MX2013009647A - Metodos para tratar y diagnosticar enfermedades. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para el diagnóstico y/o tratamiento de la enfermedad crónica del riñón, la GN mediada por el complejo inmune, la artritis reumatoide y la fibrosis pulmonar y los métodos para identificar los compuestos para dicho uso terapéutico.

Description

MÉTODOS PARA TRATAR Y DIAGNOSTICAR ENFERMEDADES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invenoión se refiere a métodos para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades del riñón crónicas, GN-mediada por el complejo inmune, artritis reumatoide y fibrosis pulmonar.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La conformación del dominio no colágeno (NC1 ) de la cadena a3 del colágeno de membrana base IV [oc3(IC)NC1] depende en parte de la fosforilación. La proteína de Unión al Antígeno Goodpasture (GPBP, 77 kD GPBP o GPBP-1 ) (WO 00/50607; WO 02/061430) es una quinasa de proteína no convencional que cataliza la isomerización conformacional del dominio ct3(IV)NC1 durante su ensamble supramolecular, resultando en la producción y estabilización de conformadores c¡3(IV)NC1 múltiples en membranas de basamento. Los niveles elevados de GPBP se han asociado con la producción de conformadores a3(IV)NC1 no tolerados, que conducen a la enfermedad de Goodpasture ("GP") mediada por la respuesta autoinmune. En pacientes con GP, los anticuerpos en contra del dominio C-terminal de no colágeno (NC1 ) de la cadena a3 de colágeno tipo IV ("antígeno Goodpasture" o "antígeno GP") causan una glomerulonefritis rápidamente progresiva (GN) y comúnmente causan hemorragia pulmonar, las dos manifestaciones clínicas cardinales del síndrome de GP.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar la enfermedad crónica del riñón (CKD, por sus siglas en Inglés), comprendiendo la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar el CKD.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar la glomerulonefritis (GN), comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la GN mediada por el complejo inmune. En una modalidad, la GN mediada por el complejo inmune se asocia con una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo que consiste de nefropatía IgA, lupus sistémico eritematoso (SLE, por sus siglas en Inglés) y la enfermedad de Goodpasture.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar la fibrosis pulmonar (PF, por sus siglas en Inglés), comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la PF. En una modalidad, la PF es una PF no idiopática.

En cada uno del primero hasta el tercer aspecto de la invención, el sujeto de preferencia es un humano. En cada aspecto, cualquier inhibidor 77 kD GPBP apropiado puede usarse; en una modalidad, el inhibidor es un anticuerpo que se une al 77 kD GPBP, tal como un anticuerpo selectivo para la isoforma 77 kD de GPBP.

En otra modalidad, el inhibidor GPBP comprende un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácido de acuerdo con la fórmula general X1-SHCIX2-X3 (SEQ ID NO: 2), en donde: X1 es 0-10 aminoácidos de la secuencia ATTAGILATL (SEQ ID NO: 3); X2 es E o Q; y X3 es 0-10 aminoácidos de la secuencia L VKREDSWQ (SEQ ID NO: 4).

En otra modalidad, el inhibidor comprende un compuesto de la Fórmula (I): (l) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: .

R se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo C Ce, alquenilo C2-C6, alqüinilo C2-C6, halo(alquilo CrC6), alcoxi C C6, halo(alcoxi CrC6), amino, (alquil CrCe)amino, di(alquil Ci-C3)amino, hidroxi(alquilo CrC6), (alcoxi CrCe) alquilo Ci-Ce, amino(alquilo CrC8), sulfanil(alquilo CrC6), (alquilo CrC6)sulfanil(alqu¡lo CrC6), -(CH2),.5-C(0)(alcoxi C C6), -(CH2)i-S-C(0)NH2, (arilo)alquilo C2-C6, y (heteroaril) alquilo d-C6; R-i es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo C C6, halo(alquilo C Ce), alcoxi CrC6, halo(alcoxi C Ce), hidroxi(alquilo C Ce), (alcoxi Ci-Ce) alquilo Ci-C6, amino(alquilo Ci-Ce), sulfanil(alquilo Ci-C6), o (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo Ci-Ce); R2 es alquilo Ci-Ce, halo(alquilo C Ce), alcoxi, Ci-C6 halo(alcoxi Ci-C6), hidroxi(alquilo d-C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo Ci-C6, formil(alquilo C0-C6), amino(alquilo Ci-Ce), sulfanil(alquilo Ci-C6), (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo Ci-C6), -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i.5-C(0)(alcoxi Ci-C6), -(CH2)i. 5-C(0)NH2, (aril) alquilo Ci-C6, o (heteroaril) alquilo Ci-C6; R3 es alquilo Ci-C6, halo(alquilo Ci-Ce), alcoxi Ci-C6, halo(alcoxi C Ce), hidroxi(alquilo C C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo C Ce, formil(alquilo Ci-C6), amino(alquilo Ci-C6), sulfanil(alquilo Ci-C6), (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo C,-C6), -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CHzJ s-C^Xalcoxi Ci-C6), -(CH2)i. 5-C(0)NH2, -(CH2)i_s-C(0)NH(alquilo C C6), -(CH2)1-5-C(0)N(alquilo Ci-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi Ci-C6), (aril) alquilo Ci-C8, o (heteroaril) alquilo CrCe; y R4 es hidroxi, halógeno, alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-Ce, halo(alcoxi Ci-C6), benciloxi, -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i.5-C(0)(alcoxi Ci-C3), -(CH2)1-5-C(0)NH2, -(CH2)i.5-C(0)NH(alquilo Ci-C6), -(CH2)i.5-C(0)N(alquilo ei-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi Ci-C6), -0(CH2)i.5-C(0)OH, -0(CH2)i.5-C(0)(alcoxi Ci-C6), (aril) alquilo CrCe, o (heteroaril) alquilo CrC6.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona métodos para el diagnóstico de la artritis reumatoide (RA) o fibrosis pulmonar (PF) comprendiendo (a) contactar una muestra de plasma de un sujeto en riesgo de RA o PF con una molécula de unión GPBP que se une a 77 kD GPBP bajo condiciones para promover la unión selectiva de la molécula de unión GPBP para el GPBP; (b) detectar la formación del complejo entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra de plasma; (c) comparar una cantidad del complejo formado entre la molécula de unión GPBP y el GPBP en la muestra de plasma para control y (d) diagnosticar al sujeto como teniendo RA o PF con base en la comparación o proporcionando la comparación a una entidad para el diagnóstico de RA o PF.

En una modalidad, la molécula de unión 77 kD GPBP comprende un anticuerpo que se une al 77 kD GPBP nativo, tal como un anticuerpo es selectivo para la isoforma 77 kD de GPBP.

En otra modalidad, la detección comprende el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste de ELISA, inmunofluorescencia y cromatografía.

En algunas modalidades, en donde el sujeto está en riesgo de RA, el sujeto puede sufrir de uno o más síntomas seleccionados del grupo que consiste de: una o más articulaciones infladas, una o más articulaciones rígidas, una o más articulaciones calientes, rigidez de articulaciones temprano en la mañana que típicamente dura más de una hora, fluido sinovial en exceso, desarrollo de tejido fibroso en el sinovia y rango disparejo del movimiento de la articulación.

En algunas modalidades, en donde el sujeto está en riesgo de PF, el sujeto puede experimentar desde uno o más síntomas seleccionados del grupo que consiste de; tos seca crónica, fatiga, debilidad, malestar en el pecho, pérdida de apetito, pérdida rápida de peso y disnea con el esfuerzo.

En cualquiera de las modalidades de este cuarto aspecto, los métodos además pueden comprender determinar el nivel de la proteína reactiva C (CRP, por sus siglas en Inglés) en el plasma del sujeto comparando la cantidad de CRP en el plasma del sujeto, para control y usar la comparación CRP para ayudar en el diagnóstico de RA o PF.

En otra modalidad, la invención proporciona métodos para el diagnóstico de CKD o la GN mediada por el complejo inmune, comprendiendo: (a) contactar una muestra de plasma de un sujeto en riesgo de CKD o GN mediada por el complejo inmune con una molécula de unión GPBP que se une a 77 kD GPBP bajo condiciones para promover la unión selectiva de la molécula de unión GPBP al GPBP; (b) detectar (i) la formación del complejo entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra de plasma y (ii) determinar el nivel de proteína reactiva C en el plasma del sujeto (CRP). (c) comparar (i) una cantidad del complejo formado entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra del plasma para control y (ii) una cantidad de CRP en el plasma del sujeto para control y (d) diagnosticar al sujeto que tiene CKD o GN mediada por el complejo inmune con base en las comparaciones o proporcionar las comparaciones a una entidad para diagnóstico de CKD o GN mediada por el complejo inmune.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar compuestos para tratar la CKD, GN mediada por el complejo inmune y/o PF, comprendiendo contactar un complejo de unión del sustrato 77 kD GPBP-77 kD-GPBP con uno o más compuestos de prueba bajo condiciones de enlace, en donde aquellos compuestos de prueba que desplazan la unión 77 kD GPBP del complejo de unión son compuestos candidatos para tratar el CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o PF.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar los compuestos para tratar CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o PF, comprendiendo contactar un sustrato 77 kD GPBP bajo condiciones de enlace con (a) uno o más compuestos de prueba y (b) 77 kD GPBP; en donde aquellos compuestos de prueba que vierten 77 kD GPBP para la unión al sustrato de unión 77 kD GPBP son compuestos candidatos para tratar CKD, la GN mediada por el complejo inmune, y/o PF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una caracterización de GPBP-1 bloqueando mAbs. A: La unión entre la GPBP recombinante y ct3(IV)NC1 se midió por ELISA en la ausencia (Control) o presencia de los mAbs indicados. Los valores se expresan como porcentajes de unión del control que se estableció a 100%. Otros mAbs para GPBP no bloquean significativamente la unión GPBP-1 a a3(IV)NC1 (no mostrado). B: ratones NZW recibieron un solo estímulo intraperitoneal de 10 \ig/g del peso corporal de mAb N12 o mAb N26 Biotinilado. Las muestras sanguíneas se colectaron en los tiempos indicados después de la inyección y los títulos en suero de los mAbs indicados medidos por ELISA. Las barras representan la média ± S.D. (n=3).

La Figura 2 muestra la reducción de la circulación de los niveles GPBP-1 (cGPBP-1 ) en ratones NZW tratados con anticuerpos específicos GPBP. A: se muestran valores medios (puntos, cuadrados o círculos) de los niveles cGPBP-1 en una prueba terapéutica representativa con los anticuerpos indicados. Las diferencias estadísticamente significantes entre el Control y los grupos N12-biotina mAb se alcanzaron en la 4a, 5a y 6a semana, usando la prueba ANOVA de dos vías (* P < 0.05 y ** P < 0.01 ). B: Se representan los niveles de suero de cGPBP-1 en cada muestra individual colectada en A (círculos) y el valor medio de cada serie (línea). Las diferencias estadísticamente significantes se encontraron entre el grupo tratado con mAb N12-biotina y cualquiera de los otros dos grupos, de acuerdo con la prueba Kruskal Wallis/Dunn (*** P < 0.001 ).

La Figura 3 muestra la administración de GPBP-1 bloqueando los mAbs que atenúa la progresión GN en los ratones NZW. Se muestran secciones glomerulares representativas de los grupos de ratones indicados [Control (n=6), mAb N12 (n=5), mAb N26 (n=5)] que se analizaron mediante procedimientos histoquímicos, de ¡nmunofluorescencia y EM. Las coloraciones de la tricromía de Masson ( asson) se usaron para identificar la arquitectura glomerular, la atrofia tubular y los infiltrados inflamatorios. La ¡nmunofluorescencia indirecta estándar se usó para visualizar los depósitos IgG e IgM usando microscopía convencional y la distribución de C3c, GPBP-1 y a3(IV) usando microscopía confocal. Las micrografías muestran material denso de electrones en el lado epitelial de un GBM capilar prolongado en los ratones de control (flechas rojas), anormalidades no encontradas en ratones tratados con mAbs de bloqueo GPBP. Magnificaciones originales x400. Barras de escala confocal = 35 y 54 µ?t? (arriba y abajo). Las barras en escala de microscopía de electrones = 2 µ?t? (arriba) y 1 µ?t? (abajo).

La Figura 4 muestra la regulación descendente de GPBP-1 que reduce los niveles pro-IL-1 ß? los retrasos IL-? ß. A: células Tipo natural y GPBP-1 silenciado (pSi-GPBP-1 ) RAW 264.7 se prepararon por 8 horas con LPS y pro-IL-1 ß y GPBP-1 se detectaron en lisados celulares por la inmunoelectrotransferencia Western con anticuerpos específicos. B y C: células tipo natural y GPBP-1 silenciadas (pSi-GPBP-1 ) RAW 264.7 se detectaron durante la noche con 1 µg/ml de LPS y NLRP3 se activaron con 10 µ? de doxorubícina por los tiempos indicados. IL-1 ß (B) y cGPBP-1 (C) se detectaron en los sobrenadantes del medio por ELISA.

La Figura 5 muestra los niveles de proteína C reactiva y cGPBP-1 (CRP) son inversamente relacionados. La cGPBP-1 y CRP se midieron en los sueros de los pacientes con proteinuria. El esquema representa los niveles medios (barra) e individuales (círculos) cGPBP-1 de los tres grupos de pacientes con niveles CRP indicados. Las diferencias estadísticamente significantes se encontraron entre el grupo de pacientes con CRP < 3 µglmL· y PCR > 4 µg/mL, de acuerdo con la prueba Kruskal Wallis/Dunn (*** P < 0.001 ).

La Figura 6 muestra pacientes con RA que muestran niveles GPBP-1 de circulación aumentados que se regulan inversamente con los niveles de circulación CRP. En círculos A representan GPBP-1 de circulación (niveles dé suero individual de 113 pacientes que tienen significantes niveles de péptido citrunilado anti-cíclico (anti-CCP) (RA) y 100 donantes sanos (Control). Las barras indican el valor medio dentro de una serie. En la derecha se indica el resultado del análisis Mann-Whittney. En B, cada círculo representa los valores representativos de PRC y GPBP-1 de circulación encontrados en el suero individual de los pacientes RA que tienen niveles significantes de anti-CCP.

La Figura 7 muestra niveles de GPBP-1 de circulación en ratones desarrollando artritis inducida con colágeno (AIC). Los puntos representan niveles de cGPBP en suero individual de los ratones indicados antes de la inmunización con colágeno tipo II de bovino (pre-inmunización) o en los tiempos indicados después de la inmunización.

La Figura 8 es la inducción de la fibrosis pulmonar (PF) por la doxorubicina. El aspecto macroscópico (paneles superiores) y la apariencia histológica representativa de los pulmones (x 10) marcados con heamatoxilina/eosina (paneles medios) o tricromía de Masson (paneles inferiores) en ratones tratados con doxorubicina y de control 12 días después de la instalación i.t. del fármaco.

La Figura 9 muestra la expresión del GPBP1 durante el desarrollo de la PF. En A se muestran los niveles de cGPBP-1 en los puntos de tiempo indicados después de la instalación i.t. de la doxorubicina. Los resultados se expresan como los valores de ratones individuales. Las barras representan el valor medio de cada examen. En B se muestran los niveles de expresión de GPBP-1 mARN en el pulmón de control y los ratones tratados con doxorubicina 12 días después de la instilación. Los resultados se expresan como media + cambio de pliegue SD de la expresión GPBP-1 relativos a la expresión de la sub-unidad 18S ribosomal medida en paralelo en cada muestra. En C, el examen de inmunohistoquímica de la expresión GPBP-1 usando un anticuerpo anti-GPBP-1 policlonal en las secciones del pulmón de control y de ratones tratados con doxorubicina 12 días después de la instilación con fármaco (x10).

La Figura 10 muestra el efecto del tratamiento con pinacidil en el desarrollo de PF inducida con doxorubicina. Los pulmones de los animales o ratones sin tratar o tratados con diferentes dosis de pinacidil se examinaron 12 días después de la instilación con doxorubicina. Las secciones de los pulmones marcados con heamatoxilina/eosina (x 10) se muestran (paneles izquierdos). Además, la extensión de lesiones histológicas se expresó en ratones individuales de cada grupo experimental como el porcentaje de parénquima afectado (panel derecho).

La Figura 1 muestra los efectos del tratamiento con pinacidil o miricetina en la inducción de la expresión de colágeno I durante el desarrollo de la PF inducida con doxorubicina. La expresión del mARN del colágeno a1 (l) se determinó en ratones tratados con pinacidil o miricetina o sin tratar, 12 días después de la instilación con doxorubicina usando RT-qPCR. Los resultados se expresaron como media ± cambio de pliegue SD de la expresión de colágeno a1(l) relativos a la expresión de la subunidad 18S ribosomal medida en paralelo en cada muestra. Las diferencias estadísticas se indican como sigue: ns: no significante, *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.005.

La Figura 12 muestra el efecto GPBP mAbs en la PF inducida con doxorubicina. La expresión de los mARNs de los colágenos a1 (I) y a1 (IV) se determinó en ratones tratados con anti-TGFp, mAb 14 ó mAb N12 o sin tratar 12 días después de la instilación con doxorubicina usando RT-qPCR. Los resultados se expresan como media ± del cambio de pliegue SD de una expresión de colágeno a1(l) relativos a la expresión de la subunidad 8S ribosomal medida en paralelo en cada muestra. Las diferencia's estadísticas se indican como sigue: ns: no significante, *p<0.05, *** p<0.005.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las referencias citadas se incorporan en este documento en su totalidad como referencia. Dentro de esta solicitud, a menos que se establezca de otra manera, las técnicas usadas pueden encontrarse en cualquiera de las varias referencias bien conocidas tales como: Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Tecnología de Expresión Genética (Métodos en Enzimología, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guía para la Purificación de Proteínas" en Métodos en Enzimología (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); Protocolos PCR: Una Guía para los Métpdos y Aplicaciones (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Cultivos de Células de Animales; Un Manual de Técnica Básica, 2*" Ed. (R.l. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, NY), Transferencia Genética y Protocolos de Expresión, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), y el Catálogo Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX).

Como se usa en este documento, las formas singulares "una", "un", y "el/la" incluye referentes plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. "Y" como se usa en este documento se usan intercambiablemente con "o" a menos que se establezca expresamente de otra manera.

Todos los términos comunes entre los diferentes aspectos y modalidades de la invención tienen el mismo significado a.menos que el contexto claramente indique lo contrario.

Como se usa en esta solicitud, el término "proteína nativa" significa que la proteína producida naturalmente por la célula, incluyendo cualquier modificación post-traslacional (PTMs) e incluye proteína no desnaturalizada o proteína desnaturalizada (como por ejemplo, proteína naturalmente producida sustancialmente purificada y sometida a uno o más agentes de desnaturalización para, por ejemplo, correrla en un gel SDS-PAGE.).

Como se usa en esta solicitud, "polipéptido sustancialmente purificado" significa que el polipéptido se ha separado de sus ambientes celulares in vivo. Además se prefiere que los polipéptidos aislados también estén sustancialmente libres de agentes de gel, tal como poliacrilamida, agarosa y reactivos cromatográficos.

A menos que se establezca de otra manera por el contexto, las modalidades divulgadas por un aspecto de la invención pueden usarse en otros aspectos de la invención, también y en combinación con las modalidades divulgadas en otros aspectos de la invención.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar la enfermedad de riñon crónica (CKD), comprendiendo la administración de un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar el CKD.

Como se muestra en los ejemplos que siguen, los inhibidores de 77 kD GPBP reducen las infiltraciones inflamatorias en los ríñones, y además pueden usarse para tratar el CKD. La última etapa de cualquier inflamación es fibrosis, y la fibrosis del túbulo intersticial representa la ruta común final para todas las enfermedades del riñon, conduciendo a la expansión gradual de la masa fibrótica que destruye la estructura normal del tejido y los resultados en CKD.

El sujeto puede ser cualquier sujeto que mitiga el beneficio del tratamiento, tal como un mamífero. En una modalidad preferida, el sujeto es un sujeto humano. La secuencia de aminoácidos de 77 kD GPBP, ahora también se llama GPBP o GPBP-1 (SEQ ID NO: 1 ) se divulgó en la Patente Estadounidense No. 6579969 emitida el 17 de Junio, 2003 y la publicación de PCT correspondiente WO 00/50607, publicada el 31 de Agosto, 2000. Como se divulga en este documento, y en W 02010/009856 y la Patente Estadounidense US 7935492, la mARN GPBP de humano experimenta empalme para producir GPBPA26, ahora también llamada CERT y GPBP-2 e iniciación de traducción no canónica para producir 91 -kDa GPBP, ahora llamada GPBP-3). Las diferentes isoformas se ha demostrado que tienen diferentes funciones, con la 77 kD GPBP alcanzando el compartimiento extracelular y existiendo en una forma de inmuno-precipitado soluble y puede aislarse de la sangre.

Como se usa en este documento, "enfermedad del riñón crónica" es una pérdida progresiva de la función renal sobre un periodo de meses o años, a pesar de la patología subyacente. En una modalidad, los individuos con proporción de la filtración glomerular (GFR, por sus siglas en Inglés) < 60 mL/min/1.73 m2 por 3 meses se clasifican como teniendo CKD, independientemente de la presencia o ausencia del daño al riñón. En otra modalidad, los individuos con daño al riñón se clasifican como teniendo CKD, independientemente del nivel de GFR, El daño al riñón se define como anormalidades patológicas o marcadores del daño, incluyendo anormalidades en la sangre y la prueba de orina o los estudios de formación de imágenes.

En varias modalidades, los métodos pueden usarse para tratar el CKD dependiente de no análisis, tal como: Etapa 1 : función ligeramente disminuida; daño al riñón con GFR normal o ligeramente alta (>90 mL/min/1.73 m2); Etapa 2: reducción suave en GFR (60-89 mL/min/1.73 m2) con daño al riñón; Etapa 3: reducción moderada en GFR (30-59 mUmin/1.73 m2=; y Etapa 4: reducción severa en GFR (15-29 mL/min/1.73 m2).

Como se usa en este documento, "tratamiento" CKD significa (a) disminuir el progreso del sujeto a una etapa final de enfermedad renal (ESRD); (b) disminuir la reducción en GFR en el sujeto; (c) limitar el progreso de la enfermedad renal en el sujeto y/o (d) reducir la severidad de los síntomas CKD.

