FI118385B - Uusi menetelmä biologisesti aktiivisen proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

118385

UUSI MENETELMÄ BIOLOGISESTI AKTIIVISEN PROTEIININ VALMISTAMISEKSI

Keksintö koskee laskostusmenetelmää biologisesti aktiivi-5 sen, dimeerisen TGF-β:n (transformoivan kasvutekijän ^ΥΥΡΡ1 β:η) kaltaisen proteiinin valmistamiseksi laskos-tuspuskurissa, joka ei sisällä detergenttiä.

TGF-β:n kaltaisilla proteiineilla, so. TGF-p-superperheen 10 proteiineilla, on keskeinen merkitys monissa biologisissa säätelyreaktioissa, kuten esimerkiksi alkionkehityksessä tai kudoksen regeneraatiossa. Ne ovat hyvin tehokkaita biologisia agensseja, joita voidaan käyttää myös terapeuttisesti moniin eri tarkoituksiin. TGF-p-superperheen par-15 haiten tunnettuja jäseniä ovat TGF-β:t itse.

TGF-β puhdistettiin homogeeniseksi alun perin ihmisen verihiutaleista, ihmisen istukasta ja naudan munuaisista, ja se identifioitiin homodimeerisenä proteiinina, jonka 20 molekyylipaino on noin 25 000 Da. Ensin se karakterisoitiin sen kyvyn perusteella vaikuttaa synergisesti EGF:n tai TGF-a:n kanssa indusoiden ei-transformoitujen NRK-solujen kiinnityskohdasta (anchorage) riippumatonta kasvua, ja äskettäin TGF-β:11a on osoitettu olevan useita 25 säätelyvaikutuksia moniin erilaisiin sekä normaaleihin * 1 *·1·1 että neoplastisiin soluihin, mikä osoittaa tämän proteii- • · i nin merkityksen monitoimintaisena soluaktiivlsuuden sää- • · telijänä. Solun tai kudoksen tyypistä sekä muiden kasvu- tekijöiden läsnäolosta tai puutteesta riippuen TGF-β voi 30 joko stimuloida mitogeneeslä, solujen lisääntymistä ja • kasvua tai tehokkaasti inhiboida mainittuja prosesseja, * tai sillä voi olla muita toimintoja, kuten esimerkiksi ••a adipogeneesin, myogeneesin, kondrogeneesin, osteogeneesin • · 1 ja immuunisolutoiminnan säätely, kemotaksian stimulointi * 1 · *, 35 tai erilaistumisen induktio tai inhibitio. Monet TGF-βίη *J‘” vaikutukset koskevat solujen tai kudosten vastetta stres- sille tai vauriolle sekä näistä aiheutuvan vahingon pa- . rantumista. Tulehduksen jälkeen TGF-β:11a on tärkeä mer- • · 1 • · • » · • · · • · 118385 2 kitys granulaatiokudoksen muodostumisessa, se lisää niiden geenien ilmentymistä, jotka liittyvät soluväliaineen, kuten fibronektiinin, kollageenin ja useiden proteaasi-inhibiittoreiden, muodostumiseen ja stimuloi fibroblas-5 tien aikaansaamaa koilageenimatrikein supistumista, mikä viittaa sillä olevan mahdollisesti merkitystä sidekudoksen supistumisessa.

Tähän mennessä on kuvattu viisi erillistä, mutta kuiten-10 kin toiminnallisesti ja rakenteellisesti läheisesti yhteen kuuluvaa TGF-β:aa, jotka on nimetty TGF-piiksi, TGF-P2:ksi, TGF-p3:ksi, TGF-p4:ksi ja TGF-p5:ksi. Kolme ensimmäistä on tavattu myös ihmisessä.

15 Kaikki TGF-β:t syntetisoidaan 390-412 aminohapon esiaste! na, joista proteolyyttisen pilkonnan jälkeen muodostuvat kypsät muodot, jotka koostuvat 112 C-terminaalisesta aminohaposta. TGF-β:t ovat niiden kypsissä, biologisesti aktiivisissa muodoissaan happo- ja lämpöstabiileita kah-20 den sellaisen polypeptidiketjun disulfidilla sitoutuneita homodimeerejä, joista molemmissa on 112 aminohappoa. Ihmisen (Derynck, R. et ai., (1985) Nature 316: 701-705), muriinin (Derynck, R. et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261: ·,·, 4377-4379) ja apinan TGF-pi:n (Sharpies, K. et ai., • t · ^ 25 (1987) DNA 6: 239-244) täydellisissä aminohapposekvens- • · · *" *. seissä on huomattava sekvenssisäilyvyys niin, että ne » · · *;,/· eroavat vain yhden aminohappotähteen osalta. Ihmisen TGF-

]···' piin, ihmisen TGF-p2:n (deMartin, R. et ai., (1987) EMBO

• J. 6: 3673-3677; Marquardt H. et ai., (1987) J. Biol.

: 30 Chem. 262: 12127-12131) ja ihmisen TGF-p3:n (Ten Dijke, P. et ai., (1988) PNAS 85: 4715-4719) aminohapposekvens- * · • *·· sien vertailu on osoittanut, että näillä kolmella prote- :T: iinilla on kypsissä muodoissaan noin 70-80 %:n sekvenssi- "\φ· identtisyys. Sian verihiutaleista on eristetty heterodi- • * ... 35 meerinen TGF-pl.2, jonka koostumuksessa yksi TGF-pi:n • · **"* alayksikkö on liittynyt disulfidisidoksella yhteen TGF- • · • · · • * • · # · ♦ • ·♦ m · 118385 3 β2:η alayksikköön (Cheifetz, S. et ai., (1987) Cell 48: 409-415).

Äskettäin on yritetty valmistaa TGF-β:ja pikemminkin yh-5 distelmä-DNA-tekniikoilla kuin eristämällä näitä tekijöitä luontaisista lähteistä (esim. verihiutaleista), jotta niitä saataisiin riittäviä määriä testaukseen erilaisissa terapeuttisissa modaliteeteissa (hoitotavoissa). Biologisesti aktiivisen yhdistelmä-TGF-β:n saaminen on kuitenkin 10 osoittautunut erittäin vaikeaksi. Kuten sekvenssilistassa SEKV. ID NOtissa 1-6 esitetyistä sekvensseistä voidaan ha valta, 112 aminohappoa sisältävät TGF-βΙίη, TGF^2:n ja TGF-p3:n kypsät muodot sisältävät 9 kysteiinitähdettä. Ku ten TGF-p2:n kohdalla on osoitettu, 9 kysteiinitähdettä 15 muodostavat 4 ketjunsisäistä ja 1 ketjujen välisen disul-fidlsidoksen [Schlunegger, M.P. ja Gruetter, M.G., Nature 358: 430-434 (1992)]. TGF-β:n heterologinen ilmentäminen saattaa johtaa tuotteeseen, joka ei virheettömästä primaa rirakenteesta huolimatta laskostu kunnolla oikeiden sekun 20 daari- tai tertiäärirakenteiden muodostumiseksi ja jolta siten puuttuu biologinen aktiivisuus.

Kun otetaan huomioon natiivien TGF-β-molekyylien monimut-kaisuus, vastaavien TGF-β-geenien ilmentämistä on tavaili /’* 25 sesti pidetty tarkoituksenmukaisena korkeammilta organis- • t « ···\ meiltä peräisin olevissa soluissa. Vaikka yhdistelmä-TGF- • * · *♦ · β-molekyylien ilmentäminen voidaan toteuttaa eukaryootti- ♦ ·· :...: sissa järjestelmissä, biologisesti aktiivisen, virheettö- • · 5 *·· mästi laskostuneen materiaalin saannot ovat silti kaikkea :[: : 30 muuta kuin tyydyttäviä.

Sen vuoksi biologisesti aktiivista TGF-β:aa yritettiin tuottaa mikrobi-isännässä. Solunsisäiset olosuhteet eivät • „ kuitenkaan esim. bakteereissa edistä oikeaa laskostumis- 35 ta, disulfidisidoksen muodostumista eivätkä disulfidin *·· ’···* stabiloimaa dimerisaatiota, joka on ilmeisesti olennaisen tärkeää aktiivisuudelle. Niinpä biologisesti aktiivista * · • · • · · ♦ · • · 118385 4 TGF-p:aa voitiin saada vain vähän sen jälkeen, kun vastaavaa geeniä oli ilmennetty E. colissa lambdapromootto-rin säätelemänä, kuten EP-patenttihakemuksessa EP-A-0 268 561 on kuvattu. Toinen selostus kuvaa TGF-βιη cDNA:n il-5 mentämistä E. colissa trp-promoottorin säätelemänä, jolloin SDS-polyakryyliamidigeelin autoradiogrammissa saatiin radioaktiivisesti leimattu proteiinivyöhyke, jonka näennäinen molekyylipaino oli 13 000 Da, mutta mitään aktiivisuutta ei mitattu (Urushizaki, Y. et ai. (1987) 10 Tumor Res. 22: 41-55).

Kun yhdistelmäproteiineja tuotetaan korkeina tasoina bakteerien (esim. E. colin) ilmentämisjärjestelmissä, ne esiintyvät usein erittäin liukenemattomina solunsisäisinä 15 saostumina, joita kutsutaan inkluusiokappaleiksi tai ref-raktiilikappaleiksi (retractile bodies), jotka voidaan tunnistaa faasikontrastimikroskoopilla solujen rajojen si säilä näkyvinä kirkkaina täplinä. Nämä inkluusiokappa-leet, jotka voidaan helposti erotella liukoisista baktee-20 riproteiineista, sisältävät yhdistelmäproteiinia suurimmaksi osaksi denaturoidussa ja pelkistetyssä muodossa, jolla ei ole luontaisen vastineensa toiminnallista aktiivisuutta ja joka on siksi kaupallisena tuotteena käyttö- .Yj kelvoton. Sen vuoksi ollaan yleisesti yhtä mieltä siitä, • · : .·. 25 että refraktiilinen yhdistelmäproteiini on liuotettava .·,j olosuhteissa, jotka soveltuvat pitämään sen denaturoidus- • · I./ sa muodossaan, ja sen jälkeen se on laskostettava niin, • · ,*** että se muuttuu denaturoidusta laskostamattomasta muodos- * ** ta oikeaan, toiminnallisesti aktiiviseen kolmiulotteiseen *·’ * 30 rakenteeseen, jota konformaatiota stabiloivat verrattain heikot atomienväliset voimat, kuten vetysidokset, hydro- i« • ’·· fobiset vuorovaikutukset ja varausvuorovaikutukset. Kys- teiiniä sisältävien proteiinien kohdalla tähän prosessiin saattaa kuulua disulfidisidosten muodostuminen. Kun di- • · ... 35 sulfidisidosten muodostumista edistetään kemiallisesti, t * virheellisten molekyylinsisäisten, ja dimeeristen tai • t Y·· multimeeristen proteiinien kohdalla molekyylienvälisten, • * • t * * M • » 118385 5 siltojen muodostuminen tulisi estää tai ainakin minimoida, koska ei-toivottujen, virheellisesti laskostuneiden isomeerien muodostuminen saattaa johtaa epähomogeeniseen materiaaliin, mikä näin ollen tekee halutunrakenteisen 5 proteiinin lisäpuhdistuksen monimutkaiseksi, tai voidaan saada sellainen proteiini, jonka aktiivisuus on vähentynyt.

Proteiinit laskostetaan tavallisesti monivaiheisessa pro-10 sessissa, jossa proteiini liuotetaan voimakkaasti denaturoivissa olosuhteissa, minkä jälkeen kaotroopin konsent-raatiota alennetaan proteiinin laskostumisen mahdollistamiseksi. Tällainen lähestymistapa kuitenkin epäonnistui TGF-p:n laskostamisessa. EF-patenttihakemuksessa EP-A-0 15 433 225 kuvataan onnistunut menetelmä biologisesti aktii visen dimeerisen TGF-βιη kaltaisen proteiinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään laimeaa detergenttiä, joka mahdollistaa TGF-βιη kaltaisen proteiinin laskostumi sen, vaikka detergentti säilyy laskostuspuskurissa.

20

Tiedetään, että dimetyylisulfoksidia (DMSO) voidaan käyttää edistämään valikoivaa ja tehokasta disulfi- disidosten muodostumista peptideissä (Tam et ai., J. Am.

•a» Chem. Soc. 113: 6657-6662, 1991). Menetelmä on valikoiva, • · · .* ! 25 so. sivureaktioita ei ole, ja siinä voidaan käyttää laa- * e t V * jaa pH-aluetta. Virheetön disulfidisillan muodostuminen m t « osoitettiin kuitenkin vain noin 30 aminohapon kokoisiin • » %»." peptideihin asti. Toisessa julkaisussa (Bentle et ai., ί ’** US-patentti 4,731,440) Somatotropiinin liuottamiseen in- V5 30 kluusiokappaleista käytettiin dimetyylisulfonia tai dime- tyylisulfonin ja urean seosta. Sitten liuennut proteiini ?*·.. voitiin renaturoida saattamalla proteiinin dimetyylisul- /»'; fonia sisältävä liuos yhteyteen heikon hapettimen kanssa.

« e # · |ia' 35 Nyt havaittiin yllättäen, että TGF-βίη kaltaisia prote- ’’··* iineja voidaan laskostaa uudelleen aktiiviseen dimeeri- ?**.: seen muotoon käsittelemällä liuotettua monomeeriä deter- • « » ♦ * * · S «f • 9 118385 6 gentittömällä laskostuspuskurilla, joka sisältää orgaanista liuotinta, kuten esimerkiksi DMSO:ta, DMFtää tai DMSO:n ja DMF:n seosta.

