JP2003525023A - グッドパスチャー抗原結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はグッドパスチャー抗原結合タンパク質（ＧＰＢＰ）をコードする単離された核酸配列および発現ベクター、実質的に精製されたＧＰＢＰ、ＧＰＢＰに対する抗体、およびＧＰＢＰを検出する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （相互参照） 本出願は１９９９年２月２４日に出願された米国仮出願番号６０／１２１４８
３の優先権を請求する。

【０００２】 (政府権限の記載) 本研究はＣｏｍｉｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｍｉｎｉｓｔｅｒｉａｌ ｄｅ Ｃｉ
ｅｎｃｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ（ＣＩＣＹＴ、スペイン）のＰｌａｎ Ｎ
ａｃｉｏｎａｌ Ｉ＋Ｄからの許可番号ＳＡＬ９１／０５１３、ＳＡＦ９４／１
０５１およびＳＡＦ９７／００６５、Ｆｏｎｄｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃ
ｉｏｎｅｓ Ｓａｎｉｔａｒｉａｓ（ＦＩＳｓｓ、スペイン）からの許可番号９
３／０３４３、並びにｌａ Ｄｉｒｅｃｃｉｏ Ｇｅｎｅｒａｌ ｄ’Ｅｎｓｅ
ｎｙａｍｅｎｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｓ ｉ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉ
ｏ（Ｃｏｍｕｎｉｔａｔ Ｖａｌｅｎｃｉａｎａ、スペイン）からの許可番号Ｇ
Ｖ−３３６６／９５、ＧＶ−Ｃ−ＶＳ−２１−１１８−９６により援助を部分的
に受けている；従ってスペイン政府は本発明の権利を保持する。

【０００３】 （発明の分野） 本発明はプロテインキナーゼ、自己免疫疾患、アポトーシスおよび癌の分野に
関する。

【０００４】 （発明の背景） グッドパスチャー（ＧＰ）病はヒトのみで報告されている自己免疫疾患である
。ＧＰ患者では、ＩＶ型コラーゲンα３鎖の非コラーゲン性Ｃ末端ドメイン（Ｎ
Ｃ１）（「グッドパスチャー抗原」）に対する自己抗体が急速な進行性糸球体腎
炎およびしばしば肺出血を引き起こし、これはＧＰ症候群の二つの重要な臨床発
現である（１を参照のこと。このセクションでの参照番号は実施例１の参考文献
リストに対応する）。

【０００５】 一つ以上の自己免疫疾患を表す有意数の患者により、またこれらの疾患のいく
つかが特異的ＭＨＣハプロタイプに対して示す強力で共通した連鎖により、少な
くともいくつかの自己免疫障害では共通の発病原因が存在するという考えが示唆
される（３１、３２）。自己免疫においては自己抗原が先導部分であり、自己抗
原性である自己成分の数は限られている（３１）という実験観察は、これらの自
己成分が、免疫系による自己／非自己認識の重要な結果と生物学的特徴を共有す
ることを示唆している。異なるが特異的である自己成分を変化させることにより
、引き金となる事象が結果的に異常な抗原処理をする可能性がある。特定のＭＨ
Ｃ特異性を発現するある個体では、異常ペプチドが非耐性Ｔセルにより認識され
、免疫応答を引き起こす（１）。

【０００６】 我々は以前にＧＰ抗原を探査し、自己免疫発病原因において関連性のある生物
学的特徴を同定した。ＮＣＩドメインは種間で、および異なるＩＶ型コラーゲン
α鎖（α１からα６）間で高度に保存されているので（２）、天然の自己免疫応
答におけるヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１の排他的な関与は、このドメインが発病原因
に関連する構造的および／または生物学的特徴を有することを示唆している。こ
れに一致して、ヒト抗原のＮ末端は高度に分岐しており、Ａ型プロテインキナー
ゼの機能的リン酸化部位を確認する独特の５個の残基モチーフ（ＫＲＧＤＳ^９）
を含有する（３、４）。さらに、ヒトα３遺伝子は、別法としてスプライシング
され、リン酸化可能なＮ末端領域をも含有する複数の転写物を生じるが、その他
のヒト関連または別の種の相同性遺伝子にはそれはない（５から７）。最近の研
究ではｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによるＧＰ抗原のＮ末端のリン酸化が
別の生成物の存在により上方制御されることが示されている（以下の実施例３を
参照のこと）。特異的セリンリン酸化およびプレｍＲＮＡ代替スプライシングは
またアセチルコリンレセプターおよびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を含
有するその他の自己抗原の生物学とも関連する（４）。後者は免疫系が中枢神経
系の白質を標的とする別の排他的ヒト自己免疫疾患である多発性硬化症（ＭＳ）
における主要な抗原であると考えられる。ＧＰ病およびＭＳは同一のＨＬＡ Ｉ
Ｉクラスハロタイプ（ＨＬＡ ＤＲＢ１＊１５０１）と強力な関連性を示すヒト
疾患である（３２、３３）。このＨＬＡ特異性を担持するＭＳ患者のＧＰ病によ
る死亡が最近報告されたのに加えて（３４）、これはこれらのヒト疾患における
共通の発病原因の存在を支持している。

【０００７】 このように、特異的セリン／スレオニンリン酸化がヒトＧＰ抗原、その他の種
のＧＰ抗原、およびその他のヒトα（ＩＶ）鎖からの相同性ドメイン間の主要な
生物学的差異であり、発病原因において重要であろう（１、４）。

【０００８】 従って、ヒトＧＰ抗原のＮ末端領域をリン酸化する特異的セリン／スレオニン
キナーゼの同定および単離はＧＰ症候群および恐らくその他の自己免疫障害の診
断および処置に非常に有利であろう。

【０００９】 （発明の開示） 本発明はヒトＧＰ抗原の独特なＮ末端領域に特異的に結合し、リン酸化するセ
リン／スレオニンキナーゼの同定および単離に関して当該分野の必要性を満足さ
せるものである。一つの態様では、本発明は種々の形態のグッドパスチャー抗原
結合タンパク質（ＧＰＢＰ）をコードする核酸配列、およびＧＰＢＰコード化配
列に機能的に結合した組換え発現ベクターを提供する。

【００１０】 別の態様では、本発明は組換え発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細
胞を提供する。さらなる態様では、本発明は実質的に精製されたＧＰＢＰおよび
ＧＰＢＰに選択的に結合する抗体を提供する。さらに別の態様では、本発明はＧ
ＰＢＰまたはＧＰＢＰをコードするの核酸の存在を検出する方法を提供する。

【００１１】 さらなる態様では、本発明は自己免疫状態またはアポトーシスの存在を検出す
る方法であって、対照組織に比較して、組織におけるＧＰＢＰの発現の増加の検
出からなる方法を提供する。

【００１２】 別の態様では、本発明は自己免疫障害、アポトーシス、または腫瘍を処置する
ための方法および医薬用組成物であって、ＧＰＢＰの発現または活性を改変する
必要性を有する患者において、ＧＰＢＰの発現または活性を改変することからな
る方法および医薬用組成物を提供する。

【００１３】 （発明の詳細な説明） 本発明に引用する全ての参考文献は出展明示により本明細書の一部とする。

【００１４】 本明細書で用いる略語は：ｂｐ、塩基対；ＤＴＴ、ジチオスレイトール；ＤＭ
ＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＥＧ
ＴＡ、エチレングリコールビス（βアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸；ＧＰ、グッドパスチャー；ｒＧＰΔＩＩＩ、ｒＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／
ＶおよびｒＧＰΔＶ、各々スプライシングしたエキソンＩＩＩ、エキソンＩＩＩ
，ＩＶおよびＶまたはエキソンＶから得られたグッドパスチャー抗原の代替の形
態を表す組換え物質；ＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰ、元来のおよび組換えグッドパ
スチャー抗原結合タンパク質；ＧＰＢＰΔ２６およびｒＧＰＢＰΔ２６、ＧＰＢ
Ｐの元来のおよび組換え代替形態；ＧＳＴ、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ；ＨＬＡ、ヒトリンパ球抗原；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィ；Ｋｂ、
千塩基対；ｋＤａ、千ダルトン；ＭＢＰ、ｒＭＢＰ、元来のおよび組換え２１ｋ
Ｄａミエリン塩基性タンパク質；ＭＢＰΔＩＩおよびｒＭＢＰΔＩＩ、エキソン
ＩＩをスプライシングして得られた元来のおよび組換え１８．５ｋＤａミエリン
塩基性タンパク質；ＭＢＰΔＶおよびＭＢＰΔＩＩ／Ｖ、各々エキソンＶ並びに
エキソンＩＩおよびＶをスプライシングして得られたミエリン塩基性タンパク質
の代替形態；ＭＨＣ、主要組織適合性複合体；ＮＣ１、非コラーゲン性ドメイン
；ＰＨ、プレクストリン相同性；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ；
ＰＭＳＦ、フッ化フェニルメチルスルフォニル；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＴＢＳ、トリス緩衝生理食塩水
：である。

【００１５】 本出願では特記しない場合、利用される技術はいくつかの既知の参考文献例え
ばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｔａｙｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（
１９８９））、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編、
アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９１））、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙの「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編、アカデミック
プレスインコーポレーティッド（１９９０））；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：
Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（
Ｉｎｎｉｓら、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９
０））、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ
、リスインコーポレーティッド、ニューヨーク、ニューヨーク州（１９８７））
、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ、１０９−１２８頁、（Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、ザヒューマナプレスイ
ンコーポレーティッド、クリフトン、ニュージャージー州）、およびアンビオン
１９９８年カタログ（アンビオン、オースティン、テキサス州）のいずれかに見
出すことができる。

【００１６】 本明細書で用いる「ＧＰＢＰ」なる用語はグッドパスチャー結合タンパク質を
意味し、その単量体およびオリゴマーの両方を含む。ヒト（配列番号：２）、マ
ウス（配列番号：４）、およびウシＧＰＢＰ配列（配列番号：６）を本明細書に
て提供する。

【００１７】 本明細書で用いる「ＧＰＢＰΔ２６」なる用語は配列番号：１４に示す２６個
のアミノ酸配列を削除したグッドパスチャー結合タンパク質を意味し、その単量
体およびオリゴマーの両方を含む。ヒト（配列番号：８）、マウス（配列番号：
１０）、およびウシＧＰＢＰ配列（配列番号：１２）を本明細書にて提供する。

【００１８】 本明細書で用いる「ＧＰＢＰｐｅｐ１」なる用語は配列番号：１４に示す２６
個のアミノ酸ペプチドを意味し、その単量体およびオリゴマーの両方を含む。

【００１９】 本明細書で用いる用語「ＧＰ抗原」はＩＶ型コラーゲンのα３ＮＣ１ドメイン
を意味する。

【００２０】 本明細書で用いる「ＭＢＰ」はミエリン塩基性タンパク質を意味する。

【００２１】 一つの態様では、本発明はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、およびＧＰＢＰｐｅｐ
１並びにその変異体またはフラグメントをコードする単離された核酸を提供する
。一つの態様では、単離された核酸は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：
５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号
：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３も
しくは配列番号：２５またはそのフラグメントと実質的に類似する配列を含む。

【００２２】 別の態様では、本発明はＧＰ抗原またはＭＢＰの代替生成物をコードする単離
された核酸を提供する。一つの態様では、単離された核酸は配列番号：４３およ
び配列番号：４４に実質的に類似するペプチドをコードする配列を含む。

【００２３】 本明細書で用いる「実質的に類似した」なる用語は、欠失、付加、または置換
など（これらに限定するものではない）の、開示する配列からの保存または非保
存変種の一つまたはそれ以上を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質
のアミノ酸配列のヌクレオチドであって、得られた核酸および／またはアミノ酸
配列は本明細書に開示する配列と機能的に同等であるヌクレオチド配列を意味す
る。機能的に同等な配列は実質的に同一の方法で機能して実質的に同一の本明細
書に開示するタンパク質を製造する。例えば機能的に同等のＤＮＡは本明細書に
開示するタンパク質と同一であるか、または一つまたはそれ以上の保存アミノ酸
変種、例えば別の非極性残基に関して非極性残基の置換、もしくは荷電した残基
に関しては同様に荷電した残基の置換体を有するタンパク質をコードする。これ
らの変化には当業者によりタンパク質の３次構造を実質的に変化しない置換体と
して認識されている変化などがある。

【００２４】 実際には、実質的に類似したなる用語は高ストリンジェンシーに対して中程度
の条件下で互いにハイブリダイズする２個のタンパク質をコードするＤＮＡを意
味し、同一のアミノ酸配列を有するか、またはその構造もしくは機能を変化しな
い配列における変化を有するタンパク質をコードする。本明細書で用いる実質的
に類似したヌクレオチドまたはアミノ酸配列は少なくとも約７０％の同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも約
９０％の同一性を共有する。しかしながら、スプライシング変種として生じる前
記のレベルの相同性以下であるタンパク質（およびかかるタンパク質をコードす
るＤＮＡまたはＲＮＡ）、または保存アミノ酸置換（または縮重コドンの置換）
により改変されたものは本発明の範囲内であることを意図することは認識される
。

【００２５】 本明細書で用いるハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは核酸ハイブ
リッドが安定である条件を意味する。当業者に既知であるように、ハイブリッド
の安定性はハイブリッドの融点（Ｔ_Ｍ）に反映する。配列相同性が１％減少する
毎にＴ_Ｍはおよそ１から１．５℃低下する。概して、ハイブリッドの安定性はナ
トリウムイオン濃度および温度の相関関係である。典型的には、低ストリンジェ
ンシー条件下でハイブリダイゼーション反応を行い、続いてより高度なストリン
ジェンシー条件に変化して洗浄する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシ
ーに対する言及はかかる洗浄条件に関係する。このように本明細書で用いる中程
度のストリンジェンシーとは０．１％ ＳＳＰＥ中３７℃または５５℃で安定し
たハイブリッドを形成するこれらの核酸配列がハイブリダイズできる条件を意味
し、一方高度なストリンジェンシーとは０．１％ ＳＳＰＥ中６５℃で安定した
ハイブリッドを形成するこれらの核酸配列がハイブリダイズできる条件を意味す
る。これらの条件が種々のバッファーおよび温度を用いて繰り返すことができ、
正確である必要はないことは理解されよう。デンハーツ溶液およびＳＳＰＥ（例
えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールド
スプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９））はその他の適当なハイブ
リダイゼーションバッファーとして当業者に既知である。

【００２６】 単離された核酸配列は一つまたはそれ以上のイントロンを有するＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡまたはゲノムクローンを含んでもよい。単離された配列はさらにポリＡ配列
、改変コザック配列、およびエピトープタグをコードする配列、搬出シグナル、
および分泌シグナル、核局在化シグナル、および原形質膜局在化シグナルなど（
これらに限定するものではない）のコードされたタンパク質の発現および／また
は精製を促進するのに有用なさらなる配列を含んでもよい。

【００２７】 別の態様では、本発明はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６またはＧＰＢＰｐｅｐ１、
およびその変異体またはフラグメントを発現する核酸配列を含む組換え発現ベク
ターを提供する。一つの態様では、ベクターは配列番号：１、配列番号：３、配
列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、
配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号
：２３もしくは配列番号：２５に示す配列またはそのフラグメントと実質的に類
似する核酸配列を含む。

【００２８】 別の態様では、本発明は配列番号：４３、配列番号：４４に示すアミノ酸配列
またはそのペプチドフラグメントに実質的に類似するペプチドを発現する核酸配
列を含む組換え発現ベクターを提供する。

【００２９】 「組換え発現ベクター」には核酸コーディンング領域または遺伝子を遺伝子生
成物の発現に影響できるいずれかのプロモーターに機能的に連結するベクターを
などがある。哺乳動物系において開示した核酸配列の発現を誘導するのに用いら
れるプロモーター配列は構成性（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦな
どの種々のプロモーターのいずれかにより誘導されるが、これらに限定するもの
ではない）かまたは誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性
などの多くの誘導性プロモーターのいずれかにより誘導されるが、これらに限定
するものではない）でよい。原核細胞をトランスフェクトするのに用いられる発
現ベクターの構築はまた当業者に既知であり、従って標準的な技術により達成で
きる。（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９８９）；Ｅ．Ｊ．Ｍｕ
ｒｒａｙ編、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９−１２８頁、ザヒューマナプレスインコーポレーティ
ッド、クリフトン、ニュージャージー州）、アンビオン１９９８年カタログ（ア
ンビオン、オースチン、テキサス州を参照のこと）。

【００３０】 発現ベクターはエピソームとしてかまたは宿主染色体ＤＮＡに組み込むことに
より宿主生物内で複製可能でなければならない。好ましい態様では、発現ベクタ
ーはプラスミドを含む。しかしながら、本発明は同等の機能を提供するその他の
発現ベクター、例えばウイルスベクターを含むことを意図する。

【００３１】 さらなる態様では、本発明は本明細書に開示する組換え発現ベクターでトラン
スフェクトされた宿主細胞を提供し、ここで宿主細胞は原核細胞かまたは真核細
胞でよい。細胞を一過性でまたは安定してトランスフェクトできる。当業者に既
知のいずれかの技術、例えば標準細菌性形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレ
クトロポレーション、またはリポソーム媒介、ＤＥＡＥデキストラン媒介、ポリ
カチオン媒介またはウイルス媒介トランスフェクションにより（これらに限定す
るものではない）発現ベクターの原核および真核細胞へのトランスフェクション
を達成できる。（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリープレス）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃ
ｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版
（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）、リスインコーポレーティッド、ニュ
ーヨーク、ニューヨーク州）を参照のこと。）

【００３２】 さらに別の態様では、本発明は実質的に精製されたＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６
およびＧＰＢＰｐｅｐ１並びにその変異体またはフラグメントを提供する。一つ
の態様では、実質的に精製されたタンパク質のアミノ酸配列は配列番号：２、配
列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、
配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号
：２２、配列番号：２４またはそのペプチドフラグメントに実質的に類似してい
る。

【００３３】 別の態様では、本発明はＧＰ抗原およびＭＢＰの実質的に精製された代替生成
物を提供する。一つの態様では、実質的に精製されたポリペプチドのアミノ酸配
列は配列番号：４３、配列番号：４４またはそのペプチドフラグメントに実質的
に類似している。

【００３４】 本明細書で用いる「実質的に精製された」なる用語はそのｉｎ ｖｉｖｏ細胞
環境から分離されているタンパク質を意味する。従って、タンパク質を天然供給
源から精製できるか、または組換えタンパク質を前記で開示したトランスフェク
トされた宿主細胞から精製できる。好ましい態様では、前記で開示したトランス
フェクトされた細胞によりタンパク質を製造し、標準的な技術を用いて精製する
。（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、コールドスプリングハーバー
ラボラトリープレス）を参照のこと。）このように原核または真核生物供給源か
らタンパク質を精製できる。さらに好ましい種々の態様において、タンパク質を
細菌、酵母または哺乳動物細胞から精製する。

【００３５】 タンパク質は、タンパク質の精製を促進するのに有用なさらなる配列、例えば
エピトープタグおよび輸送シグナルを含んでもよい。かかるエピトープタグの例
としては、ＦＬＡＧ（シグマケミカルズ、セントルイス、ミズーリー州）、ｍｙ
ｃ（９Ｅ１０）（インビトロゲン；カールスバッド、カリフォルニア州）、６−
Ｈｉｓ（インビトロゲン、ノバゲン、マジソン、ウィスコンシン州）およびＨＡ
（ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ）などがあるが、これらに限定する
ものではない。かかる輸送シグナルの例としては搬出シグナル、分泌シグナル、
核局在化シグナルおよび原形質膜局在化シグナルなどがあるが、これらに限定す
るものではない。

【００３６】 別の態様では、本発明はＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６またはＧＰＢＰｐｅｐ１に
選択的に結合する抗体を提供する。一つの態様では、抗体は配列番号：２、配列
番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配
列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：
２２、配列番号：２４またはそのペプチドフラグメントからなる群から選択され
る配列を含むタンパク質に選択的に結合する。宿主動物を完全ＧＰＢＰでか、ま
たはその抗原性ペプチドで免疫することによりかかる抗体を製造できる。抗体は
ポリクローナル、またはモノクローナル抗体でよい。

【００３７】 別の態様では、本発明は配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４６、
配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５４またはその抗原性フラグメン
トからなる群から選択される配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含むポリペ
プチドに選択的に結合する抗体を提供する。

