IT202000032423A1 - Metodo per la produzione di forme processate proteoliticamente di fattori trofici o fattori di crescita - Google Patents

Metodo per la produzione di forme processate proteoliticamente di fattori trofici o fattori di crescita Download PDF

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Enrico Tongiorgi
Laura GIARETTA
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Description

METODO PER LA PRODUZIONE DI FORME PROCESSATE
PROTEOLITICAMENTE
DI FATTORI TROFICI O FATTORI DI CRESCITA
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un metodo per produrre un polipeptide ricombinante processato e purificato codificante per una neurotrofina. In particolare, la neurotrofina ? preferibilmente scelta tra BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) ed NGF (Nerve Growth Factor).
STATO DELLA TECNICA
Il BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) ? un polipeptide appartenente alla famiglia delle neurotrofine che regola la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni e contribuisce allo sviluppo della plasticit? sinaptica. La somministrazione diretta di BDNF per il trattamento di lesioni ai nervi periferici ? considerata una promettente ed efficace strategia, ad esempio per la rigenerazione e il ripristino della sensibilit? del nervo ottico o del nervo sciatico. Il BDNF ? anche un potente agente neuroprotettivo per i neuroni del sistema nervoso centrale, e perci? ? stato sperimentato come potenziale trattamento di patologie neurodegenerative (ictus, malattia di Alzheimer, corea di Hungtington) e in alcune malattie psichiatriche (depressione, schizofrenia, disordini bipolari). Inoltre, ? stato dimostrato un ruolo del BDNF nella rigenerazione ossea e nella formazione dei legami con il periostio delle fibrille connettivali di Sharpey.
Il BDNF, insieme ad altri supplementi, viene anche utilizzato per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) derivate da pazienti con malattie genetiche in cellule progenitrici e quindi in cellule differenziate adulte. Quest?ultime, portatrici degli stessi geni difettosi dei pazienti, vengono utilizzate dall?industria farmaceutica come modello in vitro di patologie umane e per l?high throughput drug screening di ampie librerie di composti chimici finalizzato all?identificazioni di potenziali farmaci. In alternativa, le cellule progenitrici o le cellule adulte derivate da hPSC, sono utilizzate per trapianti volti alla riparazione e al rimpiazzo di tessuti. Inoltre, BDNF ? considerato un potenziale agente di riparazione dei tessuti e quindi applicato localmente in matrici solide o gel o mediante carrier costituiti da capsule porose o nano-particelle per il rilascio controllato.
La produzione di BDNF ricombinante (hrBDNF ? human recombinant BDNF) ? pertanto di interesse per l?industria farmaceutica farmaceutica interessata al drug screening su substrati cellulari e all?industria biotech per la produzione di terapie basate sul BDNF stesso, nonch? per le aziende che producono prodotti per la ricerca (accademica) di base.
Tuttavia, i tentativi di espressione in sistemi eterologhi non hanno dato ad oggi risultati soddisfacenti. Ad oggi il BDNF ricombinante umano (hrBDNF) ? stato prodotto con risultati piuttosto deludenti in lievito (Nishizawa et al., 1993; Burns et al., 2016), Escherichia coli (Hoshino et al., 2002; Fukuzono et al., 1995) e in cellule d?insetto (Negro et al., 1994). L?accumulo della proteina ricombinante nei corpi di inclusione di E. coli, e la mancanza di un apparato post-traduzionale concorrono a un folding parziale e a una conseguente limitata attivit? biologica (Philo et al., 1993). Nelle cellule di lievito e di insetto, l?apparato post-traduzionale non consente invece un?adeguata glicosilazione, essenziale per il folding di BDNF. Le cellule di mammifero eseguono le necessarie modificazioni post-traduzionali della proteina nonch? l?acquisizione della corretta struttura quaternaria tanto che la proteina ricombinante risulta biologicamente attiva, ma le rese di espressione e purificazione risultano estremamente basse.
