KR19990008407A - 피시엔에이 결합물질 - Google Patents

Abstract

이 발명은 PCNA와 상호작용하는 Fen1의 프래그먼트와 PCNA가 관계되는 질병을 치료하는데 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법에 전술한 Fen1 프래그먼트 또는 유사체를 사용하는 용도에 관한 것임. 이 발명은 또한 PCNA에 결합되는 특성을 갖고 있는 물질에도 관계되는바, 이 물질은

(i) C-잔기 부위로부터 유도된 89 아미노산의 펩타이드 또는 그 활성 부분을 함유하는 Fen1 단백질의 프래그먼트; 또는

(ii) 염기배열 모티프 QGRLDxFF(식중 x는 아미노산 S, D 또는 G중에서 선택한 것임)를 함유하는 Fen1 단백질의 프래그먼트; 또는

(iii) 전술한 단백질 프래그먼트의 작용기적 유사체

를 포함함.

Description

피시엔에이 결합물질

세포내의 게놈 통합성 보존은 세포-사이클이 조절된 DNA 복제와 DNA 복구 간의 협력을 필요로 한다. 손상된 DNA가 존재할 경우, 증식성 세포들은 DNA 복제를 중지하므로서 병변들이 달라붙지 않도록 하고 손상이 복구된후 다시 DNA 복제를 시작한다. 따라서 전술한 두 공정의 협력은 변성과 게놈 불안전성을 피하는데 절대적으로 필요하다. DNA 복제와 뉴클리오타이드 절제 복구 모두에 관여하는 것으로 알려진 단백질중에는 증식성 세포핵 항원(PCNA)이 있다.

사카로마이세스 세레비시애로부터 유도된 PCNA는 용액속에서 트리머로 존재하는 것으로 생각된다. 각 모노머는 중심 루우프에 의하여 분리된 두 개의 구조적으로 유사한 영역을 갖고 있고, 그에 따라 트리머는 X-선 결정학적 분석에 의하여 측정된 총 여섯겹의 대칭성(overall six-fold symmetry)을 보여준다(공 등, 1992; 크리슈나 등, 1994). 아미노산 단위가 다름에도 불구하고, 사람 PCNA는 발아용 효모 PCNA와 구조단위에서 높은 상동이 있는 것으로 생각된다(크리슈나 등, 1994). 이러한 구조단위 연구는 트리머 PCNA가 DNA 주위에 토로이드 구조를 형성하고 있다는 것을 보여 주므로서, PCNA가 두 가닥의 DNA 주위에 슬라이딩 클램프로 작용한다고(큐리얀과 오 돈넬에 의한 관찰, 1993) 추측한 초기 생화학적 연구를 확인시키고, 그 주형(template)상에 DNA 복제기구를 지지하여 그 가공성을 크게 향상시킬수 있다는 사실을 확인 시켰다(브라보, 1987; 프렐리히 등, 1987b). PCNA는 핵 내의 DNA 합성 사이트에 위치하고(브라보 및 맥도날도-브라보, 1985) 정제된 단백질으로부터 시험관내에서 SV40 DNA 복제를 재형성하는데 요구되는바(프레리히 등, 1992), 이러한 사실은 PCNA가 DNA 복제에 필요한 성분임을 나타낸다. 유사하게 pcn1이 결실되었을 때에는 DNA 복제에 쉬조사카로마이세스 폼베 PCNA 유전자 pcn1이 표현형 결손 특성을 보여주는 세포들과 함께 필수적으로 요구된다.(와심 등, 1992). PCNA는 그 복제역할 외에도 무세포(cell-free) 시스템에서 뉴클리오타이드 절제 복구에도 요구된다(시비 등, 1992). 그러나 PCNA가 전술한 두 별도의 역할을 수행하는 과정은 아직까지 분명하게 알려지지 않았다.

[발명의 개요]

본 발명은 사람 단백질 Fen1이 PCNA와 상호작용한다는데 착안하여 발명한 것이다. 이러한 Fen1과 PCNA의 상호작용은 세포환경에서 사람 PCNA와 상호작용하는 사람 cDNA 라이브라리에 의하여 암호화된 단백질에 대한 두 효모 혼성 스크린(yeast two hybrid screen)을 이용하므로서 확인할수 있었다.

Fen1은 사람 색소성 건피증 보체 G 그룹 단백질 (하브라켄 등, 1994; 오 도노반 등, 1994), 에스. 폼베 rad 2(S. Pombe rad 2)과 rad 13 (카 등, 1993; 머레이 등 1994) 및 에스. 세레비시애 RAD27/YKL510과 RAD2 (재키어 등, 1992; 시에드 와 프리이드버그, 1992)를 포함하는 추정상의 뉴클리오타이드 제거 복구 인자와 상동성을 갖는 5′-＞3＇익소뉴클리아제 활성 (로빈스 등, 1994)을 갖는 구조-특이적 엔도뉴클리아제 (해링톤과 리이버, 1994a)로서 기재되어 있다. 그러나 동일한 단백질이 필수 DNA 복제 인자 MF1으로 확인되었다(와가 등, 1994a).

본 발명은 또한 각 단백질의 상호간 결합 사이트의 유전자 지도 제작에 의한 아미노산 단위에서의 Fen1 과 PCNA 간 상호작용의 특성화에도 관계된다. 이러한 사실은 DNA 복제에서 PCNA의 기능을 차단하지만 (플로어스 등, 1994; 와가 등, 1994b; 와브릭 등, 1995) 복구하지 않는 (리 등, 1994; 시비 등, 1994) 사이클린-키나제 저해제인 p21^Cip1(또한 p21^WAF1또는 Sdi1으로 알려짐)이 Fen1과 동일하게 PCNA의 동일한 사이트에 결합됨을 나타낸다. PCNA와 상호작용하는 Fen1과 p21^Cip1의 부위는 상동이 있는 것으로 보이며, p21^Cip1펩타이드는 PCNA에 결합할때 Fen1과 경쟁하는 것으로 나타났다.

p21^Cip1또는 그 프래그먼트, 특히 PCNA 결합에 관하여 설명된 출원인의 선출원 PCT/GB95/02583에서 확인된바와 같은 p21^Cip1부위가 PCNA에 대하여 Fen1과 경쟁한다는 사실은 특히 세포성 DNA 복제를 차단하거나 저해하는 p21^Cip1에 대한 유사체의 스크리닝에 Fen1을 사용할수 있는 가능성을 제시한다.

