JP2014508150A - 疾病を治療および診断する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、慢性腎疾患、免疫複合体仲介ＧＮ、関節リウマチ、および肺線維症の診断および／または治療の方法、およびそのような治療的使用のための化合物の同定方法を提供する。

Description

本開示の技術は、疾病を治療および診断する方法に関する。
発明の背景
基底膜コラーゲンＩＶのα３鎖の非コラーゲン（ＮＣｌ）領域［α３（ＩＶ）ＮＣｌ］の立体配座は、ある程度、リン酸化によって決まる。グッドパスチャー抗原結合蛋白質（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＰＢＰ，７７ｋＤ ＧＰＢＰまたはＧＰＢＰ−１）（特許文献１；特許文献２）は、その超分子集合中に、α３（ＩＶ）ＮＣｌ領域の立体配座異性化を触媒し、結果的に基底膜における多様なα３（ＩＶ）ＮＣｌ配座異性体の生成および安定化をもたらす、非従来型プロテインキナーゼである。ＧＰＢＰ値上昇は、非寛容化α３（ＩＶ）ＮＣｌ配座異性体の生成と関連づけられており、グッドパスチャー（「ＧＰ」）症候群を仲介する自己免疫応答を実行する。ＧＰ患者において、ＩＶ型コラーゲンα３鎖の非コラーゲンＣ末端領域（ＮＣｌ）（「グッドパスチャー抗原」または「ＧＰ抗原」）に対する自己抗体は、ＧＰ症候群の主要な２つの臨床兆候である、急速進行性糸球体腎炎（ＧＮ）およびしばしば肺出血を引き起こす。
国際公開第００／５０６０７号 国際公開第０２／０６１４３０号
ＧＰＢＰ−１ブロッキングｍＡｂの特性化を示す図。Ａ：組換え型ＧＰＢＰ−１とα３（ＩＶ）ＮＣｌとの間の結合を、表示されたｍＡｂの非存在下（対照）または存在下で、ＥＬＩＳＡで測定した。値は、１００％に設定した対照の、結合パーセンテージとして表現されている。ＧＰＢＰに対する他のｍＡｂは、α３（ＩＶ）ＮＣｌへのＧＰＢＰ−１結合を有意にブロックしなかった（表示せず）。Ｂ：ＮＺＷマウスは、１０μｇ／ｇ体重のビオチン化ｍＡｂ Ｎ１２またはｍＡｂ Ｎ２６の単回腹腔内ブーストを受けた。注射後、表示された時に血液試料を採取し、表示されたｍＡｂの血清抗体価をＥＬＩＳＡで測定した。バーは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。 ＧＰＢＰ−特異的抗体で処置したＮＺＷマウスにおける、循環ＧＰＢＰ−１（ｃＧＰＢＰ−１）値の低下を示す図。Ａ：表示された抗体を用いた例示的な治療効果分析におけるｃＧＰＢＰ−１値の平均値（点、四角、または丸）を示す。二元配置ＡＮＯＶＡ検定（＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１）を使用した、対照とｍＡｂ Ｎ１２−ビオチン群との間の統計学的有意差は、第４週、第５週および第６週に到達した。Ｂ：Ａで採取した各個の試料における血清ｃＧＰＢＰ−１値（丸）、および各シリーズの平均値（線）を表す。クルスカル・ウォーリス（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ）／ダン（Ｄｕｎｎ）検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）によれば、ｍＡｂ Ｎ１２−ビオチン処置群と他の２群との間で統計学的有意差が認められた。 ＧＰＢＰ−１ブロッキングｍＡｂの投与は、ＮＺＷマウスにおけるＧＮ進行を減ずることを示す図。組織化学的手順、免疫蛍光手順およびＥＭ手順で分析した、表示されたマウス群［対照（ｎ＝６）、ｍＡｂ Ｎ１２（ｎ＝５）、ｍＡｂ Ｎ２６（ｎ＝５）］の例示的な糸球体切片を示す。ヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ）染色およびマッソン３色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）（マッソン（Ｍａｓｓｏｎ））染色を使用して、糸球体構造、尿細管委縮および炎症性浸潤を同定した。従来の顕微鏡法を使用してＩｇＧ沈着およびＩｇＭ沈着を可視化し、共焦点顕微鏡法を使用してＣ３ｃ，ＧＰＢＰ−１およびα３（ＩＶ）の分布を可視化するために、標準間接免疫蛍光法を使用した。顕微鏡検査は、対照マウスでは、拡張した毛細管ＧＢＭの上皮側に高電子密度物質を示しており（赤色矢印）、ＧＰＢＰブロッキングｍＡｂで処置したマウスでは、異常は認められない。原倍率ｘ４００。共焦点スケールバー＝３５μｍおよび５４μｍ（最上および最下）。電子顕微鏡法スケールバー＝２μｍ（最上）および１μｍ（最下）。 ＧＰＢＰ−１の下方制御は、ｐｒｏ−ＩＬ−１β値を低下させ、ＩＬ−１β分泌を遅らせることを示す図。Ａ：野生型およびＧＰＢＰ−１−発現停止（ｐＳｉ−ＧＰＢＰ−１）ＲＡＷ ２６４．７細胞を、ＬＰＳで８時間プライミングし、細胞溶解物中のｐｒｏ−ＩＬ−１βおよびＧＰＢＰ−１を、特異的抗体を用いたウェスタンブロットで検出した。ＢおよびＣ：野生型およびＧＰＢＰ−１−発現停止（ｐＳｉ−ＧＰＢＰ−１）ＲＡＷ ２６４．７細胞を１μｇ／ｍｌのＬＰＳで一晩プライミングし、１０μＭドキソルビシンで、表示された時間、ＮＬＲＰ３を活性化した。培地上澄中のＩＬ−１β（Ｂ）およびｃＧＰＢＰ−１（Ｃ）を、ＥＬＩＳＡで検出した。 ｃＧＰＢＰ−１値とＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）値とが、逆相関していることを示す図。蛋白尿患者の血清中のｃＧＰＢＰ−１およびＣＲＰを測定した。プロットは、表示されたＣＲＰ値を有する患者３群の平均（バー）および個々の（丸）ｃＧＰＢＰ−１値を示す。クルスカル・ウォーリス（Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ）／ダン（Ｄｕｎｎ）検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１）によれば、ＣＲＰ＜３μｇ／ｍＬの患者群とＣＲＰ＞４μｇ／ｍＬの患者群との間に統計学的有意差が認められた。 ＲＡ患者が、循環ＣＲＰ値と逆に調節される循環ＧＰＢＰ−１値の上昇を示す図。Ａで、丸は、有意なレベルの抗−環状シトルリン化ペプチド（抗ＣＣＰ）を有する患者１１３名（ＲＡ）および健常なドナー１００名（対照）の個々の血清からの循環ＧＰＢＰ−１値を表す。バーは、シリーズ内の平均値を示す。右側に、マン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｔｎｅｙ）分析の結果を示す。Ｂで、各丸は有意なレベルの抗ＣＣＰを有するＲＡ患者からの個々の血清で見られる、循環ＣＲＰおよびＧＰＢＰ−１のそれぞれの値を表す。 コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症しているマウスにおける循環ＧＰＢＰ−１値を示す図。点は、ウシＩＩ型コラーゲンで免疫化する前（免疫化前）、または免疫化後表示された時刻の、表示されたマウスの個々の血清中のｃＧＰＢＰ−１値を表す。 ドキソルビシンによる肺線維症（ＰＦ）の誘発を示す図。薬物の気管内滴下注入後１２日目の、対照マウスおよびドキソルビシン処置マウスにおける、肉眼的様相（上方パネル）およびヘマトキシリン／エオシンで染色した（真中のパネル）またはマッソン３色で染色した（下方パネル）肺の例示的な組織学的所見（ｘ１０）。 ドキソルビシン誘発性ＰＦ発症中のＧＰＢＰ−１の発現を示す図。Ａに、ドキソルビシンの気管内滴下注入後の表示された時点におけるｃＧＰＢＰ−１値を示す。結果を、個々のマウスの値として表す。バーは、各試験の平均値を表す。Ｂに、薬物滴下注入後１２日目の、対照およびドキソルビシン処置マウスの肺におけるＧＰＢＰ−１ ｍＲＮＡ発現レベルを示す。結果を、各試料で並行して測定された、リボソーム１８Ｓサブユニット発現と比較して、ＧＰＢＰ−１発現の平均±ＳＤ倍率変化として表す。Ｃに、薬物滴下注入後１２日目の、対照およびドキソルビシン処置マウスの肺切片における、ポリクローナル抗ＧＰＢＰ−１抗体を使用したＧＰＢＰ−１発現の免疫組織化学的試験（ｘ１０）。 ドキソルビシン誘発性ＰＦの発症におけるピナシジル処置の影響を示す図。非処置マウスまたは種々の用量のピナシジルで処置した動物由来の肺を、ドキソルビシン滴下注入後１２日目に試験した。ヘマトキシリン／エオシン染色した肺切片（ｘ１０）を示す（左パネル）。加えて、各実験群の個々のマウスにおける組織学的病変の拡大を、冒された実質のパーセンテージとして表す（右パネル）。 ドキソルビシン誘発性ＰＦ発症中の、コラーゲンＩ発現の誘導における、ピナシジル処置またはミリセチン処置の影響を示す図。α１（Ｉ）コラーゲンｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して、ドキソルビシン滴下注入後１２日目に非処置マウス、ピナシジル処置マウスまたはミリセチン処置マウスで測定した。結果を、各試料で並行して測定されたリボソーム１８Ｓサブユニット発現と比較して、α１（Ｉ）コラーゲン発現の平均±ＳＤ倍率変化として表す。統計学的差は、以下の通りに表示する：ｎｓ：非有意、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。 ドキソルビシン誘発性ＰＦに対するＧＰＢＰ ｍＡｂの影響を示す図。α１（Ｉ）コラーゲンｍＲＮＡおよびα１（ＩＶ）コラーゲンｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲを使用して、ドキソルビシン滴下注入後１２日目に、非処置、抗ＴＧＦβ、ｍＡｂ１４またはｍＡｂＮ１２処置マウスで測定した。結果を、各試料で並行して測定されたリボソーム１８Ｓサブユニット発現と比較して、α１（Ｉ）コラーゲン発現の平均±ＳＤ倍率変化として表す。統計学的差は、以下の通りに表示する：ｎｓ：非有意、＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００５。
第１態様で、本発明は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、ＣＫＤを治療する方法を提供する。
第２態様で、本発明は、免疫複合体仲介糸球体腎炎（ＧＮ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、免疫複合体仲介ＧＮを治療する方法を提供する。一実施態様において、免疫複合体仲介ＧＮは、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される自己免疫疾患と関連している。
第３態様で、本発明は、肺線維症（ＰＦ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、ＰＦを治療する方法を提供する。一実施態様において、ＰＦは非特発性ＰＦである。
本発明の第１態様から第３態様までのそれぞれで、対象者は、好ましくはヒトである。各態様において、任意の適当な７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターを使用することが可能である；一実施態様において、インヒビターは、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合する抗体、たとえばＧＰＢＰの７７ｋＤアイソフォームに選択性がある抗体等である。
別の実施態様において、ＧＰＢＰインヒビターは、一般式Ｘ１−ＳＨＣＩＸ２−Ｘ３（配列番号２）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここで：
Ｘ１は、配列ＡＴＴＡＧＩＬＡＴＬ（配列番号３）の０〜１０アミノ酸であり；
Ｘ２は、ＥまたはＱであり；かつ
Ｘ３は、配列ＬＭＶＫＲＥＤＳＷＱ（配列番号４）の０〜１０アミノ酸である。
別の実施態様において、インヒビターは式（Ｉ）：
の化合物またはその薬学的に許容できる塩を含み、ここで：
Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、（アリール）Ｃ２〜Ｃ６アルキル、および（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；かつ
Ｒ４は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
第４態様で、本発明は、
（ａ）ＲＡまたはＰＦの危険性のある対象者由来の血漿試料を、ＧＰＢＰへのＧＰＢＰ−結合分子の選択的結合を促進する条件下で、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合するＧＰＢＰ−結合分子と接触させること；
（ｂ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること；
（ｃ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中のＧＰＢＰとの間で形成された複合体の量を、対照と比較すること；および
（ｄ）比較に基づいて、対象者を、ＲＡまたはＰＦを有するとして診断すること、また
はＲＡもしくはＰＦを診断するための実体に比較を提供すること；
を含む、関節リウマチ（ＲＡ）または肺線維症（ＰＦ）を診断する方法を提供する。
一実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰ−結合分子は、天然の７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合する抗体、たとえばＧＰＢＰの７７ｋＤアイソフォームに選択性がある抗体等、を含む。
別の実施態様において、検出は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、およびクロマトグラフィからなる群から選択される技術の使用を含む。
対象者がＲＡの危険性のある幾つかの実施態様において、対象者は、１つまたは複数の関節腫脹、１つまたは複数の関節のこわばり、１つまたは複数の関節のほてり、一般に１時間以上持続する早朝の関節のこわばり、滑液過剰、滑膜における線維組織の発生、および関節運動範囲の障害からなる群から選択される、１つまたは複数の症状に罹患している可能性がある。
対象者がＰＦの危険性のある幾つかの実施態様においては、対象者は、慢性乾性咳、疲労、脱力、胸部不快、食欲不振、急速な体重減少、および労作と関係した呼吸困難からなる群から選択される１つまたは複数の症状に罹患している可能性がある。
この第４態様のあらゆる実施態様において、本方法は、対象者のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）血漿値を測定すること、対象者の血漿中のＣＲＰ量を対照と比較すること、およびＲＡまたはＰＦの診断を助けるためにＣＲＰ比較を使用することを、さらに含んでもよい。
別の実施態様において、本発明は、
（ａ）ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮの危険性のある対象者由来の血漿試料を、ＧＰＢＰ−結合分子のＧＰＢＰへの選択的結合を促進する条件下で、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合するＧＰＢＰ−結合分子と接触させること；
（ｂ）（ｉ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること；および
（ｉｉ）対象者のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）血漿値を測定すること；
（ｃ）（ｉ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間で形成された複合体の量を対照と比較すること；および
（ｉｉ）対象者の血漿中のＣＲＰ量を対照と比較すること；および
（ｄ）比較に基づいて、対象者を、ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮを有するとして診断すること、またはＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮの診断のための実体に比較を提供すること、
を含む、ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮを診断する方法を提供する。
第５態様で、本発明は、７７ｋＤ ＧＰＢＰ−７７ｋＤ ＧＰＢＰ−基質結合複合体を、結合条件下で、１つまたは複数のテスト化合物と接触させることを含み、ここで、７７ｋＤ ＧＰＢＰ結合を結合複合体から外す、それらのテスト化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための候補化合物である、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための化合物を同定する方法を提供する。
第６態様で、本発明は、７７ｋＤ ＧＰＢＰ−基質を、結合条件下で
（ａ）１つまたは複数のテスト化合物；および
（ｂ）７７ｋＤ ＧＰＢＰ；
と接触させることを含む、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための化合物を同定する方法を提供し、
ここで、７７ｋＤ ＧＰＢＰ−結合基質への結合に関して、７７ｋＤ ＧＰＢＰに優る
化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための候補化合物である。
全ての引用文献を、参照により全体として本明細書に援用する。本出願の範囲内で、特に指定のない限り、利用した技術は、幾つかの周知の参考文献、たとえば：分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：研究室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、遺伝子発現テクノロジー（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８５巻、Ｄ．ゴエデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、１９９１年、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア）「蛋白質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（Ｍ．Ｐ．ドイッチャー（Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ）編（１９９０年）アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．））；ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：方法および応用の手引き（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら著、１９９０年。アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア）、動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ）：基本的技術のマニュアル（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第２版（Ｒ．Ｉ．フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）著、１９８７年、リス社（Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ）、ニューヨーク、ニューヨーク）、遺伝子トランスファーおよび発現プロトコール（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ｐ．１０９〜１２８、Ｅ．Ｊ．マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）編、ザ・ヒューマン・プレス社（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ）、クリフトン、ニュージャージー）、およびアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）１９９８年カタログ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、オースチン、テキサス）等のいずれかに見られる。
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他の意味を明確に示す場合を除き、複数形の指示対象を含む。本明細書で使用されるとき「Ａｎｄ」は、明示的に別段の定めをした場合を除き、「ｏｒ」と互換的に使用される。
本発明の種々の態様および実施態様の間で共通な全ての用語は、文脈上他の意味を明確に示す場合を除き、同じ意味を有する。
本出願で使用されるとき、用語「天然の蛋白質」は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含む、細胞により自然に産生される蛋白質を意味し、非変性蛋白質、または（たとえば、実質的に精製され、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで実行するために１つまたは複数の変性剤を受けた、自然に産生された蛋白質のような）変性蛋白質を含む。
本出願で使用されるとき、「実質的に精製されたポリペプチド」は、ポリペプチドがそのインビボ細胞環境から分離されていたことを意味する。単離されたポリペプチドが、たとえばポリアクリルアミド、アガロース、およびクロマトグラフィ試薬等の、ゲル剤が実質的にないことは、さらに好ましい。
前後関係によって他の意味を明確に示す場合を除き、本発明の一態様のために開示される実施態様は、本発明の他の態様でも、また本発明の他の態様で開示される実施態様と組み合わせても、使用することができる。
第１態様で、本発明は、慢性腎疾患（ＣＫＤ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰ
のインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、ＣＫＤを治療する方法を提供する。
後続の実施例に示す通り、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターは、腎臓における炎症性浸潤を減少させ、したがってＣＫＤの治療に使用することができる。あらゆる炎症の最終段階は線維症であり、腎尿細管間質性線維症は、全ての腎疾患の最終共通路を代表し、組織の正常な構造を破壊して結果的にＣＫＤを招く、線維性腫瘤の拡大につながる。
対象者は、治療から恩恵を受ける可能性がある任意の対象者、たとえば哺乳動物等であってもよい。好ましい実施態様において、対象者はヒト対象者である。７７ｋＤ ＧＰＢＰのアミノ酸配列は、現在はＧＰＢＰまたはＧＰＢＰ−１（配列番号１）とも呼ばれ、２００３年６月１７日に発行され、２０００年８月３１に公開された、ＰＣＴ公報国際公開第００／５０６０７号に相当する、米国特許第６５７９９６９号明細書に開示された。その中、および国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書に開示されている通り、ヒトＧＰＢＰ ｍＲＮＡは、選択的スプライシングを受けて、現在はＣＥＲＴおよびＧＰＢＰ−２とも呼ばれる、ＧＰＢＰΔ２６を生成し、非標準翻訳開始を受けて、現在はＧＰＢＰ−３とも呼ばれる、９１−ｋＤａ ＧＰＢＰを生成する）。異なるアイソフォームは異なる機能を有し、７７ｋＤ ＧＰＢＰは細胞外コンパートメントに達し、可溶性の免疫沈降形で存在することが証明されており、血液から分離することができる。
本明細書で使用されるとき、「慢性腎疾患」は、基礎病理にかかわらず、数か月または数年という期間にわたる進行性の腎機能喪失である。一実施態様において、３カ月間、糸球体濾過率（ＧＦＲ）が＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２である個体は、腎損傷の有無にかかわらず、ＣＫＤを有すると分類される。別の実施態様において、腎損傷を有する個体は、ＧＦＲ値にかかわらず、ＣＫＤを有するとして分類される。腎損傷は、血液検査または尿検査あるいは画像診断における異常を含む、病理学的異常または損傷のマーカーと定義される。
様々な実施態様において：
ステージ１：僅かな機能低下；正常なまたは比較的高いＧＦＲ（=９０ｍＬ／分／１．
７３ｍ２）を有する腎損傷；
ステージ２：腎損傷を伴う、ＧＦＲの軽度低下（６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）；
ステージ３：ＧＦＲの中等度低下（３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）；および
ステージ４：ＧＦＲの重度低下（１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）
等の、透析非依存性ＣＫＤを治療するために、本法を使用することができる。
本明細書で使用するとき、ＣＫＤを「治療すること」は、（ａ）対象者の末期腎疾患（ＥＳＲＤ）への進行を遅らせること；（ｂ）対象者におけるＧＦＲ低下を遅らせること；（ｃ）対象者における腎疾患の進行を制限すること；および／または（ｄ）ＣＫＤ症状の重症度を低下させること；を意味する。