Analogamente al BDNF, anche l?NGF (Nerve Growth Factor) ? un polipeptide appartenente alla famiglia delle neurotrofine che regola la sopravvivenza e la differenziazione di alcune sottopopolazione di neuroni del sistema nervoso centrale e periferico, contribuisce allo sviluppo della plasticit? sinaptica ed ? coinvolto nella regolazione della risposta immunitaria (Engelhardt et al., 2007). Livelli elevati di NGF correlano con l?infiammazione, soprattutto a livello degli epiteli. Inoltre, la somministrazione topica di NGF ? considerata una promettente ed efficace strategia ad esempio per il trattamento di ulcere corneali e della pelle, maculopatie della retina, Retinite Pigmentosa, glioma ottico pediatrico e trami cerebrali (Aloe et al., 2008; Rocco et al., 2018 ? patents: US20090118177A1; WO2000044396A1). Il 14 Dicembre 2015 ? stata concessa dall?agenzia del farmaco europea alla Domp? farmaceutici S.p.A., Italy la designazione di farmaco orfano (orphan designation EU/3/15/1586) per un preparato a base di NGF umano ricombinante nella formulazione di gocce oculari per uso topico con il nome di Cenegermin per il trattamento della cheratopatia neurotrofica dell?occhio (NK = neurotrophic keratopathy) e recenti studi clinici ne hanno dimostrato l?elevata efficacia (Zwingelberg et al., 2020).
Altro aspetto fondamentale ? che il BDNF ed altri fattori neurotrofici (per es. NGF, NT3, NT4) richiedono un taglio proteolitico per generare la forma matura a partire dal precursore. Tale taglio proteolitico avviene di norma all?interno del reticolo endoplasmico o, in alternativa nelle cisterne dell?apparato del Golgi o nelle vescicole secretorie. Tuttavia gli organelli della via secretoria sono del tutto assenti nei batteri e alcune proteasi non sono presenti o sono molto diverse nelle cellule di lievito e di insetto.
Ad esempio, US5235043 descrive procedimenti per la produzione di proteine umane ricombinanti delle famiglie BDNF ed NGF. I metodi descrivono la produzione dei fattori neurotrofici nel batterio E.coli utilizzando un protocollo per la purificazione da colture batteriche e re-folding della proteina.
Le cellule di mammifero pur possedendo un apparato post-traduzionale adeguato non consentono la produzione di elevati quantitativi di proteina e non potrebbero pertanto sostenere le richieste dell?industria farmaceutica. BDNF, come altri fattori neurotrofici, ? espresso dapprima come pro-proteina (pro-BDNF) che in seguito pu? subire due diversi tagli proteolitici: in un primo caso la catena polipeptidica ? tagliata a circa met? della sua lunghezza e dar? origine alla forma matura (mBDNF), in un secondo caso il taglio a circa un terzo dall?estremit? N-terminale della pro-proteina dar? origine alla forma cosiddetta troncata (truncBDNF).
Delle tre forme proteiche di BDNF ad oggi individuate (pro-, matura e troncata), si sa che le forme pro- e matura possiedono attivit? biologica (Koshimizu et al. 2009) e sono quindi interessanti per future applicazioni volte alla riparazione dei tessuti. Invece, per la terza forma, detta troncata, l?attivit? biologica ? ignota.
Il precursore proBDNF di 32-kDa pu? essere processato nella forma matura di 14-kDa sia a livello intracellulare da parte della furina (Mowla et al., 2001), che a livello extracellulare dalla matrix metalloprotease-7 (MMP-7) (Lee et al., 2001). ProBDNF mostra funzioni distinte e opposte rispetto al BDNF maturo, riducendo le spine dendritiche e inducendo apoptosi e depressione a lungo termine nei neuroni in coltura, mentre il BDNF maturo promuove la formazione delle spine, la sopravvivenza neuronale e il potenziamento a lungo termine (Pang et al., 2004; Woo et al., 2005; Koshimizu et al., 2009). Ci? suggerisce che uno squilibrio tra proBDNF e BDNF maturo pu? contribuire a disturbi neurodegenerativi o psichiatrici. Attraverso una diversa scissione, proBDNF produce l?isoforma truncBDNF di 28 kDa.