본 발명의 한 형태는 PCNA에 대한 결합특성을 갖는 물질에 있어서, 전술한 물질이

(i) C-잔기 부위 또는 그 활성부분으로부터 유도된 89 아미노산의 펩타이드를 포함하는 Fen1 단백질의 프래그먼트; 또는

(ii) 시퀀스 모티프 QGRLDxFF를 포함하는 Fen1 단백질의 프래그먼트; 또는

(iii) 전술한 단백질 프래그먼트의 작용기적 유사체

를 포함하는 물질임을 특징으로 하는 것이다.

전술한 x는 S, D 또는 G 아미노산이 바람직 하지만, 기타의 다른 아미노산일수도 있다.

본 발명에서 활성부분은 전술한 총 길이의 Fen1 아미노산 염기배열 보다 적으면서 PCNA에 대한 결합특성을 유지하는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에서, 작용기적 유사체는 펩타이드가 아니지만 PCNA에 대한 결합특성을 갖고 있는 물질로서 본 출원인의 선출원에 기재된 p21^Cip1을 제외한 물질을 의미한다.

본 발명의 다른 형태는 전술한 바와 같은 Fen1 의 프래그먼트 또는 그 유사체로된 결합제를 사용하여 검사하는 검사방법에 관계된다. 특히, 본 발명은 PCNA와 결합되는 Fen1이나 그 프래그먼트 또는 그 유사체(이하 Fen1 성분이라 함)와 PCNA 또는 그 활성 프래그먼트에대한 후보 유사체(이하 PCNA 성분이라 함)를 접촉시켜 후보(candidate) 유사체와 Fen1 성분이 PCNA 성분과 결합하기 위하여 경쟁하도록 하는 공정 및 후보 유사체 및/또는 Fen1 성분에 대한 PCNA 성분의 결합정도를 검사하는 공정을 포함하는 Fen1 또는 p21^Cip1유사체를 스크리닝하는 방법에 관계된다. PCNA에 결합되는 것으로 알려진 후보 유사체는 특히 DNA 합성을 억제하거나 또는 (종양) 세포의 생장을 억제하는 것과 같은 생물학적 활성을 위하여 스크리닝할수 있다.

일반적으로 스크리닝방법은 Fen1의 프래그먼트 또는 유사체를 고체 지지체에 고정시키는 공정과 고정된 Fen1 성분을 PCNA 및 다양한 농도의 후보 유사체에 접촉시키는 공정을 포함한다. 고정된 Fen1에 결합되는 PCNA의 결합정도는 PCNA를 검출하는 항체를 사용하여 측정할수 있다. 또한 신틸레이션 근접 검사법에 의하여 방사선 표지 PCNA와 고정된 Fen1의 상호작용을 이용하는 방법으로 측정할수도 있다. 당해업계의 기술자들은 Fen1 프래그먼트 또는 유사체를 사용하는 다른 검사방식과 스크리닝기술을 선택하여 후보 유사체를 용이하게 스크리닝할수 있다.

본 발명의 또 다른 형태는 전술한 스크리닝방법을 사용하여 얻은 유사체에도 관계된다.

공지의 의약 활성 화합물에 대한 유사체의 디자인은 선도 화합물을 기초로한 의약품 개발에 대하여 알려진 접근방법이다. 이러한 접근방법은 활성 화합물이 합성하기 곤란하거나 또는 제조비용이 많이드는 화합물이거나 또는 특수한 투여방법에 부적당한 화합물인 경우에 요구되는 방법이다. 예를들면 단백질은 소화관에서 프로테아제에 의하여 쉽게 분해되므로 경구투여에 부적당한 화합물일수 있다.

주어진 표적특성을 갖는 화합물로부터 유사체를 디자인하는데는 일반적으로 몇 단계가 있다. 첫째, 표적특성을 부여하는데 임계적이고 중요한 화합물의 특수한 부분을 결정한다. 펩타이드의 경우에는, 이러한 공정이 예를들면 펩타이드에 있는 각 아미노산 잔기를 치환하는 것과 같이 아미노산 잔기를 대칭적으로 변화시키므로서 실행될수 있다. 화합물의 활성 부위를 구성하는 이러한 부분들 또는 잔기들은 파마코포어(pharmacophore)로 알려져 있다.

파마코포어를 찾아내면 NMR, X-선 굴절 데이터등과 같은 분광학적 기법에 의한 시험 데이터로부터 나오는 이들의 물성, 예를들면 입체화학, 결합, 크기 및 하전 등에 의하여 그 구조를 만든다. 전술한 모델링 공정에는 파마코포어의 컴퓨터 분석, 유사성 지도작성(이들은 파마코포어의 원자들간의 결합보다는 하전 및/또는 용량을 모델링한다) 및 다른 기술이 사용될수 있다.

이러한 다양한 접근방법에 의하여 리간드(ligand)와 그 결합 파트너(partner)의 3차원 구조가 만들어 진다. 이러한 모형은 리간드 및/또는 그 결합 파트너와 결합하면서 입체적 배향이 바뀔수 있으므로 유사체를 디자인할 때 이러한 사실을 고려하면 전술한 모형을 매우 유용하게 이용할수 있다.

