JP6458009B2 - 心不全処置 - Google Patents

Description

本発明は、胎盤増殖因子２（以降、ＰｌＧＦ−２と呼ぶ）を用いて哺乳動物において心不全または１またはそれを超える個々の心不全表現型を処置および／または予防することに関する。

心臓血管疾患の予防および処置の著しい進歩にもかかわらず、世界的統計は心不全（ＨＦ）の発生率および有病率が増加し続けていることを示す。工業先進国の高齢化社会において、ＨＦの有病率は５０〜５９歳の間で１％であるが、７５歳を超えると１０％である。さらに、心筋梗塞後の生存の増加ならびに心臓突然死の予防のための薬理学的およびデバイス治療の進歩は、慢性ＨＦを発症するリスクがある患者のプールを著しく拡大した。

従来の研究により、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）のげっ歯類モデルにおいて胎盤増殖因子アイソフォーム２（ＰｌＧＦ−２）投与が、血管形成を誘導し、心筋の局所および全体の機能を改善することができることが示された（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。胎盤増殖因子アイソフォーム１（ＰｌＧＦ−１）の単回投与または所定の持続送達期間がヒト疾患を表す大型動物モデルにおいて心臓の全体機能を高めることができるかどうかは不明なままである（非特許文献４；非特許文献５）。最近、全身へのｒｈＰｌＧＦ−１注入が、有害作用なく慢性虚血心筋の局所血流および収縮機能を著しく向上させることが実証された。しかし、局所収縮機能の部分的な改善を全体のＬＶ機能のさらなる回復に移すことはできなかった（非特許文献６）。ＰｌＧＦ−２の作用に関する同様の知識は現在不足している。

特定のモデルにおけるＰｌＧＦ１およびＰｌＧＦ２のＨＦパラメータへの特定の効果を記載する一部の刊行物もあるが、これらはこれらのタンパク質の治療可能性を率直に示すことができていないし、さらにＰｌＧＦ１およびＰｌＧＦ２について得られたデータの比較ができない。実際に、ラットモデルはＢｉｎｓａｌａｍａｈ等、２０１１（非特許文献１）、Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ等、２００６（非特許文献４）およびＩｗａｓａｋｉ等、２０１１（非特許文献５）に使用されたが、Ｂｉｎｓａｌａｍａｈ等（２０１１）およびＫｏｌａｋｏｗｓｋｉ等（２００６）だけが、生理食塩水中のＰｌＧＦ２−およびＰｌＧＦ１−タンパク質をそれぞれ心筋内投与した。Ｂｉｎｓａｌａｍａｈ等（２０１１）はまた、ナノ粒子に捕捉されたＰｌＧＦ２−タンパク質を心筋内投与した。Ｉｗａｓａｋｉ等（２０１１）は、（プラスミドをコードするＰｌＧＦ−１による）ＰｌＧＦ１の遺伝子治療的心筋内投与を使用した。Ｂｉｎｓａｌａｍａｈ等（２０１１）は、心エコー検査法を応用して左心室の駆出率（ＬＶＥＦ％）を求め、一方、Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ等（２００６）は、開胸技法を用いて左心室に挿入したコンダクタンスカテーテルを使用した。そのため、得られた結果からは、ＰｌＧＦ１とＰｌＧＦ２の治療効果の最終的な差を求めることができない。Ｒｏｎｃａｌ等、２００８（非特許文献２）およびＴａｋｅｄａ等、２００９（非特許文献３）は、両者ともにＨＦのマウスモデルに頼った。Ｒｏｎｃａｌ等（２００８）は、遺伝子療法（アデノウイルスベクター）を応用してＰｌＧＦ２を投与し、Ｔａｋｅｄａ等（２００９）は、組換え型ＰｌＧＦ１タンパク質を投与した。この場合もやはり、この差は得られた結果の信頼できる比較を阻害し、一方のＰｌＧＦアイソフォームと他方のＰｌＧＦアイソフォームを比較した最終的なより良い治療効果を捕らえることができない。

Ｂｉｎｓａｌａｍａｈ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄ ６，２６６７ Ｒｏｎｃａｌ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２１６，２３６ Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｃｉｒｃ Ｊ ７３，１６７４ Ｋｏｌａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｊ Ｃａｒｄ Ｓｕｒｇ ２１，５５９ Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１１ ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ６，ｅ２４８７２ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０４，Ｈ８８５

一態様では、本発明は、哺乳動物における心不全表現型の処置または予防（方法）で用いるための、胎盤増殖因子２タンパク質（ＰｌＧＦ−２）を含む組成物に関する。

心不全表現型は、心室機能不全、収縮末期容積の増加、駆出率の低下、心室リモデリング、または拡張末期容積の増加のいずれか１つまたはその組合せとして定義されることができる。特に、心室機能不全は、収縮末期容積の増加および／または駆出率の低下によって定義されることができる。あるいは、心室機能不全は、弛緩障害、心室充満圧の増加および保持された駆出率によって定義されることができる。特に、心室リモデリングは、拡張末期容積の増加によって定義されることができる。

処置または予防されるべき心不全表現型は、左心室および／または右心室で示され得る。特定の実施形態では、それは左心室で示される。本明細書上文に記載される組成物は、さらに哺乳動物における心不全表現型の処置または予防（方法）で用いるためのものであり、前記哺乳動物は、アテローム硬化性である。

本明細書上文に記載される組成物中のＰｌＧＦ−２タンパク質は、組換え型ＰｌＧＦ−２タンパク質、例えば哺乳動物細胞培養から得たものであってよい。そのような哺乳動物細胞培養の一例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）培養または等しい効力を有する細胞培養である。そのような細胞培養は、一過性または恒常的な方法でＰｌＧＦ−２タンパク質を発現する能力がありうる。本明細書上文に記載される組成物中のＰｌＧＦ−２タンパク質は、一実施形態において、ヒトＰｌＧＦ−２タンパク質、例えば配列番号１によって定義されるものなど、またはその多形変異体（多形体）である。

本明細書上文に記載される組成物を成すいずれのＰｌＧＦ−２タンパク質も、特に全身投与による使用のためのものである。そのような全身投与は、血管内（例えば静脈内）投与または皮下投与であってよい。

ｒｈＰＬＧＦ２−処置が、局所心筋機能を改善することを示す図である。磁気共鳴画像法より得た、局所心筋機能の指標としての局所の壁肥厚は、対照と比較してｒｈＰＬＧＦ２で処置されたブタにおいて、安静時およびドブタミンに誘発されたストレス中の虚血領域で、より良好に保たれた。グラフマーカー：黒色正方形（■）＝虚血、対照（リン酸緩衝生理食塩水）、ｎ＝１２；黒色三角形（▲）＝虚血、ｒｈＰｌＧＦ２処置、ｎ＝１２；黒色菱形（◆）：偽の前壁、ｎ＝３。統計マーカー：^＊遠隔および偽に対してｐ＜０．０５；†安静時に対してｐ＜０．０５；‡低用量ストレスに対してｐ＜０．０５；＃対照に対してｐ＜０．０５。 ｒｈＰＬＧＦ２で処置された心臓の虚血領域および遠隔領域における、安静時およびアデノシンに誘発されたストレス中の心筋血流（ＭＢＦ）を示す図である。ｒｈＰＬＧＦ２で処置された心臓の虚血領域における安静時およびアデノシンに誘発されたストレス中の心筋血流（ＭＢＦ）は、対照または偽の心筋血流（左パネル）よりも高かった。ＭＢＦは、安静時よりもストレス状態の方で高く、灌流保存を示した。遠隔領域の処置群間に有意差はなかった（右パネル）。虚血領域（左パネル）のグラフマーカー：黒色正方形（■）＝対照（リン酸緩衝生理食塩水）、ｎ＝１１；黒色三角形（▲）＝ＰｌＧＦ−２処置、ｎ＝１１；黒色菱形（◆）＝偽、ｎ＝２。遠隔領域（右パネル）のグラフマーカー：正方形（□）＝対照（リン酸緩衝生理食塩水）、ｎ＝１１；白色三角形（Δ）＝ＰｌＧＦ−２処置、ｎ＝１１；白色菱形（◇）＝偽、ｎ＝２。統計マーカー：^＊遠隔および偽に対してｐ＜０．０５；†安静時に対してｐ＜０．０５；‡対照に対してｐ＜０．０５。 アテローム硬化性バックグラウンドで再灌流を伴う心筋梗塞のネズミモデルに適用した実験設計を表すフローチャートを示す図である。ＬＡＤ＝左冠動脈前下行枝；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；ＰｌＧＦ＝組換えヒトＰｌＧＦ−２。 アテローム硬化性バックグラウンドで再灌流を伴う心筋梗塞のネズミモデルでの研究プロトコールのフローチャートを示す図である。ＬＡＤ＝左冠動脈前下行枝；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；ＰｌＧＦ＝組換えヒトＰｌＧＦ−２；ｘＷ＝ｘ週；ＥＣＨＯ＝心エコー検査法；ＩＨＣ＝免疫組織化学。 ０Ｗ＝ベースライン（ＢＬ）、８週（心筋梗塞の誘導後４週および処置の開始に相当）、ならびに１２週および２０週の時点での、対照（ＰＢＳ）処置群およびｒｈＰＬＧＦ２処置群における左心室（ＬＶ）収縮末期容積および拡張末期容積を示す図である。体表面積に対して指標化されたＬＶ拡張末期容積（パネルＡ）および体表面積に対して指標化されたＬＶ収縮末期容積（パネルＢ）は、対照群においてＭＩ後に著しく増加したが、ｒｈＰＬＧＦ２処置後には増加しなかった。^＊ベースラインに対してｐ＜０．０５。 ０＝ベースライン（ＢＬ）、８週（心筋梗塞誘導後４週および処置の開始に相当）、ならびに１２週および２０週の時点での、対照（ＰＢＳ）およびｒｈＰＬＧＦ２処置群の左心室（ＬＶ）の全体的機能を示す図である。１２週後および２０週後、駆出率（ＥＦ）は、ｒｈＰＬＧＦ２処置の後に著しく高くなった。^＊ベースラインに対してｐ＜０．０５；^＊＊８週のＭＩに対してｐ＜０．０５。 対照（ＰＢＳ）およびｒｈＰＬＧＦ２で処置したマウスにおける心臓の炎症を、遠隔の心臓領域（パネルＡ）および虚血領域（パネルＢ）のＭＡＣ３−陽性細胞の数を測定することによって評価したグラフを示す図である。ＭＡＣ３−陽性細胞の数は、両方の処置群において１２週と比較して２０週後により高かった。^＊１２週に対してｐ＜０．０５。 ドップラーパルス波超音波を用いて測定された大動脈ピーク血液速度を示す図である。パネルＡ：５カ所の測定部位による大動脈の走査画像：１＝大動脈根；２＝上行大動脈；３＝無名動脈に隣接する大動脈弓；４＝頚動脈に隣接する大動脈弓；５＝鎖骨下動脈に隣接する大動脈弓。パネルＢ：ベースライン（ＢＬ；０週＝０Ｗ）、心筋梗塞後４週、ＰＢＳまたはｒｈＰｌＧＦ−２投与の開始に相当（ＭＩ８Ｗ）ならびに１２週および２０週の大動脈弓ピーク血液速度（測定点３）。ピーク血液速度の一過性の類似した上昇が両方の群において１２週に起こった。^＊ベースラインに対してｐ＜０．０５。 対照（ＰＢＳ）およびｒｈＰＬＧＦ２で処置された動物における大動脈プラークの血管新生を測定し、プラーク面積に関連する毛細血管面積（パネルＡ）およびプラーク面積に関連する細動脈面積（パネルＢ）として表した図である。プラークの毛細血管および細動脈密度は、異なる時点の処置群間で類似していた。 プラーク面積に関連するＭＡＣ３陽性細胞面積として評価された、動脈硬化病変における炎症応答が、ｒｈＰＬＧＦ２処置群および対照（ＰＢＳ）群間で同等であったことを示す図である。

