TW202317616A - 分離的抗原結合蛋白及其用途 - Google Patents

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馬海立
劉運華
楊紅舟
郭若聞
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劉恒
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Abstract

本申請關於一種抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區的至少一個CDR，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列；且其包含輕鏈可變區的至少一個CDR，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。

Description

分離的抗原結合蛋白及其用途
本申請關於生物醫藥領域，具體的關於一種抗原結合蛋白及其用途。
過敏(包括特應性)和其他過敏反應性疾病是對外來抗原不適當的或過度的免疫反應。不適當的免疫反應包括那些被誤導的針對人體自身成分的免疫反應，導致自身免疫性疾病。過敏性疾病(也稱作變應性疾病)是全球第六大慢性疾病，影響機體多種組織器官，一旦發作會引起各種不適症狀，嚴重降低生活質量甚至危及生命。例如過敏性反應、過敏性鼻炎、哮喘、遺傳性過敏皮炎、食物過敏和風疹，在許多國家中給占人口總數20%的人群帶來痛苦，並且疾病流行的程度在逐漸增加(Wuthrich B.，Int.Arch.Allergy AppI.Tmmunol.,90,pp3_10,1989)。過敏性疾病大體上分為IgE-介導的(immunoglobulin-mediated)與IgE-非介導的(immunoglobulin-nonmediated)，由免疫球蛋白E(IgE)介導的超敏反應占多數。IgE的高親和力受體(FcεRI)是介導變應性表現的關鍵。除了肥大細胞和嗜鹼性粒細胞以外，FcεRI還見於許多其他細胞類型(包括嗜酸性粒細胞、血小板)和抗原呈遞細胞(例如單核細胞和樹突細胞)。由於IgE在介 導大部分變應性反應中起重要作用，開發針對控制IgE水平的過敏性疾病的治療策略是十分必要的。
本申請提供了一種抗原結合蛋白，其具備以下的一種或多種優勢：1)穩定性好，本申請的抗原結合蛋白成藥性高，更有利於工業化生產；2)本申請的抗原結合蛋白對新生兒受體FcRn的親和力增強，半衰期更長，可以達到延長給藥週期的目的。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈可變區的至少一個互補決定區(CDR)，該重鏈可變區(VH)包含如SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列；且其包含輕鏈可變區(VL)的至少一個互補決定區(CDR)，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白具有下述性質中的一種或多種：
1)能夠以約2.4×10-9M或更小的KD值與IgE相結合；
2)能夠抑制IgE與其受體FcεRIa和/或FcεRII的結合。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白與人IgE結合。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含重鏈HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該HCDR2包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含重鏈HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈框架區1(H-FR1)，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：4、17中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含重鏈框架區2(H-FR2)，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：81、5或27中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該H-FR2包含SEQ ID NO：5、18、27或36中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含重鏈框架區3(H-FR3)，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：6、19中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含重鏈框架區4(H-FR4)，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：7、20中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH，該VH包含SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH，該VH包含SEQ ID NO：8、21、28、37或41中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該LCDR3包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含輕鏈LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該LCDR2包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含輕鏈LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該 LCDR2包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈框架區1(L-FR1)，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：31、12或80中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該L-FR1包含SEQ ID NO：12、22、31或38中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含輕鏈框架區2(L-FR2)，該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：13、23或32中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含輕鏈框架區3(L-FR3)，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：33、14或82中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該L-FR3包含SEQ ID NO：14、24、33或39中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白還包含輕鏈框架區4(L-FR4)，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：34、15中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈可變區VL，該VL包含SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈可變區VL，該VL包含SEQ ID NO：16、35、25、40中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH包含SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH包含SEQ ID NO：8、21、28、37或41中任一項所示 的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：16、35、25、40中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包括抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該抗原結合片段包括Fab，Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包括重鏈恆定區，且該重鏈恆定區源自人IgG。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包括重鏈恆定區，且該重鏈恆定區源自人IgG1。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包括重鏈恆定區，其中與SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列相比，該重鏈恆定區包含下述胺基酸突變：M135Y、S137T和/或T139E。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白中該重鏈恆定區包含SEQ ID NO：42、44中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈，且該重鏈包含SEQ ID NO：45、47或49中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包括輕鏈恆定區，且該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈，且該輕鏈包含SEQ ID NO：46或48中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本申請的抗原結合蛋白包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：45、47或49中任一項所示的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：46或48中任一項所示的胺基酸序列。
另一方面，本申請還提供了多肽，其包含本申請的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請還提供了免疫綴合物，其包含本申請的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請還提供了分離的核酸分子，其編碼本申請的抗原結合蛋白。
另一方面，本申請還提供了載體，其包含本申請的分離的核酸分子。
另一方面，本申請還提供了細胞，其包含和/或表達本申請的抗原結合蛋白、本申請的多肽、本申請的免疫綴合物、本申請的分離的核酸分子或本申請的載體。
另一方面，本申請還提供了製備本申請的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得本申請的抗原結合蛋白表達的條件下，培養本申請的細胞。
另一方面，本申請還提供了醫藥組成物，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的多肽、本申請的免疫綴合物、本申請的分離的核酸分子、本申請的載體、本申請的細胞和/或視需要地藥學上可接受的載劑。
另一方面，本申請還提供了本申請的抗原結合蛋白、本申請的多肽、本申請的免疫綴合物、本申請的分離的核酸分子、本申請的載體、本申請的細胞和/或本申請的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療IgE相關的疾病或病症。
另一方面，本申請還提供了預防、緩解或治療IgE相關的疾病或病症的方法，該方法包括向有需要的受試者施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的多肽、本申請的免疫綴合物和/或本申請的醫藥組成物。
另一方面，本申請還提供了本申請的抗原結合蛋白、本申請的多肽、本申請的分離的核酸分子、本申請的載體、本申請的細胞、本申請的免疫綴合物和/或本申請的醫藥組成物，其用於預防、緩解或治療IgE相關的疾病或病症。
另一方面，本申請還提供了一種用於檢測或測定IgE的方法，該方法包括使用本申請的抗原結合蛋白或本申請的多肽。
另一方面，本申請還提供了一種用於檢測或測定IgE的試劑盒，該試劑盒包括本申請的抗原結合蛋白或本申請的多肽。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明書如下：
圖1顯示的是本申請的抗原結合蛋白(鼠源單株抗體)阻斷IgE與其受體FcεRIa結合的阻斷活性結果。
圖2顯示的是本申請的抗原結合蛋白(嵌合抗體及其相應鼠源抗體)阻斷IgE與其受體FcεRIa結合的阻斷活性結果。
圖3顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化抗體、其相應嵌合抗體及相應鼠源抗體)阻斷IgE與其受體FcεRIa結合的阻斷活性結果。
圖4顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE2抗體)與奧馬珠單抗阻斷IgE與其受體FcεRIa結合的檢測結果。
圖5顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5抗體)與奧馬珠單抗阻斷IgE與其受體FcεRIa結合的檢測結果。
圖6A及圖6B顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)與人IgE結合的親和力。
圖7A及圖7B顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)阻斷IgE與其受體(FcεRIa和FcεRII)結合的阻斷活性結果。
圖8顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)阻斷IgE介導的細胞激活的抑制活性檢測結果。
圖9A至圖9C顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)阻斷不同過敏原IgE介導的細胞激活的抑制活性檢測結果。
圖10顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)在小鼠體內對游離人IgE的抑制能力。
圖11顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)在小鼠速發過敏模型中緩解體溫變化的結果。
圖12顯示的是本申請的抗原結合蛋白(人源化SE5ss抗體)在食蟹猴IgE抑制模型中對游離IgE的抑制能力。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
[術語定義]
在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常指包含結合抗原部分的蛋白質，以及視需要地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。抗原結合蛋白可包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。本申請的“抗原結合蛋白”可以包含結合抗原的部分和視需要地，允許抗原結合部分採用促進該抗原結合部分結合抗原的構象的支架或構架部分。
在本申請中，術語“IgE”或“IgE免疫球蛋白”或“免疫球蛋白E”通常是指一類由漿細胞產生的抗體(或免疫球蛋白(Ig))。IgE的單體通常由兩條重鏈(ε鏈)和兩條輕鏈組成，其中ε鏈可包含4個Ig樣恆定區(Cε1-Cε4)。在本申請中，“IgE”可以是完整的IgE或其片段，可以是IgE的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物，以及具有至少一個與IgE共同表位的類似物。在人類中，IgE屬基本上由公知免疫球蛋白epsilon基因編碼的抗體類別的多肽。IgE可以包括膜錨定的(mIgE)，或非膜錨定的，也稱為循環IgE。在本 申請中，術語“IgE”可以來源於哺乳動物，IgE可以包括人IgE。在本申請中，該人IgE在GenBank數據庫中的序列號為Gene ID：3497。
在本申請中，術語“FcεRIα”通常是指是免疫球蛋白E(IgE)的Fc區的高親和受體(FcεRI，也稱作Fc epsilon RI)的α鏈。FcεRI是能夠結合IgE的ε重鏈的Fc區的四聚體受體複合物，其通常由一個α鏈(即FcεRIα)，一個β鏈(FcεRIβ)和兩個γ鏈(FcεRIγ)組成。通常情況下，α鏈可以作為抗體(例如，IgE)的結合位點，γ鏈可以作為下游信號起始的位點，β鏈可以起到放大下游信號的作用。在本申請中，“FcεRIα”可以是完整的FcεRIα或其片段，可以是FcεRIα的功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物、類似物，以及具有至少一個與FcεRIα共同表位的類似物。
在本申請中，術語“KD”，也稱作“K D ”、“KD”、“親和常數”或“平衡解離常數”，通常是指在滴定測量中在平衡時、或者藉由將解離速率常數(kd)除以結合速率常數(ka)所獲得的值。通常，可使用結合速率常數(ka)、解離速率常數(kd)和平衡解離常數(KD)表示結合蛋白(例如本申請所述的抗原結合蛋白)對抗原(例如人IgE)的結合親和力。確定結合和解離速率常數的方法為本領域熟知。例如，可以藉由Octet測定該KD值，也可以使用其他實驗途徑和儀器例如BIAcore(生物分子相互作用分析)測定。另外，電化學發光分析-溶液平衡滴定法(MSD-SET)可以測定該KD值。測量方法如Estep P.等人，MAbs,2013.5(2)：p.270-8所述。在本申請中，可以採用KinExA方法和軟體檢測KD值，測量方法如Jonathan K.Fleming等人，Methods Mol Biol.2018；1697：1-8所述。
