KR20190126829A

KR20190126829A - 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-ccl24(에오탁신 2) 항체

Info

Publication number: KR20190126829A
Application number: KR1020197028644A
Authority: KR
Inventors: 아디 모르
Original assignee: 키모맙 엘티디.
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2019-11-12
Also published as: JP2020511439A; JP7173589B2; IL269094B1; IL251024A0; IL269094B2; KR102546339B1; EP3592772B1; IL269094A; CN110418805A; CN110418805B; EP3592772A1; US11365246B2; US20200040070A1; WO2018163185A1; EP3592772C0; US20220372126A1

Abstract

본 발명은 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24(에오탁신 2) 항체에 관한 것이다.

Description

간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-CCL24(에오탁신 2) 항체

본 발명은 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-CCL24(에오탁신 2) 단클론성 항체에 관한 것이다.

케모카인(C-C 모티프) 리간드 24(CCL24 또는 에오탁신 2)는, 특히 호산구, 섬유아세포 및 T-세포의 주화성을 유도함으로써 세포 추적검사(cell trafficking)을 조장하고 C-C 케모카인 수용체 3형(CCR3) 복합체를 통해 염증 활성을 조절하는 케모카인이다. CCL24는 몇몇 염증 세포에 의해 생성되고, 이의 수용체인 CCR3은 호산구, T-세포, 단핵구 및 섬유아세포 상에 존재한다.

CCL24는 알레르기 반응 동안에 CCL24의 수준의 유의한 증가가 나타남에 따라 알레르기 병태와 관련이 있는 것으로 알려져 있다.

WO 2010/086854에는 심혈관 질환, 자가 면역 질환 및 염증 질환의 동물 모델에 효과적인 CCL24에 유도되는 항체가 개시되어 있다.

모어(Mor) 등(2013 WJCD. Vol. 3 No. 4: 339~346)에 따르면 CCL24에 대해 제조된 단클론성 항체는 림프구의 피브로넥틴에 대한 접착을 약화시키고, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 향한 이들의 이동을 강하게 억제하였다는 것을 보여준다. 또한 항체는 아포지 단백질 E(ApoE) 녹아웃 마우스에서 죽상경화성 플라크를 유의하게 감소시켰다. 애블린(Ablin) 등(2010; V161(2): 276~83) 및 모스너(Mausner) 등(World J. Immunol. 2013 Mar; 3(1): 7~14)에서 개시된 바와 같이, CCL24를 억제하는 경우에 류머티스성 관절염의 래트 모델 및 실험적 자가 면역성 뇌척수염의 마우스 모델에서 보호 효과가 증명되었다.

WO 2015/132790에는 케모카인 CCL24 중의 독특한 에피토프에 유도되는 단리된 다특이성 항체가 개시되어 있으며, 여기서 항체는 부가적인 CCR3 결합 케모카인과 결합한다. 이들 항체는 전신성 경화증 및 특발성 폐 섬유증(IPF)의 쥐 모델에서 섬유증 및 염증 특성을 억제하는데 효과적인 것으로 나타났다.

레이진(Lei Jin) 등(2017 Oncotarget, Vol. 8 (no. 3): 5135~5148)에 따르면 CCL24는 RhoB-VEGFA-VEGFR2 혈관신생을 통해 간세포 암종(HCC)에 기여하고, 나쁜 예후를 나타낸다는 것을 보여준다. 그러나 간염, 비알콜성 지방간 질환 (NAFLD, 비알콜성 지방간(NAFL)을 포함함), 담즙 정체증 및 간내 담즙 정체성 간 질환(예를 들어, 원발성 경화 담관염(PSC) 및 원발성 담즙 간경변(PBC))과 같은 간 병리에서의 CCL24의 연관성은 이전에는 증명된 바가 없다.

따라서 본 발명은 이의 양태들 중 제1 양태에서 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24(에오탁신 2) 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 제공한다.

하나의 실시형태에서, 상기 간 병리는 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 담즙 정체증, 간내 담즙 정체성 간 질환, 간염(예를 들어, 알콜성 간염) 및 간 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 상기 NAFLD는 비알콜성 지방간(NAFL) 또는 비알콜성 지방간염(NASH)이다.

하나의 실시형태에서, 상기 간 병리는 NASH에서 기인하는 간세포 암종이다.

하나의 실시형태에서, 상기 간내 담즙 정체성 간 질환은 원발성 경화 담관염(PSC) 또는 원발성 담즙 간경변(PBC)이다.

하나의 실시형태에서, 상기 간 병리는 PSC에서 기인하는 담관 암종이다.

다른 양태에서, 본 발명은,

a. 간 손상 시에 간 효소의 상승한 혈청 수준을 감소시키고/시키거나;

b. 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나;

c. 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

하나의 실시형태에서, 단리된 항-CCL24 항체는 단클론성 항체일 수 있다.

일부 실시형태에서, 단리된 항-CCL24 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간화 항체일 수 있다.

추가의 실시형태에서, 이의 항원 결합 단편은 Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 항원과 결합할 수 있는 중쇄 가변 영역, 항원과 결합할 수 있는 경쇄 가변 영역, Fab, F(ab)₂' 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나의 실시형태에서, 상기 항체는,

a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR1 또는 이의 변이체;

b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR2 또는 이의 변이체; 및

c) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및

d) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR1 또는 이의 변이체;

e) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 또는 이의 변이체; 및

f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 완전 인간화 항체이다.

하나의 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 완전 인간화 항체이다.

하나의 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시되는 6개의 CDR 서열을 포함하고, 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 완전 인간화 항체이다.

하나의 실시형태에서, 상기 항체는,

(a) NSGMN(서열번호 1)을 포함하는 중쇄 CDR1, WINTYNGEPTYTDDFKG(서열번호 2)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 HSYGSSYAMDN(서열번호 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및

(b) KASQSVDYDGDSYMN(서열번호 4)를 포함하는 경쇄 CDR1, VASNLKS(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEEPWT(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체와 동일한 에피토프와 결합한다. 하나의 실시형태에서, 상기 항체는 적어도 하나의 부가적인 치료제와 함께 투여된다.

하나의 실시형태에서, 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제는 파네소이드 X 수용체(FXR) 작용제, 페록시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 작용제, 항-케모카인 또는 항-사이토카인 단클론성 항체, 소분자, 항염증제, 항섬유화제 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 양태에서, 본 발명은 완전 인간화 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 이때 상기 완전 인간화 항체는,

f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 이때 상기 약학 조성물은 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 것이다.

하나의 실시형태에서, 상기 완전 인간화 항체는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 부가적인 치료제와 함께 투여된다.

하나의 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제의 투여 이전, 투여와 동시 또는 투여 이후에 투여된다.

하나의 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 간 병리를 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 완전 인간화 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 치료적으로 허용 가능한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 완전 인간화 항체는,

f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 간 손상 시에 간 효소의 혈청 수준을 감소시키고/시키거나, 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나, 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 완전 인간화 항체 또는 본 발명의 약학 조성물을 치료적으로 허용 가능한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 완전 인간화 항체는,

일부 실시형태에서, 상기 완전 인간화 항체는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

하나의 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 부가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 세포에서의 CCR5 활성화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 완전 인간화 항체를 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 완전 인간화 항체는,

e) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 이의 변이체; 및

본원에 개시되어 있는 청구주제를 보다 잘 이해하고 이를 실시할 수 있는 방법을 예시하기 위해 첨부된 도면을 참고하여 비제한적인 예로서만 실시형태를 개시할 것이다.
도 1a는 효소-결합 면역흡수 검정(ELISA)으로 측정할 때 대조군(20명의 건강한 개체)과 비교하여 낮은 Fib4 점수 및 높은 Fib4 점수로 분류된 55명의 NAFLD 환자에서의 순환하는 CCL24(에오탁신 2)의 계통 수준을 보여주는 그래프이다. 상기 결과는 밀리리터 당 피코그램(pv-P 값)으로 표시되어 있다. 4점 섬유화 점수(Fib4)의 계산:(나이 x AST)/(혈소판 x (ALT)²).
도 1b 내지 도 1m은 건강한 대조군과 비교하여 NAFLD 환자에서 유래한 인간 PBMC 상에서의 대표적인 CCR3 발현을 보여주는 FACS 이미지이다. 도 1b 내지 도 1d는 각각 3명의 NAFLD 환자에서 PE 표지 항-CCR3 항체로 측정할 때의 CCR3 염색을 나타낸다. 도 1e 내지 도 1g는 각각 3명의 NAFLD 환자 각각에 대한 상응하는 CCR3 염색/측면 산란, 즉 다양한 혈액 세포 개체군에서의 CCR3 발현 수준을 나타낸다. 도 1h 내지 도 1j는 각각 3명의 건강한 지원자에서의 항-CCR3 항체를 이용한 CCR3 염색을 나타낸다. 도 1k 내지 도 1m은 각각 3명의 건강한 환자 각각에 대한 상응하는 CCR3 염색/측면 산란 면적을 나타낸다. 도 1n은 FACS로 측정할 때 대조군과 비교하여 10명의 NAFLD 환자에서 유래한 말초 혈액 단핵 세포에서의 CCR3의 발현을 보여주는 그래프이다. ***pv ≤ 0.005.
도 2a 내지 도 2g는 항-CCL24 항체(즉, 쥐 CCL24 mAb CM101) 또는 항-CCR3 항체로 염색한, NASH 환자에서 수득된 인간 간 생검(biopsy)의 대표적인 외관을 보여주는 사진이다. 도 2a 내지 도 2c는 3명의 다른 환자(각각 환자 A 내지 환자 C)의 간 생검을 나타낸다. 도 2d는 건강한 간 생검을 보여주고, 음성 대조군으로서 역할을 한다. 도 2e는 건강한 개체의 림프절 생검을 보여주고, 양성 대조군으로서 역할을 한다. 도 2f 및 도 2g는 NASH 간 생검 내의 케모카인 수용체 CCR3에 대해 염색한 간 절편을 나타낸다.
도 3a는 CCL24 녹아웃 마우스와의 비교 시에 야생형(WT) 마우스 내의 간 효소 ALT의 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3b는 CCL24 녹아웃 마우스와의 비교 시에 야생형 마우스 내의 간 효소 ALP의 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3c는 CCL24 녹아웃 마우스와의 비교 시에 야생형 마우스 내의 빌리루빈 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3d는 Sircol로 측정할 때 CCL24 녹아웃 마우스와의 비교 시에 야생형 마우스 내의 콜라겐 농도를 보여주는 그래프이다. 도 3e는 CCL24 녹아웃 마우스와의 비교 시에 MCD(메티오닌-콜린 결핍) 유도 NASH 모델에서의 야생형 마우스 내의 NAFLD 활성화 점수를 보여주는 그래프이다. 도 3f는 HE로 염색하고 x5배(도 3f) 및 x20배(도 3g)로 나타낸, 정상 식이를 제공받은 야생형 마우스의 간 조직 절편의 사진이다. 도 3h는 HE로 염색하고 x5배(도 3h) 및 x20배(도 3i)로 나타낸, MCD 식이를 제공받은 야생형 마우스의 간 조직 절편의 사진이다. 도 3j는 HE로 염색하고 x5배(도 3j) 및 x20배(도 3k)로 나타낸, MCD 식이를 제공받은 CCL24 녹아웃 마우스의 간 조직 절편의 사진이다.
도 4a 내지 도 4d는 MCD 식이가 제공되고 다양한 농도의 항-CCL24 단클론성 항체(0.05, 0.5 및 5 ㎎/kg의 CM101) 또는 PBS(비히클)로 처리된 마우스에서의 AST(도 4a), ALT(도 4b), 빌리루빈(도 4c) 또는 콜라겐(도 4d) 수준을 보여주는 그래프이다. 도 4e 및 도 4f는 MCD 유도 NASH 실험용 마우스의 간 조직 절편의 사진이다. 도 4g 및 도 4h는 0.05 ㎎/㎏의 CM101로 처리된 MCD 유도 NASH 실험용 마우스의 간 조직 절편의 사진이다. 도 4i 및 도 4j는 0.5 ㎎/㎏의 CM101로 처리된 MCD 유도 NASH 실험용 마우스의 간 조직 절편의 사진이다. 도 4k 및 도 4l은 5 ㎎/㎏의 CM101로 처리된 MCD 유도 NASH 실험용 마우스의 간 조직 절편의 사진이다. 도 4m은 다양한 농도의 CM101로 처리된 MCD 유도 NASH 실험용 마우스에서의 NAFLD 활성 점수를 보여주는 그래프이다. 도 4n은 다양한 농도의 CM101로 처리된 MCD 유도 NASH 실험용 마우스의 간 내의 CCL24 수준을 보여주는 그래프이다. **pv ≤ 0.05.
도 5a 내지 도 5n은 비알콜성 지방간염의 STAM 모델에서 항-CCL24 단클론성 항체(CM101: 7.5 ㎎/㎏, n = 8) 또는 대조군 IgG(n = 8)에 의한 처리 효과를 보여주는 그래프 및 이미지이다.
도 5a 내지 도 5d는 대조군 IgG(도 5a 및 도 5b)로 처리되거나 CM101 항체(도 5c 및 도 5d)로 처리된, H&E로 염색된 간 절편의 대표적인 이미지이다. 도 5e는 NAFLD 활성 점수(NAS)를 보여주는 그래프이다. 도 5f는 간세포 팽창 점수(hepatocyte ballooning score)를 보여주는 그래프이다. 도 5g 및 도 5h는 시리우스 레드(Sirius red)로 염색한 후 대조군 IgG로 처리함으로써 평가된 간 섬유증의 이미지이다. 도 5i 및 도 5j는 시리우스 레드로 염색한 후 CM101 항체로 처리함으로써 평가된 간 섬유증의 이미지이다. 도 5k는 대조군 대비 CM101 항체로 처리된 마우스에서의 평균 시리우스 레드 염색을 보여주는 그래프이다. 도 5l 내지 도 5m은 간 절편에서 α-SMA를 발현한 후 대조군 IgG(도 5l) 또는 CM101 항체(도 5m)으로 처리함으로써 평가된 간 섬유증의 대표적인 이미지이다. 도 5n은 대조군 대비 CM101 항체로 처리된 마우스에서의 α-SMA 발현을 비교한 그래프이다.
도 6a 내지 도 6w는 티오아세트아미드(TAA) 독성 유도 간 섬유증 래트 모델[무처리 래트(n = 5), TAA 유도 래트(n = 10) 및 TAA+ CM101(2.5 ㎎/㎏) 처리 래트(n = 10)]에서의 항-CCL24 단클론성 항체(CM101)에 의한 처리 효과를 보여주는 그래프 및 이미지이다. 도 6a 내지 도 6i는 3마리의 건강한 래트(도 6a 내지 도 6c)에서 유래한 대조군 간, TAA 유도 섬유증을 갖는 3마리의 래트(도 6d 내지 도 6f)에서 유래한 간 및 CM101 항체로 처리된 TAA 유도 섬유증을 갖는 3마리의 래트(도 6g 내지 도 6i)에서 유래한 간을 포함하는 래트 간의 대표적인 거시적 이미지이다. 도 6j는 간 효소인 ALP, AST 및 ALT의 수준을 나타낸 그래프이다. 도 6k 내지 도 6t는 무처리 동물(도 6k 및 도 6l), TAA 유도 섬유증을 갖는 2마리의 동물(도 6o 내지 도 6r) 및 CM101 항체로 처리된 TAA 유도 섬유증을 갖는 2마리의 동물(도 6s 및 도 6t)의 간 절편 내의 콜라겐 침착에 대한 대표적인 H&E 염색 및 시리우스 레드 염색 이미지이다. 도 6u 및 도 6v는 섬유증(도 6u) 및 염증(도 6v) 수준을 보여주는 2개의 그래프이다. 도 6w는 Sircol에 의해 측정된 콜라겐 함량을 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 7d는 PSC 환자(도 7c 및 도 7d)와 비교하여 건강한 대조군(도 7a 및 도 7b)에서 유래한 인간 PBMC 상의 대표적인 CCR3 발현을 보여주는 FACS 도면이다. 도 7e는 PSC 환자 대비 건강한 지원자에서의 CCR3 발현 비율(%)을 요약한 그래프이다. 도 7f 및 도 7g는 항-CCL24 항체로 염색한 PSC 환자에서 유래한 간 절편을 보여주는 사진이다. 도 7h 및 도 7i는 항-CCR3 항체로 염색한 PSC 환자에서 유래한 간 절편을 보여주는 사진이다.
도 8은 비히클과 비교하여 항-CCL24 단클론성 항체(5 ㎎/㎏의 CM101)로 처리된 PSC 유도 실험용 마우스 모델에서 간 효소(도 8a 내지 도 8d)를 나타낸 그래프 및 조직학적 간 평가를 포함하는 대표적인 사진(도 8e 내지 도 8n)이다. 도 8a 내지 도 8d는 CM101 항체로 처리된 PSC 유도 실험용 마우스 모델에서 ALK 포스파타아제 수준(도 8a), 총 빌리루빈 포스파타아제 수준(도 8b), AST 수준(도 8c) 및 ALT 수준(도 8d)을 나타낸 그래프이다. 도 8e 내지 도 8n은 건강한 대조군의 조직학적 간 절편(x10배(도 8e) 및 x40배(도 8f)), ANIT 처리 마우스의 조직학적 간 절편(x10배(도 8i) 및 x40배(도 8j)) 및 CM101 항체에 의한 ANIT 처리 마우스의 조직학적 간 절편(x10배(도 8k 내지 도 8m) 및 x40배(도 8l 내지 도 8n))을 포함하는 대표적인 HE 염색 사진이다.
도 9a 내지 도 9f는 담관염 래트 모델(BDL)에서 모의 수술 대조군(도 9a 및 도 9b)(n = 5), PBS로 처리된 동물(도 9c 및 도 9d)(n = 10) 및 항-CCL24 단클론성 항체(CM101)로 처리된 동물(도 9e 및 도 9f)(n = 10)에서의 섬유증에 대한 대표적인 시리우스 레드 염색 이미지이다. 도 9g는 항-CCL24 단클론성 항체(CM101), PBS 또는 모의 수술 대조군(각각 n = 10, 10 및 5)으로 처리된 담관염 래트 모델(BDL)에서의 섬유증에 대한 시리우스 레드 염색의 정량화 그래프이다.
도 10a 내지 도 10e는 비활성화 세포(도 10a), HCM101 항체에 의한 처리 없이 높은 수준의 CCL24로 활성화된 세포(NAFDL 환자 혈청)(도 10b) 또는 HCM101 항체에 의한 처리 이후(도 10c)의 세포, 및 HCM101 항체에 의한 처리 없이 낮은 수준의 CCL24로 활성화된 세포(NAFDL 환자 혈청)(도 10d) 또는 HCM101 항체에 의한 처리 이후(도 10e)의 세포에서의 α-SMA의 세포 내 발현에 미치는 완전 인간화 항체 HCM101의 효과를 증명한 대표적인 FACS 그래프이다.
도 11a는 HCM101에 대한 CCL11(에오탁신 1)의 대표적인 비아코어 결합 곡선(Biacore binding curve)을 보여준다.
도 11b는 HCM101에 대한 CCL7(MCP3)의 대표적인 비아코어 결합 곡선을 보여준다.
도 12a 내지 12f는 β-아레스틴(β-arrestin) 동원(recruitment) 또는 cAMP 억제에 의해 나타난, 디스커버엑스 시스템(DiscoverX system)에서의 케모카인 수용체 활성화를 보여준다.
도 12a는 증가하는 농도의 CCL24와 결합함으로써 CCR3 수용체의 활성화를 나타내는 β-아레스틴의 동원 곡선을 나타낸 그래프이다. RLU: 상대적 발광 단위.
도 12b는 HCM101에 의한 CCL24 의존성 CCR3 수용체 활성화의 억제를 보여주는 그래프이다. 상기 검정은 80 nM의 일정한 CCL24 농도 및 증가하는 HCM101의 농도에서 수행되었다.
도 12c는 CCL24의 농도를 증가시킴으로써 CCR5 케모카인 수용체의 활성화를 나타낸 곡선과 함께 GPCR 활성화에 대한 디스커버엑스 cAMP 생물검정을 보여주는 그래프이다.
도 12d는 CCL24에 의한 CCR5의 활성화에 미치는 다양한 농도의 HCM101의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12e는 증가하는 농도(nM)의 인간 CCL11과의 배양에 의한 CCR5의 활성화(활성(%)으로 나타냄)의 그래프이다.
도 12f는 CCL11에 의한 CCR5의 활성화에 미치는 다양한 농도의 HCM101의 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

본 발명은, NASH 및 담즙 정체증의 동물 모델에서 증명된 바와 같이, CCL24(에오탁신 2) 폴리펩티드 내의 구조적 에피토프에 유도되고 CCL24(부가적인 주화성 인자뿐만 아니라 전염증성 CCR3 결합 케모카인인 에오탁신 1, Rantes 및 MCP-3/1)와 결합하여 이의 활성을 억제하는 단클론성 항체가 간 병리를 치료하는데 유용하다는 놀라운 발견에 기반을 두고 있다. 본 발명의 항-CCL24 항체는 간 손상 시에 증가하는 다양한 간 효소(예를 들어, ALT, AST, 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈)의 혈청 수준을 감소시키는데 효과적이었다. 본 발명의 항체는 또한 조직학적 검사에 의해 검정된 바와 같이 다양한 질환 모델에서 간 손상 또는 괴사를 감소시키는데 효과적이었으며, 또한 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시켰다. 예시된 항-CCL24 쥐 단클론성 항체(본원에서 CM101로 지칭됨; US 9,067,989) 및 이의 인간화 버전인 HCM101(WO 2015/132790)은 섬유증 질환, 자가 면역성 염증 질환, 단핵구 관련 질환 또는 알레르기성 아토피 질환의 치료에서의 사용과 관련이 있었다. US 9,067,989 및 WO 2015/132790는 둘 모두 본원에서 참고로 포함된다.

본 발명은 간 질환을 치료하는데 있어 항체에 대한 신규한 용도를 최초로 제공한다.

따라서, 이의 양태들 중 제1 양태에서, 본 발명은 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편를 제공한다.

" 에오탁신 2 "(호산구 주화성 단백질 2), " CCL24 "(케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24) 또는 " MPIF-2 "(골수성 전구체 억제 인자 2)란 용어는 상호 교환 가능하게 사용되며, 인간 7번 염색체 상에 위치하는 인간 CCL24 유전자에 의해 암호화되어 있는 CC 케모카인 부류에 속하는 사이토카인을 지칭한다. CCL24는 케모카인 수용체 CCR3과 상호 작용을 한다. CCL24 활성으로는 호산구, 호염구, T 림프구 및 호중구에서 주화성의 유도뿐만 아니라 내피세포 및 평활근 세포에서의 혈관 형성 및 이동 반응의 유도를 들 수 있다.

" 항체 "란 용어는 항원, 즉 CCL24와 특이적으로 결합하고 인식하는 면역 글로불린 유전자에 의해 암호화되어 있는 폴리펩티드를 지칭한다.

본 발명의 항-CCL24 항체는 이전에 몇몇 다양한 전염증성 CCR3 결합 케모카인을 인식하는 것으로 나타났다(WO 2015/132790). CCL24에 대해 생성되는 항체는 후속적으로 부가적인 케모카인(예를 들어, 에오탁신 1, Rantes 및 MCP-3)에 결합하여 이들의 활성을 효과적으로 약화시키는 것으로 밝혀져 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 항체는 기타 시험된 케모카인보다 높은 친화도로 CCL24에 결합한다. 명백히, 본 발명의 항체는 이들 전염증성 CCR3 결합 케모카인 내의 교차 반응성 에피토프를 인식한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 단클론성 항체이다. 본원에 정의된 바와 같은 " 단클론성 항체 ", " 단클론성 항체들 " 또는 " mAb "란 용어는 실질적으로 균질한 항체의 개체군을 지칭한다. 즉, 상기 개체군을 포함하는 개별 항체는 미량으로 존재할 가능성 있는 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하면 동일하다. 단클론성 항체는 단일 항원성 부위에 유도된다.

단클론성 항체는 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체는 하이브리드 세포의 성장을 조장하는 조건 하에 무한 증식 B 세포와 융합함으로써 면역화된 동물(예를 들어, 래트 또는 마우스)의 비장 또는 림프절에서 취한 B 세포로부터 제조될 수 있다.

마우스의 면역화는, 예를 들어 WO 2010/086854에 개시된 바와 같이 수행될 수 있다. 간단하게 말하면, 마우스의 면역화는 목적하는 항원, 즉 CCL24 또는 CCL24의 단편, 바람직하게는 완전 프로인트 보강제와 함께 유화된 N-루프 내의 구조적 에피토프(예를 들어, 50 ㎍)를 포함하는 CCL24 또는 CCL24의 단편에 의한 일차 피하(s.c.) 면역화에 의해 수행될 수 있다. 이어서, 불완전 프로인트 보강제와 함께 유화된 항원(예를 들어, 50 ㎍)을 갖는 2개의 피하 보강 주사액을 2주마다 투여한다. 가장 높은 중화 항체 역가를 갖는 마우스는 비장을 제거하기 4일 전에 PBS 중의 항원(예를 들어, 5 ㎍)의 부가적인 정맥 내(i.v.) 접종액을 투여 받는다.

