JPH11504933A - Ｐｃｎａ結合物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＣＮＡと相互作用するＦｅｎ１の断片が、ＰＣＮＡが関与する疾患の治療において有用な化合物のスクリーニング方法におけるそのような断片またはＦｅｎ１の模倣物質の使用と共に開示される。特に、ＰＣＮＡに対する結合性を有する物質が開示され、前記物質は：（ｉ）Ｃ−末端領域からの８９アミノ酸のペプチドを含むＦｅｎ１蛋白質の断片またはその活性部分；または（ii）配列主題部分ＱＧＲＬＤｘＦＦを含むＦｅｎ１蛋白質断片；または（iii）前記蛋白質断片の機能的模倣物質；を有してなり、“ｘ”は好ましくはアミノ酸Ｓ、ＤまたはＧから選択される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＰＣＮＡ結合物質発明の分野 この発明は、癌治療の領域に関するものである。更に特定的には、本発明は、 ＰＣＮＡと相互作用するＦｅｎ１の断片、及びＰＣＮＡが関与する疾患の治療に おいて有用な化合物のスクリーニング方法におけるＦｅｎ１の断片または模倣物 質の用途に関する。発明の背景 細胞内におけるゲノムの完全性は、細胞周期的に制御されたＤＮＡの複製とＤ ＮＡ修復との間の釣り合いを必要とする。損傷をもったＤＮＡの存在下では増殖 する細胞は、損傷が固定化されないようにＤＮＡ複製を停止しなければならず、 複製が再開され得る前に全ての損傷が修復されなければならない。従って、これ らの二つの工程の釣り合いは、変異及びゲノムの不安定性を回避するために重要 である。ＤＮＡ複写及びヌクレオチド切断修復の両者に関与することが知られて いる一つの蛋白質は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）である。 溶液において、サッカロミケス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）由 来のＰＣＮＡは、三量体として存在するものと考えられている。各単量体は、中 央のループにより分けられた二つの構造的に類似する領域を有し、従って三量体 は、Ｘ線結晶学的分析により決定されたように（Ｋｏｎｇら、１９９２年；Ｋｒ ｉｓｈｎａら、１９９４年）、６回の対称性を示す。アミノ酸レベルでの変化に 関わらず、ヒトＰＣＮＡは出芽酵母ＰＣＮＡに対して構造のレベルで高度に相同 的であると考えられている（Ｋｒｉｓｈｎａら、１９９４年）。これらの構造的 研究は、三量体性のＰＣＮＡが、ＤＮＡの周囲に螺旋構造を形成することを示し 、このことはＰＣＮＡが二重鎖ＤＮＡの周囲の滑動クランプとして作用して該Ｄ ＮＡ複製装置をそのテンプレート上に維持し、これによってその処理効率を大き く向上する（Ｂｒａｖｏら、１９８７年；Ｐｒｅｌｉｃｈら、１９８７年ｂ）こ とを示唆する早期の生化学的研究を確認した（Ｋｕｒｉｙａｎ及びＯ’Ｄｏｎ ｎｅｌｌ、１９９３年により総説）。ＰＣＮＡは、核内のＤＮＡ合成部位に局在 化し（例えば、Ｂｒａｖｏ及びＭａｃＤｏｎａｌｄ−Ｂｒａｖｏ、１９８５年） 、また、in vitroにおいて精製された蛋白質からＳＶ４０ ＤＮＡ複製を再構成 するために必要とされ（Ｐｒｅｌｉｃｈら、１９８７年ａ）、ＤＮＡ複製におけ る該蛋白質の必要性を明確に示した。同様に、シゾサッカロマイセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe）のＰＣＮＡ遺伝子ｐｃｎ１は、ｐｃｎ１が除去さ れた場合のＤＮＡ複製における欠損に特徴的な表現型を示す細胞について不可欠 である（Ｗａｓｅｅｍら、１９９２年）。その複製の役割に加え、ＰＣＮＡは、 無細胞系におけるヌクレオチド切断修復のために必要とされる（Ｓｈｉｖｊｉら 、１９９２年）。しかしながら、ＰＣＮＡがこれらの異なる役割を遂行するやり 方は未だ不明である。発明の要約 本発明は、ヒト蛋白質Ｆｅｎ１がＰＣＮＡと相互作用するという知見に基づく ものである。このことは、細胞環境下でヒトＰＣＮＡと相互作用し、ヒトｃＤＮ Ａライブラリーによりコードされる蛋白質についての酵母の２雑種検査を使用し て示される。 Ｆｅｎ１は、５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を伴った（Ｒｏｂｉｎｓら 、１９９４年）構造特異的エンドヌクレアーゼ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９ ９４年ａ）として以前に記述されており、これはヒト色素性乾皮症相補性Ｇ群蛋 白質（Ｈａｒｂｒａｋｅｎら、１９９４年；Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎら、１９９４年 ）、Ｓ．ポンベｒａｄ２及びｒａｄ１３（Ｃａｒｒら、１９９３年；Ｍｕｒｒａ ｙら、１９９４年）、並びにＳ．セレビシアＲＡＤ２７／ＹＫＬ５１０及びＲＡ Ｄ２（Ｊａｃｑｕｉｅｒら、１９９２年；Ｓｉｅｄｅ及びＦｒｉｅｄｂｅｒｇ， １９９２年）を含む、推定されるヌクレオチド切断修復因子と相同性を有する。 しかしながら、同じ蛋白質が必須ＤＮＡ複製因子ＭＦ１として同定されている（ Ｗａｇａら、１９９４年ａ）。 本発明は、更に各蛋白質の相互結合部位のマッピングによる、Ｆｅｎ１及びＰ ＣＮＡの間のアミノ酸レベルでの相互作用の性質決定に関する。これは、ＤＮＡ 複製におけるＰＣＮＡの機能を妨げるが（Ｆｌｏｒｅｓら、１９９４年；Ｗａｇ ａら、１９９４年ｂ；Ｓｈｉｖｊｉら、１９９４年）修復は行わない（Ｌｉら、 １９９４年；Ｓｈｉｖｊｉら、１９９４年）サイクリン−キナーゼ阻害剤、ｐ２ １^Cip1（ｐ２１^WAF1またはＳｄｉ１としても知られている）が、Ｆｅｎ１と同様 にＰＣＮＡの同じ部位に結合することを明らかにした。