JP2002526060A

JP2002526060A - ヒトのケラチノサイトからの調節タンパク質

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Publication number: JP2002526060A
Application number: JP2000574140A
Authority: JP
Inventors: クラーマーミヒャエル; ベヒテルミヒャエル; ライナルツジャネッテ; シェーファービルギット; ヴァリッヒラインハルト
Original assignee: クラーマーミヒャエル
Priority date: 1998-09-19
Filing date: 1999-09-06
Publication date: 2002-08-20
Also published as: WO2000017232A2; DE19981873D2; WO2000017232A3; CA2342957A1; DE19842863A1; EP1114157A2; AU1149100A

Abstract

(57)【要約】本発明は天然にヒトのケラチノサイト中に存在し、かつケラチノサイトの活性化状態で強化して発現されるタンパク質と同様であるかまたは類似である（すなわち機能および作用において同じ）、単離したポリペプチドに関する。更に、ヒトのケラチノサイトに典型的なポリペプチドもしくはタンパク質をコードする単離した核酸、並びにこのポリペプチドおよび核酸の検出および治療目的等のための使用および試薬のための使用にも関する。本発明によるタンパク質は配列番号２または３中に示されたアミノ酸配列またはこれから生じたアレルまたは誘導体であり、かつ本発明による核酸は配列番号１または４中に示されたヌクレオチド配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列またはこれらヌクレオチド配列の部分配列またはこれらのヌクレオチド配列の１つと完全にまたは部分的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、天然にヒトのケラチノサイト中に存在し、ケラチノサイトの活性化
状態で強化して発現されるタンパク質と同じであるかまたは類似である（すなわ
ち機能および作用において同じ）、単離したポリペプチドに関する。更に、本発
明はヒトのケラチノサイトに典型的なポリペプチドもしくはタンパク質をコード
する単離した核酸、並びにこのポリペプチドおよび核酸の、検出、特に診断目的
のための、および／または治療目的のための使用、もしくは試薬、特に組み換え
ベクター分子およびそのような分子に対する抗体、の使用にも関する。

【０００２】現在の公知技術によれば、表皮の障害、例えば自己免疫皮膚病である“尋常性
天疱瘡”および“水疱性天疱瘡”、に影響を与えるために皮膚病治療においては
、主に、広い作用効果を有する薬剤、例えば、局所または全身適用のグルココル
チコイド、ビタミン−Ａ−酸−誘導体、抗代謝剤および細胞増殖抑制剤、を使用
するか、または多かれ少なかれ非特異的な処置、例えばいわゆる“色素治療（Fa
rbstoffterapie）”または“光治療（Lichttherapie）”で処置する。しかしな
がら、公知の作用物質もしくは処置は全て、あまり特異的でなく、従って当然多
くの副作用を惹起する、という欠点を有する。

【０００３】特異的な作用物質の提供は、細胞の物質代謝に（特異的な）影響を及ぼすため
の攻撃点として（特に、医学的または化粧品学的観点において）使用することの
できる細胞の標的分子（標的構造、ターゲット）の数が表皮ケラチノサイト中で
狭く限られているという、皮膚病学においてすでに長期にわたって存在する根本
的な問題で不成功に終わっている。

【０００４】従って、本発明の課題は、診断剤、治療剤または化粧品のための、または一般
的に細胞の物質代謝に影響を及ぼすのための攻撃点として使用することのできる
、表皮ケラチノサイト中の新規標的構造を製造することである。

【０００５】この課題の解決は冒頭に記載した種類の、活性化したケラチノサイトにおいて
上昇調節され、すなわち強化して発現されもしくは生産され、かつ高濃度レベル
に維持されるタンパク質であって、かつ配列番号２または配列番号３中に示した
アミノ酸配列またはこれらの２つのアミノ酸配列の１つからアミノ酸置換、−欠
失、−挿入、または−逆位により生じたアレル（allele）または誘導体であるタ
ンパク質の提供にある。配列番号２または配列番号３によるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを以下にタンパク質ｐＫｅ＃１２２と呼ぶ。

【０００６】この課題の解決は、天然にヒトのケラチノサイト中に存在し、かつケラチノサ
イトの活性化状態で強化して発現されるタンパク質と同じかまたは類似であるタ
ンパク質をコードし、かつ配列番号１または配列番号４中に示されたヌクレオチ
ド配列またはこの両方の１つに相補的なヌクレオチド配列またはこれら両方の示
されたまたは相補的なヌクレオチド配列の１つの部分配列または前記のヌクレオ
チド配列の１つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、この際これら両
方の配列表において“Ｔ”の代わりに“Ｕ”であってもよい、単離した核酸の提
供にある。配列番号１または配列番号４で示したヌクレオチド配列とハイブリダ
イズする、有利にはこれら両方の少なくとも１つと同一であるかまたは相補的で
ある、スプライス−変異体およびセンス−またはアンチセンス−オリゴヌクレオ
チドも特に本発明による核酸もしくはヌクレオチド配列の群に属する。

【０００７】従って、本発明は配列番号１または４中に記載したヌクレオチド配列と同一で
あるかまたはこれに相補的であるスプライス変異体、特にｍＲＮＡのスプライス
変異体から生じるアミノ酸配列を有する、冒頭に挙げた種類のタンパク質もしく
はポリペプチドをも包含する。

【０００８】本発明によるセンス−またはアンチセンス−オリゴヌクレオチドは少なくとも
６個の、有利に８〜２５個のヌクレオチドを包含する。

【０００９】概念“ハイブリダイズ”とは、通常の、特に高度にストリンジェントな条件下
での公知技術のハイブリダイゼーション法である。具体的なハイブリダイゼーシ
ョンのパラメータは、当業者が使用したヌクレオチド配列およびその一般的な専
門知識により選択する(Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 199
7, John Wiley & Sons Inc., Suppl. 37, Chapter 4.9.14参照)。

【００１０】本発明による核酸は天然からも、合成または半合成によっても獲得することが
できる。プラクシスにおいては、ｃＤＮＡとしてのその実施が特に認められてい
る。

【００１１】配列番号２または３によるアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１または４に示
されている核酸によりコードされる、以下にタンパク質ｐＫｅ＃１２２と呼ばれ
るポリペプチドは、ヒトの表皮ケラチノサイトが“活性化”状態にあり、すなわ
ち特に、例えば事故により生じた皮膚損傷による、または自己免疫により惹起し
た水疱性皮膚病“尋常性天疱瘡”（接着斑に対する自己抗体により惹起される）
および“水疱性天疱瘡”（半接着斑に対する自己抗体により惹起される）におけ
る、増殖および／または移動（migration）の状態にある場合、ヒト表皮ケラチ
ノサイト中で上昇調節され、すなわち強化して発現され（生産され）、かつ出発
状態に比べて明らかに高濃度レベルに維持される。ヒト表皮ケラチノサイトの活
性化状態は、定状態（出発状態）に比較して、公知活性化マーカーｕＰＡ（ウロ
キナーゼ−型プラスミノーゲンアクチベーター）およびｕＰＡ−Ｒ（ウロキナー
ゼ−型プラスミノーゲンアクチベーターのレセプター）の上昇した発現において
も現れ、これらのマーカーにより定性的および定量的に検出することができる。
(Schaefer B.M., Reinartz J., Bechtel M.J., Inndorf S., Lang E., und Kram
er M. D., 1996: Dispase mediated basal detachment of cultured keratinocy
tes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor
(uPA-R, CD87), Exp. Cell Res. 228, S. 246-253参照)。

【００１２】タンパク質ｐＫｅ＃１２２はセリン／スレオニン−キナーゼ−モチーフ、多数
の（４つの）チロシンキナーゼリン酸化モチーフおよびＡＴＰ結合位を有するキ
ナーゼ−ドメインを有する。これは明らかにシグナル伝達過程に関連しており、
多分セリン／スレオニン−キナーゼ機能を有し、細胞−細胞−結合および／また
は細胞−マトリックス−結合および／または接着斑および／または半接着斑の形
成においておそらく重要である。

