KR20140103001A - 후기골지망 타겟팅용 펩타이드 - Google Patents

후기골지망 타겟팅용 펩타이드 Download PDF

Info

Publication number
KR20140103001A
KR20140103001A KR1020130016621A KR20130016621A KR20140103001A KR 20140103001 A KR20140103001 A KR 20140103001A KR 1020130016621 A KR1020130016621 A KR 1020130016621A KR 20130016621 A KR20130016621 A KR 20130016621A KR 20140103001 A KR20140103001 A KR 20140103001A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
cell
fluorescent protein
peptide
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020130016621A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101462762B1 (ko
Inventor
장덕진
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to KR1020130016621A priority Critical patent/KR101462762B1/ko
Publication of KR20140103001A publication Critical patent/KR20140103001A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101462762B1 publication Critical patent/KR101462762B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/05—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a GOLGI retention signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 후기골지망(trans Golgi network: TGN) 타겟팅용 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용하여 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열은 후기골지망으로 타겟팅되는 특징을 가지므로, 이를 포함하는 펩타이드는 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시킬 수 있다. 또한 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질 유전자 및 형광단백질 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 이용하는 경우 세포 내에서의 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시킬 수 있으며, 이와 더불어 이들의 공간적 위치를 확인할 수 있어, 후기골지망으로의 단백질 공간적 분포 및 이로 인한 생리학적 특성을 연구함에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

