ES2254151T3 - Proteina de union al antigeno de goodpasture. - Google Patents
Proteina de union al antigeno de goodpasture.Info
- Publication number
- ES2254151T3 ES2254151T3 ES00911146T ES00911146T ES2254151T3 ES 2254151 T3 ES2254151 T3 ES 2254151T3 ES 00911146 T ES00911146 T ES 00911146T ES 00911146 T ES00911146 T ES 00911146T ES 2254151 T3 ES2254151 T3 ES 2254151T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sec
- gpbp
- baselineskip
- protein
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01037—Protein kinase (2.7.1.37)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Secuencia de ácido nucleico aislado que codifica una proteina cinasa funcional que comprende una secuencia que comparte por lo menos 70% de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº: 9, SEC. ID nº: 11, SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº: 17, SEC. ID nº: 19, SEC. ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 y SEC. ID nº: 25.
Description
Proteína de unión al antígeno de Goodpasture.
Esta solicitud reivindica prioridad para la
solicitud provisional de la patente U.S. nº de serie 60/121.483,
presentada el 24 de febrero de 1999.
Este trabajo fue patrocinado en parte por las
becas SAL91/0513, SAF94/1051 y SAF97/0065 del Plan Nacional I+D de
la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT,
España), beca 93/0343 del Fondo de Investigaciones Sanitarias
(FISss, España) y becas GV-3166/95,
GV-C-VS-21-118-96
de la Direcció General D'Ensenyaments Universitaris i Investigació
(Comunitat Valenciana, España); por consiguiente el Estado de España
puede ostentar derechos en la invención.
La invención se refiere a los campos de las
proteína cinasas, enfermedad autoinmunitaria, apoptosis y
cáncer.
La enfermedad de Goodpasture (GP) es un trastorno
autoinmunitario descrito solamente en el hombre. En los pacientes de
GP, los anticuerpos contra el dominio C-terminal no
colágeno (NC1) de la cadena \alpha3 de colágeno tipo IV
("antígeno de Goodpasture") producen una glomerulonefritis
rápidamente evolutiva y con frecuencia hemorragias pulmonares, las
dos manifestaciones clínicas principales del síndrome GP (véase 1
para estudio. Los números de las referencias en este apartado
corresponden a la lista de referencia del Ejemplo 1).
La idea de que existen episodios patógenos
comunes por lo menos para algunos trastornos autoinmunitarios es
sugerida por el número significativo de pacientes que presentan más
de una enfermedad autoinmunitaria, y también por la vinculación
firme y frecuente que algunas de estas enfermedades presentan a
haplotipos específicos de MHC (31, 32). La observación experimental
de que el autoantígeno es el grupo principal en autoinmunidad y de
que un número limitado de autocomponentes son autoantigénicos (31),
sugiere que estos autocomponentes comparten características
biológicas con consecuencias importantes en auto/no auto
reconocimiento por el sistema inmunitario. Una posibilidad es que la
activación de episodios, alterando autocomponentes diferentes pero
específicos, produciría el tratamiento del antígeno anormal. En
determinados individuos que expresan una especificidad a MHC
determinada, los péptidos anormales podrían ser reconocidos por
linfocitos T no tolerados y desencadenar una respuesta
inmunitaria
(1).
(1).
Se ha explorado anteriormente el antígeno GP para
identificar características biológicas de relevancia en patogénesis
autoinmunitaria. Dado que el dominio NC1 es un dominio muy
conservado entre las especies y entre las diferentes cadenas
\alpha de colágeno tipo IV (\alpha1-\alpha6)
(2), la intervención exclusiva del \alpha3(IV)NC1
humano en una respuesta autoinmunitaria natural sugiere que este
dominio tiene peculiaridades estructurales y/o biológicas de
relevancia patógena. De acuerdo con esto, el terminal N del antígeno
humano es muy divergente y contiene un único motivo de cinco restos
(KRGDS^{9}) que conforma una secuencia de fosforilación funcional
para las proteína cinasas de tipo A (3, 4). Además, el gen \alpha3
humano, pero no los demás genes humanos u homólogos relacionados de
otras especies, está dividido alternativamente y genera múltiples
transcritos que contienen la zona N-terminal
fosforilable (5-7). Recientes estudios indican que
la fosforilación del terminal N del antígeno GP por la proteína
cinasa dependiente de AMPc está regulada por incremento por la
presencia de los productos alternativos (véase el Ejemplo 3 más
adelante). La fosforilación específica de la serina y la división
alternativa del pre-ARNm están también relacionadas
con la biología de los demás autoantígenos incluyendo el receptor de
acetilcolina y la proteína básica mielina (MBP) (4). Esta última se
sospecha que es el principal antígeno en la esclerosis múltiple
(MS), otra enfermedad autoinmunitaria exclusivamente humana en la
cual el sistema inmunitario dirige la materia blanca del sistema
nervioso central. Las enfermedades GP y MS son trastornos humanos
que presentan una fuerte relación con el mismo haplotipo de HLA
clase II (HLA DRB1*1501) (32, 33). Éste, junto con la reciente
publicación de muerte por enfermedad de GP de un paciente de MS que
posee esta especificidad a HLA (34), apoya la existencia de
escenarios patógenos frecuentes en estos trastornos
humanos.
humanos.
Por lo tanto, la fosforilación específica de
serina/treonina puede ser una diferencia biológica principal entre
el antígeno GP humano, los antígenos GP de otras especies y los
dominios homólogos procedentes de otras cadenas \alpha(IV)
humanas, y puede ser importante en la patogénesis (1, 4).
Por consiguiente, la identificación y aislamiento
de la serina/treonina quinasa específica que fosforila la zona
N-terminal del antígeno GP humano presentaría muchas
ventajas en el diagnóstico y el tratamiento del síndrome GP y
posiblemente en otros trastornos autoinmunitarios. La referencia 42
describe polinucleótidos y polipéptidos de GP.
La presente invención satisface la necesidad en
la materia de identificación y aislamiento de una serina/treonina
cinasa que se une específicamente a la única zona
N-terminal del antígeno GP humano y la fosforila. En
otro aspecto, la presente invención proporciona secuencias de ácido
nucleico que codifican varias formas de la proteína de unión al
antígeno de Goodpasture (GPBP), así como vectores de expresión
recombinantes unidos funcionalmente a las secuencias que codifican
GPBP.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona células huésped que han sido transfectadas con los
vectores de expresión recombinantes. En un aspecto adicional, la
presente invención proporciona GPBP sustancialmente purificada y
anticuerpos que se unen selectivamente a GPBP. En otro aspecto aún,
la invención proporciona métodos para detectar la presencia de GPBP
o de ácidos nucleicos que codifican a GPBP.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona métodos para detectar la presencia de una enfermedad
autoinmunitaria o apoptosis, que comprende detectar un aumento de la
expresión de GPBP en un tejido en comparación con un tejido de
referencia.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona métodos y composiciones farmacéuticas para tratar un
trastorno autoinmunitario, apoptosis o un tumor, que comprende
modificar la expresión o actividad de GPBP en un paciente que los
necesita.
Figura 1. Nucleótido y secuencias de
aminoácido derivadas de n4'. Las características estructurales
indicadas están desde el extremo 5' hasta el 3': el ADNc presente en
el clon (HeLa1) original (recuadro de puntos), que contiene el
dominio de homología PH (en negro) y la repetición
Ser-Xaa-Yaa (en gris); la repetición
del septeto de la estructura superenrollada previsible (casilla en
blanco) que contiene la señal de localización nuclear dividida en
dos partes (en gris); y un dominio rico en serina (casilla rellena
de gris). Los asteriscos indican las posiciones de los codones de
terminación en el marco.
Figura 2. Distribución de GPBP en tejidos
humanos (transferencia Northern) y en especies eucarióticas
(transferencia Southern). Se utilizó una sonda de ADNc de HeLa1
marcada con ^{32}P cebada al azar para identificar mensajes
homólogos en una transferencia Northern de
poli(A^{+})ARN procedente de los tejidos humanos
indicados (panel A) o en una transferencia Southern del ADN genómico
de las especies eucarióticas indicadas (panel B). La hibridación
Northern se realizó en condiciones muy severas para detectar los
mensajes de compatibilidad perfecta y a baja severidad en la
transferencia Southern para permitir la detección de los mensajes
con incompatibilidades. No se observaron diferencias apreciables en
la calidad y cantidad de cada poli A + ARN individual al
desnaturalizar la electroforesis en gel o al sondar una
transferencia representativa del mismo lote con ADNc con
\beta-actina humana. Los números indican la
posición y los tamaños en kb de los marcadores ARN o ADN
utilizados.
Figura 3. Determinación experimental de la
secuencia de iniciación de la traducción. En (A), los dos ADNc
presentes en los plásmidos pc-n4' y
pc-FLAG-n4' utilizados para la
expresión temporal están representados en líneas negras. Se indica
(Met) la posición relativa de la correspondiente secuencia de
iniciación de la traducción prevista (n4') o modificada
genéticamente (FLAG-n4'). En (B), los extractos de
las células 293 de referencia (-), pc-n4'(n4') o
pc-FLAG-n4'
(FLAG-n4') transfectadas se sometieron a
SDS-PAGE en condiciones reductoras en geles al 10%.
Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF
(Millipore) y se transfirieron con los anticuerpos indicados. Los
números y barras indican la masa molecular en kDa y las posiciones
relativas de los marcadores de peso molecular, respectivamente.
Figura 4. Caracterización de rGPBP de levadura
y de células 293. En (A), se analizaron 1 \mug (banda 1) o 100
ng (bandas 2 y 3) de rGPBP de levadura por SDS-PAGE
de reducción en un gel al 10%. Las proteínas separadas se tiñeron
con azul Coomassie (banda 1) o se transfirieron y se tiñeron con
anticuerpos anti-FLAG (banda 2) o Mab14, anticuerpo
monoclonal contra GPBP (banda 3). En (B), los extractos celulares de
levadura que expresa a GPBP se analizaron como en A y se tiñeron con
anticuerpos monoclonales anti-FLAG (banda 1),
anti-PSer (banda 2), anti-PThr
(banda 3) o anti-PTyr (banda 4) respectivamente. En
(C), se analizaron como en B 200 ng de rGPBP de levadura (banda 1),
rGPBP de levadura desfosforilada (banda 2) o rGPBP procedente de
células 293 (banda 3) con los anticuerpos indicados. En (D),
cantidades similares de células 293 no transfectadas, marcadas con
H_{3}^{32}PO_{4} (banda 1), transfectadas con
pc-n4' estable (bandas 2) o que expresan a
pc-FLAG-n4' temporal (bandas 3), se
precipitaron con el anticuerpo indicado y se analizaron por
SDS-PAGE y autorradiografía. Los marcadores de peso
molecular están representados con números y barras como en la Figura
3. Las flechas indican la posición del rGPBP.
Figura 5. GPBP recombinante contiene una
serina/treonina cinasa que fosforila específicamente la zona
N-terminal del antígeno humano de GP. Para
evaluar la fosforilación, se incubaron aproximadamente 200 ng de
rGPBP de levadura con [\gamma]^{32}P-ATP
en ausencia (A y B) o presencia de material procedente del antígeno
de GP (C). En (A), se sometió la mezcla a SDS-PAGE
reductora (gel al 10%) y se autorradiografió. En (B), la mezcla se
sometió a análisis de ^{32}P-fosfoaminoácido por
cromatografía en capa fina bidimensional. Los círculos punteados
indican la posición de los fosfoaminoácidos teñidos con ninhidrina.
En (C), las mezclas de fosforilación del material procedente de GP
indicadas se analizaron por SDS-PAGE (gel al 15%) y
autorradiografía (GPpep1 y GPpep1Ala^{9}) o se inmunoprecipitaron
con Mab 17, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente el
antígeno de GP de origen humano y bovino y se analizaron por
SDS-PAGE (12,5%) y autorradiografía (rGP, GP). Las
posiciones relativas de rGPBP (A), antígeno de rGP y los antígenos
de GP humano y bovino naturales (C) están indicados por flechas. Los
números y barras se refieren a los marcadores de peso molecular en
las Figuras anteriores.
Figura 6. Renaturalización en transferencia de
la serina/treonina quinasa presente en rGPBP. Se renaturalizaron
en transferencia cinco microgramos de rGPBP de levadura. El material
recombinante fue identificado específicamente mediante anticuerpos
anti-FLAG (banda 1) y la incorporación de ^{32}P
in situ se detectó por autorradiografía (banda 2). Los
números y barras se refieren a marcadores de peso molecular como en
las Figuras anteriores. La flecha indica la posición del polipéptido
rGPBP de 89 kDa.
Figura 7. Localización inmunológica de GPBP en
tejidos humanos. Se utilizó suero de conejo contra la zona
N-terminal de GPBP (1:50) para localizar GPBP en
tejidos humanos. Los tejidos representados son de riñón (A)
glomérulo (B), pulmón (C), alveolo (D), hígado (E), cerebro (F),
testículos (G), glándulas adrenales (H), páncreas (I) y próstata
(J). Se obtuvieron resultados similares utilizando anticuerpos
anti-GPBP purificados por afinidad o un grupo de
medio de cultivo de siete anticuerpos monoclonales diferentes
específicos de GPBP (Mab anti-GPBP 3, 4, 5, 6, 8, 10
y 14). El suero de conejo preinmune no tiñó ninguna estructura
tisular en los estudios de control en paralelo. La ampliación fue de
40\times excepto en B y D en las que fue de 100\times.
Figura 8. GPBP\Delta26 es una variante de
corte y empalme de GPBP. (A) Se retrotranscribió ARN completo
procedente del músculo del esqueleto normal utilizando cebador 53c y
posteriormente se sometió a PCR con cebadores
11m-53c (banda 2) o 15m-62c
(banda 4). Las amplificaciones de referencia de un plásmido
que contiene ADNc de GPBP utilizando los mismos pares de cebadores
se presentan en las bandas 1 y 3. Los números a la
izquierda y a la derecha se refieren al peso molecular en los pares
de bases. Se identificó la zona que desaparece en el transcrito del
músculo normal y su secuencia de nucleótido (caso inferior) y
la secuencia de aminoácidos deducida (caso superior) se
presenta en (B). Se secuenció un clon de ADN genómico que comprende
la zona del ADNc de interés y su estructura está dibujada en (C),
presentando la posición de las dimensiones relativas del exón de 78
bp cortadas y empalmadas en GPBP\Delta26 (casilla negra),
exones adyacentes (casillas grises) o intrones
(líneas). Se proporciona el tamaño tanto del intrón como de
los exones y se presenta la secuencia de nucleótidos de los límites
intrón-exón, con consenso para las secuencias de
corte y empalme 5' y 3' presentadas en la casilla en
negrita.
Figura 9. Expresión diferencial de GPBP y
GPBP\Delta26. Los fragmentos que representan el exón de 78 bp
(GPBP) o las secuencias adyacentes comunes a ambas isoformas
(GPBP/GPBP\Delta26) se marcaron con ^{32}P y se utilizaron para
hibridar transferencias Northern de la línea celular de tejido
humano y de tumor (CLONTECH). Las membranas se hibridaron en primer
lugar con sonda específica de GPBP, se agotaron y a continuación se
volvieron a analizar con sonda GPBP/GPBP\Delta26. Las condiciones
de lavado fueron menos severas para la sonda específica de GPBP
(SSPE al 0,1%, 37ºC o 55ºC) que para la GPBP/GPBP\Delta26 (SSPE al
0,1%, 68ºC) para aumentar las señales de GPBP y GPBP\Delta26
respectivamente. No se obtuvo ninguna señal detectable para la sonda
de GPBP cuando el programa de lavado era a 68ºC (no
representado).
Figura 10. GPBP\Delta26 presenta menor
actividad de fosforilación que GPBP. (A) GPBP purificada por
afinidad, expresada de modo recombinante (rGPBP) (bandas 1) o
rGPBP\Delta26 (bandas 2) se sometieron a SDS-PAGE
en condiciones reductoras y se tiñeron con azul Coomassie (2 \mug
por banda) o se realizó la transferencia (200 ng por banda) con
anticuerpos monoclonales que reconocen la secuencia FLAG
(\alpha-FLAG) o GBPB/GPBP\Delta26 (Mab14). (B)
200 ng de rGPBP (bandas 1) o rGPBP\Delta26 (bandas 2) se
fosforilaron in vitro sin sustrato para analizar la
autofosforilación (izquierda) o con 5 nmoles de GPpep1 para medir la
actividad de transfosforilación (derecha). Una punta de flecha
indica la posición del péptido. (C) 3 \mug de rGPBP (banda 1) o
rGPBP\Delta26 (banda 2) se renaturalizaron en transferencia como
se describe en Material y Métodos. Los números y barras indican la
masa molecular en kDa y la posición relativa de los marcadores de
peso molecular, respectivamente.
Figura 11. rGPBP y rGPBP\Delta26 forman
agregados muy activos de peso molecular elevado. Se sometieron
aproximadamente 300 \mug de rGPBP (A) o rGPBP\Delta26 (B) a HPLC
con filtración en gel como se describe en Material y Métodos. Las
puntas de flecha verticales y los números indican
respectivamente el perfil de elución y la masa molecular (kDa) de
los patrones de peso molecular utilizados. Los agregados mayores
eluyeron en el volumen vacío (I) y el conjunto del material presente
en las muestras eluyó en el intervalo de fraccionamiento de la
columna como segundo pico entre los marcadores de 669 y 158 kDa
(II). Se sometieron quince microlitros de las fracciones diminutas
indicadas a SDS-PAGE y tinción con azul Coomassie.
Se fosforilaron cinco microlitros de las mismas fracciones in
vitro como se describe en Materiales y Métodos y se interrumpió
la reacción hirviendo en tampón de muestra de SDS. Las fracciones se
cargaron en SDS-PAGE, se transfirieron a PVDF y se
autorradiografiaron durante 1 o 2 horas utilizando películas Kodak
X-Omat y se transfirieron utilizando anticuerpos
monoclonales anti-FLAG (Sigma).
Figura 12. Autointeracción de GPBP y
GPBP\Delta26 evaluada por un sistema de levadura de dos
híbridos. (A) Se seleccionaron células transfectadas para las
combinaciones indicadas de plásmido en medio insuficiente en
leucina-triptófano (-Trp, -Leu), y se
volvieron a sembrar transformantes independientes en placas
deficientes en histidina (-Trp, -Leu, -His) en presencia o
ausencia de 3-amino-triazol 1 mM
(3-AT), para evaluar la interacción. La fotografía
se tomó 3 días después de la siembra. (B) Las barras representan
valores medios en unidades arbitrarias de
\beta-galactosidasa de cuatro
\beta-galactosidasa independientes en ensayos en
solución.
Figura 13. GPBP se expresa asociada a
membranas basales endoteliales y glomerulares. Se sondaron
secciones incrustadas con parafina del músculo (A) o de la corteza
renal (B, C) humanos con anticuerpos específicos de GPBP (A,B) o con
Mab189, anticuerpo monoclonal específico para el
\alpha3(IV)NC1 humano (C). Las secciones congeladas
de riñón humano (D-F) se sondaron con Mab17,
anticuerpo monoclonal específico para el dominio
\alpha3(IV)NC1 (D), anticuerpos específicos para
GPBP (E) o suero de un paciente de GP (F). Los sueros de referencia
(preinmune de pollo y de referencia humano) no presentaron unión al
tejido en estudios paralelos (no representado).
Figura 14. GPBP se expresa en la corteza
cerebral humana pero no en la bovina ni en la murina. La corteza
del riñón humano (A, D), bovino (B, E) o murino (C, F) se
incrustaron en parafina y se sondaron con anticuerpos específicos
para GPBP (A-C) o anticuerpos específicos para
GPBP/GPBP\Delta26 (D-F)
Figura 15. GPBP se expresa mucho en varias
enfermedades autoinmunitarias. El ARN total del músculo del
esqueleto de un individuo de referencia (banda 1) o de un paciente
de GP (banda 2) se sometió a PT-PCR como en la Fig.
8, utilizando los oligonucleótidos 15m y 62c en el programa de
ampliación. Piel de referencia humana (B, E), congelada
(B-D) o impregnada en parafina (E-G)
o piel afectada por SLE (C, F) o líquen plano (D, G) se sondaron con
anticuerpos específicos para GPBP.
Figura 16. Fosforilación de productos de corte
y empalme alternativos de GP por PKA. En el panel izquierdo,
cantidades equimoleculares de rGP (bandas 1), rGP\DeltaV (bandas
2), rGP\DeltaIII (bandas 3) o rGP\DeltaIII/IV/V (bandas 4),
equivalentes a 500 ng de la GP se fosforilaron a las concentraciones
de ATP indicadas. Una quinta parte de la mezcla de reacción de la
fosforilación total se separó por electroforesis en gel y se
transfirió a PVDF, se autorradiografió (representado) y las
proteínas se transfirieron con M3/1, anticuerpo monoclonal
específico que reconoce las cuatro especies (representado) o
utilizando anticuerpos específicos para cada zona
C-terminal individual (no representado). Las puntas
de flecha indican la posición de cada proteína recombinante, desde
la parte superior a la parte inferior, GP, GP\DeltaV y
GP\DeltaIII-GP\DeltaIII/IV/V que presentan las
mismas movilidades. Panel derecho: el dominio
\alpha3(IV)NC1 purificado o el hexámero se fosforiló
con PKA y ATP 0,1 \muM en ausencia (bandas 1) o en presencia de 10
nmoles de péptidos que representan la zona
C-terminal de GP\DeltaIII (bandas 2) o
GP\DeltaIII/IV/V (bandas 3). Donde se indican las mezclas de
fosforilación del dominio de \alpha3(IV)NC1
purificado se digirieron con V8 y se inmunoprecipitaron con
anticuerpos específicos para el terminal N del dominio
\alpha3(IV)NC1 humano (3). Las barras y los números
indican la posición y las dimensiones (kDa) de los marcadores de
peso molecular.