주형 분자는 분자내에 파마코포어를 형성하는 화학적 작용기가 결합되도록 선택한다. 주형분자와 그 위에 결합된 화학적 작용기들은 쉽게 선택할수 있기 때문에 유사체들은 의약적으로 허용될수 있고 생체내에서 바람직한 생분해 형태를 가지면서 선도 화합물의 생물학적 활성을 유지하도록 용이하게 합성할수 있다. 이러한 접근방법에 의하여 발견된 유사체들은 그들이 목적하는 물성을 갖고 있는지 또는 그들이 물성을 나타내는 범위가 어느 정도인지를 보기 위하여 스크린할수 있다. 더구나 하나 또는 그 이상의 시험관내, 생체내 또는 임상실험용 최종 유사체를 얻기 위하여는 더 개량하거나 변형시킬수도 있다.

최종 유사체는 임상용으로 사용할수도 있고 약국에서 판매하는 약품으로 유용하게 이용될수도 있다. 임상용의 경우, 바람직한 분해 형태는 분해가 최소한으로 일어나도록된 것일수도 있으나 적당한 분해속도를 갖는 것이 바람직하며, 실제적으로 적당한 분해속도를 갖도록 하는 것이 중요하다. 예를들면 p21^Cip1유사체는 p21^Cip1억제를 무시하는 세포, 예를들면 비정상적으로 높은 수치의 PCNA를 포함하는 암 세포에 게노톡식(genotoxic) 화합물을 투여하는 동안 정상 세포의 세포 증식을 일시적으로 억제하기 위한 짧은 반감기를 갖고 있는 보조제로서 사용될수 있다.

따라서 본 발명의 다른 형태에서는 Fen1의 PCNA-결합부위에 기초하여 전술한바와 같이 얻어지는 펩타이드와 유사체들을 제공한다. 이러한 화합물들과 유사체들은 PCNA와 관련된 상태, 예를들면 암과 건선같은 과증식성 질병을 치료하기 위한 의약품 제조에 유용하게 사용할수 있다.

본 발명의 치료방법은 전술한바와 같은 각종 펩타이드와 유사체의 투여를 포함한다. 치료제의 투여 방법은 공지의 각종 제제형태와 그 처리방법을 이용할수 있다. 용량은 상용 실험에 의하여 결정될수 있다. 투여는 전신계 투여일수도 있고 표적 투여일수도 있는바, 후자의 경우는 치료제를 표적 세포에 직접적(예를들면 국부적)으로 처리하는 방법을 이용할수도 있고, 세포형 특수 항체 또는 리간드와 같은 표적 시스템을 이용할수도 있다. 표적 처리는 부작용을 최소화하고 국부화할수 있으므로 바람직하다. 그리고 표적처리는 치료제가 전신계로 투여하기에는 허용할수 없을 정도의 높은 독성을 갖고 있거나 또는 너무 높은 용량을 요구하는 경우, 또는 치료제가 다른 방법으로는 표적 세포에 들어갈수 없는 경우에 특히 유용하게 이용할수 있다.

이러한 치료제들은 직접 투여하는 대신, 치료제들이 세포들속으로 도입된 암호화된 유전자로부터 발현되도록 하여 표적 세포, 예를들면 바이러스성 인자에서 생성되도록 할수도 있다. (VDEPT 기술의 변형-후에 구체적으로 설명함). 전술한 바이러스성 인자는 치료할 특이세포를 목표로하여 투입될수도 있고 표적 세포에 선택적으로 결합된 조절인자들을 포함할수도 있다.

또한 치료제들은 치료할 세포내에서 생성되거나 또는 세포에 투입된 활성화제에 의하여 활성 형태로 전환되는 전구체의 형태로 투여될수도 있다. 이러한 형태의 접근방법은 ADEPT 또는 VDEPT로 알려졌다. 전자는 활성제가 세포형 특이 항체에 결합되도록 세포에 투입하는 공정을 포함하고, 후자는 활성제, 예를들면 효모가 바이러스성 인자의 암호화된 DNA로부터 발현되어 생성되도록 하는 공정을 포함한다.(EP-A-415731 및 WO-90/07936gh 참조)

본 발명의 또 다른 형태는 Fen1이 결합된 PCNA 부위를 확인하는 것이다. 따라서 본 발명은 Fen1에 대한 결합특성을 갖는 물질을 제공하는바, 이 물질은 아미노산 100-150 사이에 위치하는 PCNA 프래그먼트 또는 그 활성 부분 또는 전술한 단백질 프래그먼트의 작용기적 유사체를 포함한다.

이러한 부위에 있는 PCNA의 프래그먼트가 p21^Cip1또는 Fen1에 결합되는 능력을 갖고 있으면, 이들은 (i) P21^Cip1용량을 조절하거나, (ii) PCNA에 있는 결합 사이트에 결합되는 물질의 모형에 서 Fen1 또는 p21^Cip1유사체를 스크린하거나, (iii) 예를들면 노화 세포를 재활성화하기 위한 과증식성 세포를 증식시키기 위하여 사용될수 있다.

본 발명은 암 치료분야에 관계되는 것으로서, 특히 본발명은 PCNA와 상호작용하는 Fen1의 프래그먼트와 PCNA가 관계되는 질병치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법에 이용하는 전술한 FEn1의 프래그먼트 또는 그 유사체의 용도에 관한 것이다.

도 1은 사람 PCNA와의 상호작용에 의하여 두 효모 혼성 스크린에서 분리한 사람 Fen1과 프래그먼트들을 보여주는 개략도이다. (A)는 보존된 뉴클레아제 영역과 Fen1 계통군(family)을 통하여 보존된 카복시 말단 Fen1 박스(box)를 보여주는 Fen1의 개략도이고, (B)는 Fen1 프래그먼트를 암호화한 9 개의 플라스미드들이 전체 길이의 Fen1과 아미노 말단기에서 절취한 다양한 프래그먼트를 암호화하면서 두 효모 혼성 스크린에서 분리되었음을 보여준다. 분리된 가장 짧은 프래그먼트는 Fen1의 C-잔기 영역으로부터 나온 89 아미노산들을 포함한다.