후기골지망 타겟팅용 펩타이드{Peptide for targeting to trans Golgi network}
본 발명은 후기골지망(trans Golgi network: TGN) 타겟팅용 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용하여 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시키는 방법에 관한 것이다.
우리 몸에는 수많은 세포가 존재하며 개개의 세포에는 소포체, 핵, 마이토콘드리아, 퍼록시좀, 골지 등을 포함하는 소기관들이 존재하며 이들 소기관들은 각각 독특한 막에 의해 둘러싸여 있다. 하나의 세포에는 대략 십억개의 단백질들이 존재하며 이들 단백질들이 자신의 고유기능을 수행하기 위해서는 세포내의 특정한 소기관 혹은 막, 사이토졸, 핵 등으로 옮겨져야 한다.
세포가 단백질을 특정 소기관으로 운반하는 것을 “단백질 타겟팅(protein targeting)이라고 하며, 이러한 단백질 타겟팅을 위해서는 새롭게 합성된 단백질이 소포체, 골지체 및 최종 목적 소기관으로 순차적으로 운반되어져야 한다.
새롭게 합성된 단백질이 소포체로 운반되기 위해서는 신호서열(signal sequence)라는 짧은 아미노산 서열이 중요한 역할을 하며 신호서열은 단백질 합성 초기에 만들어져 소포체로 운반된 후 제거되게 된다. 이후 단백질은 골지체로 운반되어 당, 지방 등이 단백질에 결합하는 과정을 거친다. 또한 미토콘드리아, 핵 등 세포내 소기관으로 운반되기 위해서는 별도의 신호서열이 존재하여야 하며, 이러한 서열은 소포체로 보내는 신호서열과 구분해서 미토콘드리아신호서열, 핵신호서열이라고 부르기도 한다.
이와 같이, 세포 내에서 기능을 하는 목적 단백질을 세포내 소기관으로 전달시키는 단백질 신호서열은 목적하는 단백질을 전달하기 위한 매우 효율적인 방법으로서, 특정 세포내 소기관으로 타겟팅을 이끌 수 있는 신호서열을 찾아내는 것은 매우 중요한 일이라 하겠다.
한편, 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase: PDE)는 다양한 기관에서 세포내 cAMP 양을 조절함으로써 시냅스 가소성에 중요한 역할을 수행하며, 연체동물의 일종인 군소(Aplysia)의 PDEs는 unique domain인 upstream conserved region(UCR)과 HD motif를 가지고 있으며 포유류의 PDE4D와 가장 유사하여 apPDE4(aplysia AMP-specific phosphodiesterase 4 homologous protein)이라고 불린다.
본 발명자들은 apPDE4의 펩타이드 서열을 연구하던 중, apPDE4에서 존재하는 특정 단편 서열이 설파티드 결합 펩타이드(sulfatide binding peptide)임을 알아내었으며, 이러한 설파티드 결합 펩타이드를 변형하여 제조한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 후기골지망(trans Golgi network: TGN)으로 효과적으로 타겟팅 되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-0794262호
따라서 본 발명의 목적은 후기골지망(trans Golgi network)으로의 타겟팅 용도를 가진 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 이용하여 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 후기골지망(trans Golgi network) 타겟팅용 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 apPDE4(aplysia AMP-specific phophodiesterase 4 homologous protein)의 유래의 설파티드 결합 펩타이드(sulfatide-binding peptides)를 변형하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질 유전자가 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein: GFP) 또는 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein: RFP)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 혼성 플라스미드 준비 단계; (b) 상기 혼성 플라스미드를 세포 내에 도입한 후 유전자가 발현되도록 하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 목적 단백질의 이동 및 분포를 형광영상 측정을 통해 확인하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 진핵세포일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein: GFP) 또는 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein: RFP)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혼성 플라스미드를 세포 내에 주입하는 방법은 PEG(polyethylene glycol), 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란(DEAE-Dextran)으로 구성된 군으로부터 선택되는 화학물질을 이용는 방법; 양이온성 지질을 이용한 라이포펙션(lipofection) 방법; 마이크로인젝션 방법; 일렉트로포레이션 방법; 및 일렉트로퓨젼 방법으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열은 후기골지망으로 타겟팅되는 특징을 가지므로, 이를 포함하는 펩타이드는 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시킬 수 있다. 또한 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질 유전자 및 형광단백질 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 이용하는 경우 세포 내에서의 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시킬 수 있으며, 이와 더불어 이들의 공간적 위치를 확인할 수 있어, 후기골지망으로의 단백질 공간적 분포 및 이로 인한 생리학적 특성을 연구함에 있어서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드(P1) 및 이를 변형한 펩타이드(MLCCM-P1, MLAAM-P1, MLCCM-P1(AA), MLAAM-P1(AA))의 세포내 분포를 보여주는 형광이미지이다.