【００３８】 既知の方法、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー
、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８８）に記載の方法により
抗体を製造できる。一例を挙げると、最初の免疫の前に前免疫血清を収集する。
実質的に精製した本発明のタンパク質またはその抗原性フラグメントを適当なア
ジュバントと共に、免疫応答を引き出すのに十分な量および間隔で動物に注射す
る。一定の間隔で、好ましくは週毎に動物を出血させ、抗体力価を決定する。１
次免疫後動物にブースター注射をしてもしなくてもよい。各ブースター免疫後約
７日に、または１回免疫後約毎週、動物を出血させ、血清を収集し、一定分量を
約−２０℃で保存する。次いで動物から収集した血清を、ＧＰＢＰ関連タンパク
質を含まない同一の発現系から製造した非抗原性関連タンパク質が結合するカラ
ムに通すことにより、本発明のタンパク質およびペプチドに対するポリクローナ
ル抗体を直接的に精製できる。

【００３９】 動物から脾臓細胞を得ることによりモノクローナル抗体を製造できる（Ｋｏｈ
ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９
７５）を参照のこと）。一例では、近交系マウスを本発明のタンパク質もしくは
ペプチドまたはその抗原性フラグメントで免疫することにより目的のモノクロー
ナル抗体（ｍＡｂ）を製造する。腹腔内（ＩＰ）または皮下（ＳＣ）経路により
、免疫応答を引き出すのに十分な量および間隔でマウスを免疫する。０日にマウ
スに１次免疫し、約３から約３０週休ませる。免疫したマウスに静脈内（ＩＶ）
経路により１回またはそれ以上ブースター免疫する。当業者に既知の標準的な方
法により免疫マウスから脾臓を除去することにより、抗体陽性マウスからリンパ
球を入手する。安定したハイブリドーマを形成できる条件下で適当な融合パート
ナーと脾臓リンパ球を混合することによりハイブリドーマ細胞を製造する。抗体
製造細胞および融合パートナー細胞をポリエチレングリコール中約３０％から約
５０％の濃度で融合させる。当業者に既知の方法により、ヒポキサンチン、チミ
ジンおよびアミノプテリンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）
中成長させることにより融合したハイブリドーマを選別する。成長陽性ウェルか
ら上澄液を収集し、固相イムノラジオアッセイのごときイムノアッセイにより抗
体生成に関してスクリーニングする。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天技術（Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ編、アカデミックプレス（１９７３））
のごとき技術により抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞をクローニングす
る。

【００４０】 かかる抗体応答を生じるために、典型的には本発明のタンパク質を医薬上許容
される非経口投与用担体と共に処方する。かかる許容されるアジュバントにはフ
ロイント完全、フロイント不完全、アルミニウム沈殿、コリネバクテリウムパル
ヴムおよびｔＲＮＡを含有する油中水乳剤などがあるが、これらに限定するもの
ではない。ポリペプチドの濃度およびベヒクルおよびその他の構成成分の選択な
どのかかる組成物の処方は当業者の範囲内である。

【００４１】 本明細書で用いる抗体なる用語は本発明のタンパク質およびペプチドまたはそ
のフラグメントと選択的に反応するその抗体フラグメントを含むことを意図する
。慣用的な技術を用いて抗体をフラグメント化することができ、そのフラグメン
トを抗体全体に関して前記したのと同一の方法で有用性に関してスクリーニング
できる。例えば抗体をペプシン消化することによりＦ（ａｂ’）_２フラグメント
を生じることができる。得られたＦ（ａｂ’）_２フラグメントを反応させてジス
ルフィド結合を還元して、Ｆａｂ’フラグメントを作ることができる。

【００４２】 さらなる態様では本発明は、タンパク質サンプル中の本発明のタンパク質また
はペプチドの存在を検出するための方法であって、スクリーニングするタンパク
質サンプルを調製し、スクリーニングするタンパク質サンプルを本発明のタンパ
ク質またはペプチドに対する抗体と接触させること、および抗体−抗原複合体の
形成を検出することからなる方法を提供する。抗体は前記するポリクローナルま
たはモノクローナルのいずれかでよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本明
細書で用いる「タンパク質サンプル」なる用語は本発明のタンパク質またはペプ
チドおよびそのフラグメントを含有し得るいずれかのサンプルを意味し、組織お
よびその部分、組織切片、完全な細胞、細胞抽出物、精製または部分的に精製し
たタンパク質サンプル、体液、核酸発現ライブラリーなどがあるが、これらに限
定するものではない。従って、本発明のこの態様を用いて、標準的な技術、例え
ば免疫局在化、免疫蛍光分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡおよび核酸
発現ライブラリースクリーニングなど（これらに限定するものではない）により
これらの種々タンパク質サンプル中のＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、ＧＰＢＰｐｅ
ｐ１、またはＧＰ抗原の代替生成物の存在に関して試験できる（例えばＳａｍｂ
ｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと）。一つの具体例では、その技術により目
的のタンパク質またはペプチドの存在または不在のみを決定できる。別法として
、その技術により定量し、サンプル中の目的のタンパク質またはペプチドの相対
量についての情報を提供できる。定量目的ではＥＬＩＳＡが好ましい。

【００４３】 標準的な検出技術により本発明のタンパク質もしくはペプチド、またはそのフ
ラグメントおよびその抗体またはそのフラグメント間の免疫複合体形成を検出で
きる。例えば標識抗体または２次抗体を用いることにより免疫複合体を検出でき
る。標識の選択などのかかる方法は当業者に既知である。（Ｈａｒｌｏｗおよび
Ｌａｎｅ、前記で引用）。別法として、ポリクローナルまたはモノクローナル抗
体を検出可能な物質に結合できる。用語「結合した」は検出可能な物質が物理的
に抗体に連結しているという意味で用いる。適当な検出可能な物質には種々酵素
、補欠分子団、蛍光性物質、発光性物質、および放射性物質などがある。適当な
酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、
βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがある。適当な補
欠分子団複合体の例としてはストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビ
オチンなどがある。適当な蛍光性物質の例としてはアンベリフェロン、フルオレ
セイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニ
ルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどがある。発
光性物質の例としてはルミノールなどがある。適当な放射性物質の例としては^{１ ２５} Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈなどがある。

【００４４】 かかる検出方法は種々の目的で有用であり、自己免疫状態の検出、標的とされ
るまたはアポトーシスが起こっている細胞の同定、組織サンプル中の目的のタン
パク質の免疫局在化、ウェスタンブロット分析、関連タンパク質を見出すための
発現ライブラリーのスクリーニングなどがあるが、これらに限定するものではな
い。

【００４５】 さらに別の態様では、本発明はサンプル中のＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、ＧＰ
ＢＰｐｅｐ１、またはＧＰ抗原の代替生成物をコードする核酸配列の存在を検出
する方法であって、スクリーニングする核酸サンプルを調製し、サンプルを本発
明の単離された核酸配列またはそのフラグメントから誘導した核酸プローブと接
触させること、および複合体形成を検出することからなる方法を提供する。

【００４６】 本明細書で用いる用語「サンプル」はＧＰＢＰ関連核酸を含有し得るいずれか
のサンプルを意味し、組織およびその一部、組織切片、完全な細胞、細胞抽出物
、精製または部分的に精製した核酸サンプル、ＤＮＡライブラリー、並びに体液
などがあるが、これらに限定するものではない。従って、本発明のこの態様を用
いて、切片上ハイブリッド形成法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティ
ング、ＤＮＡライブラリースクリーニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ま
たは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）など（これらに限定するものではない）の標
準的な技術により、これらの種々サンプル中のＧＰＢＰ ｍＲＮＡまたはＤＮＡ
の存在に関して試験できる。（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照の
こと。）一つの具体例では、この技術により目的の核酸の存在または不在のみを
決定できる。別法として、この技術により定量でき、サンプル中の目的の核酸の
相対量に関する情報を提供できる。定量目的では、定量用ＰＣＲおよびＲＴ−Ｐ
ＣＲが好ましい。従って、一例では、ＲＮＡをサンプルから単離し、目的の核酸
配列から誘導したオリゴヌクレオチドと接触させ、逆転写酵素と共に適当なバッ
ファーおよび温度条件下でＧＰＢＰ関連ＲＮＡからｃＤＮＡを製造する。次いで
ｃＤＮＡを目的の核酸配列から誘導したプライマー対を用いるＰＣＲに供する。
好ましい態様では、配列番号：５のＲＮＡ発現生成物の存在を検出するようにプ
ライマーを設計し、サンプル中のＧＰＢＰ遺伝子発現の量を対照サンプルのレベ
ルと比較する。

【００４７】 目的の核酸配列を検出するために、標準的な標識技術を用いてプローブ、目的
の核酸、またはプローブおよび目的の核酸間の複合体を標識でき、その標識技術
には放射性、酵素、化学ルミネサンスまたはアビジンもしくはビオチン標識技術
などがあるが、これらに限定するものではなく、これらは全て当業者に既知であ
る。（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、コールドスプリングハー
バーラボラトリープレス）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ編（１９９１）、アカデミックプレス、サンディエゴ、カリフォルニア
州）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、（１９９０）、アカデミッ
クプレス、サンディエゴ、カリフォルニア州）を参照のこと。）

【００４８】 かかる核酸検出法は自己免疫状態の診断、標的になるまたはアポトーシスが行
われている細胞の同定、切片上ハイブリッド形成法、ノーザンおよびサザンブロ
ット分析およびＤＮＡライブラリースクリーニングなど（これらに限定するもの
ではない）の種々の目的に有用である。

【００４９】 以下の実施例で示すように、ＧＰＢＰは天然発生自己免疫応答において一般に
標的とされる組織構造で優先的に発現することが示され、グッドパスチャー症候
群（ＧＰ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および扁平苔癬など（これらに
限定するものではない）のいくつかの自己免疫状態において高度に発現する。さ
らに、後記する類似の実験研究法に従ってＧＰ病（α３ＩＶ型コラーゲン）、Ｓ
ＬＥ（Ｐ１リボソームリンタンパク質およびＳｍ−Ｄ１小型核リボヌクレオタン
パク質）および皮膚筋炎（ヒスチジル−ｔＲＮＡシンターゼ）の自己抗原を表す
る組換えタンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＰＢＰの基質であることが示された
。

【００５０】 このように、好ましい態様では、ＧＰＢＰ発現の検出を用いて自己免疫状態を
検出する。ＧＰＢＰ発現に関して、試験しているサンプルを対照サンプルと比較
し、ここでＧＰＢＰ発現レベルの上昇は自己免疫状態の存在を示す。この具体例
では、これはＧＰＢＰには存在するが、ＧＰＢＰΔ２６には存在しないＧＰＢＰ
ｐｒｅｐ１に選択的に結合する抗体を用いるのが好ましい。

【００５１】 さらに、添付の実施例に示すように、ＧＰＢＰは腫瘍の培養細胞株において下
方制御され、データはＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６がアポトーシスを誘起する細胞
シグナル発生経路に関与している可能性があり、これは自己免疫の病理発生過程
において上方制御され、腫瘍成長中に形質転換された細胞を攻撃する自己免疫攻
撃を防御するために細胞を形質転換中には下方制御される。このように、本明細
書に開示する検出方法を用いて標的化されたまたはアポトーシスが行われている
細胞を検出することができる。

【００５２】 別の態様では、本発明は自己免疫障害、腫瘍、を処置する、またはＧＰＢＰ、
ＧＰＢＰΔ２６もしくはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含
むタンパク質の発現または活性を改変することからなる細胞アポトーシスを防御
する必要のある患者においてかかる処置または防御をするための方法を提供する
。ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６もしくはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリ
ペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変することは、ＧＰＢＰ発現も
しくは活性の特異的誘発因子もしくは阻害因子、ＧＰＢＰ抗体、ＧＰもしくはミ
エリン塩基性タンパク質代替生成物を用いる遺伝子もしくはタンパク質治療、Ｇ
Ｐもしくはミエリン塩基性タンパク質代替生成物を発現する宿主細胞を用いる細
胞治療、または当業者に既知のその他の技術を用いて達成できる。好ましい具体
例では、方法はさらにＧＰ抗原またはＭＢＰの、実質的に精製された代替生成物
を投与し、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６もしくはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似
するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変することを含む。本
明細書で用いる「発現または活性を改変すること」とはＲＮＡまたはタンパク質
生成物のいずれかの発現または活性を改変することを意味する。

【００５３】 別の態様では、本発明はＧＰＢＰ ＲＮＡまたはタンパク質の発現または活性
を改変するための、実質的に精製された有効量のＧＰ抗原またはＭＢＰの代替生
成物および医薬上許容される担体を含む医薬用組成物を提供する。

【００５４】 投与用に、活性物質を通常指示された投与経路に適当な一つまたはそれ以上の
アジュバントと組み合わせる。化合物をラクトース、スクロース、デンプン粉、
アルカノン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグ
ネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム
塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび
／またはポリビニルアルコールと混合でき、慣用される投与用に錠剤化またはカ
プセル化できる。別法として、本発明の化合物を生理食塩水、水、ポリエチレン
グリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液
、エタノール、コーン油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガントゴム、および
／またはその他のバッファーに溶解できる。その他のアジュバントおよび投与様
式は医薬の分野で既知である。担体または希釈剤には遅延物質、例えばモノステ
アリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル単独もしくはワックスと共に、
または当業者に既知のその他の物質などがある。

【００５５】 本発明は説明のみを目的とする添付の実施例を参考としてよりよく理解される
であろうが、本明細書に添付の特許請求の範囲で定義するように本発明の範囲を
制限すると解釈すべきではない。

【００５６】 （実施例１：ＧＰＢＰの特徴づけ） ここでヒトＧＰ抗原の独特のＮ末端領域に特異的に結合し、リン酸化する新規
の型のセリン／スレオニンキナーゼのクローニングおよび特徴づけについて報告
する。

【００５７】 材料および方法 合成重合体−ペプチド。ヒトＧＰ抗原の３から２３残基を表すＧＰｐｅｐ１、
ＫＧＫＲＧＤＳＧＳＰＡＴＷＴＴＲＧＦＶＦＴ（配列番号：２６）、およびＳｅ
ｒ^９からＡｌａ^９へのその変異体であるＧＰｐｅｐ１Ａｌａ^９ＫＧＫＲＧＤＡＧ
ＳＰＡＴＷＴＴＲＧＦＶＦＴ（配列番号：２７）をメッドプローブおよびチロン
ＦＬＡＧペプチド（シグマより入手）により合成された。

【００５８】 オリゴヌクレオチド。以下は、いくつかのその他のＧＰＢＰ特異的オリゴヌク
レオチドと同様、ゲノシスおよびＧＩＢＣＯ−ＢＲＬにより合成された： ＯＮ−ＧＰＢＰ−５４ｍ： ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＡＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧ
ＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ（配列番号：２８） ＯＮ−ＧＰＢＰ−５５ｃ： ＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＡＴＣＣＧＡＣＡ
ＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号：２９） ＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１４ｍ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡ
ＧＧＣＡＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号：３０） ＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１６ｃ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＡＡＡＴＡＧＣ
ＡＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴ（配列番号：３１）

【００５９】 ヒトＧＰＢＰをコードするｃＤＮＡクローンの単離および特徴づけ−いくつか
のヒトλ−ｇｔ１１ ｃＤＮＡ発現ライブラリー（眼、胎児および成人肺、腎臓
およびＨｅＬａ Ｓ３、クロンテックより）をＧＰｐｅｐ１と相互作用するタン
パク質をコードするｃＤＮＡに関してプローブする。標準的な免疫スクリーニン
グ法に従って調製したニトロセルロースフィルター（ミリポア）を遮断し、ＧＰ
ｐｅｐ１ ｍｌあたり１から１０ナノモルと共に３７℃でインキュベートした。
特異的に結合したＧＰｐｅｐ１をＭ３／１Ａモノクローナル抗体を用いて検出し
た（７）。ＨｅＬａ誘導ライブラリーで１個のクローンを同定した（ＨｅＬａ１
）。融合タンパク質結合の特異性を組換え真核ヒトＧＰ抗原への類似の結合によ
り確認した。ＨｅＬａ１（０．５ｋｂ）のＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡインサートを用
いて同一のライブラリーをさらにスクリーニングし、重複ｃＤＮＡを単離した。
ＨｅＬａ１（ｎ４’）の全ｃＤＮＡを含有する最大のｃＤＮＡ（２．４ｋｂ）全
長を配列決定した。

【００６０】 ノーザンおよびサザンブロット−製造者の指示書に従って、予め作成したノー
ザンおよびサザンブロット（クロンテック）をＨｅＬａ１ ｃＤＮＡでプローブ
した。

【００６１】 組換えタンパク質のプラスミド構築、発現および精製−ＧＰＢＰ誘導した物質
。元来のλ−ｇｔ１１ ＨｅＬａ１クローンを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｙ１０８
９中溶原として発現した（８）。ＡＰＴＧアガロースカラム（ベーリンガー）を
用いて、細胞可溶化液からＧＰＢＰのＮ末端１５０残基を含有する対応するβガ
ラクトシダーゼ誘導融合タンパク質を精製した。ｎ４’のＥｃｏＲＩ ２．４ｋ
ｂフラグメントをブルースクリプトＭ１３＋ベクター（ストラッタジーン）（Ｂ
Ｓ−ｎ４’）中サブクローニングし、増幅し、続いてクローニングに使用した。
ＥｃｏＲＩ制限部位、翻訳開始のための標準コザックコンセンサス、タグペプチ
ド配列をコードする領域（ＦＬＡＧ、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：３２））、
および予測Ｍｅｔ_ｉおよびＢａｎ ＩＩ制限部位を含むＧＰＢＰの最初の１１個
の残基をコードする配列、（５’から３’で）含有するＤＮＡフラグメントをＯ
Ｎ−ＧＰＢＰ−５４ｍおよびＯＮ−ＧＰＢＰ−５５ｃをハイブリダイズし、修飾
Ｔ_７ ＤＮＡポリメラーゼ（アマシャム）で伸長することにより得た。得られた
ＤＮＡ生成物をＥｃｏＲＩおよびＢａｎＩＩで消化し、ｐＨＩＬ−Ｄ２（インビ
トロゲン）のＥｃｏＲＩ部位におけるＢＳ−ｎ４’のＢａｎＩＩ／ＥｃｏＲＩ
ｃＤＮＡフラグメントとライゲートし、ｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’を製造した
。このプラスミドを用いてＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５株のＭ
ｕｔ５形質転換体を得、慣用的な液体培養かまたは発酵法（Ｐｉｃｈｉａ発現キ
ット、インビトロゲン）のいずれかによりＦＬＡＧタグ化組換えＧＰＢＰ（ｒＧ
ＰＢＰ）を発現した。細胞可溶化液を抗ＦＬＡＧ Ｍ２カラム（シグマ）に負荷
し、非結合性物質をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭ トリスＨＣｌ、
ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）または塩を補充したＴＢＳ（２Ｍ ＮａＣ
ｌまで）で洗い出し、組換え物質をＦＬＡＧペプチドと共に溶出した。培養ヒト
腎臓誘導２９３細胞（ＡＴＣＣ１５７３−ＣＲＬ）中に発現するために、ＢＳ−
ｎ４’またはｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’のいずれかの２．４または２．０ｋｂ
ＥｃｏＲＩ ｃＤＮＡインサートをｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）にサブクロ
ーニングし、ｐｃ−ｎ４’およびｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’を各々製造した。一過
性の発現のために用いる場合、トランスフェクションの８時間後、可溶化液を各
々ＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いるのかまたはＦＬＡＧ精製に用いるのかに依存して０
．１％ ＳＤＳ含有または不含で、３．５から４μｌ／ｃｍ^２の冷却溶解バッフ
ァー（ＴＢＳ中１％ ノニデットＰ−４０またはトリトンＸ１００、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）を用いて細胞を溶解した。ＦＬＡＧ精製用には
、６個に対して４個の１７５ｃｍ^２培養皿の可溶化液を溶解バッファーで５０ｍ
ｌまで希釈し、前記のように精製した。安定発現用には、ｐｃ−ｎ４’で細胞を
同様にトランスフェクトし、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８で３週間選別した。細
菌組換え発現用には、ｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’の２．０ｋｂＥｃｏＲＩ ｃ
ＤＮＡフラグメントをｐＧＥＸ−５ｘ−１（ファルマシア）のグルタチオンＳト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード化ｃＤＮＡの下流でフレーム内クローニング
した。得れらた構築物を用いてＤＨ５α細胞中にＧＳＴ−ＧＰＢＰ融合タンパク
質を発現した（９）。