【００１３】公知技術においては、ケラチノサイト中のセリン／スレオニン−キナーゼが細
胞−細胞−および細胞−マトリックス−接着の機能に影響を与えることが知られ
ている。Ｓ.Ｂｌｕｍおよび共著等は、“プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）”の
タイプのセリン／スレオニン−キナーゼの活性化もしくは不活性化により接着帯
（zonula adhaerens）の一定の細胞接着−分子の局在化が影響されうるというこ
とを示した(Blum S., Ness W., Petrow W., Achenbach F., 1994: Localization
of protein kinase C in primary cultures of human keratinocytes in relat
ion to cell contact proteins. Cell Sig. 6: 157-165参照)。更に、Ｍ.Ｓｅｒ
ｒｅｓおよび共著等は、細胞培養体（ＨａＣａＴ−細胞）中のケラチノサイトを
セリン／スレオニン−ホスファターゼ−インヒビターであるオカダ酸、カリクリ
ンおよびペファブロック^ＴＭで処理すると、一方では細胞−細胞−結合の損失に
導き、他方では細胞接着に含まれるリンカータンパク質β−カテニンの強化した
セリン／スレオニンリン酸化に導く(Serres M., Grangeasse C., Haftek M., Du
rocher Y., Duclos B., Schmitt D., 1997: Hyperphosphorylation of β-Caten
in on serine-threonine residues and loss of cell-cell-contacts indused b
y calyculin A and okadaic acid in human epidermal. cells. Exp. Cell. Res
. 231: 163-172参照)ことを示した。このインビトロでの発見は外植したヒトの
皮膚の表皮ケラチノサイトで確認された：オカダ酸の適用後（２μＭ、２４時間
）、棘融解を伴う表皮細胞／細胞−結合の明らかな障害が現れた。ＰＫＣ−アク
チベータ（例えば、ブリオスタチン（Bryostatin）−１またはＴＰＡ＝ＰＭＡ＝
フォルボール・ミリステート・アセテート）およびＰＫＣ−インヒビター（Sphi
ngosin、Staurosporin、Chelerythrine、Ｈ７＝１−（５−イソキノリニルスル
ホニル）−２−メチル−ピペラジン）も、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のイ
ンヒビターまたはアクチベーターも、チロシン−キナーゼ−およびホスファター
ゼ−インヒビターまたは特異性の僅かなホスファターゼ−インヒビターも細胞に
対してこのような効果を有していない。

【００１４】半接着斑の形成においてもセリン／スレオニン−キナーゼは重要な役割を果た
す(Mainiero F., Pepe A., Wary K.K., Spinardi L., Mohammadi M., Schlessin
ger J. Giancotti F.G., 1995: Signal transduction by the alpha6beta4 inte
grin: distinct beta4 subunit sites mediate recruitment of Shc/Grb2 and a
ssociation with the cytoskeleton of hemidesmosomes. EMBO J. 14:4470-4481
参照)。

【００１５】タンパク質ｐＫｅ＃１２２の単離調製により、すなわちこのプロテインをコー
ドするヌクレオチド配列の記載によりおよびそのアミノ酸配列の報告により、生
理学的に活性なもしくは活性化したケラチノサイトの物質代謝に（および勿論タ
ンパク質ｐＫｅ＃１２２を発現する他の細胞の物質代謝にも）標的を定めて影響
を与えること、特に医学および美容的治療のために影響を与えることが可能であ
る。

【００１６】更に、本発明は、本発明による核酸を包含し、かつヒトのケラチノサイト中に
存在し、ケラチノサイトの活性化した状態で強化して発現されるタンパク質、特
にタンパク質ｐＫｅ＃１２２を原核または真核細胞中で発現する能力を有する、
組み換えＤＮＡ−ベクター分子に関する。ＤＮＡ−ベクター分子としては、プラ
クシスにおいて非常に好適であることが示されているので、有利に、プラスミド
ｐＵＥＸ−１および／またはプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔおよび／またはプラスミ
ドｐＢＫ−ＣＭＶおよび／またはプラスミドｐＨＲ２（Bluescript KS［Firma S
tratagene,Heidelberg］の誘導体、ヒトケラチン−１４−プロモータを含有する
）である。

【００１７】真核細胞としては、特に細胞培養体からの細胞、例えばＣＯＳ−細胞を挙げる
ことができ、同様に生存する生物、例えばトランスジェニックマウスの該当する
細胞および構成体も挙げることができる。

【００１８】従って、本発明は、細胞中に天然に含有されているか組換えの結果含有されて
いる活性化可能なプロモータと結合している本発明による核酸を含有し、かつ（
その結果）ヒトのケラチノサイト中に存在しかつケラチノサイトの活性化状態で
強化して発現されるタンパク質、特にタンパク質ｐＫｅ＃１２２、を発現させる
能力を有する形質転換宿主細胞をも包含する。

【００１９】更に、本発明はトランスジェニック哺乳動物、特にマウスまたはラットの製造
のための本発明による核酸または本発明によるベクター分子の使用に関する。

【００２０】本発明による形質移入体は、タンパク質ｐＫｅ＃１２２により誘発された細胞
形態学および細胞の基礎機能、例えば増殖、接着、移動および分化、の詳細な解
明に関して、特にタンパク質ｐＫｅ＃１２２自体が“病理学的”活性を有してい
るのかどうかという質問の回答に関して、調査および開発の研究の可能性を提供
する。

【００２１】更に、本発明の課題は、ヒトのケラチノサイト中に存在し、かつケラチノサイ
トの活性化状態で強化して発現されるタンパク質、特にタンパク質ｐＫｅ＃１２
２、の間接的な検出のための試薬であり、この際この試薬は、本発明による核酸
を少なくとも１種含有することを特徴とする。“間接的な検出のため”とはこの
タンパク質をコードするｍＲＮＡを直接検出するということを表し、こうしてこ
のタンパク質に関しては（このｍＲＮＡを介して）間接的である。

【００２２】このタンパク質ｐＫｅ＃１２２、およびタンパク質ｐＫｅ＃１２２と、すなわ
ち配列番号２中にまたは配列番号３中に示されたアミノ酸配列と類似のポリペプ
チド、すなわち配列番号２または３記載のアミノ酸配列の１つから置換、欠失、
挿入および／または逆位により誘導可能であるポリペプチド、または配列番号１
記載のヌクレオチド配列または配列番号４記載のヌクレオチド配列と、またはこ
れらのヌクレオチド配列の部分配列と同一であるかまたはこれと相補的であるか
、または少なくともハイブリダイズする、ｍＲＮＡのスプライス−変異体から生
じるアミノ酸を有するポリペプチドは皮膚科学の研究および開発の分野に多くの
適用可能性を提供する。特に、これらのポリペプチドもしくはタンパク質に対す
る抗体を製造することができ、この抗体は診断剤としてまたは治療薬としてまた
は化粧品（“cosmeceuticals”）としても相当する修飾で、使用可能である。

【００２３】従って、本発明は、これらのポリペプチドに対する（モノクローナル、ポリク
ローナルまたは組み換え）抗体の製造のための、そのようなタンパク質もしくは
ポリペプチドの使用、該抗体自体および同様にその皮膚病の診断処置および／ま
たは治療のための、表皮の美容的処置およびタンパク質ｐＫｅ＃１２２を発現す
る他の組織または器官の診断、治療および／または美容的処置のための使用も包
含する。

【００２４】センス−および／またはアンチセンス−オリゴヌクレオチドも新規な科学的知
識により、薬剤治療のための作用物質として挙げることができ(G. Hartmann et
al. 1998: Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Aerzteblatt 95, Heft 24,
C1115-C1119参照)、更には薬剤治療において根本的に新規な作用原理を有する作
用物質として挙げることができる。

【００２５】従って、本発明は診断および／または治療処置のための、特に皮膚病の診断お
よび／または治療処置のための、または特に表皮の美容的処置のための本発明に
よるセンス−またはアンチセンス−オリゴヌクレオチドの使用にも関する。

【００２６】本発明によるポリペプチドまたは本発明による核酸の技術的および経済的に意
味のある使用可能性は、特にそのような分子を用いてスクリーニング法により多
数の準備された物質から、該当する核酸または該当するポリペプチドに特異的に
結合する物質を選出することができるということにある。これらの物質は薬理学
的に使用可能な物質の開発のための出発物質（案内構造（Leitstruktur））とし
て使用することができ、こうして特に冒頭に記載した皮膚病の、診断および治療
のための代わるべき別の薬剤を開発するための前提を提供する。

【００２７】更に、ポリペプチドもしくは核酸に結合し、これによりその機能および／また
は発現に影響を与える、特に阻害または活性化に作用する、薬理学的に使用可能
な物質の同定のための本発明によるポリペプチドまたは本発明による核酸の使用
も、本発明に属する。

【００２８】本発明を以下に製造例および使用例を用いて詳細に説明する。

【００２９】実施例１：タンパク質ｐＫｅ＃１２２の製造Ａ）タンパク質ｐＫｅ＃１２２をコードするポリヌクレオチドの獲得もしくは
製造ポリヌクレオチドの供給源として、シェーファー等の文献（Schaefer B.M., R
einartz J., Bechtel M.J., Inndorf S., Lang E., und Kramer M. D., 1996: D
ispase mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces uroki
nase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Ex
p. Cell Res. 228, S. 246-253参照）中に十分に記載されている、細胞培養体も
しくは細胞培養モデルのヒト表皮ケラチノサイトを使用する。この文献の内容に
関しては、これにより引用していることを明らかにする。この細胞培養体もしく
は細胞培養モデルは、ケラチノサイトを細胞／マトリックス−接着の酵素的破壊
により、すなわち例えば培養マトリックスからのケラチノサイトのディスパーゼ
（Dispase）誘発剥離により、定常状態［ｕＰＡ^-／ｕＰＡ−Ｒ^-］から活性化状
態［ｕＰＡ^＋／ｕＰＡ−Ｒ^＋］に導くことを可能にしていることにより優れてい
る。活性化状態の誘発は可逆的である：分化したケラチノサイトからの融合性（
＝最大密度増殖）で、多層の細胞連結の（新たな）形成は、ｕＰＡおよびｕＰＡ
−Ｒの低下調節に導く、すなわち生産の抑制、および低い濃度レベルへの調節に
導く（このためには、刊行物：Schaefer B.M., Stark H.J., Fusenig N.E., Rod
d R.F., Kramer M.D., 1996 Differential expression of urokinase-type plas
minogen activator (uPA), its receptor (uPA-R), and inhibitor type-2 (PAI
-2) during differentiation of keratinocytes in an organotypic coculture
system, Exp. Cell Res. 220:415-423を参照)。