Figura 17. Alineación de la secuencia de
GP\DeltaIII y MBP. Se presentan (subrayadas) las secuencias de
fosforilación para PKA (encasillado) y la similitud estructural para
las secuencias en Ser 8 y 9 de MBP y GP\DeltaIII respectivamente.
Se indica la identidad (barras verticales) y la homología química
(puntos) del exón II correspondiente (flecha curvada) de ambas
especies. La secuencia completa de GP\DeltaIII de la secuencia de
escisión de colagenasa (72 restos) está alineada con los 69 restos
N-terminales de MBP que comprenden el exón I y diez
restos del exón II.
Figura 18. Fosforilación de proteínas de MBP
recombinantes por PKA. Aproximadamente 200 ng de rMBP (banda 1)
o de sus mutantes con Ser a Ala en posición 8 (banda 2) o 57 (banda
3) o rMPB\DeltaII (banda 4) o de sus mutantes con Ser a Ala en
posición 8 (banda 5) o 57 (banda 6), se fosforilaron por PKA y ATP
0,1 \muM. Las mezclas se sometieron a SDS-PAGE, se
transfirieron a PVDF y se autorradiografiaron (fosforilación) y las
especies moleculares individuales se transfirieron con anticuerpos
monoclonales contra MBP humana adquirida en Roche Molecular
Biochemicals (Western).
Figura 19. Fosforilación de proteína MBP
recombinante por GPBP. Aproximadamente 200 ng de rMBP (banda 1)
o de sus mutantes con Ser a Ala en las posiciones 8 (banda 2) o 57
(banda 3) o rMPB\DeltaII (banda 4) o de sus mutantes con Ser a Ala
en posición 8 (banda 5) o 57 (banda 6), se sometieron a
SDS-PAGE, se transfirieron a PVDF y el área que
contiene las proteínas se visualizó con Ponceau y se agotó. Las
proteínas inmovilizadas se fosforilaron in situ con rGPBP tal
como se describe en Materiales y Métodos, se autorradiografió
(fosforilación) y se transfirieron posteriormente como en la Fig.
18 (Western).
Figura 20. Regulación de la GPBP por la zona
terminal C de GP\DeltaIII. Se fosforilaron in vitro
aproximadamente 200 ng de rGPBP con ATP 150 \muM en ausencia
(banda 1) o en presencia de 5 mmoles de péptido procedente de
GP\DeltaIII sintetizado utilizando la química de Boc (banda 2) o
de Fmoc (banda 3). Las mezclas de reacción se sometieron a
SDS-PAGE, se transfirieron a PVDF y se
autorradiografiaron para evaluar la autofosforilación y
posteriormente se realizó la transferencia con anticuerpos
monoclonales anti-FLAG (Sigma) para determinar la
cantidad de material recombinante presente (Western).
Las abreviaturas utilizadas en la presente
memoria son: bp, pares de bases, DTT, ditiotreitol; DMEM, medio de
Eagle modificado por Dulbecco; EDTA, ácido etilendiamintetraacético;
EGTA, ácido etilenglicol-bis(éter
\beta-aminoetílico)
N,N,N',N'-tetraacético; GP, Goodpasture;
rGP\DeltaIII, rGP\DeltaIII/IV/V y rGP\DeltaV, material
recombinante que representa las formas alternativas del antígeno
Goodpasture resultante del corte y empalme de exón III, exón III, IV
y V o exón V, respectivamente; GPBP y rGPBP, proteína natural y
recombinante de unión al antígeno Goodpasture; GPBP\Delta26 y
rGPBP\Delta26, forma alternativa natural y recombinante de la
GPBP; GST, glutatión S-transferasa; HLA, antígenos
de linfocitos humanos; HPLC, cromatografía líquida de alto
rendimiento; Kb, miles de pares de bases; kDa, miles de daltons;
MBP, rMBP, proteína básica mielina natural y recombinante de 21 kDa;
MBP\DeltaII y rMBP\DeltaII, proteína básica mielina natural y
recombinante de 18,5 kDa que procede del corte y empalme del exón
II; MBP\DeltaV y MBP\DeltaII/V, formas alternativas de la
proteína básica mielina procedentes del corte y empalme del exón V y
de los exones II y V, respectivamente; MHC, complejo de
histocompatibilidad principal; NC1, dominio no colágeno; PH,
homología de plecstrina; PKA, proteína cinasa dependiente de cAMP;
PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo; SDS-PAGE,
electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio poliacrilamida;
TBS, solución salina tamponada con tris.
En esta solicitud, a menos que se indique de otro
modo, las técnicas utilizadas pueden basarse en cualquiera de las
referencias varias bien conocidas tales como: Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring
Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods
in Enzymology, vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic
Press, San Diego, CA). "Guide to Protein Purification" en
Methods in Enzymology (M.P. Deutscher, ed., (1990) Academic
Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San
Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,
2ª ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, NY), Gene
Transfer and Expression Protocols, págs.
109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc.,
Clifton, N.J.), y el catálogo de Ambion de 1998 (Ambion, Austin,
TX).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "GPBP" se refiere a la proteína de unión de
Goodpasture e incluye tanto los monómeros como los oligómeros de la
misma. Las secuencias de GPBP humana (SEC. ID nº: 2), de ratón (SEC.
ID nº: 4) y bovina (SEC. ID nº: 6) se proporcionan en la presente
memoria.
Tal como en la presente memoria, la expresión
"GPBP\Delta26" se refiere a la proteína de unión de
Goodpasture eliminada por la secuencia de 26 aminoácidos
representada en la SEC. ID nº: 14, e incluye tanto los monómeros
como los oligómeros de la misma. En la presente memoria se
proporcionan las secuencias de GPBP humana (SEC. ID nº: 8), de ratón
(SEC. ID nº: 10) y bovina (SEC. ID nº: 12).
Tal como se utiliza en la presente memoria la
expresión "GPBPpep1" se refiere al péptido de 26 aminoácidos
representado en la SEC. ID nº: 14 e incluye tanto los monómeros como
los oligómeros del mismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "antígeno de GP" se refiere al dominio \alpha3 NC1
del colágeno de tipo IV.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"MBP" se refiere a la proteína básica mielina.
En un aspecto, la presente invención proporciona
ácidos nucleicos aislados que codifican GPBP, GBPB\Delta26 y
GPBPpep1 y mutantes o fragmentos de los mismos. En una forma de
realización, los ácidos nucleicos aislados comprenden secuencias
sustancialmente similares a la SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID
nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº: 9, SEC. ID nº: 11, SEC. ID nº: 15,
SEC. ID nº: 17, SEC. ID nº: 19, SEC. ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 o
SEC. ID nº: 25, o fragmentos de las mismas.
La expresión "sustancialmente similar" se
utiliza en la presente memoria en relación a la secuencia de
nucleótidos del ADN o ARN, o a la secuencia de aminoácidos de la
proteína, que presenta una o más variaciones conservadoras o no
conservadoras de las secuencias expuestas, incluyendo pero sin
limitarse a deleciones, adiciones o sustituciones, en las que el
ácido nucleico resultante y/o la secuencia de aminoácidos es
funcionalmente equivalente a las secuencias expuestas en la presente
memoria. Las secuencias funcionalmente equivalentes operarán
sustancialmente de la misma manera para producir sustancialmente la
misma proteína expuesta en la presente memoria. Por ejemplo, las
proteínas que codifican los ADN funcionalmente equivalentes que son
las mismas a las dadas a conocer en la presente memoria o que
presentan una o más variaciones de aminoácidos conservadoras, tal
como una sustitución de un resto no polar por otro resto no polar o
un resto cargado para un resto cargado de forma similar. Estos
cambios incluyen los reconocidos por los expertos en la materia como
sustituciones que no alteran sustancialmente la estructura terciaria
de la
proteína.
proteína.
En la práctica, la expresión sustancialmente
similar significa que el ADN que codifica dos proteínas se híbrida a
otra en condiciones de severidad moderada a alta y codifican
proteínas que presentan la misma secuencia de aminoácidos, o
presentan cambios en la secuencia que no alteran su estructura o
función. Tal como se utiliza en la presente memoria, las secuencias
sustancialmente similares de nucleótidos o aminoácidos comparten por
lo menos aproximadamente 70% de identidad, más preferentemente por
lo menos aproximadamente 80% de identidad y lo más preferentemente
por lo menos aproximadamente 90% de identidad. Se reconoce, sin
embargo, que las proteínas (y el ADN o ARNm que codifica dichas
proteínas) que contienen menor nivel de homología que el descrito
anteriormente que aparece como variantes de corte y empalme o que
están modificados por sustituciones de aminoácidos conservadoras (o
sustitución de codones degenerados) se contemplan dentro del alcance
de la presente invención.
Severidad de hibridación se utiliza en la
presente memoria para referirse a las condiciones en las que los
híbridos del ácido nucleico son estables. Como es conocido por los
expertos en la materia, la estabilidad de los híbridos se refleja en
la temperatura de fusión (T_{M}) de los híbridos. T_{M}
disminuye aproximadamente de 1 a 1,5ºC con cada disminución del 1%
de homología de la secuencia. En general, la estabilidad de un
híbrido es función de la concentración del ión sodio y de la
temperatura. Específicamente, la reacción de hibridación se realiza
en condiciones de severidad más baja, seguida de lavados a severidad
variable, pero mayor. La referencia a la severidad de hibridación se
refiere a dichas condiciones de lavado. Por lo tanto, tal como se
utiliza en la presente memoria, severidad moderada se refiere a las
condiciones que permiten la hibridación de aquellas secuencias de
ácido nucleico que forman híbridos estables en SSPE al 0,1% a 37ºC o
55ºC mientras que severidad elevada se refiere a las condiciones que
permiten la hibridación de aquellas secuencias de ácido nucleico que
forman híbridos estables en SSPE al 0,1% a 65ºC. Se entiende que
estas condiciones pueden duplicarse utilizando una variedad de
tampones y temperaturas y que no son necesariamente exactas. La
solución de Denhardt y SSPE (véase, p. ej., Sambrook, Fritsch y
Maniatis, en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989) son bien conocidas por los
expertos en la materia, ya que son otros tampones de hibridación
adecuados.
La secuencia de ácido nucleico aislado puede
comprender un ARN, un ADNc o un clon genómico con uno o más
intrones. La secuencia aislada puede comprender además secuencias
adicionales útiles para activar la expresión y/o purificación de la
proteína codificada, incluyendo pero sin limitarse a las secuencias
poliA, secuencias de Kozak modificadas y a las secuencias que
codifican marcas de epítopo, señales de exportación y señales
secretoras, señales de localización nuclear y señales de
localización de la membrana plasmática.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden
secuencias de ácido nucleico que expresan GPBP, GBPB\Delta26 y
GPBPpep1 y mutantes o fragmentos de los mismos. En una forma de
realización, los vectores comprenden secuencias de ácido nucleico
sustancialmente similares a las secuencias presentadas en SEC. ID
nº: 1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº: 9,
SEC. ID nº: 11, SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº: 17, SEC. ID nº: 19, SEC.
ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 o SEC. ID nº: 25, o fragmentos de las
mismas.
"Vector de expresión recombinante" incluye
vectores que enlazan funcionalmente una zona de codificación del
ácido nucleico o un gen a cualquier activador capaz de efectuar la
expresión del producto génico. La secuencia del activador utilizada
para dirigir la expresión de las secuencias del ácido nucleico
expuestas en un sistema de mamífero puede ser constitutiva (dirigida
por cualquiera de entre una variedad de activadores, que incluyen
pero no se limitan a, CMV, SV40, RSV, actina y EF) o inducible
(dirigida por cualquiera de los numerosos activadores inducibles que
incluyen, pero no se limitan a, tetraciclina, ecdisona, sensible a
esteroides). La construcción de los vectores de expresión para su
utilización en la transfección de células procarióticas es también
bien conocida en la técnica y por lo tanto puede realizarse mediante
técnicas normalizadas. (Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y
Maniatis, en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Gene Transfer and
Expression Protocols, págs. 109-128, ed. E.J.
Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), y el catálogo de
Ambion de 1998 (Ambion, Austin, TX).
El vector de expresión debe ser replicable en los
organismos anfitriones ya sea como un episoma o por integración en
el ADN cromosómico del anfitrión. En una forma de realización
preferida, el vector de expresión comprende un plásmido. Sin
embargo, la invención pretende incluir otros vectores de expresión
que sirven para funciones equivalentes, tales como los vectores
víricos.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona células huésped que han sido transfectadas con los
vectores de expresión recombinantes dados a conocer en la presente
memoria, en la que las células huésped pueden ser procarióticas o
eucarióticas. Las células pueden transfectarse temporal o
establemente. Dicha transfección de los vectores de expresión en
células procarióticas y eucarióticas puede realizarse mediante
cualquier técnica conocida en la materia, incluyendo pero sin
limitarse a las transformaciones bacterianas normalizadas,
coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación o
transfección mediada por liposomas, mediada por DEAE dextrano,
mediada por policationes o mediada por virus. (Véase, por ejemplo,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et
al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press); Culture of
Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2ª ed. (R.I.
Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, NY).
Todavía otro aspecto, la presente invención
proporciona GPBP, GBPB\Delta26 y GPBPpep1 sustancialmente
purificadas y mutantes o fragmentos de las mismas. En una forma de
realización, la secuencia de aminoácidos de la proteína
sustancialmente purificada es sustancialmente similar a las SEC. ID
nº: 2, SEC. ID nº: 4, SEC. ID nº: 6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10,
SEC. ID nº: 12, SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 20, SEC.
ID nº: 22 y SEC. ID nº: 24 o fragmentos peptídicos de las
mismas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "sustancialmente purificada" significa que la
proteína se ha separado de sus medios celulares in vivo. Por
lo tanto, la proteína puede purificarse a partir de fuentes
naturales o la proteína recombinante puede purificarse a partir de
las células huésped transfectadas expuestas anteriormente. En una
forma de realización preferida, las proteínas son producidas por las
células transfectadas dadas a conocer anteriormente y purificadas
utilizando las técnicas habituales. (Véase, por ejemplo,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et
al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)). La proteína
puede también purificarse a partir de fuentes procarióticas o
eucarióticas. En varias formas de realización preferidas
adicionales, la proteína se purifica a partir de células
bacterianas, de levaduras o de mamífero.
La proteína puede comprender secuencias
adicionales útiles para activar la purificación de la proteína, tal
como marcadores de epítopo y señales de transporte. Ejemplos de
dichos marcadores de epítopo comprenden, pero no se limitan a FLAG
(Sigma Chemical, St. Louis, MO), myc (9E10) (Invitrogen, Carlsbad,
CA), 6-His (Invitrogen; Novagen, Madison, WI) y HA
(Boehringer Manheim Biochemicals). Ejemplos de dichas señales de
transporte comprenden, pero no se limitan a, señales de exportación,
señales secretoras, señales de localización nuclear y señales de
localización de membrana plasmática.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona anticuerpos que se unen selectivamente a GPBP,
GPBP\Delta26 o GPBPpep1. En otro aspecto, los anticuerpos se unen
selectivamente a una proteína que comprende una secuencia
seleccionada de entre el grupo constituido por SEC. ID nº: 2, SEC.
ID nº: 4, SEC. ID nº: 6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10, SEC. ID nº:
12, SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 20, SEC. ID nº: 22,
SEC. ID nº: 24, o los fragmentos peptídicos de las mismas. Dichos
anticuerpos pueden producirse por inmunización de un animal
anfitrión con la GPBP completa o con los péptidos antigénicos de la
misma. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.
Los anticuerpos pueden prepararse mediante
métodos bien conocidos, tales como los descritos en Harlow y Lane,
Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988). En un ejemplo, se
recoge suero preinmune antes de la primera inmunización. Las
proteínas sustancialmente purificadas de la invención, o los
fragmentos antigénicos de las mismas, junto con un adyuvante
apropiado, se inyectan en un animal en una cantidad y a intervalos
suficientes para obtener una respuesta inmunitaria. Los animales se
mezclan a intervalos regulares, preferentemente a la semana, para
determinar el título del anticuerpo. Los animales pueden o no
recibir inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial.
Aproximadamente 7 días después de cada inmunización de refuerzo, o
aproximadamente cada semana después de una sola inmunización, se
mezclan los animales, se recoge el suero y se almacenan las
alícuotas a aproximadamente -20ºC. Los anticuerpos policlonales
contra las proteínas y péptidos de la invención pueden purificarse a
continuación directamente pasando el suero recogido del animal a
través de una columna a los que se unen las proteínas relacionadas
con el no antígeno preparadas a partir del mismo sistema de
expresión sin proteínas relacionadas con GPBP.
Pueden producirse anticuerpos monoclonales
extrayendo esplenocitos del animal. (Véase Kohler y Milstein,
Nature 256, 495-497 (1975)). En un ejemplo,
se preparan anticuerpos monoclonales (mAb) de interés inmunizando
ratones endogámicos con las proteínas o péptidos de la invención, o
un fragmento antigénico de los mismos. Los ratones se inmunizan por
vía IP o SC en una cantidad de intervalos suficientes para obtener
una respuesta inmunitaria. Los ratones reciben una inmunización
inicial el día 0 y se dejan descansar durante aproximadamente 3 a
aproximadamente 30 semanas. Se administra a los ratones inmunizados
una o más inmunizaciones de refuerzo o por vía intravenosa (IV). Se
extraen linfocitos de ratones positivos al anticuerpo extirpando los
bazos de ratones inmunizados por procedimientos habituales
conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma mezclando
los linfocitos esplénicos con un socio de fusión apropiado en
condiciones que permitan la formación de hibridomas estables. Las
células productoras del anticuerpo y las células compañeras de
fusión se fusionan en polietilenglicol a concentraciones
comprendidas entre aproximadamente 30% y aproximadamente 50%. Las
células de hibridoma fusionadas se seleccionan por cultivo en medio
de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con hipoxantina,
timidina y aminopterina por procedimientos conocidos en la técnica.
Se recogen los fluidos sobrenadantes de las células positivas del
cultivo y se identifica la producción de anticuerpos mediante un
inmunoanálisis tal como el inmunorradioanálisis en fase sólida. Las
células de hibridoma procedentes de pocillos positivos al anticuerpo
se clonan mediante una técnica tal como la técnica de
agar-agar blando de MacPherson, Soft Agar
Techniques, en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y
Paterson, eds., Academic Press, 1973.
Para generar dicha respuesta al anticuerpo, las
proteínas de la presente invención se formulan específicamente con
un excipiente farmacéuticamente aceptable para administración
parenteral. Dichos adyuvantes aceptables comprenden, pero no se
limitan a, solución completa de Freund, solución incompleta de
Freund, precipitado con alúmina, emulsión agua en aceite que
contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La formulación de
dichas composiciones, incluyendo la concentración del polipéptido y
la selección del vehículo y otros componentes, está comprendida
dentro de la experiencia en la materia.
El término anticuerpo tal como se utiliza en la
presente memoria pretende incluir los fragmentos de anticuerpo del
mismo que son selectivamente reactivos con las proteínas y péptidos
de la invención o los fragmentos del mismo. Los anticuerpos pueden
fragmentarse utilizando técnicas convencionales y los fragmentos
identificados para utilidad de la misma manera descrita
anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden
generarse fragmentos de F(ab')_{2} tratando el anticuerpo
con pepsina. El fragmento de F(ab')_{2} resultante puede
tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos
de Fab'.
En un aspecto adicional, la invención proporciona
métodos para detectar la presencia de las proteínas o péptidos de la
invención en una muestra de proteína, que comprende proporcionar una
muestra de proteína que debe identificarse, poner en contacto la
muestra de proteína que debe identificarse con un anticuerpo contra
las proteínas o péptidos de la invención y detectar la formación de
complejos anticuerpo-antígeno. El antígeno puede ser
policlonal o monoclonal como se describió anteriormente, aunque se
prefieren los anticuerpos monoclonales. Tal como se utiliza en la
presente memoria, la expresión "muestra de proteínas" se
refiere a cualquier muestra que pueda contener las proteínas o
péptidos de la invención, y los fragmentos de los mismos, incluyendo
pero sin limitarse a los tejidos y partes de los mismos, secciones
de tejido, células completas, extractos celulares, muestras de
proteínas purificadas o parcialmente purificadas, fluidos corporales
y bancos de expresión de ácido nucleico. Por consiguiente, este
aspecto de la presente invención puede utilizarse para probar la
presencia de GPBP, GPBP\Delta26, GPBPpep1 o productos alternativos
del antígeno de GP en estas muestras de proteína variadas por
técnicas normalizadas incluyendo, pero sin limitarse a,
inmunolocalización, análisis de inmunofluorescencia, análisis de
transferencia Western, ELISA y cribado del banco de expresión del
ácido nucleico, (véase por ejemplo, Sambrook et al., 1989).
En una forma de realización, las técnicas pueden ser cuantitativas y
proporcionar información acerca de la cantidad relativa de la
proteína o péptido de interés en la muestra. Con fines
cuantitativos, se prefieren los ELISA.