5 Keksintö koskee parannettua menetelmää biologisesti aktii visen, dimeerisen TGF-p:n kaltaisen proteiinin tuottamiseksi sen denaturoidusta tai muusta ei-natiivista muodosta. Tämä tavoite saavutetaan sellaisen odottamattoman * havainnon perusteella, että merkittäviä määriä haluttua 10 dimeeristä tuotetta voidaan saada odottamattomalla saannolla, kun mainitun proteiinin monomeeristä muotoa käsitellään laskostuspuskurilla, joka ei sisällä detergent-tiä, ja joka laskostuspuskuri sisältää orgaanista liuotinta, kuten esimerkiksi DMS0:ta, DMF:ää tai DMS0:n ja 15 DMF:n seosta.

Keksintö koskee parannettua menetelmää dimeerisen, biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän tyyppi β:η (TGF-βίη) kaltaisen proteiinin tuottamiseksi, jossa mene-20 telmässä mainitun TGF-βίη kaltaisen proteiinin denaturoitu monomeerinen muoto altistetaan laskostusolosuhteille, jotka eivät sisällä detergenttiä.

• · ·.*.· Termillä "TGF-βίη kaltainen proteiini" tarkoitetaan tämän * · :.· : 25 keksinnön yhteydessä proteiinia, jolla on monomeerisessä :/ · muodossaan sekvenssi, jolla on vähintään 75 %:n homologia vähintään yhteen seuraavien TGF-β-superperheen jäsenten *·.. monomeerin aminohapposekvensseistä: φ <«· • · · • ♦ · 30 TGF-βΙ, TGF-p2 ja TGF-83, kasvun inhibiittori, eristetty apinan munuaissolujen BSC-1 vakioidusta (conditioned) • · ♦ kasvualustasta (so. polyergiini; Holley, R.W. et ai.

(1980) PNAS 77: 5989-5992; Ristow, H.J.(1986) PNAS 83: ’:**· 5531-5533); kanan alkion kondrosyytelstä peräisin oleva 35 TGF^4 (Jakowlew, S.B. et ai. (1988) Molecular Endoc- ,·. : rinology 2: 1186-1195); Xenopus-Laevisisistä peräisin .·. ; oleva TGF-βδ (Kondaiah P. et ai. (1990) J. Biol. Chem.

• ·· • · 118385 7 265: 1089-1093); TGF-βίη kaltaiset inhibiinit ja akti-viinit (sukupuolirauhasproteiineja, jotka säätelevät aivolisäkkeen follikkelia stimuloivan hormonin eritystä); Mailerin inhibitiotekijä (MXS, joka inhiboi Mtillerin tie-5 hyiden kehitystä nisäkäskoirassikiöillä); luun morfo-geeniset proteiinit (BMP, ryhmä polypeptidejä, jotka osallistuvat ruston ja luun muodostuksen induktioon; tämän ryhmän nykyisin tunnetut jäsenet ovat BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 ja BMP-9); Drosophllan 10 dekapentaplegisen (decapentaplegic) geenikompleksin tran-skripti (dpp, joka säätelee morfogeneesiä kärpäsen alkiossa); Vg-1 (Xenopuksen transkriptin tuote, jota esiintyy oosyyttien vegetatiivisessa osassa); ja Vgr-1, Vg-1:n kaltainen nisäkäsgeeni (Mason A. et ai. (1986) Biochem.

15 Biophys. Res. Commun. 135: 957-964; Cate, R. et ai.

(1986) Cell 45: 685-698; Wozney, J.M. et ai. (1988) Science 242: 1528-1534; Padgett, R. et ai. (1986) Nature 325: 81-84; Weeks, D.L. ja Melton, D.A. (1987) Cell 51: 861-868; Lyons, K. et ai. (1989) PNAS 86: 4554-4558).

20 "TGF-β:n kaltaisiin proteiineihin" sisältyvät myös hetero dimeerit, jotka sisältävät eri TGF-βίη kaltaisten proteii ·.·. nien alayksikköjä, tai edellä mainittujen proteiinien • « · fragmentit ja mutantit, joissa on säilynyt yksi tai kaik- • · · **.* 25 ki kantamolekyylin biologisista aktiivisuuksista.

• i * • · • »•l • · *··* Edullisesti "TGF-βίη kaltainen proteiini" on tämän keksin • · : *" nön yhteydessä mikä tahansa TGF-β-superperheen proteiini.

* ·· V : Edullisemmin se on joku seuraavista TGF-β-superperheen 30 proteiineistä: nisäkkäästä, kuten esimerkiksi ihmisestä tai eläimestä, esim. apinasta, muriinista, siasta, hevo-·*·*: sesta tai naudasta peräisin oleva TGF-βΙ, TGF-β2 ja TGF- * . β3, samoin kuin heterodimeeriset TGF-β:t, jotka koostuvat I,/ kahdesta eri alayksiköstä, joista kummassakin on 112 f · ···* 35 aminohappoa, sekä TGF-βίη fragmentit ja mutantit, mukaan i\; lukien hybridimolekyylit, joissa eri TGF-β:jen osia on • · • · · ♦ · · • ♦ 118385 8 vaihdettu; kasvun inhibiittori, eristetty apinan munuais-solujen BSC-1 vakioidusta kasvualustasta (so. polyergii-ni); kanan alkion kondrosyyteistä peräisin oleva TGF-p4; Xenopus-Laevisista peräisin oleva TGF-p5; TGF-βιη kaltai-5 set inhiblinit ja aktiviinit (sukupuolirauhasproteiineja, jotka säätelevät aivolisäkkeen follikkelia stimuloivan hormonin eritystä); MUllerin inhibitiotekijä (MIS, joka inhiboi MUllerin tiehyiden kehitystä nisäkäskoirassiki-öillä); luun morfogeeniset proteiinit (BMP, ryhmä poly-10 peptidejä, jotka osallistuvat ruston ja luun muodostuksen induktioon; tämän ryhmän nykyisin tunnetut jäsenet ovat BMF-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 ja BMP-9); Drosophilan dekapentaplegisen geenikompleksin tran-skripti (dpp, joka säätelee morfogeneesiä kärpäsen al-15 kiossa); Vg-1 (Xenopuksen transkriptin tuote, jota esiintyy oosyyttien vegetatiivisessa osassa); ja Vgr-1, Vg-l:n kaltainen nisäkäsgeeni. "TGF-p;n kaltaisiin proteiineihin" sisältyvät myös heterodimeerit, jotka sisältävät eri TGF-β:n kaltaisten proteiinien alayksikköjä, tai edellä 20 mainittujen proteiinien fragmentit tai mutantlt, joissa on säilynyt yksi tai kaikki kantamolekyylin biologisista aktiivisuuksista.

• · '·*·* Vielä edullisempia TGF-p:n kaltaisia proteiineja ovat • * : 25 TGF-pi, TGF-p2, TGF-P3, heterodimeeriset TGF-p:t, TGF-βιη • · · fragmentit ja mutantit, mukaan lukien hybridimolekyylit, joissa eri TGF-p:jen osia on vaihdettu, BMP:t, inhibiinit s\. ja aktiviinit. Vielä edullisempia ovat BMP-2, TGF-pi, t*:*; TGF-p2 ja TGF-p3 ja niiden niiden heterodimeerit sekä « 30 fragmentit ja mutantit, mukaan lukien hybridimolekyylit, *.f joissa eri TGF-β:ojen osia on vaihdettu, edullisesti hyb- ridi-TGF-pi-3, hybridi-TGF-p2-3 ja hybridi-TGF-p3-2 tai *·* ’ TGF-pl-2, joka koostuu N-terminaalista C-terminaaliin *:*" kulkevassa järjestyksessä ihmisen TGF-pi:n 44 N-terminaa~ {***: 35 lisesta aminohaposta ja TGF-p2:n 68 C-terminaalisesta ··· .* . aminohaposta. Vielä edullisempia TGF-β:n kaltaisia prote- S ·· * * iineja ovat ne, joissa on sekvenssilistassa SEKV. ID NO:- • t » ·♦ • · 118385 9 issa 1, 3, 5, 7, 9 tai 11 kuvatut aminohapposekvenssit. Kaikkein edullisin TGF-8:n kaltainen proteiini on TGF-p3.

TGF-βιη biologinen aktiivisuus tähän tarkoitukseen määri-5 telihän joko - TGF-βιη solun migraatiota edistävänä aktiivisuutena fibroblasteja kohtaan (Postlethwaite, A.E. et ai. (1987) J. Exp. Med. 165: 251, modifioitu R. Burkin (1973) PNAS 70: 369, mukaan), 10 - TGF~8:n inhibitiovaikutuksena ihmisen A 375 -melanoo- masolujen kasvuun (Brown, T.J. et ai. (1987) J. Immunol. 139: 2977), - CCL-64-solun DNA-synteesimäärityksen inhibitions (Gray-car, J.L. et ai. (1988) Molecular Endocrinology 3: 1977- 15 1986) tai - minkin jatkuvan keuhkoepiteelisolulinjan Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) kasvun inhibitiona, kuten jäljempänä esimerkeissä kuvataan.

20

Mistä tahansa lähteestä tai millä tahansa menetelmällä saatu monomeerinen, TGF-8:n kaltainen proteiini voidaan laskostaa vastaavaksi keksinnön mukaiseksi dimeeriseksi, • · biologisesti aktiiviseksi TGF~8:n kaltaiseksi proteiinik- • · :,· : 25 si. Esimerkiksi TGF-βίη kaltaisen proteiinin monomeerinen • * *·,* | muoto voi olla peräisin luontaisesta lähteestä tai se voi daan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai synteettises-ti alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Tapauksessa, • i*:*; jossa monomeeri ei sovellu in vitro -laskostamiseen kon- 30 taminanttien vuoksi, liuotettu ja denaturoitu monomeeri ;·. voidaan puhdistaa kromatografiällä, esim. kokoeks- • Il kluusiokromatografialla esim. Sephacryl S-100 HR:llä.

• · · «

Ennen laskostusta monomeerisen TGF~8:n kaltaisen proteii-i]”: 35 nin on oltava denaturoidussa (so. ei-laskostuneessa) liuo (·] · tetussa muodossa. Alalla hyvin tunnetut niin kutsutut kao

• H

trooppiset aineet kykenevät denaturoimaan ja liuottamaan • · • « 118385 10 proteiineja tehokkaasti, ne muuttavat vesiliuoksessa ja sopivina konsentraatioina kyseisen proteiinin avaruusrakenteen sen pinnan muutoksilla, joko muuttamalla hydrataa tiotilaa, liuotinympäristöä tai liuotin-pintavuorovaiku-5 tusta. Tällaisia kaotrooppisia aineita tai denaturointiai neita ovat esimerkiksi urea, guanidiinihydrokloridi, nat-riumtiosyanaatti noin 4 ja noin 9 M:n välisellä konsent-raatioalueella sekä detergentit, kuten SDS, joita käytetään 0,01-2 %:n luokkaa olevina konsentraatioina. Myös 10 TGF-p:n kaltaista proteiinia sisältävän vesiliuoksen happamuuden lisääminen pH-arvoon noin 2-4, esim. pienmolekyy lipainoisella alifaattisella orgaanisella hapolla, jossa on edullisesti 2, 3 tai 4 C-atomia, edullisemmin etikkaha polla, samoin kuin emäksiset olosuhteet, esim. pH 10 ja 15 sen ylittävät arvot, ja korkeat lämpötilat johtavat mono-meerin denaturoitumiseen ja liukenemiseen.

Sitten monomeeri altistetaan "laskostusolosuhteille", jot ka mahdollistavat biologisesti aktiivisen dimeerin tal-20 teenoton. Termillä "laskostusolosuhteet" tarkoitetaan olo suhteita, joissa edistetään ketjunsisäisten ja ketjunvä-listen disulfidisidosten muodostumista ja denaturoitu monomeeri voi omaksua sen biologiseen aktiivisuuteen liitty • · *,V vän konformaation. Tässä prosessissa ei muuteta lainkaan * * :,· · 25 monomeerin primaarirakennetta (so. aminohapposekvenssiä), :*· : vaan siinä muodostetaan dimeeriselle tuotteelle sellainen • · ·**’» kolmiulotteinen rakenne, joka liittyy biologiseen aktiivi

• «I

i*. ( suuteen. Tähän prosessiin kuuluu disulfidisidosten muodos tuminen ja monomeerien yhdistyminen dimeeriseksi, biologi 4 · * 30 sesti aktiiviseksi rakenteeksi.

·· * * " Tätä tarkoitusta varten keksinnön mukaista denaturoitua «·· • · * '·* ‘ monomeeriä käsitellään laskostuspuskurilla, joka sisältää *:**; orgaanista liuotinta. Edullinen orgaaninen liuotin on I**’; 35 DMS0:ta, dimetyylisulfonia (DMS02:ta), DMF:ää tai mitä ··· / . tahansa kahden tai kolmen edellisen seosta. Edullinen • · « orgaaninen liuotin on DMSOita, DMF:ää tai mitä tahansa * · · • * · • · 118385 11 näiden seosta.

Laskostus voidaan suorittaa neutraalissa tai emäksisessä pH:ssa sekä kohtuullisessa lämpötilassa, esim. noin 0 5 °C:n ja noin 40 eC:n välillä. Edullinen pH on noin 7 ja noin 10 välillä, edullisemmin DMSO:n tapauksessa pH-arvo on noin 9-9,5 ja DMF:n tapauksessa noin 8,5.