【００３０】これらの細胞培養体もしくは細胞培養モデルの細胞は細胞は、以下にＮＨＥＫ
（＝normale humane epidermale Keratinozyten）と呼ぶ。

【００３１】細胞培養体もしくは細胞培養モデルの製造のためには以下の処置を実施する：
皮膚生検により得られたヒト表皮ケラチノサイトを４℃で一夜トリプシン処理し
、引き続きJ. G. RheinwaldおよびH. Green（1975,Cell 6, 331-334）の“フィ
ーダー層（feeder-layer）”−法により、ペトリシャーレまたは１７５ｃｍ^２の
培養瓶中で、アデニンヘミスルフェート、インシュリン、トランスフェリン、ト
リヨードチロニン、ハイドロコルチゾン、ホルスコリン、表皮増殖因子（ＥＧＦ
）および抗体（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン）を添加
した、１０％（体積／体積）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するダルベッコ改変
イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、８日間の期間、分化条件下で、すなわち上昇し
たカルシウム濃度で、培養した（３７℃、ＣＯ_２７％）。こうしてこの培養は
従来の公知法で慣用の条件で行った。この条件下に、ケラチノサイトは融合性の
、２〜３層のいわゆる“表皮等価物”またはケラチノサイト−“シート”を形成
する。

【００３２】この表皮等価物またはケラチノサイトシートをディスパーゼＩＩ（ＦＣＳなし
のＤＭＥＭ中２.４ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理することにより、培養マトリッ
クスから剥離し、ＤＭＥＭ中で２回洗浄し、引き続き４もしくは８時間の間、完
全な調整ＤＭＥＭ中でインキュベートした。調整したＤＭＥＭ中でのインキュベ
ーションは新鮮なＦＣＳの影響を排除するために行った。インキュベーションの
間、この浮遊するケラチノサイトシートにおいて公知活性化マーカーｕＰＡおよ
びｕＰＡ−Ｒ並びに本発明において初めて記載するタンパク質ｐＫｅ＃１２２の
発現の上昇調節が生じた。ｕＰＡ／ｕＰＡ−Ｒ−上昇調節は、固相酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ）、インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫フルオレ
センスのような公知法により検出可能であった。インキュベートした細胞から公
知のグアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出法(Chrom
czynski P. and Sacchi N., 1986: Single-step metohd of RNA isolaton by ac
id guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1
62: 156-159参照)を用いて全てのＲＮＡを獲得した（ハイデルベルグからのＡＧ
Ｓ社の“ＲＮＡ−Ｃｌｅａｎ”キット）。総−ＲＮＡからｍＲＮＡをポリ−Ｔ−
被覆ビーズへの結合により単離した。このｍＲＮＡを引き続き行われるサブトラ
クションクローニングの工程の出発材料として使用した。

【００３３】対照実験中への使用のために、もしくは比較調製物のためにｍＲＮＡを接着ケ
ラチノサイトシートから単離した、すなわち前記と同じ方法を実施するが、但し
、ディスパーゼ処理の経過の際にこのディスパーゼにディスパーゼ抑制剤、例え
ばホスホラミドン（１００μｇ／ｍｌ）を付加的に添加する。

【００３４】サブトラクションクローニングの原理により、有利に剥離により誘発された（
dyshaesionsinduzierte）遺伝子の、すなわちケラチノサイトシートの剥離によ
りこの細胞中に発現が増加するような遺伝子のｃＤＮＡを含有する遺伝子ライブ
ラリーを製造した。この目的のためには接着するケラチノサイトシートの細胞か
ら得られたｍＲＮＡを新たにポリ−Ｔ−被覆ビーズに結合し、１本鎖ｃＤＮＡに
書き換え、引き続き剥離した、すなわち接着していないケラチノサイトシートの
ｍＲＮＡに対してハイブリダイズする。接着していない状態でのみ、すなわち剥
離の後に発現されかつその結果全くハイブリダイゼーションのパートナーを見い
ださない、そのようなｍＲＮＡ−分子は上澄み中に残る。これをｃＤＮＡに書き
換え、かつクローニングベクターｐＵＥＸ−１中にクローニングした。

【００３５】引き続き、これから得られた遺伝子ライブラリーに関して試験の目的で、接着
したおよび接着していないケラチノサイトシートの［^３２Ｐ］−標識ｃＤＮＡを
用いてサザンブロット法を実施した。このようなｃＤＮＡまたはむしろこのよう
なｃＤＮＡを含有する宿主細胞クローン−本発明においてはＥ.コリ株ＭＣ１０
６１−（これは剥離後に明らかな上昇調節を示した）を引き続き通常の培養条件
下に、３０℃で一夜培養もしくは増殖させた。このＥ.コリ−クローンからプラ
スミドＤＮＡ（ｐＵＥＸ１−ｃＤＮＡ）を製造し、ｐＵＥＸ１−ベクターから切
断したｃＤＮＡ−フラグメントをランダム−プライミングにより［^３２Ｐ］標識
した。この標識したｃＤＮＡをプローブとして接着したおよび接着していないケ
ラチノサイトシートからのＲＮＡとノーザンブロットに使用した。ノーザンブロ
ット法にプローブとして使用する際に接着したケラチノサイトのＲＮＡとは全く
シグナルが見られないかまたは非常に僅かのみ見られ、これとは反対に接着して
いないケラチノサイトシートのＲＮＡとは明らかなシグナルが認識されるｃＤＮ
Ａを含有するクローンを以下の配列決定法の工程のために選択した。

【００３６】ザンガー（Sanger）による改良された配列決定法であり、この間に慣用の操作
法となった“非放射性サイクル配列決定（nicht-radioaktiven Cycle-Sequencin
g）”を用いる、該当するクローンの配列決定において、配列番号１および４の
ヌクレオチド配列を有する遺伝子が見いだされた。この遺伝子およびこれに属す
るタンパク質を名称ｐＫｅ＃１２２とした。遺伝子ｐＫｅ＃１２２に属する、す
なわちｐＫｅ＃１２２特異的ｍＲＮＡ（剥離した、すなわち非接着のケラチノサ
イトシートからのもの）をより詳細に調べたところ、このｍＲＮＡは約４.８ｋ
ｂの大きさを有し、かつディスパーゼ誘発の剥離後に上昇調節を示すという情報
が得られた。図１は、ディスパーゼ誘発剥離の後（ａ）直後もしくは（ｂ）４時
間後のケラチノサイトシートからのｍＲＮＡを用いて、および［^３２Ｐ］標識ｐ
Ｋｅ＃１２２−ｃＤＮＡを用いて実施したノーザンブロットの結果を示す。この
結果は、剥離の直後は少量のｐＫｅ＃１２２−ｍＲＮＡが存在するか、またはい
ずれにしろ検出可能であったが、これに対して４時間後には多量のものが存在し
（広く色の濃いバンド）、すなわち約４.８ｋｂの分子量帯域に存在した、こと
を明らかにしている。

【００３７】遺伝子ｐＫｅ＃１２２のヌクレオチド配列は配列番号１の２３７３〜２３７５
の位置に３′−末端を有し、かつ相応して配列番号４の２４７２〜２４７４に終
止コドンを有し、これは転写末端の推定上の位置を設定し、かつポリ−Ａ−サイ
トの前の正確に２８個の核酸にいわゆる“ポリアデニル化サイト”（ＡＡＴＡＡ
ＡＡ）に非常に類似の配列、すなわちＡＡＴＡＡの１つが続く。