도 2는 Fen1 상동(homology)들 사이에 있는 PCNA 결합 사이트의 보존을 보여 준다. 침전검사(다음에 구체적으로 설명함)에서 PCNA에 결합된 펩타이드 염기배열은 QGRLDxFF의 일치된 염기배열을 나타내도록 정열된다. p21^Cip1에 있는 PCNA 결합사이트를 갖는 임계 잔기들의 보존은 볼드체(bold type)로 표시하였다.

도 3은 PCNA에 있는 Fen1 결합 사이트의 측정결과를 보여 준다. 일련의 PCNA의 N-잔기와 C-잔기 결실은 Ga14의 DNA 결합 영역을 갖는 골격에 나타나고 Ga14의 전사 활성화 영역에 융합된 Fen1과 함께 두 혼성 시스템에서 공동발현되었다. 작용기적 Ga14 전사인자의 재구성은 β-갈라토시다제 또는 His3 활성을 위한 검사결과(√기호)로 기록되었다. 총 PCNA 모노머는 크리샤 등(1994)에 의하여 기술된바와 같이 설계된 구조적인 영역 및 모티프와 함께 도시되었다. 동시에 실시된 일련의 실험에서는 PCNA와 상호작용하는 p21^Cip1을 분석하였다. Fen1과 p21^Cip1은 PCNA 구조와 동일한 형태로 결합되었음을 보여주는바, 각 단백질에 대한 PCNA의 결합부위는 중앙의 100-150 아미노산에 국한되었으며 영역 1의 βI₁과 영역 2의 βA₂-αA₂사이에 노출된 루우프(loop)를 포함하고 있다.

도 4는 p21^Cip1의 짧은 펩타이드가 PCNA에 결합하기 위하여 Fen1PBP(다음에 구체적으로 설명함)와 어떻게 경쟁하는지 보여 준다. 비오티닐화된 Fen1PBP(펩타이드 84 - 도 2 참조)는 스트렙타비딘으로 미리 피복된 ELISA 플레이트에 고정시킨다. 재조합 사람 PCNA를 과발현하는 박테리아성 세포 용해질은 p21PBP로부터 유도된 비오티닐화되지 아니한 9 아미노산 펩타이드 QTSMTDFYH의 양을 증가시키면서 첨가하여 혼합하고(와브릭 등, 1995), 이어서 PCNA에 대한 폴리클로날 항체 3009를 사용하여 고정된 Fen1PBPdp 대한 PCNA의 결합을 측정한 다음, HRP-항-토끼 항체를 사용하여 450nm에서 비색검사를 실시하였다. p21^Cip1펩타이드는 오직 1 μg/ml (대략 1 μM)에서만 Fen1PBP에 대한 PCNA 결합을 완전히 방지하였다.

효모에서의 두 혼성 스크린 및 결실 구조

이미 설명한바와 같이 두 혼성 스크린과 결실분석을 실시하였다(와브릭 등, 1995 및 국제특허출원 PCT/GB95/02583). 사람 PCNA 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 나온 프래그먼트를 pAS2로 서브클론화하여 추가의 구조를 만든다.

단백질 침전 및 웨스턴 블로팅(western blotting)

15 아미노산 오버랩(overlaps)을 갖는 20 아미노산 펩타이드를 Fen1의 PCNA 결합 사이트 같은 두 혼성 스크린에서 확인된 Fen1의 C-잔기 부위로부터 89 아미노산을 가로지르도록 합성한다.(치론 미모토프스, 오스트랄리아) 이러한 펩타이드들은 아미노 말단부에 있는 잔기를 통하여 비오틴에 연결되었다. 각 펩타이드 2.7 μg을 실온(r.t.)의 완충 식염수(PBS) 중에서 1시간 동안 스트렙타비딘 아가로즈 비이드(시그마) 10 ㎕로 배양하고, 비이드들을 PBS로 세척한 다음, 매번 11,600g 씩 원심분리하여 회수한다. HeLa 세포 용해질을 세척한 비이드에 가하여 단백질의 최종 농도가 1 mg/ml로 되도록 하고, 얼음위에서 비이드와 함께 1 시간동안 반응시킨다. 비이드들을 220 mM NaCl을 포함하는 PBS로 세척하고 0.2M DTT를 포함하는 SDS 함유 완충액에서 8분 동안 끓인 다음, 결합된 단백질을 회수한다. 단백질들은 10% SDS-PAGE 로 분리하고 전기영동방법을 이용하여 니트로셀룰로우스로 옮긴다. 블럿트(Blots)를 블로킹하고, 이어서 10% FCS를 포함하는 DMEM과 1 : 5의 비율로 희석한 PC10 하이브리도마 상등액(와심 과 레인, 1990)에서 1 시간 동안 배양한다. 세척한 다음, 2% 탈지우유-PBS-0.2% Tween에 1 : 1000의 비율로 배합된 2차 HRP-접합 항-마우스 IgG 혈청을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시킨다. 접합된 항체는 ECL 시스템을 이용하여 제조업자( 앰머샴 피엘시)의 지시에 따라 가시화시킨다.