도 2는 MLAAM-P1:RFP가 후기골지망에 위치하고 있음을 나타내는 사진으로서, 붉은색은 본 발명의 MLAAM-P1 단백질이 내는 형광이고, 녹색은 후기골지망 마커인 GalT가 내는 형광이며, MLAAM-P1 단백질과 GalT 형광이 겹쳐 보이는 부분은 노란색을 나타낸다.
도 3은 HEK293T 세포에서 발현된 MLAAM-P1:EGFP에 대한 웨스턴 블랏(western blot) 사진으로, T는 후기골지망 부분, C는 세포질부분, M은 막부분을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"후기골지망"은 trans Golgi network으로 TGN으로 약기할 수 있으며, 세포내 골지체의 트랜스 쪽에 존재하는 망상의 구조를 의미한다. 후기골지망에서는 한정 분해에 의한 단백질처리, 시알산의 전이반응, 당단백질의황산화 등이 일어나며, 또한 리소솜단백질, 조절성 분비단백질, 구성성 분비단백질, 세포막단백질 등이 선발되어, 각각의 목적지를 향하여 수송되는 것으로 알려져 있다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 손상되지 않은 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사 시에 또는 다른 유전자 발현의 조절 시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다.
"형질전환, 형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 그리고 외부 DNA 등이 도입된 세포 등을 '형질전환체'라고 한다.
" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
"숙주 세포"는 하나 이상의 DNA 또는 벡터가 도입되는 진핵 또는 원핵세포를 가리키며, 특정 대상 세포만이 아니라 그 자손 혹은 잠재적 자손까지도 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 어떤 변형이 돌연변이 혹은 환경적 영향 때문에 후속 세대에 일어날 수 있기 때문에 사실 상기 자손은 부모 세포와 동일하지는 않지만, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어의 범주 내에서 여전히 포함된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포내 후기골지망으로 목적 단백질을 이동 및 분포시킬 수 있는 펩타이드를 제공하는데 그 특징이 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 후기골지망(trans Golgi network: TGN) 타겟팅용 펩타이드를 제공하는데 그 특징이 있다.
본 발명자들은 이전에 연구된 논문 (Guo et al (1992), PNAS)을 참고하여 apPDE4(aplysia AMP-specific phophodiesterase 4 homologous protein)의 유래의 MSHWSPWSSCSVTCG로 이루어진 펩타이드가 설파티드 결합 펩타이드(sulfatide-binding peptides)임을 발견하였으며, 이 서열을 변형하여 제조한 MLAAMSHWSPWSSCSVTCG로 이루어진 펩타이드가 후기골지망(trans Golgi network)으로 효과적으로 타겟팅 되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 하기 실시예 1에서는, apPDE4 유래의 설파티드 결합 펩타이드(P1) 및 이 서열을 변형한 총 4종의 펩타이드를 제조하였으며, 이들을 각각 MLCCM-P1, MLAAM-P1, MLCCM-P1(AA), MLAAM-P1(AA)로 명명하였다(하기 표 1 참조).
한편, 본 발명의 하기 실시예 2에서는 상기 4종의 펩타이드의 세포내 분포 위치를 확인하기 위하여, 상기 4종의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자) 각각을 PCR로 증폭한 후 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 포함하는 플라스미드 벡터에 서브 클로닝한 다음, 이러한 혼성 플라스미드를 HEK293T 세포에 도입하고, 이들을 발현시켜 펩타이드 위치를 형광영상을 통해 확인하였다. 그 결과 P1:EGFP에 의한 녹색 형광은 세포질에서 관찰되었으며, MLCCM-P1:EGFP에 의한 녹색 형광은 원형질막과 엔도좀에서 관찰되며, MLAAM-P1:EGFP에 의한 녹색 형광은 후기골지망에서 관찰되었다(도 1 참조).
또한 본 발명의 하기 실시예 3에서는, 본 발명 MLAAM-P1 펩타이드의 세포내 후기골지망으로의 타겟팅을 확인한 결과, MLAAM-P1:RFP에 의한 적색 형광과 GAlT(후기골지망 마커):EGFP에 의한 녹색 형광이 세포내 동일 위치에서 관찰되었으며, 이를 통해 본 발명의 MLAAM-P1 펩타이드가 세포내 후기골지망으로의 이동 신호를 가진 펩타이드 임을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 2 참조).
또한 본 발명의 하기 실시예 4에서는, 웨스턴 블랏 분석법으로 MLAAM-P1:EGFP의 후기골지망으로의 이동을 확인한 결과, MLAAM-P1:EGFP 단백질이 후기골지망에서 두드러지게 분포되는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
상기와 같은 실험결과를 통해, 본 발명자들은 MLAAM-P1 펩타이드가 세포내 후기골지망으로의 타겟팅에 효과적이라는 사실을 실험적으로 입증하였으며, 본 발명에서는 이를 서열번호 1로 표시하였다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 후기골지망(trans Golgi network) 타겟팅용 펩타이드는 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다.
먼저 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 후기골지망(trans Golgi network) 타겟팅용 펩타이드는 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
