CN107686839B

CN107686839B - 微管结合蛋白cript、其治疗性突变体及其应用

Info

Publication number: CN107686839B
Application number: CN201710875092.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡春林
Original assignee: Anhui Duoneng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Anhui Duoneng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2037-09-25
Also published as: CN107686839A

Abstract

本发明涉及分子生物学特别是小分子蛋白治疗领域，尤其涉及一种微管结合蛋白CRIPT、其治疗性突变体及其应用，所述CRIPT蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其治疗性突变体Antp‑CRIPT‑C3Y的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明重新注解了CRIPT的亚细胞定位，发现其对细胞分裂中期仿锤体的运动起关键调控作用，同时确定了它与微管蛋白相互作用的结合序列和调节序列，确定了一个CRIPT治疗性突变体。小鼠皮下肿瘤模型研究证实，这一突变体能显著抑制肿瘤的生长。因此，CRIPT蛋白和相应靶向分子的研究将为基础科研和临床肿瘤诊断、治疗及新药开发提供新的依据，相关产品具有巨大的市场应用前景。

Description

微管结合蛋白CRIPT、其治疗性突变体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学特别是小分子蛋白治疗领域，尤其涉及一种CRIPT蛋白在调节细胞有丝分裂和开发治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

微管(microtubule)是真核生物细胞的基本组织成分，主要由α微管蛋白和β微管蛋白组成。微管在细胞质主要以胞质微管形式存在，呈网状或束状分布，通过其亚单位的装配和去装配能适应细胞的变化，与其他蛋白装配成纺锤体、中心粒、鞭毛、纤毛、轴突和神经管等结构，参与细胞形态的维持、细胞内运动和细胞分裂。

微管结合蛋白是人们早期分离微管时发现的，此类蛋白的共同特点是促进微管聚集成束增加微管稳定性或强度促进微管组装，微管结合蛋白的调控是微管调控的最基础的环节之一。微管动力学不稳态对于纺锤体正常组装而言非常重要,而微管结合蛋白正是一类能调节微管动力学不稳态的蛋白。

由于肿瘤细胞的快速增殖能力，通过有丝分裂来维持自身体积的大小和扩增，若抑制其纺锤体的形成，必将导致有丝分裂过程的阻断。基于微管在有丝分裂过程中发挥的重要作用，以微管或微管结合蛋白为靶点的试剂是目前临床疗效最好的一类化疗药物，也一直是抗肿瘤药物研究的热点。然而，与其他类型的化疗药物相似，作用于微管或微管结合蛋白的抗肿瘤药物都有严重的毒副作用，开发新的微管或微管结合蛋白的靶向药物是临床肿瘤治疗的迫切需要。

CRIPT是半胱氨酸富含PDZ结合蛋白(Cysteine-Rich PDZ-Binding Protein)，是1998年Niethammer等应用酵母双杂交系统以DLG家族蛋白PSD95的PDZ3作为bait而分离的的小分子蛋白质(由101个氨基酸残基组成)，他们以及随后的一些研究建议CRIPT主要表达在神经细胞的突触后膜下和上皮细胞的胞浆内并与微管蛋白共同定位，因此，CRIPT在文献和基因文库都被注解为神经突触后嫁接蛋白。然而我们最近分离出一个新的微管结合蛋白CRIPT，是从非分裂细胞的细胞核而不是胞浆分离到的，这与其报道的功能及亚细胞定位相冲突。

CRIPT基因编码产品在进化上是高度保守的，人类与线虫CRIPT蛋白的氨基酸76％相同，编码CRIPT同源蛋白的基因也在于世界上最小的自由生活的真核细胞生物绿藻(Ostreococcus tauri)基因组中。这种进化上高度保守性提示其可能在基因转录、蛋白质合成、细胞分裂等细胞最基本的功能和代谢活动中发挥作用。动物基因敲除实验和临床病例的基因突变分析充分证实了CRIPT蛋白在胚胎发育中的必需作用。CRIPT突变的纯合子小鼠死于胚胎期第9天左右，并伴有严重的发育异常。人类CRIPT的突变会导致矮小症、小头症等发育类疾病，进一步揭示CRIPT在人类出生前后生长发育中起着不可替代的重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种微管结合蛋白CRIPT、其治疗性突变体及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种微管结合蛋白CRIPT，所述蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还保护所述微管结合蛋白CRIPT在制备调节细胞分化产品、调节细胞凋亡产品、调节细胞周期中纺锤体运动产品、抑制肿瘤细胞侵袭产品、抑制肿瘤细胞迁移产品、抑制肿瘤细胞形成产品、预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

