KR20240041833A

KR20240041833A - 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 신규 항체

Info

Publication number: KR20240041833A
Application number: KR1020230125359A
Authority: KR
Inventors: 윤호근; 박수연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2023-09-20
Publication date: 2024-04-01
Also published as: WO2024063526A1

Abstract

본 발명은 섬유화에 관여하는 아스포린(Asporin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 섬유화 질환 발생 여부를 예측하거나, 해당 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 명확한 발병 기전이 알려져 있지 않아 효율적인 치료 방법이 부재했던 특발성 폐섬유증에 대한 진단, 예방 또한 치료에 사용될 수 있는 효과적인 항체를 제공한다. 아울러, 본 발명은 궁극적으로 병리학적 섬유화 기전에 대한 근원적인 억제 방법을 제공함으로써 다양한 조직에서의 섬유화를 효율적으로 차단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

섬유화 질환의 예방 또는 치료용 신규 항체{Novel Antibody for Preventing or Treating Fibrotic Disease}

본 발명은 섬유화에 관여하는 아스포린(Asporin, ASPN) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 섬유화 질환 발생 여부를 예측하거나, 해당 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

대부분의 장기는 조직 손상 후 염증 반응과 치유 과정을 거치는데, 계속적인 손상이나 복구가 불가능한 자극의 경우, 치유 과정에서 조직이 섬유화를 일으켜 장기 기능의 장애를 초래하게 된다. 한편, 폐에서 대표적으로 섬유화를 유발하는 질환으로는 특발성 폐섬유증(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)가 있는데, 해당 질환은 50 내지 70세에 주로 발명하여 5년 후 생존률이 20 내지 30%에 불과하여, 예후가 좋지 않은 질환으로 알려져 있다. 현재까지 해당 질환의 원인은 정확히 알려져 있지 않고, 폐 이식을 통한 치료 외에는 치료 효과가 아주 제한적인 몇몇 치료제만이 존재할 뿐이어서, 새로운 치료약의 개발이 매우 절실한 상황이다.

섬유증(Fibrosis)은 과도한 섬유질 결합 조직의 형성 및 침착을 주 특징으로 하는 회복 또는 반응성 과정으로, 여러 섬유화 질환(Fibrotic Disease) 및 만성 질환의 주요 병인으로 작용한다. 특히, 폐 섬유증은 정확한 기작은 알려져 있지 않으나, 세포 외 기질(Extracellular Matrix, ECM)의 과도한 침착 및 비정상적인 폐포 상피 세포의 손상으로 발생한다고 알려져 있다. 정상적인 상태에서 섬유아세포(fibroblast)는 상처 회복 및 결합 조직 생성에 중요한 역할을 수행하나, 조절되지 않은 지나친 섬유아세포의 발현으로 인하여 병소(foci)에 과도한 면역세포 및 ECM 단백질이 축적되는 경우 병리학적인 상태로 발전하게 되는 것이다. 이러한 개략적인 기작 외에, 폐섬유증의 예측인자 및 발병기전은 여전히 모호하기 때문에, 이에 대한 정확한 분자 및 생물학적 기작을 밝히는 것은 폐섬유증의 진단 또는 치료에 매우 중요한 요소라고 할 수 있다.

섬유화 및 섬유화 질환에서 TGF-β가 상향조절 및 활성화되며, 이는 섬유화의 중요한 신호기전에 해당한다. TGF-β에 의하여 ECM 유전자세트(Extracellular Matrix Gene Set)가 증가하게 되는데, 매트리셀 단백질(Matricellular protein)은 ECM에 포함되는 비-구조 단백질이다. 매트리셀 단백질은 ECM에서 안정한 구조적 요소로 기능하기보다는, 조직 내의 조절자로서 섬유아세포(Fibroblast)를 활성화시키는 전-섬유화(pro-fibrotic) 요소이다. 현재 폐섬유증의 치료제로 임상이 진행 중인 팜레브루맙(Pamrevlumab)도 매트리셀 단백질에 속하는 CTGF를 타겟으로 하는 표적 치료제에 해당한다.