Como se usa en este documento, "limitar el progreso de CKD" significa reducir o prevenir la disminución de la función renal en aquellos pacientes que reciben tratamiento relativo a los pacientes que no reciben el tratamiento. Dicho tratamiento además reduce la necesidad de diálisis del riñon o trasplante en los pacientes.

El progreso de la enfermedad renal puede medirse en varias formas, incluyendo las siguientes: (a) Proteinuria (es decir: es decir pérdida incrementada de la proteína en la orina, comúnmente valorara por la medición de los niveles de albúmina (es decir, "albuminuria")); (b) Separación glomerular deteriorada (es decir, función del riñon para limpiar las sustancias de la sangre; pueden medirse, por ejemplo, por la creatinina (es decir, "separación de la creatinina deteriorada"), inulina, o separación de urea); (c) Niveles incrementados de creatinina en suero y/o (d) Niveles incrementados de factor beta de transformación del crecimiento urinario (TGFG-ß).

Además, los métodos de la invención pueden usarse, por ejemplo para limitar el incremento en una o más de proteinuria, albuminuria, niveles de creatinina en suero y niveles TGF-ß urinarios y/o para limitar el deterioro de la separación glomerular y/o la separación de creatinina en un sujeto siendo tratado por los métodos de la invención.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar GN mediada por el complejo inmune, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la GN mediada por el complejo inmune. El sujeto puede ser cualquier sujeto que puede beneficiarse del tratamiento, tal como un mamífero. En una modalidad preferida, el sujeto es un sujeto humano.

Como se usa en este documento, "GN" es una enfermedad renal caracterizada por el daño glomerular, mientras "GN mediada por el complejo inmune" significa que la GN se caracteriza por las deposiciones glomerulares de los complejos inmunes.

En una modalidad, la GN mediada por el complejo inmune se asocia con una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo que consiste de nefropatía IgA, lupus sistémico eritematoso (SLE) y enfermedad de Goodpasture. Como se usa en este documento, "tratamiento" de GN mediada por el complejo inmune significa (a) disminuir el progreso del daño glomerular; (b) disminuir el progreso de los depósitos del complejo inmune glomerular; (c) reducir la inflamación glomerular; (d) reducir los depósitos del complejo inmune glomerular y/o (d) disminuir el progreso de ESRD.

Como se muestra en los ejemplos que siguen, los inhibidores de 77 kD GPBP reparan las alteraciones basadas en colágeno de la membrana base glomerular, reducen los depósitos glomerulares de los complejos inmunes y la inflamación atenuada con la GN mediada por el complejo inmune, En una modalidad preferida de los métodos del primero y segundo aspectos de la invención, los inhibidores 77 kD GPBP pueden co-administrarse con uno o más de otros terapéuticos, tal como el estándar de terapéuticos de cuidados para la enfermedad siendo tratada. En una modalidad preferida, dicho uno o más compuestos se seleccionan del grupo que consiste de inhibidores de enzima de conversión de la angiotensina y bloqueadores del receptor angiotensina o sales farmacéuticamente aceptables del mismo en un portador farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos no limitantes de inhibidores de enzima de conversión de la angiotensina para usarse en la presente invención incluyen benazepril, benazeprilato, captopril, delapril, fentiapril, fosinopril, libenzapril, moezipril, pentopril, perindopril, pivopril, quinapril, quinaprilato, ramipril, espirapril, espiraprilato, zofenopril, ceronapril, enalapril, indolapril, lisinopril, alacepril y cilazapril o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los ejemplos no limitantes de los bloqueadores del receptor angiotensina para usarse en la presente invención incluyen losarían, candesartan, irbesartan, olmesartan, valsatan, telmisartan, eprosartan y tasosartan.

En otra modalidad, el inhibidor puede administrarse en combinación con belimumab.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar la fibrosis pulmonar (PF), comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la PF. El sujeto puede ser cualquier sujeto que puede beneficiarse del tratamiento, tal como un mamífero. En una modalidad preferida, el sujeto es un sujeto humano.

PF es la formación o desarrollo de tejido conectivo en exceso (fibrosis) en los pulmones. Los síntomas de fibrosos pulmonar incluyen, pero no se limitan a falta de aliento, sequedad crónica, tos seca, fatiga y debilidad, malestar en el pecho y/o pérdida del apetito y rápida pérdida de peso. La fibrosis pulmonar se sugiere por una historia de acortamiento progresivo de la respiración (disnea) con el esfuerzo. Algunas veces, crepitaciones inspiratorias finas pueden escucharse en la base de los pulmones en la auscultación. Un análisis CAT de alta resolución generalmente demostrará anprmalidades.

Como se muestra en los ejemplos que siguen, los inhibidores de GPBP fueron efectivos en el tratamiento de la PF inducida con doxorubicina, un modelo animal para PF humano.

La PF a tratarse con los métodos de la invención puede ser un efecto secundario de otras enfermedades (es decir: "enfermedad pulmonar intersticial", incluyendo pero no limitadas a enfermedades autoinmunes (por ejemplo: artritis reumatoide-RA-, SLE, escleroderma, etc.), infecciones virales y otros daños microscópicos al pulmón (tal como exposición a asbestos, silicón, humo de cigarro, etc.), o puede ser idiopática (es decir, "fibrosis pulmonar idiopática").

Como se usa en este documento, "tratamiento" de PF significa (a) disminuir el progreso de la fibrosis pulmonar, y/o (b) reducir los síntomas PF.

En una modalidad preferida de los métodos del tercer aspecto de la invención, los inhibidores 77 kD GPBP pueden co-administrarse con uno o más terapéuticos, tal como el estándar de terapéuticos de cuidados de una enfermedad siendo tratada. En una modalidad preferida, dicho uno o más compuestos se seleccionan del grupo que consiste de corticosteroides, inmunosupresores (incluyendo pero no limitados a ciclofosfamida, azatioprina y metotrexato), agentes antünflamatorios, IFN-?, micofenolato de mofetilo y pirfenidona.

En cada uno de estos aspectos, los métodos pueden llevarse a cabo en cualquier sujeto apropiado, tal como aquellos que se han identificado como sobre-expresión 77 kD GPBP. Por ejemplo, un valor normal de 77 kD GPBP como una referencia para una curva estándar es menor que 10 ng/ml en plasma. En varias modalidades preferidas, un rango normal 77 kD GPBP es entre -1 ng/ml - 10 ng/ml en plasma. Además, en una modalidad, los sujetos identificados como teniendo más de 10 mg/ml de 77 kD GPBP en su plasma se trataron de acuerdo con los métodos de la invención. Los métodos para determinar la cantidad de 77 kD GPBP circulante se conocen en la técnica (ver WO 2010/009856 y la Patente Estadounidense 7935492) y los ejemplos como se describieron anteriormente.

En cada uno de estos aspectos de la invención señalando los métodos de tratamiento terapéutico, cualquier inhibidor apropiado de 77 kD GPBP puede usarse. En una modalidad, el inhibidor se selecciona del grupo que consiste de 77 kD GPBP de ARN anti-sentido, 77 kD GPBP de siARN y anticuerpos 77 kD GPBP. En una modalidad preferida, el inhibidor de 77 kD GPBP es un anticuerpo 77 kD GPBP, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Se divulgan anticuerpos ejemplarizadores, por ejemplo en WO 2010/009856 y US 7935492. En una modalidad preferida, los anticuerpos reconocen el 77 kD GPBP nativo, incluyendo pero no limitado a aquellos anticuerpos divulgados en WO 2010/009856 y US 7935492, que proporciona enseñanzas a aquellos expertos en la técnica para generar anticuerpos para el 77 kD GPBP nativo. Como se usa en este documento, "anticuerpos para el 77 kD GPBP" significa que los anticuerpos se unen al 77 kD GPBP nativo y no requieren que no se unan a otras especies GPBP. En una modalidad preferida adicional que puede combinarse con cualquier otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo monoclonal humanizado.

El término anticuerpo como se usa en este documento se intenta para incluir fragmentos de anticuerpo del mismo que son selectivamente reactivos con los polipéptidos de la invención, o fragmentos del mismo. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y los fragmentos analizados para utilidad en la misma manera como se describieron anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab')2 pueden generarse mediante tratar el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir los puentes de bisulfuro para producir fragmentos Fab'.

Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos monoclonales incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistiendo esencialmente de los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab)2 y F(ab')2, fragmentos bivalentes comprendiendo dos fragmentos Fab unidos por un puente de bisulfuro en la región del puente; (ii¡) un fragmento Fd esencialmente consistiendo del dominio VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv consistiendo esencialmente de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546, que consiste esencialmente de un dominio VH y (vi) uno o más CDRs aislados o un paratopo funcional.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante obtener las células del bazo. (Ver Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)). En un ejemplo, los anticuerpos monoclonales (mAb) de interés se preparan mediante inmunizar ratones consanguíneos inmunizados con el 77 kD GPBP, o un fragmento antigénico del mismo. Los ratones se inmunizan por la ruta IP o SC en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmune. Los ratones reciben una inmunización inicial en el día O y se descansaron por aproximadamente 3 a aproximadamente 30 semanas. Los ratones inmunizados se proporcionaron con una o más vacunas de refuerzo mediante la ruta intravenosa (IV). Los linfocitos, de los ratones con anticuerpo positivo se obtuvieron mediante remover los bazos de los ratones inmunizados por los procedimientos estándares conocidos en la técnica. Las células hibridoma se produjeron mediante mezclar los linfocitos esplénicos con un compañero de fusión apropiada bajo condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables. Las células que producen anticuerpos y las células compañeras de fusión se fusionan en polietilenglicol en concentraciones desde aproximadamente 30% a aproximadamente 50%. Las células hibridoma fusionadas se seleccionan por el crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina suplementadas con Medio Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM) mediante los procedimientos conocidos en la técnica. Los fluidos sobrenadantes se colectaron de pozos de crecimiento positivos y sé analizaron para la producción de anticuerpos mediante el inmuno ensayo tal como el inmuno radio ensayo de fase sólida. Las células hibridoma de los pozos de anticuerpos positivos se clonaron mediante una técnica tal como técnica de agar suave de MacPherson, Técnicas de Agar Suave en Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson, Eds. Academic Press, 1973.

"Anticuerpo Humanizado" se refiere a anticuerpos derivados de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo monoclonal de ratón. Alternativamente, los anticuerpos humanizados pueden derivarse de anticuerpos quiméricos que retienen o retienen sustancialmente las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo no humano, parental pero que exhibe inmunogenicidad disminuida como se compara con el anticuerpo parental cuando se administra a humanos. Por ejemplo, anticuerpos quiméricos que pueden comprender fragmentos de anticuerpo murino y de humano, generalmente regiones variables de ratón y de humano constantes. Dado que los anticuerpos humanizados son menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos monoclonales no humanos, se prefieren para uso de anticuerpos terapéuticos.

Los anticuerpos humanizados pueden prepararse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a (1 ) injertar las regiones de determinación complementarias de un anticuerpo monoclonal no humano en una región constante y de estructura de humano ("humanización") y (2) transplantar los dominios variables del anticuerpo monoclonal no humano, pero "encubriéndolos" con una superficie como de humano mediante el reemplazo de residuos de la superficie ("chapeado"). Estos métodos se divulgan, por ejemplo, en, por ejemplo Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. ScL, EUA, 81 :6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. lmmunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991 ); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3):169-217 (1994) y Ketltleborough, C. A. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991 ).

Para generar una respuesta para el anticuerpo, los polipéptidos de la presente invención se formulan típicamente con un portador farmacéuticamente aceptable para la administración parenteral. Dichos adyuvantes aceptables incluyen pero no se limitan a: completos de Freund, incompletos de Freund, precipitado de alumbre, agua en emulsión de aceite conteniendo Corynebacterium parvum y tARN. La formulación de dichas composiciones, incluyendo la concentración del polipéptido y la selección del vehículo y otros componentes, está dentro de la habilidad de la técnica.

En otra modalidad, el inhibidor 77 kD GPBP es un inhibidor péptido divulgado en WO 2004/070025 y US 7326768 o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En una modalidad, el inhibidor péptido es un polipéptido comprendiendo o consistiendo de una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la fórmula general X1-SHCIX2-X3 (SEQ ID NO: 2), en donde: X1 es 0-10 aminoácidos de la secuencia ATTAGILATL (SEQ ID NO:3); X2 es E o Q y X3 es 0-10 aminoácidos de la secuencia L VKREDSWQ (SEQ ID NO:4).

En una modalidad preferida, el inhibidor péptido comprende o consiste de una secuencia seleccionada del grupo consistiendo de SHCIE (SEQ ID NO:5), SHCIQ (SEQ ID NO:6), ILATLSHCIELMVKR (SEQ ID NO: 7), y ILATLSHCIQLMVKR (SEQ ID NO: 8).

En otra modalidad, el inhibidor péptido comprende o consiste de al menos seis (6, 7, 8, 9 o todos) aminoácidos contiguos EKTAGKPILF (SEQ ID NO: 9). En una modalidad preferida, el polipéptido aislado comprende o consiste de la secuencia EKTAGKPILF (SEQ ID NO: 10).

Los polipéptidos además pueden derivarse para proporcionar media vida mejorada, tal como mediante la adición de polietilenglicol (PEG) o como de otra manera se conocen en la técnica. Los polipéptidos de la invención pueden comprender aminoácidos L, aminoácidos D (que son resistentes para las proteasas de aminoácidos L específicos en vivo), una combinación de aminoácidos L y D y varios aminoácidos de "diseñador" (por ejemplo, aminoácidos ß-metilo, aminoácidos Ca-metilo y aminoácidos Noc-metilo, etc.) para transmitir propiedades especiales. Los aminoácidos sintéticos incluyen ornitina para lisina y norleucina para leucina o isoleucina.

Además, los polipéptidos pueden tener uniones peptidomiméticas, tal como uniones de éster para preparar polipéptidos con propiedades novedosas. Por ejemplo, un polipéptido puede generarse para incorporar una unión de péptido reducido, por ejemplo, Ri-CH2-NH-R2, en donde R y R2 son residuos o secuencias de aminoácidos. Una unión del péptido reducida puede introducirse como una sub-unidad de dipéptidos. Dicho polipéptido sería resistente a la actividad proteasa y poseería una media vida extendida en vivo.

El término "polipéptido" se usa en su sentido más amplio para referirse a una secuencia de sub-unidad de aminoácidos, análogos de aminoácidos o peptidomiméticos. Las sub-unidades se unen por las uniones de péptidos, aunque el polipéptido puede comprender además porciones que no se unen necesariamente al polipéptido por una unión de péptido. Por ejemplo, como se divulgó anteriormente, el polipéptido además puede comprender una molécula de aminoácido que contiene un anillo aromático.

Los polipéptidos descritos en este documento pueden sintetizarse químicamente o expresarse recombinantemente. La expresión recombinante puede llevarse a cabo usando métodos estándares en la técnica, como se divulgó anteriormente. Dichos vectores de expresión pueden comprender vectores de expresión bacterial o viral, y dichas células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas.

De preferencia, los polipéptidos para usarse en los métodos de la presente invención se sintetizan químicamente. Los polipéptidos sintéticos, preparados usando las técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida o técnicas de condensación de péptidos o cualquier combinación de los mismos, pueden incluir aminoácidos naturales o no naturales. Los aminoácidos usados para la síntesis de péptidos pueden ser resina de aminoácido estándar Boc (Na-t-butilcarbonil protegido con ?a-amino) con protocolos estándar de desprotección, neutralización, acoplamiento y de lavado o aminoácidos 9-fluorenilmetoxicarbonil protegido con ?a-amino lábil de base estándar (Fmoc). Ambos aminoácidos protegidos con Fmoc y Boc ?a-amino pueden obtenerse de Sigma, Cambridge Research Biochemical u otras empresas químicas familiares para aquellos expertos en la técnica. Además, los polipéptidos pueden sintetizarse con otros grupos de protección Na que son familiares para aquellos expertos en esta técnica.

La síntesis de péptidos de fase sólida puede llevarse a cabo mediante técnicas familiares para aquellos expertos en la técnica, y proporcionados tal como mediante el uso de sintetizadores automatizados.

Los inhibidores del anticuerpo/péptido pueden administrarse juntos en una composición farmacéutica con un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además del inhibidor de péptidos (a) un lioprotectante; (b) un surfactante; (c) un agente de volumen; (d) un agente de ajuste de la tonicidad; (e) un estabilizante; (f) un preservativo y/o (g) un amortiguador (buffer). En algunas modalidades, el amortiguador en la composición farmacéutica es un amortiguador Tris, un amortiguador histidina, un amortiguador fosfato, un amortiguador citrato o un amortiguador acetato. La composición farmacéutica también puede incluir un lioprotectante, por ejemplo, sacarosa, sorbitol o trehalosa. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica incluye un preservativo por ejemplo, cloruro de benzalconio, bencetonio, clorohexidina, fenol, m-cresol, alcohol de bencilo, metilparabeno, propilparabeno, clorobutanol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, nitrato de fenilmercurio, timerosal, ácido benzoico y varias mezclas de los mismos. En otras modalidades, la composición farmacéutica incluye un agente de volumen, como glicina. En aún otras modalidades, la composición farmacéutica incluye un surfactante por ejemplo, polisorbato-20; polisorbato-40, polisorbato-60, polisorbato-65, polisorbato-80, polisorbato-85, poloxámero-188, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trilaurato de sorbitán, tristearato de sorbitán, triolesto de sorbitán, o una combinación de los mismos. La composición farmacéutica también puede incluir un agente que ajusta la tonicidad, por ejemplo, un compuesto que renderiza la formulación sustancialmente isotónica o isoosmótica con la sangre de humano. Los agentes de ajuste de la tonicidad ejemplarizadores incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrosa, inositol, cloruro de sodio, arginina y clorhidrato de arginina. En otras modalidades, la composición farmacéutica adicionalmente incluye un estabilizador, por ejemplo, una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés previene sustancialmente o reduce la inestabilidad física y/o química de la proteína de interés en forma liquida o liofilizada. Los estabilizadores incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, inositol, cloruro sódico, metionina, arginina y clorhidrato de arginina.

El anticuerpo/inhibidor péptido puede ser el agente activo solo en la composición farmacéutica o la composición además puede comprender uno o más agentes activos apropiados para un uso intentado.

En otra modalidad, el inhibidor 77 kD GPBP se selecciona del grupo que consiste de DAB-Am32, pinacidil y miricetina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, cada una de las cuales se demuestran en los ejemplos que siguen para ser efectivos en los métodos de la presente invención.

En una modalidad adicional, el inhibidor 77 kD GPBP es uno divulgado en WO 2011/054530 y US 201 10105545. Además, los compuestos pueden ser compuestos de la fórmula (I) o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos: o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde: R se selecciona de N y C 5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo CrC6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo(alquilo C C6), alcoxi CrC6, halo(alcoxi CrC6), amino, (alquil CrC6)amino, di(alquil Ci-C6)amino, hidroxi(alqu¡lo d-C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo C,-C6, amino(alquilo CrC6), sulfanil(alquilo C C6), (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo CrC6), -(CH2)i.5-C(0)( alcoxi C Ce), -(CH2)i.5-C(0)NH2, (aril) alquilo C2-C6, y (heteroaril) alquilo C C5; R, es hidrógeno, halógeno, hidroxi, CrC6 alquilo, halo(alquilo CrC6), alcoxi CrC5, halo(alcoxi CrC6), hidroxi(alquilo CrC6), (alcoxi C,-C6) alquilo CrC6, amino(alquilo Ci-C6), sulfanil(alquilo CrC6), o (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo CrCe); R2 es alquilo Ci-C6, halo(CrC6 alquilo), alcoxi Ci-C6, halo(CrC6 alcoxi), hidroxi(alquilo C C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo CrC6, formil(alquilo C0-C6), amino(alquilo CrC6), sulfanil(alquilo CrC6), (alquilo CrC6)sulfanil(alquilo C C6), -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i.5-C(0)( alcoxi C C6), -(CH2)i. 5-C(0)NH2, (aril) alquilo C^-C6, o (heteroaril) alquilo CrC6; R3 es alquilo Ci-C6, halo(alquilo Ci-Ce), CrC6 alcoxi, halo(alcoxi C Ce), hidroxi(alquilo C1-C6), (alcoxi C^Ce) alquilo CrC6, formil(alquilo C Ce), amino(alquilo Ci-Ce), sulfanil(alquilo CrC6), (alquilo C,-Ce)sulfenil(alquilo CrC6), -(CHZJLS-CÍOOH, -(CH^s-CiOHalcoxi CrC6), -(CH2) s-C(0)NH2, -(CH2)1.5-C(0)NH(alquilo C,-C6), -(CH2)1.5-C(0)N(alquilo Ci-Ce)2. -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)( alcoxi d-C6), (aril) alquilo CrC6, o (heteroaril) alquilo C C6; y R4 es hidroxi, halógeno, alquilo d-C6, alcoxi d-C6, halo(alcoxi Ci-C6), benciloxi, -(CH2)1.5-C(0)OH, -(CH2)1-5-C(0)(alcoxi C,-Ce), -(CH2)IJ-C(0)NH2I -(CH2)1-5-C(0)NH(alquilo C C6), -(CH2)i.5-C(0)N(alquilo d-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi C,-Ce). -0(CH2)1.5-C(0)OH, -0(CH2)i-5-C(0)(alcoxi CrC6), (arilo) alquilo CrC6, o (heteroarilo) alquilo C C6.

