasjoner i området på omtrent 4 til omtrent 9 M, og detergenter så som SDS, som blir tilført i konsentrasjoner i størrelsesorden 0,01 til 2%. Surgjøring av den vandige oppløsningen inneholdende TGF-B lignende protein til en pH på omtrent 2 til omtrent 4, for eksempel med en lavmolekylvektsalifatisk organisk syre, fortrinnsvis med 2, 3 eller 4 C-atomer, mer foretrukket eddiksyre, samt basiske tilstander som omfatter for eksempel pH 10 og over, og forhøyede temperaturer vil resultere i denaturering og solubilisering av monomeren.
Monomeren blir deretter utsatt for "folde betingelser" som muliggjør isolering av biologisk aktiv dimer. Betegnelsen "folde betingelser" refererer til tilstander hvorved intra- og interkjede disulfidbindingsdannelse blir fremmet og den denaturerte monomeren blir tillatt å innta en konformasjon assosiert med den biologiske aktiviteten. Denne prosessen involverer ikke noen forandring i den primære strukturen (dvs. aminoyresekvensen) til monomeren, men er relatert til dannelsen av den 3-dimensjonale konformasjonen til det dimeriske produktet som er assosiert med den biologiske aktiviteten. Denne fremgangsmåten innbefatter dannelse av disulfidbindinger og assosiasjon av monomerer til en dimerisk, biologisk aktiv struktur.
Ifølge oppfinnelsen blir den denaturerte monomeren behandlet med en foldebuffer som omfatter et organisk oppløsningsmiddel. Foretrukne organiske opp løsningsmidler blir valgt fra gruppen bestående av DMSO, DMF og en hvilken som helst blanding derav.
Foldingen kan bli utført ved en nøytral eller alkalisk pH og ved en gunstig temperatur, for eksempel mellom omtrent 0°C og omtrent 40°C. En foretrukket pH er mellom omtrent 7 og omtrent 10, mer foretrukket når det gjelder DMSO er omtrent pH 9 til 9,5 og når det gjelder DMF omtrent pH 8,5.
Konvensjonelle buffersystemer som kan bli anvendt for folding ifølge foreliggende oppfinnelse er buffere som tilveiebringer tilstrekkelig bufferkapasitet mellom pH 6 og 10. Alle bufferene som ikke har noen inhiberende effekt på foldingen av proteinene kan anvendes i foreliggende oppfinnelse.
Egnede buffere er for eksempel tris, bis-tris eller piperazinbuffere. Bufferene kan i tillegg inneholde et salt, om ønskelig, og en basisk aminosyre, om ønskelig.
Salter som kan bli anvendt i foldebufferen er for eksempel salter av Na<+>, Li<+>, K<+>, NH4+ Mg2+ Ca<2+> eller Mn<2+> med Cl", F", Br, J-, HCO3-, S04<2+>, fosfat, acetat, cyanat eller rhodanid eller andre alkalimetall- eller alkaliske jordmetall - halogen eller pseudohalogen forbindelser ved en konsentrasjon på opp til 3 M. Foretrukket er NaCl ved en konsentrasjon på 1 til 2 M. En basisk aminosyre som kan bli anvendt i foldebufferen er for eksempel argjnin, fortrinnsvis i konsentrasjon på 0,5 M.
For folding ifølge foreliggende oppfinnelse kan DMSO bli anvendt i en konsentrasjon på omtrent 10 til omtrent 50%, mer foretrukket omtrent 20 til omtrent 50%, ytterligere mer foretrukket er omtrent 30 til omtrent 50%, mest foretrukket er omtrent 40%.
DMSO i foldebufferen kan bli erstattet med DMF. DMF kan bli anvendt i en konsentrasjon på omtrent 10 til omtrent 50%, fortrinnsvis omtrent 20 til omtrent 50%, mer foretrukket er omtrent 30 til omtrent 50%, mer foretrukket er omtrent 30 til omtrent 40%.
En blanding av DMSO og DMF kan bli anvendt i en konsentrasjon på omtrent 10 til omtrent 50% for både oppløsningsmidler kombinert.
Ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder foldebufferen i tillegg en reduserende forbindelse. En egnet reduserende forbindelse som oppmuntrer til dannelse av disulfider i proteiner eller peptider er for eksempel et lavmolekylvekt sulfhydrylreagens valgt fra gruppen bestående av glutation i dets reduserte form, ditiotreitol i dets reduserte form, B-merkaptoetanol i dets reduserte form, merkaptometanol i dets reduserte form, cystein og cystamin. En egnet konsentrasjon er for eksempel omtrent 1 til 100 mM, fortrinnsvis omtrent 1 til 10 mM, mer foretrukket er omtrent 2,5 mM.
Foretrukne reduserte sulfnydrylforbindelser som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse blir valgt fra gruppen bestående av redusert glutation, cystein, cystamin og J3-merkaptoetanol. Redusert glutation er den mest foretrukne forbindelsen.
Foldingen blir utført ved gunstige temperaturer, for eksempel mellom omtrent 0 og omtrent 40°C, fortrinnsvis ved omtrent 4°C, og ved en gunstig tidsperiode, for eksempel mellom omtrent 2 og omtrent 720 timer. På grunn av at varigheten av foldingen avhenger av temperaturen som blir anvendt kan temperaturen bli optimalisert for en hvilken som helst ønskelig foldetidsperiode og vice versa.
Produksjon av et dimerisk, biologisk aktivt TGF-B-lignende protein ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli utført i en ettrinnsprosedyre, hvori monomeren til nevnte protein blir overført til foldebufferen og reaksjonsblandingen blir inkubert i en tidsperiode på for eksempel 2 timer opp til 7 eller flere dager ved en temperatur mellom for eksempel 0°C og 40°C, fortrinnsvis 4°C mens foldingen og dimeriseringen foregår kontinuerlig. Proteinkonsentrasjonen i løpet av foldereaksjonen er av betraktelig stor betydning på grunn av at når den er for høy kan monomerene gjennomgå vesentlig aggregasjon som fører til dannelsen av uønskede høyere-ordens oligomerer. Endelige utbytter av det dimeriske produktet blir øket, dersom proteinkonsentrasjonen er mindre enn omtrent 2 mg/ml, og et konsentrasjonsområde på 0,01 til 0,5 mg/ml er foretrukket.
Etter folding blir den biologiske aktive dimeren renset for å fjerne ufullstendig foldet TGF-B lignende protein og urenheter, spesielt pyrogener eller andre endotoksiner som kan være tilstede i prepareringen dersom polypeptidet ble produsert i mikrobielle vertsceller. Separering av dimeren blir utført ved kromatografi så som størrelsesgelkromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi eller ionebytte kromatografi, for eksempel på en mono S kolonne og revers fase HPLC.
Dimeriske biologiske aktive TGF-6 lignende proteiner produsert ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen kan bli anvendt i forskjellige terapeutiske modaliteter.
Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
Eksempel 1: ekspresjon av TGF- 13 1. TGF- 132 og TGF-B3 i E. coli
Eksempel IA: generelle fremgangsmåter
Bakteriell stamme:
-E. coli K12/LC 137: htpRjm,, IonR9, lac^, <m>algm, trpam, rspL, tsx::Tnl0, supCtø
(Goff, S.A. et al. (1984) PNAS 81,6647-6651).
Plasmider:
-pPLMu (Buell, G. et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13,1923-1938): dette plasmidet inneholder bakteriofag A, Pl promoteren med fag Mu ner genribosom bindingssetet (Van Leerdam, E. et al. (1982) Virology 123,19-28). -pclg57: plasmid kodende for en termolabil A.CI857 repressor og som utviser resistens mot kanamycin (Remault, E. et al. (1983) Gene 22,103-113).