Per quanto riguarda l?NGF, il suo precursore proNGF di 30-kDa pu? essere processato nella forma matura di 13.5-kDa sia a livello intracellulare da parte della furina (Lim et al., 2007), che a livello extracellulare dalla plasmina (Lee et al., 2001). ProNGF mostra funzioni distinte e opposte rispetto all?NGF maturo, riducendo le spine dendritiche e inducendo apoptosi e depressione a lungo termine nei neuroni in coltura, mentre l?NGF maturo promuove la formazione delle spine, la sopravvivenza neuronale e il potenziamento a lungo termine. Livelli elevati di proNGF sono stati rilevati nel cervello di pazienti affetti dal morbo di Alzheimer (Fahnestock et al., 2001), o in seguito a lesioni traumatiche del sistema nervoso centrale (Harrington et al., 2004). Analogamente al BDNF, anche l?NGF possiede un sito di taglio proteolitico alternativo a quello canonico per la furina, che ? riconosciuto dalla proteasi matrix metalloprotease-7 (MMP-7) e genera una forma intermedia di circa 17-22-kDa (Lee et al., 2001) la cui funzione ? sconosciuta.
Visto l?interesse alla produzione dei fattori neurotrofici ricombinanti da parte dell?industria farmaceutica, unitamente alle difficolt? nella purificazione delle forme farmacologicamente attive quando la produzione avviene nei sistemi batterici, occorre identificare un sistema per la generazione esclusiva della proteina matura, processata dalle proteasi.
Scopo della presente invenzione ? quello di identificare un procedimento che permetta la produzione delle proteine ricombinanti in forma matura, gi? processate dalle proteasi, senza la necessit? di ulteriori passaggi di purificazione.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un metodo per produrre un polipeptide ricombinante processato e purificato avente le seguenti fasi:
a. coltivare una cellula di eucariotica comprendente un acido nucleico codificante il precursore di detto polipeptide (pro-polipeptide) ed un acido nucleico codificante una proteasi;
b. permettere a detta proteasi di tagliare proteoliticamente detto pro-polipeptide per ottenere il polipeptide ricombinante processato;
c. recuperare detto polipeptide ricombinante processato e purificato dal mezzo di coltura di detta cellula di mammifero,
in cui detto polipeptide ricombinante processato codifica per una neurotrofina scelta dal gruppo consistente in BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) ed NGF (Nerve Growth Factor).
La presente invenzione, tramite la coespressione nella stessa cellula eucariotica del precursore e della proteasi specifica, consente una produzione del fattore maturo direttamente nella via secretoria con rilascio del prodotto finale direttamente nel mezzo di coltura, facilitandone cos? la produzione e la purificazione su larga scala.
Le rivendicazioni dipendenti descrivono forme di realizzazione particolari dell?invenzione.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate. Figura 1: schema della strategia di espressione ed il processo di maturazione di BDNF. Inizialmente BDNF ? espresso nel reticolo endoplasmatico come pro-proteina la quale, dopo il taglio del signal peptide (SP), viene indirizzata al Golgi; in questo compartimento il taglio da parte di specifiche proteasi (Furina o SKI-1) dar? origine alla forma matura o alla forma troncata.
Figura 2: espressione di BDNF in cellule CHO ed in particolare la Figura 2A: Western blot di lisati di cellule CHO co-trasfettate con i vettori pcDNA3.1_Furin e pcDNA3.1_BDNF in rapporto 1:10 (FURIN:BDNF (1:10)) confrontate con il lisato di cellule trasfettate solo con il vettore pcDNA3.1_BDNF (BDNF). Si notano le due bande in corrispondenza di pro-BDNF (30 kDa e 32 kDa) e della forma matura (12 kDa e 14 kDa). Controllo negativo (CNTR -): cellule CHO non trasfettate. Figura 2B: Western blot degli eluati derivati dalla purificazione tramite cromatografia di affinit? del medium delle stesse cellule CHO co-trasfettate con i vettori pcDNA3.1_Furin e pcDNA3.1_BDNF in rapporto 1:10 (FURIN:BDNF (1:10)). Per tutti i western blot ? stato utilizzato un anticorpo specifico anti-BDNF.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
La presente invenzione riguarda quindi un metodo per produrre un polipeptide ricombinante processato e purificato avente le seguenti fasi:
a. coltivare una cellula di eucariotica comprendente un acido nucleico codificante il precursore di detto polipeptide (pro-polipeptide) ed un acido nucleico codificante una proteasi;
b. permettere a detta proteasi di tagliare proteoliticamente detto pro-polipeptide per ottenere il polipeptide ricombinante processato;
c. recuperare detto polipeptide ricombinante processato e purificato dal mezzo di coltura di detta cellula di mammifero,
in cui detto polipeptide ricombinante processato codifica per una neurotrofina scelta dal gruppo consistente in BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) ed NGF (Nerve Growth Factor).