一种微管结合蛋白治疗性突变体Antp-CRIPT-C3Y，所述蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还保护所述微管结合蛋白治疗性突变体Antp-CRIPT-C3Y在制备治疗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

CRIPT蛋白是机体正常生长发育所必需的，但其亚细胞定位和基本功能作用被长期错误注解，本发明重新注解了它的亚细胞定位，首次证明了CRIPT蛋白是一种定位在细胞核的核蛋白，并且高度保守，在动物、植物、单细胞真核生物(酵母菌除外)中都高度表达。CRIPT蛋白在细胞分裂期间与微管相结合，参与细胞的有丝分裂，对细胞分裂中期仿锤体的运动起关键调控作用，同时确定了它与微管蛋白相互作用的结合序列(aa 51-55:GKNKF)和调节序列(aa 2-7:VCEKCE)。本发明所述的一个调节序列内关键残基突变的CRIPT突变体Antp-CRIPT-C3Y能阻止分裂的细胞于分裂中期，但不影响非分裂细胞的功能，因此，这一突变体可能作为理想的抗肿瘤试剂。小鼠皮下肿瘤模型研究证实，这一突变体能显著抑制肿瘤的生长。因此，CRIPT蛋白和相应靶向分子的研究将为基础科研和临床肿瘤诊断、治疗及新药开发提供新的依据，可以用于在设计、开发治疗肿瘤等疾病的产品，具有巨大的市场应用前景。

附图说明

图1为GFP-tagged和myc-tagged CRIPT在细胞内的定位。

图2为内源性CRIPT蛋白在细胞内的定位。

图3为免疫印迹法对CRIPT进行亚细胞定位。

图4为GFP-tagged CRIPT蛋白在细胞有丝分裂期重新分布。

图5为DsReD-CRIPT-C3Y蛋白在细胞内分布。

图6为Antp-CRIPT-C3Y作用的细胞α微管蛋白染色。

图7为Antp-CRIPT-C3Y治疗和对照组动物皮下肿瘤的大小。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.GFP-tagged和myc-tagged CRIPT质粒的构建及表达蛋白在细胞内定位

(1)质粒载体构建：

引物的设计与合成：根据已知的绿色荧光蛋白GFP的基因编码序列，设计并合成一对引物，引物序列如下：

GFP-5：5’-CGCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’

GFP-3：5’-CGCGGATCCTTATCTAGATCCGGTGGA-3’

以pEGFP-C1质粒为模板，用上述两个引物进行扩增，扩增出约717bp的GFP的编码序列，PCR反应程序如下：95℃预变性30s；95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。PCR产物进行核酸胶电泳纯化回收后使用NheI和BamHI双酶切，克隆至pcDNA3.1载体上。经酶切验证和测序筛选出正确的克隆pcDNA-GFP。

设计并合成CRIPT蛋白的编码序列的引物，引物序列如下：

CRIPT-5：5’-CGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’

CRIPT-3：5’-CGCAAGCTTTTATCTAGATCCGGTGGA-3’

以HeLa细胞cDNA文库为模板，使用上述两个引物进行扩增，扩增出约303bp的CRIPT编码序列(SEQ ID NO：1)，PCR反应程序同上。PCR产物经核酸电泳纯化回收后使用BamHI和HindIII双酶切，克隆至pcDNA-GFP载体，经酶切验证和测序筛选出正确的克隆pcDNA-GFP-CRIPT。再将pcDNA-GFP-CRIPT中的CRIPT序列亚克隆入我们的pcDNA-myc载体构建pcDNA-myc-CRIPT质粒。

