CN117295763A

CN117295763A - Mfap4与纤维化治疗

Info

Publication number: CN117295763A
Application number: CN202280033435.9A
Authority: CN
Inventors: 格里斯·吕克·索伦森; 安德斯·施洛瑟; 乌费·霍姆斯科夫
Original assignee: Syddansk Universitet
Current assignee: Syddansk Universitet
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2022-04-11
Publication date: 2023-12-26

Abstract

本发明涉及一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4‑整联蛋白相互作用，用于预防、缓解和/或治疗纤维化。本发明进一步包括包含所述选择性靶向剂的组合物。

Description

MFAP4与纤维化治疗

技术领域

本发明涉及纤维化如肝纤维化的预防、缓解和/或治疗。特别地，本发明涉及针对MFAP4的选择性靶向剂在预防、缓解和/或治疗纤维化中的用途。

背景技术

纤维化的特征在于反复损伤后过度的ECM沉积，也称为纤维化瘢痕，因为纤维化是伤口愈合过程的关键部分。在病理性伤口愈合过程中，结缔组织取代了正常的实质组织。因此，纤维化是一种夸大的伤口愈合反应，其干扰正常的器官功能。它包括但不限于用TGF-β激活的肌成纤维细胞和I型胶原沉积代替常驻细胞。总的来说，组织修复机制相当复杂，细胞外基质合成和降解的严格调节确保了正常组织结构的维持。然而，如果组织损伤是严重的或反复的，伤口愈合反应经常变得失控，导致不可逆的纤维化反应。

通常观察到纤维化引起几种疾病，并且纤维化在疾病发病机理中是重要的，因为过度的ECM沉积通常导致组织功能的丧失。它是发病率和死亡率的主要原因，并可能影响所有组织，如肺、皮肤、肝、肾和心脏。因此，纤维化可能导致几种严重的疾病，如肝硬化、肾病、囊性纤维化、关节纤维化、特发性肺纤维化和肥厚性心肌病。

纤维化的治疗选择有限或尚无纤维化的治疗选择。对TGF-β途径的直接抑制还没有转化为临床应用，并且不利的风险-效益特征已经导致试验的终止。随着口服药物吡非尼酮(Pirfenidone)和尼达尼布(Nintedanib)的批准，仅特发性肺纤维化(IPF)的治疗可行性已得到证实，特发性肺纤维化是一种原因不明的致命病况。然而，这些药物与胃肠道副作用有关，不能治愈也不能逆转纤维化。

ECM是一个复杂的网络，受到多种途径的高度调控。其中一种参与ECM组织的蛋白质是微纤维相关蛋白4(MFAP4)。MFAP4的ECM结合功效有助于ECM纤维(包括原纤维蛋白和弹性蛋白)的正确组装，并通过与弹性蛋白、原纤维蛋白和胶原的直接相互作用参与ECM的组织。

MFAP4在纤维化中的作用已经在MFAP4缺陷小鼠中进行了研究，显示了矛盾的结果。MFAP4缺乏显示出对CCl4治疗后的实验性肝纤维化发展或肺博莱霉素施用后的实验性肺纤维化发展没有影响，并且在单侧输尿管梗阻中纤连蛋白和I型胶原沉积减少。此外，对于心脏纤维化，在MFAP4缺陷小鼠中的效果有些矛盾，显示了较低水平的心脏纤维化和较少的室性心律失常的结果，并且在不同的研究中没有观察到心脏胶原沉积的差异。因此，MFAP4和纤维化之间的相互作用似乎是复杂的，给出了矛盾的结果。

因此，ECM的复杂性影响纤维溶解和纤维发生之间的平衡，并且也可能在某种程度上彼此影响和抵消。如果平衡被改变，这可能导致纤维化，但是目前不存在用于逆转这种不平衡以治疗纤维化的化合物。因此，非常需要通过逆转ECM在组织中的过度沉积来治疗纤维化，以允许正常实质组织再生并避免组织功能障碍。

发明内容

本发明提供了用于治疗、缓解和/或预防纤维化的有效且可靠的选择性靶向剂，如抗体及其片段，以及包含该选择性靶向剂的组合物。这些选择性靶向剂能够靶向MFAP4，进而去分化(de-differentiate)肌成纤维细胞，从而减少和/或逆转胶原的合成。

因此，本发明的目的涉及提供用于治疗、缓解和/或预防纤维化的化合物和包含这些化合物的组合物。

因此，本发明的一方面涉及一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4-整联蛋白相互作用，用于预防、缓解和/或治疗纤维化。

本发明的第二方面涉及一种用于预防、缓解和/或治疗纤维化的组合物，其中所述组合物包含本文所述的选择性靶向剂以及一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

附图说明

图1显示MFAP4在临床/人类纤维化中增加。在A)对照肺和肺纤维化、B)对照肾和肾纤维化以及C)肝脏和肝纤维化中的MFAP4免疫染色(棕色)(来自Molleken等人,2009)。D)显示视网膜下纤维化沉积(左图)的代表性样品，通过原位杂交显示肌成纤维细胞条纹中Mfap4 mRNA表达(粉红色，右图)。Bl＝血液，Fib＝纤维化沉积，myof＝肌成纤维细胞。E)显示肺腺癌的纤维化沉积中的α-SMA(灰色)阳性肌成纤维细胞的代表性样品，通过原位杂交显示Mfap4mRNA表达(粉红色)。条以微米为单位。

图2显示TGF-β在转分化的视网膜色素上皮(RPE)细胞中诱导MFAP4，并且MFAP4可逆地增强生长因子诱导的这些细胞的活化。TGF-β诱导的人RPE细胞(ARPE19)中A)MFAP4或B)胶原的相对mRNA表达。MFAP4组织培养涂布诱导C)由MFAP4诱导的细胞粘附(RFU＝粘附于表面的荧光标记细胞的相对荧光单位)被抗MFAP4处理逆转，D)通过在面向下室的滤膜侧涂有MFAP4的transwell滤膜的PDGF增强的细胞迁移，和E)TGF-β诱导的1型胶原(Col1A1)mRNA合成在24小时后被MFAP4增强，和F)被抗MFAP4处理可逆。C-F显示了来自3-5个独立实验的数据。方差分析用于分析数据。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。

图3显示TGF-β在转分化的肝星状细胞中诱导MFAP4，并且MFAP4可逆地增强生长因子诱导的这些细胞的活化。A)TGF-β诱导的MFAP4的相对mRNA表达。MFAP4组织培养涂布诱导B)细胞粘附，并且这种粘附通过抗MFAP4处理而逆转。C)MFAP4涂布诱导细胞胶原合成(趋势，初步数据)。D)通过在面向下室的滤膜侧涂有MFAP4的transwell滤膜的PDGF增强的细胞迁移，E)抗MFAP4处理和F)RGD肽处理减少了迁移。方差分析用于分析数据。*p<0.05，**p<0.01，***，p<0.001，****p<0.0001。

图4显示通过静脉注射抗MFAP4减少了大鼠肝纤维化。A)大鼠肝纤维化通过两周饮用水中的苯巴比妥诱导，随后通过口服管饲法进行6周四氯化碳(CCl₄)处理。大鼠接受总共三次IV剂量的抗MFAP4或载体处理。B)该模型降低了大鼠体重，C)没有降低肝脏与体重的比率，D)但是显著增加了脾脏与体重的比率(代表门静脉高压)，并且这种作用通过抗MFAP4处理而显著降低。MFAP4的免疫检测E)在模型肝组织中显著诱导，并在该组织中显著降低，而F)在抗MFAP4处理后在血液中不显著降低。纤维化和炎症标志物的相对mRNA表达通过该模型在大鼠肝组织中诱导，并通过抗MFAP4处理降低，其中该标志物为G)1型胶原(Col1A1)mRNA、H)α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、I)IL-1β(IL1β)、J)TGF-β1(TGFβ1)、K)TIMP-1(TIMP1)和L)MFAP4(MFAP4)mRNA。对COL1a1和TIMP1的影响显著。方差分析用于分析数据。*p<0.05，**p<0.01，***，p<0.001，****p<0.0001。

图5显示MFAP4通过RGD-整联蛋白αvβ3依赖的相互作用在体外介导人原代HSC(HHSteC)的粘附和迁移。(A-C)使用振动细胞粘附检测剂盒进行细胞粘附。接种HHSteC(100,000个细胞/孔)并在以下条件下孵育1小时：A)在10μg/ml的FN、HSA、rhMFAP4或用MFAP4封闭抗体、抗MFAP4(20μg/ml)预处理的rhMFAP4上；B)在含有RGD或DGR的肽(100μg/ml)的存在下的10μg/ml的rhMFAP4上；C)在与10μg/ml整联蛋白封闭抗体、抗整联蛋白αvβ3、αvβ5或IC竞争的10μg/ml rhMFAP4。(D-G)使用transwell小室(Transwell insert)进行迁移检测。将HHsteC(50,000个细胞/小室)加入上室中，并允许迁移3h。在光学显微镜(放大20倍)下，在4个随机视野/小室中对迁移的细胞进行染色和计数。用以下涂布transwell小室的下侧：D)在下室中存在或不存在PDGF的情况下，用10μg/ml的HSA或rhMFAP4；E)在下室中存在PDGF和10μg/ml的抗MFAP4或IC的情况下，用10μg/ml的HSA或rhMFAP4；(F-G)在下室中存在PDGF的情况下，用10μg/ml的HSA、FN或rhMFAP4；用(100μg/ml)含RGD或DGR的肽(F)或用10μg/ml抗整联蛋白αvβ3或IC预孵育细胞。FN：纤连蛋白，HSA：人血清白蛋白，IC：同型对照，ns：不显著。数据是3-4个独立实验的平均值+SEM，每个实验重复三次。*p<0,05，**p<0,01，***p<0,001，****p<0,0001，通过单向方差分析计算。

图6显示MFAP4在HHSteC中被TGFβ1激活后上调。MFAP4增强TGFβ1刺激的HHSteC转分化，但对HHSteC增殖无影响。(A-D)饥饿16小时的HHSteC在存在或不存在TGFβ1(5ng/ml)刺激的情况下培养24、48或72h。A)通过ELISA测定培养上清液中的MFAP4浓度。(B-D)HHSteC+/-TGFβ1刺激中MFAP4、ACTA2和Col1A1的相对mRNA表达。(E,F)在存在或不存在TGFβ1刺激的情况下，将饥饿16小时的HHSteC接种在HSA或rhMFAP4涂布的孔中，并孵育72小时。ACTA2(E)和Col1A1(F)的相对mRNA表达。G)将饥饿16小时的HHSteC接种在HSA或rhMFAP4涂布的孔中，并孵育4、24、48或72h，使用WST-1检测确定细胞增殖。数据是3个独立实验的平均值+SEM。ns:不显著，**p<0,01，***p<0,001，****p<0,0001，通过单向方差分析或双向方差分析计算。FC：倍数变化。

图7显示MFAP4在CCl₄诱导的肝纤维化大鼠模型的肝脏中增加，同时αSMA表达增加。通过ELISA在(A)肝脏和(B)橄榄油和CCl₄+载体处理的大鼠血清中测量MFAP4浓度。(C)橄榄油和CCl₄+载体处理的大鼠的肝脏中MFAP4的相对mRNA表达。数据为平均值+SEM，n＝6(橄榄油组)，n＝10(CCl₄+载体组)。**p<0,01，***p<0,001，通过t检验计算。

图8显示使用抗MFAP4抗体中和MFAP4降低了肝纤维化诱导的脾肿大，但没有降低AST和ALT的水平。A)肝纤维化实验模型示意图。B)橄榄油(n＝6/组)、CCl₄+载体和CCl₄+抗MFAP4(n＝10/组)的体重，箭头代表抗MFAP4或载体施用的开始。橄榄油、CCl₄+载体和CCl₄+抗MFAP4处理的大鼠中C)肝脏和D)脾脏与体重的比率。使用商业ELISA试剂盒在橄榄油、CCl₄+载体或CCl₄+抗MFAP4处理的大鼠的血清中检测的E)ALT和F)AST的酶活性。数据为平均值+SEM，n＝6(橄榄油组)，n＝10(CCl₄+载体和CCl₄+抗MFAP4)。Ns：不显著，*p<0,05，**p<0,01，通过单向方差分析计算。