左冠動脈前下行枝の永久結紮によって引き起こされた急性心筋梗塞の以前のげっ歯類モデルは、大量の心臓虚血および大規模な梗塞サイズを誘導した（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。本発明の基礎をなす実験で使用されるブタモデルは、進行した冠動脈疾患患者の狭くなった冠動脈パターンを模倣するために流れを減少させるステント技術を使用し、中程度の心筋梗塞に関連しているが、収縮末期容積（ＥＤＶ）の増加および駆出率（ＥＦ）の低下によって示される、左心室の全体的機能の妨害をはじめとする、左心室の機能の著しい変化（虚血に誘導される収縮機能不全）を誘発する（非特許文献６）。拡張末期容積（ＥＤＶ）は、増加しないか、または僅かだけ増加するので、このモデルは中程度の心室拡張だけを表す。ブタ（すなわち、サス・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、ブタ）冠動脈流れ減少モデルは、中程度の心不全（ＨＦ）を伴う、臨床的に関連する虚血性心疾患の病態生理をより良好に表す。本明細書において使用される、アテローム硬化性バックグラウンド（進行したアテローム動脈硬化性プラーク蓄積を伴う再灌流された心筋梗塞）における虚血−再灌流のマウスモデルは、収縮機能不全（虚血誘発性；ＨＦ表現型：収縮末期容積の増加および駆出率の低下）、心室リモデリング（梗塞誘発性；ＨＦ表現型：拡張末期容積の増加）および病理学的血流パターン（主要大動脈でのアテローム動脈硬化性プラーク蓄積）をはじめとする、心臓および血管のリモデリングへの化合物の臨床効果を調べることを可能にする。

心室機能不全、心室リモデリング、ＥＳＶの増加、ＥＤＶの増加およびＥＦの低下は、本明細書においてさらに心不全（ＨＦ）表現型（の一部）と呼ばれる。ＥＳＶの増加およびＥＤＶの増加は、健康な被験体の集団で測定され、それから導き出された正常な対応する容積と比較した場合の容積の増加として求められる。これらの容積は体重に依存するので、体表面積（ＢＳＡ）への正規化が有用であり、しばしば指標化された値（ＥＤＶｉ、ＥＳＶｉ）が使用される。ＥＦの低下は、健康な被験体の集団で測定され、それから導き出された正常な対応するＥＦと比較して求められる。ＥＦは、一回拍出量（ＥＤＶ−ＥＳＶとして求められる容積）をＥＤＶで除算したものである。

例えば、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００７（Ｃｈｅｓｔ １３１：１０５０；同書中の表２参照）によって評価されたヒトの対照群において、左心室のＥＤＶｉは８４±１５ｍＬ／ｍ^２であり、左心室のＥＳＶｉは３４±１１ｍＬ／ｍ^２であり、右心室のＥＤＶｉは９１±１５ｍＬ／ｍ^２であり、右心室のＥＳＶｉは４２±１１ｍＬ／ｍ^２である。左心室のＥＦが６０±８％、右心室のＥＦが５４±７％と記すＪｏｒｇｅｎｓｅｎ等、２００７（上記参照）に裏付けられるように、ヒトにおける正常なＥＦは、５０％よりも大きいと考えられる（急性および慢性心不全の診断および処置のためのＥＳＣガイドライン ２０１２、Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ ３３：１７８７）。本明細書において用いられるＡｐｏＥ−／−マウスでは、正常なベースラインＥＤＶは、約２５〜３５ｕＬであり、正常なベースラインＥＳＶは約１２〜１７ｕＬである。これらの容積は体重に依存しているので、体表面積（ＢＳＡ）に対して指標化することは有用である。マウスについては、次式を使用してＢＳＡを計算することができる（ＢＷはグラムで表される体重である）：ＢＳＡ（ｍ^２）＝（９×ＢＷ^{（２／３）}）／１００００。平均ベースラインＢＷ＝１７．４±１．８ｇを用いると、指標化されたベースラインＥＤＶおよびベースラインＥＳＶ値は、ＥＤＶｉ＝６．４±１．５（ｍＬ／ｍ^２）およびＥＳＶｉ＝２．８±０．８（ｍＬ／ｍ^２）である。マウスについて、正常な駆出率は５５〜６５％である。

ブタモデルでＰｌＧＦ−１を用いる以前の研究は落胆するものであった。その理由は、左心室（ＬＶ）収縮末期容積（ＥＳＶ）およびＬＶ駆出率（ＥＦ）の改善が８週でも観察されなかったためである（非特許文献６）。本発明に至る研究（実施例１）では、以前にＰｌＧＦ−１で用いたものと同じ条件下でＰｌＧＦ−２を投与した場合に、８週でＬＶＥＳＶとＬＶＥＦの両方の著しい改善が観察された。ＰｌＧＦ−１とＰｌＧＦ−２との間の高い配列類似性から考えて、この知見は非常に驚くべき予想外のものであり、ＰｌＧＦ−２を投与することによって処置可能であるという新しい適応症として心不全を加えるものである。本明細書において使用されるＨＦのアテローム硬化性マウスモデル（実施例２）は、（ブタモデルのように）ＰｌＧＦ−２の心室機能への有益な効果を確認する。その上、ＰｌＧＦ−２の心室リモデリングへの有益な効果が観察された。ＰｌＧＦ−２はさらに、心臓の損傷または心筋の炎症を誘発しなかった上に、新血管新生または炎症細胞浸潤に起因するプラーク不安定性を増加させなかったので、安全であることが分かった。ＰｌＧＦは炎症誘発性であることが知られているため、さらにＰｌＧＦの喪失はアテローム動脈硬化病変の発達を遅らせるので、これらの知見は驚くべき予想外のものである（Ｒｏｎｃａｌ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ８６：２９）。

一態様では、本発明は、そのため、本明細書に記載される哺乳動物における心不全またはより特に１または複数の特定の心不全表現型の処置または予防（方法）で用いるための、胎盤増殖因子２タンパク質（ＰｌＧＦ−２）に関する。本発明は、哺乳動物における心不全表現型の処置または予防（方法）で用いるための、胎盤増殖因子２タンパク質（ＰｌＧＦ−２）を含む組成物を提供する。心不全表現型は、心室機能不全、収縮末期容積の増加、駆出率の低下、心室リモデリング、または拡張末期容積の増加のうちのいずれか１つ、またはその組合せとして定義されうる。特に、心室機能不全は、収縮末期容積の増加および／または駆出率の低下によって定義されることができる。あるいは、心室機能不全は、弛緩障害、心室充満圧の増加および保持された駆出率によって定義されることができる。特に、心室リモデリングは、拡張末期容積の増加によって定義されることができる。

あるいは、処方されると、本発明のこの態様は、哺乳動物において心不全を処置または予防する１または複数の方法に関し、前記方法は、心不全と診断された哺乳動物に治療上有効な量の胎盤増殖因子２（ＰｌＧＦ−２）を投与するステップを含み、この際、前記投与の結果として前記心不全が処置または予防される。あるいは、本発明は、心不全を処置または予防する（際に用いる）ためのＰｌＧＦ−２に関する。前記心不全は、心室機能不全を伴うものであってもよい。それは、あるいは、または心室機能不全に加えて、低下した心室駆出率または保持された心室駆出率を伴うものであってよい。

さらなる態様では、本発明は、哺乳動物心臓の心室駆出率を改善する１または複数の方法に関し、前記１または複数の方法は、心室駆出率の低下と診断された哺乳動物に治療上有効な量の胎盤増殖因子２を投与するステップを含み、この際、前記投与の結果として前記心室駆出率が改善される。あるいは、本発明は、哺乳動物心臓の心室駆出率を改善する（際に用いる）ためのＰｌＧＦ−２に関する。前記心室駆出率の低下は、心不全を伴うものであってもよい。

さらなる態様では、本発明は、哺乳動物心臓の心室機能不全を処置、予防または改善する１または複数の方法に関し、前記１または複数の方法は、心室機能不全と診断された哺乳動物に治療上有効な量の胎盤増殖因子２を投与するステップを含み、この際、前記投与の結果として前記心室機能不全が処置、予防または改善される。あるいは、本発明は、心室機能不全を処置、予防または改善する（際に用いる）ためのＰｌＧＦ−２に関する。前記心室機能不全は、心不全を伴うものであってもよい。

本発明の別の態様には、哺乳動物心臓の心室リモデリング、より特に肥大性心室リモデリングを処置または予防する１または複数の方法が含まれ、前記１または複数の方法は、（肥大性）心室リモデリングと診断された哺乳動物に治療上有効な量の胎盤増殖因子２を投与するステップを含み、この際、前記投与の結果として前記（肥大性）心室リモデリングが処置または予防される。あるいは、本発明は、哺乳動物心臓の（肥大性）心室リモデリングを処置または予防する（際に用いる）ためのＰｌＧＦ−２に関する。前記肥大性心室リモデリングは、心不全を伴うものであってもよい。

心不全では、左心室および／または右心室が罹患し得る。そのため、上記のいずれかにおいて、処置または予防される心不全または心不全表現型は、左および／または右心室で発現されるかまたは表示され得る。特定の実施形態では、それは、左心室で発現されるかまたは表示される。

心筋梗塞に至るかもしれない徴候の１つは、血管中で血流を制限するプラークの蓄積を特徴とする、アテローム性動脈硬化症である。本明細書中で実証されるように（実施例２参照）、本明細書上文に記載される組成物は、アテローム性動脈硬化症に罹患している哺乳動物（アテローム硬化性哺乳動物）における心不全表現型の処置または予防（方法）で用いるために、安全かつ効果的である。