ＰＣＮＡと相互作用する Ｆｅｎ１及びｐ２１^Cip1の領域は、相同的であることが示され、またｐ２１^Cip1 ペプチドは、ＰＣＮＡへの結合についてＦｅｎ１と競合することが見い出されて いる。 ｐ２１^Cip1またはその断片、特には我々の同時係属中の出願番号ＰＣＴ／ＧＢ ９５／０２５８３においてＰＣＮＡ結合の原因となるものとして同定されたｐ２ １^Cip1の領域が、ＰＣＮＡについてＦｅｎ１と競合するという知見は、Ｆｅｎ１ をｐ２１^Cip1についての模倣物質、特に細胞ＤＮＡ複製を阻止または阻害するも ののスクリーニングにおいて使用するという可能性をもたらした。 従って、一つの側面において、ＰＣＮＡに対する結合性を有する物質を提供し 、前記物質は： （ｉ）Ｃ−末端領域からの８９アミノ酸のペプチドを含むＦｅｎ１蛋白 質の断片またはその活性部分；または （ii）配列主題部分ＱＧＲＬＤｘＦＦを含むＦｅｎ１蛋白質断片；また は （iii）前記蛋白質断片の機能的模倣物質 を有してなる。 我々は、“ｘ”がＳ、ＤまたはＧであり得ることを見い出しているが、多分他 のアミノ酸も容認されるであろう。 本発明において、“活性部分”なる用語は、前記全長のＦｅｎ１アミノ酸配列 より短いが、ＰＣＮＡに対して結合する性質を維持するペプチドを意味する。 本発明において、“機能的模倣物質”は、ペプチドではなくともよいが、我々 の先行出願に開示されたｐ２１^Cip1断片を除いてＰＣＮＡへの結合性を有する物 質を意味する。 更なる側面において、本発明は上述されるようなＦｅｎ１の断片または模倣物 質である結合剤を使用するアッセイ法を提供する。特に本発明は、ＰＣＮＡに結 合するＦｅｎ１または断片またはその模倣物質（ここにおいて“Ｆｅｎ１成分” と称する）及び候補の模倣物質を、ＰＣＮＡまたはその活性断片（ここにおいて “ＰＣＮＡ成分”と称する）に曝して候補の模倣物質とＦｅｎ１成分とをＰＣＮ Ａ成分に対する結合について競合させ、並びにＰＣＮＡ成分の候補の模倣物質及 び／またはＦｅｎ１成分に対する結合の程度を測定することを含んでなるＦｅｎ １またはｐ２１^Cip1模倣物質のスクリーニング方法を提供する。ＰＣＮＡに結合 することが見い出された候補の模倣物質は、次いで生物学的活性、特にＤＮＡ合 成の阻害または（腫瘍）細胞成長の阻害について更にスクリーニングされる。 好都合なことに、該スクリーニング法は、Ｆｅｎ１の断片または模倣物質を固 体担体に固定化し、該固定化されたＦｅｎ１成分をＰＣＮＡ及び種々の濃度の候 補の模倣物質に曝すことにより行われ得る。固定化されたＦｅｎ１に対するＰＣ ＮＡ結合の程度は、ＰＣＮＡを検出する抗体をしようして行われ得る。別法とし て、放射標識ＰＣＮＡと固定化Ｆｅｎ１成分との、候補の模倣物質の存在下での 相互作用は、シンチレーション近接アッセイによって測定され得る。Ｆｅｎ１断 片または模倣物質を使用する他のアッセイ態様及びスクリーニング技術は、当業 者により容易に決定され得、候補の模倣物質をスクリーニングするために使用さ れ得る。 更なる側面において、本発明は上記のスクリーニング法を使用して得られる模 倣物質を包含する。 既知の医薬的に活性な化合物に対する模倣物質の設計は、“リード”化合物に 基づく医薬開発の既知の方法である。このことは、活性化合物が合成困難である 場合または費用がかかる場合、あるいは、例えばペプチド類は消化管内のプロテ アーゼによって迅速に分解される傾向があるように、特定の投与方法について不 適当である場合に望まれる。所定の目標となる性質を有する化合物から模倣物質 を設計するに際しては、一般にとられる幾つかの工程がある。第一には、目標と なる性質を与えるために臨界的及び／または重要な化合物の特定の部分が決定さ れる。ペプチドの場合には、このことは例えば各残基を順に置換する等のアミノ 酸残基を体系的に変化させることにより行われ得る。化合物の活性領域を構成す るこれらの部分または残基は、“薬理原子団（pharmacophore）”として知られ ている。 一旦、薬理原子団が見い出されれば、その構造は、ＮＭＲ、Ｘ線回折データ等 の分光学的技術など、一連の供給源からのデータを使用して、その物理的性質、 例えば立体化学、結合、大きさ及び／または電荷に従ってモデル化される。コン ピューター的な分析、類似性マッピング（原子間の結合よりむしろ薬理原子団の 電荷及び／または体積をモデル化する）及びその他の技術が、このモデル化工程 において使用され得る。 この方法の変法において、リガンド及びその結合相手の３次元構造がモデル化 される。これは、リガンド及び／または結合相手が結合において構造を変化させ る場合に特に有用であり得て、模倣物質の設計においてモデルがこれを考慮する ことを可能とする。 次いで、薬理原子団を模倣する化学基が移植され得る鋳型分子が選択される。 該鋳型分子及びそれに移植される化学基は、模倣物質の合成が容易であり、薬理 学的に許容されるであろうように、またin vivoにおいて望ましい分解プロフィ ルを持つように、リード化合物の生物学的活性を維持しつつ、都合良く選択され 得る。このような方法で見い出される模倣物質または模倣物質類は、次いでそれ らが目標とする性質を有するか否か、またはどの程度にそれが示されるかを見る ためにスクリーニングされうる。次いで更なる至適化または修飾が、in vitro、 in vivoまたは臨床試験のための１種以上の最終模倣物質に到達するために行わ れる。 