JP2521851B2 - Ｎｇｆ／ｂｄｎｆ群の神経栄養性タンパク質の生物学的に活性な組み換え体の生産 - Google Patents

Ｎｇｆ／ｂｄｎｆ群の神経栄養性タンパク質の生物学的に活性な組み換え体の生産

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】〔発明の分野〕本発明は、生物学的に活性
な形をした、ヒトＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タン
パク質の組み換え体の生産方法に関する。さらに、本発
明は、この群のタンパク質のこれまで報告されていない
メンバーを同定し、かつ続いてこれらのタンパク質を生
産する方法について開示する。 〔発明の背景〕神経栄養性因子（neurotrophic factor
）は神経系または神経系によって刺激された非神経組
織に存在する天然タンパク質であり、その機能は神経細
胞および／またはグリア細胞の生存を促進し、それらの
表現型分化を維持することである（Varon and Bunge 19
78 Ann. Rev. Neuroscience 1:327; Thoenen and Edgar
1985 Science 229:238 ）。この生理学的役割ゆえに、
神経栄養性因子はアルツハイマー病やパーキンソン病の
ような種々の神経変性性疾患に、あるいは脳卒中や脊髄
への物理的外傷のような外傷性障害後に起こる神経細胞
の変性および分化機能の低下を治療するのに有用であり
うる（Appel 1981 Ann. Neurology 10:499）。
【０００２】特定の神経栄養性因子が神経損傷の治療に
有用でありうるためには、そのクラスの損傷を受けた神
経細胞がその因子に反応しなければならない。一般に、
異なる神経栄養性因子は異なるクラスの神経細胞に別々
に影響を及ぼす。従って、様々な形態の病気または傷害
に現れうる各クラスの損傷ニューロンを治療するために
は、種々の異なる神経栄養性因子を手中にすることが得
策である。
【０００３】所定の神経栄養性因子は、正確なニューロ
ン特異性をもつことのほかに、薬物治療に使用するに足
る量で入手できなければならない。さらに、神経栄養性
因子はタンパク質であるので、外来タンパク質に対する
免疫応答を避けるために、ヒト形態のタンパク質のみを
ヒト患者に投与することが望ましいだろう。神経栄養性
因子は一般に組織中に微量で存在し（例えば、Hofer an
d Barde 1988 Nature 331:261; Linら1989 Science 24
6:1023 ）、しかもヒト組織は抽出のために簡単には入
手できないので、製剤量のヒト神経栄養性因子をヒト組
織から直接製造することは不都合であろう。代わるべき
手段として、神経栄養性因子のヒト遺伝子を単離し、そ
の遺伝子を無限量のヒトタンパク質を生産しうる組み換
え発現系を確立するための土台として使用することが望
ましいであろう。
【０００４】アミノ酸配列において密接な関係がある
が、異なる（一部重複するが）組の応答性ニューロンに
影響を及ぼす２種類の神経栄養性因子は記載されている
（Leibrockら1989 Nature 341:149 ）。これらの２種類
の神経栄養性因子は：（１）神経成長因子（ＮＧＦ）お
よび（２）脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）である。
明らかに、ＮＧＦとＢＤＮＦは両方とも比較的大きい前
駆体として合成され、その後これらの前駆体はタンパク
質分解的切断によるプロセッシングを受けて成熟神経栄
養性因子を生ずる（Edwards et al, 1986 Nature 319:7
84; Leibrockら1989 同上）。これまでに報告されたＮ
ＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性因子のメンバーの遺伝子
は、ＮＧＦの場合がヒトと種々の動物遺伝子であり（Sc
ottら 1983 Nature 302:538; Ullrich ら 1983 Nature
303:821; Meier ら 1986 EMBO J. 5:1489）、そしてＢ
ＤＮＦの場合がブタ遺伝子であるにすぎない（Leibrock
ら1989 同上）。成熟ＮＧＦと成熟ＢＤＮＦとの間には
アミノ酸配列に有意な類似性があり、例えば６個すべて
のシステインアミノ酸残基の相対位置は試験した全部の
種からの成熟ＮＧＦおよびＢＤＮＦにおいて一致してい
る（Leibrockら1989 同上）。ヒト形態のＮＧＦとＢＤ
ＮＦを比較して、その類似性を強調する図７を参照され
たい。これは、ジスルフィド結合の位置から決定して、
これら２種類のタンパク質の三次元構造が類似している
ことを示唆している。両方の成熟タンパク質はまた塩基
性等電点（ｐＩ）を共有する。
【０００５】ＮＧＦは少なくとも基底前脳のコリン作動
性ニューロンにとっての神経栄養性因子である（Hefti
および Will 1987 J. Neural Transm. Suppl (AUSTRI
A) 24:309）。アルツハイマー病の進行中に起きる、Ｎ
ＧＦ応答性の基底前脳コリン作動性ニューロンの機能的
不活性化および変性はこの病気と関連した認識・記憶欠
損の主因であると考えられる（Hefti および Will 1987
同上）。ＮＧＦはアルツハイマー病に関係した動物モデ
ルにおいて基底前脳コリン作動性ニューロンの変性を阻
止してその機能を回復させることが示されており、これ
に基づいてアルツハイマー病におけるこれらのニューロ
ンの変性を阻止してその機能を回復させるための治療薬
として提案されている（Williamsら1986 Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 83:9231; Hefti 1986 J. Neuroscience
6:2155; Kromer 1987 Science 235:214; Fischerら1987
Nature 329:65）。
【０００６】ＢＤＮＦは末梢神経系の知覚ニューロンの
ための神経栄養性因子である（Barde 1989 Neuron 2:15
25）。これに基づけば、ＢＤＮＦはいろいろな末梢神経
障害に現れる知覚神経細胞の損傷と関連した感覚喪失の
治療に有用であることが分かるであろう（Schaumbergら
1983 “Disorders of Peripheral Nerves”F.A. Davis
Co., Philadelphia, PA. ）。
【０００７】医薬開発に必要とされる、完全に生物学的
に活性で、構造的に修飾されていない成熟ＮＧＦを大量
に生産しうる組み換え発現系は非常に望ましい。昆虫細
胞におけるＮＧＦの組み換え発現を記載している、欧州
特許公開第ＥＰ８９１１３７０９号を参照されたい。生
物学的に活性な成熟ＮＧＦは、ヒトまたは動物ＮＧＦ遺
伝子が真核細胞発現系により発現される場合に生産でき
る（例えば、Edwardsら 1988 Molec. Cell. Biol. 8:24
56 ）。かかる系では、初めに全長ＮＧＦ前駆体が合成
され、その後タンパク質分解によるプロセッシングを受
けて、三次元的に正しく折りたたまれ、完全に生物学的
に活性な成熟ＮＧＦを生成する。しかしながら、真核細
胞発現系はしばしば細胞のグラム当たりのタンパク質収
量が比較的低く、製造に使用するには割合経費がかさ
む。
【０００８】対照的に、細菌のような原核細胞を使う発
現系では一般に細胞のグラム当たりの発現タンパク質の
量が比較的多く、製造に使用するのに割合費用がかから
ない。しかしながら、完全に生物学的に活性で、構造的
に修飾されていない成熟ＮＧＦを生産しうる適切な細菌
発現系は記載されていない。カナダ国特許第１２２０７
３６号に細菌発現系が開示されている。しかし、発現さ
れたタンパク質を再生（refolding ）する方法は何も提
示されていない。この失敗はたぶん一般的に細菌発現系
と関係した問題、並びに細菌内でＮＧＦを生産させるた
めに使用した特定の技法と関係した問題にまでさかのぼ
ることができよう。
【０００９】細菌は、より小さい正しい成熟タンパク質
を生成させるために、適切なタンパク分解的フラグメン
トを行ってＮＧＦ前駆体タンパク質のような前駆体タン
パク質を正しくプロセッシングすることができない。そ
れ故に、細菌に成熟ＮＧＦを生産させるためには、より
大きい前駆体形ではなく、成熟タンパク質をコードする
ＮＧＦ ＤＮＡ配列の部分だけを発現させることが必要
である。これをエシェリヒア・コリ（Escherichia col
i）で行った場合は、比較的大量の成熟ヒトＮＧＦタン
パク質が生産された（例えば、Iwaiら 1986 Chem. Pha
rm. Bull. 34:4724; Dicouら. 1989 J Neurosci, Res.
22:13;ＥＰ出願第１２１３３８号を参照されたい）。不
運にも、細菌により発現されたタンパク質は生物学的活
性がほとんどないか、あるいは全くなかった。
【００１０】細菌発現ＮＧＦを再生するプロトコルは欧
州特許出願第３３６３２４号に記載されており、ここで
は細菌内で生産された成熟ＮＧＦに若干の生物学的活性
を回復させている。しかしながら、このプロトコルは重
大な欠点をもっている。成熟ヒトＮＧＦは、多くの真核
細胞発現系が高価であり、しばしば十分量の成熟ＮＧＦ
を生産しないので、一般に医薬用途に充分な量で得るこ
とができない。これまでに開示された細菌発現系は、生
物学的に活性で化学的に修飾されていない成熟ＮＧＦを
医薬用途に充分な量で生産していない。ヒト成熟ＮＧＦ
はアルツハイマー病の治療に有用であると思われるの
で、科学界および臨床医学界はこの物質が自由に入手で
きないことを痛切に感じている。生物学的に活性なヒト
成熟ＮＧＦが入手できないことは、アルツハイマー病治
療薬としてのＮＧＦの今後の開発における臨床的障害で
あるとして、the National Institute on Aging （国立
老化研究所）が集めた、一流の科学者達のグループによ
って指摘された（Phelpsら 1989 Science 243:11 ）。
【００１１】同様の製造上の困難がＮＧＦ／ＢＤＮＦ群
の神経栄養性タンパク質のそれぞれの構成タンパク質に
もあてはまると考えられる。なぜならば、これまでに記
載されたこの群のタンパク質はシステインアミノ酸残基
を同じ位置に配置して有しており、従って恐らくＮＧＦ
と同じ分子内ジスルフィド結合のパターンを形成すると
考えられるからである（Angeletti ら 1973 Biochemist
ry 12:100 ）。
【００１２】かかる神経栄養性タンパク質の明白な価値
並びに上記のような大量の生物学的活性タンパク質の生
産に対する目下の制限を考慮すると、次のことを提供す
ることが望ましいであろう：（１）ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群
の神経栄養性タンパク質のすべての構成タンパク質、す
なわちこれら２種類のタンパク質が互いに関係があると
された方法と類似した方法でＮＧＦおよびＢＤＮＦに構
造的に関係があるタンパク質の同定、単離および特性決
定；（２）ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質
の天然に存在するすべてのヒトタンパク質（特にヒトＢ
ＤＮＦを含む）の同定、単離および特性決定；（３）Ｎ
ＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の任意のすべ
てのタンパク質をコードする遺伝子（特にかかる群のす
べてのタンパク質をコードするヒト遺伝子）の単離およ
び特性決定；（４）これらのヒトタンパク質の成熟（プ
ロセッシングを受けた）形態を多量に生産する、E.coli
のような微生物中に組み換え発現系を確立するためのヒ
ト遺伝子の使用方法；（５）生物学的特異活性を獲得さ
せるためにＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質
のタンパク質を再生する方法；および（６）ＮＧＦ／Ｂ
ＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のいずれか１種または
これらのタンパク質の任意の組合わせからなる神経学的
疾患を治療するための医薬組成物。 〔発明の要約〕本発明は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄
養性タンパク質の生物学的に活性なメンバーの生産方
法、ヒトＢＤＮＦをコードする遺伝子の核酸配列および
ヒトＢＤＮＦの推定アミノ酸配列、並びにこの群の神経
栄養性タンパク質の以前に報告されていないメンバー
（ＮＧＦ−３を含む）をコードする遺伝子の核酸配列お
よびかかるタンパク質の推定アミノ酸配列に関する。
【００１３】効率のよい細菌発現系、特にE.coliにおけ
るＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の発現方
法を記載する。さらに、細菌により生産された生物学的
に不活性な成熟ヒト神経栄養性タンパク質に生物学的活
性を回復させる方法が記載される。より詳細には、ＮＧ
Ｆの発現方法および生物学的に活性な形をしたヒト成熟
ＮＧＦの効果的な再生が記載される。ここでＮＧＦ−３
と呼ばれる、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク
質の以前には報告されていないメンバーが同定され、Ｎ
ＧＦ−３をコードするヒト遺伝子の核酸配列が同定さ
れ、そしてＮＧＦ−３の推定アミノ酸配列が記載され
る。
【００１４】また、本発明は、いろいろな神経変性性疾
患に現れる神経細胞の変性および分化機能の低下を治療
するための医薬製剤として価値あるＮＧＦ／ＢＤＮＦ群
の神経栄養性タンパク質のすべてのメンバーの精製形の
生産をも包含する。本出願は、実質的に図１に示される
核酸配列から成るヒト脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮ
Ｆ）をコードする遺伝子、並びに１９６位および／また
は６６８位のＧをＡで置き換えたこの配列を記載し、特
許請求している。さらに、実質的に図１に示されるアミ
ノ酸配列から成る成熟ヒト脳由来神経栄養性因子（ＢＤ
ＮＦ）、並びにアミノ酸６６のバリンをメチオニンで置
き換えそして／またはアミノ酸２２３のアルギニンをリ
ジンで置き換えたこの配列も記載する。ヒト成熟ＮＧＦ
−３は図７に示されるアミノ酸配列から成り、ヒト成熟
ＮＧＦ−３をコードする遺伝子は図６に示される核酸配
列から成っていた。
【００１５】神経栄養性タンパク質を再生・復元する
（その際、タンパク質は実質的に完全な生物学的活性を
獲得する）方法は、前記神経栄養性タンパク質にいろい
ろな三次元コンホメーションおよび分子内ジスルフィド
結合パターンをとらせる（反応媒体を生成させ、ここで
実質的にすべての前記タンパク質はエネルギー的に最も
安定した形をとるであろう）；そして前記反応媒体から
前記神経栄養性タンパク質を単離することから成ってい
る。
【００１６】ヒト神経栄養性タンパク質の生物学的に活
性な成熟形を生産するための細菌細胞発現系は：前記タ
ンパク質をコードする遺伝子をベクターに挿入し；前記
遺伝子を発現させて前記タンパク質の生物学的に不活性
な形態を形成させ；そして前記の生物学的に不活性な形
態を再生・復元することを含んで成る。ヒトの神経学的
疾患を治療するための医薬組成物は、許容しうる製剤上
の担体中に生物学的に活性なヒトＮＧＦ−３、ヒトＢＤ
ＮＦおよび／またはヒトＮＧＦを含有する。
【００１７】上記の一般的記載および以下の詳細な記載
は単なる例示および説明であって、特許請求した本発明
を制限するものでないことを理解すべきである。本明細
書に組み込まれてその一部を構成する添付図面は本発明
のいろいろな実施態様を例示し、そして詳細な説明と合
わせて本発明の原理を理解する上で役立つであろう。 〔図面の簡単な説明〕図１は、ヒトＢＤＮＦの核酸およ
び推定アミノ酸配列を示す。成熟（プロセッシングを受
けた）形ＢＤＮＦの推定アミノ酸配列は太字で示してあ
る。
【００１８】図２は、ベクターｐＴ５Ｔを用いたE.coli
におけるヒト成熟（プロセッシングを受けた）ＮＧＦの
発現を示す。詳細は実施例２で説明する。図３は、真核
細胞により生産された成熟ヒトＮＧＦの変性および再生
の際の、それぞれの生物学的活性の低下および回復を示
す。図４は、細菌発現ベクターｐＴ５Ｔのいくつかの特
徴を示す。特徴は描写したにすぎず、正確な比率で描い
たものではない。ＮＧＦ挿入物はＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の
神経栄養性タンパク質の任意のメンバーを示す。
【００１９】図５は、細菌発現ベクターｐＴ３ＸＩ−２
のいくつかの特徴を示す。特徴は描写したにすぎず、正
確な比率で描いたものではない。ＮＧＦ挿入物はＮＧＦ
／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の任意のメンバー
を示す。図６は、ＮＧＦ−３の核酸配列とＮＧＦおよび
ＢＤＮＦの配列との比較である。点線で示したギャップ
はアミノ酸配列を整合させるために用いたギャップの位
置に相当する（図７を参照）。ＰＣＲにより得られたＮ
ＧＦ−３の部分核酸配列には下線が引いてある。
【００２０】図７は、ＮＧＦ−３のアミノ酸配列とＮＧ
ＦおよびＢＤＮＦの配列との比較である。成熟タンパク
質の推定配列は太字で示してある。ＢＤＮＦまたはＮＧ