최종 접종(예를 들어, 4일) 이후, 앞서 개시된 바와 같이, 가장 높은 중화 항체 역가를 갖는 마우스의 비장을 제거하고, 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 비장세포를 마우스 골수종 세포(예를 들어, NS0 세포)에 융합한다(문헌[

, G. and Milstein, C. (1975) Nature 256: 495~497]). 융합 이후, HAT(히포크산틴-아미노프테린-티미딘) 배지에서 세포를 성장시킴으로써 하이브리도마 세포를 선택하였다. 이어서, 특정 항체의 생성을 위해, 예를 들어 하기에 기술한 ELISA 검정을 이용하여 세포 클론을 선별한다.

예를 들어, 단클론성 항체의 정제는 친화성 크로마토그래피, 즉 특정 에피토프가 접합되어 있는 친화성 칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피에 기반을 둘 수 있다.

당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 예시적인 항체의 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되어 있으며, 각각의 쌍은 하나의 " 경쇄 " 및 하나 " 중쇄 "를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원(또는 에피토프) 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 한정한다.

따라서 " 중쇄 가변 영역 "(V_H) 및 " 경쇄 가변 영역 "(V_L)이란 용어는 이들 중쇄 및 경쇄를 각각 지칭한다. 보다 구체적으로, 가변 영역은 초가변 영역 및 골격(FR) 영역으로 세분화된다. 초가변 영역은 소정의 위치에 있는 가장 흔한 아미노산에 비해 그 위치에 다양한 아미노산을 높은 비율로 갖는다. 보다 안정된 아미노산 서열을 갖는 4개의 FR 영역에 의해 초가변 영역이 분리되어 있다. 초가변 영역은 항원의 표면의 일부와 직접 접촉한다. 이러한 이유로, 초가변 영역은 본원에서 " 상보성 결정 영역 " 또는 " CDR "로 지칭된다.

N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 도메인을 포함한다. CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합을 담당한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3(N-말단에서 시작하여 순차적으로 번호가 매겨짐)으로 지칭되며, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치하는 사슬에 의해 확인된다.

따라서 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 항체의 중쇄의 N-말단에서 시작하는 3개의 상보성 결정 영역을 지칭하고, 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 항체의 경쇄의 N-말단에서 시작하는 3개의 상보성 결정 영역을 지칭한다.

일부 실시형태에서, 단리된 항-CCL24 단클론성 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간화 항체이다.

본원에서 정의된 바와 같은 " 키메라 " 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래하는 반면 나머지 사슬(들)이 다른 종에서 유래하는 항체를 지칭한다.

키메라 항체는, 예를 들어 하기에 기술한 바와 같이, 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

쥐-인간 키메라 항체는 항체 가변 영역을 암호화하는 쥐 V_H 및 V_L 유전자를 증폭 및 클로닝 한 후, 쥐-인간 키메라 항체를 발현함으로써 제조될 수 있다. 이를 위해, 총 RNA는 목적하는 특징을 갖는 항체를 분비하는 것으로 나타나는 쥐 항-CCL24 하이브리도마 세포로부터 단리되고, cDNA는 올리고 (dT)₁₅ 프라이머, M-MLV 및 AMV 역전사 효소를 이용하여 합성된다. 중쇄 및 경쇄 가변 유전자(V_H 및 V_L)의 증폭은, 특히 벤하르(Benhar) 및 라이터(Reiter)(문헌[Benhar, I. and Reiter, Y. (2002) Curr. Protoc. Immunol. Chapter 10: Unit 10 19B])에서 개시된 바와 같이, 각각의 유전자의 골격 1의 5' 말단에 대한 일군의 프라이머를 이용하여 수행될 수 있고, 3' 말단에 있는 불변 영역(각각 C_H1 또는 C_k)에 대해 수행될 수 있다.

이어서, 가변 유전자는 비축퇴성 프라이머를 이용하여 다시 증폭하여, 예를 들어 양 말단에 있는 클로닝을 위한 제한 부위를 pCMV 기반 항체 발현 벡터 내로 도입한다.

증폭된 중쇄 및 경쇄 가변 유전자는 따로 정제되고, 절단되고, 적당한 포유동물 전장 Ig 발현 벡터 내로 클로닝하여, 상응하는 신호-펩티드 및 불변 유전자를 각각의 사슬에 제공하며, 그 결과 IgG1/k 쥐 인간 키메라 항체의 발현을 초래한다.

" 인간화 " 항체란 용어는 전통적으로 CDR 및 선택적으로는 부가적인 적절한 위치에 있는 비인간 면역 글로불린에서 유래하는 최소 서열을 갖는 인간 유래 면역 글로불린 골격을 함유하는 비인간(예를 들어, 쥐) 항체의 형태를 지칭한다. 대체로, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역에서 유래한 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 활성을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종의 초가변 영역(공여자 항체)에서 유래한 잔기로 교체되어 있는 인간 면역 글로불린(수용자 항체)이다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 완전 인간화 " 항체란 용어는 인간 서열만을 갖도록 설계된 항체에 관한 것이다. 본 발명의 완전 인간화 항체는 환자에서 항체의 면역원성을 최소화하는 복합 인간 항체^TM 기술을 이용하여 제조되었다. 이러한 인간화 기술에서는 관련이 없는 인간 항체의 가변(V) 영역에서 유래하는 다수의 서열 분절을 출발 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 위한 수용체로서 사용한다. 인간 서열 분절을 신중하게 선택하고 인실리코(in silico) 도구를 적용함으로써 항체 친화도 및 특이성을 유지하면서 표준 인간화 항체에 비해 면역원성의 위험성을 감소시키도록 CD4+ T 세포 에피토프를 회피한다. 이 같은 항체는 인간 서열만을 함유하고, 따라서 "완전히 인간화된" 것으로 정의된다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 인간 항체 "란 용어는 인간이 생산하는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 당해 기술분야에 알려져 있는 인간 항체를 만들기 위한 기법들 중 임의의 것을 이용하여 만들어진 항체를 지칭한다. 이러한 정의에서는 특히 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다.

인간화 항체 및 인간 항체의 제조는 당해 기술분야에 널리 알려져 있다. 항체는 또한 파지 디스플레이를 이용하여 제조될 수 있다. 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 항체 파지 디스플레이(APD)는 박테리오파지의 유전자 조작 및 항원 유도 선택 및 파지 증식의 반복적인 실시에 기반을 두고 있다.

APD 과정은 선택된 세포 공급원(예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포)으로부터 품질 RNA를 제조함으로써 항체-라이브러리 제조로 시작된다. 이러한 RNA는 cDNA로 역전사되며, 이는 암호화된 항체의 VH 및 VL 사슬에 대한 PCR용으로 사용된다. 이러한 단계를 수행한 이후에 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) PCR 산물을 파지 디스플레이 벡터에 연결하며, 결국 mAb의 클론의 분석을 실시한다.

다량의 (키메라, 인간화 항체, 완전 인간화 또는 인간) 항체를 제조하기 위해, 항체를 발현하는 안정된 세포주는 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 함유하는 Ig 발현 벡터로 세포(예를 들어, CHO 세포)를 형질 감염시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 항체는 최신의 1회용 생물 반응기 시스템에서 제조될 수 있다. 항체는 잘 확립된 단클론성 항체 정제 방법을 이용하여 임상 등급으로 정제될 수 있다. 이어서, 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법, 예를 들어 후술한 바와 같은 CCL24-특이적 ELISA 검정에 의해 시험된 바와 같이, 항-CCL24 항체를 많이 생산하는 클론을 선택하고, 상층액 중의 항체 수준에 기초하여 확장할 수 있다. 특정 클론용으로 개발된 마스터 세포 은행은 모든 임상 등급의 배치용 출발 성장 물질로서 작용을 할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24 쥐 항체(본원에서 CM101로서 지칭됨) 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 상기 항체는,

a. 서열번호 9와 적어도 90% 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화된 중쇄 및 서열번호 10과 적어도 90% 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화된 경쇄를 포함하는 단클론성 항체 또는 항체의 결합 활성을 유지하는 이의 단편; 및

b. 하이브리도마 D8(ECACC 등록 번호: D 809081702)에 의해 분비되는 단클론성 항체 또는 항체의 결합 활성을 유지하는 이의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

쥐 항체 CM101 중쇄를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 9로 표시된다:

GGGCAGCAGANCCGGGGCNGNGGATAGACAGANGGGGGNNGNCGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACCCCAGTTGTCCATAGCGTAGCTACTACCGTAGGAATGACTTGCACAGAAATATGTAGCCGTGTCCTCATTTCTGAGGTTGTTGATCTGCAAATAGGCAGTGCTGGCAGAGGTTTCCAAAGAGAGGGCAAACCGTCCCTTGAAGTCATCAGTATATGTTGGCTCTCCATTGTAGGTGTTGATCCAGCCCATCCACTTTAAACCCTTTCCTGGAGCCTGCTTTACCCAGTTCATTCCAGAGTTTGTGAAGGGATACCCAGAAGCCCTGCAGGAGATCTTGACTGTGTCTCCAGGCTTCTTCAGCTCANGTCCAGACTGCACCAACTGGATCTGGGCCATGGCCNGCTA

쥐 항체 CM101의 경쇄(카파)를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 10으로 표시된다:

GGGCCAATGGNNGAGGACGCGGATGGGGGTGTCGNNGTGCCTTNGTCGNNNNCTNNTTGNNCANCNTCNACNNCNNNNANNNNANNGNNNNNTGNAANANNGATGGNNNTNNNCNACANNNTGGNNTCCTNNNNNNNTNNNNTGNNNNNGACNNCANANACANNNNCNACNNNATGANCNNCNNNCNNNNNTTGANNNNNGNCNANTATGAACNANNNAANNNNNNTACCTGNNANGCCACTCACAAGACATCA

본 발명은 또한 항체 CM101의 인간화 및 완전 인간화 버전을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 완전 인간화 단리된 항-CCL24 항체(본원에서 HCM101로서 지칭됨) 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 상기 항체는,

본 발명에 따르면, VH CDR1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 NSGMN 또는 이의 변이체를 포함하고; VH CDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 WINTYNGEPTYTDDFKG 또는 이의 변이체를 포함하고; VH CDR3은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 HSYGSSYAMDN 또는 이의 변이체를 포함하고; VK CDR1은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 KASQSVDYDGDSYMN 또는 이의 변이체를 포함하고; VK CDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열 VASNLKS 또는 이의 변이체를 포함하고; VK CDR3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열 QQSNEEPWT 또는 이의 변이체를 포함한다.

하나의 특정 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열 HSYGSSYAMDN을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3을 포함하는, 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 제공한다.

서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 각각 표시되는 상술한 CDR 서열 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 또한 이들 개개의 중쇄 및 경쇄 서열의 문맥에 나타나 있다:

본원에 예시되어 있는 단리된 완전 인간화 다중 특이적 단클론성 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:

QIQLVQSGPELKKPGASVKVSCRASGYPFTNSGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLRNEDTATYFCASHSYGSSYAMDNWGQGTSVTVSS

본원에 예시되어 있는 단리된 인간화 다중 특이적 단클론성 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8로 표시되고, 하기 아미노산 서열을 갖는다:

DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLKSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEEPWTFGGGTKVEIK

따라서, 추가의 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 단리된 항체는, 상기 항체가 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 완전 인간화 항체인 것을 특징으로 한다.

다른 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 단리된 항체는, 상기 항체가 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시된 바와 같은 6개의 CDR 서열을 포함하고, 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 완전 인간화 항체인 것을 특징으로 한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 항체와 동일한 에피토프와 결합하는, 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 단리된 단클론성 항체를 제공하며, 이때 상기 항체는,

(b) KASQSVDYDGDSYMN(서열번호 4)을 포함하는 경쇄 CDR1, VASNLKS(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEEPWT(서열번호 6)를 포함하는 경쇄 CDR3를 포함한다.

본 발명은 또한 간 병리를 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 상기에서 정의된 바와 같은 항체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 단리된 항체는, 상기 항체가 서열번호 11로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호 12로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화되는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 완전 인간화 항체인 것을 특징으로 한다.