最終的模倣物質は、臨床的な用途を有するか、あるいは研究室の道具建てにお ける薬剤として有用であり得る。臨床的使用において、所望の分解プロフィル波 、分解が最小化されるようなものであるが、しかしながら、適切な速度の分解が 望まれるばかりでなく、実際必要となる状況もある。例えば、ｐ２１^Cip1模倣物 質は、正常細胞において一時的に細胞増殖を阻止するための短い半減期の補助手 段として使用され得、その一方でｐ２１^Cip1を圧倒する細胞に対するゲノム毒性 化合物の投与は、例えば以上に高い濃度のＰＣＮＡを含む癌細胞等を停止させる 。 如かして、別の側面において本発明は、Ｆｅｎ１のＰＣＮＡ−結合領域に基づ いて、ペプチドの種、及び上述したように得られる模倣物質をも提供する。これ らの化合物、特に模倣物質は、癌及び乾癬等の過剰増殖性疾患を含むＰＣＮＡが 関与する症状を治療するための医薬の調製に有用であろう。 本発明の治療的応用は、上述した種々のペプチドまたは模倣物質の投与を含む 。治療薬の種々の投与方法が、既知の製剤化及び手段に従って使用され得る。投 与量は、日常的な実験により決定されうる。投与は全身的または標的部分的であ ってよく、後者は、治療薬の標的細胞に対する直接的（例えば局所的）投与、ま たは細胞型特異的抗体若しくはリガンド等の標的システムの使用を採用する。標 的化は、副作用を最小化または局在化することから一般に好ましく；また例えば 薬剤が全身的に投与された場合に許容できない程度に毒性がある場合や、あるい はそうでないとあまりに高すぎる投与量が要求される場合、またはそうでないと 標 的細胞に入ることができない場合には特に重要である。 これらの薬剤を直接に投与する代わりに、それらは標的細胞内において、該細 胞に導入されたコード遺伝子、例えばウイルス性ベクターからの発現によって産 生されうる（ＶＤＥＰＴ技術の変法−下記参照）。ベクターは、処置されるべき 特定の細胞に対して標的を定められることができ、あるいはそれは標的細胞内に おいて多かれ少なかれ選択的にスイッチが入れられる制御要素を含んでもよい。 別法として、該薬剤は、処置されるべき細胞内で産生されるか、または該細胞 を標的とした活性化剤による活性形態への変換のための、前駆体形態において投 与され得る。この形態の方法は、場合によりＡＤＰＥＴまたはＶＤＥＰＴとして 知られており；前者は、細胞型特異的抗体に接合されることにより活性化剤が該 細胞を標的とすることに関連し、その一方、後者はウイルスベクター内のコード ＤＮＡからの発現により活性化剤、例えば酵素が産生されることに関連する（例 えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１及びＷＯ９０／０７９３６参照）。 更なる側面において、本発明は、 Ｆｅｎ１への結合に関与するＰＣＮＡの領 域を同定する。如かして、本発明は、Ｆｅｎ１への結合性を有する物質を提供し 、前記物質はアミノ酸１００−１５０の間にあるＰＣＮＡ断片、またはその活性 部分；あるいは前記蛋白質断片の機能的模倣物質を含んでなる。 この領域のＰＣＮＡ断片が、ｐ２１^Cip1またはＦｅｎ１に対する結合能力を維 持する場合には、これらを：（ｉ）ｐ２１^Cip1投与の調整；（ii）Ｆｅｎ１また はｐ２１^Cip1模倣物質のスクリーニング及びＰＣＮＡ中のこの部位に結合する物 質の設計；（iii）低増殖性細胞の増殖の誘導、例えば老化下細胞の再活性化に 使用することができる。図面の簡単な記述 図１は、ヒトＰＣＮＡとの相互作用による酵母の２雑種検査において単離され たヒトＦｅｎ１及び断片を示す。（Ａ）保存されたヌクレアーゼ領域、及びＦｅ ｎ１ファミリーに亘って保存されたカルボキシ末端Ｆｅｎ１ボックスを示すＦｅ ｎ１の模式的ダイアグラム。（Ｂ）Ｆｅｎ１断片をコードする９個のプラスミド は、酵母の２雑種検査により単離され、全長のＦｅｎ１、及びアミノ末端にて切 断された種々の断片をコードする。単離された最も短い断片は、Ｆｅｎ１のＣ− 末端領域から８９個のアミノ酸を含む。 図２は、Ｆｅｎ１類似体の間のＰＣＮＡ結合部位の保存性を示す。沈殿アッセ イ（下記参照）においてＰＣＮＡに結合するペプチドの配列が並べられ、ＱＧＲ ＬＤｘＦＦの共通配列が与えられる。ｐ２１^Cip1上のＰＣＮＡ結合部位を有する 重要な残基は、ボールド体で示される。 図３は、ＰＣＮＡ上のＦｅｎ１結合部位の決定を示す。ＰＣＮＡの一連のＮ− 末端及びＣ−末端除去体が、Ｇａ１４のＤＮＡ結合領域を用いてフレーム内に構 築され、Ｇａ１４の転写活性化領域に融合するＦｅｎ１を用いた２雑種システム において同時発現された。機能的Ｇａ１４転写因子の再構成は、β−ガラクトシ ダーゼまたはＨｉｓ３活性についてのアッセイで試験された（チェック印）。全 ＰＣＮＡ単量体は、構造領域及びＫｒｉｓｈｎａら（１９９４）により記述され るように命名される主題について、模式的に示される。並行する一連の実験にお いて、ｐ２１^Cip1とＰＣＮＡ構築物との間の相互作用がアッセイされた。Ｆｅｎ １及びｐ２１^Cip1は、各蛋白質への結合部位がＰＣＮＡの中央の１００−１５０ アミノ酸に局在化し、領域１のβＩ₁と領域２のβＡ₂−αＡ₂との間の露呈され たループを含むＰＣＮＡ構築物に対する結合の同じパターンを示すことに注意さ れたい。 図４は、ｐ２１^Cip1の短いペプチドがＰＣＮＡに対する結合についてどのよう にＦｅｎ１ＰＢＰ（下記参照）と競合するかを示す。ビオチン化Ｆｅｎ１ＰＢＰ （ペプチド８４−図２参照）は、ストレプトアビジンにより予め被覆されたＥＬ ＩＳＡプレートに固定化された。