SDS- gelelektroforese:
SDS polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og proteinfarging blir utført som tidligere beskrevet (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227,680-685) ved anvendelse av miniprotean II celle fra BIORAD og 1 mm tykk 18% polyakrylamidgeler. Varmeinduksjon: 7 ml LB medium (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) i et 20 ml dyrkningsrør inneholdende 40 ug av ampicillin og kanamycin (LB/amp/kan) blir inokulert med en enkel koloni og inkubert ved risting over natt ved 30°C. 5 ml av denne over natt kulturen blir tilsatt til 15 ml LB/amp/kan i en 100 ml Erlenmeyer flaske. Denne flasken blir overført til en 42°C vannbad rister. En 2 ml prøve blir tatt før overføring (ikke-induserende betingelse) og 1 ml prøver ved 1 times intervaller etter overføring (induseringsbetingelser). Cellene blir pelletert ved sentrifugering (5 min., 10.000 rpm i en Eppendorf sentrifuge) og supernatanten kastet. Pelleten blir resuspendert i 100 (il prøvebuffer for SDS-PAGE og oppvarmet i 10 min. ved 95°C. 5 ul alikvoter blir applisert for SDS-PAGE.
Preparerin<g> av kompetente celler:
Kompetente E. coli celler blir dannet ved kalsiumklorid prosedyren som beskrevet i Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Celler inneholdende plasmid pclg57 blir dyrket ved 30°C.
Eksempel IB: konstruksjon av ekspresjonsvektorene pPLMu. hTGF- fil. pPLMu. hTGF-B 2 og pPLMu. hTGF-13 3 og ekspresjon av TGF-B 1. TGF- 132 og TGF-B3
Kodende sekvenser av TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 (vist i sekvenslisten), blir klonet inn i plasmid pGem-5ZF(+) (Promega) spaltet med Ncol, defosforylert med kalve tarm alkalisk fosfatase (Boehringer) og ifylt med Klenow polymerase (Gibco-BRL). De resulterende konstruksjonene er betegnet pGKM 125 (TGF-B1), pGKM 749 (TGF-B2) og pGKM 126 (TGF-B3) og blir anvendt for å transformere kompetente E. coli Y 1090 celler. Kloner inneholdende korrekte innskudd kodende for TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 blir betegnet E. coli Y1090/pGKM 125 (TGF-B1), E. coli Y1090/pGKM 749 (TGF-B2) og E. coli Y1090/pGKM 126 (TGF-63).
E. coli 1090/pGKM 125, E. coli Y1090/pGKM 740 og E. coli 1090/pGKM 126 celler blir dyrket i LB medium og plasmid DNA blir dannet ifølge metoden til Birnboim, H.C. and Doly, H. (1979) Nucleic Acids Research 7,1513,5 |ig plasmid DNA blir fullstendig spaltet i 50 ul restriksjonsbuffer med enten Ncol og Sali (Pgkml25), Ncol og EcoRV (pGKM740) eller Ncol alene (pGKM126) etter anbefalningene til forhandleren (Boehringer). DNA blir presipitert ved tilsetning av 5 ul 3M natriumacetet, 100 mM MgCl2, 5 mM EDTA og 150 ul etanol. Etter inkubasjon ved -70°C i 15 min. blir DNA pelletert ved sentrifugering ved 13.000 g i 15 min.i en SS34 rotor i en Sorvall sentrifuge. Supematanten blir kastet og pelleten resuspendert i 80 ul 0,089 M tris borat, 0,089 M borsyre og 0,002 M EDTA (TBE buffer) inneholdende 0,25% bromfenol blå og 0,25% xylencyanol. 4 ganger 20 ul prøver blir elektroforert gjennom en 1% agarosegel i TBE buffer inneholdende 0,5 ug ml ethidiumbromid ved 50 volt helt til bromfenol blå markøren når bunnen av den 10 cm lange og 0,8 cm tykke gelen. DNA fragmenter kodende for moden TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 blir visualisert under kortbølge UV lys, spaltet ut med et barberblad og elektroeluert fra gelstykket i en Schleicher & Schiill Biotrap apparatur ved anvendelse av 200 mamp i 1,5 timer. Eluerte DNA fragmenter blir presipitert (se ovenfor) og resuspendert i 20 ul TE. 5 ul plasmid pPLMu blir linearisert ved spaltning med enten Ncol og Sali, Ncol og EcoRV eller Ncol alene og gel renset som beskrevet ovenfor for fragment DNA. 100 ng av linearisert og renset pPLMu vektor DNA og 3 ganger den molare ekvivalenten av det rensede fragment DNA blir inkubert ved 4°C i 15 timer i 20 ul ligeringsbuffer (70 mM TRIS/HC1, pH 7,5,10 mM mgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM adenosin-trifosfat) inneholdende 1 enhet DNA ligase (Boehringer). 10 ul av ligeringsblandingen blir satt til 200 ul kald (4°C) kompetente (E. coli LC 137 celler inneholdende pclg57. Etter 30 min. blir cellene varmesjokket ved inkubasjon i 1,5 min. i et 42°C vannbad. 2 ml LB medium blir tilsatt og kulturen blir ristet i 60 min. ved 30°C. 200 ul alikvoter blir sådd ut på LB skåler inneholdende ampicillin og kanamycin og inkubert i 22 timer ved 30°C. Enkeltkolonier blir dyrket og plasmid DNA analysert. Subkloning av DNA fragmenter kodende for TGF-B1, TGF-B2 og TGF-B3 i pPLMu resulterer i plasmidene pPLMu.hTGF-Bl, pPLMu.hTGF-B2 og pPLMu.hTGF-B3. Kloner inneholdende ovennevnte konstruksjoner blir referert til som E. coli LC 137/pPLMu.gTHF-fil, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B2 og E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B3.
E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-Bl, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B2 og E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B3 cellene blir varmeindusert (se eksempel IA) og uttrykte proteiner blir analysert ved SDS-PAGE. TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 fremkommer som varmeinduserte proteiner 2 timer etter varmeinduksjonsmigrering med en hensiktsmessig molekylmasse på omtrent 12.000 Da.
Eksempel 1C: fermentering av transformanter
Overnatt kulturer av E. coliC137/pPLMu.h.TGF-Bl, E. coli LC137/pPLMu.h.TGF-B2 og E. coliC137/pPLMu.h.TGF-B3 i 21 Erlenmeyer flasker inneholdende 750 ml LB medium med 40 mg/l ampicillin og kanamycin blir dyrket ved 30°C. 300 ml av over natt kulturene blir tilsatt til 750 ml LB medium inneholdende antibiotika som nevnt ovenfor i 21 Erlenmeyer flasker og oppvarmet til 42°C ved risting i omtrent 3,5 minutter i et 65°C vannbad. Flaskene blir deretter overført til en 42°C risteinnretning og inkubert i 3 t. Flaskene blir nedkjølt til 12°C i et isvann bad og cellene oppsamlet etter sentrifugering i 10 min. ved 8000 rpm i en GSA rotor (Sorvall).
Eksempel 2: ekspresjon av TGF-B 1. TGF-B 2 og TGF- B3 i Saccharomvces cerevisiae De kodende sekvensene til moden TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 blir uttrykt i Saccharomyces cerevisiae under kontroll av den induserbare promoteren til gjærsyre fosfatase (PH05).
Ekspresjonsvektorene blir konstruert i to trinn:
A. konstruksjon av plasmid pJDB207/PH05-PJT 12,
B. konstruksjon av plasmid pJDB207R/PH05-TGF-B 1, pJDB207R/PH05-TGF-B2
og pJDB207R/PH05-TGF-B3.
hvor A) tilveiebringer gjærvektoren og PH05 transkripsjonen terminator og B) tilveiebringer ekspresjonskassetter med et innskudd kodende for moden TGF-B1, TGF-B2 og TGF-B3, under kontroll av PH05 promoteren.