서열번호 11:

CAGATCCAATTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAGTCAAGGTCTCCTGCAGGGCTTCTGGGTATCCCTTCACA AACTCTGGAATGAAC TGGGTAAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGC TGGATCAACACCTACAATGGAGAGCCAACATATACTGATGACTTCAAGGGA CGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAGAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGT CATTCCTACGGTAGTAGCTACGCTATGGACAAC TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

서열번호 12:

GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGACTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGGAGAGGGCCACCATCAACTGC AAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAAC TGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTAT GTTGCATCCAATCTAAAATCT GGCATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCAACCTATTACTGT CAGCAAAGTAATGAGGAACCGTGGACG TTCGGTGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA

*CDR 뉴클레오티드 서열은 볼드체로 밑줄이 그어져 있다.

본 발명은 또한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 변이체를 포함한다. 변이체는 본원에 개시된 항체의 활성을 변경하지 않는 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역 내의 돌연변이, 또는 골격 영역 내의 돌연변이를 포함할 수 있다.

" 변이체 "란 용어는 본원에서 구체적으로 확인된 서열과 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 여기서 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 결실, 치환 또는 부가되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 부가된 "이란 용어는 본원에 기술한 서열에 대한 아미노산 잔기의 임의의 부가를 의미하는 것으로 인지되어야 한다.

변이체는 다양한 아미노산 치환을 포함한다. 아미노산 " 치환 "은 하나의 아미노산을 유사하거나 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교체한 결과이다. 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다.

전형적으로, 변이체는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 테이블이 당해 기술분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 들 수 있고; 극성/중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 들 수 있고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있다.

하기 8개 그룹 각각은 서로에 대해 보존적으로 치환된 기타 예시적인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M).

보존적 핵산 치환은 상기에서 정의된 바와 같은 보존적 아미노산 치환을 초래하는 핵산의 치환이다.

본 발명에 따른 변이체는 또한 비극성에서 극성으로의 아미노산 치환 및 그 반대의 치환을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 아미노산 " 또는 " 아미노산 잔기 "란 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 자연적으로 발생하는 아미노산과 유사한 방식으로 기능을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다.

변이체 서열은 본원에 기술된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 본원에 기술된 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열)과 이들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 동일성 비율(%)이 특징일 수 있는 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.

일부 실시형태에서, 본원에 정의된 바와 같은 변이체 서열은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 지칭하며, 이때 각각의 가변 영역은 본원에 기술된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열과 비교할 때 적어도 70% 또는 75%의 서열 동일성, 약 80% 또는 약 85%의 서열 동일성, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드의 서열을 갖는다.

" 간 병리 " 또는 " 간 질환 "이란 용어는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 간의 임의의 질병에 관한 것이다. 간 병리는 일반적으로 간경변 또는 간 흉터, 감염성 원인(예를 들어, B형 간염 또는 C형 간염) 또는 비감염성 원인(알콜성 지방간염을 포함하는 화학적 또는 자가 면역 간염)에 의해 야기된 염증(간염), 종양, 양성 및 악성 (간암) 및 대사성 질환을 들 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 비알콜성 지방간 질환(NAFLD; 비알콜성 지방간(NAFL) 및 비알콜성 지방간염(NASH)을 포함함), 담즙 정체증 및 간내 담즙 정체성 간 질환(예를 들어, 원발성 경화 담관염(PSC) 및 원발성 담즙 간경변(PBC))과 같은 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 항-CCL24 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은,

a. 간 손상 시에 간 효소(예를 들어, ALT, AST, 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈)의 상승한 혈청 수준을 감소시키고/시키거나;

b. 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나;

c. 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 제공한다.

일부 실시형태에서, 상기 간 효소의 상승한 수준 또는 상기 간 손상 또는 괴사는 상기에서 정의된 바와 같이 간 병리에 의해 야기된다.

일부 실시형태에서, 상기 단리된 항-CCL24 항체는 쥐 항체(본원에서 CM101로서 지칭됨) 또는 이의 임의의 항원 결합 단편이며, 이때 상기 항체는,

a. 서열번호 9와 적어도 90% 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 중쇄 및 서열번호 10과 적어도 90% 상동성을 갖는 핵산에 의해 암호화되는 경쇄를 포함하는 단클론성 항체 또는 항체의 결합 활성을 유지하는 이의 단편; 및

일부 실시형태에서, 상기 단리된 항-CCL24 항체는 완전 인간화 항체(본원에서 HCM101로서 지칭됨) 또는 이의 임의의 항원 결합 단편이며, 이때 상기 항체는,

" 항체의 활성 "이란 용어는 CCL24와 결합하고, 바람직하게는 CCL24에 의해 매개되는 생물학적 기능을 억제하는 항체의 능력, 예를 들어 세포의 동원 또는 주화성(예를 들어, 호산구 또는 단핵구 또는 섬유아세포의 동원 또는 주화성)을 억제하는 능력을 의미한다. 생물학적 기능은 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 생체 내 또는 시험관 내에서 측정될 수 있다. 몇몇 이 같은 생체 내 검정이 하기 실시예에 기술되어 있다.

본 발명의 항체의 이의 표적 단백질에 대한 결합은, 예를 들어 ELISA 검정을 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 단리된 항-CCL24 단클론성 항체의 임의의 항원 결합 단편을 추가로 포함한다. 이 같은 항원 결합 단편은, 예를 들어 항원과 결합할 수 있는 Fab 및 F (ab')₂일 수 있다. 이 같은 단편은 (Fab 단편을 생성하기 위해) 파파인 또는 (F(ab')₂ 단편을 생성하기 위해) 펩신과 같은 효소를 이용하여 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법, 예를 들어 단백질 가수분해 개열(proteolytic cleavage)에 의해 생산될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 항체 단편은 Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 항원과 결합할 수 있는 중쇄 가변 영역, 항원과 결합할 수 있는 경쇄 가변 영역, Fab, F(ab)₂' 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이의 양태들 중 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 이때 상기 항체는 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.

본원에서 정의된 바와 같이, " 핵산 " 또는 " 핵산 분자 "란 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, 이는 데옥시리보핵산(DNA)과 같은 폴리뉴클레오티드이며, 적절한 경우 리보핵산(RNA)이다. 상기 용어는 또한 등가물로서 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하고, 상술한 실시형태에 적용할 경우에 단일 가닥(예를 들어, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 DNA이란 용어는 또한 cDNA, 즉 역전사 효소(RNA 의존성 DNA 폴리메라아제)의 작용에 의해 RNA 주형으로부터 생산되는 상보적 또는 복사 DNA를 포함한다.

본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 추가로 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 종종 " 발현 비히클 " 또는 " 발현 구조체 "로 지칭되는 " 발현 벡터 "는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합 가능한 DNA 단편, 및 숙주의 게놈 내로의 DNA 단편의 통합을 가능케 하는 기타 비히클과 같은 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 목적하는 유전자 또는 이의 단편, 및 적합한 숙주 세포에서 인식되어 목적하는 유전자의 발현을 구현하는, 작동 가능하게 연결된 유전자 제어 요소를 포함하는 자가 복제형 DNA 또는 RNA 구조체이다. 이들 제어 요소는 적합한 숙주 내에서의 발현을 구현할 수 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터는 몇 가지 예를 들면 박테리아, 효모 또는 포유동물 숙주 세포에서의 발현으로 인해 컴피턴트(competent)화될 수 있다.

이의 양태들 중 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포를 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 숙주 세포 "란 용어는 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자의 도입 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 이용한 도입에 민감한 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 NS0 세포이다. 숙주 세포에 대한 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자 또는 발현 벡터의 형질 감염은 당해 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

이의 양태들 중 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 및 본원 하기에 정의된 바와 같은 부가적인 치료제를 포함하는 면역 접합체를 제공한다.

본원에 정의된 바와 같이, " 면역 접합체 "란 용어는 부가적인 약제에 접합(연결 또는 접속)되는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 지칭한다. 면역 접합체는, 예를 들어 부가적인 약제를 본 발명에 따른 항체에 가교시킴으로써 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 항-CCL24 항체는 적어도 하나의 부가적인 치료제와 함께 투여될 수 있다.

본원에서 사용된 " 부가적인 치료제 "란 용어는 간 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있는 임의의 약제를 지칭한다. 특정 실시형태에 따르면, 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제는 화학 요법제, 사이토카인, 펩티드, 항체 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 실시형태에서, 상기 부가적인 치료제로는 파네소이드 X 수용체(FXR) 작용제(예를 들어, 카페스톨(cafestol), 케노데옥시콜산, 오베티콜산(obeticholic acid), 펙사라민(fexaramine)), 페록시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 작용제, 항-케모카인 또는 사이토카인 단클론성 항체, 케모카인 또는 사이토카인 기능을 억제하는 소분자, 항염증제 및 항섬유화제(스테로이드 및 가용성 단백질 항염증제를 포함함)을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 실시형태에서, 부가적인 치료제는 부가적인 항체이다. 본원에 정의된 바와 같이, " 부가적인 항체 "란 용어는 본 발명에 따른 항체가 아닌 항체를 지칭하며, 이는 본 발명의 항체와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 활성 성분으로서 본 발명의 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 본원에 정의된 바와 같은 면역 접합체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공하며, 이때 상기 약학 조성물은 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이고/이거나,

b. 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나;

c. 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는데 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 " 약학 조성물 "은 일반적으로 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편, 완충제, 및 조성물의 삼투압을 조절하는 약제를 포함하고, 선택적으로는 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 "란 용어는 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같은 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제, 항진균제 등을 포함한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 및 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 각각의 담체는 기타 성분과 상용성을 갖고 개체에 대해 무해하다는 측면에서 약학적 및 생리학적으로 허용 가능해야 한다. 임의의 통상적인 매질 및 약제가 활성 성분과 상용성이 없는 경우를 제외하고, 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.

기타 실시형태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 부가적인 치료제를 추가로 포함한다. 부가적인 치료제의 비제한적인 예로는 FXR 작용제, PPAR 작용제, 항-케모카인 또는 항-사이토카인 단클론성 항체, 또는 케모카인 또는 사이토카인의 활성을 억제하는 임의의 소분자, 단백질 또는 펩티드, 항염증제(스테로이드 및 항섬유화제를 포함함)를 들 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 단리된 항-CCL24 완전 인간화 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 항체는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며, 이때 상기 약학 조성물은 간 질환을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.

간 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본 발명에 따른 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

간 손상 시에 간 효소(예를 들어, ALT, AST, 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈)의 상승한 혈청 수준을 감소시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본 발명에 따른 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

간 손상 또는 괴사를 감소시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본 발명에 따른 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 본 발명에 따른 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 약학 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

" 개체 " 또는 " 환자 "란 용어는 상호 교환 가능하게 사용되고, 포유동물(예를 들어, 개, 고양이, 양, 돼지, 말, 소 또는 인간)과 같이 본 발명으로부터 이익을 얻을 수 있는 개체를 지칭한다. 하나의 특정 실시형태에서, 환자는 인간이다.

본원에 정의된 바와 같이, " 예방 "이란 용어는 간 질환 증상의 발현 또는 간 질환의 발병 또는 진행을 막거나 예방하기 위해 "예방적 치료"(preventive treatment/prophylactic treatment), 즉 보호적 방식의 작용을 제공한다는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, " 치료하기 ", " 치료하는 ", " 치료 "란 용어 또는 이의 형태가 질환 또는 병태의 유해 효과를 감소, 예방, 치유, 반전, 개선, 약화, 완화, 최소화, 억제 또는 정지시키는 것을 의미하거나, 상기에서 정의된 바와 같은 간 질환의 하나 이상의 임상 징후의 발병을 지연시킨다는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 투여는 하기 경로 중 임의의 것, 예를 들어 경구 투여, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 경막 내 또는 피하 주사; 직장 내 투여; 비강 내 투여, 안구 내 투여 또는 국소 투여에 의해 수행될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 투여는 정맥 내에서 수행될 수 있다. 기타 특정 실시형태에서, 투여는 복강 내에서 수행될 수 있다. 기타 특정 실시형태, 투여는 흡입에 의해 수행될 수 있다.

본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 항체 단편, 이를 포함하는 임의의 약학 조성물, 또는 이들을 포함하는 임의의 접합체는 질환의 발병 이전 또는 이후에 개체에 투여될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 간 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법에서는 본 발명에 따른 상기 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 질환의 발병 이전 또는 이후에 상기 개체에 투여하는 것을 특징으로 한다.