경쟁적 ELISA

ELISA 플레이트를 37℃에서 밤새 동안 웰 당 100 ng의 스트렙타비딘으로 피복한다. 플레이트들을 탈지 분유 5%를 함유하는 PBS(인산염 와충 식염수 용액)로 블로킹하고 0.2% Tween 20 (PBS-T)를 함유하는 PBS로 세척한 다음, 각개 웰에 Fen1PBP -펩타이드 84 (도 2 참조)- 10 μg/ml를 함유하는 용액 100 ㎕ 를 첨가한다. 함습실에서 실온으로 1 시간 동안 배양한 다음 웰들을 세척한다. 과발현된 재조합 사람 PCNA를 포함하는 대략 3.5 μg의 총 단백질을 염기배열 QTSMTDFYH( HPLC로 정제하고 질량분석기로 확인한 것임 )의 p21PBP로부터 유도된 다양한 농도의 9 아미노산 펩타이드와 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안에 걸쳐 웰들에 처리한다. 세척한후 항-PCNA 폴리클로날 항체 3009(칵스 등, 제조 지침서)를 1 : 1000의 비율로 첨가하고, 이어서 HRP-접합 항-또끼 IgG 혈청을 1 : 1000의 비율로 첨가한 다음, 접합된 항체는 TMB 발색공정에 의하여 가시화시킨다(할로우 와 레인, 1988). 플레이트들은 다이나텍 5000 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 판독한다.

결과

상호작용 트랩내의 Fen1 결합 PCNA의 C-잔기로부터 유도된 89 아미노산.

사람 PCNA와 물리적으로 상호작용하는 단백질은 효모 사카로마이세스 세레비시애에서 작용기적 Ga14 전이 활성물질의 재구성에 의하여 단백질-단백질 상호반응을 검출하는 두 혼성 상호작용 트랩 시스템을 이용하여 스크린한다. Ga14(Ga14AS)의 DNA 결합 영역과 융합된 사람 PCNA를 나타내는 플라스미드가 Ga14의 전이 활성 영역(Ga14ACT)을 갖는 사람 cDNA 라이브러리로부터 유도된 프래그먼트에 의하여 암호화된 분자들의 융합구조를 나타내는 프라스미드를 스크린하는데 이용된다. DNA 염기배열결정법에 의하여, 전술한 스크리닝에 의하여 분리된 클론중의 하나는 사람 단백질 Fen1의 프래그먼트(하링톤 및 리에버, 1994a; 하링톤 및 리에버, 1994b)를 암호화한다는 것을 알게 되었는바, 이들은 DNase IV (로빈스 등, 1994), rad2hs (머래이 등, 1994) 및 MF1(와가 등, 1994a)로 알려진 것 들이다. 본인들의 스크리닝(도 1)에 의하여 분리된 최소 Fen1 프래그먼트는 단백질(총 길이 380aa; 머레이 등, 1994)의 C-잔기로부터 89 아미노산을 암호화하며, 이러한 암호화는 PCNA 결합 사이트를 전술한 잔기들에 국한시킨다. 드로소필라 멜라노개스터와 시조사카로마이세스 폼베의 PCNA는 이 시스템에서 사람 Fen1과 상호반응하였는데, 이는 PCNA에 있는 상호반응 사이트의 강력한 전개 보존을 암시한다.

PCNA와의 상호작용에 중요한 Fen1 사이트의 펩타이드 지도작성

PCNA가 결합되는 Fen1의 잔기에 대한 정확한 지도를 작성하기 위하여, 두 혼성 스크린(도 1)에서 PCNA와 상호작용하는 것으로 알려진 Fen1 부위를 대표하는 일족의 비오틴화 20 아미노산 펩타이드(15 아미노산 오버랩을 갖고 있음)를 합성한다. Fen1 펩타이드(스트렙트아비딘 아가로즈 비이드와 결합된 것)는 사람의 HeLa 세포 추출액과 함께 배양하고 비이트들을 침전시킨 다음, 결합된 단백질은 모노클로날 항-PCNA 항체 PC10(와심과 레인, 1990)로 확인한 임무노블로트로 분석하였다. 결과는 PCNA가 HeLa 세포 추출물로부터 펩타이드 84, 85, 86(도 2 참조)에 의하여 동일한 효율을 갖는 침전물로 침전되었는바, 이러한 사실은 전술한 3 개의 Fen1 펩타이드에 공통적으로 존재하는 아미노산 TQGRLDDFFK가 PCNA에 대한 결합에 중요함을 강력하게 암시한다. 잔류 추출물중에 존재하는 PCNA의 양을 비교한 결과 현저한 량의 PCNA 단백질이 펩타이드 84, 86에 의하여 전체 세포 용해질로부터 침전되었음을 보여 주는바, 이는 PCNA와 Fen1 펩타이드 사이에 높은 친화력의 상호작용이 있음을 나타내는 것이다.

PCNA 결합 공통 염기배열

침전분석에서 PCNA에 의하여 확인된 사람 Fen1의 영역은 Fen1 계통군에 보존된 모티프를 포함한다. 본인들은 사람 PCNA가 Fen1, 에스. 폼베 rad 2 및 에스. 폼베 RAD27/YKL510의 효모 에서 전술한 모티프에 결합될수 있는지 실험하였다. 비오티닐화 펩타이드들은 Fen1 부분이 PCNA와 상호작용하는 것으로 나타난 영역 상동에서 애스. 폼베 rad 2 (머레이 등, 1994) 및 에스. 세레비시애 RAD27/YKL510 (재키어 등, 1992)의 공지된 염기배열에 따라 합성하였다. 이러한 펩타이드 92 및 93 (도 2 참조)은 전술한 침전반응에 사용하였다. 에스. 폼베 (펩타이드 92) 및 에스. 세레비시애 (펩타이드 93)로부터 얻은 보존된 박스의 20 아미노산 펩타이드에 의하여 HeLa 세포 추출물로부터 침전된 단백질의 PC10 임무노블로트는 PCNA가 Fen1 펩타이드 84-86에 유사한 친화력으로 rad 2 및 RAD27의 보존 부위에 결합됨을 보여 주는바, 이는 결합 모티프의 현저한 보존을 나타내는 것이다. 이미 확인된 p21Cip1-PCNA (p21PBP - 와브릭, 1995)에 대한 PCNA의 결합은 양성대조용으로 사용하고 스트렙트아비딘-아가로즈 비이드들은 음성대조용으로 사용하였다. 본인들은 다양한 종으로부터 유도된 이러한 PCNA-상호작용 펩타이드들의 염기배열들을 비교하여 QGRLDxFF의 PCNA 결합 사이트를 확인할수 있었다.