【００３８】こうして、ｐＫｅ＃１２２−遺伝子の全構造もしくはタンパク質ｐＫｅ＃１２
２をコードする一般化したポリヌクレオチドの全構造が明らかになり、この遺伝
子もしくはポリヌクレオチドが配列番号１または配列番号４中に示したヌクレオ
チド配列、またはこれら両方のヌクレオチド配列の１つの部分配列であるか、ま
たはこれらの示したヌクレオチドの１つまたはその部分配列の１つと相補的であ
るヌクレオチド配列を包含するかまたはこれからなるか、またはこれらの遺伝子
もしくはポリヌクレオチドが配列番号１または配列番号４に示したヌクレオチド
配列と、またはこれら両方のヌクレオチド配列の１つの部分配列とまたはこれら
の示したヌクレオチド配列またはその部分配列に相補的な配列と完全にまたは部
分的にハイブリダイズし、この際配列番号１および４においては、“Ｔ”の代わ
りに“Ｕ”であってもよく、かつこれらの遺伝子もしくはポリヌクレオチドから
、約４.８ｋｂのｃＤＮＡに相当するかもしくは相同であるｍＲＮＡが誘導され
る。

【００３９】Ｂ）タンパク質ｐＫｅ＃１２２をコードするポリヌクレオチド（ｐＫｅ＃１２
２−遺伝子）を基にしてタンパク質ｐＫｅ＃１２２のアミノ酸順序の誘導および
特徴付け遺伝学的コードに関してはコンピューターにより支持された方法(プログラム
：HUSAR=Heidelberg Unix Sequence Analysis Resources, Version 4.0, Deutsc
hes Krebsforschungszentrum Heidelberg, 1997)を用いて、配列番号１および４
に記載のヌクレオチド配列からそれぞれ配列番号２もしくは配列番号３中に記載
されているアミノ酸配列を誘導した。配列番号２および３に記載のアミノ酸配列
の構造分析は、同様に該プログラムを用いて、両方のアミノ酸配列に当てはまる
次の情報を与える： − 配列番号２による位置４０〜６３のアミノ酸順序（ＬＧＫＧＮＦＡＶＶＫ
ＬＡＲＨＲＶＴＫＴＱＶＡＩＫ）およびこれに相当する配列番号３に記載の位置
７３〜９６のアミノ酸順序はＡＴＰ−結合位を有する公知プロテインキナーゼ−
モチーフに相当する、 − 配列番号２による位置１５２〜１６４のアミノ酸順序（ＩＶＨＲＤＬＫＴ
ＥＮＬＬＬ）およびこれに相当する配列番号３に記載の位置１８５〜１９７は公
知セリン／スレオニン−プロテインキナーゼモチーフに相当する、 − 配列番号２による位置２３８〜２４０（ＴＬＲ）、位置４７５〜４７７（
ＴＧＲ）、位置４８５〜４８７（ＳＴＲ）および位置６００〜６０３（ＴＴＲ）
のアミノ酸順序および配列番号３に記載の位置２７１〜２７３（ＴＬＲ）、位置
５０８〜５１０（ＴＧＲ）、位置５１８〜５２０（ＳＴＲ）および位置６３３〜
６３５（ＴＴＲ）は公知プロテインキナーゼＣに関するリン酸化位に相当する、 − 配列番号２による位置１３８〜１５６のアミノ酸順序（ＷＱＩＬＳＡＶＥ
ＹＣＨＤＨＨＩＶＨＲＤ）およびこれに相当する配列番号３に記載の位置１７１
〜１８９はｐＫｅ＃１２２−１ペプチドを表し、これに対して抗−ペプチド−抗
体である“抗ｐＫｅ＃１２２−１”がウサギ中に製造された（実施例２参照）、 − 配列番号２による位置４８１〜４９９のアミノ酸順序（ＬＡＥＶＳＴＲＬ
ＳＰＬＴＡＰＣＩＶＶＳ）およびこれに相当する配列番号３に記載の位置５１４
〜５３２はｐＫｅ＃１２２−２ペプチドを表し、これに対して抗−ペプチド−抗
体である“抗ｐＫｅ＃１２２−２”がウサギ中に製造された（実施例２参照）、 − 配列番号２による位置３３９〜３５２のアミノ酸順序（ＮＨＦＡＡＩＹＹ
ＬＬＬＥＲＬ）およびこれに相当する配列番号３に記載の位置３７２〜３８５は
ｐＫｅ＃１２２−３ペプチドを表し、これに対して抗−ペプチド−抗体である“
抗ｐＫｅ＃１２２−３”がウサギ中に製造された（実施例２参照）、 − 配列番号２による位置６１４〜６２５のアミノ酸順序（ＧＬＡＲＱＶＣＱ
ＶＰＡＳ）およびこれに相当する配列番号３に記載の位置６４７〜６５８はｐＫ
ｅ＃１２２−４ペプチドを表し、これに対して抗−ペプチド−抗体である“抗ｐ
Ｋｅ＃１２２−４”がウサギ中に製造された（実施例２参照）、図２（配列番号２）中および図１４（配列番号３）中には、これらのタンパク
質ｐＫｅ＃１２２の構造データが概略的に記載されている。図２Ａおよび図１４
ＡはＡＴＶ−結合位を有するプロテインキナーゼモチーフ、セリン／スレオニン
−プロテインキナーゼモチーフおよびプロテインキナーゼＣに関する４つのリン
酸化位を示し、図２Ｂおよび図１４Ｂは配列断片を示し、これに対して抗−ペプ
チド−抗体をウサギ中で製造した。

【００４０】実施例２：ポリクローナル抗−ペプチド−抗体を製造するためのタンパク質ｐ
Ｋｅ＃１２２のアミノ酸配列の使用実施例１において記載したコンピュータープログラムを使用してコンピュータ
で支持された抗原分析を用いて、ポリクローナル抗−ペプチド−抗体の生産に好
適と思われる領域を配列番号２記載のアミノ酸配列から選択した。この領域は公
知“マルチプル−抗原ペプチド法”（Posnett D.N., Tam J.P., 1989: Multiple
antigenic peptide method for producing antipeptide site-specific antibo
dies. Methods-Enzymol. 1998; 178: 739-746参照)により分子量約１０〜１５ｋ
Ｄを有する分離したペプチド(pKe#122-1 から -4、図2参照)の形で合成された。
これらのペプチドを支持物質の添加なしに、ウサギのアジュバント支持免疫化の
ために使用した。このペプチド−製法およびこの免疫化法の詳細は公知技術にお
いて一般的に行われている。免疫前血清および免疫後血清を一般的に公知の固相
免疫活性測定法（ELISA）を用いて、それぞれの免疫化のために使用したペプチ
ドおよび比較ペプチドとの反応性に関して試験した。ペプチドｐＫｅ＃１２２−
１、ｐＫｅ＃１２２−２およびｐＫｅ＃１２２−４に対する明らかな免疫化が検
出可能であった。ポリクローナル抗体の精製のために、免疫後血清を最初に硫酸
アンモニウム沈殿を実施し、これによりＩｇＧ−フラクションを富化させた。引
き続き、この富化したＩｇＧ−フラクションを用いて、免疫親和性クロマトグラ
フィーを実施した。このためには免疫化に使用した４種のペプチドｐＫｅ＃１２
２−１から−４をセファロース４Ｂに固定し、かつこのペプチド−セファロース
−４Ｂ−複合体を免疫親和性クロマトグラフィーに使用した。３つの非常に純粋
な抗−ペプチド−ＩｇＧ−フラクション、すなわち抗ペプチドｐＫｅ＃１２２−
１、抗ペプチドｐＫｅ＃１２２−２および抗ペプチドｐＫｅ＃１２２−４が生じ
た。これらの３種の親和性で精製した抗体フラクションは、それぞれ相応する抗
原ペプチドと明らかな免疫反応を示した。表１にこの結果を示した。

【００４１】更に、ペプチドｐＫｅ＃１２２−１に対する免疫血清、ポリクローナル抗体抗
ｐＫｅ＃１２２−１、を用いて、ケラチノサイトラインＨａＣａＴのおよびディ
スパーゼでの剥離後８時間のケラチノサイトシート（非接着ケラチノサイトシー
ト）の細胞溶解産物をウェスタンブロット法で、タンパク質ｐＫｅ＃１２２の発
現に関して試験した。ＨａＣａＴ−細胞中にも、剥離した（非接着）ケラチノサ
イトシートの細胞中にも分子量約７０〜８５ｋＤを有するバンドが検出された。
この実験に属するウェスタンブロット法は実施例３Ｂ（２）中に詳細に記載され
ており、図３中に示した。ＨａＣａＴ−細胞中にも非接着ケラチノサイトシート
中にも約７０〜８５ｋＤの大きさのタンパク質が示された。