Sorprendentemente mediante il metodo della presente invenzione che prevede la coespressione nella stessa cellula eucariotica del precursore di un fattore neurotrofico e della sua proteasi specifica, consente la produzione della proteina matura direttamente che viene recuperata direttamente dal mezzo di coltura, facilitandone cos? la produzione e la purificazione su larga scala.
La sequenza codificante per il fattore trofico o di crescita (neurotrofina) nella forma immatura e la sequenza codificante l?enzima proteolitico possono essere inserite nello stesso vettore di espressione o in due vettori diversi che devono essere co-espressi nella stessa cellula.
In una forma di realizzazione, nel metodo secondo la presente invenzione, detto acido nucleico codificante una proteasi corrisponde all?acido nucleico codificante una proteasi scelta dal gruppo consistente in Furina e SKI-1.
Nella presente invenzione quando si impiega la definizione:
- ?furina? si intende comprendere un enzima appartenente alla classe delle idrolasi che catalizza il rilascio di proteine mature a partire da precursori attraverso il taglio proteolitico;
- ?SKI-1? si intende l?enzima subtilisin/kexin-isozyme 1 (SKI-1) (EC 3.4.21.112) codificato dal gene MBTPS1 nell?uomo, e necessario per il taglio proteolitico per ottenere le forme troncate delle neurotrofine, ad esempio trucBDNF.
In una ulteriore forma di realizzazione, nel metodo secondo la presente invenzione, detto polipeptide ricombinante processato e purificato che viene recuperato nella fase c. ? la forma matura o la forma troncata di detto polipeptide ricombinante. Preferibilmente detta forma matura ? la forma matura di BDNF (mBDNF) e detta forma troncata ? l?isoforma troncata di BDNF (truncBDNF).
La proteina BDNF con tag di istidina (SEQ ID NO:4) corrisponde alla sequenza:
MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLT SLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKN YLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVP VSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIG WRFIRIDTSCVCTLTIKRGRHHHHHH
Sottolinato: sequenza segnale.
In grassetto: cleavage site per SKI-1 (RGLT|SL) (posizione 54-59)
Sottolinato grassetto: cleavage site per Furin (RVRR|HS) (posizione 125-128) Corsivo: tag di istidine (His-tag).
La proteina BDNF-2U (SEQ ID NO:1), non pu? essere tagliata da SKI-1 n? da Furina (SKI-1 and Furin uncleavable) e corrisponde alla sequenza:
MTILFLTMVISYFGCMKAAPMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSAGAT SLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKN YLDAANMSMRVAAHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVP VSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIG WRFIRIDTSCVCTLTIKRGRHHHHHH
Sottolinato: sequenza segnale.
Corsivo: tag di istidine (His-tag).
Sottolinato grassetto: siti di mutazione.
In ancora un?altra forma di realizzazione, nel metodo secondo la presente invenzione il precursore di detto polipeptide ha un TAG all?estremit? carbossi-terminale. Preferibilmente il TAG all?estremit? carbossi-terminale ? [elencare i diversi TAG].
Sorprendentemente nel metodo della presente invenzione, si arriva alla produzione di un fattore trofico o di un fattore di crescita in forma matura o troncata, tramite l?espressione nella stessa cellula eucariotica di una sequenza codificante un fattore trofico o di crescita nella forma immatura, assieme alla sequenza codificante l?enzima che lo taglia proteoliticamente per ottenere la forma matura o troncata, e tale forma matura o troncata si trova direttamente nel mezzo di coltura.