Fen1은 에스. 폼베의 rad 2 및 에스. 세레비시애의 RAD27/YKL510에 가장 가까운 상동이지만 추정 뉴클리오타이드 절제 복구-관련 단백질 rad13 (에스. 폼베), RAD2 (에스. 세레비시애) 및 사람 색소성 건피증 보체 그룹 G 단백질과 함께 한정된 상동을 공유한다. 이러한 염기배열은 본인들이 발견한 PCNA에 결합되는 Fen1 부위에서 유사성을 보여주는바, 이러한 사실은 PCNA에 결합되는 부위가 새로운 PCNA 결합 모티프임을 확인하는 것이다. 본인들이 PCNA에 결합하는데 꼭 필요한 것으로 발견한 p21^Cip1의 잔기들은 PCNA와의 상호작용을 위하여 Fen1 계통군의 구성성분들에서 요구되는 것과 극히 유사하다.

PCNA의 중앙 영역과 Fen1의 상호작용

본인들은 Fen1 결합에 중요한 PCNA의 부위를 확인하기 위하여 GAl4AS에 융합된 PCNA의 결실구조들을 만들고 두 혼성 스크린 시스템에서 Fen1 플라스미드와 상호작용할수 있는 능력을 시험하였다. 그 결과는 Fen1이 PCNA 잔기 100 및 150 사이의 부위에 결합됨을 보여준다(도3). 이 부위는 각 모노머의 두 영역 사이에 있는 PCNA의 중앙 루우프에 해당하고 에스. 세레비시애 PCNA의 결정구조로부터 유도된 구조적인 모티프 βI1, βA2 및 αA2를 포함한다. 또한 이 부위는 PCNA의 N-잔기 결실을 이용하는 PCNA에 대한 사이클린-키나제 억제제 p21^Cip1의 결합(와브릭 등, 1995)에도 관계된다. 따라서, 본인들은 새로운 일련의 결실구조를 이용하는 두 혼성 시스템에서 p21^Cip1-PCNA 상호작용에 대한 종래의 관찰을 확인하고 Fen1과 p21^Cip1이 PCNA의 동일한 부위에 결합된다는 것을 증명하였다.

PCNA와 결합하기 위한 Fen1과 p21^Cip1의 경쟁

Fen1과 결합된 PCNA의 부위는 p21^Cip1에 의하여 확인된 부위와 동일하고, PCNA 상호작용을 위하여 요구되는 Fen1의 모티프는 p21PBP의 임계잔기에 대한 상동으로 나타나므로, Fen1과 p21^Cip1은 PCNA에 결합하기 위하여 경쟁하게 된다. 본인들은 ELISA 웰에 고정된 Fen1의 PCNA-상호작용 펩타이드 84(Fen1-PCNA 결합 펩타이드를 위하여 Fen1PBP를 추가한 것임)를 이용하여 이러한 가설을 시험하였다. 재조합 사람 PCNA를 와브릭 등(1995)에 의하여 정의된바와 같은 PCNA 상호작용을 위한 임계 아미노산, QTSMTDFYH를 함유하는 p21^Cip1의 비오티닐화 되지 않은 9-mer 펩타이드의 양을 증가시키면서 첨가하였다. 이러한 p21^Cip1의 짧은 펩타이드는 Fen1PBP에 결합되는 PCNA와 경쟁하여 p21^Cip1펩타이드가 첨가된 고정된 1μM 의 Fen1PBP로부터 PCNA를 완전히 치환시켰다. Fen1PBP에 대한 펩타이드의 비특이성 효과를 억제하기 위하여 부적절한 20-mer 펩타이드를 사용하였고 Fen1PBP에 결합되는 PCNA에 대한 용매로서 DMSO를 사용하였다.

토의

이 출원에서는 DNA 복제와 DNA 복구에 관련된 두 단백질의 직접적인 상호작용; 플랩 엔도뉴클리아제 Fen1(해링톤 과 리이버, 1994a) [DNase IV (로빈스 등, 1994), rad2hs (머레이 등, 1994) 및 MF1 (와가 등, 1994)로도 알려져 있음] 및 DNA 폴리머라제 δ보조 슬라이딩 클램프, PCNA (브라보 등, 1987; 프렐리히 등, 1987 b)에 대하여 설명하였다. 본인들은 두 혼성지도를 작성한 결과로부터 PCNA 결합 사이트를 포함하는 Fen1의 89 아미노산을 확인하였다. 또한 본인들은 두 혼성 스크린에서 분리한 가장 짧은 Fen1 프래그먼트를 사용하여 합성한 펩타이드를 사용하여 분석한 결과, 3개의 중복 Fen1-PCNA 결합 펩타이드(Fen1PBPs)에 대한 PCNA의 지도를 작성할수 있었다. 에스. 세레비시애 (YKL510/RAD27) 및 에스 폼베 (rad2)의 Fen1 상동으로부터 유도된 이러한 Fen1 펩타이드에서의 염기배열 중복을 비교한 결과 PCNA 결합 부위가 8 아미노산: QGRLDxFF임을 확인하였다. 이 모티프는 에스. 폼베 rad13 유전자 제품, 에스. 세레비시애 RAD2 및 사람 색소성 건피증 XP-G 단백질을 포함하는 Fen1과 제한된 상동을 공유하는 뉴클리오타이드 절제 복구에 필요한 단백질의 다른 일족에 부분적으로 보존된다. PCNA 결합에 필수적으로 요구되는 잔기는 PCNA와의 상호작용에 요구되는 (와브릭 등, 1995) 사이클린-키나제 억제인자, p21^Cip1부위와 공유된다. 따라서, 이 모티프는 신규한 PCNA 결합 공동체로 정의할수 있다.