본원에 정의된 목적을 위해 본 발명에 따른 단리된 단클론성 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물의 " 치료적 유효량 "은 의학적 병태를 치유 또는 저지하거나, 적어도 완화 또는 개선하기 위해 당해 기술분야에 공지된 바와 같은 이 같은 고려 하에 결정된다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 제제에 있어서, 투여량 또는 치료적 유효량은 초기에 시험관 내 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있거나, 본원에 기술된 동물 모델과 같은 동물 모델에 기초하여 추정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 치료적 유효량은 0.01 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 범위이다.

기타 실시형태에서, 본 발명에 따른 치료적 유효량은 0.01 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 40 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 또는 5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 범위이다.

기타 실시형태에서, 본 발명에 따른 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 투여된다.

특정의 예시적인 투여량으로는 0.75 ㎎/㎏, 또는 2.5 ㎎/㎏, 또는 5 ㎎/㎏, 또는 10 ㎎/㎏을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않으며, 이때 각각의 투여량은 1일 1회 투여량으로서 제공된다. 하나의 실시형태에서, 투여량은 정맥 내에 제공된다.

본 발명의 문맥에서 " 이를 필요로 하는 개체 "란 용어는 본원에 정의된 바와 같은 간 질환을 앓고 있는 포유동물, 특히 인간 개체를 지칭한다.

본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 간 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 추가로 제공한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 간 질환의 예방, 치료 또는 개선 방법에 사용하기 위한 단리된 완전 인간화 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편을 제공하며, 이때 상기 항체는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함한다.

" 정제된 " 또는 " 단리된 "이란 용어는 아미노산 또는 핵산 서열, 펩티드, 폴리펩티드 또는 항체와 같은 분자가 이들 자연 환경에서 제거되거나, 단리되거나, 분리된다는 것을 의미하는 것으로 인지된다. 따라서 " 단리된 항체 "는 정제된 항체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, " 정제된 " 또는 " 정제하기 "란 용어는 또한 샘플로부터 오염물질의 제거를 지칭한다.

하기 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 항체는 케모카인 수용체 CCR3 및 CCR5 둘 모두의 활성화를 감소 또는 억제할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체는 CCR5의 CCL24 유도 및 CCL11 유도 활성화 둘 모두를 억제할 수 있었다.

따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서의 CCR5 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.

따라서 본 발명의 항체는 CCR5 활성화와 연관된 질환 또는 질병을 치료하는데 이용될 수 있다. 이 같은 질환 또는 질병의 비제한적인 예로는 상기에서 정의된 바와 같은 간 병리가 있다.

실시예

추가적인 세부 설명 없이, 당업자라면 상술한 설명을 이용하여 본 발명의 개시 내용을 완전히 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서 하기의 바람직한 특정 실시형태는 단지 예시적으로 이해되어야 하며, 청구 발명을 임의의 방식으로 제한하기 위한 것은 아니다.

본원에 구체적으로 설명되지 있지 않은, 당해 기술분야에 알려져 있는 표준 분자 생물학 프로토콜은 일반적으로 문헌[Sambrook & Russell, 2001]에 개시된 바를 필수적으로 따른다.

본원에 구체적으로 설명되지 있지 않은, 당해 기술분야에 알려져 있는 표준 의료 화학 방법은 일반적으로 페르가몬 프레스(Pergamon Press)에 의해 발행된 시리즈 "Comprehensive Medicinal Chemistry"에 개시된 바를 필수적으로 따른다.

재료 및 방법

인간 개체의 혈청 내의 케모카인의 수준

에오탁신-2 수준은 제조사의 프로토콜에 따라 하기 ELISA 키트인 퀀티킨(Quantikine) 인간 CCL24(에오탁신 2)(R&D)를 이용하여 NASH 및 원발성 경화 담관염(PSC) 환자 및 건강한 공여자의 혈청에서 측정되었다.

인간 환자의 간 생검의 면역 조직 화학

NASH 환자에서 유래한 간 생검의 냉동 절편(5 ㎛ 두께)에 대해 인간 CCL24에 대한 면역 조직화학적 염색을 실시하였다. 메탄올 및 아세톤으로 고정한 후, 절편을 비면역성 토끼 및 염소 혈청으로 차단한 후에 CAS 차단 시약과 함께 배양하였다. 이어, 일차 항체를 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 세척 후, 비오티닐화 친화도로 정제된 염소 항-마우스/토끼 항체(잭슨(Jackson))를 첨가하였다. 이어서, 슬라이드를 0.3% H₂O₂와 함께 배양한 후에 부가적으로 세정하고, 스트렙타비딘-페록시다아제 접합체(잭슨)과 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 3-아미노-9 에틸카바졸 기질(다코(Dako))을 이용하여 슬라이드를 15분 동안 현상하고, 헤마톡실린으로 대조 염색하였다. 간 절편에서의 NAFLD 활성화 점수의 변화를 분석하기 위해 헤마톡실린 에오신(H&E) 염색을 이용하였다.

마우스에서 유래한 간 샘플 내의 CCL24 수준

마우스에서 수득된 간 조직의 무게를 측정하고, 이를 용균 완충액에 현탁하였다(10 ㎎의 조직 각각에 대해 프로테아제 억제제를 함유하는 100 ㎕의 용균 완충액을 첨가하였음). 이어서, 조직을 폴리트론(Polytron)으로 분쇄하고, 4℃에서 14,000 rpm으로 10분 동안 원심 분리하였다. 펠릿을 버리고, 상업용 ELISA 키트(압캠(Abcam))을 이용하여 CCL24 수준을 확인하기 위해 상층액을 검정하였다.

마우스의 간 절편에 대한 H&E 염색

마우스로부터 간, 즉 동물 당 2개의 간엽을 수확하고, 희생한 날에 2.5% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하였다. 조직을 다듬고, 파라핀에 포매하고, 5 ㎛ 이하의 두께로 절단하고, 헤마톡실린 & 에오신(H&E)으로 염색하였다. 현미경(올림푸스 BX60(Olympus BX60))을 이용하여 X10 배율, X20 배율 및 X40 배율로 사진을 촬영하였다.

NASH 임상 연구 네트워크(NASH Clinical Research Network)의 병리 위원회(Pathology Committee)가 정의한 허용 가능한 점수(문헌[Kleiner et. al., 2015 HEPATOLOGY, Vol. 41, No. 6])에 따라 NAFLD 활성 점수를 계산하기 위해 하기 파라미터를 평가하였다. 상기 점수는 지방증에 대한 점수(0점 내지 3점), 소엽 염증에 대한 점수(0점 내지 3점) 및 팽창에 대한 점수(0점 내지 2점)의 비가중 합으로서 정의되며; 따라서 0점 내지 8점의 범위이다:

1. 지방증(유조직 연관성(parenchymal involvement)에 대한 저출력 내지 중간 출력 평가) (0% ≤ 5%, 1%-5%-33%, 2%-33%-66%, 3% ≥ 66%).

2. 염증(모든 염증 병소에 대한 전반적인 평가) (0: 병소 없음, 1: 200x 필드 당 2개 이하의 병소, 2: 200x 필드 당 2개 내지 4개의 병소, 및 3: 200x 필드 당 4개 이상의 병소)

팽창(0: 없음, 1: 약간의 풍선 변화, 및 2: 다수의 세포/현저한 팽창)

래트의 간 절편에 대한 시리우스 레드 염색

간 조직을 10% 완충 중성 포르말린으로 고정하고, 파라핀에 포매하였다. 절편(4 ㎛)을 탈파라핀화하고, 피크로-시리우스 레드를 이용하여 실온(RT)에서 15분 동안 염색하고, 탈수하고, 봉입제로 봉입하였다. 올림푸스 라이트/에피형광 현미경 및 비디오 하부시스템과 인터페이스로 접속된 OsteoMeasure 이미지 분석 소프트웨어 프로그램(조지아주 애틀란타 소재의 오스테오메트릭스 인코포레이티드(OsteoMetrics, Inc.))을 이용하여 염색된 절편에서 간 섬유증을 측정하였다. STAM 마우스에서 피크로-시리우스 레드로 염색된 절편 내의 섬유증을 평가하기 위해, 콜라겐 침착을 시각화하고, 디지털 카메라(DFC295; 라이카(Leica), 독일)를 이용하여 염색된 절편의 명시야 이미지(각 슬라이드에 대해 40 필드)로 정량화하고, ImageJ 소프트웨어(미국 국립보건원)를 이용하여 분석하였다.

간 절편에 대한 면역 형광 염색

형광 면역 조직 화학:

간 조직 절편(5 ㎛ 두께)을 탈파라핀화하고, 다시 탈수하고, 시트르산나트륨 완충액(10 mM, pH 6.0)에서 10분 동안 끓였다. 절편을 PBS로 세척하고, 2 ㎎/㎖의 글리신에서 10분 동안 배양하여 유리 알데히드에 의해 야기된 자가 형광을 억제한 후, PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이어서, 절편을 PBS에서 1% BSA로 희석한 하기 일차 항체, 즉 마우스 단클론성 항-인간 CCL24(1:100 희석; 이스라엘 텔아비브 소재의 케모맙(Chemomab)) 및 래트 다클론성 항-인간 CCR3(1:50 희석; 카탈로그 번호: MAB155-100; R&D 시스템즈)과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날, 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, PBS에서 1% BSA로 1:200 희석된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)-488 접합 염소 항-마우스 IgG 또는 로다민 레드-X 접합 염소 항-래트 IgG(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로젠(Invitrogen))를 이차 항체로 사용하여 실온에서 45분 동안 암실에서 배양하였다. 관련이 없는 동형-매칭되고 농도-매칭된 마우스 및 래트 IgG(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 음성 대조군으로서 사용하였다. 일차 항체가 없는 대조 실험에서 이차 항체의 교차 반응성을 시험하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; 미국 캘리포니아주 테메큘라 소재의 케미콘 인터내셔날(Chemicon International))을 이용하여 핵을 대조 염색하였다. 이 후, 간 절편을 안티페드 수용성 봉입제(Biomeda Gel Mount; 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재의 일랙트론 마이크로스코피 사이언스(Electron Microscopy Sciences))로 봉입하고, 완전 자동화 형광축이 구비된 라이카 DM4000 B 현미경(독일 맨하임 소재의 라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems))을 이용하여 검사하였다. 라이카 소프트웨어 응용프로그램 세트 LAS V3.8이 구비된 라이카 DFC310 FX 1.4-메가픽셀 디지털 컬러 카메라(라이카 마이크로시스템즈)를 이용하여 형광 이미지를 캡쳐하였다.

ALT, AST, 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈의 측정

혈액을 원심 분리하고, 혈청을 수득하였다. COBAS 6000을 이용하여 혈청 내의 ALT, AST, 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈의 수준을 측정하였다.

CCL24에 대한 녹아웃 마우스 생성

CRISPR/Cas9 매개 게놈 공학에 의해 CCL24 녹아웃(KO) C57BL/6 마우스를 생성하였다. 시험관 내 전사에 의해 CCL24에 대한 Cas9 mRNA 및 gRNA를 생성한 후, KO 마우스의 생성을 위해 수정란에 주입하였다. PCR에 의해 원조 마우스(founder mouse)의 유전자형을 분석한 후에 DNA 서열을 분석하였다. 양성 원조 마우스를 다음 세대까지 사육하였으며, PCR에 의해 이들의 유전자형을 분석하고, DNA 서열을 분석하였다. 부가적인 사육을 수행하였으며, PCR 유전자형 분석에 의해 나타난 바와 같이 CCL24에 대한 이중 녹아웃 마우스를 확립하였다. PCR 및 서열 분석에 의해 확인되었던 잠재적인 비표적 부위를 시험하고, 음성인 것으로 확인하였다.

유도성 NASH를 갖는 CCL24 녹아웃 마우스

상술한 바와 같은 CRISPER 기술을 이용하여 C57BL 배경 상의 CCL24 녹아웃을 생성하였다. 4주 동안 6주령의 WT C57BL 마우스 또는 CCL24 녹아웃 마우스에 메티오닌-콜린 결핍 식이를 공급하였다. 4주 후, 마우스를 희생시키고, 조직 검사 및 콜라겐 측정(Sircol^TM)을 위해 이들의 간을 수확하였다. ALT, 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈을 측정하기 위해 오비탈 시너스(Orbital Sinus)로부터 혈액을 수집하였다.

생체 내 MCD 식이 유도 NASH 모델

6주 동안 6주령의 암컷 C57BL 마우스에 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 식이를 공급하였다. 식이를 시작한지 10일 이후부터 시작하여, 마우스를 100 ㎕의 복강 내 주사액 중의 5 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏ 또는 0.05 ㎎/㎏의 CM-101 또는 PBS로 매주 2회 처리하였다. CM-101에 의한 처리는 질환 증상이 발병한 이후에 개시하였다.

아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST), 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT), 알칼리 포스파타아제 및 빌리루빈 수준을 평가하기 위해 6주 이후에 마우스를 희생시키고, 오비탈 시너스로부터 혈액을 수집하였다(ANIT 모델에 대해 후술한 바와 같이 4℃(3,000x g)에서 원심 분리하여 혈청을 수득함). 또한, 조직 병리학 분석을 위해 간을 수확하고, 헤마톡실린 에오신(H&E 염색)을 위해 파라핀에 포매하였다. 콜라겐 검정(Sircol^TM) 및 간 CCL24 수준의 평가를 위해 냉동 조직을 이용하였다.

NASH 유도용 STAM 마우스 모델

200 ㎍ 스트렙토조토신(STZ; 미국 시그마-알드리치) 용액의 단일 피하 주사액을 수컷 C57BL/6 마우스가 태어난 지 2일 이후에 투여한 후, 4주령이 된 날부터 고지방 식이(HFD, 57 kcal% 지방, 카탈로그 번호: HFD32, 클레아 저팬(CLEA Japan), 일본)를 제공하였다. 대조군 IgG 및 CM101(7.5 ㎎/㎏)을 6주령에서 9주령까지 매주 2회 10 ㎕/㎏의 부피로 복강 내 투여하였다.

알파-나프틸이소티오시아네이트(ANIT) 유도 담즙 정체증 마우스 모델

1일째 날에 암컷 C57BL 마우스를 경구 섭식(10 ㎖/㎏)을 통해 ANIT(오일 중에 용해됨, 60 ㎎/㎏)로 처리하였다. 대조군에는 경구 섭식을 통해 올리브오일을 투여하였다. ANIT 처리군에 CM101 또는 비히클을 5 ㎎/㎏의 양으로 1회 복강 내 투여하였다. ANIT 투여 48시간 후, 이소플루란으로 마우스를 마취시키고 안락사 시켰다. 혈액 샘플을 수집하고, 4℃(3,000x g)에서 원심 분리하여 혈청을 수득하여 ALT, AST, ALP, 빌리루빈(화학 패널)을 시험하였다. 또한, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 포르말린 내에서 간을 수집하고, 파라핀에 포매하였다.

담관 결찰(bile duct ligation)에 의해 유도된 담즙 정체증

케타민/자일라진(Ket 50 ㎎/㎏ 및 Xyl 10 ㎎/㎏)을 복강 내 투여하여 수컷 스프라그-다울리(SD) 래트(8주령)를 마취시켰다. 복벽의 수술 부위를 면도하고, 세정하였으며, 간을 부드럽게 수축(retraction)시켜 결찰용 담관을 노출시켰다. 대조군의 모의 수술된 동물은 결찰 없이 동일한 과정을 경험하였다. 0일째 날(결찰일)로부터, 래트에 PBS 또는 HCM101의 정맥 내 주사액을 10 ㎖/㎏의 부피로 매주 2회 투여하였다. 14일 이후에 실험동물을 희생시킴으로써 실험을 종료하였다.

래트에서의 티오아세트아미드(TAA) 유도 간 섬유증 모델

질환 유도를 위해, 7주령 내지 9주령의 수컷 위스타(Wistar) 래트에 티오아세트아미드(250 ㎎/㎏)(시그마, 카탈로그 번호: 172502)를 8주 동안 매주 2회 복강 내 주사하였다. HCM101 처리 동물(2.5 ㎎/㎏)은 4주째부터 매주 2회 항체의 정맥 내 주사액을 투여 받았다.

비아코어

비아코어 T200을 이용하여 HCM101의 친화도 상수를 평가하였다. 이러한 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR) 전기 광학 현상을 이용하여 결합 파트너 사이의 결합 상수 및 온/오프 속도(on/off rate)를 측정하였다. HCM101을 CM-1 칩의 표면 상에 고정하였으며, 에오탁신 1(CCL11)/MCP3(CCL7) 용액을 상기 표면 상부로 통과시켰다. SPR 각도의 변화를 측정하고, KD(평형 해리 상수)를 결정 가능하게 하였다.

디스커버엑스 β-아레스틴 PathHunter 및 cAMP Hunter ^TM eXpress CCR5 검정

리간드 결합 이후에 G-단백질 결합 수용체(GPCR)의 활성화를 평가하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 cAMP Hunter^TM 및 β-아레스틴 PathHunter 검정 키트(미국 프리몬트 소재의 디스커버엑스)를 이용하였다. 간단하게 말하면, PathHunter GPCR β-아레스틴 검정에서, ProLink^TM(PK) 표지 CCR3 및 효소 수용체(EA) 표지 β-아레스틴을 동시에 발현하도록 유전자 조작된 CHO β-아레스틴 CCR3 세포를 96-웰 플레이트에 도말하였다. 케모카인 수용체 활성화를 유도하기 위해, 세포를 증가하는 수준(0 nM, 7.8 nM, 15.6 nM, 31.25 nM, 62.5 nM, 125 nM, 500 nM 및 2,000 nM)의 CCL24에 노출시켰다. HCM101 억제 효과는 5 ㎍/㎖, 15 ㎍/㎖, 45 ㎍/㎖ 및 135 ㎍/㎖의 증가하는 항체 농도로 80 nM의 일정한 CCL24 농도에서 평가하였다. CCR3-PK 수용체의 활성화에 의해 유도된 β-아레스틴-EA의 동원은 2개의 β-갈락토시다아제 효소 단편(EA 및 PK)의 보완을 초래한다. 이어서, PathHunter 검출 시약 기질은 실온에서 60분의 배양 기간 동안에 암실에서 세포에 첨가되어 기질의 β-갈락토시다아제 효소 가수분해를 가능케 한다. 베리타스^TM(Veritas^TM) 마이크로플레이트 발광측정기(터너 바이오시스템스 인코포레이티드(Turner Biosystems Inc.))를 이용하여 생성된 화학 발광 신호를 평가하였다. CCR5 활성화를 평가하기 위해, cAMP Hunter^TM 시스템을 이용하였다. cAMP Hunter^TM eXpress CCR5 CHO-K1 Gi 세포는 수용체의 작용제 자극에 반응하여 세포 내 cAMP 수준의 변화를 검출하도록 설계되어 있다. 세포를 96-웰 플레이트에 도말하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 세포를 상승하는 농도의 작용제(0.15625 μM, 0.3125 μM, 0.625 μM, 1.25 μM, 2.5 μM 및 5 μM의 mip-1α 또는 CCL24)에 노출시키고, cAMP 작업 검출 용액과 함께 암실에서 1시간 동안 배양하였다. cAMP 용액 A를 첨가한 후, 부가적인 3시간의 기간 동안 배양하였으며, 그 이후에 화학 발광 신호를 평가하였다. HCM101 억제를 평가하기 위해, 일정한 100 nM 농도의 CCL24를 증가하는 수준의 HCM101(1 ㎍/㎖, 2 ㎍/㎖, 7 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 60 ㎍/㎖)과 함께 첨가하였다.

콜라겐 함량의 측정

Sircol 가용성 콜라겐 검정(영국 벨파스트 소재의 바이오컬러(Biocolor))을 이용하여 가용성 콜라겐을 정량화하였다. CM101(5 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖), IgG 또는 PBS로 처리된 마우스로부터 간 샘플을 수득하였다. 샘플을 산-펩신 용액 내로 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 샘플을 분석하여 콜라겐 함량을 결정하였다. 간단하게 말하면, 100 ㎕의 샘플을 1 ㎖의 비색 검사용 시약(피크르산 중의 SR 염료)에 첨가하고, 30분 동안 교반한 후, 10,000 g에서 10분 동안 원심 분리하였다. 알칼리 시약(1 N NaOH)을 이용하여 펠릿으로부터 SR 염료를 방출하고, 마이크로플레이트 판독기 상에서 555 ㎚에서 분광광도 판독(spectrophotometric reading)을 수행하였다.

활성화된 인간 간 성상세포에서의 SMA-α 측정

간 성상세포를 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. SMA-α의 기초 측정을 위해 0일째 날에 기저 세포 샘플을 수득하였다.

앞서 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, HCM101(5 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에 낮은 수준 또는 높은 수준의 CCL24를 함유하는 1% NAFLD 환자의 혈청과 함께 세포를 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 세포를 원심 분리하고, 상업용 키트(유세포 분석 고정 & 투과화 완충액 키트 I, R&D 시스템즈; 항-인간 알파-평활근 액틴 PE, R&D 시스템즈)를 이용하여 세포 내 SMA-α의 형광 검출을 위해 염색하였다. FACS(갈리우스(Galius))를 이용하여 형광 신호를 측정하고, 칼루차(Kaluza) 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다.

간 절편에 대한 α-SMA 염색

O.C.T.에 포매된 냉동 간 조직으로부터 절편을 절단하고, 아세톤에 고정하고, 0.03% H₂O₂로 5분 동안 처리하여 내생성 페록시다아제 활성을 차단하였다. 절편을 항-α-SMA 항체(압캠, 1:200로 희석, 미국)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이차 항체(HRP-염소 항-토끼)와 함께 배양한 후, 3,3'-디아미노벤지딘/H₂O₂ 용액(니치레이 바이오사이언스 인코포레이티드(Nichirei Bioscience Inc.))을 이용하여 효소-기질 반응을 수행하였다. 디지털 카메라(DFC295; 라이카, 독일)를 이용하여 중심 정맥 주변에서 α-SMA 양성 영역의 명시야 이미지를 200배 배율로 캡쳐하였으며, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 40필드/절편 내의 양성 영역을 측정하였다.

실시예 1: NASH 및 NAFLD를 갖는 환자의 혈청 및 간 생검 둘 모두에서 상승한 수준의 CCL24가 발견된다

NASH에 대한 CCL24의 잠재적인 연관성을 조사하기 위해, NAFLD 환자의 혈청 내의 CCL24의 수준을 건강한 개체와 비교하여 검정하였다. 그 결과에 따르면, 도 1a에 나타난 바와 같이, 높은 FIB 4 점수를 갖는 환자에서 CCL24가 2배 증가하고(pv ≤ 0.01), 낮은 FIB 4 점수를 갖는 환자에서 1.5배 증가하는 것(pv ≤ 0.05)으로 나타났다. 높은 섬유화 점수는 NASH에 대한 보다 높은 가능성의 지표이다. 따라서, NAFLD 환자에서 CCL24 수준의 상승은 또한 건강한 환자 또는 NAFLD 환자의 혈액 샘플에서 취한 PBMC 상의 CCR3 발현의 상승과 연관이 있었다(도 1b 내지 도 1n). CCR3 수준은 항-CCR3 항체로 염색된 단리된 PBMC에 대한 FACS 분석을 이용하여 측정되었다. 도 1b 및 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 건강한 환자의 PBMC에서 0.47%, 0.54% 또는 0.61%와 비교하여 NAFLD 환자의 PBMC에서의 CCR3 발현은 4.88%, 3.2% 또는 4.69%로 나타났다.

게다가, NASH 환자에서 취한 간 생검에서 유의하게 상승한 CCL24 발현이 검출되는 반면(도 2a 내지 도 2c), 건강한 간에서는 어떠한 CCL24 발현도 검출되지 않았다(도 2d 및 도 2e). 도 2f 및 도 2g는 CCL24 연관 수용체 CCR3이 간에서도 발현된다는 것을 보여준다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, CCL24는 NASH의 진행에 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 나타난다. 다음 실시예에서는 간 질환의 생체 내 모델에서 항-CCL24 단클론성 항체의 효과를 평가하였다.

실시예 2: MCD 유도 NASH 모델에서 CCL24 녹아웃 마우스의 간 기능의 특성 분석

재료 및 방법 단락에 개시된 바와 같이 CCL24 녹아웃(KO) 마우스를 만들었다. CCL24 KO C57BL 마우스에 MCD를 공급함으로써 이들 마우스에서 NASH를 유도하였다. NASH는 또한 정상 유전자 C57BL 배경("야생형"으로 지칭됨)을 갖는 대조군에서도 유도되었다. 다양한 간 특징을 시험하여 질환의 진행에 미치는 CCL24 녹아웃의 효과를 증명하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, ALT(도 3a), ALP(도 3b) 및 빌리루빈(도 3c) 혈청 수준은 CCL24 녹아웃 마우스에 비해 야생형 마우스에서 유의하게 높았다. 유사하게, 도 3d에 도시된 바와 같이, 간 내의 콜라겐 농도는 CCL24 녹아웃 마우스에 비해 야생형 마우스에서 훨씬 높았다. 또한, 도 3e에 도시된 바와 같이, 치료 시험 동안에 NAFLD 변화를 측정하기 위한 수단으로서 개발된, 비알콜성 지방간 질환의 특성에 대한 점수를 매기는 시스템인 NAS 점수(NAFLD 활성 점수)는 야생형에 비해 녹아웃 마우스에서 훨씬 낮았다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, 상기 결과에 따르면 NASH 발달에서의 CCL24의 중요성이 명백히 증명되었다. 도 3f 내지 도 3k는 HE로 염색된 대표적인 간 절편을 보여준다.

실시예 3: 항-CCL24 mAb CM101에 의한 처리는 마우스 모델에서 NASH 특성을 감소시킨다

쥐 항-CCL24 항체 CM101을 이용하여 NASH 진행에 미치는 CCL24의 억제 효과를 추가로 평가하였다. 쥐 CM101은 인간 CCL24에 유되되는 마우스 단클론성 항체이다(WO 2010/086854). NASH에 미치는 CM101에 의한 처리 효과를 평가하기 위해, 메티오닌-콜린 결핍(MCD) 식이를 이용하여 쥐 모델에서 NASH를 유도하였다.

6주 동안 C57BL 마우스에 MCD 식이를 공급함으로써 NASH를 유도하였다. 대조군에는 정상 음식 식이를 제공하였다.

질환 증상이 이미 존재하는 10일째 날에 CM101(0.05 ㎎/㎏, 0.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏) 또는 PBS를 MCD 식이가 공급된 마우스에 매주 2회 복강 내 주사하였다. 식이를 시작한지 6주 후에 마우스를 희생하고, 모든 그룹으로부터 간 및 혈액 샘플을 수득하였다.

PBS 또는 보다 낮은 투여량으로 처리된 마우스와 비교하여 NASH 파라미터의 유의한 감소가 5 ㎎/㎏의 CM-101로 처리한 마우스에서 관찰되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, CM-101을 5 ㎎/㎏의 고용량으로 투여하면 시험된 모든 파라미터(간 효소, 간 콜라겐 수준 및 간 조직 점수)의 증가가 약화되었다. ALT, AST 및 빌리루빈(도 4a 내지 도 4c)은 PBS 처리 마우스와 비교하여 고용량 CM-101 처리군에서 유의하게 감소하였다(p < 0.05). CM-101의 효과는 또한 간 콜라겐 농도의 유의한 감소에서 자명하였으며, 이는 5 ㎎/㎏의 CM-101로 처리된 그룹에서 간 콜라겐이 95% 감소함을 증명하였으며, 콜라겐 농도를 정상적인 콜라겐 기저 수준까지 반전시켰다(도 4d에 도시된 바와 같음). H&E 간 염색에서의 NAFLD 활성화 점수의 결정(도 4e 내지 도 4l의 조직 절편 사진)에 따르면 5 ㎎/㎏의 CM-101로 처리된 그룹에서 7점에서 5점으로의 유의한 감소가 나타났다(도 4m).

최종적으로, 간 내의 표적 결합(target engagement)을 확인하기 위해, 간에서의 CCL24의 수준을 평가하였으며, CM101에 의한 처리로 인해 단백질 발현이 적절히 감소한 것으로 나타났다(도 4n).

실시예 4: CM101 처리에 의한 STAM 마우스 NASH 모델에서의 NAFLD 활성 점수 및 섬유증의 개선

NASH에 대한 STAM 마우스 모델에서 CM101 처리의 항섬유증 및 항염증 효과를 추가로 평가하였다. STAM 마우스는 지방증에서부터 NASH 내지 섬유증 및 간암종에 이르는 모든 질환 단계를 나타내는, 인간에서의 NASH의 병리 생리학적 발생 과정을 밀접하게 모방하는 모델을 나타낸다. 이들 동물은 태어난 지 2일 후에 스트렙토조토신의 단일 피하 주사액을 투여 받은 후, 고지방 식이를 공급하여 간 손상과 유사한 NASH를 유도하였다.

조직 병리학적 분석에 따르면 7.5 ㎎/㎏의 CM101을 STAM 마우스에 투여하였을 때 IgG 처리 대조군과 비교하여 H&E 염색으로 평가한 간 손상이 감소하였고(도 5a 내지 도 5d), NAFLD 활성 점수(NAS 점수)가 32% 만큼 유의하게 약화된 것(도 5e)으로 나타났다. 이러한 효과는 대개 65% 감소한 간세포 팽창에서의 실질적인 개선으로부터 발생하였다(도 5f). CM101은 대조군과 비교하여 간 콜라겐의 축적 및 섬유증을 유의하게 감소시켰으며, 이는 시리우스 레드 양성 영역의 감소에 의해 증명되었다(도 5g 내지 도 5k). 섬유증 확립 및 간에서의 대부분의 콜라겐 침착에 관여하는, 간 성상세포의 활성화를 나타내는 알파-평활근 액틴(α-SMA)을 또한 STAM 마우스에서 평가하였다. 항-CCL24 처리는 IgG 대조군과 비교하여 α-SMA 양성 염색 영역의 유의한 감소를 초래하였다(도 5l 내지 도 5n).

실시예 5: CM101은 래트 TAA 유도 간 섬유증 모델에서 간 손상 및 섬유증을 유의하게 감소시킨다

섬유증에 미치는 HCM101 처리의 특정 효과를 알아내기 위해, 래트 독성(TAA) 유도 섬유증 모델을 조사하였다. CCL24를 억제하면 간 손상의 감소가 나타났으며, 이는 미처리 대조군과 비교하여 간 효소 수준의 유의한 감소로 나타났다. 더욱이, 간 손상에 대한 거시적 검사에 따르면 재생 결절이 감소하고 손상이 줄어든 간 병리에서의 현저한 개선이 나타났다(도 6a 및 도 6b). 간 절편에 대한 시리우스 염색을 이용한 섬유증의 평가에 따르면 미처리 대조군과 비교하여 HCM101 처리군에서 콜라겐 침착이 평균 5배 감소하고, 염증이 거의 2배 감소하는 것으로 나타났다(도 6c). Sircol 정량화를 이용한 콜라겐 침착에 대한 추가적인 평가에 따르면 콜라겐 함량이 유의하게 45% 감소한 것으로 나타났다(도 6d).

실시예 6: CCL24 및 이의 수용체 CCR3은 PSC 환자의 간 및 순환에서 과발현된다

상업용 항-CCR3 항체를 이용하여 원발성 경화 담관염(PSC) 지원자 및 건강한 지원자(각각 n = 10 및 n = 22)에서 유래한 PBMC에 대하여 CCR3 수준을 평가하였다. 도 7a 내지 도 7e에 도시된 바와 같이, 건강한 개인(0.68% ± 0.36)과 비교하여 PSC 환자(3.94% ± 1.35)에서 CCR3 수준의 유의한 증가가 확인되었다. 면역 형광을 이용하여 PSC 환자의 간에서 CCL24 및 CCR3을 평가하였다. 도 7f 내지 도 7i에 도시된 바와 같이, CCL24 및 CCR3 수준은 면역 세포, 담관 세포 및 간세포에서 유의하게 과발현되었다.

실시예 7: CM101은 실험용 원발성 경화 담관염(PSC) 모델에서 간 손상을 강력하게 개선한다

PSC 동물 모델에서 CM101의 효과를 평가하기 위해, ANIT 화합물에 의해 유도된 설치류 담즙 정체증 모델을 이용하였다.

이러한 질환 모델에 대해 전형적인 빌리루빈, 알칼리 포스파타아제, ALT 및 AST의 상승한 혈청 수준은 ANIT 유도 담즙 정체성 마우스에서의 CM101 처리에 의해 각각 87%, 47%, 33% 및 48% 만큼 유의하게 감소하였다(도 8a). 게다가, H&E 염색을 이용하여 간 괴사를 평가함으로써 CM101의 조직 병리학적 효과를 연구하였다. ANIT 유도 간 손상은 마우스에서의 CM101 처리에 의해 약화되는 것으로 밝혀졌다(도 8b). CM101에 의한 처리 효과는 래트에서 담관 결찰에 의해 유도된 담즙 정체증의 제2 모델에서 추가로 평가하였다. 이러한 모델에서 중요 반응(doctoral reaction) 및 간 손상과 연관된 섬유증을 시리우스 레드 염색을 이용하여 평가하였으며, 무처리 수술 동물과 비교하여 항-CCL24 mAb로 처리된 래트의 간 손상이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(도 9a 및 도 9b).

실시예 8: 완전 인간화 HCM101 항체는 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시킨다

많은 장기에서, 근섬유아세포는 손상에 반응하여 반흔 과정에 중요한 역할을 한다. 간 섬유 생성 또는 간경변에서, 간 성상세포(HSC)는 전구체 개체군으로 간주된다(즉, 이들은 근섬유아세포로 교차 분화함).

근섬유아세포는 알파 평활근 액틴(αSMA)을 갖는 세포질 스트레스 섬유가 특징인 전문화된 섬유아세포이다. αSMA가 근섬유아세포를 특징짓는 인자이기 때문에 세포 내 αSMA 수준의 측정은 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이에 대한 지표로서 작용할 수 있으며, 따라서 간세포 병태의 중증도에 대한 지표로서 작용할 수 있다.

HSC의 근아세포로의 CCL24 매개 전이에 미치는 항-CCL24 항체의 효과를 측정하기 위해, HSC 세포주를 사용하였다. 완전 인간화 항-CCL24 항체 HCM101(WO 2015/132790)을 이용하여 검정을 수행하였다. 인간화 HCM101(5 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에 세포를 1% NAFLD 환자의 혈청의 존재 하에 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. FACS에 의해 αSMA의 수준을 측정하여 세포 활성화 및 근섬유아세포로의 전이를 평가하였다(도 10).

대조군 비활성화 세포, 즉 환자의 혈청에 노출되지 않은 세포는 세포 내 염색 및 FACS 분석을 이용하여 측정하였을 때 2.7%의 SMA 양성 염색을 나타냈다. CCL24의 수준(ELISA로 측정할 때 3,521 pg/㎖)이 높은 NAFLD 환자로부터 수득된 혈청에 의해 활성화된 간 성상세포 배양액에서, 세포의 34%가 SMA 양성 세포였다. 혈청을 인간화 항-CCL24 항체 HCM101(10 ㎍/㎖)로 37℃에서 1시간 동안 전-처리하는 경우, 15%의 SMA 양성 세포만이 배양액에 존재하였다. 흥미롭게도, 23%의 SMA 양성 세포만이 CCL24의 수준이 낮은(193 pg/㎖) NAFLD 환자에서 수득된 혈청에 의해 활성화된 간 성상세포에 존재하였다. 혈청을 인간화 항-CCL24 항체 HCM101(10 ㎍/㎖)로 전-처리하는 경우, 19% SMA 양성 세포만이 배양액에 존재하였다.

이 결과에 따르면 상승한 αSMA 발현은 보다 낮은 수준의 케모카인을 함유하는 혈청에 비해 높은 수준의 CCL24를 함유하는 NAFLD 혈청으로 처리된 HSC에서 보다 강력한 것으로 나타났다.

또한, 인간화 항-CCL24 항체 HCM101은, 높은 수준의 CCL24를 함유하는 혈청에 대한 노출에 의해 활성화된, 배양액에서의 αSMA 발현을 50% 감소시켰다. 이론과 결부되기를 원하지 않지만, 항-CCL24 항체는 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 CCL24 매개 전이를 약화시키는 것으로 나타났다.

실시예 9: HCM101의 친화도 및 결합 특이성

CHO 세포에 의해 생성된 HCM101의 다른 비-CCL24 케모카인에 대한 결합 친화도를 조사하기 위해 SPR 기반 기술인 비아코어를 사용하였다. 항체의 에오탁신 1(CCL11) 및 MCP3(CCL7)에 대한 상당한 결합은 비아코어에 의해 증명되었으며(각각 도 10a 및 도 10b), 이는 친화도 상수가 각각 30 nM 및 130 nM임을 나타냈다.

실시예 10: HCM101은 CCR3 및 CCR5 케모카인 수용체 활성화 둘 모두를 억제한다

HCM101가 또한 CCL11 및 CCL7과 결합할 수 있다는 것을 확립한 후, 기타 케모카인 수용체와의 가능한 결합을 통해 CCL24의 활성화 전위를 평가함으로써 이의 유효성 및 효능을 추가로 평가하였다. 이러한 목적을 위해, 디스커버엑스 케모카인 활성화 시스템을 사용하였다. 이러한 시스템은 수용체 활성화에 의해 유도된 형광 신호를 생성하는 유전자 조작된 세포를 이용한다. 디스커버엑스 세포에 대한 2개의 상이한 활성화 시스템, 즉 유전자 조작된 β-아레스틴의 동원에 의해 CCR3가 활성화되는 경우에 신호를 생성하는 CCR3 β-아레스틴 검정, 및 수용체 활성화의 발생 시에 감소하는 cAMP의 세포 내 농도에 비례하는 신호를 보내는 CCR5 cAMP 검정을 이용하였다.

CCL24는 CCR3 β-아레스틴 시스템에서의 투여량 의존적인 반응을 유도하였으며, 7 nM 내지 2,000 nM 범위의 농도의 리간드(CCL24)에 의해 수용체의 활성화가 현저하였다(도 12a). HCM101를 다양한 농도로 첨가하면 CCL24에 의한 CCR3 활성화의 투여량 의존적인 억제가 유의하였으며(도 12b), 활성은 최대 70% 감소하였다.

CCL24가 부가적인 케모카인 수용체를 통해 세포를 활성화하는 능력을 평가하기 위해, CCR5 케모카인 수용체의 활성화를 나타내는 제2 디스커버엑스 시스템을 사용하였다. 대조군으로서 잘 알려져 있고 확립된 CCR5 리간드인 mip-1α를 시험하여 수용체 활성화를 유도하는 이의 능력을 확인하였으며, 이는 cAMP의 세포 내 수준의 감소에 의해 나타났다. 실제로, cAMP의 투여량 의존적 감소는 다양한 농도의 mip-1α(데이터 미도시)에서 관찰되었다. 이들 CCR5-cAMP 세포를 CCL24로 처리하면 수용체의 투여량 의존적 활성화가 야기되며, 이는 0.15 μM 내지 5 μM 범위의 농도에서의 cAMP 수준의 감소로부터 자명하였다(도 12c). HCM101을 보충하면 이러한 효과가 반전되어, 다양한 항체 농도(7 ㎍/㎖ 내지 60 ㎍/㎖)에서 cAMP의 세포 내 수준을 증가시켰으며, 이는 수용체의 활성화에 의해 CCR5 활성화 억제가 최대 70% 감소한다는 것을 나타낸다(도 12d). CCL11에 미치는 HCM101의 효과를 검토하기 위해 CCR5 cAMP 시스템을 추가로 사용하였다. CCL11을 4 nM 내지 5 μM 범위의 농도로 투여하면 CCR5의 투여량 의존적 활성화가 야기되었다. HCM101의 투여는 CCL11 유도 CCR5 활성화를 최대 60% 약화시켰다(도 12e 및 도 12f).

실시예 11: 자가 면역 간염에 미치는 CM101의 효과

자가 면역 간염(AIH)은 계면 간염, 증가된 플라즈마 간 효소, 자가 항체의 존재 및 조절 T-세포(Tregs)의 기능 장애와 연관된 만성 염증성 간 질환이다. 래트에서의 콘카나발린(Con)-A 유도 간염은 AIH를 연구하고 잠재적인 치료제를 평가하기 위한 동물 모델이다.

래트 모델에서 급성 감염을 유도하기 위해, 300 ㎕의 PBS에 용해된 콘카나발린 A(Con A)를 꼬리 정맥을 통해 5 ㎎/㎏의 투여량으로 각각의 래트에 투여하였다. 대조군 래트는 300 ㎕의 PBS만을 투여 받았다. 0일째 날에 동물들은 2.5 ㎎/㎏의 HCM101 또는 대조군 IgG를 피하 투여 받았다. Con A의 투여 48시간 후에 동물을 희생시켰다. AST, ALT, TNF-α, IFN-γ 및 CCL24 수준을 평가하였다. 간 백혈구 침윤, 간 괴사 및 간 섬유증에 대한 조직 병리학 분석을 또한 평가하였다.

만성 간염을 유도하기 위해, 10 ㎎/㎏의 Con A를 12주 동안 매주 1회 정맥 내 투여한다. 2.5 ㎎/㎏의 CM101 또는 IgG를 2주째부터 12주째까지 피하 투여한다. 대조군은 콘카나발린 A(Con A) 대신 PBS를 투여 받는다. 간 효소(예를 들어, AST, ALT), 괴사 및 염증 섬유증의 간 조직 분석, 및 알파-SMA를 평가하였다.

SEQUENCE LISTING <110> ChemomAb Ltd. <120> Anti CCL24 (eotaxin2) antibodies for use in the treatment of hepatic diseases <130> 2513505 <150> IL 251024 <151> 2017-03-08 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Ser Gly Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Val Ala Ser Asn Leu Lys Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Ser Asn Glu Glu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Asn Ser 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser His Ser Tyr Gly Ser Ser Tyr Ala Met Asp Asn Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Leu Lys Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 426 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (386)..(386) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (422)..(422) <223> n is a, c, g, t or u <400> 9 gggcagcaga nccggggcng nggatagaca gangggggnn gncgttttgg ctgaggagac 60 ggtgactgag gttccttgac cccagttgtc catagcgtag ctactaccgt aggaatgact 120 tgcacagaaa tatgtagccg tgtcctcatt tctgaggttg ttgatctgca aataggcagt 180 gctggcagag gtttccaaag agagggcaaa ccgtcccttg aagtcatcag tatatgttgg 240 ctctccattg taggtgttga tccagcccat ccactttaaa ccctttcctg gagcctgctt 300 tacccagttc attccagagt ttgtgaaggg atacccagaa gccctgcagg agatcttgac 360 tgtgtctcca ggcttcttca gctcangtcc agactgcacc aactggatct gggccatggc 420 cngcta 426 <210> 10 <211> 254 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(61) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(73) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (75)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (80)..(83) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (85)..(86) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (88)..(92) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (95)..(95) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (98)..(98) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (100)..(101) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (107)..(109) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (111)..(113) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (115)..(115) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (119)..(121) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (125)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (131)..(137) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (139)..(142) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (145)..(149) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (153)..(154) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (157)..(157) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (163)..(166) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (168)..(168) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (171)..(173) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (178)..(178) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (180)..(181) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (183)..(185) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (187)..(191) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (196)..(200) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (202)..(202) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (206)..(206) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (214)..(214) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (216)..(218) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (221)..(226) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (233)..(234) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (236)..(236) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 gggccaatgg nngaggacgc ggatgggggt gtcgnngtgc cttngtcgnn nnctnnttgn 60 ncancntcna cnncnnnnan nnnanngnnn nntgnaanan ngatggnnnt nnncnacann 120 ntggnntcct nnnnnnntnn nntgnnnnng acnncanana cannnncnac nnnatgancn 180 ncnnncnnnn nttgannnnn gncnantatg aacnannnaa nnnnnntacc tgnnangcca 240 ctcacaagac atca 254 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cagatccaat tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcctc agtcaaggtc 60 tcctgcaggg cttctgggta tcccttcaca aactctggaa tgaactgggt aaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg atcaacacct acaatggaga gccaacatat 180 actgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcag aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagtcattcc 300 tacggtagta gctacgctat ggacaactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 12 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gacattgtgc tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60 atcaactgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ttgcatccaa tctaaaatct 180 ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caccatcagc 240 agcctgcagc ctgaggattt tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggaaccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aaa 333

Claims

간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24(에오탁신 2) 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 간 병리는 비알콜성 지방간 질환(NAFLD), 담즙 정체증, 간내 담즙 정체성 간 질환, 알콜성 간염 및 간 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제2항에 있어서, 상기 NAFLD는 비알콜성 지방간(NAFL) 또는 비알콜성 지방간염(NASH)인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제2항에 있어서, 상기 간 병리는 NASH에서 기인하는 간세포 암종인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제2항에 있어서, 상기 간내 담즙 정체성 간 질환은 원발성 경화 담관염(PSC) 또는 원발성 담즙 간경변(PBC)인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제2항에 있어서, 상기 간 병리는 PSC에서 기인하는 담관 암종인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편으로서,
a. 간 손상 시에 간 효소의 상승한 혈청 수준을 감소시키고/시키거나;
b. 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나;
c. 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는데 사용하기 위한 단리된 항-CCL24 항체 또는 이의 임의의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론성 항체인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제8항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간화 항체인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이의 항원 결합 단편은 Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 항원과 결합할 수 있는 중쇄 가변 영역, 항원과 결합할 수 있는 경쇄 가변 영역, Fab, F(ab)₂' 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는,
a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR1 또는 이의 변이체;
b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR2 또는 이의 변이체; 및
c) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
d) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR1 또는 이의 변이체;
e) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 또는 이의 변이체; 및
f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 완전 인간화 항체인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하는 완전 인간화 항체인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표시된 바와 같은 6개의 CDR 서열, 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 완전 인간화 항체인 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는,
(a) NSGMN(서열번호 1)을 포함하는 중쇄 CDR1, WINTYNGEPTYTDDFKG(서열번호 2)를 포함하는 중쇄 CDR2 및 HSYGSSYAMDN(서열번호 3)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
(b) KASQSVDYDGDSYMN(서열번호 4)을 포함하는 경쇄 CDR1, VASNLKS(서열번호 5)를 포함하는 경쇄 CDR2 및 QQSNEEPWT(서열번호 6)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체와 동일한 에피토프와 결합하는 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 적어도 하나의 부가적인 치료제와 함께 투여되는 것인 단리된 항-CCL24 항체.
제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제는 파네소이드 X 수용체(FXR) 작용제, 페록시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 작용제, 항-케모카인 또는 항-사이토카인 단클론성 항체, 소분자, 항염증제, 항섬유화제 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 항-CCL24 항체.
완전 인간화 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 완전 인간화 항체는,
a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR1 또는 이의 변이체;
b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR2 또는 이의 변이체; 및
c) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
d) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR1 또는 이의 변이체;
e) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 또는 이의 변이체; 및
f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며,
이때 상기 약학 조성물은 간 병리를 치료하는데 사용하기 위한 것인 약학 조성물.
제17항에 있어서, 상기 완전 인간화 항체는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 부가적인 치료제와 함께 투여되는 것인 약학 조성물.
제19항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제의 투여 이전, 투여와 동시 또는 투여 이후에 투여되는 것인 약학 조성물.
제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 약학 조성물은 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제는 파네소이드 X 수용체(FXR) 작용제, 페록시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 작용제, 항-케모카인 또는 항-사이토카인 단클론성 항체, 소분자, 항염증제, 항섬유화제 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
간 병리를 치료하는 방법으로서,
이를 필요로 하는 환자에게 완전 인간화 항체 또는 제17항의 약학 조성물을 치료적으로 허용 가능한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 완전 인간화 항체는,
a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR1 또는 이의 변이체;
b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR2 또는 이의 변이체; 및
c) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
d) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR1 또는 이의 변이체;
e) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 또는 이의 변이체; 및
f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 간 병리를 치료하는 방법.
간 손상 시에 간 효소의 혈청 수준을 감소시키고/시키거나, 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나, 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는 방법으로서,
이를 필요로 하는 환자에게 완전 인간화 항체 또는 제17항의 약학 조성물을 치료적으로 허용 가능한 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 완전 인간화 항체는,
g) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR1 또는 이의 변이체;
h) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR2 또는 이의 변이체; 및
i) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
j) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR1 또는 이의 변이체;
k) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 또는 이의 변이체; 및
l) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 간 손상 시에 간 효소의 혈청 수준을 감소시키고/시키거나, 간 손상 또는 괴사를 감소시키고/시키거나, 간 성상세포(HSC)의 근섬유아세포로의 전이를 약화시키는 방법.
제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 완전 인간화 항체는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 부가적인 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 부가적인 치료제는 파네소이드 X 수용체(FXR) 작용제, 페록시솜 증식인자 활성화 수용체(PPAR) 작용제, 항-케모카인 또는 항-사이토카인 단클론성 항체, 소분자, 항염증제, 항섬유화제 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
세포에서의 CCR5 활성화를 감소 또는 억제하는 방법으로서,
완전 인간화 항체를 투여하는 단계를 포함하며,
이때 상기 완전 인간화 항체는,
a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR1 또는 이의 변이체;
b) 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR2 또는 이의 변이체; 및
c) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VH CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
d) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR1 또는 이의 변이체;
e) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR2 또는 이의 변이체; 및
f) 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 VK CDR3 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 세포에서의 CCR5 활성화를 감소 또는 억제하는 방법.