La detección de la formación de inmunocomplejos
entre las proteínas o péptidos de la invención, o los fragmentos de
los mismos, y los anticuerpos o fragmentos de los mismos, puede
realizarse por técnicas de detección normalizadas. Por ejemplo, la
detección de inmunocomplejos puede realizarse utilizando anticuerpos
marcados o anticuerpos secundarios. Dichos métodos, que incluyen la
selección del marcador son conocidos por los expertos en la materia
(Harlow y Lane, supra). Como alternativa, los anticuerpos
policlonales o monoclonales pueden acoplarse a una sustancia
detectable. El término "acoplado" se utiliza para dar a
entender que la sustancia detectable está físicamente ligada al
anticuerpo. Las sustancias detectables adecuadas comprenden varios
enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales
luminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas
adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano picante, fosfatasa
alcalina, \beta-galactosidasa o
acetilcolinesterasa. Ejemplos de complejos con grupo prostético
adecuado comprenden la estreptavidina/biotina y avidina/biotina.
Ejemplos de materiales fluorescentes adecuados comprenden
umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,
diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o
ficoeritrina. Un ejemplo de material luminiscente incluye luminol.
Ejemplos de material radioactivo adecuado incluyen ^{125}I,
^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.
Dichos métodos de detección son útiles para
varios fines, incluyendo pero sin limitarse a la detección de una
enfermedad autoinmunitaria, la identificación de células dirigidas
para apoptosis o que experimentan la misma, inmunolocalización de
las proteínas de interés en una muestra de tejido, análisis de
transferencia Western e identificación de las bibliotecas de
expresión para hallar las proteínas relacionadas.
En otro aspecto no obstante, la invención
proporciona métodos para detectar la presencia en una muestra de
secuencias de ácido nucleico que codifican la GPBP, GPBP\Delta26,
GPBPpep1 o productos alternativos del antígeno GP que comprenden
proporcionar una muestra de ácido nucleico que debe identificarse,
poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico
procedente de las secuencias de ácido nucleico aisladas de la
invención o fragmentos de las mismas, y detectar la formación del
complejo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "muestra" se refiere a cualquier muestra que pueda
contener ácido nucleico relacionado con GPBP, incluyendo pero sin
limitarse a los tejidos y partes de los mismos, secciones de tejido,
células completas, extractos celulares, muestras de ácido nucleico
purificado o parcialmente purificado, bancos de ADN y fluidos
corporales. Por consiguiente, este aspecto de la presente invención
puede utilizarse para probar la presencia de ARNm o ADN con GPBP en
estas varias muestras por técnicas normalizadas incluyendo, pero sin
limitarse a, hibridación in situ, transferencia Northern,
transferencia Southern, cribado del banco de ADN, reacción en
cadena de polimerasa (PCR) o transcripción
inversa-PCR (RT-PCR). (Véase por
ejemplo, Sambrook et al., 1989). En una forma de realización,
las técnicas pueden determinar solamente la presencia o ausencia del
ácido nucleico de interés. Como alternativa, las técnicas pueden ser
cuantitativas y proporcionar información acerca de la cantidad
relativa de la proteína o péptido de interés en la muestra. Con
fines cuantitativos, se prefieren la PCR cuantitativa y
RT-PCR. Por esta razón, en un ejemplo, el ARN se
aísla de una muestra y se pone en contacto con un oligonucleótido
procedente de la secuencia de ácido nucleico de interés, junto con
la transcriptasa inversa en un tampón adecuado y condiciones de
temperatura que produzcan los ADNc del ARN relacionado con GPBP. El
ADNc se somete a continuación a PCR utilizando pares de cebadores
procedentes de las secuencias de ácido nucleico de interés. En una
forma de realización preferida, se diseñan cebadores para detectar
la presencia del producto de expresión de ARN de SEC. ID nº: 5, y la
cantidad de expresión génica de GPBP en la muestra se compara con el
nivel en una muestra de referencia.
Para detectar la secuencia del ácido nucleico de
interés, pueden utilizarse técnicas de marcado habituales para
marcar la sonda, el ácido nucleico de interés o el complejo entre la
sonda y el ácido nucleico de interés, incluyendo, pero sin limitarse
a las técnicas de radiomarcado, marcado con enzimas, marcado por
quimioluminiscencia o marcado con avidina o biotina, todas las
cuales son bien conocidas en la materia. (Véanse, por ejemplo,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et
al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene
Expression Technology (Methods in Enzymology, vol. 185, editado
por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA); PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et
al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)).
Dichos métodos de detección del ácido nucleico
son útiles para varios fines, incluyendo pero sin limitarse al
diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria, la identificación de
células dirigidas a apoptosis o que experimentan la misma,
hibridación in situ, análisis de transferencia Northern y
Southern y cribado de un banco de ADN.
Como se demuestra en los siguientes ejemplos,
GPBP presenta la expresión preferencial en estructuras tisulares que
están normalmente dirigidas a respuestas autoinmunitarias naturales
y se expresa en gran medida en varias enfermedades autoinmunitarias,
incluyendo pero sin limitarse al síndrome de Goodpasture (GP), lupus
eritematoso diseminado (SLE) y liquen plano. Además, después de un
método experimental similar al descrito a continuación, las
proteínas recombinantes que representan autoantígenos en la
enfermedad de GP (colágeno \alpha3 de tipo IV), SLE (fosfoproteína
ribosómica P1 y ribonucleoproteínas nucleares pequeñas
Sm-D1) y dermatosis
(histididil-ARNt sintetasa) se demostró que son
sustratos de GPBP in vitro.
Por lo tanto, en una forma de realización
preferida, se utiliza la detección de la expresión de GPBP para
detectar una enfermedad autoinmunitaria. Se compara la expresión de
GPBP en una muestra que se está probando con una muestra de
referencia, en la que un aumento de nivel de la expresión de GPBP
indica la presencia de una enfermedad autoinmunitaria. En esta forma
de realización, es preferible utilizar anticuerpos que se unen
selectivamente a GPBPpep1, que está presente en GPBP pero no en
GPBP\Delta26.
Además, como se demuestra en los ejemplos
adjuntos, GPBP está regulada por disminución en las líneas celulares
tumorales y los datos sugieren que GPBP/GPBP\Delta26 son similares
a los involucrados en la célula que señala la serie de reacciones
que producen apoptosis, que pueden ser regulados por incremento
durante la patogénesis autoinmunitaria y regulados por disminución
durante la transformación celular para prevenir el ataque
autoinmunitario a las células transformadas durante el crecimiento
del tumor. Por esta razón, los métodos de detección dados a conocer
en la presente memoria pueden utilizarse para detectar las células
que son dirigidas para la apoptosis o están experimentando la
misma.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria, un
tumor o para prevenir la apoptosis celular que comprende la
modificación de la expresión o actividad de GPBP, GPBP\Delta26 o
una proteína que comprende un polipéptido sustancialmente similar a
GPBPpep1 en un paciente que los necesita. La modificación de la
expresión o actividad de GPBP, GPBP\Delta26 o de una proteína que
comprende un polipéptido sustancialmente similar a GPBPpep1 puede
realizarse utilizando inductores específicos o inhibidores de la
expresión o actividad de GPBP, anticuerpos de GPBP, terapia génica o
proteica utilizando GP o productos alternativos de la proteína
básica mielina, terapia celular utilizando células huésped que
expresan GP o productos alternativos de la proteína básica mielina,
terapia de cadena complementaria u otras técnicas conocidas en la
materia. En una forma de realización preferida, el método comprende
además administrar un producto alternativo sustancialmente
purificado del antígeno GP o MBP para modificar la expresión o
actividad de GPBP, GPBP\Delta26 o una proteína que comprende un
polipéptido sustancialmente similar a GPBPpep1. Tal como se utiliza
en la presente memoria, "modificación de la expresión o
actividad" se refiere a modificar la expresión o actividad del
ARN o del producto proteico.
En un aspecto adicional, pueden utilizarse las
composiciones farmacéuticas, que comprenden una cantidad eficaz de
productos alternativos sustancialmente purificados del antígeno GP o
de MBP para modificar la expresión o actividad del ARN de GPBP o la
proteína y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Para su administración, el agente activo se
combina normalmente con uno o más adyuvantes apropiados para la vía
de administración indicada. Los compuestos pueden mezclarse con
lactosa, sacarosa, almidón en polvo, ésteres de celulosa de ácidos
alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de
magnesio, sales de sodio y de calcio de los ácidos fosfórico y
sulfúrico, acacia, gelatina, alginato de sodio, polivinilpirrolidina
y/o alcohol polivinílico, y comprimirse o encapsularse para su
administración convencional. Como alternativa, los compuestos de la
presente invención pueden disolverse en solución salina, agua,
polietilenglicol, propilenglicol, soluciones coloidales de
carboximetilcelulosa, etanol, aceite de maíz, aceite de cacahuete,
aceite de semillas de algodón, aceite de sésamo, goma de tragacanto
y/o varios tampones. Otros adyuvantes y modos de administración son
bien conocidos en la técnica farmacéutica. El excipiente o diluyente
puede comprender material retardante, tal como monoestearato de
glicerilo o diestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo
o con una cera u otros materiales bien conocidos en la técnica.
La presente invención puede comprenderse mejor
con relación a los ejemplos adjuntos que se destinan a título de
ilustración solamente y no debería considerarse que limitan el
alcance de la invención, tal como se define en las reivindicaciones
adjuntas a esta memoria.
Se describe aquí la clonación y caracterización
de un nuevo tipo de serina/treonina cinasa que se une
específicamente a la única zona N-terminal del
antígeno de GP humano y fosforila la misma.
Péptidos. GPpep1, KGKRGDSGSPATWTTRGFVFT
(SEC. ID nº: 26), que representan los restos 3 al 23 del antígeno de
GP humano y GPpep1Ala^{9}, KGKRGDAGSPATWTTRGFVFT (SEC. ID nº: 27),
un mutante Ser^{9} a Ala^{9} del mismo, se sintetizaron mediante
MedProbe y CHIRON. El péptido FLAG era de Sigma.
Oligonucleótidos. Los siguientes
oligonucleótidos así como varios otros específicos de GPBP se
sintetizaron por Genosys y GIBCO BRL:
Varios bancos de expresión de ADNc de
\lambda-gt11 humano (ojo, fetal y pulmón de
adulto, riñón y HeLa S3, de CLONTECH) se sondaron para los ADNc que
codifican proteínas que interactúan con GPpep1. Filtros de
nitrocelulosa (Millipore) preparados siguiendo los procedimientos de
inmunocribado habituales se bloquearon e incubaron con 1 a 10 nmoles
por ml de GPpep1 a 37ºC. Se detectó GPpep1 unido específicamente
utilizando anticuerpos monoclonales M3/1A (7). Se identificó un
único clon en el banco procedente de HeLa (HeLa1). La especificidad
de unión de la proteína de fusión se confirmó mediante la unión
similar al antígeno de GP humano eucariótico recombinante. Se
utilizó la inserción por el ADNc de EcoRI de HeLa1 (0,5 kb) para
cribar más el mismo banco y aislar los ADNc solapantes. El ADNc
mayor (2,4 kb) que contiene el ADNc completo de HeLa1 (n4') se
secuenció completamente.
Se sondaron las transferencias Northern y
Southern (CLONTECH) con ADNc de HeLa1 siguiendo las instrucciones
del fabricante.
Material procedente de GPBP. Se expresó el
clon original HeLa1 de \lambda-gt11 como lisogén
en Y1089 de E. coli (8). La proteína de fusión derivada de
\beta-galactosidasa correspondiente que contiene
150 restos del N-terminal de GPBP se purificó a
partir del lisado celular utilizando una columna de agarosa con APTG
(Boehringer). El fragmento de 2,4 kb de EcoRI de n4' se subclonó en
el vector Bluescript M13+ (Stratagene) (BS-n4'), se
amplificó y se utilizó para la clonación posterior. Un fragmento de
ADN que contiene (desde 5' a 3'), una secuencia de restricción de
EcoRI, un consenso de Kozak de referencia para iniciación de la
traducción, una zona de codificación para una secuencia peptídica de
marcador (FLAG, DYKDDDDK (SEC. ID nº: 32)) y la secuencia de
codificación para los primeros once restos de GPBP incluyendo el
Met_{i} y una secuencia de restricción de Ban II previstos, se
obtuvo hibridando ON-GPBP-54m y
ON-GPBP-55c y ampliando con
T_{7}ADN polimerasa modificada (Amersham). El producto del ADN
resultante se digirió con EcoRI y BanII y se ligó con el fragmento
del ADNc BanII/EcoRI de BS-n4' en la secuencia EcoRI
de pHIL-D2 (Invitrogen) para producir
pHIL-FLAG-n4'. Este plásmido se
utilizó para obtener transformantes Mut^{5} de la cepa GS115 de
Pichia pastoris y para expresar la GPBP recombinante (rGPBP)
marcada con FLAG ya sea mediante cultivo en líquido convencional o
mediante procedimientos de fermentación (kit de expresión de
Pichia, Invitrogen). Los lisados celulares se cargaron en una
columna anti-FLAG M2 (Sigma), el material no ligado
se lavó con solución salina tamponada con Tris (TBS,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM) o TBS
enriquecido con sal (hasta NaCl 2 M) y el material recombinante se
eluyó con el péptido FLAG. Para la expresión en las células 293
procedentes del riñón humano (ATCC 1573-CRL), la
inserción ADNc de EcoRI de 2,0 kb de BS-n4' o de
pHIL-FLAG-n4' se sublonó en pcADN3
(Invitrogen) para producir pc-n4' y
pc-FLAG-n4' respectivamente. Cuando
se utilizaron para la expresión temporal, 18 horas después de la
transfección las células se lisaron con 3,5-4
\mul/cm^{2} de tampón de lisis enfriado (Nonidet
P-40 o Triton-X100 al 1%, EDTA 5 mM
y PMSF 1 mM en TBS) con o sin SDS al 0,1%, dependiendo de si el
lisado debía utilizarse para SDS-PAGE o purificación
de FLAG, respectivamente. Para la purificación de FLAG, el lisado de
cuatro a seis placas de cultivo de 175 cm^{2} se diluyó hasta 50
ml con tampón de lisis y se purificó como anteriormente. Para
expresión estable, las células se transfectaron así mismo con
pc-n4' y se seleccionaron durante tres semanas con
800 \mug/ml de G418. Para la expresión bacteriana recombinante, el
fragmento de ADNc de EcoRI de 2,0 kb de
Phil-FLAG-n4' se clonó en el marco
corriente abajo de la glutatión S-transferasa ADNc
que codifica (GST) de pGEX-5x-1
(Pharmacia). El montaje resultante se utilizó para expresar la
proteína de fusión GST-GPBP en células DH5\alpha
(9).
Material procedente del antígeno de GP. Se
produjo el antígeno de GP recombinante (rGP) humano en células 293
utilizando el vector de expresión pRc/CMV-BM40 que
contenía el ADNc específico para \alpha3 entre
ON-HNC-B-N-14m
y
ON-HNC-B-N-16c.
El vector de expresión es un vector derivado de pRc/CMV (Invitrogen)
proporcionado por Billy G. Hudson (Kansas University Medical Center)
que contiene el ADNc que codifica un Met de iniciación, un péptido
señal BM40 seguido de una secuencia peptídica de marcador (FLAG) y
una secuencia de clonación polienlazadora. Para obtener el ADNc
específico para \alpha3, se realizó una reacción en cadena de
polimerasa utilizando los oligonucleótidos anteriores y un plásmido
que contiene la secuencia de ADNc de \alpha3(IV) descrita
anteriormente (3) como plantilla (clon C2). Para la expresión
estable de rGP, se transfectaron células 293 con el montaje
resultante (f\alpha3VLC) y se seleccionaron con 400 \mug/ml de
G418. Se purificó el rGP recogido utilizando una columna M2
anti-FLAG.
Todos los montajes se verificaron por cartografía
de restricción y secuenciado de nucleótidos.
Se cultivaron células 293 humanas en medio Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero de ternero
fetal al 10%. Las transfecciones se realizaron utilizando el método
de precipitación con fosfato de calcio de los Profection Mammalian
Trasfection Systems (Promega). Se seleccionaron células
transfectadas establemente por su resistencia a G418. Se aislaron
focos de células supervivientes, se clonaron y ampliaron.
Anticuerpos policlonales contra la zona
N-terminal de GPBP. Las células que expresan
HeLa1 \lambda-gt11 como lisogén se lisaron por
tratamiento con ultrasonidos en presencia de tampón de muestra
Laemmli y se sometieron a electroforesis en un gel de preparación de
acrilamida al 7,5%. El gel se tiño con azul de Coomassie y la banda
que contenía la proteína de fusión de interés se escindió y se
utilizó para la inmunización del conejo (10). Se probó la
reactividad del antisuero utilizando antígeno purificado por
afinidad a APTG. Para obtener anticuerpos purificados por afinidad,
se diluyó el antisuero 1:5 con TBS y se cargó en una columna
Sepharose 4B que contiene antígeno purificado por afinidad unido por
enlace covalente. El material unido se eluyó y, a menos que se
indique de otra manera, se utilizó en los estudios
inmunoquímicos.
Anticuerpos monoclonales contra GPBP. Se
produjeron anticuerpos monoclonales esencialmente como se indicó
anteriormente (7) utilizando GST-GPBP. Los
sobrenadantes de los clones individuales se analizaron para los
anticuerpos contra rGPBP.
Se incubaron aproximadamente 200 ng de rGPBP
durante la noche a 30ºC en \beta-glicerofosfato 25
mM (pH 7,0), EDTA 0,5 mM, EGTA 0,5 mM, MgCl_{2} 8 mM, MnCl_{2} 5
mM, DTT 1 mM y \gamma-^{32}P-ATP
0,132 \muM, en presencia o ausencia de 0,5 a 1 \mug de sustratos
de proteína o 10 nmoles de péptidos sintéticos, en un volumen total
de 50 \mul.
Se sembraron pocillos individuales de una placa
de 24 pocillos con células 293 normales o transfectadas de forma
estable con pc-n4'. Cuando se cultivaban las células
a la densidad deseada, numerosos pocillos de las células 293
normales se transfectaron con
pc-FLAG-n4'. Después de 12 horas, el
medio de cultivo se eliminó, se añadieron 20 \muCi/pocillo de
H_{3}^{32}PO_{4} en 100 \mul de DMEM exento de fosfato y se
continuó la incubación durante 4 horas. Se lisaron las células con
300 \mul/pocillo de TBS que contenía Triton X-100
al 1%, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, NaF 50 mM y vanadato 0,2 mM y se
extrajo con anticuerpos específicos y proteína
A-Sepharose. Cuando se utilizó suero
anti-GPBP, el lisado se prepurificó utilizando suero
preinmune y proteína A-Sepharose.
Se desfosforiló aproximadamente 1 \mul de rGPBP
en 100 \mul de Tris-acetato 10 mM (pH 7,5),
acetato de magnesio 10 mM y acetato de potasio 50 mM con 0,85 U de
fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Pharmacia) durante 30
min a 30ºC.
Se realizaron ensayos de renaturalización en
transferencia utilizando 1 a 5 \mug de rGPBP como se describió
anteriormente (11).
Se realizaron análisis de secuencia del ADNc
mediante el método de terminación de la cadena didesoxi utilizando
[\alpha]^{35}S-dATP, T_{7} ADN
polimerasa modificado (Amersham) y cebadores universales o
específicos de GPBP (8-10).
rGPBP inmunopurificado o fracciones de filtración
en gel de HPLC de la misma que contenían el material de interés se
fosforilaron, hidrolizaron y analizaron en cromatografía en capa
fina unidimensional (4) o bidimensional (12). Durante la realización
de dos análisis dimensionales, el tampón para la primera dimensión
fue ácido fórmico:ácido acético:agua (1:3,1:35,9) (pH 1,9) y el
tampón para la segunda dimensión fue ácido acético:piridina:agua
(2:0,2:37,8) (pH 3,5). Los aminoácidos se revelaron con ninhidrina y
los ^{32}P-fosfoaminoácidos por
autorradiografía.
Se realizaron SDS-PAGE y
transferencia Western como en (4). Se realizaron estudios de
inmunohistoquímica o secciones de referencia multitisulares
(Biomeda, Biogenex) utilizando el método de ABC peroxidasa (13).
Se realizaron investigaciones de homología frente
a las bases de datos de GenBank y SwissProt con el BLAST 2,0 (14) en
el servidor NCBI y frente a la base de datos del índice de genes
humano TIGR para los marcadores de secuencia expresada, utilizando
el servidor del Institute for Genomic Research. La investigación
para modelos y perfiles funcionales se realizó frente a la base de
datos PROSITE utilizando el programa ProfileScan en el Swiss
Institute of Bioinformatics (15). La predicción de las estructuras
superenrolladas se realizó en el Swiss Institute for Experimental
Cancer Research utilizando el programa Coils (16) con ambos
intervalos de los restos 21 y 28.
Clonación molecular de GPBP - Para
investigar proteínas que interactúan específicamente con la zona
N-terminal divergente del antígeno GP humano, se
combinaron un péptido de 21 restos (GPpep1; SEC. ID nº: 26)), que
abarca esta zona y que flanquea las secuencias, y anticuerpos
monoclonales específicos contra él para cribar varios bancos de
expresión de ADNc. Se cribaron más de 5 \times 10^{6} fagos para
identificar un solo recombinante derivado de HeLa que codifica
específicamente una proteína de fusión que interactúa con GPpep1 sin
desestabilizar la unión del anticuerpo.