【００４２】更に、ポリクローナル抗−ペプチド−抗体ｐＫｅ＃１２２−１は本発明の実施
例５中に記載された組み換え体ＧＳＴ−ｐＫｅ＃１２２−融合タンパク質約１０
０ｋＤ（図１０Ｂ中のフラグメント８５）を用いて免疫ブロット法で試験された
。このポリクローナル抗ペプチド−抗体ｐＫｅ＃１２２−１はこの融合タンパク
質と反応した。プラスの反応は対照実験との比較により確認された、この対照実
験は抗−ペプチド−抗体ｐＫｅ＃１２２−１の代わりに抗−ＧＳＴ−抗体、また
は正常ウサギＩｇＧを使用した。この結果を表１および図４中に記載した。図４
中のレーン“ａ”はヤギ−正常−ＩｇＧを用いた対照バッチであり、図４中のレ
ーン“ｂ”はヤギ−抗−ＧＳＴ−ＩｇＧを有するバッチを示しており、図４中の
“ｃ”はウサギ−正常−ＩｇＧを有するバッチ、図４中の“ｄ”はウサギ−抗−
ｐＫｅ＃１２２−１を有するバッチを示している。

【００４３】実施例３：タンパク質ｐＫｅ＃１２２の、もしくはこのタンパク質またはｐＫ
ｅ＃１２２のｍＲＮＡに対する反応試薬の、ヒト表皮ケラチノサイトの活性化状
態の検出のための使用Ａ）使用したケラチノサイト実験細胞もしくはターゲット細胞（＝標的対象細胞）としてＨａＣａＴ−細胞
および細胞培養体のもしくは細胞培養モデル（ＨＮＥＫ）のヒト表皮ケラチノサ
イトを使用した、このモデルに関しては文献中にB.M.Schaeferおよびその共著等
（前記）により詳細に記載されており、本発明においては実施例１（Ａ）に短く
まとめて記載されている。この文献の内容に関してはここで本発明への関連を明
記する。更に皮膚生検をｐＫｅ＃１２２−タンパク質の発現に関して調べた。

【００４４】Ｂ）タンパク質ｐＫｅ＃１２２に対する抗体の使用を基礎とする検出法１. 免疫組織学クリオトーム（Kryotom）を用いて、臨床的に正常な皮膚の生検からの、およ
び尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および尋常性乾癬のような疾患の結果、臨床的に
損傷を有する皮膚の生検からの組織の５μＭの厚さの凍結断片を作成した。これ
らを室温で乾燥し、１００％アセトン中で固定する（アセトンの代わりに、１０
０％メタノール、１００％エタノールまたは４％のパラホルムアルデヒドを同様
に使用することができる）。この後、この断片をいわゆる“遮断法”として知ら
れる公知法により処理し、抗体に関して非特異的な結合位を遮断する。この実施
例においては、２回の遮断法を実施した：（１）アビジン／ビオチンでの遮断お
よび（２）正常血清での遮断。最初の遮断工程においてはVector-Laboratories
社のアビジン−ビオチン−遮断キットを使用して、製造者の指示書に従ってアビ
ジン／ビオチン−遮断を実施した、すなわち室温で、最初にアビジン完成溶液で
１５分間、および引き続きビオチン完成溶液で１５分間インキュベートした。引
き続き、この断片をＰＢＳ中の１０体積％正常血清（二番目の抗体がこれから由
来する種の正常血清、ここではヤギ−正常血清；ＰＢＳ＝phosphate buffered s
aline＝リン酸塩緩衝食塩水、ｐＨ７.２〜７.４）と共に室温で１５分間インキ
ュベートした。

【００４５】この遮断に続いて、この断片を抗−ペプチド−ｐＫｅ＃１２２−１５μｇ／
ｍｌを含有するＰＢＳ中で室温で１時間インキュベートする。結合していない抗
体を除去するために、引き続きこの断片をウシ血清アルブミン０.２％（質量／
体積）を含有するＰＢＳ中で洗浄する。引き続き、ヤギからの例えばビオチン標
識し、かつウサギ−ＩｇＧに対する抗体とのインキュベーション、更なる洗浄工
程並びに蛍光染料Ｃｙ３−標識ストレプトアビジン（ＰＢＳ／０．２％ＢＳＡ中
に１：１０００希釈）の担持を実施する。Ｃｙ３の代わりに、他の蛍光染料、例
えばＦＩＴＣ、をストレプトアビジンの標識のために使用することもできる。最
後の洗浄工程の後、この断片を被覆媒体、例えばElvanolまたはHistogelで被覆
し、蛍光顕微鏡で調べて、評価する。図５中にはこのように実施した免疫蛍光検
出法の結果が記載されている：抗−ｐＫｅ＃１２２−１ＩｇＧ抗体は表皮の基底
膜領域の範囲で正常皮膚断片ケラチノサイトを染色する。疾患尋常性天疱瘡（図
５Ｂ）、水疱性天疱瘡（図５Ｃ）または尋常性乾癬（図５Ｄ）により損傷した皮
膚の生検の染色においては、表皮ケラチノサイト、特に表皮損傷の範囲で明らか
な強い染色を示す。このことにより、そこではタンパク質ｐＫｅ＃１２２の強化
した発現および明らかな上昇調節が行われた。

【００４６】２. 免疫ブロット（“ウェスタン−ブロット”）およびドットブロット図３中には抗−ｐＫｅ＃１２２−１を使用するウェスタンブロット法によるｐ
Ｋｅ＃１２２−タンパク質の検出が図示されている。このためにはケラチノサイ
トラインＨａＣａＴ（試料“ＨａＣａＴ”）の細胞溶解産物およびディスパーゼ
処理後８時間のケラチノサイトシート（試料“ＮＨＥＫ８ｈ”）の細胞溶解産物
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離した。このタンパク
質をニトロセルロース膜上に標準法によりブロットした。非特異的な結合位の遮
断のために５質量％粉ミルク／ＴＢＳ−緩衝剤と共にインキュベートした。引き
続き、“抗−１２２−１”と命名した（タンパク質−）ゾーンを抗−ｐＫｅ＃１
２２−１抗体（１μｇ／ｍｌ）の添加下に３％−粉末ミルク／ＴＢＳ−緩衝剤中
で、および“ｒｂＩｇＧ”と命名した（タンパク質−）ゾーンをウサギ−正常−
ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）の添加下に３％−粉末ミルク／ＴＢＳ−緩衝剤中で、そ
れぞれ４℃で約１８時間（一夜）インキュベートした。その後、ニトロセルロー
ス膜をＴＢＳ／ツウィーン−およびＴＢＳ−緩衝剤で洗浄し、酵素標識した抗−
ウサギ−ＩｇＧ−抗体と３％−粉末ミルク／ＴＢＳ−緩衝剤中でインキュベート
した。ＴＢＳ／ツウィーンおよびＴＢＳでの新たな洗浄の後、結合した抗体をペ
ルオキシダーゼ特異的な蛍光基質（ここでは、例えばAmersham-Buchler社のＥＣ
Ｌ−システム）で可視とし、オートラジオグラフィーで図示した。選択肢として
、色原体基質での標識も良好に可能である。細胞溶解産物も予め電気泳動による
精製なしに、直接ニトロセルロース膜上にブロットし、その後前記と同様に処理
することもできる。

【００４７】３. 固相免疫活性測定法（ELISA）マイクロタイタープレートを種々異なる濃度（１０〜０ｎｇ／ｍｌ）の組み換
えｐＫｅ＃１２２／ＧＳＴ−融合タンパク質で被覆した。非特異的な結合位をＰ
ＢＳ中の０.１質量％ゼラチン（ＰＢＳ／ゼラチン）での処理により遮断する。
引き続き被覆した凹部を抗ｐＫｅ＃１２２−１ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）と室温で
１時間インキュベートする（図６Ａ参照、黒丸）。対照バッチは同濃度のウサギ
正常−ＩｇＧで行われる（図６Ａ参照、白丸）。ＰＢＳ中の０.０５容積％ツウ
ィーン−２０（ＰＢＳ／ツウィーン）での洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ−標
識ヤギ−抗−ウサギＩｇＧ（ＰＢＳ／ツウィーン中１：１００００）と共にイン
キュベートする。未結合の酵素標識抗体を除去するための更なる洗浄工程の後に
、ペルオキシダーゼにより有色の生成物に変換する、無色ペルオキシダーゼ−基
質オルト−フェニレンジアミンを添加する。オルト−フェニレンジアミンの代わ
りに、色変化を示す他のペルオキシダーゼ基質を使用することもできる。色形成
の定量化およびこれに伴う結合抗体の定量は４９０から４０５ｎｍ（縦軸）にお
いてマイクロタイタープレート測光器中での吸収測定により行う。そのような実
験の結果は図６Ａ中に図示されている。これは、色の濃さがプレートに結合した
ｐＫｅ＃１２２−溶融タンパク質の量に比例することを示している。このことか
ら、公知抗原濃度の試料、いわゆる標準、の使用において、比較により未知の抗
原量の定量が可能になるということが導かれる。