图9显示使用抗MFAP4抗体靶向MFAP4信号传导降低了CCl₄诱导的肝促纤维化和促炎标志物的基因表达。在橄榄油、CCl₄+载体或CCl₄+抗MFAP4处理的大鼠肝脏中A)Col1A1、B)ACTA2、C)TGFβ1、D)TIMP1、E)MMP2、F)IL1β、G)COL3A1和H)MFAP4的相对mRNA表达水平。从左叶和右叶切片的肝匀浆中提取RNA。Tbp被用作管家基因。数据为平均值+SEM，n＝6(橄榄油组)，n＝10(CCl₄+载体和CCl₄+抗MFAP4)。虚线代表橄榄油组的平均值。*p<0,05，**p<0,01，***p<0,001，****p<0,0001，通过t检验或曼-惠特尼检验计算。

图10显示在CCl₄处理的大鼠中抗MFAP4抗体保护免于肝纤维化进展。A)天狼星红阳性区域的定量分析(胶原沉积的标志)。B)测量肝匀浆中羟脯氨酸含量的浓度。C)α-SMA阳性区域的定量(肌成纤维细胞的标志)。D)CD11b阳性区域的定量(浸润肝脏的活化巨噬细胞的标志)。E)通过CD31阳性区域的定量评估肝窦的毛细血管化(内皮细胞的标志)。虚线代表橄榄油组的平均值。*p<0,05，**p<0,01，***p<0,001，****p<0,0001，通过单向方差分析、t检验或曼-惠特尼检验计算。

图11显示在小鼠的非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD/NASH)中，抗MFAP4保护免于肝纤维化进展。通过7周CCl₄处理+高脂肪饮食诱导NAFLD-模型中的小鼠肝纤维化，并且小鼠在最后3周接受6次剂量的IV抗MFAP4或载体。从载体或抗MFAP4处理的动物获得肝切片的胶原染色，通过图像分析进行定量。

现在将在下文中更详细地描述本发明。

具体实施方式

定义

在进一步详细讨论本发明之前，将首先定义以下术语和惯例：

术语“纤维化”也称为纤维性瘢痕，是指一种病理性伤口愈合，其中结缔组织取代了正常的实质组织，导致相当大的组织重塑和永久性瘢痕组织的形成。纤维化涉及成纤维细胞沉积在结缔组织，包括胶原和糖胺聚糖，特别是成肌纤维细胞。如果组织损伤是严重的或反复的，该过程会导致进行性不可逆纤维化反应。纤维化可能导致反复损伤、慢性炎症和修复的结果。因此，纤维化是指由于细胞外基质成分(如胶原)的过量沉积而形成过量的纤维结缔组织。胶原以细胞外基质中的高含量存在于纤维结缔组织中。因此，在纤维化中，存在一种或多种细胞外基质成分的沉积水平，其高于没有纤维化的水平。

在本文中，术语“治疗”指预防性治疗以及治疗性治疗。

在本文中，术语“缓解”是指使疾病(即纤维化)不那么严重。

在本文中，术语“预防”是指避免纤维化的发生，并且在某些情况下可以被认为是预防性治疗。

术语“选择性靶向剂”是指靶向MFAP4-蛋白并抑制MFAP4的整联蛋白结合的一组化合物。该组涉及抗体以及抗体模拟蛋白和适配体。术语“选择性靶向剂”还包括融合化合物，如融合蛋白，其中抗体、适配体或抗体模拟蛋白与一种或多种其他蛋白融合。

本文所用的术语“抗体”应广义理解，并意在也涵盖其片段或衍生物。应当理解，在其片段或衍生物中，将包括与抗原相互作用并赋予其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基，即包括抗体的片段和衍生物，只要它们表现出所需的生物活性。抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分。这些抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体如人源化单克隆抗体、其中重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、单链抗体、Fc片段、Fv片段、scFv片段、双价抗体(diabody)、三价抗体(triabody)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、具有抗体CDR区的缀合物、纳米抗体、融合蛋白和Fab表达文库。抗体可以是完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，即例如对一种以上来源特异的抗体或其片段。抗体也可以是融合蛋白的一部分，其中抗体与另一种蛋白融合。

优选地，与抗原结合的区域是人源的。在其他实施方案中，与抗原结合的区域可以来自其他动物物种，特别是家畜和啮齿类动物，如兔、大鼠或仓鼠。

应当理解，本文每次提到“抗体”或任何类似术语时，都包括完整抗体及其任何片段、改变、衍生物或变体。

抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任何一类，它们因分子中存在的重链的性质而互不相同。这些抗体分子也包括亚类，如IgG1、IgG2及其他。轻链可以是κ链或λ链。本文提及的抗体包括指代所有类别、亚类和类型。

抗体可以包括如可检测标记的部分或具有毒性或治疗活性的物质。或者，抗体可以在恒定区包含点突变。

术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，其中每种单克隆抗体通常识别抗原上的单个表位。术语“单克隆”不限于任何制备抗体的特定方法。例如，本发明的单克隆抗体可以通过如(等人,1975)中所述的杂交瘤方法制备，或者可以使用如WO 2019/086580中所述的技术从噬菌体文库中分离。

本文使用的术语“抗体模拟蛋白”涉及蛋白质，该蛋白质本身不是抗体，而是通过选择性靶向特定靶标而发挥功能的模拟抗体。如本文所述，这涉及特异性靶向MFAP4并抑制MFAP4的整联蛋白结合的蛋白质。抗体模拟蛋白的一个实例是DARPin，它是基因工程抗体模拟蛋白，通常表现出高度特异性和高亲和力的靶蛋白结合。这种抗体模拟蛋白的其它实例是亲和体(affibody)分子、affilin、affimer、affitin、alphabody、抗运载蛋白(anticalin)、avimer、fynomer、kunitz结构域肽、knottin、monobody和nanoCLAMP。

本文使用的术语“适配体”涉及结合特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。适配体可分为DNA、RNA或XNA适配体，其由寡核苷酸链和肽适配体组成，肽适配体是本领域技术人员已知的短可变肽结构域。适配体通常是通过基于它们结合特定靶分子的能力从大的随机序列库中选择它们而产生的。

术语“有效量”和“治疗有效量”在与选择性靶向剂相关使用时是指对支持MFAP4的一种或多种生物活性水平的可观察变化有用或必需的选择性靶向剂的量，其中所述变化可以是MFAP4活性水平的增加或降低。

在本发明的上下文中，术语“序列同一性”或“同源物”表示两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间同源性程度的定量测度。如果待比较的两个序列长度不等，它们必须进行比对以给出最佳匹配，允许在多肽序列或核苷酸序列的末端插入空位(gap)或截短。序列同一性可计算为其中Ndif是比对时两个序列中不相同残基的总数，并且其中Nref是其中一个序列中残基的数量。因此，DNA序列AGTCAGTC与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Ndif＝2，Nref＝8)。空位被认为是特定残基的非同一性，即DNA序列AGTGTC与DNA序列AGTCAGTC具有75％的序列同一性(Ndif＝2，Nref＝8)。

关于涉及氨基酸序列或核苷酸序列的本发明的所有实施方案，一个或多个序列之间的序列同一性百分比也可以基于使用clustalW软件(http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html)的默认设置的比对。对于核苷酸序列比对，这些设置是：比对(Alignment)＝3Dfull，空位产生(Gap Open)10.00，空位延伸(Gap Ext.)0.20，空位间隔距离(Gapseparation Dist.)4，DNA权重矩阵：同一性(IUB)。对于氨基酸序列比对，设置如下：比对＝3Dfull，空位产生10.00，空位延伸0.20，空位间隔距离4，蛋白质权重矩阵：Gonnet。

或者，可以用DNASIS Max程序分析核苷酸序列，并且可以在http://www.paralign.org/进行序列的比较。这种服务基于两种比较算法，称为Smith-Waterman(SW)和ParAlign。第一种算法由Smith和Waterman(1981)公开，是一种公认的寻找两个序列的最佳局部比对的方法。另一种算法ParAlign是一种用于序列比对的启发式方法；Rognes(2001)公布了该方法的细节。使用了评分矩阵和空位罚分以及E值的默认设置。

在本文中，术语“K_D”或“K_D值”是指选择性靶向剂和其靶标之间(例如抗体和其抗原之间)的平衡解离常数。K_D值与选择性靶向剂的浓度(特定实验所需的选择性靶向剂的量)相关，因此K_D值越低(浓度越低)，选择性靶向剂的亲和力越高。在本文中，K_D由Biacore T200测量。

在本发明的上下文中，定义“涉及SEQ ID NO:X的AA-yy”应理解为AA＝氨基酸；-yy是SEQ ID NO:X中氨基酸的位置。因此，例如“涉及SEQ ID NO:2的Trp-33”应理解为SEQ IDNO:2中第33位的Trp。

在本发明的上下文中，定义“至多五个氨基酸”应理解为不超过五个氨基酸，即五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸或一个氨基酸。

在本发明的上下文中，定义“其中至多有xx个氨基酸不同于SEQ ID NO:X的序列”应理解为除xx个氨基酸之外与SEQ ID NO:X相同的序列，该xx个氨基酸可以不同，即不同于序列中列出的氨基酸。因此，如果至多有两个氨基酸不同于SEQ ID NO:9，这应理解为与SEQID NO:9有两个、一个或没有氨基酸不同的序列。“X”应理解为序列表SEQ ID NO:1-15中的任何一个，如本文所列的序列表SEQ ID NO:1-14中的任何一个。或者，“X”应理解为序列表SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14中的任何一个。“xx”应理解为数字五、四、三、二或一中的任何一个。

在本发明的上下文中，术语“组合物”是指适合于对受试者施用的组合物，其可以包含药学上可接受的载体或稀释剂。组合物中的活性物质可以通过任何合适的途径以液体或固体形式施用，例如口服、肠外、静脉内、皮内、皮下、全身性、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、玻璃体内或局部。这种组合物也可以称为药物组合物。

如果该组合物是可注射的，其可以包含无菌或等渗介质中的选择性靶向剂。

纤维化的预防、缓解和/或治疗

如上所述，本发明涉及用于预防、缓解和治疗纤维化的选择性靶向剂。这些选择性靶向剂针对MFAP4与其结合。这些选择性靶向剂能够靶向MFAP4，从而抑制MFAP4整联蛋白结合的作用。因此，如实施例中所证明的，通过选择性靶向剂与纤维化期间大量表达的细胞外基质成分(即纤维化的明确标志物，如胶原)的直接相互作用，可以预防和逆转纤维化。此外，结果表明，用选择性靶向剂治疗也能够逆转负责纤维化过程的细胞的表型，从而直接影响纤维化过程。因此，与现有药物相比，可以通过实际上逆转纤维化过程来治疗纤维化。因此，在第一方面，本发明涉及一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4-整联蛋白相互作用，用于预防、缓解和/或治疗纤维化。

在一个实施方案中，选择性靶向剂选自由抗体、抗体模拟蛋白和适配体组成的组。

在另一个实施方案中，选择性靶向剂是表位结合蛋白，如抗体或抗体模拟蛋白。术语“表位结合蛋白”是指靶向MFAP4并通过结合MFAP4中的表位来抑制MFAP4的整联蛋白结合的一组蛋白质。该组涉及抗体以及抗体模拟蛋白。术语“表位结合蛋白”还包括融合蛋白，其中抗体或抗体模拟蛋白与一种或多种其他蛋白融合。

纤维化可被引入不同的组织，如肝、肺、肾、心脏、血管、眼、皮肤、胰腺、肠、脑和骨髓，例如由该特定组织的损伤引起。纤维化也可能同时发生在数个器官中。

例如，肺纤维化或肺部纤维化可能作为长期感染(如肺结核或肺炎)的结果发生。它也可能是由暴露于职业危害(如煤尘)或遗传条件囊性纤维化引起的。肝纤维化和肝硬化是替代正常肝组织的瘢痕组织。肝硬化被定义为肝纤维化的晚期阶段，伴有肝脉管系统和结构的扭曲。肝纤维化和肝硬化可以是不同原因的结果，如肥胖症和导致脂肪性肝病(FLD)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)的代谢综合征，其还包括非酒精性脂肪性肝炎(NASH)；导致酒精性脂肪性肝病(AFLD)或酒精性脂肪性肝炎(ASH)的大量饮酒；乙型或丙型肝炎感染；自身免疫性疾病；胆汁淤积性疾病；和铁或铜过载。此外，心脏可能患有纤维化，其中心脏区域由于心肌梗塞、压力过载或其他原因而受损。

因此，选择性靶向剂可用于治疗、缓解和/或预防不同组织中的纤维化。在一个实施方案中，纤维化是肝纤维化或慢性肝病、肺纤维化、眼纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、肠纤维化和/或手术或损伤引起的纤维化。

在另一个实施方案中，纤维化是肝纤维化或慢性肝病。在更进一步的实施方案中，所述慢性肝病是肝硬化、肝衰竭和门静脉高压。因此，肝纤维化应理解为肝中存在纤维化。

在另一个实施方案中，纤维化是肺纤维化。因此，应理解为肺中存在纤维化。

在另一个实施方案中，纤维化是眼纤维化。因此，应理解为眼中存在纤维化。眼纤维化可以是视网膜纤维化，包括视网膜下、视网膜外和视网膜前纤维化、结膜纤维化、角膜纤维化、小梁网的纤维化和晶状体中的纤维化，以及眼任何部位因手术或损伤引起的纤维化。

在另一个实施方案中，纤维化是肾纤维化。因此，应理解为肾中存在纤维化。

在另一个实施方案中，纤维化是心脏纤维化。因此，应理解为心脏中存在纤维化。心脏纤维化可能与心脏的肌肉组织或电性能的功能障碍或心脏瓣膜壁的增厚有关。在一些实施方案中，心脏纤维化是心房和/或心室的纤维化。心脏纤维化的治疗、缓解或预防可降低心房颤动、心室颤动或心肌梗塞的风险。

在另一个实施方案中，纤维化是肠纤维化。因此，应理解为肠道系统中存在纤维化。在一个实施方案中，肠道系统中的纤维化的发展与吻合口狭窄(stenoticanastomosis)有关。在另一个实施方案中，肠道系统中的纤维化可能是手术或损伤的结果。

在另一个实施方案中，纤维化是对手术的反应。因此，应理解为纤维化是手术的结果。在一个实施方案中，纤维化的发展与吻合口狭窄有关。

在另一个实施方案中，纤维化是对损伤的反应。因此，应理解为纤维化是损伤的结果。

一些疾病涉及纤维化，并可能由纤维化引起，例如但不限于：关节纤维化；杜普伊特伦挛缩；纵隔纤维化；腹膜后纤维化；骨髓纤维化；佩罗尼氏病；粘连性囊炎；肾病(例如肾纤维化、肾病综合征、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、与系统性狼疮相关的肾炎)；进行性系统性硬化症(PSS)；慢性移植物抗宿主病；眼部疾病(例如视网膜外纤维化、视网膜纤维化、视网膜下纤维化、结膜纤维化、结膜下纤维化)；关节炎；纤维化前肿瘤和纤维化肿瘤疾病；呼吸系统病况(例如肺纤维化、囊性纤维化、特发性肺纤维化、进行性大规模纤维化和哮喘)；肝病(例如慢性肝病、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、血吸虫性肝病、肝硬化)；心血管病况(例如肥厚型心肌病、扩张型心肌病(DCM)、心房纤维化、心房颤动、心室纤维化、心室颤动、心肌纤维化、心肌炎、心内膜心肌纤维化、心肌梗塞、纤维性血管疾病、肾小管间质和肾小球纤维化、动脉粥样硬化)；神经病况(例如神经胶质增生和阿尔茨海默病)；肌营养不良症(例如Duchenne肌营养不良症(DMD)或Becker肌营养不良症(BMD))；胃肠病况(例如Chron疾病、显微镜下结肠炎和原发性硬化性胆管炎(PSC))；皮肤病况(例如硬皮病、肾原性系统性纤维化和皮肤瘢痕疙瘩)；以及由化学或环境损伤(例如，癌症化疗、杀虫剂、辐射/癌症放疗)引发的纤维化。

对肌成纤维细胞和纤维化沉积(如胶原)的影响

靶向MFAP4的选择性靶向剂能够逆转成肌纤维细胞的激活，从而防止纤维化沉积的形成，如本文公开的实施例所证明的胶原组织形成。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4-整联蛋白相互作用，用于去分化肌成纤维细胞。

用选择性靶向剂处理甚至能够逆转胶原的表达量。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4-整联蛋白相互作用，用于减少和/或逆转胶原的合成。在进一步的实施方案中，该胶原是I型胶原或III型胶原。在更进一步的实施方案中，该胶原是I型胶原。

减少是指与通常由健康组织产生的纤维化沉积(如胶原)相比，合成较少的纤维化沉积(如胶原)，而逆转是指减少组织中增加的胶原量(例如由于纤维化)至特定病理发展之前在健康组织中观察到的胶原水平。因此，可以预防或治疗以细胞外基质物质的量增加(如纤维化)为特征的组织。

选择性靶向剂

靶向MFAP4的选择性靶向剂可以具有不同的序列和不同的结合特性，但是它们能够结合MFAP4并能够阻止MFAP4结合整联蛋白。

本发明的选择性靶向剂选择性结合MFAP4，即它们优先结合MFAP4。选择性靶向剂可以选择性结合人MFAP4，但也可以可检测地结合非人MFAP4，如鼠MFAP4。或者，选择性靶向剂可以只与人MFAP4结合，没有检测到与非人MFAP4的结合。

应当理解，根据本发明使用的选择性靶向剂可以是一种类型的选择性靶向剂，或者是能够发挥类似效果的选择性靶向剂的混合物。

将不同的部分偶联至根据本发明的选择性靶向剂也可能是有利的。因此，在一个实施方案中，选择性靶向剂与可检测标记或具有毒性或治疗活性的物质偶联。

对于选择性靶向剂(如抗体)作为抗纤维化和/或抗胶原合成的药物来说，它们必须足够可溶并且不形成可能沉淀的聚集体。因此，在另一个实施方案中，选择性靶向剂主要是单体形式(在PBS，pH 7.4中测量)。“主要”应理解为至少90％的抗体为单体形式，如至少95％。

在一个实施方案中，选择性靶向剂不(直接)结合rhMFAP4中的RGD-整联蛋白相互作用序列，但仍阻断由整联蛋白连接的空间位阻所提示的MFAP4介导的活性。

在另一个实施方案中，如通过Biacore T200测量的，选择性靶向剂对rhMFAP4的K_D值低于1*10^-7，例如低于1*10^-8，或例如低于1*10^-9M，或例如在1*10^-7至1*10^-12M的范围内，例如在1*10^-7至1*10^-10M的范围内。

抗体

在一个实施方案中，选择性靶向剂是抗体。抗体应广义理解，即不仅包括完整抗体，还包括衍生物或片段。这些抗体包括人源化抗体。靶向MFAP4的抗体在本文中也被称为抗MFAP4。这些抗体可以具有不同的序列和不同的结合特性，但是它们能够结合MFAP4并能够阻止MFAP4结合整联蛋白。

抗体可以以不同的形式产生。在一个实施方案中，抗MFAP4是选自由以下组成的组的抗体或其片段：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体如人源化单克隆抗体、其中重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、单链抗体、Fc片段、Fv片段、scFv片段、双价抗体、三价抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、具有抗体CDR区的缀合物、纳米抗体、融合蛋白和Fab表达文库。在一个实施方案中，抗体是F(ab’)₂分子。在另一个实施方案中，抗体选自由单克隆抗体、Fab片段和人源化单克隆抗体组成的组。在另一个实施方案中，抗体是人源化和/或单克隆的，优选人源化单克隆抗体。

抗体的实例是

-mAS0326，具有根据SEQ ID NO:1的轻链可变区和根据SEQ ID NO:2的重链可变区

-hAS0326，具有根据SEQ ID NO:3的轻链可变区和根据SEQ ID NO:4的重链可变区

-HG Hyb 7-14，具有根据SEQ ID NO:5的轻链可变区和根据SEQ ID NO:6的重链可变区

-HG Hyb 7-5，具有根据SEQ ID NO:7的轻链可变区和根据SEQ ID NO:8的重链可变区。

在一个实施方案中，HG Hyb 7-5、HG Hyb 7-14、mAS0326和hAS0326用于根据本发明的第一方面。

在一个实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含SEQ ID NO:1、3、5或7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1、3、5或7具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性；和

·重链可变区，其包含SEQ ID NO:2、4、6或8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2、4、6或8具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性。

在一个实施方案中，抗体包含

在另一个实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性；和

·重链可变区，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性。

在另一个实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性；和

·重链可变区，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性。

在另一个实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性；和

·重链可变区，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性。

在另一个实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性；和

·重链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，或如至少95％序列同一性。

在更进一步的实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含

ο根据SEQ ID NO:9或根据其中至多五个氨基酸(如至多四个氨基酸，如至多三个氨基酸，如至多两个氨基酸，如至多一个氨基酸)不同于SEQ ID NO:9的序列的CDR 1区，条件是9位的氨基酸是Tyr；

ο根据SEQ ID NO:10或根据其中至多五个氨基酸(如至多四个氨基酸，如至多三个氨基酸，如至多两个氨基酸，如至多一个氨基酸)不同于SEQ ID NO:10的序列的CDR 2区；和

ο根据SEQ ID NO:11或根据其中至多五个氨基酸(如至多四个氨基酸，如至多三个氨基酸，如至多两个氨基酸，如至多一个氨基酸)不同于SEQ ID NO:11的序列的CDR 3区，条件是6位的氨基酸是Tyr；和

·重链可变区，其包含

ο根据SEQ ID NO:12或根据其中至多五个氨基酸(如至多四个氨基酸，如至多三个氨基酸，如至多两个氨基酸，如至多一个氨基酸)不同于SEQ ID NO:12的序列的CDR 1区，条件是3位的氨基酸是Tyr，和任选地，条件是4位的氨基酸是Met；

ο根据SEQ ID NO:13或根据其中至多五个氨基酸(如至多四个氨基酸，如至多三个氨基酸，如至多两个氨基酸，如至多一个氨基酸)不同于SEQ ID NO:13的序列的CDR 2区，任选地，条件是4位的氨基酸是Pro；和

ο根据SEQ ID NO:14或根据其中至多五个氨基酸(如至多四个氨基酸，如至多三个氨基酸，如至多两个氨基酸，如至多一个氨基酸)不同于SEQ ID NO:14的序列的CDR 3区，条件是1位的氨基酸是Glu且9位的氨基酸是Trp。

在更进一步的实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含根据SEQ ID NO:9的CDR 1区、根据SEQ ID NO:10的CDR 2区和根据SEQ ID NO:11的CDR 3区；和

·重链可变区，其包含根据SEQ ID NO:12的CDR 1区、根据SEQ ID NO:13的CDR 2区和根据SEQ ID NO:14的CDR 3区。

在仍进一步的实施方案中，抗体包含

·轻链可变区，其包含SEQ ID NO:1或3的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1或3具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如98％序列同一性，或如99％序列同一性，条件是32位的氨基酸是Tyr且94位的氨基酸是Tyr；

·重链可变区，其包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2或4具有至少80％序列同一性的序列，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少98％序列同一性，或如99％序列同一性，条件是33位的氨基酸是Trp，99位的氨基酸是Glu，107位的氨基酸是Trp，并且任选地，条件是34位的氨基酸是Met，53位的氨基酸是Pro。

应当理解，抗体可以是上述抗体的变体和/或片段。

抗体可以通过本领域技术人员公知的标准方法产生。例如，抗体可以由一种或多种载体如质粒表达。应当理解，例如轻链或重链可以由两种不同的载体表达。在一个实施方案中，载体是质粒。载体可以在细胞(如CHO细胞)中表达抗体。

抗体模拟蛋白

在一个实施方案中，选择性靶向剂是抗体模拟蛋白。在进一步的实施方案中，抗体模拟蛋白选自由以下组成的组：亲和体分子、affilin、affimer、affitin、alphabody、抗运载蛋白、avimer、DARPin、fynomer、kunitz结构域肽、knottin、monobody和nanoCLAMP。

在另一个实施方案中，选择性靶向剂是DARPin。DARPin是基因工程抗体模拟蛋白，通常表现出高度特异性和高亲和力的靶蛋白结合。

抗体模拟蛋白可以通过本领域技术人员公知的标准方法产生。

适配体

在一个实施方案中，选择性靶向剂是适配体。在另一个实施方案中，适配体选自由DNA适配体、RNA适配体、XNA适配体和肽适配体组成的组。

适配体可以通过本领域技术人员公知的标准方法产生。

组合物

选择性靶向剂可以在组合物(如药物组合物)中。因此，在第二方面，本发明涉及一种用于预防、缓解和/或治疗纤维化的组合物，其中所述组合物包含本文所述的选择性靶向剂以及一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

在一个实施方案中，所述组合物包含一种或多种稳定剂和/或一种或多种缓冲剂。在另一个实施方案中，稳定剂是表面活性剂。

施用

为了使选择性靶向剂和/或组合物能够预防、缓解和/或治疗纤维化以及减少和/或逆转胶原的产生，向待治疗的受试者提供有效量的选择性靶向剂和/或组合物。有效量取决于待治疗的受试者的尺寸以及施用的方法和疾病的严重程度。技术人员可以调整有效量。

待治疗的受试者应理解为任何能够发生纤维化的受试者。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在优选的实施方案中，哺乳动物是人。

选择性靶向剂和/或组合物可以以本领域公知的不同方式向待治疗的受试者施用。因此，在一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物通过以下方式施用：口服、肠外、静脉内、皮内、皮下、全身性、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、玻璃体内、鼻内、通过吸入、局部或通过直接或导管引导的局部器官施用。在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物以液体或固体形式施用。

在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物通过静脉内、玻璃体内或腹腔注射施用。

在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物通过注射或吸入到纤维化组织中施用。因此，选择性靶向剂和/或组合物被直接递送到受影响区域，并且因此可以局部作用于受胶原合成增加和/或纤维化影响的特定组织。这也可能导致使用较少的选择性靶向剂和/或组合物来达到类似的效果。

选择性靶向剂和/或组合物的效果可能随时间而降低，因此取决于待治疗的病况；可能需要多次施用。因此，在一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物施用至少一次，如至少两次，如至少三次，如至少四次，如至少5次，如至少6次，如至少7次，如至少8次，如至少9次，如至少10次。在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物施用三次或四次。在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物终生施用。这与慢性疾病的情况特别相关，其中选择性靶向剂和/或组合物在受试者中终生施用。

在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物通过定期注射施用。在更进一步的实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物至多每周施用一次，如至多每2周一次，如至多每4周一次，如至多每6周一次，如至多每8周一次，如至多每10周一次，如至多每12周一次，如至多每14周一次，如至多每16周一次，如至多每20周一次，如至多每6个月一次，如至多每年一次。在另一个实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物每周施用一次。

在仍进一步的实施方案中，选择性靶向剂和/或组合物通过注射每周一次施用，持续至少三周，如三周或四周。

预防或治疗纤维化的方法

在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗纤维化的方法，所述方法包括向(有此需要的)受试者施用根据本发明的选择性靶向剂或组合物。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。

在另一个实施方案中，(有此需要的)受试者被诊断患有本文所述的涉及纤维化的疾病之一。

应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。

本申请中引用的所有专利和非专利参考文献均整体通过引用的方式并入本文。

现在将在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明。

实施例

实施例1-材料和方法

人体组织

具有年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的福尔马林固定和石蜡包埋的人眼样品(总n＝6)从哥本哈根大学眼病理学研究所的组织库中检索。患者因疼痛而接受了摘除术。一些眼睛显示出浆液性视网膜下新生血管膜和/或视网膜下出血和/或视网膜周围纤维瘢痕的组织学存在。从欧登塞大学医院(Odense，丹麦)病理部的诊断生物库获得人肺腺癌组织。

使用抗MFAP4

使用MFAP4缺陷小鼠的小鼠免疫和标准杂交瘤技术产生高亲和力IgG1Mab(抗MFAP4)(Wulf-Johansson等人,2013)。

如前所述产生用于例如免疫接种的hrMFAP4(等人,2013)。

使用标准杂交瘤技术和MFAP4缺陷小鼠产生对hrMFAP4具有亲和力的单克隆抗体。

这一过程产生了一系列单克隆抗体，包括：

·针对人重组MFAP4(hrMFAP4)产生的HG Hyb 7-5鼠单克隆抗体(在例如WO 2014/114298中描述)

·针对人重组MFAP4(hrMFAP4)产生的HG Hyb 7-14鼠单克隆抗体(在例如WO2014/114298中描述)

·针对人重组MFAP4(hrMFAP4)产生的HG Hyb 7-18鼠单克隆抗体(在例如WO2014/114298中描述)

·针对人重组MFAP4(hrMFAP4)产生的mAS0326鼠单克隆抗体和选择用于人源化的抗体

·hAS0326人源化单克隆抗体(在例如WO 2019/086580中描述)

·hAS0326 Fc中和的人源化单克隆抗体，其除了重链的Fc-结构域中的点突变之外与hAS0326相似。使用本领域技术人员已知的标准技术引入这些点突变。

使用标准技术对所有抗体进行氨基酸测序。

免疫组织化学

根据制造商的说明用FITC(异构体1；Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)标记抗MFAP4(HG-HYB 7-14)。从NBF固定的石蜡包埋组织块上切下4μm厚的切片。将切片安装在FLEX IHC载玻片上(Dako；Glostrup，丹麦)，在60℃下干燥，脱蜡，并通过分级乙醇系列再水合，并随后在0.05M Tris缓冲盐水(TBS；Fagron Nordic A/S；Copenhagen,丹麦)中清洗。通过蛋白酶处理(0.05％蛋白酶XIV型；Sigma-Aldrich,St Louis,MO)进行表位检索15min。将FITC标记的抗体在抗体稀释剂(Agilent Technologies；Glostrup；丹麦)中稀释至2.5ug/ml。在室温下用抗体孵育60min，然后用1:30稀释的抗FITC-辣根过氧化物酶(HRP)(Dako，Glostrup，丹麦)孵育20min。免疫染色后，在Mayer氏苏木精(Fagron Nordic A/S；Copenhagen,丹麦)中短暂核复染。最后，对载玻片进行清洗、脱水并使用Tissue-Tek薄膜盖片机(coverslipper)(Sakura Finetek；Alphen aan den Rijn,荷兰)盖上盖玻片。

先前使用Mfap4+/+(野生型)和Mfap4-/-(基因缺陷小鼠)显示了使用抗体HG-HYB7-14对MFAP4进行免疫染色的阳性和阴性对照(Schlosser等人,2016)。

RNA原位杂交(ISH)

基本上如(Lassen等人,2017)中所述，使用RNAScope 2.5高清晰度程序的改良版本在人类组织上进行RNA ISH(Cat.No.322300,Advanced Cell Diagnostics[ACD]bioscience,Newark,CA)。

组织的4-μm切片与20个探针对(Cat.No.571221,ACD)原位杂交，该20个探针对靶向人MFAP4 mRNA(GenBank登录号:NM_002404.2)的核苷酸109-1150，随后进行分支DNA信号扩增并用Liquid Permanent Red(Cat.No.K0640；Agilent)对酪酰胺增强进行可视化。随后，用小鼠抗αSMA抗体(Cat.No.M0851；Agilent)对一些切片进行免疫染色，用HRP抗小鼠BrightVision(ImmunoLogic)检测并用Deep Space Black(BioCare)对其可视化。

ARPE-19研究

细胞培养：

在补充有10％ FBS、2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM/F-12培养基中培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19(ATCC)。细胞每3-4天传代培养一次。

细胞刺激和qPCR

将ARPE-19细胞接种(250,000个细胞/孔)在12孔板中，使其粘附8h，然后在血清饥饿状态下过夜。然后用递增浓度的rTGF-β2刺激细胞24和48h。或者，将细胞接种到MFAP4涂布的和白蛋白封闭的孔中，对其进行血清饥饿并用rTGF-β2孵育24h。在一些实验中，在接种细胞之前，用10μg/ml hAS0326(抗MFAP4)抗体孵育孔。根据制造商的说明，使用Trizol试剂提取总RNA。根据制造商的说明，使用1μg分离的RNA和M-MLV逆转录酶进行逆转录。使用Taqman Universal PCR Master Mix和Taqman Gene Expression Assay(ThermoFischerScientific)进行实时PCR，使用以下引物：hGAPDH,Assay ID:Hs99999905(Cat.No.4331182；ThermoFisherScientific)；hMFAP4,Assay ID:Hs00412974(Cat.No.4331182；ThermoFisherScientific)；hCOL1A1,Assay ID:Hs00164004(Cat.No.4331182；ThermoFisherScientific)。

粘附检测

根据制造商的说明，使用Vybrant^TM细胞粘附检测试剂盒(Molecular Probes，Invitrogen)评估细胞粘附。简而言之，用MFAP4、纤连蛋白(Sigma-Aldrich)或白蛋白(Sigma-Aldrich)涂布黑色96孔板(Nunc)，在4℃下过夜，用PBS洗涤，用10mg/ml无菌白蛋白在室温(RT)下封闭1小时，并再次洗涤。将钙黄绿素标记的细胞悬浮液以1-2·10⁵个细胞/孔上样至预涂布的板上。在一些实验中，板与10μg/ml hAS0326(抗MFAP4)或同型对照抗体(人IgG1，BioXCell)在室温下孵育1小时。在37℃孵育1小时后，用温培养基洗涤板四次，并用200μl PBS填充。使用VICTOR^TM 3多标记酶标仪(Perkin Elmer)在485/535nm处测量荧光。将所有样品标准化为仅含PBS的空白孔(Sigma-Aldrich)。

迁移检测

在4℃下，具有8.0μm孔的Transwell小室(Corning)的下侧用10μg/cm²的MFAP4或白蛋白涂布过夜，并用PBS洗涤。收集ARPE-19细胞，重新悬浮在含有0.5％ FBS的DMEM/F-12培养基中，并接种在小室的上室中(50.000个细胞/小室)。下室含有含0.5％ FBS±25ng/mlPDGF的培养基。允许细胞迁移24h，之后用PBS洗涤滤膜的上侧，并用棉签擦拭以除去任何未迁移的细胞。滤膜的下侧用Hemacolor(Sigma-Aldrich)染色，并分成四个视野。由两名独立的观察者以盲法对每个视野中的细胞进行计数。

在一些实验中，将全长hAS0326(抗MFAP4，10μg/ml)抗体加入下室中。或者，当接种细胞时，将抗整联蛋白α_Vβ₃(Millipore)、抗整联蛋白α_Vβ₅(Millipore)或同型对照抗体(小鼠IgG1，Thermofisher)加入上室中。

肝星状细胞研究

细胞培养

人类原代HSC(HHSteC,ScienCell Research Laboratories/3H biomedical)用于体外研究。细胞在星状细胞培养基+2％胎牛血清(FBS)+1％星状细胞生长补充物(SteCG，ScienCell Research Laboratories/3H biomedical)中培养。当80-90％融合时对HHSteC进行传代，并且第3代和第10代之间的HHSteC用于实验。

细胞刺激和qPCR

在MFAP4或TGF-β1刺激之前，细胞在星状细胞培养基+0％ FBS和0％SteCG中饥饿16小时。对于MFAP4刺激，在4℃下用PBS中的10μg/ml MFAP4或10μg/ml人血清白蛋白(HSA)(Sigma-Aldrich)涂布6孔板过夜。第二天，用10mg/ml HSA洗涤孔并封闭1小时。以200,000个细胞/孔的密度接种HHSteC，并孵育48小时。对于TGF-β1刺激，将HHSteC以200,000个细胞/孔的密度接种在生长培养基的6孔板中。第二天，用PBS洗涤细胞两次，并将培养基换成不含生长补充物的SteCM中的0％ FBS16小时，然后用5ng/ml重组人TGF-β1刺激细胞72h。如上所述进行实时PCR。

粘附检测

黑色96孔Maxisorb板在4℃下用在PBS中的10μg/ml重组人MFAP4(rhMFAP4)、10μg/ml人牛血清(HSA)(Sigma-Aldrich)和10μg/ml纤连蛋白(FN)(Sigma-Aldrich)涂布过夜。第二天，用10mg/ml HSA洗涤孔并封闭1小时。为了阻断MFAP4，在接种细胞之前，将固定化的rhMFAP4与20μg/ml抗MFAP4抗体hAS0326在室温下孵育1h。对于评估涉及RGD位点和整联蛋白的实验，细胞在室温下与以下物质一起孵育30min：合成的100μg/ml RGD(Sigma-Aldrich)或100μg/ml DGR肽(用作对照的RGD的改良形式)(Sigma-Aldrich)或10μg/ml的抗整联蛋白αvβ3(Sigma-Aldrich)、αvβ5(Sigma-Aldrich)、αvβ6(Sigma-Aldrich)或同型对照(IC)(抗卵清蛋白,HYB099-01；Statens Serum Institut,Copenhagen,丹麦)。

Vybrant细胞粘附检测试剂盒(Molecular Probes，Invitrogen)用于细胞粘附的定量。使用胰蛋白酶分离细胞，并重新悬浮于含有5μM钙黄绿素AM染料的无血清培养基中，达到5百万细胞/ml，并在37℃下孵育30min。孵育后，用PBS洗涤细胞两次，以100,000个细胞/孔的密度接种，并在37℃下孵育1h。然后洗涤细胞，向每个孔中加入200μl PBS，使用Gudlaug-荧光素(485nm/535nm，1.0s)方案在victor酶标仪上测量荧光。

迁移检测

在4℃℃下，用10μg/ml rhMFAP4或HSA过夜涂布孔径为8-μm的transwell小室的膜下侧。将HHSteC(100,000个细胞/小室)接种于无血清培养基的上室中，并允许它们迁移3h至含有无血清培养基+/-100ng/ml血小板衍生生长因子(PDGF)(R&D systems)的下室中。对于MFAP4阻断实验，将10μg/ml的hAS0326或10μg/ml的同型对照(IC)加入下室中。对于测试RGD位点和整联蛋白作用的实验，在接种细胞前，在室温下用以下物质预孵育细胞30min：合成的100μg/ml RGD或DGR肽或10μg/ml抗整联蛋白αvβ3或同型对照(IC)(抗卵清蛋白，HYB099-01；Statens Serum Institut,Copenhagen,丹麦)。用棉签除去未迁移的细胞。使用Hemacolor(Sigma-Aldrich)对迁移到膜下侧的细胞进行染色，并使用具有20倍物镜的Olympus IX73显微镜对每个滤膜的4个视野中的细胞进行计数。

CCl₄诱导大鼠肝纤维化

动物实验

从Janvier实验室获得雄性Sprague Dawley大鼠(200-225g)，并对其进行12小时的光暗循环，并提供自由获取的水和食物。由四氯化碳(CCL₄)(Sigma)+苯巴比妥中毒诱导肝纤维化。在CCL₄处理前两周，将35mg/dl苯巴比妥加入大鼠的饮用水中。然后停止苯巴比妥施用。此后，通过口服管饲法每周一次向大鼠施用橄榄油中的CCL₄或单独的橄榄油。橄榄油中CCL₄的第一剂量为412mg/Kg(第0天)。为了降低死亡率，如表1所示，根据前一周的体重变化调整以下CCL₄剂量。在第20天，大鼠静脉内接受其第一抗MFAP4抗体hAS0326 Fc中和(如Schlothauer等人,2016所述的Fc中和)剂量，20mg/kg。此后，它们在第27天和第34天接受2剂5mg/kg的抗MFAP4。在第38天，对大鼠实施安乐死，将肝脏和脾脏整块切下并称重。来自左叶和右叶的肝脏标本固定在福尔马林中用于免疫组织化学分析，或者在液氮中快速冷冻用于进一步分析，如肝羟脯氨酸测定、RNA和蛋白质提取。

表1：CCL₄处理方案

每周体重变化	施用剂量
		增加0-5g	与前一剂量相同
增加6-10g	前一剂量的125％
		增加>10g	前一剂量的150％
减少1-5g	前一剂量的75％
		减少6-10g	前一剂量的50％
减少>10g	无剂量

从肝组织中提取蛋白质

冷冻组织在液氮中研磨，并在PBS+10mM EDTA+蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)中孵育，然后离心(10000g，10分钟)。收集上清液，通过Bradford检测(Biorad)测定总蛋白量。从每个样品中取出0.1mg/ml的总肝蛋白，通过ELISA测定MFAP4水平。

通过ELISA检测血清和肝组织中MFAP4水平

通过在4℃下在PBS中孵育过夜，用1μg/ml抗MFAP4抗体HYB 7-18涂布96孔MaxiSorb板。每个步骤之后，在PBS 0.05％吐温20中进行四轮洗涤。洗涤缓冲液也用于通过在RT下孵育1h进行封闭。第二天，将稀释在洗涤缓冲液中的100μl/孔的样品和标准品加入板中，并在室温下在轨道振荡器(300rpm)上孵育2h。此后，加入在洗涤缓冲液中的0.5μg/ml生物素化的抗MFAP4 HYB 7-14，并在RT下振荡孵育1h。在洗涤缓冲液中以1:2000稀释链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶(Invitrogen)，并在RT下孵育半小时。最后，将溶解在用于HRP+H₂O₂(使用前加入)的酶底物缓冲液中的邻苯二胺二盐酸盐(OPD)(Thermo FisherScientific)加入板中，并在室温下在黑暗中反应15分钟。然后将100μl/孔的1M H₂SO₄加入板中以停止显色。以620nm作为参照，在492nm波长处读取光密度。

mRNA的分离、逆转录酶和实时PCR

通过与Trizol试剂(Sigma)孵育，从液氮研磨的冷冻肝组织中提取总RNA。根据制造商的说明(Thermo Fisher Scientific)将总RNA逆转录成互补DNA。使用以下TaqMan探针通过实时PCR测试基因表达，这些探针均获自Thermo Fisher Scientific：COL1A1Rn01463848_m1、ACTA2 Rn01759928_g1、IL1β Rn00580432_m1、TGFβ1 Rn00572010_m1、TIMP1 Rn01437681_m1、MFAP4 Rn1452830_g1。相对表达水平被标准化为Tbp Rn01455648_m1。

实施例2-MFAP4和器官纤维化

目的

研究纤维组织中MFAP4的存在。

材料和方法

参见实施例1

结果

图1使用免疫组织化学证明MFAP4在不同类型的器官纤维化(如肺、肾和肝脏)中积累(图1A-C)。

MFAP4由肌成纤维细胞合成，肌成纤维细胞是一种中央纤维化细胞类型。这例如在图1D-E中通过原位杂交证明。患有视网膜下纤维化沉积的人眼的代表性样品(图1D)显示了肌成纤维细胞中Mfap4 mRNA的表达。类似地，这在肺腺癌中得到证明(图1E)。

结论

肌成纤维细胞的激活正是纤维化过程的基础。这些数据表明MFAP4在纤维组织和肌成纤维细胞中积累。

实施例3-使用抗MFAP4的ARPE19细胞中表型的可逆性

目的

研究抗MFAP4处理对来自视网膜的肌成纤维细胞样细胞(ARPE19)的作用。

材料和方法

参见实施例1

结果

MFAP4的合成可以在来自不同器官的肌成纤维细胞样细胞中体外诱导。视网膜色素上皮细胞(ARPE19)转分化的TGF-β诱导导致MFAP4(MFAP4)mRNA(图2A)和Col1a1(1型胶原)mRNA(图2B)的合成增加。

当将这些细胞接种在MFAP4涂布的表面上时，MFAP4直接导致这些细胞在粘附(图2C)、有无PDGF增强情况下的迁移(图2D)和1型胶原合成(图2E)方面的激活。D和E中的数据与MFAP4在粘附中的作用无关。

用抗MFAP4处理表明这种激活可以被逆转(图2C和F)。

结论

当ARPE-19细胞转化为肌成纤维细胞时，MFAP4似乎被肌成纤维细胞活性上调。这种转化产生迁移性肌成纤维细胞，其可以渗透到损伤区域并沉积胶原质隔膜，因为也显示出胶原的产生增加。然而，结果证明用抗MFAP4处理逆转了这种表型，包括减少I型胶原的产生。因此，证明抗MFAP4可以防止纤维组织的形成。

实施例4-使用抗MFAP4的原代肝星状细胞中表型的可逆性

目的

研究抗MFAP4处理对来自肝脏的肌成纤维细胞样细胞的作用。

材料和方法

参见实施例1

结果

MFAP4合成同样在原代肝星状细胞中被诱导(图3A)。当这些细胞在体外生长时，它们自发地转分化成肌成纤维细胞样细胞，并且用TGF-β处理可以进一步增强分化。与此一致，MFAP4的合成随着培养时间和TGF-β处理而增强。

此外，MFAP4直接导致这些细胞在粘附方面的激活(图3B)。此外，当将细胞接种在MFAP4涂布的表面上时，观察到1型胶原合成增强的趋势(图3C)。此外，无论有无PDGF增强，MFAP4都增加了细胞迁移(图3D-F)。C-F中的数据与MFAP4在粘附中的作用无关。

用抗MFAP4处理，迁移激活是可逆的(图3E)。

此外，还证明了这种作用是通过RGD依赖性整联蛋白介导的，如用竞争性RGD-肽而不是RGD-肽进行特异性阻断迁移所示(图3F)。

结论

当原代肝细胞分化为肌成纤维细胞样细胞时，MFAP4似乎被肌成纤维细胞分化和激活上调。这种转化产生迁移性肌成纤维细胞，其可以渗透到损伤区域并沉积胶原质隔膜，因为也显示出胶原的产生增加。然而，结果证明用抗MFAP4处理逆转了这种表型，包括减少I型胶原的产生。因此，证明抗MFAP4可以防止纤维组织的形成。

实施例5-用抗MFAP4处理大鼠中诱导的肝纤维化

目的

研究抗MFAP4处理对肝纤维化的作用。

材料和方法

参见实施例1

结果

大鼠肝纤维化通过两周饮用水中的苯巴比妥诱导，随后通过口服管饲法进行6周四氯化碳(CCl₄)处理。在第38天被处死之前，大鼠在第20、27和34天接受总共三次IV剂量的抗MFAP4或载体处理(图4A)。这导致降低了大鼠体重，但没有降低肝脏与体重的比率，但是显著增加了脾脏与体重的比率(代表门静脉高压)，并且这种作用通过抗MFAP4处理而显著降低(图4B-D)。

MFAP4的免疫检测在模型肝组织中显著诱导并在该组织中显著降低(图4E)，而在抗MFAP4处理后在(图4F)血液中不显著降低。纤维化和炎症标志物的相对mRNA表达通过该模型在大鼠肝组织中诱导，并通过抗MFAP4处理降低，其中该标志物为1型胶原(Col1A1)mRNA(图4G)、α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)(图4H)、IL-1b(IL1b)(图4I)、TGF-β1(TGFb1)(图4J)、TIMP-1(TIMP1)(图4K)和MFAP4(MFAP4)(图4L)mRNA。

结论

这些数据表明，对诱导了肝纤维化的大鼠的处理显示出处理后I型胶原减少，表明纤维组织的形成减少。

因此，目前的数据表征了一种新的和独特的机制，其中治疗性单克隆抗体(Mab)密集地固定在纤维化沉积中，从而为病理学中的中央细胞(肌成纤维细胞)分离细胞并屏蔽必要的机械传感，激活来自细胞外基质(ECM)微环境的信号。

这种新方法的优点是解决了肌成纤维细胞的激活，尽管生长因子和细胞因子表达发出了激活信号。肌成纤维细胞的激活正是整个纤维化过程的基础。转化产生迁移性肌成纤维细胞，其渗透到损伤区域并沉积胶原质隔膜。在各种类型的器官纤维化中，MFAP4似乎被肌成纤维细胞活性上调。因此，新的抗MFAP4Mab对纤维化的多价病因具有潜在的适用性。

实施例6-抗MFAP4抑制实验性肝纤维化

目的

研究MFAP4在HHSteC生物学调节中的作用，并进一步研究抗MFAP4对实验性肝纤维化的抑制功效。

材料和方法

标准缓冲液

EDTA：0.5M、Na₂EDTA 2H₂O(6M凝胶)；10g NaOH(Merck)pH 8。PBS：8mM Na₂H₂PO₄、1.5mM KH₂PO₄、140mM NaCl、0.003mM KCl、pH 7.4。PBS/吐温：含0.05％吐温20的PBS。辣根过氧化物酶(HRP)底物缓冲液：35mM柠檬酸、67mM Na₂HPO₄、pH 5.0。

细胞培养

在补充有2％胎牛血清(FBS，0010，Sciencell)、1％星状细胞生长补充物(SteCG，5352，Sciencell)和1％青霉素-链霉素(P/S，0503，Sciencell)的星状细胞培养基(SteCM，5301，Sciencell)中培养原代人肝星状细胞，并维持在5％CO₂、37℃下。当80-90％融合时对细胞进行传代，并在第3代和第10代之间进行实验。在MFAP4和/或TGF-β1刺激之前，细胞在含0％ FBS和0％ SteCG的SteCM中饥饿16小时。对于MFAP4刺激，在4℃下用在PBS1x(Sigma-Aldrich)中的10μg/ml重组人MFAP4(rhMFAP4)或人血清白蛋白(HSA，Sigma-Aldrich)涂布6孔板过夜。第二天，用10mg/ml的HSA洗涤孔并封闭1小时。然后，将HHSteC以200,000个细胞/孔的密度接种于含有0.5％ FBS+/-TGFβ1(5ng/ml，240-B010，R&D systems)的SteCM中72小时，然后分离mRNA以评估基因表达。为了检测激活后HHSteC表达的MFAP4，以200,000个细胞/孔的密度接种HHSteC，并用TGFβ1(5ng/ml)在补充有0.5％的SteCM培养基中刺激24、48和72h。对于每个时间点，收集细胞上清液用于通过ELISA检测MFAP4表达，并分离mRNA用于评估基因表达。

粘附检测

在4℃下，用在PBS中的10μg/ml rhMFAP4、纤连蛋白(FN，Sigma-Aldrich)或HSA涂布黑色96孔Maxisorp FluroNunc^TM微量滴定板(Nunc)过夜。第二天，用10mg/ml HSA洗涤板并封闭1h。为了阻断MFAP4，在接种细胞之前，将固定化的rhMFAP4与20μg/ml的抗MFAP4抗体(hAS0326)在室温下孵育1h。为了研究RGD基序和整联蛋白在MFAP4-细胞相互作用中的参与，将HHSteC与以下物质在室温下培养30分钟：100μg/ml的合成GRGDS或SDGRG肽(Sigma-Aldrich)或10μg/ml的抗整联蛋白α_vβ₃(克隆LM609,Merck)、抗整联蛋白α_vβ₅(克隆P1F6,Merck)或同型对照(IC,抗卵清蛋白,HYB099-01；Statens Serum Institute,Copenhagen,丹麦)。使用Vybrant细胞粘附试剂盒(Molecular probes，Invitrogen)对细胞粘附进行定量。简而言之，使用标准胰蛋白酶分离细胞，并在37℃下在含有钙黄绿素AM染料(5μM，5百万个细胞/ml)的无血清培养基中孵育30分钟。然后，用PBS洗涤细胞两次，以100,000个细胞/孔的密度接种。在37℃下孵育1h后，洗涤板并加入200μl/孔的PBS。使用Victor^TM 3酶标仪(Perkin Elmer)测量荧光(λ激发＝485nm，λ吸收＝535nm)。

迁移检测

使用具有8μm孔径的聚酯滤膜(Corning)的transwell小室进行细胞迁移检测。在4℃下用在PBS中的10μg/ml rhMFAP4或HSA涂布滤膜的下侧过夜。将HHSteC以50,000个细胞/小室的密度接种在transwell小室的上室的无血清培养基中，并允许其向含有无血清培养基+/-血小板衍生生长因子-BB(PDGF)(100ng/ml，R&D systems)的下室迁移3h。对于MFAP4阻断实验，将10μg/ml的抗MFAP4抗体(hAS0326)或IC加入下室中。为了研究RGD基序和整联蛋白在MFAP4介导的细胞迁移中的作用，在接种细胞之前，将HHSteC与100μg/ml合成GRGDS和SDGRS肽或10μg/ml抗整联蛋白α_vβ₃或IC一起在室温下孵育30分钟。3h后，用棉签除去滤膜上侧的未迁移细胞。使用连续加入的Hemacolor染色溶液1、2和3(111955、111956、111957，Merck)固定和染色滤膜下侧的迁移细胞，并使滤膜干燥过夜。第二天，使用Olympus IX73显微镜，用20倍物镜对每个滤膜的4个不同视野中的细胞进行计数。

增殖检测

使用WST-1检测评估细胞增殖。在4℃下，用10μg/ml rhMFAP4或HSA涂布96孔组织培养板(Nunc)过夜。HHSteC在SteCM培养基中血清饥饿16小时。第二天，洗涤板并在室温下用10mg/ml HSA封闭1h。将细胞以14,000个细胞/孔的密度接种在含0.5％ FBS的STeCM培养基中，并在37℃下孵育4、24、48或72h。在每个时间点向孔中加入10μl细胞增殖试剂WST-1(Sigma-Aldrich)/100μl培养基。在37℃下孵育2h后，通过使用ELISA酶标仪(TECAN)测量参考波长690nm下450nm处的吸光度来定量甲臜染料(四唑盐WST-1裂解的产物)。

大鼠肝纤维化模型

从Janvier实验室获得雄性Sprague Dawley大鼠(200-225g)，并对其进行12小时的光暗循环，并不限制地提供自由获取的水和食物。使用苯巴比妥+四氯化碳(CCl₄)中毒诱导肝纤维化。

在CCl₄处理前两周，大鼠在饮用水中接受0.35mg/ml的苯巴比妥。此后，通过口服管饲法每周一次对大鼠施用橄榄油(Sigma-Aldrich)中的CCl₄(Sigma)，持续6周。CCl₄的第一剂量为412mg/kg(第0天)。为了降低死亡率，根据前一周的体重变化调整以下CCl₄剂量。对照组通过口服管饲法接受橄榄油，每周一次，持续6周，不接受苯巴比妥。在第20天，通过尾静脉内注射，CCl₄和苯巴比妥处理的大鼠接受其负荷剂量的抗MFAP4抗体hAS0326 Fc中和(如Schlothauer等人，2016所述的Fc中和)或载体对照(10mM组氨酸10％海藻糖)。此后，它们在第27天和第34天接受两次后续维持剂量的抗MFAP4抗体hAS0326 Fc中和或载体对照。在第38天，通过过量CO₂处死大鼠。

验证小鼠肝纤维化模型

购买雄性(C57Bl6/J)小鼠(12周龄)(Charles River Laboratories ResearchModel and Services Germany，Sulzfeld，德国)。动物被关在22℃的独立通风笼中，昼夜循环12:12小时。通过吸入CCl₄暴露7周(前4周每周一次，随后3周每周两次中毒)诱导肝损伤。简而言之，CCl₄以2l/min的流量吹入1min，笼子再保持关闭1分钟，最后在通风橱下10min除去CCl₄。CCl₄由高脂肪富含胆固醇饮食(WD；Ssniff)补充或CCl₄单独施用。不限制地提供水和食物。所有CCl₄中毒的动物额外地通过饮用水接受苯巴比妥(0.33g/l)作为细胞色素P-450代谢活性的诱导剂。在所有实验中使用年龄匹配的未处理的对照小鼠。在第5周，通过尾静脉内注射，20只CCl₄处理的小鼠接受两次负荷剂量的抗MFAP4抗体hAS0326 Fc中和(如Schlothauer等人，2016所述的Fc中和)或载体对照(10mM组氨酸10％海藻糖)。此后，它们在第6周和第7周都接受两次后续维持剂量的抗MFAP4抗体hAS0326 Fc中和或载体对照。在安乐死之前，小鼠通过腹膜内注射接受氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉(100mg氯胺酮/kg体重和10mg甲苯噻嗪/kg体重)。将肝脏样品固定在甲醛(4％)中，随后分别包埋在石蜡中或固定在TissueTek OCT(Sakura Finetek Germany，Staufen，德国)中。该试验由德国Goethe-Frankfurt am Main,Medical Department I的Jonel Trebicka教授的独立实验室进行。

血液和组织收集

从大鼠动物模型中，通过心脏穿刺收集血液。将肝脏和脾脏整块切下并称重。来自左叶和右叶的肝标本固定在福尔马林中用于免疫组织化学分析，或者在液氮中快速冷冻用于进一步分子分析。

肝匀浆的制备及蛋白质提取

将冷冻的肝脏在液氮中研磨直至获得粉末，将50-100mg研磨的组织转移到新鲜的Eppendorf管中，并在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche)的PBS+10mM EDTA中匀浆，随后以10,000g离心10分钟。收集上清液，并根据制造商的说明使用DC^TM蛋白质检测法(Bio-rad)测定总蛋白质浓度。

通过ELISA测量MFAP4

使用夹心ELISA测定血清、肝匀浆和HHSteC上清液中MFAP4的表达。在4℃下用1μg/ml的抗MFAP4抗体HG-HYB7-18(用于检测大鼠MFAP4)/HG-HYB 7-5(用于检测人MFAP4)涂布96孔Maxisorb微孔板(Nunc)过夜。第二天，洗涤板并在室温下用PBS/吐温封闭1h。将在PBS/吐温中稀释的100μl/孔的样品和标准品(rhMFAP4)加入板中，并在室温下在轨道振荡器上孵育2h。此后，将在PBS/吐温中稀释的0.5μg/ml生物素化的抗MFAP4抗体HG-HYB 7-14(用于大鼠MFAP4)/HG-HYB 7-18(用于人MFAP4)加入板中，并在室温下振荡孵育1h。然后，将板与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素(1:2000，在PBS/吐温中稀释，Invitrogen)在室温下连续孵育半小时，将邻苯二胺二盐酸盐(OPD)(0.4mg/ml，H1009，Sigma)溶解在具有0.03％ H₂O₂的HRP中，在室温下黑暗中孵育15min。最后，加入100μl/孔的1M H₂SO₄以停止显色。使用ELISA酶标仪，以620nm作为参照，在492nm波长处读取光密度。

大鼠肝脏中羟脯氨酸的测定

根据制造商的说明，使用羟脯氨酸比色检测试剂盒(K555，Biovision)从左右叶的2个快速冷冻切片测量羟脯氨酸(HYP)。

肝酶的测量

根据制造商的说明，使用商业试剂盒测量大鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性(对于ALT来说是MAK052；对于AST来说是MAK055，Sigma)。

定量实时PCR

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从匀浆的肝组织(来自左右叶的2个快速冷冻切片)或从HHSteC提取总RNA。使用高容量逆转录酶试剂盒(Thermo Fisher)将1-2μg RNA逆转录成互补DNA(cDNA)。使用表2中所示的TaqMan universal PCR master mix(Invitrogen)和TaqMan基因表达检测法(Thermo Fisher)，通过实时PCR对相对基因表达进行定量。

表2：用于qPCR的TaqMan检测

免疫组织化学分析

将肝组织在10％中性缓冲福尔马林中固定24h，然后转移至含有0.05％叠氮化钠(S2002,Sigma)的PBS1x中。将石蜡包埋的组织块切成4μm厚的切片，在60℃下干燥，在二甲苯中脱蜡，并在分级乙醇中水合。内源性生物素的反应性被1.5％过氧化氢阻断。

进行不同的抗原修复技术，然后与相应的抗MFAP4、α-SMA、CD11b和CD31的初级抗体一起孵育。表3详细说明了所用的抗体和抗原修复技术的细节。对于FITC缀合的抗体，使用多克隆兔抗FITC二抗(P5100，DAKO)并用山羊抗兔HRP标记的抗体(Envision+K4003，DAKO)对其可视化。对于CD11b染色，使用山羊抗兔HRP标记的抗体(Envision+K4003，DAKO)作为二抗。CD31和抗MFAP4抗体(hAS0326 Fc中和)染色分别使用OmniMap抗兔-HRP和OmniMap抗山羊-HRP检测系统(Ventana Medical Systems)进行可视化，在DiscoveryUltra免疫染色器(Ventana Medical Systems)上自动化。使用天狼星红进行胶原染色。

表3：用于免疫组织化学的初级抗体、稀释和抗原修复技术的列表

FITC：异硫氰酸荧光素，TEG缓冲液：10mM Tris；0.5mM EGTA，pH 9.0；CC1：细胞调节溶液1(pH 8.5；Ventana Medical Systems)，CC1_X_X：CC1_孵育的分钟_摄氏度。

RNA原位杂交

使用RNA scope 2.5高分辨率程序的修改版本在大鼠肝组织上进行RNA原位杂交。简而言之，将4μm切片与覆盖大鼠MFAP4 mRNA(NM_001034124.2)的366-1417之间区域的核苷酸的20个ZZ探针对(Advanced Cell Diagnostics，ACD)原位杂交，随后进行硫胺素信号放大，并用液体永久红(K0640，Agilent)对其可视化。

图像采集和定量

使用NanoZoomer-XR(Hamamatsu photonics；Hamamatsu City,日本)以40倍放大扫描免疫组织化学切片，并且使用NDP.view2软件(NanoZoomer Digital Pathology；Hamamatsu Photonics)进行图像采集。代表图像的对比度在Adobe Photoshop 2021中自动调整。

在每张载玻片的8个随机非重叠视野中进行天狼星红定量(使用NDP.view2软件以2.5倍放大获得图片)。在每张载玻片的9-11个随机非重叠视野中进行α-SMA定量(使用NDP.view2软件以2.5倍放大获得图片)，在每张载玻片的7-9个随机非重叠视野中进行CD11b定量(使用NDP.view2软件以5倍放大获得图片)，在肝小叶实质区域(不包括门户区域)的每张载玻片的15-17个随机非重叠视野中，通过CD31免疫组织化学染色的定量来评估窦毛细血管化(使用NDP.view2软件以20倍放大获得图片)。使用阈值技术，用ImageJ软件计算天狼星红、α-SMA、CD11b和CD31阳性面积，作为相对于相应区域中总像素采用的阈值以上像素的百分比。

统计学分析

在prism 8软件中进行统计分析。数据以平均值+SEM表示。使用Shapiro-Wilk检验和QQ图表检查数据的正态性。使用Student t检验、单向或双向方差分析(ANOVA)以及Tukey多重比较检验对参数结果进行分析。使用Mann-Whitney检验或Kruskal-Wallis检验分析非参数结果。

结果

MFAP4通过RGD-整联蛋白αvβ3依赖机制介导HHSteC体外粘附和迁移

基于荧光的粘附检测显示，HHSteC在1h内粘附至固定的rhMFAP4上，达到阳性对照纤连蛋白的水平，而在HSA(阴性对照)上未检测到粘附。此外，使用特异性人源化抗MFAP4抗体hAS0326阻断MFAP4，完全抑制HHSteC与rhMFAP4的附着(图5A)。为了评估MFAP4-RGD基序(一种整联蛋白配体)在MFAP4和HHSteC相互作用中的参与，将细胞与合成的RGD肽预孵育，该肽封闭RGD依赖性细胞整联蛋白的胞外结构域，或者与作为阴性对照的其对应物DGR肽预孵育。在RGD肽存在下，对rhMFAP4的细胞粘附显著降低，而对照DGR并非如此(图5B)。

HHSteC与抗整联蛋白αvβ3的预孵育抑制了与rhMFAP4的细胞粘附，而在存在抗整联蛋白αvβ5封闭抗体的情况下，没有观察到细胞粘附的显著减少(图5C)。表明整联蛋白αvβ3是HHSteC上主要的MFAP4受体。

为了评估HHSteC对MFAP4刺激的迁移反应，使用transwell小室进行了迁移检测。结果显示，在存在或不存在血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)作为HHSteC的化学引诱物的情况下，相对于HSA，HHSteC在MFAP4涂布的小室上的3小时迁移显著增加(图5D)。此外，抗MFAP4抗体完全消除了HHSteC向MFAP4的迁移(图5E)。这种细胞向固定分子梯度迁移的机制被称为趋化作用(haplotaxis)。为了进一步了解MFAP4诱导的对HHSteC的趋化作用并确定该机制中涉及的成分，将细胞与合成的RGD肽或抗整联蛋白αvβ3封闭抗体一起孵育，这些抗体显著降低了HHSteC对MFAP4刺激的迁移反应(图5F-G)。表明MFAP4通过RGD-整联蛋白αvβ3结合与HHSteC相互作用是MFAP4衍生的HHSteC趋化活性(haptotaxic activity)所必需的。

HHSteC在TGFβ1刺激下合成MFAP4，并增强TGFβ1在体外对HHSteC的促纤维化作用

HHSteC中的MFAP4合成在TGFβ1刺激的细胞中显著上调，呈现与代表细胞激活的α-SMA和1型胶原表达增加并行的时间依赖性(图6A-D)。

为了研究MFAP4对HHSteC转分化的影响，在存在或不存在TGFβ1刺激的情况下，HHSteC在MFAP4或HSA(阴性对照)涂布的孔中。在TGFβ1不存在的情况下，MFAP4不能诱导HHSteC激活，而在TGFβ1存在的情况下，与HSA上TGFβ1刺激的细胞相比，MFAP4通过ACTA2和Col1A1的上调增强HHSteC激活，这表明TGFβ1和MFAP4在体外对HHSteC激活发挥协同作用(图6E-F)。

为了研究MFAP4对HHSteC增殖的影响，将细胞接种到rhMFAP4上，并允许增殖24、48或72h。HHSteC增殖随时间显著增加，然而对于每个相应的时间点，其与接种在HSA上的细胞的增殖模式没有显著差异，表明MFAP4不是激活的HHSteC增殖的关键诱导物(图6G)。

大鼠肝纤维化模型中MFAP4的表达增加，并与α-SMA阳性细胞共定位

在用苯巴比妥预处理2周的大鼠中，通过口服管饲法用CCl₄中毒诱导肝纤维化6周。免疫组织化学分析显示α-SMA染色和胶原沉积上调，表明成功建立了肝纤维化模型(数据未显示)。原位杂交分析显示了在纤维化肝脏中MFAP4的诱导，其表达与α-SMA表达模式重叠(数据未显示)，表明α-SMA阳性细胞在整个纤维化过程中活化后是MFAP4的主要生产者。

此外，肝匀浆中MFAP4水平显著上调，mRNA表达相应增加，而血清中MFAP4水平不显著上调(图7A-C)。

MFAP4的抗体介导靶向降低促纤维化标志物的基因表达

为了研究MFAP4中和对肝纤维化进程的影响，大鼠在CCl₄施用后第20、27和34天接受抗MFAP4(一次负荷剂量为20mg/ml，两次维持剂量为5mg/ml)或载体对照(组氨酸/海藻糖)的静脉注射(图8A)。抗MFAP4抗体的免疫组织化学染色揭示了与MFAP4表达相同的模式，证实了抗MFAP4抗体对靶向MFAP4的高特异性(数据未显示)。

有趣的是，与CCl₄+载体组相比，在CCl₄+抗MFAP4处理组中观察到脾脏/体重比显著降低，在CCl₄+载体组中，脾脏/体重比相对于对照(橄榄油)被显著诱导(图8C-D)。然而，在CCl₄诱导的肝损伤后上调的AST和ALT水平(肝功能的标志物)在抗MFAP4后没有改变(图8E-F)。

另一方面，抗MFAP4显著抑制CCl₄诱导的促纤维化标志物的上调基因表达，最重要的是Col1A1、TIMP1、ACTA2、TGFβ1和MMP2，并显示出减少其他促纤维化和促炎标志物IL1β和MFAP4的趋势(图9A-H)。

阻断MFAP4保护CCl₄诱导的肝损伤后的纤维化进程

肝纤维化是一个复杂的多步骤过程，涉及不同类型的细胞之间的相互作用，以及特征明确的事件(如炎症、血管生成和最重要的源于过度胶原沉积和纤维化的ECM重塑)的进程。为了理解MFAP4参与肝纤维化进程的机制，针对该疾病的不同方面。与基因表达结果一致，在抗体处理组中，通过天狼星红染色检测的胶原沉积(图10A)以及α-SMA表达(图10C)与载体对照相比显著降低，表明激活的肌成纤维细胞减少，然而在羟脯氨酸的量中没有检测到差异(图10B)。

通过CD11b阳性细胞染色检测巨噬细胞浸润。对CCl₄处理的大鼠施用抗MFAP4显示出CD11b阳性细胞浸润减少的趋势，其代表激活的巨噬细胞的群体，但与接受载体对照的CCl₄处理的大鼠相比没有显著差异(图10D)。

肝窦的毛细血管化是肝纤维化中发生的血管结构破坏的标志，其中肝窦内皮细胞(LSEC)松动其穿孔，并获得CD31表达增加的血管表型。量化实质区域中的CD31阳性面积，揭示了与CCl₄+载体组肝脏相比，接受抗MFAP4的CCl₄处理的大鼠中的窦毛细血管化显著减少(图10E)。

使用小鼠模型来验证抗MFAP4在另一物种和非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD/NASH)肝纤维化模型中的抗纤维化功效。该模型支持抗MFAP4的静脉内干预显著减少了患病肝脏中的胶原沉积(图11)。

结论

MFAP4介导细胞粘附并增强PDGF介导的HHSteC体外迁移。这些作用在抗MFAP4抗体、抗整联蛋白αvβ3或RGD肽的存在下被逆转。此外，HHSteC在TGFβ1刺激下合成MFAP4，并增强TGFβ1在体外对HHSteC的促纤维化作用。

在苯巴比妥+四氯化碳(CCl₄)中毒8周后建立大鼠肝纤维化实验模型。在CCl₄施用期间，大鼠从第5周到第8周接受抗MFAP4抗体或载体对照的静脉注射。

CCl₄+苯巴比妥中毒增加大鼠血清和肝脏中MFAP4的表达。抗体介导的对MFAP4的阻断减少了肝脏中促纤维化标志物的基因表达，包括Col1A1、Acta2、Tgfβ1、Mmp2和Timp1。其降低了通过胶原沉积定量(天狼星红染色)评估的胶原沉积，通过α-SMA免疫组织化学染色定量评估的肌成纤维细胞激活，其限制了通过肝实质区域中CD31 IHC表达评估的窦毛细血管化。未观察到对代表巨噬细胞浸润的CD11b表达的显著影响。在非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎(NAFLD/NASH)小鼠模型中验证了抗MFAP4介导的胶原沉积减少。实施例7-抗MFAP4抑制实验性化学诱导的吻合口狭窄形成

目的

为了研究抗MFAP4对吻合口狭窄的抑制功效，其中吻合口狭窄可能是手术诱导的纤维化的结果。

材料和方法

研究设计

本研究设计为安慰剂对照试验，包括18只雌性小猪。在该研究中，在第一天，在每只小猪身上建立两个手工缝合的吻合口。在16个预先确定的浆膜下储库(depot)中，用0.8ml硬化剂乙氧基硬化醇(aethoxysclerol)(0.05mg/ml)注射所有吻合口。

在第14天，在相同的预先确定的浆膜下储库中，9只小猪接受0.8ml安慰剂，9只小猪接受0.8ml抗MFAP4抗体(hAS0326)。安慰剂由10mM组氨酸10％w/w海藻糖pH 6.0缓冲液(载体)组成。以40mg/ml的浓度施用抗MFAP4。术后第28天，提取吻合口并进行分析。由病理学家盲法评估组织病理学。

动物

使用总共18只约20kg的断奶雌性小猪。在试验前，动物适应其新环境至少一周。在恒温20-21℃下，它们被饲养在常规的大型动物饲养设施中。光/暗循环：12小时内光线逐渐变暗，自然光从窗户射进来。获得食物：每天两次(0.9kg/20kg体重)并自由饮水。为了确保动物的福利，每天对小猪进行严格的检查。

麻醉、术后治疗和安乐死

麻醉前镇静是肌内施用0.2mg/kg咪达唑仑(Midazolam Hameln,Hameln PharmaPlus GmbH,Hameln,德国)、0.04mg/kg美托咪定(Sedator,Novartis,Copenhagen,丹麦)、0.03mg/kg丁丙诺啡(Temgesic,Indivior,Berkshire,英国)和0.05mg/kg阿托品(Atropin,Amgros I/S,Copenhagen,丹麦)的组合。

用5mg/kg丙泊酚(B.Braun Medical A/S,Copenhagen,丹麦)通过耳静脉进行静脉注射(iv)来加深麻醉，并用4.0号袖带管插管。用2.1％异氟烷(Isofluran Baxter,BaxterA/S,丹麦)、在MCM 801呼吸机(Dameca,/>丹麦)上在氧气/空气(1:1)中以1.8％维持麻醉。