在本申請中，術語“互補決定區”或術語“CDR”通常是指在抗體可變序列內的互補性決定區。在重鏈和輕鏈的每個可變區中存在3個CDR，該CDR對於每個可變區命名為CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，CDR組合可指在能夠結合抗原的單個可變區中出現的3個CDR的組。這些CDR的確切邊界已根據不同系統不同地限定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的系統，不僅提供了可應用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，還提供了限定3個CDR的精確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))發現Kabat CDR內的某些亞部分採取幾乎相同的肽主鏈構象，儘管在胺基酸序列水平上具有大的多樣性。這些亞部分命名為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分別指輕鏈和重鏈區域。這些區域可以被稱為Chothia CDR，該Chothia CDR具有與Kabat CDR重疊的邊界。與Kabat CDR重疊的限定CDR的其他邊界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。在其他的CDR邊界定義可能不嚴格地遵循上述系統之一，但仍將與Kabat CDR重疊，儘管按照特定殘基或殘基組或甚至整個CDR並不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現，它們可以縮短或加長。本文所述CDR，可使用KABAT進行定義，但不排除採用其他方法進行CDR區域的劃分。
在本申請中，術語“抗體”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物或其變體，涵蓋包括抗原結合位點的任何多肽，無論其是在體外還是體內產生的。該術語包括但不限於多株的、單株的、單特異性的、多特異性的、非特異性 的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的和移植的抗體。在本申請中，術語“抗體”也可以包括抗體片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原結合功能(例如，特異性結合人IgE)的其它抗體片段。本申請所述抗體可以包括來源於人、來源於鼠、來源於猴和/或來源於羊駝的抗體。在本申請中，該抗體可以包括其功能性變體、同工型、物種同源物、衍生物或類似物。例如，本申請的中的變體可以包括與抗體具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
在本申請中，術語“抗原結合片段”通常是指與抗原結合(即特異性結合)的完整抗體(即與它們所衍生的完整抗體)競爭的免疫球蛋白或抗體的多肽片段。該抗原結合片段可以包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體、雙體抗體、以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
在本申請中，術語“可變區”或“可變結構域”通常是指抗體輕鏈和/或重鏈的一部分，其通常在不同的抗體中有較大差異，且可能影響抗體與特定抗原的結合特異性。可變區可以包含序列變化較大的區域稱作互補決定區(CDR)，可變區也可以包含比較保守的區域通常稱作框架區(FR)。
在本申請中，術語“直接或間接相連”通常是指相對的“直接相連”或“間接相連”。“直接相連”通常是指直接連接。例如，該直接相連可以為相連的物質(例如胺基酸序列區段)之間沒有間隔成分(例如胺基酸殘基或其衍生物)而直接相連接的情況；例如胺基酸序列區段X與另一胺基酸序列區段Y藉由胺基酸序列區段X的C端胺基酸與胺基酸序列區段Y的N端胺基酸形成的醯胺鍵 直接連接。“間接相連”通常是指相連的物質(例如胺基酸序列區段)之間有間隔成分(例如胺基酸殘基或其衍生物)而間接相連接的情況例如，在本申請所述的抗原結合蛋白中，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端可以直接或間接相連。
在本申請中，術語“免疫綴合物”通常指與抗原結合蛋白或其片段相連接的其他組分。該免疫綴合物可以包括與抗原結合蛋白融合或偶聯的其他的多肽、治療劑、探針和/或其他抗體。
在本申請中，術語“分離的核酸分子”通常是指任何長度的分離形式的核苷酸，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物。
在本申請中，術語“細胞”通常是指可以或已經含有包括本申請所述的核酸分子的質粒或載體，或者能夠表達本申請所述的抗原結合蛋白的個體細胞，細胞系或細胞培養物。該細胞可以包括單個細胞的子代。由於天然的，意外的或故意的突變，子代細胞與原始親本細胞在形態上或在基因組上可能不一定完全相同，但能夠表達本申請所述的抗原結合蛋白即可。該細胞可以藉由使用本申請所述的載體體外轉染細胞而得到。該細胞可以是原核細胞(例如大腸桿菌)，也可以是真核細胞(例如酵母細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞)。
在本申請中，術語“醫藥組成物”通常是指關於適合施用於患者、例如人患者的組成物。例如，本申請所述的醫藥組成物，其可以包含本申請所述的抗原結合蛋白、本申請所述的免疫綴合物、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體和/或本申請所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。此外， 該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。組成物的可接受成分在所用劑量和濃度下對接受者無毒。本發明的醫藥組成物可以包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
在本申請中，術語“載體”通常指將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。例如，載體可包括：質粒、噬菌粒、柯斯質粒、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
在本申請中，術語“藥學上可接受的載劑”通常包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所採用的劑量和濃度對暴露於其的細胞或哺乳動物是無毒的。生理學可接受的載體可包括合適的物質。
[發明詳述]
抗原結合蛋白
一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，其可包含重鏈可變區的至少一個互補決定區(CDR)，該重鏈可變區(VH)包含如SEQ ID NO：73、74中任一 項所示的胺基酸序列；且其包含輕鏈可變區(VL)的至少一個互補決定區(CDR)，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區的一個CDR，該重鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區中的兩個CDR，該重鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區中的三個CDR，該重鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區的一個CDR，該重鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區中的兩個CDR，該重鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含重鏈可變區中的三個CDR，該重鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的重鏈可變區中的CDR可以稱為HCDRn，n表示CDR的編號，通常可以為1，2或3。
例如，本申請的重鏈可變區中的CDR可以包括本申請所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR3，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR2，該HCDR2可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR2，該HCDR2可包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR1，該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR3和HCDR2，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或者其變體，且該HCDR2可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR3和HCDR2，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或者其變體，且該HCDR2可包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR2和HCDR1，該HCDR2可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或者其變體，且該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR2和HCDR1，該HCDR2可包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列或者其變體，且該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或者其變體，該HCDR2可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或者其變體，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或者其變體， 該HCDR2可包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列或者其變體，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區的一個CDR，該輕鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區中的兩個CDR，該輕鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區中的三個CDR，該輕鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區的一個CDR，該輕鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區中的兩個CDR，該輕鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含輕鏈可變區中的三個CDR，該輕鏈可變區可以包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的輕鏈可變區中的CDR可以稱為LCDRn，n表示CDR的編號，通常可以為1、2或3等。
例如，本申請的輕鏈可變區中的CDR可以包括本申請所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR3，該LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR3，該LCDR3可包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR2，該LCDR2可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR2，該LCDR2可包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR1，該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈LCDR3和LCDR2，該LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列或者其變體，且該LCDR2可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白包含輕鏈LCDR3和LCDR2，該LCDR3可包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列或者其變體，且該LCDR2可包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR2和LCDR1，該LCDR2可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列或者其變體，且該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR2和LCDR1，該LCDR2可包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列或者其變體，且該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或者其變體，該LCDR2可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列或者其變體，該LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或者其變體，該LCDR2可包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列或者其變體，該LCDR3可包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列或者其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或其變體，該HCDR2可包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列或其變體，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或其變體，該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或其變體，該LCDR2可包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列或其變體和該LCDR3可包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1可包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或其變體，該HCDR2可包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列或其變體，該HCDR3可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列或其變體，該LCDR1可包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或其變體，該LCDR2可包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列或其變體和該LCDR3可包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
框架區(FR)
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區L-FR1、L-FR2、L-FR3、和/或L-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區L-FR1、L-FR2和L-FR3。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區L-FR1、L-FR2和L-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區L-FR2、L-FR3和L-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區L-FR1、L-FR3和L-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
例如，本申請的L-FR1的C末端可以與本申請的LCDR1的N末端直接或間接相連，例如，本申請的L-FR1的C末端可以與本申請的LCDR1的N末端直接相連，例如，本申請的L-FR1的C末端可以與本申請的LCDR1的N末端間接相連，例如，本申請的間接相連可以包括本申請的L-FR1的C末端胺基酸殘基與本申請的LCDR1的N末端胺基酸殘基之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的L-FR1可以包含SEQ ID NO：12、31或80中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的L-FR1可以包含SEQ ID NO：12、31、22、38中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的L-FR2可以位於本申請的LCDR1與本申請的LCDR2之間。
例如，本申請的L-FR2的N末端可以與本申請的LCDR1的C末端直接或間接相連，並且本申請的L-FR2的C末端可以與本申請的LCDR2的N末端直接或間接相連。
例如，間接相連可以包括相連的兩個部分(例如，本申請的L-FR2與本申請的LCDR1，或者本申請的L-FR2與本申請的LCDR2)之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的L-FR2可以包含SEQ ID NO：13、32、23中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的-FR3可以位於本申請的LCDR2與本申請的LCDR3之間。
例如，本申請的L-FR3的N末端可以與本申請的LCDR2的C末端直接或間接相連，並且本申請的L-FR3的C末端可以與本申請的LCDR3的N末端直接或間接相連。
例如，間接相連可以包括相連的兩個部分(例如，本申請的L-FR3與本申請的LCDR2，或者本申請的L-FR3與本申請的LCDR3)之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的L-FR3可以包含SEQ ID NO：14、33、82中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的L-FR3可以包含SEQ ID NO：14、33、24、39中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的L-FR4的N末端與本申請的LCDR3的C末端直接或間接相連。