【００６２】 ＧＰ抗原誘導物質。ＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−１４ｍとＯＮ−ＨＮＣ−Ｂ−Ｎ−
１６ｃの間でα３特異的ｃＤＮＡを含有するｐＲｃ／ＣＭＶ−ＢＭ４０発現ベク
ターを用いて２９３細胞中にヒト組換えＧＰ抗原（ｒＧＰ）を生成した。発現ベ
クターは、Ｂｉｌｌｙ Ｇ．Ｈｕｄｓｏｎ（カンサス大学医療センター）により
提供された、開始Ｍｅｔ、タグペプチド配列（ＦＬＡＧ）に続くＢＭ４０シグナ
ルペプチドおよびポリリンカークローニング部位をコードするｃＤＮＡを含有す
るｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロゲン）誘導ベクターである。α３特異的ｃＤＮＡ
を得るために、前記のオリゴヌクレオチドおよび鋳型（クローンＣ２）として前
記で報告したα３（ＩＶ）ｃＤＮＡ配列（３）を含有するプラスミドを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応を実施した。ｒＧＰの安定発現のために２９３細胞を得られ
た構築物（ｆα３ＶＬＣ）でトランスフェクトし、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８
で選別した。回収したｒＧＰを抗ＦＬＡＧ Ｍ２カラムを用いて精製した。

【００６３】 全ての構築物を制限マッピングおよびヌクレオチド配列決定により確認した。

【００６４】 細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション−ヒト２９３細胞を１０％ ウシ
胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長させた。
プロフェクション哺乳類トランスフェクションシステム（プロメガ）のリン酸カ
ルシウム沈殿法を用いてトランスフェクションを実施した。Ｇ４１８に対する抵
抗性により安定してトランスフェクトされた細胞を選別した。生存細胞群の中心
部分を単離し、クローン化しおよび増幅した。

【００６５】 抗体生成−ＧＰＢＰのＮ末端領域に対するポリクローナル抗体。溶原としてと
してＨｅＬａ１λ−ｇｔ１１を発現する細胞をラエムリサンプルバッファーの存
在下で超音波処理により溶解し、７．５％のアクリルアミド調製用ゲル中電気泳
動に供した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、目的の融合タンパク質を含有す
るバンドを切除し、ウサギ免疫に用いた（１０）。ＡＰＴＧアフィニティ精製抗
原を用いて反応性に関して抗血清を試験した。アフィニティ精製抗体を得るため
に、抗血清をＴＢＳで１：５に希釈し、共有結合したアフィニティ精製抗原を含
有するセファロース４Ｂカラムに負荷した。結合物質を溶出し、特記しない場合
、免疫化学研究に用いた。

【００６６】 ＧＰＢＰに対するモノクローナル抗体。基本的には前記のように（７）ＧＳＴ
−ＧＰＢＰを用いてモノクローナル抗体を製造した。ｒＧＰＢＰに対する抗体に
関して個々のクローンの上澄を分析した。

【００６７】 ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ−タンパク質基質０．５から１μｇまたは
合成ペプチド１０ナノモルの存在下または不在下、２５ｍＭ βグリセロホスフ
ェート（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、８ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１３２μＭ γ
−^３２Ｐ−ＡＴＰ中、全量５０μｌでｒＧＰＢＰ約２００ｎｇを３０℃で一晩イ
ンキュベートした。

【００６８】 ｉｎ ｖｉｖｏリン酸化アッセイ−２４ウェル皿の個々のウェルに、正常のま
たは安定にｐｃ−ｎ４’トランスフェクトした２９３細胞を播種した。細胞が望
ましい密度に成長したとき、正常２９３細胞の多くのウェルをｐｃ−ＦＬＡＧ−
ｎ４’でトランスフェクトした。１２時間後、培養培地を除去し、リン酸不含Ｄ
ＭＥＭ１００μｌ中２０μＣｉ／ウェルのＨ_３ ^３２ＰＯ_４を加え、４時間インキ
ュベーションを続けた。１％ トリトンＸ−１００、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ
ＰＭＳＦ、５０ｍＭ ＮａＦおよび０．２ｍＭ バナジン酸塩を含有するＴＢ
Ｓ ３００μｌ／ウェルで細胞を溶解し、特異的抗体およびプロテインＡ−セフ
ァロースで抽出した。抗ＧＰＢＰ血清を用いた場合、前免疫血清およびプロテイ
ンＡ−セファロースを用いて可溶化液を予め清澄化した。

【００６９】 ｒＧＰＢＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ脱リン酸化−１０ｍＭ 酢酸トリス（ｐＨ７．
５）、１０ｍＭ 酢酸マグネシウムおよび５０ｍＭ 酢酸カリウム１００μｌ中
ｒＧＰＢＰ１μｇを０．８５単位のウシ腸管アルカリ性ホスファターゼ（ファル
マシア）で３０℃で３０分間脱リン酸化した。

【００７０】 再生アッセイ−前記するようにｒＧＰＢＰ１から５μｇを用いてインブロット
再生アッセイを実施した（１１）。

【００７１】 ヌクレオチド配列分析−［α］^３５Ｓ−ｄＡＴＰ、修飾Ｔ_７ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（アマシャム）およびユニバーサルまたはＧＰＢＰ特異的プライマーを用い
てジデオキシ鎖終止法によりｃＤＮＡ配列分析を実施した（８から１０）。

【００７２】 ^３２Ｐホスホアミノ酸分析−免疫精製したｒＧＰＢＰまたは目的の物質を含有
するそのＨＰＬＣゲル濾過分画をリン酸化し、加水分解し、１次元（４）または
２次元薄層クロマトグラフィ（１２）で分析した。２次元分析を実施する場合、
第１の次元のためのバッファーは葉酸：酢酸：水（１：３．１：３５．９）（ｐ
Ｈ１．９）であり、第２の次元のためのバッファーは酢酸：ピリジン：水（２：
０．２：３７．８）（ｐＨ３．５）であった。アミノ酸をニンヒドリンで現し、 ^３２ Ｐホスホアミノ酸をオートラジオグラフィにより現した。

【００７３】 物理学的方法および免疫化学技術−（４）のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウ
ェスタンブロッティングを実施した。ＡＢＣペルオキシダーゼ法を用いて、ヒト
多重組織対照スライド（バイオメディア、バイオジェネックス）で免疫化学研究
を行った（１３）。

【００７４】 コンピューター分析−相同性はＮＣＢＩサーバーでＢＬＡＳＴ２．０（１４）
を用いてジーンバンクおよびスイスプロットデータベースに対して、およびゲノ
ミックリサーチサーバーのためのインスティテュートを用いて発現配列タグに関
してＴＩＧＲヒューマンジーンインデックスデータベースに対して検索した。ス
イスインスティテュートオブバイオインフォーマティックスでプロフィールスキ
ャンプログラムを用いて、機能的なパターンおよびプロフィールに関する検索を
ＰＲＯＳＩＴＥデータベースに対して行った（１５）。２１および２８の両方の
残基のウィンドウを有するプログラムコイル（１６）を用いて実験的癌研究に関
してスイスインスティテュートで高次コイル構造の予測を行った。

【００７５】 結果 ＧＰＢＰの分子クローニング−ヒトＧＰ抗原の分岐したＮ末端領域と特異的に
相互作用するタンパク質を検索するために、この領域および隣接配列を包含する
２１残基ペプチド（ＧＰｐｅｐ１；配列番号：２６）、並びにそれに対する特異
的モノクローナル抗体を組み合わせていくつかのヒトｃＤＮＡ発現ライブラリー
をスクリーニングした。５ｘ１０^６以上のファージをスクリーニングし、抗体結
合を妨害せずにＧＰｐｅｐ１と特異的に相互作用する融合タンパク質をコードす
る単一のＨｅＬａ誘導組換え体を同定した。

【００７６】 元来のクローンのｃＤＮＡインサート（ＨｅＬａ１）を用いて５’非翻訳配列
の４０８ｂｐ、６２４残基をコードする１８７２ｂｐのオープンリーディングフ
レーム（ＯＲＦ）、および３’非翻訳配列の１０９ｂｐを含有する２．４ｋｂ
ｃＤＮＡ（ｎ４’）を単離した（図１）（配列番号：１から２）。その他の構造
的特徴が興味深い。第１に予測されるポリペプチド（本明細書で以後ＧＰＢＰと
称する）は多くのリン酸化可能な（１７．９％）および酸性（１６％）残基を有
し、配列に沿って偏って分布している。最も豊富にある残基である（９．３％）
セリンはタンパク質の２個の短い領域に偏好性を示し、これは残りのポリペプチ
ド鎖全体で平均７％以下であるのに比較して、ここではアミノ酸のほぼ４０％か
らなる。Ｎ末端の、よりセリンに富む領域は主にＳｅｒ−Ｘａａ−Ｙａａ反復を
含むことも注目に値する。酸性残基はポリペプチドのＮ末端の４分の３に優先的
に位置し、ほとんど１８％の残基が酸性である。これらの残基は最大のポリペプ
チドのＣ末端の４分の１で９％しか現れず、２個の電気的に対立するドメインを
有するポリペプチド鎖になる。Ｎ末端ではポリペプチドはプレクストリン相同性
（ＰＨ）ドメインを含有し、これは生物学的活性を呈する細胞膜への多くのシグ
ナル発生タンパク質の補給を意味している（１７）。最終的に、２分した核標的
化配列（１８）は高次コイルを形成する全ての構造的要件に全て合致する７個の
反復領域の必須部分として存在する（１６）。

【００７７】 タンパク質データバンク検索によりＰＨドメインを有するＮ末端でおよそ１０
０個の残基内に相同性がほとんど独占されていることが示された。オキシステロ
ール結合タンパク質のＰＨドメインが最も類似しており、ＧＰＢＰとの全体の同
一性が３３．５％および類似性が６５．２％である。加えて、Ｃａｅｎｏｒｈａ
ｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（線虫）コスミドＦ２５Ｈ２（信託番号Ｑ９３５
６９）はタンパク質全配列を通して全体の同一性が２６．５％および類似性が６
１％を示す仮定ＯＲＦを含有し、これは類似のタンパク質が下等の無脊椎動物に
存在することを示している。いくつかのヒト発現配列タグ（信託番号ＡＡ２８７
８７８、ＡＡ２８７５６１、ＡＡ３０７４３１、ＡＡ３３１６１８、ＡＡ０４０
１３４、ＡＡ１５８６１８、ＡＡ０４００８７、ＡＡ１２２２２６、ＡＡ１５８
６１７、ＡＡ１２１１０４、ＡＡ４１２４３２、ＡＡ４１２４３３、ＡＡ２８２
６７９、およびＮ２７５７８）は対応するＧＰＢＰ ｃＤＮＡの枝分かれを有す
る高度な配列同一性（９８％以上）を有し、これらがヒトＧＰＢＰに相当するこ
とを示唆している。興味深いことに、ＡＡ２８７８７８ＥＳＴはＧＰＢＰ５’非
翻訳領域に対応する配列内で６７個のヌクレオチドのギャップを示し、これはＧ
ＰＢＰ ｐｒｅ−ｍＲＮＡが別法としてヒト組織においてスプライシングされる
ことを示唆している（図示せず）。

【００７８】 ヒト組織におけるＧＰＢＰ遺伝子の分布および発現を最初にノーザンブロット
分析により評価した（図２、パネルＡ）。遺伝子は４．４ｋｂおよび７．５ｋｂ
の長さの間で２個の主要なｍＲＮＡ種として、およびより短い少数のその他の種
として発現される。これらの複数のｍＲＮＡ種間の構造上の関係は解っておらず
、その相関的な発現は組織間で変化する。最も高い発現レベルは横紋筋（骨格お
よび心臓の筋肉）に見られ、肺および肝臓では発現レベルは最も低いことが示さ
れる。

【００７９】 異なる種からのゲノムＤＮＡのサザンブロット研究分析により、相同性遺伝子
は系統発生を通して存在することが示された（図２、パネルＢ）。ヒト由来のプ
ローブに合致するように、ゲノムＤＮＡの起源として累進的に減少するハイブリ
ダイゼーション強度は、進化においてヒトから排除された。

【００８０】 翻訳開始部位の実験的決定−予測ＯＲＦを実験的に確認するために、ｎ４’の
ｃＤＮＡの２．４ｋｂか、またはＦＬＡＧ配列でタグ化された予測ＯＲＦ（図３
Ａ）のみを含有する真核発現ベクターを２９３細胞における一過性発現に使用し
た。ＧＰＢＰまたはＦＬＡＧ特異的抗体を用いて免疫ブロットにより対応する抽
出物を分析した。ＧＰＢ特異的抗体は両方のトランスフェクトされた細胞におい
て類似の主要ポリペプチドに結合するが、操作された構築物により製造されるポ
リペプチドのみがＦＬＡＧ配列を発現した（図３Ｂ）。これは予測Ｍｅｔでｎ４
’ ｃＤＮＡの翻訳開始部位に位置し、提示された１次構造を確認した。さらに
、組換えポリペプチドは予測された分子量よりも高い分子量を示し（８０対７１
ｋＤａ）、これはＧＰＢＰが翻訳後修飾されていることを示唆している。

【００８１】 酵母ｒＧＰＢＰの発現および特徴づけ−酵母発現およびＦＬＡＧ基盤のアフィ
ニティ精製を組み合わせてｒＧＰＢＰを製造した（図４Ａ）。低Ｍｒを示す複数
の関連生成物と共に、〜８９ｋＤａの主要なポリペプチドが得られた。抗ＦＬＡ
ＧおよびＧＰＢＰ特異的抗体の両方により組換え物質が認識され、発現系の適合
性が保証された。しかしながら、再度主要生成物により示されたＭｒが予測され
たＭｒよりも著明に高く、２９３細胞由来の組換え物質のＭｒよりも高く、ＧＰ
ＢＰが重要な区別される翻訳後修飾を受けているという考えが支持された。ポリ
ペプチド鎖にはリン酸化可能な残基が豊富であるので、組換え物質におけるホス
ホアミノ酸の存在を調べた。ホスホセリン（Ｐｓｅｒ）、ホスホスレオニン（Ｐ
Ｔｈｒ）およびホスホチロシン（ＰＴｙｒ）に対するモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体を用いることにより（図示せず）、酵母ｒＧＰＢＰ（図４Ｂ）ま
たは２９３細胞由来物質（図示せず）のいずれかの三つの全てのリン酸残基の存
在を同定した。さらに５から１０ｍＭの対応するホスホアミノ酸の添加によりそ
の結合を部分的に阻止することにより抗体の特異性を評価した（図示せず）。こ
れはリン酸残基含量が細胞発現系に依存して変化し、Ｍｒの差は主にリン酸化に
よるものであることを示唆している。脱リン酸化酵母誘導物質は一貫して２９３
細胞に由来する物質に類似のＭｒを示し、ホスホアミノ酸含量はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ移動性に相関する（図４Ｃ）。ｉｎ ｖｉｖｏ測定のように、２９３細胞にお
けるｒＧＰＢＰのリン酸化を評価した（図４Ｄ）。対照細胞（レーン１）および
安定した（レーン２）または一過性（レーン３）様式のｒＧＰＢＰ発現細胞をＨ _３ ^３２ ＰＯ_４の存在下培養した。する免疫沈澱組換え物質は^３２Ｐを含有し、こ
れはｉｎ ｖｉｖｏでＧＰＢＰのリン酸化を生じ、従ってこれは物理学的過程で
ある可能性があることを示した。

【００８２】 ｒＧＰＢＰはヒトＧＰ抗原のＮ末端領域をリン酸化するセリン／スレオニンキ
ナーゼ−ＧＰＢＰはプロテインキナーゼの古典的な触媒ドメインを定義するのに
必要な保存構造を含有しないが、新規非保存プロテインキナーゼ（１９から２７
）の最近の同定および特徴づけによりそのリン酸化活性の研究が促進された。Ｍ
ｎ^２＋およびＭｇ^２＋の存在下［γ^３２Ｐ］ＡＴＰをｒＧＰＢＰ（酵母または２
９３細胞（図示せず）のいずれかに由来）に添加した結果、抗ＦＬＡＧおよび特
異的抗体の両方により認識される主要なおよび関連する生成物においてＰＳｅｒ
およびＰＴｈｒとして^３２Ｐが組み込まれ（図５ＡおよびＢ）、これはアフィニ
ティ精製物質がＳｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼを含有することを示した。こ
の活性をさらに特徴づけするために、ＧＰｐｅｐ１，ＧＰｐｅｐ１Ａｌａ^９（Ｓ
ｅｒ^９がＡｌａで置換されたＧＰｐｅｐ１変異体）、元来のおよび組換えヒトＧ
Ｐ抗原、並びに元来のウシＧＰ抗原を検定した（図５Ｃ）。アフィニティ精製ｒ
ＧＰＢＰは異なった程度で全てのヒト由来物質をリン酸化した。しかしながら、
類似の条件でウシ由来基質において測定可能な^３２Ｐ組み込みは観察されなかっ
た。ＧＰｐｅｐ１に比較した場合、ＧＰｐｅｐ１Ａｌａ^９により示された^３２Ｐ
組み込みは低度であり、ウシ抗原のリン酸化は欠如し、これはｒＧＰＢＰに存在
するキナーゼがヒトおよびウシ抗原を認識し、Ｓｅｒ^９がキナーゼの標的である
ことを示している。

【００８３】 精製系により高品質の物質が提供されるが、プロテインキナーゼ活性と共に夾
雑物が存在することは排除できない。夾雑物の存在はまたＦＬＡＧ含有４０ｋＤ
ａポリペプチドの存在によっても示唆され、これはリン酸化アッセイにおいて特
異的抗体または^３２Ｐの組み込みのいずれとも反応性を示さなかった（図４Ａお
よび５Ａ）。プロテインキナーゼ活性を留めるポリペプチドを正確に同定するた
めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットの後ｉｎ ｖｉｔｒｏキナー
ゼ再生アッセイを実施した（図６）。我々は特異的抗体の使用（レーン１）およ
び切片上^３２Ｐ組み込みのオートラジオグラフィによる検出（レーン２）を組み
合わせるのに成功し、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ活性を留める１次ポリペプチドと
して８９ｋＤａのｒＧＰＢＰ物質を同定した。ｒＧＰＢＰ由来生成物および４０
ｋＤａ夾雑物において３２Ｐ組み込みが欠如しているということはさらに再生ア
ッセイの特異性を支持し、キナーゼ活性が８９ｋＤａポリペプチドに存在するこ
とを確認する。最近、ポリペプチドに親密に関連するプロテインキナーゼの痕跡
がブロット膜から遊離され、標識ステップにおいてポリペプチドに結合し、リン
酸化できることが示された（２８）。我々の系においてこの可能性を評価するた
めに、８９ｋＤａのポリペプチドを含有する膜小片を単独でかまたはブロットレ
ーンの別の領域を表す膜片と一緒に用いて復元実験を行った。同時にインキュベ
ートした小片に関わらず（図示せず）、８９ｋＤａポリペプチドで類似の^３２Ｐ
組み込みが観察され、これは我々のサンプルにおいて同時に精製されたプロテイ
ンキナーゼがある場合、これらが同時移動しない限り、これらは再生アッセイに
おいて８９ｋＤａポリペプチドをリン酸化していないことを示している。同時移
動が関係しないと考えられるが、しかしながら、異なる移動性を示すｒＧＰＢＰ
欠損変異体（ＧＰＢＰΔ２６およびＲ３；以下を参照のこと）もまたキナーゼ活
性を有し、インブロットで同様に復元され得る（図示せず）。

【００８４】 新規キナーゼの免疫組織化学的局在−ヒト組織におけるＧＰＢＰ発現を研究す
るために、特異的ポリクローナル（図７）またはモノクローナル抗体（図示せず
）を用いて免疫組織化学実験を行った。ＧＰＢＰはヒト組織において広範に発現
するが、それは組織および細胞特異性を示す。腎臓では主に細管上皮細胞および
糸球体メサンギウム細胞および有足細胞に見出される。肺胞では抗体は肺細胞の
染色に加えて基底膜局在化を示唆する直線的パターンを表す。肝臓は柔組織にお
いては低発現を示すが、胆管では高発現を示す。中枢神経系における発現は白質
で観察されるが、脳のニューロンでは観察されない。精巣では精原細胞において
高発現し、対照的にセルトリ細胞においては発現しない。副腎では髄質に対して
皮質細胞において高レベル発現を示す。膵臓では、ＧＰＢＰは外分泌部分に対し
てランゲルハンス島で優先的に発現される。前立腺では、ＧＰＢＰは上皮細胞で
発現されるが、間質細胞においては発現されない（図７）。その他の場所では、
ＧＰＢＰは横紋筋、腸管上皮細胞、および小脳のプルキンエ細胞で高発現される
（図示せず）。概してＧＰＢＰを高発現する組織では染色パターンは主に細胞基
質に拡散している。しかしながら、特定の場所では、加えて核（精原細胞）で、
細胞質膜（肺細胞、肝細胞、前立腺上皮細胞、白質）で、または細胞外マトリッ
クス（肺胞）で重要な染色増強がある（図７）。