本明細書上文に記載される組成物中のＰｌＧＦ−２タンパク質は、組換え型 ＰｌＧＦ−２タンパク質、例えば哺乳動物細胞培養から得られるものなどであってよい。そのような哺乳動物細胞培養の一例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）培養または等しい効力を有する細胞培養である。そのような細胞培養は、一過性または恒常的な方法でＰｌＧＦ−２タンパク質を発現する能力がありうる。本明細書上文に記載される組成物中のＰｌＧＦ−２タンパク質は、一実施形態では、ヒトＰｌＧＦ−２タンパク質、例えば配列番号１によって定義されるものなど、またはその多形変異体（多形体）である。

特定の実施形態では、ＰｌＧＦ−２タンパク質組成物は、ＰｌＧＦ−２タンパク質が唯一の活性成分であるという点でＰｌＧＦ−２タンパク質から本質的になる組成物である。さらなる特定の実施形態では、ＰｌＧＦ−２タンパク質は、組成物中の唯一の血管新生因子である。

本明細書上文に記載される組成物を成すいずれのＰｌＧＦ−２タンパク質はいずれも、特に全身投与による使用のためのものである。そのような全身投与は、血管内（例えば静脈内）投与または皮下投与であってよい。

「心不全（ＨＦ）」は、心臓が代謝組織の必要量に相応する速度で酸素を送達できなくなる心臓の構造および／または機能の異常として定義されることができる（急性および慢性心不全の診断および処置のためのＥＳＣガイドライン ２０１２、Ｅｕｒ Ｈｅａｒｔ Ｊ ３３：１７８７）。それは、心臓機能の異常から生じ、臨床成績（すなわち完全および心血管死、ＨＦのための入院）および生活の質を制限する、臨床徴候（例えば、頸静脈圧の上昇、肺の断続性ラ音および置き換えられた心尖拍動）および症状（例えば、息切れ、くるぶし腫脹および疲労）の複合体として見える。心室機能不全に起因する心不全は、駆出率の低下した患者および駆出率の保持された患者を包含する。心筋梗塞を含む虚血事象は、心不全の根底にある原因であり得るが、その他の原因としては、高血圧症、弁膜症性心疾患、心筋症、喫煙、肥満、糖尿病などが挙げられる。本明細書で報告される知見を考えると、１または複数の虚血以外の原因による心不全は、心拍出量が身体および／または肺の必要を満たすには不十分である心不全の生理学的状態のサブグループとして具体的に含められる。本明細書において使用されるブタおよびマウスモデルにおいて求められるように（実施例１および２参照）、いくつかのＨＦ表現型（上記参照）は、定量化されて測定可能なパラメータとして役立ち得る。

真性糖尿病、高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、腎不全、肥満をはじめとする重要な共存症を伴うまたは伴わない肥大性心室リモデリングの患者において観察される、ＥＦが保持されたＨＦは、ＥＦの低下を伴うＨＦとして同様に暗澹たる結果を有する。灌流と肥大のミスマッチは、ＨＦ表現型および心室機能不全の原因となる。この類似性に基づいて、本発明の範囲には、ＥＦが保持されたＨＦと診断された患者が含まれる。現在、ＥＦが保持されたＨＦの臨床成績を改善するための特異的療法はない。

別のＨＦ表現型は、弛緩障害、心室充満圧の増加および保持されたＥＦによって定義される心室機能不全に関連する。このＨＦ表現型では、ＥＦはこのように保たれるが、心室は心臓拡張期中に適切に弛緩しない。心室弛緩がこのように損なわれたならば、内部の圧力は、次の心拍からの血液が入ろうと試みるにつれて増加する（充満圧の増加）。

ヒト胎盤増殖因子、ｈＰｌＧＦは、Ｍａｇｌｉｏｎｅ等、１９９１（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８、９２６７）によって最初に開示され、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６３で利用できる２２１アミノ酸ポリペプチドの３つのアイソフォーム変異体を言う。本発明の主題は、ＰｌＧＦのアイソフォーム２、ＰｌＧＦ−２（ＰｌＧＦ２とも呼ばれる）であり、これはヘパリン結合部位を含むアイソフォームである。ｈＰｌＧＦ−２の全長参照配列（すなわち、１８−アミノ酸シグナル配列を欠く成熟タンパク質）が含まれる：
ＬＰＡＶＰＰＱＱＷＡＬＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＣＲＡＬＥＲＬＶＤＶＶＳＥＹＰＳＥＶＥＨＭＦＳＰＳＣＶＳＬＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＦＳＱＨＶＲＣＥＣＲＰＬＲＥＫＭＫＰＥＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬＣＧＤＡＶＰＲＲ（配列番号１）。

その他の種、特に哺乳動物種のＰｌＧＦ−２タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで検索することによって、例えば、ＢＬＡＳＴプログラムを配列番号１で実行することによって見出すことができる。用語「ＰｌＧＦ−２」は、通常、ｈＰｌＧＦ２様ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を含有するどんな起源のＰｌＧＦ分子でも包含する。そのようなｈＰｌＧＦ２様ＨＢＤは、ｈＰｌＧＦ２のＨＢＤと相同性が高くてもよく（例えば、９５％同一またはそれを超える）、またはそれはｈＰｌＧＦ２のＨＢＤと相同性が低くてもよい（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％未満同一である）。ｈＰｌＧＦ２のＨＢＤは上記配列番号１で下線が引かれており、より特に、ｈＰｌＧＦ１に対する２１アミノ酸配列ＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬ（配列番号２）の挿入をいう。タンパク質または化合物とヘパリンの結合は、ヘパリン結合アッセイを用いて、例えば、ヘパリンに結合する生体分子の酵素結合競合結合によって（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの９６ウェルヘパリン結合プレート中で）容易に決定できる。用語「ＰｌＧＦ−２」には、その属に存在する可能性のある、所定の属の基準ＰｌＧＦ２配列の多形変異体がさらに含まれる。

ＰｌＧＦ−２タンパク質の誘導体も、上記の本発明の態様のいずれかでの使用が意図され、この用語は少なくともＰｌＧＦ−２タンパク質部分および野生型ＰｌＧＦ−２に存在する部分とは異なるさらなる部分を含有するハイブリッド分子をさす。ＰｌＧＦ−２誘導体の例としては、例えば、ＰｌＧＦ−２と非ＰＬＧＦ関連タンパク質を含む融合タンパク質（例えば、アルブミン、またはＰｌＧＦ−２とは異なるタンパク質のさらなるヘパリン結合ドメイン）ならびにＰｌＧＦ−２とＰｌＧＦ−２の１または複数のヘパリン結合ドメインを含む融合タンパク質が挙げられる。ＰｌＧＦ−２の誘導体には、例えば、非タンパク質化合物のＰｌＧＦ−２への付加、例えば、ＰｌＧＦ−２のペグ化がさらに含まれる。用語ＰｌＧＦ−２誘導体には、活性ＰｌＧＦ−２変異タンパク質がさらに含まれる。そのような変異タンパク質には、例として、国際公開第０３／０９７６８８号に記載されるような別のアミノ酸に対するＣ末端システインの突然変異を挙げることができる。誘導の性質がどんなものであっても、結果として得られるＰｌＧＦ−２タンパク質誘導体はその生物活性を保持するべきである；しかし、活性ＰｌＧＦ−２誘導体の用量は、同じ治療効果を得るために、野生型ＰｌＧＦ−２の用量と同じであることもあり、または野生型ＰｌＧＦ−２の用量よりも高いかまたは低いことが必要であり得ると想定される。ＰｌＧＦ−１は、受容体ＦＬＴ−１（およびその可溶性変異体ｓＦＬＴ−１）だけに結合するが、ＰｌＧＦ−２は、その上にニューロピリン−１および−２と結合する。異なるシグナル伝達カスケードがＰｌＧＦ−１およびＰｌＧＦ−２により引き起こされる（Ｋｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：１０７０５；Ｍｉｇｄａｌ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２２２７２；Ｐｅｒｓｉｃｏ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３７：３１）。異なる構造、受容体の結合パターンおよびシグナル伝達を考慮すると、ＰｌＧＦ−１は、この文脈において、ＰｌＧＦ−２の誘導体であるとみなされない。

本発明の様々な態様の全てにおいて、用語「哺乳動物」は、その一般的な意味で考えられ、それには、すなわちヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジおよび同類のものが挙げられる。

本明細書において使用される用語「治療上有効な量」は、好ましくは想定される１または複数の治療効果を実現することのできる量を意味する。それは、所定の送達方法および／または所定の送達治療計画で有益な治療効果を生じるために必要とされる活性成分（ＰｌＧＦ−２タンパク質またはＰｌＧＦ−２誘導体）の量をさす。有益な治療効果には、状態、生理状態または疾患のさらなる進行を少なくとも停止または抑制することが含まれる。それは、必ずしも完全な治癒を含むわけではないが、状態、生理状態または疾患のあらゆるレベルの改善、寛解、後退または縮小をさらに含むことができるが、含んではならない。治療上有効な量は送達方法および／または送達治療計画によって決まることになるが、それは処置される哺乳動物の体重１ｋｇあたり約２〜２０００マイクログラムの量に相当することがある。

活性成分（ＰｌＧＦ−２タンパク質またはＰｌＧＦ−２誘導体）は、哺乳動物またはヒト患者にタンパク質、例えば、組換え型タンパク質として全身に投与される。ＰｌＧＦ−２タンパク質またはＰｌＧＦ−２誘導体の組み換え発現は、原核生物の宿主（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））で行われてよいが、真核細胞（例えば、ＣＨＯ、または昆虫細胞などの哺乳動物細胞株）での発現によるなどのグリコシル化されたタンパク質を産生することに利点がありうる。そのような細胞株は、一過性かまたは恒常的な方法のいずれかでＰｌＧＦ−２またはＰｌＧＦ−２誘導体を発現することが可能でありうる。