【００４８】複合溶液中でのｐＫｅ＃１２２−タンパク質の定量のためには、サンドイッチ
−ＥＬＩＳＡの実施が有利である（図６Ｂ）。このためにはマイクロタイタープ
レートをｐＫｅ＃１２２に対する抗体（例えばウサギ抗−ｐＫｅ＃１２２／ＧＳ
Ｔ−融合タンパク質、１μｇ／凹部）で被覆する。次いでマイクロタイタープレ
ートのなお残っている非特異的結合位をＰＢＳ／ゼラチンで遮断する。引き続き
、マイクロタイタープレートを種々の濃度のｐＫｅ＃１２２／ＧＳＴ−タンパク
質（１０〜０ｎｇ／ｍｌ）と共にバッチにした。ＰＢＳ／ツウィーンでの洗浄工
程の後、このプレートを第２のペルオキシダーゼ−標識抗−ｐＫｅ＃１２２−抗
体（例えば、ペルオキシダーゼ−標識ウサギ抗−ｐＫｅ＃１２２−１（ペプチド
）−抗体）と共にインキュベートする（例えば室温で振盪下に１時間）。ここで
“ペルオキシダーゼ”とは、抗体の、例えば酵素、蛍光分子またはルミネセンス
分子での実質的に全ての任意の標識を意味する。非結合の酵素標識抗体を除去す
るための更なる洗浄工程の後に、無色のペルオキシダーゼ−基質であるオルト−
フェニレンジアミンを添加し、これはペルオキシダーゼの活性により有色の生成
物に変換する。色形成の定量化は４９０から４０５ｎｍ（縦軸）でのマイクロタ
イタープレート測光器中での吸収測定により行われる。このような実験の結果を
図６Ｂ中に示した。これは、色濃度がプレートに結合したｐＫｅ＃１２２の量に
比例することを示す。この試験法により、試料中のｐＫｅ＃１２２の未知の量の
定量が成功裏に可能である。この際、基質オルト−フェニレンジアミンは、ペル
オキシダーゼ活性によりその色を変化させる全ての任意のペルオキシダーゼ基質
を代表する。

【００４９】ここで例として使用したポリクローナル抗体“抗−ｐＫｅ＃１２２−１”の代
わりに、同様に、タンパク質ｐＫｅ＃１２２に対するモノクローナル抗体を使用
してよく、かつ簡単なＥＬＩＳＡ法（＝Enzyme linked immunosorben assay）で
あっても、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡであってもよい。

【００５０】実施例４：リバースポリメラーゼ連鎖反応を用いる細胞中のｐＫｅ＃１２２特
異的ｍＲＮＡの検出ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてディスパーゼ処理の後のケラチノサ
イトシート（ＮＨＥＫ）の細胞中のおよびＨａＣａＴ−細胞中のｐＫｅ＃１２２
−特異的ＲＮＡを検出した。このためには、ディスパーゼ処理および異なる長さ
の更なるインキュベーション時間の後のケラチノサイトシート（ＮＨＥＫ）の細
胞からのおよびＨａＣａＴ−細胞からのＲＮＡを、それぞれ標準法（グアニジニ
ウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム−抽出法、実施例１Ａ参照）
で単離し、標準法でｃＤＮＡに書き換える。このｃＤＮＡをＰＣＲ処理し、ここ
で約３５０ｋｂの部分フラグメントをこのｐＫｅ＃１２２−特異的ｃＤＮＡから
増幅した。プライマー対としては、プライマー“ｐＫｅ＃１２２−フォワード３
”（ｔｇａｇｃａｇｇｃｇｃｔｇｇｇｔａｔｃａｔｇｃａｇ）および“ｐＫｅ＃
１２２−リバース２”（ｔｃａｃｃｇｇｇａａｃａａｇａａｇｇｇｃｃａｃｃｔ
）からの組合せを使用した。それぞれのプライマー１０μＭとｃＤＮＡ１０ｎｇ
を熱安定性のＤＮＡ−ポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびポ
リメラーゼ緩衝液からなる混合物(例えば: Current protocols in Molecular Bi
ology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons. Inc, Suppl. 37, Chapter 15参照)
と一緒に、本発明においては市販のClontech社の“PCR-Master-Mix”の形で、バ
ッチとした。更に、次の対照実験を実施した：１. ｃＤＮＡの代わりにプラス
ミドｐＵＥＸ−１／ｐＫｅ＃１２２を有する前記のバッチ、２. キット内部の
プラスの対照、３. ｃＤＮＡを添加しない前記反応バッチ（マイナスの対照１
）、４. ディスパーゼ処理後２時間のケラチノサイトシート（ＮＨＥＫ）の細
胞からのｃＤＮＡを含有し、プライマーを添加していない、前記反応バッチ（マ
イナス対照２）。ＰＣＲ−反応の反応生成物をアガロースゲル電気泳動で分離し
た。図７はこれらの分離の結果を示す。レーン１＝分子量マーカー、レーン２＝
ＮＨＥＫＴ０、レーン３＝ＮＨＥＫＴ２、レーン４＝ＮＨＥＫＴ４、レーン
５＝ＮＨＥＫＴ８、レーン６＝ＨａＣａＴ、レーン７＝空き、レーン８＝プラ
スの対照（ｐＵＥＸ−１；挿入物としてｐＫｅ＃１２２）、レーン９＝マイナス
の対照（ｃＤＮＡを有し、プライマーを含有しないバッチ）、レーン１０＝ＰＣ
Ｒの機能コントロールのためのキット特異的プラスの対照、レーン１１＝マイナ
スの対照（ｃＤＮＡを有さず、プライマーを含有するバッチ）、レーン１２＝分
子量マーカー。期待する大きさ約３５０ｋｂのＰＣＲ−生成物はレーン３、４、
５、６および８中に検出される、すなわち：ｐＫｅ＃１２２−特異的ｍＲＮＡは
ディスパーゼ誘発剥離後の２（Ｔ２）、４（Ｔ４）および８（Ｔ８）時間の時点
の細胞中に、および同様にＨａＣａＴ−細胞中に検出された。

【００５１】この技術は、免疫組織学的方法、ＥＬＩＳＡ法、ドットブロット法、ウェスタ
ンブロット法において低すぎる発現レベルのためにｐＫｅ＃１２２−タンパク質
の検出ができない場合にも、ｐＫｅ＃１２２−発現を検出することを可能とした
。

【００５２】実施例５：原核細胞もしくは真核細胞中のタンパク質ｐＫｅ＃１２２の発現能
力を有するベクター分子の製造組み換えｐＫｅ＃１２２−タンパク質の製造もしくは発現のために、２つの方
法を実施した。１つの方法は、２つのｐＫｅ＃１２２−グルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質であるｐＫｅ＃１２２／ＧＳＴ−Ｉ
およびｐＫｅ＃１２２／ＧＳＴ−ＩＩ（ベクターｐＧＥＸ；図８参照）を細菌（
Ｅ.コリＤＨ５α）中での発現のために製造した。他の方法のためには、ｐＫｅ
＃１２２−ＦＬＡＧ−融合タンパク質（ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ；図９参照）を
真核細胞（ｃｏｓ−細胞）中での発現のために製造した。

【００５３】ｐＫｅ＃１２２−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タ
ンパク質をＥ.コリ（ＤＨ５α）中にＩＰＴＧ−誘発により発現させた。誘発の
後、細菌の溶解産物をウェスタンブロット法において抗−ＧＳＴ−抗体と共に実
験した、すなわちｐＫｅ＃１２２−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇ
ＳＴ）−ベクターを有するが、誘発していない細菌溶解産物に、並びにＧＳＴの
みを発現する細菌の溶解産物に比較して実験した。このウェスタンブロット法の
生成物を図１０Ａ中に示した：レーン（ａ）はＩＰＴＧ−誘発前の対照形質転換
体（挿入体なしのＧＳＴ）を示す、レーン（ｂ）はＩＰＴＧ−誘発後の対照形質
転換体（挿入体なしのＧＳＴ）を示す、レーン（ｃ）はＩＰＴＧ−誘発前のｐＫ
ｅ＃１２２／ＧＳＴ−Ｉを示す、レーン（ｄ）はＩＰＴＧ−誘発後のｐＫｅ＃１
２２／ＧＳＴ−Ｉを示す、レーン（ｅ）はＩＰＴＧ−誘発前のｐＫｅ＃１２２／
ＧＳＴ−ＩＩを示す、レーン（ｆ）はＩＰＴＧ−誘発後のｐＫｅ＃１２２／ＧＳ
Ｔ−ＩＩを示す。