Utilizando la inserción de ADNc del clon original
(HeLa1), se aislaron un ADNc de 2,4 kb (n4') que contiene 408 bp de
la secuencia 5' no traducida, un marco de lectura abierta (ORF) de
1872 bp que codifica 624 restos, y 109 bp de la secuencia 3' no
traducida (Fig. 1) (SEC. ID nº: 1-2). Otras
propiedades estructurales son de interés. En primer lugar, el
polipéptido previsto (denominado en lo sucesivo GPBP) tiene un gran
número de restos fosforilables (17,9%) y ácidos (16%) distribuidos
de forma distinta a lo largo de la secuencia. Serina, que es el
resto más abundante (9,3%) presenta preferencia por dos zonas cortas
de la proteína, en las que comprende aproximadamente el 40% de los
aminoácidos, en comparación con una media de menos del 7% en todo el
resto de la cadena polipeptídica. Es también digno de mención que la
zona N-terminal, rica en serina consta
principalmente de una repetición
Ser-Xaa-Yaa. Los restos ácidos se
sitúan preferentemente en los tres cuartos
N-terminales del polipéptido, siendo los restos
ácidos casi el 18%. Estos restos representan solamente el 9% en la
mayor parte del cuarto C-terminal del polipéptido,
produciendo una cadena polipeptídica con dos dominios eléctricamente
opuestos. En el terminal N, el polipéptido contiene un dominio con
homología de plecstrina (PH), que ha estado involucrado en la
regeneración de muchas proteínas de señalización de la membrana
celular donde ejercen sus actividades biológicas (17). Por último,
una secuencia de direccionamiento nuclear en dos partes (18) existe
como parte integral de una zona de repetición del hepteto que reúne
todos los requisitos estructurales para formar un
superenrollamiento (16).
El banco de datos proteico busca las homologías
descubiertas casi exclusivamente en los aproximadamente 100 restos
en la zona N-terminal que albergan el dominio PH. El
dominio PH de la proteína de unión al oxiesterol es el más similar,
con una identidad global del 33,5% y una similitud del 65,2% con
GPBP. Además, el cósmido P25H2 de Caenorhabditis elegans
(número de registro Q93569) contiene un ORF hipotético que presenta
una identidad global del 26,5% y una similitud del 61% en toda la
secuencia de la proteína completa, lo que indica que proteínas
similares están presentes en invertebrados inferiores. Varias
etiquetas de la secuencia humana expresada (números de registro
AA287878, AA287561, AA307431, AA331618, AA040134, AA158618,
AA040087, AA122226, AA158617, AA121104, AA412432, AA412433, AA282679
y N27578) poseen un grado alto de identidad del nucleótido
(aproximadamente 98%) con los correspondientes alargamientos del
ADNc de GPBP, lo que sugiere que representan el GPBP humano. Es
interesante que el AA287878 EST presenta un hueco de 67 nucleótidos
dentro de la secuencia que corresponde a una zona no traducida en 5'
de GPBP, sugiriendo que el pre-ARNm de GPBP está
alternativamente cortado y empalmado en los tejidos humanos (no
representados).
La distribución de la expresión del gen de GPBP
en los tejidos humanos se evaluó en primer lugar por análisis por
transferencia Northern (Fig. 2, panel A). El gen se expresa como dos
especies principales de ARNm entre 4,4 kb y 7,5 kb de longitud y
otras especies menores de longitudes más cortas. La relación
estructural entre estas especies múltiples de ARNm no es conocida y
su expresión relativa varía entre los tejidos. El nivel de expresión
mayor se observa en el músculo estriado (esquelético y corazón),
mientras que el pulmón y el hígado presentan los niveles de
expresión más bajos.
El análisis de estudios de transferencia Southern
del ADN genómico de diferentes especies indicó que los genes
homólogos existen en toda la filogenia (Fig. 2, panel B).
Consecuente con el origen humano de la sonda, las intensidades de
hibridación disminuyeron de forma progresiva a medida que el origen
del ADN genómico se aleja del hombre en la evolución.
Determinación experimental de la secuencia de
partida de la traducción - Para confirmar experimentalmente el
ORF previsto, se utilizaron los vectores de expresión eucariótica
que contienen los 2,4 kb del ADNc de n4', o solamente el ORF
previsto marcado con la secuencia FLAG (Fig. 3A), para los análisis
de la expresión temporal en las células 293. Los extractos
correspondientes se analizaron por inmunotransferencia utilizando
anticuerpos específicos para GPBP o para FLAG. Los anticuerpos
específicos para GPBP se unen a un polipéptido mayor similar en
ambas células transfectadas, pero solamente el polipéptido producido
por el montaje modificado genéticamente expresó la secuencia FLAG
(Fig. 3B). Esto situó el punto de partida de la traducción del ADNc
de n4' en el Met previsto y confirmó la estructura primaria
propuesta. Además, los polipéptidos recombinantes presentaron una
masa molecular mayor de la esperada (80 frente a 71 kDa), lo que
sugiere que GPBP experimenta modificaciones después de la
traducción.
Expresión y caracterización de rGPBP de
levadura - Se combinaron la expresión de la levadura y la
purificación por afinidad basada en FLAG para producir rGPBP (Fig.
4A). Se obtuvo un polipéptido mayor de \sim89 kDa (junto con
múltiples productos relacionados que presentan
M_{r,}inferior. El material recombinante fue reconocido
tanto por los anticuerpos anti-FLAG como por los
específicos para GPBP, garantizando la fidelidad del sistema de
expresión. De nuevo, sin embargo, la M_{r} presentada por
el producto principal fue notablemente mayor que la prevista e
incluso mayor que la M_{r} del material recombinante
procedente de las células 293, apoyando la idea de que GPBP
experimenta modificaciones después de la traducción importantes y
diferenciadas. Ya que los restos fosforilables son abundantes en la
cadena de polipéptidos, se investigó la existencia de
fosfoaminoácidos en los materiales recombinantes. Utilizando
anticuerpos monoclonales o policlonales (no representados) contra
fosfoserina (PSer), fosfotreonina (PThr) y fosfotirosina (PTyr), se
identificó la presencia de los tres restos fosforados en rGPBP de
levadura (Fig. 4B) o en el material procedente de las células 293
(no representado). Se evaluó más la especificidad de los anticuerpos
inhibiendo parcialmente su unión mediante la adición de
fosfoaminoácido 5-10 mM correspondiente (no
representado). Esto sugiere que el contenido de resto fosforado
varía dependiendo del sistema de expresión celular, y que las
diferencias de M_{r} son debidas principalmente a la
fosforilación. El material desfosforilado procedente de levaduras
presentó consecuentemente M_{r} similar al material
procedente de las células 293, y el contenido en fosfoaminoácidos se
correlaciona con las movilidades en SDS-PAGE (Fig.
4C). Como medición in vivo, se evaluó la fosforilación de
rGPBP en las células 293 (Fig. 4D). Las células de referencia
(bandas 1) y las células que expresan rGPBP en un modo estable
(bandas 2) o temporal (bandas 3) se cultivaron en presencia de
H_{3}^{32}PO_{4}. El material recombinante inmunoprecipitado
contenía ^{32}P, indicando que la fosforilación de GPBP tuvo lugar
in vivo y por lo tanto es probable que sea un proceso
fisiológico.
La rGPBP es una serina/treonina cinasa que
fosforila la zona N-terminal del antígeno de GP
humano - Aunque GPBP no contiene las zonas estructurales
conservadas requeridas para definir el dominio catalítico clásico
para una proteína cinasa, la identificación y caracterización
recientes de nuevas proteína cinasas no convencionales
(19-27) estimuló la investigación de su actividad
fosforilante. La adición de [\gamma^{32}P]ATP a rGPBP
(procedente de levaduras o de células 293 (no representado)) en
presencia de Mn^{2+} y Mg^{2+} produjo la incorporación de
^{32}P como PSer y PThr en los productos principales y
relacionados reconocidos tanto por anti-FLAG como
por los anticuerpos específicos (Fig. 5A y B), lo que indica que el
material purificado por afinidad contiene una Ser/Thr proteína
cinasa. Para caracterizar más esta actividad, se analizaron GPpep1,
GPpep1Ala^{9} (un mutante de GPpep1 con Ser^{9} sustituido por
Ala), natural y antígenos de GP recombinantes humanos, y antígeno de
GP bovino natural (Fig. 5C). rGPBP purificado por afinidad fosforila
todo el material procedente del hombre en una medida diferente. Sin
embargo, en condiciones similares, no se observó incorporación de
^{32}P apreciable en el sustrato procedente de la especie bovina.
La incorporación de ^{32}P menor presentaba por GPpep1Ala^{9} en
comparación con GPpep1 y la falta de fosforilación del antígeno
bovino, indica que la cinasa presente en rGPBP discrimina entre los
antígenos humano y bovino y que Ser^{9} es una diana para la
cinasa.
Aunque el sistema de purificación proporciona
material de alta calidad, la presencia de contaminantes con
actividad de proteína cinasa podría no estar regulada. La existencia
de contaminantes se sugirió también por la presencia de un
polipéptido de 40 kDa que contiene FLAG, que no presentaba
reactividad con los anticuerpos específicos ni incorporación de
^{32}P en el análisis de fosforilación (Fig. 4A y 5A). Para
identificar exactamente el polipéptido que alberga la actividad de
la proteína cinasa, se realizaron análisis in vitro de
renaturalización de cinasa después de SDS-PAGE y de
transferencia Western (Fig. 6). Se combinaron con éxito la
utilización de anticuerpos específicos (banda 1) y la detección
autorradiográfica de la incorporación de ^{32}P in situ
(banda 2) y se identificó el material rGPBP de 89 kDa como
polipéptido primario que alberga la actividad de Ser/Thr cinasa. La
falta de incorporación de ^{32}P en los productos procedentes de
rGPBP, así como en el contaminante de 40 kDa, apoya además la
especificidad de los análisis de renaturalización y localiza la
actividad de la cinasa en el polipéptido de 89 kDa. Recientemente se
ha demostrado que los vestigios de las proteína cinasas íntimamente
asociados con un polipéptido pueden liberarse de la membrana teñida,
unirse y fosforilar el polipéptido durante la etapa de marcado (28).
Para evaluar esta posibilidad en nuestro sistema se realizaron
estudios de renaturalización utilizando una pieza pequeña de
membrana que contenía el polipéptido de 89 kDa, sola o junto con las
piezas de la membrana que representan las zonas diferentes de la
banda teñida. Se observó la incorporación de ^{32}P similar a la
del polipéptido de 89 kDa a diferencia de las piezas incubadas
conjuntamente (no representado), lo que indica que si existen
proteína cinasas purificadas conjuntamente en la muestra éstas no
están fosforilando el polipéptido de 89 kDa en los ensayos de
renaturalización a menos que emigren conjuntamente. La migración
conjunta no parece ser una preocupación, sin embargo, ya que los
mutantes de la deleción rGPBP (GPBP\Delta26 y R3, véase a
continuación) que presentan diferentes movilidades también tienen
actividades de cinasa y podrían estar igualmente en la transferencia
renaturalizada (no representado).
Localización inmunohistoquímica de la nueva
cinasa - Para investigar la expresión de GPBP en tejidos humanos
se realizaron estudios inmunohistoquímicos utilizando anticuerpos
policlonales (Fig. 7) o monoclonales específicos (no representado).
Aunque GPBP se expresa ampliamente en los tejidos humanos, presenta
especificidad tisular y celular. En el riñón, la expresión principal
se encuentra en las células epiteliales del túbulo y en las células
mesangiales glomerulares y en los podocitos. En los alveolos
pulmonares, los anticuerpos presentan un modelo lineal sugestivo de
una localización de la membrana basal, junto con la coloración de
los neumocitos. El hígado presenta expresión baja en el parénquima,
pero expresión alta en los conductos biliares. La expresión en el
sistema nervioso central se observa en la materia blanca, pero no en
las neuronas del cerebro. En los testículos, una expresión alta en
el espermatogonio contrasta con la carencia de expresión en las
células de Sertoli. Las glándulas adrenales presentan un nivel mayor
de expresión en las células corticales frente a las medulares. En el
páncreas, GPBP se expresa preferentemente en los islotes de
Langerhans frente al grupo exocrino. En la próstata, GPBP se expresa
en las células epiteliales pero no en el estroma (Fig. 7). Otras
posiciones con expresión alta de GPBP son el músculo estriado, las
células epiteliales de los intestinos y las células de Purkinje del
cerebelo (no representadas). En general, los tejidos en los que GPBP
está muy expresado el modelo de coloración es principalmente
citosólico difuso. Sin embargo en determinadas situaciones existe,
además, un importante refuerzo de coloración en el núcleo
(espermatogonio), en la membrana plasmática (neumocitos,
hepatocitos, células epiteliales de la próstata, materia blanca) o
en la matriz extracelular (alveolo) (Fig. 7).
Los datos de los solicitantes demuestran que GPBP
es una nueva serina/treonina cinasa no convencional. Se presentan
también pruebas de que GPBP discrimina entre los antígenos de GP
humano y bovino y dirige la zona fosforilable del antígeno GP humano
in vitro. Varias líneas de prueba indican que el polipéptido
de 89 kDa es la única cinasa en el rGPBP purificado por afinidad. En
primer lugar, los solicitantes no encontraron diferencias en la
auto- o transfosforilación entre las muestras de rGPBP purificadas
en presencia de sal 150 mM, 0,5 M, 1 M o 2 M (no representadas), lo
que sugiere que rGPBP no lleva unida íntimamente las cinasas. En
segundo lugar, no existe cinasa derivada de levadura que contenga
FLAG en las muestras, ya que el material purificado que utilizan los
anticuerpos específicos para GPBP no presenta diferencias en la
fosforilación (no representado). En tercer lugar, un mutante por
deleción (GPBP\Delta26; véase más adelante) presenta actividades
de auto- y transfosforilación (no representadas), lo que demuestra
que el polipéptido de 89 kD es la única parte del rGPBP con
capacidad para realizar la transferencia del fosfato.
Aunque GPBP no es homólogo para otras cinasas no
convencionales, comparten algunas propiedades estructurales
incluyendo un superenrollamiento de la hélice \alpha
N-terminal (26, 27), motivos ricos en serina (24),
contenido alto en fosfoaminoácidos (27), señal de localización
nuclear en dos partes (27) y ausencia de un nucleótido típico o del
motivo de unión del ATP (24, 27).
Los estudios de inmunohistoquímica demuestran que
GPBP es un polipéptido citosólico también hallado en el núcleo,
asociado a la membrana plasmática y probablemente a la matriz
extracelular asociado con la membrana basal, lo que indica que
contiene los requisitos estructurales para alcanzar todos estos
destinos. La señal de localización nuclear y el dominio PH confiere
a éste el potencial de alcanzar el núcleo y la membrana celular,
respectivamente (17, 29, 30). Aunque GPBP no contiene los requisitos
estructurales que deben exportarse, la zona no traducida con el
extremo 5' de su ARNm incluye un ORF corriente arriba de 130 restos
con un codón de terminación en el marco al principio (Fig. 1). Un
proceso de edición del ARNm que inserta un único par de bases (U)
generaría un punto de partida funcional en el marco y un ORF de 754
restos que contiene una señal de exportación inmediatamente
corriente abajo del Met editado (no representado). Los anticuerpos
policlonales contra un péptido sintético que representan parte de
esta secuencia hipotética adicional (PRSARCQARRRRGGRTSS (SEC. ID nº:
33)) presenta una reactividad vascular lineal en los tejidos humanos
sugestiva de una localización de la membrana extracelular basal
(datos no representados).
Como alternativa, un fenómeno de corte y empalme
podría generar transcritos con exón o exones adicionales no
identificados que proporcionarían los requisitos estructurales para
la exportación. La localización celular múltiple, el contenido
elevado en PTyr y la carencia de actividad de tirosina cinasa in
vitro sugieren que GPBP es la propia diana de la(s)
tirosina cinasa(s) específica(s) y por lo tanto
probablemente está implicado en cascada(s) de señalización
específica.
Tal como se expuso anteriormente, la
fosforilación específica de serina, así como el corte y empalme
alternativo de pre-ARNm, están asociados a la
biología de varios autoantígenos, incluyendo el antígeno GP, el
receptor de acetilcolina y la proteína básica mielina (MBP) (4).
Este último se sospecha que es el principal antígeno en la
esclerosis múltiple (MS), otra enfermedad autoinmunitaria
exclusivamente humana en la que el sistema inmunitario dirige la
materia blanca del sistema nervioso central. La enfermedad de GP y
MS son trastornos humanos que presentan una asociación fuerte con
el mismo apotipo de HLA clase II (HLA DRB1*1501) (32, 33). Esto,
junto con el informe reciente de muerte por enfermedad de GP de un
paciente de MS que lleva esta especificidad para HLA (34), apoya la
existencia de fenómenos patogénicos frecuentes en estos trastornos
humanos.
Se ha demostrado que la fosforilación de las
serinas específicas cambia la proteólisis intracelular
(35-40). De manera concebible, las alteraciones en
la fosforilación proteica pueden afectar al tratamiento y a la
presentación del péptido y mediar de este modo la autoinmunidad. La
presentación del péptido derivado del antígeno GP por el
HLA-DR15 depende más del tratamiento que de las
preferencias de moléculas DR15 relativamente indiscriminadas (41),
lo que sugiere que si el tratamiento está influido por la
fosforilación anormal, los péptidos resultantes probablemente serían
presentados por este HLA. Los datos de los solicitantes más
recientes indican que tanto en los sistemas GP como MBP, la
producción de productos de corte y empalme alternativos sirve para
regular la fosforilación de los puntos PKA específicos y
estructuralmente homólogos, lo que sugiere que ésta o una cinasa
estrechamente relacionada es la enzima de fosforilación in
vivo. Las alteraciones en el grado de fosforilación del
antígeno, producidas por un desequilibrio en los productos
alternativos o por la acción de una cinasa interferidora que
desregula la fosforilación de los mismos motivos, podría conducir a
una respuesta autoinmunitaria en individuos predispuestos. rGPBP
fosforila el antígeno GP humano en un punto principal de
fosforilacion de PKA de modo aparentemente no regulado, ya
que la presencia de productos específicos alternativos del antígeno
GP no afectaron la fosforilación del antígeno primario por GPBP (no
representado).
Aunque GPBP se expresa de manera omnipresente en
determinados órganos y tejidos presenta una preferencia por las
estructuras celulares y tisulares que son diana de las respuestas
autoinmunitarias frecuentes: células de Langerhans (diabetes tipo
I); la materia blanca del sistema nervioso central (esclerosis
múltiple); los conductos biliares (cirrosis biliar primaria); las
células corticales de las glándulas suprarrenales (enfermedad de
Addison); las células del músculo estriado (miastenia grave);
espermatogonio (infertilidad masculina); células de Purkinje del
cerebelo (síndrome paraneoplásico de degeneración cerebelar) y
células epiteliales intestinales (anemia perniciosa, gastritis
autoinmunitaria y enteritis). Todas las observaciones anteriores
apuntan a esta nueva cinasa como un candidato atractivo que debe
considerarse al observar un modelo para la enfermedad
autoinmunitaria humana.
1. Saus, J. (1998) Goodpasture's
Syndrome. Encyclopedia of Immunology, 2ª Ed., Delves, P.J., y
Roitt, I.M. Eds., Academic Press Limited, London,
UK
2. Leinonen, A., Mariyama, M.,
Mochizuki, T., Tryggvason, K., y Reeders, S.T.
(1994) J. Biol. Chem. 269,
26172-26177
3. Quinones, S., Bernal, D.,
García-Sogo, M., Elena, S.F., y
Saus, J. (1992) J. Biol. Chem. 267,
19780-19784
4. Revert, F., Penadés J.R.,
Plana, M., Bernal, D., Johansson, C.,
Itarte, E., Cervera, J., Wieslander, J.,
Quinones, S., y Saus, J. (1995) J. Biol. Chem.
270, 13254-13261
5. Bernal, D., Quinones, S., y
Saus, J. (1993) J. Biol. Chem. 268,
12090-12094
6. Feng, L., Xia, Y., y
Wilson, C.B. (1994) J. Biol. Chem. 269,
2342-2348
7. Penadés, J.R., Bernal, D.,
Revert, F., Johansson, C., Fresquet, V.J.,
Cervera, J., Wieslander, J., Quinones, S., y
Saus, J. (1995) Eur. J. Biochem. 229,
754-760
8. Sambrook, J., Fritsch, E.F., y
Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor ,
NY
9. Coligan, J.E., Dunn, B.N.,
Ploegh, H.L., Speicher, D.W., y Winfield, P.T.
(1995-97) Current Protocols in Protein
Science, John Wiley & Sons Eds., New York, NY
10. Ausubel, F.M., Brent, R.,
Kingston, R.E., Moore, D.D., Deidman, J.G.,
Smith, J.A., y Struhl, K.
(1994-98) Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley & Sons Eds., New York, NY
11. Ferrel, J.E., y Martin, G.S.
(1991) Methods in Enzymology 200,
430-435
12. Boyle, W.J., van der Geer, P.,
y Hunter, T. (1991) Methods in Enzymology
201, 110-149
13. Hsu, S.M., Raine, L., y
Fanger, H. (1981) J. Histochem. Cytochem.
29, 577-580
14. Altschul, S.F., Madden, T.L.,
Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z.,
Miller, W., y Lipman, D.J. (1997) Nucleic
Acids Res. 25, 3389-3402
15. Bairoch, A., Bucher, P., y
Hofmann, K. (1997) Nucleic Acids Res.
25, 217-221
16. Lupas, A. (1996) Trends
Biochem. Sci. 21, 375-382
17. Lemmon, M.A., Falasca, M.,
Ferguson, K.M., y Schlessinger, J. (1997)
Trends Cell Biol. 7, 237-242
18. Boulikas, T. (1993) Crit.
Rev. Eukaryot. Gene Expr. 3, 193-227
19. Csermely, P., y Kahn, C.R.
(1991) J. Biol. Chem. 266,
4943-4950
20. Maru, Y., y Witte, O.N.
(1991) Cell 67, 459-468
21. Beeler, J.F., LaRochelle, W.J.,
Chedid, M., Tronick, S.R., y Aaronson, S.A.
(1994) Mol. Cell. Biol. 14,
982-988
22. Csermely, P., Miyata, Y.,
Schnaider, T., y Yahara, I. (1995) J. Biol.
Chem. 270, 6381-6388
23. Dikstein, R., Ruppert, S., y
Tjian, R. (1996) Cell 84,
781-790
24. Eichinger, L., Bomblies, L.,
Vandekerckhove, J., Schleicher, M., y
Gettermans, J. (1996) EMBO J. 15,
5547-5556
25. Côté, G.P., Luo, X.,
Murphy, M.B., y Egelhoff, T.T. (1997) J.
Biol. Chem. 272, 6846-6849
26. Ryazanov, A.G., Ward, M.D.,
Mendola, C.E., Pavur, K.S., Dorovkov, M.V.,
Wiedmann, M., Erdjument-Bromage, H,
Tempst, P., Parmer, T.G., Prostko, C.R.,
Germino, FJ., y Hait, W.N. (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94, 4884-4889
27. Fraser, R.A., Heard, D.J.,
Adam, S., Lavigne, A.C., Le Douarin, B.,
Tora, L., Losson, R.,
Rochette-Egly, C., y Chambon, P.
(1998) J. Biol. Chem. 273,
16199-16204
28. Laugelier, Y., Champoux, L.,
Hamel, M., Guilbault, C., Lamarche, N.,
Gaudreau, P., y Massie, B. (1998) J. Biol.
Chem. 273, 1435-1443
29. Lemmon, M.A., y Ferguson, K.M.
(1998) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 228,
39-74
30. Rebecchi, MJ., y Scarlata, S.
(1998) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27,
503-528
31. Roitt, I. (1994) Autoimmune
diseases in Essential Immunology, 383-439, 8th Ed.,
Blackwell Scientific,Oxford, UK
32. Erlich, H., y Apple, R
(1998) MHC disease associations. Encyclopedia of Immunology,
2nd Ed., Delves, PJ., y Roitt, I.M. Eds., Academic Press
Limited, London, UK
33. Phelps, R.G., Turner, A.N., y
Rees, A.J.(1996) J. Biol. Chem. 271,
18549-18553
34. Henderson, R.D., Saltissi, D.,
y Pender, M.P. (1998) Acta Neurol. Scy.
98, 134-135
35. Litersky, J.M., y Johnson,
G.V.W. (1992) J. Biol. Chem. 267,
1563-1568.
36. Brown, K., Gerstberger, S.,
Carlson, L., Franzoso, G., y Siebenlist, U.
(1995) Science 267,
1485-1488
37. Chen, ZJ., Parent, L., y
Maniatis, T. (1996) Cell 84,
853-862
38. Aberle, H., Bauer, A.,
Stappert, J., Kispert, A., y Kemler, R.
(1997) EMBO J. 16,
3797-3804
39. Regnier, C.H., Song, H.Y.,
Gao, X., Goeddel, D.V., Cao, Z., y
Rothe, M. (1997) Cell 90,
373-383
40. Vlach, J., Hennecke, S., y
Amati, B (1997) EMBO J. 16,
5334-5344
41. Phelps, R.G., Jones, V.L.,
Coughlan, M., Turner, A.N., y Rees, A.J.
(1998) J. Biol. Chem. 273,
11440-11447
42. US-A-5 424
408
Los solicitantes describen aquí la existencia de
dos isoformas de GPBP que son generadas por corte y empalme
alternativo de un exón de 78 pares de bases (bp) de longitud que
codifica un motivo de 26 restos rico en serina. Ambas isoformas,
GPBP y GPBP\Delta26, existen como agregados de alto peso molecular
que proceden de la autoagregación del polipéptido. La presencia del
péptido de 26 restos en la cadena polipeptídica produce una especie
molecular que autointeractúa más eficazmente y forma agregados con
mayor actividad específica. Por último, los solicitantes presentan
pruebas que apoyan la observación de que GPBP está implicada en la
patogénesis autoinmunitaria humana.
Péptidos. GPpep1, KGKRGDSGSPATWTTRGFVFT
(SEC. ID nº: 26) se describe en el Ejemplo 1. GPBPpep1,
PYSRSSSMSSIDLVSASDDVHRFSSQ (SEC. ID nº: 14), representa los restos
371 a 396 de GPBP fue sintetizada por Genosys.
Oligonucleótidos. Los siguientes
oligonucleótidos fueron sintetizados por Life Technologies, Inc., 5'
a 3': ON-GPBP-11m, G CGG GAC TCA GCG
GCC GGA TTT TCT (SEC. ID nº: 34);
ON-GPBP-15m, AC AGC TGG CAG AAG AGA
C (SEC. ID nº: 35); ON-GPBP-20c, C
ATG GGT AGC TTT TAA AG (SEC. ID nº: 36);
ON-GPBP-22m, TA GAA GAA CAG TCA CAG
AGT GAA AAG G (SEC. ID nº: 37);
ON-GPBP-53c, GAATTC GAA CAA AAT AGG
CTT TC (SEC. ID nº: 38);
ON-GPBP-56m, CCC TAT AGT CGC TCT TC
(SEC. ID nº:39); ON-GPBP-57c, CTG
GGA GCT GAA TCT GT (SEC. ID nº: 40);
ON-GPBP-62c, GTG GTT CTG CAC CAT CTC
TTC AAC (SEC. ID nº: 41);
ON-GPBP-\Delta26, CA CAT AGA TTT
GTC CAA AAG GTT GAA GAG ATG GTG CAG AAC (SEC. ID nº: 42).
Reacción en cadena de transcriptasa inversa y
polimerasa (RT-PCR). Se preparó ARN total a
partir de diferentes tejidos de referencia y de GP como se describe
en (15). Se retrotranscribieron cinco microgramos de ARN total
utilizando perlas de la primera cadena You-Prime
listas para usar (Amersham Pharmacia Biotech) y 40 pmoles de
ON-GPBP-53c. El ADNc correspondiente
se sometió a PCR utilizando los pares de cebadores
ON-GPBP-11m/ON-GPBP-53c
u
ON-GPBP-15m/ON-GPBP-62c.
La identidad de los productos obtenidos con 15 m-62c
fue más confirmada por restricción de Alu I. Para ampliar
específicamente los transcritos de GPBP, se realizó la PCR
utilizando los cebadores
ON-GPBP-15m/ON-GPBP-57c.
Estudios de hibridación Northern. Se
sondaron transferencias Northern de tejido múltiple humano y de la
línea celular tumoral preparadas previamente (CLONTECH) con un ADNc
que contenía el exón de 78 bp presente solamente en GPBP o con un
ADNc que representa ambas isoformas. Los ADNc correspondientes se
obtuvieron por PCR utilizando un par de cebadores
ON-GPBP-56m y
ON-GPBP-57c utilizando GPBP como
plantilla o con los cebadores
ON-GPBP-22m y
ON-GPBP-20c utilizando
GPBP\Delta26 como plantilla. Los productos resultantes se marcaron
al azar y se hibridaron siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Construcción del plásmido, expresión y
purificación de proteínas recombinantes. El plásmido
pHIL-FLAG-n4', utilizado para la
expresión recombinante de GPBP marcado con FLAG en Pichia
pastoris se ha descrito en otra parte (4). La secuencia de
codificación para el exón de 78 bp fue eliminada por mutagénesis
dirigida al sitio utilizando
ON-GPBP-\Delta26 para generar el
plásmido pHIL-FLAG-n4'\Delta26. La
expresión y purificación por afinidad de GPBP recombinante y de
GPBP\Delta26 se realizó como en (4).
HPLC con filtración en gel. Se inyectaron
muestras de 250 \mul en una columna de HPLC
PE-TSK-G4000SW para filtración en
gel con Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM. El
material se eluyó de la columna a 0,5 ml/min, se controló a 220 nm y
se recogieron fracciones diminutas.
Ensayos de fosforilación in vitro .
Se realizaron estudios de autofosforilación, transfosforilación y
renaturalización en transferencia como en el Ejemplo 1.
Anticuerpos y técnicas inmunoquímicas.
Anticuerpos policlonales fueron producidos por pollos contra un
péptido sintético (GPBPpep1) que representa la secuencia codificada
por el exón de 78 bp (Genosys). Se diluyeron yemas de huevo 1:10 en
agua, se ajustó el pH a 5,0. Después de 6 horas a 4ºC, se clarificó
la solución por centrifugación (25 min a 10.000 \times g a 4ºC) y
los anticuerpos precipitaron añadiendo 20% (p/v) de sulfato de sodio
a 20.000 \times g, 20'. Se disolvieron los sedimentos en PBS (1 ml
por yema) y se utilizaron para estudios inmunohistoquímicos. La
producción de anti-
cuerpos contra GPBP/GPBP\Delta26 o contra el dominio \alpha3(IV)NC1 se expusieron anteriormente (véase también 4, 13).
cuerpos contra GPBP/GPBP\Delta26 o contra el dominio \alpha3(IV)NC1 se expusieron anteriormente (véase también 4, 13).
Velocidad de sedimentación. La
determinación de las velocidades de sedimentación se realizó en una
ultracentrifugadora analítica Optima XL-A (Beckman
Instruments Inc.), equipada con escáner VIS-UV,
utilizando un rotor Ti60 y celdas de doble sector de carbón activo
Epon de longitud de paso óptico 12 mm. Se centrifugaron las muestras
de aprox. 400 \mul a 30.000 rpm a 20ºC y se tomaron exploraciones
radiales a 220 nm cada 5 min. Se obtuvieron los coeficientes de
sedimentación a partir de la cantidad de movimiento del límite del
soluto utilizando el programa XLAVEL (suministrado por
Beckman).
Equilibrio de sedimentación. Se hicieron
experimentos de equilibrio de la sedimentación como se describió
anteriormente para los experimentos de velocidad con muestras de 70
\mul y se centrifugó a 8.000 rpm. Se analizaron los gradientes de
concentración experimentales en el equilibrio utilizando el programa
EQASSOC (Beckman) para determinar la masa molecular media ponderada
correspondiente. Se calcularon unos volúmenes parciales específicos
de 0,711 cm^{3}/g para GPBP y de 0,729 cm^{3}/g para
GPBP\Delta26 a partir de las composiciones de aminoácidos
correspondientes.
Métodos físicos y técnicas inmunoquímicas.
Se realizaron SDS-PAGE y transferencia Western en
condiciones reductoras como se describió anteriormente (3). Se
realizaron estudios de inmunohistoquímica en tejidos empapados en
parafina y fijados en formalina utilizando el método de peroxidasa
ABC (4) o en biopsias humanas congeladas fijadas con acetona fría
utilizando procedimientos normalizados para inmunofluorescencia
indirecta.
Estudios de dos híbridos. Se realizaron
estudios de autointeracción en Saccharomyces cerevisiae
(HF7c) utilizando pGBT9 y pGAD424 (CLONTECH) para generar proteínas
de fusión del dominio de unión y activación de GAL4,
respectivamente. Se evaluó la interacción siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Se ensayó la actividad de
\beta-galactosidasa con X-GAL
(0,75 mg/ml) para determinaciones in situ y con
orto-nitrofenil \beta-D
galactopiranosido (0,64 mg/ml) para determinaciones en solución.
Identificación de dos variantes de GPBP
cortadas y empalmadas. Para caracterizar la especie GPBP en
tejidos humanos normales, los solicitantes acoplaron la
transcripción inversa a una reacción en cadena de polimerasa
(RT-PCR) en ARN total de diferentes tejidos,
utilizando oligonucleótidos específicos que flanquean el marco de
lectura abierto completo de GPBP. Se obtuvo un único fragmento de
ADNc que presenta tamaño inferior al esperado del ARN procedente del
músculo esquelético (Fig. 8A) y de ARN procedente del riñón, pulmón,
piel o glándula suprarrenal (no representados). Combinando las
reampliaciones por PCR anidadas y la cartografía de restricción de
endonucleasa, se determinó que todos los productos de
RT-PCR corresponden a la misma especie molecular (no
representada). Se secuenció completamente 2,2 Kb de ADNc del músculo
humano y lo encontraron idéntico al material procedente de HeLa
excepto por ausencia de 78 nucleótidos (posiciones 1519 a 1596), que
codifican un motivo de 26 restos (aminoácidos 371 a 396) (Fig. 8B).
Por lo tanto los solicitantes denominaron a esta isoforma más
frecuente de GPBP, GPBP\Delta26.
Para investigar si los 78 kb representan un
transcrito omitido por el exón durante el tratamiento con
pre-ARNm, se utilizó este fragmento de ADNc para
sondar un banco genómico humano y se aisló un clon de \sim14 Kb.
Combinando la hibridación de la transferencia Southern y PCR, se
caracterizó el clon genómico y un fragmento del ADN contiguo de
12.482 bp se secuenció completamente (SEC. ID nº: 25). La secuencia
contenía (desde 5' a 3'), 767 bp de la secuencia del intrón, un exón
de 93 bp, un intrón de 818 bp, la secuencia del exón de 78 bp de
interés, un intrón de 9.650 bp, un exón de 96 bp y una secuencia del
intrón de 980 bp (Fig. 8C). Los límites exón-intrón
determinados comparando las secuencias de ADN y ADNc
correspondientes reúnen el consenso canónico para los puntos de
corte y empalme 5' y 3' (Fig. 8C) (5), confirmando de este modo la
naturaleza de exón de la secuencia de 78 bp. Se localizó el gen GPBP
en el cromosoma 5q13 por hibridación in situ de fluorescencia
(FISH) utilizando el clon genómico como sonda (no representado).
La expresión relativa de GPBP en muestras humanas
se evaluó por análisis de transferencia Northern utilizando el exón
de 78 bp o un ADNc de 260 bp que representa la secuencia flanqueante
de 78 bp (103 bp 5' y 157 bp 3') presente tanto en GPBP como en
GPBP\Delta26 (Fig. 9). Los 78 bp que contienen la especie
molecular de interés se expresaron preferentemente en el músculo
estriado (tanto esquelético como cardíaco) y en el cerebro y se
expresaron poco en la placenta, pulmones e hígado. En contraste con
GPBP\Delta26, el GPBP se expresó en concentraciones muy bajas en
el riñón, páncreas y en las líneas celulares de cáncer.
Todo lo anterior indica que GPBP se expresa a
bajas concentraciones en los tejidos humanos normales y que la falta
inicial de detección por RT-PCR de GPBP puede
atribuirse a una ampliación preferencial del GPBP\Delta26 más
abundante. De hecho, el ADNc de GPBP pudo ampliarse en tejidos
humanos (músculo esquelético, pulmones, riñón, piel y glándulas
suprarrenales) cuando se realizaron las ampliaciones específicas por
RT-PCR utilizando oligonucleótidos específicos para
el exón de 78 bp (no representados). Esto sugiere también que el
ARNm de GPBP\Delta26 es el principal transcrito detectado en los
estudios de transferencia Northern utilizando la sonda de ADNc que
representa tanto a GPBP como a GPBP\Delta26.
Expresión recombinante y caracterización
funcional de GPBP\Delta26. Para investigar si la presencia del
motivo de 26 restos rico en serina afectaría las propiedades
bioquímicas de GPBP, se expresaron y purificaron ambas isoformas
(rGPBP y rGPBP\Delta26) y se evaluaron sus actividades de auto- y
transfosforilación (Fig. 10). Como se describió anteriormente para
rGPBP (véase también 4), rGPBP\Delta26 se purifica como un único
polipéptido principal y varios productos menores relacionados (Fig.
10A). Sin embargo, el número y cantidades relativas de los productos
derivados varían en comparación con rGPBP, y ellos presentan M_{r}
en SDS-PAGE que no puede atribuirse simplemente a
la deleción de 26 restos. Esto sugiere que el motivo de 26 restos
tiene consecuencias estructurales y funcionales que podrían
considerarse para las actividades reducidas en solución de
autofosforilación y transfosforilación presentadas por
rGPBP\Delta26 (Fig. 10B). Es interesante que las diferencias en la
actividad específica presentadas en los ensayos en solución no
fueron evidentes cuando se evaluó la autofosforilación en
transferencia después de SDS-PAGE y
renaturalización, lo que sugiere que el motivo de 26 restos tiene
probablemente importantes consecuencias funcionales en el contexto
de la estructura cuaternaria. Los estudios de renaturalización
demostraron además que las actividades de transferencia del fosfato
residen en los polipéptidos principales que representan los marcos
de lectura abiertos propuestos y no son detectables en productos
derivados menores.
rGPBP y rGPBP-26 existen como
agregados de alto peso molecular muy activos. El análisis por
filtración en gel de rGPBP o rGPBP\Delta26 purificadas por
afinidad proporcionaron dos picos cromatográficos (I y II),
presentando ambos PM mayor de lo esperado para las especies
moleculares individuales, según se determinó mediante estudios por
SDS-PAGE (89 kDa y 84 kDa, respectivamente) (Fig.
11). El conjunto del material recombinante eluyó como un solo pico
entre los marcadores de peso molecular de 158 kDa y de 669 kDa (pico
II), mientras que las cantidades limitadas de rGPBP y solamente los
vestigios de rGPBP\Delta26 eluyeron en el pico I (>1.000 kDa).
Las alícuotas de las fracciones que representan cada perfil
cromatográfico se sometieron a SDS-PAGE y se tiñeron
o incubaron en presencia de ^{32}P[\gamma] ATP y se
analizaron por inmunotransferencia y autorradiografía. Junto con el
polipéptido primario principal, cada pico cromatográfico contenía
múltiples productos derivados de tamaños mayores o menores lo que
indica que el polipéptido primario se asocia para formar agregados
de peso molecular alto que se estabilizan por enlaces covalente y no
covalente (no representado). La actividad de cinasa también presentó
dos picos que coinciden con los perfiles cromatográficos. Sin
embargo, el pico I presentó una actividad específica mucho mayor
que el pico II, lo que indica que estos agregados de alto peso
molecular contenían una forma mucho más activa de la cinasa.
Volúmenes iguales de las fracciones números 13 y 20 de rGPBP
presentaban actividad de fosforilación comparable, aún cuando el
contenido en proteína es aproximadamente 20 veces menor en la
fracción 13, estimado por transferencia Western y tinción con azul
Coomasie (Fig. 11A). Las actividades específicas de rGPBP y
rGPBP\Delta26 en el pico II son también diferentes y son
coherentes con los estudios presentados para el material completo,
apoyando de este modo la hipótesis de que la presencia del motivo
de 26 restos rico en serina hace más activa la cinasa. Estos
resultados sugieren también que tanto rGPBP como rGPBP\Delta26
existen como oligómeros en condiciones naturales y que tanto la
formación del agregado de alto peso molecular como la actividad
específica son muy dependientes de la presencia del motivo de 26
restos rico en serina. El análisis por centrifugación analítica de
rGPBP puso de manifiesto que el pico I contenía agregados grandes
(más de 10^{7} Da). El pico II de rGPBP contenía una población
homogénea de agregados de 220 \pm 10 kDa, representando
probablemente trímeros con un coeficiente de sedimentación de 11S.
El pico II de rGPBP\Delta26 sin embargo consistía en una población
más heterogénea que contiene probablemente varias especies
oligoméricas. La población principal (aprox.
80%) presentó una masa molecular media ponderada de 310 \pm 10 kDa y un coeficiente de sedimentación de 14S.
80%) presentó una masa molecular media ponderada de 310 \pm 10 kDa y un coeficiente de sedimentación de 14S.
GPBP y GPBP\Delta26 interactúan en un
sistema de dos híbridos en levadura. Para evaluar la relevancia
de la autoagregación y para determinar la función del motivo de 26
restos, se realizaron estudios comparativos utilizando un sistema de
interacción de dos híbridos en levadura. En este tipo de estudio,
los polipéptidos cuya interacción está en estudio se expresan como
una parte de una proteína de fusión que contiene los dominios de
activación o de enlace del factor GAL4 de transcripción. Una
interacción eficaz entre las dos proteínas de fusión mediante el
polipéptido en estudio produciría la reconstrucción del activador de
la transcripción y la posterior expresión de los dos genes
indicadores, Lac Z e His3, permitiendo la detección del color de la
colonia y el crecimiento en un medio insuficiente en His,
respectivamente. Se estimó la intensidad de las interacciones
mediante la velocidad de crecimiento en medio insuficiente en
histidina, en presencia de diferentes concentraciones de un
inhibidor competitivo del producto génico His3
(3-AT) y un análisis colorimétrico cuantitativo en
galactosidasa \beta líquida. En la Fig. 12 se presenta un
experimento representativo. Al analizar GPBP\Delta26 para la
autointeracción, se observó una producción significativa de los
genes indicadores, mientras que ninguna expresión fue detectable
cuando cada proteína de fusión se expresó sola o con las proteínas
de fusión de referencia. La inserción del motivo de 26 restos en el
polipéptido para obtener GPBP produjo un aumento notable en la
interacción del polipéptido. Todos los datos anteriores indican que
GPBP\Delta26 se autoasocia in vivo y que la inserción de
los 26 restos en la cadena polipeptídica proporciona una especie
molecular más interactiva.
GPBP se expresa en gran medida en los
gromérulos y alveolos humanos pero no en los bovinos ni murinos.
Los solicitantes han demostrado que GPBP/GPBP\Delta26 se expresa
preferentemente en células y tejidos humanos que se dirigen
normalmente a respuestas autoinmunitarias naturales. Para investigar
específicamente la expresión de GPBP, se produjeron anticuerpos
policlonales contra un péptido sintético que representa el motivo de
26 restos característico de esta isoforma de cinasa y se utilizó
para estudios inmunohistoquímicos en tejidos humanos impregnados en
parafina congelada o fijada con formalina (Fig. 13). En general,
estos anticuerpos presentaban más especificidad que los anticuerpos
que reconocen ambas isoformas para las estructuras del tejido que
son objetivo de las respuestas autoinmunitarias tales como los
conductos biliares, los islotes de Langerhans o la materia blanca
del sistema nervioso central (no representados). No obstante, el
descubrimiento más notable fue la presencia de depósitos lineales de
anticuerpos selectivos para GPBP alrededor de pequeños vasos en cada
tejido estudiado (A), lo que sugiere que GPBP está asociada a
membranas endoteliales basales. Por consiguiente, en el glomérulo,
los anticuerpos anti-GPBP presentaron un modelo
vascular que recuerda estrechamente la coloración de la membrana
basal glomerular proporcionada por los anticuerpos monoclonales que
reconocen específicamente el \alpha3(IV)NC1
(compárese 13B con 13C y 13D) o circulando autoanticuerpos GP
(compárese 13E y 13F). Estas observaciones apoyaban además la
observación inicial de que GPBP se expresa en estructuras tisulares
dirigidas en respuestas autoinmunitarias naturales, lo que sugiere
que la expresión de GPBP es un factor de riesgo y hace vulnerable el
tejido del anfitrión a un ataque autoinmunitario.
Para evaluar más esta hipótesis, los solicitantes
investigaron la presencia de GPBP y GPBP\Delta26 en el glomérulo
de dos mamíferos que no experimentan de forma natural la enfermedad
de GP en comparación con el hombre (Fig. 14). Los anticuerpos
específicos para GPBP no pudieron colorear el glomérulo de ambas
muestras bovina o murina (compárese 14A con 14B y 14C) mientras que
los anticuerpos que reconocen la secuencia
N-terminal común tanto a GPBP como a GPBP\Delta26
tiñeron estas estructuras en las tres especies, aunque con
diferentes distribuciones e intensidades (14D-14F).
En la corteza renal bovina, GPBP\Delta26 se expresó a una
velocidad inferior que en el hombre, pero presentó una distribución
en el tejido similar. En las muestras murinas, sin embargo,
GPBP\Delta26 presentó una distribución en el tejido que recuerda
estrechamente la de GPBP en el glomérulo humano. Resultados
similares se obtuvieron al estudiar el alveolo en tres especies
diferentes (no representado). Para descartar que las diferencias en
la detección del anticuerpo fueran debidas a las diferencias en la
estructura primaria más bien que a una expresión diferencial, se
determinaron las estructuras primarias correspondientes en estas
dos especies mediante secuenciado del ADNc. Las GPBP bovina y de
ratón (SEC. ID nº: 3 a 6 y 9 a 12) presentaron una identidad global
con material humano del 97,9% y 96,6% respectivamente. Además, el
motivo de 26 restos de ratón fue idéntico al humano mientras que el
bovino se diferenció solamente en un resto. Por último, y de manera
similar al hombre, se logró ampliar ADNc de GPBP a partir de ARN
total de riñón de ratón o bovino utilizando oligonucleótidos
específicos para los correspondientes exones de 78 bp, lo que indica
que GPBP se expresa a muy bajas concentraciones no detectables por
técnicas inmunoquímicas.
GPBP se expresa en gran medida en varias
enfermedades autoinmunitarias. Los solicitantes analizaron
varios tejidos de diferentes pacientes de GP por
RT-PCR específica para evaluar las concentraciones
de ARNm en GPBP/
GPBP\Delta26. Como en los riñones de referencia, la isoforma principal expresada en riñones de GP fue GPBP\Delta26. Sin embargo, en el músculo de uno de los pacientes, se expresó GPBP preferentemente, mientras que GPBP\Delta26 fue la única isoforma detectada en las muestras de músculo de referencia (Fig. 15A). Dado que no hubo muestras de riñón de este paciente en concreto, no se pudo evaluar la expresión de GPBP/GPBP\Delta26 en el órgano diana correspondiente. Por razones similares, no se pudieron evaluar las concentraciones de GPBP/GPBP\Delta26 en el músculo de los pacientes en los que se estudiaron los riñones. Las células de músculo expresan grandes concentraciones de GPBP/GPBP\Delta26 (véase transferencia Northern en Fig. 9) y comprenden el conjunto del tejido. En cambio, la expresión de GPBP/GPBP\Delta26 en el riñón fue mucho menor y el glomérulo fue prácticamente la única estructura del riñón que expresa la isoforma GPBP (véase Fig. 13). El glomérulo es una estructura relativamente menos abundante en el riñón que el miocito en el músculo y el glomérulo es la estructura dirigida por ataque inmune en patogénesis de GP. Estos factores, junto con la ampliación preferente de los mensajes más abundantes y más cortos al realizar los estudios de RT-PCR pudieron tenerse en cuenta para la falta de detección de GPBP tanto en los riñones normales como con GP, imposibilitando de este modo la evaluación de la expresión de GPBP en el glomérulo durante la patogénesis. No obstante, el aumento de las concentraciones de GPBP en un paciente de GP sugiere que la expresión de GPBP/GPBP\Delta26 está alterada durante la patogénesis de GP y que el aumento de la expresión de GPBP tiene un significado patogénico en la enfermedad de GP.
GPBP\Delta26. Como en los riñones de referencia, la isoforma principal expresada en riñones de GP fue GPBP\Delta26. Sin embargo, en el músculo de uno de los pacientes, se expresó GPBP preferentemente, mientras que GPBP\Delta26 fue la única isoforma detectada en las muestras de músculo de referencia (Fig. 15A). Dado que no hubo muestras de riñón de este paciente en concreto, no se pudo evaluar la expresión de GPBP/GPBP\Delta26 en el órgano diana correspondiente. Por razones similares, no se pudieron evaluar las concentraciones de GPBP/GPBP\Delta26 en el músculo de los pacientes en los que se estudiaron los riñones. Las células de músculo expresan grandes concentraciones de GPBP/GPBP\Delta26 (véase transferencia Northern en Fig. 9) y comprenden el conjunto del tejido. En cambio, la expresión de GPBP/GPBP\Delta26 en el riñón fue mucho menor y el glomérulo fue prácticamente la única estructura del riñón que expresa la isoforma GPBP (véase Fig. 13). El glomérulo es una estructura relativamente menos abundante en el riñón que el miocito en el músculo y el glomérulo es la estructura dirigida por ataque inmune en patogénesis de GP. Estos factores, junto con la ampliación preferente de los mensajes más abundantes y más cortos al realizar los estudios de RT-PCR pudieron tenerse en cuenta para la falta de detección de GPBP tanto en los riñones normales como con GP, imposibilitando de este modo la evaluación de la expresión de GPBP en el glomérulo durante la patogénesis. No obstante, el aumento de las concentraciones de GPBP en un paciente de GP sugiere que la expresión de GPBP/GPBP\Delta26 está alterada durante la patogénesis de GP y que el aumento de la expresión de GPBP tiene un significado patogénico en la enfermedad de GP.
Para investigar la expresión de GPBP y
GPBP\Delta26 en la patogénesis autoinmunitaria, se estudiaron
procesos cutáneos autoinmunitarios y se compararon con las muestras
de referencia que representan a la piel normal o a la dermatitis no
autoinmunitaria (Fig. 15). Las muestras de referencia presentaban
una expresión limitada de GPBP en la mayoría de los queratinocitos
periféricos (15B, 15E), mientras que los queratinocitos que se
propagan desde el estrato basal al córneo expresaban GPBP abundante
en la piel afectada por lupus eritematoso diseminado (SLE) (15C,
15F) o por liquen plano (15D, 15G). GPBP se expresó preferentemente
en las estructuras de la superficie celular que recuerdan
estrechamente las ampollas descritas anteriormente en los
queratinocitos cultivados en irradiación de UV y producción de
apoptosis (6). En cambio, los anticuerpos que reconocen tanto a GPBP
como a GPBP\Delta26 proporcionaron un modelo citosólico difuso a
través de toda la epidermis tanto en las muestras autoinmunitarias
afectadas como en las de referencia (no representadas). Estos datos
indican que tanto en los queratinocitos afectados de referencia como
autoinmunitarios, se expresó GPBP\Delta26 en el citosol y que la
expresión no varió significativamente durante la diferenciación
celular. En cambio, los queratinocitos maduros eran prácticamente
las únicas células que expresan GPBP. Sin embargo, la formación de
ampollas y la expresión de GPBP se observó en las etapas de
diferenciación iniciales en la epidermis afectada por respuestas
autoinmunitarias (15C, 15D, 15F, 15G). Esto apoya además las
observaciones anteriores que indican que la apoptosis aberrante en
los queratinocitos basales está involucrada en la patogénesis de
procesos autoinmunitarios que afectan la piel (7) y sugiere que la
apoptosis y la expresión de GPBP están ligadas en este sistema
celular humano.
El corte y empalme de pre-ARNm
alternativo es un mecanismo fundamental para la expresión génica
diferencial que ha sido descrito para regular la distribución del
tejido, la localización intracelular y la función de diferentes
proteína cinasas (8-11). A este respecto, y
recordando estrechamente GPBP, existe B-Raf en forma
de variantes múltiples cortadas y empalmadas, en las que la
presencia de exones específicos las convierte en cinasas más
interactivas, eficaces y oncogénicas (12).
Aunque es evidente que rGPBP\Delta26 todavía
lleva el dominio catalítico no caracterizado de esta nueva cinasa,
tanto las actividades de autofosforilación como las de
transfosforilación se reducen en gran medida cuando se comparan con
rGPBP. La filtración en gel y dos experimentos híbridos proporcionan
algunos conocimientos en los mecanismos que subyacen a dicha
actividad de transferencia reducida del fosfato. Aproximadamente el
1 a 2% de rGPBP está organizado en agregados de peso molecular muy
alto que presenta aproximadamente un tercio de la actividad de
fosforilación de rGPBP, lo que indica que la agregación molecular
alta hace más eficaz las estructuras cuaternarias. GPBP\Delta26
recombinante, sin prácticamente ningún material del pico I, presentó
constantemente una actividad reducida de cinasa. Sin embargo, la
agregación no parece ser el único mecanismo por el cual los 26
restos aumentan la actividad específica, ya que el material de
rGPBP\Delta26 presente en el pico II también muestra una actividad
de fosforilación reducida cuando se compara con las fracciones
homólogas de rGPBP. Una posibilidad es que los agregados derivados
de rGPBP presenten actividades específicas mayores debido al
fortalecimiento de la estructura cuaternaria producido por la
inserción del motivo de 26 restos. Los oligómeros se mantienen
juntos principalmente por enlaces no covalentes muy fuertes, ya que
el conjunto del material aparece como un solo polipéptido en
SDS-PAGE no reductora, y la presencia de urea 8 M o
guanidina 6 M ejerce poco efecto sobre los perfiles de la filtración
en gel cromatográficos (no representados). Permanece sin aclarar
cómo el motivo de 26 restos se vuelve más reforzado y con estructura
activa. Se han propuesto cambios de conformación producidos por la
presencia de un motivo codificado por el exón que alteran el estado
de activación de la cinasa para el dominio del enlazador de la
proteína Src (24) y los exones 8b y 10 de B-Raf
(12). Como alternativa, el motivo de 26 restos puede proporcionar
los requisitos estructurales tales como los restos cuya
fosforilación puede ser necesaria para la activación total de
GPBP.
Se ha informado de (13) que la estructura
primaria del antígeno de GP (\alpha3(IV)NC1) es el
objetivo de un proceso de plegamiento complejo que proporciona
múltiples confórmeros. Los confórmeros aislados son estructuras de
energía no mínima específicamente activadas para la fosforilación
por agregación supramolecular y probable formación de la estructura
cuaternaria. En los pacientes con GP, la
\alpha3(IV)NC1 presenta alteraciones de conformación
y capacidad reducida para mediar la estabilización del disulfuro en
la red de colágeno IV. Los anticuerpos de GP, a su vez, demuestran
afinidad más fuerte hacia los confómeros
\alpha3(IV)NC1 del paciente, lo que indica que el
material con conformación alterada produjo la respuesta
autoinmunitaria. Por consiguiente, parece que en la enfermedad de GP
una alteración precoz en el proceso de conformación de la
\alpha3(IV)NC1 podría generar confórmeros alterados
para los cuales el sistema inmunitario no es tolerante, mediando de
este modo en la respuesta inmunitaria.
Otra prueba (Raya et al., resultados no
publicados) indica que la fosforilación es la señal que dirige el
plegamiento de \alpha3(IV)NC1 en los extremos con
energía no mínima. En este escenario, son de especial relevancia
patogénica tres características del sistema
\alpha3(IV)NC1 humano cuando se comparan con los
sistemas del antígeno correspondiente de especies que, como la
bovina o murina, no experimentan la enfermedad de GP espontánea. En
primer lugar, el terminal N de la \alpha3(IV)NC1
humana contiene un motivo que es fosforilable por PKA y también por
GPBP (véase anteriormente y también 2-4). En segundo
lugar, el gen humano genera múltiples productos alternativos
mediante corte y empalme alternativo del exón (14,15). El exón
saliente genera productos alternativos con extremos
C-terminales divergentes que regulan por incremento
la fosforilación de PKA in vitro del producto
\alpha3(IV)NC1 primario (véase el Ejemplo 3 más
adelante). En tercer lugar, la GPBP humana se expresa asociada a las
membranas basales glomerulares y alveolares, las dos principales
dianas en la enfermedad de GP. El proceso de conformación
dependiente de la fosforilación es también una característica de los
dominios NC1 no patógenos (13), lo que sugiere que el terminal N
fosforilable, la diversificación de corte y empalme alternativa y la
expresión de GPBP en las membranas basales glomerular y alveolar,
son todas características exclusivamente humanas que colocan el
proceso de conformación de \alpha3(IV)NC1 en un
estado vulnerable. Los cuatro riñones independientes con GP
estudiados expresaron concentraciones mayores de productos
alternativos al antígeno GP (15; Bernal y Saus, resultados no
publicados) y en un paciente de GP se observó un aumento de la
expresión de GPBP (véase anteriormente). Ambos aumentos de
concentraciones de productos del antígeno de GP alternativos y de
GPBP es de esperar que tengan consecuencias en el proceso de
conformación dependiente de la fosforilación de la
\alpha3(IV)NC1 y por lo tanto con potencial
patógeno.
GPBP se expresa en gran medida en la piel
dirigido por respuestas autoinmunitarias naturales. En la epidermis,
GPBP está asociada a las ampollas en la superficie de las células
características del proceso de diferenciación mediado por apoptosis
que experimentan los queratinocitos durante la maduración desde los
extractos basales a los córneos (22, 23). Queratinocitos de
pacientes de SLE presentan una sensibilidad notablemente elevada a
la apoptosis producida por UV (6, 18, 20) y a la apoptosis aumentada
y prematura de los queratinocitos se ha descrito que existe en SLE y
dermatomiositis (7). Regularmente, se observan cuerpos apoptósicos
que se propagan desde los estratos basales a los periféricos de la
epidermis en varias enfermedades autoinmunitarias de la piel
incluyendo el lupus viscoide (no presentado), SLE y liquen plano.
Los autoantígenos y las versiones modificadas de los mismos se
agrupan en las ampollas de la superficie celular de los
queratinocitos apoptósicos (6,18,20). Las ampollas superficiales
apoptósicas presentan autoantígenos (21) y probablemente liberan
versiones modificadas a la circulación (16-20). Se
ha sugerido que la liberación de autoantígenos modificados de
cuerpos apoptósicos podría ser el fenómeno inmunizante que media las
respuestas autoinmunitarias generalizadas que median en SLE y el
escleroderma (18,19).
La prueba de los investigadores indica que tanto
GPBP como GPBP\Delta26 son capaces de actuar in vitro como
proteína cinasas, siendo GPBP una isoforma más activa que
GPBP\Delta26. Además, el material recombinante que representa GPBP
o GPBP\Delta26 purificado a partir de una levadura o a partir de
las células 293 humanas contenía una actividad proteolítica asociada
que degrada específicamente el dominio
\alpha3(IV)NC1 (resultados no publicados). La
actividad proteolítica opera en \alpha3(IV)NC1
producido en un sistema de expresión eucariótico, pero no en el
material recombinante producido en las bacterias (resultados no
publicados), lo que indica que el tratamiento de
\alpha3(IV)NC1 tiene algunos requisitos de
conformación o después de la traducción no presentes en el material
procariótico recombinante. Por último se ha descrito que varios
autoantígenos experimentan fosforilación y degradación en
queratinocitos apoptósicos (20). Aunque sin estar limitados por un
mecanismo exacto, los solicitantes proponen, a la luz de todos los
datos anteriores, que el sistema que ensambla a GPBP en las ampollas
apoptósicas realiza probablemente una modificación compleja de los
autoantígenos que incluye la fosforilación, cambios de conformación
y degradación. Por consiguiente, la proteína recombinante que
representa autoantígenos en SLE (fosfoproteína ribosómica P1 y
ribonucleoproteínas nucleares pequeñas Sm-D1) y en
dermatomiositis (histidil-ARNt sintetasa) eran
sustratos in vitro de GPBP (resultados no publicados).
La regulación por disminución en las líneas
celulares cancerosas de GPBP, sugiere que el sistema celular que
alberga a GPBP/GPBP\Delta26 está probablemente involucrado en la
serie de reacciones de señalización que provocan la muerte celular
programada. La serie de reacciones apoptósicas correspondiente
podría ser regulada por incremento durante la patogénesis
autoinmunitaria para producir una presentación del antígeno alterada
en pacientes que llevan aplotipos de MHC específicos; y regulada por
disminución durante la transformación celular para impedir el ataque
autoinmunitario a las células transformadas durante el desarrollo
del tumor.
1. Saus, J. (1998) in Goodpasture's
Syndrome: Encyclopedia of Immunology 2nd edn. Vol. 2, eds. Delves,
P.J., & Roitt, I.M., (Academic Press Ltd., London), págs.
1005-1011.
2. Quinones, S., Bernal, D.,
Garcia-Sogo, M., Elena S.F., &
Saus, J. (1992) J. Biol. Chem. 267,
19780-19784.
3. Revert, F., Penadés, J.R.,
Plana, M., Bernal, D., Johansson, C.,
Itarte, E., Cervera, J., Wieslander, J.,
Quinones, S., & Saus, J.(1995) J. Biol.
Chem. 270, 13254-13261.
4. Raya, A., Revert, F.,
Navarro, S., & Saus, J. (1999) J. Biol.
Chem. 274, 12642-12649.
5. Green, M.R. (1986) Ann. Rev.
Genet. 20,671-708.
6. Casciola-Rosen, L.A.,
Anhalt, G. & Rosen, A. (1994) J. Exp.
Med. 179:1317-1330.
7. Pablos, J.L:, Santiago, B.,
Galindo, M., Carreira, P.E., Ballestin, C.&
Gomez-Reino, J.J. (1999) J.
Pathol. 188: 63-68.
8. Srinivasan, M., Edman, C.F.,
& Schulman, H. (1994) J. Cell. Biol.
126, 839-852.
9. Naito, Y., Watanabe, Y.,
Yokokura, H., Sugita, R., Nishio, M., &
Hidaka, H. (1997) J. Biol. Chem. 272,
32704-32708.
10. Bayer, K.-U., Löhler, J., &
Harbers, K. (1996) Mol. Cell. Biol. 16,
29-36.
11. Madaule, P., Eda, M.,
Watanabe, N, Fujisawa, K., Matsuoka, T.,
Bito, H., Ishizaki, T., & Narumiya, S.
(1998) Nature 394, 491-494.
12. Papin, C.,
Denouel-Galy, A., Laugier, D.,
Calothy, G., & Eychène, A. (1998) J.
Biol. Chem. 273, 24939-24947.
13. Solicitud de patente provisional US nº de
serie pendiente de asignar, presentada el 11 de febrero de 2000
(caso número 98, 723-C).
14. Penadés, J.R., Bernal, D.,
Revert, F., Johansson, C., Fresquet, V.J.,
Cervera, J., Wieslander, J., Quinones, S.
& Saus, J. (1995) Eur. J. Biochem.
229, 754-760.
15. Bernal, D., Quinones, S., &
Saus, J. (1993) J. Biol. Chem., 268,
12090-12094.
16. Casciola-Rosen, L.A.,
Anhalt, G.J.& Rosen, A.(1995) J. Exp.
Med. 182: 1625-1634.
17. Casiano, C.A., Martin, S.J.,
Green, D.R., & Tan, E.M. (1996) J Exp.
Med. 184: 765-770.
18. Casciola-Rosen, L.,
& Rosen, A. (1997) Lupus
6:175-180.
19. Bolivar, J., Guelman, S.,
Iglesias, C., Ortíz, M., & Valdivia, M.
(1998) J. Biol. Chem. 273:
17122-17127.
20. Utz, P.J., & Anderson, P.
(1998) Arthritis Rheum. 41:
1152-1160.
21. Golan, T.D., Elkon, K.B.,
Ghavari, A.E.,& Krueger, J.G. (1992) J.
Clin. Invest. 90: 1067-1076.
22. Polalowska, R.R., Piacentini,
M., Bartlett, R., Goldsmith, L.A., & Haake,
A.R. (1994) Dev. Dinam. 199:
176-188.
23. Maruoka, Y., Harada, H.,
Mitsuyasu et al. (1997) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 238: 886-890.
24. Xu, W., Harrison, S.C., &
Eck, M.J. (1997) Nature 385,
595-602.
En la enfermedad de GP, el ataque del sistema
inmunitario está mediado por autoanticuerpos contra el dominio
C-terminal no colágeno de la cadena \alpha3 del
colágeno IV (el antígeno de GP) (1). El terminal N del
\alpha3(IV)NC1 humano contiene una zona muy
divergente e hidrófila con un único motivo estructural, KRGDS^{9},
que alberga una señal de adhesión celular como parte integral de un
punto de fosforilación funcional para las proteína cinasas de tipo A
(2,3). Además, la zona del gen que codifica el antígeno de GP humano
genera de forma característica múltiples ARNm mediante corte y
empalme alternativo del exón (4,5). Los productos alternativos
divergen en los extremos C-terminales y todos menos
uno comparten el KRGDS^{9} N-terminal (4,5).
La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad
neurológica humana exclusiva caracterizada por la presencia de
placas inflamatorias de desmielización en el sistema nervioso
central (6). Varias pruebas indican que esta enfermedad está
producida por un ataque autoinmunitario mediado por los linfocitos T
citotóxicos hacia los componentes específicos de la materia blanca
que incluye la proteína básica mielina (MBP) (7, 8). En el hombre,
el gen MBP genera cuatro productos (MBP, MBP\DeltaII, MBP\DeltaV
y MBP\DeltaII/V) que proceden del corte y empalme alternativo del
exón mediante el tratamiento de ARNm (9). Entre éstos, MBP\DeltaII
es la forma más abundante en el sistema nervioso central maduro,
mientras que la forma MBP que contiene todos los exones está
prácticamente ausente (9).
Existen varias similitudes biológicas entre las
respuestas autoinmunitarias que median en la enfermedad de GP y MS,
a saber: 1) ambas son enfermedades exclusivas humanas y se inician
específicamente después de una enfermedad vírica pseudogripal; 2)
existe un enlace fuerte al mismo haplotipo de la zona
HLA-DR de la MHC de clase II; 3) se generan varios
productos mediante corte y empalme alternativo; y 4) recientemente
se ha descrito la muerte de un paciente de MS por enfermedad de GP
(10).
Polímeros sintéticos: Se sintetizaron el péptido
derivado de GP\DeltaIII, QRAHGQDLDALFVKVLRSP (SEC. ID nº: 43) y el
péptido derivado de GP\DeltaIII/IV/V, QRAHGQDLESLFHQL (SEC. ID nº:
44), utilizando la química de Boc- (MedProbe) o de Fmoc- (Chiron,
Lipotec).
Material derivado de GP: Se obtuvieron los
montajes que representan las diferentes formas cortadas y empalmadas
de GP subclonando los ADNc utilizados en otra parte para expresar
las proteínas recombinantes correspondientes (5) en la secuencia
BamHI del vector pET15b modificado, en el que se eliminó la
secuencia aminoterminal derivada del vector extraño excepto para el
Met de iniciación. Se eliminó la secuencia de más cortando el vector
con NcoI y Bam HI, rellenando los terminales libres con Klenow y
religadura. Esto produjo la reforma de ambas secuencias de
restricción y colocó la secuencia BamHI inmediatamente corriente
abajo del codón para el Met aminoterminal.
Las proteínas recombinantes que representan GP o
GP\DeltaV (SEC. ID nº: 46) se purificaron por precipitación (5).
Los sedimentos bacterianos que contienen las proteínas recombinantes
que representan GP\DeltaIII (SEC. ID nº: 48) o GP\DeltaIII/IV/V
(SEC. ID nº: 50) se disolvieron mediante urea 8 M en
Tris-HCl 40 mM pH 6,8 y tratamiento con
ultrasonidos. Tras la centrifugación a 40.000 \times g los
sobrenadantes se pasaron a través de un filtro de 0,22 \mum y se
aplicaron a la columna Q recurso para FPLC. Se acidificó el efluente
a pH 6 con HCl y se aplicó a una columna S recurso equilibrada
previamente con MES 40 mM pH 6 para una segunda purificación por
FPLC. Se utilizó el material en el efluente resultante para la
fosforilación in vitro.
Material derivado de MBP: Se obtuvo
MBP\DeltaII (SEC. ID nº: 51) humano representante de ADNc por
RT-PCR utilizando ARN total del sistema nervioso
central. La MBP humana representante del ADNc fue una donación
generosa de C. Campagnoni (UCLA). Se clonaron ambos fragmentos en
una versión modificada de pHIL-D2 (Invitrogen) que
contiene una secuencia de codificación 6\timesHis en el terminal C
para generar pHIL-MBP\DeltaII-His
y pHIL-MBP-His, respectivamente.
Estos plásmidos se utilizaron para la expresión recombinante en
Pichia pastoris como se describe en (12). Se purificaron las
proteínas recombinantes utilizando cromatografía por afinidad en
metal inmovilizado (resina TALON, CLONTECH) en condiciones
desnaturalizantes (urea 8 M) y se eluyó con imidazol 300 mM
siguiendo las instrucciones del fabricante. El material purificado
por afinidad se renaturalizó a continuación por dilución en 80
volúmenes de Tris-HCl 50 mM pH 8,0, CHAPS 10 mM,
NaCl 400 mM, DTT 2 mM y se concentró 50 veces por ultrafiltración a
través de una membrana de tipo YM10 (AMICON). Se produjeron mutantes
de Ser a Ala mediante mutagénesis dirigida al sitio sobre las
construcciones naturales que contenían la secuencia utilizando el
kit transformador de mutagénesis de CLONTECH y las proteínas
resultantes se produjeron igualmente.
Estudios de fosforilación. Los estudios de
fosforilación se realizaron esencialmente como se describió
anteriormente (véase también 3 y 12). En algunos experimentos, los
sustratos se renaturalizaron en transferencia y a continuación, se
fosforilaron durante 30 min a temperatura ambiente añadiendo enzima
100 \mul de tampón de fosforilación que contenía 0,5 \mug de
rGPBP. La digestión con V8 endopeptidasa e inmunoprecipitación se
realizaron tal como se describe en (3).
Producción de anticuerpos. Los péptidos
sintéticos que representan los extremos divergentes
C-terminales de GP\DeltaIII o GP\DeltaIII/IV/V
comprendidos en SEC. ID nº: 43 o SEC. ID nº: 44 se conjugaron
respectivamente en un citocromo C, BSA o ovoalbúmina utilizando un
procedimiento normalizado de acoplamiento de glutaraldehído. Los
conjugados de la proteína resultante se utilizaron para la
inmunización del ratón para obtener anticuerpos policlonales
específicos para GP\DeltaIII y anticuerpos monoclonales
específicos para GP\DeltaIII/IV/V (Mab153). Para obtener
anticuerpos monoclonales específicos para GP\DeltaV (Mab5A) se
inmunizaron ratones utilizando proteína bacteriana recombinante que
representa la forma alternativa correspondiente que comprende la
SEC. ID nº: 50. La producción de anticuerpos monoclonales (M3/1,
P1/2) o policlonales (anti-GPpep1) contra la SEC. ID
nº: 26 que representa la zona N-terminal de las
formas alternativas de GP se han descrito anteriormente (3,5).
Ensamblado. Se ensambló el péptido por
síntesis en fase sólida paso a paso utilizando una estrategia
Boc-bencilo. La resina de partida utilizada fue la
resina Boc-Pro-PAM (0,56 meq/g, lote
R4108). El procedimiento de desprotección/acoplamiento utilizado
fue: TFA (1 \times 1 min) TFA (1 \times 3 min) DCM (evaporación
del flujo) alcohol isopropílico (1 \times 30 s) DMF (3 \times 1
min) ACOPLAMIENTO/DMF (1 \times 10 min) DMF (1 \times 1 min)
ACOPLAMIENTO/DMF (1 \times 10 min) DMF (2 \times 1 min) DCM (1
\times 1 min). En cada etapa se utilizaron 10 ml por gramo de
resina peptídico. El acoplamiento de todos los aminoácidos (cinco
veces en exceso) se realizó en DMF en presencia de BOP, Hobt y DIEA.
Para la síntesis se utilizaron los siguientes grupos protectores de
la cadena lateral: bencilo para serina;
2-clorobencilocarbonilo para lisina; ciclohexilo
para ácido aspártico y ácido glutámico; tosilo para histidina y
arginina.
Escisión. Se escindió el péptido de la
resina y se desprotegió completamente mediante un tratamiento con
fluoruro de hidrógeno líquido (HF): Se añadieron diez mililitros de
HF por gramo de resina peptídico a la mezcla mantenida a 0ºC durante
45 min en presencia de p-cresol como antioxidantes.
Tras la evaporación del HF, la mezcla de reacción en bruto se lavó
con éter, se disolvió en TFA, se precipitó con éter y se secó.
Purificación. Fase estacionaria: Sílice
C18, 15 \mum, 120 A; fase móvil: disolvente A: TFA al 0,1% en agua
y disolvente B: acetonitrilo/A, 60/40 (v/v); gradiente: lineal desde
20 hasta 60% B en 30 min; caudal: 40 ml/min; y la detección fue por
U.V. (210 nm). Las fracciones con una pureza mayor del 80% se
agruparon y se liofilizaron. El control de pureza e identidad se
realizó por HPLC analítica y ES/MS. El producto final tenía una
pureza del 88% y un peso molecular experimental de 2.192,9.
Ensamblado. Se sintetizaron los péptidos
en fase sólida lineal paso a paso en
Pro-clorotritil-resina (0,685 meq/g)
con la química de Fmoc/tBu habitual. Se utilizó el procedimiento de
desprotección/acoplamiento: Fmoc aa (0,66 g), HOBt (0,26 g), DIPCDI
(0,28 ml) durante 40 min siguiendo un control por la prueba de
Kaiser. Si la prueba resultaba positiva el tiempo se prolongaba
hasta el cambio a negativa. A continuación DMF (31 min),
piperidina/DMF al 20% (11 min), piperidina/DMF al 20% (15 min) y DMF
(41 min). Los protectores de la cadena lateral fueron: Pmc
(pentametilcromano sulfonilo) para arginina, Bcc
(terc-butoxicarbonilo) para lisina, tBu
(terc-butilo) para ácido aspártico y para serina y
Trl (tritilo) para histidina.
Escisión. Se escindió el péptido y se
desprotegió totalmente mediante tratamiento de escisión con TFA/agua
90/10. Se añadieron diez mililitros de solución de TFA por gramo de
resina. El agua actúa como antioxidante. Después de dos horas, se
filtró la resina y se precipitó la solución resultante cinco veces
con éter dietílico frío. Se secó el precipitado final.
Purificación. Fase estacionaria: Kromasil
C18 10 \mum; fase móvil: disolvente A: TFA al 0,1% en agua y
disolvente B: TFA al 0,1% en acetonitrilo; isocrático: B al 28%;
caudal: 55 ml/min; detección: 220 nm. Se agruparon las fracciones
con la pureza mayor y se liofilizaron y se realizó una segunda ronda
de purificación por HPLC. Se realizó el control de pureza e
identidad por HPLC analítica y ES/MS. El producto final tenía 97% de
pureza y un peso molecular experimental de 2.190,9.
Regulación de la fosforilación del antígeno GP
humano por corte y empalme alternativo. Se produjeron proteínas
recombinantes bacterianas que representan el antígeno primario (GP)
o los productos alternativos individuales GP\DeltaV (SEC. ID nº:
46), GP\DeltaIII (SEC. ID nº: 48) y GP\DeltaIII/IV/V (SEC. ID
nº: 50) y se determinó su capacidad para ser fosforilados por PKA
(Figura 16, panel izquierdo). Utilizando concentraciones de ATP
normales (150 \muM) se fosforilaron los cuatro antígenos
recombinantes pero en grados muy diferentes. Las formas alternativas
incorporaron ^{32}P más eficazmente que el antígeno GP primario,
sugiriendo que son mejores sustratos. Debido a que estos antígenos
es de esperar que estén en el compartimento extracelular, se ensayó
también su fosforilabilidad con más concentraciones fisiológicas de
ATP (0,1-0,5 \muM). En estas condiciones, las
diferencias en la incorporación de ^{32}P entre los productos
primarios y alternativos fueron más evidentes, indicando que a
concentraciones de ATP bajas el antígeno GP primario fue un sustrato
muy escaso para la cinasa. Entre los tres puntos de fosforilación de
PKA presentes en el antígeno de GP, Ser^{9}
N-terminal y Ser^{26} son los principales y son
frecuentes en todos los productos alternativos ensayados (3,5). Por
consiguiente, las diferencias observadas en la fosforilación para
los polipéptidos completos también existían entre las zonas
N-terminales individuales, determinadas tras la
digestión específica de V8 y la inmunoprecipitación (no
representadas). Esto sugiere fuertemente que las diferencias en la
fosforilación pueden ser debidas a la presencia de diferentes
secuencias C-terminales en los productos
alternativos. Dado que GP\DeltaIII y GP\DeltaIII/IV/V
presentaron velocidades de incorporación de ^{32}P
significativamente mayores que GP\DeltaV y tienen zonas
C-terminales divergentes más cortas, se utilizaron
péptidos sintéticos que representan individualmente estas secuencias
C-terminales (SEC. ID nº: 43, SEC. ID nº: 44) para
examinar más sus funciones reguladoras en la fosforilación in
vitro del antígeno natural. El colágeno IV es una molécula
trimérica compuesta por tres cadenas alfa entrelazadas. En las
membranas basales, dos moléculas de colágeno IV se ensamblan a
través de sus dominios NC1 para proporcionar una estructura de NC1
hexamérica que puede ser solubilizada mediante digestión con
colagenasa bacteriana (1). La disociación de la estructura del
hexámero libera el antígeno de GP en formas monoméricas y diméricas
relacionadas con el disulfuro (1). Para la serie siguiente de
experimentos, se realizaron fosforilaciones en presencia de
concentraciones bajas de ATP de tipo extracelular utilizando tanto
el antígeno de GP natural monomérico como hexamérico (Figura 16,
panel derecho). La presencia de cada péptido específico pero no los
péptidos de referencia (no representados) produjo la fosforilación
de un único polipéptido que presenta un PM aparente de 22 kDa. Por
digestión específica de V8 e inmunoprecipitación, se ha identificado
el correspondiente polipéptido como conformador de 22 kDa del
\alpha3(IV)NC1, caracterizado anteriormente e
identificado como el mejor sustrato para el PKA (11).
Regulación de la fosforilación de la MBP
mediante corte y empalme alternativo. La MBP contiene en su zona
N terminal dos puntos de fosforilación de PKA (Ser^{8},
Ser^{57}) que son estructuralmente similares al punto del terminal
N (Ser^{9}) presente en los productos del antígeno de GP (Fig.
17). El punto Ser^{8} presente en todas las proteínas MBP está
situado en una posición similar a la del Ser^{9} en los
polipéptidos derivados de GP. Además, en los Ser^{8} y Ser^{9}
de MBP y GP\DeltaIII están respectivamente a una distancia similar
en las estructuras primarias de un motivo muy homólogo presente en
el exón II correspondiente (flecha curva en la Fig. 17). El motivo
derivado de GP\DeltaIII coincide con la zona divergente del
terminal C que regula por incremento la fosforilación en PKA de
Ser^{9} en el sistema del antígeno GP (Fig. 16). La secuencia
pseudorreguladora en MBP está situada en el exón II y su presencia
en los productos finales depende de un mecanismo alternativo de
corte y empalme del exón. Por consiguiente, el motivo de MBP
identificado por comparación estructural con GP\DeltaIII puede ser
también la regulación de la fosforilación en PKA deSer^{8}. Se
produjeron proteínas recombinantes que representan a MBP y
MBP\DeltaII (SEC. ID nº: 54) y a los correspondientes mutantes Ser
a Ala para manipular genéticamente cada uno de los dos puntos de
fosforilación de PKA (Ser^{8} y Ser^{57}) presentes en el exón
I. Posteriormente, su fosforilación fue evaluada in vitro por
PKA (Fig. 18). MBP\DeltaII fue un sustrato mejor que MBP y
Ser^{8} fue el punto principal de fosforilación, lo que indica
que, igual que en el sistema antigénico de GP, el corte y empalme
alternativo del exón regula la fosforilación en PKA de los puntos
específicos situados en la zona N-terminal común a
todas las formas alternativas derivadas de MBP.
En experimentos similares que evalúan la
fosforilación de GPBP de las proteínas MBP recombinantes, GPBP
fosforiló preferentemente a MBP, aunque se observó una pequeña
fosforilación de MBP\DeltaII (Fig. 19). Además, los mutantes Ser a
Ala recombinantes no presentaron reducción significativa en la
incorporación de ^{32}P, lo que indica que GPBP fosforila a
MBP/MBP\DeltaII de modo inverso a PKA y que estas dos cinasas no
comparten los puntos principales de fosforilación en las proteínas
MBP.
A partir de estos datos se concluyó que en el
sistema MBP, el corte y empalme alternativo regula la fosforilación
de las serinas específicas mediante PKA o GPBP.
Los péptidos sintéticos que representan la
zona terminal C de GP\DeltaIII influyen en la fosforilación de
GPBP. Para evaluar el efecto de la zona terminal C de
GP\DeltaIII sobre la actividad de GPBP, se sintetizaron los
péptidos que representan esta zona utilizando dos químicas
diferentes (Boc o Fmoc) y se añadió por separado a una mezcla de
fosforilación que contenía GPBP (Fig. 20). Los péptidos sintéticos
basados en Boc influyeron posteriormente en la autofosforilación de
GPBP mientras que los basados en Fmoc inhibieron la
autofosforilación de GPBP, lo que sugiere que las secuencias
reguladoras derivadas de los productos alternativos en uno de los
sistemas antigénicos GP y MBP pueden influir en la actividad de la
cinasa de GPBP.
Los solicitantes han demostrado que el dominio
\alpha3(IV)NC1 experimenta una diversificación
estructural compleja mediante dos mecanismos diferentes: 1) corte y
empalme (4,5) alternativo y 2) isomerización de la conformación del
producto primario (11). Ambos mecanismos generan productos que se
distinguen en PKA, lo que indica que la fosforilación de PKA es un
fenómeno crítico en la biología del dominio
\alpha3(IV)NC1. La fosforilación guía por lo menos
en parte el plegamiento, pero también el montaje supramolecular del
dominio \alpha3(IV)NC1 en la red del colágeno IV (11
y resultados no publicados de Raya et al.). Los confórmeros
alterados del \alpha3(IV)NC1 condujeron a la
respuesta autoinmunitaria que media la enfermedad de GP (11), lo
que sugiere que una alteración en la fosforilación del antígeno
podría ser el fenómeno primario al comienzo de la enfermedad. Por
consiguiente, se ha observado que el aumento de los niveles de
expresión de GP\DeltaIII en varios riñones con GP (4 y resultados
no publicados de Bernal y Saus) y un aumento de expresión de GPBP se
ha detectado en otro paciente con Goodpasture (Fig. 15). Ambos
aumentos de expresión de los productos alternativos del antígeno de
GP y de GPBP es de esperar que tengan consecuencias en el estado
estacionario de la fosforilación de \alpha3(IV)NC1 y
por consiguiente en el correspondiente proceso de conformación. La
discriminación entre los diferentes productos estructurales por PKA
sugiere de manera acusada que esta cinasa u otra cinasa
estructuralmente similar, está involucrada en el proceso fisiológico
de conformación del antígeno y que la fosforilación del antígeno por
GPBP tiene un significado patógeno. En patogénesis, GPBP podría ser
una cinasa intrusora, interfiriendo en el proceso de conformación
dependiente de la fosforilación. Por consiguiente, GPBP se expresa
en estructuras tisulares que están dirigidas por respuestas
autoinmunitarias naturales y un aumento de expresión de GPBP está
asociado a enfermedades autoinmunitarias graves (véanse los ejemplos
1 y 2 anteriormente).
Un mecanismo alternativo de corte y empalme
regula también la fosforilación en PKA de las serinas específicas en
el sistema antigénico de MBP. MBP es también un sustrato para GPBP
lo que sugiere que GPBP puede desempeñar una función patógena en la
esclerosis múltiple y en otras respuestas autoinmunitarias.
Todos los datos anteriores identifican a GPBP
como una diana potencial para los productos terapéuticos en la
enfermedad autoinmunitaria. En la Fig. 20, se demuestra que los
péptidos sintéticos que representan la zona terminal C de
GP\DeltaIII (SEC. ID nº: 43) modulan la acción de GPBP in
vitro y por consiguiente se identificaron ésta y las secuencias
relacionadas como compuestos basados en péptidos para modular la
actividad de GPBP in vivo. La producción de la fosforilación
del antígeno de GP por PKA se consiguió al utilizar los péptidos
basados en Boc pero no al utilizar los péptidos similares basados en
Fmoc. Además, los péptidos basados en Boc pero no en Fmoc eran
sustratos in vitro de PKA (no representados), lo que indica
que existen importantes diferencias estructurales entre ambos
productos. Como ambos productos presentaron diferencias no
significativas en la espectrometría de masas, una posibilidad es que
el procedimiento de desprotección diferente utilizado pueda ser
responsable de diferencias de conformación en la estructura
secundaria que pueden ser críticas para la actividad biológica. Por
consiguiente, el péptido basado en Boc pierde su capacidad para
producir PKA en el almacenaje prolongado a bajas temperaturas.
1. Saus, J. (1998) in Goodpasture's
Syndrome: Encyclopedia of Immunology 2ª edn. Vol. 2, eds. Delves,
P.J., & Roitt, I.M., (Academic Press Ltd., London), págs.
1005-1011.
2. Quinones, S., Bernal, D.,
Garcia-Sogo, M., Elena S.F., &
Saus, J. (1992) J. Biol. Chem. 267,
19780-19784.
3. Revert, F., Penadés, J.R.,
Plana, M., Bernal, D., Johansson, C.,
Itarte, E., Cervera, J., Wieslander, J.,
Quinones, S., & Saus, J.(1995) J. Biol.
Chem. 270, 13254-13261.
4. Bernal, D., Quinones, S., &
Saus, J. (1993) J. Biol. Chem., 268,
12090-12094.
5. Penadés, J.R., Bernal, D.,
Revert, F., Johansson, C., Fresquet, V.J.,
Cervera, J., Wieslander, J., Quinones, S. &
Saus, J. (1995) Eur. J. Biochem. 229,
754-760.
6. Raus, J. CM, en Multiple Sclerosis :
Encyclopedia of Immunology 2ª edn. Vol. 3 (eds. Delves, P.J., &
Roitt, I.M.) 1786-1789 (Academic Press Ltd., London,
1998).
7. Pette, M., Fujita, K.,
Wilkinson, D., Altmann, D.M., Trowsdale, J.,
Giegerich, G., Hinkkanen, A., Epplen, J.T.,
Kappos, L., and Wekerle, H. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 7968-7972
8. Tschida, T., Parker, K.C.,
Turner, R.V., McFarland, H.F., Coligan, J.E.,
and Biddison, W.E. (1994) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91, 10859-10863.
9. Campagnoni, A.T. (1988) J.
Neurochem. 51, 1-14.
10. Henderson, R.D., Saltissi, D.,
and Pender, M.P. (1998) Acta Neurol. Scand.
98, 134-135.
11. Solicitud de patente provisional U.S. nº de
serie pendiente de asignar, presentada el 11 de febrero de 2000
(Caso número 98, 723-C).
12. Raya, A., Revert, F.,
Navarro, S., and Saus, J. (1999). J. Biol.
Chem. 274, 12642-12649.
<110> Saus, Juan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína de unión a Goopasture
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
98-723-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Pendiente de asignación
\vskip0.400000\baselineskip
<141> Presentado aquí adjunto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (409)..(2280)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 624
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (444)..(2315)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 624
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2361
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (421)..(2292)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
<211A 624
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2187
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (391)..(2187)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 598
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2684
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (444)..(2237)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 598
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2283
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (421)..(2214)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 598
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2034
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPBPR3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(990)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPBR3
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1978
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: FLAG-GPBPDNLS
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(1860)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 617
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: FLAG-GPBPDNLS
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1975
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: FLAG-GPBPDSXY
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(1857)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 616
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: FLAG-GPBPDSXY
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1915
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: FLAG-GPBPDSXY/NLS
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(1797)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: FLAG-GPBPDSXY/NLS
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2038
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPBP-D169A
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(1920)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 637
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPBP-D169A
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12482
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPpep1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ser Gly Ser Pro Ala
Thr Trp Thr Thr Arg}
\sac{Gly Phe Val Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPpep1Ala9
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gly Lys Arg Gly Asp Ala Gly Ser Pro Ala
Thr Trp Thr Thr Arg}
\sac{Gly Phe Val Phe Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-54m
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgaattcac catggcccca ctagccgact acaaggacga cgatgacaag
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:ON-GPBP-55c
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgagcccga cgagttccag ctctgattat ccgacatctt gtcatcgtcg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:
ON-HNC-B-N-14m
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccgc tagctaagcc aggcaaggat gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial:
ON-HNC-B-N-16c
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggatccat gcataaatag cagttctgct gt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido FLAG
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido hipotético
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Arg Ser Ala Arg Cys Gln Ala Arg Arg Arg
Arg Gly Gly Arg Thr}
\sac{Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-11m
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgggactca gcggccggat tttct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-15m
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagctggca gaagagac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-20c
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgggtagc ttttaaag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-22m
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagaagaaca gtcacagagt gaaaagg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-53c
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcgaac aaaataggct ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-56m
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctatagtc gctcttc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-57c
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgggagctg aatctgt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-62c
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggttctgc accatctctt caac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ON-GPBP-26
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacatagatt tgtccaaaag gttgaagaga tggtgcagaa c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido derivado GPIII
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Asp Ala Leu
Phe Val Lys Val Leu}
\sac{Arg Ser Pro}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: péptido derivado
GPIII-IV-V
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Arg Ala His Gly Gln Asp Leu Glu Ser Leu
Phe His Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 685
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDV
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(633)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDV
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 680
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDIII
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(216)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDIII
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDIII-IV-V
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(207)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDIII-IV-V
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 507
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDIII-V
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)(216)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: GPDIII-V
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 659
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: HMBP-21
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (37)..(627)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: HMBP-21
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
Claims (23)
1. Secuencia de ácido nucleico aislado que
codifica una proteína cinasa funcional que comprende una secuencia
que comparte por lo menos 70% de identidad con una secuencia de
ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por SEC.
ID nº: 1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº:
9, SEC. ID nº: 11, SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº: 17, SEC. ID nº: 19,
SEC. ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 y SEC. ID nº: 25.
2. Secuencia de ácido nucleico aislado que
comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre el
grupo constituido por SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5,
SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº: 9, SEC. ID nº: 11, SEC. ID nº: 13, SEC.
ID nº: 15, SEC. ID nº: 17, SEC. ID nº: 19, SEC. ID nº: 21, SEC. ID
nº: 23 y SEC. ID nº: 25.
3. Ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia que codifica un polipéptido seleccionado de entre el grupo
constituido por GPBP, GBPB\Delta26 y GPBPpep1 o fragmentos de las
mismas funcionalmente equivalentes, que codifican una proteína
cinasa funcional, en el que GPBP está caracterizada SEC. ID
nº: 2, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 6, GPBP\Delta 26 está
caracterizada por la SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10 y SEC. ID
nº: 12, y GPBPpep1 está caracterizada por la SEC. ID nº:
14.
4. Secuencia de ácido nucleico aislado que
codifica una proteína cinasa funcional que comprende una secuencia
que codifica una secuencia de proteínas que comparte por lo menos
70% de identidad con una secuencia de proteínas seleccionada de
entre el grupo constituido por las SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 4,
SEC. ID nº: 6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10, SEC. ID nº: 12, SEC.
ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 20, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID
nº: 24.
5. Secuencia de ácido nucleico aislado que
comprende una secuencia que codifica una secuencia de proteínas
seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID nº: 2,
SEC. ID nº: 4, SEC. ID nº: 6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10, SEC. ID
nº: 12, SEC. ID nº: 14, SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº:
20, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID nº: 24.
6. Vector de expresión recombinante que comprende
la secuencia de ácido nucleico aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
7. Vector de expresión recombinante que comprende
una secuencia de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia
de ácido nucleico seleccionada de entre el grupo constituido por
SEC. ID nº: 1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID
nº: 9, SEC. ID nº: 11, SEC. ID nº: 13, SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº:
17, SEC. ID nº: 19, SEC. ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 y SEC. ID nº: 25;
o fragmentos de las mismas funcionalmente equivalentes.
8. Célula huésped transfectada con el vector de
expresión recombinante según la reivindicación 6 ó 7.
9. Polipéptido sustancialmente purificado de una
cinasa funcional, que comprende una secuencia de aminoácidos que
comparte por lo menos 70% de identidad con una secuencia
seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID nº: 2,
SEC. ID nº: 4, SEC. ID nº: 6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10, SEC. ID
nº: 12, SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 20, SEC. ID nº:
22, SEC. ID nº: 24 o fragmentos peptídicos de las mismas
funcionalmente equivalentes.
10. Polipéptido sustancialmente purificado, que
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el
grupo constituido por las SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 4, SEC. ID nº:
6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10, SEC. ID nº: 12, SEC. ID nº: 14,
SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº: 20, SEC. ID nº: 22, SEC.
ID nº: 24 o fragmentos peptídicos de las mismas funcionalmente
equivalentes que codifican una proteína funcional.
11. Proteína sustancialmente purificada, que
comprende un polipéptido seleccionado de entre el grupo constituido
por GPBP, GBPB\Delta26 y GPBPpep1 o fragmentos de las mismas
funcionalmente equivalentes que codifican una proteína cinasa
funcional, en la que GPBP está caracterizada por las SEC. ID
nº: 2, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 6, GPBP\Delta 26 está
caracterizada por la SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10 y SEC. ID
nº: 12, y en la que GPBPpep1 está caracterizada por la SEC.
ID nº: 14.
12. Anticuerpo que se une selectivamente a la
proteína o al polipéptido sustancialmente purificados según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. Anticuerpo según la reivindicación 12, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
14. Anticuerpo según la reivindicación 12, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
15. Método para la determinación de la presencia
de un proteína que comparte por lo menos 70% de identidad con una
proteína seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID
nº: 2, SEC. ID nº: 4, SEC. ID nº: 6, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10,
SEC. ID nº: 12, SEC. ID nº: 14, SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC.
ID nº: 20, SEC. ID nº: 22, SEC. ID nº: 24, que comprende
\newpage
a) poner en contacto la muestra de proteína que
debe examinarse con el anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en condiciones que favorezcan la formación
del complejo anticuerpo-antígeno; y
b) detectar la formación de complejos
anticuerpo-antígeno, en los que la presencia del
complejo anticuerpo-antígeno indica la presencia de
una proteína que es sustancialmente similar a una proteína
seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID nº: 2,
SEC. ID nº: 4, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10, SEC. ID
nº: 12, SEC. ID nº: 14, SEC. ID nº: 16, SEC. ID nº: 18, SEC. ID nº:
20, SEC. ID nº: 22 y SEC. ID nº: 24.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
la detección comprende un método seleccionado de entre el grupo
constituido por inmunolocalización, análisis de inmunofluorescencia,
análisis de transferencia Western, ELISA y cribado del banco de
expresión del ácido nucleico.
17. Método para detectar en una muestra una
secuencia que comparte por lo menos 70% de identidad con un ácido
nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por SEC. ID nº:
1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº: 9, SEC.
ID nº: 11, SEC. ID nº: 13, SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº: 17, SEC. ID
nº: 19, SEC. ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 o SEC. ID nº: 25, que
comprende poner en contacto la muestra con el ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o con fragmentos
funcionalmente equivalentes de los mismos que codifican una proteína
cinasa funcional y detectar la formación del complejo, en el que la
formación del complejo indica la presencia en la muestra de las
secuencia que comparte por lo menos 70% de identidad con un ácido
nucleico seleccionado de entre el grupo constituido por SEC. ID nº:
1, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 5, SEC. ID nº: 7, SEC. ID nº: 9, SEC.
ID nº: 11, SEC. ID nº: 13, SEC. ID nº: 15, SEC. ID nº: 17, SEC. ID
nº: 19, SEC. ID nº: 21, SEC. ID nº: 23 o SEC. ID nº: 25.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
la detección se realiza mediante un método seleccionado de entre el
grupo constituido por hibridación, transcripción inversa, PCR,
transcripción inversa acoplada con PCR, transferencia Northern,
transferencia Southern y cribado de banco de ADN.
19. Método para detectar una enfermedad
autoinmunitaria en un paciente, que comprende
- detectar el ARN de GPBP alterado o la expresión
de la proteína en una muestra de tejido o fluido corporal del
paciente comparada con una muestra de tejido o de fluido corporal de
referencia en el que ninguna enfermedad autoinmunitaria está
presente, en el que una alteración en el ARN de GPBP o la expresión
de la proteína en relación a la referencia indica la presencia de
una enfermedad autoinmunitaria , en el que GPBP está
caracterizada por las SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID
nº: 6.
20. Método para detectar células que experimentan
apoptosis o transformación cancerosa en una muestra de tejido o de
fluido corporal, que comprende detectar ARN de GPBP alterado o la
expresión de la proteína en una muestra de tejido o de fluido
corporal del paciente comparada con una muestra de tejido o de
fluido corporal de referencia normal en el que una alteración en el
ARN de GPBP o la expresión de la proteína en relación a la
referencia indica la presencia de células que experimentan apoptosis
o transformación cancerosa, en el que GPBP está
caracterizada por las SEC. ID nº 2, SEC ID nº 4 y SEC ID nº
6.
21. Utilización de un anticuerpo de GPBP o de un
oligómero de cadena complementaria para la preparación de una
composición farmacéutica destinada al tratamiento de un paciente con
un trastorno autoinmunitario, en la que la expresión o actividad de
GPBP, GPBP\Delta26, o una proteína que comprende un polipéptido
que comparte por lo menos 70% de identidad con GPBPpep1 se modifica
en el paciente con el trastorno autoinmunitario, en la que GPBP está
caracterizada por las SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID
nº: 6, GPBP\Delta 26 está caracterizada por la SEC. ID nº:
8, SEC. ID nº: 10 y SEC. ID nº: 12, y en la que GPBPpep1 está
caracterizada por la SEC. ID nº: 14.
22. Utilización de un anticuerpo de GPBP o de un
oligómero de cadena complementaria para la preparación de una
composición farmacéutica destinada al tratamiento de un paciente con
un tumor, en la que la expresión o actividad de GPBP,
GPBP\Delta26, o una proteína que comprende un polipéptido que
comparte por lo menos 70% de identidad con GPBPpep1 se modifica en
el paciente con el tumor, en la que GPBP está caracterizada
por las SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 6, GPBP\Delta
26 está caracterizada por la SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10 y
SEC. ID nº: 12, y en la que GPBPpep1 está caracterizada por
la SEC. ID nº: 14.
23. Utilización de un anticuerpo de GPBP o de un
oligómero de cadena complementaria para la preparación de una
composición farmacéutica destinada a la prevención de la apoptosis
celular, en la que la expresión o actividad de GPBP, GPBP\Delta26,
o una proteína que comprende un polipéptido que comparte por lo
menos 70% de identidad con GPBPpep1 se modifica en la célula, en la
que GPBP está caracterizada por las SEC. ID nº: 2, SEC. ID
nº: 4 y SEC. ID nº: 6, GPBP\Delta 26 está caracterizada por
la SEC. ID nº: 8, SEC. ID nº: 10 y SEC. ID nº: 12, y en la que
GPBPpep1 está caracterizada por la SEC. ID nº: 14.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12148399P | 1999-02-24 | 1999-02-24 | |
| US121483P | 1999-02-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2254151T3 true ES2254151T3 (es) | 2006-06-16 |
Family
ID=22397008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00911146T Expired - Lifetime ES2254151T3 (es) | 1999-02-24 | 2000-02-24 | Proteina de union al antigeno de goodpasture. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6579969B1 (es) |
| EP (1) | EP1144650B1 (es) |
| JP (1) | JP3761784B2 (es) |
| AT (1) | ATE316577T1 (es) |
| AU (1) | AU760197B2 (es) |
| CA (1) | CA2361987C (es) |
| DE (1) | DE60025704T2 (es) |
| ES (1) | ES2254151T3 (es) |
| MX (1) | MXPA01008605A (es) |
| WO (1) | WO2000050607A2 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7060459B2 (en) | 2000-12-08 | 2006-06-13 | Juan Saus | TNF-inducible promoters and methods for using |
| US6881547B1 (en) | 2001-01-31 | 2005-04-19 | Juan Saus | Methods and reagents for treating autoimmune disorders |
| US7147855B2 (en) * | 2001-12-07 | 2006-12-12 | Juan Saus | GIPs, a family of polypeptides with transcription factor activity that interact with goodpasture antigen binding protein |
| WO2004070025A2 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-19 | Juan Saus | Novel goodpasture antigen-binding protein isoforms and protein misfolded-mediated disorders |
| JP2005035926A (ja) * | 2003-07-14 | 2005-02-10 | Japan Science & Technology Agency | セラミド輸送を促進する薬剤、該薬剤を製造する塩基配列、セラミド遊離を促進する活性の測定方法、及びセラミドの膜間移動を促進する活性の測定方法 |
| EP2522730A1 (en) * | 2007-03-02 | 2012-11-14 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Improvement of protein production |
| EP2236285B2 (en) | 2007-12-17 | 2019-05-08 | Kureha Corporation | Thermally shrinkable laminate film for deep drawing, packaged article, and method for packaging of cheese |
| US20100017232A1 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | StevenDale Software, LLC | Information Transmittal And Notification System |
| JP5654989B2 (ja) * | 2008-07-22 | 2015-01-14 | フィブロスタチン ソシエダ リミターダＦｉｂｒｏｓｔａｔｉｎ，Ｓｏｃｉｅｄａｄ Ｌｉｍｉｔａｄａ | グッドパスチャー抗原結合タンパク質およびその検出 |
| EP2427557B1 (en) | 2009-05-05 | 2015-03-18 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Cho/cert cell lines |
| US8586776B2 (en) | 2009-11-05 | 2013-11-19 | Fibrostatin, S.L. | GPBP inhibition using Q2 peptidomimetics |
| MX2013009647A (es) | 2011-02-21 | 2014-02-03 | Fibrostatin S L | Metodos para tratar y diagnosticar enfermedades. |
| US9066938B2 (en) | 2012-07-02 | 2015-06-30 | Fibrostein, S.L. | GPBP-1 inhibition and its therapeutic use |
| US20160184274A1 (en) | 2014-12-31 | 2016-06-30 | Fibrostatin, S.L. | Methods for inhibiting mesenchymal phenotype after epithelial-to-mesenchymal transition |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5424408A (en) | 1990-11-30 | 1995-06-13 | Yale University | α-3 chain type IV collagen polynucleotides |
| US6007980A (en) | 1990-11-30 | 1999-12-28 | Yale University | Alpha-3 chain type IV collagen polypeptides |
| EP0627001A4 (en) * | 1992-02-17 | 1997-03-12 | Florey Howard Inst | Mammalian sos - a regulator/effector of tyrosine kinase signalling. |
| US5716622A (en) * | 1995-01-06 | 1998-02-10 | The Rockefeller University | Functionally active regions of signal transducer and activators of transcription |
| JP2001507563A (ja) * | 1995-11-23 | 2001-06-12 | キャンサー リサーチ キャンペーン テクノロジー リミテッド | Ｂｒｃａ２癌感受性遺伝子の同定及び配列決定に関する材料及び方法並びにそれらの使用 |
-
2000
- 2000-02-24 MX MXPA01008605A patent/MXPA01008605A/es active IP Right Grant
- 2000-02-24 AT AT00911146T patent/ATE316577T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-24 WO PCT/IB2000/000324 patent/WO2000050607A2/en active IP Right Grant
- 2000-02-24 US US09/512,563 patent/US6579969B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-24 ES ES00911146T patent/ES2254151T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-24 EP EP00911146A patent/EP1144650B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-24 JP JP2000601171A patent/JP3761784B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-24 DE DE60025704T patent/DE60025704T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-24 AU AU33140/00A patent/AU760197B2/en not_active Ceased
- 2000-02-24 CA CA002361987A patent/CA2361987C/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-10-11 US US10/270,877 patent/US7186527B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-10-11 US US10/270,837 patent/US7189517B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-23 US US11/709,963 patent/US7629132B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-10-15 US US12/579,650 patent/US20100247553A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6579969B1 (en) | 2003-06-17 |
| US20100247553A1 (en) | 2010-09-30 |
| US20030054488A1 (en) | 2003-03-20 |
| WO2000050607A2 (en) | 2000-08-31 |
| DE60025704D1 (de) | 2006-04-13 |
| US20070178540A1 (en) | 2007-08-02 |
| US20030049791A1 (en) | 2003-03-13 |
| MXPA01008605A (es) | 2003-06-24 |
| CA2361987A1 (en) | 2000-08-31 |
| US7629132B2 (en) | 2009-12-08 |
| CA2361987C (en) | 2007-07-03 |
| US7186527B2 (en) | 2007-03-06 |
| WO2000050607A3 (en) | 2000-11-30 |
| AU3314000A (en) | 2000-09-14 |
| AU760197B2 (en) | 2003-05-08 |
| JP2003525023A (ja) | 2003-08-26 |
| EP1144650A2 (en) | 2001-10-17 |
| EP1144650B1 (en) | 2006-01-25 |
| DE60025704T2 (de) | 2006-09-07 |
| ATE316577T1 (de) | 2006-02-15 |
| US7189517B2 (en) | 2007-03-13 |
| JP3761784B2 (ja) | 2006-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7629132B2 (en) | Goodpasture antigen binding protein | |
| JP3561268B2 (ja) | レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のｃＤＮＡクローニング方法及びｈＧＲＢタンパク質 | |
| ES2625316T3 (es) | Neuquinasa, una proteína corriente abajo de neuregulina | |
| JP2003501038A (ja) | 蛋白質キナーゼ | |
| JP2000515734A (ja) | ヒトｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼインヒビターホモログ | |
| US5621075A (en) | Insulin receptor substrate | |
| JP2008522162A (ja) | Ｍｅｒの診断用および治療用の作用薬 | |
| US20050244911A1 (en) | Methods and reagents for treating autoimmune disorders | |
| JPH10510422A (ja) | チロシンリン酸化タンパク質に結合する新規なタンパク質ドメイン | |
| US20070190581A1 (en) | Density enhanced protein tyrosine phosphatases | |
| US6387642B2 (en) | Method for identifying a reagent that modulates Myt1 activity | |
| US20050074756A1 (en) | FALP proteins | |
| JPH08508397A (ja) | 新規なレセプター型ホスホチロシンホスファターゼ‐ベータ | |
| JP2003530109A (ja) | エルビンをコードする遺伝子及びその診断及び治療的使用 | |
| US20070087983A1 (en) | Novel ubp8rp polypeptides and their use in the treatment of psoriasis | |
| US20080274117A1 (en) | Validation of Tssk Family Members and Tsks as Male Contraceptive Targets | |
| Felberg | Characterization of the C-terminal protein tyrosine phosphatase-like domain of CD45 | |
| WO2006026358A2 (en) | Sperm specific raft associated proteins |