例如，間接相連可以包括本申請的L-FR4的N末端胺基酸殘基與本申請的LCDR3的C末端胺基酸殘基之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的L-FR4可以包含SEQ ID NO：15、34中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的重鏈可變區可以包括框架區H-FR1、H-FR2、H-FR3、和/或H-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區H-FR1、H-FR2和H-FR3。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區H-FR1、H-FR2和H-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區H-FR2、H-FR3和H-FR4。
例如，本申請的輕鏈可變區可以包括框架區H-FR1、H-FR3和H-FR4。
例如，本申請的鏈可變區可以包括框架區H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
例如，本申請的H-FR1的C末端可以與本申請的HCDR1的N末端直接或間接相連。例如，本申請的H-FR1的C末端可以與本申請的HCDR1的N末端直接相連，例如，本申請的H-FR1的C末端可以與本申請的HCDR1 的N末端間接相連，例如，本申請的間接相連可以包括本申請的H-FR1的C末端胺基酸殘基與本申請的HCDR1的N末端胺基酸殘基之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的H-FR1可以包含SEQ ID NO：4、17中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的H-FR2可以位於本申請的HCDR1與本申請的HCDR2之間。
例如，本申請的H-FR2的N末端可以與本申請的HCDR1的C末端直接或間接相連，並且本申請的H-FR2的C末端可以與本申請的HCDR2的N末端直接或間接相連。
例如，本申請的間接相連可以包括相連的兩個部分(例如，本申請的H-FR2與本申請的HCDR1，或者本申請的H-FR2與本申請的HCDR2)之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的H-FR2可以包含SEQ ID NO：5、27、81中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的H-FR2可以包含SEQ ID NO：5、27、18、36中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的H-FR3可以位於本申請的HCDR2與本申請的HCDR3之間。
例如，本申請的H-FR3的N末端可以與本申請的HCDR2的C末端直接或間接相連，並且本申請的H-FR3的C末端可以與本申請的HCDR3的N末端直接或間接相連。
例如，間接相連可以包括相連的兩個部分(例如，本申請的H-FR3與本申請的HCDR2，或者本申請的H-FR3與本申請的HCDR3)之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的H-FR3可以包含SEQ ID NO：6、19中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的H-FR4的N末端可以與本申請的HCDR3的C末端直接或間接相連。
例如，間接相連可以包括本申請的L-FR4的N末端胺基酸殘基與本申請的LCDR3的C末端胺基酸殘基之間相隔1個、2個、3個、4個、5個或更多個胺基酸，這些胺基酸可以是天然存在的或經修飾的任意胺基酸。
例如，本申請的H-FR4可以包含SEQ ID NO：7、20中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：4-7、17-20、27或36中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
可變區，恆定區，重鏈和輕鏈
在本申請中，本申請的抗原結合蛋白可包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)。例如，本申請的重鏈可變區可包含SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列或其變體。例如，本申請的輕鏈可變區可包含SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：73-76中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
例如，本申請的重鏈可變區包含SEQ ID NO：73、74任一項所示的胺基酸序列或其變體。例如，本申請的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：75、76任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的重鏈可變區包含SEQ ID NO：8、21、28、37或41任一項所示的胺基酸序列或其變體。例如，本申請的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16、35、25、40任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的重鏈可變區包含SEQ ID NO：57、59、61、63、65中任一項所示的核苷酸序列或其變體。例如，本申請的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：58、60、62、64、66中任一項所示的核苷酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸和/或核苷酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：8、16、21、25、28、35、37、40、41或57-66中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包括抗體重鏈恆定區，且本申請的抗體重鏈恆定區可以源自人IgG重鏈恆定區。例如，本申請的抗原結合蛋白可以包括抗體重鏈恆定區，且本申請的抗體重鏈恆定區可以源自人IgG1重鏈恆定區。例如，本申請的抗體重鏈恆定區可以包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
例如，本申請的重鏈恆定區變體可以包括在人IgG1重鏈恆定區(胺基酸序列如SEQ ID NO：42)基礎上，包含下述胺基酸突變：M135Y、S137T和/或T139E(胺基酸序列編號以序列SEQ ID NO：42為基礎)。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包括抗體輕鏈恆定區，且本申請的抗體輕鏈恆定區可以包括人Igκ(Kappa)恆定區。例如，本申請的抗體輕鏈恆定區可以包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至 少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含抗體重鏈，且本申請的抗體重鏈可以包含SEQ ID NO：45、47或49中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含抗體重鏈，且本申請的抗體重鏈可以包含SEQ ID NO：67、69、或71中任一項所示的核苷酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸和/或核苷酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：45、47、49、67、69、71中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含抗體輕鏈，且本申請的抗體輕鏈可以包含SEQ ID NO：46或48中任一項所示的胺基酸序列或其變體。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含抗體輕鏈，且本申請的抗體輕鏈可以包含SEQ ID NO：68、70或72中任一項所示的核苷酸序列或其變體。
例如，在提及具體的胺基酸和/或核苷酸序列時(例如特定的序列)，所指代的序列還可以涵蓋其變體。例如，本申請的變體可以包含與SEQ ID NO：45-49、67-72中任一項所示的胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%、至少99%、 至少99.2%、至少99.4%、至少99.6%、至少99.8%或至少99.9%同一性的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白，其中該FR1、FR2、FR3和FR4可以包含選自下述任意一組的胺基酸序列：
1)該H-FR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該L-FR1包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
2)該H-FR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該L-FR1包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
3)該H-FR1包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列；該L-FR1包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
4)該H-FR1包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，該H-FR2包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列；該L-FR1包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
5)該H-FR1包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，該SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，該H-FR3包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，且該H-FR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列；該L-FR1包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該L-FR2包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，該L-FR3包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，且該L-FR4包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包含本申請的抗體重鏈和本申請的抗體輕鏈。
抗原結合蛋白的性質
本申請的抗原結合蛋白能夠以約2.4×10-9M或更小的KD值與IgE(例如人IgE)相結合。
可以藉由本領域常用的Octet方法、MSD-SET法和/或KinExA方法對該結合進行測定。例如，該KD值可以藉由MSD-SET測定，測量方法如Estep P.等人，MAbs,2013.5(2)：p.270-8所述，該KD值也可以藉由KinExA方法測定，測量方法如Jonathan K.Fleming等人，Methods Mol Biol.2018；1697：1-8所述。
例如，藉由MSD-SET測定，該抗原結合蛋白結合源自人的IgE抗原的KD值可以為
Figure 110140767-A0202-12-0032-126
2×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-127
1.5×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-128
1×10-9MM、
Figure 110140767-A0202-12-0032-129
8×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-131
7×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-135
6×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-136
5×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-137
4.5×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-138
4×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-139
3.5×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-140
3×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-141
2.5×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-143
2×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-144
1.8×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-145
1.5×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-147
1×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-148
9×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-150
8×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-151
7×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-152
6×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-153
5×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-155
4×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-157
3×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-158
2×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-159
1×10-11M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-161
9×10-12M。
例如，藉由KinExA法進行測定時，本申請的抗原結合蛋白結合該IgE的KD值可以為例如，
Figure 110140767-A0202-12-0032-163
3.5×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-164
3.4×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-165
3.3×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-167
3.2×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-170
3.1×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-171
3×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-173
2.9×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-174
2.8×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-175
2.7×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-176
2.6×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-177
2.5×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-179
2.4×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-181
2.3×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-190
2.2×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-183
2.1×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-184
2.0×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-185
1.9×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-186
1.8×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-187
1.7×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-188
1.6×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-191
1.5×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-192
1.4×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-193
1.3×10-12M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-194