本明細書で使用されるとき、「ＣＫＤの進行を制限すること」は、治療を受けていない患者と比較して、治療を受けている患者の腎機能低下を減少させるかまたは防止することを意味する。したがって、そのような治療は、患者における腎臓透析または腎臓移植の必要性を減少させる。
腎疾患の進行は、以下：
（ａ）蛋白尿（すなわち：蛋白質の尿中への損失増加；多くの場合、アルブミン値の測
定（すなわち「アルブミン尿」）によって評価される）；
（ｂ）糸球体クリアランス障害（すなわち：血液から物質を除去する腎機能；たとえば、クレアチニンクリアランス（すなわち：「クレアチニンクリアランス障害」）、イヌリンクリアランス、または尿素クリアランスで測定できる）；
（ｃ）血清クレアチニン値上昇；および／または
（ｄ）尿中形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）値上昇
を含む、様々な方法で測定できる。
したがって、本発明の方法は、たとえば、本発明の方法で治療しようとしている対象者における、蛋白尿、アルブミン尿、血清クレアチニン値、および尿中ＴＧＦ−Ｐ値の、１つまたは複数の上昇を制限するため、および／または糸球体クリアランスおよび／またはクレアチニンクリアランスの障害を制限するために、使用することができる。
第２態様で、本発明は、免疫複合体仲介ＧＮを治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、免疫複合体仲介ＧＮを治療する方法を提供する。対象者は、治療から恩恵を受ける可能性がある任意の対象者、たとえば哺乳動物等であってもよい。好ましい実施態様において、対象者はヒト対象者である。
本明細書で使用されるとき、「ＧＮ」は、糸球体損傷を特徴とする腎疾患であり、「免疫複合体仲介ＧＮ」は、ＧＮが免疫複合体の糸球体沈着により特徴づけられることを意味する。
一実施態様において、免疫複合体仲介ＧＮは、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される自己免疫疾患と関連がある。本明細書で使用されるとき、免疫複合体仲介ＧＮを「治療すること」は、（ａ）糸球体損傷の進行を遅らせること；（ｂ）糸球体免疫複合体沈着の進行を遅らせること；（ｃ）糸球体炎症を減少させること；（ｄ）糸球体免疫複合体沈着を減少させること；および／または（ｄ）ＥＳＲＤへの進行を遅らせること；を意味する。
後続の実施例に示す通り、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターは、糸球体基底膜コラーゲンをベースとする変化を修復し、免疫複合体の糸球体沈着を減少させ、免疫複合体仲介ＧＮに付随する炎症を減弱させる。
本発明の第１態様および第２態様の方法の好ましい実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターは、１つまたは複数の他の治療法、たとえば治療しようとしている疾病の標準的ケア療法と同時投与が可能である。好ましい一実施態様において、そのような１つまたは複数の化合物は、薬学的に許容できる担体中の、アンギオテンシン変換酵素インヒビターおよびアンギオテンシン受容体ブロッカー、またはその薬学的に許容できる塩類からなる群から選択される。本発明で使用するためのアンギオテンシン変換酵素インヒビターの非限定的な例としては、ベナゼプリル、ベナゼプリラト、カプトプリル、デラプリル、フェンチアプリル、フォシノプリル、リベンザプリル、モエキシプリル、ペントプリル、ペリンドプリル、ピボプリル、キナプリル、キナプリラト、ラミプリル、スピラプリル、スピラプリラト、ゾフェノプリル、セロナプリル、エナラプリル、インドラプリル、リシノプリル、アラセピル、およびシラザプリル、またはその薬学的に許容できる塩類などが挙げられる。本発明で使用するためのアンギオテンシン受容体ブロッカーの非限定的な例としては、ロサルタン、カンデサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、エプロサルタン、およびタソサルタンなどが挙げられる。
別の実施態様において、インヒビターをベリムマブと併用することができる。
第３態様で、本発明は、肺線維症（ＰＦ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、ＰＦを治療する方法を提供する。対象者は、治療から恩恵を受ける可能性がある任意の対象者、たとえば哺乳動物等であってもよい。好ましい実施態様において、対象者はヒト対象者である。
ＰＦは、肺における、過剰な結合組織の形成または発生（線維症）である。肺線維症の症状としては、息切れ、慢性乾燥、空咳、疲労および脱力、胸部不快、および／または食欲不振および急速な体重減少などが挙げられるが、それらに限定されない。肺線維症は、労作と関係した進行性息切れ（呼吸困難）の病歴により示唆される。時には、聴診の際に、肺底で細かい吸気性クラックルが聞こえる場合がある。高解像度ＣＡＴスキャンは通例、異常を示す。
後続の実施例に示す通り、ＧＰＢＰのインヒビターは、ヒトＰＦ用の動物モデルである、ドキソルビシン−誘発性ＰＦの治療に有効であった。
本発明の方法で治療されるＰＦは、他の疾患（すなわち、自己免疫疾患（例：関節リウマチ−ＲＡ−、ＳＬＥ、強皮症等）、ウイルス感染症または肺への他の顕微鏡的肺傷害（たとえばアスベスト、ケイ素、たばこの煙等への曝露）を含むがそれらに限定されない、「間質性肺疾患」）の副次効果であってもよく、あるいは特発性（すなわち「特発性肺線維症」）であってもよい。
本明細書で使用されるとき、ＰＦを「治療すること」は、（ａ）肺線維症の進行を遅らせること；および／または（ｂ）ＰＦ症状を減少させること、を意味する。
本発明の第３態様の方法の好ましい実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターは、１つまたは複数の他の治療法、たとえば治療しようとしている疾病の標準的ケア療法と同時投与が可能である。好ましい一実施態様において、そのような１つまたは複数の化合物は、コルチコステロイド類、免疫抑制薬（シクロホスファミド、アザチオプリン、およびメトトレキサートを含むがそれらに限定されない）、消炎剤、ＩＦＮ−γ、ミコフェノール酸モフェチル、およびピルフェニドンからなる群から選択される。
こうした態様のそれぞれで、本方法は適当な対象者、たとえば７７ｋＤ ＧＰＢＰを過剰発現していると認定されている者等、に対して実行することが可能である。たとえば、検量線のための基準としての７７ｋＤ ＧＰＢＰの正常値は、血漿中に１０ｎｇ／ｍｌ未満である。様々な好ましい実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰの正常範囲は、血漿中に約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである。したがって、一実施態様において、血漿中に１０ｍｇ／ｍｌ超の７７ｋＤ ＧＰＢＰを有すると認定された対象者が、本発明の方法に従って治療される。循環７７ｋＤ ＧＰＢＰの量を測定する方法は、当該技術分野で周知であり（国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書を参照されたい）、例を後述する。
治療方法を列挙した本発明のこうした態様のそれぞれで、７７ｋＤ ＧＰＢＰの任意の適当なインヒビターを使用することができる。一実施態様において、インヒビターは、７７ｋＤ ＧＰＢＰアンチセンスＲＮＡ、７７ｋＤ ＧＰＢＰ ｓｉＲＮＡ、および７７ｋＤ ＧＰＢＰ抗体からなる群から選択される。好ましい実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターは、７７ｋＤ ＧＰＢＰ抗体か、またはその薬学的に許容できる塩類である。例示的な抗体は、たとえば、国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書に開示されている。好ましい実施態様において、国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書に開示されている抗体を含むがそれらに限定されない抗体は、天然の７７ｋＤ ＧＰＢＰを認識し、天然の７７ｋＤ ＧＰＢＰに対する抗体を産生するために当業者に教示を提供する。本明細書で使用されるとき、「天然の７７ｋＤ ＧＰＢＰに対する抗体」は、その抗体が天然の７７
ｋＤ ＧＰＢＰに結合することを意味し、それらが他のＧＰＢＰ種に結合しないことを必要としない。一実施態様において、抗体は７７ｋＤ ＧＰＢＰに特異的である。任意の他の実施態様と併用できる、さらに好ましい実施態様において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体等の、モノクローナル抗体である。
本明細書で使用されるとき、用語抗体は、本発明のポリペプチド類またはそのフラグメントと選択的に反応する、その抗体フラグメントを含むことを意図する。抗体は、従来の技術を使用して断片化することができ、また全抗体について上述したものと同様に、有用性についてフラグメントをスクリーニングすることができる。たとえば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。結果として得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理してジスルフィド架橋を減らし、Ｆａｂ’フラグメントを産生することができる。
モノクローナル抗体フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ Ｉ領域で本質的に構成される一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ領域およびＣＨ１領域で本質的に構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ領域およびＶＨ領域で本質的に構成される、Ｆｖフラグメント；（ｖ）ＶＨ領域で本質的に構成される、ｄＡｂフラグメント（ウォード（Ｗａｒｄ）ら著、（１９８９年）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）１つまたは複数の単離されたＣＤＲ、または機能的パラトープ、などが挙げられる。
モノクローナル抗体は、動物由来の脾臓細胞を得ることによって産生することができる。（ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６、４９５〜４９７（１９７５年）参照）。一実施例で、対象のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系繁殖マウスを７７ｋＤ ＧＰＢＰ、またはその抗原断片で、免疫化することにより調製される。マウスは、免疫応答を誘発するのに十分な量および間隔で、ＩＰルートまたはＳＣルートにより免疫化する。マウスは、０日に初回免疫化を受け、約３〜約３０週間、休息する。免疫化マウスに、１回または複数回の追加免疫を、静脈内（ＩＶ）経路で投与する。抗体陽性マウス由来のリンパ球は、当該技術分野で既知の標準手順によって、免疫化マウスから脾臓を摘除することにより得られる。ハイブリドーマ細胞は、安定したハイブリドーマの形成を可能にする条件下で、脾臓リンパ球を適当な融合パートナーと混合することによって産生される。抗体産生細胞と融合パートナー細胞を、濃度約３０％〜約５０％のポリエチレングリコール中で融合させる。融合したハイブリドーマ細胞は、当該技術分野で既知の手順により、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン添加ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中での成長によって選択される。上澄液を成長陽性ウェルから採取し、固相イムノラジオアッセイ等のイムノアッセイ法で、抗体産生についてスクリーニングする。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、マクファーソン（ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ）の軟寒天技術、軟寒天技術（Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、組織培養方法および応用（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、クルーズ（Ｋｒｕｓｅ）およびパターソン（Ｐａｔｅｒｓｏｎ）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９７３年、等の技術で、クローン化する。
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体由来の抗体、たとえばマウスモノクローナル抗体等を指す。あるいは、ヒト化抗体は、親の、非ヒト、抗体の抗原結合特性を保持するかまたは実質的に保持するが、ヒトに投与したとき、親の抗体に比べて低下した免疫原性を示す、キメラ抗体由来であってもよい。たとえば、キメラ抗体は、ヒト抗体フラグメントおよびマ
ウス抗体フラグメント、通例、ヒト定常領域とマウス可変領域を含むことができる。ヒト化抗体は、ヒトにおける免疫原性が非ヒトモノクローナル抗体より遥かに低いため、治療的抗体使用に好ましい。
ヒト化抗体は、（１）非−ヒトモノクローナル抗体由来の相補性決定領域を、ヒトフレームワークおよび定常領域上に移植（グラフト）すること（「ヒト化」）、および（２）非ヒトモノクローナル抗体可変領域を移植（トランスプラント）するが、それらを、表面残基の置換によってヒト様表面で「覆い隠すこと」（「ベニヤリング」）、を含むがそれらに限定されない、当該技術分野で既知の種々の方法を使用して調製できる。これらの方法は、たとえばジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２１巻：Ｐ５２２〜５２５（１９８６年）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、８１巻：Ｐ６８５１〜６８５５（１９８４年）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）およびオイ（Ｏｉ）著、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４巻：Ｐ６５〜９２（１９８８年）；バーホイヤー（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３９巻：Ｐ１５３４〜１５３６（１９８８年）；パドラン（Ｐａｄｌａｎ）著、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８巻：Ｐ４８９〜４９８（１９９１年）；パドラン（Ｐａｄｌａｎ）著、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）巻：Ｐ１６９〜２１７（１９９４年）；およびケットルボロー（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ）Ｃ．Ａ．ら著、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．４（７）巻：Ｐ７７３〜８３（１９９１年）に開示されている。
抗体応答を生じさせるために、本発明のポリペプチドは一般に、薬学的に許容できる非経口投与用担体と調合される。そのような許容できる補助剤としては、完全フロイント補助剤、不完全フロイント補助剤、ミョウバン沈降物、コリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）含有油中水乳剤およびｔＲＮＡなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドの濃縮ならびに媒体および他の成分の選択を含む、そのような組成物の製剤は、当該技術分野の技術の範囲内である。
別の実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターは、国際公開第２００４／０７００２５号および米国特許第７３２６７６８号明細書に開示されているペプチドインヒビターか、またはその薬学的に許容できる塩類である。一実施態様において、ペプチドインヒビターは、一般式Ｘ１−ＳＨＣＩＸ２−Ｘ３（配列番号２）で示されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列で構成される、ポリペプチドであり、ここで：
Ｘ１は、配列ＡＴＴＡＧＩＬＡＴＬ（配列番号３）の０〜１０アミノ酸であり；
Ｘ２はＥまたはＱであり；かつ
Ｘ３は、配列ＬＭＶＫＲＥＤＳＷＱ（配列番号４）の０〜１０アミノ酸である。
好ましい実施態様において、ペプチドインヒビターは、ＳＨＣＩＥ（配列番号５）、ＳＨＣＩＱ（配列番号６）、ＩＬＡＴＬＳＨＣＩＥＬＭＶＫＲ（配列番号７）、およびＩＬＡＴＬＳＨＣＩＱＬＭＶＫＲ（配列番号８）からなる群から選択される配列を含むか、同配列で構成される。
別の実施態様において、ペプチドインヒビターは、連続した少なくとも６つ（６、７、８、９、または全て）のアミノ酸ＥＫＴＡＧＫＰＩＬＦ（配列番号９）を含むか、同アミノ酸で構成される。好ましい実施態様において、単離されたポリペプチドは、配列ＥＫＴＡＧＫＰＩＬＦ（配列番号１０）を含むか、同配列で構成される。
ポリペプチドは、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付加または当該技術分野で既知の別の方法で、さらに誘導体化して、半減期を増加することができる。本発明のポリペプチドは、特別な性質を伝達するために、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸（インビボで、Ｌ−アミノ酸特異的プロテアーゼ抵抗性である）、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の
組合せ、および様々な「デザイナー」アミノ酸（たとえば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸等）を含んでもよい。合成アミノ酸は、リジンのためのオルニチン、およびロイシンまたはイソロイシンのためのノルロイシンを含む。
加えて、本ポリペプチドは、新規な特性をもつポリペプチドを調製するために、ペプチド模倣結合、たとえばエステル結合等を、有することができる。たとえば、少ないペプチド結合を組み入れたポリペプチド、すなわちＲ１−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２を生じさせることが可能であり、ここで、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基またはアミノ酸配列である。少ないペプチド結合は、ジペプチドサブユニットとして導入することが可能である。そのようなポリペプチドは、プロテアーゼ活性に対して抵抗性があり、インビボで、長い半減期を有するであろう。
用語「ポリペプチド」は、サブユニットアミノ酸、アミノ酸類縁体、またはペプチド模倣物の配列に言及するために、広義で使用される。サブユニットはペプチド結合で連結されるが、ポリペプチドは、必ずしもペプチド結合でポリペプチドに連結されないさらなる部分を含むことができる。たとえば、上述の通り、ポリペプチドは、芳香族環を含む非アミノ酸分子をさらに含むことができる。
本明細書に記載のポリペプチドは、化学的に合成してもよく、または組換え的に発現させてもよい。上に開示した通り、組換え発現は、当該技術分野における標準方法を使用して遂行できる。そのような発現ベクターは、細菌またはウイルスの発現ベクターを含むことができ、またそのような宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
好ましくは、本発明の方法で使用するためのポリペプチドは、化学的に合成される。固相、液相、またはペプチド縮合技術、あるいはその任意の組合せの、周知の技術を使用して調製される合成ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコールを用いた標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ酸樹脂であってもよく、または標準的な塩基に不安定なＮα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってもよい。Ｆｍｏｃ Ｎα−アミノ保護アミノ酸もＢｏｃ Ｎα−アミノ保護アミノ酸も、シグマ・ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、または当業者によく知られている他の化学会社から入手することができる。加えて、本ポリペプチドは、当業者によく知られている他のＮα−保護基を用いて合成することができる。
固相ペプチド合成は、当業者によく知られている技術によって、またたとえば自動合成装置を使用するのであれば、遂行することが可能である。
ペプチド／抗体インヒビターは、薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物の状態で、一緒に投与することが可能である。医薬組成物は、ペプチドインヒビターに加えて（ａ）凍結乾燥保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）浸透圧調整剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存料および／または（ｇ）バッファーを含んでもよい。幾つかの実施態様において、医薬組成物中のバッファーはトリス（Ｔｒｉｓ）バッファー、ヒスチジンバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーである。医薬組成物は、凍結乾燥保護剤、たとえばスクロース、ソルビトールまたはトレハロースも含んでもよい。ある実施態様において、医薬組成物は、保存料、たとえば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびその様々な
混合物を含む。他の実施態様において、医薬組成物は、グリシンのような、増量剤を含む。さらに他の実施態様において、医薬組成物は、界面活性剤たとえば、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−６５、ポリソルベート−８０ポリソルベート−８５、ポロキサマ−１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、またはその組合せを含む。医薬組成物は、浸透圧調整剤、たとえば製剤をヒト血液と実質的に等張または等浸透圧にする化合物、も含んでもよい。例示的な浸透圧調整剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンなどが挙げられる。他の実施態様において、医薬組成物は、安定剤、たとえば、対象の蛋白質と組み合わせたとき、凍結乾燥状態または液状の、対象の蛋白質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止するかまたは減少させる分子をさらに含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンなどが挙げられる。
ペプチドインヒビター／抗体は、医薬組成物中の唯一の活性薬物であってもよく、または組成物は所期の使用に適した１つまたは複数の他の活性薬物をさらに含んでもよい。
別の実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターは、ＤＡＢ−Ａｍ３２、ピナシジル、およびミリセチン、ならびにその薬学的に許容できる塩類からなる群から選択され、それぞれが、本発明の方法で有効であることが、後続の実施例で証明される。
さらなる実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターは、国際公開第２０１１／０５４５３０号および米国特許第２０１１０１０５５４５号明細書に開示されているものである。したがって、化合物は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容できる塩類：
またはその薬学的に許容できる塩であってもよく、ここで：
Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、（アリール）Ｃ２〜Ｃ６アルキル、および（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；かつ
Ｒ４は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
別の実施態様において、式（Ｉ）のインヒビター化合物は、式（ＩＩ）のものであってもよい：
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物であり、
ここで、
Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、および−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６
アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、または−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ、
Ｒ４は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物であり、