(2)细胞转染和染色

将GFP-tagged和myc-tagged CRIPT分别转染至Neurons和HeLa等细胞，使用磷酸钙细胞转染试剂盒进行转染，操作方法以说明书为准。转染48小时后固定细胞，分别用抗MAP2抗体显示神经细胞浆骨架、myc-tag抗体显示myc-tagged CRIP T蛋白、DAPI染细胞核，利用激光扫描共聚焦显微镜照相，结果用LSM Image Browser软件进行分析。结果如图1所示，CRIPT绿色荧光蛋白在所有转染的神经细胞和非分裂期的肿瘤细胞中都只出现在细胞核内而不分布到胞浆，同样myc-tagged CRIPT的标签抗体染色信号也只出现在细胞核内。

实施例2.内源性CRIPT蛋白的亚细胞免疫荧光染色

我们产生了兔源性CRIPT多克隆抗体，并用它检查了多种不同细胞上CRIPT蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)的定位。方法如下：4％多聚甲醛室温固定Neurons和HeLa等细胞30min，经0.5％Triton X-100室温透10min后，利用5％脱脂奶粉进行室温封闭30min后，以抗CRIPT多抗(1:1000)为一抗室温孵育1h，FITC标记的山羊抗兔抗体(1:400)为二抗室温避光孵育40min。处理好的细胞利用激光扫描共聚焦显微镜照相，结果如图2所示，在不同发育阶段的小鼠脑内和培养的神经细胞及肿瘤细胞内的分布，CRIPT蛋白染色信号也只局限在细胞核内。

实施例3.免疫印迹法对CRIPT进行亚细胞定位

分别提取细胞核蛋白(N)和细胞浆蛋白(C),变性后进行SDS-PAGE电泳，电泳后湿转至尼龙膜上，5％脱脂奶粉封闭尼龙膜，室温孵育2h；将尼龙膜置入1：1000稀释的兔抗CRIPT抗体中，4℃孵育过夜，TBST洗涤NC膜3次，每次20min；将膜置入1：10000稀释的驴抗兔IgG-HRP，室温孵育1h，TBST洗涤NC膜尼龙膜3次，每次20min；ECL反应液均匀地滴在膜上，反应1min后，观察结果。结果如图3所示。结果显示CRIPT蛋白位于分离的细胞核内组分中(N)。

实施例4.有丝分裂期间GFP-CRIPT蛋白的分布

HeLa等细胞转染GFP-CRIPT24小时后执行α-tubulin和DAPI染色，照片选取分裂期的细胞。结果(如图4)显示，在静止和分裂间期的细胞中CRIPT蛋白仅表达在细胞核内，而在分裂前期GFP-CRIPT蛋白被释放到细胞质中，分裂中后期重新分布并结合到仿锤丝上与α微管蛋白(α-tubulin)的染色重叠共同定位。

实施例5.DsRed-tagged的CRIPT-C3Y蛋白在细胞内的分布

确定点突变C3Y，且该突变存在于CRIPT与α微管蛋白结合序列(aa 51-55:GKNKF)之外的调节序列(aa 2-7:VCEKCE)之内。由于这一突变不影响CRIPT与微管的结合，同时也不改变在静止和分裂间期的细胞中定位，因此，这一突变蛋白可能作为抗肿瘤试剂或作为设计抗肿瘤药物的靶点。Hela等细胞转染DsRed-CRIPT-C3Y 48小时后执行α-tubulin和DAPI染色，照片显示表达红色荧光蛋白的细胞。结果(图5)显示突变的蛋白阻断仿锤丝的运动，使大部分红色荧光蛋白的细胞停留于分裂中期，进而诱发细胞凋亡。

实施例6.Antp-CRIPT-C3Y对培养的肿瘤细胞的影响

将一个能协助蛋白分子进入细胞的16氨基酸短肽(Antp)融合到CRIPT-C3Y的氨基末端并在大肠杆菌中表达出这一突变体蛋白Antp-CRIPT-C3Y(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)。在培养的肿瘤细胞(HepG2、SMMC-7721等)培养液中加入50μM Antp-CRIPT-C3Y 24小时后，固定细胞并执行α-tubulin和DAPI染色，结果显示α-tubulin染色，超过30％细胞停留于分裂中期(如图6所示)，长时间的作用则完全阻断细胞的增值。