1.2×10-12M或
Figure 110140767-A0202-12-0032-195
1.1×10-12M。
本申請的抗原結合蛋白能夠抑制IgE與其受體FcεRIa和/或FcεRII的結合。
例如，藉由ELISA方法檢測，本申請的抗原結合蛋白抑制IgE與其受體FcεRIa的結合的IC50值可以為
Figure 110140767-A0202-12-0032-196
2000ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-197
1800ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-198
1500ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-199
1300ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-200
1000ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-201
950ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-202
900ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-203
850ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-204
800ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-205
750ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-206
700ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-207
650ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-208
600ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-209
550ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-211
500ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-212
450ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-214
430ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0032-215
400ng/mL。
例如，藉由ELISA方法檢測，本申請的抗原結合蛋白抑制IgE與其受體FcεRIa的結合的IC50值可以為
Figure 110140767-A0202-12-0032-216
4.9×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-217
4.5×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-219
4.0×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-220
3.5×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-221
3.0×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-222
2.5×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-223
2.0×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-225
1.5×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0032-226
1.0×10-9M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-228
9.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-230
8.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-231
7.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-233
6.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-234
5.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-236
4.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-238
3.0×10-10M、
Figure 110140767-A0202-12-0033-239
2.5×10-10M。
例如，藉由ELISA方法檢測時，本申請的抗原結合蛋白抑制IgE與其受體FcεRIa的結合的IC50值可以為例如，
Figure 110140767-A0202-12-0033-243
35ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-244
34ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-245
33ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-247
32.5ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-251
32.5ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-254
32.4ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-255
32.3ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-256
32.2ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-257
32.1ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-258
32.0ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-259
31ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-260
30ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-263
29ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-265
28ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-266
27ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-267
26ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-268
25ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-269
24ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-270
23ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-271
22ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-274
21ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-275
20ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-276
19ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-277
18ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-279
17ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-280
16ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-281
15ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-282
14ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-283
13ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-284
12ng/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-285
11ng/mL或
Figure 110140767-A0202-12-0033-286
10ng/mL。
例如，藉由ELISA方法檢測時，本申請的抗原結合蛋白抑制IgE與其受體FcεRII的結合的IC50值可以為例如，
Figure 110140767-A0202-12-0033-288
4.0μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-290
3.9μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-293
3.8μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-294
3.7μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-295
3.6μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-296
3.5μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-297
3.4μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-298
3.3μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-299
3.2μg/mL、
Figure 110140767-A0202-12-0033-300
3.1μg/mL或
Figure 110140767-A0202-12-0033-301
3.0μg/mL。
例如，本申請的抗原結合蛋白可以包括抗體或其抗原結合片段。例如，本申請的抗體可以包括但不限於重組抗體、單株抗體、人抗體、鼠源抗體、人源化抗體、嵌合抗體、駱駝化單結構域抗體、雙特異性抗體、單鏈抗體、雙抗體、三抗體或四抗體。
例如，本申請的抗體可以為人源化抗體。例如，本申請的抗原結合蛋白可以為免疫特異性結合至相關抗原(例如人IgE抗原且包含基本上具有人類抗體的胺基酸序列的框架區(FR)及基本上具有非人類抗體的胺基酸序列的互補決定區(CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段)。此處的“基本上”在CDR的情況下可以是指CDR的胺基酸序列與非人類抗體CDR的胺基 酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少98.5%或至少99%同一。本申請的人源化抗體基本上可以包含所有至少一個且通常兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(即抗體)的CDR區且所有或基本上所有框架區為具有人類免疫球蛋白共有序列的框架區。例如，人源化抗體還可包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(例如，Fc)，通常為人類免疫球蛋白的恆定區。在一些實施例中，人源化抗體至少含有輕鏈或及重鏈的可變域。抗體還可包括重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。例如，人源化抗體可以僅含人源化輕鏈。例如，人源化抗體可以僅含人源化重鏈。例如，人源化抗體可以僅含輕鏈和/或人源化重鏈的人源化可變域。
例如，本申請的抗原結合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
多肽和免疫綴合物
另一方面，本申請提供了一種多肽，其可以包含本申請的抗原結合蛋白。本申請的多肽還可以包括其他肽段或蛋白片段，例如，其還可以包含促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的其他架或骨架部分。在某些情況下，本申請的多肽還可以包含與其他抗原結合的部分，和/或具有其他功能的蛋白片段。例如，本申請的多肽可以是融合蛋白，多特異性抗體，和/或其他重組蛋白。
另一方面，本申請提供了一種免疫綴合物，其可以包含本申請的抗原結合蛋白或本申請的多肽。例如，本申請的免疫綴合物可以包括與該抗原結合蛋白融合或偶聯的其他的多肽、治療劑(例如，細胞毒性分子)、探針和/或 其他抗體。例如，本申請所述免疫綴合物可以包括藥學上可接受的標記物、檢測劑和/或治療物。
核酸、載體、宿主細胞和製備方法
另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，該一種或多種核酸分子可編碼本申請的抗原結合蛋白或多肽。例如，該一種或多種核酸分子中的每一個核酸分子可以編碼完整的該分離的抗原結合蛋白或該多肽，也可以編碼其中的一部分。本申請所述的核酸分子可以為分離的。在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗原結合蛋白或該多肽的核酸。
另一方面，本申請提供了一種或多種載體，其包含本申請所述的一種或多種核酸分子。每種載體中可包含一種或多種該核酸分子。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體可以含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，該載體還可以含有複製起始位點。此外，該載體可以包括，例如質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。
另一方面，本申請提供了一種細胞，該細胞可包含本申請所述的一種或多種核酸分子和/或本申請所述的一種或多種載體。例如，每種或每個細胞可包含一個或一種本申請所述的核酸分子或載體。例如，每種或每個細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請所述的核酸分子或載體。例如，可將本申請所述的載體引入該細胞中，例如原核細胞(例如，細菌細胞)、CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞，或者其他真核細胞，如來 自植物的細胞、真菌或酵母細胞等。可藉由本領域已知的方法將本申請所述的載體引入該細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。
例如，載體可以包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。又例如，該載體可以含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，該載體還可以含有複製起始位點。此外，該載體還可以包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
例如，該細胞可以包括原核細胞、酵母菌細胞或高等真核細胞。適用於此目的的原核生物包括格蘭氏陰性菌和格蘭氏陽性菌，例如，腸細菌，例如大腸桿菌、腸桿菌、歐文氏菌(Erwinia)、克雷臼氏桿菌(Klebsiella)、變形菌(Proteus)、沙門氏菌(Salmonella)、黏質沙雷氏菌(Serratia)、和志賀氏桿菌(Shigella)以及桿菌、假單胞菌和鏈黴菌。
例如，該細胞可以包括哺乳動物宿主細胞系。例如，猴腎臟細胞，人類胚胎腎臟細胞系，幼小倉鼠腎臟細胞，中國倉鼠卵巢細胞小鼠塞爾托利(sertoli)細胞，人類子宮頸癌細胞(HELA)，犬腎臟細胞，人類肺細胞，人類肝臟細胞，小鼠乳腺癌細胞或NSO細胞。
例如，該細胞還可以包括用本發明所述的載體在體外轉染的細胞。例如，該細胞可以是細菌細胞(例如，大腸桿菌)、酵母細胞或其它真核細 胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、LNCAP細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞或骨髓瘤細胞。在某些實施方案中，該細胞可以為哺乳動物細胞。例如，該哺乳動物細胞可以為HEK293細胞。
醫藥組成物、應用
另一方面，本申請還提供了製備本申請的抗原結合蛋白的方法，該方法可以包括在使得本申請所述的抗原結合蛋白表達的條件下，培養本申請所述的細胞。
另一方面，本申請還提供了本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸分子、本申請的載體、本申請的細胞和/或本申請的醫藥組成物在製備藥物中的用途，本申請的藥物用於預防、緩解和/或治療IgE相關的疾病或病症。
另一方面，本申請還提供了預防、緩解或治療IgE相關的疾病或病症的方法，本申請方法可以包括向有需要的受試者施用本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸分子、本申請的載體、本申請的細胞和/或本申請的醫藥組成物。
另一方面，本申請還提供了本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸分子、本申請的載體、本申請的細胞和/或本申請的醫藥組成物，其可以用於預防、緩解或治療IgE相關的疾病或病症。
例如，IgE相關的疾病或病症可以包括Omalizumab(商品名Xolair)在世界範圍(例如，美國、中國、歐洲等)內獲得批准的可適用於治療的疾病或病症。例如，該疾病或病症可以包括過敏性疾病。
例如，該受試者可以包括人類和非人類動物。例如，該受試者可以包括但不限於貓、狗、馬、豬、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