다만, ECM 단백질에 속하는 SLRP(Small Leucine-rich Repeat Proteoglycan) 단백질 패밀리인 아스포린(Asporin) 단백질을 표적으로 하는 섬유증, 특히 폐섬유증의 치료방법에 대한 연구는 진행이 미흡한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 아스포린(Asporin) 단백질과 섬유증과의 연관성에 집중하여, 해당 단백질을 섬유증의 치료 타겟으로 하여 아스포린에 특이적인 단일클론 항체를 개발하고, 해당 항체의 항-섬유화 효과를 입증하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국특허공개공보 제2009-0048163호

본 발명자들은 전 세계적으로 높은 유병률을 가지면서 폐 이식 등을 제외하고는 유효한 치료 방법이 전무한 난치성 질환인 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)에 대한 효율적인 치료 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 폐 섬유화의 발병 기전에서 아스포린(Asporin)의 역할과 기능을 규명하고, 아스포린을 특이적으로 인식 및 억제하는 신규한 단일클론 중화항체를 개발하여 폐섬유화의 예방 또는 치료효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 HCDR1, 서열번호 2의 서열로 이루어진 HCDR2 및 서열번호 3의 서열로 이루어진 HCDR3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명자들은 전 세계적으로 높은 유병률을 가지면서 폐 이식 등을 제외하고는 유효한 치료 방법이 전무한 난치성 질환인 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)에 대한 효율적인 치료 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 폐 섬유화의 발병 기전에서 아스포린(Asporin) 단백질이 섬유아세포-매개 섬유화(섬유증)를 일으킨다는 사실을 규명하고 아스포린(Asporin) 단백질이 치료 타겟이 될 수 있음을 확인하였을 뿐 아니라, 아스포린(Asporin) 단백질을 높은 친화도로 인식하고 이를 억제하는 신규한 단일클론 중화항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 용어“항체(antibody)”는 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 항체로서, 이의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

본 명세서에서 용어“항체의 항원 결합 단편”은 전체 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

본 명세서에서 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어“CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편의 범위에는 CDR 영역에 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 인산화된 PLCγ2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 일특정예에서는 ± 2 이내, 다른 특정예에서는 ± 1 이내, 또 다른 특정예에서는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 일특정예에서는 ± 2 이내, 다른 특정예에서는 ± 1 이내, 또 다른 특정예에서는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 일특정예에 따르면 70%의 상동성, 다른 특정예에 따르면 80%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482 Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al. Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al. Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al. Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al. J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어 “아스포린(Asporin) 단백질”이란, 인간에서 ASPN 유전자에 의하여 인코딩되는 단백질로서, 연골 기질과 관련된 류신이 풍부한 반복(Leucine-Rich Repeat, LRR) 단백질 패밀리에 속하는 단백질을 의미한다. 아스포린 단백질은 OS3, PLAP-1, PLAP1 또는 SLRR1C로 지칭될 수도 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함한다.

본 명세서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_L 및 불변영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편이다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다.

본 명세서에서 용어“단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면, 섬유화를 일으키는 아스포린(Asporin) 단백질의 활성이 억제되면서 과도한 섬유화를 방지하여 섬유화 질환(fibrotic disease)로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 발명에서 용어“섬유화 질환(fibrotic disease)”는 병리학적인 조직의 섬유화(fibrosis) 진행을 수반하고, 이러한 섬유화를 직접 또는 간접적인 원인으로 하는 모든 병적 상태를 통칭한다. 또한 용어“섬유화 또는 섬유증(fibrosis)”는 염증이 있거나 손상된 조직 내부 및 주변 부위에 섬유질 결합조직(콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 세포외기질의 구성요소)이 과도하게 축적되어 영구적인 흉터, 장기 기능 장애 및 궁극적으로는 사망을 초래할 수 있는 질환을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 섬유화 질환은 간 섬유증; 신장 섬유증 및 폐 섬유증(Pulmonary Fibrosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에서 용어 “간 섬유증”은, 간의 만성 손상으로 섬유 조직이 증식하는 증상으로, 담도 섬유증, 괴사 후 흉터, 확산 간 섬유증 등의 다양한 원인으로 인하여 발생할 수 있다.

본 발명에서 용어 “신장 섬유증”은, 세뇨관간질 섬유증 및 사구체 경화증을 특징으로 하는 질환으로, 만성 신장 질환의 최종 징후로서, 신장 섬유증은 세포 외 기질 성분의 과도한 축적 및 침착을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어 “폐섬유증(pulmonary fibrosis)”은, 반복된 폐 또는 폐 조직의 손상 및 상처로 인하여 폐가 섬유화되는 질환을 의미하며, 호흡곤란; 마른기침; 피로감; 체중저하; 및 곤봉손발톱(nail clubbing)의 증상을 동반한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 폐 섬유증(Pulmonary Fibrosis)은 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)이다.

본 발명에서 용어“특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)”는 폐 조직이 두꺼워지고 경직되어 흉터 조직이 형성되는 것을 특징으로 하는 진행성 호흡기 질환을 의미하며, 폐 기능의 점진적이고 비가역적인 감소를 특징으로 하는 만성 흉터성 폐 질환의 일종으로써, 명확한 원인이 알려져 있지 않아서‘특발성’이라고 지칭된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 아스포린(Asporin) 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 섬유화 질환 발생 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 아스포린(Asporin) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)에 상세하게 기재되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 종양의 전이 여부 또는 전이 가능성을 예측할 수 있다. 즉, 개체의 시료에서 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 개체의 종야의 전이가 진행되었거나 향후 진행될 가능성이 높은 것으로 판단된다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 섬유화 질환 발생 여부를 판단하거나, 발생 가능성을 예측하기 위해 아스포린(Asporin) 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량 측정수단을 포함하는 통상적인(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 경쇄 CDR(LCDR); 경쇄 가변영역; 및 이를 포함하는 항체 또는 그의 항원결합 단편에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 섬유화에 관여하는 아스포린(Asporin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 섬유화 질환 발생 여부를 예측하거나, 해당 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 명확한 발병 기전이 알려져 있지 않아 효율적인 치료 방법이 부재했던 특발성 폐섬유증에 대한 진단, 예방 또한 치료에 사용될 수 있는 효과적인 항체를 제공한다.

(c) 아울러, 본 발명은 궁극적으로 병리학적 섬유화 기전에 대한 근원적인 억제 방법을 제공함으로써 다양한 조직에서의 섬유화를 효율적으로 차단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 인간 폐 조직(Human Lung Tissue)의 면역조직화학염색 결과를 도시한 그림으로서, 왼쪽은 대조군과 즉발성 폐섬유증(IPF) 환자에서의 염색결과가 도시된 그림이고, 오른쪽은 아스포린(Asporin) 발현량을 y축으로 하여 대조군과 IPF 환자에서의 아스포린 발현량을 정량적으로 비교한 그래프이다.
도 2a는 블레오마이신(Bleomycin)을 주입하여 섬유화를 진행시킨 마우스 폐 섬유화 모델에서의 아스포린(Asporin)에 대한 면역조직화학 염색결과(왼쪽) 및 아스포린 발현량을 도시한 그래프(오른쪽)이다. 도 2b는 TGF-β이식(transgenic)을 통하여 섬유화를 진행시킨 마우스 폐 섬유화 모델에서의 아스포린(Asporin)에 대한 면역조직화학 염색결과(왼쪽) 및 아스포린 발현량을 도시한 그래프(오른쪽)이다.
도 3a는 신장 섬유화 마우스 모델인 일측성 요관 폐쇄 모델(Unilateral Ureter Obstruction ,UUO)에서의 아스포린에 대한 면역조직화학 염색결과(왼쪽 위), 시리우스 레드 염색을 통한 콜라겐 관찰 결과(왼쪽 아래), 아스포린 발현량을 도시한 그래프(오른쪽 위) 및 시리우스 레드 염색을 통한 섬유화 발생 면적 측정 결과를 도시한 그래프(오른쪽 아래)이다. 도 3b는 간 섬유화 마우스 모델인 콜린 결핍 식이 마우스(choline-deficient high fat diet, CD-HFD)에서의 아스포린에 대한 면역조직화학 염색결과(왼쪽 위), 시리우스 레드 염색을 통한 콜라겐 관찰 결과(왼쪽 아래), 아스포린 발현량을 도시한 그래프(오른쪽 위) 및 시리우스 레드 염색을 통한 섬유화 발생 면적 측정 결과를 도시한 그래프(오른쪽 아래)이다.
도 4는 아스포린(Asporin) 타겟 치료제 개발을 위하여 제작한 단일클론항체#1 내지 #11를 도시한 표이다.
도 5a는 친화력(Affinity)가 좋은 2개의 클론에 대하여 수행한 닷 블롯팅(Dot Blotting)의 결과를 도시한 그림이다. 도 5b는 폐 섬유아세포인 MRC5에서 수행한 펩타이드 블로킹 결과를 도시한 그림이다.
도 6a는 인간 섬유아세포에서 TGF-βdp 의하여 유도된 세포 증식이 아스포린 항체 처리시 감소됨을 확인한 결과를 도시한 그래프이다. 도 6b는 인간 섬유아세포에서 TGF-βdp 의하여 유도된 섬유화의 타겟 유전자들(Acta 2, Col1a1 및 Col3a1)이 아스포린 항체 처리로 인하여 감소됨을 확인한 결과를 도시한 그래프이다.
도 7a는 본원 발명의 항-아스포린 항체들(#9 및 #10)의 섬유아세포 증식 억제능을 CTGF 항체(CTGF Ab.)와 비교한 결과를 도시한 그래프이다. 도 7b는 본원 발명의 섬유아세포 증식 억제능을 통하여 펩타이드 블로킹 정도를 측정함으로써 항체의 특이도를 검증한 결과를 도시한 그림이다. 도 7c는 qRT-PCR을 이용하여 본원 발명의 항-아스포린 항체들(#9 및 #10)의 섬유화 타겟 유전자(Acta2, Col1a1, Col3a1)를 검증한 결과를 도시한 그림이다.
도 8a는 폐섬유화 마우스 모델에서 본원 발명의 항체(#10) 투여에 따른 조직내 섬유화 양상에 대한 그림과 MTS alc α-SMA 방법에 따른 섬유화의 정량 결과를 도시한 그래프이다. 도 8b는 폐섬유화 마우스 모델에서 채취한 기관지폐포세척액에 포함된 세포를 계수한 결과를 도시한 그림이다. 도 8c는 폐섬유화 마우스 모델에서의 수용성 콜라겐을 측정하여 정량한 결과를 도시한 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 분석방법

동물 모델

마우스를 12시간 명주기/12시간 암주기 조건에서 온도와 습도가 제어된 특정-무병원체 동물 시설(specific pathogen-free animal facility)에 수용하였다. BLM 투여 전, 8주령 마우스에 10 mg/kg 타목시펜(tamoxifen)(Merck, Darmstadt, Germany)을 주 3회로 1주 동안 주사하였다. Zoletil 50 (30mg/kg) 및 Rompun (10mg/kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취시켰다. 마우스에 PBS(비히클 대조군) 또는 4mg/kg BLM (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)을 기관 내 주사하였다. 각 그룹에는 평균 8마리의 마우스를 사용하였다.

면역염색

면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)를 준비하기 위해, 폐 절편 슬라이드를 단계별 알코올 시리즈(graded alcohol series)를 통해 재-수화(rehydration)한 다음, 10mM 시트르산 나트륨에서 항원을 검색하였다. IHC 염색 프로토콜은 과산화효소 차단 시약, 1차 항체(O/N), 2차 항체(1시간) 분자 및 폴리머 백본에 연결된 양고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase)의 순차적 적용; 및 3,3'-디아미노벤지딘 사염산염(3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)과 함께 과산화수소 기질을 갖는 발색 시약(Dako, Santa Clara, CA, USA)을 사용한 시각화를 포함하여 수행하였다. 아스포린(Asporin) 단백질의 강도는 ImageJ를 사용하여 계산하였다. 아울러, 아스포린 항체는 Thermo PA5-28124를 이용하였다.

일측성 요관 폐쇄(Unilateral Ureter Obstruction, UUO) 마우스 섬유증 모델의 수술

마우스에서 신장 섬유증을 유도하려고 기계적 스트레스를 가하였다. 졸레틸(50mg/ml)과 룸푼 (23.32mg/ml)을 복강 내 주사 주입하여 마우스를 마취한 후 집게(forceps)와 의료용 안과 가위(Iris Scissor)로 피부와 복막을 절개하였다. 하나의 신장을 찾아 요관을 뾰족하지 않은 갈고리로 끊고, 검은 실크 실로 요관을 두 번 묶었다. 그 후 검은 실크 실로 복막과 피부를 봉합하였으며, 포비돈 요오드로 살균하였다. 수술 마우스는 일측성 요관 폐쇄 수술 후 8일째에 희생되었다.

조직학적 관찰을 위한 신장 조직 절편(Section) 준비

피막이 없는 신장(Kidney with no-capsule)에 4% 포름알데히드를 주입하고4℃에서 24시간 동안 압력을 가하여 고정하였다. 조직 처리 후, 파라핀 블록에 포매하고 4μm로 절단하였다.

콜라겐 관찰을 위한 시리우스 레드 염색

FFPE 신장 조직을 사용하였고, 자일렌으로 파라핀을 제거하였으며, 100%, 90%, 80%의 EtoH로 수화하였다. 수화 후, 신장 조직에 picro Sirius red(ab150681, Abcam, Cambridge, UK)를 1시간 동안 점적하고 0.5% 산성수로 2회 세척하였다. 소수성 마운팅 용액(Hydrophobic mounting solution)으로 조직을 마운팅하였다.

콜린 결핍 식이 마우스 (Choline-deficient High Fat Diet, CD-HFD 마우스 모델

CD-HFD 모델을 제작하기 위하여, Int J Exp Pathol. Apr;94(2):93-103. (2013)을 참조하였다. 아울러, CDAA, 0.1% 메티오닌이 포함된 HFD (CDAHFD; #A06071302)는 Research Diets(New Brunswick, NJ, USA)에서 구하였다. 이 HFD는 그램 당 5.2kcal를 제공하고 8주 동안 320g/kg의 라드-기반 지방을 함유한다.

닷 블롯팅(Dot blot)

닷 블롯팅은 하기 단계를 통해 수행하였다.

(1) 전달 항체 품질 관리: 해당 펩타이드 항원의 닷 블롯 검출

(2) BSA 접합(conjugated) 폴리펩타이드를 니트로셀룰로오스 막에 부착시켰다(각 포인트는 2μL였다). 포인트 그룹은 오른쪽에서 왼쪽으로 25ng, 5ng, 1ng, 0,25ng, 0.05ng, 0.01ng의 접합된 폴리펩타이드를 포함시켰다(도 5a). 5% 탈지유/TBST를 이용하여 차단하였다.

(3) 1:1000 희석된 항체로 1시간 동안 배양한 후, TBST로 3회 세척하고, 2차 항체를 45분간 배양하였다.

(4) ECL 시약을 첨가하여 1분간 반응시킨 후, 방부 필름(preservative film)을 첨가하고 X-ray 필름을 암실에서 노출시켜 현상하였다(노출은 수차례 진행하였다).

펩타이드 차단 및 웨스턴 블로팅

세포는 용해 완충액(20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5% MgCl2, 1mM EDTA, 1mM Na2VO4, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH 7.5)에서 용해하였다. 용해물을 간단히 볼텍싱하고 초음파 처리하였으며, 4℃에서 20분 동안 12,000 x g로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 상층액을 수집하고 새로운 튜브로 옮겼다. 단백질 농도는 660 nm 단백질 분석 시약(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 결정하였다. 동일한 양의 단백질 추출물을 SDS-polyacrylamide 젤에서 전기영동한 다음 Nitrocellulose transfer membrane(Whatman, Dassel, Germany)으로 옮겼다. 멤브레인은 0.1%(v/v) Tween 20(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 5%(w/v) 무지방 Difco^TM 탈지유(BD Biosciences, Sparks, MD, USA) 및 3% BSA(Affymetrix, Santa clara OH, USA)를 포함하는 PBS로 차단하였고, 항-아스포린(Abmart, 중국)을 1차 항체로 사용하여 조사하였다. 그 다음, 막을 1x PBST로 세척하고 적절한 2차 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 항체(Thermo Scientific, Rockford IL, USA)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 향상된 화학발광 검출 시약(enhanced chemiluminescence detection reagent)(Thermo Scientific)과 함께 LAS-3000 시스템(Fujifilm, Stamford, CT, USA)을 사용하여 시각화하였다.

펩타이드 차단(Peptide blocking)을 위해 희석된 1차 항체를 ASPN 서열의 펩타이드와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 항체를 블롯 멤브레인 배양(blotted membrane incubation)에 사용하였다. 아울러, 아스포린 펩타이드의 서열은 다음과 같다 : CPFGCQCYSRVVHCSDLGLT (서열번호 23).