組換えヒトＰＣＮＡを過剰発現する細菌性細胞 溶解物は、ｐ２１ＰＢＰから誘導された非ビオチニル化９アミノ酸ペプチド、Ｑ ＴＳＭＴＤＦＹＨ（Ｗａｒｂｒｉｃｋら、１９９５）の増大する量と混合され、 次いで固定化されたＦｅｎ１ＰＢＰに対するＰＣＮＡの結合が、ＰＣＮＡに対す るポリクローナル抗体３００９を使用し、続いてＨＲＰ−抗−ウサギ抗体及び４ ５０ｎｍにおける比色測定により検出される。僅かに１μｇ／ｍｌ（およそ１μ Ｍ）のｐ２１^Cip1ペプチドが、Ｆｅｎ１ＰＢＰに対するＰＣＮＡの結合を完全に 阻害した。詳細な記述 酵母の２雑種検査及び欠失の構築 ２雑種検査及び欠失分析は、本質的に以前に記述されているようにして実施さ れた（Ｗａｒｂｒｉｃｋら、１９９５及び国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２ ５８３）。更なる構築物は、ヒトＰＣＮＡ開放読み枠からの断片をｐＡＳ２にサ ブクローニングすることにより作成された。 蛋白質沈殿及びウェスタンブロッティング １５個のアミノ酸の重複を有する２０個のアミノ酸ペプチドが、２雑種検査に てＦｅｎ１上のＰＣＮＡ結合部位として同定されたＦｅｎ１のＣ−末端領域に由 来する８９個のアミノ酸に亘って合成された（Chiron Minotores、オーストラリ ア）。これらのペプチドは、アミノ末端の残基ＳＧＳＧを介してビオチンに結合 された。各ペプチドの２．７μｇを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０ μlのストレプトアビジン・アガロースビーズ（Sigma）を用いて室温（r.t.）に て１時間インキュベートし、次いでビーズをＰＢＳ中で充分によく洗浄し、各回 毎に１１，６００ｇにて遠心分離により回収した。洗浄したビーズにＨｅＬａ細 胞溶解物を、最終蛋白質濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、ビーズと共に 氷上で１時間インキュベートした。ビーズを、２２０ｍＭ ＮａＣｌを伴ったＰ ＢＳ中にて十分に洗浄し、次いで結合した蛋白質を０．２Ｍ ＤＴＴを含むＳＤ Ｓ負荷緩衝液中で８分間煮沸することによりはずした。蛋白質を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでニトロセルロースに電気泳動的にうつしとっ た。ブロットがブロックされた後、１０％ＦＣＳを用いてＤＭＥＭ中に１：５に 希釈されたＰＣ１０ハイブリドーマ上清（Ｗａｓｅｅｎ及びＬａｎｅ、１９９０ 年）と共に室温にて１時間インキュベートした。洗浄後に、２％脱脂乳−ＰＢＳ −０．２％トゥイーン中の１：１０００の第２のＨＲＰ−接合抗−マウスＩｇＧ 血清を、室温にて１時間で添加した。結合した抗体を、製造者の指示に従って、 ＥＣＬシステムを用いて可視化した（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｐｌｃ）。 競合ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡプレートを、ウエル当たり１００ｎｇのストレプトアビジンを用い て、３７℃にて一夜で被覆した。プレートをＰＢＳ中の５％脱脂粉乳にてブロッ クし、０．２％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）により充分に洗浄し 、次いで１００μｌＦｅｎ１ＰＢＰ−ペプチド８４（図２参照）を１０μｇ／ｍ ｌにて各ウエルに添加した。加湿チャンバー内での、室温にて１時間のインキュ ベーションに続いて、ウエルを充分に洗浄した。過剰発現された組換えヒトＰＣ ＮＡを含むおよそ３．５μｇの全蛋白質を、ｐ２１ＰＢＰ（Ｗａｒｂｒｉｃｋら 、１９９５年）から誘導された配列ＱＴＳＭＴＤＦＹＨ（ＨＰＬＣにより精製さ れ、質量分光法により確認された）の９個のアミノ酸のペプチドの濃度を変化さ せて混合し、室温にて１時間でウエルに適用した。十分に洗浄後に、抗−ＰＣＮ Ａポリクローナル抗体３００９（Ｃｏｘら、原稿準備中）を１：１０００にて添 加し、引き続いてＨＲＰ−接合抗−ウサギＩｇＧ血清を１：１０００にて添加し 、結合した抗体をＴＭＢ比色測定法（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８年） により可視化した。プレートをダイナテック５０００プレートリーダーを用い、 ４５０ｎｍにて測定した。結果 Ｆｅｎ１Ｃ−末端領域由来の８９アミノ酸は、相互作用トラップにおいてＰＣＮ Ａを結合する ヒトＰＣＮＡと物理的に相互作用する蛋白質を、酵母サッカロミケス・セレビ シアにおける機能可能なＧａ１４転写活性因子の再構成による、蛋白質−蛋白質 相互作用を検出する２雑種相互作用トラップシステムを使用してスクリーニング した。ヒトＰＣＮＡをＧａ１４のＤＮＡ結合領域（Ｇａ１４ＡＳ）と融合して発 現するプラスミドを、ヒトｃＤＮＡライブラリーからの断片によりコードされる 分子をＧａ１４転写活性化領域（Ｇａ１４ＡＣＴ）と共に融合構築物として発現 するプラスミドをスクリーニングするために使用した。ＤＮＡ配列決定において 、このスクリーニングにより単離されたクローンの１種類は、ＤＮアーゼＩＶ（ Ｒｏｂｉｎｓら、１９９４年）、ｒａｄ２ｈｓ（Ｍｕｒｒａｙら、１９９４年） 及びＭＦ１（Ｗａｇａら、１９９４年ａ）としても知られているヒト蛋白質Ｆｅ ｎ１断片をコードすることが見い出された。我々のスクリーニングにて単離され た最小のＦｅｎ１断片（図１）は、該蛋白質（全長３８０ａａ（Ｍｕｒｒａｙら 、１９９４年））のＣ−末端領域からの８９個のアミノ酸をコードしており、従 って、ＰＣＮＡ結合部位をこれらの残基に局在化させる。