En otra modalidad, los compuestos inhibidores de la Fórmula (I) pueden ser aquellos de la Fórmula (II): En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos de la fórmula (I) o (II) en donde: R se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo d-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo (alquilo d-C6), alcoxi d-C6, halo (alcoxi d-C6), amino, (alquil d-d^mino, di(alquil d-CeJamino, hidroxi (alquilo C C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo C C6, amino(alquilo d-C6), sulfanil(alquilo d-C6), (alquilo d-C6)sulfanil(alquilo d-C6), -(CH2)i^-C(0)( alcoxi d-Ce), y -(CH2)1-s-C(0)NH2; RÍ es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo d-C6, halo (alquilo C^-Ce), alcoxi d-C6, halo (alcoxi Ci-Ce), hidroxi (alquilo d-C6), (alcoxi d-C6) alquilo d-C6, amino (alquilo d-C6), sulfanil (alquilo C C6), o (alquilo d-C6) sulfanil (alquilo d-C6); R2 es alquilo C,-C6, halo (alquilo d-C6), alcoxi d-Ce, halo (alcoxi d-C3), hidroxi (alquilo d-C6), (alcoxi C C6) alquilo d-C6, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo CrC6), sulfanil (alquilo d-C6), (alquilo d-C6) sulfanil (alquilo d-C6), -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH^^s-CiOKalcoxi d-C6), o -(CH2),. 5-C(0)NH2; R3 es alquilo C C6, halo (alquilo C Ce), alcoxi d-d. halo (alcoxi d-Ce), hidroxi (alquilo d-d). (alcoxi C C6) alquilo C,-C6, formil (alquilo d-d), amino (alquilo C C6), sulfanil (alquilo Cr C6), (alquilo d-d) sulfanil (alquilo C,-C6), -(CH^Ls-CiOJOH, -(CH2)i.5-C(0)(alcoxi d-Ce). -(CH2)i. 5-C(0)NH2, -(CH2)i.5-C(0)NH(alquilo C C6), -(CH^^-dC Nialquilo d-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcoxi d-d); y R es hidroxi, halógeno, alquilo d-d, alcoxi d-d. halo (alcoxi d-d). benciloxi, -(CHZJLJ-CÍOJOH, -(CH2)1-5-C(0)(alcoxi d-Ce), -(CH2)1.5-C(0)NH2, -(CH2)i.5-C(0)NH(alquilo d-d), -(CH2)1-5-C(0)N(alquilo Ci-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi d-d), -OÍCHzJ^g-CÍOJOH, o -0(CH2)1-5-C(0)(alcoxi d-d)- En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos de la fórmula (I) o (II) en donde: R se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo d-d. alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo(alquilo d-d). alcoxi Ci-C6, halo(alcoxi d-d). amino, (alquil d-d)amino, di(alquil Ci-C6)amino, hidroxi (alquilo d-d). (alcoxi d-d) alquilo C,-C6, y amino(alquilo Ci-C6); R, es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo d-d, halo (alquilo d-d), alcoxi Ci-C6, o halo (alcoxi d-d); R2 es alquilo d-d, halo (alquilo d-d). hidroxi (alquilo d-d). (al coxi d-d) alquilo Ci-Ce, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo Ci-C6), sulfanil (alquilo d-d), o (alquilo d-d) sulfanil (alquilo C Ce); R3 es alquilo d"d. -(CHz^s-dOJOH, -(CHzKs-dOXalcoxi d-d), -(CH^.s-CÍOJNH;,, -(CH2)i-5-C(0)NH (alquilo CrC6), -(CH2)1-5-C(0)N(alquilo d-d)2, -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcoxi C C6); y R4 es hidroxi, halógeno, alquilo d-d. alcoxi d-d, halo (alcoxi d-d). benciloxi, -(CH2)1-5-C(0)OH, -(CH2)1-5-C(0)(alcoxi), d-d -(CH^.s-CÍOJNhk, -(CH2)1-s-C(0)NH(alquilo d-d).

-(CH2)i-5-C(0)N(alquilo C^-Ceh, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi C,-C6), -0(CH2)1-5-C(0)OH, o -OÍCHzJ^-CÍOJÍalcoxi C,-C6).

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos de fórmula (II), en donde R es N. Estos compuestos pueden representarse por la Fórmula (III): En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos de la Fórmula (II), en donde R es CR5. Estos compuestos pueden representarse por la Fórmula (IV): En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describieron anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde es hidrógeno, hidroxi o alcoxi d-C6.

En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describieron anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R, es hidrógeno.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describieron anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R2 es alquilo C C6, halo (alquilo CrC6), hidroxi (alquilo CrC6), formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo CrC6), o sulfanil (alquilo C Ce).

En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R2 es alquilo C^-C6, halo (alquilo C Ce), hidroxi (alquilo C C8), o formil (alquilo C0-C6).

En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia con cualquiera de las formulas (l)-(IV), en donde R2 puede ser alquilo C Ce, halo (alquilo CrCis), o hidroxi (alquilo C Ce). Por ejemplo, en ciertas modalidades R2 puede ser alquilo C -C6 tal como metilo, etilo o isopropilo. En otras modalidades, R2 puede ser halo (alquilo C^-Ce) tal como fluorometilo, difluorometilo o trifluorometilo. R2 puede en ciertas modalidades ser hidroxi (alquilo ?^?ß). Por ejemplo, el hidroxi (alquilo ?,-?ß) puede ser hidroximetilo, 1 -hidroxietilo, o 2-hidroxietilo.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencias cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R2 es alquilo CrC6. En ciertas modalidades preferidas R2 es metilo.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia con cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R3 es alquilo 0,-06, -(CH2)1.5-C(0)OH) -(CH2)1.5-C(0)(alcoxi C,-C6), -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcoxi C C6).

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R3 es -(CH2)1.5-C(0)OH, -(CH2)1-5-C(0)(alcox¡ d-C6), o -(CH2)1-5-C(0)NH2.

En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R3 es -(CH2)1.2-C(0)OH, o -(CH2)1.2-C(0)(alcoxi C C6). Por ejemplo, en ciertas modalidades, R3 puede ser -(CH2)2-C(0)OH, -(CH2)2-C(0)(OCH3), -(CH2)2-C(0)(OCH2CH3), o -(CH2)2-C(0)(OC(CH3)3). En otras modalidades, R3 puede ser -(CH2)2-C(0)OH, o -(CH2)2-C(0)(OCH2CH3).

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia con cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R3 es -(CH^.Ü-CÍC OH. De preferencia R3 es -(CH2)2-0(O)OH.

En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde Ft, es hidroxi, halógeno, alquilo Ci-C6, alcoxi CrC6, halo (alcoxi d-C6), o benciloxi.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde R4 es hidroxi o alcoxi C Ce (por ejemplo, metoxi). De preferencia R4 es alcoxi Ci-C6. En una modalidad más preferida, R4 es metoxi.

En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a las fórmulas (I), (II), o (IV), en donde R5 es alquilo C,-C6, halo (alquilo Ci-C6), alcoxi C Ce, o halo (alcoxi Ci-Ce).

En otra modalidad' preferida, los inhibidores son compuestos como se describieron anteriormente con referencia* a las fórmulas (I), (II), o (IV), en donde R5 es alquilo C C6,tal como metilo.

En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a las fórmulas (I), (II), o (IV), en donde R5 es halo (alquilo 0G06), tal como trifluorometilo.

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de las fórmulas (I), (II), o (IV), en donde: R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo C C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo (alquilo CrC6), alcoxi C C6, halo (alcoxi C^Ce), amino, (alquilo C C6)amino, di(alquilo C Ceíamino, hidroxiíalquilo Ci-Ce), (alcoxi Ci-Ce) alquilo C,-C6, y amino (alquilo C Ce); R, es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo CrC6, halo (alquilo CrC6), alcoxi C Ce, o halo (alcoxi C!-C6); R2 es alquilo CrC6, halo (alquilo C C6), hidroxi (alquilo C Ce), (alcoxi CrC6) alquilo CrC6, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo CrC6), sulfanil (alquilo CrC6), o (alquilo C C6) tio (alquilo Cr Ce); R3 es -(CH2)i.2-C(0)OH, -(CH2)i_2-C(0) (alcoxi CrC6), -(CH2)i.2-C(0)NH2, -(CH2)1.2-C(0)NH(alquilo CrC6), -(CH2)1-2-C(0)N(alquilo Cree)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)( alcoxi CrC6); y R4 es hidroxi, alcoxi Ci-Ce, halo (alcoxi CrC6), o benciloxi.

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de la fórmula (III), en donde: Ri es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo d-Ce, halo (alquilo CrC6), alcoxi CrC6, o halo (alcoxi CrC6); R2 es alquilo CrC6, halo (alquilo CrC6), hidroxi (alquilo CrCe), (alcoxi CrC6) alquilo CrC6, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo CrC6), sulfanil (alquilo CrC6), o (alquilo Ci-Ce) tio (alquilo Ci-Ce); R3 es -(CH2)1.2-C(0)OH, -(CH2)i-2-C(0)(alcoxi CrC6), -(CH2)i.2-C(0)NH2l -(CH2)i.2-C(0)NH(alquilo Ci-C6), -(CH^.ü-CíOMalquilo CrC6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)( alcoxi CrC6); y R4 es hidroxi, alcoxi C1-C6, halo (alcoxi CrC6), o benciloxi.

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de las fórmulas (I), (II), o (IV), en donde es hidrógeno; R2 es alquilo Ci-Ce, halo (alquilo C^Ce), hidroxi (alquilo CrC6), o formil (alquilo CrC6); R3 es -(CH2)i.2-C(0)OH, -(CH2)i.2-C(0)(alcoxi d-Cg), o -(CH2)i-2-C(0)NH2; R4 es hidroxi o alcoxi CrC6; y R5 es alquilo C,-Ct, halo (alquilo C^Ce), alcoxi Ci-C6, o halo (alcoxi C -Ce).

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de la fórmula (III), en donde Ri es hidrógeno; R2 es alquilo C C6, halo (alquilo Ci-Ce), hidroxi (alquilo C C6), o formil (alquilo Ci-Ce); R3 es -(CH^.z-CÍC OH, -(CH2)1.2-C(0)(Ci-C6 alcoxi), o -(CH2)i.2-C(0)NH2; R4 es hidroxi o alcoxi Ci-C6; y R5 es alquilo Ci-C6, halo (alquilo Ci-C6), Ci-C6 alcoxi, o halo(alcoxi Ci-C6).

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de las fórmulas (IH'V), en donde: R, si está presente se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo Ci-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo (alquilo Ci-C6), alcoxi C^Ce, halo (alcoxi C,-C6), amino, (alquil CrC6) amino, di (alquil C Cj amino, hidroxi (alquilo C^Ce), (alcoxi CrC6) alquilo Cr C6, y amino (alquilo C^Ce); RÍ es hidrógeno; R2 es d-Ce alquilo; R3 es -(CH2)i.2-C(0)OH; y R4 es alcoxi C,-C6.

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de las fórmulas (l)-(IV), en donde: R, si está presente, se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo Ci-Ce, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo (alquilo C -C6), alcoxi Ci-C6, halo (alcoxi (- -06), amino, (alquil CrC6) amino, di (alquil Ci-C6) amino, hidroxi (alquilo Ci-Ce), (alcoxi Ci-C6) alquilo C C6, y amino(alquilo Ci-C6); Ri es hidrógeno ; R2 es metilo; R3 es -(CH2)2-C(0)OH; y R4 es metoxi.

En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos de la Fórmula (V), son de la Fórmula (VI): En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos de la fórmula (V) o (VI) en donde: R se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo CrC<¡, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo (alquilo CrC6), alcoxi Ci-C6, halo (alcoxi Ci-Ce), amino, (alquil C C6) amino, di (alquil C-,-Ce) amino, hidroxi (alquilo C,-Ce), (alcoxi C,-C6) alquilo C,-C6, amino(alquilo CrCe , sulfanil (alquilo C^Ce), (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo Ci-Ce), -(CH2)14-C(0)0H, -(CH2),.5-C(0)(alcoxi C,-C6), y -(CH2)«-C(0)NH2; Ri es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo C C6, halo (alquilo Ci-C6), alcoxi Ci-Ce, halo (alcoxi Ci-Ce), hidroxi (alquilo Ci-C6), (alcoxi C C6) alquilo Ci-Ce, amino (alquilo Ci-Ce), sulfanil (alquilo Ci-C6), o (alquilo Ci-C6) sulfanil (alquilo Ci-C6); R2 es alquilo Ci-C6, halo (alquilo Ci-C6), alcoxi Ci-C6, halo (alcoxi Ci-C6), hidroxi (alquilo d-C6), (alcoxi ?^?e) alquilo Ci-C6, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo Ci-Ce), sulfanil (alquilo Ci-Ce), (alquilo Ci-C6)sulfanil(alqu¡lo CrCe), -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i.5-C(0)(alcoxi d-Ce). -(CH2),. 5-C(0)NH2, -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcoxi C,-C6); y R6 es hidroxi, halógeno, alquilo C C6, alcoxi C C6, halo (alcoxi Ci-C6), benciloxi, -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i.5-C(0)(alcoxi C C6), -(CH2)i.5-C(0)NH2, -(CH2)i.5-C(0)NH(alqu¡lo C,-Ce), -(CH2)i.5-C(0)N(alquilo C1-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi Ci-C6), o -OS(0)2CF3.

En otra modalidad preferida, la divulgación proporciona compuestos de la fórmula (V) o (VI) en donde: R se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo Ci-C6, alquenilo C2-C5, alquinilo C2-C6, halo (alquilo Ci-Ce), alcoxi Ci-C6, halo (alcoxi Ci-C6), amino, (alquil Ci-C6) amino, di (alquil Ci-C6)amino, hidroxi (alquil Ci-C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo d-C6, y amino(alquilo Ci-C6); R, es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo Ci-C6, halo (alquilo Ci-C6), alcoxi Ci-C6, o halo (alcoxi Ci-C6); R2 es alquilo Ci-C6, halo (alquilo C C6), hidroxi (alquilo Ci-C6), (alcoxi C C6) alquilo Ci-C6, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo Ci-C6), sulfanil (alquilo d-C6), (alquilo C1-C6)sulfantl(alquilo Ci-Ce) , -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcoxi Ci-C6); y R6 es hidroxi, halógeno, alquilo Ci-C6, alcoxi Ci-C6, halo(alcoxi Ci-C6), benciloxi, -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i.5-C(0)(alcoxi d-C3), -(CH2)i.5-C(0)NH2, -(CH2)i.5-C(0)NH(alquilo C,-Ce), -(CH2)i.5-C(0)N(alquilo Ci-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)( alcoxi d-Ce), o -OS(0)2CF3.

En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se divulgó anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (V)-(VI), en donde R-¡ es hidrógeno.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (V)-(VI), en donde R2 es alquilo C,-C6, halo (alquilo C C6), hidroxi (alquilo CrC6), formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo CrC6), sulfanil (alquilo C C6), -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcox¡ CrCe).

En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las Fórmulas (V)-(VI), en donde R2 es alquilo CrC6, halo (alquilo C C6), hidroxi (alquilo CrC6), formil (alquilo C0-C6), -CH=CH-C(0)OH, o -CH=CH-C(0)(alcoxi C Ce).

En aún otra modalidad preferida, la divulgación proporciona compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (V)-(VI), en donde R2 puede ser alquilo CrC6, halo (alquilo CrC6), hidroxi (alquilo C,-C6), o -CH=CH-C(0)(alcoxi CrC6). Por ejemplo, en ciertas modalidades, R2 puede ser alquilo CrCe tal como metilo, etilo o isopropilo. En otras modalidades, R2 puede ser halo (alquilo CrC6) tal como fluorometilo, difluorometilo, o trifluorometilo. R2 puede, en ciertas modalidades ser hidroxi (alquilo CrC6). Por ejemplo, el hidroxi (alquilo CrC6) puede ser hidroximetilo, 1 -hidroxietilo, o 2-hidroxietilo.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describieron anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (V)-(VI), en donde R2 es alquilo CrC6. En ciertas modalidades preferidas R2 es metilo.

En una modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a cualquiera de las fórmulas (V)-(VI), en donde Re es hidroxi, halógeno, alquilo CrC6, alcoxi CrC6, halo (alcoxi CrC6), benciloxi, o -OS(0)2CF3.

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia con cualquiera de las Fórmulas (V)-(VI), en donde R6 es hidroxi o alcoxi C Ce (por ejemplo, metoxi).

En una modalidad preferida, la divulgación proporciona compuestos como se describió anteriormente con referencia a las fórmulas (V)-(VI), en donde R5 es alquilo C^-C3, halo (alquilo C C6), CrC6 alcoxi, o halo (alcoxi d-Ce).

En otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a las Fórmulas (V)-(VI), en donde R5 es alquilo C^Ce, tal como metilo.

En aún otra modalidad preferida, los inhibidores son compuestos como se describió anteriormente con referencia a las Fórmulas (V)-(VI), en donde R5 es halo (alquilo CrC6), tal como trifluorometilo.

En ciertas modalidades preferidas, la divulgación proporciona compuestos de cualquiera de las Fórmulas (V)-(VI), en donde: R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo d-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo (alquilo CrC6), alcoxi C -CQ, halo (alcoxi C Ce), amino, (alquil C1-Ce)amino, di(alquil d-CeJamino, hidroxi (alquilo C C6), (alcoxi C C6) alquilo C,-C6, y amino (alquilo d-Ce); es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo C Ce, halo (alquilo C,-C6), CrC6 alcoxi, o halo (alcoxi C Ce); R2 es alquilo CrC6, halo (alquilo C Ce), hidroxi (alquilo Ci-Ce), (alcoxi C C6) alquilo ?,-?ß, formil (alquilo C0-C6), amino (alquilo C C6), sulfanil (alquilo C C6), (alquilo (^-?ß) tio (alquilo C,-Ce). o -CH=CH-C(0)( alcoxi C C6) y R6 es hidroxi, alcoxi Ci-C6, halo (alcoxi ( Ce), o -OS(0)2CF3.

En ciertas modalidades preferidas, los inhibidores son compuestos de cualquiera de las Fórmulas (V)-(VI), en donde es hidrógeno; R2 es alquilo CrC6, halo (alquilo C C6), hidroxi (alquilo C,-C6), formil (alquilo C0-Ce), o -CH=CH-C(0)(alcoxi C^Ce); R6 es hidroxi, alcoxi ?,-?ß, o -OS(0)2CF3; y R5 es alquilo C^Ce, halo (alquilo C Ce), alcoxi ?,-Ce, o halo(alcoxi 0G06). Los compuestos del inhibidor GBPB incluyen sales, esteres, amidas y pro-fármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos, incluyendo pero no limitados a sales de carboxilato, sales de adición del aminoácido, esteres, amidas y pro-fármacos de los compuestos de la presente invención que están dentro del alcance del criterio médico, apropiado para usarse en contacto con los tejidos de los pacientes sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesiva y los similares, en proporción con un porcentaje de beneficio/riesgo razonable y efectivo para el uso intentado, así como las formas zwitterionicas, donde es posible, de los compuestos de la invención. El término "sales" se refiere a sales de adición orgánicas e inorgánicas relativamente no tóxicas de los compuestos de la presente invención. Estas sales pueden prepararse in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos o mediante la reacción separada del compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido inorgánico u orgánico apropiado y el aislamiento de las sales así formadas. Las sales representativas incluyen sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato y los similares. Estas pueden incluir cationes basados en metales álcali y alcalino tórreos, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio y los similares, así como cationes amonio no tóxicos, amonios cuaternarios y amina pero no limitados a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y los similares. (Ver por ejemplo, Berge S.M. et al., "Pharmaceuticai Salts," J. Pharm. Sci., 1977;66: 1 -19 que se incorpora en este documento como referencia).

Los ejemplos de esteres no tóxicos farmacéuticamente aceptables de los inhibidores incluyen esteres alquílicos C 1-Ce, en donde el grupo alquilo es lineal o ramificado, sustituido o no sustituido, esteres cicloalquílicos C5-C7 así como esteres arilalquílicos tales como bencilo y trifenilmetilo. Se prefieren los esteres alquílicos CrC4i tal como metilo, etilo, 2,2,2-tricloroetilo y tert-butilo. Los esteres de los compuestos de la presente invención pueden prepararse de acuerdo con métodos convencionales.

Los ejemplos de amidas no tóxicas farmacéuticamente aceptables de los inhibidores incluyen amidas derivadas de amoníaco, amidas alquilo Ci-Ce primarias y dialquil aminas Ci-C6 secundarias, en donde los grupos alquilo son lineales o ramificados. En el caso de aminas secundarias, la amina también puede estar en la forma de un heterociclo de 5 o 6 miembros conteniendo un átomo de nitrógeno. Se prefieren amidas derivadas de amoníaco, aminas primarias alquilo C1-C3 y aminas secundarias dialquilo Ci-C2. Las amidas de los compuestos de la invención pueden prepararse de acuerdo con los métodos convencionales.

El término "pro-fármaco" se refiere a compuestos que se transforman rápidamente en vivo para producir el compuesto madre de la fórmula anterior, por ejemplo, mediante hidrólisis en sangre. Se proporciona una divulgación cuidadosa de pro-fármacos en ¡n T. Higuchi y V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 de la Serie del Simposio A.C.S. y en Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceuticai Association y Pergamon Press, 1987, ambas de las cuales se incorporan en este documento como referencia.

El término "alquenilo" como se usa en este documento, significa un hidrocarburo de cadena ramificada o lineal, conteniendo desde 2 a 10 carbonos, a menos que se especifique de otra manera y conteniendo al menos un enlace doble de carbono a carbono. Los ejemplos representativos de alquenilo incluyen etenil, 2-propenil, 2-metil-2-propenil, 3-butenil, 4-pentenil, 5-hexenil, 2-heptenil, 2-metil-1-heptenil, 3-decenil y 3,7-d¡metilocta-2,6-dien¡lo.

El término "alcoxi" como se usa en este documento, significa un grupo alquilo, como se define en este documento, indexado a la porción molecular madre a través de un átomo de oxigeno. Los ejemplos representativos de alcoxi, incluyen pero no se limitan a metoxi, etoxi, propoxi, 2-propox¡, butoxi, tert-butoxi, pentiloxi y hexiloxi.

El término "alquilo" como se usa en este documento, significa un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada de 1 a 10 átomos de carbono a menos que se especifique de otra manera. Los ejemplos representativos de, alquilo incluyen, pero no se limitan a: metilo, etilo, n-propilo, ¡so-propilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo, tert-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentil,2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, y n-decilo. Cuando un grupo "alquilo" es un grupo de unión entre otras dos porciones, entonces también puede ser una cadena lineal o ramificada, los ejemplos incluyen pero no se limitan a -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CHC(CH3)-, -CH2CH(CH2CH3)CH2-.

El término "aíquileno" se refiere a un grupo alquilo bivalente. Una "cadena de aíquileno" es un grupo polimetileno, es decir, -(CH2)n-, en donde n es un número entero positivo, de preferencia de uno a seis, de uno a cuatro, de uno a dos o de dos a tres. Una cadena de aíquileno sustituido es un grupo polimetileno en el cual uno o más átomos de hidrógeno metileno se reemplaza con un sustituyente. Los sustituyentes apropiados incluyen aquellos posteriormente descritos para un grupo alifático sustituido. Una cadena de aíquileno también puede sustituirse en una o más posiciones con un grupo alifático o un grupo alifático sustituido.