Ｆの成熟配列において下線が引いてある各アミノ酸はＮ
ＧＦ−３の対応アミノ酸と同一である。ＮＧＦ−３の成
熟配列において下線が引いてある各アミノ酸はＮＧＦと
ＢＤＮＦの両方の対応アミノ酸と同一である。点線で示
したギャップは整合を高めるために配列中に置かれた。
ＢＤＮＦ、ＮＧＦおよびＮＧＦ−３に存在する６個のシ
ステインは３種類すべてのタンパク質で同じ位置にあ
り、かっこでくくってある。
【００２１】図８は、ヒトＢＤＮＦ挿入物を含むかまた
は含まないプラスミドｐＳＧ５でトランスフェクトされ
たＣＯＳ−７細胞の抽出物の、Ｅ１０ニワトリ背根神経
節ニューロンを使ったバイオアッセイを示す。図９は、
Ｅ１１ニワトリ胚交感神経節ニューロンに対するバイオ
アッセイを用いた、昆虫細胞により生産されたヒト組み
換えＮＧＦの用量−応答曲線を示す。
【００２２】図１０は、Ｅ１１ニワトリ胚交感神経節ニ
ューロンに対するバイオアッセイを用いた、E.coliによ
り生産されたヒト組み換えＮＧＦの最終再生混合物の連
続希釈物の生物学的活性を示す。図１１は、（Ａ）１０
０ｎｇの天然の、昆虫細胞により生産されたＮＧＦを加
えた図１０でアッセイした最終再生混合物５０μｌ；お
よび（Ｂ）天然の、昆虫細胞により生産されたＮＧＦを
加えなかった最終再生混合物５０μｌ；の逆相高性能液
体クロマトグラフィーによる分析を示す。天然の、昆虫
細胞により生産されたＮＧＦが普通にこのカラムを流れ
る位置は符号ＮＧＦと矢印で示してある。
【００２３】図１２は、精製前の最終再生混合物を逆相
ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロマトグラフィーにかけ
た場合のタンパク質の溶離プロフィール（２１４ｎｍで
の光学濃度）を示す。適切に再生されたＮＧＦは約３７
％のアセトニトリルで溶離する最大タンパク質ピークで
ある。図１３は、透析および濃縮後であるがＳ−セファ
ロース前の最終再生混合物を逆相ＨＰＬＣによりＣ４カ
ラムでクロマトグラフィーにかけた場合のタンパク質の
溶離プロフィール（２１４ｎｍでの光学濃度）を示す。
適切に再生されたＮＧＦは約３７％のアセトニトリルで
溶離する最大タンパク質ピークである。
【００２４】図１４は、Ｓ−セファロースで精製後の最
終再生混合物を逆相ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロマ
トグラフィーにかけた場合のタンパク質の溶離プロフィ
ール（２１４ｎｍでの光学濃度）を示す。適切に再生さ
れたＮＧＦは約３７％のアセトニトリルで溶離する最大
タンパク質ピークである。主ピークの直後に溶離する小
さいタンパク質ピークは、逆相ＨＰＬＣによるクロマト
グラフィー中に形成された適正に再生されたＮＧＦの単
量体である。 〔好適な実施態様の説明〕本発明の原理を理解する上
で、以下の実施例と合わせて、役に立つ本発明の目下の
好適な実施態様を詳細に説明する。
【００２５】本発明は、ある“群（family）”の神経栄
養性タンパク質の同定および生産を多面的に記載する。
ＮＧＦおよびＢＤＮＦは、おそらく生物におけるそれら
の生理学的役割を異にする（すなわち、各メンバーは異
なる組の応答性ニューロンに影響を及ぼす）構造的に関
連した神経栄養性タンパク質の一群を規定すると思われ
る。神経系に対する種々の形態の損傷によりその機能を
損なわれた異なる神経細胞型を治療するのに利用できる
１そろいの神経栄養性タンパク質を得るためには、この
ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の任意のそしてすべての付加的なメ
ンバーの遺伝子を単離することが大いに望まれるであろ
う。
【００２６】ヒトを治療するにはヒトタンパク質を使用
することが望ましい。この原理によれば、ヒトタンパク
質を製造するにはＢＤＮＦのヒト遺伝子を得ることが望
ましいであろう。また、この原理、およびいろいろな神
経学的症状を治療するためには異なるニューロン特異性
を備えた１そろいの神経栄養性タンパク質を有すること
が望ましいという上記原理によれば、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ
群の神経栄養性タンパク質の任意のそしてすべての付加
的なメンバーのヒト遺伝子を得ることが望ましいであろ
う。
【００２７】生物学的に活性な細菌発現ＮＧＦが得られ
ないということはこの分野における大きな障害である。
この生物学的活性が欠如する理由は、成熟ＮＧＦタンパ
ク質が自然に正しい三次元構造をとりかつ正しい分子内
ジスルフィド結合を形成する（両方とも生物学的活性に
必要不可欠である）ことができないということらしい。
従って、完全な生物学的活性に必要とされる三次元構造
と分子内ジスルフィド結合パターンを細菌発現成熟ＮＧ
Ｆに回復させることができる再生プロトコルを開発する
ことが必要であろう。
【００２８】欧州特許出願第３３６３２４号に記載され
たＮＧＦの再生プロトコルは十分にこの問題を解決して
いない。このプロトコルは高ｐＨにさらし（ｐＨ１３が
推薦される）−−細菌により生産されたＮＧＦの正しく
ないジスルフィド結合を破壊すると思われる−−その後
ｐＨを低下させるものである−−正しい分子内ジスルフ
ィド結合形成の機会を与えると思われる。このプロトコ
ルで採用している高ｐＨへの暴露は、グルタミンおよび
アスパラギン（成熟ヒトＮＧＦ中に７個存在する）のア
ミン側鎖の排除並びにアスパラギン−グリシン、アスパ
ラギン−セリンおよびアスパラギン−トレオニン隣接対
（成熟ヒトＮＧＦ中に２個存在する）の広範な化学的変
化を含む、タンパク質の広範な修飾を引き起こすことが
知られている。これらの化学的修飾のほかに、この再生
法はＮＧＦの生物学的活性の約１／１０か回復させない
ことが明らかになった。従って、欧州特許出願第３３６
３２４号に記載されたプロトコルは、完全に生物学的に
活性で、化学的に修飾されていない成熟ヒトＮＧＦを得
るには不十分であることが明らかである。苛酷な条件を
使用しないタンパク質の再生・復元プロトコルは数多く
存在するが、かかる方法はどれもＮＧＦにうまく当ては
まらなかった。再生法の一般的記載については、H. Koh
no, Methods Enzymol., vol. 185, p. (1990 ）を
参照されたい。
【００２９】これらの考察に基づくと、完全に生物学的
に活性で、化学的に修飾されていない成熟ヒトＮＧＦを
細菌中に大量に生産できる製造システムは、医薬用途に
適した生物学的に活性で修飾されていない形におけるＮ
ＧＦ／ＢＤＮＦ群の任意のタンパク質を同様に大量に生
産させるのに有用であろう。 １．ヒトＢＤＮＦの単離 本発明の一実施態様では、ＢＤＮＦの前駆体および成熟
体をコードするヒト遺伝子を得るための方法が提供され
る。本発明はヒトＢＤＮＦの前駆体および成熟体、並び
にかかるタンパク質をコードする遺伝子を包含する。本
明細書全体を通して、神経栄養性タンパク質の成熟体は
タンパク分解的フラグメント後に自然界に存在するよう
な生物学的に活性な形のタンパク質を意味する。神経栄
養性タンパク質の前駆体はタンパク分解的フラグメント
前のヒト遺伝子によりコードされるタンパク質を意味す
る。以下の実施例１で説明する、この実施態様の好適な
形式では、ブタＢＤＮＦをコードする核酸配列の種々の
領域に基づいて、鎖長約１５−３０塩基の合成オリゴヌ
クレオチドＢＤＮＦ−１、ＢＤＮＦ−２、ＢＤＮＦ−２
Ａ、ＢＤＮＦ−２Ｂ、ＢＤＮＦ−３、ＢＤＮＦ−４およ
びＢＤＮＦ−５が作製された。これらのブタＢＤＮＦオ
リゴヌクレオチドは、ヒトＢＤＮＦ遺伝子の介在セグメ
ントを増幅させるために、鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ
を用いるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣ
Ｒ）においてプライマーとしていろいろな組合わせで使
用される。増幅されたフラグメントをサブクローニング
し、サブクローンはＰＣＲで用いた２つのプライマー間
に存在する配列を表す別のオリゴヌクレオチドプローブ
とハイブリダイズするものについてスクリーニングされ
る。
【００３０】このスクリーニングで単離した陽性サブク
ローンは、ＢＤＮＦ遺伝子の部分としてのそれらとの同
一性を確認するために配列決定できる。１以上のこれら
の増幅フラグメントを使って、ＢＤＮＦのヒト遺伝子を
得るためにヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングできる。ヒトゲノムクローンのサブクローン化制限
フラグメントは、ヒトＢＤＮＦの前駆体および成熟体を
コードする核酸配列および推定アミノ酸配列を得るため
に配列決定される。これらの方法により得られた、本発
明の範囲に含まれるヒトＢＤＮＦの核酸配列および推定
アミノ酸配列を図１に示す。
【００３１】２．ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タン
パク質の以前に報告されていないメンバーの同定 本発明の一実施態様では、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄
養性タンパク質の以前に報告されていない新メンバーの
前駆体および成熟体をコードするヒト遺伝子を得るため
の方法が提供される。所望のヒトＤＮＡ配列は、ヒトＮ
ＧＦまたはＢＤＮＦと同一でないが、この群のありうる
限定性特徴に関してＮＧＦまたはＢＤＮＦと明らかに関
係があるタンパク質をコードする未報告の任意のすべて
の配列である。かかる特徴には１以上の次のこと、すな
わち、適当なバイオアッセイでの神経栄養性活性；アミ
ノ酸の同一性および保存的置換の両方を含むアミノ酸配
列における有意な相同性；アミノ酸配列中のシステイン
残基の保存された位置；タンパク質分泌のための疎水性
シグナル配列；成熟体へのタンパク分解的プロセッシン
グのためのシグナル配列；および／またはプロセッシン
グを受けたタンパク質の塩基性等電点；が包含される。
【００３２】Ａ．この実施態様の好適な一形式では、鎖
長約１５−４０塩基の数種類の合成 オリゴヌクレオチドが動物およびヒトＮＧＦおよびＢＤ
ＮＦをコードする核酸配列の保存および可変領域に基づ
いて作製される。これらのＮＧＦ／ＢＤＮＦオリゴヌク
レオチドは、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群のメンバーのヒト遺伝
子の介在セグメントを増幅させるために、鋳型としてヒ
トゲノムＤＮＡまたは神経系の種々の別々の領域から作
製したヒトｃＤＮＡライブラリーを用いるＰＣＲにおい
てプライマーとしていろいろな組合わせで使用できる。
【００３３】神経系の別々の領域からのｃＤＮＡを使う
ことは、（１）ＮＧＦおよびＢＤＮＦに関するメッセー
ジを多量に含まない領域がＮＧＦおよびＢＤＮＦそれら
自体からＰＣＲにより増幅されたフラグメントのバック
グラウンドを減ずることができる；および（２）所望の
ニューロン集団に影響を及ぼす神経栄養性因子が神経系
の予測しうる領域に存在すると思われる；ので有利であ
る。
【００３４】増幅されたフラグメントをサブクローニン
グし、そして個々のサブクローンは（ａ）オリゴヌクレ
オチドプライマー間に存在するＤＮＡ配列を表す縮重オ
リゴヌクレオチドとのポジティブハイブリダイゼーショ
ンによるか、あるいは（ｂ）ＮＧＦまたはＢＤＮＦから
増幅されるとほぼ予想される大きさの挿入物を含有する
サブクローンを検出するための制限マッピングにより選
択できる。
【００３５】かかる選択されたサブクローンは、それら
がＮＧＦ／ＢＤＮＦ群のＮＧＦ、ＢＤＮＦまたは新メン
バーの遺伝子部分であるかどうか調べるために配列決定
できる。サブクローン化され増幅されたフラグメントが
ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の新メンバーであると思われる場合
は、このフラグメントを放射性標識して、推定上の新し
い神経栄養性タンパク質のヒト遺伝子を得るためにヒト
ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用でき
る。このヒト遺伝子は新しい神経栄養性タンパク質の前
駆体および成熟体をコードする核酸配列および推定アミ
ノ酸配列を得るために配列決定できる。
【００３６】Ｂ．この実施態様の２番目の好適な形式で
は、上記のようにＰＣＲで増幅されたフラグメントのサ
ブクローンを、ＮＧＦまたはＢＤＮＦ遺伝子に特有の非
縮重断片を数種類のそれぞれを用いてスクリーニングで
きる。このスクリーニングの目的は、すでに特性決定さ
れたＮＧＦおよびＢＤＮＦメンバーから増幅された断片
を排除することにより、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の新タンパ
ク質の遺伝子から増幅された断片の単離を容易にするこ
とである。この方法でＮＧＦおよびＢＤＮＦと異なると
同定された増幅断片は配列決定してそれらの同一性を確
認でき、そして適当な場合には、上記のようにヒト遺伝
子を得るのに使用できる。
【００３７】Ｃ．この実施態様の３番目の好適な形式で
は、ヒトゲノムライブラリーおよび神経系の種々の別々
の領域から作製されたヒトｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングして、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群のありうる新しい
メンバーを含有するクローンをつきとめることができ
る。かかるライブラリーはＮＧＦまたはＢＤＮＦをコー
ドするヒトＤＮＡ配列の一部を使って、あるいは動物お
よびヒトＮＧＦまたはＢＤＮＦをコードする核酸配列の
種々の保存および可変領域に基づいて作製された、鎖長
約１５−４０塩基の合成オリゴヌクレオチドの１つを使
ってスクリーニングできる。これらのライブラリーのス
クリーニングにおいてハイブリダイゼーションの緊縮性
（stringency）を低下させると、プローブはＮＧＦおよ
びＢＤＮＦ配列を含有するクローンとハイブリダイズす
るばかりでなく、類似の（たぶん関係がある）配列とも
ハイブリダイズできる。ＮＧＦおよびＢＤＮＦのメッセ
ージを多量に含まない神経系の領域からのｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることは、ＮＧＦおよびＢ
ＤＮＦクローンのバックグラウンドを減らすのに得策で
あろう。これらのスクリーニングで同定されたクローン
は、それらがＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の新しいメンバーの遺
伝子であるかどうか判定するために配列決定できるし、
あるいはすでに知られたＮＧＦおよびＢＤＮＦの遺伝子
である可能性があるものを排除するために、それらは先
行する節で述べたようにさらにスクリーニングすること
ができる。
【００３８】この実施態様の３つの好適な形式はそれぞ
れＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の新しい
ヒトタンパク質の前駆体および成熟体をコードする核酸
配列および推定アミノ酸配列を得るのに使用できる。本
発明はＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質の以
前に報告されたことのない任意のすべてのタンパク質を
包含するものである。
【００３９】ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク
質の新しいメンバーが上記方法を使って同定されてい
る。以下の実施例４で説明するように、また図６に示す
ように、以前に報告されたことのないタンパク質ＮＧＦ
−３をコードする完全な核酸配列が同定された。図６に
示した核酸配列に基づいて、成熟および前駆体ＮＧＦ−
３の完全な推定アミノ酸配列が得られた。配列決定され
たＮＧＦ−３遺伝子を参考にして推定された、ＮＧＦ−
３のアミノ酸配列を図７に示す。
【００４０】さらに、本発明はここに記載した神経栄養
性タンパク質と生物学的に均等な任意の起源の神経栄養
性タンパク質を包含する。好適な実施態様においては、
本発明は成熟ヒト神経栄養性タンパク質を包含する。本
明細書全体を通して、神経栄養性タンパク質への言及は
ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質のメンバー
として同定され、ここに記載されたタンパク質のことを
指すと解釈されるべきである。
【００４１】本明細書および請求の範囲で用いる“生物
学的に均等”とは、神経細胞またはグリア細胞の生存を
促進しかつそれらの表現型分化を維持する能力をもつ
（しかし、必ずしもここに記載した天然の神経栄養性タ
ンパク質と同程度である必要はない）本発明物質を意味
する。本明細書および請求の範囲で用いる“実質的に相
同”とは、以前に報告された任意の神経栄養性タンパク
質が示す相同度を越えた天然神経栄養性タンパク質との
相同度を意味する。好ましくは、相同度は７０％以上、
より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％、９
５％または９９％以上である。特に好適なグループの神
経栄養性タンパク質は天然タンパク質と９５％以上相同
である。ここに記載した相同の百分率は、Dayhoff, At
las of Protein Sequence and Structure Vol. 5, p.
124 (1972), National BiochemicalResearch Foundatio
n, Washington, D.C.（参考文献としてここに詳細にと
り込まれる）に記載されるように、その整合を助けるた
めに、１００アミノ酸の鎖長に４つのギャップを導入し
た場合に、比較される配列中の同一のアミノ酸残基と整
合する２つの配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の
百分率として計算される。また、ここに記載したタンパ
ク質に対する抗体との交差反応によって単離できる神経
栄養性タンパク質、あるいは記載したタンパク質の遺伝
子またはセグメントとのハイブリダイゼーションにより
遺伝子を単離しうる神経栄養性タンパク質も実質的に相
同なものとして包含される。
【００４２】３．遺伝子発現 本発明の一実施態様においては、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の
神経栄養性タンパク質のメンバーのヒト遺伝子（ＮＧ
Ｆ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦ−３のヒト遺伝子を含む）
は、各遺伝子によりコードされる成熟ヒト神経栄養性タ
ンパク質を製造するための組み換え発現系を確立するの
に使用できる。この実施態様の好適な形式では、発現が
微生物、特にE.coli内で行われる。
【００４３】それぞれの神経栄養性タンパク質の遺伝子
はE.coli内での効率のよい発現を促進するために修飾で
きる。かかる修飾（以下で詳細に説明する）には、制限
するものではないが、次のもの：（ｉ）遺伝子中に存在
しうる付加的なコード配列および非コード配列を除去す
ることによる、推定された成熟（プロセッシングを受け
た）形態のタンパク質だけをコードするＤＮＡ配列の作
製；（ii）E.coliにより優先的に利用されるコドンへの
ヒトコドンの変更；（iii ）E.coliにおける効率のよい
翻訳を促進するための翻訳カプラーの付加；（iv）その
後の連結反応およびクローニングに便利な新しい制限部
位の挿入；および（ｖ）E.coliにおけるＤＮＡの効率の
よい発現を促進するよう設計された数種の発現ベクター
の１種またはそれ以上へのＤＮＡの挿入；が包含され
る。最終的な発現構築物を適当なE.coli株中に形質転換
し、そして成熟神経栄養性タンパク質を生産する形質転
換体がスケールアップおよび製造のために選択できる。
本発明の好適な実施態様に従った、E.coliにおけるＮＧ
Ｆの発現を以下の実施例２に記載する。
【００４４】Ａ．総論 かかる神経栄養性タンパク質を直接生産するのに、天然
または合成ＤＮＡ配列を使用できる。本発明の一実施態
様では、別の形態の神経栄養性因子（活性部位がここに
記載した神経栄養性タンパク質と生物学的に等しい様式
で機能する）を生産できる。一般的発現方法は： １．神経栄養性活性を有するタンパク質またはその前駆
体の生産を宿主細胞に指示できるＤＮＡ配列の作製； ２．宿主細胞へ移してその中で複製させることができる
ベクター（このベクターはＤＮＡ配列またはその前駆体
を発現させるのに必要なオペレーション要素を含有）へ
の前記ＤＮＡ配列のクローニング； ３．神経栄養性タンパク質またはその前駆体をコードす
るＤＮＡを発現しうる宿主細胞への、合成ＤＮＡ配列お
よびオペレーション要素を含有するベクターの移入； ４．ベクターを増幅させかつタンパク質またはその前駆
体を発現させる条件下での宿主細胞の培養； ５．前記タンパク質またはその前駆体の収穫；そして ６．前記タンパク質に活性三次構造をとらせ、それによ
りこのものが生物学的活性を保有するか、または生物学
的活性を有するタンパク質へプロセッシングできる；こ
とを含んで成る。
【００４５】Ｂ．ＤＮＡ配列 この方法での使用を意図されるＤＮＡ配列は実施例１、
２および４で部分的に論じられる。図６はヒトＮＧＦ、
ＢＤＮＦ、およびＮＧＦ−３をコードする完全な核酸配
列を示す。これらの配列には合成および天然ＤＮＡ配
列、およびそれらの組合わせも包含されることが意図さ
れる。天然配列にはさらにｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ
セグメントも包含される。
【００４６】ｃＤＮＡまたはゲノムポリヌクレオチド配
列によりコードされるものと同一のタンパク質をコード
するポリヌクレオチド配列の合成的作製手段は、特にこ
こに含まれる教示内容に照らして、当業者に一般に知ら
れている。ポリヌクレオチドの合成に関する現在の技術
の例として、Matteucci,M.D., および Caruthers, M.
H., J. Am. Chem. Soc. 103:3185(1981) およびBeaucag
e, S.L.およびCaruthers, M.H., Tetrahedron Lett.22:
1859 (1981)、並びにＡＢＩオリゴヌクレオチド合成機
についている説明書を挙げることができる（これらは参
考文献としてここに詳細にとり込まれる）。
【００４７】これらの合成配列は以下で詳述する天然配
列と同一であっても、異なるヌクレオチドを含んでいて
もよい。一実施態様においては、その合成配列が本発明
の天然ＤＮＡ配列に見られるものと異なるヌクレオチド
を含有する場合は、これらの異なる配列はここに記載し
た神経栄養性タンパク質と同じ一次構造を有するポリペ
プチドを依然としてコードすることが意図される。別の
実施態様では、異なるヌクレオチドを含有する合成配列
はここに記載した神経栄養性タンパク質と同じ生物学的
活性を有するポリペプチドをコードするであろう。
【００４８】さらに、そのＤＮＡ配列は天然配列の断
片、すなわち自然界に存在しかつ本発明者らによって初
めて単離・精製されたポリヌクレオチドの断片であって
もよい。一実施態様においては、そのＤＮＡ配列はｃＤ
ＮＡライブラリーから分離された制限断片である。別の
実施態様においては、そのＤＮＡ配列はヒトゲノムライ
ブラリーから分離される。この実施態様で有用なかかる
ライブラリーの例は Wymanら (1985) Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 82, 2880-2884 に記載されている。
【００４９】所望の神経栄養性タンパク質をコードする
ＤＮＡ配列はいくつかの異なる方法で得ることができ
る。ヒトｃＤＮＡライブラリーおよびヒトゲノムライブ
ラリーを神経栄養性タンパク質遺伝子またはその遺伝子
産物と結合しうる少なくとも１種のプローブを使って検
索できる。プローブと結合するその能力によって前記タ
ンパク質をコードする遺伝子を同定した後、その遺伝子
を単離して、宿主細胞内でその遺伝子を維持・発現させ
るのに必要なオペレーション要素に連結することができ
る。
【００５０】遺伝子配列を同定・単離する別の方法はポ
リメラーゼ・チェイン・リアクションの使用による。実
施例１で説明するように、ヒトＢＤＮＦをコードする天
然ＤＮＡ配列は、ブタＢＤＮＦの核酸配列から設計され
た数種の合成オリゴヌクレオチドを作製し、そしてヒト
ＢＤＮＦ配列の増幅断片を同定するためのポリメラーゼ
・チェイン・リアクションにおいてこれらのプライマー
対を利用することにより同定・単離された。ＰＣＲによ
り得られた増幅断片は次にヒトＢＤＮＦの全核酸配列を
クローニングするのに使用された。
【００５１】実施例４で説明するように、ヒトＮＧＦ−
３をコードする天然ＤＮＡ配列は、ヒトおよび動物ＮＧ
ＦおよびＢＤＮＦの核酸配列から設計された合成オリゴ
ヌクレオチドを作製し、そして以前に報告されたことの
ないヒトＮＧＦ−３配列の増幅断片を同定するためのポ
リメラーゼ・チェイン・リアクションにおいてこれらの
プライマーを利用することにより同定・単離された。Ｐ
ＣＲにより得られた増幅断片はヒトＮＧＦ−３の全核酸
配列をクローニングするのに使用された。
【００５２】 ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから
これらの方法により単離された、ここに記載のヒトＢＤ
ＮＦタンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配
列はプラスミドｐＳＹＮ２３に挿入された。このプラス
ミドは、ブダペスト条約に従って、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビ
ル）に１９９１年３月２０日受託番号４０９９２号とし
て寄託されている。このＤＮＡ配列は、２２３部位のア
ミノ酸に対応するコドンがＡＧＡでなくＡＡＡとなって
いる点を除き図１に記述されている。
【００５３】 ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから
これらの方法により単離された、ここに記載のＮＧＦ−
３タンパク質の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列
はプラスミドｐＳＹＮ３０に挿入された。このプラスミ
ドは、ブダペスト条約に従って、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（メリーランド州ロックビ
ル）に１９９１年３月２０日受託番号４０９９１号とし
て寄託されている。このＤＮＡ配列は、以下の実施例４
で詳述する。
【００５４】Ｃ．ベクター （ｉ）微生物、特にE.coli 本発明での使用が意図されるベクターには上記のＤＮＡ
配列を好適な又は必要なオペレーション要素と共に挿入
しうる任意のベクターが包含され、このベクターは次に
宿主細胞に移入されて、かかる細胞中で複製できる。特
に、これらのベクターはすべて次の特徴の一部または全
部をもつことが好適である：（１）最少の宿主生物配列
を有する；（２）所望の宿主内に安定した状態で維持・
増殖される；（３）所望の宿主内に高コピー数で存在し
うる；（４）対象の遺伝子の転写を促進するように配置
された調節可能なプロモーターを有する；（５）ＤＮＡ
配列が挿入される部位から離れたプラスミドの部位に存
在する選択可能な特徴をコードするマーカーＤＮＡ配列
を少なくとも１つ有する；および（６）転写を終結させ
ることができるＤＮＡ配列を有する。
【００５５】本発明のクローニングベクターは種々のオ
ペレーション要素を含有する。これらの“オペレーショ
ン要素”には次のものが含まれる：調節遺伝子、プロモ
ーター、転写ターミネーター、非翻訳配列、リボソーム
結合部位、リーダー配列および翻訳カプラー、翻訳ター
ミネーター、選択マーカー。実際に、これらのベクター
の単離、作製および相互交換が容易にできる方法でそれ
らを構築することが可能である。
【００５６】ここで論じるオペレーション要素は、従来
の文献とここに含まれる教示内容に照らして、当業者に
より日常的に選択される。これらのオペレーション要素
の一般的な例はB. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New Y
ork (1983)（参考文献としてここに詳細にとり込まれ
る）に記載されている。適当なオペレーション要素の種
々の例は先に論じたベクターに存在し、上記ベクターの
基本的特徴を論じる刊行物を通して明らかになろう。
【００５７】上記ベクターの必要かつ所望の全構成成分
の合成および単離後に、当業者に一般的に知られた方法
によりベクターが作製される。かかるベクターの作製は
当業者によって行われる職務の範囲内であると考えら
れ、それだけで過度の実験なしに実施することが可能で
ある。例えば、Maniatisら Molecular Cloning, Cold S
pring Harbor Laboratories (1984)（参考文献としてこ
こに詳細にとり込まれる）に記載されるように、同様の
ＤＮＡ配列が適当なクローニングベクターに連結されて
いる。
【００５８】以下の実施例２には、成熟ヒトＮＧＦをコ
ードする核酸配列を含有する２種類のベクターの作製が
記載される。適当な核酸配列が挿入されたベクターはｐ
Ｔ５ＴおよびｐＴ３ＸＩ−２と呼ばれるE.coli発現ベク
ターである。ベクターｐＴ５Ｔ：ＮＧＦの細部を図４
に、そしてベクターｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦの細部を図
５に示す。
【００５９】本発明のクローニングベクターの構築にお
いては、各ベクターに多コピー数のＤＮＡ配列とそれに
付随するオペレーション要素を挿入できる点にさらに留
意されたい。かかる実施態様では、宿主生物が所望の神
経栄養性タンパク質をベクター当たり比較的多量に生産
するであろう。ベクターに挿入できるＤＮＡ配列のコピ
ー数は、その大きさ故に、適当な宿主細胞に移入されそ
こで複製および転写される作製ベクターの能力によって
のみ制限される。
【００６０】（ii）その他の微生物 E.coli以外の微生物において使用するのに適したベクタ
ーも本発明の意図するものである。かかるベクターを表
１に示す。さらに、いくつかの好適なベクターを以下で
論じる。ここに記載したこれら微生物ベクターは、従来
の文献とここに含まれる教示内容に照らして、当業者に
より日常的に使用される。かかるベクターの作製は当業
者によって行われる職務の範囲内であると考えられ、そ
れだけで過度の実験なしに実施することが可能である。
【００６１】
【表１】
【００６２】１．Backman, K., Ptashne, M.および Gil
bert, W. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 73, 4174-4178
(1976). ２．de Boer, H.A., Comstock, L.J.,および Vasser,
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985). （ａ）シュードモナスベクター 広範囲のグラム陰性細菌内で自律複製する数種のベクタ
ープラスミドが、シュードモナス（Pseudomonas ）属宿
主におけるクローニングベヒクルとして使用するのに好
適である。これらのうちのいくつかは Tait, R.C., Clo
se, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M., Rodriguez,
R.L., および Kado, C.I., Biotechnology, May, 1983,
p. 269-275; Panopoulos, N.J.,Genetic Engineering
in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New Yo
rk, New York, p.163-185 (1981); およびSakagucki,
k., Current Topics in Microbiology andImmunology 9
6:31-45 (1982)（それぞれ参考文献としてここに詳細に
とり込まれる）に記載されている。
【００６３】特に好適な構築は、Bagdasarian, M., Bag
dasarian, M.M., Coleman, S.,および Timmis, K.N.,Pl
asmids of Medical, Environmental and Commercial Im
portance, Timmis, K.N.および Puhler, A. 編, Elsevi
er/North Holland Biomedical Press (1979 ）（参考文
献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるプラ
スミドＲＳＦ１０１０およびその誘導体を用いるであろ
う。このＲＳＦ１０１０の利点は、それがE.coliとシュ
ードモナス種の両方に容易に形質転換されかつ安定した
状態で維持される、比較的小型の、高コピー数プラスミ
ドであるということである。この系では、エシェリヒア
のところで述べたようなＴａｃ発現系を使用することが
好適であろう。何故ならば、E.coli ｔｒｐプロモータ
ーは、Sakagucki, k., Current Topics in Microbiolog
y and Immunology 96:31-45 (1982)およびGray, G.L.,
McKeown, K.A., Jones A.J.S., Seeburg, P.H., and He
yneker, H.L., Biotechnology, Feb. 1984, p.161-165
（両方とも参考文献としてここに詳細にとり込まれる）
に記載されるように、シュードモナスＲＮＡポリメラー
ゼにより容易に認識されると思われるからである。転写
活性はプロモーターを例えばE.coliまたはシュードモナ
ス・アエルギノザ（P. aeruginosa ）ｔｒｐプロモータ
ーと交換することにより最大限に高めることができる。
さらに、E.coliのｌａｃＩ遺伝子も調節を行うためにこ
のプラスミドに包含されよう。
【００６４】翻訳は神経栄養性タンパク質の細胞内発現
をもたらすように選ばれた種類の任意の高度発現タンパ
ク質の開始部位だけでなく、任意のシュードモナスタン
パク質の翻訳開始にも連結することができる。宿主シュ
ードモナス種の制限マイナス株を利用できない場合に
は、E.coliから単離したプラスミド構築物による形質転
換効率が低い。従って、Bagdasarian, M.,らPlasmids o
f Medical, Environmental and Commercial Importanc
e, p.411-422, Timmis および Puhler 編, Elsevier/No
rth Holland Biomedical Press (1979）（参考文献と
してここに詳細にとり込まれる）に記載されるように、
シュードモナス・クローニングベクターは所望の宿主の
形質転換に先立って別の種のｒ−ｍ＋株を通過させるこ
とが望ましい。
【００６５】（ｂ）バチルスベクター さらに、バチルス属宿主における好適な発現系はクロー
ニングベヒクルとしてのプラスミドｐＵＢ１１０の使用
を包含する。他の宿主ベクター系と同様に、バチルスで
は本発明の神経栄養性タンパク質を細胞内タンパク質ま
たは分泌タンパク質として発現させることが可能であ
る。この実施態様は両方の発現系を包含する。バチルス
とE.coliの両方において複製するシャトルベクターは、
Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S.,およびShivak
umar, A.G., Genetic Engineering, Vol. 2, Setlowお
よびHollander 編, Plenum Press, New York, New Yor
k, p.115-131 (1980) （参考文献としてここに詳細にと
り込まれる）に記載されるように、種々の遺伝子の構築
および試験に利用できる。B.ズブチリス（B. subtilis
）からの神経栄養性タンパク質の発現および分泌に関
しては、α−アミラーゼのシグナル配列が好ましくはこ
のタンパク質のコード領域に連結される。細胞内タンパ
ク質の合成に関しては、移動可能なＤＮＡ配列がα−ア
ミラーゼリーダー配列のリボソーム結合部位に翻訳共役
されよう。
【００６６】これらの構築物の転写は好ましくはα−ア
ミラーゼプロモーターまたはその誘導体により指示され
る。この誘導体は天然α−アミラーゼプロモーターのＲ
ＮＡポリメラーゼ認識配列を含有するが、またｌａｃオ
ペレーター領域も組み込む。ペニシリナーゼ遺伝子プロ
モーターとｌａｃオペレーターから構築された同様のハ
イブリッドプロモーターは、Yansura, D.G. およびHenn
er, Genetics and Biotechnology of Bacilii, Ganesa
n, A.T.およびHoch, J.A., 編., Academic Press, p. 2
49-263 (1984)（参考文献としてここに詳細にとり込ま
れる）に記載されるように、バチルス宿主において調節
可能な様式で機能することが示されている。E.coliのｌ
ａｃＩ遺伝子も調節を行うためにこのプラスミドに含ま
れよう。
【００６７】（ｃ）クロストリジウムベクター クロストリジウム（Clostridium ）による発現に好適な
構築物の一つは、Squires, C.H. ら, J. Bacteriol. 15
9:465-471 (1984)（参考文献としてここに詳細にとり込
まれる）に記載されるプラスミドｐＪＵ１２中で行わ
れ、この構築物はJ. Bacteriol.159:460-464 (1984)
（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載さ
れる Heefner, D.L.らの方法によりクロストリジウム・
パーフリンジェンス（C. perfringens）に形質転換され
る。転写はテトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター
により指示される。翻訳は他の宿主で使用するのに適し
たベクターについて先に概説した方法と厳密に類似した
方法でこの同じｔｅｔr 遺伝子のシャイン・ダルガーノ
配列に連結される。
【００６８】（ｄ）酵母ベクター 酵母に導入された外来ＤＮＡの維持は、Botstein, D.お
よびDavis, R.W.,TheMolecular Biology of the Yeast
Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Stra
thern, Jones およびBroach, 編, p. 607-636 (1982)
（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載さ
れるいくつかの方法で行うことができる。サッカロミセ
ス属の宿主生物で使用するのに適した一発現系は２ミク
ロンプラスミド上に神経栄養性タンパク質遺伝子を保有
する。この２ミクロン環状プラスミドの利点にはｃｉ
ｒ’株に導入した場合の比較的高いコピー数および安定
性が含有される。これらのベクターは好ましくはE. col
i での複製および選択を可能にするために、ｐＢＲ３２
２由来の複製起点および少なくとも１つの抗生物質耐性
マーカーを組み込んでいる。さらに、このプラスミドは
好ましくは酵母のＬＥＵ２欠損変異株において同じ目的
をとげるために、２ミクロン配列および酵母ＬＥＵ２遺
伝子を有しよう。
【００６９】組み換え神経栄養性タンパク質を最終的に
酵母に発現させようとする場合は、初めにクローニング
ベクターをE. coli に移し、そこでベクターを複製さ
せ、そして増巾後にベクターを回収して精製することが
好適である。その後、ベクターはタンパク質の最終的発
現のために酵母に移入されよう。 (iii) 哺乳動物細胞 神経栄養性タンパク質のｃＤＮＡは哺乳動物細胞による
タンパク質発現用の遺伝子として役立てられよう。それ
は Kozak, Nucleic Acids Research 15:8125-8132 (198
7)（参考文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載
されるようなリボソーム結合に効果的な配列をもつべき
であり、さらにプロセッシングされた形における成熟タ
ンパク質を細胞外へ導くリーダー配列（セクション３
（ａ）（vi) 参照）のコード能力をもつべきである。完
全なｃＤＮＡ配列を担持するＤＮＡ制限断片は、Guaren
te, L., Cell 52:303-305 (1988)およびKadonaga, J.T.