Eksempel 2A: konstruksjon av plasmid pJDB207R/ PH05- TGF- fi3
Plamsmid p31RJT 12 (europeisk patentsøknad EP 277.313) blir linearisert med restriksjonsendonuklease Sali. Delvis Hindm spaltning i nærvær av ethidiumbromid resulterer i et 1 kb Sall/Hindm fragment omfattende 276 bp Sall/BamHI pBR322 sekvensen, 534 bp promoteren til gjærsyrefosfatase PH05, gjærinvertase signalsekvensen (kodende for 19 aminosyrer) og PH05 transkripsjonen terminator. 1 kb Sall/HindHI fragment av p31RIT 12 blir klonet i gjær-E.coli skyttelvektoren pJDB207 (Beggs, J.D. i: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, s. 383-389), som var blitt spaltet med Sali og HindTfl. Det resulterende plasmidet inneholder 1 kb innskuddet blir referert til som pJDB207/PH05-RIT 12.
Eksempel 2B: konstruksjon av plasmid pJDB207R/ PH05- TGF-B3
Plasmid pGKM740 (TGF-B3) (se eksempel l.G) blir spaltet med Ncol. De klebrige endene blir ifylt i en reaksjon med Klenow DNA polymerase EcoRI linker (5'-CCGGAATTCCGG; Biolabs) blir tilsatt og blandingen ligert. Det resulterende sirkulære plasmidet blir referert til som pGKMA668 (TGF-B3) og spaltet med EcoRI og Sali. Et 0,4 kb EcoRI/Sall fragment blir isolert fra en agarosegel, renset og resuspendert i sterilt vann ved en konsentrasjon på 25 ug/ml. Fragmentet inneholder den modne kodende sekvensen til TGF-B3 med et ATG i ramme til kodon GCT som definerer aminosyren Alal av moden TGF-B3.
PH05 promoteren blir isolert fra p31RIT 12 (se ovenfor) på et 534 bp BamHI/EcoRI fragment. Plasmid pJDB207/PH05-RIT 12 blir spaltet med BamHI og Xhol. Det store 6,8 kb BamHI/XhoI fragmentet blir isolert. PH05 transkripsjonen terminator forblir på fragmentet. BamHI/EcoRI PH05 promoterfragmentet, EcoRI/Sall fragmentet kodende for TGF-B3 og BamHI/XhoI vektorfragmentet blir ligert. En korrekt klon med TGF-B3 genet under kontroll av PH05 promoteren klonet igjen mot klokkeretning orientering i pJDB207 blir referert til som pJDB207R/PH05-TGF-B3.
På analog måte blir moden TGF-B 1 og TGF-B2 uttrykt i S. cerevisiae. Plasmider inneholdende de kodende sekvensene til TGF-B 1 og TGF-B3 er pGKM125 og pGKM126 (se eksempel 1 .G). Etter spaltning av disse plasmidene med NcbL tilførsel av EcoRI linkere og ligering, blir de resulterende sirkulære plasmidene spaltet med EcoRI og Sali. EcoRI/Sall fragmentene blir klonet inn i pJDB207 som beskrevet ovenfor. De resulterende plasmidene blir referert til som pJDB207R/PH05-TGF-Bl og pJDB207R/PH05-TGF-B3.
Eksempel 2C: transformasjon av S. cerevisiae stamme GRF18
Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 ( MATct. his3- l 1. his3- 15. leu2- 3. Ieu2- 112. can<R> DSM 3665 ) blir transformert med plasmidene
pJDB207R/PH05-TGF-B 1
pJDB20tR/PH05-TGF-B2
pJDB207R/PH05-TGF-B3
ved anvendelse av transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen, A. et al. (1978) PNAS 75,1929. Transformerte gjærceller blir selektert på gjærminimalmedium skåler det som mangler leucin. Enkelt transformerte gjærkolonier blir isolert og referert til som Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-B 1
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-B2 og
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-B3.
Eksempel 2D: Fermentering av S. cerevisiae transformanter og preparering av celleekstrakter
Gjærtransformanter, som nevnt ovenfor, inneholder plasmider med PH05 promoter-kontrollerte ekspresjonskassetter og krever derfor derepresjon av promoteren for ekspresjon av TGF-B 1, TGF-B2 eller TGF-B3. Transformantene blir hver dyrket i to suksessive prekulturer (10 ml og 50 ml) i gjær høy ?\ minimalt medium dannet ifølge oppskriften til Difco gjærnitrogenbase uten aminosyrer, men som inneholder 10 g/l L-asparagin istedenfor (NH^SC^, 1 g/l L-histidin og 20 g/l glukose. Cellene til den andre forkulturen blir vasket i 0,9% NaCl og alle cellene blir anvendt for å inokulere 100 ml lav Pj minimalmedium dannet ifølge oppskriften til Difco Yeast Nitrogen Base medium (uten aminosyrer), men som inneholder 0,03 g/l KH2PO4,10 g/l L-asparagin, 1 g/l L-histidin og 20 g/l glukose. Kulturene blir agitert ved 30°C ved 180 rpm.
Cellene fra 10 ml kulturen blir samlet ved 5 t., 241. og 48 t. ved sentrifugering ved 30.000 rpm og vasket en gang i 0,9% NaCl. Cellepelleten blir resuspendert i lyseringsbuffer (66 mM kaliumfosfat pH 7,4,4 mM Zwittergent (Calbiochem)). 8 g av glasskulene (0,5-0,75 mm i diameter) blir tilsatt og suspensjonen ristet omfattende 4-5 ganger i 2 min. hver på en Vortex blander i kulde. Celleekstraktet blir dekantert for å fjerne glasskulene. Celledebris i ekstraktet blir sedimentert ved sentrifugering i 5 min. ved 30.000 rpm ved 4°C. Supernatanten og pelletene blir separert og lagret ved -20°C.
Eksempel 3
Eksempel 3A: isolering av ikke- oppløselige. monomere TGF- B3 fra E. coli
E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-fi3 celler blir fermentert som beskrevet i eksempel 1C. Celleoppbrudd og isolering av ikke-oppløselig TGF-B3 blir utført ved 4°C. Omtrent 18 g av våtcellene blir suspendert i 60 ml 0,1 M TRIS/HCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenyl Methan Sulphonyl Fluorid), pH 8,3 (oppbruddsbuffer). Cellene blir sendt to ganger gjennom en Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) ifølge forhandlerens instruksjoner og volumet blir brakt til 200 ml med oppbruddsbufferen. Suspensjonen blir sentrifugert i 20 min. ved 15.000 g. Pelleten som blir oppnådd blir suspendert i 100 ml oppbruddsbuffer inneholdende 1 M NaCl og sentrifugert i 10 min. som ovenfor. Pelleten blir suspendert i 100 ml oppbruddsbuffer inneholdende 1% Triton X-100 (Pierce) og på nytt sentrifugert i 10 min som ovenfor. Den vaskede pelleten blir deretter suspendert i 50 ml 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% DTT og homogenisert i en teflon vevs maler. Den resulterende suspensjonen inneholder rå monomerisk TGF-B3 i en ikke-oppløselig form.
Eksempel 3B: solubilisering og rensin<g> av monomerisk TGF- B3
10 ml av TGF-B suspensjonen oppnådd ifølge eksempel 3A blir surgjort med 10% eddiksyre til pH 2,5 og sentrifugert i en Eppendorf sentrifuge i 10 min. ved romtemperatur. Supernatanten blir kromatografert på en Sephacryl S-100 kolonne (Pharmacia, 2.6x78 cm) i 10% eddiksyre ved en strømningsrate på 1,4 ml/min.
(Alternativt kan kromatografi bli utført på Sephacryl S-100HR (Pharmacia) og kolonnen kan bli kjørt i 1% eddiksyre eller 5 mM HC1). Fraksjoner inneholdende monomerisk, denaturert TGF-B3 som eluerer mellom 190 min. og 220 min. blir slått sammen. Dette materialet blir anvendt for folding for å oppnå biologisk aktiv, dimerisk TGF-B3 (eksempel 4) eller for ytterligere rensning og strukturell analysering (eksempel 3D).