ここで、
Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ
Ｒ４は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（ＩＩ）の化合物であり、ここでＲはＮである。こうした化合物は、式（ＩＩＩ）：
で表すことができる。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（ＩＩ）の化合物であり、ここでＲはＣＲ５である。こうした化合物は、式（ＩＶ）：
で表すことができる。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ１は水素、ヒドロキシ、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ１は水素である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、またはスルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）またはホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）である。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、またはヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり得る。たとえば、ある実施態様において、Ｒ２は、メチル、エチル、またはイソプロピル等の、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり得る。他の実施態様において、Ｒ２は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル等の、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり得る。Ｒ２は、ある実施態様において、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり得る。たとえば、ヒドロキ
シ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）は、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、または２−ヒドロキシエチルであり得る。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。ある好ましい実施態様において、Ｒ２はメチルである。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、または−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。たとえば、ある実施態様において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＯＣＨ３）、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ３）、または−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＯＣ（ＣＨ３）３）であり得る。他の実施態様において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＣＨ３）であり得る。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨである。好ましくは、Ｒ３は、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）ＯＨである。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ４は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、またはベンジルオキシである。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ４は、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシ（たとえば、メトキシ）である。好ましくは、Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである。さらに好ましい実施態様において、Ｒ４はメトキシである。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＶ）に関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＶ）に関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ５は、メチル等の、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＶ）に関して上述した化合物であり、ここで、Ｒ５は、トリフルオロメチル等の、ハ
ロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＶ）のいずれかの化合物であり、ここで：
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）チオ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ
Ｒ４は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、またはベンジルオキシである。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（ＩＩＩ）のいずれかの化合物であり、ここで：
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）チオ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ
Ｒ４は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、またはベンジルオキシである。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＶ）のいずれかの化合物であり、ここで、Ｒ１は、水素であり；Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、またはホルミル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、または−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり；Ｒ４は、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり；Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（ＩＩＩ）のいずれかの化合物で
あり、ここで、Ｒ１は、水素であり；Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、またはホルミル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、または−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２であり；Ｒ４は、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物であり、ここで：
Ｒは、存在するのであれば、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ３は、−（ＣＨ２）１〜２−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり；かつ
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかの化合物であり、ここで：
Ｒは、存在するのであれば、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素であり；
Ｒ２はメチルであり；
Ｒ３は、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）ＯＨであり；かつ
Ｒ４はメトキシである。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）または式（ＶＩ）：
の化合物である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物であり、ここで：
Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アル
コキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、および−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ
Ｒ６は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）または−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３である。
別の好ましい実施態様において、開示内容は、式（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物を提供し、ここで：
Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ
Ｒ６は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、または−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３である。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここでＲ１は水素である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここでＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここでＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。さらに別の好ましい実施態様において、開示内容は、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物を提供し、ここでＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり得る。たとえば、ある実施態様において、Ｒ２は、メチル、エチル、またはイソプロピル等の、Ｃ１〜Ｃ６アルキルで有り得る。他の実施態様において、Ｒ２は、フルオロメチル、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチル等の、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）で有り得る。Ｒ２は、ある実施態様において、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり得る。たとえば、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）は、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、または２−ヒドロキシエチルで有り得る。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここでＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。ある好ましい実施態様において、Ｒ２はメチルである。
好ましい一実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここでＲ６は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、または−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかに関して上述した化合物であり、ここでＲ６は、ヒドロキシまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシ（たとえば、メトキシ）である。好ましい一実施態様において、開示内容は、式（Ｖ）〜（ＶＩ）に関して上述した化合物を提供し、ここでＲ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。
別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＴ）に関して上述した化合物であり、ここでＲ５は、メチル等の、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
さらに別の好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）に関して前述した化合物であり、ここでＲ５は、トリフルオロメチル等の、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）である。ある好ましい実施態様において、開示内容は、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかの化合物を提供し、ここで：
Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびアミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）チオ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；かつ
Ｒ６は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、または−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３である。
ある好ましい実施態様において、インヒビターは、式（Ｖ）〜（ＶＩ）のいずれかの化合物であり、ここで、Ｒ１は水素であり；Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、または−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）であり；Ｒ６は、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または−ＯＳ（Ｏ）２ＣＦ３であり；Ｒ５は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）である。ＧＢＰＢインヒビター化合物は、健全な医学的判断の範囲内であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、等なしに、患者の組織と接触した使用に適し、妥当な利益／リスク比に見合い、それらの所期の使用に有効である、本発明の化合物のカルボン酸塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミド、プロドラッグ、ならびに可能であれば、本発明の化合物の両性イオン形を含むがそれらに限定されない、化合物の薬学的に許容できる塩類、エステル類、アミド類、およびプロドラッグを含む。用語「塩類」は、本発明の化合物の、比較的非毒性の、無機酸付加塩および有機酸付加塩を指す。こうした塩類は、化合物の最終分離および精製の間にインサイチュで、または精製した化合物をその遊離塩基形で、適当な有機酸または無機酸と別々に反応させ、そのようにして形成された塩を分離することによって、調製することができる。例示的な塩類としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩、等が挙げられる。これらは、アルカリ金属およびアルカリ土類金属をベースとするカチオン、たとえば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、等を含むがそれらに限定されない、非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含んでもよい。（たとえば、ベルジュ（Ｂｅｒｇｅ）Ｓ．Ｍら著、「医薬品塩類（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ）」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９７７年；６６巻：Ｐ１〜１９を参照されたい（参照により本明細書に援用する）。）
インヒビターの、薬学的に許容できる、非毒性のエステル類の例としては、Ｃ１〜Ｃ６アルキルエステル（ここで、アルキル基は直鎖または分岐鎖であり、置換されたまたは未置換である）、Ｃ５〜Ｃ７シクロアルキルエステル、ならびにベンジルおよびトリフェニルメチル等のアリールアルキルエステルなどが挙げられる。Ｃ１〜Ｃ４アルキルエステル、たとえばメチル，エチル、２，２，２−トリクロロエチル、およびｔｅｒｔ−ブチル等が、好ましい。本発明の化合物のエステル類は、従来の方法に従って調製することが可能である。
インヒビターの、薬学的に許容できる、非毒性のアミド類の例としては、アンモニア、一級Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミンおよび二級Ｃ１〜Ｃ６ジアルキルアミンから誘導されるアミドなどが挙げられ、ここで、アルキル基は直鎖状または分岐鎖状である。二級アミンの場合には、アミンは、窒素原子１個を含む、５員または６員のヘテロ環の形であってもよい。アンモニア、Ｃ１〜Ｃ３アルキル一級アミンおよびＣ１〜Ｃ２ジアルキル二級アミンから誘導されるアミド類が好ましい。本発明の化合物のアミド類は、従来の方法に従って
調製することが可能である。
用語「プロドラッグ」は、たとえば、血中で加水分解により、インビボで容易に変換されて上式の親化合物を生じる化合物を指す。プロドラッグの徹底的な議論は、Ｔ．ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｓｔｅｌｌａ）著、「新規デリバリーシステムとしてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
Ｓｅｒｉｅｓ）の第１４巻、および薬物設計における生体可逆的担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）、エドワード（Ｅｄｗａｒｄ）Ｂ．ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）編、アメリカン・ファーマシューティカル・アソシエーション・アンド・ペルガモン・プレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年に提供されており、その両者を参照により本明細書に援用する。
本明細書で使用されるとき、用語「アルケニル」は、特別の定めのない限り、２〜１０個の炭素を含み、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニルの代表例としては、エテニル、２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、３−ブテニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル、２−ヘプテニル、２−メチル−１−ヘプテニル、３−デセニル、および３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエニル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分に付加された、本明細書で定義される、アルキル基を意味する。アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、およびヘキシルオキシ等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は、特別の定めのない限り、１〜１０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、およびｎ−デシル等が挙げられるが、それらに限定されない。「アルキル」基が、他の２つの部分の間の結合基であるとき、そのときはアルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい；例としては−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＣ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２−等が挙げられるが、それらに限定されない。
用語「アルキレン」は、二価アルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎは正の整数、好ましくは１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、または２〜３である。置換アルキレン鎖は、１つまたは複数のメチレン水素原子が置換基で置換されているポリメチレン基である。適当な置換基としては、置換脂肪族基について後述されるものなどがある。アルキレン鎖はまた、１つまたは複数の位置で、脂肪族基または置換脂肪族基で置換されていてもよい。
本明細書で使用されるとき、用語「アルキニル」は、２〜１０個の炭素原子を含み、かつ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素基を意味する。アルキニルの代表例としては、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニル、３−ブチニル、２−ペンチニル、および１−ブチニル等が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、フェニル（すなわち、単環アリール）か、または芳香族二環系の中に炭素原子のみを含む少なくとも１つのフェニル環または芳香族二環を含む二環系を意味する。二環アリールは、アズレニル、ナフチルであってもよく、あるいは単環シクロアルキル、単環シクロアルケニル、または単環ヘテロシクリルに縮合したフェニルであってもよい。二環アリールは、二環系のフェニル部分内に含まれる炭素原子、あるいはナフチル環またはアズレニル環が付いた炭素原子を介して、親分子部分に結合している。二環アリールの縮合した単環シクロアルキル部分または単環ヘテロシクリル部分は、１つまたは２つのオキソ基および／またはチア基で任意選択的に置換されている。二環アリールの代表例としては、アズレニル、ナフチル、ジヒドロインデン−１−イル、ジヒドロインデン−２−イル、ジヒドロインデン−３−イル、ジヒドロインデン−４−イル、２，３−ジヒドロインドール−４−イル、２，３−ジヒドロインドール−５−イル、２，３−ジヒドロインドール−６−イル、２，３−ジヒドロインドール−７−イル、インデン−１−イル、インデン−２−イル、インデン−３−イル、インデン−４−イル、ジヒドロナフタレン−２−イル、ジヒドロナフタレン−３−イル、ジヒドロナフタレン−４−イル、ジヒドロナフタレン−１−イル、５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−ｌ−イル、５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−４−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−６−イル、２，３−ジヒドロベンゾフラン−７−イル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル、ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル、２Ｈ−クロメン−２−オン−５−イル、２Ｈ−クロメン−２−オン−６−イル、２Ｈ−クロメン−２−オンー７−イル、２Ｈ−クロメン−２−オン−８−イル、イソインドリン−１，３−ジオン−４−イル、イソインドリン−１，３−ジオン−５−イル、インデン−１−オン−４−イル、インデン−１−オン−５−イル、インデン−１−オン−６−イル、インデン−１−オン−７−イル、２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキサン−５−イル、２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキサン−６−イル、２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン３（４Ｈ）−オン−５−イル、２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン３（４Ｈ）−オン−６−イル、２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン３（４Ｈ）−オン−７−イル、２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン３（４Ｈ）−オン−８−イル、ベンゾ［ｄ］オキサジン−２（３Ｈ）−オン−５−イル、ベンゾ［ｄ］オキサジン−２（３Ｈ）−オン−６−イル、ベンゾ［ｄ］オキサジン−２（３Ｈ）−オン−７−イル、ベンゾ［ｄ］オキサジン−２（３Ｈ）−オン−８−イル、キナゾリン−４（３Ｈ）−オン−５−イル、キナゾリン−４（３Ｈ）−オン−６−イル、キナゾリン−４（３Ｈ）−オン−７−イル、キナゾリン−４（３Ｈ）−オン−８−イル、キノキサリン−２（１Ｈ）−オン−５−イル、キノキサリン−２（１Ｈ）−オン−６−イル、キノキサリン−２（１Ｈ）−オン−７−イル、キノキサリン−２（１Ｈ）−オン−８−イル、ベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−オン−４−イル、ベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−オン−５−イル、ベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−オン−６−イル、および、ベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−オン−７−イルなどが挙げられるが、それらに限定されない。ある実施態様において、二環アリールは、（ｉ）ナフチルか、または（ｉｉ）５員または６員の単環シクロアルキル、５員または６員の単環シクロアルケニル、あるいは５員または６員の単環ヘテロシクリルのいずれかに縮合したフェニル環であり、ここで縮合シクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクリル基は、独立にオキソまたはチアである、１つまたは２つの基で任意選択的に置換されている。