实施例7.Antp-CRIPT-C3Y对小鼠皮下肿瘤生长的影响

小鼠腹部皮下两侧各注射3x10⁶HepG2细胞，两周后连续12天腹腔注射100μMAntp-CRIPT-C3Y(治疗组)和生理盐水(对照组)，注射后一周分离皮下肿瘤并照相。如图7所示，Antp-CRIPT-C3Y显著地抑制了肿瘤的生长，支持其抗肿瘤作用。在细胞水平和动物模型上的实验结果都证实了CRIPT突变体蛋白Antp-CRIPT-C3Y可以作为治疗肿瘤的试剂。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽朵能生物科技有限公司

<120> 微管结合蛋白CRIPT、其治疗性突变体及其应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgtgcg aaaaatgtga aaagaaactt ggtactgtta tcactccaga tacatggaaa 60

gatggtgcta ggaataccac agaaagtggt ggaagaaagc tgaatgaaaa taaagctttg 120

acttcaaaaa aagcaagatt tgatccatat ggaaagaata agttctccac ttgtagaatt 180

tgtaaaagtt ctgtgcacca accaggttct cattactgcc agggctgtgc ctacaaaaaa 240

ggcatctgtg cgatgtgtgg aaaaaaggtt ttggatacca aaaactacaa gcaaacatct 300

gtc 303

<210> 2

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Cys Glu Lys Cys Glu Lys Lys Leu Gly Thr Val Ile Thr Pro

1 5 10 15

Asp Thr Trp Lys Asp Gly Ala Arg Asn Thr Thr Glu Ser Gly Gly Arg

20 25 30

Lys Leu Asn Glu Asn Lys Ala Leu Thr Ser Lys Lys Ala Arg Phe Asp

35 40 45

Pro Tyr Gly Lys Asn Lys Phe Ser Thr Cys Arg Ile Cys Lys Ser Ser

50 55 60

Val His Gln Pro Gly Ser His Tyr Cys Gln Gly Cys Ala Tyr Lys Lys

65 70 75 80

Gly Ile Cys Ala Met Cys Gly Lys Lys Val Leu Asp Thr Lys Asn Tyr

85 90 95

Lys Gln Thr Ser Val

100

<210> 3

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccagatta agatctggtt ccaaaatcgt cgtatgaaat ggaagaagat ggtgtacgaa 60

aaatgtgaaa agaaacttgg tactgttatc actccagata catggaaaga tggtgctagg 120

aataccacag aaagtggtgg aagaaagctg aatgaaaata aagctttgac ttcaaaaaaa 180

gcaagatttg atccatatgg aaagaataag ttctccactt gtagaatttg taaaagttct 240

gtgcaccaac caggttctca ttactgccag ggctgtgcct acaaaaaagg catctgtgcg 300

atgtgtggaa aaaaggtttt ggataccaaa aactacaagc aaacatctgt c 351

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

Met Val Tyr Glu Lys Cys Glu Lys Lys Leu Gly Thr Val Ile Thr Pro

20 25 30

Asp Thr Trp Lys Asp Gly Ala Arg Asn Thr Thr Glu Ser Gly Gly Arg

35 40 45

Lys Leu Asn Glu Asn Lys Ala Leu Thr Ser Lys Lys Ala Arg Phe Asp

50 55 60

Pro Tyr Gly Lys Asn Lys Phe Ser Thr Cys Arg Ile Cys Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val His Gln Pro Gly Ser His Tyr Cys Gln Gly Cys Ala Tyr Lys Lys

85 90 95

Gly Ile Cys Ala Met Cys Gly Lys Lys Val Leu Asp Thr Lys Asn Tyr

100 105 110

Lys Gln Thr Ser Val

115

Claims

1.一种微管结合蛋白治疗性突变体Antp-CRIPT-C3Y在制备预防、抑制和/或治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述突变体Antp-CRIPT-C3Y编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

2.一种微管结合蛋白治疗性突变体Antp-CRIPT-C3Y在制备调节细胞分化产品中的应用，其特征在于：所述突变体Antp-CRIPT-C3Y编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种微管结合蛋白治疗性突变体Antp-CRIPT-C3Y在制备调节细胞凋亡产品中的应用，其特征在于：所述突变体Antp-CRIPT-C3Y编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种微管结合蛋白治疗性突变体Antp-CRIPT-C3Y在制备调节细胞周期中纺锤体运动产品的应用，其特征在于：所述突变体Antp-CRIPT-C3Y编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。