Fino ad ora, non si era mai riusciti ad ottenere la forma matura o troncata direttamente nel mezzo di coltura cellulare, ma erano necessari passaggi di purificazione. Infatti, nel caso della espressione in colture batteriche, le proteine prodotte vengono ritenute nel citoplasma delle cellule, largamente sotto forma di corpi di inclusione, richiedendo il trattamento con agenti denaturanti per essere estratte. Di conseguenza, in seguito alla purificazione su colonna cromatografica, sono necessari due ulteriori trattamenti: un trattamento con proteasi per il taglio della proteina matura, ed un trattamento di ripiegamento (?re-folding?) per indurre la proteina ad assumere nuovamente la forma nativa biologicamente attiva. Tale processo di estrazione, purificazione e ripiegamento delle proteine prodotte in batteri ? meno efficiente e pi? laborioso rispetto al metodo qui descritto che consente la purificazione della proteina ricombinante, gi? processata proteolicamente, su colonna cromatografica senza ulteriori passaggi. Per quanto riguarda invece le neurotrofine prodotte in cellule eucariotiche come cellule di insetto (per esempio delle specie Drosophila melanogaster, Antherea eucalypti o Spodeptera frugiperda) la proteina viene espressa mediante infezione con Baculovirus contenente le sequence codificanti per il gene di interesse. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di espressione di baculovirus non sono adatti per la secrezione ad alto livello di proteine ricombinanti. La via secretoria nelle cellule degli insetti ha infatti una capacit? limitata e non pu? gestire l'efflusso di proteine ricombinanti durante l'infezione da baculovirus [Kaba et al., 2004]. Un'altra limitazione dei sistemi di espressione in cellule di insetto ? che non sono attrezzati per gestire l'elaborazione post-traduzionale ad alto volume delle proteine secrete, in particolare di quelle che richiedono un taglio proteolitico per raggiungere una forma matura e completamente attiva.
Nel caso delle produzione di proteine secretorie in cellule di lievito, nonostante i numerosi vantaggi dei lieviti come cellule ospiti, in quanto cellule eucariotiche dotate di una via di secrezione simile a quella dei mammiferi, ci sono notevoli limitazioni al loro uso come sistemi di espressione, tra cui secrezione inefficiente, ripiegamento improprio, iperglicosilazione e trattamento proteolitico aberrante delle proteine (Thak et al. 2019). Inoltre, per una produzione di proteine efficiente da parte dei lieviti ? spesso necessario ricorrere ad un esteso editing delle sequenze da esprimere come proteine eterologhe perch? i lieviti hanno un diverso ?codon usage?, cio? utilizzano codoni diversi rispetto ai mammiferi per codificare alcuni aminoacidi (Thak et al., 2019; Brule and Grayhack, 2017).In ancora un?altra forma di realizzazione, nel metodo secondo la presente invenzione detto polipeptide ricombinante, pu? essere ulteriormente purificato mediante la cromatografia di affinit?. Le proteine sono contrassegnate da una breve sequenza amminoacidica denominata "tag" che conferisce loro propriet? di legame specifiche per un ligando specifico il quale viene immobilizzato su beads. Un esempio di questa applicazione sono le purificazioni Histag. In questo caso il tag ? costituito da una sequenza amminoacidica costituita da 6 istidine (denominata His-tag), posta all?N- o al C-terminale della proteina, ed il ligando ? un chelante accoppiato con uno ione metallico, in questo caso il Nickel. Lo ione metallico viene riconosciuto dalla His-tag che si legano ad esso ed in questo modo la proteina da purificare viene immobilizzata sui beads e quindi separata dal resto del campione.
In una forma preferita, la cellula eucariotica utilizzata nel metodo dell?invenzione ? una cellula di mammifero, preferibilmente detta cellula ? una cellula CHO (Chinese Hamster Ovary cells).
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1: Sintesi artificiale dei vettori pcDNA3.1_BDNF, pcDNA3.1_Furin e pcDNA3.1_SKI1 per l?espressione nelle CHO
Per facilitare la purificazione delle tre proteine, ? stato aggiunto al C-terminale della sequenza di BDNF un tag di sei istidine; mentre al C-terminale di Furina e SKI-1 ? stato inserito uno strep-tag.