本明細書で使用されるとき、用語「ハロ」または「ハロゲン」は、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは−Ｆを意味する。
用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」および「ハロアルコキシ」は、場合によって、１つまたは複数のハロゲン原子で置換されている、アルキル、アルケニルまたはアルコキシ基を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」は、単環ヘテロアリールか、または少なくとも１つの芳香族複素環を含む二環系を意味する。単環ヘテロアリールは、５員環または６員環であってもよい。５員環は、２つの二重結合と、１、２、３、または４つの窒素原子および任意選択的に１つの酸素原子またはイオウ原子で構成される。６員環は、３つの二重結合と、１、２、３または４つの窒素原子で構成される。５員または６員のヘテロアリールは、ヘテロアリール内に含まれるいずれかの炭素原子またはいずれかの窒素原子を介して、親分子部分に結合されている。単環ヘテロアリールの代表例としては、フリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピロリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、およびトリアジニルなどが挙げられるが、それらに限定されない。二環ヘテロアリールは、フェニル、単環シクロアルキル、単環シクロアルケニル、単環ヘテロシクリル、または単環ヘテロアリールに縮合した単環ヘテロアリールで構成される。二環ヘテロアリール基の縮合したシクロアルキル部分またはヘテロシクリル部分は、独立にオキソまたはチアである１つまたは２つの基で任意選択的に置換されている。二環ヘテロアリールが縮合したシクロアルキル、シクロアルケニル、またはヘテロシクリル環を含む場合、そのときは二環ヘテロアリール基は、二環系の単環ヘテロアリール部分内に含まれるいずれかの炭素原子または窒素原子を介して親分子部分に結合されている。二環ヘテロアリールが、ベンゾ環に縮合した単環ヘテロアリールである場合、そのときは二環ヘテロアリール基は、二環系内のいずれかの炭素原子または窒素原子を介して親分子部分に結合されている。二環ヘテロアリールの代表例としては、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾキサジアゾリル、ベンゾキサチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、シンノリニル、５，６−ジヒドロキノリン−２−イル、５，６−ジヒドロイソキノリン−１−イル、フロピリジニル、インダゾリル、インドリル、イソキノリニル、ナフチリジニル、キノリニル、プリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−２−イル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−３−イル、５，６，７，８−テトラヒドロキノリン−４−イル、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン−１−イル、チエノピリジニル、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｃ］［ｌ，２，５］オキサジアゾリル、および６，７−ジヒドロベンゾ［ｃ］［ｌ，２，５］オキサジアゾール−４（５Ｈ）−オニルなどが挙げられるが、それらに限定されない。ある実施態様において、縮合二環ヘテロアリールは、フェニル環、５員または６員の単環シクロアルキル、５員または６員の単環シクロアルケニル、５員または６員の単環ヘテロシクリル、あるいは５員または６員の単環ヘテロアリールのいずれかに縮合した５員または６員の単環ヘテロアリール環であり、ここで縮合したシクロアルキル基、シクロアルケニル基、およびヘテロシクリル基は、独立にオキソまたはチアである１つまたは２つの基で任意選択的に置換されている。
ＧＰＢＰインヒビターは通常、指示された投与経路に適した１つまたは複数の補助剤と併用される。インヒビターは、ラクトース、スクロース、澱粉粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリジン、および／またはポリビニルアルコールと混合して、従来の投与用に錠剤化またはカプセル化してもよい。あるいは、インヒビターは、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、コーンオイル、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガントガム、および／または様々なバッファーに溶解してもよい。他の補助剤および投与方法は、薬剤学の技術分野で周知である。担体または希釈剤は、時間遅延物質、たとえばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独でまたはワックスと一緒に、あるいは当該技術分野で周知の物質等、を含んでもよい。
インヒビターは、唯一の活性医薬品として投与することができ、あるいは本発明の方法
を実行するのに有用な１つまたは複数の他の化合物と併用することもできる。併用として投与するとき、治療薬は、同時にまたは異なるときに投与される別々の組成物として調合することもでき、あるいは治療薬を単一の組成物として投与することもできる。
インヒビターは、固形（顆粒剤、散剤または坐薬を含む）で、または液体（たとえば、液剤、懸濁剤、乳剤）で、調合することが可能である。インヒビターは、種々の液剤で用いることができ、滅菌等の従来の製薬工程にかけることが可能であり、かつ／または従来の補助剤、たとえば保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、バッファー等を含んでもよい。
インヒビターは、従来の非毒性の薬学的に許容できる担体、補助剤および媒体を含む投与量単位製剤で、経口的、局所的、非経口的、吸入またはスプレーによって、あるいは直腸内に、投与することが可能である。本明細書で使用されるとき、用語非経口的は、経皮、皮下、血管内（たとえば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内の注射または注入技術等を含む。インヒビターを含有する医薬組成物は、経口使用に適した形状、たとえば、錠剤、トローチ剤、薬用ドロップ、水性または油性懸濁剤、分散性散剤または顆粒剤、乳剤、硬カプセル剤または軟カプセル剤、シロップ剤またはエリキシル剤等であってもよい。
経口使用向けの組成物は、医薬組成物の製造技術分野に知られている任意の方法に従って調製することが可能であり、そのような組成物は、口当たりがよい製剤を提供するために、甘味料、香味剤、着色剤および保存料からなる群から選択される１つまたは複数の化学物質を含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容できる賦形剤との混合物の中に、有効成分を含む。こうした賦形剤は、たとえば、不活性な希釈剤、たとえば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム等；造粒剤および崩壊剤、たとえば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、たとえば澱粉、ゼラチンまたはアカシア、および滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってもよい。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、既知の技術でコーティングされていてもよい。場合によっては、そのようなコーティングは、消化管内での分解や吸収を遅らせ、その結果、より長期間にわたって持続的な作用を提供するための既知の技術によって調製することが可能である。たとえば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の、時間遅延物質を使用することが可能である。
経口使用のための製剤は、有効成分が不活性な固体希釈剤、たとえば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合される硬ゼラチンカプセル剤として提供されることもあり、または有効成分が水媒質または油媒質、たとえばピーナッツ油、流動パラフィンまたはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセル剤として提供されることもある。
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物の中に、活性物質を含む。そのような賦形剤は、懸濁化剤、たとえばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガムおよびアカシアゴムであってもよく；分散剤または湿潤剤は、天然のリン脂質、たとえば、レシチン、または脂肪酸とアルキレンオキシドの縮合生成物、たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン、長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドの縮合生成物、たとえばヘプタデカエチレンオキシセタノール、または、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、たとえばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、または脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、たとえばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであってもよい。水性懸濁液は、１つまたは複数の保存料、たとえばエチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤、および１つまたは複数の甘味料、たとえばスクロースまたはサッカリン等
も含んでもよい。
油性懸濁液は、植物油、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油の中に、あるいは流動パラフィン等の鉱油の中に、インヒビターを懸濁させることによって調合することが可能である。油性懸濁液は、増粘剤、たとえば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもよい。口当たりのよい経口製剤を提供するために、甘味料および香味剤を添加してもよい。こうした組成物は、アスコルビン酸等の酸化防止剤を添加することによって保存することが可能である。
水の添加による水性懸濁液の製剤に適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つまたは複数の保存料との混合物で、インヒビターを提供する。適当な分散剤または湿潤剤あるいは懸濁化剤は、すでに上述したもので例示されている。追加的な賦形剤、たとえば甘味料、香味剤および着色剤も存在してもよい。
インヒビターは、水中油乳剤の形で投与することも可能である。油性相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤は、天然ゴム、たとえばアカシアゴムやトラガントガム、天然のリン脂質、たとえば大豆、レシチン、および脂肪酸とヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル、無水物、たとえばモノオレイン酸ソルビタン塩、およびエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合生成物、たとえばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであってもよい。乳剤は、甘味料および香味剤も含んでもよい。
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味料、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと調合することが可能である。そのような製剤は、粘滑薬、保存料、ならびに香味剤および着色剤も含んでもよい。インヒビター組成物は、無菌の注射用水性懸濁液または油性懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は、既知の技術に従って、上述の適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して調合することが可能である。無菌の注射用製剤は、非毒性の親らしく許容できる希釈剤または溶媒、たとえば１，３−ビタンジオール中の溶液等、無菌の注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用することが可能な許容できる媒体および溶媒としては、水、リンゲル液および塩化ナトリウム等張液などがある。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁化剤として従来使用されている。このために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含め、任意の無刺激性の不揮発性油を使用することが可能である。加えて、オレイン酸等の脂肪酸は、注射剤の製剤に用途がある。
インヒビター含有組成物は、たとえば、薬物を直腸投与するための、坐薬の形で投与することも可能である。こうした組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって、直腸内で溶けて薬物を放出するであろう、適当な非刺激性の賦形剤と薬物を混合することによって調製することができる。そのような材料としては、カカオバターおよびポリエチレングリコールなどが挙げられる。
本発明のインヒビター含有組成物は、無菌媒体中で、非経口的に投与することが可能である。薬物は、使用される媒体および濃度に応じて、媒体中に懸濁させたり溶解させたりすることができる。好都合なことに、局所麻酔薬、保存料および緩衝剤等の補助剤を媒体に溶解させることができる。
およそ約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の、インヒビター投与量レベルが、上述の疾患の治療で有用である。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることが可能なインヒビターの量は、治療を受ける宿主および個々の投与方法によって異なるであろう。投与量単位形は一般に
約１ｍｇ〜約５００ｍｇのインヒビターを含有する。
「薬学的に許容できる」は、健全な医学的判断の範囲内であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に見合う他の問題または合併症なしで人類および動物の組織との接触に適するか、さもなければヒトまたは家畜での使用に許容できるとして、米国食品医薬品局により承認済である、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
第４態様で、本発明は、
（ａ）ＲＡまたはＰＦの危険性のある対象者由来の血漿試料を、ＧＰＢＰ−結合分子のＧＰＢＰへの選択的結合を促進する条件下で、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合するＧＰＢＰ−結合分子と接触させること；
（ｂ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること；
（ｃ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間で形成された複合体の量を対照と比較すること；および
（ｄ）比較に基づいて、対象者を、ＲＡまたはＰＦを有するとして診断すること、またはＲＡもしくはＰＦの診断のための実体に比較を提供すること；
を含む、関節リウマチ（ＲＡ）または肺線維症（ＰＦ）を診断する方法を提供する。
ＲＡの危険性のある対象者は、ＲＡの何らかの症状または危険因子を有する対象者である。症状としては、特に早朝覚醒時または長期にわたる非活動後に、罹患関節が腫脹している、ほてっている、痛いおよび／またはこわばっている、関節の炎症；一般に１時間以上持続する早朝の関節のこわばり増加；腱テザリング；腱びらん；関節表面破壊；関節運動範囲障害；関節（手／指、足／つま先、頸椎，膝、および肩を含む）を冒す変形；および関節機能脳喪失、などが挙げられるが、それらに限定されない。
ＰＦは、肺における、過剰な結合組織の形成または発生（線維症）である。肺線維症の症状としては、進行性の息切れ（呼労作と関係した呼吸困難）等の息切れ、慢性乾燥、空咳、疲労および脱力、胸部不快、および／または食欲不振および急速な体重減少などが挙げられるが、それらに限定されない。時には、聴診の際に、肺底で細かい吸気性クラックルが聞こえる場合がある。解像度ＣＡＴスキャンは通例、異常を示す。
後続の実施例に示す通り、循環７７ｋＤの量は、ＲＡおよびＰＦの前炎症期に増加し、ついで炎症性ＲＡの特徴である腫脹した関節における痛みの発生、および炎症性ＰＦの特徴である労作と関係した呼吸困難の発生と共に治まるため、７７ｋＤ ＧＰＢＰは、ＲＡおよびＰＦの前炎症マーカーである。したがって、本方法を使用して、前炎症期にＲＡまたはＰＦを有する対象者を認定することができ、ＲＡまたはＰＦに罹患している対象者の早期治療を可能にする。
したがって、好ましい実施態様において、前炎症性ＲＡの症状、たとえば１つまたは複数の関節腫脹、１つまたは複数の関節のこわばり、１つまたは複数の関節のほてり、一般に１時間以上持続する早朝の関節のこわばり増加、過剰な滑液、滑膜における線維組織の発生、および／または関節運動範囲の障害等を有する対象者におけるＲＡを診断するために、本方法を使用することができる。さらなる実施態様において、対象者は、１つまたは複数の関節腫脹の全てで痛みを経験している訳ではない。さらなる実施態様において、対象者は、１つまたは複数の関節の関節軟骨の破壊または強直を患わない。
別の好ましい実施態様において、たとえば慢性乾燥、空咳；疲労および脱力；胸部不快；食欲不振および／または急速な体重減少；および／または労作と関係した呼吸困難等の
、前炎症性ＰＦの症状を有する対象者におけるＰＦを診断するために、本方法を使用することができる。さらなる実施態様において、対象者は、安静時に呼吸困難を患っていない。
今問題にしている方法は、疾病の決定的な診断を提供しないかもしれないが、本方法が、診断に役立つ陽性の徴候を提供するのであれば十分である。
この態様で使用されるとき、７７ｋＤ ＧＰＢＰの量は、完全な７７ｋＤ ＧＰＢＰだけのこともあり、血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰと７７ｋＤ ＧＰＢＰフラグメントの量を含むこともある。
対象者は、治療から恩恵を受ける可能性がある任意の対象者、たとえば哺乳動物等であってもよい。好ましい実施態様において、対象者はヒト対象者である。
関節リウマチ（ＲＡ）は、多くの組織および器官を冒す可能性があるが、主として（滑膜）関節を攻撃する、慢性の、全身性炎症性障害である。経過は、滑膜細胞の腫脹に続発する関節周囲の被嚢の炎症反応、過剰な滑液、および滑膜における線維組織の発生をもたらす。疾病経過の病理は、多くの場合、関節軟骨の破壊および関節の強直に至る。ＲＡは、肺、心膜、胸膜、強膜におけるびまん性の炎症、および皮下組織で最もよく見られる結節性病変も引き起こすことがある。
世界人口の約１％が、ＲＡに悩まされており、女性は男性より３倍多い。発症は、４０〜５０歳が最も高頻度であるが、あらゆる年齢の人々が冒される可能性がある。ＲＡは、障害を引き起こし、痛みを伴う疾患である可能性があり、もし適切に治療しなければ、機能および運動性の実質的喪失を招くことがある。症状、身体検査、Ｘ線、および臨床検査に基づいて行われる臨床診断ではあるが、米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（ＡＣＲ）および欧州リウマチ学会（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌｅａｇｕｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）（ＥＵＬＡＲ）は、診断ガイドラインを発行している。
「ＧＰＢＰ−結合分子」は、１つまたは複数の他の生体分子、構造、細胞、組織等とは対照的に、７７ｋＤ ＧＰＢＰに選択的に結合するペプチドまたは核酸分子である。そのようなＧＰＢＰ−結合分子の例示的な実施態様としては、抗体、アプタマーまたは基質などがあるが、それらに限定されない。本明細書で使用されるとき、「ＧＰＢＰ基質」は、７７ｋＤ ＧＰＢＰ、またはＧＰＢＰ−結合活性を保持するそのフラグメントに結合するＧＰＢＰ生物活性の標的である。そのようなＧＰＢＰ基質としては、Ｉ−２０（配列番号１８），ＧＰＢＰ−相互作用蛋白質（ＧＩＰ）（配列番号１９〜２３）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）およびその誘導体（配列番号２４〜２７），プリオン蛋白質（ＰｒＰ）（配列番号２８），ＩＶ型コラーゲンα３鎖ＮＣ１領域（α３（ＩＶ）ＮＣｌ）（配列番号２９）、およびアルツハイマー病βペプチド（ＡβＩ−４２）（配列番号３０）などが挙げられるが、それらに限定されない。こうした基質のＧＰＢＰ結合を示す例示的な参考文献は、米国特許第６，５７９，９６９号明細書；米国特許第７，１４７，８５５号明細書；および米国特許第７，３２６，７６８号明細書にみられ、参照により全体として本明細書に援用する。
「血漿試料」は、血液の液体成分である、血漿を意味し、たとえば、血球を除去するための全血の遠心分離によって調製される。本明細書で使用されるとき、血漿試料は、血液凝固因子が除去されている、血清試料も含む。
血漿試料は、適当な対象者から、好ましくは、ＲＡまたはＰＦに罹患している危険性のある、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、または家畜（ウシ、ヒツジ等）を含むがそれらに限定されない、哺乳動物、から得ることが可能である。最も好ましい実施態様において、血漿試
料は、ヒト対象者から得る。本明細書に開示されている通り、発明者は、ＲＡおよびＰＦの動物モデルで、循環７７ｋＤ ＧＰＢＰ値の上昇を確認した。
抗体は、上述の通り、ポリクローナルであれ、モノクローナルであれ、またはヒト化モノクローナルであれ、いずれの選択的ＧＰＢＰ抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
血漿試料中で、ＧＰＢＰ−結合分子、たとえば抗体、アプタマー、または基質等の、７７ｋＤ ＧＰＢＰへの結合を促進するのに適した条件は、本明細書における教示および以下で提供する実施例に基づいて、当業者により決定され得る。たとえば、抗体−抗原結合は、多くの場合、疎水的相互作用（いわゆる疎水結合）に依存する；したがって、高い塩濃度、たとえばモル濃度範囲内、を使用して、非特異的結合を減少させ、特異的抗原−抗体結合を増加させることができる。選択性および特異性を増進するために、１つまたは複数の洗浄ステップを含む、さらなるステップが任意選択的に含まれてもよい。この洗浄ステップは、非結合の７７ｋＤ ＧＰＢＰおよび／またはＧＰＢＰ−結合分子、または、非結合もしくは弱く結合した血清蛋白質；高濃度血清蛋白質の結合を減少させるための非特異的結合のインヒビター、７７ｋＤ ＧＰＢＰを含むことが分かっている対照試料および／または７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合しないことが分かっている陰性対照を、および／または７７ｋＤ ＧＰＢＰを持たないこと（ｅｘ：ＧＰＢＰの欠失）が分かっている血漿試料の包含、を除去するためのものである。
本方法は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、およびクロマトグラフィ（たとえば、抗体を表面上で免疫化し、血漿蛋白質を標識して、抗体を血漿中のＧＰＢＰに結合させるのに適した条件下で、表面を流す、ラテラル・フロー・アッセイ）を含むがそれらに限定されない標準技術で、血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰの存在についてテストすることができる。一実施態様において、フローサイトメトリーに連結された機能的ビーズ（ベクトン・ディッキンソン・テクノロジー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））が使用される；この技術は、体液または細胞／組織抽出物中の蛋白質レベルを測定するための新たな方法である。具体的には、蛍光マトリックスで作られたビーズを１つまたは複数の７７ｋＤ ＧＰＢＰ抗体で被覆し、血漿試料と混合し、さらにフィコエリトリン標識した検出用抗体と共にインキュベートする。最後に、マトリックス蛍光放射に従ってビーズを選択するフローサイトメトリープログラム、およびフィコエリトリン放出による分析物のレベル測定によって、ビーズを分析する。血球計算器で同時に検出して識別できる、最高３０までの異なるタイプのビーズがある。この方法は、ＧＰＢＰ抗体で被覆された特定のビーズタイプを、他の分析物用の結合ペプチド（すなわち自己抗体）で被覆された別個のビーズタイプと混合して同時に測定できるため、高感度および高性能を汎用性と結びつける。様々な分析物の測定は、ＧＰＢＰ測定の可能性を高める可能性がある。一実施態様において、本技術は７７ｋＤ ＧＰＢＰアイソフォームの有無のみを決定することが可能である。あるいは、本技術は定量的である可能性があり、試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰの相対量に関する情報を提供する可能性がある。定量目的には、ＥＬＩＳＡが好ましい。
免疫複合体形成の検出は、標準検出技術で遂行できる。たとえば、免疫複合体の検出は、標識抗体または二次抗体を使用することによって遂行できる。標識の選択を含むそのような方法は、当業者に知られている。あるいは、抗体を検出可能な物質に結合する（ｃｏｕｐｌｅ）ことができる。用語「結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ）」は、検出可能な物質が抗体に物理的に連結されることを意味するために使用される。適当な検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光体、発光体および放射性物質などがある。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがある。適当な補欠分子族複合体の例
としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどがある。適当な蛍光体の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどがある。発光体の例としてはルミノールなどがある。適当な放射性物質としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈなどがある。
本方法は、たとえば「正常」値の７７ｋＤ ＧＰＢＰを有することが分かっている血漿試料由来の対照、または血漿を入手した対象者由来の血漿で７７ｋＤ ＧＰＢＰの正常値が事前に測定された血漿試料由来の対照等の、対照と、テスト血漿試料で検出された７７ｋＤ ＧＰＢＰ値の比較を含む。様々な実施態様において、対照は、組換え型７７ｋＤ ＧＰＢＰまたは参照値を使用した検量線を提供する。血漿試料中７７ｋＤ ＧＰＢＰの量と対照との比較で、対照と比較して血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰ上昇は、ＲＡまたはＰＦの存在を示す。
別の実施態様において、検量線用の基準値としての７７ｋＤ ＧＰＢＰの正常値は、血漿中に約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであるが、前炎症ＲＡ対象者は、正常値の少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍およびそれ以上（すなわち３００倍）、正常を超える。したがって、様々な実施態様において、ＲＡの危険性のある対象者は、もし対象者の７７ｋＤ ＧＰＢＰ血漿値が１００ｎｇ／ｍｌ以上；２００ｎｇ／ｍｌ以上；３００ｎｇ／ｍｌ以上；４００ｎｇ／ｍｌ以上；５００ｎｇ／ｍｌ以上；６００ｎｇ／ｍｌ以上；７００ｎｇ／ｍｌ以上；８００ｎｇ／ｍｌ以上；９００ｎｇ／ｍｌ以上；１０００ｎｇ／ｍｌ以上；２０００ｎｇ／ｍｌ以上；または３０００ｎｇ／ｍｌ以上であれば、ＲＡを有すると診断される。
前炎症ＰＦモデルは、正常値の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、またはそれ以上で、正常な７７ｋＤ ＧＰＢＰ値を超える。したがって様々な実施態様において、ＰＦの危険性のある対象者は、もし対象者の７７ｋＤ ＧＰＢＰ血漿値が２０ｎｇ／ｍｌ以上；３０ｎｇ／ｍｌ以上；４０ｎｇ／ｍｌ以上；５０ｎｇ／ｍｌ以上；６０ｎｇ／ｍｌ以上；７０ｎｇ／ｍｌ以上；または８０ｎｇ／ｍｌ以上であれば、ＰＦを有すると診断される。
さらなる実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰ測定を、他の分析物の分析と組み合わせることにより、本方法は、ＲＡまたはＰＦの鑑別診断または予後の実施を可能にする。非限定的な実施態様において、ＲＡの危険性のある対象者で分析し得る他の分析物としては、リウマチ因子（ＲＦ）、抗ＣＣＰ、抗変異シトルリン化ビメンチン（抗ＭＣＶ）などがある。ＰＦの危険性のある対象者で分析し得る他の分析物としては、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）などがある。
この第４の態様の全ての実施態様および実施態様の組合せの中の好ましい実施態様において、本方法は、対象者の血漿中のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）値を測定することをさらに含む。ＣＲＰは、炎症のマーカーである。後続の実施例に開示されている通り、血清中の７７ｋＤ ＧＰＢＰ値とＣＲＰ値は、ＣＫＤおよびＲＡで逆相関している：７７ｋＤ ＧＰＢＰ血漿値は、ＣＫＤおよびＲＡの前炎症段階で上昇しており、次いで炎症期の間に低下する。対照的に、ＣＲＰ血漿値は、ＲＡおよびＣＫＤの炎症期の間に上昇するが、ＲＡおよびＣＫＤの前炎症期の間ずっと、ベースラインにとどまっている。したがって、一実施態様において、本方法は、血漿ＣＲＰ値を測定すること、血漿ＣＲＰの量を対照と比較すること；および対象者がＲＡまたはＰＦを有するとして診断するのに役立つために、ＣＲＰ比較を使用することを、さらに含む。
別の実施態様において、本発明は、
（ａ）ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮの危険性のある対象者由由来の血漿試料を、ＧＰＢＰ−結合分子のＧＰＢＰへの選択的結合を促進する条件下で、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合するＧＰＢＰ−結合分子と接触させること；
（ｂ）（ｉ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中の７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること；および
（ｉｉ）対象者のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）血漿値を測定すること；
（ｃ）（ｉ）ＧＰＢＰ−結合分子と血漿試料中のＧＰＢＰとの間で形成された複合体の量を、対照と比較すること；および
（ｉｉ）対象者の血漿中のＣＲＰ量を対照と比較すること；および
（ｄ）比較に基づいて、対象者を、ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮを有するとして診断すること、またはＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮの診断のための実体に比較を提供すること；
を含む、ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮを診断する方法を提供する。
こうした実施態様、またはその組合せの、いずれの方法も、対象者由来の血漿中の７７ｋＤＧＰＢＰ値およびＣＲＰ値を、２つ以上の時点（すなわち：２、３、４、５、以上の時点）に測定すること、それぞれを対照と比較すること、および２つ以上の測定値の比較に基づいて、対象者がＲＡ、ＰＦ、ＣＫＤ、または免疫複合体仲介ＧＮを有すると診断することをさらに含んでもよい。全ての実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰ値と同じ血漿試料、または種々の試料から、ＣＲＰ値を測定することが可能である。健康なヒト血漿中のＣＲＰの正常濃度は通常、３μｇ／ｍＬ未満である。炎症の結果として、ＣＲＰ値は少なくとも４μｇ／ｍｌ、たとえば軽度炎症では１０μｇ／ｍｌ、活動性炎症では４０μｇ〜２００μｇ／ｍｌ（またはそれより高い）等、である。
第５態様で、本発明は、７７ｋＤ ＧＰＢＰ−７７ｋＤ ＧＰＢＰ−基質結合複合体を、結合条件下で、１つまたは複数のテスト化合物と接触させることを含み、ここで、結合複合体から７７ｋＤ ＧＰＢＰを外すテスト化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための候補化合物である、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための化合物を同定する方法を提供する。
第６態様で、本発明は、７７ｋＤ ＧＰＢＰ−基質を、結合条件下で、
（ａ）１つまたは複数のテスト化合物；および
（ｂ）７７ｋＤ ＧＰＢＰ；
と接触させることを含む、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための化合物を同定する方法を提供し、
ここで７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質への結合に関して、７７ｋＤ ＧＰＢＰに優る化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを治療するための候補化合物である。
こうした第５および第６の実施態様において適当な７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質は、上に開示されている通りであり、Ｉ−２０（配列番号１８）、ＧＰＢＰ−相互作用蛋白質（ＧＩＰ）（配列番号１９〜２３）、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）およびその誘導体（配列番号２４〜２７）、プリオン蛋白質（ＰｒＰ）（配列番号２８）、ＩＶ型コラーゲンα３鎖ＮＣｌ領域（α３（ＩＶ）ＮＣｌ）（配列番号２９）、およびアルツハイマー病βペプチド（ＡβＩ−４２）（配列番号３０）などが挙げられるが、それらに限定されない。好ましい一実施態様において、７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質は、α３（ＩＶ）ＮＣｌを含む。こうした基質のＧＰＢＰ結合を示す例示的な参考文献は、米国特許第６，５７９，９６９号明細書；米国特許第７，１４７，８５５号明細書；および米国特許第７，３２６，７６８号明細書にみられ、参照により全体として本明細書に援用する。
後続の実施例に示す通り、７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質との結合複合体から７７ｋＤ ＧＰＢＰを外す化合物（たとえば抗体等）、または７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質への結合について７７ｋＤ ＧＰＢＰと競合する化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、および／またはＰＦを、治療するための候補化合物である。α３（ＩＶ）ＮＣｌまたは他の７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質へのテスト化合物の結合を評価するための適当な条件は、本明細書における教示に基づいて、当業者により決定され得る。一実施態様において、後続の実施例で使用される条件を使用することができる。非限定的な一実施態様において、結合相互作用を評価するために、マイクロウェルプレートを、適当なバッファー中の適量のα３（ＩＶ）ＮＣｌで被覆することが可能である。次いで、非特異的結合を最小限に抑えるために、プレートをブロックすることが可能である。一実施態様において、次に、α３（ＩＶ）ＮＣｌへの結合を促進するのに適した条件下で、ある量の７７ｋＤ ＧＰＢＰ（たとえば天然の７７ｋＤ ＧＰＢＰ等）と共にプレートをインキュベートし（結合複合体を形成するため）、その後、適当な洗浄ステップ（非結合の７７ｋｄＧＰＢＰを除去するため）および次いで、テスト化合物のいずれかがマイクロウェル中の７７ｋＤＧＰＭＢ−α３（ＩＶ）ＮＣｌ結合複合体から７７ｋｄ ＧＰＢＰを外せるかどうかを評価するために、１つまたは複数のテスト化合物との結合が続く。代替実施態様において、α３（ＩＶ）ＮＣｌへの結合に関して７７ｋＤ ＧＰＢＰに優ることができるテスト化合物を同定するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰおよび１つまたは複数のテスト化合物を、同時に、結合条件下で接触させる。こうした実施態様において、結合事象の同定および分析を容易にするために、７７ｋＤ
ＧＰＢＰを検出可能に標識してもよく、かつ／またはより多いテスト化合物の１つを検出可能に標識してもよい。非限定的な、例示的な実施態様において、プレートを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのポリ−Ｈｉｓ−α３（ＩＶ）ＮＣｌで被覆する。プレートは、４℃で１６時間被覆し、ＰＢＳ中３％のＢＳＡで、室温にて１時間ブロックする。ブロック後、１μｇ／ｍＬのテスト化合物の存在下または非存在下で、プレートを、穏やかに振盪しながら、室温にて１〜２時間、１μｇ／ｍＬのＦＬＡＧ−７７ｋＤＧＰＢＰと共にインキュベートする。結合したＦＬＡＧ−７７ｋＤ ＧＰＢＰを、１μｇ／ｍＬ 抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼで検出する。
他の例示的な好適条件は上述の通りである。たとえば、テスト化合物が抗体であるとき、抗体−抗原結合は、多くの場合、疎水性相互作用（いわゆる疎水結合）に依存する；したがって、高い塩濃度、たとえばモル濃度範囲内、を使用して、非特異的結合を減少させ、特異的抗原−抗体結合を増加させることができる。任意選択的に、選択性および特異性を増進するために、非結合の７７ｋＤ ＧＰＢＰおよび／またはテスト化合物；α３（ＩＶ）ＮＣｌ等の７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質へのＧＰＢＰ結合に関する競合物を含むことが分かっている対照試料および／またはα３（ＩＶ）ＮＣｌ等の７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質への７７ｋＤ ＧＰＢＰ結合に関して競合しないことが分かっている陰性対照を除去するための、１つまたは複数の洗浄ステップを含むがそれらに限定されない、さらなるステップが含まれてもよい。
本方法は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、およびクロマトグラフィを含むがそれらに限定されない標準技術を使用することができる。定量目的には、ＥＬＩＳＡが好ましい。結合事象の検出は、標準検出技術で遂行できる。たとえば、結合複合体の検出は、標識抗体または二次抗体を使用することによって遂行できる。標識の選択を含む、そのような方法は、当業者に知られている。あるいは、抗体を検出可能な物質に結合する（ｃｏｕｐｌｅ）ことができる。用語「結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ）」は、検出可能な物質が抗体に物理的に連結されることを意味するために使用される。適当な検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光体、発光体および放射性物質などがある。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどがある。適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどがある。適当な蛍光体の
例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンなどがある。発光体の例としてはルミノールなどがある。適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈなどがある。
テスト化合物がポリペプチド配列を含むとき、そのようなポリペプチドは、化学的に合成してもよく、または組換え的に発現させてもよい。上に開示した通り、組換え発現は、当該技術分野における標準方法を使用して遂行できる。そのような発現ベクターは、細菌またはウイルスの発現ベクターを含むことができ、またそのような宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。固相、液相、またはペプチド縮合技術、あるいはその任意の組合せの、周知の技術を使用して調製される合成ポリペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコールを用いた標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ酸樹脂であってもよく、または標準的な塩基に不安定なＮα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であってもよい。Ｆｍｏｃ Ｎα−アミノ保護アミノ酸もＢｏｃ Ｎα−アミノ保護アミノ酸も、シグマ・ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、または当業者によく知られている他の化学会社から入手することができる。加えて、本ポリペプチドは、当業者によく知られている他のＮα−保護基を用いて合成することができる。固相ペプチド合成は、当業者によく知られている技術によって、またたとえば自動合成装置を使用するのであれば、遂行することが可能である。
テスト化合物が抗体を含むとき、そのような抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。抗体は、ヒト化抗体であっても、完全ヒト抗体であっても、またはマウス型の抗体であってもよい。そのような抗体は、たとえば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）著、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；研究室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８８年）に記載されている、周知の方法で作ることができる。
テスト化合物が核酸配列を含むとき、そのような核酸は、化学的に合成してもよく、または組換え的に発現させてもよい。組換え型発現技術は、当業者に周知である（たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、前出、参照）。核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また一本鎖でも二本鎖でもよい。同様に、そのような核酸は、当該技術分野における標準技術を使用して、手動反応または自動化反応により、化学的にまたは酵素的に合成することができる。化学的に、またはインビトロ酵素的合成によって、合成されるのであれば、細胞内に導入する前に核酸を精製することが可能である。たとえば、核酸は、溶剤または樹脂を用いた抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィ、またはその組合せによって、混合物から精製することができる。あるいは、核酸は、試料処理による損失を避けるために、全く精製せずに、または最小限の精製で、使用することが可能である。
テスト化合物が、ポリペプチド、抗体、または核酸以外の化合物を含むとき、そのような化合物は、有機化学合成を実行するための技術分野における種々の方法のいずれかによって作ることができる。
（実施例）
実施例１．グッドパスチャー抗原結合蛋白質−１は、免疫複合体仲介ＧＮの治療標的で
ある。
ＣＯＬ４Ａ３ＢＰ（ＧＰＢＰ遺伝子）は、７７−ｋＤ ＧＰＢＰまたはＧＰＢＰとも呼ばれる、標準的なＧＰＢＰ−１（１）；ＣＥＲＴまたはＧＰＢＰΔ２６とも呼ばれる、選択的ｍＲＮＡエキソンスプライシングアイソフォームである、ＧＰＢＰ−２（２）；および、選択的ｍＲＮＡ翻訳開始に起因し、９１−ｋＤ ＧＰＢＰとも呼ばれる変異型である、ＧＰＢＰ−３（３）を含む、少なくとも３つのポリペプチドを発現させる。ＧＰＢＰ−１は主として分泌され、ＩＶ型コラーゲンと相互に作用し（３）；ＧＰＢＰ−２は主としてサイトゾルに局在し（３）、小胞体とゴルジ装置の間で、セラミドを輸送し（４）蛋白質分泌を誘導し（５）；またＧＰＢＰ−３は、細胞膜と関連しており、ＧＰＢＰ−１移出を促進する（３）。
ＩＶ型コラーゲンは、３種の三重らせん分子［α１．α１．α２（ＩＶ）、α３．α４．α５（ＩＶ）およびα５．α５．α６（ＩＶ）］を形成する、６つの別個のα鎖（α１〜α６）で構成される（６）。腎糸球体の主要な構造支持体は、末梢のラッピング（ｗｒａｐｐｉｎｇ）膜組織化α３．α４．α５（ＩＶ）ネットワーク（ＧＢＭ）および中枢のメッシュ組織化α１．α１．α２（ＩＶ）ネットワーク（メサンギウム基質）を含む。毛細血管壁にて、α３．α４．α５（ＩＶ）ネットワーク（上皮）は、膜組織化α１．α１．α２（ＩＶ）ネットワーク（内皮）と融合して、糸球体濾過関門の主成分である、毛細管ＧＢＭの骨格を生じる。
ＧＰＢＰ−１は、ＩＶ型コラーゲンをターゲットにし（１）、その糸球体組織を制御する、非従来型Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである（７）。したがって、ＧＰＢＰ−１の発現増加は糸球体濾過関門にてα３．α４．α５（ＩＶ）ネットワークとα１．α１．α２（ＩＶ）ネットワークの分離を引き起こし、α１．α１．α２（ＩＶ）ネットワークの増大を誘導し、その結果として、毛細管虚脱（糸球体硬化）を仲介する。狼瘡易発性のＮＺＷマウスにおいて、自己抗体産生は、ＧＰＢＰ−１の糸球体発現過剰と相関関係を示し、破壊された毛細管ＧＢＭ上に免疫複合体沈着を形成する結果となる（７）。
ＧＰＢＰ−１が、細胞外コンパートメントに分泌されており（３）、ＧＰＢＰ−１がヒト血漿（ｃＧＰＢＰ−１）の構成成分であること、およびｃＧＰＢＰ−１値上昇は、免疫複合体仲介ＧＮと関連していることを我々は証明した（国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書）。ここで、我々はｃＧＰＢＰ−１が免疫複合体仲介ＧＮの治療標的であることを明らかにする。
結果
ｃＧＰＢＰ−１の同定およびその臨床的関連の評価
国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書に記載の通り、ｃＧＰＢＰ−１を単離するために、ＧＰＢＰ−特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である固定化ｍＡｂ Ｎ２６を含むアフィニティカラムに、ヒト血漿を吸着させた。結合した物質を溶離して、約７７ｋＤａの多数派のポリペプチド、および、ＧＰＢＰ−特異的抗体と反応する、より低Ｍｒの少数派のポリペプチドを含むことを示し、ＧＰＢＰ−１および誘導生成物がヒト血漿の通常の構成成分であることを確認した。ｃＧＰＢＰ−１のＭｒは、使用した分子量標準によって７４ｋＤａと８０ｋＤａの間で変化した（表示せず）。
ｃＧＰＢＰ−１を測定するために、ｍＡｂ Ｎ２６を捕捉抗体として使用し、ｍＡｂ Ｎ２７−ＨＲＰを検出抗体として使用する（国際公開第２０１０／００９８５６号および米国特許第７９３５４９２号明細書に記載されている通り、両者とも種々の非重複エピトープに結合する）、直接サンドイッチＥＬＩＳＡを、我々は開発した。組換え型ＧＰＢＰ
−１を用いて実施した検量線は、０．４〜４００ｎｇ／ｍＬの間で直線関係を示した。このプロトタイプを使用して、我々は、ヒトｃＧＰＢＰ−１の正常値は１０ｎｇ／ｍＬ未満であると推定しており、年齢および性別による有意な変化は何も検出されなかった。
ｃＧＰＢＰ−１検出の臨床関連を探究するために、我々はその値を蛋白尿患者（＞０．５ｇ／日）で測定し、こうした患者はより高いｃＧＰＢＰ−１値を示すことが分かった。しかし、ＩｇＡ腎症またはループス腎炎を経験している患者だけはｃＧＰＢＰ−１値上昇を示したが、普通の腎疾患（多発性嚢胞腎、ＰＫＤ）またはＧＮを有する他の患者は、糸球体コラーゲン上の免疫複合体沈着に仲介されず、国際公開第２０１０／００９８５号および米国特許第７９３５４９２号明細書に記載されている通り、ｃＧＰＢＰ−１値の統計学的に有意な上昇はなかったため、ｃＧＰＢＰ−１値の差は、特定の臨床実体と対照を比較するとき、より意味深い。検出抗体がｍＡｂ ｅ１１−２（ＧＰＢＰ−１を認識するがＧＰＢＰ−２を認識しないｍＡｂ）であるとき、同様の結論が得られた。
ｃＧＰＢＰ−１値上昇が有害な生体影響であるかどうかを評価するために、高値の組換え型ｃＧＰＢＰ−１（２００ｎｇ／ｍＬ）を有するＡ５４９ヒト細胞を培養し、ｍＲＮＡ発現プロフィールを分析した。個々の遺伝子の発現に、統計学的に有意な変化は認められなかった；しかし、ＫＥＧＧ経路の機能分析は、組換え型ｃＧＰＢＰ−１上昇が、ｍａｐ０５３２２経路を活性化することを示し（ウェブサイト：ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｐａｔｈｗａｙ：ｍａｐ０５３２２）、それはＳＬＥの発症と関連していた（テーブル１）。
ＮＺＷ高齢マウスにおける自己抗体とｃＧＰＢＰ−１の協調上昇
ＮＺＷ高齢マウスは、ＧＰＢＰ−１の糸球体発現増加と関連した自己免疫応答（ＳＬＥ）を発症することを以前に報告した（７）。ＧＰＢＰ−１の糸球体発現増加は、局所的ｍＲＮＡ発現増加に起因し得るが、ＧＰＢＰ−１の糸球体蓄積は、少なくともある程度、ｃＧＰＢＰ−１の糸球体構造内捕捉に起因する可能性がある。その結果として、我々は、ｃＧＰＢＰ−１値がＮＺＷマウスにおけるＳＬＥの自然進行を反映するかどうかを探究した。興味深いことに、ｃＧＰＢＰ−１血漿値はＮＺＷ高齢マウスで上昇し、ｃＧＰＢＰ−１値上昇と病理学的マーカーとの間の関係を明らかにする血漿自己抗体値と直接的に相関があったばかりでなく、ｃＧＰＢＰ−１値の正常化または抑制は、ＧＮ進行を止めるための治療戦略となることが示唆された。
ＮＺＷマウスにおけるＩｇＧ免疫複合体の顕著な沈着
ＮＺＷマウスは、糸球体におけるＩｇＡ免疫複合体の顕著な沈着を伴う、ＩｇＧおよびＩｇＡ自己抗体からなる狼瘡易発性の自己免疫応答を示すことを、我々は報告した（７）。しかし、本研究では、ＮＺＷマウスはＩｇＧをベースとする狼瘡易発性の自己免疫応答を示し、循環ＩｇＡ自己抗体は検出されなかった（データは図示せず）。自己免疫応答とＮＺＷマウスにおけるＧＮとの間の関係をさらに調査するために、高齢マウス（＞８カ月）の腎臓を組織化学的技術および免疫組織化学的技術により分析した。前述の通り（７）、我々は破壊されたＧＢＭコラーゲンネットワークおよびＧＢＭの上皮成分と拡張したメサンギウムまたは内皮ＧＢＭ成分との間に蓄積した大量のＧＰＢＰ−１（図３Ａ）を認め
た。組織学的分析は、多様な病理学的所見の存在も示した（図３Ｂ）：糸球体間質の増殖（ａ）、硝子様血栓（ｂ）、内皮下沈着（ｃ）、マトリックス増殖（ｄ）、ワイヤーループ沈着（ｅ）、糸球体分葉（ｆ）、内毛細血管増殖（ｇ）、糸球体炎症性浸潤（ｈ）、壊死、核崩壊および核濃縮（ｉ）、偶発半月体（ｊ）、尿細管間質性炎症性浸潤（ｋ）および尿細管委縮（ｌ）。我々は、主として糸球体の末梢に分布したＩｇＧおよびＣ３ｃの大量の粒状沈着物、およびメサンギウムを優先的に占領するＩｇＭの沈着物の存在も認めた。ＧＢＭの上皮成分に沿ったＩｇＧおよびＣ３ｃ沈着の局在を、共焦点顕微鏡法分析および電子顕微鏡法でさらに確認した（以下参照）。最後に、また既報の通り（７）、これらのマウスでＧＮの臨床兆候は何も検出できなかった。
ＧＰＢＰ−１ブロッキング抗体の特性化
ＩＶ型コラーゲン［α３（ＩＶ）ＮＣｌ］へのＧＰＢＰ−１結合を、ビオチン化ｍＡｂ
Ｎ１２またはＮ２６が阻止する能力を評価し、こうしたｍＡｂは、インビボでｃＧＰＢＰ−１をブロックできる可能性があることが分かった（図１Ａ）。
血漿中のｍＡｂ動力学を調査するために、ＮＺＷマウスに単回腹腔内ブースト（２５０μｇ）を注射し、それらの循環値をモニターした（図１Ｂ）。両ｍＡｂは、注射の３日後に、ピークに達した（１０μｇ／ｍＬ）。ｍＡｂ Ｎ１２−ビオチン値は８日目に半分低下し、１４日目までにほぼ検出不可能であったが、ｍＡｂ Ｎ２６−ビオチン値は１４日目で高い（６μｇ／ｍＬ）ままであり、ｍＡｂ Ｎ２６−ビオチンの血清クリアランスはｍＡｂ Ｎ１２−ビオチンより低いことを示す。
興味深いことに、我々は、抗体投与がマウスのｃＧＰＢＰ−１値を徐々に上昇させることを確認し（図示せず）、これは、抗体がｃＧＰＢＰ−１を標的としてリバウンド作用を誘発したことを示唆した。他の生物学的処置と関連した、血漿値に対するリバウンド作用が記述されている（８）。
ＮＺＷマウスＧＮの抗ＧＰＢＰｍＡｂ処置
ＧＮを治療するためのｍＡｂの有効性を評価するために、ＮＺＷ高齢マウス（８〜１０ヶ月齢）に対し、ＰＢＳ（担体）、または、約１μｇ／ｇ体重のマウスＩｇＧ（対照）を含むＰＢＳ、ｍＡｂ Ｎ１２−ビオチンを含むＰＢＳ、あるいはｍＡｂ Ｎ２６−ビオチンを含むＰＢＳを注射したところ、１回分の投与では、リバウンド作用を誘発しなかった（図２）。初回注射後、ｃＧＰＢＰ−１値は処置と関係なく低下し、研究開始時におけるマウスの処置によって引き起こされたある種のストレスがｃＧＰＢＰ−１値に影響したことが示唆された。しかし、処置の間じゅう低下したままであったｍＡｂ Ｎ１２−ビオチン処置マウス以外は、第１週の後にｃＧＰＢＰ−１値が上昇し、第３週にわたってほぼ元の値に戻り、第４週から第６週までの間に統計学的有意に達した（図２Ａ）。さらに、研究のタイムコースの間ずっと、ｍＡｂ Ｎ１２−ビオチン投与マウスにおけるｃＧＰＢＰ−１値の低下は、ｍＡｂＮ２６−ビオチン処置マウスより有効であった（図２Ｂ）。
処置の終わりに全てのマウスを屠殺し、腎病理を評価した（図３）。対照マウス由来の腎臓は、ＮＺＷ免疫複合体仲介ＧＮに特有の異常を示した；しかし、ＧＰＢＰ−特異的抗体処置マウスは、関連のある糸球体病変または尿細管病変を示さなかった（ＨＥおよびメイスン（Ｍａｓｏｎ））。したがって、生物学的処置はＧＰＢＰ−１の糸球体沈着を減少させ、ＧＰＢＰの尿細管細胞内発現に影響をおよぼさず、免疫複合体（ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＣ３ｃ）の沈着を減少させた。後者は、対照マウスで毛細管ＧＢＭの上皮側によく見られる高電子密度沈着が実質的に存在しないことによって、さらに裏付けられた。こうした全観察結果と一致して、ＧＰＢＰ−特異的抗体処置マウスで、尿細管間質性炎症性浸潤が敏速に減少した（ＨＥ）。
考察
ＳＬＥの最も重篤な兆候である、ＩｇＡ腎症およびループス腎炎を含む免疫複合体仲介ＧＮは、十分に解明されていない。こうした障害を治療するための現行の治療選択肢は限られており、十分に有効ではない。Ｂ−リンパ球刺激物質（ＢＬＹＳ）に対するｍＡｂであるベリムマブは、この５０年の間に食品医薬品局によりＳＬＥ治療用に承認されてきた第１薬剤の代表である（９）。病因に関係なく、ＣＫＤは、広範囲の尿細管間質性線維症を呈し、あらゆるタイプの腎疾患に共通した最終的な病理学的病期であるＥＳＲＤに向かう容赦ない進行を特徴とする。したがって、早期検出してＣＫＤ進行を減ずるための、新しいバイオマーカーおよび治療標的が必要である。
ＮＺＷ高齢マウスが、糸球体における顕著なＩｇＡ沈着を伴うＩｇＡおよびＩｇＧ狼瘡易発性の自己抗体応答を示すことを、我々は前に報告した（７）。ここで、我々は、ＮＺＷマウスが、ＩｇＧの顕著な糸球体沈着を伴う狼瘡易発性のＩｇＧ自己免疫応答を示すことを明らかにする。こうした結果から、ＮＺＷマウスの遺伝的背景は、ＳＬＥおよび免疫複合体仲介ＧＮの素因を与えるが、沈着した免疫複合体の構成は、概して、自己免疫応答の性質に依存することが示唆される。ＮＺＷマウスは遺伝的に同種であるため、自己免疫応答の差、したがって、沈着する免疫複合体の組成の差は、環境因子に依存すると予想される。これと一致して、我々の以前の研究は、標準的な動物施設で飼育されたＮＺＷマウスで実施したが、本研究では、ＮＺＷマウスを病原体フリー環境で維持した。この可能性を調査するために、商業的供給元から得られる若いＮＺＷマウスを病原体フリー条件または非病原体フリー条件で維持して、ＮＺＷマウスは、病原体フリー条件でＩｇＧを顕著に沈着し、非病原体フリー条件でＩｇＡを顕著に沈着することをさらに確認した（未発表の観察結果）。しかし、我々の両研究で、ＧＰＢＰ−１−依存性ＧＢＭコラーゲン変化は、ＩｇＧ免疫複合体沈着の炎症促進条件に起因する可能性がある炎症性徴候を除き、類似していた。集合的に、ＮＺＷマウスにおける遺伝的背景は、狼瘡易発性の自己抗体産生およびＧＰＢＰ−１糸球体発現増加の両方を生じやすくすることを、証拠は示している；しかし、産生されて、破壊されたＧＢＭ上に沈着した自己抗体のタイプを決定する際には、環境因子が病理学的重症度を究極的に決定するであろう。したがって、ＮＺＷマウスは、病原体フリー環境または低制限環境で維持されたかどうかによって、それぞれ、「炎症性の」ループス腎炎様（本実施例）または「非炎症性の」ＩｇＡ腎症様（７）を示した。
ブロッキング抗体は、投与されるとき、組織結合したＧＰＢＰ−１およびｃＧＰＢＰ−１の両方を含む細胞外ＧＰＢＰ−１の活性を特異的に阻害すると予想される。したがって、本明細書における治療効果分析は、ＮＺＷマウスが発症した臨床的に無症状であるループス腎炎様における細胞外ＧＰＢＰ−１の病因的役割を決定するための独特のテストを示す。抗体治療は、ＧＢＭコラーゲンをベースとする変化を実質的に修復し、免疫複合体の糸球体沈着を減少させ、その結果として炎症を減ずることが、我々の結果から示唆される。ｃＧＰＢＰ−１値を下げる能力について異なる能力を示すが、ＧＢＭコラーゲンへのＧＰＢＰ−１結合について類似したブロッキング活性を示す２つの独立したｍＡｂは、類似した方式でＧＮ進行を減ずる。後者は、治療効果が、ｃＧＰＢＰ−１値のクリアランスよりも、ブロッキングに依存することを示す。さらに、抗ＧＰＢＰ療法は明らかに、ｃＧＰＢＰ−１値を下げる（図２）よりも、効率よく糸球体ＧＰＢＰ−１沈着を減少させ（図３）、糸球体ＧＰＢＰ−１がＧＢＭコラーゲン解体に関与していることが示唆される。
ブロッキング抗体は、ＧＢＭコラーゲンを結合するｃＧＰＢＰ−１の容量を低下させることにより、および組織結合したＧＰＢＰ−１の放出を増強することにより、糸球体ＧＰＢＰ−１を下げると予想される。ｃＧＰＢＰ−１値が、組織結合したＧＰＢＰ−１値にいかにして影響するかはまだ決定されていないが、両ＧＰＢＰ−１源は影響を及ぼす可能性があり、より一般的な状況では、一次（優勢な局所産生）または二次（優勢な遠位産生）免疫複合体仲介ＧＮの主な原因となる。
ＧＮ進行に対する有益な影響とは対照的に、ｍＡｂ処置は自己免疫応答の減少または減弱には有効ではない（未発表の観察結果）。循環ＧＰＢＰ−１の上昇と自己抗体とは関連している可能性があるが、病原性イベントと関係なく、個々のマウスにおけるそれらの正の相関関係（未発表の観察結果）からは、むしろｃＧＰＢＰ−１値の誘導は、共通した独特の発病カスケードにおける自己抗体産生の下流で生じることが示唆される。一貫して、ＧＰＢＰ−１発現上昇は、自己抗体産生の存在しない条件下で、免疫複合体ＧＮを誘導した（７）。
集合的に、データから、組織結合した自己抗体は、ＧＰＢＰ−１発現および分泌を誘導することが示唆される。ＧＰＢＰ−１は、周囲の細胞外コンパートメント内の組織に結合したままであるか、血漿に入るかのいずれかである。糸球体では、組織結合したＧＰＢＰ−１は、ｃＧＰＢＰ−１の局所的産生および捕捉に起因する。組織結合したＧＰＢＰ−１の蓄積が、局所的産生増加（一次ＧＮ）に起因するか、または遠位産生増加およびその後の捕捉（二次ＧＮ）に起因するかを問わず、ＧＢＭコラーゲンは解体を受けて、追加的免疫複合体沈着形成を促進する。ｃＧＰＢＰ−１上昇により仲介される、免疫複合体沈着物および狼瘡易発性の細胞性刺激は、ＳＬＥおよびＧＮ進行を持続させる病因を上方制御する。抗ＧＰＢＰブロッキング抗体は、ＧＢＭコラーゲン解体および免疫複合体沈着形成を減じ、病原性フィードバックを破壊する。我々のデータは、免疫複合体仲介ＧＮにおけるｃＧＰＢＰ−１、病原因子および治療標的を同定する。
実施例１のための参考文献
実施例２．ｃＧＰＢＰ−１は、前炎症バイオマーカーおよび炎症促進性バイオマーカーである
ＧＰＢＰ−１は炎症促進性因子である。
抗ＧＰＢＰ−１抗体治療は、結果的に炎症性浸潤を減少させる（図３）という結果は、
ＧＰＢＰ−１が炎症促進性因子の役割をするかどうかという調査に、我々を駆り立てた。
ヒト組換え型ＧＰＢＰ−１を発現する、または発現しない、Ａ５４９細胞のトランスクリプトームの比較分析で、ＮＬＲＰ３の発現は、ヒト組換え型ＧＰＢＰ−１発現に応答して特異的に増加するが、他の関連ＮＬＲＰファミリーメンバーの発現は不変のままであることが明らかにされた（テーブル２）。
同様に、Ｎｅｕｒｏ ２ａ細胞におけるＧＰＢＰ−１の発現過剰は、ＩＬ−１βおよびインフラマソームの成分であるＮＬＲＰ５ａのｍＲＮＡ発現上昇を誘導した。その全てから、ＧＰＢＰ−１がｐｒｏ−ＩＬ−１β発現およびインフラマソーム活性化を誘導することが示唆される。
この関係を研究するために、我々はマクロファージＲＡＷ２６４．７およびＬＰＳならびにドキソルビシンを使用して（１）、ｐｒｏ−ＩＬ−１β発現およびＩＬ−１β放出を評価した。多くの異なる化学物質、たとえばアスベスト、ケイ酸塩、尿酸血漿またはドキソルビシン等は、インフラマソーム活性化剤である（２）が、それらは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のアゴニスト（すなわちＬＰＳ）に依存するマクロファージでのｐｒｏ−ＩＬ−１β（３７ＫＤａ）の発現を誘導できない。マクロファージをＬＰＳでプライミングするとき、ｐｒｏ−ＩＬ−１βはサイトゾル中に蓄積し、インフラマソーム活性化剤は、ｐｒｏ−ＩＬ−１β開裂およびＩＬ−１β（１７ＫＤａ）の細胞外媒体への放出をもたらした（３）。
我々のアッセイでは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージを１μｇ／ｍｌのＬＰＳで一晩プライミングし、ＮＬＲＰ３インフラマソームを１０μＭのドキソルビシンで活性化させた。培地中の、分泌したＩＬ−１βおよびｃＧＰＢＰ−１を、指示された時間にＥＬＩＳＡで測定し、細胞溶解物中のｐｒｏ−ＩＬ−１βおよびＧＰＢＰ−１のサイトゾル発現をウェスタンブロットで分析した（図４）。ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＧＰＢＰ−１のサイレンシングは、ｐｒｏ−ＩＬ−１β合成およびＩＬ−１β放出の減少を引き起こした（図４Ａおよび図４Ｂ）。こうした細胞におけるｃＧＰＢＰ−１放出の時間パターンは、ＩＬ−１βのそれと類似しており（図４Ｂおよび４Ｃ）、したがってＧＰＢＰ−１−抑制ＲＡＷ２６４．７細胞は、ｃＧＰＢＰ−１放出の顕著な減少を示し、これは、ＧＰＢＰ−１が、細胞により分泌される主要なＧＰＢＰアイソフォームであることを示す。
我々のデータは、結果的にｃＧＰＢＰ−１とＩｌＬ−１βの両者の細胞外コンパートメントへの協調分泌をもたらすｐｒｏ−ＩＬ−１β発現およびインフラマソーム活性化を、ＧＰＢＰ−１が誘導することも示す。
ｃＧＰＢＰ−１は、蛋白尿患者における前炎症バイオマーカーである。
早期前炎症ステップにおけるｃＧＰＢＰ−１の役割をさらに決定するために、我々は、蛋白尿患者の血清中の、全身性炎症Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）のバイオマーカーレベルを測定した。我々は、ＣＲＰ血清値とｃＧＰＢＰ−１血清値との間に逆相関があり（図５）、こうした患者では、ｃＧＰＢＰ−１値が、ＣＲＰ値より早く上昇することを示し、したがってｃＧＰＢＰ−１は、蛋白尿患者における前炎症性バイオマーカーとして想定されるべきであることが分かった。
ｃＧＰＢＰ−１は、ＲＡの前炎症性バイオマーカーである。
上記結果の範囲を決定するために、我々は、自己免疫応答仲介ＲＡを経験している患者のｃＧＰＢＰ−１値を測定し、こうした患者は、対照個体に関してｃＧＰＢＰ−１値上昇を示すことが分かった（図６Ａ）。興味深いことに、こうした患者でｃＧＰＢＰ−１値とＣＲＰ値の両方を測定するとき、我々は類似した結論に達し、そこで蛋白尿を経験している患者を分析したとき、ｃＧＰＢＰ−１値とＣＲＰ値は対抗制御されていることが証明された（図６Ｂ）。
ＲＡの病因に関与する免疫学的メカニズムの理解においてここ数十年に遂げた非常に大きい進歩は、主として実験的動物モデルの開発によってもたらされてきた。これらの中で、最も多く研究され、また頻繁に使用されたものはウシＩＩ型コラーゲンで免疫化した後の自己免疫関節炎モデルである（ＣＩＡ）。ＣＩＡ発症はＭＨＣによって制御され（４）、その臨床的進展は性ホルモンによって左右され、オスまたはテストステロンで雄性化されたメスで、より重症である（５）。最近の結果から、Ｔ細胞における組換え型ヒトＢｃｌ−２の発現は、ＣＩＡの発症を抑制することが裏付けられる。これはたぶん抗アポトーシス分子が、自己免疫応答を抑制する調節性Ｔ細胞の個体群拡大を可能にするためである（６）。我々はこの実験モデルを使用して、ＣＩＡ発症におけるｃＧＰＢＰ−１値の制御について研究した。軽度のＣＩＡを発症しているコラーゲンＩＩ型−免疫化非トランスジェニック（ｔｇ）メスマウスと、ＣＩＡを発症しなかったＢｃｌ−２−Ｔｇメスマウスの両者ともに、ｃＧＰＢＰ−１値は、全自己免疫プロセスの間ずっと、不変のままである（ｐ＞０．０５）。対照的に、重度のＣＩＡを発症しているマウス［コラーゲンＩＩ型免疫化オスマウス、または抗ＣＤ２５モノクローナル抗体処置後に調節性Ｔ細胞が著減した非−Ｔｇ（ｎｏ Ｔｇ）メスマウスおよびＢｃｌ−２−Ｔｇメスマウス（５、６）は、臨床的ＣＩＡ発症に先立って、非常に高値のｃＧＰＢＰ−１を示す（ＣＩＡ誘発後４週間；全例で、ｐ＜０．０２）が、いったん非常に重症のＣＩＡが臨床的に明らかになるとその後は、こうした値は有意に低下しており、健康な非免疫化対照ではさらに低い値が認められた（ＣＩＡ誘発後８週間；全例で、ｐ＜０．０５；図７）。集合的に、我々のデータは、循環ＧＰＢＰ−１が、ＲＡ発病における早期のバイオマーカーであることを示す。
考察
ＩＬ−１βは、主として血液単球で産生される、プロトタイプの多機能サイトカインであるが、マクロファージ、樹枝状細胞およびほぼ全タイプの種々の細胞によっても産生される（７）。ＩＬ−１βは、幾つかの炎症性障害の病因ならびにＧＮのヒトモデルおよび動物モデルに関与している（７、８、９、１０）。
インフラマソームを活性化する同一の炎症促進性刺激に対して、ＩＬ−１βおよびｃＧＰＢＰ−１放出は協調している。ＬＰＳ刺激等の、炎症促進条件下で、ｐｒｏ−ＩＬ−１βおよびＧＰＢＰ−１は、細胞内部に蓄積される。次いで、ドキソルビシン仲介インフラマソーム活性化後、ＩＬ−１βとｃＧＰＢＰ−１の両者が細胞外媒体に分泌される。
培養されたマクロファージ様マウス細胞株ＲＡＷ２６４．７で、ＧＰＢＰ−１の下方制御は、ｐｒｏ−ＩＬ−１βの産生を減少させ、ＩＬ−１βの放出を遅らせて、炎症促進性カスケードにおいて、ＧＰＢＰ−１発現および活性化は、ｐｒｏ−ＩＬ１β発現および活
性化より早いステップであることを示す。健康な対照の血清中では、ｃＧＰＢＰ−１濃度は１０ｎｇ／ｍｌ未満であり、ＩｇＡ腎症患者およびループス腎炎患者の血清では有意に高いことを、我々は発見した（上記参照）。このことは、亜臨床的免疫複合体仲介ＧＮを経験している高齢ＮＺＷ腎臓の糸球体にＧＰＢＰ−１が蓄積するという我々の以前の所見と一致している（１１）。マクロファージＲＡＷ２６４．７は、炎症促進性刺激後、多量のｃＧＰＢＰ−１（＞２０ｎｇ／ｍｌ）をＩＬ−１βとともに分泌し、ｃＧＰＢＰ−１が自己分泌、傍分泌（糸球体におけるｃＧＰＢＰ−１）または内分泌炎症促進因子（血清中のｃＧＰＢＰ−１）の役割までも果たし得るという可能性を高める。さらに、ＧＰＢＰ−２は治療−炎症（１２）の標的として以前提案されている。これは、ＧＰＢＰ−２の抑制は、ＩＬ−１βに応答したＰＧＥ２合成のためのセラミドの利用可能性を制限すると予想され、ＧＰＢＰ−１およびＧＰＢＰ−２が炎症促進性カスケードの一部であることが示唆されるためである。加えて、我々は、ｃＧＰＢＰ−１値を、全身性炎症のマーカーである、ＣＲＰの値と比較した。こうした蛋白質の血清濃度は、蛋白尿またはＲＡを有する患者の血清で逆相関を示し、前炎症因子および炎症促進性因子として、ｃＧＰＢＰ−１の二重の役割が示唆される。
参考文献
実施例３．肺線維症を治療するための薬物としての、グッドパスチャー抗原結合蛋白質−１（ＧＰＢＰ−１）インヒビター
肺線維症（ＰＦ）は、肺組織が損傷して瘢痕化するときに起きる。ＰＦは、未知の原因によって発症する（特発性ＰＦ）こともあり、または慢性の炎症プロセス、感染症、環境要因、電離放射線およびある種の薬品への曝露を含む、多くの条件に関連しているか、または誘発されることがある（１）。この点については、癌で化学療法を受けている患者の約５〜１０％が、ある程度のＰＦを発症している可能性があると推定されてきた。したがって、ブレオマイシンおよびドキソルビシンは、ヒトを含む種々の動物種でＰＦを誘発することが明らかにされている（２〜５）。ＰＦ患者の予後は悪く、この疾病を有する患者の大半は５年以内に死亡する。不幸なことに、ＰＦ患者の転帰を改善することが証明されている薬品は無く（１）、肺移植が、現在利用できる唯一の治療選択肢である。
ＧＰＢＰ−１は、細胞内外の、構造蛋白質の超分子構造形成を制御する（６、７）。ＧＰＢＰ−１の発現は、ＴＮＦα等の炎症性刺激により制御され（８、９）、また炎症は線維形成過程の開始および進行において重要な役割を果たすため、我々はここで、ＧＰＢＰ−１が異なるタイプのコラーゲン（すなわち：コラーゲンＩ型）の異常な蓄積で特徴づけられる疾病、たとえばＰＦ等の、病因に関与する重要分子である可能性があるという仮説をたてた。本研究で我々は、プレツビック・ケミカル・ライブラリー（Ｐｒｅｔｓｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ）から２つの化合物（インビトロでＧＰＢＰ−１活性を変調する能力がある）を特性化した。これらの化合物（ピナシジルおよびミリセチン）の治療能力は、マウスにおけるドキソルビシン誘発性ＰＦの実験モデルを使用して、インビボで評価されている。最後に、ＧＰＢＰ−１がドキソルビシン誘発性−ＰＦにおける標的であることを確認するために、我々はＧＰＢＰ−１に対する２つの異なるモノクローナル抗体、ｍＡｂ １４およびｍＡｂ Ｎ１２を使用して、マウスにおけるドキソルビシン誘発性−ＰＦを治療した。
結果
ドキソルビシンの気管内滴下注入は、ＰＦを促進する。
Ｃ５７ＢＬ／６オスマウスへの、ドキソルビシン７５μｇの気管内（ｉ．ｔ）滴下注入は、薬物投与後１２日目に、出血性のように見える肺の激しい炎症によって肉眼的に特徴づけられる広汎性の変化を、肺構造に引き起こした（図８）。組織学的分析は、結果的に肺胞の閉塞をきたす血管周囲肉芽腫および間質マトリックス沈着の存在を含む、激しい炎症性の細胞浸潤を示す（図８、ＨＥ）。間質マトリックス沈着物の膠原性は、肺のマッソン３色染色後に明白に示される（図８）。組織学的病変の発生と並行して、α１−コラーゲンＩ遺伝子発現の増加が、ドキソルビシン−処置マウスの肺でＲＴ−ｑＰＣＲ分析により確認される（図９）。
ドキソルビシン−誘発性ＰＦを誘発中の、ＧＰＢＰ−１の発現増強
ドキソルビシン誘発性ＰＦの発病におけるＧＰＢＰ−１の潜在的関与を探究するために、我々はまず、ドキソルビシン滴下注入後、異なる時点で、循環ＧＰＢＰ−１値をＥＬＩＳＡにより測定した：ＧＰＢＰ−１の血清値はドキソルビシン滴下注入後早期（５日目）に敏速に上昇し、その後低下して、炎症および線維症が臨床的に明らかになる１２日目に最低値に達し（図９Ａ、全例で、ｐ＜０．０５）、その場合、発現レベルは対照と類似している（図９Ｂ）。最後に、特異的抗ＧＰＢＰ−１ポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学（６）は、未処置マウスの肺におけるＧＰＢＰ−１の発現が非常に低レベルであり、その発現が、気管支上皮に限定されることを示している（図９Ｃ）。対照的に、気管支上皮および実質の両方に位置するドキソルビシン−処置マウスの肺では、ＧＰＢＰ−１の発現増大が確認される。この最後の位置で、ＧＰＢＰ−１発現は、細胞外マトリックス沈着と関連してパッチパターンを採用する（図９Ｃ）。
ＧＰＢＰ−１の２つのインビトロ・インヒビターである、ピナシジルおよびミリセチンは、インビボで、ドキソルビシン誘発性ＰＦを改善する。
プレツビック・ケミカル・ライブラリー（Ｐｒｅｔｓｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ）からの２つの化学化合物、ピナシジルおよびミリセチンは、それらがインビトロでＧＰＢＰ−１活性を妨げる能力に関して選択された（図示せず）。
我々はここで、ドキソルビシン誘発性ＰＦを治療するためにピナシジルまたはミリセチンを使用する可能性を探究してきた。最初に、マウスにドキソルビシンを気管内滴下注入し、実験の最初から最後まで（０〜１２日）種々の用量のピナシジルで処置した。一日用量０．０８ｍｇ／ｋｇのピナシジルは、ドキソルビシン誘発性肺線維症の重症度を敏速に低下させ（図１０）、また一貫して、肺のα１（Ｉ）コラーゲンｍＲＮＡの有意な発現低下がピナシジル処置マウスで確認された（図１１Ａ）。より低用量のピナシジルは、結果的にα１（Ｉ）コラーゲンｍＲＮＡ（図１１Ａ）の類似した発現低下をもたらした。意外なことに、ピナシジルの治療効果は、より高用量の薬物（０．２５または１．２２５ｍｇ／ｋｇ／日）を投与したとき失われた（図１１Ａ）。対照的に、マウスをミリセチンで処置したとき、テストした全ての用量で、ドキソルビシン誘発性線維症の効率的な減少が得られた（図１１Ｂ）。
ＧＰＢＰ−１に対する２つのモノクローナル抗体である、ｍＡｂ １４およびｍＡｂ Ｎ２６は、インビボで、ドキソルビシン誘発性ＰＦを改善する。
我々は、ドキソルビシン誘発性ＰＦを治療するためにｍＡｂ １４およびｍＡｂ Ｎ１２を使用する可能性を探究してきた。４群のマウスに、ドキソルビシンを気管内注入し、気管内滴下注入後第１日から、既知の抗線維症療法である、形質転換増殖因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）βに対するモノクローナル抗体（αＴＧＦβ；１ｍｇ／週を３回に分けて）（１０）、またはｍＡｂ−１４（１ｍｇ／週を３回に分けて）、またはｍＡｂ Ｎ１２（２５μｇ／週、単回注入で）で処置するか、または治療せずに放置した（Ｄｏｘｏ）。肺線維症に対する治療効果を評価するために、肺におけるコラーゲンＩのα１鎖のｍＲＮＡ発現（２）およびコラーゲンＩＶのα１鎖のｍＲＮＡ発現をＲＴ−ｑＰＣＲで測定した。ドキソルビシンは、α１（Ｉ）発現とα１（ＩＶ）発現の両者を増加させる（線維症）。ＧＰＢＰ−１に対するｍＡｂは、α１（ＩＶ）の発現を有意に減少させずα１（Ｉ）発現に対して限定された効果があったαＴＧＦよりも良好に、α１（Ｉ）とα１（ＩＶ）の両者の発現を減少させた（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（図１２）
結論
ドキソルビシンの気管内滴下注入はＰＦを誘発した。
１）ドキソルビシン誘発性ＰＦの発症中に、血清中のｃＧＰＢＰ−１値および肺におけるＧＰＢＰ−１値の上昇が確認された。
２）ＧＰＢＰ−１に対する２つのｍＡｂを含む４つの明らかに異なるＧＰＢＰ−１インヒビターは、ドキソルビシン誘発性ＰＦを改善した。
参考文献
方法
動物実験
全ての手順を、実験における動物の使用に関する施設ガイドラインに準拠して実施した。
免疫複合体仲介糸球体腎炎を治療するために、抗体を用いたインビボ研究（実施例１）用に、ＮＺＷマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを産生し、病原体フリー環境で維持した。インビボでｍＡｂをモニターするために、８〜１０カ月齢のＮＺＷマウスに１０μｇ／
ｇ体重のビオチン−標識ｍＡｂ Ｎ１２（ｎ＝３）またはＮ２６（ｎ＝３）の単回ブーストを投与し、特定の時点で血清試料を採取した。治療効果分析用に、８〜１０カ月齢のＮＺＷマウスは、１μｇ／ｇ体重の、ｍＡｂ Ｎ１２−ビオチン（ｎ＝５）、ｍＡｂ Ｎ２６−ビオチン（ｎ＝５）、マウス血清由来のＩｇＧ（ｎ＝３）、またはＰＢＳ（ｎ＝３）のいずれかの注射を１週間に１回受けた。処置を８週間継続し、注射の直前に血清試料を採取した。抗体またはＰＢＳを腹腔内に投与し、血清試料をマウス尾から得て分析測定に使用した。ＩｇＧ−処置マウスとＰＢＳ−処置マウスとの間に差は認められず、統計分析用の対照として、両群を集合的に使用した。処置の終わりに、全てのマウスを屠殺し、標準的な組織学的技術で腎臓を分析した。３カ月齢のＮＺＷマウス由来の血清および８〜１０月齢のＣ５７ＢＬ／６マウス由来の血清を分析的研究で対照として使用した。
ドキソルビシンでＰＦを誘発するために（実施例３）、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６オスマウスをハーラン・イベリカ（Ｈａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａ）（バルセロナ、スペイン）から購入した。ドキソルビシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を気管内（ｉ．ｔ．）滴下注入するために、ケタミン（５０μｇ／ｇ体重）、硫酸アトロピン（０．２μｇ／ｇ）およびジアゼパム（４μｇ／ｇ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射でマウスを麻酔した。気管を、首の前面の皮膚切開によって定位し、鉗子で固定した。次いで、７５μｌのドキソルビシン塩酸塩（１ｍｇ／ｍｌ）を、３０Ｇ針で気管内注射した。ついで、３／０シルクで皮膚を縫合した。マウスに、固形飼料を不断給餌し、ドキソルビシン気管内滴下注入後、種々の時点で、後眼窩叢から採血した。ピナシジルおよびミリセチンは、それらがインビトロでＧＰＢＰの自己リン酸化活性を阻害する能力に基づいて、プレツビック・ケミカル・ライブラリー（Ｐｒｅｔｓｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ）から選択された。ドキソルビシンを気管内滴下注入されたマウスに、０．０２７、０．０８、０．２５または１．２２５ｍｇ／ｋｇのピナシジルか、０．１１、０．３４または０．９５ｍｇ／ｋｇのミリセチンのいずれかを、毎日腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ドキソルビシン投与後１２日目に、肺の遺伝子発現分析および病理解剖学的研究のためにマウスを屠殺した。
ヒト血清試料
ヒト血清試料を、対応する倫理委員会によって事前に認可された手順にしたがって、ホスピタル１２デ・オクトゥブレ（Ｈｏｓｐｉｔａｌ １２ ｄｅ Ｏｃｔｕｂｒｅ）（マドリード、スペイン）およびワシントン大学ジョージＭオブライエン・腎臓疾患リサーチセンター（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（セントルイス、米国）から入手した。ＰＫＤを除き、患者診断は、対応する腎生検の組織学的分析によって裏付けられた。
抗体およびウェスタンブロット法
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ヒト組換え型ＧＰＢＰ−１に対するモノクローナル抗体Ｎ１２、Ｎ２６、およびＮ２７を生成したが、その産生は以前に報告されている（１、２）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるキメラ蛋白質であるＧＳＴ−ｅ２６に対するモノクローナル抗体ｅ１１−２を生成した。ＧＳＴ−ｅ２６は、ＧＰＢＰ−１のエキソン１１によりコード化される蛋白質配列（ＧＰＢＰ−２には存在しない）を含み、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合したキメラ蛋白質である。必要があれば、ｍＡｂ Ｎ１２およびｍＡｂ Ｎ２６を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロックフォード、イリノイ）でビオチン−標識し、インビボ検定に使用した。免疫蛍光試験のために、アレキサ・フルア（Ａｌｅｘａ（登録商標）
Ｆｌｕｏｒ）５４６（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバド、カリフォルニア）で標識されたｍＡｂ Ｎ２７か、事前に特性化されたニワトリ抗ＧＰＢＰ−ｐｅｐ １ポリクローナル抗体のいずれかを使用して、ＧＰＢＰ−１を可視化した（３
）。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；ＥＺ−リンク・プラス・活性化ペルオキシダーゼ（ＥＺ−ＬＩＮＫ Ｐｌｕｓ（登録商標） Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で標識したモノクローナル抗体Ｎ２７を、組換え型ＧＰＢＰ−１およびｃＧＰＢＰ−１の検出に使用した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロッティングを、標準手順に従って、還元条件下で実施した。
市販の抗体
アレキサ・フルア（Ａｌｅｘａ（登録商標） Ｆｌｕｏｒ）６４７（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバド、カリフォルニア）で標識したヤギ抗ＩＶ型コラーゲン・ポリクローナル抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、テメキュラ、カリフォルニア）、およびビオチン標識抗α３（ＩＶ）ｍＡｂ３（ウィズラブ（Ｗｉｅｓｌａｂ）ＡＢ、ルンド、スウェーデン）を、それぞれ糸球体α１．α１．α２（ＩＶ）ネットワークおよびα３．α４．α５（ＩＶ）ネットワークの検出に使用した。組換え型ｃＧＰＢＰ−１とα３（ＩＶ）ＮＣｌ領域の両者は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼ（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ミズーリ）で検出した。補体成分３ｃ（Ｃ３ｃ）、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ沈着を、ウサギポリクローナル抗Ｃ３ｃ−ＦＩＴＣ（アブカム（Ａｂｃａｍ））、およびヤギ抗マウスＩｇＡ−、ＩｇＧ−またはＩｇＭ−ＦＩＴＣ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で、それぞれ可視化した。ビオチン化抗体を、高感度ニュートラビジン−ＨＲＰ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ロックフォード、イリノイ）、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＡＦ４８８（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））またはエクストラビジン（Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ（登録商標））−ＴＲＩＴＣ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））で検出した。使用した二次抗体は、ニワトリＩｇＹ−ＦＩＴＣ（アブカム（Ａｂｃａｍ））に対するヤギポリクローナル抗体、およびロバ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ジャクソン・イムノリサーチ・ヨーロッパ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｎｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ）、サフォーク、英国）であった。
細胞培養
Ａ５４９細胞を、ダルベッコ変法イーグルＦ−１２で増殖させ、ＨＥＫ ２９３およびＲＡＷ ２６４．７を、ダルベッコ変法イーグル培地で培養した。全ての培地に１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。
プラスミド構築および細胞形質移入
ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）２．１−Ｕ６ハイグロベクター（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を、ＧＰＢＰ−１をサイレンシングするために特異的な低分子干渉ｍＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の安定した発現に使用した。誘導された構築物はｐＳｉ−ＧＰＢＰ−１と名づけられ、ｃＤＮＡ標的配列は、既述の通り、ＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＣＧＣＴＣＴＴＣＣ（配列番号１１）であった（４）。
ｍＡｂ ｅ１１−２抗体を得るために使用される、ＧＳＴ−ｅ２６の発現および精製用に、ＧＰＢＰ−１エキソン１１のｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−５ｘ−１ベクター（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））におけるＧＳＴのｃＤＮＡとのインフレームの下流にクローニングした。
ＲＡＷ ２６４．７細胞の形質移入を、製造業者の推奨にしたがって、プロフェクション・哺乳類トランスフェクションシステム（ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎ（登録商標） Ｍａｍ
ｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））またはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用した、リン酸カルシウム手順で実施した。個々のクローンにおけるＧＰＢＰ−１の発現を、細胞抽出物のウェスタンブロット分析で決定した。ＧＰＢＰ−１値低下を示すクローンを、機能的研究で使用した。
細胞処理
野生型ＲＡＷ２６４．７細胞およびＧＰＢＰ−１−抑制（サイレンシング）ＲＡＷ２６４．７細胞を、２ｘ１０６細胞／ウェルで、６ウェル培養プレートにプレーティングし、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）血清型０２６：Ｂ６）で一晩（１６時間）刺激した。次いで、ＬＰＳ−刺激マクロファージを１０μＭドキソルビシン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））に２、４、および６時間、曝露した。ドキソルビシンと共にインキュベートした後、細胞溶解物中のｐｒｏ−ＩＬ−１βおよびサイトゾルＧＰＢＰ−１の発現をウェスタンブロットで分析し、培地上澄中の成熟ＩＬ−１βおよびｃＧＰＢＰ−１をＥＬＩＳＡで定量した。
細胞溶解物を、溶解バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ ＳＤＳ、１μＭロイペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で細胞を解体し、氷上で１０分間インキュベートすることによって得た。溶解物を、４℃にて１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離することによって清澄させ、ウェスタンブロットで分析した。
ＧＰＢＰ−１およびＧＳＴ−ｅ２６の組換え型発現および精製
ＥＬＩＳＡで使用される組換え型ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−ＧＰＢＰ−１を、発現プラスミドｐＥＴ−１５ｂ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）のマルチプルクローニングサイトにインフレームでクローニングされたＧＰＢＰ−１ ｃＤＮＡで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製した。上記発現プラスミドｐＥＴ−１５ｂは、標準手順に従ったニッケル−キレート化アガロースカラム（クロンテック・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウンテン・ビュー、カリフォルニア）を用いた精製を容易にするために６つのヒスチジンのタグを付加する。
組換え型ｃＧＰＢＰ−１（ｒｃＧＰＢＰ−１）を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティ・ゲル（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ）（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ミズーリ）を使用して、ＦＬＡＧ−ＧＰＢＰ−１を恒常的に分泌するＨＥＫ ２９３細胞クローンの細胞培地から精製した。
ＧＳＴ−ｅ２６発現を、ｐＧＥＸ−５ｘ−１−ｅ２６構築物を包懐する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞において１ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘導し、精製を、製造業者の推奨に従って、ＧＳＨ−アガロースアフィニティ樹脂（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いて実施した。
ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−ＧＰＢＰ−１、ｒｃＧＰＢＰ−１またはＧＳＴ−ｅ２６の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー・ブルー染色で評価し、その完全性を、ｍＡｂ Ｎ２６、ｍＡｂ Ｎ２７およびｍＡｂ ｅ１１−２を含む、ＧＰＢＰ−１に対するｍＡｂを使用したウェスタンブロットで評価した。
病理学的研究
全てのマウスを、ＣＯ２室で屠殺した。抗体を用いたインビボ実験（実施例１）後、腎臓を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。電子ロータリーミクロトーム（ミ
クローム（Ｍｉｃｒｏｍ）、ヴァルドルフ、ドイツ）で、２μｍの切片を得て、従来のヘマトキシリン／エオシン（ＨＥ）、マッソン染色にかけた。
ＰＦアッセイでは、マウス肺を、４％リン酸塩緩衝ホルマリンで気管支内灌流し、次いで、この固定液中で２４時間インキュベートし、最後にパラフィン包埋した。５μｍの組織切片を、従来の方法に従ってＨＥまたはマッソン３色で染色した。免疫組織化学用に、パラフィン包埋した肺を抗ＧＰＢＰ−ｐｅｐ１抗体で染色し（３）、それを抗ニワトリ−ＨＰＲおよびＤＡＢ基質（ダコ・ダイアグノスティコス（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｏｓ），Ｓ．Ａ．、バルセロナ、スペイン）で検出した。標本を、ヘマトキシリンで対比染色した。
免疫蛍光法
腎臓をＯＣＴ（サクラ、東京、日本）に包埋し、凍結した。クライオスタット（ミクローム（Ｍｉｃｒｏｍ））を用いて６μｍの切片を得て、既述の通り、従来の顕微鏡法分析および共焦点顕微鏡法分析用に染色した（３）。
マイクロアレイ分析
ヒトＡ５４９細胞を、２００ｎｇ／ｍＬのｒｃＧＰＢＰ−１有り無しで、３時間培養した。次いで、細胞を溶解し、製造業者の推奨に従って、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）プロテクトミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア）を用いて総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを、ナノドロップ（登録商標）（ＮａｎｏＤｒｏｐ）ＮＤ１０００（ナノドロップ・テクノロジー（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィルミントン、デラウェア）を用いて分光光度法で定量し、品質を、ＲＮＡ６０００ナノ・バイオアナライザー（Ｎａｎｏ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、パロ・アルト、カリフォルニア）アッセイで確認した。簡単に記載すると、製造業者の説明書に従って、ロー・インプット・クイック・アンプ・ラベリング・キット・ワン−カラー（Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ（登録商標） Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔ Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））を使用してシアニン３−ＣＴＰ−標識ｃＲＮＡを産生するために、１５０ｎｇの総ＲＮＡを使用した。「ワンカラー・マイクロアレイ−ベースド・ジーン・エクスプレッション・アナリシス（Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ」プロトコール・バージョン６．０（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））に従い、４１０００＋ ヒト遺伝子および転写物を含むホール・ヒューマン・ゲノム・オリゴ・マイクロアレイ・キット（Ｗｈｏｌｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｌｉｇｏ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））を用いて、１６００ｎｇの標識ｃＲＮＡをハイブリダイズさせた。製造業者の説明書に従って、アジレント・マイクロアレイ・スキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ）でアレイを走査し、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）プロトコールＧＥｌ＿１０７＿Ｓｅｐ０９、グリッド・テンプレート０１４８５０＿Ｄ＿Ｆ＿２０１００４３０およびＱＣメトリック・セット（ＱＣ Ｍｅｔｒｉｃ Ｓｅｔ）ＧＥｌ＿ＱＣＭＴ＿Ｓｅｐ０９に従い、アジレント・フィーチャー・エクストラクション・ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）１０．７．１を使用してデータを抽出した。分析は、ゲノミクス・コア・サービス・オブ・ザ・セントロ・デ・インヴェスティゲーション・プリンシペ・フェリペ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｓｅｒｖｉｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｅ Ｆｅｌｉｐｅ）（バレンシア、スペイン）で、アジレント・マイクロアレイ・スキャナ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ）（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、パロ・アルト、カリフォルニア）を使用して、実施した。
生データファイルは、供給元の方法論を使用してバックグラウンド補正し、強度信号シグナルは、変位値正規化アルゴリズムによって全アレイを標準化した。全比較の示差遺伝子発現評価は、リンマ調整ｔ統計量を使用して実施した。ベンジャミニ・ホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）により提唱された多重検定のための従来の調整（５）を使用して、調整Ｐ値を導いた。また、本研究で実施した比較のそれぞれについて、ロジスティック回帰モデルを使用し、前述同様に多重検定用に補正して、（５）遺伝子セット分析を実施した。全ての分析は、バイオインフォマティクス・デパートメント・オブ・セントロ・デ・インヴェスティゲーション・プリンシペ・フェリペ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｅ Ｆｅｌｉｐｅ）のＢａｂｅｌｏｍｉｃｓ（登録商標）（６）ウェブ・スイートを使用して実施した。アレイデータは、ＧＥＯに預託されている（受け入れ番号ＧＳＥ３２１８１）。
リアルタイムＰＣＲ分析
実験的肺線維症のアッセイで、肺におけるＧＰＢＰおよびコラーゲンＩ型およびＩＶ型ｍＲＮＡの発現を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）で分析した。製造業者の説明書に従い、ＲＴ−ＰＣＲキット（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスキャタウェイ、ニュージャージー）を用いたｃＤＮＡ合成に、１μｇの単離ＲＮＡを使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲを、特異的プライマーＳＹＢＲ・グリーン・ＰＣＲ・マスター・ミックス（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）（アプライド・バイオシステムズ、ライフ・テクノロジー社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用して、ＭＸ−３０００Ｐストラタジーン・インスツルメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（アジレント・テクノロジー社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンタ・クララ、カリフォルニア）で実施した。使用したプライマーは：α１（Ｉ）コラーゲン遺伝子には、５’プライマー ５’−ＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴ−３’（アミノ酸配列１２）および３’プライマー ５’−ＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＡＡＣＧＡＣＣＴ−３’（配列番号：１３）；ＧＰＢＰ遺伝子には、５’プライマー ５’−ＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡ−３’（配列番号１４）および３’プライマー ５’−ＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号１５）；１８Ｓ遺伝子には、５’プライマー ５’−ＧＴＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴ−３’（配列番号１６）および３’プライマー ５’−ＧＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣＣＴＡＣＣ−３’（配列番号１７）であった。結果（三重）は、リボソーム１８Ｓサブユニット発現に正規化され、また各試料で並行して測定された。データを、対照試料と比較して、平均倍率変化として表す。
ｃＧＰＢＰ−１の免疫精製
ｃＧＰＢＰ−１を、アフィニティクロマトグラフィでヒト血漿から抽出した。具体的には、血漿（２００ｍＬ）を遠心分離で清澄させ、濾過し（０．４５μｍ）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）を加えた１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水、ＴＢＳ）で１：５（ｖ／ｖ）希釈した。１ｍＬのシアン酸ブロミド−活性化−セファロース４Ｂ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））に固定された１ｍｇのｍＡｂ Ｎ２６を含むカラムに上澄を負荷した。結合した物質を１０ｍＬのＴＢＳＴで洗浄し、イムノピュア・ジェントル・Ａｇ／Ａｂ溶離バッファー（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標） Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶離し、ＴＢＳに対して徹底的に透析した。
ＥＬＩＳＡ手順
ＧＰＢＰ−１とＩＶ型コラーゲンのα３鎖の非コラーゲン１領域［α３（ＩＶ）ＮＣｌ］との相互作用を評価するために、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬのｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−ＧＰＢＰ−１でプレートを被覆した。ブロック後、プレートを、１μｇ／ｍＬのｍＡｂ Ｎ１２またはＮ２６の存在下または非存在下で、１μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣｌと共にインキュベートした。結合したＦＬＡＧ−α３（ＩＶ）ＮＣｌを、１μｇ／ｍＬ 抗ＦＬＡＧ Ｍ２−ペルオキシダーゼで検出した。
ｃＧＰＢＰ−１の定量化またはビオチン化ｍＡｂの定量化を、それぞれ、ＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬのｍＡｂ Ｎ２６またはｐｏｌｙ−Ｈｉｓ−ＧＰＢＰ−１でプレートを被覆するサンドイッチＥＬＩＳＡで実施した。プレートをブロックし、試料（１：１０〜１：２０希釈）と共にインキュベートし、それぞれ、１μｇ／ｍＬのｍＡｂ Ｎ２７−ＨＲＰまたは高感度ニュートラビジン−ＨＲＰ（Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）−ＨＲＰ）を用いて検出を実施した。
全ての場合で、プレートを、４℃で１６時間被覆し、ＰＢＳ中３％のＢＳＡにて室温で１時間ブロックした。その後のインキュベーションを、穏やかに振盪しながら室温にて１〜２時間行った。ステップ間にプレートを徹底的に洗浄し、蛍光性ＨＲＰ基質（クォンタ・ブルー（Ｑｕａｎｔａ Ｂｌｕｅ）、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で展開した。蛍光強度をスペクトラマックス・ジェミニ ＸＰＳ 蛍光マイクロプレート・リーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標） Ｇｅｍｉｎｉ ＸＰＳ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニベール、カリフォルニア）で測定し、ソフトマックス・プロ・データ獲得＆解析ソフトウェア（ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標） Ｐｒｏ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））で解析したデータを獲得した。他に指示がない限りあらゆる希釈および洗浄は、ＴＢＳＴで行った。
抗−ｓｓ−ＤＮＡ ＩｇＧ抗体価およびＣＲＰ価を、製造業者の説明書に従い、それぞれアルファ・ダイグノスティック・インタナショナル（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｌ．）（サンアントニオ、テキサス）およびメディテック（Ｍｅｄｉｔｅｃ）（キール、ドイツ）からの市販キットを使用して、間接サンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。
刺激されたＲＡＷ ２６４．７細胞による成熟ＩＬ−１β産生を評価するために、製造業者の説明書に従い、マウスＩＬ−１β用ＥＬＩＳＡレディー・セット・ゴー・キット（ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ Ｋｉｔ）（イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用して、細胞培地を分析した。
電子顕微鏡法試験
腎臓を切除し、０．１Ｍ リン酸ナトリウム ｐＨ７．４（ＰＢ）中に２％のパラホルムアルデヒドおよび２．５％のグルタルアルデヒドにおいて、４℃にて２４時間浸漬することによって固定し、次いでＰＢ洗浄した。ビブラトーム（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＶＴ−１０００；ライカ・マイクロシステムズ・ハイデルベルグ有限会社（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＧｍｂＨ）、マンハイム、ドイツ）を用いて２００μｍの切片を得て、ＰＢ中に２％の四酸化オスミウムで１．５時間固定し、氷温水で洗浄し（３ｘ５分）、氷温エタノール溶液の濃度を上昇させながら連続的に洗浄することにより脱水し（３０％で５分、５０％で５分、および７０％で１０分）、７０％エタノール中に２％の酢酸ウラニルで、４℃にて２．５時間洗浄し、７０％エタノール中で２ｘ５分洗浄、９６％エタノール中で２ｘ５分および１０分洗浄、１００％エタノール中で２
ｘ７分洗浄、および乾燥１００％エタノール中で１回１０分洗浄によりさらに脱水した。最後に、切片をプロピレンオキシドで２ｘ１０分洗浄し、アラルダイト（ダーキュパン（Ｄｕｒｃｕｐａｎ）、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））に包埋した。１．５μｍの準超薄切片および０．０８μｍの超薄切片をダイアモンドナイフで切り、それぞれ１％トルイジンブルーおよびクエン酸鉛（レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）溶液）で染色した。
統計解析
プリズム４．０ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ ４．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（グラフパド・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標） Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア）を、全ての計算に使用した。データを、シリーズ間の有意差を評価するために二元配置ＡＮＯＶＡまたはクルスカル・ウォーリス（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）検定を用いて解析し、ｃＧＰＢＰ−１と抗−ｓｓＤＮＡ自己抗体との間の相関の統計学的有意性を決定するためにスピアマン検定（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｔｅｓｔ）を用いて解析した。Ｐ値＜０．０５は有意であると考えられた。
参考文献

Claims (24)

  1. 肺線維症（ＰＦ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、ＰＦを治療する方法。
  2. 前記ＰＦが非特発性ＰＦである、請求項１に記載の方法。
  3. 慢性腎疾患（ＣＫＤ）を治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、ＣＫＤを治療する方法。
  4. 免疫複合体仲介ＧＮを治療するために、７７ｋＤ ＧＰＢＰのインヒビターの有効量を、必要としている対象者に投与することを含む、免疫複合体仲介ＧＮを治療する方法。
  5. 前記免疫複合体仲介ＧＮが、ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびグッドパスチャー症候群からなる群から選択される自己免疫疾患と関連がある、請求項４に記載の方法。
  6. 前記対象者がヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記７７ｋＤ ＧＰＢＰインヒビターが、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合する抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記抗体が、７７ｋＤ ＧＰＢＰアイソフォームに対する選択性を有する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 前記ＧＰＢＰインヒビターが、一般式Ｘ１−ＳＨＣＩＸ２−Ｘ３（配列番号２）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、ここで：
    Ｘ１は、配列ＡＴＴＡＧＩＬＡＴＬ（配列番号３）の０〜１０アミノ酸であり；
    Ｘ２は、ＥまたはＱであり；かつ
    Ｘ３は、配列ＬＭＶＫＲＥＤＳＷＱ（配列番号４）の０〜１０アミノ酸である；
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ＧＰＢＰインヒビターが式（Ｉ）：
    の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を含み、ここで：
    Ｒは、ＮおよびＣＲ５から選択され；
    Ｒ５は、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、アミノ、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
    （アリール）Ｃ２〜Ｃ６アルキル、および（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルからなる群から選択され；
    Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）であり；
    Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ０〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
    Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ホルミル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルファニル（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；かつ
    Ｒ４は、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、ベンジルオキシ、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−（ＣＨ２）１〜５Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、−（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）２、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）１〜５−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）、（アリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または（ヘテロアリール）Ｃ１〜Ｃ６アルキルである；
    請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 関節リウマチ（ＲＡ）または肺線維症（ＰＦ）を診断する方法であって、
    （ａ）ＲＡまたはＰＦの危険性のある対象者由来の血漿試料を、７７−ｋＤ ＧＰＢＰへのＧＰＢＰ−結合分子の選択的結合を促進する条件下で、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合するＧＰＢＰ−結合分子と接触させること；
    （ｂ）前記ＧＰＢＰ−結合分子と前記血漿試料中の前記７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること；
    （ｃ）前記ＧＰＢＰ−結合分子と前記血漿試料中の前記７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間で形成された複合体の量を、対照と比較すること；および
    （ｄ）前記比較に基づいて、対象者を、ＲＡまたはＰＦを有するとして診断すること、またはＲＡもしくはＰＦを診断するための実体に前記比較を提供すること
    を含む方法。
  13. 前記７７ｋＤ ＧＰＢＰ−結合分子が、天然の７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合する抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記抗体が、７７ｋＤ ＧＰＢＰアイソフォームに対する選択性を有する、請求項１３に
    記載の方法。
  15. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記検出することが、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、およびクロマトグラフィからなる群から選択される技術の使用を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記対象者がＲＡの危険性を有する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記対象者が、１つまたは複数の関節腫脹、１つまたは複数の関節のこわばり、１つまたは複数の関節のほてり、一般に１時間超持続する早朝の関節のこわばり、滑液過剰、滑膜における線維組織の発生、および関節運動範囲の障害からなる群から選択される１つまたは複数の症状に罹患している、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記対象者がＰＦの危険性のある、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記対象者が、慢性乾性咳、疲労、脱力、胸部不快、食欲不振、急速な体重減少、および労作と関係した呼吸困難からなる群から選択される１つまたは複数の症状に罹患している、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記対象者のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）血漿値を測定すること、前記対象者の血漿中のＣＲＰ量を対照と比較すること、およびＲＡまたはＰＦの診断の補助のために前記ＣＲＰ比較を使用することをさらに含む、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮを診断する方法であって、
    （ａ）ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮの危険性のある対象者由来の血漿試料を、ＧＰＢＰ−結合分子の７７ｋＤ ＧＰＢＰへの選択的結合を促進する条件下で、７７ｋＤ ＧＰＢＰに結合するＧＰＢＰ−結合分子と接触させること；
    （ｂ）（ｉ）前記ＧＰＢＰ−結合分子と前記血漿試料中の前記７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間の複合体形成を検出すること；および
    （ｉｉ）前記対象者のＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）血漿値を測定すること；
    （ｃ）（ｉ）前記ＧＰＢＰ−結合分子と前記血漿試料中の前記７７ｋＤ ＧＰＢＰとの間で形成された複合体の量を対照と比較すること；および
    （ｉｉ）前記対象者の血漿中のＣＲＰ量を対照と比較すること；および
    （ｄ）前記比較に基づいて、前記対象者を、ＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮを有するとして診断すること、またはＣＫＤまたは免疫複合体仲介ＧＮの診断のための実体に前記比較を提供すること
    を含む方法。
  23. ７７ｋＤ ＧＰＢＰ−７７ｋＤ ＧＰＢＰ基質結合複合体を、結合条件下で、１つまたは複数のテスト化合物と接触させることを含み、ここで、７７ｋＤ ＧＰＢＰ結合を前記結合複合体から外すテスト化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、およびＰＦの少なくとも一方を治療するための候補化合物である、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、およびＰＦの少なくとも一方を治療するための化合物を同定する方法。
  24. ７７ｋＤ ＧＰＢＰ−基質を、結合条件下で
    （ａ）１つまたは複数のテスト化合物；および
    （ｂ）７７ｋＤ ＧＰＢＰ；
    と接触させることを含み、ここで、前記７７ｋＤ ＧＰＢＰ−結合基質への結合に関して、７７ｋＤ ＧＰＢＰに優る化合物は、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、およびＰＦの少な
    くとも一方を治療するための候補化合物である、ＣＫＤ、免疫複合体仲介ＧＮ、およびＰＦの少なくとも一方を治療するための化合物を同定する方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016023959A (ja) * 2014-07-16 2016-02-08 学校法人慶應義塾 インフラマソーム活性化制御物質のスクリーニング方法
JP2021507243A (ja) * 2017-12-20 2021-02-22 ノルディック・ビオサイエンス・エー／エスＮｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａ／Ｓ ツムスタチンアッセイ

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104684584A (zh) 2012-07-02 2015-06-03 费卜卢斯坦丁公司 Gpbp-1的抑制及其治疗用途
US20160184274A1 (en) * 2014-12-31 2016-06-30 Fibrostatin, S.L. Methods for inhibiting mesenchymal phenotype after epithelial-to-mesenchymal transition
CN105061600A (zh) * 2015-09-05 2015-11-18 苏州普罗达生物科技有限公司 类风湿因子IgA抑制多肽及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005501222A (ja) * 2000-12-29 2005-01-13 レディ ユーエス セラピューティクス インコーポレイテッド 炎症応答を調節する化合物を検出するための方法及び組成物
WO2010009856A2 (en) * 2008-07-22 2010-01-28 Juan Saus Goodpasture antigen binding protein and its detection
JP2010509575A (ja) * 2006-11-08 2010-03-25 ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを用いる糖尿病の診断およびリスク層化

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US6124128A (en) 1996-08-16 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Long wavelength engineered fluorescent proteins
ES2254151T3 (es) * 1999-02-24 2006-06-16 Juan Saus Proteina de union al antigeno de goodpasture.
US6881547B1 (en) 2001-01-31 2005-04-19 Juan Saus Methods and reagents for treating autoimmune disorders
US7147855B2 (en) 2001-12-07 2006-12-12 Juan Saus GIPs, a family of polypeptides with transcription factor activity that interact with goodpasture antigen binding protein
US7326768B2 (en) 2003-02-05 2008-02-05 Juan Saus Goodpasture antigen-binding protein isoforms and protein misfolded-mediated disorders
ATE551067T1 (de) * 2006-02-03 2012-04-15 Crc For Asthma And Airways Ltd Tumstatin zur behandlung von erkrankungen die mit der neumodellierung von atemwegsgewebe zusammenhängen
US9884899B2 (en) * 2007-07-06 2018-02-06 Promedior, Inc. Methods for treating fibrosis using CRP antagonists
SI2185198T1 (sl) * 2007-08-02 2015-04-30 Gilead Biologics, Inc. Inhibitorji LOX in LOXL2 ter njihova uporaba
US8497381B2 (en) * 2008-02-25 2013-07-30 Panmira Pharmaceuticals, Llc Antagonists of prostaglandin D2 receptors
JP5883794B2 (ja) 2009-11-05 2016-03-15 フィブロスタチン ソシエダ リミターダＦｉｂｒｏｓｔａｔｉｎ，Ｓｏｃｉｅｄａｄ Ｌｉｍｉｔａｄａ 擬似ｑ２ペプチドを用いるｇｐｂｐ抑制

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005501222A (ja) * 2000-12-29 2005-01-13 レディ ユーエス セラピューティクス インコーポレイテッド 炎症応答を調節する化合物を検出するための方法及び組成物
JP2010509575A (ja) * 2006-11-08 2010-03-25 ブラームズ アクチェンゲゼルシャフト ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを用いる糖尿病の診断およびリスク層化
WO2010009856A2 (en) * 2008-07-22 2010-01-28 Juan Saus Goodpasture antigen binding protein and its detection

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016023959A (ja) * 2014-07-16 2016-02-08 学校法人慶應義塾 インフラマソーム活性化制御物質のスクリーニング方法
JP2021507243A (ja) * 2017-12-20 2021-02-22 ノルディック・ビオサイエンス・エー／エスＮｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａ／Ｓ ツムスタチンアッセイ
JP7249346B2 (ja) 2017-12-20 2023-03-30 ノルディック・ビオサイエンス・エー／エス ツムスタチンアッセイ

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