ドロソフィラ・メラノ ガスター（Drosophila melanogaster）及びシゾサッカロマイセス・ポンベ（Sch izosaccharomyces pombe）由来のＰＣＮＡもこの系おいてヒトＦｅｎ１と相互作 用し、ＰＣＮＡ上の相互作用部位の強い進化論的保存を示唆した。 ＰＣＮＡとの相互作用に重要なＦｅｎ１上の部位のペプチドマッピング ＰＣＮＡが結合するＦｅｎ１の残基を正確にマッピングするために、一連のビ オチン化された２０アミノ酸ペプチド（１５アミノ酸の重複を伴う）を、２雑種 検査においてＰＣＮＡと相互作用することが見い出されたＦｅｎ１領域を代表さ せて合成した（図１）。Ｆｅｎ１ペプチド（ストレプトアビジン・アガロースビ ーズに結合される）を、ヒトＨｅＬａ細胞抽出物とインキュベートし、次いでビ ーズを沈殿させ、結合された蛋白質を、モノクローナル抗−ＰＣＮＡ抗体ＰＣ１ ０（Ｗａｓｅｅｍ及びＬａｎｅ、１９９０年）をプローブに用いるイムノブロッ ト法により分析した。結果は、ＰＣＮＡがペプチド８４、８５及び８６により同 じ効率をもってＨｅＬａ細胞抽出物から沈殿することを示し（図２参照）、これ らの３個のＦｅｎ１ペプチドに共通するアミノ酸ＴＱＧＲＬＤＤＦＦＫが、ＰＣ ＮＡへの結合に重要であることを強く示唆した。枯渇していない抽出物中に存在 するＰＣＮＡの量と、Ｆｅｎ１ペプチド８４−８６により沈殿された量との比較 は、全細胞溶解物からのＰＣＮＡ蛋白質の定量的な除去を示し、ＰＣＮＡとＦｅ ｎ１ペプチドとの間の相互作用の高い親和性を示した。 ＰＣＮＡ−結合共通配列 沈殿アッセイ法においてＰＣＮＡにより認識されるヒトＦｅｎ１の領域は、Ｆ ｅｎ１ファミリーにおいて高度に保存された主題部を含む。我々は、ヒトＰＣＮ ＡがＦｅｎ１の酵母相同物、Ｓ．ポンベｒａｄ２及びＳ．ポンベＲＡＤ２７／Ｙ ＫＬ５１０におけるこの主題部に結合し得るかどうかを試験した。ビオチニル化 ペプチドを、Ｓ．ポンベｒａｄ２（Ｍｕｒｒａｙら、１９９４年）及びＳ．セレ ビシアＲＡＤ２７／ＹＫＬ５１０（Ｊａｃｑｕｉｅｒら、１９９２年）のＰＣＮ Ａと相互作用することが示されたＦｅｎ１の部分に相同な領域における発表され た配列に基づいて合成した。これらのペプチド９２及び９３（図２参照）は、上 述した沈殿反応において使用された。Ｓ．ポンベ（ペプチド９２）及びＳ．セレ ビシア（ペプチド３９）由来の保存されたボックスの２０アミノ酸ペプチドによ り、ＨｅＬａ細胞抽出物から沈殿された蛋白質のＰＣ１０イムノブロットは、Ｐ ＣＮＡがＦｅｎ１ペプチド８４−８６に対して同様な親和性をもったｒａｄ２及 びＲＡＤ２７の保存領域に結合することを示し、結合主題部の顕著な保存性を例 示している。ＰＣＮＡの先に定義したｐ２１^Cip1−ＰＣＮＡ結合ペプチド（ｐ２ １ＰＢＰ−Ｗａｒｂｒｉｃｋ、１９９５）に対する結合が、陽性の対照として使 用され、またストレプトアビジン−アガロースビーズ単独が陰性の対照として使 用された。種々の分子種（図２）からのこれらのＰＣＮＡ−相互作用ペプチドの 配列の比較により、我々はＱＧＲＬＤｘＦＦのＰＣＮＡ結合部位を定義しうる。 Ｆｅｎ１は、Ｓ．ポンベのｒａｄ２及びＳ．セレビシアのＲＡＤ２７／ＹＫＬ ５１０に対して最も近接して相同的であるが、それは推定されるヌクレオチド切 断修復−関連蛋白質ｒａｄ１３（Ｓ．ポンベ）、ＲＡＤ２（Ｓ．セレビシア）及 び挑戦的にはヒト色素性乾皮症相補性Ｇ群蛋白質とも限られた相同性を共有する 。これらの配列を並べると、我々がＦｅｎ１にとってＰＣＮＡに結合するために 重要であることを見い出した領域において、類似性が明らかとなり、新規なＰＣ ＮＡ結合主題部を定義する。顕著なことに、我々が以前にＰＣＮＡへの結合のた めに重要であることを見い出したｐ２１^Cip1の残基は、ＰＣＮＡ相互作用のため にＦｅｎ１ファミリーの一員に要求されるものと極めて類似している。 Ｆｅｎ１はＰＣＮＡの中央領域を相互作用する Ｆｅｎ１結合に重要なＰＣＮＡの領域を定義するために、我々はＧＡ１４ＡＳ に融合するＰＣＮＡの一連の欠失構築物を作成し、２雑種システムにおいてそれ らのＦｅｎ１プラスミドとの相互作用の能力を試験した。結果（図３）は、Ｆｅ ｎ１がＰＣＮＡの残基１００と１５０との間の領域に結合することを示す。この 領域は、各単量体の二つの領域間のＰＣＮＡの中央ループに対応し、構造的主題 部β１１、βＡ２及びαＡ２も含んでいる（Ｓ．セレビシアＰＣＮＡの結晶構造 から（Ｋｒｉｓｈｎａら、１９９４年））。顕著なことに、この領域はＰＣＮＡ のＮ−末端欠失物を使用すると、サイクリン−キナーゼ阻害剤ｐ２１^Cip1のＰＣ ＮＡへの結合（Ｗａｒｂｒｉｃｋら、１９９５年）にも関連づけられた。従って 、我々は、２雑種系におけるｐ２１^Cip1−ＰＣＮＡ相互作用の以前の観察を、新 たな一連の欠失構築物を使用して確認及び拡張し、Ｆｅｎ１及びｐ２１^Cip1が、 ＰＣＮＡの同じ領域に結合することを例示した。 ｐ２１^Cip1はＰＣＮＡへの結合についてＦｅｎ１と競合する Ｆｅｎ１に結合するＰＣＮＡの領域はｐ２１^Cip1により認識されるものと同じ であり、かつＰＣＮＡ相互作用に要求されるＦｅｎ１の主題部は、ｐ２１ＰＢＰ の重要な残基と相同的であるものと考えられる（Ｗａｒｂｒｉｃｋら、１９９５ 年）ことから、Ｆｅｎ１及びｐ２１^Cip1が、ＰＣＮＡに対する結合について競合 するであろうことは高い可能性をもってあり得る。従って、我々は、この仮定を ＥＬＩＳＡウエルに固定化されたＦｅｎ１のＰＣＮＡ−相互作用ペプチド８４ （Ｆｅｎ１ＰＢＰをＦｅｎ１−ＰＣＮＡ結合ペプチドと称する）を使用して試験 した。