Eksempel 3C: isolering av monomere TGF-13 3 fra Saccharomyces cerevisiae Pelleten av oppbrutte celler oppnådd fra en 500 ml fermentasjon utført som beskrevet ovenfor blir suspendert i 20 ml 4M urea, 0,1 M TRIS, 1% DTT, pH 8.0. Blandingen blir oppbevart ved romtemperatur i 30 minutter med vortexing hvert 5. minutt. Uoppløselig materiale blir fjernet ved sentrifugering ved 30.000 g i 30 minutter ved 4°C og supernatanten justert til pH 2,5 med eddiksyre og omfattende dialysert mot 5% eddiksyre over natt ved 4°C. Oppløsningen blir sentrifugert som ovenfor og den klare supernatanten blir konsentrert ved ultrafiltrering på en YM 10 membram (Amicon) til et sluttvolum på 4 ml. Prøven blir deretter kromatografert på Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) i 5% eddiksyre som beskrevet i eksempel 3.B: for tilveiebringing av monomerisk TGF-133.
Eksempel 3D: ytterligere rensning av monomere TGF-B 3 ved RP- HPLC
Alikvoter av de sammenslåtte fraksjonene fra Sephacryl S-100 kolonne (eksempel 3.B) blir renset på en Vydac 214TP5415 HPLC revers fase kolonne (4,6 x 150 mm, The Separations Group, Hesperia, CA, USA). Kolonnen blir ekvilibrert i en blanding av 70% TFA 0,1% i vann og 30% TFA 0,08% i acetonitril, og produktet blir eluert i en lineær gradient over 30 min. som slutter med en blanding av 55% TFA 0,1% i vann og 45% TFA 0,08% i acetonitril ved en strømningsrate på 1 ml/min. Eluatet blir registrert for absorbanse ved 216 nm og individuelle topper blir samlet manuelt ifølge UV absorbansen. Denaturert, monomerisk TGF-JJ3 blir eluert ved 21,5 min. Avhengig av den individuelle revers fase kolonnen anvendt for separeringen blir det samme preparatet av TGF-B3 eluert rundt henholdsvis 16 min. og 18 min.
TGF-B3 fraksjonene analysert ved RP-HPLC ved anvendelse av samme kolonne og oppløsningsmiddelsystem som ovenfor. TGF-B3 blir eluert ved en lineær gradient over 42 min. begynnende fra 100% TFA 0,1% i vann og som blir avsluttet med en behandling av 30% TFA i vann og 70% TFA 0,08% i acetonitril. TGF-B3 blir eluert som en enkelt topp etter 30,4 min. Avhengig av den individuelle kolonnen anvendt blir retensjonstider på henholdsvis 29 min. og 29,9 min. oppnådd.
Eksempel 3E: analysering av monomerisk TGF- B3 ved SDS- PAGE
Individuelle alikvoter av Sephacryl S-100 kolonnen (eksempel 3.B) eller revers fase kolonne (eksempel 3.D) blir tørket i vakuum og analysert ved SDS-PAGE på 15% polyakrylamid slab geler farvet med coomassie blå R-250. Et enkelt bånd med hensiktsmessig molekylmasse på omtrent 12.000 Da blir oppnådd og kan ikke sjeines fra redusert naturlig grise TGF-133.
Eksempel 3F: N- terminal aminosyresekvens bestemmelse av monomerisk TGF-B3 TGF-B3 fra eksempel 3.B blir avdampet i vakuum, oppløst i 25 ul 0,1 M eddiksyre og utsatt for aminosyresekvens bestemmelse på en gassfase protein sekvenatormodell 470A (Applied Biosystems).
Den N-terminale aminosyresekvensen er identisk med den som er vist i sekvenslisten under SEQ ID NO: 6: Eksempel 4: In vitro folding av TGF- B3 i dimetvlsulfoksid ( DMSO) inneholdende buffer
TGF-B3 oppnådd som beskrevet ovenfor blir foldet ved 4°C i en buffer bestående av 0,IM tris, 1 M NaCl, 0,5 M argjnin, 5 mM redusert glutation og 40% (v/v) DMSO. pH til bufferen blir justert til pH 9,5 med NaOH. Sluttkonsentrasjonen av TGF-B3 er 0,1 mg/ml. Etter 7 dager ved 4°C blir oppløsningen surgjort med konsentrert eddiksyre til pH 3,5, konsentrert omtrent 10 ganger ved ultrafiltrering i en Amicon omrørt celle med YM 10 membran (Amicon). Den konsentrerte oppløsningen blir fortynnet til det opprinnelige volumet med 0,1 M eddiksyre og rekonsentrert. Denne prosedyren blir gjentatt to ganger. Oppløsningen blir deretter utsatt for ionebyttekromatografi som beskrevet nedenfor.
Eksempel 5: in vitro folding av TGF-B 3 i dimetvlformamid ( DMF) inneholdende buffer TGF-B3 oppnådd som beskrevet ovenfor blir foldet ved 4°C i en buffer bestående av 0,1M tris, IM NaCl, 0,5 M arginin, 5 mM redusert glutation og 30% (v/v) DMF. pH-bufferen blir justert til pH 8,5. Sluttkonsentrasjonen av TGF-B3 er 0,1 mg/ml. Etter 7 dager ved 4°C blir oppløsningen surgjort med konsentrert eddiksyre til pH 3,5, konsentrert omtrent 10 ganger ved ultrafiltrering i en Amicon omrørt celle med YM 10 membran (Amicon). Den konsentrerte oppløsningen blir fortynnet til opprinnelig volum med 0,1 M eddiksyre og på ny konsentrert. Denne prosedyren blir gjentatt to ganger. Oppløsningen blir deretter utsatt for ionebyttekromatografi som beskrevet nedenfor. Eksempel 6: isolering av dimerisk biologisk aktiv TGF-B 3 ved kationbvtte kromatografi Oppløsninger oppnådd i eksempel 4 eller eksempel 5, inneholdende mellom omtrent 10 og 50 mg TGF-B3 blir applisert med 6 ml/min på en HiLoad 26/10 S-Septiarose High Performance column (Pharmacia). Kolonnen blir først vasket med 20 mM natriumacetat, 30% isopropylalkohol, pH 4,0 (buffer A) i 5 minutter og deretter eluert med en lineær gradient over 45 min. begynnende med buffer A inneholdende 0,2 M NaCl og avsluttende med buffer A inneholdende 0,5 M NaCl. Eluatet blir registrert ved 280 nm og manulert fraksjonert. Fraksjonene blir undersøkt for dimerisk TGF-B3 ved ikke-reduserende SDS-PAGE og for biologisk aktivitet ved in vitro bioanalyse.
Eksempel 7: ytterligere rensing og karakterisering av dimerisk TGF-B3
Eksempel 7A: rensing ved RP- HPLC
Fraksjoner inneholdende dimerisk biologisk aktiv TGF-B3 blir slått sammen, dialysert mot en 0,1 M eddiksyre eller fortynnet med samme volum 0,1% TFA i vann og utsatt for RP-HPLC på en Vydac 214TP510 kolonne (lem x 25 cm, The Separations Gruop, USA). Kolonnen blir ekvilibrert ved en strømningsrate på 4,5 ml/min. med en blanding av 75% oppløsningsmiddel A (TFA 0,1% i vann) og 25% oppløsningsmiddel B (TFA 0,08% i acetonitril). Etter applisering av prøven blir kolonnen vasket under likevektsbetingelser helt til absorpsjonen registrert ved 235 nm har nådd grunnlinje nivå. Kolonnen blir deretter eluert i løpet av 30 min. med en lineær gradient begynnende ved likevektsbetingelser og som avsluttes med en blanding av 45% oppløsningsmiddel A og 55% oppløsningsmiddel B. Eluatet blir fraksjonert manuelt og analysert ved ikke-reduserende SDS-PAGE og ved in vitro bioanalyse.
Eksempel 7B: analysering ved SDS- PAGE
Alikvoter av renset TGF-B ifølge eksempel 7A blir tørket i vakuum og analysert ved SDS-PAGE (Laemlli, U.K. (1970) Nature 227, 680) på 15% polyakrylamid slab geler farvet med coomassie blå R-250. Uredusert prøve utviser et enkelt bånd med tilsynelatende molekylmasse på rundt 25 kDa, mens den reduserte prøven viser et bånd ved omtrent 12,5 kDa.