【００８５】 考察 我々のデータはＧＰＢＰが新規で、非保存セリン／スレオニンキナーゼである
ことを示している。我々はまたＧＰＢＰがヒトおよびウシＧＰ抗原を認識し、ｉ
ｎ ｖｉｖｏでヒトＧＰ抗原のリン酸化可能な領域を標的化することを明らかに
した。いくつかの証拠のラインが、８９ｋＤａポリペプチドがアフィニティ精製
ｒＧＰＢＰにおいて唯一のキナーゼであることを示している。第１に、我々は１
５０ｍＭ、０．５Ｎ、１Ｍまたは２Ｍの塩の存在下で精製されたｒＧＰＢＰサン
プル間で自己およびトランスリン酸化における差異を見出さず（データを示さず
）、これはｒＧＰＢＰが親密な結合性キナーゼを担持しないことを示唆している
。第２に、ＧＰＢＰ特異的抗体を用いて精製した物質がリン酸化において差異を
示さないので（図示せず）、我々のサンプルではＦＬＡＧ含有、酵母誘導キナー
ゼがない。第３に欠失変異体（ＧＰＢＰΔ２６；以下を参照のこと）は自己およ
びトランスリン酸化活性を減じ（図示せず）、これは８９ｋＤａポリペプチドが
リン酸移動を実施する能力を有するｒＧＰＢＰのほんの一部であることを示して
いる。

【００８６】 ＧＰＢＰはその他の非保存性キナーゼと相同ではないが、Ｎ末端αへリックス
高次コイル（２６、２７）、セリンに富むモチーフ（２４）、ホスホアミノ酸の
高含量（２７）、２分裂した核局在化シグナル（２７）、および典型的なヌクレ
オチドまたはＡＴＰ結合モチーフの不在（２４、２７）などのいくつかの構造上
の特徴を共有している。

【００８７】 免疫組織化学研究はＧＰＢＰが細胞基質性ポリペプチドであり、原形質膜に結
合して核においても見出され、基底膜に結合して細胞外マトリックスに見出され
る可能性もあり、これはこれらの全方向に到達するための構造上の要件を有して
いることを示している。核局在シグナルおよびＰＨドメインはそれに各々核およ
び細胞膜に到達する可能性を付与する（１７、２９、３０）。ＧＰＢＰは搬出さ
れる構造上の要件を有していないが、そのｍＲＮＡの５’末端非翻訳領域が初め
にフレーム内に停止コドンを有する１３０残基の上流ＯＲＦを含む（図１）。単
一の塩基対（Ｕ）を挿入するｍＲＮＡ編集過程が機能的なフレーム内出発部位お
よび編集Ｍｅｔのすぐ下流に搬出シグナルを含有する７５４残基のＯＲＦを生じ
るのであろう（図示せず）。この仮説上の余剰配列の一部（ＰＲＳＡＲＣＱＡＲ
ＲＲＲＧＧＲＴＳＳ（配列番号：３３））を示す合成ペプチドに対するポリクロ
ーナル抗体はヒト組織において直線的な血管反応性を示し、これは細胞外基底膜
局在を示唆する（データは示さず）。

【００８８】 別法として、スプライシング現象により搬出のための構造上の要件を提供する
さらなる未同定エキソンを有する転写物を生じることができた。複数の細胞局在
、ＰＴｙｒの高含量、およびｉｎ ｖｉｔｒｏチロシンキナーゼ活性の欠損はＧ
ＰＢＰ自体が特異的チロシンキナーゼの標的であり、従って、特異的シグナル発
生カスケードに関与している可能性がある。

【００８９】 前記するように、特異的セリンリン酸化およびプレｍＲＮＡ代替スプライシン
グは、ＧＰ抗原、アセチルコリンレセプターおよびミエリン塩基性タンパク質（
ＭＢＰ）などのいくつかの自己抗原の生物学に関連している（４）。後者は多発
性硬化症（ＭＳ）、免疫系が中枢神経系の白質を標的化するその他の排他的ヒト
自己免疫疾患における主要な抗原であることが疑われる。ＧＰ病およびＭＳは同
一のＨＬＡ ＩＩクラスハロタイプ（ＨＬＡ ＤＲＢ１^＊１５０１）と強力な関
連性を示すヒト障害である（３２、３３）。これは、このＨＬＡ特異性を担持す
るＭＳ患者のＧＰ病による死亡の最近の報告に加えて（３４）、これらのヒト障
害における共通の発病原因が存在することを支持している。

【００９０】 特異的なセリンのリン酸化が細胞内タンパク質溶解を変化させることが示され
ている（３５から４０）。考えられることは、タンパク質リン酸化における変化
はプロセシングおよびペプチド展示に影響し、従って自己免疫を媒介する。ＨＬ
Ａ−ＤＲ１５によるＧＰ抗原誘導ペプチド展示は、相対的に乱雑なＤＲ１５分子
の優先性よりもプロセシングにより依存し（４１）、これはプロセシングが異常
なリン酸化により影響される場合、得られるペプチドはこのＨＬＡにより提示さ
れることを示唆している。我々の最近のデータでは、ＧＰおよびＭＢＰ系の両方
で、代替スプライシング生成物の生成が特異的および構造上相同であるＰＫＡ部
位のリン酸化を制御するために提供され、これはこのまたは非常に関連性のある
キナーゼがｉｎ ｖｉｖｏリン酸化酵素であることを示唆している。抗原リン酸
化の程度の変化は代替生成物における不均衡によるか、または同一のモチーフの
リン酸化を脱制御する侵入性のキナーゼの作用により引き起こされ、素因のある
個体において自己免疫応答を導くことができる。ＧＰ抗原の特異的代替生成物の
存在がＧＰＢＰによる１次抗原のリン酸化を影響しなかったので、ｒＧＰＢＰは
見かけ上制御されない様式で主要ＰＫＡリン酸化部位でヒトＧＰ抗原をリン酸化
する（図示せず）。

【００９１】 ＧＰＢＰは偏在して発現されるが、特定の器官および組織では共通の自己免疫
応答の標的となる細胞および組織構造の偏好性が示される：ランゲルハンス細胞
（Ｉ型糖尿病）；中枢神経系の白質（多発性硬化症）；胆管（胆汁性肝硬変）；
副腎の皮質細胞（アジソン病）；横紋筋細胞（重症筋無力症）；精原細胞（男性
不妊症）；小脳のプルキンエ細胞（腫瘍随伴性小脳変性症候群）；および腸管上
皮細胞（悪性貧血、自己免疫性胃炎および腸炎）。ヒト自己免疫疾患のモデルを
想定する場合、前記の観察はすべてこの新規キナーゼが魅力的な候補物質である
ことを示している。

【００９２】 背景および実施例１の参考文献 １ Ｓａｕｓ， Ｊ．（１９９８）グッドパスチャー症候群。Ｅｎｃｙｃｌｏｐ
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ｌａ， Ｃ．Ｅ．， Ｐａｖｅｒ， Ｋ．Ｓ．， Ｄｏｒｏｖｋｏｖ， Ｍ．Ｖ
．， Ｗｉｅｄｍａｎｎ， Ｍ．， Ｅｒｄｊｕｍｅｎｔ−Ｂｒｏｍａｇｅ，
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【００９３】 （実施例２：ＧＰＢＰ代替スプライシング） ここで２６残基のセリンに富むモチーフをコードする７８塩基対（ｂｐ）の長
さのエキソンの代替スプライシングにより生じるＧＰＢＰの二つのアイソフォー
ムの存在を報告する。両方のアイソフォーム、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６は
、ポリペプチド自己凝集の結果である高分子凝集体として存在する。ポリペプチ
ド鎖における２６残基ペプチドの存在はより有効に自己相互作用し、より高い特
異活性を有する凝集体を形成する分子種に至る。最終的には、ＧＰＢＰがヒト自
己免疫の発病原因に関与するという観察を支持する証拠を提示する。

【００９４】 材料および方法 合成ポリマー： ペプチド．ＧＰｐｅｐ１、ＫＧＫＲＧＤＳＧＳＰＡＴＷＴＴＲＧＦＶＦＴ（配
列番号：２６）を実施例１で記載する。ＧＰＢＰｐｅｐ１、ＰＹＳＲＳＳＳＭＳ
ＳＩＤＬＶＳＡＳＤＤＶＨＲＦＳＳＱ（配列番号：１４）はＧＰＢＰの３７１か
ら３９６残基を表し、ゲノシスにより合成された。

【００９５】 オリゴヌクレオチド。以下のオリゴヌクレオチドをライフテクノロジーズイン
コーポレーティッドにより合成した（５’から３’へ）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−１１
ｍ，Ｇ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＣＡ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＣＴ（
配列番号：３４）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−１５ｍ，ＡＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＣＡＧ
ＡＡＧ ＡＧＡ Ｃ（配列番号：３５）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−２０ｃ，Ｃ ＡＴＧ
ＧＧＴ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＡＡ ＡＧ（配列番号：３６）ＯＮ−ＧＰＢＰ−
２２ｍ，ＴＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＡＧＴ ＧＡＡ Ａ
ＡＧ Ｇ（配列番号：３７）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−５３ｃ，ＧＡＡＴＴＣ ＧＡＡ
ＣＡＡ ＡＡＴ ＡＧＧ ＣＴＴ ＴＣ（配列番号：３８）；ＯＮ−ＧＰＢＰ
−５６ｍ，ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＧＴ ＣＧＣ ＴＣＴ ＴＣ（配列番号：３９）
；ＯＮ−ＧＰＢＰ−５７ｃ，ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＴＣＴ ＧＴ（
配列番号：４０）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−６２ｃ，ＧＴＧ ＧＴＴ ＣＴＧ ＣＡＣ
ＣＡＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ（配列番号：４１）；ＯＮ−ＧＰＢＰ−Δ２
６，ＣＡ ＣＡＴ ＡＧＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＡＡ
ＧＡＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＡＡＣ（配列番号：４２）。

【００９６】 逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。全ＲＮＡを（１５
）に記載するように、異なる対照およびＧＰ組織から調製した。全ＲＮＡ５μｇ
をレディートゥーゴー ユープライム ファーストストランドビーズ（アマシャ
ム ファルマシア バイオテック）、および４０ピコモルのＯＮ−ＧＰＢＰ−５
３ｃを用いて逆転写した。対応するｃＤＮＡをプライマーＯＮ−ＧＰＢＰ−１１
ｍ／ＯＮ−ＧＰＢＰ−５３ｃまたはＯＮ−ＧＰＢＰ−１５ｍ／ＯＮ−ＧＰＢＰ−
６２ｃを用いるＰＣＲに供した。１５ｍ−６２ｃで得られた生成物の同一性をさ
らにＡｌｕ Ｉ制限により確認した。ＧＰＢＰ転写物を特異的に増幅するために
、プライマーＯＮ−ＧＰＢＰ−１５ｍ／ＯＮ−ＧＰＢＰ−５７ｃを用いてＰＣＲ
を実施した。

【００９７】 ノーザンハイブリダイゼーション研究。予め製造したヒト多重組織および腫瘍
培養細胞株ノーザンブロット（クロンテック）をＧＰＢＰにのみ存在する７８ｂ
ｐエキソンを含有するｃＤＮＡで、または両方のアイソフォームを表すｃＤＮＡ
でプローブした。プライマー対ＯＮ−ＧＰＢＰ−５６ｍおよびＯＮ−ＧＰＢＰ−
５７ｃを用いて、ＧＰＢＰを鋳型として用いて、またはプライマー対ＯＮ−ＧＰ
ＢＰ−２２ｍおよびＯＮ−ＧＰＢＰ−２０ｃを用いて、ＧＰＢＰΔ２６を鋳型と
して用いてＰＣＲにより対応するｃＤＮＡを得た。得られた生成物をランダム標
識し、および製造者指示書に従ってハイブリダイズした。

【００９８】 プラスミド構築、組換えタンパク質の発現および精製。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓにおけるＦＬＡＧタグ化ＧＰＢＰの組替え発現に用いられたプラスミ
ドｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’は別に報告されている（４）。ＯＮ−ＧＰＢＰΔ
２６を用いて７８ｂｐエキソンをコードする配列を位置指定突然変異誘発により
欠失させ、プラスミドｐＨＩＬ−ＦＬＡＧ−ｎ４’Δ２６を生じた。組換えＧＰ
ＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の発現およびアフィニティ精製を（４）の通りに行っ
た。

【００９９】 ゲル濾過ＨＰＬＣ。２５０μｌのサンプルを５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７
．５、１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡にしたゲル濾過ＰＥ−ＴＳＫ−Ｇ４０００Ｓ
Ｗ ＨＰＬＣカラムに注入した。カラムから０．５ｍｌ／分で物質を溶出し、２
２０ｎｍでモニター観察し、微小な分画を収集した。

【０１００】 ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ。自己、トランスリン酸化およびインブロ
ット復元実験を実施例１に記載のとおりに実施した。

【０１０１】 抗体および免疫化学技術。ポリクローナル抗体をニワトリにおいて７８ｂｐエ
キソン（ゲノシス）によりコードされる配列を表す合成ペプチド（ＧＰＢＰｐｅ
ｐ１）に対して産生させた。卵黄を水で１：１０に希釈し、ｐＨを５．０に調整
した。４℃で６時間後、溶液を遠心（４℃、１００００ｘｇで２５分間）により
清澄化し、２０℃、２００００ｘｇで２０重量／容量％ 硫酸ナトリウムを添加
することにより抗体を沈殿させた。ペレットをＰＢＳ（卵黄あたり１ｍｌ）に溶
解し、免疫化学実験に用いた。ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６に対するまたはα３（
ＩＶ）ＮＣ１ドメインに対する抗体の生成については前記している（また４，１
３を参照のこと）。

【０１０２】 沈降速度。ＶＩＳ−ＵＶスキャナーを装備したオプティマＸＬ−Ａ分析用超遠
心（ベックマンインストラメンツインコーポレーティッド）で、Ｔｉ６０ロータ
ーおよび１２ｍｍ光学距離のイーポンチャーコールの２重セクターセルを用いて
沈降速度の決定を行った。およそ４００μｌのサンプルを２０℃、３００００ｒ
ｐｍで遠心し、２２０ｎｍでラジアル走査を５分毎に取った。ＸＬＡＶＥＬ（ベ
ックマン提供による）プログラムを用いて溶質結合の動きの速度から沈降係数を
得た。

【０１０３】 沈降平衡。沈降平衡実験を７０μｌのサンプルを用いる速度実験に関して前記
で記載するように実施し、８０００ｒｐｍで遠心した。平衡時の実験濃度勾配を
ＥＱＡＳＳＯＣプログラム（ベックマン）を用いて分析し、対応する平均分子量
を決定した。ＧＰＢＰに関して０．７１１ｃｍ^３／ｇおよびＧＰＢＰΔ２６に関
して０．７２９ｃｍ^３／ｇの部分的特異的容量を対応するアミノ酸組成物から算
出した。

【０１０４】 物理的方法および免疫化学技術。（３）で前記するように還元条件下ＳＤＳ−
ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを実施した。ホルマリン固定パラフィ
ン包埋組織に関して、ＡＢＣ過酸化法（４）を用いて、または冷アセトンで固定
した凍結ヒト生検に関して間接的免疫蛍光の標準的な方法を用いて免疫組織化学
実験を実施した。

【０１０５】 二つのハイブリッド実験。ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ４２４（クロンテック）
を用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）（ＨＦ７
ｃ）において自己相互作用実験を実施し、各々ＧＡＬ４結合およびドメイン融合
タンパク質の活性化を生じた。製造者の推奨に従って相互作用を評価した。βガ
ラクトシダーゼ活性を切片上ではＸ−ＧＡＬ（０．７５ｍｇ／ｍｌ）を用いて、
および溶液中決定ではオルトニトロフェニルβ−Ｄガラクトピラノシド（０．６
４ｍｇ／ｍｌ）を用いて評価した。

【０１０６】 結果 二つのスプライシングＧＰＢＰ変種の同定。正常ヒト組織におけるＧＰＢＰ種
を特徴づけるために、ＧＰＢＰの全オープンリーディングフレームを隣接する特
異的オリゴヌクレオチドを用いて、異なる組織からの全ＲＮＡに関してポリメラ
ーゼ連鎖反応に逆転写を連動させた。骨格筋由来ＲＮＡから（図８Ａ）、および
腎臓、肺、皮膚、または副腎由来ＲＮＡから（図示せず）、予測されたよりも小
型であることを示す単一のｃＤＮＡフラグメントを得た。入れ子式ＰＣＲ再増幅
およびエンドヌクレアーゼ制限マッピングを組み合わせて、全ＲＴ−ＰＣＲ生成
物が同一の分子種に対応することを決定した（図示せず）。ヒト筋肉からの２．
２ｋｂのｃＤＮＡを全て配列決定し、２６残基モチーフ（アミノ酸３７１−３９
６）をコードする７８ヌクレオチド（１５１９−１５９６位置）が存在しない以
外は、ＨｅＬａ誘導物質と同一であることを見出した（図８Ｂ）。従って、この
より一般的であるＧＰＢＰのアイソフォームをＧＰＢＰΔ２６と称した。

【０１０７】 ７８ｂｐがプレｍＲＮＡプロセシング中に転写をスキップするエキソンを表す
のかどうかを調べるために、このｃＤＮＡを用いてヒト由来のゲノムライブラリ
ーをプローブし、〜１４Ｋｂのクローンを単離した。サザンブロットハイブリダ
イゼーションおよびＰＣＲを組み合わせて、ゲノムクローンを特徴づけし、１２
４８２ｂｐの隣接ＤＮＡフラグメントを全て配列決定した（配列番号：２５）。
配列は（５’から３’で）７６７ｂｐのイントロン配列、９３ｂｐのエキソン、
８１８ｂｐのイントロン、７８ｂｐの目的のエキソン配列、９６５０ｂｐのイン
トロン、９６ｂｐのエキソンおよび９８０ｂｐのイントロン配列（図８Ｃ）を含
有した。対応するＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列を比較することにより決定したエキ
ソンイントロン境界は５’および３’スプライシング部位の標準的なコンセンサ
スに合致し（図８Ｃ）（５）、７８ｂｐ配列のエキソン特性を確認する。プロー
ブとしてゲノムクローンを用いる蛍光切片上ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）に
よりＧＰＢＰ遺伝子は染色体５ｑ１３に局在した（図示せず）。

【０１０８】 ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方に存在する７８ｂｐエキソンかまたは７
８ｂｐの隣接配列を表す２６０ｂｐのｃＤＮＡ（１０３ｂｐ５’および１５７ｂ
ｐ３’）を用いるノーザンブロット分析によりヒト由来の標本におけるＧＰＢＰ
の相対的発現を評価した（図９）。目的の分子種を含有する７８ｂｐは横紋筋（
骨格筋および心筋の両方）および脳に好んで発現し、胎盤、肺および肝臓にはあ
まり発現しなかった。ＧＰＢＰΔ２６とは対照的に、ＧＰＢＰは腎臓、膵臓およ
び癌の培養細胞株では非常に低レベルでしか発現しなかった。

【０１０９】 前記の全ては、ＧＰＢＰが正常ヒト組織では低レベルで発現され、ＧＰＢＰの
ＲＴ−ＰＣＲにより最初に検出されなかったのはより豊富なＧＰＢＰΔ２６が優
先的に増幅されたためであろうということを示している。実際、７８ｂｐエキソ
ン特異的オリゴヌクレオチドを用いて特異的ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った場合、Ｇ
ＰＢＰのｃＤＮＡをヒト組織（骨格筋、肺、腎臓、皮膚および副腎）から増幅で
きた（図示せず）。これはまた、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方を表すｃ
ＤＮＡプローブを用いる場合、ＧＰＢＰΔ２６ ｍＲＮＡがノーザンブロット実
験で検出された主要な転写物であることをも示唆している。

【０１１０】 ＧＰＢＰΔ２６の組換え発現および機能上の特徴づけ。２６残基のセリンに富
むモチーフの欠如がＧＰＢＰの生化学的特性に影響するかどうかを調べるために
、両方のアイソフォーム（ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６）を発現し、精製
し、自己およびトランスリン酸化活性を評価した（図１０）。ｒＧＰＢＰに関し
て前記で報告するように（４をも参照のこと）、単一の主要なポリペプチドおよ
びいくつかの関連する微少な生成物としてｒＧＰＢＰΔ２６を精製した（図１０
Ａ）。しかしながら、ｒＧＰＢＰに比較して、誘導生成物の数および相対量は変
化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単純に２６残基の削除のせいにはできないＭｒが表示
された。これは２６残基モチーフが重要な構造を有し、および溶液中自己および
トランスリン酸化活性の低減の原因となる機能上の成果がｒＧＰＢＰにより表さ
れたことを示唆する（図１０Ｂ）。興味深いことに、リン酸化がＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後インブロットで評価され、復元された場合、溶液中アッセイにおいて示され
た特異的活性における差異は明白ではなく、これは２６残基モチーフが４次構造
レベルで重要な機能上の成果を有する可能性があることを示唆した。さらに復元
実験によりリン酸塩移動活性が提示されたオープンリーディングフレームを表す
主要なポリペプチドに存在し、誘導された微少生成物では検出されないことを示
した。