El término "alquinilo" como se usa en este documento, significa un grupo hidrocarburo de cadena lineal o ramificada conteniendo de 2 a 10 átomos de carbono y conteniendo al menos un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos representativos de alquinilo incluyen pero no se limitan a acetilenilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 3-butinilo, 2-pentinilo y 1-butinilo.

El término "arilo" como se usa en este documento, significa un fenilo (es decir, arilo monocíclico), o un sistema de anillo bicíclico conteniendo al menos un anillo fenilo o un anillo bicíclico aromático conteniendo solamente átomos de carbono en el sistema de anillo bicíclico aromático. El arilo bicíclico 'puede ser azulenilo, naftilo o un fenilo fusionado a un cicloalquilo monociclico, un cicloalquenilo monocíclico, o un heterocíclico monocíclico. El arilo bicíclico se une a la porción molecular madre a través de cualquier átomo de carbono contenido dentro de la porción de fenilo del sistema bicíclico o cualquier átomo de carbono con el anillo de naftilo o azulenilo. Las porciones heterocíclicas monocíclicas o del cicloalquilo monocíclico fusionado del arilo bicíclico se sustituyen opcionalmente con uno o dos grupos tia y/u oxo. Los ejemplos representativos de los arilos bicíclicos incluyen pero no se limitan a azulenilo, naptilo, dihidroinden-1-il, dihidroinden-2-il, dihidroinden-3-il, dihidroinden-4-il, 2,3-dihidroindol-4-il, 2,3-dihidroindol-5-il, 2,3-dihidroindol-6-il, 2,3-dihidroindol-7-il, inden-1-il, inden-2-il, inden-3-il, inden-4-il, dih¡dronaftaleno-2-il, dihidronaftaleno-3-il, dihidronaftaleno-4-il, dihidronaftaleno-1-il, 5,6,7,8-tetrahidronaftaleno-1-il, 5,6,7, 8-tetrahidronaftaleno-2-il, 2,3-dihidrobenzofuran-4-il, 2,3-dihidrobenzofuran-5-il, 2,3-dihidrobenzofuran-6-il, 2,3-dihidrobenzofuran-7-il, benzo[d][1 ,3]dioxol-4-il, benzo[d][1 ,3]dioxol-5-il, 2H-cromen-2-on-5-il, 2H-cromen-2-on-6-il, 2H-cromen-2-on-7-il, 2H-cromen-2-on-8-il, isoindolina-1,3-dion-4-il, isoindolina-1 ,3-dion-5-il, inden-1-??-4-il, inden-1-on-5-il, inden-1-on-6-il, inden-1-on-7-il, 2,3-dihidrobenzo[b][1 ,4]dioxan-5-il, 2,3-dihidrobenzo[b][1 ,4]dioxan-6-il, 2H-benzo[b][1 ,4]oxazin3(4H)-on-5-il, 2H-benzo[b][1 ,4]oxazin3(4H)-??-6-il, 2H-benzo[b][1 ,4]oxazin3(4H)-on-7-il, 2H-benzo[b][1 ,4]oxazin3(4H)-on-8-il, benzo[d]oxazin-2(3H)-on-5-il, benzo[d]oxazin-2(3H)-on-6-il, benzo[d]oxazin-2(3H)-on-7-il, benzo[d]oxazin-2(3H)-on-8-il, quinazolin-4(3H)-on-5-il, quinazolin-4(3H)-on-6-il, quinazolin-4(3H)-on-7-il, quinazolin-4(3H)-on-8-il, quinoxalin-2(1 H)-on-5-il, quinoxalin-2(1 H)-on-6-il, quinoxalin-2(1 H)-on-7-il, quinoxalin-2(1 H)-on-8-il, benzo[d]tiazol-2(3H)-on-4-il, benzo[d]tiazol-2(3H)-on-5-il, benzo[d]tiazol-2(3H)-on-6-il, y, benzo[d]tiazol-2(3H)-on-7-il. En ciertas modalidades, el arilo bicíclico es (i) naptilo o (ii) un anillo fenilo fusionado a un cicloalquilo monocíclico de 5 o 6 miembros, un cicloalquenilo monocíclico de 5 o 6 miembros o un heterocíclilo monocíclico de 5 o 6 miembros, en donde los grupos cicloalquilo, cicloalquenilo y heterocíclilo se sustituyen opcionalmente con uno o dos grupos que son independientemente oxo o tia.

El término "halo" o "halógeno" como se usa en este documento, significa -Cl, -Br, -I o -F.

Los términos "haloalquilo", "haloalquenilo" y "haloalcoxi" se refieren a un grupo alquilo, alquenilo o alcoxi, según sea el caso, que se substituye con uno o más átomos de halógeno.

El término "heteroarilo," como se usa en este documento, significa un sistema de anillo heteroarilo monocíclico o biciclico conteniendo al menos un anillo heteroaromático. El heteroarilo monocíclico puede ser un anillo de 5 o 6 miembros. El anillo de 5 miembros consiste de dos dobles enlaces y uno, dos, tres o cuatro átomos de nitrógeno y opcionalmente un átomo de oxígeno o azufre. El anillo de seis miembros consiste de tres enlaces dobles y uno, dos, tres o cuatro átomos de nitrógeno. El heteroarilo de 5 ó 6 miembros se conecta a la porción molecular madre a través de cualquier átomo de carbono o cualquier átomo de nitrógeno contenido dentro del heteroarilo. Los ejemplos representativos del heteroarilo monocíclico incluyen pero no se limitan a furilo, imidazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadíazolilo, oxazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, pirazolilo, pirrolilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, tienilo, triazolilo y triazinilo. El heteroarilo biciclico consiste de un heteroarilo monocíclico fusionado a un fenilo, un cicloalquilo monocíclico, un cicloalquenilo monocíclico, un heterocíclico monocíclico o un heteroarilo monocíclico. La porción de heterocíclico o cicloalquilo fusionado del grupo heteroarilo biciclico se sustituye opcionalmente con uno o dos grupos que son independientemente oxo o tia. Cuando el heteroarilo biciclico contiene un anillo cicloalquilo, cicloalquenilo o heterocíclilo fusionado, entonces el grupo heteroarilo biciclico se conecta a la porción molecular madre a través de cualquier átomo de carbono o nitrógeno contenido dentro de la porción de heteroarilo monocíclico del sistema de anillo biciclico. Cuando el heteroarilo biciclico es un heteroarilo monocíclico fusionado a un anillo venzo, entonces el grupo heteroarilo bicíclico se conecta a la porción molecular madre a través de cualquier átomo de carbono o átomo de nitrógeno dentro del sistema de anillo bicíclico. Los ejemplos representativos del heteroarilo bicíclico incluyen pero no se limitan a bencimidazolil, benzofuranil, benzotienil, benzoxadiazolil, benzóxatiadiazolil, benzotiazolil, cinnolinil, 5,6-dihidroquinolin-2-il, 5,6-dihidroisoquinolin-1-il, furopiridinil, indazolil, indolil, isoquinolinil, naftiridinil, quinolinil, purinil, 5,6,7,8-tetrahidroquinolin-2-il, 5,6,7,8-tetrahidroquinolin-3-il, 5,6,7,8-tetrahidroquinol¡n-4-il, 5,6,7,8-tetrahidroisoquinolin-1-il, tienopiridinil, 4,5,6J-tetrahidrobenzo[c][1 ,2,5]oxadiazolil, y 6,7-dihidrobenzo[c][1 ,2,5]oxadiazol-4(5H)-onil. En ciertas modalidades, el heteroarilo bicíclico fusionado es un anillo heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros fusionado a un anillo fenilo, un cicloalquilo monocíclico de 5 o 6 miembros, un cicloalquenilo monocíclico de 5 o 6 miembros, un ¦ heterociclilo monocíclico de 5 o 6 miembros, o un heteroarilo monocíclico de 5 o 6 miembros, en donde los grupos cicloalquilo, cicloalquenilo y heterociclilo fusionados se sustituyen opcionalmente con uno o dos grupos que son independientemente oxo o tía.

Los inhibidores GPBP se combinan ordinariamente con uno o más adyuvantes apropiados para la ruta indicada de administración. Los inhibidores pueden mezclarse con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, esteres de celulosa de los ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de los ácidos sulfúricos y fosfóricos, acacia, gelatina, alginato de sodio, polivinilpirrolidina, y/o alcohol de polivinilo, y entabletados o encapsulados para administración convencional. Alternativamente, los inhibidores pueden disolverse en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, soluciones coloidales de carboximetil celulosa, etanol, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semillas de algodón, goma de tragacanto y/o varios estabilizadores. El portador o diluyente puede incluir material de retraso del tiempo, tal como monoestearato de glicerilo o distearato de glicerilo solo o con una cera, u otros materiales bien; conocidos en la técnica.

Los inhibidores pueden administrarse como el agente farmacéutico activo solo o pueden usarse en combinación con uno o más de otros compuestos útiles para llevar a cabo los métodos de la invención. Cuando se administran como una combinación, los agentes terapéuticos pueden formularse como composiciones separadas que se proporcionan al mismo tiempo o en diferentes tiempos o los agentes terapéuticos pueden proporcionarse como una sola composición.

Los inhibidores pueden hacerse en una forma sólida (incluyendo gránulos, polvos o supositorios) o en una forma líquida (por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones). Los inhibidores pueden aplicarse en una variedad de soluciones y pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como preservativos, estabilizantes, agentes humectantes, emulsificantes, estabilizantes, etc.

Los inhibidores pueden administrarse oralmente, tópicamente, parenteralmente, mediante inhalación o rocío, o rectalmente en formulaciones de dosis unitaria conteniendo portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos. El término parenteral como se usa en este documento incluye percutáneo, subcutáneo, intravascular (por ejemplo, intravenoso), intramuscular o inyección intratecal o técnicas de infusión y los similares. Las composiciones farmacéuticas conteniendo inhibidores pueden estar en una forma apropiada para uso oral, por ejemplo, como tabletas, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas o aceitosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o suaves, o jarabes o elíxires.

Las composiciones intentadas para uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste de agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes preservativos para proporcionar preparaciones sabrosas. Las tabletas contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son apropiados para la fabricación de tabletas. Estos excipientes pueden ser por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio, agentes desintegrantes y de granulación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico, agentes enlazantes, por ejemplo almidón, gelatina o acacia y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden ser no cubiertas o pueden cubrirse por técnicas conocidas. En algunos casos, dichos recubrimientos pueden prepararse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y por lo tanto proporcionar una acción sostenida por un periodo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material para el retraso del tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones para el uso oral también pueden prepararse como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín o como cápsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio aceitoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes apropiados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, cárboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropil-metilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia; los agentes humectantes o de dispersión pueden ser un fosfátido de ocurrencia natural, por ejemplo, lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenooxicetanol o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol polioxietileno o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por .ejemplo monooleato de sorbitán de polietileno. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más preservativos, por ejemplo etilo, o n-propil p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones aceitosas pueden formularse mediante la suspensión de los inhibidores en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón o aceite de coco o en un aceite mineral, tal como una parafina líquida. Las suspensiones aceitosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol de cetilo. Los agentes edulcorantes y los agentes saborizantes pueden agregarse para proporcionar preparaciones orales sabrosas. Estas composiciones pueden preservarse por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos dispersables y granulos apropiados para la preparación de una suspensión acuosa por la adición de agua proporcionan los inhibidores en mezcla con un agente humectante o de dispersión, agente de suspensión y uno o más preservativos. Los agentes humectantes o de dispersión apropiados o agentes de suspensión se ejemplifican por aquellos ya anteriormente mencionados. Los excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, agentes saborizantes y colorantes también pueden estar presentes.

Los inhibidores también pueden administrarse en la forma de emulsiones de aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de estos. Los agentes emulsificantes apropiados pueden ser gomas de ocurrencia natural, por ejemplo goma acacia o goma de tragacanto, fosfatidos de ocurrencia natural, por ejemplo, soya, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo, monooleato de sorbitán y productos de condensación de los dichos esteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitán y productos de condensación de los dichos esteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitán de polioxietileno. Las emulsiones también pueden contener agentes saborizantes y edulcorantes.

Los jarabes y elíxires pueden formularse con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol, glucosa o sacarosa. Dichas formulaciones también pueden contener un demulcente, un preservativo y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones inhibidoras pueden estar en la forma de una suspensión oleginosa o acuosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando aquellos agentes humectantes o de dispersión apropiados y los agentes de suspensión que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo como una solución en 1 ,3-butanediol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y la solución de cloruro sódico isotónico. Además, los aceites estériles fijos se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo blando puede emplearse incluyendo mono o di-glicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Las composiciones que contienen inhibidores también pueden administrarse en la forma de supositorios, por ejemplo, para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mediante la mezcla del fármaco con un excipiente no irritable apropiado que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquidas en la temperatura rectal y por lo tanto fundirse en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen mantequilla de cacao y polietilenglicoles.

Las composiciones que contienen el inhibidor de la presente invención pueden administrarse parenteralmente en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y concentración usados, puede suspenderse o disolverse en el vehículo. Ventajosamente, los adyuvantes tales como anestésicos locales, preservativos y agentes estabilizantes pueden disolverse en el vehículo.

Los niveles de dosis de los inhibidores en el orden de desde aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 50 mg por. kilogramo de peso corporal por día y más preferiblemente entre 0.1 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por día, son útiles en el tratamiento de las condiciones arriba indicadas. La cantidad del inhibidor que puede combinarse con los materiales portadores para producir una sola forma de dosis variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Las formas de dosis unitarias generalmente contienen entre desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg del inhibidor.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que están dentro del alcance del criterio médico, apropiado para contactar los tejidos de los seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones de acuerdo con la proporción de riesgo/beneficio razonable o el cual de otra manera ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos como siendo aceptables para usarse en humanos o animales domésticos.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar artritis reumatoide (RA) o fibrosis pulmonar (PF) comprendiendo (a) contactar una muestra de plasma de un sujeto en riesgo de RA o PF con una molécula de unión de GPBP que se une al 77 kD GPBP bajo condiciones para promover la unión selectiva de la molécula de unión GPBP al GPBP; (b) detectar la formación del complejo entre la molécula de unión GPBP y la 77 kD GPBP en la muestra de plasma; (c) comparar una cantidad del complejo formado entre la molécula de unión GPBP y la 77 kD GPBP en la muestra de plasma para control y (d) diagnosticar al sujeto como teniendo RA o PF con base en la comparación o proporcionar la comparación a una entidad para diagnóstico de la RA o PF.

Los sujetos en riesgo de RA son aquellos sujetos con cualquier síntoma o factores de riesgo para RA. Los síntomas incluyen pero no se limitan a inflamación de las articulaciones con las articulaciones afectadas estando hinchadas, calientes, dolorosas y/o rígidas, particularmente temprano por la mañana al caminar o después de inactividad prolongada, rigidez incrementada de las articulaciones en la mañana que típicamente dura más de una hora, tendón de gatillo, erosión del tendón, destrucción de la superficie de las articulaciones; rango deteriorado del movimiento de las articulaciones; deformación de la envoltura de la articulación (incluyendo manos/dedos, pies/dedos, espina cervical, rodillas, y hombros) y pérdida de la función de las articulaciones.

PF es la formación o desarrollo de tejido conectivo en exceso (fibrosis) en los pulmones. Los síntomas de fibrosis pulmonar incluyen pero no se limitan a dificultad para respirar tal como dificultad para respirar progresiva (disnea con el esfuerzo), tos seca crónica, fatiga y debilidad, malestar en el pecho y/o pérdida rápida de peso y del apetito. Algunas veces, las crepitaciones inspiratorias finas pueden escucharse en la base de los pulmones en la auscultación. Un CAT de alta resolución puede demostrar generalmente anormalidades.

Como se muestra en los ejemplos que siguen, 77 kD GPBP es un marcador pre-inflamatorio para la RA y PF, como la cantidad de 77 kD circulante incrementa en el estado pre-inflamatorio de RA y PF, y posteriormente disminuye con el desarrollo del dolor en una articulación (articulaciones) inflamada característica de RA inflamatoria, y con el desarrollo de disnea con el esfuerzo característica de la PF inflamatoria. Además, los métodos pueden usarse para identificar a los sujetos que tienen RA o PF en la etapa pre-inflamatoria, permitiendo el tratamiento anticipado de los sujetos que sufren de RA o PF.

Además, en una modalidad preferida, el método puede usarse para diagnosticar RA en un sujeto con síntomas de RA pre-inflamatoria, tal como una o más articulaciones inflamadas, una o más articulaciones rígidas, una o más articulaciones calientes, temprano en la mañana que típicamente tardan más de una hora, fluido sinovial en exceso, el desarrollo de tejido fibroso en el sinovia y/o rango deteriorado del movimiento de la articulación. En una modalidad adicional, el sujeto no está experimentando dolor en todas de una o más de las articulaciones inflamadas. En modalidades adicionales, el sujeto no padece de destrucción del cartílago articular o anquilosis de una o más articulaciones.

En otra modalidad preferida, el método puede usarse para diagnosticar PF en un sujeto con síntomas de PF inflamatoria, tal como tos seca crónica, fatiga y debilidad; malestar en el pecho, pérdida del apetito y/o pérdida rápida de peso y/o disnea con el esfuerzo. En una modalidad adicional, el sujeto no está padeciendo de disnea en descanso.

Mientras un método de diagnóstico particular no puede proporcionar un diagnóstico definitivo de una condición, basta si el método proporciona una indicación positiva que ayuda en el diagnóstico.

Como se usa en este aspecto, la cantidad de 77 kD GPBP puede constituir solamente el 77 kD GPBP intacto o puede comprender una cantidad de fragmentos 77 kD GPBP y 77 kD GPBP en la muestra de plasma.

El sujeto puede ser cualquier sujeto que puede beneficiarse del diagnóstico, tal como un mamífero. En una modalidad preferida, el sujeto es un sujeto humano.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria sistémica, crónica que puede afectar muchos tejidos y órganos, pero principalmente ataca a las articulaciones (sinoviales). El proceso produce una respuesta inflamatoria de la cápsula alrededor de las articulaciones secundarias para la inflamación de las células sinoviales. La patología del proceso de la enfermedad comúnmente conduce a la destrucción del cartílago articular y la anquilosis de las articulaciones. RA también puede producir inflamación difusa en los pulmones, pericardio, pleura, esclerótica y también las lesiones nodulares, más común en el tejido subcutáneo.

Aproximadamente 1% de la población mundial está afligida por la RA, las mujeres tres veces más que comúnmente los hombres. El inicio es más frecuente entre los 40 y 50, pero la gente de cualquier edad puede afectarse. Puede ser una condición de dolor y deshabilitación que puede conducir a la pérdida sustancial del funcionamiento y movilidad si no se trata adecuadamente. Es un diagnóstico clínico hecho con base en los síntomas, exámenes físicos, rayos X y pruebas de laboratorio, aunque el Colegio Americano de Reumatología (ACR, por sus siglas en inglés) y las guías de diagnóstico público de la Liga Europea en contra del Reumatismo (EULAR, por sus siglas en inglés).

Una "molécula de unión GPBP" es un péptido o molécula de ácido nucleico que se une selectivamente a 77 kD GPBP, como se opone a una o más moléculas biológicas, estructuras, células, tejidos, etc. Las modalidades ejemplarizadoras de dichas moléculas de unión GPBP incluyen pero no se limitan a anticuerpos, aptámeros o sustratos. Como se usa en este documento, un "sustrato GPBP" es un blanco de la actividad biológica GPBP que se une a 77 kD GPBP, o un fragmento del mismo que retiene la actividad de enlace GPBP. Dichos sustratos GPBP incluyen pero no se limitan a I-20 (SEQ ID NO:18), proteínas de interacción GPBP (GIPs) (SEQ ID NOS:19-23), proteína básica mielina (MBP) y derivados de los mismos (SEQ ID NOS:24-27), proteína prión (PrP) (SEQ ID NO:28), dominio NC1 de cadena a3 de colágeno tipo IV (a3(IV)NC1 ) (SEQ ID NO:29), y péptido beta de la enfermedad de Alzheimer (?ß 1-42) (SEQ ID NO:30). Las referencias ejemplarizadoras demostrando la unión GPBP de estos sustratos puede encontrarse en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,579,969; 7,147,855 y 7,326,768, incorporadas en este documento en su totalidad como referencia.

Una "muestra de plasma" significa plasma en la sangre, el componente líquido de la sangre y se prepara, por ejemplo mediante centrifugación de la sangre total para remover las células sanguíneas. Como se usa en este documento, una muestra de plasma también incluye una muestra de suero en sangre, en la cual los factores de coagulación de la sangre se han removido.

La muestra de plasma puede obtenerse de cualquier sujeto apropiado, de preferencia de un mamífero que está én riesgo de sufrir RA o PF, incluyendo pero no limitados a un humano, perro, gato, caballo o ganado (vacas, ovejas, etc.). En una modalidad más preferida, la muestra de plasma se obtiene de un sujeto humano. Como se divulgó en este documento, Como se divulga en este documento, los inventores han observado niveles de 77 kD GPBP circulante incrementados en modelos de animales de RA y PF.

El anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo GPBP selectivo, ya sea policlonal, monoclonal o monoclonal humanizado como se describió anteriormente, aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales.

Las condiciones apropiadas para promover la unión de las moléculas de enlace GPBP, tal como anticuerpos, aptámeros o sustratos al 77 kD GPBP en las muestras de plasma pueden determinarse por aquellos expertos en la técnica con base en las enseñanzas de este documento, y los ejemplos proporcionados posteriormente. Por ejemplo, la unión de anticuerpo-antígeno comúnmente depende de lae interacciones hidrofóbicas (los así llamados enlaces hidrofóbicos); además, las altas concentraciones de sal, tal como en el rango molar pueden usarse para reducir la unión no específica e incrementar la unión de anticuerpo-antígeno no específica. Opcionalmente, las etapas adicionales pueden incluirse para promover la selectividad y especificidad, incluyendo pero no limitadas a una o más etapas de lavado para remover el 77 kD GPBP no unido y/o la molécula de unión GPBP o proteínas de suero débilmente unidas o no unidas; inhibidores de enlace no específico para reducir la unión de proteínas de suero de alta concentración, muestras de control conocidas para contener 77 kD GPBP y/o controles negativos conocidos por no unirse a 77 kD, GPBP y/o inclusión de las muestras de sangre conocidas por no poseer 77 kD GPBP (ejemplo, eliminados para GPBP).

Los métodos pueden probarse por la presencia de 77 kD GPBP en la muestra de plasma, por las técnicas estándares incluyendo pero no limitadas a ELISA, inmunofluorescencia y cromatografía (por ejemplo, pruebas de flujo lateral en donde el anticuerpo se inmoviliza en una superficie y las proteínas de plasma se etiquetan y se permite que fluyan sobre la superficie bajo condiciones apropiadas para permitir el enlace del anticuerpo al GPBP en el plasma). En una modalidad, se usan los lechos funcionales (Tecnología Becton Dickinson) acoplados a la citometría de flujo; esta técnica es un método de ingeniería para medir los niveles de proteínas en el fluido biológico o los extractos celulares/de tejido. Específicamente, los lechos hechos de una matriz de fluorescencia se cubren con uno o más anticuerpos 77 kD GPBP, mezclados con la muestra de plasma y además incubados con un anticuerpo de detección marcado con una ficoeritrina. Finalmente, los lechos se analizan por un programa de citometría de flujo que selecciona los lechos de acuerdo con la emisión de matriz de fluorescencia y la medición del nivel de analitos a través de la emisión de ficoeritrina. Existen más de treinta tipos diferentes de lechos que pueden detectarse simultáneamente y discriminarse por el citómetro. Este método acopla el funcionamiento y la alta sensibilidad con la versatilidad dado que un tipo de lecho especifico cubierto con el anticuerpo GBPB puede mezclarse con un tipo de lecho distinto acoplado con los péptidos de enlace para otro analito (es decir, autoanticuerpos) y medidos simultáneamente. La medición de varios analitos podría mejorar el potencial de determinación de GPBP. En una modalidad, las técnicas pueden determinar solamente la presencia o ausencia de la isoforma 77 kD GPBP. Alternativamente, las técnicas pueden ser cuantitativas, y proporcionar información acerca de la cantidad relativa de 77 kD GPBP en la muestra. Para propósitos cuantitativos, se prefieren los ELISAs.

La detección de la formación de inmunocomplejos puede llevarse a cabo mediante técnicas de detección estándares. Por ejemplo, la detección de inmunocomplejos puede llevarse a cabo mediante el uso de anticuerpos secundarios o anticuerpos marcados. Dichos métodos, incluyendo la selección de la marca se conocen por aquellos expertos en la técnica. Alternativamente, los anticuerpos pueden acoplarse a una sustancia detectable. El término "acoplado" se usa para significar que la sustancia detectable está físicamente unida al anticuerpo. Las sustancias detectables apropiadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas apropiadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasas alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinaesterasa. Los ejemplos de complejos del grupo prostético apropiado incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Los ejemplos de materiales de fluorescencia apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un ejemplo de -un material luminiscente incluye luminol. Los ejemplos del material radioactivo apropiado incluyen 125l, ,31l, 35S o 3H.

Los métodos comprenden la comparación de los niveles 77 kD GPBP detectados en una muestra de plasma de prueba con un control, tal como un control de una muestra de plasma conocida por tener niveles "normales" de 77 kD GPBP o valores normales previamente determinados para 77 kD GPBP en el plasma del sujeto del cual se obtiene el plasma. En varias modalidades, el control proporciona una curva estándar usando 77 kD GPBP recombinante o un valor de referencia. En comparación, la cantidad de 77 kD GPBP en la muestra de plasma para un control, un incremento en el 77 kD GPBP en la muestra de plasma, relativo al control indica la presencia de RA o PF.

En otra modalidad, un valor normal de 77 kD GPBP como una referencia para una curva estándar es entre -1 ng/ml en el plasma, mientras la RA pre-inflamatoria en sujetos excede lo normal en al menos 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces e incluso más (es decir, 300 veces) los valores normales. Además, en varias modalidades, un sujeto en riesgo de RA está diagnosticado para tener RA si los nivele de plasma 77 kD GPBP del sujeto están en 100 ng/ml o mayores; 200 ng/ml o mayores; 300 ng/ml o mayores; 400 ng/ml o mayores; 500 ng/ml o mayores; 600 ng/ml o mayores; 700 ng/ml o mayores; 800 ng/ml o mayores; 900 ng/ml o mayores; 1000 ng/ml o mayores; 2000 ng/ml o mayores; o 3000 ng/ml o mayores.

Los modelos PF pre-inflamatorios exceden los valores 77 kD GPBP normales por al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, o más de los valores normales. Además en varias modalidades, un sujeto en riesgo de PF se diagnostica como teniendo PF si los niveles de 77 kD GPBP en el plasma del sujeto son 20 ng/ml o mayores, 30 ng/ml o mayores, 40 ng/ml o mayores; 50 ng/ml o mayores; 60 ng/ml o mayores; 70 ng/ml o mayores u 80 ng/ml o mayores.

En una modalidad adicional, combinando la determinación de 77 kD GPBP con el análisis de otros analitos permite que los métodos realicen diagnósticos diferenciales o pronósticos de RA o PF. En modalidades no limitantes, otros analitos podrían evaluarse en los sujetos en riesgo de RA incluyendo el factor reumatoide (RF), el anti-CCP, la vimentina citrunilada anti-mutada (anti-MCV). Otros analitos también podrían analizarse en sujetos en riesgo de PF incluyendo el factor de crecimiento de transformación beta (TGF-ß).

En una modalidad preferida de todas las modalidades y la combinación de las modalidades de este cuarto aspecto, el método además comprende determinar un nivel de proteína reactiva C (CRP) en el plasma del sujeto. El CRP es un marcador de la inflamación. Como se divulgó en los ejemplos que siguen, los niveles de 77 kD GPBP y CRP en el suero se relacionan inversamente relacionados en CKD y RA: los niveles de 77 kD GPBP en el plasma se incrementan en el estado dé pre-inflamación de CKD y RA y posteriormente se disminuyen durante el periodo de inflamación. En contraste, los niveles de plasma CRP incrementan durante la fase de inflamación de RA y CKD mientras permanecen en los niveles de base durante la fase pre-inflamatoria de RA y CKD. Además, en una modalidad, los métodos además comprenden medir los niveles de plasma CRP, comparando una cantidad de plasma CRP para controlar y usar la comparación CRP para ayudar en el diagnóstico del sujeto como teniendo RA o PF.

En otra modalidad, la invención proporciona métodos para diagnosticar la CKD o la GN mediada por el complejo inmune comprendiendo: (a) contactar una muestra de plasma de un sujeto en riesgo de CKD o GN mediada por el complejo inmune con una molécula de unión GPBP que se une al 77 kD GPBP bajo condiciones para promover la unión selectiva de la molécula de unión GPBP al GPBP; (b) detectar (¡) la formación del complejo entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra de plasma y (¡i) determinar el nivel de la proteina reactiva C en el plasma del sujeto (CRP) (c) comparando (¡) una cantidad del complejo formado entre la molécula de unión GPBP y el GPBP en la muestra de plasma para control y (¡i) una cantidad de CRP en el plasma del sujeto para controlar y (d) diagnosticar al sujeto como teniendo CKD o GN mediada por el complejo inmune con base en las comparaciones o proporcionar las comparaciones a una entidad de diagnóstico de CKD o GN mediada por el complejo inmune.

Los métodos de cualquiera de estas modalidades o combinaciones de las mismas, además pueden comprender medir los niveles de CRP y 77 kD GPBP en el plasma del sujeto en dos o más intervalos de tiempo (es decir, 2, 3, 4, 5 o más intervalos de tiempo), comparando cada uno para control y diagnosticando al sujeto que tiene RA, PF, CKD, o GN mediada por el complejo inmune con base en la comparación * de dos o más mediciones. En todas las modalidades, los niveles de CRP pueden medirse de la misma muestra de plasma como los niveles de 77 kD GPBP o de una muestra diferente. Las concentraciones normales de CRP en el plasma de un humano saludable son usualmente menores que 3 µg/mL. Como un resultado de los niveles de CRP de inflamación son al menos 4 µg/m\, tal como 10 µ9 p?? para la inflamación leve y 40 µ9-200 µ?/??? (o mayor) en la inflamación activa.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar los compuestos para tratar el .CKD, GN mediada por el complejo inmune y/o PF, comprendiendo contactar un complejo de unión del sustrato 77 kD GPBP-77 kD GPBP con uno o más compuestos de prueba bajo condiciones de enlace, en donde aquellos compuestos de prueba que desplazan el 77 kD GPBP del complejo de unión son compuestos candidatos para tratar el CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o la PF.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar compuestos para tratar el CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o la PF, comprendiendo contactar un sustrato 77 kD GPBP bajo condiciones de enlace con (a) uno o más compuestos de prueba y (b) 77 kD GPBP; en donde aquellos compuestos de prueba que vierten el 77 kD GPBP para la unión del sustrato 77 kD GPBP son compuestos candidatos para tratar el CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o PF.

Los sustratos 77 kD GPBP apropiados en éstas quinta y sexta modalidades son como se divulgaron anteriormente, pero no se limitan a I-20 (SEQ ID NO: 18), proteínas de interacción GPBP (GIPs) (SEQ ID NOS:19-23), proteína básica mielina (MPB) y derivados de los mismos (SEQ ID NO:24-27), proteína prión (PrP) (SEQ ID NO:28), dominio NC1 de cadena a3 de colágeno tipo IV (cc3(IV)NC1 ) (SEQ ID NO:29) y el péptido beta de la enfermedad de Alzheimer (?ß ,^2) (SEQ ID NO:30). En una modalidad preferida, el sustrato 77 kD GPBP comprende a3(IV)NC1. Las referencias ejemplarizadoras demostrando la unión GPBP de estos sustratos pueden encontrarse en las Patentes Estadounidenses Nos. 6,579,969; 7,147855 y 7,326,768 incorporadas en este documento como referencia en su totalidad.

Como se muestra en los ejemplos que siguen, los compuestos (tal como anticuerpos) que desplazan el 77 kD GPBP de los complejos de enlace con los sustratos 77 kD GPBP o que compiten con 77 kD GPBP para unirse a los sustratos 77 kD GPBP son compuestos candidatos para tratar el CKD, GN mediada por el complejo inmune y/o PF. Las condiciones apropiadas para valorar la unión de los compuestos de prueba al a3(IV)NC1 u otros sustratos 77 kD GPBP pueden determinarse por aquellos expertos en la técnica con base en las enseñanzas en la misma. En una modalidad, pueden usarse las condiciones para aquellos usados en los ejemplos que siguen. En una modalidad no limitante, las placas de micro pozos pueden cubrirse con una cantidad apropiada de a3(IV)NCl en un estabilizador apropiado para valorar las interacciones de enlace. Las placas posteriormente pueden bloquearse para minimizar la unión no específica. En una modalidad, las placas posteriormente se incuban con una cantidad de 77 kD GPBP (tal como el 77 kD GPBP nativo) y bajo condiciones apropiadas para promover la unión al a3(IV)NC1 (para formar un complejo de enlace), seguido por cualquier etapa de lavado apropiada (para remover el 77 kD GPBP sin unir) y posteriormente unirse con uno o más compuestos de prueba para valorar si cualquier de los compuestos de prueba puede desplegar el 77 kD GPBP del complejo de unión 77 kD GPBP-oc3(IV)NC1 en el micro pozo. En una modalidad alterna, el 77 kD GPBP y uno o más de los compuestos de prueba se contactan bajo condiciones de unión al mismo tiempo, para identificar los compuestos de prueba que pueden verter el 77 kD GPBP para unirse al a3(IV)NC1. En estas modalidades, el 77 kD GPBP puede marcarse separadamente, y/o uno o más compuestos de prueba pueden marcarse separadamente para facilitar la identificación y análisis de los eventos de enlace. En una modalidad ejemplarizadora no limitante, las placas se cubren con 1 µg/mL de poli-His-a3(IV)NC1 en PBS. Las placas se cubren por 16 horas a 4°C y se bloquean con 3% de BSA en PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las placas se incuban con 1 µ?/??? FLAG-77kD GPBP en la ausencia o presencia de 1 µ?/mL de los compuestos de prueba por 1-2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. La unión FLAG-77 D GPBP se detecta con 1 µg/mL de ANTI-FLAG M2-Peroxidasa.

Otras condiciones apropiadas ejemplarizadoras como anteriormente se divulgaron. Por ejemplo, cuando los compuestos de prueba son anticuerpos, la unión del antígeno-anticuerpo comúnmente depende de las interacciones hidrofóbicas (los así llamados enlaces hidrofóbicos), además, altas concentraciones de sal, tal como en el rango molar pueden usarse para reducir el enlace no específico e incrementa la unión del anticuerpo antígeno específica. Opcionalmente, las etapas adiciones pueden incluir promover la selectividad y especificidad, incluyendo pero no limitadas a una o más etapas de lavado para remover el 77 kD GPBP no unido y/o los compuestos de prueba; las muestras de control conocidas por contener competidores para la unión GPBP para los sustratos 77kD GPBP tal como a3(IV)NC1 y/o controles negativos que no competen para la unión 77 kD GPBP para los sustratos 77 kD GPBP tal como cx3(IV)NC1.

Los métodos pueden usar técnicas estándares incluyendo pero no limitados a ELISA, inmunofluorescencia y cromatografía. Para propósitos cuantitativos, se prefieren las ELISAs. La detección de los eventos de enlace puede llevarse a cabo mediante técnicas estándares. Por ejemplo, la detección de complejos de enlace puede llevarse a cabo mediante el uso de anticuerpos marcados o anticuerpos secundarios. Dichos métodos, incluyendo la selección de la marca se conocen por aquellos expertos en la técnica. Alternativamente, los anticuerpos pueden acoplarse a una sustancia detectable. El término "acoplado" se usa para significar que la sustancia detectable se une físicamente al anticuerpo. Las sustancias detectables apropiadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de las enzimas apropiadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa. Los ejemplos de los complejos del grupo prostético apropiado incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Los ejemplos de los materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína diclorotriazinilaminal, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol. Los ejemplos del material radioactivo apropiado incluyen 125l, 1311, 35S o 3H.

Cuando los compuestos de prueba comprenden secuencias de polipéptidos, dichos polipéptidos pueden sintetizarse químicamente o expresarse recombinantemente. La expresión recombinante puede llevarse a cabo usando métodos estándares en la técnica, como se divulgó anteriormente. Dichos vectores de expresión pueden comprender vectores de expresión bacterial o viral y dichas células huésped pueden ser procariotas o eucariotas. Los polipéptidos sintéticos, preparados usando las técnicas bien conocidas en la técnica de fase sólida, fase líquida o técnica de condensación de péptidos o cualquier combinación de los mismos, puede incluir aminoácidos naturales y no naturales. Los aminoácidos usados para el análisis de péptidos pueden ser resina de aminoácidos Boc estándares (?a-t-butiloxicarbonilo protegido con ?a-amino) con desprotección estándar, neutralización, acoplamiento y protocolos de lavado o aminoácidos (Fmoc) 9-fluorenilmetoxicarbonil ?a-amino protegidos Fmoc y Boc, Ambos aminoácidos Na-amino protegidos Fmoc y Boc pueden obtenerse de Sigma, Cambridge Research Biochemical u otras empresas químicas familiares para aquellos expertos en la técnica. Además, los polipéptidos pueden sintetizarse con otros grupos de protección Na que son familiares para aquellos expertos en la técnica. La síntesis de péptido de fase sólida puede llevarse a cabo por las técnicas familiares para aquellos en la técnica y proporcionarse, tal como mediante el uso de sintetizadores automatizados.

Cuando los compuestos de prueba comprenden anticuerpos, dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos pueden ser humanizados, completamente humanos o formas murinas de los anticuerpos. Dichos anticuerpos pueden hacerse por métodos bien conocidos, tales como los descritos en Anticuerpos Harlow y Lañe; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

Cuando los compuestos de prueba comprenden secuencias de ácido nucleico, dichos ácidos nucleico pueden sintetizarse químicamente o también expresarse recombinantemente. Las técnicas de expresión recombinante son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (Ver por ejemplo, Sambrook, et al., supra). Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN y pueden ser de hebra simple o doble. Similarmente, dichos ácidos nucleicos pueden ser sintetizados químicamente o enzimáticamente mediante reacciones manuales o estándares, usando técnicas estándares en la técnica. Si se sintetiza químicamente o mediante síntesis enzimática in vitro, el ácido nucleico puede purificarse antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden purificarse de una mezcla mediante la extracción con un solvente o resina, precipitación, electroforesis,, cromatografía o una combinación de los mismos. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden usarse sin o un mínimo de purificación para evitar pérdidas debido al procesamiento de muestras.

Cuando los compuestos de prueba comprenden compuestos diferentes a los polipéptidos anticuerpos o ácidos nucleicos, dichos compuestos pueden hacerse mediante cualquier variedad de métodos en la técnica para conducir la síntesis química orgánica.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Proteína-1 de unión al antígeno Goodpasture es un blanco terapéutico para la GN mediada del complejo inmune COL4A3BP (gen GPBP) expresado en al menos tres polipéptidos incluyendo el GPBP-1 canónico, también llamado 77-kD GPBP o GPBP (1 ); GPBP-2, un exón mARN alterno empalmando la isoforma también llamada CERT o GPBPA26 (2); y GPBP-3, una variante que resulta del inicio de la traducción del mARN alterno y también llamado 91 -kD GPBP (3). GPBP-1 es principalmente secretado e interactúa con el colágeno tipo IV (3); GPBP-2 se localiza principalmente en el citosol (3), transporta ceramida entre el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi (4) en induce la secreción de la proteína (5) y el GPBP-3 se asocia con las membranas celulares y promueve la exportación GPBP-1 (3).

El colágeno Tipo IV se compone de seis cadenas de a distintas (a1-ab) que forman tres tipos de moléculas de triple hélice [cc1.a1.a2(IV), a3.a4.a5 (IV) y a5.cc5.cc6(IV)] (6). El soporte estructural principal para el glomérulo renal incluye red (GBM) de a3.a4.a5 (IV) organizada de membrana envolvente periférica y red (matriz mesagial) de a3.a4.a5 (IV) de red central organizada. En la pared capilar, la red oc3.cc4.a5 (IV) (epitelial) se funde con una red (endotelial) de a1.cc1.a2.(IV) de membrana organizada para producir la columna vertebral del GBM capilar, un componente principal de la barrera de filtración glomerular.

GPBP-1 es una quinasa Ser/Thr no convencional que señala al colágeno tipo IV (1 ) y regula su organización glomerular (7). Además, la expresión incrementada de GPBP-1 causa la disociación de la red a1.a4.a5 (IV) y a1.a1.a.2 (IV) en la barrera de filtración glomerular e induce la expansión de la red a1.a1.a2 (IV), por lo tanto mediando el colapso capilar (glomeruloesclerosis).

En ratones NZW propensos al lupus, la producción de anticuerpos se correlaciona con la sobre expresión glomerular de GPBP-1 y resulta en formación de depósitos del complejo inmune en el GB capilar interrumpido (7).

El GBPB se secreta al compartimiento extracelular (3) y se ha demostrado que el GPBP-1 es un constituyente del plasma humano (cGPBP-1 ) y que los niveles incrementados de cGPBP-1 se asocian con la GN mediada por el complejo inmune (WO 2010/009856 y US 7935492). Aquí, se muestra que el cGPBP-1 es un blanco terapéutico para la GN mediada por el complejo inmune.

RESULTADOS Identificación de cGPBP-1 y valoración de su relevancia clínica Para aislar el cGPBP-1 , el plasma humano se absorbió en una columna de afinidad conteniendo mAB inmovilizado N26, un anticuerpo monoclonal GPBP-específico (mAb), como se describe en WO 2010/009856 y US 7935492. El material de unión se eluyó y se muestra para contener un polipéptido principal de ca. 77 kDa y los polipéptidos principales de Mr menor reactivo con anticuerpos específicos GPBP confirmando ese GPBP-1 y los productos derivados son constituyentes normales del plasma humano. El Mr de cGPBP-1 varió entre 74- y 80- kDa dependiendo de los estándares de masa molecular usados (no mostrado).

Para medir el cGPBP-1 , se desarrollo una ELISA intermedia directa usando mAb N26 como el anticuerpo de captura y mAb N27-HRP como el anticuerpo de detención, ambos de los cuales se unen a diferentes epítopes no superpuestos, como se describe en WO 2010/009856 y US 7935492. Las curvas estándares realizadas con el GPBP-1 recombinante desplegadas en relación lineal entre 0.4 y 400 ng/mL. Usando este epítope, se han estimado niveles normales de cGPBP-1 humano para estar bajo 10 ng/mL, no detectando variaciones significantes con la edad y sexo.

Para explorar la relevancia clínica de la detección cGPBP-1 , se midieron sus niveles en los pacientes con proteinuria (>0.5 g/día) y se encontró que estos pacientes despliegan niveles mayores de cGPBP-1. Sin embargo, las diferencias en los niveles cGPBP fueron más significantes cuando se comparan con las entidades y controles clínicos específicos, dado que solamente los pacientes que padecen nefropatía IgA o nefritis por lupus desplegaron niveles cGPBP-1 elevados mientras que otros con enfermedades renales comunes (enfermedad del riñón policistico, PKD) o GN no mediada por el depósito de los complejos inmunes en el colágeno glomerular, no tuvieron incremento estadísticamente significante de los niveles cGPBP-1 , como se describe en WO 2010/009856 y la US 7935492. Se obtuvieron conclusiones similares cuando la detección del anticuerpo fue mAb e11-2, a mAb reconociendo el GPBP-1 pero no GPBP-2.

Para valorar si los niveles cGPBP-1 elevados tuvieron efectos biológicos perjudiciales, las células A549 se cultivaron con niveles elevados de cGPBP-1 recombinante (200 ng/mL) y se analizó el perfil de expresión mARN. No se observaron cambios estadísticamente significantes en la expresión de los genes individuales; sin embargo, el análisis funcional de las rutas KEGG revelaron que el cGPBP-1 recombinante elevado activó la ruta map05322 activado (sitio web:genome.jp/dbget-bin/www_bget?pathway:map05322), que se ha asociado con el principio de SLE (Tabla 1 ).

Tabla 1 Incremento Coordinado de los anticuerpos y el cGPBP en los ratones NZW maduros Se ha reportado previamente que los ratos maduros desarrollaron una respuesta autoinmune (SLE) asociada con la expresión glomerular incrementada de GPBP-1 (7). Aunque lo último fue atribuible a la expresión mARN local incrementada, la acumulación glomerular de CPBP-1 también podría ser debido, al menos en parte, al atrapamiento de cGPBP-1 en las estructuras glomerulares. Consecuentemente, se exploró si los niveles de cGPBP-1 reflejados en el progreso natural de SLE en los ratones NZW. Curiosamente, los niveles de cGPBP-1 en el plasma incrementaron en los ratones NZW maduros y se correlacionaron directamente con los niveles de plasma de autoanticuerpos descubriendo una relación entre los niveles cGPBP-1 elevados y los marcadores patológicos, pero también se sugiere esa normalización o inhibición de los niveles cGPBP-1 sirve como una estrategia terapéutica para detener el progreso de GN.

Depósito recombinante de los complejos inmunes IgC en los ratones NZW Se ha reportado que los ratones NZW desarrollaron una respuesta autoinmune propensos al lupus consistiendo de los: anticuerpos IgG e IgA con depósitos predominantes de los complejos inmunes IgA en el glomérulo (7). En el presente estudio, sin embargo, los ratones NWZ desarrollaron una respuesta autoinmune propensa al lupus con base en IgG y los anticuerpos IgA no circulantes se detectaron (no se muestran datos). Para además investigar la relación entre la respuesta auto inmune y GN en los ratones NZW, ríñones de los ratones maduros (> 8 meses) se analizaron mediante técnicas de inmunohistoquímica e histoquímicas. Como se describió ' previamente (7), se encontraron rede de colágeno de GBM interrumpida y GPBP-1 abundante acumulado entre el componente epitelial del GBM y un componente GBM endotelial o de mesangio prolongado (Figura 3A). El análisis histológico también revelo la presencia de hallazgos patológicos múltiples (Figura 3B): proliferación mesangial (a), trombos hialinos (b), depósitos subendoteliales (c), expansión de matriz (d), depósitos de lazos de alambre (e) lobularidad glomerular (f); proliferación endocapilar (g), infiltrados inflamatorios glomerulares (h), necrosis, cariorrexis y picnosis (i), crecimientos ocasionales (j), infiltrados inflamatorios intersticiales del túbulo (k) y atrofia tubular (I). También se nota la presencia de depósitos granulares abundantes de IgG y C3c, principalmente distribuidos en la periferia de los glomérulos y los depósitos de IgM, ocupando preferiblemente el mesangio. La localización de los depósitos IgG y C3c a lo largo del componente epitelial del GBM además se confirmó por el análisis con microscopía confocal y el microscopía de electrones (ver posteriormente). Finalmente y como se reportó previamente (7) no se detectaron manifestaciones clínicas de GN en estos ratones.

Caracterización de los anticuerpos de bloqueo GPBP-1 La habilidad del mAb N12 o N26 biotinilado para inhibir la unión GPBP-1 al colágeno tipo IV [oc3(IV)NC1] se evaluó y se encontró que estos mAbs pueden bloquear potencialmente el cGBP-en vivo (Figura 1 A).

Para investigar los cinéticos mAb en el plasma, se inyectó a los ratones NZW con un solo estimulo ¡ntraperitoneal (250 µ9) y sus niveles de circulación monitoreados (Figura 1 B). Ambos mAbs alcanzaron un pico tres días después de la inyección (10 µg/mL). Los niveles de mAb N12-biotina cayeron en la mitad del día 8 y casi fueron indetectables por el día 14, mientras los niveles de mAb N26-b¡otina en el día 14 permanecieron elevados (6 µ?/???.), revelando que la separación en suero de mAb N26-biotina fue menor que la mAb N12-biotina.

Interesantemente, se observó que la administración del anticuerpo incrementó los niveles de cGPBP-1 en los ratones con el tiempo (no mostrado), sugiriendo que los anticuerpos señalan el cGPBP-1 e impulsan un efecto de rebote. Se han descrito los efectos de rebote en los niveles de plasma asociados con otros tratamientos biológicos (8).

Tratamiento de los ratones NZW GN con mAbs anti-GPBP Para evaluar la eficacia de los mAbs para tratar la GN, los ratones adultos NZW (8-10 meses de nacidos) se inyectaron con PBS (portador) o con ~1 µg/g de peso corporal de IgG murino (Control), mAb N12-biotina o mAb N26-biotina, una dosis encontrada que no impulsa un efecto de rebote (Figura 2). Después de la primera inyección, los niveles cGPBP-1 cayeron independientemente del tratamiento, sugiriendo que un cierto estrés provocado por la manipulación de los ratones influyó en los niveles de cGPBP-1 al inicio del estudio. Sin embargo, siguiendo la primera semana, los niveles cGPBP-1 incrementaron y regresaron casi a los niveles originales después de la tercera semana, excepto para los ratones tratados con mAb N12-biotina que permanecieron reducidos a lo largo del tratamiento, logrando significancia estadística entre la cuarta y sexta semana (Figura 2A). Además, con el curso del tiempo del estudio, la disminución de los niveles cGPBP-1 en los ratones tratados con mAb N12-biotina fue más efectiva que en los ratones tratados con mAb N-26 biotina (Figura 2B).

Al final del tratamiento todos los ratones fueron sacrificados y se evaluó la patología renal (Figura 3). Los ríñones de los ratones de control desplegaron anormalidades características de la GN mediado por el complejo inmune NZW, sin embargo, los ratones tratados con anticuerpos GPBP específicos no presentaron lesiones tubulares o glomerulares relevantes (HE y Masón). Por consiguiente, los tratamientos biológicos redujeron los depósitos glomerulares de GPBP-1 , no afectan la expresión intracelular tubular de GPBP, y reducen los depósitos de los complejos inmunes (IgG, IgM y C3c). Lo último además se soportó por la ausencia virtual de depósitos densos de electrones comúnmente encontrados en el lado epitelial del GBM capilar en los ratones de control. Consistente con estas observaciones, los infiltrados inflamatorios intersticiales del túbulo fueron agudamente reducidos en los ratones tratados con anticuerpos GPBP específicos (HE).

DIVULGACIÓN La GN mediada por el complejo inmune incluyendo nefropatía de IgA y la nefritis por lupus, la manifestación más seria de SLE, se entienden pobremente. Las opciones terapéuticas actuales para tratar estas enfermedades se limitan y no son completamente efectivas. Belimumab, un mAb en contra del estimulador de linfocitos B (BLYS), representa el primer fármaco que se ha aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos para tratar la SLE en los últimos 50 años (9). Sin importar la etiología, La CKD se caracteriza por un progreso inexorable hacia ESRD que se manifiesta por fibrosis intersticial del túbulo masiva, la etapa patológica común final de todos los tipos de enfermedades del riñón. Además, existe una necesidad de nuevos bio-marcadores y blancos terapéuticos para la detección temprana y atenuación del progreso de la CKD: Se han reportado previamente que los ratones adultos NZW desarrollaron IgA y respuesta de autoanticuerpos propensos a lupus IgG con depósitos predominantes de IgA en el glomérulo (7). Aqui se muestra que los ratones NZW desarrollaron una respuesta autoinmune IgG propensa al lupus con depósito glomerular predominante de IgG. Estos hallazgos sugieren que el antecedente genético de los ratones NZW predispone a la SLE y la GN mediada por el complejo inmune, pero la composición de los complejos inmunes depositados depende, en y en gran medida de la naturaleza de la respuesta autoinmune. Dado que los ratones NZW son genéticamente homogéneos, las diferencias en la respuesta autoinmune y por lo tanto, en la composición de los complejos inmunes siendo depositados se espera que dependan de los factores ambientales. Consistente con esto, los estudios previos se realizaron con ratones NZW hospedados en instalaciones de animales estándares mientras que para el presente estudio los ratones NZW se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos. Para investigar esta posibilidad, los ratones jóvenes NZW obtenidos de un proveedor comercial se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y no libres de patógenos y además se confirmó que los ratones NZW predominantemente depositan el IgG en el ambiente libre de patógenos y el IgA en el ambiente no libre de patógenos (observaciones no publicadas). Sin embargo, en ambos estudios, las alteraciones del colágeno GBM dependiente de GPBP-1 fueron similares con la excepción de que las manifestaciones inflamatorias pueden atribuirse a la condición más pro-inflamatoria de los depósitos del complejo inmune IgG. Colectivamente, la evidencia indica que el antecedente genético en los ratones NZW los predispone a ambos producción de autoanticuerpos propensos a lupus y expresión glomerular GPBP-1 incrementada; sin embargo, los factores ambientales condicionarían por último la- severidad patológica en la determinación del tipo de autoanticuerpos siendo producidos y depositados en el GB interrumpido. Por consiguiente, los ratones NZW desarrollaron un lupus "inflamatorio" como nefritis (ejemplo presente) o un IgG "no inflamatorio" como nefropatia (7) dependiendo de si se mantienen en un ambiente libre de patógenos o en un ambiente menos restrictivo, respectivamente.

Cuando se administran, los anticuerpos de bloqueo se espera que inhiban específicamente la actividad de GPBP-1 extracelular que comprende ambos el GPBP-1 de unión al tejido y el cGPBP-1. Además, las pruebas terapéuticas en este documento representan una sola prueba para determinar el rol patogénico del GPBP-1 extracelular en lupus clínicamente silencioso como nefritis desarrollado por los ratones NZW. Los resultados sugieren que el tratamiento con anticuerpos virtualmente repara las alteraciones basadas en colágeno GBM, reduce los depósitos glomerulares de los complejos inmunes y consecuentemente, atenúa la inflamación. Dos mAbs independientes que despliegan diferente habilidad para disminuir los niveles cGPBP-1 , pero bloquean la actividad similar del GPBP que se une al antigeno GBM, atenúan el progreso de la GN en una forma similar. Lo último indica que los efectos terapéuticos dependen más del bloqueo que de la separación de los niveles cGPBP. Además, la terapia anti-GPBP aparentemente reduce los depósitos GPBP-1 glomerulares más eficientemente (Figura 3) que disminuye los niveles cGPBP (Figura 2), sugiriendo que el GPBP-1 glomerular es responsable de la desorganización del colágeno GBM.

Los anticuerpos de bloqueo se espera que disminuyan el GPBP-1 glomerular mediante la reducción de la capacidad del cGPBP-1 de unirse al colágeno GBM y mediante mejorar la liberación del GPBP-1 unido al tejido. Aunque queda por determinar cómo los niveles de cGPBP influyen en los niveles de GPBP-1 unido al tejido, ambas fuentes de GPBP-1 son comúnmente operativas y en un contexto' más general cuentan para la GN mediada por el complejo inmune primaria (predominante la producción local) o secundaria (predominante la producción distante).

En contraste a los efectos benéficos en el progreso de la GN, el tratamiento con mAbs no fue efectivo para reducir o atenuar la respuesta autoinmune (observaciones no publicadas). Aunque la elevación del GPBP-1 circulante y los autoanticuerpos podrían asociarse pero no relacionarse con eventos patogénicos, su correlación positiva en ratones individuales (observaciones no publicadas) más bien sugiere que la inducción de los niveles cGPBP ocurre hacia debajo de la producción de autoanticuerpos en una cascada patogénica única común, Consistentemente, la expresión GPBP-1 incrementada indujo la GN del complejo inmune en la ausencia de producción de autoanticuerpos (7).

Colectivamente, los datos sugieren que los autoanticuerpos de unión al tejido inducen la expresión GPBP-1 y la secreción. El GPBP-1 continúa unido al tejido en el compartimiento extracelular circundante o ingresa al plasma. En los glomérulos, el GPBP-1 unido al tejido resulta de la producción local y el atrapamiento del cGPBP-1. No importa la acumulación del GPBP-1 unido al tejido resultante de la producción local incrementada (GN primaria) o de la producción distal incrementada y el atrapamiento subsecuente (GN secundaria), el colágeno GBM experimenta desorganización y promueve la formación del depósito del complejo inmune adicional. Los depósitos de complejo inmune y el estimulo celular propenso a lupus, mediado por el cGPBP-1 elevado, positivamente regula la patogénesis que perpetúa la SLE y el progreso de la GN. Los anticuerpos de bloqueo anti-GPBP atenúan la desorganización de colágeno GBM y la formación del depósito del complejo inmune e interrumpe la retroalimentación patogénica. Los datos identifican el cGPBP-1 , el factor patogénico y el blanco terapéutico en la GN mediada por el complejo inmune.

REFERENCIAS PARA EL EJEMPLO 1 1. Raya A, Revert F, Navarro S y Saus J. Caracterización de un tipo novedoso de quinasa treonina/serina que fosforila específicamente al antígeno Goodpasture de humano. J Biol Chem 1999; 274: 12642-12649. 2. Raya A, Revert-Ros F, Martínez-Martínez P, Navarro S, Rosello E, Vieites B, Granero F, Forteza J y Saus J. Proteína de unión al antígeno Goodpasture, la proteína que fosforila al antígeno Goodpasature, es una variante alternativamente empalmada en la patogénesis autoinmune. J Biol Chem 2000; 275: 40392-40399. 3. Revert F, Ventura I, Martínez-Martínez P, Granero-Moltó F, Revert-Ros F, Macías J y Saus J. Proteína de unión al antígeno Goodpasture es una proteína exportable soluble que interactúa con el colágeno tipo IV. Identificación de las isoformas de unión de la membrana novedosa J Biol Chem 2008; 283: 30246-30255. 4. Hanada K, Kumagai K, Yasuda S, Miura Y, Kawano M, Fukasawa M y Nishijima M.

Maquinaria Molecular para el tráfico no vesicular de la ceramida. Nature 2003; 426: 803- 809. 5. Fugmann T, Hausser A, Schoffler P, Schmid S, Pfizenmaier K y Olayioye MA. Regulación del transporte secretor por la fosforilación medida por la quinasa D de la proteína de la proteína de transferencia de ceramida. J Cell Biol 2007; 178: 15-22. 6. Hudson BG, Tryggvason K, Sundaramoorthy M y Neilson EG. Síndrome de Iport, Síndrome de Goodpasture y colágeno tipo IV. N Engl J Med 2003; 348: 2543-2556. 7. Revert F, Merino R, Monteagudo C, Macias J, Peydró A, Alcácer J, Muniesa P, Marquina R, Blanco M, Iglesias M, Revert-Ros F, Merino J y Saus J. Expresión de la proteina de unión al antígeno Goodpasture incrementada que induce la desorganización del colágeno tipo IV y deposita la inmunoglobulina A en la membrana de base glomerular. Am J Pathol 2007; 171 : 1419-1430. 8. Chung ES, Packer M, Lo KH, Fasanmade AA, Willerson JT; Anti-TNF Terapia anti-TNF en contra de los Investigadores de la Falla Cardiaca Congestiva. Terapia Anti-TNF en contra de los Investigadores de la Falla Cardiaca Congestiva: Aleatorizado, de doble fin, controlado con placebo, prueba piloto del infliximab, un anticuerpo monoclonal quimérico para el factor alfa de necrosis tumoral, en pacientes con falla cardiaca de moderada a severa: resultados de la Terapia Anti-TNF en contra de la prueba de Falla Cardiaca Congestiva (ATTACH). Circulatíon 2003; 107: 3133-3140. 9. Sanz I, Yasothan U y Kirkpatrick P. Belimumab. Nat Rev Drug Discov 201 1 ; 10: 335-336.

Ejemplo 2. El cGPBP-1 es un biomarcador pre y pro-inflamatorio GPBP-1 es un factor pro-inflamatorio.

El hallazgo que el tratamiento con el anticuerpo anti-GPBP-1 resulta en una reducción de los infiltrados inflamatorios (Figura 3), ha impulsado a la investigación de si el GPBP-1 actúa como un factor pro-inflamatorio.

El análisis comparativo de las transcriptomas de las células A549 expresando o no expresando el GPBP-1 recombinante de humano reveló que la expresión de de NLRP3 se incrementó específicamente en respuesta a la expresión CPBP-1 recombinante de humano mientras la expresión de los otros miembros de la familia NLRP permaneció sin cambios (Tabla 2).

Tabla 2 Similarmente, la sobre-expresión del GPBP-1 en las células Neuro 2a inducen expresión del mAR elevada de IL-?ß y NLRP5 un componente de la inflamasoma. Todos de los cuales sugieren que el GPBP-1 induce la expresión pro-IL-1 ß y la activación de la inflamasoma.

Para estudiar esta relación, se usaron macrófagos RAW264.7 t LPS y doxorubicina (1 ) para evaluar la expresión pro-IL-1 ß y la liberación IL-1 p. Muchos diferentes agentes tales como asbestos, silicatos, cristales de ácido úrico o doxorubicina son activadores de la inflamasoma (2),, pero son incapaces de inducir la expresión pro-ILip (37 KDa) en macrófagos que dependen de los agonistas de los receptores tipo Toll (TLR) (es decir LPS). Sobre la primerización de los macrófagos con LPS pro-IL-1 ß acumulado en el citosol y los activadores de la inflamasoma conducen a la penetración pro-IL-1 ß y a la liberación del IL-? ß maduro (17 kDa) para el medio extracelular (3).

En las pruebas, los macrófagos RAW264.7 se primerizaron durante la noche con 1 µ?/??? de LPS y la inflamasoma NLRP3 se activó con 10 µ de doxorubicina. Los IL-1 ß y cGPBP-1 secretados en medios de cultivo se midieron por ELISA en los tiempos indicados, y la expresión citosólica de pro-IL-1 ß y GPBP-1 se analizó en los lisatos celulares mediante inmunoelectrotransferencia Western (Figura 4). El silenciamiento de GPBP-1 en las células RAW264.7 causó una reducción en la síntesis pro-IL-1 ß y la liberación de IL-1 ß (Figura 4A y 4B). El diseño del tiempo de la liberación cGPBP-1 en éstas células fue similar a ese del IL- ß (Figura 4B y 4C) y además las células RAW264.7 silenciadas con GPBP-1 mostraron una disminución marcada en la liberación cGPBP-1 , in'dicando que GPBP-1 es la misma isoforma GPBP siendo secretada por la célula.

Nuestros datos también indican que el GPBP-1 induce la expresión pro-IL-1 ß y la activación de la inflamasoma que resulta en la secreción coordinada del compartimiento extracelular de ambos cGPBP e IL-1 ß. cGPBP-1 es un biomarcador pre-inflamatorio en los pacientes con proteinuria.

Para además determinar el rol de cGPBP en las etapas pre-inflamatorias tempranas se midieron los niveles de un biomarcador para la Proteína Reactiva C de la inflamación sistémica (CRP) en el suero de los pacientes con proteinuria. Se encontró que existe una relación inversa entre los niveles de CRP y cGPBP en suero (Figura 5) indicando que los niveles cGPBP incrementan antes que los niveles CRP en estos pacientes y además el cGPBP-1 debe contemplarse como un biomarcador pre-inflamatorio en pacientes con proteinuria. cGPBP-1 es un biomarcador pre-inflamatorio para RA Para determinar el alcance de los hallazgos anteriores, se midieron los niveles de cGPBP-1 en los pacientes que experimentan respuesta autoinmune mediada por RA y se encontró que estos pacientes muestran niveles de cGPBP-1 incrementados con respecto a los individuos de control (Figura 6A). Interesantemente, cuando se miden ambos niveles vGPBP-1 y CRP en estos pacientes se encuentran conclusiones similares entonces, cuando se analizan los pacientes que experimentan proteinuria, y además los niveles cGPBP-1 y CRP se muestran para ser regulados con conteo (Figura 6B).

El progreso enorme, hecho en las recientes décadas en nuestro entendimiento de los mecanismos inmunológicos involucrados en la patogénesis de RA se ha proporcionado ampliamente por el desarrollo de modelos experimentales en animales. Entre estos, el más estudiado y frecuentemente usado es el modelo de la artritis reumatoide después de la inmunización con colágeno tipo II de bovino (CIA). El desarrollo de CIA se controla por el HC (4) y su evolución clínica se gobierna por las hormonas del sexo y es más severa en machos o hembras masculinizadas con testosterona (5). Los hallazgos recientes soportan que una expresión de Bcl-2 de humano recombinante en las células T inhiba el desarrollo de CIA. Esto es probablemente debido a que la molécula anti-apoptótica permite a la población de las células T regulatorias suprimir la respuesta autoinmune para expandirse (6). Cuando se usa este modelo experimental para estudiar la regulación de los niveles cGPBP en el desarrollo de CIA. En ambos ratones hembra (tg) no transgénicos inmunizados de colágeno tipo II, desarrollando una CIA suave, y los ratones hembra Tg Bcl-2 que fallan en desarrollar CIA, los niveles de cGPBP-1 permanecen sin cambio durante todo del proceso autoinmune (p>0.05). En contraste, los ratones desarrollando una CIA severá [ratones machos inmunizados de colágeno tipo II o hembras no Tg y hembras Tg Bcl-2 que se agotan en células T reguladoras después del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-CD25 (5,6) exhiben muy altos niveles de cGPBP-1 precediendo al umbral de una CIA clínica (después de 4 semanas de inducción de CIA; p<0.02 en todos los casos), pero estos niveles son significativamente reducidos, incluso debajo de los niveles observados en controles no inmunizados sanos, una vez que la CIA es clínicamente manifestada con alta severidad (8 semanas después de la inducción de CIA, p<0.05 en todos los caso, Figura 7). Colectivamente, nuestros datos indican que la GPBP-1 es un bio-marcador para la etapa temprana en la patogénesis RA.

DIVULGACIÓN IL-1 ß es una citoquina multi-funcional prototípica, principalmente producida por los monocitos sanguíneos. Pero también por los macrófagos, las células dendríticas y por una variedad de células de casi todos los tipos (7). IL-1 ß está involucrado en la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias y en modelos de animales y de humanos de GN (7, 8, 9, 10).

El JL-1 p y la liberación de cGPBP-1 se coordinan en el mismo estimulo pro-inflamatorio que activa la inflamasoma. Bajo condiciones pro-inflamatorias tales como la estimulación LPS, el pro-IL-1 ß y GPBP-1 se acumulan dentro de la célula. Entonces, después de la activación de la inflamasoma mediada con doxorubicina, ambos IL-1 p y cGPBP se secretan a medios extracelulares.

La regulación descendente de GPBP-1 disminuye la producción de pro-IL-? ß y retrasa la liberación de IL-1 ß en la línea celular como macrófago cultivado RAW 264.7 revelando que la expresión GPBP-1 y la activación es una etapa más anticipada que la expresión pro-IL 1 ß y la activación en la cascada pro-inflamatoria. Se encontró que la concentración de cGPBP-1 está debajo de 10 ng/ml en el suero de los controles saludables y se incrementa significantemente en el suero de los pacientes con nefropatía de IgA y nefritis por lupus (ver lo anterior). Esto es consistente con los hallazgos previos que el GPBP-1 se acumula en los glomérulos de los ríñones NZW envejecidos experimentando GN mediada por el complejo inmune sub-clínico (1 1 ). Los macrófagos RAW 264.7 secretan grandes cantidades de cGPBP-1 (>20 ng/ml) junto con IL-1 ß después del estímulo pro-inflamatorio, elevando la posibilidad de que el cGPBP-1 pueda funcionar como un factor pro-inflamatorio autocrino, paracrino (cGPBP-1 en el glomérulo) o incluso endocrino (cGPBP-1 en suero). Además, el GPBP-2 se ha propuesto previamente como un blanco para tratar la inflamación (12), dado que su inhibición se espera para limitar la disponibilidad de las ceramidas para la síntesis de PGE2 en respuesta de IL-?ß, sugiriendo que ambos GPBP-1 y GPBP-2 son parte de una cascada pro-inflamatoria. Adicionalmente, se compararon los niveles de cGPBP-1 con aquellos de CRP, un marcador de la inflamación sistémica. Los niveles del suero de estas proteínas muestran una relación inversa en los sueros de los pacientes con proteinuria o RA, que sugieren un rol dual para cGPBP-1 como un factor pre- y pro-inflamatorio.

REFERENCIAS 1. Sauter KA, Wood LJ, Wong J, lordanov M y Magun BE. La doxorubicina y la daunorubicina inducen la liberación y procesamiento de la interleuquina 1 ß a través de la activación de la inflamasoma NLRP3.' Cáncer Biol Ther 2011 ; 11: 1008-1016. 2. Schroder K, Zhou R y Tschopp J. La inflamasoma NLRP3: Un Sensor para el Daño Metabólico? Science 2010; 327: 296-300. 3. Perregaux D y Gabel CA.La maduración y la liberación de la lnterleuquina-?ß en la respuesta a ATP y Nigericina. J Biol Chem 994; 269: 5195-15203. 4. Holmdahl R, Bockermann R, Bácklund J y Yamada H. La patogénesis molecular de la artritis inducida en colágeno en ratones - un modelo para la artritis reumatoide. Ageing Res Rev 2002; 1 , 135-147. 5. Jansson L y Holmdahl R. Supresión inducida por oestrogen de la artritis por colágeno; el oestradiol 17-beta es, terapéuticamente activo en ratones híbridos F1 normales y castrados de ambos sexos. Clin Exp Immunol 1992; 89: 446-451. 6. González J, Tamayo E, Santiuste I, Marquina R, Buelta L, González-Gay MA, Izui S, López-Hoyos M, Merino J y Merino R. Inhibición dependiente de las células T CD4+CD25+ de la auto-inmunidad en ratones transgénicos sobre-expresando el Bcl-2 de humano en linfocitos T. J Immunol 2007; 178: 2778-2786. 7. Church LD, Cook GP y McDermott MF. Iniciador: inflamasomas e interleuquina 1 beta en las enfermedades inflamatorias. Nat Clin Pract Rheumatol 2008; 4: 34-42. 8. Timoshanko JR, Kitching AR, Iwakura Y, Holdsworth SR y Tipping PG. Contribuciones de IL-1 beta y IL-1 alfa para la GN creciente en ratones. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 910-918. 9. Goldbach-Mansky R y Kastner DL. Auto-inflamación: el rol prominente de IL- en enfermedades auto-inflamatorias monogénicas e implicaciones para las enfermedades comunes. J Allergy Clin Immunol 2009; 124: 1141-9; quiz 1150-1. 10. Aringer M y Smolen JS. Expresión de la citoquina en ríñones de lupus. Lupus 2005; 14: 13-18. 1 1. Revert F, Merino R, Monteagudo C, Macias J, Peydró A, Alcácer J, Muniesa P, Marquina R, Blanco M, Iglesias M, Revert-Ros F, Merino J y Saus J. La expresión de la proteína de unión al antígeno Goodpasture incrementada induce la desorganización y el depósito del colágeno tipo IV de la inmunoglobulina A en la membrana de la base glomerular. Am J Paf/7o/ 2007; 171 : 1419-1430. 12. Lamour NF, Stahelin RV, Wijesinghe DS, Maceyka M, Wang E, Allegood JC, Merrill AH Jr, Cho W, Chalfant CE. Quinasa ceramidas usa la ceramidas proporcionada por la proteína de transporte de ceramidas: localización para los organelos de la síntesis eicosanoide. J Lipid Res. 2007; 48:1293-304.

Ejemplo 3: Inhibidores de la proteína-1 de unión al antígeno Goodpasture (GPBP-1) como fármacos para el tratamiento de la fibrosis pulmonar La fibrosis pulmonar (PF) ocurre cuando el tejido del pulmón llega a dañarse y cicatrizarse. La PF puede desarrollarse por causas desconocidas (PF idiopática) o se asocia o induce por muchas condiciones incluyendo los procesos inflamatorios crónicos, infecciones, agentes ambientales, exposición a la radiación ionizante y ciertos medicamentos (1 ). A este respecto, se ha estimado que aproximadamente 5-10% de los pacientes bajo quimioterapia por cáncer pueden desarrollar algún grado de PF. Además, la bleomicina y la doxorubicina han demostrado que inducen la PF en diferentes especies animales incluyendo los humanos (2-5). El pronóstico de los pacientes con PF es malo y la mayoría de los pacientes con esta enfermedad se mueren dentro de los 5 años. Desafortunadamente, ningún medicamento ha demostrado que mejora el resultado de los pacientes con PF (1 ) y el trasplante de pulmón es solamente una opción terapéutica disponible en nuestros días.

El GPBP-1 regula la organización supramolecular de las proteínas estructurales tanto dentro y fuera de la célula (6, .7). Dicha expresión de GPBP-1 se regula por el estímulo inflamatorio tal como TNFa (8, 9) y la inflamación juega un rol principal en la inhibición y o progreso del proceso fibrótico, aquí se hipotetiza que el GPBP-1 puede ser una molécula clave involucrada en la patogénesis de las enfermedades caracterizadas por la acumulación aberrante de diferentes tipos de colágenos (es decir: tipo I del colágeno) tal como PF. En el presente estudio, se han caracterizado dos compuestos de la Biblioteca Química de Pretswick que tienen la habilidad de modular la actividad GPBP-1 in vitro. La capacidad terapéutica de estos compuestos, pinacidil y miricetina, se ha evaluado en vivo usando el modelo experimental de la PF inducida por doxorubicina en ratones. Finalmente, para confirmar que el GPBP-1 es un blanco en la PF inducida por doxorubicina se usaron dos diferentes anticuerpos monoclonales para" GPBP-1 , mAb 14 y mAb N12 para tratar la PF inducida por doxorubicina en ratones.

RESULTADOS Instilación Intratraqueal de la doxorubicina que promueve la PF.

La instilación intratraqueal (i.t.) de 75 µg de doxorubicina en ratones machos C57BL/6 causó una alteración generalizada en la arquitectura de los pulmones 12 días después de la administración del fármaco que macroscópicamente se caracterizó por la inflamación intensa de los pulmones que parecen hemorrágicos (Figura 8). El análisis histológico muestra una infiltración celular inflamatoria intensa que incluye la presencia de granulomas perivasculares y la deposición de la matriz intersticial resultando en la obliteración de los alveolos (Figura 8, HE). La naturaleza del colágeno de los depósitos de la matriz intersticial es evidente 'después de la marcación de tricromías de Masson de los pulmones (Figura 8). En paralelo con el desarrollo de las lesiones histológicas, un incremento en la expresión del gen del a1 -colágeno se observa en los pulmones de ratones tratados con doxorubicina por el análisis RT-qPCR (Figura 9).

Expresión mejorada de GPBP-1 durante la inducción de la PF inducida por doxorubicina Para explorar el involucramiento potencial de GPBP-1 en la patogénesis de la PF inducida con doxorubicina, se han medido primero los niveles de GPBP-1 circulante en diferentes intervalos de tiempo después de la instilación de la doxorubicina por ELISA: los niveles de suero de GPBP-1 incrementan agudamente por anticipado después de la instilación con doxorubicina (día 5) y subsecuentemente caen alcanzando los valores más bajos en el día 12 cuando la inflamación y la fibrosis son clínicamente evidentes (Figura 9A, p<0.05 en todos los casos), en cuyo caso los niveles de expresión son similares a los de control (Figura 9B). Finalmente, los estudios de inmunohistoquímica usando anticuerpo policlonal anti-GPBP-1 específico (6) muestran que el GPBP-1 expresado en niveles muy bajos en los pulmones de ratones no tratados y su expresión se confinan en el epitelio bronquial (Figura 9C). En contraste, una expresión aumentada de GPBP-1 se observa en los pulmones de ratones tratados con doxorubicina que se localizan en ambos parénquima y epitelio bronquial. En esta última ubicación, la expresión GPBP-1 adopta un diseño parchado en asociación con los depósitos de matriz extracelulares (Figura 9C).

Pinacidil y miricetina, dos inhibidores in vitro de GPBP-1 , aminoran la PGF inducida con doxorubicina en vivo.

Dos compuestos químicos de la Biblioteca Pública de Pretwick, el Pinacidil y la Miricetina, se seleccionaron por su habilidad para interferir in vivo con la actividad GPBP-1 (no mostrada).

Aquí se ha explorado el uso potencial del pinacidil o miricetina para tratar la PF inducida con doxorubicina. Primero, los ratones se instilaron i.t. con doxorubicina y se trataron desde el inicio hasta el final del experimento (días 0-12) con diferentes dosis de pinacidil. Una dosis diaria de 0.08 mg/kg de pinacidil redujo agudamente la severidad de la fibrosis pulmonar inducida con doxorubicina (Figura 10) y consistentemente una expresión reducida significante de mARN de colágeno a1 (I) pulmonar se observó en los ratones tratados con pinacidil (Figura 11 A). Las dosis menores de pinacidil resultaron en una reducción similar de la expresión de mARN de colágeno a1 (l) (Figura 11 A). Sorprendentemente, el efecto terapéutico del pinacidil se perdió cuando se administraron dosis más altas del fármaco (0.25 o 1.225 mg/kg/día) (Figura 11 A). En contraste, cuando los ratones se trataron con miricetina, la reducción eficiente en la fibrosis inducida con doxorubicina se obtuvo en todas las dosis probadas. (Figura 11 B). mAb14 y mAb N26, dos anticuerpos monoclonales para GPBP-1 , aminoran la PF inducida con doxorubicina en vivo Se ha explorado el uso potencial de mAb 14 y mAb N12 para tratar la PF inducida con doxorubicina. Cuatro grupos de ratones se inyectaron i.t. con doxorubicina y se trataron desde el primer día después de la instilación i.t. con un anticuerpo monoclonal en contra del Factor de Crecimiento de Transformación ß (ctTGFP; 1 mg/semana divido en 3 dosis), una terapia anti-fibrótica conocida (10) o con mAb-14 (1 mg/semana dividido en 3 dosis) o con mAB N12 (25 ?/ßß?t???? en una sola inyección) o se dejaron sin tratar (Doxo). Para evaluar el efecto de los tratamientos en la fibrosis pulmonar, la expresión mARN en los pulmones de la cadena a1 del colágeno I (2) y el colágeno IV se determinaron por RT-qPCR. La doxorubicina incrementa ambas expresiones a1(l) y a1 (IV) (fibrosis). La mAbs en contra de GPBP-1 reduce la expresión de ambos <x1 (l) y 1 (IV) mejor que aTGF, que no reduce significativamente la expresión de a1 (IV) y tuvo un efecto más limilado en la expresión <x1 (l) (* P < 0.05, *** P < 0.001 ). (Figura 12).

CONCLUSIONES La instilación intra-traqueal de la PF inducida con doxorubicina. 1 ) Un incremento en los niveles de cGPBP-1 en suero y GPBP-1 en los pulmones se observó durante el desarrollo de la PF inducida con doxorubicina. 2) Cuatro inhibidores GPBP-1 distintos incluyendo dos mAbs en contra de GPBP-1 aminoraron la PF inducida con doxorubicina.

REFERENCIAS 1. Noth I y Martínez FJ. Avances recientes en la fibrosos pulmonar idiopática. Chest 2007; 132: 637-650. 2. Sleijfer S. Neumonitis inducida con bleomicina. Chest 2001 ; 120: 617-624. 3. Injac R y Strukelj B. Avances recientes en la protección en contra de la toxicidad inducida por doxorubicina. Technol Cáncer Res Treat 2008; 7: 497-516. 4. Meadors M, Floyd J y Perry MC. Toxicidad pulmonar de lá quimioterapia. Semin Oncol 2006; 33: 98-105. 5. Óz E y Ylhan MN. Efectos de la melatonina en la reducción de los efectos tóxicos de la doxorubicina. Mol Cell Biochem 2006; 286: 1 1—15. 6. Revert F, Merino R, Monteagudo C, Macias J, Peydró A, Alcacer J, Muniesa P, Marquina R, Blanco M, Iglesias M, Revert-Ros F, Merino J y Saus J. La expresión de la proteína de unión al antígeno Gdodpasture incrementada induce la desorganización del colágeno tipo IV y el depósito de inmunoglobulina A en la membrana de base glomerular. Am J Pathol 2007; 171 : 1419-1430. 7. Revert-Ros F, López-Pascual E, Granero-Moltó F, Macias J, Breyer R, Zent R, Hudson BG, Saadeddin A, Revert F, Blasco R, Navarro C, Burks D, Saus J. La proteína de unión al antígeno Goodpasture (GPBP) dirige la formación miofibril: identificación del efecto descendente intracelular de ia proteína de interacción GPBP 130kDa. J Biol Chem. 2011 ; 286: 35030-35043. 8. Granero F, Revert F, Revert-Ros F, Lainez S, Martínez-Martínez P y Saus J. Un promotor responsable TNF-específica en humanos para la proteína de unión al antígeno Goodpasture. FEBS J 2005, 272: 5291-5305. 9. Miralem T, Gibbs PE, Revert F, Saus J y Maines MD. La actividad de la quinasa (GPBP) de la proteína de unión al antígeno suprime la reductasa biliverdin en humanos: la reductasa regula la expresión GPBP del factor a-NF- B-dependiente de la necrosis tumoral. J Biol Chem 2010; 285:12551-12558. 10. McCormick LL, Zhang Y, Tootell E, Gilliam AC. El tratamiento anti-TGF-beta previene la fibrosis pulmonar y de la piel en la enfermedad de injerto en contra del huésped esclerodermatoso murino: un modelo para el escleroderma en humanos. J Immunol. 1999; 163:5693-5699.

MÉTODOS Experimentos en humanos Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las líneas guía institucionales para el uso de animales en experimentación.

Para los estudios en vivo con anticuerpos para tratar la glomerulonefritis mediada por el complejo inmune (Ejemplo 1 ), los ratones NZW y C57BL/6 se generaron y mantuvieron en un ambiente libre de patógenos. Para monitorear mAbs en vivo, ratones NZW de 8-10 meses de viejos recibieron un solo estímulo de 10 µg/g de peso corporal de mAB N12 (n=3) o N26 (n=3) marcados con biotina y las muestras de suero se colectaron en intervalos de tiempo específicos. Para las pruebas terapéuticas, ratones NZW de 8-10 meses de viejos recibieron una inyección semanal de 1 de peso corporal de mAb N12-biotna (n=5), mAb N26-biotina (m=5), IgG de suero de ratón (n=3) o PBS (n=3). Los tratamientos duraron 8 semanas y las muestras de suero se colectaron inmediatamente antes de » las inyecciones. Los anticuerpos o PBS se administraron intraperitonealmente y las muestras de suero se obtuvieron de la cola del ratón y se usaron para las determinaciones analíticas. No se encontraron diferencias entre los ratones tratados con IgG y PBS y ambos grupos se usaron colectivamente para análisis estadístico. Al final del tratamiento, todos los ratones se sacrificaron y los ríñones se analizaron mediante técnicas histológicas estándares. El suero de ratones NZW de 3 meses de viejos y ratones C57BL/6 de 8-10 meses de viejos se usaron como controtes en los estudios analíticos.

Para inducción de la PF con doxorubicina (Ejemplo 3) se compraron ratones C57BL/6 machos de seis a 10 semanas de viejos en Harían Ibérica (Barcelona, España). Para instilación intratraqueal (i.t.) de la doxorubicina (Sigma), los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (50 µg/g de peso corporal), sulfato atropina (0.2 µg/g) y diazepam (4 µg/g). La tráquea se localizó por incisión cutánea en la cara anterior del cuello y se inmovilizó con fórceps. Entonces 75 µ? de clorhidrato de doxorubicina (1 mg/ml) se inyectaron 1.t. con una aguja de 30G. La piel posteriormente se suturó con 3/0 de seda. Los ratones se alimentaron ad libitum con una dieta de cpmida normal y se sangraron del plexo retro-orbital en diferentes intervalos de tiempo después de la instilación i.t. de doxorubicina. El pinacidil y la miricetina se seleccionaron de la Biblioteca Química de Pretswick en la base de su capacidad para inhibir la actividad de autofosforilación de GPBP en vivo. Los ratones instilados i.t. con doxorubicina se inyectaron diariamente i.p. con 0.027, 0.08, 0.25 o 1.225 mg/kg de Pinacidil o con 0.11 , 0.34 o 0.95 mg/kg de miricetina. Los ratones se sacrificaron doce días después de la administración de doxorubicina por el análisis de expresión de genes y los estudios anatomopatológicos de los pulmones.

Muestras de Suero en Humanos Las muestras de suero en humanos se obtuvieron del Hospital 12 de Octubre (Madrid, España) y del Centro George M. O'Brien de la Universidad de Washington para la Búsqueda de Enfermedades del Riñón (St. Louis, EUA) siguiendo los procedimientos previamente autorizados por el Comité Ético correspondiente, excepto para PKD, el diagnóstico del paciente se soportó por el análisis histológico de la biopsia renal correspondiente.

Anticuerpos e inmunoelectrotransferencia Western Los anticuerpos monoclonales N12, N26 y N27 se generaron en contra del GPBP-1 recombinante de humano Pichia pastoris, cuya producción se ha reportado previamente (1 , 2). El anticuerpo monoclonal e1 1 -2 se genero en contra de GST-e26, una proteína quimérica expresada en E. coli conteniendo la secuencia de proteínas codificada por el exón 1 1 de GPBP-1 , ausente en GPBP-2, fusionada al glutatión S-transferasa (GST). Cuando se indica, mAbs N12 y N26 fueron marcados con biotina con Sulfo-NHS-LC-Biotina (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se usaron para pruebas en vivo. Para los estudios de inmunofluorescencia, el GPBP-1 se visualizó usando mAb N27 marcado con Flúor 546 Alexa™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), o anticuerpos policlonales anti-GPBP-pepl de pollos previamente caracterizados (3). El anticuerpo monoclonal N27 marcado con peroxidasa de rábano (HRP; EZ-LINK Plus™ Peroxidasa Activada, Thermo Fisher Scientific) se usó para la detección de GPBP-1 y c-GPBP-1 recombinante.

La inmunoelectrotransferencia Western y SDS-PAGE se realizaron bajo condiciones reducidas siguiendo los procedimientos estándares.

Anticuerpos Comerciales Los anticuerpos policlonales de colágeno anti-tipo IV de cabra (Chemicon, Temecula, CA) se marcaron con Flúor 647 Alexa™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), y mAb3 anti-a3 (IV) marcado con biotina (Wieslab AB, Lund, Suiza) se usaron para la detección de las redes glomerulares oc1.a1.a2(IV) and a3.a4.a5(IV) respectivamente. Ambos dominios recombinantes cGPBP-1 y oc3(IV)NC1 se detectaron con ANTI-FLAG M2-Peroxidasa (Sigma-Aldrich, St Louis. MO). Los depósitos del componente complemento 3c (C3c), IgA, IgG e IgM se visualizaron con anti-C3c-FITC policlonal de conejo (Abcam) y IgA-, IgG- o IgM-FITC anti-ratón de cabra (Sigma-Aldrich), respectivamente. Los anticuerpos biotinilados se detectaron con NeutrAvidin-HRP de Alta Sensibilidad (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), estreptavidina-AF488 (Invitrogen) o Extravidin™-TRITC (Sigma-Aldrich). Los anticuerpos secundarios usados fueron anticuerpos policlonales de cabra para el IgY-FITC de pollo (Abcam) e IgG-HRP anti-ratón de burro (Jackson InmunoResearch Europe Ltd, Suffolk, RU).

Cultivo Celular Las células A549 se cultivaron en F-12 de Eagle modificado de Dulbecco, mientras HEK 293 y RAW 264.7 se cultivaron con medio de Eagle modificado de Dulbecco. Todos los medios se suplementaron con 10% de suero de becerro fetal y con 1% de penicilina/estreptomicina.

Construcción del plásmido y transfección celular El higro vector pSilencer™ 2.1 - U6 (Ambion) se empleó para expresión estable de mARNs de interferencia pequeña (siARNs) específicas para el GPBP-1 de silenciado. La construcción derivada se nombró pSi-GPBP-1 y la secuencia blanco de cADN fue GCCCTATAGTCGCTCTTCC (SEQ ID NO: 11), como se describió previamente (4).

Para la expresión y la purificación de GST-e26, usado para obtener el anticuerpo mAb e11- 2, el cADN del exón GPBP-1 se clonó descendentemente en el recuadro con el cADN de GST en el vector PGEX-5x-1 (GE Healthcare).

Las transfecciones de las células RAW 264.7 se realizaron mediante los procedimientos del fosfato de calcio usando el Sistema de Protección de Mamíferos ProFection™ (Promega) o la Lipofectamina 2000 (Invitrogen), siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. La expresión de GPBP-1 en clones individuales se determinó por el análisis de inmunoelectrotransferencia Western de los extractos celulares. Los clones expresando niveles reducidos de GPBP-1 se usaron en estudios funcionales.

Tratamiento Celular Las células RAW 264.7 de tipo natural y las células RAW 264.7 GPBP-1 silenciado se colocaron en placas de 2 x106 células/pozo en placas de cultivo de 6 pozos y se estimularon con 1 ?/?? de LPS (Sigma-Aldrich, serotipo E. Coli 026.B6) durante la noche (16 h). Posteriormente, los macrófagos LPS-amplificados se expusieron a 10 µ? de doxorubicina (Sigma-Aldrich) durante 2, 4 y 6 horas. Después de la incubación con doxorubicina, la expresión de pro-IL-? ß y GPBP-1 citosólico se analizó en los lisatos celulares por la inmunoelectrotrarisferencia Western y IL-1 ß y el cGPBP-1 maduro en sobrenadantes medios se cuantificó por ELISA.

Los lisatos celulares' se obtuvieron mediante eliminar las células en el estabilizador de lisis (25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 150 mM NaCI, 1 % Tritón X-100, 0.1 % SDS, 1 µ? de leupeptina, 1 mM de PMSF) y se incubaron en hielo por 10 min. Los lisatos se clarificaron mediante centrifugación a 15,000 x g por 10 min a 4 °C y se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia Western.

Expresión recombinante y purificación de GPBP-1 y GST-e26 El poli-His-GPBP-1 recombinante usado en ELISA se purificó de E. coli transformado con c ADN GPBP-1 clonado en el recuadro en el sitio de clonación múltiple del pET-15b del plásmido de expresión (Merck KgaA, Darmstadt, Alemania), los cuales agregan una etiqueta de seis histidinas para facilitar su purificación con columnas de agarosa templada con níquel (Clontech Laboratories, Mountain Viéw, CA) siguiendo los procedimientos estándares.

El cGPBP-1 recombinante (rcGPBP-1 ) se purificó usando Gel de Afinidad ANTI-FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) del medio de cultivo celular de un clon celular HEK 293 que constitutivamente secreta FLAG-GPBP-1.

La expresión GST-e26 se indujo con 1 mM de IPTG en células DH5oc E. coli albergando la construcción pGEX-5x-1 -e26 y la purificación se realizó con resina de afinidad de GSH-agarosa (Sigma) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La pureza de poli-H¡s-GPBP-1 , rcGPBP-1 o GST-e26 se evaluó mediante SDS-PAGE y marcación con azul Coomassie y su integridad mediante inmunoelectrotransferencia Western usando mAbs para GPBP-1 incluyendo mAb N26, mAb N27 y mAb e1 1 -2.

Estudios Patológicos Todos los ratones se sacrificaron en una cámara de C02. Después de los anticuerpos en vivo con los anticuerpos (Ejemplo 1 ), los ríñones se fijaron en 10% de formalina y se incrustaron en parafina. Se obtuvieron secciones de 2 µt? por un micrótomo giratorio electrónico ( icrom, Walldorf, Alemania) y se sometieron a marcación de Masson (Masson), Hematoxilina/Eosina convencional. En pruebas PF, los pulmones de los ratones se perfusionaron intrabronquialmente con 4% de formalina estabilizada con fosfato, entonces se encubaron en este fijador durante 24 horas y finalmente se incrustaron en parafina. Las secciones del tejido de 5 µ?? se marcaron con HE o con tricromía de Masson siguiendo los métodos convencionales. Para inmunohistoquímica, los pulmones incrustados en parafina se marcaron con anticuerpos anti-GPBP-pepl (3), que se detectaron con sustrato DAB y HPR anti-pollo (Dako Diagnósticos, S.A., Barcelona España). Los especímenes se contra marcaron con hematoxilina.

Inmunofluorescencia Los ríñones se incrustaron en OCT (Sakura, Tokio, Japón) y se congelaron. Secciones de seis-µ?? se obtuvieron con un criostato (Microm) y se marcaron para análisis de microscopía confocal y convencional previamente descrita (3).

Análisis de Microseries Las células A549 de humanos se cultivaron con o sin 200 ng/mL de rcGPBP-1 por tres horas. Posteriormente las células se lisaron y el ARN total se extrajo con un mini equipo de protección Rneasy™ (Qiagen Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN cuantifícado por espectrometría con un bioanalizador NanoDrop™ ND1000 (NanoDrop Technologies, Wilminton, DE) y la calidad se conformó mediante una prueba del Nano Bioanalizador RNA 6000 (Agilent Technologies, Palo Mo, CA). Brevemente, 150 ng del ARN total se usaron para producir cARN marcada con 3-CTO Cianina usando el equipo de Marcación Amp Quick™ de Entrada baja de Un Color (Agilent) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Siguiendo el protocolo del Análisis de Expresión de Genes Basado en Microseries de Un color Versión 6.0 (Agilent), 1600 ng de cARN marcados se hibridaron con el Equipo de Oligo Microseries del Genoma Humano Completo (Agilent) conteniendo 41000+ genes de humano únicos y transcripciones. Las series se analizaron en un Analizador de Microseries Agilent de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los datos se extrajeron usando el Programa de Extracción de Características Agilent 10.7.1 siguiendo el protocolo Agilent GE1_107_Sep09, platilla de rejilla 014850_D_F_20100430 y el Equipo Métrico QC GE1_QCMT_Sep09. El análisis se realizó en el Servicio de Núcleo de Genomas del Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia, España) usando un Analizador de Microserie Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Los archivos de los datos sin procesar se originaron correctamente usando la metodología del proveedor y la señal de la intensidad se estandarizó a través de las series vía el algoritmo de normalización cuantil. La evaluación de la expresión del gen diferencial de todas las comparaciones se llevó a cabo usando t-estadísticas moderadas limma. El ajuste convencional para la prueba múltiple propuesta por Benjamini Hochberg (5) se usó para derivar los P-valores ajustados. También, para cada una de las comparaciones realizadas en este estudio, el análisis del equipo de genes se llevó a cabo usando modelos de regresión logística y corrigiendo la prueba múltiple como antes (5). Todos los análisis en donde se llevaron a cabo usando la prueba en la red Babelomics™ (6) en el Departamento de Bioinformática del Centro de Investigación Príncipe Felipe. Los datos de la serie se han depositado en GEO (Número de Acceso GSE32181).

Análisis PCR en Tiempo Real En pruebas de fibrosis pulmonar experimental, la expresión de GPBP y de los mARNs de los colágenos tipo I y tipo IV en el pulmón se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Un µg de ARN aislado se usó para la síntesis de cADN con un equipo RT-PCR (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La RT-qPCR se realizó en un instrumento MX-3000P Stratagene (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) usando una Mezcla Maestra de PCR Verde SYBR de iniciadores (primers) específicos (Applied Biosystems, Life Technologies Corporation). Los iniciadores usados fueron: para gen de colágeno a1 (l), 5' iniciador 5'-TCCTGCTGGTGAGAAAGGAT-3' (SEQ ID NO: 12) y el iniciador 3' 5'-CTGGAGTCCCATAACGACCT-3' (SEQ ID NO: 13); para el gen GPBP gene, iniciador 5' 5'-GCTGTTGAAGCTGCTCTTGACA-3' (SEQ ID NO: 14) e iniciador 3' 5*-CCTGGGAGCTGAATCTGTGAA-3'(SEQ ID NO: 15); para el 18S, iniciador 5' 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3' (SEQ ID NO: 16) e iniciador 3" 5'-GCGATGATGGCTAACCTACC-3' (SEQ ID NO: 17). Los resultados (en triplicado) se normalizan para la expresión de la subunidad 18S ribosomal y se midieron en paralelo para cada muestra. Los datos se expresaron como cambio de doblez medio relativo a las muestras de control.

Inmunopurificación de cGPBP-1 cGPBP-1 se extrajo del plasma de humano mediante cromatografía de afinidad.

Especialmente, el plasma (200 mL) se clarificó mediante centrifugación, se filtró (0.45 µ??) y se diluyó 1 :5 (v/v) con 25 mM, Tris pH 7.4, 150 mM de NaCI (Solución salina estabilizada con Tris, TBS) suplementada con 0.05% Tween 20 (TBST). El sobrenadante se cargó en una columna conteniendo 1 mg de mAb N26 inmovilizado en 1 mL de Sefarosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Sigma-Aldrich). El material dé unión se lavó con 10 mL de TBST, se eluyó con Estabilizador de Elución Ag/Ab Suave ImmunoPureTM (Thermo Fisher Scientific) y se dializó extensivamente en contra de TBS.

Procedimientos de ELISA Para evaluar la interacción de GPBP-1 con el dominio 1 de no colágeno de la a3 cadena del colágeno tipo IV [ 3(IV)NC1], las placas se cubrieron con 1 µg/mL poli-His-GPBP-1 en PBS. Después del bloqueo, las placas se incubaron con 1 µg/mL FLAG-a3(IV)NC1 , en la ausencia o presencia de 1 µg /mL de mAbs N12 o N26. La unión FLAG-a3(IV)NC1 se detectó con 1 ug/mL ANTI-FLAG M2-Peroxidasa.

La cuantificación de cGPBP-1 o el mAbs biotinilado se realizó mediante la intercalación de placas de recubrimiento de ELISA con mAb N26 o poli-His-GPBP-1 en 2 µglmL en PBS, respectivamente. Las placas se bloquearon y se incubaron con las muestras (diluciones 1 :10-1 :20) y la detección realizada con mAb N27-HRP o NeutrAvidin™-HRP de Alta Sensibilidad en 1 µ?/???, respectivamente.

En todos los casos, las placas se cubrieron por 16 h a 4°C y se bloquearon con 3% de BSA en PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Las incubaciones subsecuentes se hicieron por 1 -2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Las placas se lavaron intensamente entre las etapas y se desarrollaron con un sustrato HRP fluorescente (Quanta Blue, Thermo Fisher Scientific). La intensidad de la fluorescencia se midió con un Lector de Microplacas de Fluorescencia XPS SpectraMax™ Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos adquiridos se adquirieron con el Programa de Análisis y Adquisición de Datos SoftMax™ Pro (Molecular Devices). A menos que se indique de otra manera todas las diluciones y lavados se hicieron con TBST.

Las titulaciones CRP y IgG de Anti-ss-ADN se midieron mediante el intercambio indirecto de ELISA usando un equipo comercial de Alpha Diagnostic Intl. (San Antonio, TX) y Meditec (Kiel, Alemania), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para evaluar la producción de IL-1 ß madura mediante las células RAW 264.7 estimuladas, el medio de cultivo celular se analizó usando el equipo ELISA listo para usarse para el IL-1 ß de ratón (eBioscience, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Estudios Microscópicos de los Electrones Los ríñones se dividieron y fijaron mediante inmersión en 2% de paraformaldehído y 2.5% de glutaraldehído en 0.1 M de fosfato de sodio pH 7.4 (PB) por 24 horas a 4°C y posteriormente se lavaron con PB. Las secciones de 200 µ?? se obtuvieron con vibratomo (Leica VT-1000; Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Alemania), fijados con 2% de tetróxido de osmio en PB por 1.5 horas, se lavaron con agua templada (3 x 5 min), se deshidrataron a través de lavados secuenciales con concentraciones de incremento de soluciones de etahol templadas (5 min con 30%, 5 min con 50% y 10 min con 70%), se lavaron con 2% de acetato de uranilo en 7% de etanol por 2.5 horas a 4°C y ádemás se deshidrataron con lavados de 2 x5 minutos en 70% de etanol, y lavados de 10 minutos con 96% de etanol, lavados de 2 x 7 minutos en 100% de etanol y un solo lavado de 10 min en 100% de etanol seco. Finalmente, las sesiones se lavaron 2 x 10 minutos con óxido de propileno y se incrustaron en araldito (Durcupan, Sigma-Aldrich). Las secciones de semifinas de 1.5 µ?? ? secciones de ultrafinas de 0.08 µ?? se cortaron con un cuchillo de diamante y se marcaron con 1 % de azul de toluidina y con citrato de hojas (solución Reynolds), respectivamente.

Análisis Estadísticos Se usó el programa Prism 4.0 (GraphPad™ Software, San Diego, CA) para todos los cálculos. Los datos se analizaron con ANOVA de dos resultados o la prueba Kruskal-Wailis para evaluar las diferencias significantes entre las series y con la prueba de Spearman para determinar la significancia estadística de la correlación entre los auto-anticuerpos cGPBP-1 y anti-ssADN. Un valor P <0.05 se consideró significante.

REFERENCIAS 1. Raya A, Revert F, Navarro S y Saus J. Caracterización de un tipo novedosos de quinasa serína/treonina que específicamente fosforila al antígeno Goodpasture de humano. J Biol Chem 1999; 274: 12642-12649.

Raya A, Revert-Ros F, Martinez-Martinez P, Navarro S, Rosello E, Viertes B, Granero F, Forteza J y Saus J. La proteína de unión al antigeno Goodpasture, la quinasa que fosforila al antigeno Goodpasture, es una variante alternativamente empalmada implicada en la patogénesis auto-inmune. J Biol Chem 2000; 275: 40392-40399.

Revert F, Merino R, Monteagudo C, Macias J, Peydró A, Alcacer J, Muniesa P, Marquina R, Blanco M, Iglesias M, Revert-Ros F, Merino J y Saus J. La expresión de la proteína de unión al antigeno Goodpasture induce a la desorganización del colágeno tipo IV y al depósito de inmunoglobulina A en la membrana de base glomerular, Am J Pathol 2007; 171 : 1419-1430.

Revert F, Ventura I, Martínez-Martínez P, Granero-Moltó F, Revert-Ros F, Macías J y Saus J. La proteína de unión al antigeno Goodpasture es una proteína exportable soluble que interactúa con el colágeno tipo IV. Identificación de las isoformas de la unión a la membrana novedosas. J Biol Chem 2008; 283: 30246-30255.

Benjamini Y y Hochberg Y. Control de la Proporción de Descubrimiento Falso: Un Avance Poderoso Práctico para las Pruebas Múltiples. J R Statist Soc B 1995; 57: 289-300.

Medina I, Cárbonell J, Pulido L, Madeira SC, Goetz S, Conesa A, Tárraga J, Pascual-Montano A, Nogales-Cadenas R, Santoyo J, García F, Marbá M, Montaner D y Dopazo J. Babelómicos: una plataforma integral para el análisis de las transcripciones, proteómicos y de los datos genómicos con perfil funcional avanzado, Nucleic Acids Res 2010; 38 (Asunto del Servidor Web): W210-W213.

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar la fibrosis pulmonar (PF), comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la PF.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la PF es PF no idiopática.

3. Un método para tratar la enfermedad del riñón crónica (CKD), comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la CKD.

4. Un método para tratar la GN mediada por el complejo inmune, comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un inhibidor de 77 kD GPBP para tratar la GN mediada por el complejo inmune.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde la GN mediada por el complejo inmune se asocia con una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo que consiste de nefropatía IgA, lupus sistémico eritematoso (SLE) y enfermedad de Goodpasture.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el sujeto es un humano.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde le inhibidor 77 kD GPBP es un anticuerpo que se une a 77 kD GPBP.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo se selecciona para la isoforma 77 kD GPBP.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7 u 8, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1-9, en donde el inhibidor GPBP comprende un poíipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácido de acuerdo con la fórmula general X1 -SHCIX2-X3 (SEQ ID NO: 2), en donde: X1 es 0- 0 aminoácidos de la secuencia ATTAGILATL (SEQ ID NO: 3); X2 es E o Q; y X3 es 0-10 aminoácidos de la secuencia LMVKREDSWQ (SEQ ID NO: 4).

11. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 -10, en donde el inhibidor GPBP comprende un compuesto de la fórmula (I): o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R se selecciona de N y CR5; R5 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, alquilo CrC6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, halo(alquilo CrC6), alcoxi C,-C6, halo(alcoxi C -Ce), amino, (alquil CrC6)amino, di(alquil Ci-C6)amino, hidroxi(alquilo CrC6), (alcoxi C^Ce) alquilo Ci-C6, amino(alquilo ?,-?ß), sulfanil(alquilo Ci-C6). (alquilo Ci-C6)sulfanil(alquilo C-,-C6), -(CH2)1.5-C(0)(alcoxi CrC6), -(CH2)i.5-C(0)NH2, (arilo)alquilo C2-C6, y (heteroaril) alquilo Ci-C6; es hidrógeno, halógeno, hidroxi, alquilo C C6, halo(alquilo CTC6), alcoxi CVC6, halo(alcoxi ?,-?ß), hidroxi(alquilo C†-C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo C^Ce, amino(alquilo C^Ce), sulfanil(alquilo ?,-?ß), o (alquilo C CeJsulfanilíalquilo CrC6); R2 es alquilo d-C6, halo(alquilo d-C6), alcoxi, d-C6 halo(alcoxi d-C6), hidroxi(alquilo Cr C6), (alcoxi d-C6) alquilo d-C6, formil(alquilo C0-C6), amino(alquilo CrC6), sulfanil(alquilo d-C6), (alquilo C,-Ce)sulfanil(alquilo C,-C6), -(CH2)i.5-C(0)OH, -(CH2)i-5-C(0)(alcoxi C C6), -(CH2)i. 5-C(0)NH2, (aril) alquilo d-C6, o (heteroaril) alquilo d-C6; R3 es alquilo d-C6, alo(alquilo Ci-C6), alcoxi C,-Ce, halo(alcoxi d-C6), hidroxi(alquilo C C6), (alcoxi Ci-C6) alquilo Ci-C6, formil(alquilo CrC6), amino(alquilo CrC6), sulfanil(alquilo d-C6), (alquilo CrC6)sulfani!(alquil0 d-C6), -(CHa - OJOH, -(CH2)1.5-C(0)(alcox¡ CrC6), -(0?2) . s-C(0)NH2, -(CH2)i-s-C(0)NH(alquilo C,-Ce). -(CH2)i^-C(0)N(alquilo d-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi d-C6), (aril) alquilo d-Ce, o (heteroaril) alquilo d-C6; y R4 es hidroxi, halógeno, alquilo d-Ce, alcoxi d-C6, halo(alcoxi d-C6), benciloxi, -(CH2)w-C(0)OH, -(CH2)1-5-C(0)(alcoxi d-C6), -(CH2)1-5-C(0)NH2, -(CH2)w-C(0)NH(alqu¡lo CrC6), -(CH^Ls-CÍOJNÍalquilo d-C6)2, -CH=CH-C(0)OH, -CH=CH-C(0)(alcoxi d-C6), -0(CH2)i^-C(0)OH, -OiCH^g-CiOKalcoxi d-C6), (aril) alquilo CrC6, o (heteroaril) alquilo d-C6.

12. Un método para diagnosticar la artritis reumatoide (RA) o la fibrosis pulmonar (PF) comprendiendo: (a) contactar una muestra de plasma de un sujeto en riesgo de RA o PF con una molécula de unión GPBP que se une a 77 kD GPBP bajo condiciones para promover la unión selectiva de la molécula de unión GPBP para el 77 kD GPBP; (b) detectar la formación del complejo entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra de plasma; (c) comparar una cantidad del complejo formado entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra de plasma para control y (d) diagnosticar al sujeto como teniendo RA o PF con base en la comparación o proporcionando la comparación a una entidad para el diagnóstico de RA o PF.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde la molécula de unión al 77 kD GPBP comprende un anticuerpo que se une al 77 kD GPBP nativo.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el anticuerpo es selectivo para la isoforma 77 D GPBP.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

16. El método de conformidad con las reivindicaciones 12-15, en donde la detección comprende el uso de una técnica seleccionada del grupo que consiste de ELISA, inmunofluorescencia y cromatografía.

17. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 12-16, en donde el sujeto está en riesgo de RA.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el sujeto sufre de uno o más de los síntomas seleccionados del grupo que consiste de: una o más articulaciones infladas, una o más articulaciones rígidas, una o más articulaciones calientes, rigidez de articulaciones temprano en la mañana que típicamente dura más de una hora, fluido sinovial en exceso, desarrollo de tejido fibroso en el sinovia y rango disparejo del movimiento de la articulación.

19. El método de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 12-16, en donde el sujeto está en riesgo de PF.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde el sujeto sufre de uno o más de los síntomas seleccionados del grupo que consiste de: tos seca crónica, fatiga, debilidad, malestar en el pecho, pérdida de apetito, pérdida rápida de peso y disnea con el esfuerzo.

21. El método de conformidad con las reivindicaciones 12-20 que además comprende determinar el nivel de la proteína reactiva C (CRP), en el plasma del sujeto comparando la cantidad de CRP en el plasma del sujeto, para control y usar la comparación CRP para ayudar en el diagnóstico de RA o PF.

22. Un método para diagnosticar el CKD o la GN mediada por el complejo inmune. comprendiendo: (e) contactar una muestra de plasma de un sujeto en riesgo de CKD o GN mediada por el complejo inmune con una molécula de unión GPBP que se une a 77 kD GPBP bajo condiciones para promover la unión selectiva de la molécula de unión GPBP al 77 kD GPBP; (f) detectar (iii) la formación del complejo entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra de plasma y (iv) determinar el nivel de proteína reactiva C en el plasma del sujeto (CRP). (g) comparar (iii) una cantidad del complejo formado entre la molécula de unión GPBP y el 77 kD GPBP en la muestra del plasma para control y (iv) una cantidad de CRP en el plasma del sujeto para control y (h) diagnosticar al sujeto como teniendo CKD o GN mediada por el complejo inmune con base en las comparaciones o proporcionar las comparaciones a una entidad para diagnóstico de CKD o GN mediada por el complejo inmune.

23. Un método para identificar compuestos para tratar la CKD, GN mediada por el complejo inmune y/o PF, comprendiendo contactar un complejo de unión del sustrato 77 kD GPBP-77 kD-GPBP con uno o más compuestos de prueba bajo condiciones de enlace, en donde aquellos compuestos de prueba que desplazan la unión 77 kD GPBP del complejo de unión son compuestos candidatos para tratar la CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o PF.

24. Un método para identificar los compuestos para tratar CKD, la GN mediada por el complejo inmune y/o PF, comprendiendo contactar un sustrato 77 kD GPBP bajo condiciones de enlace con (c) uno o más compuestos de prueba y (d) 77 kD GPBP; en donde aquellos compuestos de prueba que vierten 77 kD GPBP para la unión al sustrato de unión 77 kD GPBP son compuestos candidatos para tratar CKD, la GN mediada por el complejo inmune, y/o PF.