Eksempel 7C: molekylær massebestcmmclse
Renset TGF-83 fra eksempel 7A blir analysert ved elektrospray ioniseringsmasse spektrometri (ESI-MS). Den totale massen som blir funnet er meget nære opp til den teoretiske ventede verdien.
Eksempel 7D: aminosvreanalvse
Aminosyreanalyse ble utført som beskrevet i Knecht, R. og Chang, J.-X., Analytical Chemistry 58:2375-2379 (1986). Resultatene er i samsvar med teorien.
Eksempel 7E: N- terminal aminosyresekvens bestemmelse
10-20 ug TGF-133 ifølge eksempel 7A blir avdampet i vakuum, løst opp i 25 ul 10 mM eddiksyre og utsatt for aminosyresekvensbestemmelse på en gassfase sekvensmodell 477A (Applied Biosystems). Aminosyresekvensen til de første 10 residiene som er blitt bestemt var som ventet utfra teorien.
Eksempel 7F: <p>roteol<y>tisk fragmentering med Asp- N <p>rotease
92 ug (6,7 nmol) TGF-B3 blir redusert, 4-vinylpyridyletylert, tørket i en vakuum sentrifuge og på ny oppløst i 200 ul 5 mM HC1. 200 ul 0,2 M tris-acetat buffer, pH 7,8, inneholdende 10 mM Zwittergent 3-12 detergent (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA) blir tilsatt og blandet med protein oppløsningen. Spaltningen blir utført med 2 ug (oppløst i 50 ul vann) endoproteinase Asp-N (fra Pseudomonas fragi mutant, Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG) ved 37°C. Etter 13 timer blir 50 \ i\ 10% (v/v) TFA tilsatt og blandingen separert ved RP-HPLC på en Vydaz 218TP5415 kolonne (4,6 mm x 150 mm, The Separations Gruop) med en lineær gradient bestående av 5 til 45% (v/v) acetonitril i 0,1% TF A/vann i 40 min. ved en strømningsrate på 0,1 ml/min. Isolerte peptider blir analysert ved elektrospray ioniseringsmasse spektrometri, ESI-MS. Molekylærmassene som er blitt bestemt er i samsvar med de beregnede verdiene for ventede Asp-N fragmenter.
Fragmentene identifisert dekker den fullstendige aminosyresekvensen med unntagelse av residiene l og 2. Disse aminosyrene blir identifisert ved N-terminal sekvénsbestemmelse av hele proteinet og ved analysering av V8 fragmentene.
Eksempel 7G: <p>roteolytisk fragmentering med V8 protease
I likhet med eksempel 11 med Asp-N blir protease 4-vinylpyridylert TGF-B3 spaltet med protease V8 og fragmentene separert ved RP-HPLC og analysert ved ESI-MS. Molekylær massene som blir bestemte er i samsvar med de teoretiske verdiene som videre tilveiebringer identiteten til TGF-133. Fragmentene som er blitt identifisert dekker hele sekvensen av 112 aminosyreresidier.
Eksempel 8: in vitro aktivitetestest for foldet TGF- B: minklunge epitelcelle ( Mv- l- Lul sur fosfatase analyse
TGF-B eller hybridprotein blir screenet in vitro i en cellulær bioanalyse som måler potensen av forbindelsen for inhibering av veksten av en kontinuerlig minklunge epitelcellelinje Mv-l-Lu (ATCC/CCL64). Mv-l-Lu cellelinjen har vist seg å være en sensitiv reporter i bioanalysen for TGF-B, og utviser en sigmoid-formet konsentrasjonsrespons med en rapportert EC50 på omtrent 10-50pg/ml (Tucker, et al., Science 1984; 226: 705-707; Absher et al., J Immunol Methods 1991; 138: 301-303; Danielpour et al., J Cell Physiol 1989; 138: 79-86). Mv-l-Lu cellene, hvor proliferasjonen derav er sterkt inhibert av TGF-B, blir for tiden betraktet som den cellelinjen som er mest egnet for utvikling av en analytisk bioanalyse for dette cytokinet (Kelley et al., Exp LungRes 1992; 18: 877-887; Meager J. Immunol Methods 1991; 141: 1-14). Analysen blir utført i 96-brønn mikrotiterskåler ved anvendelse av celler som opprinnelig ble oppnådd, ved føring 46, fra American Type Culture Collection, Rockville MD, USA. Cellene blir sådd ut ved lav tetthet (50.000 celler pr brønn) i vekstmedium (minimalt essensielt medium med 5% v/v føtalt kalveserum) inneholdende seriefortynninger av en TGF-B standard eller prøve. Analysene blir deretter inkubert ved 37°C i en fukt 5% CO2 inkubator i 72 timer. Inhibisjon av celleproliferasjonen blir bestemt ifølge en sensitiv enzymatisk celle farvemetode (som gir en kolorimetrisk vurdering av mengden av sur fosfatase som blir produsert i hver brønn). I det intensiteten til farvingen tilsvarer antall celler som er tilstede i hver brønn. Absorbanse O.D. til hver brønn blir bestemt ved 405 nm og analysedata blir plottet og analysert ved hjelp av en egnet PC programvare. I denne analysen blir en enhet (U) aktivitet beskrevet som mengden av TGF-B som er nødvendig for halv-maksimal inhibisjon av Mv-l-Lu celleproliferasjonen.
Eksempel 9: in vivo aktivitetstester for foldet TGF-B3
Eksempel 9A: le<g>ine av mellom- tykkelsessår hos gamle mus
Det er kjent at prosesser for sårleging blir dårligere i høyere alder (Grove, G.L. (1982)
Arch. Dermatol. Res. 272:381) og representerer følgelig hovedproblemer innen området geriatrisk medisin. Derfor blir in vivo biologiske effekter av foldet aktiv dimerisk TGF-B3 for leging av mellom-tykkelsessår (dannet etter annen grads forbrenning) undersøkt i en delvis mangelfull eller redusert sårlegingssituasjon, dvs. hos gamle dyr ved anvendelse av følgende protokoll som ligner den som er beskrevet av Schultz, G.S. et al.
(1987) Science 235:350.
Enkelt middermale termiske skader blir dannet på dosal thorax i bedøvde gamle C57/BL6 mus (alder fra 450 dager eller mer), hvor ryggene tidligere er blitt barbert og behandlet med en kommersiell krem-type hårfjerner med en enkel 10 sekunder lang applikasjon av en messingtemplat (lxl cm, 8 gm) som er blitt ekvilibrert ved 80°C i et vannbad. Den resulterende blæren blir kirurgisk fjernet og brannsårene behandlet daglig i 5 dager med en topisk applikasjon av 25 ul steril bærer bufferoppløsning (bestående av 0,8% w/v hydroksypropyl cellulose i en oppløsning av 10 mM histidin, 140 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (500ng, 100ng eller 10ng) foldet aktiv dimerisk TGF-B3, eller med bare bufferoppløsning, eller blir latt være ubehandlet. Alle topiske påførte materialer er sterile, endotoksin-frie og pyrogen-frie, og alle musene blir individuelt huset i løpet av eksperimentet. Hver eksperimentelle gruppe består av 5 dyr.
Etter 5 dagers behandling med TGF-B3 blir musene bedøvd, blærene (om tilstede) blir fjernet kirurgisk fra brannsårene og brannsårene blir tatt bilde av. Områder av brannsårene som har regenerert epithel blir overført på transparent overhead film og prosentandel av hvert opprinnelige brannområde som er blitt leget blir beregnet ved planimetri. Resultatene er også sammenlignet med epithelial regenerasjonsprosessen i unge (56-84 dager gamle) C57/BL6 mus med identiske middermale brannsår som blir latt være ubehandlet i løpet av eksperimentet.