일련의 PCNA의 아미노 말단기와 카복시 말단기 결실은 각 PCNA 모노머의 두 영역 사이에 있는 루우프에 노출된 잔기를 포함하는 아미노산 100과 150 사이의 부위에 Fen1 결합 사이트를 한정시킨다. 본인들의 데이터에 의하면, 비록 각개 아미노산 단위에서 Fen1 결합 사이트를 정의하지는 못하지만, 용액중에 노출된 대부분의 잔기, 즉 루우프의 17 아미노산내에 포함된 잔기들에서 상호반응이 일어남은 확인할수 있었다.

멜라노개스터와 에스. 폼베로부터의 PCNA가 두 혼성 시스템에서 사람 Fen1의 프래그먼트에 결합되므로, 상호작용은 Fen1 상동은 물론이고 PCNA에 대하여서도 전개를 가로지르도록 보존된다. 이와같은 상호작용의 보존정도는 이러한 상호작용이 세포성 DNA 복제 및/또는 복구에 절대적으로 필요한 것일수 있음을 암시한다. 본인들은 이 PCNA의 중앙 루우프가 p21^Cip1에 대한 결합사이트를 제공함을 이미 설명하였다. Fen1과 p21^Cip1이 PCNA 결합에 필수적인 아미노산을 공유하고 PCNA에 있는 동일한 사이트에 결합하는 것으로 나타나므로, 이들은 PCNA 기능을 선택적으로 조절하게 되고 그에 따라 이러한 단백질들은 암이나 기타의 과증식 질병의 치료에 사용할수 있음을 예측할수 있다.

PCNA는 DNA 복제기구를 그들의 주형에 유지시키는 슬라이딩 클램프로서 작용하고 효모의 작용성을 향상시키므로 핵 DNA 에 중요하다. 더구나 PCNA는 뉴클리오타이드 절제 복구에도 요구된다(시비 등, 1992). PCNA는 각개 공정에 특이한 단백질과의 상호작용에 의한 복제와 복구의 상이한 역할에 이용될수도 있다. 따라서 PCNA 파트너의 시험은 DNA 복구과 DNA 합성을 이해하는데 결정적인 역할을 한다. 이러한 시험은 PCNA와 구조-특이성 엔도뉴클리아제인 Fen1간의 상호작용을 증명한다.

PCNA와 Fen1 간의 직접적인 상호작용의 증명은 이와같은 복합체의 생물학적 기능과 작용의 의문점을 요구한다. 두 가설은 본인들의 다음과 같은 데이터와도 일치한다: (1) PCNA-Fen1 복합체는 DNA 복제에 기여한다; (2) 복합체는 DNA 복구에 활성적이다. 알려진 Fen1의 활성이 전술한 가설중의 하나를 뒷받침하는가? Fen1 단백질은 공지된 복구 유전자 제품의 상동이기 때문에 포유류 뉴클리오타이드 절제 복구에 기여하는 것으로 추축되었다. 전술한 Fen1 단백질은 에스. 폼베 rad2 유전자 제품의 상동으로 확인된 구조-특이성 플랩 엔도뉴클리아제이다.[rad2hs(머레이 등, 1994), DNase IV(로빈스 등, 1994)] 전술한 Fen1 단백질은 전체 플랩구조를 요구하면서 독립적인 플랩 길이로 작용하는 5' 단일 스트랜드 부위에서 끝나는 DNA 플랩을 절단한다(해링톤과 리이버, 1994). 또한 Fen1은 2중 스트랜드 DNA에 대한 특이성 5'-3' 익소뉴클리아제 활성을 갖고 있다(해링톤과 리에버, 1994a). 사람과 마우스 Fen1은 에스. 세르비시애로부터 유도된 구조-특이성 엔도뉴클리아제 YKL510 (RAD27)과 RAD2(해링톤과 리에버, 1994b) 및 ERCC5(시오미 등, 1994)로 알려진 사람 색소성 건피증 보체 G 그룹 단백질(머레이 등, 1994)을 갖고 있는 상동을 공유한다. 에스. 세레비시애 RAD2 유전자의 촉진인자에는 두 자외선 유도 일차측 요소들이 존재하는바, 이는 DNA 복구 유전자의 특성인 게노톡시 발작을 가져오는 증가된 단백질 결합을 보여주는 것이다(시에드와 프리이드버그). 이러한 두 요소 DRE1과 DRE2 중 DRE1의 결실은 오직 G1/S에서만 증가된 자외선 감수성을 가져오고 DRE2의 결실은 G1/S, S/G2 및 고정상이 보다 큰 감수성을 갖도록 하므로 전술한 두 요소는 세포 사이클을 통하여 미분조절될수 있다(시에드와 프리이드버그, 1992). Fen1과 특성화된 복구 단백질 간의 구조적 및 작용기적 상동은 Fen1이 포유동물 뉴클리오타이드 절제 복구에 관계된다는 추측을 확인하는 것이다.

Fen1이 DNA 복제에 추가의 역할을 한다는 사실은 여러 경로로 입증되고 있다. Fen1은 복제된 SV40 DNA를 폐쇄된 원(form I)으로 성숙시키는데 필수적이며 오카자키 프래그먼트(와가 등, 1994a)로부터 리보뉴클리오타이드 프라이머를 제거할수 있는 RNase H 활성을 갖고 있다(와가 등, 1994a). Fen1의 소 상동은 DNA 폴리머라제 ε^∈의 부분적으로 정제된 유분에서 검출되었으며 이 소 상동은 래깅 스트랜드(Lagging strand) 반응에서 합성 DNA 기질상에서 완전한 DNA를 합성하는데 필요하다(시이겔 등, 1992; 터치이와 밤바라, 1993). 방사선-감수성 돌연변이로 확인된 Fen1의 에스. 폼베 및 에스. 세레비시애 상동은 DNA 복제에 문제점이 있는 돌연변이체 표현형을 보여준다(예를들면, 리건 등, 1995). 에스. 세레비시애 RAD27 유전자의 일차측 부위는 그 제품이 S 상으로 되는것을 요구하는 유전자들의 두 Mlu1 박스 특성을 갖고 있고 이들의 전사는 G1/S에서 최대 수준에 도달한다. 이러한 Fen1과 그 상동의 형태는 S 상 DNA 복제에서의 역할과 거의 일치한다. DNA 복제 및 복구에서의 단백질의 다른 두 역할은, 예를 들면 PCNA가 두 공정에 작용하므로 서로 양립될수 없는 것이 아니다.