【００５４】図面から明らかなように、異なる大きさのＧＳＴプラスのバンドの混合物を検
出可能であり、すなわちＩＰＴＧ−誘発の後のみ異なる大きさのＧＳＴプラスの
バンドの混合物を検出可能である。最大分子のバンドは約１００ｋＤの分子量を
有し（フラクション８５）、最も低い分子量のバンドは約２６ｋＤであり、これ
は純粋なＧＳＴ−タンパク質の分子量に相当する。前記データは、Ｅ.コリ中で
組み換えｐＫｅ＃１２２−ＧＳＴ−融合タンパク質の分解が生じるということを
示す。発現した融合タンパク質（レーンｄ）は、不溶性のタンパク質凝集物とし
ていわゆる“封入体”中に存在し、従って、Ｐｒｅｐ−細胞により精製を実施し
た。次いで、このＰｒｅｐ細胞−精製のフラクションを標準法により電気泳動に
より分離し、すでに前記の抗−ＧＳＴ−抗体を用いる免疫ブロット法により分析
した。この精製法の生産物を図１０Ｂ中に図示した。精製により異なる大きさの
ＧＳＴ−融合タンパク質が生じた。最も強いバンド、すなわち多くのＧＳＴ−融
合タンパク質は６５ｋＤの見かけ（apparent）分子量マーカーを示す。このこと
はｐＫｅ＃１２２−ＧＳＴ−融合タンパク質６５ｋＤがＧＳＴ−タンパク質およ
びタンパク質ｐＫｅ＃１２２の約４０ｋＤの大きさのフラグメントからなるとい
う結論を許可する。この６５ｋＤのｐＫｅ＃１２２／ＧＳＴ−融合タンパク質を
ポリクローナルアンチ血清の製造のためにウサギ中に引き入れる。抗体の製造お
よび特徴付けは抗−ペプチド−抗体に関する実施例２におけると同様に行った。

【００５５】最大分子のバンドは約１００ｋＤの見かけ分子量を有した（図１０Ｂ、フラク
ション８５参照）。このことは１００ｋＤのｐＫｅ＃１２２−ＧＳＴ−融合タン
パク質がＧＳＴ−タンパク質およびタンパク質ｐＫｅ＃１２２の約７０〜７５ｋ
Ｄの大きさのフラグメントからなるという結論を許可する（図４およびこれに属
する実施例２中の記載参照）。

【００５６】真核系においてはｐＢＫ−ＣＭＶ−ｐＫｅ＃１２２−ベクター（図９）をいわ
ゆるｃｏｓ−細胞、すなわち公知技術において一般的に公知のｃｏｓ−細胞ライ
ンの細胞、中に形質転換する。このｃｏｓ−細胞をＤＥＡＥ−デキストラン／ク
ロロキンでの処理による標準法によりプラスミド−ＤＮＡを取り込ませた。その
後、この形質転換細胞を２日間標準条件（３７℃および７％ＣＯ_２）下にインキ
ュベートした。このｃｏｓ−細胞を溶解し、免疫ブロット法でＦＬＡＧ−エピト
ープもしくは抗−ペプチド−抗体抗−ｐＫｅ＃１２２−１ＩｇＧに対する抗体の
使用下に分析した。図１１は免疫ブロットの生成物を示す：レーンａは非形質転
換ｃｏｓ−細胞を示し、レーンｂはＦＬＡＧ−対照タンパク質を示しかつレーン
ｃはｐＫｅ＃１２２−ＦＬＡＧベクター構成体で形質転換したｃｏｓ−細胞を示
す。レーンｃは抗−ＦＬＡＧ抗体により着色した、約分子量８０ｋＤのバンドを
示す。レーンｂは抗−ＦＬＡＧ−抗体の機能性を示す、ＦＬＡＧ−標識対照タン
パク質を示す。

【００５７】実施例６：ｐＫｅ＃１２２−特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドによる
ケラチノサイトへの影響アンチセンス−ヌクレオチドを細胞、ケラチノサイトから取りだし(G. Hartma
nn et al. 1998: Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Aerzteblatt 95, Hef
t 24, C1115-C1119参照)、この細胞中に存在するｍＲＮＡに結合させ、その翻訳
およびこうして発現を抑制する(Y.-S. Lee, et al. 1997: Definition by speci
fic antisense oligonucleotides of a role for proteinkinase Cα in expres
sion of differentiation markers in normal and neoplastic mouse epidermal
keratinocytes, Molecular Carcinogenesis 18, S. 44-53参照)。好適なアンチ
センス−オリゴヌクレオチドをｐＫｅ＃１２２−特異的ヌクレオチド配列（配列
番号１もしくは４）により製造した。これを好適な緩衝媒体（いわゆる“オリゴ
緩衝剤”）で濃度１００μＭに調節した。ＨａＣａＴ−細胞を３７℃および７％
ＣＯ_２で７０〜８０％の融合（confluent）まで培養した。この細胞をトリプシ
ン処理し（０.２％ＥＤＴＡ１０分間、０.１％トリプシン５〜１０分間）２５０
００細胞／ｍｌの濃度に調節した。９６穴−プレートの凹部当たり、細胞懸濁液
１００μｌ（細胞２５００個に相当）をピペットで入れた。この細胞を１時間イ
ンキュベートし、その後アンチセンス−オリゴヌクレオチド（１００μＭ−溶液
の２μｌ）の添加を実施し、更に２４〜４８時間インキュベーションした。マイ
ナスの対照としては、同じ塩基分布であるが、たまたま選択された配列を有する
オリゴヌクレオチドを添加した細胞バッチを使用した。

【００５８】そのように処理した細胞を顕微鏡を用いて、細胞中の表現型変化に関して調べ
た。顕微鏡分析の結果を図１２および図１３中に示した。図１２ａはｐＫｅ＃１
２２−特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドで処理されている、サブ融合（
subconfluent）ＨａＣａＴ−培養体を示し、図１２ｂは対照オリゴヌクレオチド
で処理されているサブ融合ＨａＣａｔ−培養を示し、図１３ａはｐＫｅ＃１２２
−特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドで処理されている、融合（confluen
t）ＨａＣａＴ−培養体を示し、図１３ｂは対照オリゴヌクレオチドで処理され
ている融合ＨａＣａｔ−培養を示し、図１３ｃは図１３ａのより詳細な図を示す
。

【００５９】この顕微鏡実験結果は、特異的なアンチセンス−オリゴヌクレオチドで処理し
た培養体中の細胞の数が対照−オリゴヌクレオチドに比べて明らかに減少してい
るということを示している。このことはアンチセンス−オリゴヌクレオチドに起
因する細胞増殖の減少を推量させる。融合の達成の後、アンチセンス−オリゴヌ
クレオチドで処理したＨａＣａＴ−培養体中に、対照−オリゴヌクレオチドで処
理した培養体中には見いだされなかった、強度に拡大した細胞が見いだされた。
この大きな細胞はその形態学において分化したケラチノサイトに相当する。この
発見はｐＫｅ＃１２２−特異的アンチセンス−オリゴヌクレオチドで処理した細
胞が分化への強化された傾向を示すということを推定させる。

【００６０】要約すると、ｐＫｅ＃１２２−特異的オリゴヌクレオチドでの処理は増殖およ
び分化への明らかな影響に導く。

【００６１】表１抗−ペプチド−抗体の特徴付け。それぞれの血清からＩｇＧ−フラクションを
硫酸アンモニウム沈殿により富化させた。それぞれのＩｇＧ−調製物を相当する
ペプチドおよび関連していないペプチドを用いてペプチド−ＥＬＩＳＡで試験し
た。更なる工程でＩｇＧ−調製物を精製した融合タンパク質ＧＳＴ−ｐＫｅ＃１
２２−１を免疫−ブロット法で試験した。

【００６２】

【表１】配列表（１）一般的情報：出願人：名称：ミヒャエル・クラーマー博士町：ベルクシュトラーセ８５市：プフングシュタット州：ヘッセン国：ドイツ郵便コード：６４３１９代理人：名称：ウルリケ・ルドルフ博士町：インデルシャンツ１０市：シュリースハイム州：バーデン−ビュルッテンベルグ国：ドイツ郵便コード：６９１９８代理人番号：２４６２６３書類記号：ｋｍ-１／ｐｃｔ電信情報電話：０６２０３−６１３４８テレファックス：０６２０３−６４１９６発明の名称：ヒトのケラチノサイトからの調節タンパク質配列の数：４コンピューター読み取り可能形：媒体型：フロッピー（登録商標）ディスクコンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブルオペレーティングシステム：ＭＳ−ＤＯＳソフトウエア：ウィンドウズ６.０マイクロソフトＷＯＲＤ（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情報：配列特徴：長さ：２５３３塩基対型：デオキシリボ核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセテイカル：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：生物名：ホモサピエンス種族：コーカサス成長段階：成人細胞型：表皮ケラチノサイト直接の起源：ケラチノサイトからのｃＤＮＡ特徴：名称／記号：ヒトのケラチノサイトからの調節タンパク質をコードする配
列存在位置：１..２５３３特徴を決定した方法：ｃＤＮＡ−配列決定配列

【００６３】

【外１】

【００６４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情報：配列特徴：長さ：７９０アミノ酸型：アミノ酸配列配列の種類：タンパク質起源：生物名：ホモサピエンス種族：コーカサス成長段階：成人細胞型：表皮ケラチノサイト直接の起源：ｃＤＮＡ−配列からの誘導特徴：名称／記号：ヒトのケラチノサイトからの調節タンパク質をコードする配
列存在位置：１..７９０特徴を決定した方法：ｃＤＮＡ−配列からの誘導その他の情報：セリン／スレオニン−キナーゼ−モチーフ１個、チロシン
キナーゼリン酸化モチーフ４個およびＡＴＰ−結合位を有するキナーゼ−ドメイ
ン１個を包含する配列