배지 농도

MRC5 세포가 배양된 60-mm 세포 배양 접시에서 배지를 수확하고, 0.45 μm 필터(Sartorius, Stonehouse, UK)에 통과시킨 후, 조건 배지(conditioned medium)로 사용하였다. 추가로, 배양 배지를 VIVASPIN6 컬럼(Sartorius)에 적용하고 10,000 x g에서 2시간 동안 원심분리하였다; 농축된 단백질은 단백질 분석을 사용하여 계산한 다음, 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다.

세포 배양

인간 섬유아세포주 MRC5는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하였다. 세포는 10%(v/v) 태아 소 혈청과 1% 항생제/항진균 용액(Corning, Manassas, VA, USA)이 보충된 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 37℃, 5% CO2로 배양하였다.

MRC5 인간 섬유아세포 증식

세포는 TGF-β1(20ng/ml) 및 모노클로날 항체의 24시간 동안의 처리 전에 2시간 동안 혈청-고갈시켰다. 세포를 트립신으로 처리(trypsinized)하고 세포 계수기로 계수하였다.

RNA 분리 및 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)

제조사의 프로토콜(Takara, Kyoto, Japan)에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 500㎕의 Trizol을 세포 배양 접시(6웰)에 첨가하고 세포를 튜브에 수집하였다. 100 μl의 클로로포름을 샘플에 첨가하고 샘플을 볼텍싱시켰다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고 4℃에서 15분 동안 12,000 x g로 원심 분리하였다. 250ul의 상청액을 수집하고 새로운 튜브로 옮겼습니다. 250㎕의 이소프로판올을 샘플에 첨가하고 샘플을 4℃에서 10분 동안 12,000 xg로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 500㎕의 75% 에탄올을 샘플에 첨가하였다. 샘플을 4℃에서 5분 동안 13,000 x g로 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 실온에서 건조시켰다. DEPC 30㎕를 건조된 펠렛에 첨가하였다. RNA의 농도는Nanodrop1000(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 측정하였다. RNA 분리 후 총 RNA 1μg을 사용하고 제조사의 프로토콜에 따라 CellScript(CellSafe, Seoul, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.

qRT-PCR 분석은 ABI PRISM 7000 Sequence Detection System 기기 및 소프트웨어(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여, 일부 수정한 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 적절한 양의 역전사 반응 혼합물을 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 특정 프라이머로 증폭하였다. qRT-PCR에 대한 PCR 프라이머 서열은 표 1에 나열하였다.

타겟	센스가닥	안티센스가닥
human COL1a1	CCTCAAGGGCTCCAAC (서열번호 33)	GGTTTTGTATTCAATCACTGTCTTGC (서열번호 34)
human COL3a1	TGGTCTGCAAGGAATGCCTGGA (서열번호 35)	TCTTTCCCTGGGACACCATCAG (서열번호 36)
human α-SMA	CTGGCATCGTGCTGGACTCT (서열번호 37)	GATCTCGGCCAGCCAGATC (서열번호 38)

통계 분석

결과는 Prism 소프트웨어 버전5(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 시각화 및 분석하였다. 2개 이상의 샘플 그룹을 비교할 때 통계적 유의성을 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 조사하였다. 데이터 값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 두 그룹의 통계적 유의성을 결정하는 데 사용되는 스튜던트t-검정. P < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실험결과

IPF 환자에서, 아스포린 단백질 발현이 증가되어 있음을 확인하였다

전술한 면역조직화학염색를 통하여 IPF 환자의 폐 조직 절편(lung section slides)를 관찰한 결과, IPF 환자에서 아스포린(Asporin) 단백질의 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 도 1의 왼쪽 그림은 대조군 및 IPF환자에서의 면역조직화학염색 결과를 도시한 사진이고, IPF 환자에서 아스포린 발현으로 인하여 조직화학염색된 부분이 화살표로 표시되어 있다. 도 1의 오른쪽은 대조군 및 IPF 환자에서 ASPN (아스포린, y축)의 발현량을 도시한 그래프이다. 실험 결과에 따르면, 대조군과 비교하여 IPF 환자에서 아스포린의 발현량이 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있다.

마우스 폐섬유화 모델들에서 아스포린 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다

블레오마이신(bleomycin)은 폐손상 및 폐섬유화의 부작용을 일으키므로, 이를 이용하여 폐섬유화가 진행된 마우스 모델을 얻었다. 또한, TGF-β 유전자의 이식(transgenic)을 통하여 폐섬유화가 유도된 마우스 모델도 준비하였다. 이들 폐섬유화 유도 마우스 모델에서 얻은 마우스 폐조직(mouse lung tissue)에서 면역조직화학염색을 진행한 결과, 모두 아스포린(Asporin)의 발현이 유의하게 증가되는 것을 확인하였다.

신장 섬유화 마우스 모델 및 간 섬유화 마우스 모델에서 아스포린 발현이 유의하게 증가함을 확인하였다

신장섬유화모델인 UUO(Unilateral Ureter Obstruction) 마우스 모델 및 간섬유화 모델인 콜린 결핍 식이 마우스(choline-deficient high fat diet, CD-HFD)에서도, 섬유화 유도에 따라 아스포린(Asporin)의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 도 3a는 UUO, 도 3b는 CD-HFD에 관한 실험 결과를 도시한 그림이며, 각각의 모델에 대하여 면역조직화학염색 결과 및 아스포린의 발현량과 섬유화 발생면적을 나타낸 그래프가 도시되어 있다. 해당 결과로부터 신장 및 간에서의 섬유화에 의하여 아스포린이 증가함을 명확히 알 수 있었다.

단일클론 항체 후보들의 아스포린에 대한 친화도(Affinity)를 조사하여 특이도가 높은 항체를 선별하였다

도 4와 같이 #1 내지 #11의 항-아스포린 항체의 클론들을 확보하였다. 이중, 닷 블롯팅(Dot Blotting) 및 펩타이드 블로킹(Peptide Blocking)을 통하여 특이성이 높은 2개의 클론을 조사하여 선별하였고, 그 중 하나(#10)의 섬유화 억제 효과를 확인하였다.

선별된 단일클론항체의 섬유화 억제 효과를 확인하였다

선별된 단일클론 항체들(#10)의 섬유아 세포 증식능 억제 효과 및 섬유화 타겟 유전자 발현 억제 효과가 있음을 실험적으로 확인하였고, 이를 통하여 선별된 단일클론항체들의 섬유화 억제 효과 및 섬유화질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 확인할 수 있었다.

선별된 항체의 세포모델에서의 항섬유화 유효성을 확인하였다

인간 섬유아 세포(Human fibroblast)에서 TGF-β 유도 세포 증식이 아스포린 (Asporin) 항체 처리 시 감소됨을 확인하였다. 아울러, 인간 섬유아 세포에서 TGF-β 유도 섬유화 타겟 유전자들이 아스포린 항체 처리 후 감소됨도 확인할 수 있었다. 이를 통하여, 본 발명의 항-아스포린항체들의 항섬유화 유효성을 최종적으로 확인할 수 있었다.

선별된 항체의CDR 서열은 다음과 같다

HCDR1 : GFTFSDYW (서열번호 1)

HCDR2 : IRNKPYNYETY (서열번호 2)

HCDR3 : TAYYRYDVLFDY (서열번호 3)

LCDR1 : QDISNY (서열번호 4)

LCDR2 : YTS (서열번호 5)

LCDR3 : QQSKTLPLT (서열번호 6)

HFR1 : EVKLVETGGGLVQPGRPMKLSCVAS (서열번호 7)

HFR2 : MNWVRQSPEKGLEWVVQ (서열번호 8)

HFR3 : YYSDSVKGRFTISRDDSKSCVYLQMNNLRAEDMGIYYC (서열번호 9)

HFR4 : WGQGTSLTVSS (서열번호 10)

중쇄가변영역: EVKLVETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVVQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSCVYLQMNNLRAEDMGIYYCTAYYRYDVLFDYWGQGTSLTVSS (서열번호 11)

LFR1 : DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRAS (서열번호 12)

LFR2 : LNWYQQKPEGTVKLLIY (서열번호 13)

LFR3 : RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC (서열번호 14)

LFR4 : FGAGTKLELK (서열번호 15)

경쇄가변영역: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPEGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQSKTLPLTFGAGTKLELK (서열번호 16)

핵산 서열

HCDR1 : ggattcacttttagtgactactgg (서열번호 17)

HCDR2 : attagaaacaaaccttataattatgaaaca (서열번호 18)

HCDR3 : acagcctactataggtacgacgtcctcttcgactac (서열번호 19)

LCDR1 : caggacattagcaattat (서열번호 20)

LCDR2 : tacacatca (서열번호 21)

LCDR3 : caacagagtaaaacgcttcctctcacg (서열번호 22)

HFR1 : gaggtgaagctggttgagactggaggaggcttggtgcaacctgggaggcccatgaaactctcctgtgttgcctct (서열번호 23)

HFR2 : atgaactgggtccgccagtctccagagaaaggactggagtgggtagtacaa (서열번호 24)

HFR3 : tattattcagattctgtgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattccaaaagttgtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacatgggtatctattactgt (서열번호 25)

HFR4 : tggggccaaggcacctctctcacagtctcctcag (서열번호 26)

중쇄 가변영역 : gaggtgaagctggttgagactggaggaggcttggtgcaacctgggaggcccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcacttttagtgactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaaggactggagtgggtagtacaaattagaaacaaaccttataattatgaaacatattattcagattctgtgaaaggcagattcaccatctcaagagatgattccaaaagttgtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacatgggtatctattactgtacagcctactataggtacgacgtcctcttcgactactggggccaaggcacctctctcacagtctcctcag (서열번호 27)

LFR1 : gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagt (서열번호 28)

LFR2 : ttaaactggtatcagcagaaaccagaaggaactgttaaactcctgatctac (서열번호 29)

LFR3 : agattacactcaggagtcccatcaagattcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggaacaagaagatattgccacttacttttgt (서열번호 30)

LFR4 : ttcggagctgggaccaagttggagctgaaac (서열번호 31)

경쇄 가변영역 : gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagaaggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaagattcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggaacaagaagatattgccacttacttttgtcaacagagtaaaacgcttcctctcacgttcggagctgggaccaagttggagctgaaac (서열번호 32)

폐섬유화 마우스 모델에서 항-아스포린 항체의 유효성 평가하였다

전술한 #10 항-아스포린 항체의 유효성을 평가하기 위하여, 동물 모델에서의 섬유화 억제 효과를 추가적으로 확인하였다. 동물 모델은 폐섬유화 마우스 모델을 사용하였다.

8-10 주령 C57BL/6 마우스에 Bleomycin 을 2mg/kg 용량으로 기관지내 주사하여 폐섬유화를 유도하고 다음날 부터 Asporin 항체 10mg/kg로 이틀에 한번씩 5회 정맥내 투여후 12일째에 마우스를 희생하여 실험에 이용하였다. 마우스 폐의 파라핀 절편을 Masson’s trichrome 염색(MTS)과 α-SMA의 면역조직화학염색을 이용하여 조직내 섬유화를 관찰하고 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량하였다. 블레오마이신(Bleomycin)에 의해 유도된 폐섬유화가 본원 발명의 항-아스포린 항체 주입시 감소되는 형상을 관찰할 수 있었다(도 8a).

마우스의 폐에서 기관지폐포세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid) 취하여 세포를 계수하였다. 블레오마이신(Bleomycin)에 의해 증가된 세포수가 본원 발명의 항-아스포린 항체를 처리한 그룹에서 유의하게 감소된 것을 관찰할 수 있었다(도 8b).

아울러, 마우스의 폐에서 수용성 콜라겐을 측정하였다. Sircol collagen assay kit (Biocolor, UK)를 이용하여 측정하였을 때, 블레오마이신에 의해 증가된 콜라겐 양이 본원 발명의 항-아스포린 항체 주입시 현저하게 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(도 8c).

결론적으로, 본원 발명의 항-아스포린 항체의 뛰어난 섬유화 억제 효과를 동물 모델을 이용하여 검증할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

서열번호 1의 서열로 이루어진 HCDR1, 서열번호 2의 서열로 이루어진 HCDR2 및 서열번호 3의 서열로 이루어진 HCDR3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 3 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 섬유화 질환은 간 섬유증; 신장 섬유증 및 폐 섬유증(Pulmonary Fibrosis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 폐 섬유증(Pulmonary Fibrosis)은 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 진단용 조성물.
서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 아스포린(Asporin) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.