Le sequenze nucleotidiche utilizzate sono le sequenze umane codificanti i tre prodotti proteici di BDNF (NM_170732.4), Furin (NM_001289823.1) e SKI-1 (NM_003791.3). Il vettore scelto per l?espressione nelle CHO ? il pcDNA3.1 [Prodotto da Invitrogen] un vettore comunemente usato per l?espressione costitutiva in cellule di mammifero contenente il promotore forte CMV. Le sequenze descritte sono state sintetizzate con i rispettivi tag e clonate nel vettore pcDNA3.1 per BDNF e pcDNA3.1/Hygro per Furin e SKI-1 (GenScript). Per la produzione di pro-BDNF la sequenza della pro-neurotrofina ? stata modificata in modo che non possa essere processata da endoproteasi endogene ed ? stata chiamata BDNF-2U (SEQ ID NO:1). Nello specifico la sequenze ? stata modificata in modo tale che la sequenza peptidica contenesse le seguenti mutazioni: R54A; L56A; R127A; R128A. Gli aminoacidi in posizione 54 e 56 corrispondono al sito di taglio da parte di SKI-1 e le modifiche in posizione 127 e 128 corrispondono al sito di taglio da parte di Furin. Vengono prodotti tre distinti vettori contenenti le sequenze per pro-BDNF (pcDNA3.1_BDNF: SEQ ID NO:2), Furina (pcDNA3.1_Furin SEQ ID NO: 5) e SKI1 (pcDNA3.1_SKI1 SEQ ID NO: 6).
La Figura 1 mostra la strategia di espressione ed il processo di maturazione di BDNF nelle cellule di mammifero.
Vengono trasfettate le cellule di mammifero CHO per la produzione della proteina ricombinante.
Esempio 2: Espressione delle forme pro-BDNF, mBDNF e truncBDNF in CHO
Nel caso dell?espressione in cellule CHO sono stati utilizzati quattro distinti vettori contenenti le sequenze per pro-BDNF (pcDNA3.1_BDNF: SEQ ID NO:2), BDNF-2U (pcDNA3.1-BDNF-2U), Furina (pcDNA3.1_Furin) e SKI1 (pcDNA3.1_SKI1).
I vettori sono stati testati singolarmente per verificare la capacit? di espressione di ciascuna proteina nelle CHO a 24 h dalla trasfezione.
L?espressione di pro-BDNF in cellule trasfettate con il vettore pcDNA3.1_BDNF oppure con il vettore pcDNA3.1-BDNF-2U ? stata confermata tramite western blot utilizzando un anticorpo specifico anti-BDNF e un anticorpo anti-histag per confermare la presenza del tag. Nel lisato ? stata rilevata la presenza della pro-proteina all?altezza di 32 kDa come atteso. Si rileva inoltre una seconda banda delle dimensioni di circa 30 kDa che si suppone essere la forma non glicosilata della proteina.
Per confermare l?espressione ricombinante delle due proteasi, Furina e SKI-1, nelle cellule trasfettate con i vettori pcDNA3.1_Furin e pcDNA3.1_SKI1 rispettivamente, ? stato utilizzato un anticorpo anti-streptag.
Una volta verificata singolarmente l?espressione delle quattro proteine si sono effettuati gli esperimenti di co-espressione. I vettori pcDNA3.1_BDNF e pcDNA3.1_Furin sono stati co-trasfettati nelle cellule CHO per la produzione di BDNF maturo, mentre la combinazione dei vettori pcDNA3.1_BDNF e pcDNA3.1_SKI1 ? stata utilizzata per l?espressione di truncBDNF.
Sono state testate diverse condizioni di trasfezione, variando sia il rapporto tra la quantit? di DNA e l?agente trasfettante sia variando i rapporti tra i vettori nei valori di 1:1, 1:2; 1:5, 1:10 a favore del vettore pcDNA3.1_BDNF. Per la produzione di BDNF maturo la condizione migliore di trasfezione ? stata l?utilizzo di un rapporto 1:10 tra i vettori pcDNA3.1_Furin e pcDNA3.1_BDNF (Figura 2A). In queste condizioni dopo 48 h dalla trasfezione sono state rilevate nella frazione solubile due bande di 12 e 14 kDa (il peso di BDNF maturo ? di 14 kDa), che si suppongono essere forme diversamente glicosilate della proteina matura. La stessa banda, seppur di pi? debole intensit?, ? stata rilevata anche in cellule trasfettate con il solo vettore pcDNA3.1_BDNF e ci? suggerisce che il taglio proteolitico non sia dovuto solo a Furina, ma anche a proteasi endogene. Oltre alle due bande di 12 e 14 kDa si rileva la presenza anche della proproteina, indicando che BDNF viene processato solo parzialmente nella sua forma matura.