全身送達（例えば、皮下、または血管内、例えば、静脈内もしくは冠内）は、心筋内注射にまさる実際的な利点を有する。後者は手術中に実行されるかまたは精巧なカテーテルを経由して実行される。心筋内送達は、次のさらなる制限を有する：送達時間が特有であり、反復はさらなる介入を必要とし、局所浮腫を回避するために注入量を最小に保たなくてはならない。一方、全身送達によって治療薬の十分な投与量に達することは、（非器官特異的）副作用によって妨げられる可能性がある。これは、例えば、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦ増殖因子の例に当てはまり、それらの最大静脈内もしくは冠内投与量は、低血圧症および浮腫を引き起こすそれらの傾向によって制限される。しかし、そのような副作用は、ＰｌＧＦによってはもたらされない（Ｌｕｔｔｕｎ ｅｔ ａｌ．２００２，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９７９：８０）。さらに、本明細書において実証される全身ＰＬＧＦ送達の効力および安全性は、以前に試験した血管新生治療薬、例えば、ＶＥＧＦ−ＡおよびＦＧＦで直面した問題を緩和する（概説には、Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：４５４参照）。上記のＰｌＧＦ−２タンパク質またはＰｌＧＦ−２誘導体の全身投与は、任意の適した経路によって得ることができる（例えば、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内、大動脈内、冠内または非経口投与、あるいは簡単なカテーテル法によって；さらなる投与様式は、浸透圧ポンプによるなどの連続送達である）。静脈内および／または皮下投与が全身投与の好ましい経路である。ＰｌＧＦ−２タンパク質またはＰｌＧＦ−２誘導体の全身投与を構成するために考慮されないものは、心筋内投与（投与された化合物の全身への拡散が限られることによる）および遺伝子療法による投与である。

上記のいずれにおいても、活性成分（ＰｌＧＦ−２タンパク質またはＰｌＧＦ−２誘導体）は、製薬上許容され得る担体をさらに含む製剤に含められてよい。

用語「製薬上許容され得る担体」は、例として１または複数の活性成分を溶解、分散または拡散することによってその適用または伝播を促進し、かつ／またはその有効性を損なうことなくその貯蔵、輸送または取り扱いを容易にするために、該活性成分と共に処方される任意の材料または物質をさす。製薬上許容され得る担体は、固体であっても液体であってもよい、すなわち、本発明の組成物は、濃縮物、乳濁液、溶液、顆粒、ペレットまたは粉末として適切に使用または貯蔵されることができる。

本発明の組成物での使用に適した製薬担体は当業者に周知であり、本発明内でそれらの選択に特定の制限はない。それらには、添加剤、例えば湿潤剤、分散剤、乳化剤、溶媒、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤（例えば糖または塩化ナトリウム）および同類のものなども、これらが薬務と一致している、すなわち担体および添加剤が哺乳動物に永久的な損害を与えないという条件で含まれてよい。本発明の医薬組成物は、公知の方法で、例えば、一段階または多段階手順で、選択された担体材料を用いて活性成分を均質混合、コーティングおよび／または磨砕することにより調製されてよく、適切な場合は、その他の添加剤、例えば表面活性剤も、微粒子化によって（例えば活性成分の制御放出または持続放出のためのミクロスフェアまたはナノ粒子の形態でそれらの添加剤を得ることを考えて）調製されてよい。

本発明の医薬組成物で使用されるために適した表面活性剤は、良好な乳化性、分散性および／または湿潤性を有する非イオン性、陽イオン性および／または陰イオン性材料であり、適した陰イオン性界面活性剤には、水溶性石鹸および水溶性合成表面活性剤の両方が含まれる。適した石鹸はアルカリもしくはアルカリ土類金属塩、高級脂肪酸（Ｃ１０−Ｃ２２）の非置換もしくは置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸のナトリウムもしくはカリウム塩、あるいは、例えば、ココナッツ油または獣脂から得られる天然脂肪酸混合物のナトリウムもしくはカリウム塩である。合成界面活性剤としては、ポリアクリル酸のナトリウムもしくはカルシウム塩；脂肪スルホン酸塩および硫酸塩；スルホン化ベンズイミダゾール誘導体およびアルキルアリールスルホン酸塩が挙げられる。脂肪スルホン酸塩または硫酸塩は、通常、アルカリもしくはアルカリ土類金属塩、非置換アンモニウム塩または８〜２２個の炭素原子を有するアルキルもしくはアシルラジカルで置換されたアンモニウム塩、例えば、リグノスルホン酸またはドデシルスルホン酸または天然脂肪酸から得られる脂肪アルコールサルフェートの混合物のナトリウムもしくはカルシウム塩、硫酸またはスルホン酸エステル（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）および脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸のアルカリもしくはアルカリ土類金属塩の形態である。適したスルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは８〜２２個の炭素原子を含有する。アルキルアリールスルホン酸塩の例は、ドデシルベンゼンスルホン酸またはジブチル−ナフタレンスルホン酸またはナフタレン−スルホン酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまたはアルカノールアミン塩である。また、適しているのは、対応するリン酸塩、例えば、リン酸エステルの塩およびｐ−ノニルフェノールのエチレンおよび／または酸化プロピレンを伴う付加物、またはリン脂質である。この目的に適したリン脂質は、セファリンまたはレシチン型の天然（動物もしくは植物細胞に起源をもつ）または合成リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リゾレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジル−コリン、ジパルミトイルホスファチジル（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｈａｔｉｄｙｌ）コリンおよびそれらの混合物である。

適した非イオン性界面活性剤としては、アルキルフェノール、脂肪アルコール、脂肪酸、分子中に少なくとも１２個の炭素原子を含有する脂肪族アミンまたはアミド、アルキルアリールスルホン酸塩およびジアルキルスルホスクシネートのポリエトキシ化およびポリプロポキシ化誘導体、例えば、脂肪族および脂環式アルコール、飽和および不飽和脂肪酸ならびにアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体が挙げられ、前記誘導体は、好ましくは（脂肪族）炭化水素部分に３〜１０個のグリコールエーテル基および８〜２０個の炭素原子と、アルキルフェノールのアルキル部分に６〜１８個の炭素原子を含有する。さらに適した非イオン性界面活性剤は、アルキル鎖に１〜１０個の炭素原子を含有するポリプロピレン（ｐｏｙｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコール、エチレンジアミノポリプロピレングリコールを伴うポリエチレンオキシドの水溶性付加物であり、その付加物は、２０〜２５０個のエチレングリコールエーテル基および／または１０〜１００個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。そのような化合物は、通常、１プロピレングリコール単位当たり１〜５個のエチレングリコール単位を含有する。非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコール酸エーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリエチレンソルビタン（例えばポリオキシエチレンソルビタントリオレエートなど）、グリセロール、ソルビタン、スクロースおよびペンタエリトリトールの脂肪酸エステルも適した非イオン性界面活性剤である。

適した陽イオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩、好ましくは、ハロ−、フェニル−、置換フェニル−またはヒドロキシル−基で所望により置換されていてもよい４個の炭化水素ラジカルを有するハロゲン化物；例えばＮ−置換基として少なくとも１つのＣ８−Ｃ２２アルキルラジカルを含有する第四級アンモニウム塩（例えば、セチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイルおよび同類のもの）および、さらなる置換基として、非置換もしくはハロゲン化低級アルキル、ベンジルおよび／またはヒドロキシ−低級アルキルラジカルを含有する第四級アンモニウム塩が挙げられる。この目的に適した表面活性剤のより詳細な記述は、例えば「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ Ａｎｎｕａｌ」（ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｒｏｐ．，Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９８１）、「Ｔｅｎｓｉｄ−Ｔａｓｃｈｅｎｂｕｃｈ」第２版（Ｈａｎｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｉｅｎｎａ，１９８１）および「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ」（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１）に見出すことができる。

本発明の医薬組成物中の活性成分の作用持続時間を制御するために、さらなる成分が活性成分の製剤に含められてよい。制御放出組成物は、従って、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンおよび同類のものなどの適切なポリマー担体を選択することによって達成することができる。薬物放出速度および作用持続時間は、活性成分を、例えばヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメタクリル酸メチルおよびその他の上記ポリマーなどのポリマー物質の粒子、例えばマイクロカプセルの中に組み込むことによって制御することもできる。そのような方法としては、リポソーム、ミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルなどのようなコロイド薬物送達系が挙げられる。投与経路に応じて、医薬組成物は保護コーティングを必要とすることもある。

注射用途に適した剤形としては、滅菌水溶液または分散液およびその即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。そのため、この目的のための典型的な担体としては、生体適合性水性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび同類のものならびにそれらの混合物が挙げられる。

ブタモデルにおける心不全へのＰｌＧＦ−２の効果

１．１ ＰｌＧＦ−２産生
ｒｈＰｌＧＦ−２（組換えヒトＰｌＧＦ−２）を発現している組換え型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を、ｈＰｌＧＦ−２のｃＤＮＡ配列を挿入したｐＥＥ１４４ｈＰ２構築物を用いて開発した。グリコシル化ｒｈＰｌＧＦ−２を、バイオリアクターで、超音波灌流された（ｓｏｎｏ−ｐｅｒｆｕｓｅｄ）高細胞密度培養によって生成した。ＣＨＯ細胞由来のグリコシル化ｒｈＰｌＧＦ−２を、異なるアフィニティークロマトグラフィー工程によって精製した。最初の工程では、細胞培養液を、ＰｌＧＦ−２（２８ｋｄ）が膜を通過しないように３ｋｄのカットオフで中空繊維で濃縮した。次に、２Ｍ硫酸アンモニウムを添加した後、濃縮物を疎水性Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでさらに精製した。ｒｈＰｌＧＦ−２を１０ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ８．５を用いて溶離し、または一部の例では水中４０％エチレングリコールさえも必要とした。溶離した画分を脱塩し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて緩衝液をＰＢＳに交換した。アフィニティークロマトグラフィーの最後の工程で、Ｈｅｐａｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヘパリン結合ドメインを含有するｒｈＰｌＧＦ−２を保持した。精製タンパク質は、ＰＢＳ中１Ｍ ＮａＣｌを用いるステップ溶離によって得た。種々の画分をプールした後、−２０℃でＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのさらなる脱塩の後に精製したｒｈＰｌＧＦ−２をＰＢＳ中で貯蔵した。

１．２ 研究群
この調査は、実験動物の管理および使用のためのベルギーの国立衛生研究所のガイドラインに従い、この二重盲検無作為化対照試験のプロトコールは、動物実験に関してその土地の倫理委員会に承認された（Ｅｔｈｉｓｃｈｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｅ Ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ，ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。

０日目、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）における流れ制限ステントの留置を用いて心筋虚血を誘導した（非特許文献６）。４週目に、偽群（Ｓｈａｍ）と比較して慢性心筋虚血を確認した後、ブタを、盲検化されたｒｈＰｌＧＦ−２（ＰｌＧＦ−２）またはＰＢＳ（対照）に１０日間無作為に割り当てた。血行動態パラメータ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および着色ミクロスフェアを４週目および８週目に測定した。８週目に、プロポフォールおよび飽和塩化カリウムの過剰投与を用いてブタを安楽死させた。ステントに対して遠位の左心室（ＬＶ）を、ミクロスフェアおよび組織学的解析のために、底部から尖部まで心筋の長軸に対して垂直の５枚の薄片に切断した。

３３頭の交雑した家畜のいずれかの性別のブタ（サス・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）、体重２０〜２５ｋｇ、Ａｎｉｍａｌｉｕｍ Ｋ．Ｕ．Ｌｅｕｖｅｎ、ルーヴェン、ベルギー）に、介入の１日前に、３００ｍｇアスピリン（Ｄｉｓｐｒｉｌ、Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ、ブリュッセル、ベルギー）および３００ｍｇクロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ、Ｓａｎｏｆｉ、パリ、フランス）を予め投薬した。ブタをＴｅｌａｚｏｌ（チレタミン４ｍｇ／ｋｇおよびゾラゼパム４ｍｇ／ｋｇ）（Ｚｏｌｅｔｉｌ１００、Ｖｉｒｂａｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、カロ、フランス）およびキシラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｖｅｘｙｌａｎ、ＣＥＶＡ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ、ブリュッセル、ベルギー）で鎮静させ、静脈内プロポフォール（３ｍｇ／ｋｇ）（Ｄｉｐｒｉｖａｎ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、ブリュッセル、ベルギー）と、それに続いて１０ｍｇ／ｋｇ／時の持続注入プロポフォール（Ｄｉｐｒｉｖａｎ）およびレミフェンタニル（１８μｇ／ｋｇ／時）（Ｕｌｔｉｖａ、ＧＳＫ、Ｇｅｎｖａｌ、ベルギー）を用いて麻酔を導入した。空気および酸素の混合物（１：１）による８〜１０ｍｌ／ｋｇの一回呼吸量の機械的人工呼吸を調節して、動脈血ガス値によって制御される炭酸正常状態および酸素正常状態を維持した。心拍（ＨＲ）、リズムおよびＳＴ部分を心電図検査法を用いて連続的にモニターした。０日目に、抗凝固処理（ヘパリン１００００ＩＵ）および抗血小板処理（アセチルサリチル酸４５０ｍｇ）の後、流れ制限ステントを左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）に埋め込んで、心室（ｖｅｎｔｒｉｃａｌ）機能不全を誘導した。アスピリン（３００ｍｇ）およびクロピドグレル（７５ｍｇ）を追跡調査の間毎日継続した。

３６頭のブタを登録した（３頭の偽群と３３頭の研究群）。流れ制限ステントを研究群の３３頭のブタに埋め込んだ、そのうち７頭のブタは急性合併症で死亡し；１頭のブタは９日目に死亡し、別の豚は１１日目に大きな心筋梗塞（ＬＶ質量の２５〜３０％）によって死亡した。２４頭のブタを４週目に評価し、処置に対して盲検的に無作為化して（１２の対照および１２のＰｌＧＦ−２）、８週目に再評価した。

１．３ ＰｌＧＦ−２またはＰＢＳによる無作為化された処置
ＭＲＩを用いて安静時およびストレス中の局所の心筋の低灌流および機能不全を確認した後、動物を、浸透圧ミニポンプによるｒｈＰｌＧＦ−２またはＰＢＳの１０日間ＩＶ注入に対し無作為化した。循環ＰｌＧＦレベルを、標準的なＰｌＧＦイムノアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｅｌｉｓａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて定量化した、それは９５％アミノ酸同一性を共有するためヒトとブタの両方のＰｌＧＦ−２アイソフォームを検出する。プレートを、ＰｌＧＦを特異的に認識するモノクローナル抗体で一晩（４℃）コーティングし、１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、洗浄し、二次ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ヒトＰｌＧＦ抗体とともにインキュベートした。結合したｒｈＰｌＧＦを、ストレプトアビジン−ＨＲＰ基質でインキュベーションの後に検出した。ｒｈＰｌＧＦ−２の標準的な希釈液を陽性対照試料として用いた。

１．４ １０日間のＩＶ注入後のＰｌＧＦレベル
偽群と比較して、血清ＰＬＧＦレベルは、心筋虚血の誘導前の０日目および４週後で同様であった（それぞれ、１０±４に対して７±０の偽、および１４±９に対して１０±２ｐｇ／ｍｌの偽）（３の偽群および２４の研究群）。対照的に、ＰｌＧＦ−２で処置されたブタは、ミニポンプ移植後１週および２週に対照および偽の６３倍を上回る高い循環ＰｌＧＦレベルを有した（５週：７９９±３０２に対して対照で１１±５、偽で１３±５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５；６週：８６７±４２３に対して対照１１±４および偽１２±５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）。８週目、ＰｌＧＦレベルはなお２倍を超えて増加していた（１８±９に対して対照８±３および偽８±１ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）（１２のＰｌＧＦ−２および１２の対照）。

１．５ 統計分析
統計分析は、ＢｉｏＳｔａｔ２００９統計ソフトウェア（バージョン５．８．３．０、ＡｎａｌｙｓｔＳｏｆｔ）を用いて実施した。データは平均値±ＳＤとして表した。ＡＮＯＶＡおよびフィッシャー事後検定を用いて群間の差を分析した。スチューデントＴ検定を用いて処置前と処置後の差を比較した。データが正規分布に従わなかった場合は、クラスカル−ワリス（ＫＷ）ノンパラメトリック統計が報告され、マン−ホイットニーまたはウイルコクソン検定を用いて群間の差を確認した。

１．６ 侵襲性の圧力−容積技法を用いて測定された、左心室の収縮性は、ＰｌＧＦ−２処置によって著しく改善された
心拍数も血圧も、４週目の偽群と比較してあまり異ならなかった。虚血群では、流れ制限ステントが収縮期機能（ｄＰ／ｄｔ_ｍａｘ）の低下、およびＬＶ拡張末期容積の増加を誘導した。対照と比較して、駆出率ＥＦおよび前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ：ｐｒｅｌｏａｄ ｒｅｃｒｕｉｔａｂｌｅ ｓｔｒｏｋｅ ｗｏｒｋ）の著しい増加は、ＰｌＧＦ−２で処置された動物におけるＬＶ収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）の低下と関連した（表１）。

４週目に、左心室（ＬＶ）に配置した５−Ｆ Ｍｉｌｌａｒ圧力−コンダクタンスカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、テキサス州ヒューストン、ＵＳＡ）で血行動態変数を測定した。心拍（ＨＲ）、ＬＶ収縮期および拡張末期圧、ならびに圧力上昇および低下の一次導関数（ｄＰ／ｄｔ_ｍａｘおよびｄＰ／ｄｔ_ｍｉｎ）を記録した。８週目に、即時的な、心室内圧およびコンダクタンス測定を実施した。ＬＶ前負荷は、下大静脈（ＩＶＣ）に配置したバルーンカテーテルで変化させた。ＬＶ容積を補正および較正するために、肺の動脈に配置されたスワン−ガンツカテーテル（Ｅｄｗａｒｄｓ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、カリフォルニア州アーバイン）を用いて熱希釈方法によって心拍出量を求めた。血液抵抗は、抵抗キュベット（Ｒｈｏ−キュベット）および心室壁のコンダクタンスに起因し得る平行コンダクタンスで測定し、ＩＶＣへの１０ｍｌの３０％高張生理食塩水注射を用いて結合組織を評価した。拡張末期容積（ＥＤＶ）、収縮期末期容積（ＥＳＶ）、駆出率（ＥＦ）、ｄＰ／ｄｔ_ｍａｘおよびｄＰ／ｄｔ_ｍｉｎを定常状態条件中に計算した。心室収縮性の頑強な負荷非依存性パラメータである、前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）は、ＩＶＣ閉塞による一過性の前負荷低下中に導いた。全ての変数は、ＰｏｗｅｒＬａｂ記録ユニットおよびＬａｂＣｈａｒｔ ソフトウェア（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オックスフォードシャー、英国）を用いてデジタル化および処理した。

対照と比較して、ＥＦおよびＰＲＳＷの著しい改善は、ｒｈＰｌＧＦ２で処置された動物でのＬＶＥＳＶの低下に関係した。対照群はＬＶＥＳＶが２倍増加し、ＥＦおよびＰＲＳＷは偽群のブタよりも著しく低かった（表１）。

表１ 圧力容積ループを用いる、ステント留置後８週および無作為化処置後４週の左心室の全体的な機能分析
値は平均値±ＳＤである。ＥＤＶ：拡張末期容積；ＥＳＶ：収縮末期容積；ＥＦ：駆出率；ＰＲＳＷ：前負荷動員一回仕事量。^＊対照に対してｐ＜０．０５；†偽に対してｐ＜０．０５；‡偽に対してｐ＝０．０５。

１．７ ＰＬＧＦ２−処置は、安静時およびドブタミン−ストレス中の全体および局所の心機能を改善する（心ＭＲＩから得たデータ）。
心ＭＲＩは、３Ｔシステム（ＴＲＩＯ−Ｔｉｍ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、エルランゲン）で４週および８週目に心電図トリガ、心臓専用の表面コイルを用いて、呼吸停止中に実施した。全体および局所の機能は、安静時およびドブタミンに誘発されるストレス中に、６−ｍｍ厚さのスライスを用いて、完全なＬＶを網羅する垂直および水平の長軸および短軸のシネＭＲＩで評価した。ドブタミン（Ｄｏｂｕｔｒｅｘ，Ｍｅｒｃｋ，Ｏｖｅｒｉｊｓｅ、ベルギー）を５μｇ／ｋｇ／分で静注した後、ベースラインを上回る８０％の目標心拍数に達するまで滴定した。安静時およびストレス中の局所灌流（アデノシン１８０μｇ／ｋｇ／分）を、デュアルボーラス初回通過イメージングを用いて評価した。心筋の生存力は、遅延造影（ＬＥ）ＭＲＩを用いて評価した。

ＭＲＩシーケンスの完全な説明は以前に報告されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ＿Ｒｅｓ ８９：１６６）。調査者らに処置の割当てを知らせずに、専用ソフトウェアを用いて全てのＭＲＩ調査を分析した。心筋の局所灌流、機能およびＬＥを同一の解剖学的領域で評価した。これらのスライスで、ＬＶ心外膜と心内膜の境界の表示図を、６の等角セグメントに分割した。全体的なＬＶ機能の評価のために、心内膜と心外膜の境界を、拡張末期容積および収縮末期容積の短軸スライスにおいて追跡した。本発明者らは、ＬＶ ＥＤＶおよびＥＳＶ、心拍出量（ＳＶ）ならびにＥＦを、全体的な機能の指標として計算した。ＬＶ質量および全ての容積は、体表面積に対して指標化されて報告された（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｎｉｅｌｓｅｎ １９８４，「Ｓｃａｌｉｎｇ：Ｗｈｙ ｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｓｉｚｅ ｓｏ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ？」，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。心筋壁肥厚は、遠隔および虚血領域の局所機能の指標として測定された。心筋血流（ＭＢＦ）は、遠隔および虚血領域の局所灌流のパラメータとして計算された。充血性の灌流は慢性虚血における虚血領域を正確に明確化することができるので、４週目のストレス灌流中の偽群で得たセグメント閾値（平均−ｔ０．９５、ｎ−１^＊ｓｄ^＊ｓｑｒｔ（（ｎ＋１）／ｎ））を用いて虚血領域を明確化した。心筋梗塞サイズの計算のため、心内膜と心外膜の境界およびＬＥ領域の輪郭を描いた。心筋梗塞サイズ（ＩＳ）をＬＶ心筋容積に正規化した全ＬＥ量として計算した。

ＰｌＧＦ−２注入後、ＥＦはＰＢＳ処置と比較して４〜８週に著しく改善された。この改善は、拡張末期容積指標ＥＳＶｉの低下に関係している（表２Ａ）。流れ制限ステントの留置は、４週目に制限された梗塞を誘導した（梗塞サイズＩＳ ４±６％、０〜１５％に及ぶ）。両群で梗塞サイズ（ＩＳ）は同等であった。特に、ＩＳは４週から８週まで変化しなかった（表２Ａ）。容易に比較するために、ＰｌＧＦ−２を評価するために本明細書において使用される同じモデルにおけるＰｌＧＦ−１について報告された関連する最初のデータ（非特許文献６中の表４）を、本明細書下文の表２Ｂに含める。しかし、公開される値は平均値±標準誤差（ＳＥ）を反映するが、表２Ｂに示される値は平均値±標準偏差（ＳＤ）を反映することに注意しなければならない。ＰｌＧＦ−２の効果に反して、ＰｌＧＦ−１はＥＦを改善しないばかりか、ＥＳＶｉを低下させもしない。

表２Ａ．ＭＲＩを用いる左心室の全体的な機能および構造分析；ＰｌＧＦ−２研究。
値は平均値±ＳＤである。ＥＤＶｉ：拡張末期容積指数；ＥＳＶｉ：収縮末期容積指数；ＳＶｉ：心拍出量指数；ＥＦ：駆出率；ＬＶＭｉ：左心室質量指数；ＩＳ：梗塞サイズ。容積測定パラメータは、体表面積に対して指標化された。^＊偽、８週に対してｐ＝０．０１；†対照に対してｐ＜０．００１。
表２Ｂ．ステント留置後８週目の全体的なＬＶ機能のＭＲＩ分析；ＰｌＧＦ−１研究。
値は平均値±ＳＤとして表示される。容積測定パラメータは、次のようなＭｅｅｈの式を用いて、体表面積に対して指標化された：ＢＳＡ（単位ｍ^２）＝ｋ×［体重（単位ｋｇ）］^２／３×１０^−２、式中、ｋ＝９．０．ＢＷ：体重；ＥＤＶｉ：拡張末期容積指数；ＥＳＶｉ：収縮末期容積；ＬＶＭｉ：左心室質量指数；ＳＶｉ：心拍出量指数；ＥＦ：駆出率。^＊偽に対してｐ＜０．０５。

８週目、偽群の動物において、安静時の壁肥厚は、ＬＡＤ灌流領域および遠隔領域（５４±１％対５５±１％）で同等であり、増加性のドブタミンストレスに対して同様の進行性応答を示した。虚血領域では、安静時のｒｈＰｌＧＦ−２処置ブタの壁肥厚は、対照と比較して著しく選択的に増加した（３７±１５％対２３±９％、ｐ＝０．０２）が、ＰＢＳは効果がなかった。対照群のストレスへの二相応答に反して、ｒｈＰｌＧＦ−２処置後の壁肥厚は低用量ストレス中に増加し、虚血領域において定常期を示す高用量ストレス中にはさらなる増加はなかった。遠隔領域では、壁肥厚はｒｈＰｌＧＦ−２群、対照群または偽群間で、安静時および全ての相のストレス中で同等であった（図１）。

虚血性ステント留置から４週間後、虚血領域における安静時と充血刺激後の両方での心筋血流（ＭＢＦ）は、偽群と比較して著しく低下した（安静時：０．６３±０．１８対０．８７±０．０６ｍｌ／分／ｇ、ｐ＝０．０３、およびストレス時：０．９４±０．３３対１．７４±０．０１ｍｌ／分／ｇ、ｐ＝０．０００４）が、なお残りの灌流保留分が残っていた。８週目に、ｒｈＰｌＧＦ−２処置群において、ＭＢＦは、安静時（０．８３±０．３２対０．５８±０．２１ｍｌ／分／ｇ、ｐ＝０．０３）と充血性の灌流時（１．５０±０．５０対１．０２±０．４６ｍｌ／分／ｇ、ｐ＝０．０３）に著しく増加したが、対照群では増加しなかった。遠隔領域では、安静時および充血性の灌流後のＭＢＦは、ｒｈＰｌＧＦ−２処理、対照および偽群動物間で同等であった（図２）。

１．８ ミクロスフェア測定
血行動態データを得た後、６−ＦピッグテールカテーテルをＬＶに挿入し、６００万個の着色ミクロスフェア（直径１５μｍ；Ｔｒｉｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ）を注入して局所心筋血流（ＭＢＦ）を測定した。絶対血流は、異なる心筋の領域のミクロスフェア濃度を基準血液試料で測定した濃度と比較することにより定量化した。基準血液試料は、腹部大動脈から一定の速度で抜き取られ、ミクロスフェア注射の２０秒前に開始された。２つの基準組織試料を、左右の腎臓から入手してミクロスフェア分布の均質性を試験した。虚血領域および遠隔領域（下壁）由来の心筋試料ならびに基準血液および腎臓試料を、発光分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３Ｅ 紫外可視分光システム）を用いて分析した。ＭＲＩ測定値に一致して、着色されたミクロスフェアを用いて測定したＭＢＦは、ｒｈＰｌＧＦ２処置動物において４週から８週まで著しく増加したが、対照では増加しなかった（表３）。

表３．虚血領域の局所心筋血流の絶対値。
値は平均値±ＳＤである。^＊４週目の局所心筋血流に対してｐ＜０．０５。

１．９ バイオマーカー分析、新血管新生測定
心臓壊死マーカー（Ｔｎｌ、ＣＫ、ＣＫＭＢ、ＣＫＭＢ相対指標およびＬＤＨ）および肝臓機能（ＡＳＴおよびＡＬＴ）試験を、ステント留置前の０日目、処置の４週前、５、６および８週の追跡調査期間に分析した。これらの値は、ｒｈＰｌＧＦ２群、対照群および偽群で同等であった。

１．１０ ＰｌＧＦ−２は虚血心筋の新血管新生を誘導する
新血管新生を、虚血域および遠隔域の５−μｍパラフィン包埋切片で評価した。全ての画像を各域から１０の無作為に選択された高倍率視野（ＨＰＦ）で分析した。レシチンおよび平滑筋細胞（ＳＭ−アクチン）マーカーを用いて、それぞれ毛細血管および小型の筋肉化した（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）血管を標識した。毛細血管および筋肉化した細動脈の密度を、レクチン−およびＳＭ−アクチン陽性血管の数をカウントすることによって評価し、組織面積と比較して表した。

ｒｈＰｌＧＦ２処置ブタにおいて、レクチン染色毛細血管および平滑筋細胞アクチンで検出可能な細動脈密度は、虚血領域で、対照よりも著しく高かった（１６９１±５０９対１１０１±４４５（対照）の毛細血管数／ｍｍ^２、ｐ＜０．０５；６９±２９対３９±１３（対照）の筋肉化血管数／ｍｍ^２、ｐ＜０．０５）。

１．１１ １０日注入後のＰｌＧＦ−２の安全性分析
心臓壊死マーカーおよび肝機能試験は、３群間で同等であり、生理学的範囲内であった。

１．１２ 結論
駆出率（ＥＦ）の低下したＨＦの臨床的に代表的なモデル（すなわちＳｕｓ ｓｃｒｏｆａ）において、組換えヒトＰｌＧＦ−２とプラセボの左心室機能不全に対する効果を比較した。侵襲性血行動態測定を用いて、ＥＦの改善によって表される全体的な心機能が４１±９％から５２±１１％に改善されることが実証された。その上、包括的な磁気共鳴画像法を用いて、ＰｌＧＦ−２に媒介される改善されたＥＦが、それぞれ４４±１１％から５１±１１％となったことが確認された。統合されたデータは、ＰｌＧＦ−２処置の後の心機能不全の予防は、経時的に収縮末期容積（ＥＳＶ）のより少ない増加に起因していることを示す（ΔＥＳＶ指数：ＰｌＧＦ−２群で−１３±９ｍＬ／ｍ^２に対して対照群で−１±１１ｍＬ／ｍ^２）。ＥＦのこれらの観察される変化（ΔＥＦ）は、ＰｌＧＦ−２処置動物での＋５±６％に対して対照で−２±２％であった。ΔＥＦの大きさは、与えられた重要な死亡率の有益性とともにβ遮断薬およびＡＣＥ−阻害剤を用いた以前の重要なＨＦ調査の間に観察された変化と同様であった。これらの臨床研究の結果は、ＨＦの標準治療処置プロトコールへの後者の薬剤の組み込みをもたらした。驚くことに、本明細書において実証されるＰｌＧＦ−２のＨＦへの臨床効果（ＨＦ表現型ＥＳＶおよびＥＦの改善）は、同じ前臨床ＨＦモデルで使用したＰｌＧＦ−１の効果よりも優れている。

アテローム硬化性マウスモデルにおける心筋虚血のＰｌＧＦ−２治療

２．１ 緒論
前の実施例では、慢性心筋虚血をもつブタにおける組換えヒト胎盤増殖因子２（ｒｈＰｌＧＦ−２）の全身投与は、安静時およびストレス中の局所心筋血流および左心室の収縮機能を著しく向上させることが実証された。さらに、ｒｈＰｌＧＦ−２の持続送達はまた、有害作用なく全体的な心機能の顕著な回復ももたらした。しかし、本発明者らが調査した非アテローム硬化性ブタモデルは、血管新生増殖因子が内膜過形成および冠動脈アテローム硬化病変の進行を誘導することがあり得るアテローム性動脈硬化症をもつ患者への直接外挿を除外する（Ｃｅｌｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｎａｔ Ｍｅｄ ７：４２５）。以前のアテローム硬化性ウサギでの実験研究により、局所のアデノウイルスのＰｌＧＦ−２送達が、首輪をつけた頸動脈における内膜肥厚およびマクロファージ蓄積を著しく増加させることが報告された。また、初期アテローム動脈硬化病変のサイズおよびマクロファージ含有量は、アポＥ欠損（Ａｐｏ Ｅ−／−）マウスと比較してアポリポタンパク質（アポ）ＥとＰｌＧＦの両方が欠損したマウスで減少した（Ｋｈｕｒａｎａ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１１：２８２８）。別の研究では、抗ＰｌＧＦ抗体の５週間の送達の後、アテローム動脈硬化性プラークの炎症細胞浸潤およびプラークサイズは、軽度のアテローム性動脈硬化症の初期段階で減少した（Ｒｏｎｃａｌ ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ８６：２９）。ＰｌＧＦレベルの増加が心筋虚血の重症度を反映するかまたは病変の進行に寄与するかどうかは不明のままである。そのため、進行したアテローム性動脈硬化症および慢性心筋梗塞／虚血のネズミモデルでのＰｌＧＦ−２注入の後の心筋および血管組織の炎症応答を調査した。ＰｌＧＦ−２の持続性全身投与の異なる以下のパラメータへの効果を評価した：５カ月後の心筋の新血管新生、心臓の灌流および機能、心臓のリモデリング、アテローム動脈硬化性プラークのサイズ、マクロファージ蓄積ならびにプラークの活性化。

２．２ 材料および方法
２．２．１ 研究デザイン
この調査は、実験動物の管理および使用のためのベルギーの国立衛生研究所のガイドラインに従い、この二重盲検無作為化対照試験のプロトコールは、動物実験に関してその土地の倫理委員会に承認された（Ｅｔｈｉｓｃｈｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｅ Ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ，ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。

Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入した５週齢の雄Ａｐｏ Ｅ−／−マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２−ＡＰＯＥ／Ｊ、ｎ＝５０、体重１７．４±１．８ｇ）を研究で使用した。実験全体を通じて、全てのマウスは高コレステロール（１．２５％）食（ＴＤ．８８１３７、Ｔｅｋｌａｄ，Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を自由に摂食した。４週間後、大動脈のアテローム動脈硬化病変、心臓の形態、全体的および局所機能を、超音波イメージングを用いて評価した。その後、左冠動脈（前）下行枝（ＬＡＤ）閉塞（６０分）とそれに続く再灌流を実施して心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。８週目、慢性心筋梗塞／虚血および大動脈アテローム性動脈硬化症の評価の後、盲検化されたＰｌＧＦ−２（４５０μｇ／ｋｇ／日）（ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトＰｌＧＦ−２；カタログ番号６８３７−ＰＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、英国）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔモデル２００４、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フランス）を用いる２８日間の処置にマウスを無作為に割り当てた。１２週目、各々の群のマウスの半数に超音波イメージングおよび死後病理学的解析を受けさせた。残りのマウスは２０週まで追跡調査し、同様の解析を繰り返した（実験のフローチャートを図３に示す）。総コレステロール、ＰｌＧＦレベル、心臓壊死および炎症マーカーの定量のために血液試料を集めた。安楽死の後、心臓、大動脈、脾臓および脛骨を組織学的解析のために採取した。

２．２．２ 心筋梗塞の誘導
ネンブタール（６０ｍｇ／ｋｇ）による麻酔の後、マウスを、麻酔中の低体温を防ぐために温熱パッド（３７℃）の上に仰臥位に置いた。機械的人工呼吸は、炭酸正常状態および酸素正常状態を維持するために、２５０μｌの一回呼吸量および１５０／分の速度であった。

心臓を、第３肋骨と第４肋骨の間の肋間腔での開胸によって露出させた。７−０縫合糸を置いてＬＡＤを６０分間結紮した。結紮を外すために、絹の係蹄を外し、目視検査で再灌流を確認した。次に、胸部を閉じた。手術後、マウスを麻酔から回復するまで置き、ひとたび自発呼吸が再開すると気管内チューブを取り外した。術後皮下ブプレノルフィン（０．０５〜０．２ｍｇ／ｋｇ）無痛法を用いた。

２．２．３ ＰｌＧＦまたはＰＢＳによる無作為化処置
心筋梗塞の４週後、動物を、ＰｌＧＦ−２（ＣＨＯ細胞由来の組換えヒトＰｌＧＦ−２；カタログ番号６８３７−ＰＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、英国）またはＰＢＳの浸透圧ミニポンプによる２８日皮下注入に無作為化した。循環ＰｌＧＦレベルを、ヒトとネズミの両方のＰｌＧＦ−２アイソフォームを検出する標準的なＰｌＧＦイムノアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｅｌｉｓａ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて定量化した。プレートを、ＰｌＧＦを特異的に認識するモノクローナル抗体で一晩（４℃）コーティングし、１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロッキングし、洗浄し、二次ビオチン化ポリクローナルヤギ抗ヒトＰｌＧＦ抗体とともにインキュベートした。結合したＰｌＧＦを、ストレプトアビジン−ＨＲＰ基質でインキュベーションの後に検出した。ＰｌＧＦ−２の標準的な希釈液を陽性対照試料として用いた。

２．２．４ 超音波イメージング測定
経胸壁超音波イメージングを、軽い麻酔（酸素中１〜２％イソフルラン）下で実施した。動物を、継続的なＥＣＧおよび呼吸モニタリングを行いながら３７℃の電気温熱パッドの上に仰臥位に置いた。心臓および血管の画像を、デジタル超音波システム（Ｖｅｖｏ ２１００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ、トロント、カナダ）で、１８〜３８および３２〜５６ＭＨｚ高周波リニアアレイトランスデューサ（それぞれ、ＭＳ４００およびＭＳ５５０Ｓ）で得た。

２Ｄ心エコー調査は、傍胸骨長軸で実施された（Ｂｈａｎ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ａｍ．Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０６，Ｈ１３７１）。画質を最適化するために、画像深度、幅およびゲイン設定をそれに応じて適合させた。平均深度は１４ｍｍであり、全フレームレートは２００フレーム／秒を上回った。画像は、３００フレームからなるシネループにデジタル保存した。

上行大動脈および大動脈弓の血流速度は、パルス波ドップラー画像を用いて異なる解剖学的観点で特徴付けた。ドップラー速度測定は、標的位置の中央のドップラービームと想定血流方向の間の可能な限り小さい入射角で実施された。

全ての超音波イメージング調査は、調査者に処置割当てを知らせずにＶｅｖｏ ２１００（１．５．０）ソフトウェアを用いて分析した。

左心室（ＬＶ）容積および機能は、スペックルトラッキング分析を用いて評価した。心内膜の境界の十分な視覚化および画像アーチファクトの不在に基づいて適したＢモードループを選択した。３つの連続した心周期を、画質に基づく分析のために選択した。心内膜と心外膜の境界の半自動化されたトラッキングを実施し、３つ全ての心周期にわたって検証し、その後、各シネループの全体にわたって良質のトラッキングを達成するために必要に応じて補正した。その後、トラッキングした画像をフレームごとに処理した。ＬＶ収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）およびＬＶ拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）を、ディスクテクニックの方法を用いて追跡から計算した。ＬＶＥＦおよびＬＶ質量は、容積から誘導した。ＬＶ質量および全容積は、体表面積に対して指標化されて報告された（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｎｉｅｌｓｅｎ １９８４、前記参照）。ピーク収縮期の縦軸および半径方向のひずみ尺度は、局所スペックルトラッキング分析中に得た（Ｔｈｉｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ４：５５０；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ １０８：９０８）。ＬＶ心筋の各長軸断面を、心周期を通して６の標準的な解剖的部分に分割した。ＭＩの１カ月後に記録された画像では、虚血領域は、中央前側、先端前側、および先端下壁部分で規定され、壁運動異常を考慮に入れた。基底下壁および中央下壁部分を、遠隔領域と名付けた。局所歪値は、それぞれ、梗塞部分および遠隔部分を横切るこれらの同じ測定値を平均することによって得た。

動脈の硬さの指標としての血流ピーク速度を抽出し、３連続心周期について平均した。

２．２．５ 総コレステロール、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）測定
総コレステロールレベルは、処置後０週、１カ月および３カ月目に分析した。炎症の指標としての高感受性ＣＲＰは、０週および２エンドポイントで測定した。心臓ＴｎＩは、０週の虚血再灌流後３時間および２エンドポイントで分析した。

２．２．６ 組織病理学的分析
心臓は、大静脈からの２００μｌ過飽和ＫＣｌの注射後の心臓拡張期に停止させた。組織をヘパリン処置した生理食塩水で灌流し、亜鉛ホルマリン固定液（Ｚ２９０２、シグマ）で固定した。心臓、大動脈、脾臓および脛骨を採取した。心臓および脾臓の湿重量および脛骨の長さを測定した。心臓および大動脈弓を固定液中で一晩、その後７０％エタノール中で保存し、標準的な手順を用いてパラフィンに包埋し、５μｍ厚のスライスに切開した。心臓をＬＶの心尖部からベース部分まで横に、そして大動脈弓を縦方向にスライスした。

心臓のスライスで、線維症、血管形成および炎症を評価した。線維症および梗塞サイズ（ＩＳ）を、シリウス・レッド染色したスライスで定量化した。梗塞サイズの信頼できる測定に必要な１心臓当たりの切片の最小数は、全２０スライスの１／３である（Ｔａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｊ Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０２：２１０４）。本発明者らは、ＬＶ全体を網羅するために規則的な間隔の７つのスライスを分析した。赤色に染色したコラーゲンを閾値を用いて分割（単離）した。梗塞巣は、閾値面積から導き、ＬＶ面積は手作業で追跡した。ＩＳは、全ての切片からの梗塞巣の合計を、全ての切片からＬＶ面積の合計で除算し、１００を乗じることによって計算した。新血管新生および炎症を、虚血域および遠隔域で評価した。全ての画像を各域から無作為に選択された８の高倍率視野（ＨＰＦ）で分析した。毛細血管および細動脈密度は、組織面積に対するレクチンおよびＳＭ−アクチン陽性血管の数によって評価した。炎症応答は、ＭＡＣ３免疫組織化学染色を用いて評価した。炎症は、組織面積に対するＭＡＣ３陽性細胞の数として表した。

大動脈弓スライス上で、弓の小さいほうの湾曲にあるアテローム動脈硬化性プラークを、プラークサイズ、組成、血管新生および炎症について分析した。Ｖｅｒｈｏｅｆｆ Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎは、弾性薄膜だけを染色する。プラーク面積は、内腔面積と内部の弾性薄膜で区切られる面積との間の差として測定し、血管サイズに起因する変動をなくすために結果を総血管面積に正規化した。プラークコラーゲンおよびカルシウム沈着部位は、シリウス・レッドおよびアリザリン・レッドについて陽性に染色された。レクチンおよびＳＭ−アクチンを用いてプラーク中の毛細血管および小型の筋肉化した血管を標識した。ＭＡＣ３染色を用いて炎症応答を定量化した。画像を獲得し、閾値を用いて分析して、各方法について全陽性染色を求めた。次に、これらの結果を総血管面積に正規化した。

２．２．７ 統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを用いて実施した。データは平均値±ＳＤとして表した。ＡＮＯＶＡおよび事後検定を用いて、０週、８週〜１カ月および３カ月の対照ならびに０週、８週〜１カ月および３カ月の処置のモデルの進化を評価し、群間の差を分析した。スチューデントＴ検定を用いて処置前と処置後の差を比較した。データが正規分布に従わなかった場合は、クラスカル−ワリス（ＫＷ）ノンパラメトリック統計が報告され、マン−ホイットニーまたはウイルコクソン検定を用いて群間の差が確認された。

２．３ 結果
２．３．１ 研究群
５０匹のＡｐｏ Ｅ−／−雄マウスを登録し、高コレステロール食を自由に摂食させた。４週後、本発明者らは６０分のＬＡＤ閉塞および再灌流を全てのマウスで実施し、そのうち１０匹のマウスが急性虚血性合併症で死亡した。４０匹のマウスを８週目に、盲検的に処置（ＰＢＳ２０匹およびＰｌＧＦ２０匹）に対し無作為化して評価した。それらのうちの半数（ＰＢＳ１０匹およびＰｌＧＦ１０匹）を１２週目に再評価し、残りの半数を２０週目に再評価した。ＰｌＧＦ群から２匹のマウスが（１匹は１２週目に、もう１匹は２０週目に）超音波検査中に死亡した。２０週の追跡調査の後、１９匹のマウスのうち４匹に上肢下垂足が見つかった（右側２匹および左側２匹、ＰＢＳ群から３匹）。１３匹のマウスに皮膚の問題があった（ＰＢＳ群から８匹）。研究フローチャートは、図４に表される。

２．３．２ ２８日の皮下注入後のＰｌＧＦレベル
血漿ＰｌＧＦレベルは、０週および、ＭＩの誘導の１カ月後である８週で同様であった（０±０に対して８週では０．４±２．１ｐｇ／ｍｌ）。ＰＢＳ群では、９週から２０週までのＰｌＧＦ値は、０週および８週と同等であった。対照的に、ＰｌＧＦで処置されたマウスは、ミニポンプ移植後１、２および３週でＰＢＳよりも循環ＰｌＧＦレベルが１６５３倍、９２倍、および２３倍高かった（９週：５７８１±３７１０に対してＰＢＳ３．５±８．６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００１；１０週：１６８．８±５４７．１に対してＰＢＳ１．８±４．６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０００９；１１週 ：４２．０±７８．０に対してＰＢＳ１．８±５．４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１９）。１２週および２０週目に、ＰｌＧＦレベルは０週および８週のレベルに戻った。

２．３．３ ＰｌＧＦ−２は心血管リスク因子に重要な影響を及ぼさない
ＰｌＧＦ２処理は、体重、総コレステロールレベル、高感受性ＣＲＰレベル、心臓重量および正規化心臓重量（体重に対する心臓重量および脛骨長に対する心臓重量）を含む心血管リスク因子をあまり変化させなかった。

２．３．４ ＰｌＧＦ−２は、心機能を向上させ、ＬＶリモデリングを予防する：心エコー検査スペックルトラッキングイメージングを用いるＬＶ容積、心臓の全体および局所の機能分析。
心拍は心筋梗塞後に著しく増加し、１２週までさらに上昇し、２０週まで高いままであった。ＬＡＤの虚血再灌流は、ＥＦの低下、ならびにＬＶＥＤＶｉおよびＬＶＥＳＶｉの増加を誘導した。ＰＢＳと比較して、ＥＦの著しい改善は、１２週目のＰｌＧＦ−２で処置された動物におけるＬＶＥＤＶｉおよびＬＶＥＳＶｉの低下に関連していた。ＰｌＧＦ−２注入は、２０週目でさらなるＬＶＥＤＶｉ、ＬＶＥＳＶｉの上昇およびＥＦの悪化を防いだ。このことは、全体的なＬＶ構造（図５）および機能（図６）へのＰｌＧＦ−２の有益な効果を確認する。

ＭＩの４週間後、虚血領域における半径方向と縦軸の両方のひずみは、０週と比較して著しく減少した。ＰｌＧＦ−２処置の後、局所の半径方向および縦軸のひずみは１２週目に一時的に改善された。

２．３．５ ＰｌＧＦ−２は、虚血心筋において新血管新生を誘導する
ＰｌＧＦ−２で処置されたマウスにおいて、レクチン染色した毛細血管密度は、１カ月後に虚血領域において対照よりも著しく高かった（２１４４±４７８に対して２８１３±２１２の毛細血管数／ｍｍ^２、対照に対してｐ＜０．０５）。ＳＭアクチン−染色した細動脈密度は、３カ月目にＰｌＧＦ−２で処置された群で著しく高くなった（１２５±１８に対して７７±１３の対照における小型の筋肉化した血管の数／ｍｍ^２、ｐ＝０．００１４）。

２．３．６ ＰｌＧＦ−２は、心臓の損傷および炎症を誘導しない
０週、１２および２０週と比較して、ｃＴｎＩレベルは虚血再灌流の３時間後に著しく増加して、心筋梗塞が確認された。１２週および２０週の異なる処置群間で差異は見出されなかった。このことは、ＰｌＧＦ−２が心臓壊死を誘導しなかったことを証明する。

シリウス・レッド染色の分析に基づいて、ＩＳは１２週と２０週の両方の群において同等であった（１２週のＰｌＧＦは９．７±５．３に対して１１．５±６．２％；２０週のＰｌＧＦは９．６±７．５に対して１２．１±５．１％）。１２週および２０週目に、ＭＡＣ３＋細胞密度は、虚血領域および遠隔領域の群間において同等であった。しかし、２０週目にＭＡＣ３＋細胞密度は領域（虚血または遠隔非虚血）および処置（ＰＢＳまたはＰｌＧＦ−２）に関わらず、１２週と比較して著しく増加した、図７参照。

２．３．７ ＰｌＧＦ−２は不安定なプラーク表現型を促進しなかった：
ドップラーパルス波超音波を用いる大動脈の硬さ測定。
大動脈の硬さの指標として、５の異なる位置：大動脈根、上行大動脈、無名動脈、頸動脈および鎖骨下動脈に隣接する大動脈弓の３カ所でピーク速度を測定した（図８）。ピーク速度は、心筋梗塞の１カ月後に大動脈根を除く全ての位置で著しく増加した。ＰＢＳと比較して、ＰｌＧＦ−２の適用は、１２または２０週でのピーク速度差を誘導しなかった。

組織染色を用いるプラーク分析における形態計測、線維症、カルシウム沈着、血管形成および炎症。
ＰｌＧＦ−２投与は、処置１カ月後および３カ月後にＶｅｒｈｏｅｆｆ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色で測定した、正規化されたプラーク面積を増加させなかった。しかし、プラーク面積は後期段階により大きくなり、これは継続的な高コレステロール食の摂食による可能性が最も高かった。ＰｌＧＦ−２注入は、１２週および２０週で、正規化されたプラーク線維症（シリウス・レッド染色）およびカルシウム沈着（アリザリン・レッド染色）の変化を誘導しなかった。１２週目に、プラークカルシウム沈着が４匹のマウスで明らかになり（そのうちの２匹はＰＢＳ群からのマウス）、一方、２０週目に、１４匹のマウスで明らかになった（そのうちの７匹はＰＢＳ群からのマウス）。ＰｌＧＦ−２処置は、１２週または２０週でプラークの毛細血管面積および細動脈面積を増加させなかった（図９）。このことは、ＰｌＧＦ−２がプラーク脆弱性に寄与しなかったさらなる確証を表す。ＰＢＳと比較して、ＰｌＧＦ−２で処置されたマウスは、１２週および２０週でプラークにおいて同等の炎症応答、プラーク面積に対する同様のＭＡＣ３^＋細胞面積（図１０）を示した。

脾臓重量および体重に対する脾臓は、観察した時点で群間で異ならなかった。

２．３．８ 結論
結論として、提示されるデータは、ＰｌＧＦ−２の全身投与がＨＦの進行を著しく制限することを実証する。より特に、ＰｌＧＦ−２が心筋の新血管新生能、収縮機能を改善すること、ＰｌＧＦ−２がアテローム動脈硬化性プラークのサイズを増加させることなく、マクロファージの蓄積を増加させることなく、プラークを不安定化することなく、心臓の構造を保存することが本明細書において実証される。

従って現在のデータは、心筋灌流および機能の改善を必要とする患者の処置において患者におけるＰｌＧＦ−２タンパク質の注入の使用を支持する。現在のデータは、心臓のリモデリングの予防のために、そして虚血心筋症によって引き起こされる心不全の発生を防ぐために、ＰｌＧＦ−２の使用をさらに支持する。

Claims (17)

1. 哺乳動物において心不全表現型を処置または予防する際に使用するための胎盤増殖因子２タンパク質（ＰｌＧＦ−２）を含む組成物であって、前記哺乳動物がアテローム硬化性である、組成物。
2. 前記心不全表現型が、心室機能不全である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記心室機能不全が、収縮末期容積の増加によって定義される、請求項２に記載の組成物。
4. 前記心室機能不全が、駆出率の低下によって定義される、請求項２に記載の組成物。
5. 前記心室機能不全が、収縮末期容積の増加および駆出率の低下によって定義される、請求項２に記載の組成物。
6. 前記心不全表現型が、心室リモデリングである、請求項１に記載の組成物。
7. 前記心室リモデリングが、拡張末期容積の増加によって定義される、請求項６に記載の組成物。
8. 前記心室機能不全が、弛緩障害、心室充満圧の増加および保持された駆出率によって定義される、請求項２に記載の組成物。
9. 前記心不全表現型が、左および／または右心室に示される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 前記ＰｌＧＦ−２タンパク質が、組換え型ＰｌＧＦ−２タンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 前記組換え型ＰｌＧＦ−２タンパク質が、哺乳動物細胞培養から得られる、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記哺乳動物細胞培養が、一時的または恒常的にＰｌＧＦ−２を発現することのできるチャイニーズハムスター卵巣細胞培養である、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記ＰｌＧＦ−２タンパク質が、ヒトＰｌＧＦ−２タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
14. 前記ヒトＰｌＧＦ−２タンパク質が、配列番号２を含むものである、請求項１３に記載の組成物。
15. 全身投与による使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
16. 前記全身投与が、血管内もしくは皮下投与である、請求項１５に記載の組成物。
17. 前記血管内投与が、静脈内投与である、請求項１６に記載の組成物。