또한 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 후기골지망(trans Golgi network) 타겟팅용 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 헥산(DNA) 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예를 들면, Biosearch 또는 Applied iosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., MolecularCloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 또는 상기 유전자가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 이러한 폴리뉴클레오티드는 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
상기 “작동 가능하게 연결된”은 발현 조절 서열이 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 말하며, 발현 조절 서열(프로모터 포함)의 조절 하에 유전자(폴리뉴클레오티드)가 발현되어 유전자에 의해 코딩되는 본 발명의 펩타이드 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질 유전자가 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 후기골지망(trans Golgi network) 타겟팅에 효과적이므로, 후기골지망으로 타겟팅 하고자 하는 목적 유전자에 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 연결하여 벡터에 삽입한 후, 이를 발현시키는 경우 목적 단백질을 후기골지망으로 타겟팅할 수 있다.
또한, 이때 이러한 타겟팅을 확인하기 위하여 형광단백질 유전자를 이용할 수 있다. 즉 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 함께 형광단백질 유전자를 연결하여 벡터에 삽입하는 경우, 형광단백질의 발현으로 인해 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동/분포 여부를 확인할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein: GFP) 또는 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein: RFP)일 수 있으나, 특별히 그 종류를 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 재조합 벡터를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 혼성 플라스미드 준비 단계; (b) 상기 혼성 플라스미드를 세포 내에 도입한 후 유전자가 발현되도록 하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 목적 단백질의 이동 및 분포를 형광영상 측정을 통해 확인하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 (a) 단계는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 혼성 플라스미드 준비하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 후기골지망(trans Golgi network)으로 타겟팅하는 용도를 가지며, 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 후기골지망으로 이동 및 분포시키고자 하는 특정 단백질을 코딩하는 유전자이며, 형광단백질을 코딩하는 유전자는 목적 단백질이 실제적으로 후기골지망으로 이동 및 분포되는지는 확인할 수 가시화 기능을 갖는다.
본 발명의 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계를 통해 준비된 혼성 플라스미드를 세포 내에 도입한 후 유전자가 발현되도록 하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 혼성 플라스미드를 세포 내에 도입은, 혼성 플라스미드를 이용하여 세포를 형질전환시키는 것으로서, 형질전환 방법은 당 분야의 통상의 지식을 가진 기술자들에게 잘 알려진 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, PEG(polyethylene glycol), 인산칼슘, DEAE-덱스트란 등의 화학물질을 이용하는 방법; 양이온성 지질을 이용하는 라이포펙션(lipofection) 방법; 마이크로인젝션법; 일렉트로포레이션법; 일렉트로퓨젼법 등을 사용할 수 있으나, 특별히 이를 제한하는 것은 아니다. 형질전환된 세포에서 신호단백질(후기골지망 타겟팅 펩타이드)과 형광단백질이 연결된 목적 단백질이 효율적으로 발현되도록 조건을 최적화할 필요가 있는데, 이는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 각 신호단백질 및 형광단백질의 종류에 따라 적절히 조절하여 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 진핵세포일 수 있으며, 상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein: GFP) 또는 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein: RFP)일 수 있다.
상기 형질전환된 세포에서 발현되는 단백질로부터 방출되는 특정 파장의 형광을 형광현미경을 사용하여 상기 세포가 살아있는 상태에서 계속하여 영상화할 수 있게 함으로써, 세포 내에서의 목적 단백질의 발현과정 및 후기골지망으로의 이동과정을 단계별로 세밀하게 가시화할 수 있다.