【０１１１】 ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰ−２６は非常に活性な高分子量凝集体として存在
する。アフィニティ精製ｒＧＰＢＰまたはｒＧＰＢＰΔ２６のゲル濾過分析によ
り、２個のクロマトグラフィピーク（ＩおよびＩＩ）を生じ、ＳＡＳ−ＰＡＧＥ
実験で決定されるように、共に個々の分子種で予測されたものよりも高ＭＷを示
した（各々８９ｋＤａ、８４ｋＤａ）（図１１）。大部分の組換え物質を１５８
ｋＤａおよび６６９ｋＤａ分子量マーカーの間で単一のピークとして溶出し、一
方限定量のｒＧＰＢＰおよび極微量のｒＧＰＢＰΔ２６をピークＩで溶出した（
＞１０００ｋＤａ）。各クロマトグラフィプロフィールを表す分画の一定分量を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、染色するか、または^３２Ｐ［γ］ＡＴＰの存在下イン
キュベートし、イムノブロットおよびオートラジオグラフィにより分析した。主
要な１次ポリペプチドに加えて、各クロマトグラフィのピークはより大きいまた
はより小さい大きさの複数の誘導生成物を含有し、これは１次ポリペプチドが結
合して、共有および非共有結合により安定化された高分子量凝集体を形成するこ
とを示している（図示せず）。キナーゼ活性もまたクロマトグラフィプロフィー
ルと一致する２個のピークを呈した。しかしながら、ピークＩはピークＩＩより
もより高度な特異的活性を示し、これはこれらの高分子量凝集体がキナーゼのよ
り活性な形態を含有していることを示した。等容量のｒＧＰＢＰ分画番号１３お
よび２０は、タンパク質含量では分画１３はウェスタンブロットおよびクーマシ
ーブルー染色により推測されるより２０倍低いが、匹敵するリン酸化活性を呈し
た（図１１Ａ）。ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６のピークＩＩでの特異的活
性もまた異なり、物質全体に関して示された実験と合致し、従って２６残基のセ
リンに富むモチーフの存在によりキナーゼがより活性になるにするという仮説を
支持している。これらの結果はまたｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６の両方が
元来の条件下でオリゴマーとして存在し、高分子量凝集体の形成および特異的活
性の両方が２６残基のセリンに富むモチーフの存在に大いに依存することをも示
唆している。ｒＧＰＢＰの分析用遠心分析によりピークＩが大きな凝集体（１０ ^７ Ｄａ以上）を含有することが表された。ｒＧＰＢＰのピークＩＩは２２０±１
０ｋＤａ凝集体の相同性集合体を含有し、１１Ｓの沈降係数を有する三量体を表
す可能性がある。しかしながら、ｒＧＰＢＰΔ２６のピークＩＩは、いくつかの
オリゴマー種を含有する可能性のあるより異種性の集合体からなる。主要な集合
体（約８０％）は平均分子量３１０±１０ｋＤａおよび１４Ｓの沈降係数を示し
た。

【０１１２】 酵母２ハイブリッド系におけるＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６自己相互作用。
自己凝集の生理学的関係を評価するために、および２６残基モチーフの役割を決
定するために、酵母における２ハイブリッド相互作用系を用いて比較実験を実施
した。この型の実験では、ＧＡＬ４転写因子の活性化または結合ドメインのいず
れかを含有する融合タンパク質の一部として、相互作用を実験するポリペプチド
を発現する。実験するポリペプチドを通して２個の融合タンパク質間の有効な相
互作用が転写活性化因子の再構築および引き続いて２個のレポーター遺伝子、Ｌ
ａｃＺおよびＨｉｓ３の発現に至り、各々コロニーの色の検出およびＨｉｓ欠損
培地における成長が可能になる。異なる濃度のＨｉｓ３遺伝子生成物（３−ＡＴ
）の競合阻害因子の存在下、ヒスチジン欠損培地における成長速度による相互作
用の強度、および定量比色液体βガラクトシダーゼアッセイを評価した。代表的
な実験を図１２に表す。自己相互作用に関してＧＰＢＰΔ２６を検定する場合、
レポーター遺伝子の有意な誘導が観察されたが、各融合タンパク質が単独でまた
は対照融合タンパク質と共に発現された場合、発現は検出されなかった。ＧＰＢ
Ｐを得るためのポリペプチドにおける２６残基モチーフの挿入により、ポリペプ
チド相互作用において著明に増加した。前記の全データはＧＰＢＰΔ２６がｉｎ
ｖｉｖｏで自己結合し、２６残基のポリペプチド鎖への挿入により、より相互
に影響する分子種を生じることを示す。

【０１１３】 ＧＰＢＰはヒト糸球体および肺胞において発現されるが、ウシおよびネズミ糸
球体および肺胞では発現されない。ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６は天然に発生する
自己免疫応答において一般的に標的化されるヒト細胞および組織において優先的
に発現される。ＧＰＢＰの発現を具体的に調べるために、このキナーゼアイソフ
ォームの２６残基モチーフの特徴を表す合成ペプチドに対してポリクローナル抗
体を産生させ、凍結またはホルマリン固定し、パラフィン包埋したヒト組織にお
いて免疫組織化学実験に用いた（図１３）。概して、これらの抗体は、自己免疫
応答の標的である組織構造、例えば胆管、ランゲルハンス島、または中枢神経系
の白質に関して両方のアイソフォームを認識する抗体よりも高い特異性を示す（
図示せず）。それにも関わらず、最も著明な知見は、試験したいずれの組織でも
小さい血管の周囲のＧＰＢＰ選択的抗体の直線的な沈着の存在であり（Ａ）、こ
れはＧＰＢＰが内皮細胞基底膜と結合していることを示唆している。結果的に、
糸球体では、抗ＧＰＢＰ抗体はα３（ＩＶ）ＮＣ１を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体（１３Ｂを１３Ｃおよび１３Ｄと比較する）によるか、または循環Ｇ
Ｐ自己抗体により（１３Ｅおよび１３Ｆを比較する）生じる糸球体基底膜染色に
非常に類似した血管パターンを示した。これらの観察によりＧＰＢＰが天然の自
己免疫応答において標的化される組織構造において発現されるという最初の観察
がさらに支持され、これはＧＰＢＰの発現は危険因子であり、自己免疫攻撃に対
して宿主組織を脆弱にすることを示唆している。

【０１１４】 この仮説をさらに評価するために、ヒトと比較して天然にはＧＰ病にならない
２種の哺乳動物の糸球体においてＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の存在を調べた
（図１４）。ＧＰＢＰ特異的抗体はウシおよびネズミの両方の標本の糸球体を染
色せず（１４Ａを１４Ｂおよび１４Ｃと比較する）、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ
２６の両方に共通するＮ末端配列を認識する抗体は三つ全ての種のこれらの構造
を染色したが、分布および強度は異なっていた（１４Ｄから１４Ｆ）。ウシ腎皮
質では、ＧＰＢＰΔ２６はヒトよりも低率で発現されたが、類似の組織分布が示
された。しかしながらネズミサンプルでは、ＧＰＢＰΔ２６はヒト糸球体におけ
るＧＰＢＰの組織分布と非常に類似した組織分布が示された。異なる３種におい
て肺胞を試験した場合、類似の結果が得られた（図示せず）。抗体検出における
差異が差次発現よりもむしろ１次構造の差異によるものであることを排除するた
めに、ｃＤＮＡ配列決定により、これらの２種において対応する１次構造を決定
した。ウシおよびマウスＧＰＢＰ（配列番号：３から６、および９から１２）は
全体的にヒト物質と各々９７．９％および９６．６％の同一性を示した。さらに
、マウス２６残基モチーフはヒトと同一であったが、ウシは１個の残基において
のみ分岐した。最終的には、ヒトに類似して、対応する７８ｂｐエキソンに特異
的なオリゴヌクレオチドを用いてマウスまたはウシ腎臓全ＲＮＡからＧＰＢＰ
ｃＤＮＡをうまく増幅し、これによりＧＰＢＰが非常に低レベルで発現され、免
疫化学技術により検出できないことが示された。

【０１１５】 ＧＰＢＰはいくつかの自己免疫状態において高度に発現される。特異的ＲＴ−
ＰＣＲにより異なるＧＰ患者からのいくつかの組織を分析し、ＧＰＢＰ／ＧＰＢ
ＰΔ２６ ｍＲＮＡレベルを評価した。対照の腎臓と同様に、ＧＰ腎臓で主に発
現されたアイソフォームはＧＰＢＰΔ２６であった。しかしながら、１人の患者
の筋肉ではＧＰＢＰが優先的に発現され、一方ＧＰＢＰΔ２６は対照筋肉サンプ
ルにおいて検出された唯一のアイソフォームであった（図１５Ａ）。我々はこの
特定の患者からの腎臓サンプルを有していなかったので、対応する標的器官にお
けるＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６発現を評価できなかった。類似の理由から、腎臓
を試験した患者の筋肉におけるＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６レベルを評価できなか
った。筋肉細胞は高レベルのＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６を発現し（図９における
ノーザンブロットを参照のこと）、これらは多量の組織を含む。対照的に腎臓に
おけるＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６の発現はもっと少なく、糸球体は実際に、ＧＰ
ＢＰアイソフォームを発現する唯一の腎臓構造である（図１３を参照のこと）。
糸球体は、筋細胞が筋肉にあるよりも相対的に腎臓に余り豊富にない構造であり
、糸球体はＧＰ発病過程において免疫攻撃により標的化される構造である。ＲＴ
−ＰＣＲ実験を行う場合により豊富でより短いメッセージが優先的に増幅される
のに伴い、これらの因子により正常およびＧＰ腎臓の両方でＧＰＢＰが検出され
ないことが説明され、従って発病過程における糸球体でのＧＰＢＰ発現の評価を
除外できる。それにも関わらず、ＧＰ患者におけるＧＰＢＰレベルの増加はＧＰ
ＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６発現がＧＰ発病過程において変化し、ＧＰＢＰ発現の増強
がＧＰ病において重要な病因であることを示唆している。

【０１１６】 自己免疫発病過程におけるＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の発現を調べるため
に、皮下自己免疫過程を試験し、これらを正常皮膚または非自己免疫性皮膚炎を
表す対照サンプルと比較した（図１５）。対照サンプルは大抵の末梢ケラチノサ
イトにおいて限定的なＧＰＢＰ発現を示すが（１５Ｂ、１５Ｅ）、基底層から角
質層に広がるケラチノサイトは全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（１５Ｃ、１
５Ｆ）または扁平苔癬（１５Ｄ、１５Ｇ）の影響をうける皮膚において豊富なＧ
ＰＢＰを発現した。ＵＶ照射およびアポトーシス誘導時の培養ケラチノサイトで
前記した小疱に非常に類似した細胞表面構造においてＧＰＢＰが優先的に発現さ
れた（６）。対照的に、ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方を認識する抗体は
、自己免疫の影響を受けたまたは対照のサンプルの両方において表皮全体を通じ
て細胞基質性拡散パターンを生じた（図示せず）。これらのデータは対照および
自己免疫の影響を受けたケラチノサイト両方において、ＧＰＢＰΔ２６が細胞基
質で発現され、細胞分化の間に発現は有意には変化しなかったことを示している
。対照的に、成熟ケラチノサイトは実際に唯一のＧＰＢＰ発現細胞であった。し
かしながら、小疱形成およびＧＰＢＰ発現は自己免疫応答により影響を受けた表
皮において初期分化段階で観察された（１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｆ、１５Ｇ）。こ
れはさらに基底ケラチノサイトで異常なアポトーシスが皮膚に影響する自己免疫
の発病過程に関係することを示す以前の観察を支持し（７）、これはアポトーシ
スおよびＧＰＢＰ発現がこのヒト細胞系に関連していることを示唆している。

【０１１７】 考察 代替プレｍＲＮＡスプライシングは組織分布、細胞内局在、および異なるプロ
テインキナーゼの機能を制御することが報告されている差次遺伝子発現の基礎的
なメカニズムである（８から１１）。この点で、およびＧＰＢＰに非常に類似し
て、Ｂ−Ｒａｆは複数のスプライシング変種として存在し、ここで特異的エキソ
ンの存在により、より相互に影響し、有効な腫瘍形成性キナーゼになる（１２）
。

【０１１８】 ｒＧＰＢＰΔ２６がなおこの新規キナーゼの特徴づけされていない触媒性ドメ
インを担持することは明らかであるが、ｒＧＰＢＰと比較した場合、自己および
トランスリン酸化活性の両方が大きく低下する。ゲル濾過および２ハイブリッド
実験により、このように低下したリン酸移動活性の基礎となるメカニズムにいく
らかの見識が提供される。ｒＧＰＢＰの約１から２％がｒＧＰＢＰのリン酸化活
性の約３分の１をあらわす非常に高分子量の凝集体に構成され、これは高分子量
凝集体がより有効な４次構造を付与することを示している。組換えＧＰＢＰΔ２
６は実施にピークＩの物質を伴わず、一貫して低下したキナーゼ活性を示す。し
かしながら、ピークＩＩに存在するｒＧＰＢＰΔ２６物質もまたｒＧＰＢＰの相
同性分画と比較した場合、リン酸化活性の低下を示すので、凝集体が、２６残基
が特異活性を増加させる唯一のメカニズムではないようである。一つの可能性は
、ｒＧＰＢＰ由来の凝集体が２６残基モチーフの挿入により引き起こされる４次
構造強化のために、より高度な特異活性を表すということである。大量の物質が
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のポリペプチドとして現れ、８Ｍの尿素ま
たは６Ｍのグアニジンのいずれかの存在はクロマトグラフィゲル濾過プロフィー
ルにおいてほとんど影響がないので、オリゴマーは非常に強力な非共有結合によ
り主に繋がれている（図示せず）。どのように２６残基モチーフがより強力で、
活性な構造を付与するのかを明らかにすべきであろう。キナーゼの活性化状態を
変化させるモチーフをコードするエキソンの存在により誘導される立体配座の変
化がＢ−ＲａｆのＳｒｃタンパク質（２４）およびエキソン８ｂおよび１０（１
２）のリンカードメインとして提示されている。別法として、２６残基モチーフ
が構造上の要件、例えばそのリン酸化がＧＰＢＰの全活性化に必要である残基を
提供できる。

【０１１９】 ＧＰ抗原（α３（ＩＶ）ＮＣ１）の１次構造が複数の立体配座を生じる複合体
折り畳み過程の標的であることを報告した（１３）。単離された立体配列は超分
子凝集体のリン酸化および恐らく４次構造形成により特異的に活性化される非最
低エネルギー構造である。ＧＰ患者ではα３（ＩＶ）ＮＣ１が立体配座の変化お
よびコラーゲンＩＶネットワークのジスルフィド安定化を媒介する能力の低下を
示す。そしてＧＰ抗体が患者α３（ＩＶ）ＮＣ１配座異性体に対してより強力な
親和性を示し、これは立体配座が変化した物質が自己免疫応答を引き起こすこと
を示している。従って、ＧＰ病ではα３（ＩＶ）ＮＣ１の立体配座形成過程にお
ける初期の変化が、免疫系が耐性でない配座異性体の変化を生じ、このように自
己免疫応答を媒介するようである。

【０１２０】 その他の証拠（Ｒａｙａら、結果は未発表）により、リン酸化が非最低エネル
ギー末端にα３（ＩＶ）ＮＣ１の折り畳みを誘導するシグナルであることが示さ
れている。このシナリオでは、ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１系の三つの特徴はウシま
たはネズミのような自然にはＧＰ病にならない種からの対応する抗原系と比較し
た場合、発病原因と特別な関係にある。第１にヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端
はＰＫＡによりおよびＧＰＢＰによりリン酸化されるモチーフを含有する（前記
、および２から４をも参照のこと）。第２にヒト遺伝子は代替エキソンスプライ
シングにより複数の代替生成物を生じる（１４、１５）。エキソンスキッピング
により、１次α３（ＩＶ）ＮＣ１生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＫＡリン酸化
を上方制御する分岐したＣ末端を有する代替生成物を生じる（以下の実施例３を
参照のこと）。第３にヒトＧＰＢＰは、ＧＰ病の二つの主要な標的である糸球体
および肺胞基底膜に結合して発現される。リン酸化依存性立体配座形成過程はま
た非病原性ＮＣ１ドメインの特徴でもあり（１３）、これはリン酸化可能なＮ末
端、代替スプライシングによる多様化および糸球体および肺胞基底膜でのＧＰＢ
Ｐの発現は全て、α３（ＩＶ）ＮＣ１の立体配座形成過程を脆弱な状態に置く全
ての排他的なヒトの特徴であることを示唆している。四つの別個のＧＰ腎臓実験
では高レベルおＧＰ抗原代替生成物を発現し（１５；ＢｅｒｎａｌおよびＳａｕ
ｓ、結果は未発表）、ＧＰ患者ではＧＰＢＰ発現の増加が見出された（前記を参
照のこと）。代替ＧＰ抗原生成物およびＧＰＢＰの両方のレベル増加はα３（Ｉ
Ｖ）ＮＣ１のリン酸化依存性立体配座形成過程における結果である、従って発病
の可能性を有していると予測される。

【０１２１】 ＧＰＢＰは天然の自己免疫応答により標的化される皮膚において高度に発現さ
れる。表皮ではＧＰＢＰはケラチノサイトが成熟中に基底から角質層になるアポ
トーシス媒介分化過程の細胞表面小疱と結合している（２２、２３）。ＳＬＥ患
者からのケラチノサイトはＵＶ誘起のアポトーシスに対して感受性が著明に高め
られており（６、１８、２０）、ＳＬＥおよび皮膚筋炎では増強されたおよび時
期尚早なケラチノサイトアポトーシスの存在が報告されている（７）。一貫して
、円盤状狼瘡（図示せず）、ＳＬＥおよび扁平苔癬などのいくつかの皮膚自己免
疫状態において基底から表皮の周辺層までアポトーシス体が広がっているのが見
出された。自己抗原およびその修飾体はアポトーシスケラチノサイトの細胞表面
小疱に密集する（６、１８、２０）。アポトーシス表面小疱は自己抗原（２１）
を提供し、循環系に修飾体を放出する可能性がある。（１６から２０）。これは
アポトーシス体からの修飾自己抗原の放出が全身性自己免疫応答媒介ＳＬＥおよ
び強皮症を媒介する免疫化であり得ることを示唆している（１８、１９）。

【０１２２】 ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の両方がｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテインキナー
ゼとして作用でき、ＧＰＢＰはＧＰＢＰΔ２６よりもより活性なアイソフォーム
であるということが示される。さらに酵母からまたはヒト２９３細胞から精製さ
れたＧＰＢＰまたはＧＰＢＰΔ２６を表す組換え物質がα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメ
インを特異的に減成する、関連するタンパク質溶解活性を有した（結果は未発表
）。タンパク質溶解活性は真核細胞発現系において生成されたα３（ＩＶ）ＮＣ
１に機能するが、細菌において生成された組換え物質には機能せず（結果は未発
表）、これはα３（ＩＶ）ＮＣ１プロセシングが原核細胞組換え物質には存在し
ないいくつかの立体配座形成または翻訳後要件を有することを示している。最終
的に、いくつかの自己抗原がアポトーシス性ケラチノサイトにおいてリン酸化お
よび減成を行うことが報告されている（２０）。正確なメカニズムにまで限定は
していないが、前記の全データに鑑み、我々はアポトーシス性小疱で機械的に集
めたＧＰＢＰは、リン酸化、立体配座変化および減成などの自己抗原の複雑な改
変を行う可能性があることを提示する。従って、ＳＬＥ（Ｐ１リボソームリンタ
ンパク質およびＳｍ−Ｄ１小型核リボヌクレオタンパク質）および皮膚筋炎（ヒ
スチジルｔＲＮＡシンセターゼ）において自己抗原を表す組換えタンパク質はｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでＧＰＢＰの基質であった（結果は未発表）。

【０１２３】 ＧＰＢＰの培養癌細胞株における下方制御はＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６を機械
的に繋げた細胞がプログラムされた細胞死を誘起するシグナル発生経路に関与し
ている可能性があることを示唆している。対応するアポトーシス経路は自己免疫
発病過程で上方制御して特異的ＭＨＣハロタイプを担持する個体の抗原展示を変
化させ；細胞の形質転換中に下方制御して腫瘍成長中の形質転換された細胞への
自己免疫攻撃を防御できる。