对动物进行机械通气，呼吸频率为16次/分钟，潮气量为10ml/kg。连续监测血压、心电图、心率和氧饱和度。围手术期镇痛为50μg/kg/h静脉注射芬太尼(B.Braun MedicalA/S,Copenhagen,丹麦)。小猪术前接受预防性抗生素15mg/kg阿莫西林(CuramoxProlongatum Vet,Boehringer Ingelheim Danmark A/S,丹麦)，围手术期接受20mg/kg甲硝唑(B.Braun,Melsungen AG,德国)，随后在术后将30mg/kg阿莫西林(Clamoxyl,Zoetis,Helsinki,芬兰)加入食物中，每天两次，持续3天。术后镇痛包括每小时50μg芬太尼透皮贴剂。(Pracetam Vet,Ceva Animal Health A/S,Vejle,丹麦)。当术后监测动物时，如果有任何疼痛迹象，则皮下(s.c.)施用丁丙诺啡(0.125mg/kg)(Temgesic,Schering-Plough Animal health,New Jersey,美国)，并调整施用的芬太尼的量。

研究完成后，通过耳静脉施用120mg/kg戊巴比妥(Euthanimal,ScanVet AnimalHealth A/S,Fredensborg,丹麦)对小猪实施安乐死。

外科手术

通过小于10cm的中线剖腹手术暴露小肠。在每只小猪中用monocryl 4-0(Ethicon,Johnson&Johnson,Diegem,比利时)在经口至回盲交界部50cm和150cm处进行两个端对端吻合口的浆膜肌膜缝合。为了诱导纤维化，将总共0.8ml 5mg/ml的乙氧基硬化醇(Chemische Fabrik Kreussler&Co.,Wiesbaden,德国)注射至吻合口的近端和远端的16个储库中。

用运行的0(Ethicon,Johnson&Johnson,Somerville,New Jersey,美国)闭合腹部筋膜。用运行的/>3-0(Ethicon,Johnson&Johnson,Diegem,比利时)皮内闭合皮肤。皮肤切口用液体绷带(KRUUSE Wound Plast,Cat.no:161020)封住。

术后第14天再次进行剖腹手术，吻合口被识别并从粘附中清除。根据粘附的沥滤等级对粘附进行分级(Kim等人,2013)。在离吻合线2mm距离的吻合口近端和远端的16个储库(0.05ml)中，总共浆膜下施用0.8ml安慰剂或抗MFAP4。如前所述闭合筋膜和皮肤。

在术后第28天，如上所述对小猪进行镇静和麻醉。再次进行剖腹手术，吻合口被识别并从粘附中清除。根据粘附的沥滤等级对粘附再次进行分级。对所有吻合口进行肉眼检查，包括狭窄。肠的直径在吻合口部位处和离吻合口近端和远端10cm的部位处测量。

放射照相术

为了检查吻合口狭窄的程度，将肠袢在体内夹在每个吻合口近端和远端约10cm处。将水溶性造影剂输注到20mmHg的压力下，并获得一个平面中的图像。在每个X射线图像中存在3cm的对照针，以便能够缩放图像。将X射线数字化，并使用图像分析软件(Image J，NIH，Bethesda，美国)测量吻合水平近端和远端的直径。

每个吻合口的吻合指数(AI)通过将吻合口的直径乘以2再除以平均吻合前和吻合后直径来计算，该平均吻合前和吻合后直径基于距吻合口1cm间隔内的五个测量点。0.5的比率相当于吻合部位减少50％。

最大吻合抗拉强度(MATS)

吻合口单独安装在装备有XLC 100N测力传感器(Lloyds Instruments,Fareham,英国)的测试仪器(LF Plus；Lloyds Instruments,Fareham,英国)中。吻合口在近端和远端切除约5cm的边缘。在切除后5分钟进行抗拉强度测试之前，用水清洗这些片段的排泄物成分，以防止低温缺血对MATS的影响。夹子之间为60mm，吻合口位于中间。以15mm/min的速率拉伸该片段，直至发生透壁破裂。在两个不同的场合测量施加的力；当浆膜中的撕裂变得可见时(MATS-1)，以及当透壁破裂出现时(MATS-2)。

通过软件计算的负载-应变中的同时下降被用于确认MATS-2的破裂点。MATS-3是抗拉强度测试期间施加的最大力，由软件计算。

组织病理学分析

抗拉强度测试完成后，收集来自吻合口的组织样本进行组织病理学分析和组织化学分析。吻合口的远端一半在10％甲醛溶液中固定8天，随后包埋在石蜡中。将石蜡包埋切片切成3μm厚的切片，并用天狼星红染色(胶原沉积/纤维化)。吻合线处的胶原沉积/纤维化以百分比进行评估。组织学分析由经验丰富的对干预措施不了解的病理学家进行评估。

统计学分析

MATS、组织学评估的吻合口愈合和狭窄程度通过非参数和参数测试进行组间比较。双尾Fisher精确检验用于评估组织学变量的潜在组间差异。多元线性回归用于评估注射抗MFAP4或安慰剂以及组织学评分是否对MATS有影响。如果p值低于0.05，则认为结果具有统计学显著性。使用Stata/BE(版本17；Texas,美国)进行统计学分析。

结果

最大吻合抗拉强度

来自安慰剂组的五个吻合口被排除在抗拉强度测试之外。一些被排除是因为MATS测试中的软件错误，而另一些被排除是因为对透壁破裂的误解。因此，安慰剂组包括13个吻合口，处理组包括18个吻合口。

与安慰剂组相比，处理组在所有三项测试中均具有最高的平均MATS值，并且在对粘附和体重增加进行调整之前，所有强度测试都具有显著性。当调整时，只有MATS2和3保持显著性(表4)。

表4：处理组和安慰剂组的最大吻合抗拉强度、吻合指数、粘附、肉眼检查和体重增加。

¹通过多元线性回归进行校正。

放射照相术

当对体重增加和粘附进行调整后，处理组的吻合指数与对照组相比有显著差异。

肉眼检查

没有肠脓肿、可见渗漏、瘘管或肠梗阻迹象。吻合线近端、远端或吻合线处的粘附评分和肠外径差异未受到干预的显著影响。

胶原沉积

由于样本质量差，排除了一个吻合口，并且无法对其进行评估，在安慰剂组中留下17个吻合口，在处理组中留下18个吻合口。与安慰剂组26.94±15.45相比，处理组的胶原沉积平均值较低，为19.71±7.49(p值＝0.028)。

结论

该研究表明，在猪模型的小肠吻合口中注射抗MFAP4对减少术后第28天的胶原沉积/纤维化具有积极作用。其进一步增加了最大抗拉强度。因此，抗MFAP4对减轻由于手术引起的纤维化诱发的肠内吻合口狭窄具有积极作用。

参考文献

Kim,et al.“Comparative study for preventive effects ofintra-abdominaladhesion using cyclooxygenase-2enzyme(COX-2)inhibitor,low molecular weightheparin(LMWH),and synthetic barrier”.Yonsei Med J.54(6),1491-7(2013).

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序列表

SEQ ID NO:1-轻链可变区(mAS0326)

SEQ ID NO:2-重链可变区(mAS0326)

SEQ ID NO:3-轻链可变区(hAS0326)

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SEQ ID NO:14-重链可变区；CDR3

SEQ ID NO:15-重链hAS0326 Fc-中和

项目

1、一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4-整联蛋白相互作用，用于预防、缓解和/或治疗纤维化。

2、根据项目1所述的选择性靶向剂，其中纤维化是肝纤维化或慢性肝病、肺纤维化、眼纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、肠纤维化和/或手术或损伤引起的纤维化。

3、根据项目2所述的选择性靶向剂，其中纤维化是肝纤维化或慢性肝病。

4、根据项目3所述的选择性靶向剂，其中所述慢性肝病是肝硬化、肝衰竭和门静脉高压。

5、根据项目2所述的选择性靶向剂，其中所述纤维化是眼纤维化。

6、根据项目5所述的选择性靶向剂，其中眼纤维化是视网膜纤维化。

7、根据前述项目中任一项所述的选择性靶向剂，其中所述选择性靶向剂是抗体。

8、根据项目7所述的选择性靶向剂，其中所述抗体选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体如人源化单克隆抗体、其中重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、单链抗体、Fc片段、Fv片段、scFv片段、双价抗体、三价抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、具有抗体CDR区的缀合物、纳米抗体、融合蛋白和Fab表达文库。

9、根据项目7至8中任一项所述的选择性靶向剂，其包含

10、根据项目1至6中任一项所述的选择性靶向剂，其中所述选择性靶向剂是抗体模拟蛋白和/或适配体。

11、根据项目10所述的选择性靶向剂，其中

·所述抗体模拟蛋白选自由以下组成的组：亲和体分子、affilin、affimer、affitin、alphabody、抗运载蛋白、avimer、DARPin、fynomer、kunitz结构域肽、knottin、monobody和nanoCLAMP，和/或

·所述适配体选自由以下组成的组：DNA适配体、RNA适配体、XNA适配体和肽适配体。

12、一种用于预防、缓解和/或治疗纤维化的组合物，其中所述组合物包含如项目1至11中任一项所述的选择性靶向剂以及一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

13、根据项目1至11中任一项所述的选择性靶向剂和/或根据项目12所述的组合物，其中所述选择性靶向剂和/或所述组合物通过以下方式施用：口服、肠外、静脉内、皮内、皮下、全身性、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、玻璃体内、鼻内、通过吸入、局部或通过直接或导管引导的局部器官施用。

14、根据项目13所述的选择性靶向剂和/或组合物，其中所述选择性靶向剂和/或所述组合物通过静脉内、玻璃体内或腹腔注射施用。

15、根据项目13至14中任一项所述的选择性靶向剂和/或组合物，其中所述选择性靶向剂和/或组合物通过注射或吸入至纤维化区域施用。

序列表

<110> 赛丹思科大学

<120> MFAP4与纤维化治疗

<130> 74461PC01

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 1

Asp Val Gln Ile Ile Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

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65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe

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<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 2

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Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Val Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

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<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 3

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<212> PRT

<213> 抗体序列

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Gly Val Ile His Pro Asn Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<211> 107

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 5

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1 5 10 15

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<213> 抗体序列

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Asp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Trp Ile Phe Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

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<213> 抗体序列

<400> 9

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<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 10

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<211> 10

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 11

Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Phe Thr Phe

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<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 12

Ser Tyr Trp Met His Trp

1 5

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 13

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Ser

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 14

Glu Met Trp Asn Tyr Gly Asn Ser Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 15

<211> 471

<212> PRT

<213> 抗体序列

<400> 15

Met Gly Trp Ser Trp Ile Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys

20 25 30

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35 40 45

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260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

340 345 350

Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

Claims

1.一种选择性靶向剂，其能够结合MFAP4并抑制MFAP4-整联蛋白相互作用，用于预防、缓解和/或治疗纤维化，其中所述选择性靶向剂是抗体。

2.根据权利要求1所述的选择性靶向剂，其中纤维化是肝纤维化或慢性肝病、肺纤维化、眼纤维化、肾纤维化、心脏纤维化、肠纤维化和/或手术或损伤引起的纤维化。

3.根据权利要求2所述的选择性靶向剂，其中纤维化是肝纤维化或慢性肝病。

4.根据权利要求3所述的选择性靶向剂，其中所述慢性肝病是肝硬化、肝衰竭和门静脉高压。

5.根据权利要求2所述的选择性靶向剂，其中所述纤维化是眼纤维化。

6.根据权利要求5所述的选择性靶向剂，其中眼纤维化是视网膜纤维化。

7.根据前述权利要求中任一项所述的选择性靶向剂，其中所述抗体选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体如人源化单克隆抗体、其中重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、单链抗体、Fc片段、Fv片段、scFv片段、双价抗体、三价抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、具有抗体CDR区的缀合物、纳米抗体、融合蛋白和Fab表达文库。

8.根据前述权利要求中任一项所述的选择性靶向剂，其包含

9.一种用于预防、缓解和/或治疗纤维化的组合物，其中所述组合物包含根据权利要求1至8中任一项所述的选择性靶向剂以及一种或多种生理上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的选择性靶向剂和/或根据权利要求9所述的组合物，其中所述选择性靶向剂和/或所述组合物通过以下方式施用：口服、肠外、静脉内、皮内、皮下、全身性、动脉内、肌内、鞘内、眼内、结膜内、玻璃体内、鼻内、通过吸入、局部或通过直接或导管引导的局部器官施用。

11.根据权利要求10所述的选择性靶向剂和/或组合物，其中所述选择性靶向剂和/或所述组合物通过静脉内、玻璃体内或腹腔注射施用。

12.根据权利要求9至10中任一项所述的选择性靶向剂和/或组合物，其中所述选择性靶向剂和/或所述组合物通过注射或吸入至纤维化区域施用。