組換えヒトＰＣＮＡを、Ｗａｒｂｒｉｃｋら、（１９９５年）により定義 されるようにＰＣＮＡ相互作用に重要なアミノ酸、ＱＴＳＭＴＤＦＹＨを含むｐ ２１^Cip1の非−ビオチン化９−量体ペプチドの増大する量とともに添加した。こ のｐ２１^Cip1の短いペプチドは、僅かに１μＭの添加されたｐ２１^Cip1ペプチド において全量のＰＣＮＡが固定化Ｆｅｎ１ＰＢＰから排除されて、Ｆｅｎ１ＰＢ Ｐに対する結合についてＰＣＮＡと明らかに競合する。無関係な２０−量体ペプ チドを、Ｆｅｎ１ＰＢＰに対するＰＣＮＡの結合へのペプチド及び溶媒ＤＭＳＯ の非特異的影響についての対照として使用した。検討 この出願において、我々は、ＤＮＡ複製及びＤＮＡ修復に関与する２種類の蛋 白質の間の相互作用；フラップエンドヌクレアーゼＦｅｎ１（Ｈａｒｒｉｎｇｔ ｏｎ及Ｌｉｅｂｅｒ，１９９４ａ；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ及Ｌｉｅｂｅｒ，１９ ９４ｂ）［ＤＮアーゼＩＶ（Ｒｏｂｉｎｓら、１９９４年）、ｒａｄ２ｈｓ（Ｍ ｕｒｒａｙら、１９９４年）及びＭＦ１（Ｗａｇａら、１９９４年）としても知 られている］並びにＤＮＡポリメラーゼδ補助摺動クランプ、ＰＣＮＡ（Ｂｒａ ｖｏら、１９８７年；Ｐｒｅｌｉｃｈら、１９８７年ｂ）を開示している。２雑 種系における欠失マッピングは、ＰＣＮＡ結合部位に含まれるものとしてＦｅｎ １の８９個のアミノ酸を定義することを可能とした。２雑種検査にて単離された 最も短いＦｅｎ１断片に従って合成されたペプチドを使用する分析は、次いでＰ ＣＮＡ結合部位を３個の重複するＦｅｎ１−ＰＣＮＡ結合ペプチド（Ｆｅｎ１Ｐ ＢＰ）に対して位置づけることを可能とした。これらのＦｅｎ１ペプチドにおけ る配列の重複、並びにＳ．セレビシア（ＹＫＬ５１０／ＲＡＤ２７）及びＳ．ポ ンベ（ｒａｄ２）のＦｅｎ１相同物から誘導されたものの比較は、ＰＣＮＡ結合 領域を８個のアミノ酸：ＱＧＲＬＤｘＦＦとして定義する。この主題部は、Ｓ． ポンベｒａｄ１３遺伝子生成物、Ｓ．セレビシアＲＡＤ２及びヒト色素性乾皮症 ＸＰ−Ｇ蛋白質を含み、限定された相同性をＦｅｎ１と共有するヌクレオチド切 断修復のために必要とされるであろう蛋白質の別のファミリーにおいても部分的 に保存されるであろう。顕著なことには、ＰＣＮＡ結合に重要な残基は、サイク リン−キナーゼ阻害剤、ｐ２１^Cip1のＰＣＮＡとの相互作用に必要な領域（Ｗａ ｒｂｒｉｃｋら、１９９５年）とも共通している。従って、この主題部は、新規 なＰＣＮＡ結合共通部分を定義するであろう。 ＰＣＮＡの一連のアミノ末端及びカルボキシ末端の除去は、Ｆｅｎ１結合部位 を、各単量体の２個の領域の間のループ中に露呈される残基を含むアミノ酸１０ ０−１５０の間の領域に局在化させた。我々のデータは、Ｆｅｎ１結合部位をこ このアミノ酸のレベルまで定義することは可能としないが、相互作用が、溶液中 で最も露呈されるＰＣＮＡのこれらの残基、即ちループ内の１７個のアミノ酸の 内に含まれるものを関与させることは可能である。 Ｄ．メラノガスター及びＳ．ポンベ由来のＰＣＮＡも、２雑種系においてヒト Ｆｅｎ１断片に結合することから、相互作用はＦｅｎ１相同物のみならずＰＣＮ Ａについても進化の過程で保存される。このようなレベルでの保存性は、この相 互作用が細胞ＤＮＡ複製及び／または修復に重要であろうことを示唆している。 我々は、ＰＣＮＡのこの中央のループがｐ２１^Cip1のための結合部位を与えるで あろうことを既に報告した。Ｆｅｎ１及びｐ２１^Cip1は、ＰＣＮＡ結合のために 本質的なアミノ酸を共に有し、ＰＣＮＡの同じ部位に結合するものと思われるこ とから、それらはＰＣＮＡ機能を競合的に変化させるはずであり、これらの蛋白 質の癌及び他の過剰増殖疾患の治療における用途を示唆している。 ＰＣＮＡは、ＤＮＡ複製装置をその鋳型に繋ぎ止める摺動クランプとして機能 し、該酵素の処理能力を向上して、核ＤＮＡ複製について基礎となるものである 。加えてＰＣＮＡは、ヌクレオチド切断修復に必要とされる（Ｓｈｉｖｊｉら、 １９９２年）。ＰＣＮＡは、各工程に特異的な蛋白質との相互作用によって、複 製及び修復の異なる役割に採用されるであろう。従って、ＰＣＮＡの相手となる ものの検査は、ＤＮＡ修復及びＤＮＡ合成の両者の理解において重要な到達点で ある。この研究は、ＰＣＮＡの、構造−特異的エンドヌクレアーゼであるＦｅｎ １ との相互作用を例示するものである。 直接的ＰＣＮＡ−Ｆｅｎ１相互作用の例示は、このような複合体の生物学的機 能及び活性について質問を求める。二つの仮定は、我々のデータと一致する： （１）ＰＣＮＡ−Ｆｅｎ１複合体はＤＮＡ複製において機能を有する；（２）該 複合体はＤＮＡ修復において活性である。Ｆｅｎ１の既知の活性はいずれかの仮 定を指示するであろうか？Ｆｅｎ１蛋白質は、既知の修復遺伝子生成物との相同 性故に、哺乳動物ヌクレオチド切断修復において機能することが示唆されている 。それはＳ．ポンベｒａｄ２遺伝子生成物のヒト相同物（ｒａｄ２ｈｓ（Ｍｕｒ ｒａｙら、１９９４年）、ＤＮアーゼＩＶ（Ｒｏｂｉｎｓら、１９９４年））と して同定されている構造−特異的フラップエンドヌクレアーゼである。それは、 フラップの全体構造を必要とするが、フラップの長さに依存することなく作用し て、５’単鎖領域において終わるＤＮＡフラップを特異的に切断する（Ｈａｒｒ ｉｎｇｔｏｎ＆Ｌｉｅｂｅｒ、１９９４年ａ）。加えて、Ｆｅｎ１は二重鎖ＤＮ Ａに特異的な５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ヒト及びマウスＦ ｅｎ１は、Ｓ．