另一方面，本申請還提供了醫藥組成物，其包含本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸分子、本申請的載體和/或本申請的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載劑。
例如，醫藥組成物可以另外地含有適合治療或預防IgE相關的疾病或病症的一種或多種其它治療劑。
例如，該藥學上可接受的載劑增強或穩定組成物，或促進組成物的製備。例如，該藥學上可接受的載劑可以包括生理上相容的溶劑、分散介質、包衣材料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。
例如，該施用可以藉由不同的方式進行，例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或真皮內施用。
例如，本申請的醫藥組成物可以藉由本領域已知的多種方法施用，取決於期望結果、施用途徑和/或施用模式改變。例如，施用可以為靜脈內、肌內、腹膜內或皮下、或鄰近靶位點施用。例如，配製該醫藥組成物使得可將它們玻璃體內施用入眼。例如，取決於施用途徑，可以將該抗原結合蛋白(例如，抗體、雙特異性和多特異性分子)用材料包覆以保護化合物免於酸或其它天然條件的作用，該作用可以使化合物失活。
例如，本申請的醫藥組成物可以為無菌的且為流體。例如，藉由使用包衣材料(諸如卵磷脂)、或在分散液的情況下藉由保持所要求的顆粒大小、以及藉由使用表面活性劑可以保持適當的流動性。
例如，在組成物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇，諸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化鈉。例如，可注射的該醫藥組成物的長期吸收可以藉由在該醫藥組成物中包括延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁或明膠)來實現。
例如，本申請的抗原結合蛋白、本申請的核酸分子、本申請的載體和/或本申請的細胞與視需要的藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑混合而製備以貯存。例如，本申請的醫藥組成物的形式可以為凍乾製劑或水溶液。
例如，本申請的藥學上可接受的載劑可以包括藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑。
例如，本申請的可接受的載體、賦形劑或穩定劑以採用的劑量和濃度對接受者是無毒的，並且包括緩衝劑例如磷酸鹽檸檬酸鹽、乙酸鹽和其他有機酸。
例如，包含本申請的抗原結合蛋白的醫藥組成物可以是水溶性形式。
例如，用於體內施用的醫藥組成物可以是無菌的。這可以藉由無菌過濾膜過濾或其他方法而容易地實現。例如，以無菌水溶液形式施用包含本申請的抗原結合蛋白的醫藥組成物可以多種方式進行，包括但不限於口服、皮下、靜脈內、鼻內、耳內、透皮、局部(例如，凝膠、油膏、洗劑、乳霜等)、腹膜內、肌肉內、肺內、胃腸外、直腸或眼內。在一些情況下，例如治療傷口、炎症等，本申請的抗原結合蛋白可以作為溶液或噴霧劑直接應用。
例如，本申請的醫藥組成物可以根據本領域熟知且常規實踐的方法製備。例如，本申請的醫藥組成物可以在GMP條件下製備。通常，在本申請的醫藥組成物中使用IgE結合蛋白的治療有效劑量或有效劑量。例如，藉由本領域技術人員已知的常規方法可將IgE結合蛋白配製成藥學上可接受的劑量形式。調節劑量方案以提供最佳的期望響應(例如，治療響應)。本申請的醫藥組成物中活性成分的實際劑量水平可發生改變以便獲得有效實現特定患者所期望的治 療響應、組成物和施用模式而對患者不具有毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決於多種藥物代謝動力學因素，例如，本申請使用的特定組成物或其酯、鹽或醯胺的活性，施用途徑，施用時間，正使用的特定化合物的排泄速率，治療的持續時間，與使用的特定組成物組合使用的其它藥物、化合物和/或物質，治療的受試者的年齡、性別、體重、狀態、一般健康和先前病史以及其它因素。
例如，皮下施用可以用於其中患者可以自己施用醫藥組成物的情況。許多蛋白治療劑不足夠有效以允許配製皮下施用最大可接受體積的治療有效劑量。本申請公開的抗原結合蛋白可適用於皮下施用，例如，可以增加的效價、提高的血漿半衰期和提高的溶解度。
本領域已知，蛋白治療劑可以藉由IV輸注或快速濃注來遞送。本申請公開的抗原結合蛋白也可以使用此類方法遞送。
另一方面本申請還提供了檢測樣品中IgE的方法，該方法包括施用本申請中所述的抗原結合蛋白。
例如，將獲取自受試者的樣品接觸本申請的抗原結合蛋白(例如，IgE結合蛋白)。例如，其中用可檢測標記或報告分子標記IgE結合蛋白或將抗IgE結合蛋白用作捕獲配體以選擇性地從患者樣品分離IgE。或者，未標記的抗IgE結合蛋白可以結合第二抗體用於檢測應用中，該第二抗體自身是具有可檢測標記的。可檢測標記或報告分子可以是放射性同位素，例如如3H、14C、32P、35S或125I；還可以是螢光或化學發光部分，例如異硫氰酸螢光素、若丹明；或酶，例如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或螢光素酶；可以用於檢測或測量樣品中的IgE的特定示例性分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)和螢光激活的細胞分選(FACS)。
可以用於本申請的IgE檢測中的樣品可以包括獲取自正常或病理狀況下的受試者的任何組織或流體樣品，其含有可檢測含量的IgE蛋白或其片段。例如，可以將測量獲自健康受試者(例如，未患IgE相關疾病的受試者)的特定樣品的IgE蛋白的水平，以最初建立IgE的基線或標準水平。隨後將這個IgE的基線水平相對於獲取自疑似患有IgE相關疾病或病症或與該病症相關症狀的個體的樣品中測量的IgE水平進行比較。IgE結合蛋白可以不含另外的標記，也可以含有N-末端或C-末端標記。例如，該標記是生物素。在結合分析中，標記(如果存在的話)的位置可以確定肽相對於其上結合肽的表面的方向。例如，如果表面包被了抗生物素蛋白，則含有N-末端生物素的肽將使得肽的C-末端部分遠離表面。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請發明的各個技術方案，而不用於限制本申請發明的範圍。
[實施例]
實施例1 本申請的抗原結合蛋白製備
1-1 抗人IgE鼠源單株抗體製備
(1)小鼠免疫
向四週齡的BALB/c小鼠皮下注射20μg重組表達的人IgE的Fc區域(CH2-4)蛋白(IgE-Fc，SEQ ID NO：42)(在弗氏完全佐劑中)。每三至四星期注射一次，一共注射五次。最後在腹膜內單次注射20μg重組人IgE-Fc蛋白。
(2)ELISA法測定小鼠血清與人IgE-Fc抗原的結合
以重組人IgE-Fc蛋白包被酶標板(Costar)，室溫過夜。棄去包被溶液，用溶解在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的2.5%的脫脂奶封閉各孔0.5小時，用含有0.05% 吐溫(Tween)-20的PBS洗孔。然後分別加入稀釋血清和作為陰性對照的非相關抗體(Irrevalent mAb)，室溫孵育1小時，用含有0.05%吐溫(Tween)-20的PBS洗孔，然後每孔加入50μl的HRP標記的羊抗鼠IgG多株抗體(Jackson Laboratory)作為檢測抗體。經血清測試後，鑑定出含有高水平抗重組人IgE-Fc蛋白抗體血清的小鼠。
(3)細胞融合、篩選和鼠源單株抗體製備
經血清測試鑑定出含有高水平抗人IgE-Fc抗體血清的小鼠後，取出該小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤Sp2/0細胞株相融合。混合5×108的Sp2/0細胞與5×108的脾細胞在50%聚乙二醇(PEG，分子量為1450)和5%二甲基亞楓(DMSO)溶液中融合。用Iscove培養基(含有10%胎牛血清，100單位/mL青黴素，100μg/mL鏈黴素，10mM次黃嘌呤，0.4μM胺基蝶呤和1.6mM胸苷)來調整脾臟細胞數至7.5 x 105/mL，以0.2ml加入96孔培養板的孔內。置於37℃，5% CO2的培養箱內。10天後，取出各孔內的培養基測試其中鼠源抗體對人IgE-Fc的結合能力，以此篩選出與人IgE-Fc結合的陽性孔。再將上述含有能與人IgE-Fc結合抗體的孔內融合細胞進行亞選殖，同樣以ELISA方法篩選得到表達高親和力鼠單株抗體的融合瘤細胞株。
製備純化的鼠單株抗體，以獲得待測試的抗體樣品。在補充10% FCS的RPMI1640培養基中培養產生特異性抗體的細胞純株。當細胞密度達到大約5×105個細胞/ml時，用無血清培養基替換該培養基。2至4天後，將培養過的培養基離心，以收集培養物上清液。使用蛋白G管柱用於純化抗體。用150mM的NaCl透析單株抗體沖提液。藉由0.2μm濾器將透析的溶液過濾除菌，以獲得待測試的抗體樣品。製備得到單株抗體SE3(11/5)、SE5(4/23)、SE2、SE5。
1-2 抗人IgE嵌合抗體製備
(1)鼠源抗體的重鏈可變區的選殖
為獲得鼠源抗體的重鏈和輕鏈可變區編碼DNA序列，用mRNA純化試劑盒(NEB)從小鼠融合瘤細胞分離出mRNA，以此製備cDNA(SMARTer RACE試劑盒，Clontech)。藉由聚合酶鏈式反應(PCR)從cDNA中選殖重鏈可變區DNA片段。PCR的5'-引子使用混合液：0.4μM的引子1(5'-ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，如SEQ ID NO：53所示)和2μM的引子2(5'-ctaatacgactcactatagggc-3'，如SEQ ID NO：54所示)。PCR的3'-引子為引子3(5'-catcccagggtcaccatggagtta-3'，如SEQ ID NO：55所示)。引子3與小鼠IgG1重鏈恆定區同源反義。將膠純化後得到的重鏈可變區DNA片段選殖入TOPO-TA載體(Invitrogen)並測序，得到編碼SE2小鼠融合瘤重鏈的可變區胺基酸序列(如SEQ ID NO：8所示)和核苷酸序列(如SEQ ID NO：57所示)，藉由Kabat定義方式確定其互補決定區的胺基酸序列HCDR1(如SEQ ID NO：1所示)、HCDR2(如SEQ ID NO：2所示)和HCDR3(如SEQ ID NO：3所示)，和編碼SE5小鼠融合瘤重鏈的可變區胺基酸序列(如SEQ ID NO：28所示)和核苷酸序列(如SEQ ID NO：61所示)，及其互補決定區的胺基酸序列HCDR1(如SEQ ID NO：1所示)、HCDR2(如SEQ ID NO：26所示)和HCDR3(如SEQ ID NO：3所示)。互補決定區的定義參見Kabat E.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242。
(2)鼠源抗體的輕鏈可變區的選殖
以與步驟(1)相似的方法，使用上述5'-引子混合液(引子1和引子2)和另一個與小鼠免疫球蛋白輕鏈恆定區同源反義的3'-引子(引子4，5’-gactgaggcacctccagatgttaa-3’，如SEQ ID NO：56所示)，從cDNA中選殖輕鏈可變區DNA片段。將這些得到的DNA片段選殖入TOPO-TA載體並測序，得到編碼SE2小鼠融合瘤輕鏈的可變區胺基酸序列(如SEQ ID NO：16所示)和核苷酸序列(如SEQ ID NO：58所示)，及其互補決定區的胺基酸序列LCDR1(如SEQ ID NO：9所示)、LCDR2(如SEQ ID NO：10所示)和LCDR3(如SEQ ID NO：11所示)，和編碼SE5小鼠融合瘤輕鏈的可變區胺基酸序列(如SEQ ID NO：35所示)和核苷酸序列(如SEQ ID NO：62所示)，及其互補決定區的胺基酸序列LCDR1(如SEQ ID NO：9所示)、LCDR2(如SEQ ID NO：29所示)和LCDR3(如SEQ ID NO：30所示)。
(3)嵌合型抗體製備
將步驟2)選殖得到的鼠源單株抗體的重鏈和輕鏈可變區序列分別使用無縫選殖的方法插入到含有信號肽(如SEQ ID NO：50所示)和人IgG1重鏈恆定區(如SEQ ID NO：42所示)，或者含有信號肽(如SEQ ID NO：50所示)和人Kappa輕鏈恆定區(如SEQ ID NO：43所示)的pCDNA3.1(購自淼靈生物)真核表達載體中，經DNA測序確認正確後，在DH5α菌株中擴增後，使用NucleoBond Xtra Midi Plus(MACHEREY-NAGEL)質粒中抽試劑盒製備質粒。將製備好的嵌合型單株抗體重鏈和輕鏈質粒使用PEI(PolyScience)共轉Expi293細胞(購自Thermo fisher)，瞬時表達單株抗體。使用蛋白A管柱純化瞬時表達的抗體，用PBS透析單株抗體沖提液。藉由0.2μm濾器將透析的溶液過濾除菌，以獲得待測試的抗體樣品。
1-3 抗人IgE人源化抗體製備
(1)抗人IgE鼠源單株抗體人源化
以同源建模的抗體可變區結構為基礎，確定可能影響抗原-抗體相互作用的關鍵胺基酸位點，並對關鍵胺基酸位點進行回復突變，使用CDR移植的方法獲得SE2和SE5抗體可變區的人源化胺基酸序列，人源化SE2重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：21所示，人源化SE2輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：25所示，人源化SE5重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：37所示，人源化SE5輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：40所示。對胺基酸序列進行逆翻譯後得到的DNA序列並進行合成，SE2重鏈可變區人源化核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，SE2輕鏈可變區人源化核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示，SE5重鏈可變區人源化核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示，SE5輕鏈可變區人源化核苷酸序列如SEQ ID NO：64所示，所得到的DNA用於重組抗體表達載體構建。
(2)抗人IgE人源化抗體製備
將步驟1)得到的人源化單株抗體的重鏈和輕鏈可變區分別使用無縫選殖的方法插入到含有信號肽(如SEQ ID NO：50所示)和人IgG1重鏈恆定區(如SEQ ID NO：42所示)，或者含有信號肽(如SEQ ID NO：50所示)和人Kappa輕鏈恆定區(如SEQ ID NO：43所示)的pCDNA3.1(購自淼靈生物)真核表達載體中，經DNA測序確認正確後，使用NucleoBond Xtra Midi Plus(MACHEREY-NAGEL)質粒中抽試劑盒製備質粒。將製備好的人源化單株抗體重鏈和輕鏈質粒使用PEI(PolyScience)共轉Expi293細胞(購自Thermo fisher)，瞬時表達單株抗體。使用蛋白A管柱純化瞬時表達的抗體，用PBS透析單株抗體沖提液。藉由0.2μm濾器將透析的溶液過濾除菌，以獲得待測試的抗體樣品。
(3)改造後的人源化抗體
對抗體可變區的序列分析發現，SE5重鏈CDR2區(如SEQ ID NO：26所示)的N53為潛在的N-糖基化位點，對人源化SE5進行了N53S/T57S突變改造，同時對SE5的Fc區域(SEQ ID NO：42)進行了M135Y、S137T和/或T139E(YTE)改造，以增強抗體分子在酸性條件下與新生兒受體FcRn的親和力，從而延長抗體分子在體內的半衰期，達到延長給藥週期的目的，改造後的人源化分子稱為SE5ss。
實施例2 本申請抗原結合蛋白(鼠源單株抗體)阻斷活性檢測
使用ELISA方法檢測純化的鼠源單株抗體阻斷人IgE-Fc與其受體FcεRIa結合的阻斷活性。具體方法為，將重組表達的人FcεRIa-Fc蛋白(如SEQ ID NO：51所示胺基酸序列)使用PBS稀釋到終濃度2.5μg/mL，100μL/孔包被酶標板(購自Corning，貨號：42592)，4℃溫過夜。第二天棄去包被液，用溶解在PBS中的2.5%的脫脂奶封閉1小時，用含有0.05%吐溫(Tween)20的PBS洗孔。加入預先混合10分鐘、含有1μg/mL的生物素標記的人IgE-Fc(如SEQ ID NO：52所示胺基酸序列)和梯度稀釋的鼠源或對照抗體的預混液，由實施例1製備所得的鼠源抗體或對照抗體奧馬珠(購自Novartis，貨號：Xolair)從5μg/mL做2倍梯度稀釋(即5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL直到0.002441μg/mL，)，室溫孵育1小時。棄去上清後用含有0.05%吐溫(Tween)20的PBS洗孔，使用HRP標記的鏈黴親和素(購自生工生物，貨號：D111054-0001)1：1000稀釋後檢測。檢測結果如圖1所示，純化得到的各鼠源單株抗體均能夠不同程度的阻斷人IgE-Fc與其受體FcεRIa結合的能力，SE2、SE5均較對照抗體奧馬珠單抗有著更強的阻斷活性。
實施例3 本申請抗原結合蛋白(嵌合抗體)阻斷活性檢測
為進一步驗證選殖得到並重組表達的嵌合單株抗體的活性，使用與實施例2相似的ELISA方法檢測純化的嵌合抗體阻斷人IgE-Fc與其受體FcεRIa結合的阻斷活性。具體方法為，將重組表達的人FcεRIa-Fc蛋白(如SEQ ID NO：51所示胺基酸序列)使用PBS稀釋到終濃度1μg/mL，100μL/孔包被酶標板(購自Corning，貨號：42592)，4℃溫過夜。第二天棄去包被液，用溶解在PBS的2.5%脫脂奶封閉1小時，用含有0.05%吐溫(Tween)20的PBS洗孔。加入預先混合10分鐘、含有100ng/mL的生物素標記的人IgE-Fc(如SEQ ID NO：52所示胺基酸序列)和梯度稀釋的嵌合抗體或鼠源抗體的預混液，嵌合抗體或鼠源抗體從2μg/mL開始做3倍梯度稀釋(即2μg/mL、666.67ng/mL、222.22ng/mL、74.07ng/mL、24.69ng/mL、8.23ng/mL、2.74ng/mL，最後為0ng/mL)，室溫孵育1小時。棄去上清後用含有0.05%吐溫(Tween)20的PBS洗孔，使用HRP標記的鏈黴親和素(購自生工生物，貨號：D111054-0001)1：1000稀釋後檢測。根據如下公式：抗體濃度X的抑制率(%)=(抗體濃度為0的OD450讀值-抗體濃度為X的OD450讀值)/抗體濃度為0的OD450讀值×100，計算不同抗體、不同濃度下的抑制率。檢測結果如圖2所示，由選殖得到鼠源單株可變區序列構建的嵌合重組單株抗體，與其融合瘤純化的鼠源母抗體有相近的阻斷活性。
實施例4 本申請的抗原結合蛋白(抗人IgE人源化抗體)阻斷活性檢測