Resultatene av planimetriske analyser demonstrerte at topisk applikasjon av foldet aktiv dimerisk TGF-B3 daglig i 5 dager i en egnet bærerbuffer stimulerer og aksellererer epithelisk regenerering i del-tykkelsessår på eldre mus på en doseavhengig måte sammenlignet med bare bærerbuffer eller ubehandlede sår. Unge mus er sannsynligvis nok kompetente til vellykket re-epithelialisering av deres sår i fravær av topisk påført TGF-B3. Histologiske analyser viser grad av den forsterkede re-epithelialiseringsprosessen sammen med en hyperkeratose av regenerert epidermis på dag 6 i TGF-133 behandlede sår.
Eksempel 9B: leging av full- tykkelsessår hos voksne rotter
De biologiske effektene av foldet aktiv dimerisk TGF-63 blir også undersøkt i en andre in vivo modell av sårreparering, dvs. ved leging av full-tykkelsessår (dannet ved kirurgisk innsnitt) hos voksne rotter ved anvendelse av følgende protokoll som ligner den som er beskrevet av Mustoe, T.A. et al. (1987) Science: 237:1333.
Enkel, fulltykkelse 5 cm lange lineære innsnitt blir dannet med kirurigiske sakser 1,5 cm på begge sidene av dosal midtlinjen til pentobarbiton bedøvde hann Wistar rotter (300-350 g) hvor ryggene på forhånd er blitt barbert og behandlet med en kommersiell krem-type hårfjerner. I de eksperimentelle gruppene mottar kantene på venstre side av innsnittene (sett med dorsal side øverst) mottar enkelt topiske applikasjoner (100 ul) av en steril bærerbuffer (bestående av 0,8% w/v hydroksypropyl cellulose i en oppløsning av 10 mM histidin, 140 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (2 ug, 1 ug, 0,1 ug eller 0,01 ug) av en foldet aktiv dimerisk TGF-63. Kantene til de kontralaterale høyreside innsnittene mottar tilsvarende like mengder av en placebokontroll (bovin serumalbumin) i nevnte bærerbuffer og kanter av innsnittene i kontrolldyr mottar bare bærerbuffer i venstre side innsnittene og ingen behandling i høyre side innsnittene etter kirurgiske innsnitt. Alle topiske anvendte materialer er sterile, endotoksin-frie og pyrogen-frie. Kantene til hvert sår blir deretter belagt med 5 jevnt plasserte, avbrutte horisontale mattress sting av 5-0 Ethilon. Alle dyrene blir huset separat og sårene blir leget i varierende perioder opp til og inkludert 21 dager etter behandling. Etter avliving blir hele den dorsale huden fjernet fra hvert dyr og alt subkutant fett blir forsiktig dissektert fra undersiden av hver av hudene ved anvendelse av en kirurgisk skalpell. En templat bestående av to parallelle kirurgiske blader (8 mm avstand mellom bladene) blir deretter anvendt for å fjerne hudstrimler (mellom stingene på hver innsnitt) for strekkfasthet målinger. Prøver blir tatt fra den ene enden av hvert innsnitt for histologisk analysering. Den maksimale belastningen som blir tolerert av hver fjernede hudprøve blir målt med en Universal Tensile Strength Machine Model 144501 (Zwick, Ulm, FRG). Målingene blir dannet på 30mm x 8mm strimler som er forsikret mellom hydrauliske klyper og deretter strukket til bristepunktet i en rate på 10 mm pr minutt i det den maksimale belastningen er blitt registrert på en kartregistrator. Målingene blir utført på triplikate prøver fra hvert sår og eksperimentelle grupper besto av 4 dyr. Bruddstyrken blir ikke målt på sår som viser tegn til infeksjon eller omfattende haemorrage (mindre enn 3% av alle sårene).
Resultatene av strekkfasthetsmålingene demonstrerte at en enkelt topisk applikasjon av foldet aktiv dimerisk TGF-63 i en egnet bærerbuffer forsterker bruddstyrken opp til to ganger og aksellererer legingen av full-tykkelse innsnittssår i voksne rotter på en doseavhengig måte over en 21 dager lang tidsperiode når sammenlignet mot kontrollgruppen. Istologiske analyser viser den markerte økningsinfluks av mononukleære celler, fibroblaster og kollagen produksjon i TGF-B3 behandlede sår over 21 dagers periode sammenlignet med kontrollsårene. En forbigående hyperkeratose er også tilstede i TGF-B3 behandlede sår opp til 14 dager etter behandlingen.
Eksempel 10: preparering av solubiliserte monomeriske hybrid TGF- B proteiner
5 ml plasmid pPMLu blir linearisert ved spaltning med Ncol og Sali og gelrenset som beskrevet ovenfor for fragment DNA. lOOng av linearisert og renset pPLMu vektor DNA og 3x av den molare ekvivalenten av det respektive rensede fragment DNA kodende for hybrid TGF-B 1-3, TGF-B2-3 og TGF-B3-2, vist i sekvenslisten blir inkubert ved 4°C i 15 timer i 20 ml ligeringsbuffer (70 mM TRIS-HCl, pH 7,5,10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM adenosin-trifosfat) inneholdende 1 enhet DNA ligase (Boehringer). 10 ml av ligeringsblandingen blir tilsatt til 200 ml kald (4°C) kompetente E. coli LC137 celler inneholdende plasmid pcl857. Etter 30 min. blir cellene varmesjokkbehandlet ved inkubasjon i 1,5 min. i et 42°C vannbad. 2 ml LB medium blir tilsatt og kulturer ristet i 60 min. ved 30°C. 200 ml alikvoter blir utsått på LB skåler inneholdende ampicillin og kanamycin og inkubert i 22 timer ved 30°C. Enkelt kolonier blir dyrket og plasmid DNA analysert. Subkloning av DNA fragmenter kodende for TGF-B 1-3, TGF-B2-3 og TGF-63-2 i pPLMu resulterte i plasmidene pPLMu. TGF-B1 (44/45)63, pPLMu. TGF-B2(44/45)B3 og pPLMu.TGF-63(44/45)62. Kloner inneholdende ovennevnte konstruksjoner blir referert til som henholdsvis E. coliC137/pPLMu.TGF-fl 1(44/45)63, E. coliC137/pPLMu.TGF-B2(44/45)63 ogE. coliC137/pPLMu.TGF-B3(44/45)62.
E. coliC137/pPLMu.TGF-61(44/45)63, E. coliC137/pPLMu.TGF-62(44/45)63 ogE. coliC137/pPLMu.TGF-63(44/45)62 blir varmeindusert som følger (se også eksempel 3. A) og uttrykte proteiner blir analysert ved SDS-PAGE. TGF-61-3, TGF-62-3 og TGF-63-2 og alle fremkommer som varmeinduserte proteiner 2 timer etter varmeinduksjonsmigrering uten en tilsynelatende molekylmasse på omtrent 12.000 Da. Over natt kulturer av E. coliCl37/pPLMu.TGF-Bl(44/45)B3, E. cohC137/pPLMu.TGF-B2(44/45)B3 og E. coliC137/pPLMu.TGF-B3(44/45)B2 i 21 Erlenmeyerflasker inneholdende 750 ml LB medium med 40 mg/l Ampicillin og Kanamycin blir dyrket ved 30°C. 300 ml over natt kulturer blir tilsatt til 750 ml LB medium inneholdende antibiotika som nevnt ovenfor i 21 Erlenmeyerflasker og oppvarmet til 42°C ved risting i omtrent 3,5 min. i et 65C vannbad. Flaskene blir deretter overført til en 42°C risteinnretning og inkubert i 3 timer. Flaskene blir nedkjølt til 12°C i et isvannbad og cellene samlet etter sentrifugering i 10 min. ved 8000 rpm i en GSA rotor (Sorvall).
Prosedyrene angitt nedenfor for produksjon av monomerisk solubilisert TGF-B 1-3 hybrid eller også for solubilisering av TGF-B2-3 og TGF-B3-2.