【０１２４】 実施例２の参考文献 １ Ｓａｕｓ， Ｊ．（１９９８）グッドパスチャー症候群について：Ｅｎｃｙ
ｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第二版，Ｖｏｌ． ２，Ｄｅ
ｌｖｅｓ， Ｐ．Ｊ．， Ｒｏｉｔｔ， Ｉ．Ｍ．編，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ロンドン）ｐｐ． １００５−１０１１． ２ Ｑｕｉｎｏｎｅｓ， Ｓ．， Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｇａｒｃｉａ−
Ｓｏｇｏ， Ｍ．， Ｅｌｅｎａ， Ｓ．Ｆ．およびＳａｕｓ， Ｊ．（１９９
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１９７８０−１９７８４ ３ Ｒｅｖｅｒｔ， Ｆ．， Ｐｅｎａｄｅｓ Ｊ．Ｒ．， Ｐｌａｎａ，
Ｍ．， Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｃ．， Ｉｔａｒｔ
ｅ， Ｅ．， Ｃｅｒｖｅｒａ， Ｊ．， Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr， Ｊ．，
Ｑｕｉｎｏｎｅｓ， Ｓ．およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０，１３２５４−１３２６１ ４ Ｒａｙａ， Ａ．， Ｒｅｖｅｒｔ， Ｆ．， Ｎａｖａｒｒｏ， Ｓ．お
よびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２６４２
−１２６４９． ５ Ｇｒｅｅｎ， Ｍ．Ｒ．（１９８６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０，
６７１−７０８． ６ Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ， Ｌ．Ａ．， Ａｎｈａｌｔ， Ｇ．およ
びＲｏｓｅｎ， Ａ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１３１７−１
３３０． ７ Ｐａｂｌｏｓ， Ｊ．Ｌ：， Ｓａｎｔｉａｇｏ， Ｂ．， Ｇａｌｉｎｄ
ｏ， Ｍ．， Ｃａｒｒｅｉｒａ， Ｐ．Ｅ．， Ｂａｌｌｅｓｔｉｎ， Ｃ．
およびＧｏｍｅｚ−Ｒｅｉｎｏ， Ｊ．Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１
８８：６３−６８． ８ Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ， Ｍ．， Ｅｄｍａｎ， Ｃ．Ｆ．およびＳｃｈｕ
ｌｍａｎ， Ｈ．（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２６，８３９−８５
２． ９ Ｎａｉｔｏ， Ｙ．， Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｙ．， Ｙｏｋｏｋｕｒａ，
Ｈ．， Ｓｕｇｉｔａ， Ｒ．， Ｎｉｓｈｉｏ， Ｍ．およびＨｉｄａｋａ
， Ｈ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３２７０４−３２７０
８． １０ Ｂａｙｅｒ， Ｋ．−Ｕ．， Ｌｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．およびＨａｒｂｅｒ
ｓ，Ｋ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６，２９−３６． １１ Ｍａｎｄａｕｌｅ， Ｐ．， Ｅｄａ， Ｍ．， Ｗａｔａｎａｂｅ，
Ｎ， Ｆｕｊｉｓａｗａ， Ｋ．， Ｍａｔｓｕｏｋａ， Ｔ．， Ｂｉｔｏ，
Ｈ．， Ｉｓｈｉｚａｋｉ， Ｔ．およびＮａｒｕｍｉｙａ， Ｓ．（１９９
８）Ｎａｔｕｒｅ ３９４，４９１−４９４． １２ Ｐａｐｉｎ， Ｃ．， Ｄｅｎｏｕｅｌ−Ｇａｌｙ， Ａ．， Ｌａｕｇ
ｉｅｒ， Ｄ．， Ｃａｌｏｔｈｙ， Ｇ．およびＥｙｃｈｅｎｅ， Ａ．（１
９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２４９３９−２４９４７． １３ 米国仮特許出願，出願番号割り当て未定，２０００年２月１１日登録（事
件番号９８，７２３−Ｃ） １４ Ｐｅｎａｄｅｓ Ｊ．Ｒ．， Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｒｅｖｅｒｔ，
Ｆ．， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｃ．， Ｆｒｅｓｑｕｅｔ， Ｖ．Ｊ．，
Ｃｅｒｖｅｒａ， Ｊ．， Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr， Ｊ．， Ｑｕｉｎｏｎｅ
ｓ， Ｓ．およびＳａｕｓ， Ｊ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２２９，７５４−７６０． １５ Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｑｕｉｎｏｎｅｓ， Ｓ．およびＳａｕｓ，
Ｊ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２０９０−１２０９４
． １６ Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ， Ｌ．Ａ．， Ａｎｈａｌｔ， Ｇ．Ｊ
．およびＲｏｓｅｎ， Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１６２
５−１６３４． １７ Ｃａｓｉａｎｏ， Ｃ．Ａ．， Ｍａｒｔｉｎ， Ｓ．Ｊ．， Ｇｒｅｅ
ｎ， Ｄ．Ｒ．およびＴａｎ， Ｅ．Ｍ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
８４：７６５−７７０． １８ Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ， Ｌ．およびＲｏｓｅｎ， Ａ．（１９
９７）Ｌｕｐｕｓ ６：１７５−１８０． １９ Ｂｏｌｉｖａｒ， Ｊ．， Ｇｕｅｌｍａｎ， Ｓ．， Ｉｇｌｅｓｉａ
ｓ， Ｃ．，Ｏｒｔｉｚ， Ｍ．およびＶａｒｄｉｖｉａ， Ｍ．（１９９８）
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７３：１７１２２−１７１２７． ２０ Ｕｔｚ， Ｐ．Ｊ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｐ．（１９９８）Ａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４１：１１５２−１１６０． ２１ Ｇｏｌａｎ， Ｔ．Ｄ．， Ｅｌｋｏｎ， Ｋ．Ｂ．， Ｇｈａｖａｒｉ
， Ａ．Ｅ．およびＫｒｕｅｇｅｒ， Ｊ．Ｇ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉ
ｎｖｅｓｔ．９０：１０６７−１０７６． ２２ Ｐｏｌａｌｏｗｓｋａ， Ｒ．Ｒ．， Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｉ， Ｍ．，
Ｂａｒｔｌｅｔｔ， Ｒ．， Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ， Ｌ．Ａ．およびＨａａ
ｋｅ， Ａ．Ｒ．（１９９４）Ｄｅｖ．Ｄｉｎａｍ．１９９：１７６−１８８．
２３ Ｍａｒｕｏｋａ， Ｙ．， Ｈａｒａｄａ， Ｈ．， Ｍｉｔｓｕｙａｓ
ｕ他（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２
３８：８８６−８９０． ２４ Ｘｕ， Ｗ．， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｃ．およびＥｃｋ， Ｍ．Ｊ
．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５，５９５−６０２．

【０１２５】 （実施例３．エキソンスプライシングによるヒト自己抗原リン酸化の制御） 導入 ＧＰ病ではＩＶ型コラーゲンのα３鎖（ＧＰ抗原）の非コラーゲン性Ｃ末端ド
メイン（ＮＣ１）に対する自己抗体により免疫系攻撃が媒介される（１）。ヒト
α３（ＩＶ）ＮＣ１のＮ末端は独特な構造モチーフ、ＫＲＧＤＳ^９を有する高度
に分岐した親水性領域を含有し、Ａ型プロテインキナーゼの機能的リン酸化部位
に必要な部分として細胞付着シグナルを保持している（２，３）。さらに特徴的
には、ヒトＧＰ抗原をコードする遺伝子領域は代替エキソンスプライシングによ
り複数のｍＲＮＡを生じる（４、５）。代替生成物はＣ末端で分岐し、一つを除
いて全てがＮ末端ＫＲＧＤＳ^９を共有する（４、５）。

【０１２６】 多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系で炎症性脱ミエリン化プラークの存在によ
り特徴づけられる排他的ヒト神経学的疾患である（６）。この疾患が、ミエリン
塩基性タンパク質（ＭＢＰ）などの白質の特異的構成成分に対する、細胞毒性Ｔ
セルに媒介される自己免疫攻撃により誘起されるということがいくつかの証拠に
より示されている（７、８）。ヒトでは、プレｍＲＮＡプロセシング中の代替エ
キソンスプライシングの結果、ＭＢＰ遺伝子が四つの生成物（ＭＢＰ、ＭＢＰΔ
ＩＩ、ＭＢＰΔＶおよびＭＢＰΔＩＩ／Ｖ）を生じる（９）。これらの中でＭＢ
ＰΔＩＩが成熟中枢神経系では最も豊富であり、一方全てのエキソンを含有する
ＭＢＰ体は実際には存在しない（９）。

【０１２７】 自己免疫応答媒介ＧＰ病およびＭＳにはいくつかの生物学的類似性が存在し、
主に；１）両者ともに排他的な疾患であり典型的にはウイルス性インフルエンザ
様の疾患後に始まる；２）ＩＩクラス ＭＨＣのＨＬＡ−ＤＲ領域の同一のハロ
タイプに強力な連関が存在する；３）代替スプライシングによりいくつかの生成
物を生じる；および４）ＧＰ病によるＭＳ患者の死亡が最近報告されている（１
０）。

【０１２８】 材料および方法 合成ポリマー：ＧＰΔＩＩＩ由来のペプチド、ＱＲＡＨＧＱＤＬＤＡＬＦＶＫ
ＶＬＲＳＰ（配列番号：４３）およびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ由来のペプチド、
ＱＲＡＨＧＱＤＬＥＳＬＦＨＱＬ（配列番号：４４）をＢｏｃ−（メドプローブ
）またはＦｍｏｃ−（カイロン、リポテック）化学のいずれかを用いて合成した
。

【０１２９】 プラスミド構築および組換え発現 ＧＰ由来物質：他の場合に修飾ｐＥｔ１５ｂベクターのＢａｍＨＩ部位に、対
応する組換えタンパク質を発現するｃＤＮＡをサブクローニングすることにより
（５）、異なるＧＰスプライシング形態を表す構築物を得、ここで開始Ｍｅｔを
除く外来性ベクター由来アミノ末端配列を排除した。ベクターをＮｃｏＩおよび
ＢａｍＨＩで切断することにより余分な配列を除去し、遊離末端をクレノウで埋
め、再度ライゲートした。これにより両方の制限部位を再形成し、アミノ終止Ｍ
ｅｔのコドンのすぐ下流にＢａｍＨＩ部位を置いた。

【０１３０】 ＧＰまたはＧＰΔＶ（配列番号：４６）を表す組換えタンパク質を沈殿により
精製した（５）。ＧＰΔＩＩＩ（配列番号：４８）またはＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／
Ｖ（配列番号：５０）を表す組換えタンパク質を含有する細菌性ペレットを４０
ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）中で８Ｍの尿素、および超音波処理により溶
解した。４００００ｘｇで遠心した後、上澄を０．２２μｍフィルターに通し、
ＦＰＬＣ用にリソースＱカラムに注入した。溶出物をＨＣｌでｐＨ６まで酸性に
し、２回目のＦＰＬＣ精製用に４０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）で予め平衡にしたリ
ソースＳカラムに注入した。得られた溶出物中の物質をｉｎ ｖｉｖｏリン酸化
に用いた。

【０１３１】 ＭＢＰ由来物質：中枢神経系からの全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによりヒト
ＭＢＰΔＩＩ（配列番号：５１）を表すｃＤＮＡを得た。ヒトＭＢＰを表すｃＤ
ＮＡはＣ．Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉ（ＵＣＬＡ）から進呈された。両方のフラグメ
ントをＣ末端で６ｘＨｉｓコーディング配列を含有するｐＨＩＬ−Ｄ２（インビ
トロゲン）の修飾体にクローニングし、各々ｐＨＩＬ−ＭＢＰΔＩＩ−Ｈｉｓお
よびｐＨＩＬ−ＭＢＰ−Ｈｉｓを作った。（１２）に記載するようにこれらのプ
ラスミドを用いて組換え体をＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに発現させた。固
定金属アフィニティクロマトグラフィ（ＴＡＬＯＮ樹脂、クロンテック）を用い
て、変性条件下（８Ｍ 尿素）組換えタンパク質を精製し、製造者の指示書に従
って３００ｍＭ イミダゾールで溶出した。次いでアフィニティ精製物質を５０
ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＤＴＴの８０容量に希釈することにより復元し、ＹＭ１０型膜（
アミコン）を通して限外濾過することにより５０倍に濃縮した。クロンテックの
形質転換体変異誘発キットを用いて構築物を含有する元来の配列で位置指定変異
誘発によりＳｅｒからＡｌａへの変異体を作り、その結果得られるタンパク質は
同様に製造された。

【０１３２】 リン酸化実験。基本的に前記のように（３および１２も参照のこと）リン酸化
実験を行った。いくつかの実験では基質をインブロット復元し、次いでｒＧＰＢ
Ｐ０．５μｇを含有するリン酸化バッファー１００μｌを積層することにより、
室温で３０分間リン酸化した。Ｖ８エンドペプチターゼを用いる消化および免疫
沈澱を（３）に記載するように実施した。

【０１３３】 抗体生成。各々配列番号：４３または配列番号：４４に含まれるＧＰΔＩＩＩ
またはＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／ＶのＣ末端分岐末端を表す合成ペプチドをグルタル
アルデヒドカップリング標準法を用いてチトクロームＣ、ＢＳＡまたはオブアル
ブミンに抱合させた。得られたタンパク質抱合体をマウス免疫に用いてＧＰΔＩ
ＩＩに特異的なポリクローナル抗体およびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖに特異的なモ
ノクローナル抗体（Ｍａｂ１５３）を得た。ＧＰΔＶに特異的なモノクローナル
抗体（Ｍａｂ５Ａ）を得るために、配列番号５０を含んだ対応する代替型を表現
する組換え細菌性タンパク質を用い、マウスを免疫した。ＧＰ代替体のＮ末端領
域を表す配列番号２６に対するモノクローナル（Ｍ３／１、Ｐ１／２）またはポ
リクローナル（抗ＧＰｐｅｐ１）抗体の生成については前記した（３、５）。

【０１３４】 Ｂｏｃ基に基づくペプチド合成 構築。Ｂｏｃ−ベンジル法を用いて段階的固相合成によりペプチドを構築した
。用いた出発樹脂はＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＰＡＭ樹脂（０．５６ｍｅｑ／ｇ、Ｒ４１
０８バッチ）であった。用いた脱保護／カップリング方法は：ＴＦＡ（１ｘ１分
）、ＴＦＡ（１ｘ３分）、ＤＣＭ（フローフラッシュ）、イソプロピルアルコー
ル（１ｘ３０秒）、ＤＭＦ（３ｘ１分）、カップリング／ＤＭＦ（１ｘ１０分）
、ＤＭＦ（１ｘ１分）、カップリング／ＤＭＦ（１ｘ１０分）、ＤＭＦ（２ｘ１
分）、ＤＣＭ（１ｘ１分）：であった。各ステップでペプチド樹脂グラムあたり
１０ｍｌを用いた。ＤＭＦ中ＢＯＰ、ＨｏｂｔおよびＤＩＥＡの存在下全アミノ
酸（５倍過剰）のカップリングを実施した。以下の側鎖保護基を合成するために
：セリンにベンジル；リジンに２クロロベンジルオキシカルボニル；アスパラギ
ン酸およびグルタミン酸にはシクロヘキシル；ヒスチジンおよびアルギニンには
トシル：を用いた。

【０１３５】 切断。樹脂からペプチドを切断し、液体フッ化水素（ＨＦ）と反応させること
により十分に脱保護した：ペプチド樹脂グラムあたりＨＦ１０ｍｌを加え、捕捉
剤としてｐ−クレゾールの存在下で、混合物を０℃下４５分間保持した。ＨＦを
蒸発させた後、粗製反応混合物をエーテルで洗浄し、ＴＦＡに溶解し、エーテル
で沈殿させ、乾燥した。

【０１３６】 精製。固定相：シリカＣ１８、１５μｍ、１２０Ａ；移動相：溶媒Ａ：水０．
１％ ＴＦＡおよび溶媒Ｂ：アセトニトリル／Ａ、６０／４０（容量／容量）；
勾配：２０から６０％線形Ｂで３０分間；流速：４０ｍｌ／分；および検出はＵ
．Ｖ．（２１０ｎｍ）。純度８０％以上の分画をプールし、凍結乾燥した。純度
および同一性の対照を分析用ＨＰＬＣおよびＥＳ／ＭＳにより実施した。最終生
成物の純度は８８％であり、実験上の分子量は２１９２．９であった。

【０１３７】 Ｆｍｏｃ−基盤のペプチド合成 構築。標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いてＰｒｏ−クロロトリチル樹脂（
０．６８５ｍｅｑ／ｇ）で段階的直線的固相によりペプチドを合成した。用いた
脱保護／カップリング方法は：Ｆｍｏｃ ａａ（０．６６ｇ）、ＨＯＢｔ（０．
２６ｇ）、ＤＩＰＣＤＩ（０．２８ｍｌ）で４０分間であり、カイザー試験によ
る対照に従った。試験が陽性であった場合、陰性に変化するまで時間を延長した
。次いでＤＭＦ（３１分）、ピペリジン／ＤＭＦ ２０％（１１分）、ピペリジ
ン／ＤＭＦ ２０％（１５分）およびＤＭＦ（４１分）。側鎖保護体は：アルギ
ニンにＰｍｃ（ペンタメチルクロメーンスルホニル）、リジンにＢｃｃ（ｔｅｒ
ｔ−ブトキシカルボニル）、アスパルギン酸およびセリンにｔＢｕ（ｔｅｒｔ−
ブチル）、並びにヒスチジンにＴｒｌ（トリチル）：であった。

【０１３８】 切断。ペプチドを切断し、処理切断物をＴＦＡ／水 ９０／１０と反応させる
ことにより十分に脱保護した：樹脂グラムあたりＴＦＡ１０ｍｌを加えた。水は
捕捉剤として作用する。２時間後、樹脂を濾過し、得られた溶液を冷ジエチルエ
ーテルで５回沈殿させた。最終沈殿物を乾燥した。

【０１３９】 精製。固定相：クロマシルＣ１８、１０μｍ；移動相：溶媒Ａ：水０．１％Ｔ
ＦＡおよび溶媒Ｂ：アセトニトリル０．１％ＴＦＡ；定組成：２８％Ｂ；流速：
５５ｍｌ／分；検出：２２０ｎｍ。高純度の分画をプールし、凍結乾燥し、第２
巡のＨＰＬＣ精製を行った。純度および同一性の対照を分析用ＨＰＬＣおよびＥ
Ｓ／ＭＳにより実施した。最終生成物の純度は９７％であり、実験上の分子量は
２１９０．９であった。

【０１４０】 結果 代替スプライシングによるヒトＧＰ抗原のリン酸化の制御。１次抗原（ＧＰ）
または個々の代替生成物ＧＰΔＶ（配列番号：４６）、ＧＰΔＩＩＩ（配列番号
：４８）およびＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（配列番号：５０）を表す細菌性組換え
タンパク質を製造し、ＰＫＡによるリン酸化される能力を試験した（図１６、左
のパネル）。標準的なＡＴＰ濃度（１５０μＭ）を使用して四つの組換え抗原全
てがリン酸化されたが、程度は異なった。代替型は１次ＧＰ抗原よりも効率よく ^３２ Ｐを取り込んだが、このことはこれらがよりよい基質であることを示唆して
いる。これらの抗原が細胞外区画にあると考えられるので、より生理学的なＡＴ
Ｐ濃度（０．１から０．５μＭ）でまたリン酸化能力を検定した。これらの条件
下では、１次および代替生成物間の^３２Ｐ組み込みにおける差異がより明確であ
り、これは低ＡＴＰ濃度では１次ＧＰ抗原がキナーゼにはあまりよくない基質で
あることを示した。ＧＰ抗原に存在する三つのＰＫＡリン酸化部位の中で、Ｎ末
端Ｓｅｒ^９およびＳｅｒ^２６が主要なものであり、検定した全ての生成物に共通
である（３、５）。従って、全ポリペプチドのリン酸化で観察された差異はまた
特異的Ｖ８消化および免疫沈澱後に決定されるように個々のＮ末端領域間にも存
在した（図示せず）。これはリン酸化における差異が代替生成物における異なる
Ｃ末端配列の存在によるものであることを強く示唆している。ＧＰΔＩＩＩおよ
びＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／ＶがＧＰΔＶよりも著明に高い^３２Ｐ組み込み率を示し
、これらはより短い分岐Ｃ末端領域を有するので（５）、別個にこれらのＣ末端
配列を表す合成ペプチド（配列番号：４３、配列番号：４４）を用いてさらに元
来の抗原のｉｎ ｖｉｖｏリン酸化における制御的役割を試験した。ＩＶ型コラ
ーゲンは三つの絡み合ったα鎖からなる三量体分子である。基底膜では、二つの
ＩＶ型コラーゲン分子がＮＣ１ドメインを介して集まり、細菌性コラゲナーゼ消
化により溶解できる六量体ＮＣ１構造を生じる（１）。六量体構造の解離により
単量体のＧＰ抗原およびジスルフィド関連の二量体を放出する（１）。以下の一
連の実験のために、細胞外様の低ＡＴＰ濃度の存在下、単量体または六量体の両
方の元来のＧＰ抗原を用いてリン酸化を実施した（図１６、右パネル）。各特異
的ペプチドは存在するが対照ペプチドは存在しない場合（図示せず）、２２ｋＤ
ａの見かけのＭＷを表示する単一のポリペプチドのリン酸化が誘起された。特異
的Ｖ８消化および免疫沈澱により対応するポリペプチドが、以前に特徴づけされ
、ＰＫＡに最適の基質であると同定されたα３（ＩＶ）ＮＣ１の２２ｋＤａの配
座異性体として同定された（１１）。

【０１４１】 代替スプライシングによるＭＢＰのリン酸化の制御。ＭＢＰはＮ末端領域で、
ＧＰ抗原生成物に存在するＮ末端部位（Ｓｅｒ^９）に構造的に類似する２個のＰ
ＫＡリン酸化部位（Ｓｅｒ^８、Ｓｅｒ^５７）を含有する（図１７）。全てのＭＢ
Ｐタンパク質に存在するＳｅｒ^８部位はＧＰ由来のポリペプチドのＳｅｒ^９より
も類似の位置にある。加えて、ＭＢＰおよびＧＰΔＩＩＩＳｅｒ^８およびＳｅｒ ^９ は各々対応するエキソンＩＩに存在する高度に相同なモチーフの１次構造で類
似の距離にある（図１７の曲がった矢印）。ＧＰΔＩＩＩ由来のモチーフはＧＰ
抗原系においてＳｅｒ^９のＰＫＡリン酸化を上方制御するＣ末端分岐領域と一致
する（図１６）。ＭＢＰにおける制御様配列はエキソンＩＩに位置し、最終生成
物中のその存在は代替エキソンスプライシングメカニズムに依存する。従って、
ＧＰΔＩＩＩに構造比較することにより同定されるＭＢＰモチーフはまたＳｅｒ ^８ のＰＫＡリン酸化をも制御できる。我々はＭＢＰおよびＭＢＰΔＩＩ（配列番
号：５４）を表す組換えタンパク質並びに対応するＳｅｒからＡｌａへの変異体
を製造し、エキソンＩに存在する２個のＰＫＡリン酸化部位の各々（Ｓｅｒ^８お
よびＳｅｒ^９）をノックアウトした。続いてＰＫＡによるｉｎ ｖｉｔｒｏリン
酸化を評価した（図１８）。ＭＢＰΔＩＩはＭＢＰよりも良好な基質であり、Ｓ
ｅｒ^８は主要なリン酸化部位であり、これはＧＰ抗原系に類似して、代替エキソ
ンスプライシングが全てのＭＢＰ由来代替形態に共通するＮ末端領域に位置する
特異的部位のＰＫＡリン酸化を制御することを示した。

【０１４２】 組換えＭＢＰタンパク質のＧＰＢＰリン酸化を評価する類似の実験では、ＧＰ
ＢＰは優先的にＭＢＰをリン酸化し、一方ＭＢＰΔＩＩのリン酸化はほとんど観
察されなかった（図１９）。さらに、組換えＳｅｒからＡｌａへの変異体は^３２ Ｐ組み込みにおいて有意な減少を示さず、これはＧＰＢＰが、ＰＫＡとは反対の
方法でＭＢＰ／ＭＢＰΔＩＩをリン酸化し、これらの２個のキナーゼがＭＢＰタ
ンパク質における主要なリン酸化部位を共有しないことを示した。

【０１４３】 これらの全データから、我々はＭＢＰ系においてＰＫＡまたはＧＰＢＰのいず
れかにより、代替スプライシングが特異的セリンのリン酸化を制御すると結論づ
けた。

【０１４４】 ＧＰΔＩＩＩのＣ末端領域を表す合成ペプチドがＧＰＢＰリン酸化に影響する
。ＧＰＢＰ活性に及ぼすＧＰΔＩＩＩのＣ末端領域の影響を評価するために、こ
の領域を表すペプチドを二種の異なる化学反応（ＢｏｃまたはＦｍｏｃ）を用い
て合成し、ＧＰＢＰを含有するリン酸化混合物に別個に添加した（図２０）。Ｂ
ｏｃ基盤の合成ペプチドはＧＰＢＰ自己リン酸化に陽性に影響するが、Ｆｍｏｃ
基盤のものはＧＰＢＰ自己リン酸化を阻止し、これはＧＰおよびＭＢＰ抗原系の
いずれかで、代替生成物に由来する制御配列がＧＰＢＰのキナーゼ活性に影響し
うることを示唆している。

【０１４５】 考察 我々はα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインが二つの異なるメカニズム：１）代替スプ
ライシング（４、５）および２）１次生成物の立体配座異性体形成（１１）によ
り複雑な構造多様性を作ることを示した。両方のメカニズムによりＰＫＡにより
区別される生成物が生じるが、これはＰＫＡリン酸化がα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメ
インの生物学において重大な事象であることを示している。リン酸化は少なくと
も部分的な折り畳みのみならず、ＩＶ型コラーゲンネットワークのα３（ＩＶ）
ＮＣ１ドメインの超分子集合体をも導く（１１およびＲａｙａら、結果は未発表
）。α３（ＩＶ）ＮＣ１の配座異性体の変化によりＧＰ病を媒介する自己免疫応
答に至り（１１）、これは抗原リン酸化の変化が疾患の発病における１次的事象
であり得ることを示唆している。従って、いくつかのＧＰ腎臓においてＧＰΔＩ
ＩＩの発現の増加が認められ（４およびＢｅｒｎａｌおよびＳａｕｓ、結果は未
発表）、および別のグッドパスチャー患者においてＧＰＢＰの発現の増加が検出
された（図１５）。代替ＧＰ抗原生成物の、およびＧＰＢＰの両方の発現増加は
α３（ＩＶ）ＮＣ１のリン酸化の安定した状態、従って対応する立体配座形成過
程にある結果であると考えられる。ＰＫＡによる異なる構造生成物間の区別はこ
のキナーゼ、または別の構造的に類似するキナーゼが生理学的抗原立体配座形成
過程に関与し、ＧＰＢＰによる抗原リン酸化が発病原因の重要性を有することが
強く示唆される。発病過程においてＧＰＢＰは介入性のキナーゼであり、リン酸
化依存的立体配座形成過程に干渉する。従って、天然の自己免疫応答により標的
化される組織構造においてＧＰＢＰが発現され、ＧＰＢＰの発現増加はいくつか
の自己免疫状態に関係する（前記の実施例１および２を参照のこと）。

【０１４６】 代替スプライシングメカニズムはまたＭＢＰ抗原系において特異的セリンのＰ
ＫＡリン酸化を制御する。ＭＢＰはまたＧＰＢＰの基質であり、これはＧＰＢＰ
が多発性硬化症、およびその他の自己免疫応答において病因的役割を果たし得る
ことを示唆している。

【０１４７】 前記の全データによりＧＰＢＰが自己免疫疾患の治療に可能性のある標的とし
て同定される。図２０ではＧＰΔＩＩＩ（配列番号：４３）のＣ末端領域を表す
合成ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＰＢＰの作用を変調することを示し、従っ
てこの、および関連の配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＰＢＰの活性を変調するため
のペプチド基盤の化合物として同定された。ＰＫＡによるＧＰ抗原リン酸化の誘
導はＢｏｃ基盤のペプチドを用いたときに達成されたが、類似のＦｍｏｃ基盤の
ペプチドを用いたときには達成されなかった。さらに、Ｆｍｏｃ基盤ではなくＢ
ｏｃ基盤のペプチドはＰＫＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ基質であり（図示せず）、これ
は両方の生成物間に重要な構造上の差異が存在することを示している。両生成物
が質量分析法において有意な差異を示さなかったので、一つの可能性は、用いた
異なる脱保護方法が生物学的活性に重大な２次構造における立体配座の差異の原
因となり得るということである。従って、Ｂｏｃ基盤のペプチドは低温で長期保
存したとき、ＰＫＡを誘起する能力を喪失する。

【０１４８】 実施例３の参考文献 １ Ｓａｕｓ， Ｊ．（１９９８）グッドパスチャー症候群について：Ｅｎｃｙ
ｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第二版，Ｖｏｌ． ２，Ｄｅ
ｌｖｅｓ， Ｐ．Ｊ．およびＲｏｉｔｔ， Ｉ．Ｍ．編，（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，ロンドン），ｐｐ． １００５−１０１１． ２ Ｑｕｉｎｏｎｅｓ， Ｓ．， Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｇａｒｃｉａ−
Ｓｏｇｏ， Ｍ．， Ｅｌｅｎａ， Ｓ．Ｆ．およびＳａｕｓ， Ｊ．（１９９
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１９７８０−１９７８４ ３ Ｒｅｖｅｒｔ， Ｆ．， Ｐｅｎａｄｅｓ Ｊ．Ｒ．， Ｐｌａｎａ， Ｍ
．， Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｃ．， Ｉｔａｒｔｅ
， Ｅ．， Ｃｅｒｖｅｒａ， Ｊ．， Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr， Ｊ．， Ｑ
ｕｉｎｏｎｅｓ， Ｓ．およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７０，１３２５４−１３２６１ ４ Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｑｕｉｎｏｎｅｓ， Ｓ．およびＳａｕｓ， Ｊ
．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１２０９０−１２０９４ ５ Ｐｅｎａｄｅｓ Ｊ．Ｒ．， Ｂｅｒｎａｌ， Ｄ．， Ｒｅｖｅｒｔ，
Ｆ．， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ， Ｃ．， Ｆｒｅｓｑｕｅｔ， Ｖ．Ｊ．，
Ｃｅｒｖｅｒａ， Ｊ．， Ｗｉｅｓｌａｎｄｅr， Ｊ．， Ｑｕｉｎｏｎｅ
ｓ， Ｓ．およびＳａｕｓ， Ｊ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２２９，７５４−７６０． ６ Ｒａｕｓ， Ｊ．ＣＭ，多発性硬化症について：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第二版，Ｖｏｌ． ３，（Ｄｅｌｖｅｓ， Ｐ
．Ｊ．およびＲｏｉｔｔ， Ｉ．Ｍ．編）１７８６−１７８９（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，ロンドン， １９９８）． ７ Ｐｅｔｔｅ， Ｍ．， Ｆｕｊｉｔａ， Ｋ．， Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，
Ｄ．， Ａｌｔｍａｎｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ， Ｊ．， Ｇｉ
ｅｇｅｒｉｃｈ， Ｇ．， Ｈｉｎｋｋａｎｅｎ， Ａ．， Ｅｐｐｌｅｎ，
Ｊ．Ｔ．， Ｋａｐｐｏｓ， Ｌ．およびＷｅｋｅｒｌｅ， Ｈ．（１９９４）
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７，７９６８−７
９７２ ８ Ｔｓｃｈｉｄａ， Ｔ．， Ｐａｒｋｅｒ， Ｋ．Ｃ．， Ｔｕｒｎｅｒ，
Ｒ．Ｖ．， ＭｃＦａｒｌａｎｄ， Ｈ．Ｆ．， Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ
．およびＢｉｄｄｉｓｏｎ， Ｗ．Ｅ．（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１，１０８５９−１０８６３． ９ Ｃａｍｐａｇｎｏｎｉ， Ａ．Ｔ．（１９８８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．
５１，１−１４． １０ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ， Ｒ．Ｄ．， Ｓａｌｔｉｓｓｉ， Ｄ．およびＰ
ｅｎｄｅｒ， Ｍ．Ｐ．（１９９８）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ． Ｓｃａｎｄ．
９８，１３４−１３５ １１ 米国仮特許出願，出願番号割り当て未定，２０００年２月１１日登録（事
件番号９８，７２３−Ｃ） １２ Ｒａｙａ， Ａ．， Ｒｅｖｅｒｔ， Ｆ．， Ｎａｖａｒｒｏ， Ｓ．
およびＳａｕｓ，Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２６４
２−１２６４９．

【０１４９】 本発明は前記の特定の好ましい態様により制限されない。通常の熟練した当業
者には、本発明の概念から逸脱することなく、開示された好ましい態様に種々の
改変を加えることができるだろう。かかる改変は全て本発明の範囲内であること
を意図する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｎ４’のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列。示した構造上の特徴は５’か
ら３’末端で：元来のクローン（ＨｅＬａ１）に存在するｃＤＮＡは（点線の囲
み）、これはＰＨ相同性ドメイン（黒色）およびＳｅｒ−Ｘａａ−Ｙａａ反復（
灰色）を含有する；２分された核局在化シグナルを含有する予想できる高次らせ
ん構造（開いた囲み）の７個の反復（灰色）；並びにセリンに富むドメイン（灰
色ボックスで埋められている）である。アスタリスクはフレーム停止コドンを示
す。

【図２】 ヒト組織（ノーザンブロット）および真核生物種（サザンブロット）における
ＧＰＢＰの分布。ランダムプライミング^３２Ｐ標識ＨｅＬａ１ ｃＤＮＡプロー
ブを用いて、提示したヒト組織（パネルＡ）からのポリ（Ａ^＋）ＲＮＡのノーザ
ンブロットにおいて、または提示した真核生物種（パネルＢ）からのゲノムＤＮ
Ａのサザンブロットにおいて相同性メッセージを同定した。高度に厳密な条件下
でノーザンハイブリダイゼーションを実施して完全な対合メッセージを検出し、
サザンの低厳密性で誤対合のメッセージを検出できた。変性ゲル電気泳動により
、または同一のロットからの代表的なブロットをヒトβアクチンｃＤＮＡでプロ
ーブする場合、個々のポリＡ＋ＲＮＡの品質および量において評価できる差異は
観察されなかった。数字は用いたＲＮＡまたはＤＮＡマーカーの位置および大き
さをｋｂで示す。

【図３】 翻訳出発部位の実験的決定。Ａ）では一過性の発現に用いられるｐｃ−ｎ４’
およびｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’プラスミドに存在する２個のｃＤＮＡが黒線で示
されている。対応する予想される（ｎ４’）または操作された（ＦＬＡＧ−ｎ４
’）翻訳出発部位の相対位置を示す（Ｍｅｔ）。（Ｂ）では対照（−）、ｐｃ−
ｎ４’、ｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’または（ＦＬＡＧ−ｎ４’）トランスフェクト
した２９３細胞からの抽出物を還元条件下１０％ ゲル中ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供
した。分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア）に移し、指示した抗体で
ブロッティングした。数字および棒線は分子量をｋＤａで、および分子量マーカ
ーの相対位置を各々示す。

【図４】 酵母および２９３細胞からのｒＧＰＢＰの特徴づけ。（Ａ）では酵母ｒＧＰＢ
Ｐの１μｇ（レーン１）または１００μｇ（レーン２および３）を１０％ ゲル
中還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。分離したタンパク質をクーマシーブル
ーで染色する（レーン１）かまたは移動させて抗ＦＬＡＧ抗体（レーン２）かま
たはＭａｂ１４すなわちＧＰＢＰに対するモノクローナル抗体（レーン３）でブ
ロッティングした。（Ｂ）では、ＧＰＢＰ発現酵母からの細胞抽出物をＡのよう
に分析し、各々抗ＦＬＡＧ（レーン１）、抗ＰＳｅｒ（レーン２）、抗ＰＴｈｒ
（レーン３）または抗ＰＴｙｒ（レーン４）モノクローナル抗体でブロッティン
グした。（Ｃ）では酵母ｒＧＰＢＰ（レーン１）、脱リン酸化酵母ｒＧＰＢＰ（
レーン２）または２９３細胞由来のｒＧＰＢＰ（レーン３）のいずれか２００ｎ
ｇをＢのように指示した抗体を用いて分析した。（Ｄ）では類似の量のＨ_３ ^３２ ＰＯ_４標識トランスフェクトされていない（レーン１）、安定したｐｃ−ｎ４’
トランスフェクトされた（レーン２）、一過性のｐｃ−ＦＬＡＧ−ｎ４’発現（
レーン３）２９３細胞を溶解し、指示した抗体で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィにより分析した。分子量マーカーを図３のように数字
および棒線で表す。矢印はｒＧＰＢＰの位置を示す。

【図５】 組換えＧＰＢＰはヒトＧＰ抗原のＮ末端領域を特異的にリン酸化するセリン／
スレオニンキナーゼを含有する。リン酸化を評価するために、酵母ｒＧＰＢＰお
よそ２００ｎｇを［γ］^３２Ｐ−ＡＴＰと共にＧＰ抗原誘導物質の不在下（Ａま
たはＢ）または存在下（Ｃ）インキュベートした。（Ａ）では混合物を還元ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（１０％ ゲル）およびオートラジオグラフィに供した。（Ｂ）で
は混合物を２次元薄層クロマトグラフィによる^３２Ｐホスホアミノ酸分析に供し
た。ニンヒドリン染色ホスホアミノ酸の位置を点線の円で示す。（Ｃ）では指示
したＧＰ誘導物質のリン酸化混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ ゲル）および
オートラジオグラフィによりにより分析する（ＧＰｐｅｐ１およびＧＰｐｅｐ１
Ａｌａ^９）か、またはＭａｂ１７すなわちヒトおよびウシ由来のＧＰ抗原を特異
的に認識するモノクローナル抗体で免疫沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５
％）およびオートラジオグラフィにより分析した（ｒＧＰ、ＧＰ）。ｒＧＰＢＰ
の相対位置（Ａ）、ｒＧＰ抗原および元来のヒトおよびウシＧＰ抗原（Ｃ）を矢
印で示す。数字および棒線は前記の図面のように分子量マーカーを意味する。

【図６】 ｒＧＰＢＰに存在するセリン／スレオニンキナーゼのインブロット復元。酵母
のｒＧＰＢＰ５μｇをインブロット復元した。抗ＦＬＡＧ抗体（レーン１）およ
びオートラジオグラフィにより検出される切片上^３２Ｐ組み込み（レーン２）に
より組換え物質を特異的に同定した。数字および棒線は前記の図面のように分子
量マーカーを意味する。矢印は８９ｋＤａ ｒＧＰＢＰポリペプチドの位置を示
す。

【図７】 ヒト組織におけるＧＰＢＰの免疫学的局在。ＧＰＢＰのＮ末端領域に対するウ
サギ血清（１：５０）を用いてヒト組織においてＧＰＢＰを局在化した。示した
組織は腎臓（Ａ）、糸球体（Ｂ）、肺（Ｃ）、肺胞（Ｄ）、肝臓（Ｅ）、脳（Ｆ
）、精巣（Ｇ）、副腎（Ｈ）、膵臓（Ｉ）および前立腺（Ｊ）である。抗ＧＰＢ
Ｐアフィニティ精製抗体または７個の異なるＧＰＢＰ特異的モノクローナル抗体
からの培養培地のプール（抗ＧＰＢＰ Ｍａｂｓ３、４、５、６、８、１０およ
び１４）を用いて類似の結果が得られた。ウサギ前免疫血清はパラレル対照実験
においていずれの組織構造をも染色しなかった。拡大図はＢおよびＤは１００倍
で、それ以外は４０倍であった。

【図８】 ＧＰＢＰΔ２６はＧＰＢＰのスプライシング変種。（Ａ）正常の骨格筋からの
全ＲＮＡをプライマー５３ｃを用いて逆転写し、続いてプライマー１１ｍ−５３
ｃ（レーン２）または１５ｍ−６２ｃ（レーン４）を用いるＰＣＲに供した。同
一のプライマー対を用いるＧＰＢＰ ｃＤＮＡ含有プラスミドの対照増幅をレー
ン１およびレーン３に示す。左および右の数字は塩基対の分子量を意味する。正
常な筋肉転写物で喪失した領域を同定し、そのヌクレオチド配列（小文字）およ
び推定アミノ酸（大文字）を（Ｂ）に示す。目的のｃＤＮＡ領域を含むゲノムＤ
ＮＡのクローンを配列決定し、その構造を（Ｃ）に描き、ＧＰＢＰΔ２６でスプ
ライシングした７８ｂｐエキソン（黒色ボックス）、隣接エキソン（灰色ボック
ス）およびイントロン（線）の位置および相対的な大きさを示す。イントロンお
よびエキソンの両方の大きさが得られ、イントロン−エキソン境界のヌクレオチ
ド配列を示し、５’および３’スプライシング部位のコンセンサスを太字で示す
。

【図９】 ＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の差次的発現。７８ｂｐエキソン（ＧＰＢＰ）
または両方のアイソフォーム（ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６）に共通の隣接配列を
示すフラグメントを^３２Ｐ標識し、これを用いてヒト組織および腫瘍の培養細胞
株ノーザンブロット（クロンテック）をハイブリダイズした。膜を最初にＧＰＢ
Ｐ特異的プローブでハイブリダイズし、剥離し、次いでＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２
６プローブで再分析した。洗浄条件はＧＰＢＰ特異的プローブ用（０．１％ Ｓ
ＳＰＥ、３７℃または５５℃）にはＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６各々のシグナ
ルを増強するＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６（０．１％ ＳＳＰＥ、６８℃）用ほど
厳密ではない。洗浄プログラムが６８℃の場合、ＧＰＢＰプローブではシグナル
が検出されなかった（図示せず）。

【図１０】 ＧＰＢＰΔ２６はＧＰＢＰよりも低いリン酸化活性を示す。（Ａ）組換え発現
、アフィニティ精製ＧＰＢＰ（ｒＧＰＢＰ）（レーン１）またはｒＧＰＢＰΔ２
６（レーン２）を還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クーマシーブルー染色す
る（レーンあたり２μｇ）かまたはＦＬＡＧ配列（α−ＦＬＡＧ）またはＧＰＢ
Ｐ／ＧＰＢＰΔ２６（Ｍａｂ１４）を認識するモノクローナル抗体でブロッティ
ング（レーンあたり２００ｎｇ）した。（Ｂ）ｒＧＰＢＰ（レーン１）またはｒ
ＧＰＢＰΔ２６（レーン２）２００ｎｇを、基質を用いずにｉｎ ｖｉｔｒｏリ
ン酸化し、自己リン酸化を評価する（左）かまたは、５ナノモルＧＰｐｅｐ１を
用いてトランスリン酸化活性（右）を測定した。矢印はペプチドの位置を示す。
（Ｃ）ｒＧＰＢＰ（レーン１）またはｒＧＰＢＰΔ２６（レーン２）３μｇを材
料および方法で記載するようにインブロット復元した。数字および棒線は各々分
子量をｋＤａで、および分子量マーカーの相対位置を示す。

【図１１】 ｒＧＰＢＰおよびｒＧＰＢＰΔ２６は非常に活性な高分子量凝集体を形成する
。ｒＧＰＢＰ（Ａ）またはｒＧＰＢＰΔ２６（Ｂ）約３００μｇを材料および方
法で記載したゲル濾過ＨＰＬＣに供した。垂直方向の矢印および数字は各々用い
た分子量標準の溶出プロフィールおよび分子量（ｋＤａ）を示す。大きな凝集体
は空隙容量で溶出され（Ｉ）、サンプルに存在する物質の大部分は６６９および
１５８ｋＤａマーカーの間の第２のピークとしてカラムの分画範囲に溶出された
（ＩＩ）。指示した微小分画の１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブ
ルー染色に供した。同一分画の５μｌを材料および方法に記載するようにｉｎ
ｖｉｔｒｏリン酸化し、ＳＤＳサンプルバッファー中沸騰させることにより反応
を停止させる。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ＰＶＤＦに移し、コダックＸ
−オーマットフィルムを用いて１または２時間オートラジオグラフィに供し、抗
ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマ）を用いてブロッティングした。

【図１２】 酵母２ハイブリッド系によるＧＰＢＰおよびＧＰＢＰΔ２６の自己相互作用。
（Ａ）指示した組み合わせのプラスミドでトランスフェクトした細胞をロイシン
トリプトファン欠損培地（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ）で選別し、別個の形質転換体を
１ｍＭの３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）の存在下または不在下ヒスチジン
欠損プレート（−Ｔｒｐ、−Ｌｅｕ、−Ｈｉｓ）上で再度画線培養し、相互作用
を評価した。画線培養の３日後に写真撮影した。（Ｂ）棒線は４個の別個のβガ
ラクトシダーゼ溶液内アッセイのβガラクトシダーゼの任意のユニットの平均値
を表す。

【図１３】 ＧＰＢＰは内皮および糸球体基底膜に結合して発現される。ヒト筋肉（Ａ）ま
たは腎臓皮質（Ｂ、Ｃ）のパラフィン包埋切片をＧＰＢＰ特異的抗体（Ａ、Ｂ）
またはＭａｂ１８９すなわちヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１に特異的なモノクローナル
抗体（Ｃ）でプローブした。ヒト腎臓の凍結切片（ＤからＦ）をＭａｂ１７すな
わちヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインに特異的なモノクローナル抗体（Ｄ）、Ｇ
ＰＢＰ特異的抗体（Ｅ）、またはＧＰ患者からの血清（Ｆ）でプローブした。対
照血清（ニワトリ前免疫およびヒト対照）はパラレル実験で組織結合性を示さな
かった（図示せず）。

【図１４】 ＧＰＢＰはヒト腎臓皮質において発現するがウシおよびネズミ腎臓皮質では発
現しない。ヒト（Ａ、Ｄ）、ウシ（Ｂ、Ｅ）またはネズミ（Ｃ、Ｆ）腎臓の皮質
をパラフィン包埋し、ＧＰＢＰ特異的抗体（ＡからＣ）またはＧＰＢＰ／ＧＰＢ
ＰΔ２６特異的抗体（ＤからＦ）のいずれかでプローブした。

【図１５】 ＧＰＢＰはいくつかの自己免疫状態で高度に発現される。増幅プログラムにお
いてオリゴヌクレオチド１５ｍおよび６２ｃを用いて、対照の個体から（レーン
１）またはＧＰ患者から（レーン２）の骨格筋全ＲＮＡを図８のようにＲＴ−Ｐ
ＣＲに供した。凍結（ＢからＤ）またはパラフィン包埋（ＥからＧ）ヒト対照皮
膚（Ｂ、Ｅ）またはＳＬＥ（Ｃ、Ｆ）または扁平苔癬（Ｄ、Ｇ）の影響を受けた
皮膚をＧＰＢＰ特異的抗体でプローブした。

【図１６】 ＰＫＡによるＧＰ代替スプライシング生成物のリン酸化。左のパネルでは等モ
ル量のｒＧＰの（レーン１）、ｒＧＰΔＶ（レーン２）、ｒＧＰΔＩＩＩ（レー
ン３）またはｒＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（レーン４）（ＧＰ５００ｎｇと等価）
を指示したＡＴＰ濃度でリン酸化した。全リン酸化反応混合物の５分の１をゲル
電気泳動により分離し、ＰＶＤＦに移し、オートラジオグラフィに供し（図示せ
ず）、四つ全種を認識する特異的モノクローナル抗体であるＭ３／１で、または
個々のＣ末端領域に特異的な抗体を用いてタンパク質をブロッティングした（図
示せず）。矢印は上から下にＧＰ、ＧＰΔＶおよびＧＰΔＩＩＩ−ＧＰΔＩＩＩ
／ＩＶ／Ｖの各組換えタンパク質の位置を示し、これらは同一の移動性を表した
。右パネル：精製α３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインまたはヘキサマーをＧＰΔＩＩＩ
（レーン２）またはＧＰΔＩＩＩ／ＩＶ／Ｖ（レーン３）のいずれかのＣ末端領
域を表すペプチド１０ナノモルの存在下または不在下（レーン１）、ＰＫＡおよ
び０．１μＭ ＡＴＰでリン酸化した。指示する場合、精製α３（ＩＶ）ＮＣ１
ドメインのリン酸化混合物をＶ８消化し、ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインのＮ
末端に特異的な抗体で免疫沈澱させた（３）。棒線および数字は分子量マーカー
の位置および大きさ（ｋＤａ）を示す。

【図１７】 ＧＰΔＩＩＩおよびＭＢＰの配列アラインメント。ＰＫＡのリン酸化部位（囲
み）およびＭＢＰおよびＧＰΔＩＩＩのＳｅｒ８および９の部位に関する構造類
似性を各々示す（下線）。両方の分子種の対応するエキソンＩＩ（曲がった矢印
）の同一性（垂直棒線）および化学的相同性（点線）を示す。コラゲナーゼ切断
部位（７２残基）からのＧＰΔＩＩＩ完全配列を、エキソンＩおよびエキソンＩ
Ｉの１０個の残基を含むＭＢＰの６９Ｎ末端残基で整列させた。

【図１８】 ＰＫＡによる組換えＭＢＰタンパク質のリン酸化。約２００ｎｇのｒＭＢＰ（
レーン１）、もしくは８位置（レーン２）もしくは５７位置（レーン３）でのそ
れのＳｅｒからＡｌａへの変異体、またはｒＭＰＢΔＩＩ（レーン４）もしくは
８位置（レーン５）もしくは５７位置（レーン６）でのそれのＳｅｒからＡｌａ
への変異体をＰＫＡおよび０．１μＭ ＡＴＰでリン酸化した。混合物をＳＤＳ
−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、オートラジオグラフィに供し（リン酸化）
、個々の分子種をロッシュモレキュラーバイオケミカルズ（ウェスタン）から入
手のヒトＭＢＰに対するモノクローナル抗体でブロッティングした。

【図１９】 ＧＰＢＰによる組換えＭＢＰタンパク質のリン酸化。約２００ｎｇのｒＭＢＰ
（レーン１）、もしくは８位置（レーン２）もしくは５７位置（レーン３）での
それのＳｅｒからＡｌａへの変異体、またはｒＭＰＢΔＩＩ（レーン４）もしく
は８位置（レーン５）もしくは５７位置（レーン６）でのそれのＳｅｒからＡｌ
ａへの変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、タンパク質を含有す
る部分をポンソーで可視化し、剥離した。固定したタンパク質を材料および方法
で記載したＧＰＢＰで切片上でリン酸化し、オートラジオグラフィに供し（リン
酸化）、続いて図１８のようにブロッティングした（ウェスタン）。

【図２０】 ＧＰΔＩＩＩのＣ末端領域によるＧＰＢＰの制御。約２００ｎｇのｒＧＰＢＰ
を、１５０μＭのＡＴＰを用い、Ｂｏｃ−（レーン２）またはＦｍｏｃ−（レー
ン３）化学反応のいずれかを用いて合成したＧＰΔＩＩＩ誘導ペプチド５ナノモ
ルの存在下または不在下で（レーン１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化した。反応
混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦに移し、オートラジオグラフィに供
して自己リン酸化を評価し、続いて抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（シグマ）を
用いてブロッティングし、存在する組換え物質の量を決定した（ウェスタン）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ 16/18 1/19 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/564 Ｚ 33/53 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/564 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DA77 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 BA61 CA04 CA09 DA03 HA11 HA14 HA17 4B063 QA01 QA08 QA13 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QQ52 QQ79 QR32 QR35 QR48 QR55 QR62 QR77 QS25 QS34 4B064 AG27 CA20 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 DC50 NA14 ZB082 ZB262 4C085 AA03 BB11 CC21 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 EA54 FA74

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７
   、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号
   ：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３および配列番号：２
   ５からなる群から選択される核酸配列に実質的に類似する配列を含む、単離され
   た核酸配列。
2. 【請求項２】 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７
   、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号
   ：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３および配列番号：２
   ５からなる群から選択される核酸配列を含む、単離された核酸配列。
3. 【請求項３】 ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６およびＧＰＢＰｐｅｐ１からなる
   群から選択されるポリペプチド、またはそのフラグメントをコードする配列を含
   む、単離された核酸配列。
4. 【請求項４】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８
   、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番
   号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２および配列番号：２４からなる群か
   ら選択されるタンパク質配列に、実質的に類似するタンパク質配列をコードする
   配列を含む、単離された核酸配列。
5. 【請求項５】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８
   、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番
   号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２および配列番号：２４からなる群か
   ら選択されるタンパク質配列をコードする配列を含む、単離された核酸配列。
6. 【請求項６】 請求項１から５のいずれかに記載の単離された核酸配列を含
   む、組換え発現ベクター。
7. 【請求項７】 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７
   、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号
   ：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３および配列番号：２
   ５からなる群から選択される単離された核酸配列、またはそのフラグメントを含
   む、組換え発現ベクター。
8. 【請求項８】 請求項６または７に記載の組換え発現ベクターでトランスフ
   ェクトした宿主細胞。
9. 【請求項９】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８
   、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番
   号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４またはそのペプチ
   ドフラグメントからなる群から選択される配列に実質的に類似するアミノ酸配列
   を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：
    ８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列
    番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４またはそのペプ
    チドフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実質的に精製
    されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６およびＧＰＢＰｐｅｐ１からな
    る群から選択されるポリペプチド、またはそのペプチドフラグメントを含む、実
    質的に精製されたタンパク質。
12. 【請求項１２】 請求項９から１１のいずれかに記載の実質的に精製された
    タンパク質またはポリペプチドに選択的に結合する抗体。
13. 【請求項１３】 抗体がポリクローナル抗体である請求項１２に記載の抗体
    。
14. 【請求項１４】 抗体がモノクローナル抗体である請求項１２に記載の抗体
    。
15. 【請求項１５】 配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：
    ８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列
    番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４からなる群から
    選択されるタンパク質に実質的に類似するタンパク質の存在を検出する方法であ
    って； ａ）スクリーニングするタンパク質サンプルを調製し； ｂ）スクリーニングするタンパク質サンプルを抗体−抗原複合体形成を促進す
    る条件下で請求項１２から１４のいずれかの抗体と接触させること；および ｃ）抗体−抗原複合体の存在が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６
    、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号
    ：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４か
    らなる群から選択されるタンパク質に実質的に類似するタンパク質の存在を示す
    、抗体−抗原複合体形成の検出； からなる方法。
16. 【請求項１６】 検出が、免疫局在化、免疫蛍光分析、ウェスタンブロット
    分析、ＥＬＩＳＡおよび核酸発現ライブラリースクリーニングからなる群から選
    択される方法を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：
    ７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番
    号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３または配列番号：
    ２５からなる群から選択される核酸に実質的に類似する配列をサンプル中で検出
    する方法であって、サンプルを請求項１から５のいずれかに記載の単離された核
    酸、またはそのフラグメントと接触させること、および複合体形成を検出するこ
    とからなる方法であって、ここで複合体形成は配列番号：１、配列番号：３、配
    列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、
    配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号
    ：２３または配列番号：２５からなる群から選択される核酸に実質的に類似する
    配列の、サンプル中の存在を示す方法。
18. 【請求項１８】 ハイブリダイゼーション、逆転写、ＰＣＲ、逆転写を組み
    合わせたＰＣＲ、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、およびＤＮ
    Ａライブラリースクリーニングからなる群から選択される方法により検出を実施
    する請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 患者の自己免疫状態を検出する方法であって、 患者からの組織または体液サンプルを調製し； 自己免疫状態が存在しない対照組織または体液サンプルを調製し；および 対照サンプルと比較しての組織または体液サンプル中のＧＰＢＰ ＲＮＡまた
    はタンパク質発現の変化の検出であって、ここで対照と相対するＧＰＢＰ ＲＮ
    Ａまたはタンパク質発現の変化は自己免疫状態の存在を示す； ことを含む方法。
20. 【請求項２０】 組織または体液サンプル中のアポトーシスまたは癌形質転
    換が行われている細胞を検出する方法であって、 患者からの組織または体液サンプルを調製し； 正常な対照組織または体液サンプルを調製し；および 対照サンプルと比較して組織または体液サンプル中のＧＰＢＰ ＲＮＡまたは
    タンパク質発現の変化の検出であって、ここで対照と相対するＧＰＢＰ ＲＮＡ
    またはタンパク質発現の変化がアポトーシスまたは癌形質転換が行われている細
    胞の存在を示す； ことを含む方法。
21. 【請求項２１】 自己免疫障害を有する患者においてＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ
    ２６またはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含むタンパク質
    の、発現または活性を改変することからなる、自己免疫障害を有する患者の処置
    方法。
22. 【請求項２２】 腫瘍を有する患者において、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６ま
    たはＧＰＢＰｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含むタンパク質の、発
    現または活性を改変することからなる、腫瘍を有する患者の処置方法。
23. 【請求項２３】 細胞において、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６またはＧＰＢＰ
    ｐｅｐ１に実質的に類似するポリペプチドを含むタンパク質の、発現または活性
    を改変することからなる、細胞アポトーシスを防御する方法。
24. 【請求項２４】 グッドパスチャー抗原のまたはミエリン塩基性タンパク質
    の代替生成物を、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６または実質的にＧＰＢＰｐｅｐ１に
    類似するポリペプチドを含むタンパク質の、発現または活性の改変のために用い
    る、請求項２１、２２または２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列
    番号：５１もしくは配列番号：５３またはそのフラグメントに実質的に類似する
    配列を含む核酸を、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６、または実質的にＧＰＢＰｐｅｐ
    １に類似するポリペプチドを含むタンパク質の、発現または活性を改変するため
    に用いる、請求項２１、２２または２３に記載の方法。
26. 【請求項２６】 配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４６、配列
    番号：４８、配列番号：５０または配列番号：５４に実質的に類似する配列を含
    むポリペプチド、またはそのフラグメントを、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６または
    実質的にＧＰＢＰｐｅｐ１に類似するポリペプチドを含むタンパク質の、発現ま
    たは活性を改変するために用いる、請求項２１、２２または２３に記載の方法。
27. 【請求項２７】 配列番号：４３、配列番号：４４またはそのペプチドフラ
    グメントからなる群から選択される、アミノ酸配列に実質的に類似するポリペプ
    チドをコードする配列を含む、単離された核酸配列。
28. 【請求項２８】 配列番号：４３、配列番号：４４およびそのペプチドフラ
    グメントからなる群から選択される、ポリペプチドをコードする配列を含む、単
    離された核酸配列。
29. 【請求項２９】 請求項２７または２８に記載の単離された核酸配列を含む
    組換え型発現ベクター。
30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の組換え型発現ベクターでトランスフェ
    クトされた宿主細胞。
31. 【請求項３１】 配列番号：４３、配列番号：４４またはそのペプチドフラ
    グメントからなる群から選択される配列に、実質的に類似するアミノ酸配列を含
    む、実質的に精製されたポリペプチド。
32. 【請求項３２】 配列番号：４３、配列番号：４４またはそのペプチドフラ
    グメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリ
    ペプチド。
33. 【請求項３３】 請求項３１または３２に記載の実質的に精製されたタンパ
    ク質またはポリペプチドに選択的に結合する抗体。
34. 【請求項３４】 抗体がポリクローナル抗体である請求項３３に記載の抗体
    。
35. 【請求項３５】 抗体がモノクローナル抗体である請求項３３に記載の抗体
    。
36. 【請求項３６】 配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４６、配列
    番号：４８、配列番号：５０もしくは配列番号：５４またはそのフラグメントか
    らなる群から選択される、ポリペプチド配列に実質的に類似する実質的に精製さ
    れたポリペプチドを投与して、ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６または実質的にＧＰＢ
    Ｐｐｅｐ１に類似するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変す
    ることからなる、請求項２１、２２または２３に記載の方法。
37. 【請求項３７】 配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列
    番号：５１もしくは配列番号：５３またはそのフラグメントに実質的に類似する
    配列、またはそのフラグメントを含む、単離された核酸を投与してＧＰＢＰ、Ｇ
    ＰＢＰΔ２６または実質的にＧＰＢＰｐｅｐ１に類似するポリペプチドを含むタ
    ンパク質の発現または活性を改変することからなる、請求項２１、２２または２
    ３に記載の方法。
38. 【請求項３８】 ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６または実質的にＧＰＢＰｐｅｐ
    １に類似するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変するための
    、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番
    号：５０または配列番号：５４からなる群から選択されるポリペプチド配列また
    はそのフラグメントに、実質的に類似する実質的に精製されたポリペプチドの有
    効量および医薬上許容される担体を含む、医薬用組成物。
39. 【請求項３９】 ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６または実質的にＧＰＢＰｐｅｐ
    １に類似するポリペプチドを含むタンパク質の発現または活性を改変するための
    配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１もしくは配
    列番号：５３からなる群から選択されるポリペプチド配列またはそのフラグメン
    トに実質的に類似する配列を含む、単離された核酸配列の有効量および医薬上許
    容される担体を含む、医薬用組成物。
40. 【請求項４０】 請求項３８または３９に記載の医薬用組成物を投与して、
    ＧＰＢＰ、ＧＰＢＰΔ２６または実質的にＧＰＢＰｐｅｐ１に類似のポリペプチ
    ドを含む、タンパク質の発現または活性を改変することを含む、請求項２１、２
    ２または２３に記載の方法。