1)使用與實施例2近似的ELISA方法檢測純化的鼠源抗體、嵌合抗體以及人源化抗體阻斷人IgE-Fc與其受體FcεRIa結合的阻斷活性。具體方法為，將重組表達的人FcεRIa-Fc蛋白(如SEQ ID NO：51所示胺基酸序列)使用PBS稀釋 到終濃度1μg/mL，100μL/孔包被酶標板(購自Corning，貨號：42592)，4℃溫過夜。第二天棄去包被液，用溶解在PBS的2.5%的脫脂奶封閉1小時，用含有0.05%吐溫(Tween)20的PBS洗孔。加入預先混合10分鐘、含有100ng/mL的生物素標記的人IgE-Fc(如SEQ ID NO：52所示胺基酸序列)和梯度稀釋的各個抗體的預混液，各抗體均從1μg/mL做3倍梯度稀釋(即1μg/mL、333.33ng/mL、111.11ng/mL、37.04ng/mL、12.35ng/mL、4.12ng/mL、1.37ng/mL，最後點為0ng/mL)，室溫孵育1小時。棄去上清後用含有0.05%吐溫(Tween)20的PBS洗孔，使用HRP標記的鏈黴親和素(購自生工生物，貨號：D111054-0001)檢測。檢測結果如圖3至圖5所示，重組表達的人源化單株SE2和SE5，分別與其相應的嵌合抗體及鼠源母抗體有相近的阻斷活性(圖3)。
2)按照本實施例步驟1)的方法檢測SE2人源化抗體、SE5人源化抗體和奧馬珠單抗阻斷人IgE-Fc與其受體FcεRIa結合的阻斷活性。在SE2人源化抗體和奧馬珠單抗的比較實驗中，抗體濃度從3μg/mL做3倍梯度稀釋(即3μg/mL、1μg/mL、333.33ng/mL、111.11ng/mL、37.04ng/mL、12.35ng/mL、4.12ng/mL、1.37ng/mL，最後為0ng/mL)；在SE5人源化抗體和奧馬珠單抗的比較實驗中，抗體濃度從10nM做3倍梯度稀釋(即10nM、3.33nM、1.11nM、370.37pM、123.46pM、41.15pM、13.72pM，最後為0pM)。SE5比較實驗中包括對照抗體(即圖5中對照，其為同型her2抗體pertuzumab，序列來源於IMGT抗體庫)。
根據如下公式：抗體濃度X的抑制率(%)=(抗體濃度為0的OD450讀值-抗體濃度為X的OD450讀值)/抗體濃度為0的OD450讀值×100，計算不同抗體、不同濃度下的抑制率。結果如圖4-5所示，SE2人源化抗體和SE5 人源化抗體較對照抗體奧馬珠單抗均有著更強的阻斷活性，其中SE2和奧馬珠單抗的阻斷IC50值分別約為416.7ng/mL和2110ng/mL，SE5和奧馬珠單抗的阻斷IC50值分別約為266.2pM和4996pM。
實施例5 本申請的抗原結合蛋白(抗人IgE人源化抗體)親和力檢測
使用超敏因子電化學發光分析-溶液平衡滴定法(MSD-SET)檢測人源化抗體和人IgE的平衡親和力，測量方法如Estep P.等人，MAbs,2013.5(2)：p.270-8所述。溶液平衡滴定(SET)在PBS+0.1%不含IgG的BSA緩衝液(PBSF)中進行，其中抗原人IgE(購自：abcam，貨號：ab65866)保持恆定在10-100pM，且與從0.1-100nM起始的人源化抗體3倍連續稀釋液一起孵育。具體地，針對SE2和SE5測定時，抗原人IgE保持恆定在13.33pM，人源化抗體SE2和SE5從166.67pM連續三倍稀釋至0.0085pM；針對奧馬珠單抗測定時，抗原人IgE保持恆定在133.3pM，奧馬珠單抗從66.67nM開始3倍連續稀釋至1.13pM。將稀釋於PBS中的20nM的抗體包被至標準結合MSD-ECL板(購自MSD，貨號：L15XA-3)上在4℃下過夜。用1%的Casein將MSD-ECL板封閉30分鐘，同時以700rpm振盪。然後將MSD-ECL板用洗滌緩衝液(PBS+0.05% Tween 20)洗滌3次。將抗原人IgE與人源化抗體2倍連續稀釋液孵育的樣品加入MSD-ECL板，700rpm振盪下孵育150s，之後洗滌一次。向MSD-ECL板加入含有250ng/mL磺基標簽標記的鏈黴親和素的PBSF，5分鐘之後，將MSD-ECL板用洗滌緩衝液洗滌(PBS+0.05% Tween 20)洗滌3次。加入1x閱讀緩衝液T(購自MSD，貨號：R92TC-1)在MSD Sector Imager儀器(型號：MESO QuickPlex SQ 120) 上讀數。在Prism-GraphPad6軟體中，將游離抗原百分比繪製為滴定的抗體的函數，並擬合至二次方程式以提取KD。測量結果見下表1。
Figure 110140767-A0202-12-0050-14
由表1中所示結果可知，人源化重組單株抗體SE2和SE5與人IgE結合的平衡親和力分別約為10.880pM和9.995pM，對照抗體奧馬珠單抗約為2489pM，親和力有顯著提高。
實施例6 本申請的抗原結合蛋白(改造後抗人IgE人源化抗體)親和力檢測
使用KinExA檢測人源化抗體和對照抗體(Omalizumab)與人IgE(來源於U266細胞(ATCC)，製備方法參見Mol Immunol.1986,23(2)：159-67)的平衡親和力。溶液平衡滴定(SET)在PBS+0.1%不含IgG的BSA緩衝液(PBSF)中進行，其中抗原人IgE-Biotin(生物素標記人IgE，製備方法參考Thermofisher EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit使用說明)保持恆定在20pM-5nM，且與從2nM-1μM抗體兩倍連續稀釋液一起孵育。具體地，針對人源化抗體SE5ss測定時，抗原人IgE-Biotin保持恆定在20pM，人源化抗體SE5ss從2nM開始連續兩倍稀釋至30.52fM，將混合樣品在室溫下孵育30小時；針對對照抗體Omalizumab測定時，抗原人IgE-Biotin保持恆定在5nM，Omalizumab從1μM開始連續兩倍稀釋至15.26pM，將混合樣品在室溫下孵育20小時。將抗原人 IgE-Biotin與抗體兩倍連續稀釋液孵育的樣品在KinExA儀器(型號：4000)中流過用抗體包被的珠子，樣品中未與抗體結合的游離抗原人IgE-Biotin就會與珠子上包被的抗體結合，繼續將連有螢光的二抗Alexa Fluor 647 Streptavidin流過珠子，儀器藉由檢測珠子上的螢光信號並藉由KinExA軟體擬合得到KD值。測量結果見圖6A及圖6B。實驗結果表明，根據實施例1製備的人源化重組單株抗體SE5ss和Omalizumab與人IgE結合的平衡親和力分別約為2.08pM和1.79nM，SE5ss親和力遠高於Omalizumab。
實施例7 本申請的抗原結合蛋白(改造後抗人IgE人源化抗體)阻斷活性檢測
(1)本申請的抗原結合蛋白阻斷人源IgE與其受體FcεRIa結合的阻斷活性
使用ELISA方法檢測SE5ss單株抗體阻斷人源IgE與其受體FcεRIa結合的阻斷活性。具體方法為，將重組表達的人FcεRIa-Fc蛋白用PBS稀釋到1μg/mL，100μL/孔包被酶標板(Corning，貨號：42592)，4℃孵育過夜。第二天棄去包被液，使用含2.5%脫脂牛奶的PBS 25℃封閉1小時，結束後用PBST(PBS+0.05% Tween 20)洗滌3次，之後加入預先混合1小時、含有100ng/mL的人源IgE和梯度稀釋的待檢抗體(SE5ss、Omalizumab和人源IgG)的預混液，25℃孵育1小時，待檢抗體終濃度從10ug/mL起，3倍連續稀釋10個點至0.17ng/mL，再加0ug/mL的點，結束後用PBST洗3次。使用1：5000稀釋的山羊抗人IgE抗體(Invitrogen，貨號：A18795)和1：2000稀釋的HRP標記的兔抗山羊IgG抗體(生工，貨號：D110117-0100)進行檢測。測得OD450值用四參數回歸模型分析，計算抗體的IC50。結果如圖7A所示，根據實施例1製備的SE5ss和Omalizumab 均能有效阻斷人源IgE與FcεRIα受體的結合，IC50分別是32.38ng/mL和1009ng/mL，SE5ss阻斷人源IgE與FcεRIα受體結合的能力遠遠好於Omalizumab。
(2)本申請的抗原結合蛋白阻斷人源IgE與其受體FcεRII(CD23)受體的阻斷活性
使用與步驟(1)相似的ELISA方法，檢測SE5ss阻斷人源IgE與其受體FcεR Ⅱ(CD23)的阻斷活性。具體方法為，將重組人FcεR Ⅱ(CD23，購於翊翹神州，貨號：10261-H07H)蛋白用PBS稀釋至1.5μg/mL，100μL/孔包被酶標板(Corning，貨號：42592)。第二天棄去包被液，使用1% casein室溫封閉2小時。將生物素標記的重組表達β乳球蛋白特異性人IgE(bIgEk，Structure 15,1413-1421,2007)和β-乳球蛋白(sigma，貨號：L3908)等體積(莫耳比大約1：10)混勻(濃度均為60μg/mL)，37℃孵育1小時後和梯度濃度的抗體再混合，37℃孵育1小時，待測抗體(SE5ss、Omalizumab和人源IgG)終濃度從300ug/mL起，3倍連續稀釋7個點到0.41μg/mL，再加0ug/mL的點，bIgEk-Biotin和β-乳球蛋白複合物的濃度恆定為30μg/mL，結束後用PBST洗3次。使用1：8000稀釋的Streptavidin-HRP抗體(購自生工，貨號：D110513-0100)進行檢測。測得OD450值用四參數回歸模型分析，計算各抗體的IC50。結果如圖7B所示，實驗結果表明根據實施例1製備的SE5ss和Omalizumab均能有效阻斷人源IgE與FcεR Ⅱ(CD23)受體的結合，IC50分別是3.756μg/mL和3.444μg/mL，二者阻斷人源IgE與FcεR Ⅱ蛋白結合的能力與相近。
(3)本申請的抗原結合蛋白對人源IgE介導的RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc細胞報告基因激活的抑制活性檢測
RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc細胞株構建：為檢測IgE介導的細胞激活及本申請的抗原結合蛋白阻斷IgE的細胞水平活性，在大鼠嗜鹼性細胞RBL-2H3細胞系(中科院細胞庫)基礎上，構建了表達人FcεRIα受體和NFAT驅動的螢光素酶(Luciferase)報告基因細胞株，命名為：RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc。構建過程參見：Analytical and Bioanalytical Chemistry volume 412,pages1901-1914(2020)；Allergy 2010；65：1266-1273；J Immunol July 1,1996,157(1)221-230。
取對數生長期的RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc細胞鋪於96孔平底板，每孔約5E4個細胞，50uL培養基。之後加入預先混合的人源IgE和梯度濃度的待檢抗體(SE5ss、Omalizumab和人源IgG)的預混液，37℃、5% CO2培養箱孵育20小時左右。人源IgE恆定終濃度為1000ng/mL，待檢抗體終濃度從45ug/mL起，3倍連續稀釋8個點到0.021ug/mL，再加0ug/mL的點。第二天板子用PBS清洗兩遍，每孔加入含10μg/mL抗人IgE抗體的(購自Invitrogen，貨號：A18795)完全培養基，放於培養箱孵育3小時左右。結束後每孔加入100μL One-Lite TM(諾唯贊)檢測試劑，等待約5分鐘後轉移到96孔白板中，使用酶標儀發光檢測模塊進行檢測，結果用四參數回歸模型擬合抑制曲線，計算抗體的IC50。結果如圖8所示，結果說明SE5ss和Omalizumab均可抑制人源IgE介導的效應細胞報告基因激活，IC50分別為0.2641μg/mL和0.6093μg/mL，SE5ss的抑制能力明顯強於Omalizumab。
(4)本申請的抗原結合蛋白抑制不同過敏原過敏的人血清誘發的RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc細胞激活的活性檢測
取對數生長期的RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc細胞鋪於96孔平底板，每孔約5E4個細胞，50uL培養基。將梯度濃度的待測抗體(SE5ss、Omalizumab和人 源IgG)和不同過敏源人血清依次加到細胞中，37℃、5% CO2培養箱孵育20小時左右。由於各血清中特異性過敏原的IgE含量不同，所以使用了不同濃度的血清及抗體。塵蟎過敏人血清(PlasmaLab，貨號：PL25740)使用濃度是1.5%，抗體終濃度從10000ng/mL起3倍連續稀釋9個點至5ng/mL；蝦過敏人血清(PlasmaLab，貨號：PL24819)使用濃度是3%，Omalizumab和人源IgG終濃度從1200.00ng/mL起3倍稀釋12個點到0.01ng/mL，SE5ss的濃度從133.33ng/mL起，3倍連續稀釋11個點至0.002ng/mL；胡桃過敏人血清(PlasmaLab，貨號：PL27530)使用濃度是1.5%，抗體終濃度從10000ng/mL起，3倍連續稀釋9個點至1.5ng/mL，三組均加上0ug/mL的點作為對照。第二天板子用PBS清洗兩遍，每孔加入100uL含10μg/mL對應過敏原(塵蟎過敏原，購於Greerlabs，貨號：XPB82D3A25；蝦過敏原，購於沃卡威，貨號：M110227；胡桃過敏原，購於沃卡威，貨號：M110343)的完全培養基，放於培養箱孵育3小時左右。結束後每孔加入100μL One-LiteTM檢測試劑，等待約5分鐘後轉移到96孔白板中，使用酶標儀發光檢測模塊進行檢測，結果用四參數回歸模型擬合抑制曲線，計算抗體的IC50。實驗結果表明，根據實施例1製備的SE5ss和Omalizumab都能抑制各過敏血清介導的RBL-2H3-FcεRIα-NFATLuc細胞報告激活，其中對塵蟎過敏血清抑制的IC50分別為19.38ng/mL和177.9ng/mL(圖9A)；對蝦過敏血清抑制的IC50分別為1.917ng/mL和229.8ng/mL(圖9B)；對胡桃過敏血清抑制的IC50分別為51.57ng/mL和264.2ng/mL(圖9C)，SE5ss的抑制能力均明顯優於Omalizumab。
實施例8 本申請的抗原結合蛋白(改造後抗人IgE人源化抗體)在動物體內活性檢測
(1)本申請的抗原結合蛋白在人源IgE重建小鼠模型中的藥效學評估
建立人源IgE重建模型評估SE5ss對小鼠體內游離IgE的抑制作用。試驗採用Balb/c小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，將44隻小鼠根據性別和體重隨機分為陰性對照組、溶媒對照組、SE5ss 0.5μg組、SE5ss 1μg組、SE5ss 2μg組和Omalizumab 2μg組，其中陰性對照組為4隻小鼠，其餘各組均為每組8隻。每隻小鼠靜脈注射2μg人源IgE(來源於U266培養純化，In house，批號5/20/29)，其中陰性對照組靜脈注射同等體積的PBST(HyClone，批號C520004-0001)；2小時後靜脈注射不同劑量的SE5ss和陽性藥Omalizumab(Novartis，批號SPX27)。分別於給藥前一天，給藥前1小時，給藥後1小時和給藥後4小時對所有小鼠進行下頜靜脈採血，使用MSD檢測小鼠血清樣本中游離IgE的含量，方法簡述如下：MSD板包被FcεRIα-Fc(In house，批號：069-109-11)，加入待測樣本，37度孵育1小時後PBST洗滌3次，加入生物素標記的鼠抗人IgE抗體(In house，Clone# AE10-10)，37度孵育1小時後PBST洗滌3次，採用MSD sulfo-tag labeled streptavidin進行檢測(MSD，批號：R32AD-1)。試驗採用SE5ss溶媒(In house，批號129-098-01)作為陰性對照。結果如圖10所示，根據實施例1製備的不同濃度的SE5ss和Omalizumab均能明顯的抑制小鼠體內游離IgE(P<0.05)，且抑制能力呈劑量依賴效應，0.5μg/隻SE5ss對游離IgE的抑制能力大於2μg/隻的Omalizumab(P<0.05)。
(2)本申請的抗原結合蛋白在外源重建速髮型過敏反應模型中藥效學評估
試驗使用human-FcεRIA轉基因小鼠(購自上海南方模式生物科技股份有限公司)建立外源重建速髮型過敏反應小鼠模型，腹腔注射不同劑量的SE5ss，藉 由小鼠體內溫度的變化，對SE5ss進行初步藥效學評估。51隻human-FcεRIA轉基因小鼠根據性別及基線體溫隨機分為陰性對照組、溶媒對照組、SE5ss 5μg/隻組、SE5ss 10μg/隻組、SE5ss 20μg/隻組和Omalizumab 20μg/隻組，其中陰性對照組為6隻，其餘各組為9隻小鼠。各組動物腹腔注射給予不同劑量的SE5ss和Omalizumab(Novartis，批號SPX27)。給藥1小時後腹腔注射給予各組動物人源IgE 20μg/隻，給藥24小時後腹腔注射給予抗-人IgE(ε-特定鏈)山羊抗20μg/隻(Sigma，批號I6284-1mg)，建立速髮型過敏反應模型。分別於給抗人源IgE抗體前和後20分鐘、40分鐘、60分鐘和90分鐘對小鼠的體溫進行測定。試驗採用SE5ss溶媒作為陰性對照。結果如圖11所示，給予抗人源IgE抗體後，溶媒對照組小鼠體溫開始下降，在40分鐘時達到體溫最低點，後續緩慢回升。SE5ss各劑量組均能抑制小鼠體溫下降，且呈劑量依賴效應。其中SE5ss 10μg/隻與Omalizumab 20μg/隻藥理學效應相當，SE5ss 20μg/隻組可以將小鼠體溫維持在正常範圍。
(3)本申請的抗原結合蛋白在食蟹猴IgE抑制模型中的藥效學評估
在食蟹猴體內靜脈注射不同劑量的SE5ss，對其抑制食蟹猴游離IgE的能力進行評價。將18隻食蟹猴(中科院上海藥物研究所)，根據性別和體重隨機分為3組，3/性別/組，單次皮下注射分別給予1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg SE5ss，並於給藥前、給藥後1小時、第14天、第28天、第42天和第56天的採集血清樣本並測定游離IgE的含量。結果如圖12所示，不同濃度的SE5ss均能明顯抑制食蟹猴體內游離IgE，且抑制能力呈劑量依賴效應25mg/kg組在給藥後1小 時，游離IgE下降至給藥前的2.4%，在第14和28天游離IgE均低於檢測下限，在第42和56天回升至基線的19.1%和34.8%。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方式的範圍內。
<110> 大陸商天辰生物醫藥(蘇州)有限公司(LONGBIO PHARMA(SUZHOU)CO.,LTD.)
<120> 分離的抗原結合蛋白及其用途
<130> 0125-PA-022TW
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss重鏈CDR1
<400> 1
Figure 110140767-A0202-12-0058-15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5ss重鏈CDR2
<400> 2
Figure 110140767-A0202-12-0058-16
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss重鏈CDR3
<400> 3
Figure 110140767-A0202-12-0058-17
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5重鏈FR1