Tavanomaiset puskurijärjestelmät, joita voidaan käyttää 10 keksinnön mukaiseen laskostukseen, ovat puskureita, joilla saadaan riittävä puskurikapasiteetti pH-välillä 6-10. Kaikki ne puskurit, joilla ei ole inhibitiovaikutusta pro teiinien laskostumiseen, ovat tässä keksinnössä käyttökel poisia.

15

Sopivia puskureita ovat esimerkiksi Tris-, bis-Tris- tai piperatsiinipuskurit. Puskurit voivat sisältää lisäksi haluttaessa suolaa sekä haluttaessa emäksistä aminohappoa.

20

Suoloja, joita voidaan käyttää laskostuspuskurissa, ovat esimerkiksi Na*:n, Li*:n. K*:n, NH4*:n, Mg2*:n, Ca2*:n tai

Mn2*:n suolat Cl":n. F":n, Br':n, J':n, HC03":n, S042‘:n, fos- *.V faatin, asetaatin, syanaatin tai rodanidin kanssa tai « * : 25 muut alkalimetalli- tai maa-alkalimetalli- halogeeni- tai ! -pseudohalogeeniyhdisteet 3 M konsentraatioon saakka.

Edullinen on NaCl 1-2 M:n konsentraation.

·*« «· i

Emäksinen aminohappo, jota voidaan käyttää laskostuspusku 30 rissa, on esimerkiksi arginiini, edullisesti 0,5 M:n kon- .. sentraationa.

• · • «· • · * • · · "** ‘ DMSO:ta voidaan käyttää keksinnön mukaiseen laskostukseen *:**: konsentraationa noin 10 %:sta noin 50 %:iin, edullisemmin t"*: 35 noin 20 %:sta noin 50 %:iin, vielä edullisemmin noin 30 • •e . %:sta noin 50 %:iin, edullisimmin noin 40 %:n konsentraa- • · · \ tiona.

• · · • * • · 12 1 1 8385 DMSO voidaan laskostuspuskurissa korvata DMF:llä. DMF:ää voidaan käyttää konsentraationa noin 10 %:sta noin 50 %:iin, vielä edullisemmin noin 20 %:sta noin 50 %:iin, vieläkin edullisemmin noin 30 %:sta noin 50 %:iin, edulli 5 simmin noin 30 %:sta noin 40 %:iin.

DMSO:n ja DMF:n seosta voidaan käyttää konsentraationa noin 10 %:sta noin 50 %:iin molemmat liuokset yhdistettynä.

10 DMSO tai DMF voidaan vastaavasti korvata myös DMS02:lla.

Keksinnön edullisessa suoritustavassa laskostuspuskuri si sältää lisäksi pelkistintä. Sopiva pelkistin, joka suosii 15 disulfidien muodostumista proteiineissa tai peptideissä, on esim. pienmolekyylipainoinen sulfhydryylireagenssi, jo ka on glutationi pelkistetyssä muodossaan, ditiotreitoli pelkistetyssä muodossaan, β-merkaptoetanoli pelkistetyssä muodossaan, merkaptometanoli pelkistetyssä muodossaan, 20 kysteiini tai kysteamiini. Sopiva konsentraatio on esim. noin 1-100 mM, edullisesti noin 1-10 mM, edullisemmin noin 2,5 mM.

•,V Edullisia pelkistettyjä sulfhydryyliyhdisteitä tässä kek- ij1: 25 sinnössä käytettäviksi ovat pelkistetty glutationi, kyste ;1· i iini, kysteamiini ja β-merkaptoetanoli. Edullisin yhdiste • · .2·. on pelkistetty glutationi.

• » · ·· t ·..

« .···, Laskostus suoritetaan kohtuullisissa lämpötiloissa, esi- « 1 · 30 merkiksi noin 0 °C:n ja noin 40 °C:n välillä, edullisesti noin 4 °C:ssa, ja kohtuullisessa ajassa, esimerkiksi noin • t 2 tunnin ja 720 tunnin välillä. Koska laskostuksen kesto • · 1 riippuu käytetystä lämpötilasta, lämpötila voidaan opti- *:··; moida mitä tahansa haluttua laskostusaikaa varten ja ,·2. 35 päinvastoin.

··· • 1 '· ‘1 Keksinnön mukaisen dimeerisen, biologisesti aktiivisen • 1 1 • ·· 2 • · 118385 13 TGF-βιη kaltaisen proteiinin valmistus voidaan suorittaa yksivaiheisella menetelmällä, jossa mainitun proteiinin monomeeri siirretään laskostuspuskuriin ja reaktioseosta inkuboidaan esim. noin 2 tunnista 7:ään tai useampaan 5 vuorokauteen esimerkiksi noin 0 eC:n ja noin 40 eC:n välisessä lämpötilassa, edullisesti 4 °C:ssa, samalla kun kaiken aikaa tapahtuu laskostusta ja dimerisaatiota. Las-kostusreaktion aikaisella proteiinikonsentraatiolla on suuri merkitys, koska jos se on liian korkea, monomeerit 10 saattavat aggregoitua huomattavassa määrin, mikä johtaa ei-toivottujen korkeampiasteisten oligomeerien muodostumiseen. Dimeerisen tuotteen loppusaannot kohoavat, jos proteiinikonsentraatio on alle noin 2 mg/ml, edullinen konsentraatioalue on 0,01-0,5 mg/ml.

15

Laskostuksen jälkeen biologisesti aktiivinen dimeeri puhdistetaan, jotta siitä saadaan poistettua epätäydellises-ti laskostunut TGF-βιη kaltainen proteiini ja epäpuhtaudet, erityisesti pyrogeenit tai muut endotoksiinit, 20 joita saattaisi olla valmisteessa läsnä, jos polypeptidi tuotettiin mikrobi-isäntäsoluissa. Dimeerin erottelu tehdään kromatografiällä, kuten esimerkiksi koon mukaan la-jittelevalla (sizing) geelikromatografiällä, hydrofobis- » · *.V ten vuorovaikutusten kromatografialla tai ioninvaihtokro- ·,· : 25 matografiällä, esim. Mono S -pylväällä, ja käänteisfaasi- :1· : HPLCillä.

• » • · · • ·

• M

t‘.( Edelleen keksintö koskee dimeerisiä, biologisesti aktiivi siä TGF-S:n kaltaisia proteiineja, kun ne on tuotettu kek 30 sinnön mukaisella menetelmällä. Näitä TGF-βιη kaltaisia .. proteiineja voidaan käyttää monenlaisissa terapeuttisissa • · modaliteeteissa.

* · · • · · *:2·: Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä, eikä niitä ole I3· 35 tarkoitettu rajoittaviksi.

• M

fe · • · · • ·· • · f • I 1 2 * ·· 3 • · 118385 14

Esimerkki 1: TGF-B1tn. TGF-B2:n 1a TGF-B3:n ilmentäminen E. colissa

Esimerkki IA: Yleiset menetelmät 5 Bakteerikanta: - E. coli K12/LC 137: htpR,», lonR9, lac*,, mal.., trp^, pho,,,, rspL, tsx::TnlO, supCt, (Goff, S.A. et ai. (1984) PNAS 81: 6647-6651).

10 Plasmidit: - pPLMu (Buell, G. et ai. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 1923-1938): Tässä plasmidissa on bakteriofagin λ PL-pro-moottori faagin Mu ner-geenin ribosominsitoutumiskohdan kanssa (Van Leerdam, E. et ai. (1982) Virology 123: 19- 15 28).

- pcl857: plasmidi, joka koodaa termolabiilia Xcie57-repres-soria ja antaa resistenssin kanamysiinille (Remault, E. et ai. (1983) Gene 22: 103-113).

20 SDS-oeelielektroforeesi: SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja pro teiinivärjäys tehdään, kuten aikaisemmin on kuvattu .. (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227: 680-685), käyttämällä *·*;* BIORADin Miniprotean II -kennoa (cell) ja 1 mm:n paksui- ί·: ·' 25 siä 18%:isiä polyakryyliamidigeelejä.

4*· * • · I * Lämpöinduktio: J '·. 7 ml:aan LB-kasvualustaa (Maniatis et ai. (1982), Molecu- lar Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 20 30 ml:n viljelyputkessa, joka sisältää 40 pg sekä ampisillii nia että kanamysiiniä (LB/amp/kan), siirrostetaan yksi pe m ,···, säke ja inkuboidaan ravistelemalla yli yön 30 eC:ssa. Vii • · 4 *·( si millilitraa tätä yli yön viljelmää lisätään 15 mitään * * LB/amp/kan-kasvualustaa 100 ml:n erlenmeyerpullossa. Tämä l,,«s 35 pullo siirretään 42 eC:n vesihauderavistelijaan. Ennen .'.J siirtoa (ei-indusoivat olosuhteet) otetaan 2 ml:n näyte • · • · 4 · 4 • »4 ♦ · 118385 15 ja 1 tunnin väliajoin siirron jälkeen 1 ml:n näytteet (indusoivat olosuhteet). Solut pelletoidaan sentrifugoi-malla (5 min, 10 000 rpm Eppendorf-sentrifugissa) ja su-pematantti heitetään pois. Pelletti resuspendoidaan 100 5 μΐ:aan näytepuskuria SDS-PAGEa varten ja kuumennetaan 10 minuutin ajan 95 °C:ssa. SDS-PAGElle pannaan 5 μ1:η erät.

Kompetenttien solujen valmistus:

Kompetentit E. coli -solut valmistetaan kalsiumkloridime-10 netelmällä, kuten on kuvattu teoksessa Maniatis et ai.

(1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Plasmidin pcl857 sisältäviä soluja kasvatetaan 30 °C:ssa.

15 Esimerkki IB: Ilmentämisvektorien pPLMu.hTGF-Bl. pPLMu.-hTGF-B2 1a pPLMu.hTGF-S3 konstruointi 1a TGF-Bl:n. TGF-B2:n ia TGF-B3:n ilmentäminen TGF-pl:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n koodaavat sekvenssit (esi-20 tetään sekvenssilistassa) kloonataan kukin erikseen plas-midiin PGem-5ZF(+) (Promega), joka on pilkottu NcoI:llä, defosforyloitu vasikan suolen alkalisella fosfataasilla # , (Boehringer) ja täydennetty Klenowin polymeraasilla (Gib- • ·

*·’·* co-BRL). Tuloksena saatuja konstrukteja nimitetään pGKM

i 25 125:ksi (TGF-pi), pGKM 740:ksi (TGF-p2) ja pGKM 126:ksi

• S

: (TGF-p3) ja niitä käytetään transformoimaan kompetentit E. coli Y 1090 -solut. Klooneja, jotka sisältävät oikeat * *·. TGF-pl:tä, TGF-p2:ta ja TGF-p3:ea koodaavat insertit, lYi nimitetään vastaavasti seuraavasti: E.coli Y1090/pGKM 125 30 (TGF-pl), E.COli Y1090/pGKM 740 (TGF-p2) ja E.COli Y1090- /pGKM 126 (TGF-p3).

• f· • · « • · · E.COli Y1090/PGKM 125, E.coli Y1090/pGKM 740 ja E.COli • * Y1090/pGKM 126 -soluja kasvatetaan LB-kasvualustassa ja (...* 35 plasmidi-DNA valmistetaan H.C. Birnboimin ja H. Dolyn menetelmällä (1979) Nucleic Acids Research 7: 1513. Viisi • · • · « · * « *♦ • · 118385 16 mikrogrammaa plasmid!-DNA:ta pilkotaan täydellisesti 50 piissä restriktiopuskuria joko Ncol:llä ja Sällillä (pGKM125), Ncolillä ja EcoRVillä (pGKM740) tai pelkästään

Ncolillä (pGKM126) seuraamalla toimittajan (Boehringer) 5 suosituksia. DNA seostetaan lisäämällä 5 μΐ 3 M nat- riumasetaattia, 100 mM MgCl2:ia, 5 mM EDTAita ja 150 μΐ etanolia. Sen Jälkeen, kun on inkuboitu -70 °C:ssa 15 minuutin ajan, DNA pelletoidaan sentrifugoimalla 13 000 g:llä 15 minuutin ajan SS34-roottorissa Sorvali-sentrifu- 10 gissa. Supernatantti heitetään pois ja pelletti resuspen- doidaan 80 pl:aan 0,089 M TRIS-boraattia, 0,089 M boori- happoa ja 0,002 M EDTA:ta (TBE-puskuria), joka sisältää 0,25 % bromifenolisinistä ja 0,25 % ksyleenisyanolia.

Elektroforeesi ajetaan neljä kertaa 20 pl:n näytteille 15 l%:isen agaroosigeelin läpi TBE-puskurlssa, joka sisältää 0,5 pg/ml etidiumbromidia, 50 voltilla, kunnes bromi- fenolisininen markkeri saavuttaa 10 cm pitkän ja 0,8 cm paksun geelin alareunan. DNA-fragmentit, jotka koodaavat kypsää TGF-βΙ:tä, TGF-p2:ta ja vastaavasti TGF-p3:a, vi- 20 sualisoidaan lyhytaaltoisella uv-valolla, leikataan irti partaterällä ja sähköeluoidaan geelin palasta Schleicher & SchUll Biotrap -laitteella käyttämällä 200 mamp 1,5 tunnin ajan. Eluoidut DNA-fragmentit saostetaan (katso *.V edellä) ja resuspendoidaan 20 pl:aan TE:tä.