ら Cell 51:1079-1090 (1987) （両方とも参考文献とし
てここに詳細にとり込まれる）に記載されるような、転
写プロモーターおよび転写エンハンサーを有する発現ベ
クターに挿入できる。タンパク質の構成的発現が細胞の
増殖に有害である場合、プロモーターはプラスミドｐＭ
ＳＧ（Pharmacia カタログ番号２７４５０６０１）にお
けると同様に調節可能であることができる。ベクター
は、そのベクターから転写されたｍＲＮＡが適正にプロ
セッシングされるように、Ausubel, F.M.ら, Current P
rotocols in Molecular Biology, Wiley (1987)（参考
文献としてここに詳細にとり込まれる）に記載されるよ
うな、完全なポリアデニル化シグナルを有するべきであ
る。最後に、ベクターはE. coli での複製および選択が
できるように、ｐＢＲ３２２由来の複製起点および少な
くとも１つの抗生物質耐性マーカーを有しよう。
【００７０】神経栄養性タンパク質を生産する安定した
細胞株を選別するために、発現ベクターは薬剤耐性マー
カーのような選択マーカーの遺伝子を担持できるし、ま
たはAusubel ら同上に記載されるようなｄｈｆｒ細胞系
を形質転換するための、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄ
ｈｆｒ）遺伝子のような、欠損細胞系用の補足遺伝子を
担持できる。あるいはまた、選択マーカーを担持する別
個のプラスミドを発現ベクターと同時に形質転換に使用
することもできる。
【００７１】Ｄ．宿主細胞／形質転換 このようにして得られたベクターは適当な宿主細胞へ移
入される。これらの宿主細胞は微生物、昆虫細胞または
哺乳動物細胞でありうる。本発明の好適な実施態様で
は、使用される宿主細胞は微生物でありそしてより詳し
くはE. coli 細胞である。
【００７２】（ｉ）微生物 外因性ＤＮＡをとり込みかつそれらの遺伝子と付随する
オペレーション要素を発現しうる任意の微生物を選択で
きると考えられる。宿主生物を選択した後、ベクターを
当業者に一般的に知られた方法を使って宿主生物に移入
する。かかる方法の例は R.W. Davis ら, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, NewYork, (1980) （参考文献としてこ
こに詳細にとり込まれる）に見ることができる。一実施
態様では、温度調節が上記のようなオペレーション要素
の使用を介した遺伝子発現の調節手段として意図される
ので、形質転換は低温で起こることが好適である。他の
実施態様においては、浸透調節遺伝子がベクターに挿入
された場合は、外来性遺伝子の適切な制御を確保するた
めに、形質転換期間中塩濃度の調節が必要であろう。
【００７３】宿主微生物が通性嫌気性菌または好気性菌
であることが好適である。この方法で使用するのに好ま
しい詳細な宿主には酵母および細菌が包含される。詳細
な酵母にはサッカロミセス属のもの、特にサッカロミセ
ス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が含まれ
る。詳細な細菌にはバチルス属、エシェリヒア属、およ
びシュードモナス属のもの、特にバチルス・ズブチリス
およびエシェリヒア・コリが包含される。他の宿主細胞
は表Ｉに示してある。
【００７４】（ii）哺乳動物細胞 ベクターはリン酸カルシウム：ＤＮＡ共沈、エレクトロ
ポレーション、またはプロトプラスト融合のようないく
つかの技法により培養下の哺乳動物細胞に導入できる。
好適な方法はAusubel ら同上に記載されるようなリン酸
カルシウム共沈法である。
【００７５】形質転換可能であり、しかもｃＤＮＡ配列
を転写・翻訳し、前駆体神経栄養性タンパク質をプロセ
ッシングしそして成熟タンパク質を分泌することができ
る安定した細胞型が数多く存在する。しかしながら、細
胞型は、もし起こるとしたら、分泌タンパク質のグリコ
シル化およびアミノ酸残基の翻訳後修飾に関して変動で
きよう。従って、理想的な細胞型は天然分子と同一の組
み換え神経栄養性タンパク質を生産するものである。 Ｅ. 工学的に作製された細胞の培養 神経栄養性タンパク質の発現に適した条件下宿主細胞を
培養する。これらの条件は一般に宿主細胞に特異的であ
り、かかる細胞の増殖条件に関する刊行された文献およ
び本明細に含まれる教示に照らして、通常の技術を有す
る者が容易に決定できる。例えば、 Bergey's Manual o
f Determinative Bacteriology, 第８版, Williams & W
ilkins Company, Baltimore, Marylandは、参考文献と
して詳細に本文にとり込まれるが、これには細菌培養条
件に関する情報が載っている。酵母および哺乳動物細胞
の培養に関する同様の情報は、 Pollack, R. Mammalian
Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (197
5)から得られ、これは参考文献として詳細に本文にとり
込まれる。
【００７６】ＤＮＡ配列の発現調節に必要な任意の条件
は、ベクター内に挿入されるかまたはベクター中に存在
する任意のオペレーション要素に依存し、形質転換およ
び培養段階で効力を発揮するであろう。ある実施態様に
於ては、ＤＮＡ配列の発現を阻害する適当な調節条件の
存在下細胞を高密度に増殖させる。最適な細胞密度に達
したときに、周囲の条件をＤＮＡ配列の発現に適した条
件に変化させる。こうして、宿主細胞が最適密度近くま
で増殖した後の一定時間に神経栄養性タンパク質を生産
させること、およびその結果生じるタンパク質をその発
現に必要な調節条件を誘導した後の一定時期に収集する
ことが意図される。 ４. 発現した組換えタンパク質の再生 本発明の好ましい実施態様に於ては、組換え成熟神経栄
養性タンパク質を収集後、その活性構造をとらせる前に
精製する。当該タンパク質を最初に精製する場合は再生
タンパク質を高収率で回収することが容易になると本発
明者らは考えるので、この実施態様が好ましい。しかし
ながら、もう一つの好ましい別の実施態様に於いては、
精製前に神経栄養性タンパク質を再生してその活性構造
をとることを可能にすることができる。さらに別の好ま
しい実施態様に於ては、このタンパク質は培養培地から
回収した時点で、再生された活性な状態で存在する。
【００７７】ある特定の状況に於ては、成熟神経栄養性
タンパク質は、宿主微生物内で発現し、細胞壁または細
胞膜を通って、または細胞周辺腔へ輸送される時点で、
当該タンパク質の適正で、活性な構造をとるであろう。
このことは、一般に、適当なリーダー配列をコードする
ＤＮＡが当該の組換えタンパク質をコードするＤＮＡに
連結されている場合に起こるであろう。
【００７８】本発明のある実施態様に於ては、微生物内
で生産されたタンパク質は実質的な生物活性を欠く可能
性があり、したがってこれを再生して、神経栄養性タン
パク質にＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の一員として期待される生
物学的特異活性を付与する必要があろう。予想される特
異活性は、真核細胞で発現されたタンパク質について観
察されるかあるいはまた、天然起源から精製された同一
または関連タンパク質について観察されるもののどちら
かである (例えば、マウス顎下腺ＮＧＦおよびブタ脳Ｂ
ＤＮＦ) 。
【００７９】微生物で発現されたタンパク質に生物活性
がないのは、分子内ジスルフィド結合が正しく形成され
ないことに関係している場合が多い。このような実施態
様の好ましい一局面に於ては、Ｅ. コリ内で生産された
組換え神経栄養性タンパク質を再生して、分子内ジスル
フィド結合の正確な配置および予想される生物学的特異
活性を得ることができる。
【００８０】好ましい局面に於ては、組換えタンパク質
を以下の工程を用いて再生することができる： (１) 微生物内で生産された成熟神経栄養性タンパク質
に関して生じたあらゆる分子内または分子間ジスルフィ
ド結合、および／またはあらゆる非共有結合性相互作用
を、まず破壊する。これを行うために、タンパク質を十
分な変性剤 (例えば、塩酸グアニジンまたは尿素) 、お
よび十分な還元剤 (例えば、β−メルカプトエタノー
ル、ジチオトレイトール、またはシステイン) に曝して
タンパク質を変性させ、非共有結合性相互作用を破壊
し、ジスルフィド結合を還元する。
【００８１】(２) 成熟神経栄養性タンパク質を変性お
よび還元した後、還元タンパク質に存在する遊離のチオ
ール基を大過剰のジスルフィド含有試薬 (例えば、グル
タチオンまたはシスチン) の添加によって酸化する。こ
の反応により、成熟神経栄養性タンパク質中の各システ
イン残基が酸化剤の単量体形とジスルフィド結合を形成
するものである混合ジスルフィド結合が形成される。こ
の工程によって、後続のプロセッシングで神経栄養性タ
ンパク質に間違った分子内ジスルフィド結合が形成され
るのを阻止できる。
【００８２】(３) 次に、変性剤および酸化剤を所定濃
度に希釈し、そしてジスルフィド結合の架け変えを触媒
するためにチオール含有試薬 (例えばシステイン) を添
加する。その目的は、変性剤濃度を十分に低下させて神
経栄養性タンパク質が様々な三次元構造をとることを可
能にする環境を作ることであり、また酸化／還元ポテン
シャルを調整してジスルフィド結合の形成および破壊を
可能にする環境を作ることである。成熟神経栄養性タン
パク質の正しい三次元構造およびジスルフィド結合パタ
ーンは、他のありうるコンホーメーションに比べてエネ
ルギー的により安定であると考えられている。したがっ
て、神経栄養性タンパク質が様々な三次元コンホーメー
ションおよび分子内ジスルフィド結合パターンをとるこ
とを可能にする条件により、神経栄養性タンパク質のか
なりの割合が正しい分子内ジスルフィド結合パターン、
正しい三次元構造、を再生し、したがって生物学的に活
性となることが可能となろう。
【００８３】好ましい実施態様に於ては、組換え神経栄
養性タンパク質を尿素含有バッファー中に0.１−２mg／
ml濃度となるように溶解する。もし必要ならば、ジスル
フィド結合の架け換えを促進するために、やはり尿素を
含有する高 pＨバッファー溶液を添加することによっ
て、かかる溶液の pＨをアルカリ性となす。還元剤を最
終濃度約１−15mMとなるように添加する。次に、酸化剤
を最終濃度約15−50mMとなるように添加する。神経栄養
性タンパク質含有溶液を５−20倍に希釈し、その溶液が
ジスルフィド含有試薬より２−３倍多いチオール含有試
薬を含有するような濃度まで、チオール含有試薬を加え
る。
【００８４】組換え神経栄養性タンパク質の再生に関す
るもっとも好ましい実施態様に於いては、最終的な再生
混合物を脱気し、そして嫌気性条件で再生が起こるよう
にする。さらに、本発明のもっとも好ましい実施態様に
於いては、ＮＧＦ溶液は再生前に他のタンパク質から実
質的に精製される。この文脈で実質的に精製されると
は、その溶液が、ＮＧＦ再生の速度または効率を妨げる
宿主細胞タンパク質を実質的に含まないことを意味す
る。そして最終的に、本発明の好ましい実施態様に於い
ては、グリコール含有試薬もまた再生混合物に包含され
る。
【００８５】これらの方法は穏やかで、神経栄養性タン
パク質の化学的修飾をもたらすべきでない。このプロト
コルで変性剤として尿素を用いる場合は、生じる可能性
のあるシアン酸イオンを尿素溶液をDOWEX1-X8 (BioRad)
のような陰イオン交換カラムに通すことによって除去す
ることが重要である。シアン酸イオンを除去しないと、
タンパク質中のアミノ基が修飾される可能性がある (St
ark 1967 Methods inEnzymology 11: 125) 。
【００８６】最終再生溶液に於ける変性剤、酸化剤、チ
オール試薬およびそれらの濃度の選択および最適濃度
は、正しく再生され生物学的に活性な神経栄養性タンパ
ク質の割合をモニターすることによって実験的に決定さ
れる。最終再生溶液に於ける目標は、好ましいコンホー
メーションおよびジスルフィド結合パターンが達成され
るまで、神経栄養性タンパク質にジスルフィド結合の架
け換えとコンホーメーション変化が起こり得る制御され
た環境を与えることである。上記した最適な再生にとっ
て好ましい条件は、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タ
ンパク質のすべてについて実質的に同一であることが予
想されるが、それはこれらのタンパク質が、成熟タンパ
ク質中の全部で６個のシステイン残基の相対位置を含め
て、アミノ酸配列に於いて密接に関連しているためであ
り、したがって同一のジスルフィド結合パターンをとる
と推定されるからである。
【００８７】本発明の再生に関する実施態様により、生
物学的に活性な神経栄養性タンパク質を生じないことが
示されている望ましい発現系において神経栄養性タンパ
ク質を発現できる。本発明の方法を行った後、細菌で発
現された組換え神経栄養性タンパク質は、最低10％の生
物活性を獲得するであろう。より好ましい実施態様に於
いては、神経栄養性タンパク質は少なくとも30％の生物
活性を得るであろう。最も好ましい実施態様に於いて
は、当該タンパク質は少なくとも50％の生物活性を有す
るであろう。
【００８８】下記の実施例３は、この再生プロトコルが
細菌で生産される成熟ＮＧＦの再生に有効であることを
示す実験について、以下のように説明する： (１) 真核細胞発現件で生産されるかあるいは天然起源
から精製された、正しく折りたたまれ完全に生物学的に
活性な成熟ＮＧＦを上記のように変性させてジスルフィ
ド結合を還元し、生物活性を失わせる。このＮＧＦは変
性および還元以前は生物学的に活性であったので、生物
活性の喪失によって変性および再生が起こったことを証
明できる； (２) 変性させ還元させたＮＧＦを、本文記
載のプロトコルにしたがって再生し、生物活性が回復さ
れたことを判定する。生物活性の回復は、変性され還元
されたタンパク質の適正な再生にかかっていると推定さ
れる。細菌細胞発現系も含めて、上記のどの起源に由来
する成熟ＮＧＦも、変性および還元後は構造的に区別で
きないと主張されている。したがって、真核細胞発現系
または天然起源のいずれかに由来する変性され還元され
た成熟ＮＧＦを適正に再生できることは、細菌細胞で生
産された成熟ＮＧＦをうまく再生できることを示す (実
施例３および図３参照) 。
【００８９】実施例３Ｂは、上記と同様の方法を用い
た、Ｅ. コリを使用する細菌発現系で生産された成熟Ｎ
ＧＦの再生の成功を説明する。再生されたＮＧＦは完全
に生物学的に活性で、逆相高性能液体クロマトグラフィ
ーで天然型の、昆虫細胞で生産されたＮＧＦの位置で移
動する。 ５. 組換え神経栄養性タンパク質の精製 最も利用し易く、高収率で生物学的に活性なタンパク質
を生じることが経験的に確認されている、成熟神経栄養
性タンパク質を再生するための上記プロトコルは、組換
えタンパク質の精製の段階に適用できる。
【００９０】本発明の一実施態様に於いては、ＮＧＦ／
ＢＤＮＦ群の組換え体は、タンパク質化学の標準的な技
法によって、その組換えタンパク質が医薬製剤中に使用
するに十分に純粋となるまで発現宿主細胞の抽出物から
精製できる。かかる純度は、調製物中の全タンパク質の
最低90％が神経栄養性タンパク質であること、そして好
ましくは全タンパク質の最低95％が神経栄養性タンパク
質であることと定義される。好ましい実施態様に於いて
は、組換えタンパク質の精製に用いられる方法には、下
記の一部またはすべてが包含されうるが、それらに限定
されない：イオン交換クロマトグラフィー (例、Ｑ−、
Ｓ−、およびＤＥＡＥ−セファロースイオン交換カラ
ム) 、ゲル浸透クロマトグラフィー (例、セファロース
サイジングカラム) 、クロマトフォーカシング (例、 M
ono-Ｐカラム) 、疎水性相互作用クロマトグラフィー
(例、オクチル−、およびフェニル−セファロースＨＩ
Ｃカラム) 、アフィニティークロマトグラフィー (例、
亜鉛、銅、および水銀金属−アフィニティーカラム) 。 ６. 医薬製品の製剤 前記のように、本発明の神経栄養性タンパク質は、治療
剤としての使用を意図されており、したがって製薬上許
容される担体中で製剤化されることが意図される。本発
明の一実施態様に於いては、神経栄養性タンパク質を化
学的に修飾して、その分子の薬動学的性質を向上させる
ことができる。一例は、ポリエチレングリコールのよう
な高分子量ポリマー物質の神経栄養性タンパク質への結
合である。神経栄養性タンパク質は、治療すべき神経細
胞障害の種類に応じて、個別にか、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群
の別の神経栄養性タンパク質と組み合わせてか、または
他の神経栄養性タンパク質または他の治療薬と組み合わ
せて投与できる。
【００９１】本発明の治療用組成物は注射によって非経
口的に、または埋め込まれたポンプからの持続的な注入
によって鞘内に投与することが好ましい。また、非経口
的徐放性製剤、吸入ミスト、経口で活性な製剤、または
坐薬のような他の有効な投与形態も意図される。好まし
い担体の一つは生理食塩溶液であるが、他の製薬上許容
される担体も使用できることが意図される。好ましい実
施態様の一つに於いては、担体および神経栄養性タンパ
ク質が生理学的に適合する徐放性製剤を構成することが
意図される。かかる担体に於ける主要な溶媒は本質的に
水性であっても非水性であってもよい。さらに、担体
は、製剤の pＨ、浸透性、粘度、透明度、色、無菌性、
安定性、溶解速度、またはにおいを改変もしくは維持す
るために、他の薬理学的に許容される賦形剤をも含有で
きる。同様に、担体はさらに、神経栄養性タンパク質の
安定性、溶解速度、放出または吸収を改変もしくは維持
するために、他の薬理学的に許容される賦形剤をも含有
できる。かかる賦形剤は、単位量または複数回量におけ
る非経口投与用製剤に、あるいは埋め込まれたポンプか
らの持続的または定期的注入によるかまたは鞘膜内への
定期的な注射による鞘膜内デリバリーのための製剤に通
常慣用的に使用される物質である。
【００９２】ひとたび治療用組成物が製剤化されると、
その組成物は溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固
体、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として、滅菌
バイアル中に保存できる。かかる製剤は、すぐ使用でき
る形でまたは投与直前に再構成を必要とする形態で保存
できる。かかる製剤の好ましい保存は、少なくとも４℃
程度の低温で行われ、−70℃が好ましい。また、神経栄
養性タンパク質を含有するかかる製剤は生理的 pＨまた
はその付近で保存され投与されるのが好ましい。現在で
は、約pH5.５より低い pＨ、および約8.０より高い pＨ
で製剤を保存し、投与することは望ましくないと考えら
れている。
【００９３】神経栄養性タンパク質を含有する製剤を非
経口的に投与する方法は、皮下または筋肉内ルートによ
ることが好ましい。望ましい量の神経栄養性タンパク質
を得るには、毎日繰り返しまたはより低頻度で皮下また
は筋肉内注射を行うことができる。約0.01mg／kgより低
い用量で毎日神経栄養性タンパク質を投与することは効
果がなく、一方１mg／kgより高い用量で毎日投与するこ
とは望ましくない副作用をもたらすと考えられている。
また、神経栄養性タンパク質を含有するある種の製剤を
経口投与することも意図される。この様式で経口投与さ
れる神経栄養性タンパク質はカプセル封入されることが
好ましい。カプセル化された神経栄養性タンパク質は、
固体投与形の製剤化に通例用いられる担体を用いてまた
は用いずして製剤化できる。カプセルは、その製剤の活
性部分が、生物利用可能性が最大となり、そして全身に
行きわたる前の分解が最小となる時点で胃腸管内に放出
されるように設計されることが好ましい。神経栄養性タ
ンパク質の吸収を促進するために、付加的な賦形剤を包
含することができる。希釈剤、香料、低融点ワックス、
植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も
使用できる。
【００９４】投与様式に関わらず、特定の用量が患者の
およその体重にしたがって算出される。上記各製剤が関
わる治療に適した用量を決定するのに必要な計算の一層
の改善は、当業者によってルーチンに行われ、それは過
度の実験を行うことなく当業者によってルーチンに行わ
れる業務の範囲内である。生物試験では、本発明の神経
栄養性タンパク質を用いても、毒性作用はまったく観察
されない。 実施例１：ＢＤＮＦのヒト遺伝子の単離、配列決定およ
び発現 Ａ. ヒトＢＤＮＦ遺伝子の部分を増幅するためのポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクションの利用 ブタＢＤＮＦについて報告された核酸配列に基づいて、
以下のオリゴヌクレオチドを合成した (Leibrockら、19
89 上記) 。 ──────────────────────────────────── ＢＤＮＦ−１［ブタＢＤＮＦの第５番目のコード塩基のすぐ上流に位置し、また 5' BamHI部位をも含有する、縮重していないセンスストランドオリゴ］ 5' ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＡＣ 3' ──────────────────────────────────── ＢＤＮＦ−２［ブタＢＤＮＦの開始コドンから下流に連なる、部分的に縮重した 推定センスストランドオリゴ；このオリゴは縮重を減らすために二つの異なるプ ールで合成された；推定物は、哺乳動物のコドン使用の選択を利用することによ って縮重を減らしたオリゴヌクレオチドである］ ＢＤＮＦ−２Ａ 5' ＡＴＧ ＡＣＮ ＡＴＣ／Ａ／Ｔ ＣＴＧ ＴＴＴ／Ｃ ＣＴＧ ＡＣＮ ＡＴＧ 3' ＢＤＮＦ−２Ｂ 5' ＡＴＧ ＡＣＮ ＡＴＣ／Ａ／Ｔ ＣＴＧ ＴＴＴ／Ｃ ＣＴＣ ＡＣＮ ＡＴＧ 3' ──────────────────────────────────── ＢＤＮＦ−３［ブタＢＤＮＦの終止コドンのすぐ下流に位置し、また 5' SpeI部 位をも含有する、縮重していないアンチセンスストランドオリゴ］ 5' ＡＣＴ ＡＧＴ ＴＡＡ ＴＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＡＡＡ ＧＣＣ 3' ──────────────────────────────────── ＢＤＮＦ−４［ブタＢＤＮＦの終止コドンから上流に連なる、部分的に縮重した 推定アンチセンスストランドオリゴ］ 5' ＡＴＮ ＧＴＧ／Ｃ ＡＧＮ ＧＴＡ／Ｇ ＣＡＮ ＡＣＡ／Ｇ ＣＡ 3' ──────────────────────────────────── ＢＤＮＦ−５［成熟 (プロセシングを受けた) ＢＤＮＦタンパク質のコード領域 に存在する縮重したセンスストランドオリゴ］ 5' ＧＡＴ／Ｃ ＡＡＡ／Ｇ ＡＡＡ／Ｇ ＡＣＮ ＧＣＮ ＧＴＮ ＧＡＴ／Ｃ ＡＴＧ 3' ──────────────────────────────────── ヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用い、以下の組合せの合
成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ
反応を行った：ＢＤＮＦ−１およびＢＤＮＦ−３；ＢＤ
ＮＦ−２ＡおよびＢＤＮＦ−３；ＢＤＮＦ−２Ｂおよび
ＢＤＮＦ−３；ＢＤＮＦ−２ＡおよびＢＤＮＦ−４；Ｂ
ＤＮＦ−２ＢおよびＢＤＮＦ−４；および、ＢＤＮＦ−
１およびＢＤＮＦ−４。反応産物を電気泳動にかけ、そ
して放射性標識ＢＤＮＦ−５をプローブとして用いてＤ
ＮＡ (サザン) ブロットを探査し、ヒトＢＤＮＦに相当
する可能性のある増幅フラグメントを同定した。詳細に
ついては本実施例の実施補遺参照。
【００９５】おおよそ予想される分子量の位置に、プラ
イマーとしてＢＤＮＦ−１／ＢＤＮＦ−３、ＢＤＮＦ−
２Ａ／ＢＤＮＦ−３、およびＢＤＮＦ−２Ｂ／ＢＤＮＦ
−３を用いた反応でＢＤＮＦ−５とハイブリッド形成す
るバンドが存在した。電気泳動したＢＤＮＦ−１／ＢＤ
ＮＦ−３反応混合物に由来する、ハイブリッド形成した
サザンバンドの位置のＤＮＡをゲルから切り出し、一部
をとって、配列決定プライマーとしてＢＤＮＦ−１およ
びＢＤＮＦ−３を用いて直接配列決定し、ＢＤＮＦコー
ド領域内のヒト遺伝子の部分配列を得た (図１) 。この
増幅されたＤＮＡの残りをSmaI切断ファージＭ13mp10に
サブクローニングし、放射性標識ＢＤＮＦ−５とのハイ
ブリッド形成に基づいて陽性サブクローンを選択した。
二つの相互に無関係な、反対方向の陽性サブクローン、
ＢＤＮＦ−ＰＣＲ１および２を配列決定し、ＢＤＮＦコ
ード領域内におけるヒト遺伝子の配列を得た (図１) 。 Ｂ. ＢＤＮＦヒト遺伝子をクローニングするためのＰＣ
Ｒ増幅ＤＮＡの使用 増幅されハイブリッド形成したサザンバンドの位置にあ
るＤＮＡを放射性標識し、これを用いてファージラムダ
ＥＭＢＬ３におけるヒトゲノムＤＮＡライブラリーをス
クリーニングした。６個の陽性クローンがプラーク精製
された。クローン♯３由来ＤＮＡを下記の制限酵素で別
々に消化した：HinfI ; AluI；RsaI；およびNcoI／Sau3
AI。これらの酵素を選択したのは、それらがＢＤＮＦコ
ード配列をＭ13にクローニングするのに適した大きさの
いくつかのフラグメントに切断するからである。ＢＤＮ
Ｆコード配列を含有する制限フラグメントをファージＭ
13mp10にサブクローニングし、配列決定して、ＢＤＮＦ
コード領域に於けるヒト遺伝子の配列を確認した (図
１) 。図１はまた、前駆体および成熟 (プロセシングを
受けた) ヒトＢＤＮＦタンパク質の推定アミノ酸配列を
も示す。図１で提案された切断部位はＮＧＦおよびブタ
ＢＤＮＦの既知配列、およびＮＧＦおよびブタＢＤＮＦ
の既知アミノ酸配列における切断部位の類似性に基づ
く。
【００９６】ＰＣＲ増幅フラグメントから得られたＢＤ
ＮＦ配列 (図１) 、およびヒトゲノムＤＮＡクローンか
ら得られたＢＤＮＦ配列は第196位の核酸が異なる。ヒ
トゲノムクローンは196位のＧの代わりにＡを有し、こ
れによってアミノ酸66がバリンからメチオニンに変化す
る。この相違は前駆体で生じ、ＢＤＮＦの生物学的活性
形である成熟型では起こらない。一つの塩基対および一
つのアミノ酸のこの変化は、ヒトゲノム内のＢＤＮＦ配
列に於ける対立遺伝子の差異を表す可能性がある。
【００９７】付加的なクローンの配列決定によって、図
１に示すのと同一の配列が得られた。ただし、 223位の
アミノ酸はアルギニン (Ｒ) の代りにリジン (Ｋ) であ
り、そのコドンはＡＧＡの代わりにＡＡＡであった。こ
の差異はヒトＢＤＮＦの生物学的に活性な成熟型に生じ
る。これは、この位置での代替ヒト対立遺伝子を表すの
かもしれない。 Ｃ. ＣＯＳ−７細胞に於ける生物学的に活性なＢＤＮＦ
の発現 本発明者らが得たヒトＢＤＮＦ遺伝子が、実際に生物学
的に活性なＢＤＮＦをコードしていることを確認するた
めに、その遺伝子を一時的にＣＯＳ−７細胞で発現さ
せ、そして発現された物質を、ブタ脳から精製されたＢ
ＤＮＦの既知性質である、培養中のニワトリ胚 (10日)
後根神経節ニューロンの生存を促進する能力に関してア
ッセイした (Barde ら、1982 The EMBO Journal 1: 54
9) 。
【００９８】 １. ヒトＢＤＮＦ発現のためのＤＮＡ構築物の作製 上記Ｂ項のように作製し、オリゴヌクレオチドＢＤＮＦ
−１およびＢＤＮＦ−３を用いるＰＣＲによってヒトゲ
ノムＤＮＡから増幅した、ヒトＢＤＮＦコード配列を含
有するゲル精製ＤＮＡを、ＣＯＳ細胞発現ベクター pSG
５ (Green ら、1988 Nuc. Acids Res. 16: 369) に連結
した。プラスミド pSG５を制限エンドヌクレアーゼEcoR
IおよびBamHIで消化し、付着末端を４種すべてのデオキ
シリボヌクレオチドの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントで処理することにより平滑化し
た。次に、完全なＢＤＮＦコード配列を含有するゲル精
製ＤＮＡを、末端を平滑化した pSG５に連結した。ＣＯ
Ｓ細胞内へのトランスフェクションに際して、ＳＶ40極
初期プロモーターからＢＤＮＦ前駆体タンパク質を発現
できる挿入ＤＮＡの方向は、制限マッピングによって同
定される。望ましい方向において、ＢＤＮＦ挿入物はBa
mHIおよびBg1IIで消化後にベクターから分離できる。
【００９９】２. ＣＯＳ細胞のトランスフェクション ＢＤＮＦコード挿入物を有する pSG５由来ＤＮＡおよび
同挿入物を有しない同ＤＮＡをアルカリ溶解および続く
CsCl密度遠心によって調製した (Maniatisら、上記) 。
製品使用説明書 (ＢＲＬ) のプロトコルＣにしたがっ
て、リポフェクチンを用いてこのプラスミドＤＮＡをＣ
ＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。ＢＤＮＦコ
ード挿入物を含有しないプラスミドＤＮＡでトランスフ
ェクションしたＣＯＳ細胞培養物を陰性対照として使用
した。
【０１００】３. 発現産物のバイオアッセイ トランスフェクション24時間後、細胞を皿から掻き取
り、短時間の遠心によって収集した。細胞ペレットを氷
上で、１mM ＥＤＴＡ、0.１mM ＰＭＳＦ、および0.１
μＭペプスタチン含有20mMリン酸ナトリウム、pH6.７中
での短時間の音波処理によって抽出した。各培養物から
の細胞抽出物の連続希釈物を、ニワトリ胚(10日) 後根
神経節ニューロンを用いて生物活性についてアッセイし
た (実施例３の実験補遺参照) 。有意な生物活性が、Ｂ
ＤＮＦ挿入物を含有する pSG５を用いてトランスフェク
ションした細胞の抽出物中に検出されたが、挿入物を含
有しない pSG５でトランスフェクションした細胞の抽出
物では検出されなかった (図８) 。これらの結果は、ク
ローニングされた遺伝子が生物学的に活性なＢＤＮＦを
発現しうることを示す。 Ｄ. Ｅ. コリに於ける成熟ヒトＢＤＮＦの発現 図１に示されるヒト成熟ＢＤＮＦ遺伝子をＥ. コリ発現
ベクターに挿入し、かかるベクターをＥ. コリ宿主細胞
に導入し、そして下記実施例２記載の方法にしたがっ
て、ＮＧＦ遺伝子に代えてＢＤＮＦ遺伝子を用いること
によって、ヒト成熟ＢＤＮＦを生産する遺伝子の発現を
達成する。 実施例１の実験補遺 １. 分子生物学の方法 実質的には Saikiら、1988 Science 239: 487 の記載に
したがってポリメラーゼ・チェイン・リアクション (Ｐ
ＣＲ) を行った。ＰＣＲ反応産物を２％アガロースゲル
で電気泳動し、そしてＤＮＡ (サザン) ブロッティング
のために Zeta-Bindメンブラン (BioRad) 上に移した。
適当な増幅バンドをもとのゲルから切り取り、ＤＮＡポ
リメラーゼのクレノウフラグメント (New England Biol
abs)を用いて末端を修復することにより、サブクローニ
ング用に調製した。次に、平滑末端としてクローニング
するか、またはプライマーに制限部位が入れてあれば適
当な酵素で消化後にクローニングした。かかるフラグメ
ントを、適当に切断しホスファターゼ処理したＭ13mp10
ベクター (Amersham) にサブクローニングした。キナー
ゼ処理によってオリゴヌクレオチドを放射性標識した
(T. Maniatis, E. F.Fritsch, J. Sambrook、Molecular
Cloning; A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor La
boratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982))。オ
リゴヌクレオチドのハイブリッド形成条件は、６Ｘ Ｓ
ＳＣＰ、２Ｘ Denhardt's、２mM ＥＤＴＡ、0.05％ピ
ロリン酸ナトリウム、0.１％ＳＤＳ、100mcg／ml 酵母
ｔＲＮＡ (非特異的競合剤として) 、pH8.０とした。ハ
イブリッド形成の温度、およびハイブリッド形成したブ
ロットおよびフィルター洗浄の緊縮条件は、その相対的
なＧＣ含量比に基づき各オリゴヌクレオチドプローブに
応じて個々に調整された。長い放射性標識ＤＮＡプロー
ブをランダムプライミングにより調製した［A. P. Fein
bergおよび B. Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6 (1
983)］。かかるプローブを用いたハイブリッド形成条件
は：65℃で、５Ｘ ＳＳＣＰ、２Ｘ Denhardt's、２mM
ＥＤＴＡ、0.05％ピロリン酸ナトリウム、0.１％ＳＤ
Ｓ、 250μｇ／mlニシン精子ＤＮＡ、pH8.０とし；0.１
Ｘ ＳＳＣＰおよび0.１％ＳＤＳ中65℃で洗浄した。配
列決定はＭ13ベクターに於ける両方向のサブクローンか
ら調製された一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、ジデオキ
シチェインターミネーター法［F. Sanger, S. Nicklen,
A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,
5463 (1977) ］によって行った。 実施例２：Ｅ. コリに於ける組換えＮＧＦの生産 成熟型の (プロセシングされた) ヒトＮＧＦをコードす
る合成遺伝子をBritish Biotech から購入した。この遺
伝子は様々な制限部位を挿入するために行われたヒト核
酸配列内での変化以外は、ＮＧＦについて報告されたヒ
ト核酸配列 (Ullrich ら、 1983 上記) と同一であり、
これはプラスミドＢＢＧ26内で供給される。
【０１０１】このプラスミドでＥ. コリＤＨ５アルファ
株を形質転換し、後続の操作に十分な量のプラスミドを
生産した。適当な発現ベクターに挿入するためにこの合
成遺伝子を修飾する目的で、以下の二つのオリゴヌクレ
オチドを合成した：
【０１０２】
【０１０３】これらオリゴヌクレオチドは5'末端で１個
のBamHI部位を、そして 3'末端で一個の EcoR
I部位を有する。この合成ＮＧＦ遺伝子の5'末端付近に
唯一の EcoRI部位が存在する。ＢＢＧ26を制限酵素 Eco
RIに接触させた後、この合成オリゴヌクレオチドを Eco
RI部位のすぐ5'側で切断されたプラスミドと連結するこ
とができ、したがってＮＧＦコード配列の5'部分を置き
換えることができる。コード配列の5'末端をこのように
置換することによって、上流の翻訳カップラーの挿入が
可能となり (上記オリゴヌクレオチド配列を参照) 、ま
たＥ. コリで好んで用いられるコドンの置換が可能とな
る (deBoerおよび Kastelein From Geneto Protein: St
eps Dictating the Maximal Level of Gene Expression
(1986)Davisおよび Reznikoff編、pp.225-283, Butter
worths, NY )。これらの変化はＮＧＦ配列の効率的な発
現を促進するために設計される。
【０１０４】オリゴヌクレオチドＮＧＦ−ＡおよびＮＧ
Ｆ−Ｂをキナーゼ処理し、ともにアニーリングした後、
EcoRI切断されたホスファターゼ処理したプラスミドＢ
ＢＧ26に連結し、そしてこの混合物をホスファターゼ処
理した。この混合物を制限酵素BamHI で処理し、修飾さ
れたＮＧＦコード配列を含有する約390bp BamHI フラグ
メントをゲル精製した。このフラグメントを、ゲル精製
され BamHI切断しそしてフォスファターゼ処理された二
つの異なるＥ. コリ発現ベクターの各々に連結した、す
なわち (１) ｐＴ５Ｔと呼ばれるＴ７ファージプロモー
ター系に基づくベクター；または (２) ｐＴ３ＸＩ−２
と呼ばれる、トリプトファンおよびラクトースの両方で
誘導されるハイブリッド「Ｔａｃ」プロモーターに基づ
くベクター (詳細については本実施例の実験補遺および
図４および図５参照) 。この結果、ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦま
たはｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦのいずれかが生成した。
【０１０５】ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦを用いてＥ. コリＢＬ21
(ＤＥ３) 株を形質転換した。この菌株 (Studier およ
び Moffat, J. Mol. Biol. (1986) 189: 113-130に記
載) は、除去できない溶原ラムダバクテリオファージ上
にＩＲＴＧ誘導可能なｌａｃプロモーターの制限下にあ
るＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する。ｐＴ５Ｔ
ベクター内の挿入物はＴ７ファージプロモーターの制御
下にあるので、これは結局挿入配列の発現をｌａｃプロ
モーターの制御下に置くことになり、したがって発現は
イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド (ＩＰＴ
Ｇ) によって誘導可能である。形質転換体を釣り上げ、
増殖させ、そして32Ｐ−標識390-bp BamHIフラグメント
とハイブリッド形成させてどの形質転換体がＮＧＦ挿入
物を担持するかを判定した。８個の陽性形質転換体が選
択され、増殖させ、そしてベクターＤＮＡを単離して配
列決定した。８個の各々がベクター中に正しい挿入物を
正しい方向で有していた。２個を別々に、 15mcg／mlテ
トラサイクリン含有ルリアブロス中で光学濃度 (O.D.)
約0.６となるまで増殖させた後、培養物を最終濃度１mM
のＩＰＴＧ添加によって誘導した。各培養物の試料を誘
導後２時間から21時間まで一定間隔で採り、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ試料バッファー (０.025％ブロモフェノールブル
ー、10％グルセロール、１％β−メルカプトエタノー
ル、２％ＳＤＳ、0.0625Ｍトリス−ＨＣｌ、pH6.８) 中
で溶解させた。各試料を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て電気泳動し、そしてＮＧＦの生成を正しい分子量位置
にクマシーブリリアントブルー染色バンドが出現するこ
とおよびマウス顎下腺ＮＧＦ(Sigma) に対する抗体を用
いたウェスタンブロット分析の両者によってモニターし
た。陰性対照として、誘導しない同一培養物から、およ
びＮＧＦ挿入物を含有しないｐＴ５Ｔベクターで形質転
換した細菌の培養物から、試料を採取した。図２に示す
結果は、形質転換体ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ−18がプロセシン
グされたＮＧＦに予想される分子量位置で抗−ＮＧＦ抗
血清によっても認識されるタンパク質バンドを生じるこ
とを示す (レーンの分類：ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ-18 ＩＰＴ
Ｇによる誘導２, ４, ８, 10, および21時間) 。予想通
り、ＮＧＦ挿入物を含有しないｐＴ５Ｔで形質転換され
た細菌 (レーンの分類：ｐＴ５Ｔ ｕ (非誘導) および
ｉ (誘導))、またはＩＰＴＧの存在による誘導を行わな
いｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ-18 (レーン分類：ｐＴ５Ｔ：ＮＧ
Ｆ-18 ＩＰＴＧによる誘導０時間) では、このバンドは
検出されない。
【０１０６】ｐＴ３ＸＩ−２：ＮＧＦを用いてファージ
−耐性Ｅ. コリＫ−株、ＪＭ107 を形質転換した。13個
の形質転換体をｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ形質転換体と同様に増
殖させそして３個がヒト成熟ＮＧＦタンパク質を発現す
ることが、ｐＴ５Ｔ：ＮＧＦ形質転換体に関して上記し
たと同様に、細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりクマ
シーブリリアントブルー染色および抗−マウスＮＧＦ抗
血清による免疫染色後に判明した。
【０１０７】Ｅ. コリＪＭ107 に於てｐＴ３ＸＩ−２：
ＮＧＦにより生産された組換えＮＧＦのアミノ酸末端ア
ミノ酸配列によって、アミノ末端メチオニンが生産され
たＮＧＦの少なくとも85％で発現の間に除去されていた
ことが示された。これは、生産されたＮＧＦが、プロセ
シングされた成熟ヒトＮＧＦの正しいアミノ末端を有す
ることを示している。
【０１０８】本文記載のようにして生産されたＮＧＦ
が、下記実施例３記載の方法によって判定されるよう
に、検出可能な生物活性を何ら有しないことが明らかと
なった。ベクターｐＴ５Ｔ：ＮＧＦまたはベクターｐＴ
３ＸＩ−２：ＮＧＦのいずれかによって生産されたタン
パク質を神経成長刺激活性について調べ、そしてバキュ
ロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で生産された組換
えｈβＮＧＦを対照として用いた。陽性対照は1.１mg／
mlの濃度で半−最大ニューロン生存を生じた。対照的
に、Ｅ. コリでこれら二つのベクターから生産されたポ
リペプチドは約 3,600mg／mlの濃度でもいずれも何ら
有意な生物活性を示さなかった。 実施例２の実験補遺 １. "Ｔ７プロモーター" 系に基づく発現ベクター、ｐ
Ｔ５Ｔの説明 (このベクターの特徴については図４参
照) Ｔ７プロモーターに基づく発現ベクターｐＴ５Ｔは、実
質的にはｐＪＵ1003と同一であるが［Squires ら、J. B
iol. Chem. (1988) 263: 16297-16302］、ただしＴ７プ
ロモーターの5'側の唯一の BglII部位とテトラサイクリ
ン耐性遺伝子内のClaI部位の間に短い一続きのＤＮＡが
存在する。このＤＮＡの配列は以下の通りである：
【０１０９】
【０１１０】２. ｐＴ３ＸＩ−２の説明：ハイブリッド
「Ｔａｃ」プロモーター系を用いたｐＫＫ223-３の修飾
(このベクターの特徴については図５参照) ) この構築のための出発プラスミドはPharmacia から購入
したプラスミドｐＫＫ233-３であった。プラスミドｐＫ
Ｋ223-３はテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を担持す
る。この機能しない遺伝子を、プラスミドｐＢＲ322 上
に担持される完全なテトラサイクリン耐性遺伝子で置換
した。プラスミドＰＫＫ233-３をSphIで完全に消化しそ
してBamHI で部分消化した。4.４キロ塩基対フラグメン
トをゲル精製しそして以下の配列：
【０１１１】
【０１１２】を有する合成アダプターおよびｐＢＲ322
(PL Biochemicals, カタログ番号27-4891-01)のテトラ
サイクリン耐性遺伝子のClaI、SphI消化物由来ＤＮＡの
539塩基対フラグメントと混合した。生成するプラスミ
ドをｐＣＪ１と命名した。次に、Mew England Biolabs
より入手したXhoIリンカーをプラスミドｐＣＪ１のPvuI
I 部位に挿入しプラスミドｐＣＪＸ−１を作製した。こ
の挿入によってプラスミドのコピー数を制御するｒｏｐ
遺伝子が破壊される。ｌａｃ１遺伝子を含有する EcoRI
フラグメントをプラスミドｐＭＣ９［Calos ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983), 80: 3015-3019 ］か
ら精製した後、以下の配列を有するXhoI-EcoRIアダプタ
ーを用いてXhoI部位に挿入した：
【０１１３】
【０１１４】次に、プラスミドｐＣＪＸ−１の EcoRIお
よびPstI部位間のポリリンカー配列を以下に示すポリリ
ンカー配列で置き換えた：
【０１１５】
【０１１６】かくして得られたプラスミドベクターをｐ
ＣＪＸＩ−１と呼んだ。最後にテトラサイクリン耐性遺
伝子を、制限酵素 HindIII、 BamHIおよびSalI認識部位
が亜硫酸水素塩変異誘発によって破壊された同様の遺伝
子で置換した。次のような方法を用いてｐＢＲ322 のテ
トラサイクリン耐性遺伝子を変異させた。プラスミドｐ
ＢＲ322 を HindIIIで切断し、次に亜硫酸水素ナトリウ
ムで変異誘発した［Shortle および Nathans, Proc. Na
tl. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 5: 2170-2174 ］。変異
誘発されたＤＮＡを連結して環状ＤＮＡを形成させ、次
にHindIII で切断して変異誘発を受けなかったプラスミ
ドをすべて線状とした。Ｅ. コリＪＭ109 ［Yanisch-Pe
rronら、Gene (1985) 33: 103-119 ］をこのプラスミド
で形質転換した後、選択培地に塗布した。プラスミドを
テトラサイクリン耐性コロニーから単離し、そしてテト
ラサイクリン耐性遺伝子内の HindIII部位の欠失に関し
て検査した。成功裡に変異したプラスミドをｐＴ１と命
名した。同様な方法によりｐＴ１中の BamHI部位を変異
誘発し、プラスミドｐＴ２を生成させた。次にプラスミ
ドｐＴ２を変異誘発させて、SalI部位を除去してプラス
ミドｐＴ３を作製した。変異テトラサイクリン耐性遺伝
子を担持するｐＴ３のClaI／BsmIフラグメントを単離
し、ｐＣＪＸ−１の相同フラグメントを置換するのに使
用し、ｐＴ３ＸＩ−２を作製した。変異したテトラサイ
クリン耐性遺伝子は機能するタンパク質を従前通りコー
ドする。 ３. ｐＴ３ＸＩ−２−φ10ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎの形成
(ＮＧＦのためのｔａｃプロモーターベクターの調製) 最初に、塩基性繊維芽細胞増殖因子 (ｂＦＧＦ) の「遺
伝子」を合成した。この「遺伝子」はSommerら (1987 B
iochem. Biophys. Res Commun. 141: 67) によって報告
されたｂＦＧＦと同一の配列をコードするが、Ｅ. コリ
でよく発現される遺伝子に偏って見られるコドンを用い
る。この遺伝子の構造はそのコード部分の前に、翻訳の
効率的な開始を保証するための翻訳カップラー配列 (Sq
uires ら、1988, 上記、参照) がくるようになってい
る。
【０１１７】ｂＦＧＦ合成遺伝子をまずベクターＭ13mp
18の EcoRIと HindIII部位の間に挿入し、配列決定し
た。この遺伝子の構造は以下の通りである：
【０１１８】
【０１１９】遺伝子の一部の特徴を強調している。次に
この遺伝子をBamHIおよびHindIII消化によって単離し、
BamHI／HindIII−切断ｐＪＵ1003 (Squiers ら、1988,
上記) に挿入してｐＪＵ1003−ｓｙｎＦＧＦを生成さ
せた。このプラスミドをXbaIおよび HindIIIで切断し、
ｂＦＧＦ遺伝子を担持するXbaI／HindIII フラグメント
を単離した。このフラグメントを、下記のEcoRI-XbaIリ
ンカーを用いて、 EcoRIおよび HindIII切断ｐＴ３ＸＩ
−２に連結した： 5' ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＣＡ ＡＣＧ ＧＴＴ ＴＣＣ ＣＴ 3' ＧＧ ＴＧＴ ＴＧＣ ＣＡＡ ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＴＣ 5' 新たに得られたプラスミドをｐＴ３ＸＩ−２−φ10ＴＣ
３ＦＧＦｓｙｎと命名する。 ４. ＴａｃプロモーターベクターへのＮＧＦ発現構築物
の挿入 ｐＴ３ＸＩ−２−φ10ＴＣ３ＦＧＦｓｙｎを BamHIで切
断し、その結果7.４kbp の発現ベクターが線状となり、
約0.５kbp のｂＦＧＦ ＤＮＡフラグメントが放出され
た。修飾されたＮＧＦコード配列を含有する390bp BamH
I フラグメントを、ゲル精製したBamHI 切断ベクターＤ
ＮＡフラグメントに連結し、プラスミドｐＴＸ３Ｉ−
２：ＮＧＦを生成させた。 実施例３：ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群メンバーの神経栄養性タ
ンパク質の再生 Ａ. 真核細胞で生産されるかまたは天然起源から精製さ
れた成熟ＮＧＦの再生 本発明の一実施態様は、細菌で生産された不活性で成熟
型の組換えＮＧＦを再生し、生物活性を回復させる能力
に関する。これが可能であることを立証するために、真
核細胞発現系で生産されるかまたは天然起源から精製さ
れた完全に生物学的に活性な成熟ＮＧＦが、変性および
ジスルフィド結合の還元によってその生物活性が破壊さ
れた後で、うまく再生できるということをまず最初に確
立した。この証明は二つの理由から重要である： (１) 完全に変性させ還元した後で、細菌で生産された
成熟ＮＧＦ (もともと不活性) 、または天然起源から精
製された成熟ＮＧＦ (もともと活性) が、不活性であり
そして構造的に区別できないことを提起することは合理
的である。これらは構造的に区別できないので、真核細
胞または天然起源由来の変性および還元された成熟ＮＧ
Ｆが成功裡に再生できることは、細菌から発現された成
熟ＮＧＦをも変性および還元後にやはり成功裡に再生で
きることを示す。
【０１２０】(２) 完全な長さを有するＮＧＦ前駆体は
細菌内で、真核細胞発現系に於けると同様にタンパク分
解的にプロセシングを受けて正しい成熟ＮＧＦを生成さ
せることができない。したがって細菌では成熟ＮＧＦの
コード配列を直接発現させる必要があり、完全な長さの
前駆体のコード配列を発現させる必要はない。成熟ＮＧ
Ｆが真核細胞および天然起源において生ずるような完全
な長さの前駆体として最初に合成される場合にのみその
正しい折りたたみを生じそして生物学的な活性を発揮す
るであろうことは理論的には可能である。このことは、
細菌で生産された成熟タンパク質がうまく再生されるあ
らゆる可能性を排除するものであろう。しかしながら、
変性および還元された成熟ＮＧＦが、ここで立証された
ように成功裡に再生されることは、適正な再生が完全な
長さの前駆体によって決まるのではないことを証明して
いる。
【０１２１】２種類のもともとは生物学的に活性な成熟
ＮＧＦを変性および還元後に再生することに成功した、
すなわち (１) 雄マウス顎下腺から精製された成熟 (ベ
ータ) ＮＧＦ(SIGMA) および (２) 欧州特許公告EP8911
3709号記載の方法にしたがって真核細胞で生産された組
換えヒト成熟ＮＧＦ。図３は、上記のように生産された
組換えヒト成熟ＮＧＦがニワトリ胚交感神経節ニューロ
ンの生存をＮＧＦに予想される濃度で促進することを示
す (Graeene 1977 Develop. Biol. 58: 96-113) 。図３
はまた、この生物活性が変性およびジスルフィド結合の
還元後に失われることをも示している。図３はさらに、
変性および還元されたタンパク質が本文記載の方法によ
り再生された後、完全な生物活性をとり戻すことを示し
ている。マウス顎下腺から精製された成熟βＮＧＦを用
いて実質的に同様の結果が得られた。これら再生の成功
は、細菌で生産された成熟ＮＧＦの再生可能性を強く示
している。
【０１２２】１. ＮＧＦ再生のプロトコル ＮＧＦを0.５mg／mlの濃度でＰＢＳ (0.15M NaCl, 0.04
M K2HPO4、0.02M KH2PO4 、pH7.２) に溶解し、塩酸グ
アニジンを最終濃度３Ｍとなるまで添加することにより
変性させた。25℃で30分後、ジチオトレイトール (ＤＴ
Ｔ) を最終濃度5.６mMとなるまで添加し、そして25℃で
さらに２時間インキュベーションを続行した (50mM Ｄ
ＴＴもほぼ同様に良好な結果を伴って使用されている)
。次に、酸化型グクタチオンを最終濃度50mMとなるま
で添加し、25℃で10分間インキュベートした。この溶液
を pＨ調整なしの、0.２％ヒト血清アルブミン含有0.６
％トリス (Boehringer/Mannheim 604-205)で７倍に希釈
した。Ｌ−システインを最終濃度20または30mMとなるま
で添加して、同様の良好な結果を得た。この再生混合物
を25℃で16−20時間インキュベートした後、この物質を
Centricon-10濃度装置(Amicon) を用いて濃縮し、バッ
ファーをＰＢＳと交換した。
【０１２３】２. 再生後のＮＧＦ生物活性のアッセイ 未処理の出発ＮＧＦ、３Ｍグアニジンおよび5.6mM ＤＴ
Ｔ含有変性バッファー中に残るＮＧＦ、および変性させ
次に再生させたＮＧＦを、本実施例の実験補遺に記載さ
れるようにして、分離したＥ11ニワトリ胚腰椎交感神経
鎖神経節由来のニューロンの生存を促進する能力につい
てアッセイした。図３はこのバイオアッセイの結果を示
す。変性および還元されたＮＧＦは 450ng／mlで半最大
生物活性を示したが、出発ＮＧＦおよび再生ＮＧＦはそ
れぞれ0.５および1.０ng／mlで半最大生物活性を示し
た。これらの結果は、変性および化学的還元が組換えヒ
ト成熟ＮＧＦの生物活性を約1,000 倍低下させること、
および再生過程により、バイオアッセイの実験誤差の約
２倍以内で、出発ＮＧＦで見られた生物活性がこの物質
に回復されることを示している。 Ｂ. Ｅ. コリ細胞で生産された成熟ヒトＮＧＦの再生 上記実施例２に記載のようにしてＥ. コリ細胞で発現さ
れた成熟ＮＧＦは生物学的に不活性である。以下に記載
する方法にしたがって、かかるＮＧＦを再生して生物学
的に活性なＮＧＦを生成させる。
【０１２４】１. 再生のための出発物質の調製 実施例２記載のＪＭ107 中のｐＴ３Ｘ１−２：ＮＧＦ由
来のＥ. コリ細胞ペースト10ｇを、10mM ＥＤＴＡ, pH
7.０, 50ml中に再懸濁しそして 16,000psiで２回フレン
チプレスにかけた。細胞抽出物を16,000×ｇで20分間遠
心沈澱させ、上清を捨てた。ペレットを10mM ＥＤＴ
Ａ, pH7.0, 100mM中でホモジナイズした。再懸濁したペ
レットを上記のように遠心分離して上清を捨てた。この
ペレットを再度pH7.０の10mM ＥＤＴＡ, １00ml中でホ
モジナイズした。再懸濁したペレットを上記のように遠
心分離して上清を捨てた。このペレットを50mlトリス中
の４Ｍ尿素、pH8.０, 30mlおよび0.２％β−メルカプト
エタノールでホモジナイズした。上記のように、再懸濁
したペレットを遠心分離し上清を捨てた。ペレットを８
Ｍ尿素を含有する20mMクエン酸ナトリウム, pH3.０の30
mlでホモジナイズした。再懸濁したペレットを上記のよ
うに遠心分離し、上清を氷上に置いた。ペレットを８Ｍ
尿素を含有する20mMクエン酸ナトリウム, pH3.０の30ml
中でホモジナイズし、上記のように遠心分離し、上清を
氷上に置いた。この上清は−80℃で保存できる。
【０１２５】２. Ｅ. コリ抽出物の再生 上記の最終上清抽出物に、４分の１量の８Ｍ尿素含有１
Ｍトリス、pH8.５を添加した。ジチオトレイトールを最
終濃度５−15mMとなるまで添加し、その溶液を25℃で１
時間放置した。次に、シスチン (または酸化型グルタチ
オン) を最終濃度15−50mMとなるまで添加し、この溶液
を25℃で10−15分放置した。９容の3.２−4.２Ｍ尿素含
有100mM Na2HPO4 を添加した後、シスチン (またはグル
タチオン) の最終濃度の２−３倍のシステインを加え
た。この溶液を一晩４℃に保持した。これらの条件は活
性ＮＧＦを還元も変性もさせない。
【０１２６】前記条件は許容できることが判明した濃度
範囲および代替試薬を提供する。以下は代表的な再生実
験の一例を示す：40mlの上記Ｅ. コリ抽出物 (クマシー
ブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルのレーザーデンシトメトリーによる測定で、約 6
50μgm／mlのＮＧＦを含有する) に10mlの８mM尿素含有
１Ｍトリス、pH8.５を加えた。２mlの400mM ジチオトレ
イトールを添加しそしてこの溶液を25℃で１時間放置し
た。４mlの600mM 酸化型グルタチオンを添加し、この溶
液を25℃で15分間放置し、この時点で 450mlの3.２Ｍ尿
素含有100mM Na2HPO4 , pH8.３を添加し、続いて６mlの
１Ｍシステインを添加した。この溶液を４℃で16時間放
置した。この溶液は以下で最終再生混合物と呼ぶ。 ２ａ. Ｅ. コリで生産された成熟ヒトＮＧＦの抽出およ
び再生に関する別法 以下の方法がすでに提示された方法よりも好ましい、な
ぜなら結果的に再生の効率および速度が有意に高く、ま
た正しく再生された生物学的に活性な成熟ヒトＮＧＦを
より高収率で生ずるためである。 ＮＧＦ抽出 ＮＧＦを生産するＥ. コリ細胞 (実施例２に記載) を10
容量／重量 (例えば１リッター／100gm 細胞ペースト)
の10mM ＥＤＴＡ, pH7.０中で、フレンチプレスまたは
ゴーリンミルによって破壊した。溶解物を16,000×ｇで
20分間遠心分離してペレットから上清を分離した。この
ペレットを10倍容の10mM ＥＤＴＡ, pH7.０中でホモジ
ナイズし、上記のように遠心することによってさらに２
回再抽出した。そのペレットをもう一度上記のように抽
出した。洗浄されたペレットを５容量／重量の２Ｍ尿素
含有20mMトリス、pH8.０で抽出しそして上記のように遠
心した。上清を捨てた。
【０１２７】このペレットから、10容量／重量の８Ｍ尿
素含有20mMクエン酸塩、pH3.０を用いてＮＧＦを抽出し
そして上記のように遠心した。ペレットを最後に４容量
／重量の８Ｍ尿素含有20mMクエン酸塩、pH3.０で上記の
ように再抽出する間に、上清を氷上に保持した。このＣ
Ｕ (クエン酸尿素) 抽出物中におけるＮＧＦは総タンパ
ク質の約50％であった。
【０１２８】代表的な再生は以下のように行われた：20
mlの８Ｍ尿素含有１Ｍトリス、 pH8.５を、約２mg／ml
のＮＧＦを含有するＣＵ抽出物80mlに添加した。ジチオ
トレイトールまたはβ−メルカプトエタノールを最終濃
度５mMとなるまで添加し、この混合物を30−60分間25℃
に保持した。次に酸化型グルタチオンまたはシスチンを
最終濃度20mMとなるまで添加し、反応混合物を10−15分
間25℃に保持した。次に、19容の希釈バッファー (１00
mM Na2HPO4 , 10mMエタノールアミン、pH8.3,4.６Ｍ尿
素、および15.8％ポリエチレングリコール300 ) を添加
した。システインまたは２−メルカプトエチルアミンを
最終濃度３mMとなるまで添加した。３−５サイクルの脱
気およびアルゴンパージにより、最終的な再生混合物を
真空下で脱気しそして精製アルゴンでパージした。この
混合物をガスが侵入しないようにシールし、アルゴン下
９℃で１−７日間保持した。
【０１２９】最終再生混合物中におけるシステイン (ま
たは２−メルカプトエチルアミン)対酸化型グルタチオ
ン (またはシスタミン) の比率を最適にすることが賢明
である。最適比率 (代表的には２−10の間) は、最終反
応混合物を保持する温度を包含するいくつかの要因の如
何に応じて変動し得る。０−25℃の温度で再生ＮＧＦが
生じる；しかしながら、好ましい温度は４−９℃の間で
ある。希釈工程では３ｘから80ｘの最終希釈度でＮＧＦ
を生じる；しかしながら、20ｘまたはそれ以上の希釈度
が再生される総ＮＧＦの％が最も高くなる。ポリエチレ
ングリコール２00, ３00および1000が25％までの最終濃
度で使用される場合に再生ＮＧＦを生じる；しかしなが
ら、ポリエチレングリコール２00または３00を15％の最
終濃度で用いる場合の収率の方がより高い。エチレング
リコール、グリセロール、プロピレングリコールをポリ
エチレングリコールの代わりに使用できる；しかしなが
ら、再生効率はポリエチレングリコール３00と比べてお
よそ３分の２に低下する。最終再生混合物中の尿素濃度
は４から６Ｍの間をとることができるが、4.５−6.０Ｍ
で最高収率の再生ＮＧＦを生ずる。再生混合物における
pＨが８から10までの範囲で再生が起こるが、pH10が最
も速い再生を生ずる。最終再生混合物中のリン酸バッフ
ァー濃度は、１00から３00mMの間で最低に維持され、こ
の間リン酸塩バッファー対エタノールアミンの比は10：
１に維持される。
【０１３０】上記のようにして行われた再生の結果、代
表的には当初量の約30％以上のＮＧＦが正しく再生され
た生物活性型を生じた。Ｅ. コリから抽出されたＮＧＦ
を上記のように尿素およびメルカプトエタノール中で変
性および還元し、次にＲＰ−ＨＰＬＣ (約43％アセトニ
トリルで単一ピークとして出現) で精製する場合再生効
率は出発ＮＧＦの60％以上に増加する。このことは、
Ｅ. コリ抽出物中の混入物が、部分的に再生効率を妨げ
ることを示している。例えばイオン交換クロマトグラフ
ィーのようなＲＰ−ＨＰＬＣ以外の方法による再生に先
立ちＮＧＦの精製を行う場合も再生効率を高めることが
できる。 ３. 再生効率の測定 最終再生混合物中のＮＧＦの総量を以下のように測定し
た：還元条件下で泳動したＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色後、レーザー
デンシトメトリースキャンを行った。このゲルに於て、
一部のレーンはＮＧＦ目盛り用標準物質 (実施例３で述
べるバキュロウイルス、昆虫細胞−産物) を様々な濃度
で含有し、一方、他の一部のレーンは最終再生混合物の
一定部分を含有した。レーザーデンシトメトリーの光学
濃度とＮＧＦ標準タンパク質量との間に定量的な関係を
確立することによって、未知試料中のＮＧＦ量を測定で
きる。
【０１３１】最終再生混合物中で正しく再生されたＮＧ
Ｆ量は以下のようにして測定した：最終再生混合物の連
続希釈物を実施例３の実験補遺に記載のアッセイで、イ
ンビトロでニワトリ胚交感神経鎖ニューロンの生存促進
能について検査した。同じアッセイである濃度範囲の標
準昆虫細胞生産ＮＧＦもニューロン生存促進能について
検査した。バイオアッセイで半最大生存を生ずる最終再
生混合物の希釈度を半最大生存を生ずるのに必要な標準
ＮＧＦと同一濃度の正しく再生されたＮＧＦを含有する
とみなした。
【０１３２】これらの方法を用いて、上記の実験的な再
生で正しく再生されたＮＧＦ量を測定した。バイオアッ
セイに於ては、半最大生存を生ずるのに3.７ng／mlの昆
虫細胞生産ＮＧＦが必要であった。１：1500の希釈度の
最終再生混合物が半最大生存を生じたことから、その最
終再生混合物は (1500×3.７＝) 5550ng／mlの活性ＮＧ
Ｆを含有すると結論された。最終再生混合物中のＮＧＦ
の総量はレーザーデンシトメトリーによって 52000ng／
mlと概算され、このことは約11％の再生効率を示してい
る。
【０１３３】図９は標準昆虫細胞生産ＮＧＦのバイオア
ッセイ結果を示し、このＮＧＦは3.７ng／mlで半最大生
存を生じた。図10は最終再生混合物のバイオアッセイ結
果を示し、この試料は１：1500の希釈度で半最大生存を
生じた。 ４. Ｅ. コリで生産された再生ＮＧＦの精製および特性
決定 逆相高性能液体クロマトグラフィー (ＲＰ−ＨＰＬＣ)
を用いて、最終再生混合物中の生物学的に活性な再生Ｎ
ＧＦの精製および特性決定を行った。ＲＰ−ＨＰＬＣ条
件は以下の通りであった、すなわち溶媒Ａ＝水中0.１％
トリフルオロ酢酸 (ＴＦＡ) ；溶媒Ｂ＝アセトニトリル
中0.１％ＴＦＡ (すべてＨＰＬＣ等級試薬) ；カラム＝
VyDec C4 #214TP54 ；流量＝毎分１ml。試料は時間０で
注入しそして以下のプログラムで濃度勾配を展開した： 引き続いて再生試料を分析するためにカラムの目盛りづ
けをする目的で、天然に存在するＮＧＦおよび還元ＮＧ
Ｆの位置を決定した。％Ｂは、カラム溶離剤中の溶媒Ｂ
量である。昆虫細胞により生産された天然型ＮＧＦの試
料は約34％Ｂで溶出した。変性され還元された昆虫細胞
生産ＮＧＦの試料は約43％Ｂで溶出した。このＮＧＦ
は、２00mMトリス、pH8.５中の６Ｍ塩酸グアニジンおよ
び50mMジチオトレイトールに曝すことによって変性およ
び還元された。個々のＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、これら
二つの試料が溶出する正確な％Ｂを決定するために、こ
れら標準物質を用いた別々の目盛りを要した。
【０１３４】上記再生実験から得られた最終再生混合物
50μl において、天然ＮＧＦの位置でタンパク質ピーク
が出現した (図11Ｂ) 。再生前には、この位置にタンパ
ク質は全く溶出しなかった。100ng の天然型昆虫細胞生
産ＮＧＦを別の50μl 試料に添加した場合、この位置の
ＮＧＦピークの大きさは約二倍となった (図11Ａ) 。こ
のことにより、再生後に出現するタンパク質は天然型Ｎ
ＧＦと同じ位置で溶出することが確認され、また50μl
の最終再生混合物中にこの物質が約100ng 存在すること
も示された。交感神経ニューロン生存アッセイに於て、
ＲＰ−ＨＰＬＣ濃度勾配から収集したフラクションの生
物活性をアッセイした場合、このピークだけが検出可能
な生物活性を示した。このことにより、最終再生混合物
中におけるこのタンパク質のＮＧＦとしての同一性がさ
らに確認される。このピークの比活性は、天然型混合細
胞生産ＮＧＦで観察されたそれの範囲内であった (別の
日に行われた別々のアッセイに於て、半最大生存0.５−
５ng／ml) 。このように、Ｅ. コリ由来の再生ＮＧＦは
天然型昆虫細胞生産ＮＧＦの位置で溶出し、完全に生物
学的に活性である。
【０１３５】再生が上記実施例３. Ｂ. ２ａ. における
ようにして行われる場合は、再生ＮＧＦの精製を以下の
ようにして行うことができる。最終再生混合物を、例え
ば中空繊維フィルター／濃縮器のような濃縮装置を用い
て約20倍に濃縮する。次にこの濃縮物を10−20倍容の尿
素含有バッファーで透析する。使用するバッファーは50
mM酢酸ナトリウム、pH5.０であり、これは再生ＮＧＦが
このバッファー中に可溶せでかつこのバッファー中で安
定であり、そしてその pＨが後続の陽イオン交換クロマ
トグラフィーに適しているためである。透析バッファー
は、透析後の最終尿素濃度が1.５−２Ｍとなるに十分な
尿素を包含する。これによって、逆相ＨＰＬＣにより判
定されるように、Ｅ. コリタンパク質および正しく再生
されなかったＮＧＦを沈澱させることが可能となる。
【０１３６】透析した試料を遠心して沈澱をペレットと
し、次に50mM酢酸ナトリウム、 pH5.０中のＳ−セファ
ロースにかける。このカラムを洗浄し、0.05−1.５Ｍ N
aClの直線塩濃度勾配を用いて溶出させる。ＮＧＦは逆
相ＨＰＬＣによって均質となるまで精製させる。図12は
最終再生混合物の逆相ＨＰＬＣ (ＲＰ−ＨＰＬＣ) タン
パク質プロフィールを示す。正しく再生されたＮＧＦが
主要なタンパク質ピークであり、約37％アセトニトリル
で溶出する。図13は、濃縮および透析後ではあるがＳ−
セファロースでのクロマトグラフィー前の最終再生混合
物のＲＰ−ＨＰＬＣタンパク質プロフィールを示す。約
47％アセトニトリルで溶出する (図12) 再生されないＮ
ＧＦを包含する、図12で見られる他のタンパク質の混入
が有意に減少しそして正しく再生されたＮＧＦは実質的
に純粋である。図14は、Ｓ−セファロースでのクロマト
グラフィー後の試料のＲＰ−ＨＰＬＣタンパク質プロフ
ィールを示す。ほとんどすべての混入タンパク質が除去
されている。再生ＮＧＦの主要ピークのすぐ後に溶出す
る小ピークは、再生されたＮＧＦの単量体である。約37
％アセトニトリルで溶出する主要ピークは再生ＮＧＦの
二量体である。
【０１３７】逆相−精製されたＮＧＦのニワトリ胚交感
神経細胞生存バイオアッセイに於ける比活性は、E.D.50
＝0.17±0.01ng／mlであった。比較すると、昆虫細胞で
生産されたヒト組換えＮＧＦ (実施例３記載) の比活性
は、E.D.50＝0.26±0.02ng／mlであった。このことは、
Ｅ. コリで生産され、ここで記載される方法によって再
生および精製された再生ＮＧＦが完全に生物学的に活性
であることを証明している。
【０１３８】Ｃ. 成熟ヒトＢＤＮＦの再生 上記実施例１Ｄに記載されるようにして、Ｅ. コリで生
産された組換え成熟ヒトＢＤＮＦを、上記実施例３Ｂ記
載の方法にしたがって再生することにより生物学的に活
性なものにする。 Ｄ. 成熟ＮＧＦ−３の再生 下記実施例４記載のような成熟ヒトＮＧＦ−３を、上記
実施例３Ｂ記載の方法にしたがって再生することにより
生物学的に活性となす。 実施例３の実験補遺 １. ＮＧＦおよびＢＤＮＦのバイオアッセイ ニワトリ胚交感神経鎖および後根神経節の培養物を前記
のようにして調製した(Collins および Lile 1989 Brai
n Research 502: 99)。簡単に説明すると、交感神経ま
たは後根神経節を、加湿環境中、38℃で８−11日間イン
キュベートされた、病原体に汚染されていない受精卵か
ら取り出した。その神経節を、最初に10mM ＨＥＰＥＳ
バッファーpH7.２を含有し２価カチオンを含有しないハ
ンクス平衡塩類溶液に37℃で10分間曝し、次に上記のよ
うに改変されたハンクス平衡塩類溶液中 0.125％バクト
トリプシン１：250 (Difco, Detroit, Michigan)の溶液
に37℃で12分間曝すことによって化学的に解離させた。
ウシ胎児血清を最終濃度10％となるまで添加することに
よってトリプシン処理を停止させた。この処理後、神経
節を、10％ウシ胎児血清および10mM ＨＥＰＥＳ, pH7.
２を含有し炭酸水素塩を含有しないダルベッコ高グルコ
ース改変イーグル培地からなる溶液に移し、約10回ガラ
ス製パストゥールピペットを通して粉砕することにより
機械的に解離させた。このパストゥールピペットの開口
部は予め口焼きされ、そのピペットを満たすのに２秒か
かるように直径にすぼめられている。次に、解離した神
経節を100mm 直径の組織培養皿内の培養培地 (10％ウシ
胎児血清、４mMグルタミン、60mg／１ペニシリン−Ｇ、
25mM ＨＥＰＥＳ, pH7.２を添加したダルベッコ改変イ
ーグル培地) に塗布して３時間おいた (培養皿当り解離
神経節40) 。皿に付着する非ニューロン細胞を付着しな
い神経細胞から分離するために、このようにプレ塗布を
行った。３時間後、付着しない神経細胞を遠心によって
収集し、培養培地に再懸濁し、96ウェルミクロタイター
組織培養プレートの半分の領域に、ウェル当り1500個の
神経細胞の密度で、ウェル当り50μl として塗布した。
塗布の前に、そのミクロタイターウェルは10mMホウ酸ナ
トリウム、pH8.４に溶解したポリ−Ｌ−オルニチンの１
mg／ml溶液に４℃で一晩曝し、蒸留水で洗浄しそして風
乾しておいた。
【０１３９】神経栄養活性に関してアッセイすべき試料
の連続希釈物10μl を各ウェルに添加し、その皿を7.５
％CO2 含有加湿環境下37℃で20時間インキュベートし
た。18時間後、10mM ＨＥＰＥＳ, pH7.２を含有し炭酸
水素塩を含まないダッベッコ高グルコース改変イーグル
培地中のテトラゾリウム色素ＭＴＴの1.５mg／ml溶液
を、ウェル当り15μl 添加し、培養物を37℃のインキュ
ベーターに戻して４時間置いた。次に、6.７mlの12Ｍ
ＨＣｌを１リッターのイソプロパノールに溶解した溶液
75μl を添加し、そして各ウェルの内容物を30回ピペッ
トを通して粉砕して細胞を破壊し、色素を懸濁させた。
自動ミクロタイターリーダー (Dynatech, Chantilly, V
irginia)を用いて、570nm での吸光度を各ウェルに関す
る690nm の標準値と比較して測定した。何ら神経栄養性
物質を加えなかったウェルの吸光度 (陰性対照) を試料
含有ウェルの吸光度から引算した。得られた吸光度は、
各ウェル内に生存する細胞数と比較し、そして色素還元
能を有する神経細胞として定義される。ml当りの栄養ユ
ニット (ＴＵ) で表される栄養活性の濃度は、神経細胞
の最大生存の50％を生ずる希釈度と定義された。例え
ば、１：100,000 希釈した場合に試料が50％最大生存を
生ずる場合、その力価は 100,000TU／mlと定義された。
比活性は、ml当りの栄養ユニット数を未希釈試料のml当
りのタンパク質濃度で割ることによって決定された。 実施例４：ＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養性タンパク質
の新規メンバー、ＮＧＦ−３のクローニング Ａ. ＮＧＦ−３のＤＮＡフラグメントを増幅するための
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション (ＰＣＲ) の利
用 種々の種の成熟 (プロセシングされた) ＮＧＦおよびブ
タおよびヒトのＢＤＮＦをコードする核酸配列の高度に
保存された領域に基づいて、二つの部分的に縮重したオ
リゴヌクレオチド、ＮＮＦ−１およびＮＮＦ−３を合成
した。これらをヌクレオチドの配列、および増幅フラグ
メントのサブクローニングを容易にするために挿入され
た5'制限部位を以下に示す。 (Ｉ＝イノシン)
【０１４０】
【０１４１】ＮＮＦ−１およびＮＮＦ−３をＰＣＲ (実
施例１の実験補遺参照) のプライマーとして用い、ヒト
ゲノムＤＮＡを鋳型とした。ＰＣＲ産物を３％アガロー
スゲルで電気泳動し、そして予想される大きさの 150−
200bp 付近の蛍光ＤＮＡバンドをゲルから切り出し、平
滑末端連結によってSmaI−切断ファージＭ13mp10にクロ
ーニングした。生成する連結反応液をＥ. コリＴＧ１株
上に塗布し、２連のリフトをとった。第一のリフトは、
ＰＣＲによって得られたランダムに標識したヒトＢＤＮ
Ｆコード配列と高い緊縮条件下でハイブリッド形成した
(実施例１参照) 。第二のリフトは、British Biotech
から入手したランダムに標識したヒトＮＧＦ成熟タンパ
ク質コード配列と高い緊縮条件下にハイブリッド形成し
た (実施例１参照) 。いずれか一方のプローブとハイブ
リッド形成したプラークは、それ以上追跡しなかった。
ベータ−ガラクトシダーゼを生産できないことによって
示される、挿入物を含有する残りすべてのプラークを配
列決定した。かかるプラークの一つ内のファージ、ＮＮ
Ｆ−18、は136bp の増幅されたＤＮＡフラグメントをオ
リゴヌクレオチドＮＮＦ−１およびＮＮＦ−３の間に含
有し、このフラグメントはヒトＮＧＦと53％等しく、ヒ
トＢＤＮＦと44％同一なタンパク質フラグメントをコー
ドしていた (図７) 。アミノ酸相同性の一部はＮＧＦお
よびＢＤＮＦの双方に対するものであり、また一部はＮ
ＧＦまたはＢＤＮＦの一方に対する相同性である (図
７) 。ＮＧＦ−３フラグメントは、ＮＧＦおよびＢＤＮ
Ｆの二つが相互に担持するのとほぼ等しい相同性をＮＧ
ＦまたはＢＤＮＦに対して有する(図７) 。図６で、こ
のフラグメントのＤＮＡ配列に下線を付し、ここでＮＧ
ＦおよびＢＤＮＦと比較する。これらの相同性に基づけ
ば、このフラグメントはＮＧＦ／ＢＤＮＦ群の神経栄養
性タンパク質の新規メンバーの遺伝子から増幅されたと
結論された。この新規遺伝子およびタンパク質をＮＧＦ
−３と命名した。
【０１４２】Ｂ. ＮＧＦ−３のヒト遺伝子をクローニン
グするためのＰＣＲ増幅ＤＮＡの利用 上記のようにしてＰＣＲによって増幅されたＮＧＦ−３
のＤＮＡフラグメントを、32Ｐ−ｄＣＴＰの存在下ＰＣ
Ｒ増幅を行うことにより放射性標識し、そしてこれを用
いてラムダＦＩＸIIのヒトゲノムライブラリー ( Strat
agene カタログno. 946203) をスクリーニングした。ク
ローニングを繰り返すことによって、1.２×106個のプ
ラークから６個の陽性クローンを精製した。制限酵素Hi
ncIIを用いた、一陽性クローン由来のＤＮＡの部分消化
物をベクターＭ13にサブクローニングした。放射性標識
ＰＣＲフラグメントとハイブリッド形成した数個のＭ13
サブクローンを上記実施例１Ｂ記載の方法にしたがって
両方向から配列決定して、ヒトＮＧＦ−３の完全な核酸
配列 (図６) および推定アミノ酸配列 (図７) を得た。
【０１４３】 Ｃ. Ｅ. コリでの成熟ヒトＮＧＦ−３の発現 上記実施例４Ｂ記載のようにして得られたヒト成熟ＮＧ
Ｆ−３遺伝子をＥ. コリ発現ベクターに挿入し、そのベ
クターをＥ. コリ宿主細胞に導入しそして上記実施例２
記載の方法に従い、ＮＧＦ−３遺伝子をＮＧＦ遺伝子に
代えて用いることにより遺伝子を発現させて成熟ＮＧＦ
−３を生産させる。次に、組換え発現タンパク質を上記
実施例３Ｂ記載の方法にしたがって再生することにより
生物学的に活性となす。
【０１４４】上記説明および実施例は本発明およびその
好ましい実施態様を説明するために示す。本文記載の方
法の多数の改変は当業者に明白であって下記請求の範囲
内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＢＤＮＦの核酸および推定アミノ酸配列を
示す。成熟 (プロセッシングを受けた) 形ＢＤＮＦの推
定アミノ酸配列を太字で示す。
【図２】 ベクターｐＴ５Ｔを用いたＥ．ｃｏｌｉにお
けるヒト成熟（プロセッシングを受けた）ＮＧＦの発現
を示す電気泳動図の写真である。
【図３】真核細胞により生産された成熟ヒトＮＧＦの変
性および再生の際の、それぞれの生物学的活性の低下お
よび回復を示す。
【図４】細菌発現ベクターｐＴ５Ｔのいくつかの特徴を
示す。
【図５】細菌発現ベクターｐＴ３ＸＩ−２のいくつかの
特徴を示す。
【図６】ＮＧＦ−３の核酸配列とＮＧＦおよびＢＤＮＦ
の配列とを比較して示す。
【図７】ＮＧＦ−３のアミノ酸配列をＮＧＦおよびＢＤ
ＮＦの配列と比較して示す。
【図８】ヒトＢＤＮＦ挿入物を含むかまたは含まないプ
ラスミドｐＳＧ５でトランスフェクトされたＣＯＳ−７
細胞の抽出物の、Ｅ10ニワトリ背根神経節ニューロンを
使ったバイオアッセイを示す。
【図９】Ｅ11ニワトリ胚交感神経節ニューロンに対する
バイオアッセイを用いた、昆虫細胞により生産されたヒ
ト組み換えＮＧＦの用量−応答曲線を示す。
【図10】Ｅ11ニワトリ胚交感神経節ニューロンに対する
バイオアッセイを用いた、E.coliにより生産されたヒト
組み換えＮＧＦの最終再生混合物の連続希釈物の生物学
的活性を示す。
【図11】(Ａ) 100ng の天然の、昆虫細胞により生産さ
れたＮＧＦを加えた図10でアッセイした最終再生混合物
50μl ；および (Ｂ) 天然の、昆虫細胞により生産され
たＮＧＦを加えなかった最終再生混合物50μl ；の逆相
高性能液体クロマトグラフィーによる分析を示す。
【図12】精製前の最終再生混合物を逆相ＨＰＬＣにより
Ｃ４カラムでクロマトグラフィーにかけた場合の蛋白の
溶離プロフィール (214nmでの光学濃度) を示す。
【図13】透析および濃縮後であるがＳ−セファロース前
の最終再生濃度を逆相ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロ
マトグラフィーにかけた場合の蛋白の溶離プロフィール
(214nmでの光学濃度) を示す。
【図14】Ｓ−セファロースで精製後の最終再生混合物を
逆相ＨＰＬＣによりＣ４カラムでクロマトグラフィーに
かけた場合の蛋白の溶離プロフィール (214nm での光学
濃度) を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン ベックテッシュ アメリカ合衆国 コロラド州 80302, ボウルダー，34番ストリート 3344 (72)発明者 ドリツラヴ ミスマー アメリカ合衆国 コロラド州 80303, ボウルダー，ベンタヴェン 76 (72)発明者 タダヒコ コウノ アメリカ合衆国 コロラド州 80027, ルイスヴィル，ヘイズ コート 1557 (56)参考文献 特開 平５−328974（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−84299（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−28199（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−161493（ＪＰ，Ａ) ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＩＥＳ，ＶＯ Ｌ．３，ＮＯ．４（1985），ＰＰ．298 〜306 ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．247 （1990），ＰＰ．1446〜1451 ＮＡＴＵＲＥ，ＶＯＬ．344（1990）, ＰＰ．339〜341

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 原核細胞内で組換えにより発現させた神
    経栄養性タンパク質を再生・復元する方法であって、前
    記タンパク質が実質的に完全な生物学的活性を獲得し、
    前記神経栄養性タンパク質がＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリ
    ーの神経栄養性タンパク質のひとつであり、以下の工
    程； （ａ）変性剤および還元剤を前記神経栄養性タンパク質
    を含有する溶液に添加することにより、該溶液中ですべ
    ての分子内および分子間ジスルフィド結合を破壊して、
    遊離チオールを形成させ、 （ｂ）ジスルフィド含有化合物で前記遊離チオールを酸
    化して、混合ジスルフィド結合を形成させ、 （ｃ）チオール含有化合物の存在下で前記溶液を希釈
    し、そして （ｄ）前記神経栄養性タンパク質を単離するを含む前記
    の方法。
  2. 【請求項２】 神経栄養性タンパク質がＮＧＦ、ＢＤＮ
    ＦまたはＮＧＦ−３である、請求項１記載の神経栄養性
    タンパク質を再生・復元する方法。
  3. 【請求項３】 原核細胞が細菌である、請求項１記載の
    神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
  4. 【請求項４】 細菌が大腸菌である、請求項３記載の神
    経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
  5. 【請求項５】 上記（ｃ）の工程で得られる再生混合物
    が嫌気的条件下に維持される、請求項１記載の神経栄養
    性タンパク質を再生・復元する方法。
  6. 【請求項６】 上記（ｃ）の工程で前記溶液がグリコー
    ル含有試薬を含有する緩衝液で希釈される、請求項１記
    載の神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
  7. 【請求項７】 グリコール含有試薬がポリエチレングリ
    コールである、請求項６記載の神経栄養性タンパク質を
    再生・復元する方法。
  8. 【請求項８】 変性剤がグアニジン塩酸塩または尿素で
    ある、請求項１記載の神経栄養性タンパク質を再生・復
    元する方法。
  9. 【請求項９】 ジスルフィド含有化合物が酸化型のグル
    タチオン、シスチンまたはシスタミンである、請求項１
    記載の神経栄養性タンパク質を再生・復元する方法。
  10. 【請求項１０】 チオール含有化合物がシステインまた
    はジチオトレイトールである、請求項１記載の神経栄養
    性タンパク質を再生・復元する方法。
  11. 【請求項１１】 原核細胞内で組換えにより発現させた
    神経栄養性タンパク質を折り畳む方法であって、前記タ
    ンパク質は生物学的活性を獲得し、前記神経栄養性タン
    パク質がＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タン
    パク質のひとつであり、以下の工程； 前記神経栄養性タンパク質を８モル尿素含有２０ｍＭク
    エン酸ナトリウム、ｐＨ約３．０、中に約０．６ｍｇ／
    ｍｌの濃度まで溶解させ、 ８モル尿素含有１Ｍトリス溶液、ｐＨ約８．５、を加え
    て前記溶液のｐＨを上げ、約５〜１５ｍＭの濃度までジ
    チオトレイトールを加えて前記神経栄養性タンパク質を
    還元し、 約１５〜５０ｍＭの濃度まで酸化型のグルタチオンまた
    はシスチンを加えて前記神経栄養性タンパク質を酸化
    し、 約３．２〜４．２Ｍ尿素含有１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ
    ４、ｐＨ約８．０、の溶液を用いて、神経栄養性タンパ
    ク質の前記溶液を約９倍に希釈し、 グルタチオンまたはシスチンの濃度に対して約２〜３倍
    のシステインを加えて前記神経栄養性タンパク質のジス
    ルフィド相互変換を触媒させ、そして前記反応混合物か
    ら前記神経栄養性タンパク質を単離するを含む前記の方
    法。
  12. 【請求項１２】 神経栄養性タンパク質がＮＧＦ、ＢＤ
    ＮＦまたはＮＧＦ−３である、請求項１１記載の神経栄
    養性タンパク質を折り畳む方法。
  13. 【請求項１３】 原核細胞が細菌である、請求項１１記
    載の神経栄養性タンパク質を折り畳む方法。
  14. 【請求項１４】 細菌が大腸菌である、請求項１３記載
    の神経栄養性タンパク質を折り畳む方法。
  15. 【請求項１５】 原核細胞内で組換えにより発現させた
    神経栄養性タンパク質を折り畳む方法であって、前記タ
    ンパク質は生物学的活性を獲得し、前記神経栄養性タン
    パク質がＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーの神経栄養性タン
    パク質のひとつであり、以下の工程； 前記神経栄養性タンパク質を含有する溶液にジチオトレ
    イトールまたはβ−メルカプトエタノールを加え、 前記溶液に酸化型グルタチオンまたはシスタミンを加
    え、 グリコール含有試薬を含有する緩衝溶液を用いて前記溶
    液を希釈し、 システインまたは２−メルカプトエチルアミンを加えて
    最終再生混合物を生成させ、 前記最終再生混合物を脱気し、そして前記最終再生混合
    物から前記神経栄養性タンパク質を単離するを含む前記
    の方法。
  16. 【請求項１６】 神経栄養性タンパク質がＮＧＦ、ＢＤ
    ＮＦまたはＮＧＦ−３である、請求項１５記載の神経栄
    養性タンパク質を折り畳む方法。
  17. 【請求項１７】 原核細胞が細菌である、請求項１５記
    載の神経栄養性タンパク質を折り畳む方法。
  18. 【請求項１８】 細菌が大腸菌である、請求項１７記載
    の神経栄養性タンパク質を折り畳む方法。
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