<400> 4
Figure 110140767-A0202-12-0059-18
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2重鏈FR2
<400> 5
Figure 110140767-A0202-12-0059-19
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5重鏈FR3
<400> 6
Figure 110140767-A0202-12-0059-20
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5重鏈FR4
<400> 7
Figure 110140767-A0202-12-0060-21
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2重鏈重鏈可變區胺基酸序列
<400> 8
Figure 110140767-A0202-12-0060-22
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss輕鏈CDR1
<400> 9
Figure 110140767-A0202-12-0060-23
Figure 110140767-A0202-12-0061-24
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈CDR2
<400> 10
Figure 110140767-A0202-12-0061-25
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈CDR3
<400> 11
Figure 110140767-A0202-12-0061-26
<210> 12
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈FR1
<400> 12
Figure 110140767-A0202-12-0061-27
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈FR2
<400> 13
Figure 110140767-A0202-12-0062-28
<210> 14
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈FR3
<400> 14
Figure 110140767-A0202-12-0062-29
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE2人源化/SE5人源化/SE5ss人源化輕鏈FR4
<400> 15
Figure 110140767-A0202-12-0062-30
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈可變區胺基酸序列
<400> 16
Figure 110140767-A0202-12-0062-31
Figure 110140767-A0202-12-0063-32
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化/SE5人源化/SE5ss人源化重鏈FR1
<400> 17
Figure 110140767-A0202-12-0063-33
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化重鏈FR2
<400> 18
Figure 110140767-A0202-12-0063-34
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化/SE5人源化/SE5ss人源化重鏈FR3
<400> 19
Figure 110140767-A0202-12-0064-35
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化/SE5人源化/SE5ss人源化重鏈FR4
<400> 20
Figure 110140767-A0202-12-0064-36
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2重鏈可變區人源化胺基酸序列
<400> 21
Figure 110140767-A0202-12-0064-37
Figure 110140767-A0202-12-0065-38
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化輕鏈FR1
<400> 22
Figure 110140767-A0202-12-0065-39
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化/SE5人源化/SE5ss人源化輕鏈FR2
<400> 23
Figure 110140767-A0202-12-0065-40
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化輕鏈FR3
<400> 24
Figure 110140767-A0202-12-0065-41
Figure 110140767-A0202-12-0066-42
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈可變區人源化胺基酸序列
<400> 25
Figure 110140767-A0202-12-0066-43
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5重鏈CDR2
<400> 26
Figure 110140767-A0202-12-0066-44
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5重鏈FR2
<400> 27
Figure 110140767-A0202-12-0067-45
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5重鏈可變區胺基酸序列
<400> 28
Figure 110140767-A0202-12-0067-46
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5/SE5ss輕鏈CDR2
<400> 29
Figure 110140767-A0202-12-0068-47
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5/SE5ss輕鏈CDR3
<400> 30
Figure 110140767-A0202-12-0068-48
<210> 31
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈FR1
<400> 31
Figure 110140767-A0202-12-0068-49
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈FR2
<400> 32
Figure 110140767-A0202-12-0068-50
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈FR3
<400> 33
Figure 110140767-A0202-12-0069-51
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈FR4
<400> 34
Figure 110140767-A0202-12-0069-52
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈可變區胺基酸序列
<400> 35
Figure 110140767-A0202-12-0069-53
Figure 110140767-A0202-12-0070-54
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5人源化/SE5ss人源化重鏈FR2
<400> 36
Figure 110140767-A0202-12-0070-55
<210> 37
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5重鏈可變區人源化胺基酸序列
<400> 37
Figure 110140767-A0202-12-0070-56
Figure 110140767-A0202-12-0071-58
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5人源化/SE5ss人源化輕鏈FR1
<400> 38
Figure 110140767-A0202-12-0071-59
<210> 39
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5人源化/SE5ss人源化輕鏈FR3
<400> 39
Figure 110140767-A0202-12-0071-60
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5人源化/SE5ss人源化輕鏈可變區人源化胺基酸序列
<400> 40
Figure 110140767-A0202-12-0072-61
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5ss重鏈可變區人源化胺基酸序列
<400> 41
Figure 110140767-A0202-12-0072-62
Figure 110140767-A0202-12-0073-63
<210> 42
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化/SE5人源化/人IgG1重鏈恆定區胺基酸序列
<400> 42
Figure 110140767-A0202-12-0073-64
Figure 110140767-A0202-12-0074-65
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化/SE5人源化/SE5ss人源化/人Kappa輕鏈恆定區胺基酸序列
<400> 43
Figure 110140767-A0202-12-0075-66
<210> 44
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5ss人源化重鏈恆定區胺基酸序列
<400> 44
Figure 110140767-A0202-12-0075-67
Figure 110140767-A0202-12-0076-68
Figure 110140767-A0202-12-0077-69
<210> 45
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化重鏈全長序列
<400> 45
Figure 110140767-A0202-12-0077-70
Figure 110140767-A0202-12-0078-71
Figure 110140767-A0202-12-0079-72
<210> 46
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2人源化輕鏈全長序列
<400> 46
Figure 110140767-A0202-12-0079-73
Figure 110140767-A0202-12-0080-74
<210> 47
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5人源化重鏈全長序列
<400> 47
Figure 110140767-A0202-12-0080-75
Figure 110140767-A0202-12-0081-76
Figure 110140767-A0202-12-0082-77
<210> 48
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5人源化/SE5ss人源化輕鏈全長序列
<400> 48
Figure 110140767-A0202-12-0082-78
Figure 110140767-A0202-12-0083-79
<210> 49
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5ss人源化重鏈全長序列
<400> 49
Figure 110140767-A0202-12-0084-80
Figure 110140767-A0202-12-0085-81
<210> 50
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 載體中的信號肽胺基酸序列
<400> 50
Figure 110140767-A0202-12-0086-82
<210> 51
<211> 405
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc ε RIa-Fc蛋白胺基酸序列
<400> 51
Figure 110140767-A0202-12-0086-83
Figure 110140767-A0202-12-0087-84
Figure 110140767-A0202-12-0088-85
<210> 52
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人IgE的Fc區域(CH2-4)胺基酸序列
<400> 52
Figure 110140767-A0202-12-0088-86
Figure 110140767-A0202-12-0089-87
<210> 53
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重鏈/輕鏈可變區5’端引子1
<400> 53
Figure 110140767-A0202-12-0090-88
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重鏈/輕鏈可變區5’端引子2
<400> 54
Figure 110140767-A0202-12-0090-89
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重鏈可變區3’端引子
<400> 55
Figure 110140767-A0202-12-0090-90
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 輕鏈可變區3’端引子
<400> 56
Figure 110140767-A0202-12-0090-91
<210> 57
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2重鏈可變區核苷酸序列
<400> 57
Figure 110140767-A0202-12-0090-93
Figure 110140767-A0202-12-0091-94
<210> 58
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈可變區核苷酸序列
<400> 58
Figure 110140767-A0202-12-0091-95
<210> 59
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2重鏈可變區人源化核苷酸序列
<400> 59
Figure 110140767-A0202-12-0091-96
<210> 60
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2輕鏈可變區人源化核苷酸序列
<400> 60
Figure 110140767-A0202-12-0092-97
<210> 61
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5重鏈可變區核苷酸序列
<400> 61
Figure 110140767-A0202-12-0092-98
<210> 62
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈可變區核苷酸序列
<400> 62
Figure 110140767-A0202-12-0092-99
Figure 110140767-A0202-12-0093-100
<210> 63
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5重鏈可變區人源化核苷酸序列
<400> 63
Figure 110140767-A0202-12-0093-101
<210> 64
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5輕鏈可變區人源化核苷酸序列
<400> 64
Figure 110140767-A0202-12-0093-102
<210> 65
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5ss重鏈可變區人源化核苷酸序列
<400> 65
Figure 110140767-A0202-12-0094-103
<210> 66
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE5ss輕鏈可變區人源化核苷酸序列
<400> 66
Figure 110140767-A0202-12-0094-104
<210> 67
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化SE2重鏈全長核苷酸序列
<400> 67
Figure 110140767-A0202-12-0094-105
Figure 110140767-A0202-12-0095-106
<210> 68
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化SE2輕鏈全長核苷酸序列
<400> 68
Figure 110140767-A0202-12-0095-107
Figure 110140767-A0202-12-0096-108
<210> 69
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化SE5重鏈全長核苷酸序列
<400> 69
Figure 110140767-A0202-12-0096-109
Figure 110140767-A0202-12-0097-110
<210> 70
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化SE5輕鏈全長核苷酸序列
<400> 70