Esempio 3: Purificazione di BDNF-2U e mBDNF dal terreno di crescita delle cellule CHO
Un risultato rilevante ? la presenza di BDNF maturo nel terreno di crescita: la purificazione in cromatografia di affinit? del medium di coltura ha permesso, infatti, di isolare le due bande di 12 e 14 kDa corrispondenti alla forma matura di BDNF (Figura 2B). Sono stati fatti dei tentativi preliminari di purificazione della proteina matura sia dal lisato che dal medium. La purificazione della forma matura dal terreno di coltura ? sicuramente la pi? promettente in quanto permette di isolare la sola forma matura e di semplificare le fasi di purificazione.
Eventuali proteine contaminanti ancora presenti negli eluati potranno essere rimosse ad esempio aumentando la concentrazione di imidazolo nei lavaggi per rimuovere gli aspecifici. Un altro modo per facilitare la purificazione dal medium ? coltivare le cellule in sospensione senza il siero in modo da ridurre la presenza di proteine che possono interferire con le fasi di purificazione.
La produzione della proteina non processabile BDNF-2U (pro-BDNF) ? efficientemente espressa nelle cellule CHO e buona parte della proteina viene secreta nel terreno di coltura. Si ipotizza che l?assenza dei siti di taglio proteolitici non favorisca il taglio da parte di proteasi endogene rendendo quindi la proteina pi? stabile. Come per la forma matura la purificazione dal medium di BDNF-2U avviene mediante purificazione per affinit?, grazie alla presenza di un tag inserito al C-terminale della proteina.
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante il metodo della presente invenzione. In particolare, tale metodo si ? mostrato sorprendentemente e vantaggiosamente adatto alla produzione di proteine ricombinanti. Al tempo stesso, tale metodo, essendo veloce ed estremamente facile da eseguire, pu? essere convenientemente realizzato in un qualsiasi tipo di laboratorio e si ? dunque rivelato vantaggioso per l?industria farmaceutica e biotech.

Claims (8)

RIVENDICAZIONI
1. Un metodo per produrre un polipeptide ricombinante processato e purificato avente le seguenti fasi:
a. coltivare una cellula eucariotica comprendente un acido nucleico codificante il precursore di detto polipeptide (pro-polipeptide) ed un acido nucleico codificante una proteasi;
b. permettere a detta proteasi di tagliare proteoliticamente detto pro-polipeptide per ottenere il polipeptide ricombinante processato;
c. recuperare detto polipeptide ricombinante processato e purificato dal mezzo di coltura di detta cellula di mammifero,
in cui detto polipeptide ricombinante processato codifica per una neurotrofina scelta dal gruppo consistente in BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) ed NGF (Nerve Growth Factor).
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto acido nucleico codificante una proteasi corrisponde all?acido nucleico codificante una proteasi scelta dal gruppo consistente in Furina e SKI-1.
3. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui detto polipeptide ricombinante processato e purificato che viene recuperato nella fase c. ? la forma matura o la forma troncata di detto polipeptide ricombinante.
4. Il metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detto polipeptide ricombinante processato e purificato che viene recuperato nella fase c. ? la forma matura di BDNF (mBDNF) o l?isoforma troncata di BDNF (truncBDNF).
5. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto precursore di detto polipeptide ha un TAG all?estremit? carbossi-terminale.
6. Il metodo secondo la rivendicazione 5, in cui detto TAG all?estremit? carbossiterminale ? un His-tag.
7. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui detto polipeptide ricombinante, processato e purificato dal mezzo di coltura della fase c., viene ulteriormente purificato mediante un passaggio in colonna cromatografica.
8. Il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui detta cellula eucariotica ? una cellula di mammifero, preferibilmente detta cellula ? una cellula CHO.
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