• · t · * ia* \ Viisi mikrolitraa plasmidia pPLMu linearisoidaan pilkko- maila joko Ncolillä ja Sällillä, Ncolillä ja EcoRVillä j’·.. tai pelkästään Ncolillä ja geelipuhdistetaan, kuten edel- • 5*1*. lä on kuvattu fragmentti-DNAiille. 100 ng:aa llnearisoi- 30 tua ja puhdistettua pPLMu-vektori-DNAita ja vastaavan puhdistetun fragmentti-DNA:n kolminkertaista molaarista • «· *... ekvivalenttia inkuboidaan 4 °C:ssa 15 tunnin ajan 20 • · *

*.* piissä ligaatiopuskuria (70 mM TRIS/HC1, pH 7,5, 10 mM

*"*! MgCljiia, 5 mM DTTitä, 0,1 mM adenosiini-trlfosfaattia), 35 joka sisältää 1 yksikön DNA-ligaasia (Boehringer).

* * · | l \ Kymmenen mikrolitraa ligaatioseosta lisätään 200 pl:aan • · · • ·« • 118385 17 kylmiä (4 °C) kompetentteja E. coil LC 137 -soluja, jotka sisältävät plasmidin pcl857. Kun 30 minuuttia on kulunut, soluille aiheutetaan lämpösokki inkuboimalla niitä 1,5 mi nuutin ajan 42 eC:n vesihauteessa. Lisätään 2 ml LB-kasvu 5 alustaa ja viljelmää ravistellaan 60 minuutin ajan 30 °C:ssa. Kahdensadan mikrolitran erät maljataan LB-maljoil le, jotka sisältävät ampisilliinia ja kanamysiiniä, ja in kuboidaan 22 tunnin ajan 30 eC:ssa. Yksittäisiä pesäkkeitä viljellään ja plasmidi-DNA analysoidaan. TGF-pi:tä, 10 TGF-p2:ta ja TGF-p3:a koodaavien DNA-fragmenttien subk- loonaamisella pPLMuihun saadaan plasmidit pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu.hTGF-p2 ja vastaavasti pPLMu.hTGF-p3. Edellä mainitut konstruktit sisältäviä klooneja kutsutaan nimillä E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-pi, E. coli LC l37/pPLMu.hTGF-p2 15 ja vastaavasti E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3.

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-pl, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β2 ja E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3 -soluja indusoidaan lämmöllä (katso esimerkki IA) ja ilmentyneet proteiinit 20 analysoidaan SDS-PAGElla. TGF-pi, TGF-p2 ja TGF-p3 ilmestyvät kaikki 2 tunnin kuluttua lämpöinduktion jälkeen lämpöindusoituina proteiineina, jotka kulkevat noin 12 000 Da:n näennäisellä molekyylipainolla.

♦ ♦ ♦ • * • · • · · ;*· · 25 Esimerkki 1C: Transformanttien fermentointi • a ~ 1 1 m — ..........

* « · • i • · ♦ ♦♦ *...* E.coli LC 137/pPLMu.h.TGF-pi:n, E.coli LC 137/pPLMu.- ! *·· h.TGF-p2:n ja E.coli LC 137/pPLMu.h.TGF-p3:n yli yön vil- ··♦ *,· 5 jelmiä 2 l:n erlenmeyerpulloissa, jotka sisältävät 750 ml 30 LB-kasvualustaa, jossa on 40 mg/1 ampisilliinia ja kana-\\, mysiiniä, kasvatetaan 30 eC:ssa. Kolmesataa millilitraa j*·*· yli yön viljelmiä lisätään 750 ml:aan LB-kasvualustaa, * , joka sisältää antibiootteja edellä mainitun mukaisesti, 2 l:n erlenmeyerpulloissa ja kuumennetaan 42 °C:seen ravis- • * ·«·’ 35 telealalla noin 3,5 minuutin ajan 65 eC:n vesihauteessa.

Sitten pullot siirretään 42 eC:n ravistimeen ja niitä • · · * ·· * · 118385 18 inkuboidaan 3 tunnin ajan. Pullot jäähdytetään 12 °C:seen jäävesihauteessa ja solut otetaan talteen sen jälkeen, kun on sentrifugoitu 10 minuutin ajan 8000 rpm:llä GSA-roottorissa (Sorvali).

5

Esimerkki 2: TGF-B1:n. TGF-B2:n la TGF-B3;n ilmentäminen Saccharomvces cerevislaessa

Kypsän TGF-βΙίη, TGF-p2:n ja TGF-p3:n koodaavat sekvens-10 sit ilmennetään Saccharomyces cerevislaessa hiivan happaman fosfataasin (PH05) indusoituvan promoottorin säätelemänä.

Ilmentämisvektorit konstruoidaan kahdessa valheessa: 15 A. plasmidin pJDB207/PH05-RIT 12 konstruointi, B. plasmidien pJDB207R/PH05-TGF-pi, pJDB207R/PH05-TGF-p2 ja pJDB207R/PH05-TGF-p3 konstruointi, jolloin A)-kohdassa saadaan hiivavektori ja ΡΗ05-trans-20 kription terminaattori ja B)-kohdassa saadaan ekspressio-kasetit, joissa on kypsää TGF-pl:tä, TGF-p2:ta ja vastaavasti TGF-p3:ea koodaava insertti PH05:n promoottorin säätelemänä.

• « • Λ • « · • * · 25 Esimerkki 2A: Plasmidin DJPB207/PH05-RIT 12 konstruointi s » a · ♦ • · • e

Plasmidi p31RIT 12 (EP-patenttihakemus EP 277.313) li-nearisoidaan restriktioendonukleaasilla Sali. Osittainen ,'J·. HindiII-pilkonta etidiumbromidin läsnäollessa johtaa 1 30 kb:n Sall/Hindlll-fragmenttiin, joka sisältää 276 bp:n

Sall/BamHI pBR322-sekvenssin, hiivan happaman fosfataasin • « * PH05 534 bp:n promoottorin, hiivan invertaasln signaali- « S » sekvenssin (koodaa 19 aminohappoa) sekä PH05in transkrip- **"* tion terminaattorin. Plasmidin p31RIT 12 1 kb:n Sall/Hin- • *♦ 35 dl II-fragmentti kloonataan hi iva-E. coli-sukkulavektoriin * /. : pJDB207 (Beggs, J.D. teoksessa Molecular Genetics in ♦ *» e * I · · t e* # * 118385 19

Yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, s. 383-389), joka on pilkottu Sällillä ja Hindlllilla. Tulok sena saatua plasmidia, joka sisältää 1 kb:n insertin, kut sutaan pJDB207/PH05-RIT 12:ksi.

5

Esimerkki 2B; Plasmidin pJDB207R/PH05-TGF-B3 konstruointi

Plasmidi pGKM740 (TGF-p3) (katso esimerkki l.G) pilkotaan Ncolillä. Kohesiiviset päät (sticky ends) täytetään reak-10 tiolla Klenowin DNA-polymeraasin kanssa. Lisätään EcoRI-linkkeriä (5'-CCGGAATTCCGG; Biolabs) ja seos liitetään yhteen. Tuloksena saatua rengasmaista plasmidia kutsutaan pGKMA668:ksi (TGF-p3) ja se pilkotaan EcoRlillä ja Sallii lä. Agaroosigeelistä eristetään 0,4 kbin EcoRI/Sall-frag-15 mentti, puhdistetaan ja resuspendoidaan steriiliin veteen 25 pg/ml:n konsentraation. Fragmentti sisältää TGF-p3:n kypsän koodaavan sekvenssin, jossa on ATG kehyksen sisällä kodonille GCT, mikä määrää kypsän TGF-p3:n aminohapon Ala 1.

20

Plasmidista p31RIT 12 (katso edellä) eristetään 534 bpin BamHl/EcoRI-fragmentilla oleva PH05-promoottori. Plasmidi PJDB207/PH05-R1T 12 pilkotaan BamHIilla ja Xholillä. Eris • ♦ •,V tetään suuri, 6,8 kbin BamHI/xhoI-fragmentti. Fragmentilla*: 25 la säilyy PK05in transkription terminaattori. BamHI/Eco- | Rl-PH05-promoottorifragmentti, TGF-p3:ea koodaava Eco- RI/SalI-fragmentti ja BamHI/Xhol-vektorifragmentti liite- I**., tään yhteen. Yhtä oikeaa kloonia, jossa on TGF-p3-geeni • j*:*. PH05-promoottorin säätelemänä kloonattuna vastapäivä! seen 30 orientaatioon pJDB207:ään, kutsutaan pJDB207R/PH05-TGF- ··. P3:ksi.

• ·· * « « t \ Kypsät TGF-pi ja TGF-p2 ilmennetään analogisella tavalla * ***** S. cerevisiaessa. TGF-pi:n ja TGF-p3:n koodaavat sekvens- 35 sit sisältävät plasmidit ovat pGKM125 ja vastaavasti .*! : PGKM126 (katso esimerkki l.G). Kun nämä plasmidit on pil- *, · kottu Ncolillä, EcoRl-linkkerit lisätty ja ligaatio suori • · 118385 20 tettu, tuloksena saadut rengasmaiset plasmidit pilkotaan EcoRl:llä ja Sällillä. EcoRI/Sall-fragmentit kloonataan plasmidiin pJDB207, kuten edellä on kuvattu. Tuloksena saatuja plasmideja kutsutaan pJDB207R/PH05-TGF-pi:ksi ja 5 pJDB207R/PH05-TGF-β3:ksi.

Esimerkki 2C: S. cerevisiae -kannan GRF18 transformaatio

Saccharomyces cerevisiaen kanta GRF18 (MATa, his3-ll, 10 his3-15, leu2-3, leu2-112, can8, DSM 3665) transformoidaan plasmideilla pJDB207R/PH05-TGF-pl pJDB207R/PH05-TGF-p2 pJDB207R/PH05-TGF-p3 15 käyttämällä transformaatiomenetelmää, joka on kuvattu artikkelissa Hinnen A. et ai., (1978) PNAS 75: 1929. Transformoidut hiivasolut valikoidaan hiivan minimimal-joilla, joista puuttuu leusiini. Yksittäiset transformoidut hiivapesäkkeet eristetään ja ne on nimetty seuraa-20 vasti:

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-pi Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p2 ja .V: Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p3.

« « • ·, · • · « M· « ;*· · 25 Esimerkki 2D: S. cerevisiaen trans formant tien fermentaa- • · .*·*. tio 1a solu-uutteiden valmistus ··* • *> • · « «« *... Hiivatransformantit, kuten edellä on mainittu, sisältävät • · · 9 9 • φ · plasmidit, joissa on PH(?5-promoottorin säätelemät ekspres .. 30 siokasetit, ja sen vuoksi promoottorin esto on poistetta- • · va TGF-pl:n, TGF-p2:n tai TGF-p3:n ilmentymiseksi. Kuta- • · · *·[ * kin transformanttia kasvatetaan kahdessa peräkkäisessä ·;··· esiviljelmässä (10 ml ja 50 ml) korkean P1-pitoisuuden ,*··. omaavassa minimialustassa, joka on valmistettu Difcon • · « .· . 35 hiiva-typpi-perusalustan reseptin mukaan ilman aminohap- • · · *; ** poja, mutta (NH4)2S04:n sijasta se sisältää 10 g/1 L-aspa- • * * * ♦-• · 118385 21 ragiinia, 1 g/1 L-histidiiniä ja 20 g/1 glukoosia. Toisen esiviljelmän solut pestään 0,9%:isella NaClrlla ja kaikkia soluja käytetään siirrostamaan 100 ml matalaa (low) P^minimialustaa, joka on valmistettu Difcon hiiva-typpi-5 perusalustan reseptin mukaan (ilman aminohappoja), mutta se sisältää 0,03 g/1 KH2P04i 10 g/1 L-asparagiinia, 1 g/1 L-histidiiniä ja 20 g/1 glukoosia. Viljelmiä ravistellaan 30 eC:ssa 180 rpm:llä.

10 Solut otetaan talteen 10 ml:n viljelmästä 5, 24 ja 48 tun nin kohdalla sentrifugoimalla 3000 rpm:llä ja pestään ker ran 0,9%:isella NaCl:lla. Solupelletti resuspendoidaan lyysauspuskurissa [66 mM kaliumfosfaattia pH 7,4, 4 mM Zwittergenttiä (Calbiochem)]. Lisätään 8 g lasihelmiä 15 (läpimitaltaan 0,5-0,75 mm:n läpimitta) ja suspensiota ravistellaan voimakkaasti 4-5 kertaa aina 2 minuutin ajan kulloinkin Vortex Mixerillä kylmässä. Solu-uute dekantoi-daan lasihelmien poistamiseksi. Uutteessa oleva solujäännös sedimentoidaan sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 3000 20 rpm:llä 4 eC:ssa. Supematantti ja pelletit erotetaan ja säilytetään -20 °C:ssa.