【００６５】

【外２】

【００６６】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情報：配列特徴：長さ：８２３アミノ酸型：アミノ酸配列配列の種類：タンパク質起源：生物名：ホモサピエンス種族：コーカサス成長段階：成人細胞型：表皮ケラチノサイト直接の起源：ｃＤＮＡ−配列から誘導特徴：名称／記号：ヒトのケラチノサイトからの調節タンパク質をコードする配
列存在位置：１..８２３特徴を決定した方法：ｃＤＮＡ−配列からの誘導その他の情報：セリン／スレオニン−キナーゼ−モチーフ１個、チロシン
キナーゼリン酸化モチーフ４個およびＡＴＰ−結合位を有するキナーゼ−ドメイ
ン１個を包含する配列

【００６７】

【外３】

【００６８】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に関する情報：配列特徴：長さ：２６３２塩基対型：デオキシリボ核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセテイカル：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源：生物名：ホモサピエンス種族：コーカサス成長段階：成人細胞型：表皮ケラチノサイト直接の起源：ケラチノサイトからのｃＤＮＡ特徴：名称／記号：ヒトのケラチノサイトからの調節タンパク質をコードする配
列存在位置：１..２６３２特徴を決定した方法：ｃＤＮＡ−配列決定配列

【００６９】

【外４】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１のＡ）で実施したノーザンブロット法の結果を示す図である。

【図２】配列番号２のタンパク質ｐＫｅ＃１２２の構造データを概略的に示した図であ
る。

【図３】実施例３のＢ）１.において実施した、抗−１２２−１およびｒｂＩｇＧのウ
ェスタンブロット法の結果を示す図である。

【図４】実施例２で実施した、免疫ブロット法の結果を示す図である。

【図５】実施例３のＢ）３.において実施した、免疫蛍光検出法の結果を示す図である
。

【図６】実施例２のＢ）３.のＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。

【図７】実施例４に記載した、ＰＣＲ−反応の反応生成物をアガロースゲル電気泳動で
分離した結果を示す図である。

【図８】ベクターｐＧＥＸの制限地図を示す図である。

【図９】ベクターｐＢＫ−ＶＭＷの制限地図を示す図である。

【図１０】実施例５に記載した、ウェスタンブロット法の結果を示す図である。

【図１１】実施例５に記載した、免疫ブロット法の結果を示す図である。

【図１２】実施例６の顕微鏡分析の結果を示す写真図である。

【図１３】実施例６の顕微鏡分析の結果を示す写真図である。

【図１４】配列番号３のタンパク質ｐＫｅ＃１２２の構造データを概略的に示した図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 17/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８４Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/12 ４Ｃ０８５Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ４Ｃ０８６ 9/12 Ｚ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ａ０１Ｋ 67/027 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ０１Ｋ 67/027 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャネッテライナルツドイツ連邦共和国ハイデルベルクアンゲルヴェーク２ (72)発明者ビルギットシェーファードイツ連邦共和国ハイデルベルクオーデンヴァルトシュトラーセ 49／２ (72)発明者ラインハルトヴァリッヒドイツ連邦共和国ハイデルベルクヘルマン−レンス−ヴェーク 52／１Ｆターム(参考） 2G045 CB09 DA12 DA13 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 CA05 CA09 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA12 4B050 CC04 DD11 EE10 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ08 QQ53 QR32 QS16 QS25 4B065 AA26X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA44 CA46 4C084 AA13 BA01 BA02 BA22 CA18 ZA89 ZC78 4C085 AA13 BB11 CC04 DD88 EE01 4C086 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA89 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA89 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然にヒトのケラチノサイト中に存在し、かつケラチノサイ
トの活性化状態で強化して発現されるタンパク質と同様であるかまたは類似であ
り、かつ配列番号２中にまたは配列番号３中に示されたアミノ酸配列またはこれらの両
方のアミノ酸配列の１つからアミノ酸置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入または
アミノ酸逆位により生じたアレルまたは誘導体である、単離したポリペプチド。
【請求項２】天然にヒトのケラチノサイト中に存在し、かつケラチノサイ
トの活性化状態で強化して発現されるタンパク質と同様であるかまたは類似であ
るタンパク質をコードし、配列番号１中にまたは配列番号４中に示されたヌクレオチド配列、またはこれらの両方の１つに相補的なヌクレオチド配列、またはこれら両方の図示したまたは相補的なヌクレオチド配列の１つの部分配
列、またはこれらの前記ヌクレオチド配列の１つと完全にまたは部分的にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を有する、単離した核酸。
【請求項３】核酸が天然の、合成のまたは半合成の源から得られている、
請求項２記載の単離した核酸。
【請求項４】核酸がｃＤＮＡである請求項２または３記載の単離した核酸
。
【請求項５】核酸が、少なくともヌクレオチド６個、有利にヌクレオチド
８から２５個を包含し、配列番号１中にまたは配列番号４中に示されたヌクレオ
チド配列またはその部分配列とハイブリダイズする、センス−またはアンチセン
ス−オリゴヌクレオチドである請求項２または３記載の単離した核酸。
【請求項６】核酸が配列番号１または配列番号４中に示されたヌクレオチ
ド配列とハイブリダイズする、スプライス−変異体である、請求項２または３記
載の単離した核酸。
【請求項７】配列番号１または配列番号４中に示したヌクレオチド配列、
またはこれら両方の１つに相補的なヌクレオチド配列、またはこれら両方の示したまたは相補的なヌクレオチド配列の１つの部分配列、
または前記ヌクレオチド配列の１つと完全にまたは部分的にハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を有する、ｍＲＮＡのスプライス−変異体から生じるアミノ酸
配列を有することを特徴とする、単離したポリペプチド。
【請求項８】請求項２から６のいずれか１項記載の核酸を包含し、ヒトの
ケラチノサイト中に存在し、かつ活性化ケラチノサイト中で強化して発現される
タンパク質、特にタンパク質ｐＫｅ＃１２２を真核細胞または原核細胞中で発現
する能力を有する、組み換えＤＮＡ−ベクター分子。
【請求項９】ベクター分子がプラスミドｐＵＥＸ−１またはｐＧＥＸ−２
ＴまたはｐＢＫ−ＣＭＶまたはｐＨＲ２である、請求項８記載の組み換えＤＮＡ
−ベクター分子。
【請求項１０】宿主細胞中に天然ににまたは組換えの結果として含有され
ている、活性化可能なプロモータと結合している、請求項２から６のいずれか１
項記載の核酸を含有し、かつヒトのケラチノサイト中に存在しかつ活性化ケラチ
ノサイト中で強化して発現されるタンパク質、特にタンパク質ｐＫｅ＃１２２を
発現させるための能力を有する、形質転換した宿主細胞。
【請求項１１】プロモータがサイトケラチン−１４−プロモータであり、
宿主細胞がケラチノサイトであるか、またはプロモータがＣＭＶ−プロモータで
あり、宿主細胞がＣｏｓ−細胞である請求項１０記載の形質転換した宿主細胞。
【請求項１２】トランスジェニック哺乳動物、特にマウスまたはラットの
製造のための、請求項２に記載の核酸または請求項８記載のベクター分子の使用
。
【請求項１３】これらのポリペプチドおよび／またはこれと類似のタンパ
ク質に対する抗体を製造するための請求項１または請求項７記載のポリペプチド
の使用。
【請求項１４】抗体を特に皮膚病の診断および／または治療処置のために
、または特に表皮の美容的処置のために使用する請求項１３記載の使用。
【請求項１５】請求項１または請求項７記載のポリペプチドと特異的に反
応する抗体。
【請求項１６】皮膚病の診断および／または治療処置のための、または表
皮の美容的処置のための請求項１５記載の抗体の使用。
【請求項１７】ヒトのケラチノサイト中に存在し、かつ活性化ケラチノサ
イト中で強化して発現されるタンパク質、特にタンパク質ｐＫｅ＃１２２を間接
的に検出するための試薬において、この試薬が請求項２から６までのいずれか１
項記載の核酸を少なくとも１種または請求項１または７記載のポリペプチドを包
含することを特徴とする試薬。
【請求項１８】特に皮膚病の診断および／または治療処置のための、また
は特に表皮の美容的処置のための、請求項５記載のセンス−またはアンチセンス
−オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１９】ポリペプチドもしくは核酸に結合し、これによりその機能
および／または発現に影響を与える、特にインヒビターまたはアクチベータとし
て作用する、医学的、化粧品学的または薬理学的に使用可能な物質の同定のため
の請求項１または請求項７記載のポリペプチドまたは請求項２記載の核酸の使用
。