セレビシア由来の構造−特異性エンドヌクレアーゼＹＫＬ５１０ （ＲＡＤ２７）及びＲＡＤ２（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ＆Ｌｉｅｂｅｒ、１９９４ 年ｂ）、並びにＥＲＣＣ５（Ｓｈｉｏｍｉら、１９９４年）としても知られるヒ ト色素性乾皮症相補性Ｇ群蛋白質（Ｍｕｒｒａｙら、１９９４年；Ｏ’Ｄｏｎｏ ｖａｎら、１９９４年）と相同性を共有する。２個のＵＶ−誘発可能な上流要素 が、Ｓ．セレビシアＲＡＤ２遺伝子のプロモーター内に存在し、これは遺伝子毒 性的損傷に続いてＤＮＡ修復遺伝子に特徴的な蛋白質結合の増大を示す（Ｓｉｅ ｄｅ＆Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ、１９９２）。ＤＲＥ１の欠失はＧ１／Ｓにおいての み増大したＵＶ感受性をもたらすが、その一方でＤＲＥ２の欠失はＧ１／Ｓ、Ｓ ／Ｇ２及び定常相においてより高い感受性を導くことから（Ｓｉｅｄｅ＆Ｆｒｉ ｅｄｂｅｒｇ、１９９２）、興味深いことにこれらの２個の要素ＤＲＥ１及びＤ ＲＥ２は細胞周期に亘って差動的に制御されうる。従って、Ｆｅｎ１及び特徴付 けされた修復蛋白質の間の構造的及び機能的相同性は、Ｆｅｎ１が哺乳動物ヌク レオチド切断修復に関与するという示唆を支持している。 しかしながら、証拠の幾つかはＤＮＡ複製におけるＦｅｎ１の更なる役割を指 し示す。それは複製されたＳＶ４０ ＤＮＡを共有結合的に閉鎖された環（フォ ームＩ）に熟成するために必須であり、また、リボヌクレオチドプライマーをオ カザキ断片から除去するであろうＲＮアーゼＨ活性を有する（Ｗａｇａら、１９ ９４ａ）。Ｆｅｎ１のウシ相同物は、ＤＮＡポリメラーゼεの部分精製分画中に 検出されており、被覆鎖反応における合成的ＤＮＡ基質上の完全ＮＡＤＮＡ合成 に必要とされる（Ｓｉｅｇａｌら、１９９２；Ｔｕｒｃｈｉｉ＆Ｂａｍｂａｒａ 、１９９３年）。放射感受性変異として同定されるものであるが、Ｆｅｎ１のＳ ．ポンベ及びＳ．セレビシア相同物は、ＤＮＡ複写の誤りと一致する変異表現型 を示す（例えば、Ｒｅａｇａｎら、１９９５年）。挑戦的であるが、Ｓ．セレビ シアＲＡＤ２７遺伝子の上流領域は、それらの生成物がＳ相で必要とされる遺伝 子に特徴的な２個のＭｌｕＩボックスを含み、その転写がＧ１／Ｓにおいて最大 レベルに達する。Ｆｅｎ１及びその相同物のこれらの特徴は、Ｓ相ＤＮＡ複写に おける役割と極めてよく一致する。該蛋白質のＤＮＡ複写及び修復における２種 の交互的役割は、例えば、ＰＣＮＡが両者の工程において機能を有することから 両立しない。 ＰＣＮＡ結合についてのＦｅｎ１及びｐ２１^Cip1の間の競合は、クランプ蛋白 質の機能を調整するであろうし、また、我々は特定の理論に縛られることは望ま ないが、ＰＣＮＡと結合するｐ２１^Cip1は、複写能力を有する形態（ＰＣＮＡ− Ｆｅｎ１）から、ＤＮＡ複写をサポートできない修復能力を有する形態に移行す るというアイデアの考えに刺激される。このようなＰＣＮＡ機能の変更は、ＤＮ Ａ損傷に続くＤＮＡ複写の停止と、ＤＮＡ修復との間の直接的な連結を与えるで あろう。この仮説と矛盾することなく、ｐ２１^Cip1は、それ自体ゲノム損傷に応 答して誘導されるヒト腫瘍抑制蛋白質ｐ５３（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、１９９３年 ）によって転写的に誘導される（Ｃｏｘ＆Ｌａｎｅ、１９９５年の総説）。ゲノ ムの損傷に続くｐ２１^Cip1の高い濃度と組み合わせて、ＰＣＮＡに対するＦｅｎ １より高いＰ２１^Cip1の親和性は、複合体からのＦｅｎ１の全ての離脱を充分 にもたらし得るであろう。 ここに示した結果は、ＤＮＡ複写及び修復複合体におけるＰＣＮＡ及びＦｅｎ １の生物学的役割を越えての応用を有する。ＰＣＮＡは、ある種のヒト腫瘍にお いては、Ｋｉ６７（例えば、Ｋｎｅｃｈｅｌら、１９９３年）等の他の細胞周期 マーカーの濃度を上回って上昇し、我々は過剰増殖細胞においてＰＣＮＡの複写 活性を阻害するために有用であろうｐ２１^Cip1、ｐ２１ＰＢＰのペプチドを既に 記述した。ｐ２１^Cip1のＰＣＮＡ−阻害活性を模倣する新規な薬剤の開発は、適 当なスクリーニング方法を必要とする。従って、Ｐ２１ＰＢＰから誘導された最 小ペプチドが、ＰＣＮＡに対する結合においてＦｅｎ１ＰＢＰと成功裡に競合こ こに記述した研究は、ＰＣＮＡ結合及びおそらくＤＮＡ合成の阻害においてｐ２ １ＰＢＰ活性を模倣する小型分子の迅速かつ再現性あるスクリーニングを提供す べく、容易に拡張され得る。そのようなスクリーニングにより決定される薬剤は 、癌を含む過剰増殖性疾患の治療のための有用性が示されるであろう。参考文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年２月２６日 【補正内容】 請求の範囲 １． ＰＣＮＡに対する結合性を有する物質であり、前記物質が本質的にＦｅ ｎ１のＣ−末端８９アミノ酸由来の断片、若しくはその活性部分、または“ｘ” が任意のアミノ酸である配列ＱＧＲＬＤｘＦＦを有するペプチドからなるＰＣＮ Ａ結合性物質。 ２． “ｘ”が、Ｓ、ＤまたはＧである請求の範囲１項に記載の物質。 ３． 請求の範囲１項または２項に記載の物質及びＰＣＮＡを模倣する候補の 物質を、ＰＣＮＡまたはその活性断片に曝して候補の模倣物質と該物質とをＰＣ ＮＡ成分に対する結合について競合させ、並びにＰＣＮＡ成分の、候補の模倣物 質または該物質に対する結合の程度を測定することを含んでなるＦｅｎ１または ｐ２１^Cip1模倣物質のスクリーニング方法。 ４． 候補の模倣物質を更に生物学的活性についてスクリーニングすることを 含んでなる請求の範囲３項に記載の方法。 ５． 生物学的活性が、ＤＮＡ合成の阻害または腫瘍細胞成長の阻害である請 求の範囲４項に記載の方法。 ６． 該物質または候補の模倣物質が固体担体に固定化される請求の範囲３項 ないし５項のいずれか１項に記載の方法。 ７． 候補の模倣物質の結合の程度がＰＣＮＡ若しくはその活性断片の標識、 またはＰＣＮＡに結合可能な標識抗体の使用により検出される請求の範囲３項な いし６項のいずれか１項に記載の方法。 ８． 請求の範囲３項ないし７項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法 により得ることができるＦｅｎ１またはｐ２１^Cip1模倣物質。 ９． 請求の範囲１項または２項に記載の物質を、医薬的に許容される担体と の組合せにおいて含有する医薬組成物。 １０． 医学的治療方法において使用される請求の範囲１項または２項に記載の 物質。 １１． Ｆｅｎ１に対する結合性を有する物質であり、該物質はアミノ酸１００ −１５０の間に位置するＰＣＮＡ断片またはその活性部分から本質的になる物質 。 １２． 請求の範囲３項ないし８項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法 における、ＰＣＮＡの活性断片としての請求の範囲１１項に記載の物質の使用。 １３． ＰＣＮＡが関与する疾患の治療用医薬の調製における請求の範囲１項ま たは２項に記載の物質の使用。 １４． 該疾患が、癌または乾癬等の過剰増殖性疾患である請求の範囲１３項に 記載の使用。 １５． 該医薬が、ＰＣＮＡ結合物質の分配を調節するために請求の範囲１１項 に記載のＦｅｎ１結合物質を更に含有する請求の範囲１３項または１４項に記載 の使用。 １６． 過剰増殖性細胞における増殖の誘発のための医薬調製における請求の範 囲１１項に記載の物質の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 レイン，デイヴィッド フィリップ イギリス国 ＫＹ16 Ｏ８Ｎ ファイフ セント アンドリュース バルムロ マジ ックウェル ハウス （番地なし) (72)発明者 ワーブリック，エマ イギリス国 ＤＤ６ ９ＢＢ ファイフ テイポート ダルグライシュ ストリート 32 (72)発明者 グローヴァー，デイヴィッド ムーア イギリス国 ＰＨ２ ７ＲＢ パース エ ロル インチクーナンズ ステイブルズ コテイジ （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＰＣＮＡに対する結合性を有する物質であり、前記物質は： （ｉ）Ｃ−末端領域からの８９アミノ酸のペプチドを含むＦｅｎ１蛋白 質の断片またはその活性部分；または （ii）配列主題部分ＱＧＲＬＤｘＦＦを含むＦｅｎ１蛋白質断片；また は （iii）前記蛋白質断片の機能的模倣物質； を有してなる物質。 ２． “ｘ”が、アミノ酸Ｓ、ＤまたはＧである請求の範囲１項に記載の物質 。 ３． ＰＣＮＡに結合するＦｅｎ１または断片またはその模倣物質（“Ｆｅｎ １成分”）及び候補の模倣物質を、ＰＣＮＡまたはその活性断片（“ＰＣＮＡ成 分”）に曝して候補の模倣物質とＦｅｎ１成分とをＰＣＮＡ成分に対する結合に ついて競合させ、並びにＰＣＮＡ成分の候補の模倣物質及び／またはＦｅｎ１成 分に対する結合の程度を測定することを含んでなるＦｅｎ１またはｐ２１^Cip1模 倣物質のスクリーニング方法。 ４． 候補の模倣物質を更に生物学的活性についてスクリーニングすることを 含んでなる請求の範囲３項に記載の方法。 ５． 生物学的活性が、ＤＮＡ合成の阻害または腫瘍細胞成長の阻害である請 求の範囲４項に記載の方法。 ６． Ｆｅｎ１の断片または模倣物質が、固体担体に固定化される請求の範囲 ３項ないし５項のいずれか１項に記載の方法。 ７． ＰＣＮＡ模倣物質の結合の程度がＰＣＮＡ成分の標識、またはＰＣＮＡ に結合可能な標識抗体の使用により検出される請求の範囲３項ないし６項のいず れか１項に記載の方法。 ８． 請求の範囲３項ないし７項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法 により得ることができるＦｅｎ１またはｐ２１^Cip1模倣物質。 ９． 請求の範囲１項または２項に記載の物質を、医薬的に許容される担体と の組合せにおいて含有する医薬組成物。 １０． 医学的治療方法において使用される請求の範囲１項または２項に記載の 物質。 １１． Ｆｅｎ１に対する結合性を有する物質であり、前記物質はアミノ酸１０ ０−１５０の間に位置するＰＣＮＡ断片またはその活性部分；または前記蛋白質 断片の機能的模倣物質から本質的になる物質。 １２． 請求の範囲３項ないし８項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法 のＰＣＮＡ成分としての請求の範囲１１項に記載の物質の使用。 １３． ＰＣＮＡが関与する疾患の治療用医薬の調製における請求の範囲１項ま たは２項に記載の物質の使用。 １４． 該疾患が、癌または乾癬等の過剰増殖性疾患である請求の範囲１３項に 記載の使用。 １５． 該医薬が、ＰＣＮＡ結合物質の分配を調節するために請求の範囲１１項 に記載のＦｅｎ１結合物質を更に含有する請求の範囲１３項または１４項に記載 の使用。 １６． 過剰増殖性細胞における増殖の誘発のための医薬調製における請求の範 囲１１項に記載の物質の使用。