*.*. Esimerkki 3 ♦ » : .·. Esimerkki 3A: Liukenemattoman, monomeerisen TGF-B3:n tai- • · · *·* ’ 25 teenotto E. colista m % · • · 9 · • · .Γ* E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3 -soluja fermentoidaan, kuten * · • · ♦ esimerkissä 1C on kuvattu. Solujen hajotus ja liukenemat- • ♦ · toman TGP-p3:n talteenotto suoritetaan 4 °C:ssa. Noin 18 30 g märkiä soluja suspendoidaan 60 ml:aan 0,1 M Γ ·· TRIS/HC1:ää, 10 mM EDTAita, 1 mM PMSF:ää (fenyylime- ’ taanisulfonyylifluoridi), pH 8,3 (hajotuspuskuri). Solut johdetaan kaksi kertaa Frenchpressin (SLM Instruments, • « ... Inc.) läpi valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tilavuus I · *!* 35 saatetaan 200 ml:ksi hajotuspuskurilla. Suspensiota sent- • · rifugoidaan 20 minuutin ajan 15 000 g:llä. Saatu pelletti • · *·.*·: suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka sisältää 1 118385 22 M NaCl:ia, ja sitä sentrifugoidaan 10 minuutin ajan kuten edellä. Pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspusku-ria, joka sisältää 1 %:n Triton X-l00:aa (Pierce), ja sitä sentrifugoidaan jälleen 10 minuutin ajan kuten edel-5 lä. Pesty pelletti suspendoidaan sitten 50 ml:aan 20 mM Tris/HCl:ää, 1 mM EDTA:ta, 1 mM FMSF:ää, 1 % DTT:tä ja homogenisoidaan Teflon-verkkojauhimessa (tissue grinder). Tuloksena saatu suspensio sisältää puhdistamatonta mono-meeristä TGF-p3:a liukenemattomassa muodossa.

10

Esimerkki 3B: Monomeerisen TGF-B3:n liuotus 1a puhdistus 15

Esimerkin 3A mukaisesti saadusta TGF-p3-suspensiosta 10 ml tehdään happamaksi 10%:isella etikkahapolla pH-arvoon 2,5 ja sentrifugoidaan Eppendorf-sentrifugissa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Supernatantti kromatogra-20 foidaan Sephacryl S-100 -pylväällä (Pharmacia, 2,6 x 78 cm) 10%:isessa etikkahapossa virtausnopeudella 1,4 ml/min. (Vaihtoehtoisesti kromatografia voidaan suorittaa Sephacryl S-100HR -pylväällä (Pharmacia) ja pylväs voi- « ·

: .·. daan ajaa l%:isessa etikkahapossa tai vastaavasti 5 mM

• · i \\\ 25 HCl:ssä). Ne monomeeristä denaturoitua ΤβΡ-β3:β sisältä- « * vät fraktiot yhdistetään, jotka eluoituvat 190 minuutin .**’ ja 220 minuutin välillä. Tätä materiaalia käytetään las- • « kostamiseen biologisesti aktiivisen, dimeerisen TGF-p3:n J · ♦ ·' * saamiseksi (esimerkki 4) tai lisäpuhdistukseen ja raken- 30 neanalyysiin (esimerkki 3D).

• · • · • ♦ · Λ ·♦« 5.5 5 Esimerkki 3C: Monomeerisen TGF-B3:n talteenotto Saccharo- muces cerevislaesta • · • · · : : 35 Rikkoutuneiden solujen muodostama pelletti, joka on saatu • * ·*.*·: 500 ml:sta edellä kuvatulla tavalla suoritettua fermentaa ·.*·· tiota, suspendoidaan 20 ml:aan 4 M ureaa, 0,1 M TRISiä, 1 118385 23 % DTT:tä, pH 8,0. Seosta pidetään huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan sekoittaen (vortexing) jaksoittain joka 5 minuutin välein. Liukenematon materiaali poistetaan sent-rifugoimalla 30 000 g:llä 30 minuutin ajan 4 eC:ssa ja 5 supernatantin pH säädetään arvoon 2,5 etikkahapolla ja dialysoidaan voimakkaasti 5%:ista etikkahappoa vastaan yli yön 4 eC:ssa. Liuosta sentrifugoidaan kuten edellä ja kirkas supernatantti konsentroidaan ultrasuodatuksella YM 10 -kalvolla (Amicon) lopulliseen 4 ml:n tilavuuteen.

10 Sitten näyte kromatografoidaan Sephacryl S-100 HR:llä (Pharmacia) 5%:isessa etikkahapossa, kuten esimerkissä 3 on kuvattu, jolloin saadaan monomeeristä TGF-p3:a.

Esimerkki 3D: Monomeerisen TGF-B3:n lisäpuhdistaminen RP-15 HPLC:llä

Sephacryl S-100-pylväästä saatujen yhdistettyjen fraktioiden (esimerkki 3.B) erät puhdistetaan Vydac 214TP5415 HPLC -käänteisfaasipylväällä (4,6 x 150 mm, The Separa-20 tions Group, Hesperia, GA, USA). Pylväs tasapainotetaan seoksessa, jossa on 70 % 0,l%:ista TFA:ta vedessä ja 30 % 0,08%:ista TFA:ta asetonitriilissä, ja tuotetta eluoidaan 'V. lineaarigradientilla 30 minuutin ajan virtausnopeudella 1 • · : .·. ml/min päätyen seokseen, jossa on 55 % 0,1%: is ta TFA: ta • · · j 25 vedessä ja 45 % 0,08%:ista TFA:ta asetonitriilissä. Eluaa • · tista seurataan absorbanssia 216 nm:ssä ja yksittäiset • ];*** piikit otetaan talteen manuaalisesti UV-absorbanssin mu- 4 kaan. Denaturoitu, monomeerinen TGF-83 eluoituu 21,5 mi- *·* * nuutissa. Erotteluun käytettävästä yksittäisestä kään- 30 teisfaasipylväästä riippuen sama TGF-β3-valmiste eluoituu • · ; *·· vastaavasti noin 16 ja 18 minuutissa.

♦ ·· • « « • « · TGF-β3-fraktiot analysoidaan RP-HPLC:llä käyttämällä sa- • · ...( maa pylvästä ja liuotinjärjestelmää kuin edellä. TGF- 35 p3:ea eluoidaan lineaarigradientilla 42 minuutin ajan • · V*: aloittamalla 100 %:sta 0,1%:ista TFA:ta vedessä ja pääty- *·/.: en seokseen, jossa on 30 % TFA:ta vedessä ja 70 % 118385 24 0,08%:lsta TFA:ta asetonitriilissä. TGF-83 eluoituu yhte- m nä piikkinä 30,4 minuutin kuluttua. Käytetystä yksittäisestä pylväästä riippuen saadaan 29 minuutin ja vastaavasti 29,9 minuutin retentioajat.

5

Esimerkki 3E; Monomeerlsen TGF-B3:n analysointi SDS-PAGEl la

Sephacryl S-100-pylväästä (esimerkki 3.B) tai käänteis-10 faasipylväästä (esimerkki 3.D) saadut yksittäiset erät kuivataan tyhjössä ja analysoidaan SDS-PAGElla 15%:isillä polyakryyliamidigeelilevyillä, jotka on värjätty Coomas-sie Blue R-250:llä. Saadaan yksi, näennäiseltä molekyyli-painoltaan noin 12 000 Da:n vyöhyke, jota ei voida erot-15 taa pelkistetystä luontaisesta sian TGF-p3:sta.

Esimerkki 3F: Monomeerlsen TGF-B3:n N-terminaallsen aminohapposekvenssin määritys 20 TGF-p3 esimerkistä 3.B haihdutetaan tyhjössä, liuotetaan 25 μΐ:aan 0,1 M etikkahappoa ja sen aminohapposekvenssi määritetään kaasufaasiprotelinisekvensoijalla, jonka mal-li on 470A (Applied Biosystems).

• « • * · • · ♦ .·, · 25 N-terminaalinen aminohapposekvenssi on identtinen sekvens • · I./ silistassa SEKV. ID N0:ssa 6 esitetyn sekvenssin kanssa.

* t ··· • · t ·..

Esimerkki 4: TGF-B3:n in vitro -laskostus dimetvvllsulfok ί · * ·* * sidla (DMS0:ta) sisältävässä puskurissa 30 • · : ’·· Edellä kuvatulla tavalla saatu TGF-p3 laskostetaan 4 ·»·

V : “C:ssa puskurissa, jonka koostumus on 0,1 M Trisiä, 1 M

NaCl:a, 0,5 M arginiinia, 5 mM pelkistettyä glutationia • * «... ja vastaavasti 40 % (v/v) DMS0:ta. Puskurin pH säädetään *!* 35 pH-arvoon 9,5 NaOH: 11a. TGF-p3:n lopullinen konsentraatio • « :.*·ί on 0,1 mg/ml. Kun liuosta on pidetty 7 päivän ajan 4 *·.*·: °C:ssa, sen happamuutta lisätään väkevällä etikkahapolla 118385 25 pH-arvoon 3,5, ja se konsentroidaan noin 10-kertaisesti ultrasuodattamalla Amicon-sekoituskammiossa (stirred cell) YMlO-kalvolla (Amicon). Konsentroitu liuos laimennetaan alkuperäiseen tilavuuteen 0,1 M etikkahapolla ja 5 konsentroidaan uudelleen. Tämä menettely toistetaan kahdesti. Sitten liuokselle tehdään ioninvaihtokromatogra-fia, kuten jäljempänä kuvataan.

Esimerkki 5: TGF-83:n in vitro -laskostus dimetwllforma-10 midia (DMF:ää) sisältävässä puskurissa

Edellä kuvatulla tavalla saatu TGF-p3 laskostetaan 4 eC:ssa puskurissa, jonka koostumus on 0,1 M Trissiä, 1 M NaCl, 0,5 M arginiinia, 5 mM pelkistettyä glutationia ja 15 vastaavasti 30 % (v/v) DMF:ää. Puskurin pH säädetään pH-arvoon 8,5. TGF-p3:n lopullinen konsentraatio on 0,1 mg/ml. Kun liuosta on pidetty 7 päivän ajan 4 °C:ssa, sen happamuutta lisätään väkevällä etikkahapolla pH-arvoon 3,5, ja se konsentroidaan noin 10-kertaisesti ult-20 rasuodattamalla Amicon-sekoituskammiossa (stirred cell) YMlO-kalvolla (Amicon). Konsentroitu liuos laimennetaan alkuperäiseen tilavuuteen 0,1 M etikkahapolla ja konsent-roidaan uudelleen. Tämä menettely toistetaan kahdesti.

« · :.·. Sitten liuokselle tehdään ioninvaihtokromatografia, kuten m · : 25 jäljempänä kuvataan.

• * • » «I· • * • *

Esimerkki 6t Dlmeerisen biologisesti aktiivisen TGF-B3:n eristys kationinvaihtokromatoarafiällä s : : 30 Esimerkissä 4 tai vastaavasti esimerkissä 5 saatua liuos- * · : *♦· ta, joka sisältää noin 10-50 mg TGF-p3:a, syötetään vir- ··· ϊ#ί ί tausnopeudella 6 ml/min HiLoad 26/10 S-Sepharose High Per formance -pylvääseen (Pharmacia). Ensin pylväs pestään 20 « ...( mM natritimasetaatilla, 30%:isella isopropyylialkoholilla, I · *!’ 35 pH 4,0 (A-puskuri) 5 minuutin ajan ja eluoidaan sitten • · ·/·· lineaarigradientilla 45 minuutin ajan aloittamalla A-pus- kurista, joka sisältää 0,2 M NaCl, ja päätymällä A-pusku- 118385 26 riin, joka sisältää 0,5 M NaCl:a. Eluaattia seurataan 280 nm:ssä ja fraktioidaan manuaalisesti. Fraktioista tutkitaan dimeerinen TGF-p3 ei-pelkistävällä SDS-PAGE:11a ja biologinen aktiivisuus in vitro -biomäärityksellä.

5

Esimerkki 7: Dimeerisen TGF-B3:n lisäpuhdlstus la karakte risointi

Esimerkki 7Ai Puhdistus RP-HPLC:llä 10 Fraktiot, jotka sisältävät dimeeristä biologisesti aktiivista TGF-p3:a, yhdistetään, dialysoidaan 0,1 M etikka-happoa vastaan tai laimennetaan samalla tilavuudella 0,1-%:ista TFA:ta vedessä ja suoritetaan RP-HPLC Vydac 214TP510 HPLC -käänteisfaasipylväällä (1 cm x 25 cm, The 15 Separations Group, USA). Pylväs tasapainotetaan virtausnopeudella 4,5 ml/min seoksella, jossa on 75 % liuotinta A [0,l%:ista TFA:ta vedessä] ja 25 % liuotinta B [0,08%:ista TFA:ta asetonitriilissä]. Näytteen syöttämisen jälkeen pylväs pestään tasapaino-olosuhteissa, kunnes 20 235 nm:ssä seurattu absorptio on saavuttanut perusviivan tason. Sitten pylvästä eluoidaan 30 minuutin ajan llneaa-rigradientilla, joka alkaa tasapaino-olosuhteista ja pää-,Y: tyy seokseen, jossa on 45 % liuotinta A ja 55 % liuotinta m · : .*. B. Eluaatti fraktioidaan manuaalisesti ja analysoidaan .·. : 25 ei-pelkistävällä SDS-PAGE:11a sekä in vitro -biomäärityk- ,’··*. sellä.

··· • 9 t *... Esimerkki 7B; SDS-PAGE-analyysi t : : 30 Esimerkin 7A puhdistetun TGF-p3:n erät kuivataan tyhjössä ί '* ja analysoidaan SDS-PAGE:11a (Laemmli, U.K. (1970) Nature ««* V ; 227: 680) 15%:isillä polyakryyliamidigeelilevyillä, jotka on värjätty Coomassie Blue R-250:lla. PelkistämätÖn näyte ,···. tuottaa yhden, näennäiseltä molekyylipainoltaan noin 25 **’ 35 kDa:n vyöhykkeen, kun taas pelkistetty näyte tuottaa noin *·*" 12,5 kDa:n vyöhykkeen.

• i • · · • ·· • · 118385 27

Esimerkki 7C: Molekvylipainon määritys

Esimerkin 7 A puhdistettu TGF-p3 analysoidaan elektroni-suihku-ionisaatiomassaspektrometrialla (ESI-MS). Havaittu 5 kokonaismassa on hyvin lähellä teoreettisesti odotettua arvoa.

Esimerkki 7D: Aminohappoanalvvsi 10 Aminohappoanalyysi suoritettiin, kuten on kuvattu artikkelissa Knecht, R. ja Chang, J.-X., Analytical Chemistry 58: 2375-2379 (1986). Tulokset sopivat hyvin yhteen teorian kanssa.

15 Esimerkki 7E: N-terminaalisen aminohapposekvenssin määritys 10-20 pg esimerkin 7A TGF-p3:a haihdutetaan tyhjössä, liuotetaan 25 μΐ:aan 10 mM etikkahappoa ja sen aminohap- 20 posekvenssi määritetään kaasufaasisekvensoijalla, joka on mallia 477A (Applied Biosystems). Kymmenen ensimmäisen tähteen määritetty aminohapposekvenssi oli, teorian pe- *.·. rusteella odotetun mukainen.

• · · • · • · • · · * « * j 25 Esimerkki 7F: Proteolvvttinen fraomentolnti Asn-N-proteaa ‘I..1 silla : : ·*« • 9 • ** 92 pg (6,7 nmol) TGF-p3:a pelkistetään, 4-vinyylipyridyy- : lietyloidaan, kuivataan tyhjösentrifugissa ja liuotetaan

30 uudelleen 200 pl:aan 5 mM HCl:ää. Lisätään 200 pl 0,2 M

Tris-asetaattipuskuria, pH 7,8, joka sisältää 10 mM Zwit- :*«*: tergentti 3-12 -detergenttiä (Calbiochem Corporation, La 4* j Jolla, CA), ja sekoitetaan proteiiniliuoksen kanssa. Pil- ... konta suoritetaan 2 pg:n (liuotettu 50 pl:aan vettä) | * 35 kanssa endoproteinaasia Asp-N (Pseudomonaksen fragt -mu- • · !.*·· tantista, sekvenssilaatu, Boehringer Mannheim Biochemica, :\i Saksa) 37 eC:ssa. Kun 13 tuntia on kulunut, lisätään 50 118385 28 μΐ 10%:ista (ν/ν) TFA:ta ja seos erotellaan RP~HPLC:lia Vydac 218TP5415 -pylväällä (4,6 mm x 150 mm, The Separations Group) lineaarigradientilla 5%:isesta 45%:iseen (v/v) asetonitriiliin 0,l%:isessa TFA/vedessä 40 minuutin 5 ajan virtausnopeudella 0,1 ml/min. Eristetyt peptidit analysoidaan elektronisuihku-ionisaatiomassaspektromet-rialla (ESI-MS). Määritetyt molekyylipainot sopivat hyvin yhteen odotettujen Asp-N-fragmenttien laskennallisten arvojen kanssa.

10

Identifioidut fragmentit käsittävät koko aminohapposekvenssin tähteitä 1 ja 2 lukuunottamatta. Nämä aminohapot tunnistetaan kokonaisen proteiinin N-terminaalisen sekvenssin määrityksen sekä V8-fragmenttien analyysin perus-15 teella.

Esimerkki 7G: Proteolvvttinen fraomentointi V8-proteaasil la 20 Samalla tavalla kuin esimerkissä 11 Asp-N-proteaasin kanssa 4-vinyylipyridyloitu TGF-p3 pilkotaan proteaasilla V8 ja fragmentit erotellaan RP-HPLC:llä ja analysoidaan ESI-MS:llä. Määritetyt molekyylipainot sopivat hyvin yh- • * j teen teoreettisten arvojen kanssa, mikä edelleen varmis- ·*· * ,·. : 25 taa TGF-p3:n tunnistuksen. Identifioidut fragmentit kat- ,’··] tavat koko 112 aminohappotähteen sekvenssin.

• » ·»· «· \ '··

Esimerkki 8; Laskostetun TGF-Brn in vitro -aktilvisuustut I·* ·* ' kirnusi Minkin keuhkoepiteelisolun (Mv-1-Lu) hapan fosfa- 30 taasimääritvs ·· • · f ·· **· V : TGF-p tai hybridiproteiini seulotaan in vitro biologises- ....: sa solun määrityksessä, joka mittaa yhdisteen tehon jat- ···, kuvan minkin keuhkoepiteelisolulinjan Mv-l-Lu I · *t* 35 (ATCC/CCL64) kasvun inhiboinnissa. Mv-l-Lu-solulinja on • · \’’i osoittautunut olevan herkkä reportteri TGF-p: jen biomää- • · :,*·· rityksessä muodostamalla sigmoidin muotoisen konsentraa- 118385 29 tiovasteen, jonka raportoitu EC50 on noin 10-50 pg/ml (Tucker et al.r Science 1984, 226: 705-707; Absher et ai., J. Immunol. Methods 1991, 138: 301-303; Danielpour et ai., J. Cell Physiol., 1989, 138: 79-86). Mv-l-Lu-so-5 luja, joiden lisääntymistä TGF-β Inhiboi voimakkaasti, pidetään tällä hetkellä parhaiten sopivana solulinjana tämän sytokiinin analyyttisen biomäärityksen kehittämiseen (Kelley et ai., Exp. Lung Res. 1992, 18: 877-887; Meager, J. Immunol. Methods., 1991, 141: 1-14). Määritys 10 suoritetaan 96-koloisilla mikrotiitterilevyillä käyttämällä soluja, jotka saatiin alun perin viljelyvaiheesta (passage) 46 talletuslaitokselta American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. Solut siirrostetaan alhaisella tiheydellä (5000 solua/kolo) kasvualustassa (mi-15 nimiessentiaalikasvualusta, jossa on 5 % (v/v) naudan sikiön seerumia), joka sisältää TGF-p-standardin tai näytteen laimennossarjoja. Sitten määrityksiä inkuboidaan 37 °C:ssa kostutetussa 5%:isessa C02-inkubaattorissa 72 tunnin ajan. Solujen lisääntymisen inhibitio määritetään 20 herkällä entsymaattisella solunvärjäysmenetelmällä (jolla saadaan kussakin kolossa tuotetun happaman fosfataasimää-rän kolorimetrinen arvio), värjäyksen voimakkuus vastaa 9 9 •'V kussakin kolossa olevien solujen lukumäärää. Kunkin kolon j t*: absorbanssi O.D. määritetään 405 nm:ssä ja määritysai- :*· · 25 neisto plotataan ja analysoidaan sopivalla PC-ohjelmalla.

* 9 .***. Tässä määrityksessä yksi aktiivisuus yksikkö (U, unit) 999 j*. kuvataan sellaisena TGF-β:n määränä, joka tarvitaan inhi- *·.·, boimaan puolet Mv-1-Lu-solujen maksimaalisesta lisäänty- misestä.

30 9 9 • ·* 9 99· a · » 9 9 9 • * ·

99U

i : 999 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9·9 9 ·· • a 118385 30

Esimerkki 9: Laskostuneen TGF-B3:n in vivo -aktiivisuus-tutkimukset

Esimerkki 9A: Osittaissvwlsten (Partial-Thickness) haavo 1en paraneminen vanhoissa hiirissä 5

Haavan paranemisprosessien tiedetään heikkenevän iän myötä (Grove, G.L. (1982) Arch. Dermatol. Res. 272:381) ja sen vuoksi ne ovat tärkeitä ongelmia geriatrisessa lääketieteessä. Siitä syystä tutkitaan laskostuneen, aktiivi-10 sen dimeerisen TGF-p3:n biologisia vaikutuksia in vivo osittaissyvyisten haavojen (muodostuneet toisen asteen palovammoissa) paranemiseen osittain vajavaisessa tai heikentyneessä haavan paranemistilanteessa, nimittäin vanhoissa eläimissä, käyttämällä seuraavaa menettelyta-15 paa, joka on samanlainen kuin artikkelissa Schultz et ai. (1987) Science 235: 350 on kuvattu.

Anestesioitujen vanhojen C57/BL6-hiirien (450 päivää tai vanhempia), joiden selät on aikaisemmin ajettu paljaiksi 20 kaupallisella voidemaisella karvanpoistoaineella, dorsaa-liin rintakehään aiheutetaan yksittäisiä mlddermaalisia lämpövaurioita käyttämällä 10 sekunnin ajan yhtä messinki • · esinettä (lxl cm, 8 g), joka on tasapainotettu 80 \ °C:ssa vesihauteessa. Tuloksena muodostuva rakkula pois- • s· a ·’· · 25 tetaan kirurgisesti ja palovammoja käsitellään päivittäin • « .***. 5 päivän ajan panemalla paikallisesti 25 μΐ steriiliä apuainepuskuriliuosta (joka koostuu 0,8%:isesta (w/v) * t# hydroksipropyyliselluloosasta liuoksessa, jossa on 10 mM ** ’ histidiiniä, 140 mM NaCl, pH 7,4), joka sisältää eri mää- 30 riä (500 ng, 100 ng tai 10 ng) laskostettua aktiivista :dimeeristä TGF-p3:a, tai pelkästään puskuriliuoksella tai V : ne jätetään hoitamatta. Kaikki paikallisesti annettavat ····· materiaalit ovat steriilejä, endotoksiinittomia ja pyro- I***. geenittömiä, ja kaikki hiiret pidetään kokeen aikana hä-

• M

s* ( 35 keissä yksittäin. Jokainen koeryhmä koostuu viidestä 1 eläimestä.

• · t * · • ·♦ » · 118385 31

Viiden päivän TGF-p3-hoidon jälkeen hiiret nukutetaan, rakkulat (jos niitä on) poistetaan kirurgisesti palovammoista ja palovammat valokuvataan. Ne palovamma-alueet, joissa epiteeli on regeneroitunut, piirretään piirtohei-5 tinkalvolle yhtenäisen paksuisina (areas .... are outlined onto uniform thickness transparent overhead projector film) ja jokaisen parantuneen alkuperäisen palovamma-alueen prosenttiosuus lasketaan planimetrisesti. Tuloksia verrataan myös epiteelin regeneraatioprosessiin nuorissa 10 (56-84 päivän ikäisissä) C57/BL6-hilrlssä, joilla on sa manlaisia middermaalisia palovammoja, jotka jätetään kokeen aikana hoitamatta.

Planimetristen analyysien tulokset osoittavat, että las-15 kostuneen, aktiivisen dimeerisen TGF-p3:n paikallinen anto päivittäin viiden päivän ajan sopivassa apuainepus-kurissa stimuloi ja nopeuttaa epiteelin uusiutumista vanhojen hiirien osittaissyvyisissä haavoissa annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna pelkästään apuainepusku-20 rilla käsiteltyihin tai hoitamattomiin haavoihin. Nuoret hiiret kykenevät ilmeisesti riittävän onnistuneesti uudistamaan haavoihinsa epiteelin ilman mitään paikallises-.V: ti annettavaa TGF-p3:ea. Histologisissa analyyseissä pal- • ·1· jastuu voimistuneen epiteelin uusiutumisprosessin laajuus M» · j 25 yhdessä uudistuneen ihon hyperkeratoosin kanssa kuudente- t m ,·**, na päivänä TGF-B3-hoidetuissa haavoissa.

• 1 • M ·· t 1..

Esimerkki 9B: Tävssvvvisten (full-thickness) haavojen * paraneminen aikuisilla rotilla 30 J 1' Laskostuneen aktiivisen dimeerisen TGF-p3:n biologisia V 1 vaikutuksia tarkastellaan myös toisessa in vivo haavan pa * ..··· ranemismallissa, nimittäin täyssyvyisten haavojen (muodos .···, tettu kirurgisella leikkauksella) paranemiseen aikuisilla *·1 35 rotilla käyttämällä samanlaista menetelmää kuin on kuvat- .·.: *. 1ϊ tu artikkelissa Mustoe, T.A. et ai., (1987) Science 237: N 1333.