Figure 110140767-A0202-12-0097-111
<210> 71
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化SE5ss重鏈全長核苷酸序列
<400> 71
Figure 110140767-A0202-12-0098-112
<210> 72
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人源化SE5ss輕鏈全長核苷酸序列
<400> 72
Figure 110140767-A0202-12-0099-113
<210> 73
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5重鏈可變區胺基酸序列通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> Xaa=Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa=Ser或Thr
<400> 73
Figure 110140767-A0202-12-0099-114
Figure 110140767-A0202-12-0100-115
<210> 74
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss重鏈可變區人源化胺基酸序列通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> Xaa=Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa=Ser或Thr
<400> 74
Figure 110140767-A0202-12-0100-116
Figure 110140767-A0202-12-0101-117
<210> 75
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5輕鏈可變區胺基酸序列通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> Xaa=His或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa=Phe或Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa=Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(106)
<223> Xaa=Lys或Gln
<400> 75
Figure 110140767-A0202-12-0102-118
<210> 76
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss輕鏈可變區人源化胺基酸序列通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa=Phe或Trp
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa=Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa=Asn或Ser
<400> 76
Figure 110140767-A0202-12-0103-119
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5ss/SE5重鏈CDR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Ser或Thr
<400> 77
Figure 110140767-A0202-12-0104-120
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss輕鏈CDR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Phe或Trp
<400> 78
Figure 110140767-A0202-12-0104-121
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss輕鏈CDR3通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Asn或Ser
<400> 79
Figure 110140767-A0202-12-0104-122
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss輕鏈人源化-FR1通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Leu或Val
<400> 80
Figure 110140767-A0202-12-0105-123
<210> 81
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss重鏈人源化-FR2通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa=Leu或Met
<400> 81
Figure 110140767-A0202-12-0105-124
<210> 82
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SE2/SE5/SE5ss輕鏈人源化-FR3通式
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa=Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa=Phe或Tyr
<400> 82
Figure 110140767-A0202-12-0106-125

Claims (57)

  1. 一種抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區的至少一個CDR，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列；且其包含輕鏈可變區的至少一個CDR，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗原結合蛋白，其具有下述性質中的一種或多種：
    1)能夠以約2.4×10-9M或更小的KD值與IgE相結合；
    2)能夠抑制IgE與其受體FcεRIa和/或FcεRII的結合。
  3. 如請求項2所述的抗原結合蛋白，其中該IgE為人IgE。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈HCDR3，該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含重鏈HCDR2，該HCDR2包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項5所述的抗原結合蛋白，其中該HCDR2包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含重鏈HCDR1，該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈H-FR1，該H-FR1的C末端與該HCDR1的N末端直接或間接相連，且該H-FR1包含SEQ ID NO：4、17中任一項所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含重鏈H-FR2，該H-FR2位於該HCDR1與該HCDR2之間，且該H-FR2包含SEQ ID NO：81、5或27中任一項所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項11所述的抗原結合蛋白，其中該H-FR2包含SEQ ID NO：5、18、27或36中任一項所示的胺基酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含重鏈H-FR3，該H-FR3位於該HCDR2與該HCDR3之間，且該H-FR3包含SEQ ID NO：6、19中任一項所示的胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含重鏈H-FR4，該H-FR4的N末端與該HCDR3的C末端相連，且該H-FR4包含SEQ ID NO：7、20中任一項所示的胺基酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，該VH包含SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH，該VH包含SEQ ID NO：8、21、28、37或41中任一項所示的胺基酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈LCDR3，該LCDR3包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
  18. 如請求項17所述的抗原結合蛋白，其中該LCDR3包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含輕鏈LCDR2，該LCDR2包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。
  20. 如請求項19所述的抗原結合蛋白，其中該LCDR2包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含輕鏈LCDR1，該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
  23. 如請求項1至22中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈L-FR1，該L-FR1的C末端與該LCDR1的N末端直接或間接相連，且該L-FR1包含SEQ ID NO：31、12或80中任一項所示的胺基酸序列。
  25. 如請求項24所述的抗原結合蛋白，其中該L-FR1包含SEQ ID NO：12、22、31或38中任一項所示的胺基酸序列。
  26. 如請求項1至25中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含輕鏈L-FR2，該L-FR2位於該LCDR1與該LCDR2之間，且該L-FR2包含SEQ ID NO：13、23或32中任一項所示的胺基酸序列。
  27. 如請求項1至26中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含輕鏈L-FR3，該L-FR3位於該LCDR2與該LCDR3之間，且該L-FR3包含SEQ ID NO：33、14或82中任一項所示的胺基酸序列。
  28. 如請求項27所述的抗原結合蛋白，其中該L-FR3包含SEQ ID NO：14、24、33或39中任一項所示的胺基酸序列。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的抗原結合蛋白，其還包含輕鏈L-FR4，該L-FR4的N末端與該LCDR3的C末端相連，且該L-FR4包含SEQ ID NO：34、15中任一項所示的胺基酸序列。
  30. 如請求項1至29中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL，該VL包含SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈可變區VL，該VL包含SEQ ID NO：16、35、25、40中任一項所示的胺基酸序列。
  32. 如請求項1至31中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
  33. 如請求項1至32中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：2、26中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該LCDR1包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：10、29中任一項所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：11、30中任一項所示的胺基酸序列。
  34. 如請求項1至33中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH包含SEQ ID NO：73、74中任一項所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：75、76中任一項所示的胺基酸序列。
  35. 如請求項1至34中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，該VH包含SEQ ID NO：8、21、28、37或41中任一項所示的胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：16、35、25、40中任一項所示的胺基酸序列。
  36. 如請求項1至35中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括抗體或其抗原結合片段。
  37. 如請求項36所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv和/或dAb。
  38. 如請求項1至37中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括重鏈恆定區，且該重鏈恆定區源自人IgG。
  39. 如請求項1至38中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括重鏈恆定區，且該重鏈恆定區源自人IgG1。
  40. 如請求項1至39中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括重鏈恆定區，其中與SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列相比，該重鏈恆定區包含下述胺基酸突變：M135Y、S137T和/或T139E。
  41. 如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白，其重鏈恆定區包含SEQ ID NO：42、44中任一項所示的胺基酸序列。
  42. 如請求項1至41中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈，且該重鏈包含SEQ ID NO：45、47或49中任一項所示的胺基酸序列。
  43. 如請求項1至42中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括輕鏈恆定區，且該輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
  44. 如請求項1至43中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含輕鏈，且該輕鏈包含SEQ ID NO：46或48中任一項所示的胺基酸序列。
  45. 如請求項1至44中任一項所述的抗原結合蛋白，其包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含SEQ ID NO：45、47或49中任一項所示的胺基酸序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：46或48中任一項所示的胺基酸序列。
  46. 一種多肽，其包含如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白。
  47. 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白。
  48. 一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白。
  49. 一種載體，其包含如請求項48所述的核酸分子。
  50. 一種細胞，其包含和/或表達如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項46所述的多肽、如請求項47所述的免疫綴合物、如請求項48所述的核酸分子或如請求項49所述的載體。
  51. 一種製備如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項50所述的細胞。
  52. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項46所述的多肽、如請求項47所述的免疫綴合物、如請求項48所述的核酸分子、如請求項49所述的載體、如請求項50所述的細胞和/或視需要地藥學上可接受的載劑。
  53. 一種如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項46所述的多肽、如請求項47所述的免疫綴合物、如請求項48所述的核酸分子、如請求項49所述的載體、如請求項50所述的細胞和/或如請求項52所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於預防、緩解和/或治療IgE相關的疾病或病症。
  54. 一種預防、緩解或治療IgE相關的疾病或病症的方法，該方法包括向有需要的受試者施用如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白、如 請求項46所述的多肽、如請求項47所述的免疫綴合物和/或如請求項52所述的醫藥組成物。
  55. 如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項46所述的多肽、如請求項48所述的核酸分子、如請求項49所述的載體、如請求項50所述的細胞、如請求項47所述的免疫綴合物和/或如請求項52所述的醫藥組成物，其用於預防、緩解或治療IgE相關的疾病或病症。
  56. 一種用於檢測或測定IgE的方法，該方法包括使用如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白或如請求項46所述的多肽。
  57. 一種用於檢測或測定IgE的試劑盒，該試劑盒包括如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白或如請求項46所述的多肽。
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