본 발명은 또한 (ⅰ) 세포내에서 후기골지망으로 위치를 이동시킬 수 있는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질을 코딩하는 유전자가 연결된 재조합 유전자를 준비하는 단계;(ⅱ) 상기 재조합 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 프로모터 부분과 터미네이터 부분을 포함하여 구성된 혼성 플라스미드를 준비하는 단계; (ⅲ) 상기 혼성 플라스미드를 세포 내에 주입하여 형질전환시키는 단계; (ⅳ) 상기 형질전환세포에서 재조합 유전자가 발현되도록 하는 단계; (ⅴ) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 리포터 단백질의 이동 및 분포 전에 약물을 처리하여 형질전환세포내의 형광영상을 측정하는 단계; 및 (ⅵ) 상기 단계(ⅴ)에서 얻은 형광영상과 상기 약물을 처리하지 않은 대조군에서의 형질전환세포의 형광영상을 비교하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 특정 단백질(목적 단백질)의 이동 및 분포에 영향을 미치는 약물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시킬 수 있기 때문에, 상기와 같은 과정을 이용하는 경우 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동을 저해 또는 촉진하는 화학물질을 효율적으로 검색할 수 있다.
즉 생리학적 활성을 가지고 있는 것으로 추정되는 화학물질을, 상기 볼 발명에 따른 형질전환세포 내에서 목적 단백질이 발현되기 전, 후 또는 발현과 동시에 상기 형질전환세포에 처리하고, 이들이 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동에 미치는 영향을 세포내 목적 단백질의 분포를, 그러한 화학물질을 처리하지 않은 대조군과 비교함으로써 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
apPDE4 유래의 설파티드 결합 펩타이드 발견 및 이를 이용한 펩타이드 제조
포스포디에스터라아제(phosphodiesterase: PDE)는 다양한 기관에서 세포내 cAMP 양을 조절함으로써 시냅스 가소성에 중요한 역할을 수행하며, 연체동물의 일종인 군소(Aplysia)의 PDEs는 unique domain인 upstream conserved region(UCR)과 HD motif를 가지고 있으며 포유류의 PDE4D와 가장 유사하여 apPDE4(aplysia AMP-specific phosphodiesterase 4 homologous protein)이라고 불린다.
본 발명자들은 이전에 연구된 논문 (Guo et al (1992), PNAS)을 참고하여 apPDE4(aplysia AMP-specific phophodiesterase 4 homologous protein)의 유래의 MSHWSPWSSCSVTCG로 이루어진 펩타이드가 설파티드 결합 펩타이드(sulfatide-binding peptides)임을 최초로 발견하였으며, 이 서열을 변형하여 4종류의 펩타이드를 제조하였다(하기 표 1 참조).
apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 및 이를 변형한 펩타이드 제조
펩타이드 종류 펩터이드 서열 약칭
apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 MSHWSPWSSCSVTCG P1
변형 펩타이드 MLCC MSHWSPWSSCSVTCG MLCCM-P1
MLAA MSHWSPWSSCSVTCG MLAAM-P1
MLCC MSH A SP A SSCSVTCG MLCCM-P1(AA)
MLAA MSH A SP A SSCSVTCG MLAAM-P1(AA)
< 실시예 2>
apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 및 이의 변형 펩타이드의 세포내 발현
본 발명자들은 상기 표 1의 apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 및 이의 변형 펩타이드 4종의 세포내에서 분포 위치를 확인하기 위하여, 상기 표 1의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자) 각각을 PCR로 증폭한 후 EGFP(enhanced green fluorescent protein)를 포함하는 플라스미드 벡터에 서브 클로닝한 다음, 혼성 플라스미드를 HEK293T 세포에 도입하고, 이들을 발현시켜 펩타이드 위치를 형광영상을 통해 확인하였다.
자세하게는, 먼저 상기 표 1의 apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 및 이의 변형 펩타이드 4종을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자) 각각을 제조한 후(표 2 참조) 이들을 하기 표 3의 특정 프라이머 서열을 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR의 조건은 하기 표 4와 같다. 이렇게 증폭된 폴리펩티드는 pcDNA3.1-EGFP 벡터에 HindIII/XbaI 자리에 넣어 EGFP를 c-말단에 연결함으로써 혼성 플라스미드를 제조하였다. 그런 다음, DMEM 배양액(10% FBS+ Penicillin/streptomycin)에서 37 ℃(5% CO2)에서 배양된 HEK293T 세포에, 상기 혼성 플라스미드를 Ca2+ phosphate(Clontech)방법을 이용해 형질주입(transfection)하였다. 이후 혼성 플라스미드가 발현됨에 따라 HEK293T 세포내의 형광영상을 Cal Zeiss 공초점 현미경을 이용해 측정하였다.
그 결과는 도 1에서 나타낸 바와 같이, P1:EGFP에 의한 녹색 형광은 세포질에서 관찰되며, MLCCM-P1:EGFP에 의한 녹색 형광은 원형질막과 엔도좀에서 관찰되며, MLAAM-P1:EGFP에 의한 녹색 형광은 후기골지망에서 내에서 관찰되었다. 그러나 MLAAM-P1(AA):EGFP에 의한 녹색 형광은 후기골지망에서 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 MLAAM-P1은 세포내 후기골지망으로의 이동 신호를 가진 펩타이드 임을 확인할 수 있었다.
apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 및 이를 변형한 펩타이드 각각의 폴리뉴클레오티드 서열
펩타이드 종류 약칭 폴리뉴클레오티드 서열
apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드 P1 5'-ATG AGC CAC TGG TCA CCT TGG TCT TCA TGC TCT GTG ACC TGT GGA-3'
변형 펩타이드 MLCCM-P1 5'-ATG CTG TGC TGT ATG AGC CAC TGG TCA CCT TGG TCT TCA TGC TCT GTG ACC TGT GGA-3'
MLAAM-P1 5'-ATG CTG TGC TGT ATG AGC CAC TGG TCA CCT TGG TCT TCA TGC TCT GTG ACC TGT GGA-3'
MLCCM-P1(AA) 5'-ATG CTG TGC TGT ATG AGC CAC GCT TCA CCT GCT TCT TCA TGC TCT GTG ACC TGT GGA-3'
MLAAM-P1(AA) 5'-ATG CTG GCT GCT ATG AGC CAC GCT TCA CCT GCT TCT TCA TGC TCT GTG ACC TGT GGA-3'
PCR에 사용된 프라이머 서열
유전자
(폴리뉴클레오티드)		 프라이머 서열
P1 sense 5’- GCA AGC TTG CCA CCA TGA GCC ACT GGT CAC CTT GG-3’
antisense 5’-CGT CTA GAT CCA CAG GTC ACA GAG CAT GAA GAC CAA GGT GAC CAG TG-3’
MLCCM-P1 sense 5’-GCA AGC TTG CCA CCA TGC TGT GCT GTA TGA GCC ACT GGT CAC CTT GG-3’
antisense 5’-CGT CTA GAT CCA CAG GTC ACA GAG CAT GAA GAC CAA GGT GAC CAG TG-3’
MLAAM-P1 sense 5’-GCA AGC TTG CCA CCA TGC TGG CTG CTA TGA GCC ACT GGT CAC CTT-3’
antisense 5’-CGT CTA GAT CCA CAG GTC ACA GAG CAT GAA GAC CAA GGT GAC CAG TG-3’
MLCCM-P1(AA) sense 5’-GCA AGC TTG CCA CCA TGC TGT GCT GTA TGA GCC ACT GGT CAC CTT GG-3’
antisense 5’-GCT CTA GAT CCA CAG GTC ACA GAG CAT GAA GAC GCA GGT GAC GCG TGG-3’
MLAAM-P1(AA) sense 5’-GCA AGC TTG CCA CCA TGC TGG CTG CTA TGA GCC ACT GGT CAC CTT-3’
antisense 5’-GCT CTA GAT CCA CAG GTC ACA GAG CAT GAA GAC GCA GGT GAC GCG TGG-3’
PCR 조건
온도 시간 Cycle
94℃ 2분 1
94℃ 20초 30
48℃ 20초
72℃ 40초
72℃ 5분 4
4℃ ∞ 1
< 실시예 3>
본 발명 MLAAM - P1 펩타이드의 후기골지망으로의 위치 관찰
본 발명자들은 apPDE4 유래 설파티드 결합 펩타이드를 변형하여 제조한 MLAAM-P1 펩타이드의 세포내 후기골지망으로의 타겟팅을 검증하기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 상기 MLAAM-P1 펩타이드의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자)를 PCR로 증폭한 후 RFP를 포함하는 플라스미드 벡터에 서브 클로닝한 다음 혼성 플라스미드를 HEK293T 세포에 도입하고, 이들을 발현시켜 펩타이드 위치를 형광영상을 통해 확인하였다. 이때 후기골지망(trans Golgi network: TGN) 마커로 GalT-EGFP를 사용하였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, MLAAM-P1:RFP에 의한 적색 형광과 GAlT:EGFP에 의한 녹색 형광이 세포내 동일 위치에서 관찰되었으며, 이를 통해 본 발명의 MLAAM-P1 펩타이드가 세포내 후기골지망으로의 이동 신호를 가진 펩타이드 임을 다시 한번 확인할 수 있었다.
< 실시예 4>
웨스턴 블랏 분석법으로 MLAAM - P1 : EGFP 의 후기골지망으로의 이동 확인
상기 실시예2와 동일한 방법으로 MLAAM-P1:EGFP의 혼성 플라스미드를 HEK293T 세포내로 도입한 후, 24시간 방치하였다. 세포액 5 ml를 원심분리한 후 4℃의 마쇄용액(10mM EDTA, 50 mm HEPES-KOH, 0.33 M 소르비톨(sorbitol), 0.5 g/l BSA, 5 mM 소디움 아스코로베이트(sodium ascorbate)) 5 ml에 현탁시켜서, 호모게나이저(homogenizer)로 3초 간격으로 20분간 처리하여 전체 단백질 용액을 제조하였다. 전체 단백질 용액을 100,000×g로 원심분리하여 액상 부분과 막 부분을 각각 분리하였다. 각각의 시료를 SDS를 포함하는 10% 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하였으며, 전개된 젤을 nitrocellulose 막에 붙여서 단백질을 이동시킨 후, 이를 폴리클로날 항-(polyclonal anti-)EGFP 항체로 결합시켰다. 이때, calnexin은 소포체 멤브레인 마커로 이용하였으며, 베타-튜불린(β-tubulin)은 세포질 마커로 이용하였다.
그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, MLAAM-P1:EGFP 단백질은 후기골지망에서 두드러지게 분포되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 MLAAM-P1 펩타이드가 후기골지망으로의 이동을 유도할 수 있음을 알 수 있었다. 도 4에서 T는 후기골지망 부분을 나타내며, C는 세포질 부분을 M은 막 부분을 나타낸다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
apPDE4: aplysia AMP-specific phophodiesterase 4 homologous protein
TGN: Trans-Golgi Network
EGFP: enhanced green fluorescent protein
RFP: red fluorescent protein
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Peptide for targeting to trans Golgi network <130> PN1209-462 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trans Golgi network targeting peptide <400> 1 Met Leu Ala Ala Met Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser Cys Ser Val 1 5 10 15 Thr Cys Gly

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 후기골지망(trans Golgi network) 타겟팅용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 apPDE4(aplysia AMP-specific phophodiesterase 4 homologous protein)의 유래의 설파티드 결합 펩타이드(sulfatide-binding peptides)를 변형하여 제조한 것을 특징으로 하는 후기골지망 타겟팅 펩타이드.
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 프로모터, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질 유전자가 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein: GFP) 또는 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein: RFP)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 목적 단백질을 후기골지망으로 이동 및 분포시키는 방법.
  7. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 형광단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 혼성 플라스미드 준비 단계;
    (b) 상기 혼성 플라스미드를 세포 내에 도입한 후 유전자가 발현되도록 하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환세포 내에서 발현되는 목적 단백질의 이동 및 분포를 형광영상 측정을 통해 확인하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색 형광단백질(Green Fluorescent Protein: GFP) 또는 적색 형광단백질(Red Fluorescent Protein: RFP)인 것을 특징으로 하는 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 혼성 플라스미드를 세포 내에 주입하는 방법은 PEG(polyethylene glycol), 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란(DEAE-Dextran)으로 구성된 군으로부터 선택되는 화학물질을 이용는 방법; 양이온성 지질을 이용한 라이포펙션(lipofection) 방법; 마이크로인젝션 방법; 일렉트로포레이션 방법; 및 일렉트로퓨젼 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법인 것을 특징으로 하는 세포 내에서 목적 단백질의 후기골지망으로의 이동과 공간적 분포를 확인하는 방법.
KR1020130016621A 2013-02-15 2013-02-15 후기골지망 타겟팅용 펩타이드 KR101462762B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130016621A KR101462762B1 (ko) 2013-02-15 2013-02-15 후기골지망 타겟팅용 펩타이드

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130016621A KR101462762B1 (ko) 2013-02-15 2013-02-15 후기골지망 타겟팅용 펩타이드

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140103001A true KR20140103001A (ko) 2014-08-25
KR101462762B1 KR101462762B1 (ko) 2014-12-04

Family

ID=51747549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130016621A KR101462762B1 (ko) 2013-02-15 2013-02-15 후기골지망 타겟팅용 펩타이드

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101462762B1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100794262B1 (ko) * 2004-12-13 2008-01-11 학교법인 포항공과대학교 외래단백질을 단백질저장액포로 타겟팅 시키기 위한유전자 컨스트럭트

Also Published As

Publication number Publication date
KR101462762B1 (ko) 2014-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Oka et al. Importin α: functions as a nuclear transport factor and beyond
Mikuni et al. High-throughput, high-resolution mapping of protein localization in mammalian brain by in vivo genome editing
Scarpulla Nuclear control of respiratory chain expression in mammalian cells
DE69936103T2 (de) Fusionsproteine bestehend aus proteingerüst und bibliotheken von zufälligen peptiden
Lin et al. The Drosophila maternal-effect gene fs (1) Ya encodes a cell cycle-dependent nuclear envelope component required for embryonic mitosis
Gehring Homeotic genes, the homeo box, and the genetic control of development
JP5143552B2 (ja) 細胞周期フェーズマーカー
CA2372926A1 (en) 143 human secreted proteins
Blechman et al. Genome editing reveals idiosyncrasy of CNGA2 ion channel-directed antibody immunoreactivity toward oxytocin
KR101462762B1 (ko) 후기골지망 타겟팅용 펩타이드
JP2019508018A (ja) ＳｏｒＣＳペプチド及びそれらの用途
Kneissel et al. A novel karyoskeletal protein: characterization of protein NO145, the major component of nucleolar cortical skeleton in Xenopus oocytes
CN107686839B (zh) 微管结合蛋白cript、其治疗性突变体及其应用
KR20090122769A (ko) 세포내로 단백질을 전달하는 방법 및 이를 위한 펩타이드
Kaneko et al. The mouse YAF2 gene generates two distinct transcripts and is expressed in pre-and postimplantation embryos
US20100111913A1 (en) Method of enhancing migration of neural precursor cells
JP6583606B2 (ja) Ｄｎａ傷害抑制剤
AU773085B2 (en) Transfer compounds, the production and the use thereof
Takenaka et al. Direct observation of histone H2B-YFP fusion proteins and transport of their mRNA between conjugating Paramecia
KR20170033559A (ko) 유전자 전달을 위한 신규의 융합 펩타이드
Samifanni Locating Transcription Activation Activity in Dlx5 and Dlx6 Proteins
CN104892771B (zh) 一种具有提高学习记忆能力的多肽TAT-N-cad S3及其应用
US20190153048A1 (en) System and method for the production of a biological mesh
JP4578149B2 (ja) 樹状突起スパイン移行配列
KR20240024760A (ko) 세포 간 네트워크를 규명할 수 있는 근접분자 표지기술

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171017

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191022

Year of fee payment: 6