118385 32

Pentobarbitonilla anestesioiduille Wistar-urosrotille (300-350 g), joiden selät on aikaisemmin ajeltu ja karvat poistettu kaupallisella voidemaisella karvanpoistoaineel-la, tehdään leikkaussaksilla yksi täyssyvyinen 5 cm pitkä 5 lineaarinen leikkaushaava molemmille puolille 1,5 cm:n päähän dorsaalisesta keskiviivasta. Koeryhmissä vasemmalla puolella (katsottuna selkäpuoli ylöspäin) olevan haavan reunoihin applikoidaan topikaalisesti (100 μΐ) steriiliä apuainepuskuria (joka koostuu 0,8%:isesta (w/v) 10 hydroksipropyyliselluloosasta liuoksessa, joka sisältää 10 mM histidiiniä, 140 mM NaCl, pH 7,4), joka sisältää eri annoksia (2 pg, 1 pg, 0,1 pg tai 0,01 pg) laskostettua aktiivista dimeeristä TGF-p3:a. Vastakkaisella oikealla puolella olevan haavan reunoihin pannaan vastaava 15 määrä plasebo-kontrollia (naudan seerumin albumiinia) mainitussa apuainepuskurissa, ja kontrollieläinten haavojen reunoihin pannaan vasemman puolen haavoissa apuainepuskuria ja oikean puolen haavat jätetään leikkaushaavan tekemisen jälkeen hoitamatta. Kaikki paikallisesti 20 annettavat materiaalit ovat steriilejä, endotoksiinitto-mla ja pyrogeenittömiä. Sitten jokaisen haavan reunat lähennetään 5:llä tasaisesti asetetulla horisontaalisella katkonaisella patjaompeleella 5-0 Ethilon. Kaikkia eläi- • :*· miä pidetään erikseen häkeissään ja haavojen annetaan M· * .*. · 25 parantua käsittelyn jälkeen eri ajanjaksoja 21 päivään S 9 asti sen sisältäen. Eläinten lopetuksen jälkeen jokaises- «·.' ta eläimestä irrotetaan koko selänpuolen iho ja kaikki • ...( ihonalainen rasva leikataan huolellisesti pois jokaisen * ihon alapuolelta leikkausspaattelia käyttäen. Sitten 30 ihosta leikataan suikaleita (kunkin leikkaushaavan ommel- • " ten välistä) käyttämällä templaattia, joka koostuu kah- V : desta samansuuntaisesta leikkausterästä (terien väli on 8 9 ».··· mm), vetolujuuden mittaamiseksi. Histologiseen analyysiin i'*', otetaan näytteet jokaisen leikkaushaavan toisesta päästä.

t 35 Kunkin leikatun ihonäytteen kestämä maksimikuorma mitä- v * · '·*ί taan laitteella Universal Tensile Strength Machine, malli • * *.**: 144501 (Zwick, Ulm, Saksa). Mittaukset tehdään 30 mm x 8 118385 33 mm suikaleille, jotka kiinnitetään lujasti hydraulisten puristinten väliin, minkä jälkeen niitä venytetään murtu-mispisteeseen nopeudella 10 nun/minuutti, ja maksimikuorma rekisteröidään piirturiin (chart recorder). Mittaukset 5 tehdään kolmelle näytteelle kustakin haavasta ja koeryhmät koostuvat 4 eläimestä. Murtumislujuutta ei mitata haavoille, joissa näkyy infektion merkkejä tai liiallista verenvuotoa (alle 3 % kaikista haavoista).

10 Vetolujuuden mittaustulokset osoittavat, että yksi topi-kaalinen anto laskostettua aktiivista dimeeristä TGF-p3:a sopivassa apuainepuskurissa vahvistaa täyssyvylsten leikkaushaavojen murtumislujuutta jopa kaksinkertaisesti ja nopeuttaa paranemista aikuisilla rotilla annoksesta riip-15 puvalla tavalla yli 21 päivän ajanjaksona kontrolliryhmään verrattuna. Histologiset analyysit paljastavat merkittävästi kohonneen mononukleaaristen solujen, fibro-blastien ja kollageenin tuotannon lisääntymisen (influx) TGF-p3-hoidetuissa haavoissa 21 päivän ajanjakson aikana 20 kontrollihaavoihin verrattuna. Myös selvää ohimenevää hyperkeratoosia esiintyy TGF-p3-hoidetuissa haavoissa 14 päivään asti hoidon jälkeen.

• · • 1 2 ♦ · 9 « 1 ·'» Esimerkki 10: Liuotettujen monomeeristen hvbridi-TGF-B- !·· · ,·, ϊ 25 proteiinien valmistus 9 #♦1 S ·

* V

Γ’ Viisi millilitraa plasmidia pPLMu linearisoidaan pllkko- maila NcoI:llä ja Sall:llä ja geelipuhdistetaan, kuten 2 1 edellä fragmentti-DNAiille on kuvattu. 100 ng:aa lineari- 30 soitua ja puhdistettua pPLMu-vektori-DNA:ta ja 3 x molaa-: ” rinen ekvivalentti vastaavaa puhdistettua fragmentti- V s DNA:ta, joka koodaa sekvenssilistassa esitettyjä hybride- jä TGF-pi-3, TGF-p2-3 ja vastaavasti TGF-p3-2, inkuboi-*··, daan 4 · C:ssa 15 tunnin ajan 20 ml:ssa ligaatiopuskuria 35 (70 mM THIS-HCl:ää, pH 7,5, 10 mM MgCl2:ia, 5 mM DTT:tä, *.1? 0,1 mM adenosiinitrifosfaattia), joka sisältää 1 yksikön *.'·· DNA-ligaasia (Boehringer). Sitten 10 ml ligaatioseosta 118385 34 lisätään 200 ml:aan kylmiä (4 °C) kompetentteja E. coll LC137 -soluja, joissa on plasmidi pcl857. Kun 30 minuuttia on kulunut, soluille annetaan lämpösokki inkuboimalla niitä 1,5 minuutin ajan 42 °C:n vesihauteessa. Lisätään 2 5 ml LB-kasvualustaa ja viljelmää ravistellaan 60 minuutin ajan 30 eC:ssa. LB-maljollle, jotka sisältävät am-pisilliinia ja kanamysiiniä, maljataan 200 ml:n erät ja inkuboldaan 22 tunnin ajan 30 eC:ssa. Yksittäisiä pesäkkeitä viljellään ja plasmidi-DNA analysoidaan. TGF-βΙ-10 3:ea, TGF-p2-3:a ja TGF-p3-2:ta koodaavien DNA-fragment tien subkloonaus pPLMu:hun johtaa plasmideihin pPLMu.TGF-β1(44/45)β3, pPLMu.TGF-p2(44/45)β3 ja vastaavasti pPLMu.-TGF-p3(44/45)β2. Edellä mainittuja konstrukteja sisältäviä klooneja kutsutaan nimillä E.coll LC137/pPLMu.TGF-15 β1(44/45)β3, E.coil LC137/pPLMu.TGF-p2(44/45)β3 ja vas taavasti E.COll LC137/pPLMu.TGF-p3(44/45)β2.

E.coll LC137/pPLMu.TGF-βΙ(44/45)β3:ea, E.coll LC137/pPL-Mu.TGF-p2(44/45)β3:ea ja E.coll LC137/pPLMu.TGF-20 β3(44/45)β2:ta indusoidaan lämmöllä seuraavasti (katso myös esimerkki 3.A) ja ilmentyneet proteiinit analysoidaan SDS-PAGE:11a. TGF-pl-3, TGF-p2-3 ja TGF-p3-2 ilmes- ., tyvät kaikki 2 tunnin kuluttua lämpöinduktiosta lämmön « · *·*;' indusoimina proteiineina, jotka kulkevat noin 12 000 Da:n : 25 näennäisellä molekyylipainolla.

* · • * · • * • t E.coll LC137/pPLMu.TGF-pl(44/45)β3:η, E.coll * *· LC137/pPLMu.TGF-β2(44/45)β3:n ja E.coll LC137/pPLMu.TGF- ίρί : β3(44/45)β2:η yli yön viljelmiä 2 l:n erlenmeyerpullois- 30 sa, jotka sisältävät 750 ml LB-kasvualustaa, jossa on 40 mg/1 ampisilliinia ja kanamysiiniä, kasvatetaan 30 eC:ssa. Kolmesataa millilitraa yli yön viljelmiä lisätään * · · ’· 750 ml:aan LB-kasvualustaa, joka sisältää antibiootteja • » · · · * * kuten edellä on mainittu, 2 l:n erlenmeyerpulloissa ja • · · 35 kuumennetaan 42 eC:seen ravistelemalla noin 3,5 minuutin .*..· ajan 65 eC:n vesihauteessa. Sitten pullot siirretään 42 » · • · • t * • »· * · 118385 35 eC:iseen ravistimeen ja niitä inkuboidaan 3 tunnin ajan. Pullot jäähdytetään 12 °C:seen jää-vesihauteessa ja solut otetaan talteen sen jälkeen, kun on sentrifugoitu 10 minuutin ajan 8000 rpmtllä GSA-roottorissa (Sorvali).

5

Monomeerisen liuotetun TGF-pi-3-hybridin tuottamiseen jäi jempänä annetut menetelmät koskevat myös TGF-p2-3:n ja TGF-p3-2:n liuotusta.

10 E.coli LC137/pPLMu.TGF-pi(44/45)β3-soluja fermentoidaan, kuten edellä on kuvattu, ja inkluusiokappaleet valmistetaan seuraavasti. Solujen hajotus ja inkluusiokappaleiden talteenotto suoritetaan 4 °C:ssa. Noin 18 g märkiä soluja suspendoidaan 60 ml:aan 0,1 M TRIS/HCl:ää, 10 mM EDTA:ta, 15 1 mM PMSF:ää (fenyylimetaanisulfonyylifluoridia), pH 8,3 (hajotuspuskuri). Solut johdetaan kaksi kertaa Frenchpres sin (SLM Instruments, Inc.) läpi valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tilavuus saatetaan 200 ml:ksi hajotuspusku-rilla. Suspensiota sentrifugoidaan 20 minuutin ajan 15 20 000 g:llä. Saatu pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajo- tuspuskuria, joka sisältää 1 M NaCl:ia, ja sitä sentrifugoidaan 10 minuutin ajan kuten edellä. Pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka sisältää 1 % .V: Triton X-100:aa (Pierce), ja sitä sentrifugoidaan jälleen * 25 10 minuutin ajan kuten edellä. 0,3 g pestyä pellettiä • · · ·

· suspendoidaan sitten 10 ml:aan 20 mM Tris/HCliää, 1 mM

EDTA:ta, 1 mM PMSF:ää, 0,1 % DTT:tä, pH 8,0, ja sekoite-··. taan magneettisekoittimella 1 tunnin ajan huoneenlämpöti- *...# lassa. Sitten näyte saatetaan pH-arvoon 2,5 väkevällä • t * * 30 etikkahapolla ja homogenisoidaan Teflon-verkkohomo- genisaattorilla ja sentrifugoidaan Centricon H-401-sent- • · • ** rifugilla (Kontron Instruments), jossa on kiinteäkulmai- • · · V * nen roottori A.8.24, 60 minuutin ajan 15 eC:ssa ja 12 000 ....: rpm:llä. Kirkkaan supernatant in etikkahappo korvataan 10 .···. 35 mM HCl:llä Amicon 8010 -sekoituskammiossa, jossa on YM05- • · *·* suodatin, toistuvalla konsentroinnilla ja liuoksen lai- • · J.*" mentamisella 10 mM HCl:llä.

• · • · · • ·♦ • · 118385 36

Esimerkki 11: Saria laskostuskokeita eri TGF-β-molekyyleillä 1a TGF-B-hvbrideillä

Keksinnön monipuolisuudesta ja laajasta sovellettavuudes-5 ta ovat esimerkkeinä tulokset, joista esitetään yhteenveto kahdessa seuraavassa esimerkkien sarjassa. Ne spesifiset olosuhteet ja yksittäiset proteiinit luetellaan, joita käytettiin proteiinin in vitro -laskostuskokeita. Muut koeolosuhteet ovat, kuten esimerkissä 4 on kuvattu. Bio-10 loginen aktiivisuus määritettiin 3. ja 7. päivänä proteiinin in vitro -laskostuskokeen alkamisesta.

* » · * i » • · • · * · • · • · · · • · • 1 · • · φ 1 • · · • 1 • · • · 1 *· • « · • · · « · 1 • ·

Φ I

» · 1 * • · » * · · • · · • · • · · t : * · · • · • · « * · · • · · • · · • · · * · 118385 37

In vitro laskostus orgaanisessa liuottimessa ilman deter-genttiä: Biomäärityksen tulokset

No RSH_DMSO DMF pH TGF-B_m\v\suus 1. ) 2.5mM GSH 10% 9.5 03 + 2. ) 2.5mM GSH 20% 9.5 63 + 3. ) 2iimM GSH 30% 8.0 63 + 4. ) 2.5mM GSH 30% 9.5 63 ++ 5. ) 2.5mM GSH 40% 9.5 63 ++ 6. ) 2.5mM GSH 50% 9.5 63 ++ 7. ) 2.5mM GSH 40% 6.5 63 + 8. ) 2.5mM GSH 40% 7.5 63 + 9. ) 2.5mM GSH 40% 8.5 63 + 10. ) 2.5mM GSH 40% 10.5 63 ++ 11. ) O.OmMGSH 40% 9.5 63 + 12. ) 2.5mM GSH 40% 9.5 62 + 13. ) 2.5mM GSH 40% 9.5 61-3 + 14. ) 2.5mM GSH 40% 9.5 63-2 + 15. ) 2.5mM GSH 40% 9.5 62-3 + 16. ) 2.5mM GSH 10% 9.5 63 + 17. ) 2.5mM GSH 20% 9.5 63 ++ 18. ) 2.5mM GSH 30% 9.5 63 ++ • • :*: 19.) 2.5mMGSH 40% 9.5 63 + • · · · : 20.) 2.5mM Kysteiini 4o% 9.5 63 + • * 21.) 2.5mM Kysteamllnl 40% 9.5 63 + • · · • · ♦ • * · t · * l · · * * · * m • * · « • * · • · · • · · » m • « • · · > : • · · * • · • · · • · · • « » · « I · • · ♦ • · 118385 38 RSH: sulfhydryylireagenssl, joka on taulukossa spesifioitu 6SH: pelkistetty glutationi DMSO: dimetyylisulfoksidi 5 DMF: dlmetyyliformamidi p3: TGF-p3 p2: TGF-p2 pl-3: TGF-pl-3-hybridi P3-2: TGF-p3-2-hybridi 10 p2-3: TGF-p2-3-hybridi

Aktiivisuus: +: keskinkertainen aktiivisuus in vitro bio-raäärityksessä, joka on kuvattu esimerkissä 8 ++: korkea aktiivisuus in vitro biomäärityksessä, joka on kuvattu esimerkissä 8.

15

Mikro-organismien talletus

Seuraavat mikro-organismit talletettiin talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mlkroorganlsmen (DSM), Masche-20 roder Weg lb, D-3300 Braunschweig (Saksa): mikro-organismi talletuspäivä talletusnumero E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-pl 28.11, 1989 DSM 5656 \V E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p2 28.11, 1989 DSM 5657 • 1 i 25 E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3 28.11, 1989 DSM 5658 ·.1 : Saccharomyces cerevisiae GRF18 4.3, 1986 DSM 3665 • · · • « • 1 ·1« ·» i 1..

• ·1 1· · • · *· • m • · · * • 1 • « · I » t • 1 • · i : • · · * · » » i • · · 1 · • t 1 • ·1 * t

SEKVENSSILISTAUS

118385 39 (I) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA:

(A) NIMI: CIBA-GEIGY AG

(B) KATU: Klybeckstr. 141 (C) KAUPUNKI: Basel

(E) MAA: SVEITSI

(F) POSTINUMERO (ZIP): 4002 (G) PUHELIN: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (II) KEKSINNÖN NIMITYS: Uusi menetelmä biologisesti aktli vlsen proteiinin tuottamiseksi (III) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 12 (lv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensoplva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.30 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID NO:l TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 339 emäsparia ·.*. (B) TYYPPI: nukleotidi [·*·" (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen ; :*: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ··· ·

· (il) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA - mRNA

• i* • ·

'···* (lii) HYPOTEETTINEN: EI

t *..

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: : (B) KLOONI: E. COll LC137/pPLMu.hTGF-pl (DSM 5656) I'*.· (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi ** * (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-βΙ" • · (xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l: ··· a · • tl • «V • · a · a · · ψ ·· a · 118385 40 GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 15 10 15 GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG AAG TGG 96

Val Arg Gin Leu Tyr He Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC CTC GGG CCC TGC 144

He His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG GTC CTG GCC CTG 192

Pro Tyr He Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TOG GCG GGG CCG TGC TGC GTG CCG 240

Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 . . CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC TAC GTG GGC CGC AAG CCC 288 • · « 1 · • 1 • · * · 1 I · « ··· · • · *.1 1 Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro He Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 ·1· ·· I ·..

AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC 336

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met He Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser .. 100 105 110 • · * ·♦ • tl *1 J TGA 339 • · «·· t : ··· • · • · · • ·· • · · * · · « »I • · (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: 118385 41 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (il) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 15 10 15

Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Vai Leu Ala Leu 50 55 60

Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Vai Pro 65 70 75 80 • · • a • · a a · | .1» Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Vai Tyr Tyr Vai Gly Arg Lys Pro ;1! : 85 90 95 • · • · ··· • · • · • aa • a ! " Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 a· a · a «a a aaa a a a aaa a • a • «•aa • a a«« i : • aa • a · • a a • aa a · · • a · a aa a a (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: 118385 42 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 339 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA - OlRNA

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. COli LC137/pPLMu.hTGF-p2 (DSM 5657) (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote» "ihmisen TGF~32" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC 48

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys 115 120 125 CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TGG 96

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 130 135 140 • 1 • 1 # · 1 • · : ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC 144 IM · .1. i Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys • » ··· ***..

··· * * a e *· : 1..

«·· • · · • · · ♦ t#·· • · *·· t : ··1 · t 1 ♦ m ·1 • · * · • · · f «f • 1 118385 43 145 150 155 160 CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGO AGG GTC CTG AGC TTA 192

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Val Leu Ser Leu 165 170 175 TAT AAT ACC ΑΤΑ AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT CCT TGC TGC GTG TCC 240

Tyr Asn Thr lie Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 180 185 190 CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC TAC ATT GGC AAA ACA CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr He Leu Tyr Tyr He Gly Lys Thr Pro 195 200 205 AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336

Lys He Glu Gin Leu Ser Asn Met lie Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 210 215 220 TAA 339 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: . . (A) PITUUS: 112 aminohappoa •,V (Β) TYYPPI: aminohappo ·.·. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen : :*· : (il) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini O (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4: • ·

• M

f ♦ *

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys .. 1 5 10 15 • a» * « · ’·' Leu Arg Pro Leu Tyr He Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp *:··: 20 25 30 ··« i : « ·· • · ♦ · • · · • ·· • * 118385 44

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Tht Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Ser 65 70 75 80

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95

Lys Ile Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 339 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA - mRNA

\V (vii) VÄLITÖN LÄHDE: S.% (B) KLOONI: E. coll LC137/pPLMu.hTGF-p3 !:5 · (DSM 5658) t · ♦ • · 1··\ (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote- "ihmisen TGF-p3" i/ : (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5: • t • · * · · * ··· • « * f * · * »«««« • · »· * i : * · « « * t t · « «t e * • · ♦ · * t »* • » 118385 45 GOT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 115 120 125 GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG 96

Val Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 130 135 140 GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 145 150 155 160 CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 165 170 175 TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 180 185 190 CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC 288 , , Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro ••V' 195 200 205 f **· :.:: :/ · AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336 't t! Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser »*·.. 210 215 220 m • *· * /. t TGA 339 ·· ? \* » ··* • « » « · · (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: m · (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa ,* . (Β) TYYPPI: aminohappo */·· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · * ** • · 118385 46 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS; SEKVENSSI ID NO:6:

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 15 10 15

Val Arg Pro Leu Tyr He Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr He Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95

Lys val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser ’/f 100 105 110 l i Ϊ «·· · • · Ϊ * ! m · «·« : : tat J\e> (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT; tT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 336 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi !'.fi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen tl 5 ' (ii) MOLEKYYLITYYPPI: muu nukleiinihappo (A) KUVAUS: /kuvaus»"TGF-βΙ:n ja TGF-p3:n DNA:n yhdistelmähybridi-DNA" *«t / . (vii) VÄLITÖN LÄHDE: *.*·: (B) KLOONI: E. coli LCl37/pPLMu.TGF-pl(44/45)β3 • · • ♦ · * «a • · 118385 47 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 1..132 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote1 "ihmisen TGF-pi:n 44 N-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 133..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote1 "ihmisen TGF~p3:n 68 C-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote1 "TGF-pl-3-niminen hybridi-TGF-β" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7: GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG AAG TGG 96

Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 ·.·. ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TCC 144 m m Λ

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys • · · ·1· · • · : · : • · » · · * · • · ··1 • · • · • 1· • ·« • · · • ♦ · ·· • · • · · • a · * 1 · ♦ ♦ · « • ♦ * 2 : : ··· • · * 1 • ·· • · · • 1 · * ♦· 2 • · 118385 48 35 40 45 CCA TAG CTC CGC ACT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 TAG AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo . . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · • · ♦ :V. (il) molekyylityyppi: proteiini • · · ·· 1 :2· : (xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8: • · »·· • • 1 ··· : ·.. Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys ♦T: 1 5 10 15 • ;·. Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp *... 20 25 30 * · · • ♦ · ***** Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys ;3: 35 40 45 ··· * • · • · 1 • ·· • · · • · · 2 * · · 3 • 1 118385 49

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Veil Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 336 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: muu nukleiinihappo (A) KUVAUS: /kuvaus** "hybridi-TGF-p2-3:ea koodaava yhdistelmähybridi-DNA" • · *.v (Vii) VÄLITÖN LÄHDE: ·; :*: (B) KLOONI: E. coli LC137/pPLMu.TGF-p2(44/45)p3 • · Φ * \ (ix) OMINAISPIIRRE: .···. (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 1..132 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote- "ihmisen TGF-p2:n *...# 44 N-terminaalista aminohappoa" I · · (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 133..336 *... (D) MUU INFORMAATIO: /tuote- "ihmisen TGF-p3:n :.* * 68 C-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: ···. (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi ···* (B) SIJAINTI: 1..336 .·* : (D) MUU INFORMAATIO: /tuote** "hybridi-TGF-p2-3" • ·♦ • ♦ « · • · · • ·· • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9: 118385 50 GOT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC 48

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn vai Gin Asp Asn Cys Cys 15 10 15 CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TGG 96

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu 50 55 60 TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Pro 65 70 75 80 /·1· CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG AOC CCC 288 • · : ,·. Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Vai Gly Arg Thr Pro i 85 90 95 e · • · • · · • « · • · 1 • · • 2 AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336 • ·· * Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met Vai Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 • · • · • I» * 1« « · » * · · • « • 1 · i : • · · * « * · · • ·« • · • · · * ·· 2 • · 51 (2) SEKVENSSIN ID NO:10 TIEDOT: 118385 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (il) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10:

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys 15 10 15

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Pro 65 70 75 80 * e ·/,· Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Vai Gly Arg Thr Pro :85 90 95 ♦ ** * • ·

« * I

• · • · ,***. Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met Vai Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser ··" 100 105 110 I ♦· a • ·· • * · 1 · » *· • · • ·* «M • · · ♦ ♦ ♦ » • · ·«» : : ·** a · • « · • · • · • · · • M • · 52 1 1 8385 (2) SEKVENSSIN ID NO:11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 336 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: muu nukleiinihappo

(A) KUVAUS: /kuvaus="hybridi-TGF-p3-2:ta koodaava yhdistelmähybridi-DNA

(Vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. COlI LC137/pPLMu.TGF-p3(44/45)β2 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 1..132 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-p3:n 44 N-terminaalista aminohappoa” (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 133..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-p2:n 68 C-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote» "hybridi-TGF-p3-2" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:11: . . GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT 48 • · • · · • · • · • 4 · • · · • · • · · *· · Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys O 15 10 15 » ♦ t I1·’: GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG 96

Vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp .. 20 25 30 • · _ * 1 e • · 1 • · · GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC 144 *;··: Vai His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45 ··· « » · « ·» • · • 1 • · · % »· • · 118385 53 CCG TAT TTA TGG ACT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG GTC CTG AGC TTA 192

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 TAT AAT ACC ΑΤΑ AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT CCT TGC TGC GTG TCC 240

Tyr Asn Thr lie Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80 CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC TAC ATT GGC AAA ACA CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr lie Gly Lys Thr Pro 85 90 95 AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT CTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336

Lys lie Glu Gin Leu Ser Asn Met lie Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo V. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · e a : (il) molekyyli tyyppi : proteiini «M · r • e *.1 ϊ (xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO: 12: ··» « · • · ··· • · t 1..

*«· • · · • · t * • · • · • ·· M· • · » • « · • a • ·· z : • · · • · • · « «e • ♦ · • a 1 a ·· « · 118385 54

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 15 10 15

Vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Vai His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Ser 65 70 75 80

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95

Lys Ile Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 p ♦ • · • · · e · • · • · · * · ; ··» 1 * ♦ • · · • 1 » · e·· «·· I· · • · m *« S 1#1 e ·»· « · · 5 ♦ · * e···· • · t : ··· · • · · • ·· • · • 1 » · · ·:

Claims (14)

118385

1. Menetelmä dimeerisen biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän tyyppi β:η (TGF-β:n) kaltaisen prote- 5 iinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainitun TGF-β:η kaltaisen proteiinin denaturoitua monomeeristä muotoa käsitellään puskurilla, joka ei sisällä detergenttiä ja joka sisältää orgaanista liuotinta, joka on DMSO:ta, DMFrää tai mitä tahansa näiden seosta ja jota käytetään 10. noin 10-50 %:n (v/v) konsentraationa, ja jossa puskuri sisältää lisäksi pelkistintä ja puskurin pH on noin 7 -noin 10.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa or~ 15 gaanista liuotinta käytetään noin 20-50 %:n konsentraationa.'

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa orgaanista liuotinta käytetään noin 30-50 %:n konsentraatio- 20 na.

. . 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa or- • · · ]·*·* gaanista liuotinta käytetään noin 30-40 %:n konsentraatio- • · · *·· · na. « · • * · ^ *. *: , 25 • · ·

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa or- j ·.. gaanista liuotinta käytetään noin 40 %:n konsentraationa. • * · · · • · ·

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa TGF-β:n j*.#> 30 kaltainen proteiini on TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3, heterodi- .···. meerinen TGF-β, TGF-β:n fragmentti tai mutantti, mukaan • · lukien hybridimolekyylit, joissa eri TGF-β:jen osia on •••ί vaihdettu, BMP, inhibiini tai aktiviini. • · · • * * · • · · *

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa TGF^:n kaltainen proteiini on TGF^2, ΤΰΡ-β3, hybridi-TGF^l-2, hybridi-TGF^l-3, hybridi-TGF^2-3, hybridi-TGF-β3-2 tai 118385 BMP-2 .

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jossa TGF-βιη kaltainen proteiini on TGF-p3. 5

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa puskurin lämpötila on noin 0 °C:sta noin 40 °C:seen.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa pel-10 kistin. on pelkistetty sulfhydryyliyhdiste.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa pelkistetty sulfhydryyliyhdiste on glutationi pelkistetyssä muodossaan, β-merkaptoetanoli pelkistetyssä muodossaan, 15 merkaptometanoli pelkistetyssä muodossaan, kysteiini, kys-teamiini tai ditiotreitoli pelkistetyssä muodossaan.

, ,. 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa pel kistettyä sulfhydryyliyhdistettä käytetään noin 1-100 mM:n 20 konsentraationa. '•m»m

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa pel- » · 1 .1 1 kistettyä sulfhydryyliyhdistettä käytetään noin 1-10 mM:n • « · '2 1 konsentraationa. • ft · • · · _ _ • · 25 · · • · *···2'

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa pel- : 3 kistettyä sulfhydryyliyhdistettä käytetään noin 2,5 mM:n • · · : konsentraationa. ·· * · • <·· ··· • · • · • · · ·«· ··»« 999 • · • · ··· 9 9 2 9 3 9 9 118385