E. coliC137/pPLMu.TGF-Bl(44/45)B3 cellene blir fermentert som beskrevet ovenfor og inklusjonslegemer blir dannet som følger. Celleødeleggelse og isolering av inklusjonslegemene blir utført ved 4°C. Omtrent 18 g fuktige celler blir suspendert i 60 ml 0,1 M TRIS/HC1, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenyl Methan Sulphonyl Fluorid), pH 8,3 (oppbrytningsbuffer). Cellene blir sendt to ganger gjennom en Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) ifølge forhandlerens instruksjoner og volumet blir brakt til 200 ml med oppbrytningsbufferen. Suspensjonen blir sentrifugert i 20 min. ved 15000 g. Pelleten som blir oppnådd blir suspendert i 100 ml oppbrytningsbuffer inneholdende 1 M NaCl og sentrifugert i 10 min. som ovenfor. Pelleten blir suspendert i 100 ml oppbrytningsbuffer inneholdende 1% Triton X-100 (Pierce) og sentrifugert på ny i 10 min. som ovenfor. 0,3 g av den vaskede pelleten blir deretter suspendert i 10 ml 20 mM tris/HCl, 1 mM EDTA, 2 mM PMSF, 0,1% DTT, pH 8,0 og omrørt med en magnetisk rører i 1 time ved romtemperatur. Prøven blir deretter brakt til pH 2,5 med konsentrert eddiksyre og homogenisert i en vevshomogenisator av teflon og sentrifugert i en Centricon H-401 sentrifuge (Kontron instrumenter) med en fiksert vinkel rotor A.8.24 i 60 min., ved 15°C og 12.000 rpm. Eddiksyren til den klare supernatanten blir byttet med 10 mM HCI i en Amicon 8010 omrørt celle med YM05 filter ved gjentatt konsentrasjon og fortynning av oppløsningen med 10 mM HCI.
Eksempel 11: serier av refoldingseksperimenter med forskjellige TGF-B oe TGF-B-h<y>brider
Allsidigheten og den brede anvendbarhet av oppfinnelsen blir eksemplifisert ved resultatene oppsummert i følgende serier av eksempler. De spesifikke betingelsene og de individuelle proteinene anvendt i in vitro protein refoldingseksperimentene er oppført. Andre eksperimentelle betingelser er som beskrevet i eksempel 4. Biologisk aktivitet ble bestemt 3 og 7 dager etter begynnende in vitro proteinfolding.
Id vitro folding i organisk oppløsningsmiddel uten detergent:
Deponering av mikroorganismer
Følgende mikroorganismer ble deponert til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascherider Weg lb, D-3300 Braunschweig (FRG):
Claims (14)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av dimerisk, biologisk aktiv transformerende vekstfaktor type fl (TGF-B)-lignende protein, karakterisert ved å behandle den denaturerte monomeriske formen av nevnte TGF-B-lignende protein med en detergent-fri buffer som omfatter et organisk oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av DMSO, DMF og en hvilken som helst blanding derav, i en konsentrasjon på omtrent 10 til omtrent 50%, der bufferen i tillegg inneholder en reduserende forbindelse og der bufferen har en pH mellom ca. 7 og 10.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet anvendes i en konsentrasjon på omtrent 20 til omtrent 50%.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet anvendes i en konsentrasjon på omtrent 30 til omtrent 50%.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet anvendes i en konsentrasjon på omtrent 30 til omtrent 40%.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet anvendes i en konsentrasjon på omtrent 40%.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det TGF-B-lignende proteinet velges fra gruppen bestående av TGF-B1, TGF-B2, TGF-B3, heterodimerisk TGF-B, fragmenter og mutanter av et TGF-B inkludert hybridmolekyler hvor deler av forskjellige TGF-B blir utvekslet, BMP, inhibiner og aktiviner.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at TGF-B-lignende protein velges fra gruppen bestående av TGF-B2, TGF-B3. hybrid TGF-Bl-2, hybrid TGF-81-3, hybrid TGF-B2-3, hybrid TGF-B3-2 og BMP-2.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at TGF-B-lignende protein er TGF-B3.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen har en temperatur på omtrent 0°C til omtrent 40°C.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den reduserende forbindelsen er en redusert sulfhydrylforbindelse.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen velges fra gruppen bestående av glutation i dets reduserte form, B-merkaptoetanol i dets reduserte form, merkaptometanol i dets reduserte form, cystein, cystamin og ditiotreitol i dets reduserte form.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen anvendes i en konsentrasjon på omtrent 1 til 100 mM.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen anvendes i en konsentrasjon på omtrent 1 til 10 mM.
14.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen anvendes i en konsentrasjon på omtrent 2,5 mM.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94810439 | 1994-07-25 | ||
| PCT/EP1995/002719 WO1996003433A1 (en) | 1994-07-25 | 1995-07-12 | New process for the production of biologically active protein |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO970326L NO970326L (no) | 1997-01-24 |
| NO970326D0 NO970326D0 (no) | 1997-01-24 |
| NO317730B1 true NO317730B1 (no) | 2004-12-13 |
Family
ID=8218293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19970326A NO317730B1 (no) | 1994-07-25 | 1997-01-24 | Fremgangsmate for fremstilling av dimerisk, biologisk aktivt TGF-beta-lignende protein |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7057016B2 (no) |
| EP (1) | EP0779896B1 (no) |
| JP (2) | JPH11505404A (no) |
| KR (1) | KR100394532B1 (no) |
| AT (1) | ATE207934T1 (no) |
| AU (1) | AU699879B2 (no) |
| CA (1) | CA2194578A1 (no) |
| DE (1) | DE69523611T2 (no) |
| DK (1) | DK0779896T3 (no) |
| ES (1) | ES2166402T3 (no) |
| FI (1) | FI118385B (no) |
| HU (1) | HU222829B1 (no) |
| IL (1) | IL114702A (no) |
| NO (1) | NO317730B1 (no) |
| NZ (1) | NZ290374A (no) |
| PT (1) | PT779896E (no) |
| TW (1) | TW517059B (no) |
| WO (1) | WO1996003433A1 (no) |
| ZA (1) | ZA956139B (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6084076A (en) * | 1995-12-21 | 2000-07-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of refolding human activin A |
| DE10026713A1 (de) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Walter Sebald | Mutein einer Kette eines Proteins aus der Superfamilie des Wachstumsfaktors TGF-beta |
| US20030134292A1 (en) * | 2001-10-30 | 2003-07-17 | Farchaus Joseph W. | Thermostable DNA polymerases and methods of making same |
| FR2871061B1 (fr) * | 2004-06-04 | 2007-08-10 | Coletica Sa | Principe actif capable d'induire la transformation du tgbf- latent inactif en tgfb actif |
| US7572474B2 (en) | 2005-06-01 | 2009-08-11 | Mead Johnson Nutrition Company | Method for simulating the functional attributes of human milk oligosaccharides in formula-fed infants |
| US8075934B2 (en) * | 2008-10-24 | 2011-12-13 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional composition with improved digestibility |
| WO2007033180A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Abela Pharmaceuticals, Inc. | Materials for facilitating administration of dimethyl sulfoxide (dmso) and related compounds |
| US8480797B2 (en) | 2005-09-12 | 2013-07-09 | Abela Pharmaceuticals, Inc. | Activated carbon systems for facilitating use of dimethyl sulfoxide (DMSO) by removal of same, related compounds, or associated odors |
| EP1966229B1 (en) | 2005-09-12 | 2015-10-21 | Abela Pharmaceuticals, Inc. | Systems for removing dimethyl sulfoxide (dmso) or related compounds, or odors associated with same |
| US9427419B2 (en) | 2005-09-12 | 2016-08-30 | Abela Pharmaceuticals, Inc. | Compositions comprising dimethyl sulfoxide (DMSO) |
| GB0604966D0 (en) * | 2006-03-11 | 2006-04-19 | Renovo Ltd | Medicaments and proteins |
| US8986769B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-03-24 | Mead Johnson Nutrition Company | Methods for preserving endogenous TGF-β |
| BRPI0921494A2 (pt) | 2008-11-03 | 2018-10-30 | Prad Reasearch And Development Ltd | método de planejamento de uma operação de amostragem para uma formação subterrãnea, método de contolar uma operação de amostragem de formação subterrânea, método de controlar uma operação de perfuração para uma formação subterrãnea, e método de realizar uma amostragem durante a operação de perfuração. |
| US9855212B2 (en) | 2009-10-30 | 2018-01-02 | Abela Pharmaceuticals, Inc. | Dimethyl sulfoxide (DMSO) or DMSO and methylsulfonylmethane (MSM) formulations to treat infectious diseases |
| US10647777B2 (en) * | 2014-05-28 | 2020-05-12 | Genzyme Corporation | Methods of controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions |
| JP2016183118A (ja) * | 2015-03-25 | 2016-10-20 | 東ソー株式会社 | 増殖因子前駆体のリフォールディング方法 |
| WO2018122794A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Biogend Therapeutics Co., Ltd. | Recombinant polypeptides and nucleic acid molecules, compositions, and methods of making and uses thereof |
| CA3232809A1 (en) * | 2021-10-11 | 2023-04-20 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Engineered tgf-beta monomers and methods of use |
| GB2616476A (en) * | 2022-03-11 | 2023-09-13 | Multus Biotechnology Ltd | Recombinant transforming growth factor beta 3 in yeast |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0051985B2 (en) * | 1980-11-07 | 1989-12-27 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology (Icp) | Immunoassay of proteins |
| GR79124B (no) | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| US4620948A (en) | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| DE3587022T2 (de) | 1984-02-17 | 1993-06-17 | Genentech Inc | Menschlicher transformationswachstumsfaktor und vorlaeufer oder fragment hiervon, zellen, dna, vektoren und verfahren zu ihrer herstellung, zusammensetzungen und produkte, die diese enthalten, sowie davon abgeleitete antikoerper und diagnostizierverfahren. |
| US4572798A (en) | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| US4731440A (en) | 1985-02-22 | 1988-03-15 | Monsanto Company | Method of somatotropin solubilization using dimethylsulfone and naturation |
| IL78197A (en) | 1985-03-22 | 1991-07-18 | Genentech Inc | Nucleic acid encoding tgf-beta and its uses |
| GB8508340D0 (en) | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
| EP0208539A3 (en) | 1985-07-11 | 1988-08-03 | Repligen Corporation | Folding disulfide-cross-linkable proteins |
| US5453363A (en) | 1985-10-23 | 1995-09-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes |
| JPH0759598B2 (ja) * | 1986-02-14 | 1995-06-28 | 藤沢薬品工業株式会社 | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 |
| NZ222168A (en) | 1986-10-20 | 1991-05-28 | Oncogene Science Inc | Tumour growth inhibiting protein related to tgf-#b#1 and tgf-#b#2, preparation by genetic engineering methods, antibodies and pharmaceutical compositions |
| EP0268561A3 (en) | 1986-11-17 | 1988-10-26 | Sandoz Ag | Production and use of a novel t-cell suppressor factor |
| FI100106B (fi) | 1986-12-05 | 1997-09-30 | Novartis Ag | Menetelmä plasminogeenin yksisäikeisen yhdistelmäaktivaattorin valmist amiseksi |
| US4931548A (en) | 1987-01-30 | 1990-06-05 | Techne Corporation | Heterodimer form of transforming growth factor-beta |
| IL86090A (en) | 1987-04-16 | 1993-03-15 | Cetus Oncology Corp | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| US5162507A (en) | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| ATE156491T1 (de) | 1987-05-11 | 1997-08-15 | Chiron Corp | Prozess zur gewinnung von gereinigtem, oxidiertem, renaturiertem, rekombinantem interleukin-2 aus mikroorganismen |
| EP0293785A3 (en) * | 1987-05-29 | 1990-05-02 | Oncogen Limited Partnership | Cloning and expression of simian transforming growth factor-ss1 |
| US4985544A (en) | 1987-08-04 | 1991-01-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for renaturing fish growth hormone |
| US5061786A (en) * | 1989-05-25 | 1991-10-29 | Genentech, Inc. | Biologically active polypeptides based on transforming growth factor-β |
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| US5843463A (en) * | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
| US5144006A (en) * | 1991-06-13 | 1992-09-01 | The Rockefeller University | Oxidative folding of peptide and protein substrates using hydrocarbon sulfoxides |
| AU2738392A (en) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Ciba-Geigy Ag | Novel hybrid transforming growth factors |
| US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| TW440566B (en) * | 1994-07-25 | 2001-06-16 | Novartis Ag | Novel process for the production of biologically active dimeric protein |
-
1995
- 1995-07-11 TW TW084107189A patent/TW517059B/zh not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 DE DE69523611T patent/DE69523611T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 WO PCT/EP1995/002719 patent/WO1996003433A1/en active IP Right Grant
- 1995-07-12 HU HU9700211A patent/HU222829B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 PT PT95926858T patent/PT779896E/pt unknown
- 1995-07-12 JP JP8505401A patent/JPH11505404A/ja not_active Withdrawn
- 1995-07-12 NZ NZ290374A patent/NZ290374A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 DK DK95926858T patent/DK0779896T3/da active
- 1995-07-12 EP EP95926858A patent/EP0779896B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 AT AT95926858T patent/ATE207934T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 AU AU31096/95A patent/AU699879B2/en not_active Ceased
- 1995-07-12 ES ES95926858T patent/ES2166402T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-12 KR KR1019970700477A patent/KR100394532B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 CA CA002194578A patent/CA2194578A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-24 ZA ZA956139A patent/ZA956139B/xx unknown
- 1995-07-24 IL IL11470295A patent/IL114702A/xx not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-01-22 FI FI970258A patent/FI118385B/fi active IP Right Grant
- 1997-01-24 NO NO19970326A patent/NO317730B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-20 US US09/813,271 patent/US7057016B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-11-09 JP JP2006304238A patent/JP4354980B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2007082554A (ja) | 2007-04-05 |
| DE69523611D1 (de) | 2001-12-06 |
| IL114702A0 (en) | 1995-11-27 |
| TW517059B (en) | 2003-01-11 |
| ZA956139B (en) | 1996-03-07 |
| NO970326L (no) | 1997-01-24 |
| JPH11505404A (ja) | 1999-05-21 |
| EP0779896A1 (en) | 1997-06-25 |
| EP0779896B1 (en) | 2001-10-31 |
| HUT76667A (en) | 1997-10-28 |
| CA2194578A1 (en) | 1996-02-08 |
| WO1996003433A1 (en) | 1996-02-08 |
| DK0779896T3 (da) | 2002-02-18 |
| AU3109695A (en) | 1996-02-22 |
| NZ290374A (en) | 1998-07-28 |
| FI970258A0 (fi) | 1997-01-22 |
| NO970326D0 (no) | 1997-01-24 |
| AU699879B2 (en) | 1998-12-17 |
| ES2166402T3 (es) | 2002-04-16 |
| HU222829B1 (hu) | 2003-11-28 |
| FI118385B (fi) | 2007-10-31 |
| JP4354980B2 (ja) | 2009-10-28 |
| IL114702A (en) | 2005-03-20 |
| PT779896E (pt) | 2002-03-28 |
| US20020115834A1 (en) | 2002-08-22 |
| US7057016B2 (en) | 2006-06-06 |
| ATE207934T1 (de) | 2001-11-15 |
| DE69523611T2 (de) | 2002-06-20 |
| KR100394532B1 (ko) | 2003-10-22 |
| FI970258A (fi) | 1997-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4354980B2 (ja) | 生物学的に活性なタンパク質の製造のための新規の方法 | |
| AU638075B2 (en) | Process for the production of biologically active protein | |
| JP2007031453A (ja) | 生物学的に活性な二量体型タンパク質の製造のための新規の方法 | |
| EP0542679A1 (en) | Novel hybrid transforming growth factors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |