CN110418805B

CN110418805B - 用于在肝病的治疗中使用的抗ccl24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)抗体

Info

Publication number: CN110418805B
Application number: CN201880018207.8A
Authority: CN
Inventors: 阿迪·莫尔
Original assignee: Chemomab Ltd
Current assignee: Chemomab Ltd
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: IL251024A0; IL269094B1; IL269094B2; EP3592772C0; JP2020511439A; EP3592772B1; CN110418805A; ES2977583T3; US20220372126A1; EP3592772A1; IL269094A; US20200040070A1; JP7173589B2; KR102546339B1; WO2018163185A1; KR20190126829A; US12018074B2; US11365246B2

Abstract

本发明涉及用于在肝脏病理的治疗中使用的分离的抗CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)抗体。

Description

用于在肝病的治疗中使用的抗CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子 2)抗体

技术领域

本发明涉及抗CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)单克隆抗体在肝病的治疗中的用途。

背景

趋化因子(C-C基序)配体24(CCL24或嗜酸性粒细胞趋化因子2)是通过C-C趋化因子受体3型(CCR3)复合物，尤其是通过诱导嗜酸性粒细胞、成纤维细胞和T细胞的趋化性而促进细胞运输并调节炎性活性的趋化因子。CCL24由若干炎性细胞产生，并且其受体CCR3存在于嗜酸性粒细胞、T细胞、单核细胞和成纤维细胞上。

已知CCL24与过敏状况有关，因为在过敏反应期间CCL24的水平存在显著增加。

WO 2010/086854公开了针对CCL24的抗体，其在心血管疾病、自身免疫疾病和炎性疾病的动物模型中是有效的。

Mor等人(2013WJCD.第3卷.第4期:339-346)示出，针对CCL24制备的单克隆抗体减弱了淋巴细胞对纤连蛋白的粘附并且有效地抑制了它们朝向血管内皮生长因子(VEGF)的迁移。抗体还显著减少了载脂蛋白E(ApoE)被敲除的小鼠中的动脉粥样硬化斑块。如Ablin等人.(2010；V161(2):276–83)和Mausner等人.(World J.Immunol.2013年3月；3(1):7-14)中描述的，CCL24的抑制在类风湿性关节炎的大鼠模型中和在实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠模型中证明了保护作用。

WO 2015/132790公开了针对趋化因子CCL24中的独特的表位的分离的多特异性抗体，其中抗体结合另外的CCR3结合趋化因子。在全身性硬化症和特发性肺纤维化(IPF)的鼠模型中，这些抗体示出在抑制纤维化和炎性特征方面是有效的。

Lei Jin等人(2017Oncotarget,第8卷(第3期):5135-5148)示出，CCL24经由RhoB-VEGFA-VEGFR2血管生成对肝细胞癌(HCC)有贡献并且指示预后不良。然而，CCL24在肝脏病理中的参与先前未被证实，所述肝脏病理诸如肝炎、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD，包括非酒精性脂肪肝(NAFL))、胆汁淤积和肝内胆汁淤积性肝病，诸如原发性硬化性胆管炎(PSC)和原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

一般描述

因此，本发明在其第一方面提供了一种分离的抗CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)抗体或其任何抗原结合片段，用于在肝脏病理的治疗中使用。

在一个实施方案中，所述肝脏病理选自由以下组成的组：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、胆汁淤积、肝内胆汁淤积性肝病、肝炎(例如，酒精性肝炎)和肝硬化。

在一个实施方案中，所述NAFLD是非酒精性脂肪肝(NAFL)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

在一个实施方案中，所述肝脏病理是由NASH引起的肝细胞癌。

在一个实施方案中，所述肝内胆汁淤积性肝病是原发性硬化性胆管炎(PSC)或原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

在一个实施方案中，所述肝脏病理是由PSC引起的胆管癌。

在另一个方面中，本发明涉及分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段，用于在以下中使用：

a.降低肝损伤后升高的肝酶的血清水平；

b.减少肝损伤或坏死；和/或

c.减弱肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞的转变。

在一个实施方案中，分离的抗CCL24抗体可以是单克隆抗体。

在一些实施方案中，分离的抗CCL24抗体可以是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或完全人源化抗体。

在另外的实施方案中，分离的抗CCL24抗体的抗原结合片段选自由以下组成的组：Fv、单链Fv(scFv)、能够结合抗原的重链可变区、能够结合抗原的轻链可变区、Fab、F(ab)2’及其任何组合。

在一个实施方案中，所述抗体是包含重链可变区和轻链可变区的完全人源化抗体，所述重链可变区包含：

a)互补决定区VH CDR1，所述互补决定区VH CDR1包含由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或其变体；

b)互补决定区VH CDR2，所述互补决定区VH CDR2包含由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列或其变体；和

c)互补决定区VH CDR3，所述互补决定区VH CDR3包含由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或其变体；

所述轻链可变区包含：

d)互补决定区VK CDR1，所述互补决定区VK CDR1包含由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列或其变体；

e)互补决定区VK CDR2，所述互补决定区VK CDR2包含由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列或其变体；和

f)互补决定区VK CDR3，所述互补决定区VK CDR3包含由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，所述抗体是完全人源化抗体，该完全人源化抗体包含由SEQID NO:7或其变体表示的重链可变区以及由SEQ ID NO:8或其变体表示的轻链可变区。

在一个实施方案中，所述抗体是完全人源化抗体，该完全人源化抗体包含由SEQID NO:1-6表示的六个CDR序列、以及与SEQ ID NO:7具有至少90％序列同源性的重链可变区和与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同源性的轻链可变区。

在一个实施方案中，所述抗体与包含以下的抗体结合相同的表位：

(a)包含NSGMN(SEQ ID NO:1)的重链CDR1、包含WINTYNGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO:2)的重链CDR2、和包含HSYGSSYAMDN(SEQ ID NO:3)的重链CDR3；以及

(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:4)的轻链CDR1、包含VASNLKS(SEQ ID NO:5)的轻链CDR2、和包含QQSNEEPWT(SEQ ID NO:6)的轻链CDR3。在一个实施方案中，所述抗体与至少一种另外的治疗剂组合施用。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：类法呢醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)激动剂、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂、抗趋化因子或抗细胞因子单克隆抗体、小分子、抗炎剂、抗纤维化剂和类固醇。

在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含完全人源化抗体和药学上可接受的载体，所述完全人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

f)互补决定区VK CDR3，所述互补决定区VK CDR3包含由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列或其变体；

其中所述药物组合物用于在肝脏病理的治疗中使用。

在一个实施方案中，所述完全人源化抗体还包含与SEQ ID NO:7具有至少90％序列同源性的重链可变区和与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同源性的轻链可变区。在一个实施方案中，所述药物组合物与至少一种另外的治疗剂组合施用。

在一个实施方案中，所述药物组合物在施用所述至少一种另外的治疗剂之前、同时或之后施用。

在一个实施方案中，所述药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。

在一个实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：类法呢醇X受体(FXR)激动剂、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂、抗趋化因子或抗细胞因子单克隆抗体、小分子、抗炎剂、抗纤维化剂和类固醇。

在另一个方面中，本发明提供了一种治疗肝脏病理的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗上可接受的量的完全人源化抗体或本发明的药物组合物，所述完全人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

在另外的方面中，本发明提供了一种降低肝损伤后肝酶的血清水平和/或减少肝损伤或坏死、和/或减弱肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞转变的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用治疗上可接受的量的完全人源化抗体或本发明的药物组合物，所述完全人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

在一些实施方案中，所述完全人源化抗体包含与SEQ ID NO:7具有至少90％序列同源性的重链可变区和与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同源性的轻链可变区。

在一个实施方案中，所述方法还包括施用至少一种另外的治疗剂。

在另一个方面中，本发明提供了一种减少或抑制细胞中的CCR5活化的方法，所述方法包括施用完全人源化抗体，所述完全人源化抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

附图简述

为了更好地理解本文公开的主题并且为了例示主题可以如何在实践中进行，现在将参考附图通过仅非限制性实例的方式描述实施方案，在附图中：

图1A是示出如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的，与对照(20名健康受试者)相比，55名NAFLD患者中的CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)的全身循环水平的图，该55名NAFLD患者被分为低Fib4评分和高Fib4评分。结果以皮克每毫升(pv-P值)呈现。纤维化4评分(Fib4)如下计算：(年龄x AST)/(血小板x(sqr(ALT))。

图1B-图1M是FACS图像，示出与健康对照相比，来自NAFLD患者的人PBMC上代表性的CCR3表达。图1B-图1D各自代表三名NAFLD患者中如由PE标记的抗CCR3抗体测量的CCR3染色。图1E-图1G各自代表三名NAFLD患者中的每名患者的对应的CCR3染色/侧向散射(sidescatter)，即不同的血细胞群体中CCR3表达的水平。图1H-图1J各自代表在3名健康志愿者中使用抗CCR3抗体的CCR3染色。图1K-图1M各自代表三名健康患者中的每名患者的对应的CCR3染色/侧向散射区域。图1N是示出如通过FACS测量的、与对照相比，来自10名NAFLD患者的外周血单核细胞中的CCR3表达的图。***pv≤0.005。

图2A-图2G是示出从用抗CCL24抗体(即鼠CCL24 mAb CM101)或抗CCR3抗体染色的NASH患者获得的人类肝活检的代表性外观的照片。图2A-图2C代表三名不同患者(分别为患者A-患者C)的肝活检。图2D示出了健康肝脏的活检，并且用作阴性对照。图2E示出了健康受试者的淋巴结的活检，并且用作阳性对照。图2F和图2G代表对NASH肝活检中的趋化因子受体CCR3染色的肝脏切片。

图3A是示出与CCL24敲除小鼠相比，野生型(WT)小鼠中肝酶ALT的水平的图。图3B是示出与CCL24敲除小鼠相比，野生型小鼠中肝酶ALP的水平的图。图3C是示出与CCL24敲除小鼠相比，野生型小鼠中胆红素水平的图。图3D是示出如通过sircol测量的，与CCL24敲除小鼠相比，野生型小鼠中的胶原浓度的图。图3E是示出与CCL24敲除小鼠相比，野生型小鼠中MCD(甲硫氨酸胆碱缺乏)诱导的NASH模型中的NAFLD活化评分的图。图3F是接受正常饮食的野生型小鼠的肝组织学切片的照片，HE染色在x5放大率(图3F)和x20放大率(图3G)。图3H是接受MCD饮食的野生型小鼠的肝组织学切片的照片，HE染色在x5放大率(图3H)和x20放大率(图3I)。图3J是接受MCD饮食的CCL24敲除小鼠的肝组织学切片的照片，HE染色在x5放大率(图3J)和x20放大率(图3K)。

图4A-图4D是示出用MCD饮食喂食并用不同浓度的抗CCL24单克隆抗体(0.05mg/kg、0.5mg/kg和5mg/kg CM101)或PBS(媒介物)处理的小鼠中AST(图4A)、ALT(图4B)、胆红素(图4C)或胶原(图4D)的水平的图。图4E和图4F是MCD诱导的NASH实验小鼠的肝组织学切片的照片。图4G和图4H是用0.05mg/kg CM101处理的MCD诱导的NASH实验小鼠的肝组织学切片的照片。图4I和图4J是用0.5mg/kg CM101处理的MCD诱导的NASH实验小鼠的肝组织学切片的照片。图4K和图4L是用5mg/kg CM101处理的MCD诱导的NASH实验小鼠的肝组织学切片的照片。图4M是示出用不同浓度的CM101处理的MCD诱导的NASH实验小鼠的NAFLD活跃性评分的图。图4N是示出用不同浓度的CM101处理的MCD诱导的NASH实验小鼠的肝脏中CCL24水平的图。**pv≤0.05。

图5A-图5N是示出在非酒精性脂肪性肝炎的STAM模型中用抗CCL24单克隆抗体(CM101-7.5mg/kg，n＝8)或对照IgG(n＝8)处理的效果的图和图像。

图5A-图5D是用对照IgG(图5A和图5B)或用CM101抗体(图5C和图5D)处理的H&E-染色的肝脏切片的代表性图像。图5E是示出NAFLD活跃性评分(NAS)的图。图5F是示出肝细胞气球样变(ballooning)评分的图。图5G和图5H是在用对照IgG处理后通过天狼星红染色评估的肝纤维化的图像。图5I和图5J是在用CM101抗体处理后通过天狼星红染色评估的肝纤维化的图像。图5K是说明用CM101抗体处理的小鼠相对于对照的平均天狼星红染色的图。图5L-图5M是在用对照IgG(图5L)或用CM101抗体(图5M)处理后通过肝脏切片中α-SMA表达评估的肝纤维化的代表性图像。图5N是比较用CM101抗体处理的小鼠相对于对照的α-SMA表达的图。

图6A-图6W是示出在硫代乙酰胺(TAA)毒性诱导的肝纤维化大鼠模型[首次用于实验(n＝5)，TAA诱导(n＝10)和TAA+CM101(2.5mg/kg)处理的大鼠(n＝10)]中用抗CCL24单克隆抗体(CM101)处理的效果的图和图像。图6A-图6I是大鼠肝脏的代表性宏观图像，包括来自3只健康大鼠的对照肝脏(图6A-图6C)、来自3只具有TAA诱导的纤维化的大鼠的肝脏(图6D-图6F)和来自3只用CM101抗体处理的具有TAA诱导的纤维化的大鼠的肝脏(图6G-图6I)。图6J是呈现出肝酶ALP、AST和ALT的水平的图。图6K-图6T是首次用于实验的动物(图6K-图6L)、两只具有TAA诱导的纤维化的动物(图6O-图6R)和两只用CM101抗体处理的具有TAA诱导的纤维化的动物(图6S-图6T)的肝脏切片中胶原沉积的H&E染色和天狼星红染色的代表性图像。图6U-图6V是图示出纤维化(图6U)和炎症(图6V)水平的两个图。图6W是代表由sircol测量的胶原含量的图。

图7A-图7D是FACS图，示出了与PSC患者(图7C-图7D)相比，来自健康对照(图7A-图7B)的人PBMC上的代表性CCR3表达。图7E是总结健康志愿者相对于PSC患者中CCR3表达百分比的图。图7F-图7G是示出用抗CCL24抗体染色的来自PSC患者的肝脏切片的照片。图7H-图7I是示出用抗CCR3抗体染色的来自PSC患者的肝脏切片的照片。

图8是呈现出与媒介物相比，在用抗CCL24单克隆抗体(5mg/kg的CM101)处理的PSC诱导的实验小鼠模型中肝酶(图8A-图8D)和包括代表性图片的组织学肝评估(图8E-图8N)的图。图8A-图8D是呈现出用CM101抗体处理的PSC诱导的实验小鼠模型中的ALK磷酸酶水平(图8A)、总胆红素磷酸酶水平(图8B)、AST水平(图8C)和ALT水平(图8D)的图。图8E-图8N是组织学肝脏切片的HE染色，包括在x10放大率(图8E)和x40放大率(图8F)的健康对照；在x10放大率(图8I)和x40放大率(图8J)的ANIT处理的小鼠，以及在x10放大率(图8K-图8M)和x40放大率(图8L-图8N)的用CM101抗体处理的ANIT处理的小鼠的代表性图片。

图9A-图9F是在伪手术对照(图9A和图9B)(n＝5)、用PBS处理的动物(图9C和图9D)(n＝10)和用抗CCL24单克隆抗体(CM101)处理的动物(图9E和图9F)(n＝10)中胆管炎大鼠模型(BDL)中的纤维化的天狼星红染色的代表性图像。图9G是用抗CCL24单克隆抗体(CM101)、PBS或伪手术对照(分别为n＝10、10和5)处理的胆管炎大鼠模型(BDL)中纤维化的天狼星红染色的定量图。

图10A-图10E是代表性FACS图，展示了在未活化的细胞中(图10A)、在未用HCM101抗体处理的情况下(图10B)或在用HCM101抗体处理后(图10C)具有高CCL24水平活化的细胞(NAFDL患者血清)中、以及在未用HCM101抗体处理的情况下(图10D)或在用HCM101抗体处理后(图10E)具有低CCL24水平活化的细胞(NAFDL患者血清)中完全人源化抗体HCM101对α-SMA的细胞内表达的影响。

图11A示出了CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子1)与HCM101的代表性Biacore结合曲线。

图11B示出了CCL7(MCP3)与HCM101的代表性Biacore结合曲线。

图12A-图12F示出了在DiscoverX系统中趋化因子受体活化，其由β-抑制蛋白募集或cAMP抑制指示。

图12A是代表β-抑制蛋白的募集曲线的图，指示通过结合递增浓度的CCL24活化CCR3受体。RLU-相对光单位。

图12B是图示出通过HCM101抑制CCL24依赖性CCR3受体活化的图。该测定在恒定的80nM的CCL24浓度和递增的HCM101浓度进行。

图12C是图示出用于GPCR活化的DiscoverX cAMP生物测定的图，其中曲线表示通过递增浓度的CCL24活化CCR5趋化因子受体。

图12D是示出不同浓度的HCM101对CCL24活化CCR5的抑制作用的图。

图12E是示出通过与递增浓度的人CCL11(nM)孵育活化CCR5(示出为活性％)的图。

图12F是示出不同浓度的HCM101对CCL11活化CCR5的抑制作用的图。

具体实施方式

本发明基于令人惊讶的发现，即针对CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)多肽的构象表位并结合和抑制CCL24(以及另外的趋化剂、促炎性CCR3结合趋化因子：嗜酸性粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3/1)的活性的单克隆抗体在肝脏病理的治疗中是有用的，如在NASH和胆汁淤积的动物模型中证明的。本发明的抗CCL24抗体有效降低各种肝酶(例如，ALT、AST、碱性磷酸酶和胆红素)在肝损伤后增加的血清水平。如通过组织学检查评估的，本发明的抗体还有效减少各种疾病模型中的肝损伤或坏死，并且还减弱肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞的转变。例示的抗CCL24鼠单克隆抗体(在本文中被称为CM101，US 9,067,989)及其人源化版本HCM101(WO 2015/132790)涉及用于治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性紊乱、单核细胞相关的紊乱或过敏性特应性紊乱。US9,067,989和WO 2015/132790两者通过引用并入本文。

本发明首次提供了抗体在处理肝脏紊乱中的新用途。

因此，在其第一方面，本发明提供了一种分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段，用于在肝脏病理的处理中使用。

术语“嗜酸性粒细胞趋化因子2”(嗜酸性粒细胞趋化蛋白2)、“CCL24”(趋化因子(C-C基序)配体24)或“MPIF-2”(髓样祖细胞抑制因子2)可互换地使用，并且指的是由位于人类染色体7上的人类CCL24基因编码的属于CC趋化因子家族的细胞因子。CCL24与趋化因子受体CCR3相互作用。CCL24活性包括诱导嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞的趋化性，以及诱导内皮和平滑肌细胞的血管生成和迁移响应。

术语“抗体”指的是由免疫球蛋白基因编码的多肽，其特异性结合并识别抗原，即CCL24。

先前示出了本发明的抗CCL24抗体识别若干种不同的促炎性CCR3结合趋化因子(WO 2015/132790)。针对CCL24产生的抗体随后被发现结合并有效减弱另外的趋化因子(例如，嗜酸性粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3)的活性。在一个具体的实施方案中，抗体以高于对其它所测试的趋化因子的亲和力结合CCL24。明显地，本发明的抗体识别这些促炎性CCR3-结合趋化因子中的交叉反应性表位。

在优选的实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。如本文定义的术语“单克隆抗体(monoclonal antibody)”、“单克隆抗体(monoclonal antibodies)”或“mAb”指的是基本上同源的抗体群体，即除了可能以较小量存在的可能天然发生的突变之外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点。

单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法制备和纯化。例如，单克隆抗体可以由从被免疫的动物(例如大鼠或小鼠)的脾或淋巴结提取的B细胞通过在有利于杂交细胞生长的条件下与永生化B细胞融合而制备。

对小鼠的免疫可以例如如WO 2010/086854中描述的进行。简言之，对小鼠的免疫可以通过例如用完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)乳化的期望的抗原，即CCL24，或在N环区含有构象表位的CCL24的片段(例如50μg)初次皮下(s.c.)免疫进行。然后每2周施用两份具有用不完全弗氏佐剂乳化的抗原(例如50μg)的皮下加强注射液。在移除脾脏前4天，具有最高的中和抗体滴度的小鼠接受在PBS中的抗原(例如5μg)的另外的静脉内(i.v.)加强免疫。

在最后的加强免疫后(例如，四天)，移除具有最高的中和抗体滴度的小鼠的脾脏，并且使用聚乙二醇将脾细胞融合至小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0细胞)，如先前描述的(G.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495–497)。在融合后，杂交瘤细胞通过使细胞在HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)培养基中生长来选择。然后例如使用下文描述的ELISA测定筛选细胞克隆用于特异性抗体产生。

单克隆抗体的纯化可以基于例如亲和层析，即使用与特定表位缀合的亲和柱。

如本领域已知的，示例性抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”和一条“重链”。每条链的N-末端定义主要负责抗原(或表位)识别的约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。

因此，术语“重链可变区”(V_H)和“轻链可变区”(V_L)分别指的是这些重链和轻链。更具体地，可变区被细分为高变区和框架(FR)区。相对于给定位置最常见的氨基酸，高变区在该位置具有高比率的不同的氨基酸。具有更稳定的氨基酸序列的四个FR区将高变区分开。高变区直接接触抗原表面的一部分。出于该原因，高变区在本文中被称为“互补决定区”，或“CDR”。

从N-末端到C-末端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。CDR主要负责结合至抗原的表位。从N-末端依次编号，每条链的CDR通常被称为CDR1、CDR2和CDR3，并且也通常由特定CDR所在的链标识。

因此，互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3指的是从抗体的重链的N-末端起始的三个互补决定区，并且互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3指的是从抗体的轻链的N-末端起始的三个互补决定区。

在一些实施方案中，分离的抗CCL24单克隆抗体是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或完全人源化抗体。

如本文定义的术语“嵌合”抗体指的是重链和/或轻链的一部分源自特定物种，而所述链的剩余部分源自另一物种的抗体。

嵌合抗体可以通过本领域已知的任何方法制备，例如如下文描述的。

鼠-人嵌合抗体可以通过以下方式制备：扩增和克隆鼠的编码抗体可变区的V_H和V_L基因，然后表达鼠-人嵌合抗体。为此，从被证实分泌具有期望特性的抗体的鼠抗-CCL242杂交瘤细胞中分离总RNA，并且使用oligo(dT)₁₅引物、M-MLV和AMV逆转录酶合成cDNA。重链可变基因和轻链可变基因(V_H和V_L)的扩增可以使用针对各个基因的框架1的5’末端(基本上如Benhar和Reiter(Benhar,I.和Reiter,Y.(2002)Curr.Protoc.Immunol.Chapter 10:Unit10 19B)中所描述的)以及针对3’末端的恒定区(分别为C_H1或C_k)的一组引物进行。

然后可变基因使用非简并引物再扩增，在所述非简并引物的两端引入限制性位点以用于克隆到，例如基于pCMV的抗体表达载体中。

所扩增的重链可变基因和轻链可变基因被分别纯化、消化并克隆到合适的哺乳动物全长Ig表达载体中，所述表达载体为每条链提供相应的信号肽和恒定基因，导致IgG1/k鼠人嵌合抗体表达。

术语“人源化”抗体通常指的是非人类(例如，鼠)抗体的形式，其包含源自人的免疫球蛋白框架以及在CDR处和任选地在其它相关位置处的源自非人的免疫球蛋白的最少序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有期望的特异性、亲和性和活性的高变区(供体抗体)的残基取代。

如本文使用的，术语“完全人源化”抗体涉及被设计成仅具有人序列的抗体。本发明的完全人源化抗体使用Composite Human Antibodies^TM技术来制备，该技术使抗体在患者中的免疫原性最小化。在该人源化技术中，源自不相关的人抗体的可变(V)区的多个序列区段用作起始抗体的互补决定区(CDR)的接受体。通过仔细选择人序列区段并应用计算机模拟工具，避免了CD4+T细胞表位，从而与标准的人源化抗体相比降低了免疫原性的风险同时保留了抗体的亲和力和特异性。这样的抗体仅包含人序列，并因此被定义为“完全人源化的”。

如本文使用的术语“人抗体”指的是这样的抗体，其具有对应于人产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列和/或已经使用本领域已知的用于制备人抗体的任何技术被制备。该定义特别地排除了含有非人抗原结合残基的人源化抗体。

人源化抗体和人抗体的制备是本领域熟知的。抗体也可以使用噬菌体展示来制备。如本领域已知的，抗体噬菌体展示(APD)基于细菌噬菌体的遗传工程化和几轮重复的抗原指导的选择以及噬菌体繁殖。

APD方法开始于抗体文库制备，通过从所选择的细胞来源(例如，外周血单核细胞)制备高质量的RNA。将该RNA逆转录成cDNA，cDNA用于所编码的抗体的V_H链和V_L链的PCR。此步骤之后是将可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)的PCR产物连接到噬菌体展示载体中，以mAb克隆的分析结束。

为了制备大量抗体(嵌合的、人源化的、完全人源化的或人的)，表达抗体的稳定细胞系可以通过用含有抗体的重链和轻链两者的Ig表达载体转染细胞(例如CHO细胞)来制备。抗体然后可以在现有技术状态的单次使用生物反应器系统中制造。可以使用良好确立的单克隆抗体纯化方法将抗体纯化为临床级。然后可以基于上清液中的抗体水平选择和扩增高度抗CCL24抗体产生克隆，如通过本领域已知的任何方法，例如CCL24特异性ELISA测定测试的，如下文详述的。针对特定克隆开发的主细胞库可以用作所有临床级批次的起始生长材料。

在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗CCL24鼠抗体(在本文中被称为CM101)或其任何抗原结合片段，用于在肝病的处理中使用，其中所述抗体选自由以下组成的组：

a.包含由与SEQ ID NO:9具有至少90％同源性的核酸编码的重链和由与SEQ IDNO:10具有至少90％同源性的核酸编码的轻链的单克隆抗体或其片段，其保留抗体的结合活性；和

b.由杂交瘤D8(ECACC登录号D 809081702)分泌的单克隆抗体或其片段，其保留抗体的结合活性。

编码鼠抗体CM101重链的核酸序列表示为SEQ ID NO:9：

编码鼠抗体CM101轻链(κ)的核酸序列表示为SEQ ID NO:10：

本发明还包括抗体CM101的人源化版本和完全人源化版本。

在一些实施方案中，本发明提供了完全人源化的分离的抗CCL24抗体(在本文中被称为HCM101)或其任何抗原结合片段，用于在肝病的治疗中使用，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

根据本发明，VH CDR1包含由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列NSGMN或其变体；VHCDR2包含由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列WINTYNGEPTYTDDFKG或其变体，VH CDR3包含由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列HSYGSSYAMDN或其变体；VK CD1包含由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN或其变体；VK CDR2包含由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列VASNLKS或其变体；并且VK CDR3包含由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列QQSNEEPWT或其变体。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了包含互补决定区VH CDR3的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段，用于在肝脏病理的治疗中使用，该互补决定区VH CDR3包含由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列HSYGSSYAMDN。

上文的分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6表示的CDR序列CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3也在它们相应的重链序列和轻链序列的背景内呈现：

本文例示的分离的完全人源化多特异性单克隆抗体的重链的氨基酸序列由SEQID NO:7表示，并且具有以下氨基酸序列：QIQLVQSGPELKKPGASVKVSCRASGYPFTNSGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLRNEDTATYFCASHSYGSSYAMDNWGQGTSVTVSS。

本文例示的分离的人源化多特异性单克隆抗体的轻链的氨基酸序列在本文中由SEQ ID NO:8表示，并且具有以下氨基酸序列：

因此，在另外的实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的抗体是，其中所述抗体是完全人源化抗体，该完全人源化抗体包含由SEQ ID NO:7或其变体表示的重链可变区以及由SEQ ID NO:8或其变体表示的轻链可变区。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的抗体是，其中所述抗体是完全人源化抗体，该完全人源化抗体包含由SEQ ID NO:1-6表示的六个CDR序列、以及与SEQID NO:7具有至少90％序列同源性的重链可变区和与SEQ ID NO:8具有至少90％序列同源性的轻链可变区。

在另一个实施方案中，本发明提供了与一种抗体结合相同的表位的分离的单克隆抗体，该一种抗体包含：

(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:4)的轻链CDR1、包含VASNLKS(SEQ ID NO:5)的轻链CDR2、和包含QQSNEEPWT(SEQ ID NO:6)的轻链CDR3，

用于在肝脏病理的治疗中使用。

本发明还提供了治疗肝脏病理的方法，包括向有相应需要的受试者施用如上文定义的抗体。

在另一个实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的抗体是，其中所述抗体是包含由SEQ ID NO:11表示的核酸序列或其变体编码的重链可变区以及由SEQ ID NO:12表示的核酸序列或其变体编码的轻链可变区的完全人源化抗体。

SEQ ID NO:11：

SEQ ID NO:12：

*CDR核苷酸序列被加粗并加下划线。

本发明还包括重链可变区和轻链可变区的变体。变体可以包含不改变本文描述的抗体的活性的重链和轻链的互补决定区或框架区中的突变。

术语“变体”意指与本文所特别标识的序列不同的氨基酸序列或核苷酸序列，其中一个或更多个氨基酸残基或核苷酸被缺失、取代或添加。

应当理解，如本文使用的术语“添加”意指向本文描述的序列任意添加氨基酸残基。

变体包含各种氨基酸取代。氨基酸“取代”是用具有相似或不同的结构和/或化学性质的另一个氨基酸取代一个氨基酸的结果。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质的相似性进行。

通常，变体包含保守氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

以下八组各自含有彼此为保守取代的其他示例性氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。

保守核酸取代是导致如上文定义的保守氨基酸取代的核酸取代。

根据本发明的变体还包括非极性到极性氨基酸取代，并且反之亦然。

如本文使用的，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”指的是天然存在的氨基酸和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。

变体序列指的是可以通过其氨基酸或核苷酸序列与本文描述的氨基酸序列或核苷酸序列(例如本文描述的抗体的重链和轻链的氨基酸序列或核苷酸序列)的同一性百分比来表征的氨基酸序列或核苷酸序列。

在一些实施方案中，如本文定义的变体序列指的是编码重链可变区和轻链可变区的核酸序列，各自具有在与本文描述的重链可变区和轻链可变区的序列相比时至少70％或75％的序列同一性、约80％或85％的序列同一性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列。

术语“肝脏病理”或“肝病”在本文中可互换地使用，并且涉及任何肝脏紊乱。肝脏病理通常包括肝硬化或肝瘢痕、由传染性原因(例如乙型肝炎或丙型肝炎)或非传染性原因(化学性或自身免疫性肝炎，包括酒精性脂肪性肝炎)引起的炎症(肝炎)、肿瘤、良性和恶性(肝癌)以及代谢紊乱。在某些实施方案中，本发明提供了一种抗CCL24抗体，用于在肝脏病理的治疗中使用，所述肝脏病理诸如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD，包括非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、胆汁淤积和肝内胆汁淤积性肝病，诸如原发性硬化性胆管炎(PSC)和原发性胆汁性肝硬化(PBC)。

本发明还提供了一种分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段，用于在以下中使用：

a.降低肝损伤后升高的肝酶(例如ALT、AST、碱性磷酸酶和胆红素)的血清水平；

b.减少肝损伤或坏死；和/或

c.减弱肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞的转变。

在一些实施方案中，所述升高的肝酶水平或所述肝损伤或坏死由如上文定义的肝脏病理引起。

在一些实施方案中，所述分离的抗CCL24抗体是鼠抗体(在本文中被称为CM101)或其任何抗原结合片段，其中所述抗体选自由以下组成的组：

a.包含由与SEQ ID NO:9具有至少90％同源性的核酸编码的重链和由与SEQ IDNO:10具有至少90％同源性的核酸编码的轻链的单克隆抗体或其片段，其保留抗体的结合活性；以及

在一些实施方案中，所述分离的抗CCL24抗体是完全人源化抗体(在本文中被称为HCM101)或其任何抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

术语“抗体的活性”意指抗体结合CCL24的能力，并且优选地抑制由CCL24介导的生物学功能的能力，例如抑制细胞募集或趋化性(例如嗜酸性粒细胞或单核细胞或成纤维细胞的募集或趋化性)的能力。生物学功能可以使用本领域熟知的方法在体内或体外测量。若干这样的体内测定在下文的实施例中描述。

本发明的抗体与其靶蛋白的结合可以例如使用ELISA测定来测量。

本发明还包括本发明的分离的抗CCL24单克隆抗体的任何抗原结合片段。这样的抗原结合片段可以是例如Fab和F(ab’)₂，它们能够结合抗原。这样的片段可以通过本领域已知的任何方法，例如通过蛋白水解裂解，使用诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab’)₂片段)的酶来制备。

因此，在一些实施方案中，抗体片段选自由以下组成的组：Fv、单链Fv(scFv)、能够结合抗原的重链可变区、能够结合抗原的轻链可变区、Fab、F(ab)₂’及其任何组合。

在其方面的另一个方面中，本发明提供了一种分离的核酸分子，包含编码根据本发明的抗体或其任何抗原结合片段的核苷酸序列，其中所述抗体用于在肝病的治疗中使用。

如本文定义的术语“核酸”或“核酸分子”指的是核苷酸的聚合物，其可以是单链的或双链的，其是多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)，并且在适当情况下为核糖核酸(RNA)。该术语还应当被理解为包括从核苷酸类似物制备的RNA或DNA的等价物、类似物，并且如适用于所描述的实施方案，包括单链(诸如有义或反义)和双链的多核苷酸。本文中使用的术语DNA还包括cDNA，即通过逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)的作用从RNA模板产生的互补或拷贝DNA。

本发明还提供了包含如本文定义的分离的核酸分子的表达载体。

如本文使用的“表达载体”有时指的是“表达媒介物”或“表达构建体”，包括诸如质粒、病毒、细菌噬菌体、可整合的DNA片段的载体，和其它能够使DNA片段整合到宿主基因组的媒介物。表达载体通常是含有期望的基因或其片段和可操作地连接的遗传控制元件的自我复制的DNA或RNA构建体，所述遗传控制元件在合适的宿主细胞中被识别并实现期望的基因的表达。这些控制元件能够实现在合适的宿主内的表达。根据本发明的表达载体可能能够在细菌、酵母、或哺乳动物宿主细胞(仅举几例)中表达。

在其方面的又另一个方面中，本发明提供了用根据本发明的分离的核酸分子或用根据本发明的表达载体转染的宿主细胞。

如本文使用的，术语“宿主细胞”指的是易于引入根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的表达载体的细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞或NS0细胞。将根据本发明的分离的核酸分子或表达载体转染到宿主细胞可以通过本领域已知的任何方法进行。

在其方面的又另一个方面中，本发明提供了如下文定义的免疫缀合物(immunoconjugate)，该免疫缀合物包含根据本发明的抗体或其任何抗原结合片段以及另外的治疗剂。

如本文定义的术语“免疫缀合物”指的是与另外的剂缀合(连接或接合)的根据本发明的抗体或其任何抗原结合片段。免疫缀合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过使另外的剂与根据本发明的抗体交联或通过重组DNA方法来制备。

本发明的抗CCL24抗体可以与至少一种另外的治疗剂组合施用。

本文使用的术语“另外的治疗剂”指的是可以用于治疗肝病的任何剂。根据某些实施方案，所述至少一种另外的治疗剂选自由化学治疗剂、细胞因子、肽、抗体和抗生素组成的组。

在某些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于类法呢醇X受体(FXR)激动剂(例如咖啡醇、鹅脱氧胆酸、奥贝胆酸(obeticholic acid)、fexaramine)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂、抗趋化因子或细胞因子单克隆抗体、抑制趋化因子或细胞因子功能的小分子、抗炎剂和抗纤维化剂，包括类固醇和可溶性蛋白抗炎剂。

在某些实施方案中，另外的治疗剂是另外的抗体。如本文定义的术语“另外的抗体”指的是可以与本发明的抗体组合使用的不是根据本发明的抗体的抗体。

本发明还提供了一种药物组合物，包含本发明的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或如本文定义的免疫缀合物作为活性成分、以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，其中所述药物组合物用于在肝病的治疗中使用，和/或用于在以下中使用：

b.减少肝损伤或坏死；和/或

c.减弱肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞的转变。

本发明的“药物组合物”通常包含如本文定义的抗体或其任何抗原结合片段以及缓冲剂、调节组合物的渗透压的剂、以及任选地一种或更多种如本领域已知的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

如本文使用的术语“药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂”包括如本领域已知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂等。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。每种载体应该是药学上可接受的和生理学上可接受的，其意义在于与其它成分相容并且对受试者不是有害的。设想了任何常规介质或剂在治疗性组合物中的使用，除非其与活性成分不相容。

在其它实施方案中，根据本发明的药物组合物还包含另外的治疗剂。另外的治疗剂的非限制性实例包括FXR激动剂、PPAR激动剂、抗趋化因子或抗细胞因子单克隆抗体、或抑制趋化因子或细胞因子的活性的任何小分子、蛋白质或肽，抗炎剂，包括类固醇和抗纤维化剂。

在具体的实施方案中，本发明涉及包含分离的抗CCL24完全人源化抗体或其任何抗原结合片段的药物组合物，其中抗体包含由SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区，其中所述药物组合物用于在肝病的治疗中使用。

还提供了一种预防、治疗或改善肝病的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。

还提供了一种降低肝损伤后升高的肝酶(例如ALT、AST、碱性磷酸酶和胆红素)的血清水平的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。

还提供了一种减少肝损伤或坏死的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。

还提供了一种减弱肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞转变的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。

术语“受试者”或“患者”可互换地使用并且指的是可以受益于本发明的受试者，诸如哺乳动物(例如犬科动物(canine)、猫科动物(feline)、绵羊(ovine)、猪科动物(porcine)、马科动物(equine)、牛科动物(bovine)或人)。在一个具体的实施方案中，患者是人。

如本文定义的术语“预防”意指提供“预防性治疗(preventive treatment)”或“预防性治疗(prophylactic treatment)”，即以保护性方式起作用，以防御或防止肝病症状的出现，或肝病发作或进展。

应当理解，如本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或其形式意指降低、防止、治愈、逆转、改善、减弱、缓和、最小化、抑制或停止疾病或状况的恶性影响或延迟肝病的一种或更多种临床迹象的发作，如本文定义的。

根据本发明的施用可以通过以下途径中的任一种进行：口服施用、静脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内或皮下注射；直肠内施用；鼻内施用、眼部施用或局部施用。

在具体的实施方案中，根据本发明的施用可以静脉内进行。在其它具体的实施方案中，施用可以腹膜内进行。在其它具体的实施方案中，施用可以通过吸入进行。

如本文定义的抗体或抗体片段、包含所述抗体或抗体片段的任何药物组合物或包含所述抗体或抗体片段的任何缀合物可以在疾病发作之前或之后被施用至受试者。

因此，在一些实施方案中，根据本发明的预防、治疗或改善肝病的方法是，其中根据本发明的所述分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段、或根据本发明的药物组合物在疾病发作之前或之后被施用至所述受试者。

用于本文定义的目的的根据本发明的分离的单克隆抗体或其任何抗原结合片段、或根据本发明的药物组合物的“治疗有效量”通过本领域已知的为了治愈、阻止或至少缓解或减轻医学状况的考量来确定。对于在本发明的方法中使用的任何制剂，剂量或治疗有效量可以最初从体外细胞培养测定或基于动物模型诸如本文详述的动物模型来估计。

在一些实施方案中，根据本发明的治疗有效量在0.01mg/kg至100mg/kg的范围内。

在其它实施方案中，根据本发明的治疗有效量在0.01mg/kg至40mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、或5mg/kg至10mg/kg的范围内。

在其它实施方案中，根据本发明的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或根据本发明的药物组合物以单一剂量或多个剂量被施用至受试者。

具体的示例性剂量包括但不限于0.75mg/kg、或2.5mg/kg、或5mg/kg、或10mg/kg，每个剂量作为单一每日剂量给予。在一个实施方案中，剂量在静脉内给予。

在本发明的上下文中，术语“有相应需要的受试者”指的是患有如本文定义的肝病的哺乳动物和特别地人类受试者。

本发明还提供了根据本发明的分离的抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段或根据本发明的药物组合物，用于在预防、治疗或改善如本文定义的肝病的方法中使用。

在具体的实施方案中，本发明提供了分离的完全人源化抗CCL24抗体或其任何抗原结合片段，其中抗体包含由SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区和由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区，用于在预防、治疗或改善如本文定义的肝病的方法中使用。

应当理解，术语“纯化的”或“分离的”指的是从其自然环境移出、分离或分开的分子，诸如氨基酸或核酸序列、肽、多肽或抗体。因此“分离的抗体”是纯化的抗体。如本文使用的，术语“纯化的(purified)”或“纯化(to purify)”也指的是从样品移除污染物。

如下文的实施例中示出的，本发明的抗体能够减少或抑制趋化因子受体CCR3和CCR5两者的活化。此外，本发明的抗体能够抑制CCL24诱导的和CCL11诱导的CCR5的活化。

因此，在另一个方面中，本发明提供了抑制细胞中的CCR5活化的方法，所述方法包括施用如上文定义的本发明的抗体。

因此，本发明的抗体可以用于治疗与CCR5活化相关的疾病或紊乱。这样的疾病或紊乱的非限制性实例是如上文定义的肝脏病理。

实施例

无需进一步详尽说明，认为本领域的技术人员可以使用前述描述，利用本公开内容至其最大程度。下面优选的具体实施方案因此将被解释为仅说明性的，并且不以任何方式限制所要求保护的发明。

本文未具体描述的本领域已知的标准分子生物学方案通常基本上遵循如Sambrook&Russell,2001。

本文未具体描述的本领域已知的标准药物化学方法通常基本上遵循由各个作者和编辑在Pergamon Press出版的系列“Comprehensive Medicinal Chemistry”。

材料和方法

人类受试者的血清中的趋化因子水平

根据制造商的方案，使用以下ELISA试剂盒确定NASH患者和原发性硬化性胆管炎(PSC)患者以及健康供体的血清中的嗜酸性粒细胞趋化因子-2的水平：Quantikine人CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)(R&D)。

人类患者的肝活检的免疫组织化学

人CCL24的免疫组织化学染色对来自NASH患者的肝活检的5μm厚的冷冻切片进行。用甲醇和丙酮固定后，将切片用非免疫兔和山羊血清封闭，然后与CAS封闭试剂孵育。随后，在室温加入第一抗体持续1小时。在洗涤后，加入生物素化的亲和纯化的山羊抗小鼠/兔抗体(Jackson)。然后将载玻片与0.3％H2O2孵育，随后进行另外的冲洗，并且在室温与链霉亲和素-过氧化物酶缀合物(Jackson)孵育持续30分钟。将载玻片用3-氨基-9乙基咔唑底物(Dako)显影持续15分钟，并且用苏木精复染。苏木精伊红(H&E)染色用于分析肝脏切片中NAFLD活化评分的变化。

来自小鼠的肝脏样品中的CCL24水平

将从小鼠获得的肝组织称重并悬浮在裂解缓冲液中(对于每10mg的组织——加入100μl含有抗蛋白酶的裂解缓冲液)。然后将组织用Polytron破碎，并且在4℃以14000rpm离心持续10分钟。弃去沉淀物，并且使用商业ELISA试剂盒(Abcam)测定上清液的CCL24水平。

小鼠肝脏切片中的H&E染色

收获小鼠肝脏，每只动物两个肝叶，并在处死当天固定在2.5％多聚甲醛(PFA)中。将组织修剪，包埋在石蜡中，以不超过5微米厚度切片，并且用苏木精&伊红(H&E)染色。使用显微镜(Olympus BX60)以X10、X20和X40的放大率拍摄照片。

根据NASH Clinical Research Network的Pathology Committee(Kleiner等人2015HEPATOLOGY,第41卷,第6期)定义的可接受的评分，对下列参数进行评估，以用于计算NAFLD活跃性评分。评分被定义为对于脂肪变性(0-3)、小叶炎症(0-3)和气球样变(0-2)评分的未加权总和；因此在从0至8的范围：

1.脂肪变性(实质受累的低至中等能力评估)

(0≤5％、1-5％-33％、2-33％-66％、3≥66％)。

2.炎症(所有炎症病灶的总体评估)(0＝无病灶、1：每200x视野≤2个病灶、2：每200x视野2个-4个病灶、3：每200x视野≥4个病灶。)

气球样变(0＝无、1＝气球样变化少、2＝许多细胞/突出的气球样变)

大鼠肝脏切片的天狼星红染色

将肝组织用10％缓冲的中性福尔马林固定并包埋在石蜡中。将切片(4μm)脱石蜡并且在室温(RT)用picro-天狼星红染色持续15分钟，脱水并用封固介质封固。使用OsteoMeasure图像分析软件程序(OsteoMetrics,Inc.,Atlanta,GA)配合Olympus光/落射荧光显微镜和视频子系统，测量染色的切片中的肝纤维化。为了评估STAM小鼠的picro-天狼星红染色的切片中的纤维化，使用数字照相机(DFC295；Leica,Germany)通过明视野图像(每个载玻片40个视野)来可视化和定量胶原沉积并且用ImageJ软件(美国国立卫生研究院(National Institute of Health)，USA)进行分析。

肝脏切片的免疫荧光染色

荧光免疫组织化学：

将肝组织切片(5μm厚)脱石蜡，再水合，并且在柠檬酸钠缓冲液(10mM，pH 6.0)中煮沸持续10分钟。将切片在PBS中洗涤，在2mg/ml甘氨酸中孵育持续10分钟以淬灭由游离醛引起的自体荧光，并且然后在室温用在PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭持续1小时。然后将切片在4℃与在具有1％BSA的PBS中稀释的以下第一抗体孵育过夜：小鼠单克隆抗人CCL24(1:100稀释；Chemomab,Tel Aviv,Israel)和大鼠多克隆抗人CCR3(1:50稀释；目录号MAB155-100；R&D Systems)。第二天，将载玻片在PBS中洗涤三次，并且在室温在黑暗中与在具有1％BSA的PBS中1:200稀释的作为第二抗体的Alexa Fluor-488缀合的山羊抗小鼠IgG或罗丹明红-X缀合的山羊抗大鼠IgG(Invitrogen,San Diego,CA,USA)孵育持续45分钟。不相关的同种型匹配和浓度匹配的小鼠和大鼠IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)被用作阴性对照。第二抗体的交叉反应性在对照实验中测试，其中省略了第一抗体。将细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Chemicon International,Temecula,CA,USA)复染。然后将肝脏切片用不变色的水性封固介质(Biomeda Gel Mount；Electron MicroscopySciences,Foster City,CA,USA)封固，并且用配备有全自动荧光轴的Leica DM4000 B显微镜(Leica Microsystems,Mannheim,Germany)检查。荧光图像用配备有Leica软件应用套件LAS V3.8的Leica DFC310 FX 1.4-兆像素数字彩色照相机(Leica Microsystems)拍摄。

ALT、AST、碱性磷酸酶和胆红素的测量：

将血液离心并获得血清。使用COBAS 6000测量血清中的ALT、AST、碱性磷酸酶和胆红素的水平。

产生对CCL24敲除的小鼠

CCL24敲除(KO)C57BL/6小鼠由CRISPR/Cas9介导的基因组工程产生。CCL24的Cas9mRNA和gRNA通过体外转录产生，并且然后注射到受精卵中用于KO小鼠产生。通过PCR、随后通过DNA测序分析对始创小鼠(founder mice)进行基因分型。阳性始创鼠被繁殖到下一代，通过PCR和DNA测序分析对其进行基因分型。进行另外的繁殖并建立如通过PCR基因分型所揭示的，CCL24的双敲除小鼠。对通过PCR和序列分析鉴定的潜在脱靶位点进行测试并证实为阴性。

具有诱导型NASH的CCL24敲除小鼠

如上文描述的，使用CRISPER技术产生C57BL背景上的CCL24敲除。将6周龄的WTC57BL小鼠或CCL24敲除小鼠用甲硫氨酸胆碱缺乏的饮食喂食持续4周。在4周后，处死小鼠，并且收获其肝脏以用于组织学和胶原测量(Sircol^TM)。从眼窝窦收集血液，以用于评估ALT、碱性磷酸酶和胆红素。

体内MCD饮食诱导的NASH模型

将6周龄的雌性C57BL小鼠用甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)的饮食喂食持续6周。从饮食开始后10天开始，用CM-101或PBS的100μl腹膜内注射液以5mg/kg、0.5mg/kg或0.05mg/kg每周两次对小鼠进行处理。在疾病症状出现后，开始用CM-101处理。

在6周后将小鼠处死，从眼窝窦收集血液(在4℃离心(3000×g)以获得血清，如下文关于ANIT模型所描述的)，以用于评估天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶和胆红素的水平。此外，收获肝脏以用于组织病理学分析，并且经历石蜡包埋以用于苏木精伊红(H&E)染色。冷冻组织被用于胶原测定(Sircol^TM)和肝脏CCL24水平的评估。

用于NASH诱导的STAM小鼠模型

在出生后2天，将200μg链脲佐菌素(STZ,Sigma-Aldrich,USA)溶液的单次皮下注射液施用至雄性C57BL/6小鼠，之后从4周龄后进行高脂肪饮食(HFD，57千卡％脂肪,目录#HFD32,CLEA Japan,Japan)。从6周龄至9周龄，每周两次以10μl/kg的体积腹膜内施用对照IgG和CM101(7.5mg/kg)。

α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)诱导的胆汁淤积小鼠模型

在第1天通过口服管饲(10ml/kg)用ANIT(溶解在油中，60mg/kg)处理雌性C57BL小鼠。通过口服管饲对对照组施用橄榄油。将CM101或媒介物，每次5mg/kg，IP施用至ANIT处理组。在ANIT施用后48小时，用异氟烷将小鼠麻醉并安乐死。收集血液样品并且在4℃离心(3000×g)获得血清，以测试：ALT、AST、ALP、胆红素(化学组)。此外，将肝脏收集在福尔马林中，并包埋在石蜡中以用于苏木精和伊红(H&E)染色。

由胆管结扎诱导的胆汁淤积

将雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(8周龄)在腹膜内用氯胺酮/赛拉嗪(氯胺酮50mg/kg和赛拉嗪10mg/kg)麻醉。将腹壁的手术部位刮毛和清洁，并且将肝脏轻轻牵拉以显示出胆管以用于结扎。对照伪手术的动物在没有结扎的情况下经历相同的程序。从第0天(结扎日)开始，每周两次对大鼠施用10mg/kg体积的PBS或HCM101 10mg/kg的静脉内注射液。在14天后，通过处死实验动物终止实验。

大鼠中硫代乙酰胺(TAA)诱导的肝纤维化模型

为了疾病诱导，每周两次对7-9周龄雄性Wistar大鼠腹膜内注射硫代乙酰胺(250mg/kg)(Sigma,目录#172502)，持续8周。从第4周开始，HCM101处理的动物(2.5mg/kg)每周两次接受抗体的静脉内注射液。

Biacore

使用Biacore T200评估HCM101的亲和常数。该方法使用表面等离子体共振(SPR)电光现象来测量结合配偶体之间的结合常数和开/关速率。将HCM101固定在CM-1芯的表面上，并且将嗜酸性粒细胞趋化因子1(CCL11)/MCP3(CCL7)的溶液通过表面。测量SPR角的变化，并该变化能够确定KD(平衡解离常数)。

DiscoverXβ-抑制蛋白PathHunter和cAMP Hunter^TM eXpress CCR5测定

为了评估配体结合后G蛋白偶联受体(GPCR)活化，根据制造商的方案使用cAMPHunter^TM和β-抑制蛋白PathHunter测定试剂盒(DiscoverX,Fremont,United States)。简言之，在PathHunter GPCR β-抑制蛋白测定中，将被工程化以共表达ProLink^TM(PK)加标签的CCR3和酶受体(EA)加标签的β-抑制蛋白的CHOβ-抑制蛋白CCR3细胞铺板在96孔板中。为了诱导趋化因子受体活化，将细胞暴露于升高的CCL24水平(0nM、7.8nM、15.6nM、31.25nM、62.5nM、125nM、500nM和2000nM)。以80nM的恒定的CCL24浓度，评估HCM101的抑制作用，其中升高的抗体浓度为5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml和135μg/ml。由CCR3-PK受体的活化诱导的β-抑制蛋白-EA的募集导致两个β-半乳糖苷酶片段(EA和PK)的互补。然后将PathHunter检测试剂底物加入到细胞中，持续60min的孵育时间段，在RT，黑暗，能够使底物的β-半乳糖苷酶酶促水解。产生的化学发光信号通过Veritas^TM Microplate Luminometer(TurnerBioSystems Inc.)评估。为了评估CCR5活化，使用cAMP Hunter^TM系统。设计cAMP Hunter^TMeXpress CCR5 CHO-K1 Gi细胞以检测细胞内cAMP水平响应于受体的激动剂刺激的变化。将细胞铺板在96孔板中并孵育过夜。将细胞暴露于升高浓度的激动剂(0.15625μM、0.3125μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM和5μM的mip-1α或CCL24)，并且在黑暗中与cAMP工作检测溶液孵育持续1h。在加入cAMP溶液后，在评估化学发光信号之前，进行另外3h的孵育时间段。为了评估HCM101抑制，在升高的HCM101水平(1μg/ml、2μg/ml、7μg/ml、20μg/ml和60μg/ml)的情况下，加入恒定的100nM的CCL24。

胶原含量的测量

可溶性胶原使用Sircol可溶性胶原测定(Biocolor,Belfast,UK)来定量。肝脏样品从用CM101(5、20或100μg/ml)、IgG或PBS处理的小鼠获得。将样品提取到酸-胃蛋白酶溶液中。根据制造商的方案分析样品的胶原含量。简言之，将100μl的样品加入到1ml的比色试剂(苦味酸(picric acid)中的染料SR)中并搅拌持续30min，然后在10,000g离心持续10min。用碱性试剂(1N NaOH)从沉淀物释放SR染料，并且在酶标仪上在555nm处获取分光光度读数。

活化的人肝星状细胞的SMA-α测量

将肝星状细胞在无血清DMEM培养基中培养持续24小时。在第0天获得基线细胞样品，用于SMA-α的基础测量。

在有或没有HCM101(5μg/ml)的情况下,将细胞与含有高水平或低水平的CCL24的1％NAFLD患者的血清孵育持续48小时，如先前通过ELISA测定的。在48小时后，将细胞离心并使用商业试剂盒(Flow Cytometry Fixation&Permeabilization Buffer Kit I,R&Dsystems；Anti-Human alpha-Smooth Muscle Actin PE,R&Dsystems)染色以用于细胞内SMA-α荧光检测。荧光信号通过FACS(Galius)测量，并且使用Kaluza软件进行分析。

肝脏切片的α-SMA染色

从包埋在O.C.T.中的冷冻肝组织切下切片，固定在丙酮中，并且用0.03％H2O2处理持续5分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。将切片在室温与抗α-SMA抗体(Abcam,USA，稀释1:200)孵育持续1小时。在与第二抗体(HRP-山羊抗兔)孵育后，使用3,3’-二氨基联苯胺/H2O2溶液(Nichirei Bioscience Inc.)进行酶-底物反应。α-SMA-阳性区域的明视野图像使用数字照相机(DFC295；Leica,Germany)以200倍放大率在中心静脉周围拍摄，并且使用ImageJ软件测量40个视野/切片中的阳性区域。

实施例1：在具有NASH和NAFLD的患者的血清和肝活检两者中发现升高的CCL24水平

为了检查CCL24在NASH中的潜在作用，评估了与健康受试者相比NAFLD患者的血清中的CCL24的水平。结果指示具有高FIB 4评分的患者中的CCL24的2倍增加(pv≤0.01)和具有低FIB 4评分的患者中的CCL24的1.5倍增加(pv≤0.05)，如图1A中示出的。高纤维化评分指示NASH的较高的概率。因此，NAFLD患者中的升高的CCL24水平也与取自健康或NAFLD患者的血液样品的PBMC上升高的CCR3表达相关(图1B-图1N)。使用用抗CCR3抗体染色的分离的PBMC的FACS分析来测量CCR3水平。如在图1B-图1C中可以看出，NAFLD患者的4.88％、3.2％或4.69％的PBMC示出CCR3表达，相比之下健康患者的PBMC中0.47％、0.54％或0.61％示出CCR3表达。

此外，在取自NASH患者的肝活检中检测到显著升高的CCL24表达(图2A-图2C)，而在健康肝脏中未检测到CCL24表达(图2D-图2E)。图2F和图2G示出了CCL24相关受体CCR3也在肝脏中表达。不希望被理论束缚，似乎CCL24在NASH的进展中可能具有重要作用。在下一个实施例中，抗CCL24单克隆抗体的作用在肝疾的体内模型中评估。

实施例2：CCL24敲除小鼠的MCD诱导的NASH模型中的肝功能的表征

CCL24敲除(KO)小鼠如材料和方法部分中描述的产生。通过喂食CCL24 KO C57BL小鼠MCD在这些小鼠中诱导NASH。NASH也在具有正常遗传C57BL背景的对照组(被称为“野生型”)中诱导。测试各种肝脏特征，以证明CCL24敲除对疾病进展的影响。如图3中示出的，ALT(图3A)、ALP(图3B)和胆红素(图3C)的血清水平在野生型小鼠中比在CCL24敲除小鼠中显著更高。类似地，如图3D中示出的，肝脏中的胶原浓度在野生型小鼠中比在CCL24敲除小鼠中高得多。此外，如图3E中示出的，被开发作为测量治疗试验期间NAFLD的变化的工具的对非酒精性脂肪性肝病的特征评分的系统——NAS评分(NAFLD活跃性评分)在基因敲除小鼠中比在野生型中低得多。不希望被理论束缚，结果清楚地证明了CCL24在NASH发展中的重要性。图3F至图3K示出了代表性HE染色的肝脏切片。

实施例3：用抗CCL24 mAb CM101处理降低了小鼠模型的NASH特征

使用鼠抗CCL24抗体CM101进一步评估CCL24对NASH进展的抑制作用。鼠CM101是针对人CCL24的鼠单克隆抗体(WO2010/086854)。为了评估用CM101处理对NASH的影响，使用甲硫氨酸胆碱缺乏的(MCD)饮食在鼠模型中诱导NASH。

通过用MCD饮食喂食C57BL小鼠持续6周来诱导NASH。用正常食物饮食喂食对照组。

当疾病症状已经存在时，从第10天开始，对MCD喂食的小鼠每周两次腹膜内注射CM101(0.05mg/kg、0.5mg/kg、5mg/kg)或PBS。在饮食开始后6周，将小鼠处死，并且从所有组获得肝脏样品和血液样品。

与用PBS或更低剂量处理的小鼠相比，在用5mg/kg CM-101处理的小鼠中观察到NASH参数的显著降低。如图4中示出的，5mg/kg CM-101高剂量减弱了所有测试参数(肝酶、肝胶原水平和肝组织学评分)的增加。与PBS处理的小鼠相比，在高剂量CM-101处理组中ALT、AST和胆红素(图4A-图4C)显著降低(p<0.05)。CM-101的作用在肝脏胶原浓度的显著降低中也是明显的，表明用5mg/kg CM-101处理的组中的肝脏胶原降低了95％，使其恢复回到正常的基础胶原水平(如图4D中示出的)。H&E肝染色中NAFLD活化评分的确定(图4E-图4L中的组织学切片的图)揭示了用5mg/kg CM-101处理的组中从7分显著降低到5分(图4M)。

最后，为了证实肝脏内的靶接合，评估了肝脏中CCL24的水平，示出由于用CM101处理，蛋白质表达的充分降低(图4N)。

实施例4：通过CM101处理对STAM小鼠NASH模型的NAFLD活跃性评分和纤维化的改善

CM101处理的抗纤维化和抗炎作用在用于NASH的STAM小鼠模型中进一步评估。STAM小鼠代表与人类的NASH发展的病理生理学过程非常相似的模型，呈现了从脂肪变性、通过NASH到纤维化和肝癌的所有疾病阶段。这些动物在出生后2天接受单一皮下注射链脲佐菌素，随后接受高脂肪饮食，这诱导类似肝脏损伤的NASH。

组织病理学分析示出，与对照IgG处理组相比(图5E)，将7.5mg/kg的CM101施用至STAM小鼠降低了通过H&E染色评估的肝损伤(图5A-图5D)并且将NAFLD活跃性评分(NAS评分)显著减少了32％。该作用主要由肝细胞气球样变的显著改善引起，这降低了65％(图5F)。与对照组相比，CM101显著减少了肝胶原的累积和纤维化，由天狼星红阳性区域减少所证明(图5G-图5K)。代表肝星状细胞活化的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)也在STAM小鼠中评估，肝星状细胞负责肝中纤维化的建立和大部分胶原沉积。与对照IgG组相比，抗CCL24处理导致α-SMA-阳性染色的区域显著减少(图5L-图5N)。

实施例5：CM101显著降低大鼠TAA诱导的肝纤维化模型中的肝损伤和纤维化

为了确定HCM101处理对纤维化的具体作用，研究了大鼠毒性(TAA)诱导的纤维化模型。与未处理的对照相比，对CCL24的抑制导致肝损伤的减少，由显著降低的肝酶水平所指示。此外，肝损伤的宏观检查揭示肝脏病理的明显改善，具有减少的再生结节和减少的损伤(图6A-图6B)。通过对肝脏切片的天狼星染色来评估纤维化示出了，与未处理的对照相比，HCM101处理组的胶原沉积平均减少5倍并且炎症减少近2倍(图6C)。通过Sircol定量进一步评估胶原沉积揭示胶原含量显著降低45％(图6D)。

实施例6：CCL24及其受体CCR3在PSC患者的肝脏和循环中过表达

使用商业抗CCR3抗体评估来自原发性硬化性胆管炎(PSC)和健康志愿者(分别为n＝10、n＝22)的PBMC上的CCR3水平。如图7A-图7E中示出的，与健康个体(0.68％±0.36)相比，在PSC患者中发现CCR3水平显著增加(3.94％±1.35)。使用免疫荧光评估PSC患者的肝脏中的CCL24和CCR3。如图7F-图7I中示出的，CCL24和CCR3水平在免疫细胞、胆管细胞和肝细胞中显著地过表达。

实施例7：CM101稳健地改善实验性原发性硬化性胆管炎(PSC)模型中的肝损伤

为了评估CM101在PSC动物模型中的作用，使用由ANIT化合物诱导的啮齿动物胆汁淤积模型。

在ANIT诱导的胆汁淤积小鼠中，通过CM101处理，该疾病模型典型的升高的胆红素、碱性磷酸酶、ALT和AST的血清水平分别显著降低了87％、47％、33％和48％(图8A)。此外，通过使用H&E染色评估肝坏死，研究了CM101的组织病理学作用。发现小鼠中ANIT诱导的肝损伤通过CM101处理得以减轻(图8B)。在大鼠中通过胆管结扎诱导的第二种胆汁淤积模型中进一步评估了用CM101处理的效果。该模型中与doctoral反应和肝损伤相关的纤维化通过天狼星红染色评估，并且示出与没有处理的手术动物相比，用抗CCL24 mAb处理的大鼠的肝脏的损伤显著减少(图9A-图9B)。

实施例8：完全人源化HCM101抗体减弱肝星状细胞向肌成纤维细胞的转变

在许多器官中，肌成纤维细胞在响应于损伤的瘢痕形成过程中发挥主要的作用。在肝纤维发生或肝硬化中，认为肝星状细胞(HSC)是肌成纤维细胞的前体群体(即，它们转分化为肌成纤维细胞)。

肌成纤维细胞是一种特化的成纤维细胞，其特征在于具有α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的细胞质应力纤维。由于αSMA是表征肌成纤维细胞的因子，细胞内αSMA水平的测量可以用作肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞转变的指标，并且因此用作肝细胞状况的严重程度的指标。

为了测量抗CCL24抗体对CCL24介导的HSC向成肌细胞转变的影响，使用HSC细胞系。使用完全人源化抗CCL24抗体HCM101进行测定(WO 2015/132790)。在有或没有人源化HCM101(5μg/ml)的情况下，在1％NAFLD患者的血清的存在下，在37℃孵育细胞持续48小时。αSMA的水平通过FACS来测量，以评估细胞活化和向肌成纤维细胞的转变(图10)。

对照非活化细胞，即未暴露于患者的血清的细胞，示出2.7％SMA阳性染色，如通过细胞内染色和FACS分析测量的。在用从具有高CCL24水平的NAFLD患者获得的血清活化的肝星状细胞培养物中(3521pg/ml，如通过ELISA测量的)，34％的细胞是SMA阳性细胞。当血清在37℃用人源化抗CCL24抗体HCM101(10μg/ml)预处理持续1小时时，培养物中仅存在15％SMA阳性细胞。有趣地，仅23％SMA阳性细胞存在于用从具有低CCL24水平(193pg/ml)的NAFLD患者获得的血清活化的肝星状细胞中。当血清用人源化抗CCL24抗体HCM101(10μg/ml)预处理时，培养物中仅存在19％SMA阳性细胞。