PCNA와 결합하기 위한 Fen1과 p21^Cip1의 경쟁은 클램프 단백질의 기능을 조절한다. 본인들은 특정한 이론에 얽매이지 않지만, PCNA에 결합하는 p21^Cip1이 복제 수용 형태로부터 DNA 복제를 지원할수 없는 복구 수용 형태로로 이동한다는 생각은 고려할만한 것이다. 이러한 PCNA 기능의 변화는 DNA 손상에 뒤 따른 DNA의 복제 중지와 DNA의 복북구 개시 사이에 직접적인 연결을 제공한다. 이러한 가설에 맞게 p21^Cip1은 게놈성 손상(콕스와 레인, 1995)에 감응하여 도입되는 사람 종양억제 단백질 p53(엘-데일리 등, 1993)에 의하여 도입된다. p21^Cip1의 보다 높은 단위와 관련된 Fen1 보다 높은 p21^Cip1의 PCNA에 대한 친화력은 게놈성 손상에 뒤이어 Fen1이 복합체로부터 전부 전위되도록 한다.

전술한 결과는 DNA 복제 및 복구 복합체에서 PCNA와 Fen1의 생물학적 역할을 전제로하는 용도를 제공한다. PCNA는 사람 종양에서 Ki67(네첼 등, 1993)과 같은 기타의 세포 사이클 표시제의 단위 이상으로 증가한다. 본인들은 이미 p21^Cip1, p21PBP의 펩타이드가 과증식성 세포에서 PCNA의 복제활성을 억제하는데 이용될수 있음을 설명하였다. p21^Cip1의 PCNA-억제 활성을 모방하는 새로운 의약품의 개발은 적당한 스크리닝 공정을 필요로 한다. 이와 같이 p21PBP로부터 유도된 최소 펩타이드가 PCNA에 결합하기 위하여 Fen1PBP와 경쟁한다는 전술한 연구는 PCNA 결합과 DNA 합성의 억제에서 p21PBP를 모방하는 작은 분자들을 위한 신속하고 재현할수 있는 스크린을 용이하게 제공할수 있도록 한다. 이러한 스크린을 거쳐 얻어지는 의약품은 암을 포함하는 과증식성 질병의 치료에 유용하게 이용될수 있다.

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Claims (16)

1. PCNA에 결합되는 특성을 갖고 있는 물질에 있어서, 이 물질이 Fen1의 C-잔기 89 아미노산이나 그 활성 부분 또는 염기배열 QGRLDxFF(식중 x는 아미노산임)를 갖고 있는 펩타이드를 필수적으로 포함함을 특징으로 하는 물질.
2. 제1항에서, x가 S, D 및 G 아미노산 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 물질.
3. Fen1 또는 p21^Cip1유사체를 스크리닝하는 방법에 있어서, 이 방법이 제1 또는 2항의 물질과 후보(candidate) 유사체 또는 그 활성 프래그먼트를 PCNA에 노출시켜 후보 유사체와 전술한 물질이 PCNA 성분에 결합하기 위하여 경쟁하도록 하는 공정과 후보 유사체 또는 전술한 물질에 대한 PCNA의 결합정도를 검사하는 공정을 포함하는 방법.
4. 제3항에서, 이 방법이 생물학적 활성에 대하여 후보 유사체를 스크리닝하는 공정을 포함함을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에서, 생물학적 활성이 DNA 합성의 억제 또는 종양 세포 생장의 억제임을 특징으로 하는 방법.
6. 제3 내지 5항에서, 전술한 물질 또는 후보 유사체가 고체 지지체에 고정됨을 특징으로 하는 방법,
7. 제3 내지 6항에서, 후보 유사체의 결합 정도가 PCNA 또는 그 활성 프래그먼트를 표시하거나 또는 PCNA에 결합될수 있는 표시된 항체를 사용하는 방법에 의하여 검사됨을 특징으로 하는 방법.
8. 제3 내지 7항의 스크리닝 방법에 의하여 얻어지는 Fen1 또는 p21^Cip1유사체.
9. 제1 또는 2항의 물질과 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물.
10. 의료 방법에 사용하기 위한 제1 또는 2항의 물질.
11. Fen1에 대한 결합특성을 갖고 있는 물질에 있어서, 이 물질이 아미노산 100-150 사이에 존재하는 PCNA의 프래그먼트 또는 그 활성 부분을 필수적으로 포함함을 특징으로 하는 물질.
12. 제3 내지 8항중의 어느 한 항에 청구된 스크리닝 방법에 PCNA의 활성 프래그먼트로 사용하는 제11항에 청구된 물질의 용도.
13. PCNA가 관계되는 질병의 치료를 위한 약물의 제조에 이용되는 제1 또는 2항에 청구된 물질의 용도.
14. 제13항에서, 질병이 암이나 건선 같은 과증식성 질병임을 특징으로 하는 용도.
15. 제14항에서, 약물이 PCNA 결합 물질의 도출을 조절하기 위한 제11항의 Fen1 결합 물질을 포함함을 특징으로 하는 용도.
16. 과증식성 세포에 증식을 유도하기 위한 약물의 제조에 사용되는 제11항에 청구된 물질의 용도.