结果示出，与含有较低水平的趋化因子的血清相比，升高的αSMA的表达在用含有高水平的CCL24的NAFLD血清处理的HSC中更稳健。

此外，人源化抗CCL24抗体HCM101在通过暴露于含有高CCL24水平的血清而活化的培养物中导致αSMA表达减少50％。不希望被理论束缚，似乎抗CCL24抗体减弱了CCL24介导的肝星状细胞(HSC)向肌成纤维细胞的转变。

实施例9：HCM101的亲和力和结合特异性

使用Biacore(一种基于SPR的技术))以便检查由CHO细胞产生的HCM101与其他非CCL24趋化因子的结合亲和力。通过Biacore(分别为图10A和图10B)证明了抗体与嗜酸性粒细胞趋化因子1(CCL11)和MCP3(CCL7)的大量结合，分别揭示了30nM和130nM的亲和常数。

实施例10：HCM101抑制CCR3和CCR5趋化因子受体活化两者

在确定HCM101也可以结合CCL11和CCL7之后，通过可能结合其他趋化因子受体来评估CCL24的活化潜力来进一步评估其有效性和效力。为了此目的，使用DiscoverX趋化因子活化系统。该系统利用产生由受体活化诱导的发光信号的工程化细胞。使用两种不同的DiscoverX细胞的活化系统，一种为CCR3β-抑制蛋白测定，其当CCR3被工程化β-抑制蛋白的募集活化时产生信号，并且一种为CCR5 cAMP测定，其给出与受体活化开始时降低的细胞内cAMP浓度成比例的信号。

CCL24在CCR3β-抑制蛋白系统中诱导剂量依赖性响应，其中在从7nM-2000nM的范围的配体(CCL24)浓度明显使受体活化(图12A)。加入不同浓度的HCM101导致CCL24对CCR3活化的显著的剂量依赖性抑制(图12B)，其中活性降低高达70％。

为了评估CCL24通过另外的趋化因子受体使细胞活化的能力，使用第二个DiscoverX系统来指示CCR5趋化因子受体的活化。作为对照，测试了mip-1α(一种熟知且已建立的CCR5配体)诱导受体活化的能力，通过降低的细胞内cAMP水平表示。事实上，在不同浓度的mip-1α观察到cAMP的剂量依赖性降低(数据未示出)。用CCL24处理这些CCR5-cAMP细胞导致受体的剂量依赖性活化，这从在从0.15μM-5μM范围的浓度的降低的cAMP水平明显可见(图12C)。HCM101补充与该效果相反，在不同抗体浓度(7μg/ml-60μg/ml)增加了细胞内cAMP水平，这指示受体活化减少直至CCR5活化抑制高达70％(图12D)。CCR5 cAMP系统还用于检查HCM101对CCL11的影响。以从4nM至5μM的范围的浓度施用CCL11引起CCR5的剂量依赖性活化。施用HCM101将CCL11诱导的CCR5活化减弱了高达60％(图12E和图12F)。

实施例11：CM101对自身免疫性肝炎的影响

自身免疫性肝炎(AIH)是一种慢性炎性肝病，与界面性肝炎、升高的血浆肝酶、自身抗体的存在和调节性T细胞(Tregs)功能障碍相关。大鼠中伴刀豆球蛋白(Con)-A诱导的肝炎是用于研究AIH和用于评估潜在疗法的动物模型。

为了在大鼠模型中诱导急性肝炎，将溶解在300μl PBS中的伴刀豆球蛋白A(ConA)以5mg/kg的剂量经由尾静脉施用至每只大鼠。对照大鼠仅接受300μl的PBS。在第0天动物接受皮下HCM101 2.5mg/kg或对照IgG。在Con A施用后48h处死动物。评估AST、ALT、TNF-α、IFN-γ和CCL24水平。还评估了肝白细胞浸润、肝坏死和肝纤维化的组织病理学分析。

为了诱导慢性肝炎，每周一次IV施用10mg/kg Con A，持续12周。从第2周至第12周皮下施用2.5mg/kg CM101或IgG。对照组接受PBS而不是伴刀豆球蛋白A(ConA)。评估肝酶(例如AST、ALT)、坏死和炎性纤维化的肝组织学分析以及α-SMA。

序列表

<110> 彻莫马布有限公司

<120> 用于在肝病的治疗中使用的抗CCL24 (嗜酸性粒细胞趋化因子2)抗体

<130> 2513505

<150> IL 251024

<151> 2017-03-08

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Asn Ser Gly Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

His Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Val Ala Ser Asn Leu Lys Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Gln Gln Ser Asn Glu Glu Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Ser

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Ser His Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Lys Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 426

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(40)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (386)..(386)

<223> n为a、c、g、t或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (422)..(422)

<223> n为a、c、g、t或u

<400> 9

gggcagcaga nccggggcng nggatagaca gangggggnn gncgttttgg ctgaggagac 60

ggtgactgag gttccttgac cccagttgtc catagcgtag ctactaccgt aggaatgact 120

tgcacagaaa tatgtagccg tgtcctcatt tctgaggttg ttgatctgca aataggcagt 180

gctggcagag gtttccaaag agagggcaaa ccgtcccttg aagtcatcag tatatgttgg 240

ctctccattg taggtgttga tccagcccat ccactttaaa ccctttcctg gagcctgctt 300

tacccagttc attccagagt ttgtgaaggg atacccagaa gccctgcagg agatcttgac 360

tgtgtctcca ggcttcttca gctcangtcc agactgcacc aactggatct gggccatggc 420

cngcta 426

<210> 10

<211> 254

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(36)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(52)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(56)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(61)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (64)..(64)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (66)..(66)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(73)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (75)..(78)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(83)

<223> n为a、c、g或t

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<221> misc_feature

<222> (85)..(86)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (88)..(92)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (95)..(95)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (98)..(98)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(101)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(109)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (111)..(113)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (115)..(115)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (119)..(121)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (125)..(126)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (131)..(137)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (139)..(142)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (145)..(149)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (153)..(154)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (157)..(157)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (159)..(159)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (163)..(166)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (168)..(168)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (171)..(173)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (178)..(178)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (180)..(181)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (183)..(185)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (187)..(191)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (196)..(200)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (202)..(202)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (204)..(204)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (206)..(206)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (214)..(214)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (216)..(218)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (221)..(226)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (233)..(234)

<223> n为a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (236)..(236)

<223> n为a、c、g或t

<400> 10

gggccaatgg nngaggacgc ggatgggggt gtcgnngtgc cttngtcgnn nnctnnttgn 60

ncancntcna cnncnnnnan nnnanngnnn nntgnaanan ngatggnnnt nnncnacann 120

ntggnntcct nnnnnnntnn nntgnnnnng acnncanana cannnncnac nnnatgancn 180

ncnnncnnnn nttgannnnn gncnantatg aacnannnaa nnnnnntacc tgnnangcca 240

ctcacaagac atca 254

<210> 11

<211> 360

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

cagatccaat tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcctc agtcaaggtc 60

tcctgcaggg cttctgggta tcccttcaca aactctggaa tgaactgggt aaagcaggct 120

ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg atcaacacct acaatggaga gccaacatat 180

actgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcag aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagtcattcc 300

tacggtagta gctacgctat ggacaactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 12

<211> 333

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

gacattgtgc tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60

atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa tctaaaatct 180

ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc 240

agcctgcagc ctgaggattt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggaaccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aaa 333

Claims

1.一种分离的抗CCL24(嗜酸性粒细胞趋化因子2)抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗肝脏病理的药物组合物中的用途，其中所述抗体是包含重链可变区和轻链可变区的完全人源化抗体，所述重链可变区包含：

a)由SEQ ID NO.1表示的互补决定区VH CDR1；

b)由SEQ ID NO.2表示的互补决定区VH CDR2；和

c)由SEQ ID NO.3表示的互补决定区VH CDR3；

所述轻链可变区包含：

d)由SEQ ID NO.4表示的互补决定区VK CDR1；

e)由SEQ ID NO.5表示的互补决定区VK CDR2；和

f)由SEQ ID NO.6表示的互补决定区VK CDR3；并且

其中所述肝脏病理选自由胆汁淤积和原发性硬化性胆管炎(PSC)组成的组。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述分离的抗CCL24抗体的抗原结合片段选自由以下组成的组：Fv、单链Fv(scFv)、能够结合抗原的重链可变区、能够结合抗原的轻链可变区、Fab、F(ab)₂’及其任何组合。

3.如权利要求1至2中任一项所述的用途，其中所述抗体包含由SEQ ID NO:7表示的重链可变区和由SEQ ID NO:8表示的轻链可变区。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述抗体与至少一种另外的治疗剂组合施用。

5.如权利要求2所述的用途，其中所述抗体与至少一种另外的治疗剂组合施用。

6.如权利要求3所述的用途，其中所述抗体与至少一种另外的治疗剂组合施用。

7.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂选自抗炎剂。

8.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为抗纤维化剂。

9.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为类固醇。

10.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为抗趋化因子单克隆抗体。

11.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为抗细胞因子单克隆抗体。

12.如权利要求4-6中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：类法呢醇X受体(FXR)激动剂和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂。

13.如权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物与至少一种另外的治疗剂组合施用。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述药物组合物在施用所述至少一种另外的治疗剂之前、同时或随后施用。

15.如权利要求1所述的用途，其中所述药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。

16.如权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂选自抗炎剂。

17.如权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为抗纤维化剂。

18.如权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为类固醇。

19.如权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为抗趋化因子单克隆抗体。

20.如权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为抗细胞因子单克隆抗体。

21.如权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂选自由以下组成的组：类法呢醇X受体(FXR)激动剂和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂。