CN106103479A

CN106103479A - 识别其它ccr3‑结合趋化因子的抗嗜酸粒细胞趋化因子‑2抗体

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Publication number: CN106103479A
Application number: CN201580011755.4A
Authority: CN
Inventors: 阿迪·莫尔
Original assignee: Link Cloth Ltd
Current assignee: Link Cloth Ltd
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2016-11-09
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: BR112016020366A2; PT3114139T; DK3114139T3; RU2705255C2; EP3114139A2; IL247219A0; WO2015132790A3; ES2926700T3; IL247219B; US10479830B2; EP3114139B1; EP4155317A1; CN106103479B; BR112016020366B1; JP2017508461A; US10246508B2; RU2016136639A; US20160368979A1; WO2015132790A2; RU2016136639A3

Abstract

本发明涉及针对趋化因子嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)2中的独特表位的分离的多特异性抗体，籍此所述抗体结合其它CCR3‑结合趋化因子。本发明还涉及这些抗体用于减弱各种细胞的迁移，以及用于治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患(allergic atopic disorder)的用途。

Description

识别其它CCR3-结合趋化因子的抗嗜酸粒细胞趋化因子-2 抗体

技术领域

本发明涉及抗嗜酸粒细胞趋化因子-2(CCL24)单克隆抗体在纤维化疾病、炎性疾病、自身免疫疾病或过敏性疾病的治疗中的用途，所述单克隆抗体对其它趋化因子具有多特异性结合特性。

背景技术

自身免疫性疾患是由机体对抗其自身细胞的过度活跃的免疫反应引起的(1)。几乎所有自身免疫性疾病都是慢性的，并且不能被永久治愈。全球超过3亿的患者遭受这些疾患的困扰。在所有自身免疫病患者中女性占约70％-75％。

嗜酸粒细胞趋化因子-2是特别地通过诱导嗜酸粒细胞(2-4)、嗜碱粒细胞(4)和Th2-型淋巴细胞(5)的趋化性而促进细胞运输并调节在CCR3基因复合物位点处的炎性活性的趋化因子。

迄今，嗜酸粒细胞趋化因子-2在过敏症的背景中是众所周知的。已经充分证明在过敏性反应期间嗜酸粒细胞趋化因子-2的水平显著升高(6-8)。近来，发明人发现嗜酸粒细胞趋化因子-2也参与自身免疫性疾病和炎性疾病(WO 2010/086854)。如Ablin等(9)中所描述的，在类风湿性关节炎的大鼠模型中对嗜酸粒细胞趋化因子-2的抑制示出了保护性效应。此外，如Mausner等所发表的，观察到嗜酸粒细胞趋化因子-2的封闭减弱了实验性自身免疫性脑脊髓炎(10)。

硬皮病或系统性硬化病(SSc)是慢性的罕见的多系统自身免疫性疾病，其特征在于免疫系统活化、内皮功能紊乱以及涉及纤维原细胞的活性纤维化过程(11)。硬皮病病灶发展中的最早期阶段是内皮细胞活化和血管损伤。这之后是炎性细胞，主要是单核细胞，然后是淋巴细胞的迁移。最终，纤维原细胞群被激活。活化的纤维原细胞继续产生细胞外基质，细胞外基质是硬皮病最终纤维化病理学的基础(11)。研究显示，人类真皮纤维原细胞组成性地表达嗜酸粒细胞趋化因子1、2和3的mRNA(13)。另外，在肺纤维化和在博来霉素诱导的硬化病小鼠模型中观察到嗜酸粒细胞趋化因子水平升高(14)。基因敲除嗜酸粒细胞趋化因子和CCR3的小鼠发展显著减弱的肺纤维化(14，15)。

促炎性CCR3结合趋化因子嗜酸粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3也属于CC趋化因子家族，并作为CCR3受体的配体。它们也参与免疫细胞的迁移，该事实解释了它们在炎症临床前模型中的功效(16，17)。

特发性肺纤维化(IPF)是局限在肺部的进行性纤维化疾病，发生在老年个体中，更通常地发生在男性中，并且其特征是悲观的预后，自确诊起的中位生存期为3到5年。表征IPF的临床特征包括呼吸短促、影像学明显的弥漫性肺浸润、以及活组织检查上不同程度的炎症、纤维化或二者皆有。IPF的原因仍然未知，然而奠定纤维原细胞和免疫细胞的募集和增殖以及其病理学分化的机制被认为是疾病进展的标志。另外，在IPF进展中涉及大量的调节因子，包括细胞因子、趋化因子、致纤维因子、促凝蛋白(coagulant protein)、氧化剂和凋亡调节剂(18，19)。另外，包括胶原的细胞外基质组分的堆积是该纤维化过程所必需的(20)。

该疾病的治理通常包括支持性治疗，例如，补充氧气、肺康复的组合，对肺移植评价的考虑以及识别和治疗可能的合并症(21)。对于患有IPF的个体，吡非尼酮(Esbriet)和尼达尼布是目前可得的仅有的FDA/EMA批准的治疗(22-24)。在纤维化的各种体外系统和动物模型中吡非尼酮具有抗纤维化和抗炎特性。

附图简述

为了理解本发明并观察其如何在实践中执行，将参考附图，仅通过非限制性实例的方式来描述实施方案，其中：

图1A-1C是示出了通过Elisa测量的系统性硬化病患者中的嗜酸粒细胞趋化因子2(图1A)，Rantes(图1B)和嗜酸粒细胞趋化因子1(图1C)的全身循环水平的图。结果用皮克每毫升表示。

图2A-2B是示出了在用博来霉素诱导的硬皮病小鼠的预防模型中，不同参数的CM101治疗的效果。图2A是示出了用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(10、20或50μg的CM101)、IgG和PBS治疗对皮肤厚度(±标准误)的影响的图。图2B是示出了用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(10、20或50μg的CM101)、IgG和PBS处理对胶原浓度(±标准误)的影响的图，*表示p≤0.05。(媒介物-无治疗(PBS)；BLM-博来霉素)

图3A-3B是示出了用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(10μg或50μg的CM101)治疗对博来霉素诱导的硬皮病模型小鼠的支气管肺泡液中的淋巴细胞(图3A)和嗜酸粒细胞(图3B)(±标准误)的影响的图(预防模式)。*表示p≤0.05。(媒介物-无治疗(PBS)；BLM-博来霉素)

图4是示出了在治疗方案中用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(CM101，50μg)和PBS(媒介物)处理对小鼠的皮肤胶原浓度(±标准误)的影响的图，*表示p≤0.05。(媒介物-无治疗(PBS)；BLM-博来霉素)

图5A-5B是示出了在治疗模式中用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(CM101，50μg)和PBS(媒介物)治疗对小鼠的支气管肺泡液内的单核细胞(图5A)和白细胞(WBC)(图5B)浸润(±标准误)的影响的图，*表示p≤0.05。(媒介物-无治疗(PBS)；BLM-博来霉素)。图5C-5F是代表性FACS结果(在流式细胞术中30秒内的细胞计数)；5C–PBS；5D–BLM 8天；5E–BLM 21天；5F–BLM+CM101。

图6A-6D是示出了小鼠皮肤的代表性外观的照片(苏木精伊红(H&E)染色)。图6A–PBS；图6B–BLM基线；图6C–BLM终点；图6D-用CM101治疗的小鼠(在确定疾病后开始用CM 101治疗)。图6E-6H是示出了小鼠皮肤的代表性外观的照片(Masson’s三色染色)。图6E–PBS；图6F–BLM基线；图6G–BLM终点；图6H-用CM101治疗的小鼠(在实验性SSc被确立后开始用CM101治疗)。

图7A-7B是示出了用hCM101染色的IPF患者的肺部病灶的照片。

图8是示出了在IPF的预防模式中，用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(10、100μg的CM101)、IgG和PBS(媒介物)治疗对小鼠的胶原浓度(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。***pv≤0.01。(BLM-博来霉素)。

图9是示出了在IPF模型的预防模式中，用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(10、100μg的CM101)、IgG和PBS(媒介物)治疗对小鼠的支气管肺泡液内的单核细胞(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。(BLM-博来霉素)。

图10是示出了在IPF预防模式中，CM101(10、100μg)对BAL液的嗜酸粒细胞趋化因子2水平的影响的图(±标准误)。*pv≤0.05。(BLM-博来霉素，媒介物-PBS)。

图11是示出了在IPF的治疗模式中，用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(50μg的CM101)、IgG和PBS(媒介物)治疗对小鼠的肺胶原浓度(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。**pv≤0.01。(BLM-博来霉素)。

图12A-12B是示出了在IPF模型的治疗模式中，用抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2单克隆抗体(50μg的CM101)、IgG和PBS(空载体)治疗对小鼠的支气管肺泡液内的单核细胞(图12A)和多形核细胞(图12B)(±标准误)影响的图。*pv≤0.05。(BLM-博来霉素)。

图13A-13H是来自用CM101或PBS治疗的小鼠的用苏木精伊红(H&E)(分别为图13D和图13A)或用Masson’s三色染色法染色(分别为图13H和图13E)的肺部病灶的代表性外观的照片。来自用博来霉素(BLM)处理指定天数并用H&E染色的小鼠的肺部病灶呈现在图13B和图13C中。来自用博来霉素(BLM)处理指定天数并用Masson’s三色法染色的小鼠的肺部病灶呈现在图13F和图13G中。

图14是呈现了CM101(100μg)相比于吡非尼酮(100mg/kg/天)对IPF小鼠的肺胶原浓度(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。(BLM-博来霉素)。

图15A-15C是示出了CM101(100μg)相比于吡非尼酮(100mg/kg/天)对IPF模型小鼠的支气管肺泡液内的单核细胞(图15A)、多形核细胞(图15B)和白细胞(图15C)(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。**pv≤0.01。(BLM-博来霉素)。

图16是示出了抗嗜酸粒细胞趋化因子-2mAb(hCM101)与嗜酸粒细胞趋化因子-2结合的图。这些结果被呈现为在405nm下的光密度(OD)读数(±标准误)。pv≤0.05。(BSA–牛血清白蛋白)。

图17是示出了抗嗜酸粒细胞趋化因子-2mAb(hCM101)与嗜酸粒细胞趋化因子-1结合的图。这些结果被呈现为在405nm下的光密度(OD)读数(±标准误)。pv≤0.05。(BSA–牛血清白蛋白)。

图18是示出了抗嗜酸粒细胞趋化因子-2mAb(hCM101)与RANTES结合的图。这些结果被呈现为在405nm下的光密度(OD)读数(±标准误)。pv≤0.05。(BSA–牛血清白蛋白)。

图19是示出了抗嗜酸粒细胞趋化因子-2mAb(hCM101)与MCP-3结合的图。这些结果被呈现为在405nm下的光密度(OD)读数(±标准误)。pv≤0.05。(BSA–牛血清白蛋白)。

图20A是示出了hCM101在嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子2、Rantes和MCP-3(这些蛋白质的结构是超叠压(super imposed)的)的N环中的结合位点的图形表示；图20B示出了所有四个蛋白质中假定的结合表位的氨基酸序列比对。

图21A-21H是示出蛋白质表面和带的简图，图示表示了展示hCM101分别与嗜酸粒细胞趋化因子2(图21A和图21E)、嗜酸粒细胞趋化因子1(图21B和图21F)、RANTES(图21C和图21G)和MCP3(图21D和图21H)的相似的结合位点。蛋白质表面按照电荷被圈出；粗线表示带正电区域。转角部位由圆圈表示，并且N环部位由椭圆表示。

图22A-22B是由hCM101(5、10和50μg)引起的系统性硬化病血清的嗜酸粒细胞趋化因子2水平拉下(pull-down)的代表性凝胶(图22A)和密度测定(图22B)。O.D.–光密度。

图23示出了通过hCM101检测的嗜酸粒细胞趋化因子1、RANTES和MCP-3(2、1、0.5μg)的代表性十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳分析。

图24是示出了hCM101(100、50和10nM)、IgG(50nM)或PBS("0")对嗜酸粒细胞系向嗜酸粒细胞趋化因子1和嗜酸粒细胞趋化因子2迁移(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。**pv≤0.01。

图25是示出了hCM101(100、50和10nM)、IgG(50nM)或PBS("0")对单核细胞系向MCP-3和RANTES迁移(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。

图26A是示出了hCM101(100和10nM)、IgG(50nM)或PBS("0")对CD14+细胞(分离自系统性硬化病患者)向MCP-3和RANTES迁移(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。

图26B是示出了hCM101(100和10nM)、IgG(50nM)或PBS("0")对CD14-细胞(分离自系统性硬化病患者)向嗜酸粒细胞趋化因子1、2和RANTES迁移(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05，**pv≤0.01。

图27A是示出了hCM101(100nM)或PBS(EOX-2)对纤维原细胞系向嗜酸粒细胞趋化因子2迁移(±标准误)的影响的图。**pv≤0.01。图27B-27D是图27A所示的纤维原细胞的对照(图27B)、PBS处理(图27C)和hCM101处理(图27D)的代表性图。

图28A是示出了hCM101(100nM)或PBS(EOX-1)对纤维原细胞向嗜酸粒细胞趋化因子1迁移(±标准误)的影响的图。*pv≤0.05。图28B-28D是示出了图28A所示的纤维原细胞的的对照(图27B)、PBS处理(图27C)和hCM101处理(图27D)的代表性图。

图29A-29C是示出了hCM101对α-SMA的细胞内表达的影响的代表性FACS图，α-SMA作为成肌纤维细胞转变的指示。*pv≤0.05。图29A示出了从硬皮病患者得到的血清中的SMA阳性细胞为44％，图29B示出了从用hCM101(10μg/ml)治疗的硬皮病患者得到的血清中的SMA阳性细胞为22％，并且图29C示出了从用hCM101(5μg/ml)治疗的硬皮病患者得到的血清中的SMA阳性细胞为27％。

图30A-30B是展示在嗜酸粒细胞中，在CM101(100、50、10、5或0nM)影响下的时间分辩(time-resolved)的钙活化指数的图(图30A)，以及嗜酸粒细胞趋化因子2诱导钙信号的变化作为CM101浓度的函数(图30B)。pv≤0.05。

图31是展示在用hCM101孵育后T细胞增殖的图。结果展示为刺激指数。

图32是在Episcreen中示出了临床免疫原性(抗蛋白质治疗性抗体反应)和T细胞增殖之间的关系的图。

概述

本发明通过其一个方面提供了一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，其与至少两种CCR3-结合趋化因子结合而在纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患的治疗中使用。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体为单克隆抗体。在其它实施方案中，根据本发明所述的单克隆抗体为嵌合抗体、人抗体、人源化的抗体或完全人源化的抗体。

在另外的实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的多特异性抗体是，其中所述分离的多特异性抗体的抗原结合片段选自由Fv、单链Fv(scFv)、能够结合抗原的重链可变区、能够结合抗原的轻链可变区、Fab、F(ab)₂′以及它们的任意组合组成的组。

在一些实施方案中，如本文所限定的纤维化疾病选自由硬皮病、特发性肺纤维化(IPF)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾小球硬化症、肝硬化和代谢综合征组成的组。

在其它实施方案中，如本文所限定的自身免疫性炎性疾患选自由系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、牛皮癣、结肠炎、葡萄膜炎、多发性硬化症和I型糖尿病组成的组。

在另外的实施方案中，根据本发明的单核细胞相关疾患为动脉粥样硬化。

又在另外的实施方案中，如本文所限定的过敏性特异反应性疾患选自由哮喘、特应性皮炎、荨麻疹和超敏反应组成的组。

在一些实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的多特异性抗体是，其中所述至少两种CCR3-结合趋化因子选自由嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Rantes和MCP-3组成的组。

在其它实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的多特异性抗体是，其中所述抗体结合嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Rantes和MCP-3。

在另外的实施方案中，如本文所限定的用于使用的分离的多特异性抗体是，其中所述抗体减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性。

在一些实施方案中，如本文所限定的抗体为包含重链可变区和轻链可变区的完全人源化的抗体，该重链可变区包含：

a)互补决定区VH CDR1，包含由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列或其变体；

b)互补决定区VH CDR2，包含由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列或其变体；和

c)互补决定区VH CDR3，包含由SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或其变体；并且

该轻链可变区包含：

d)互补决定区VK CDR1，包含由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列或其变体；

e)互补决定区VK CDR2，包含由SEQ ID NO.9表示的氨基酸序列或其变体；和

f)互补决定区VK CDR3，包含由SEQ ID NO.10表示的氨基酸序列或其变体。

在其它实施方案中，根据本发明的抗体是完全人源化的抗体，其包含由SEQ IDNO:3或其变体表示的重链可变区以及由SEQ ID NO:4或其变体表示的轻链可变区。

本发明在其另一个方面提供了一种分离的抗体，其与CCR3-结合趋化因子的N环区的构象表位结合，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。

在一些实施方案中，如本文所限定的构象表位在所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间包含至少3个带正电氨基酸残基。

在其它实施方案中，如本文所限定的带正电氨基酸残基选自由Arg、Lys和His构成的组。

在另外的实施方案中，如本文所限定的构象表位包含选自以下的氨基酸序列：由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。

本发明通过其另一个方面提供了一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，其与至少两种CCR3-结合趋化因子结合，其中所述抗体为完全人源化的抗体并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

本发明还提供了编码如本文所限定的抗体的核酸分子。

本发明通过其另一个方面提供了一种编码与至少两种CCR3-结合趋化因子结合的人源化的抗体的核酸分子，其中所述核酸分子包含由SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2表示的序列。

本发明还提供了一种包含根据本发明的核酸分子的表达载体。

本发明通过另一个方面提供了一种包含根据本发明的核酸分子的宿主细胞。

本发明还提供了一种包含如本文所限定的抗体和药学可接受的载体的药物组合物。

在一些实施方案中，根据本发明所述的药物组合物用于治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性疾患。

本发明还提供了一种治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性疾患的方法，包括向需要其的患者施用治疗可接受量的如本文所限定的抗体或药物组合物。

本发明又通过其另一个方面提供了在纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患中减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性的方法，包括向患有一种所述疾病的患者施用治疗可接受量的如本文所限定的抗体或药物组合物。

本发明还提供了一种筛选和鉴定能够减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性的方法，所述方法包括：

a.获得针对CCR3-结合趋化因子的抗体；以及

b.评价所述抗体与CCR3-结合趋化因子的N环区的构象表位的结合，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基；

c.选择与所述构象表位结合的抗体；

其中与所述构象表位特异性结合的抗体能够有效地减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性。

在一些实施方案中，筛选和鉴定能够减弱表达CCR3、CCR1、CCR2或CCR5中的至少一个的迁移特性的抗体的方法是，其中所述构象表位包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种包含构象表位的分离的CCR3-结合趋化因子的N环区，用于产生针对所述CCR3-结合趋化因子的抗体，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述分离的N环区包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明基于这样的令人惊讶的发现：针对嗜酸粒细胞趋化因子2(CCL24)多肽的构象表位的抗体结合并抑制嗜酸粒细胞趋化因子2以及另外的趋化因子，促炎性CCR3结合趋化因子：嗜酸粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3的活性。因此本发明提供了一种独特的完全人源化的单克隆抗体(本文称为hCM101)，其能够通过中和引起免疫细胞趋化性的至少一种趋化因子来阻止免疫细胞的迁移。抗体hCM101抑制这些CCR3-结合趋化因子(其中一些结合另外的受体)与其相应受体的结合，并且在功能上减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞(嗜酸粒细胞和单核细胞系以及人类纤维原细胞)的迁移特性。

不希望受到理论的束缚，为多特异性的抗体的这些独特的异常的特性，即靶向若干趋化因子，可以解释其功效及其克服趋化因子功能的冗余性的潜在能力。因此，该抗体在自身免疫性疾病的治疗中是有益的，所述自身免疫性疾病与慢性炎症相关并且其特征在于免疫细胞的迁移和浸润，包括过敏性疾病和纤维化疾病。

因此，本发明提供了一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，其与至少两种CCR3-结合趋化因子结合而在纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患的治疗使用。

如本文所用，术语“多-特异性(或多特异性)抗体”是指能够识别多个抗原的多反应性抗体，特别地本发明包含能够识别若干不同的促炎性CCR3-结合趋化因子的多特异性抗体。本发明的抗体是针对嗜酸粒细胞趋化因子2而产生的，并被发现随后结合和有效地减弱其它趋化因子的活性(例如嗜酸粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3)。在一些实施方案中，本发明的多特异性抗体以相似的亲和力与多种趋化因子结合。在其它实施方案中，所述抗体对各种趋化因子具有不同的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，所述抗体以高于其它所测试的趋化因子的亲和力结合嗜酸粒细胞趋化因子2。显然，本发明的多特异性抗体识别这些促炎性CCR3-结合趋化因子中的交叉反应性表位。

CCR3(3型C-C趋化因子受体)是人体内由CCR3基因编码的蛋白质。近来CCR3已被指定为CD193(分化簇193)。由该基因编码的蛋白质是C-C型趋化因子的受体。其为跨膜的G蛋白偶联受体，由嗜酸粒细胞以及大量的细胞类型表达，包括巨噬细胞和内皮细胞。该受体结合并响应各种各样的趋化因子，包括嗜酸粒细胞趋化因子(也称为嗜酸粒细胞趋化因子1或CCL11)、嗜酸粒细胞趋化因子-2(CCL24)、嗜酸粒细胞趋化因子-3(CCL26)、MCP-3(CCL7)、MCP-4(CCL13)和RANTES(CCL5)。

如本文所限定的术语“CCR3-结合趋化因子”是指结合CCR3蛋白的任意趋化因子并且包括，例如不限于嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、嗜酸粒细胞趋化因子-3、Rantes、MCP-3和MCP-4。应当强调的是，一些CCR3-结合趋化因子也与其他趋化因子受体例如，CCR1、CCR2或CCR5结合。

因此在一些实施方案中，本发明所述的用于使用的分离的多特异性抗体是，其中所述至少两种CCR3-结合趋化因子选自由嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Rantes和MCP-3组成的组。

术语“嗜酸粒细胞趋化因子2”(嗜酸粒细胞趋化蛋白2)、“CCL24”(趋化因子(C-C基序)配体24)或“MPIF-2”(骨髓祖细胞抑制因子2)互换使用并指位于人类染色体7上的由人CCL24基因编码的属于CC趋化因子家族的趋化因子。CCL24与趋化因子受体CCR3相互作用。CCL24的活性包括诱导嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞的趋化性，以及诱导内皮和平滑肌细胞的血管生成和迁移反应。嗜酸粒细胞趋化因子2的氨基酸序列(不含N端信号肽)由SEQ ID NO:11表示。

如上所述，本发明所包括的其它CCR3-结合趋化因子是嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-3、Rantes、MCP-3和MCP-4，仅举几例。

本文所限定的术语“嗜酸粒细胞趋化因子1”(也称为C-C基序趋化因子11和嗜酸粒细胞趋化蛋白)是指由人CCL11基因编码的蛋白。嗜酸粒细胞趋化因子1通过诱导嗜酸粒细胞的趋化性来募集嗜酸粒细胞且因而被牵涉于过敏反应中。嗜酸粒细胞趋化因子1的作用是通过其与称为趋化因子受体(包括CCR2、CCR3和CCR5)的G蛋白连接的受体的结合介导的。人嗜酸粒细胞趋化因子1的氨基酸序列(不含N端信号肽)是由例如SEQ IDNO:12表示的。

本文所限定的术语“Rantes”(活化时调节、正常T细胞表达和分泌)，也称为趋化因子(C-C基序)配体5(CCL5)，是指由人CCL5基因编码的蛋白质。Rantes是被分类为针对T细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞的趋化细胞因子或趋化因子的8kDa蛋白质，并且在将淋巴细胞募集到发炎位点中起积极作用。在T细胞释放的特定细胞因子(即IL-2和IFN-γ)的帮助下，Rantes也诱导一些自然杀伤(NK)细胞的增殖和活化以形成CHAK(CC-趋化因子活化的杀伤体)细胞。Rantes特别地结合CCR3受体。人Rantes(不含N端信号肽)的氨基酸序列是由例如SEQ ID NO:13表示的。

本文所限定的术语“MCP-3”(单核细胞特异性趋化因子3)，也称为趋化因子(C-C基序)配体7(CCL7)，被归类为称为CC趋化因子的趋化因子亚族之中。MCP-3专门吸引单核细胞，并且调节巨噬细胞的功能。它是由一些肿瘤细胞系和巨噬细胞产生的。该趋化因子位于人染色体17上，在含有许多其它CC趋化因子的大簇内。Rantes特别地结合CCR3受体。人MCP-3(不含N端信号肽)的氨基酸序列是由例如SEQ ID NO:14表示的。

在一些实施方案中，本发明的用于使用的分离的多特异性抗体的用途是，其中所述抗体结合嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Rantes和MCP-3。

在其它具体的实施方案中，本发明的用于使用的分离的多特异性抗体减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性。

术语“减弱”表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的“迁移特性”表示本发明的抗体减弱细胞迁移，如可在趋化性测定中测量的。此类趋化性测定是本领域熟知的。示例性趋化性测定在下面的实施例部分展示。减弱迁移特性是指，与未处理的细胞相比，细胞迁移的任意统计学显著的减少。例如，迁移细胞的数目至少减少50％。

如下面的实施例部分例示的，本发明的抗体能够结合若干促炎性趋化因子并抑制它们的各种活性，例如抑制细胞募集或趋化性(例如嗜酸粒细胞或单核细胞或纤维原细胞的募集或趋化性)、抑制纤维原细胞向成肌细胞的转化、以及减少细胞活化。因此，这些抗体在不利症状或作用至少部分是由促炎性CCR3趋化因子介导的疾病的治疗中可能是有用的。

特别地，如下面的实施例所展示的，本发明的抗体在被分类为纤维化疾病的特发性肺纤维化(IPF)和硬皮病模型中引起若干特征的显著减轻。

纤维化是器官或组织的过量纤维结缔组织在修复性或反应性过程中的形成。这可以是反应性的、良性的或病理状态的。纤维化可以用来描述纤维组织过量沉积的病理状态，以及愈合时结缔组织沉积的过程。因此如本文所用的术语“纤维化疾病”涉及一种异常状况，其中纤维结缔组织遍及正常平滑肌或其他正常器官组织散布或取代正常平滑肌或其他正常器官组织。纤维化可累及心脏、肺、腹膜、皮肤或肾脏。纤维化疾病的非限制性实例包括硬皮病、特发性肺纤维化(IPF)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾小球硬化症、肝硬化及代谢综合征。

因此，在一些实施方案中，纤维化疾病选自由硬皮病、特发性肺纤维化(IPF)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾小球硬化症、肝硬化及代谢综合征组成的组。

如本文所限定的术语“硬皮病”，也称为系统性硬化病，是指特征是皮肤(真皮)硬化(sclero)的慢性系统性自身免疫性疾病。在更严重的方面，其也影响内部器官。硬皮病可以是局限性硬皮病，并且包括主要影响手、臂和脸的皮肤表现，或可以是弥漫性硬皮病，其快速进展并且影响皮肤或一个或更多个内部器官，通常是肾、食管、心脏、心和/或肺的大片区域。这种形式的硬皮病可能是相当致残的。虽然没有对于硬皮病本身的治疗方案，但是个别器官系统的并发症被治疗。

术语“特发性肺纤维化”(IPF)是指肺泡壁的进行性纤维化，伴随进行性呼吸困难和可能致命的缺氧或右心衰竭。该急性形式被称为Hamman-Rich综合征。

如本文所用术语“炎症”是指免疫系统对有害刺激，如病原体、受损细胞(由例如烧伤、创伤、赘生物引起)或诸如化学品、热或冷的刺激产生的复杂的生物学反应。术语“炎性疾病”或“炎性疾患”指的是与炎症相关的疾病，包括但不限于自身免疫性炎性疾患。

如本文所用，术语自身免疫性疾病描述了由身体对抗正常存在于身体内的物质和组织的过度活跃的免疫反应引起的病理状况。免疫系统将身体的一些部分错认为病原体并对其进行攻击。这可能局限于特定器官或涉及可能影响肺和肾的基底膜的不同位置的特定组织。自身免疫性疾病的实例包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、腹部疾病、I型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、变应性肉芽肿(Churg-Strauss Syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroditis)、格雷夫斯病(Graves'disease)、牛皮癣、炎性肠病(溃疡性结肠炎和克罗恩病)、硬皮病和天疱疮。

如本文所用，术语“自身免疫性炎性疾患”涉及由免疫系统攻击身体自身组织引起的疾患，其特征还在于增加的炎症。自身免疫性炎性疾患的非限制性实例包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、牛皮癣、结肠炎、葡萄膜炎、多发性硬化症和I型糖尿病。

因此在一些实施方案中，本文所限定的自身免疫性炎性疾患选自由系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、牛皮癣、结肠炎、葡萄膜炎、多发性硬化症和I型糖尿病组成的组。

如本文所用，术语“单核细胞相关疾患”涉及影响单核细胞和巨噬细胞功能并且在例如脂贮积症(例如戈谢病和尼曼-皮克病)或在动脉粥样硬化中引起细胞内碎片的形成(buildup)的遗传性异常。血液中单核细胞的增加(单核细胞增多症)发生于对慢性感染的反应、自身免疫性疾病、血液疾患、以及一些癌症中。巨噬细胞在组织中的增殖可能发生于对感染的反应、肉状瘤病和郎格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans cellhistiocytosis)。

如本文所用，术语“动脉粥样硬化”(也称为动脉硬化性血管病或ASVD)是这样的病理学状况，其中由于脂肪物质例如胆固醇的的积聚而导致动脉壁增厚。这个过程是动脉壁的慢性炎症反应的结果，在很大程度上是由巨噬细胞的积累导致的并被低密度脂蛋白促进，而没有通过功能性高密度脂蛋白(HDL)从巨噬细胞充分去除脂肪和胆固醇。动脉的硬化或成垢(furring)是由动脉内多个斑块的形成所引起的。

如本文所用，术语“过敏性特异反应性疾患”是指一种形式的过敏症，其使具有遗传易感性的人遭受一些过敏源的超敏反应。过敏性特异反应性疾患的非限制性实例包括哮喘、特应性皮炎、枯草热、荨麻疹和超敏反应。

因此又在另外的实施方案中，根据本发明的过敏性特异反应性疾患选自由哮喘、特应性皮炎、荨麻疹和超敏反应组成的组。

如上所述，本发明提供了与至少两种促炎性CCR3-结合趋化因子结合的分离的多特异性抗体。术语“抗体”是指由免疫球蛋白基因或其功能性片段的编码的多肽，其特异性结合并识别抗原，即促炎性CCR3-结合趋化因子。具体而言，本发明的抗体至少结合和识别嗜酸粒细胞趋化因子2、嗜酸粒细胞趋化因子1、RANTES和MCP-3。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体。本文所限定的术语“单克隆抗体(monoclonal antibody)”、“单克隆抗体(monoclonal antibodies)”或“mAb”是指基本上同源的抗体群，即除了可能以较小量存在的可能天然发生的突变之外，构成该群的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点。

单克隆抗体可由本领域已知的任何方法制备和纯化。例如，单克隆抗体可由被免疫的动物(例如大鼠或小鼠)的脾或淋巴结提取的B细胞通过在有利于杂交细胞生长的条件下与永生化B细胞融合而制备。

对小鼠的免疫可按照例如WO 2010/086854中所描述的进行。简言之，对小鼠的免疫可通过例如用完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)乳化的期望的抗原，即，CCR3-结合趋化因子，例如嗜酸粒细胞趋化因子2、或在N环区含有构象表位的CCR3-结合趋化因子的片段(例如50μg)初次皮下(s.c.)免疫进行。然后每2周施用两份具有用不完全弗氏佐剂乳化的抗原(如50μg)的皮下增强注射液。具有最高的中和抗体滴度的小鼠接受溶于PBS的抗原(例如5μg)的另外的静脉内(i.v.)增强免疫，4天后移除脾脏。

最后的增强免疫后(例如4天)，切除具有最高的中和抗体滴度的小鼠的脾脏，并如前所述(G.和Milstein,C.(1975)Nature 256:495–497)地使用聚乙二醇将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(例如NS0细胞)融合。融合后，使所述细胞在HAT(次黄嘌呤-氨蝶呤-胸苷)培养基中生长以选择杂交瘤细胞。然后例如使用如下所述的ELISA测定筛选细胞克隆用于特异性抗体生产。

单克隆抗体的纯化可基于例如亲和层析，即，使用偶联了特异性表位的亲和柱。

如本领域中公知的，示例性抗体结构单元包括一个四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”和一条“重链”。每条链的N端定义了约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原(或表位)识别。

因此，术语“重链可变区”(V_H)和“轻链可变区”(V_L)分别是指这样的重链和轻链。更具体而言，可变区又细分为高变区和框架(FR)区。相对于指定位置最常见的氨基酸，高变区在该位置具有高比率的不同氨基酸。具有更稳定的氨基酸序列的四个FR区将高变区隔开。高变区直接接触抗原表面的一部分。出于这个原因，高变区在本文中称为“互补决定区”或“CDR”。

从N端至C端，轻链和重链都包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4域。CDR主要负责结合抗原表位。从N端按顺序编号，每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，并且也通常由特定CDR所定位的链标示。

因此，互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3是指始于抗体重链的N端的三个互补决定区，而互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3是指始于抗体轻链的N端的三个互补决定区。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的多特异性单克隆抗体为嵌合抗体、人抗体、人源化的抗体或完全人源化的抗体。

如本文所限定的术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来自特定物种，而所述链的剩余部分来自另一物种的抗体以及该抗体的表现出相同活性的片段。

嵌合抗体可通过本领域已知的任意方法，例如如下所述的方法制备。

鼠-人嵌合抗体可由以下方式制备：扩增和克隆鼠的编码抗体可变区的V_H和V_L基因，然后表达鼠-人嵌合抗体。为此，从被证实分泌具有期望特性的抗体的鼠抗-嗜酸粒细胞趋化因子2杂交瘤细胞中分离总RNA，并利用oligo(dT)₁₅引物、M-MLV和AMV反转录酶合成cDNA。重链和轻链可变基因(V_H和V_L)的扩增可通过针对各个基因阅读框1的5’端(基本上如Benhar和Reiter(Benhar,I.和Reiter,Y.(2002)Curr.Protoc.Immunol.Chapter 10:Unit10 19B)中所描述的)以及针对3’端的恒定区(分别为C_H1或C_k)的一组引物进行。

然后使用非简并引物再扩增可变基因，在所述非简并引物的两端引入限制性位点以便克隆到，例如基于pCMV的抗体表达载体中。

所扩增的重链和轻链可变基因被分别纯化、消化并克隆入合适的哺乳动物全长Ig表达载体中，所述表达载体为每条链提供相应的信号肽和恒定基因，致使IgG1/k鼠人嵌合抗体的表达。

为了制备大量的抗体，可以通过用含有嵌合抗体的重链和轻链的Ig表达载体转染细胞(例如CHO细胞)来制备表达所述抗体的稳定细胞系。然后，选择抗-嗜酸粒细胞趋化因子2(或任何用于生产抗体的其他CCR3-结合趋化因子)的高产抗体克隆并基于上清中的抗体水平繁殖，上清中的抗体水平按照本领域已知的任意方法检测，例如如下详述的CCR3-结合趋化因子特异性ELISA检验。

术语“人源化的”抗体通常是指非人类(例如，鼠)抗体的形式，其包含从人源免疫球蛋白的框架以及在CDR处和可选地在其它相关位置处的最少的来自非人源的免疫球蛋白的序列。在大多数情况下，人源化的抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种例如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物的具有期望的特异性、亲和性和活性的高变区(供体抗体)的残基取代。

如本文所用，术语“完全人源化的”抗体涉及被设计成仅具有人序列的抗体。本发明的完全人源化的抗体是使用Composite Human Antibodies^TM技术来制备的，该技术能将抗体在患者体内的免疫原性降到最小。在这种人源化技术中，来自不相关的人抗体的可变区(V)的多个序列片段用作起始抗体的互补决定区(CDRs)的接受体。通过仔细选择人序列片段并应用计算机模拟工具，避免了CD4+T细胞表位，从而与标准化的人源化的抗体相比降低了免疫原性的风险同时保留了抗体的亲和力和特异性。此类抗体只含有人类序列，并因此定义为“完全人源化的”。

如本文所用的“人抗体”是指这样的抗体，其具有的氨基酸序列对应于人产生的抗体的氨基酸序列和/或已利用本领域已知的制备人抗体的任意技术被制备。该定义特别地排除了含有非人抗原结合残基的人源化的抗体。

人源化的抗体和人抗体的制备是本领域熟知的。抗体也可以利用噬菌体展示制备。如本领域已知，抗体噬菌体展示(APD)基于噬菌体的遗传学构建和几轮重复的抗原指导的选择以及噬菌体繁殖。

APD方法开始于抗体文库制备，通过从所选择的细胞来源(例如，外周血单核细胞)制备高质量的RNA。将该RNA逆转录成cDNA，cDNA用于所编码抗体的VH和VL链的PCR。此步骤之后是将可变重链(VH)和可变轻链(VL)的PCR产物连接到噬菌体展示载体中，以mAbs克隆的分析结束。

在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的完全人源化的多特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：CDRH1，包含由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列NSGMN或其变体；CDRH2，包含由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列WINTYNGEPTYTDDFKG或其变体；和CDRH3，包含由SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列HSYGSSYAMDN或其变体；并且该轻链可变区包含：CDRL1，包含由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN或其变体；CDRL2，包含由SEQ ID NO.9表示的氨基酸序列VASNLKS或其变体；和CDRL3，包含由SEQ ID NO.10表示的氨基酸序列QQSNEEPWT或其变体。

换言之，本发明提供了一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，其与至少两种CCR3-结合趋化因子结合，其中所述抗体为完全人源化的抗体，并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，其与至少两种促炎性CCR3-结合趋化因子结合而在纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患的治疗中使用，其中所述抗体为完全人源化的抗体，并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含：

该轻链可变区包含：

上述由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10分别表示的CDR序列CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3也存在于其相应的重链或轻链序列的背景内：

本文所例示的分离的完全人源化的多特异性单克隆抗体的重链的氨基酸序列由SEQ ID NO:3表示，并且是以下氨基酸序列：

QIQLVQSGPELKKPGASVKVSCRASGYPFTNSGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLRNEDTATYFCASHSYGSSYAMDNWGQGTSVTVSS。

本文所例示的分离的人源化的多特异性单克隆抗体的轻链的氨基酸序列由SEQID NO:4表示，并且是以下氨基酸序列：

DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLKSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEEPWTFGGGTKVEIK。

因此在另外的实施方案中，根据本发明的用于使用的分离的多特异性抗体是，其中所述抗体为完全人源化的抗体，其包含由SEQ ID NO:3或其变体表示的重链可变区和由SEQ ID NO:4或其变体表示的轻链可变区。

本发明也包括重链和轻链可变区的变体。所述变体可以包含不改变本文所述抗体的活性的重链和轻链的互补决定区或框架区中的突变。

术语“变体”的意思是，与本文所特别鉴定的序列不同的氨基酸序列或核苷酸序列，其中一个或更多个氨基酸残基或核苷酸被缺失、置换或添加。

应当理解，本文所用的术语“添加的”的意思是，向本文所描述的序列任意添加氨基酸残基。

变体包含多种氨基酸置换。氨基酸“置换”是用具有相似或不同的结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换一个氨基酸的结果。氨基酸置换可在相似的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或所涉及残基的两亲性质的基础上进行。

通常情况下，变体包含保守性氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域公知的。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；并且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

以下八组各自含有对于彼此是保守性置换的其它示例性氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。

保守性核酸置换是导致如上定义的保守性氨基酸置换的核酸置换。

根据本发明的变体也包括非极性到极性氨基酸的置换以及反过来的置换。

如本文所用，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指天然存在和合成的氨基酸、以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸拟似物。

变体序列是指可通过其氨基酸或核苷酸序列与本文所述的氨基酸或核苷酸序列(例如本文所述抗体的重链和轻链的氨基酸或核苷酸序列)的同一性百分比来表征的氨基酸或核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文所定义的变体序列是指编码重链和轻链可变区的核酸序列，，其各自具有在与本文所述的重链和轻链可变区的序列相比时至少70％或75％序列同一性、约80％或85％序列同一性、约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，根据本发明的分离的多特异性的人源化的单克隆抗体是，其中其重链可变区被这样的核酸序列编码，所述核酸序列与由SEQ ID NO.1表示的重链可变域的核酸序列至少70％相同；并且其中，其轻链可变区被这样的核酸序列编码，所述核酸序列与由SEQ ID NO.2表示的重链可变域的核酸序列至少70％相同。

术语“抗体的活性”的意思是，抗体与至少两种CCR3-结合趋化因子结合的能力，并且优选地是，抑制通过该CCR3-结合趋化因子介导的生物学功能的能力。

此类生物学功能的非限制性实例为：抑制细胞募集或趋化(例如嗜酸粒细胞或单核细胞或纤维原细胞的募集或趋化性)、抑制纤维原细胞向成肌细胞的转变、或减少细胞活化(例如通过Ca⁺更新来测量)。这些生物学功能可通过本领域熟知的方法在体内或体外进行测量。下面的实施例中描述了若干该类测定。

用于确定按照本发明制备的抗体与其靶蛋白的结合的另外的体外实验包括，例如，ELISA测定。

本发明还包括本发明的分离的多特异性单克隆抗体的任意抗原结合片段。此类抗原结合片段可以是，例如，Fab和F(ab')₂，其能结合抗原。此类片段可通过本领域已知的任意方法制备，例如通过蛋白水解切割、使用例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')₂片段)的酶。

因此在一些实施方案中，根据本发明的分离的多特异性单克隆抗体是，其中所述抗体为选自由Fv、单链Fv(scFv)、能够结合抗原的重链可变区、能够结合抗原的轻链可变区、Fab、F(ab)₂′以及它们的任意组合组成的组的抗体片段。

有趣的是，利用表位定位，发明人鉴定了嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子2、Rantes和MCP-3中与本发明抗体(hCM101)结合的特异性表位。

在嗜酸粒细胞趋化因子2中与本发明抗体(hCM101)结合的表位包括由SEQ ID NO:15表示的氨基酸序列CMFFVSKRIP，在嗜酸粒细胞趋化因子1中的表位包括由SEQ ID NO:16表示的氨基酸序列CFNLANRKIPLQRL，在rantes中的表位包括由SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列AYIARPLPRAHIKEYFY，并且在MCP3中，所述表位包括由SEQ ID NO:18表示的氨基酸序列CCYRFINKKI(“N环的第一部分”)以及由SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列SYRRTTSSH(“N环的第二部分”)。

如从图20B中所示的这些表位的氨基酸序列比对明显的，这些表位的氨基酸序列是不同的。然而，如图21A-D图示地表明的，所有这些表位位于CCR3-结合趋化因子内的同一区域，即在N-环区并且明显地形成被hCM101识别的独特的三维结构。换句话说，在嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子2、Rantes和MCP-3的N环中存在与本发明抗体(hCM101)结合的共同构象表位。

如本文所用，术语“构象表位”是指抗原决定簇，被抗体识别的抗原的部分，其包括抗原氨基酸序列的连续或不连续的部分。构象表位基于抗原的3D表面特征和形状、或三级结构而与抗体的结合位点相互作用。在一些情况下，此类表位可部分地通过线性序列和它们在多肽结构中的相对位置和在已鉴定的表位内发现的特征性氨基酸序列确定。

术语“N环区”的意思是，N环和朝向位于CCR3-结合趋化因子的N端的第一条β链的转角。例如，如图21A(其中示出了嗜酸粒细胞趋化因子-2的蛋白质表面)和图21E(其中示出了嗜酸粒细胞趋化因子-2的带图)所示，在CCR3-结合趋化因子嗜酸粒细胞趋化因子-2中，N环区包括由SEQ ID NO:15表示的氨基酸序列CMFFVSKRIP。

因此在一些实施方案中，本发明的分离的抗体是，其中所述构象表位的氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列。

有趣的是，对在嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子2、Rantes和MCP-3的N环区发现的构象表位的生物信息学分析表明，若干带正电的氨基酸残基位于如上定义的表位的连续氨基酸序列部分内或在其附近。这些表位被示意性地在图20和21中示出。根据生物信息学分析，抗体结合CCR3-结合趋化因子内的区域，该区域包括在N环区内形成的结构并且涉及下列位置处的氨基酸残基：嗜酸粒细胞趋化因子2中的位置Lys-14和Arg-15(位于由SEQ ID NO:15表示的表位内)和Arg-20，嗜酸粒细胞趋化因子1中的位置Arg-16和Lys-17(位于由SEQ ID NO:16表示的表位内)和Arg-22，Rantes中的位置Arg-17(位于由SEQ IDNO:17表示的表位内)、His-23和Arg-21，以及MCP3中的位置Lys-18和Lys-19(位于由SEQ IDNO:18表示的表位内)和Arg-24。在各趋化因子序列中确定的氨基酸位置涉及不含N端信号肽的趋化因子序列，如分别对应于嗜酸粒细胞趋化因子2、嗜酸粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP3的氨基酸序列(不含N端信号肽)的SEQ ID NOs:11-14所示。

术语“位置”的意思是在氨基酸序列内的定位，其中“第1位”表示信号肽后(即成熟多肽的氨基酸序列)的第一个N端氨基酸残基，“第2位”指示如本领域已知的，在N端至C端方向上N端氨基酸残基下游的氨基酸残基，等等。

术语“相对高浓度”的带正电氨基酸残基的意思是，至少三个带正电氨基酸残基，例如三个带正电氨基酸残基。

因此，本发明通过其另一个方面提供了一种分离的抗体，其结合CCR3-结合趋化因子的N环区内的构象表位，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。

在一些具体的实施方案中，本发明的分离的抗体是，其中所述构象表位包括在所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的至少三个带正电氨基酸残基。

在其它具体的实施方案中，所述带正电氨基酸残基选自由Arg、Lys和His组成的组。

在一些具体的实施方案中，本发明的分离的抗体与这样的表位结合，所述表位包含下列位置处的氨基酸残基：嗜酸粒细胞趋化因子2中的位置Lys-14、Arg-15和Arg-20，嗜酸粒细胞趋化因子1中的位置Arg-16、Lys-17和Arg-22，Rantes中的位置Arg-17、His-23和Arg-21，以及MCP3中的位置Lys-18、Lys-19和Arg-24。

如上所限定的共同的表位还可用于筛选和鉴定与若干CCR3-结合趋化因子具有多特异性结合能力的另外的抗体。此类抗体很可能在减弱由这些趋化因子介导的细胞迁移时是有活性的。

因此在另一个方面，本发明提供了一种筛选和鉴定能够有效地减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5中至少一者的细胞的迁移特性的抗体的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括：

a.获得针对CCR3-结合趋化因子的抗体；以及

c.选择与所述构象表位结合的抗体；

在一个实施方案中，所述构象表位包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。

在一个具体的实施方案中，评价结合的步骤通过使抗体与所述构象表位接触，例如通过将该抗体与包括趋化因子的N环的片段孵育、或将通过该抗体与具有由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列中的至少一者孵育进行。孵育可以通过本领域已知的用于评价抗原-抗体结合的任意方法进行，例如通过ELISA或通过利用含有多个氨基酸片段的芯片。孵育是在结合缓冲液的存在下进行的，并且例如通过进一步与可检测地标记的二抗孵育来评价抗体结合。

如本文所用，术语“筛选和鉴定”是指评价一个抗体或多个抗体的与如上所定义的本发明的表位结合的能力，并选择与所述表位结合并从而被预期在与CCR-结合趋化因子结合时减弱所述趋化因子的活性的抗体。

在一些具体的实施方案中，所述构象表位包含如下位置处的氨基酸残基：嗜酸粒细胞趋化因子2(其氨基酸序列由SEQ ID NO.11表示)中的Lys-14、Arg-15和Arg-20，嗜酸粒细胞趋化因子1(其氨基酸序列由SEQ ID NO.12表示)中的Arg-16、Lys-17和Arg-22，Rantes(其氨基酸序列由SEQ ID NO.13表示)中的Arg-17、His-23和Arg-21，以及MCP3(其氨基酸序列由SEQ ID NO.14表示)中的Lys-18、Lys-19和Arg-24。

本发明的被鉴定的构象表位也可以用作抗原，用于产生能够有效减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5中至少一者的细胞的迁移特性的抗体。因此在另一个方面，本发明提供了一种分离的包含构象表位的CCR3-结合趋化因子的N环区，用于产生针对所述CCR3-结合趋化因子的抗体，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。在具体的实施方案中，所述分离的N环区包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的包含构象表位的CCR3-结合趋化因子的N环区，用于在产生针对所述CCR3-结合趋化因子的抗体的方法中使用，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。在具体的实施方案中，所述分离的N环区包含选自由SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。

因此本发明还提供了一种用于产生能够有效地减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5中至少一者的细胞的迁移特性的抗体的方法，包括获得本发明的表位并利用本领域已知的任意方法产生针对所述表位的抗体。

用于对动物接种和产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域已知的。

本发明在其另一个方面提供了一种分离的核酸分子，其包含编码根据本发明的抗体或其任意抗原结合片段的核苷酸序列。

本文所限定的术语“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸的聚合物，其可为单链或双链的，其为多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)，且在适当情况下为核糖核酸(RNA)。这些术语应当被理解为包括由核苷酸类似物制备的RNA或DNA的等价物、类似物，并且如适用于所描述的实施方案，包括单链(如正义或反义)和双链多核苷酸。本文所用的术语DNA也包括cDNA，即通过反转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)的作用由RNA模板产生互补DNA或副本DNA。

本发明还提供了一种包含本文所限定的分离的核酸分子的表达载体。

本文所用的“表达载体”有时是指“表达工具”或“表达构建体”，包括诸如质粒、病毒、噬菌体、可整合的DNA片段的载体，或其它能够使DNA片段整合到宿主基因组的工具。表达载体通常是含有期望的基因或其片段的自我复制的DNA或RNA构建体，并且被可操作地连接到在合适的宿主细胞中被识别并实现期望的基因的表达的遗传控制元件。这些控制元件能够实现在合适的宿主内的表达。根据本发明的表达载体可能能够在细菌、酵母、或哺乳动物宿主细胞(仅举几例)中表达。

本发明又在其另一个方面提供了一种用根据本发明的分离的核酸分子或用根据本发明的表达载体转染的宿主细胞。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指容易被引入根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的表达载体的细胞。优选地，所述细胞为哺乳动物细胞，例如CHO细胞或NS0细胞。将根据本发明的分离的核酸分子或表达载体转染到宿主细胞可以通过本领域已知的任意方法进行。

本发明又在其另一个方面提供了一种免疫免疫缀合物(immunoconjugate)，其包含根据本发明的抗体或其任意抗原结合片段以及另外的治疗剂，如抗炎剂。

如本文所限定的术语“免疫缀合物”是指，与另外的试剂偶联(连接或结合)的根据本发明的抗体或其任意抗原结合片段。免疫缀合物可通过本领域技术人员已知的任意方法制备，例如通过将另外的试剂与根据本发明的抗体交联或通过重组DNA方法。

本发明的多特异性抗体可以与至少一种另外的治疗剂组合施用。

本文所用的术语“另外的治疗剂”是指可用于治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患的任意试剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是另外的抗炎剂或抗纤维化剂。根据一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自由化学治疗剂、细胞因子、多肽、抗体和抗生素组成的组。

在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括但不限于甲氨蝶呤、类固醇、环孢菌素、NSAIDS(非类固醇抗炎药)、类固醇、干扰素-β、静脉内免疫球蛋白(IVIG)、吡非尼酮、尼达尼布、波生坦、或马西替坦(macicentan)。

在一些实施方案中，另外的治疗剂是另外的抗体。如本文所限定的术语“另外的抗体”是指可与本发明的抗体组合使用的不是根据本发明的抗体的抗体。作为非限定性实例，此类抗体可以针对TNFα、TNF受体、IL6受体或CD20。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含本文所定义的本发明的分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段或免疫缀合物作为活性成分以及药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

本发明的“药物组合物”通常包含如本文所限定的抗体或其任意抗原结合片段以及缓冲剂、能够调节组合物的渗透压的试剂、以及可选的一种或更多种本领域已知的药学可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

如本文所用的术语“药学可接受的载体、赋形剂或稀释剂”包括本领域中公知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂等。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、以及植物油的溶剂或分散介质。在可与其它成分相容并且对受试者无害的意义上，每种载体应该是药学上可接受的并且是生理上可接受的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容之外，设想了其在治疗组合物中的使用。

在其它实施方案中，根据本发明的药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗炎剂。

在具体的实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含与至少两种促炎性CCR3-结合趋化因子结合的分离的多特异性人源化的抗体或其任意抗原结合片段，，其中所述抗体包含具有由SEQ ID NO.3表示的序列或其变体的重链可变区，以及具有由SEQ IDNO.4表示的序列或其变体的轻链可变区。

还提供了一种预防、治疗或改善自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病的方法，其包括向需要其的患者施用治疗可接受量的根据本发明所述的分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明还提供了一种预防、治疗或改善自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病的方法，包括向需要其的患者施用治疗可接受量的与至少两种促炎性CCR3-结合趋化因子结合的分离的多特异性人源化的抗体或其任意抗原结合片段，其中所述抗体包含具有由SEQ ID NO.3表示的序列或其变体的重链可变区，以及具有由SEQ ID NO.4表示的序列或其变体的轻链可变区。

术语“受试者”或“患者”被可互换地使用并指受益于本发明的受试者，例如哺乳动物(例如犬、猫科动物、绵羊、猪、马、牛或人)。在一个具体的实施方案中，患者为人。

本文所限定的术语“预防”的意思是提供“预防性治疗(preventive treatment)”或“预防性治疗(prophylactic treatment)”，即以保护性的方式防御或防止自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病、或这种疾病的发作性症状(episode)。

应当理解的是，本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或其形式是指减轻、预防、治愈、逆转、改善、减弱、缓和、最小化、抑制或停止疾病或状况的恶性影响或是延迟受促炎性CCR3-结合趋化因子影响的疾病的一种或更多种临床适应症的发作。此类疾病包括自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”是指减轻、预防、治愈、逆转、减弱、缓和、最小化、抑制或停止由嗜酸粒细胞趋化因子2介导的疾病或状况的的恶性影响。

根据本发明的施用可通过以下途径中的任意一种进行：口服、静脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内或皮下注射；直肠内施用；鼻内施用、眼部施用或局部施用。

在具体的实施方案中，根据本发明的施用可通过静脉内进行。在其它具体的实施方案中，施用可在腹膜内进行。在其它具体实施方案中，施用可通过吸入进行。

如本文所限定的抗体或抗体片段、包含所述抗体或抗体片段的任意药物组合物或包含所述抗体或抗体片段的任意缀合物可在疾病发作之前或之后被施用至受试者。

因此在一些实施方案中，根据本发明的预防、治疗或改善自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病的方法是，其中根据本发明的所述分离的人源化的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，或根据本发明的药物组合物在疾病发作之前或之后被施用至受试者。

用于本文所限定的目的的根据本发明的分离的单克隆抗体或其任意抗原结合片段，或根据本发明的药物组合物的“治疗有效量”是通过本领域已知的为了治愈、阻止或至少缓解或减轻医学状况的考量来确定的。对于本发明所述的方法中使用的任何制剂，所述剂量或治疗有效量可最初从体外细胞培养测定或基于动物模型诸如本文所详述的动物模型来估计。

在一些实施方案中，根据本发明的治疗有效量在0.01至100mg/kg的范围内。

在其它实施方案中，根据本发明的治疗有效量在0.01至40mg/kg、0.1至40mg/kg或1至10mg/kg的范围内。

在其它实施方案中，根据本发明的分离的人源化的多特异性抗体或其任意抗原结合片段或根据本发明的药物组合物是以单一剂量或多个剂量施用到受试者的。

在本发明的上下文中的术语“需要其的受试者”是指患有自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病的温血动物，诸如例如大鼠、小鼠、狗、猫、豚鼠、灵长类动物和人。

本发明还提供了根据本发明的分离的人源化的多特异性抗体或其任意抗原结合片段或根据本发明的药物组合物，用于在预防、治疗或改善自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病的方法中使用。

在具体的实施方案中，本发明提供了分离的人源化的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，用于在预防、治疗或改善自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患、过敏性特异反应性疾患或纤维化疾病的方法中使用，所述抗体或其任意抗原结合片段与至少两种促炎性CCR3-结合趋化因子结合，其中所述抗体包含由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列或其变体的重链可变区，以及由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列或其变体的轻链可变区。

应当理解，术语“纯化的”或“分离的”是指从其自然环境中取出、分离或分开的分子，例如氨基酸或核酸序列、肽、多肽或抗体。因此“分离的抗体”是指纯化的抗体。如本文所用，术语“纯化的(purified)”或“纯化(to purify)”也指从样品中除去污染物。

材料和方法

特异性ELISA

通过ELISA评估CM101的特异性。板用以下的抗原包被：嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子2、单核细胞趋化蛋白-3(CCL7)和RANTES(CCL5)。全部在1μg ml^–1浓度在4℃下过夜包被。洗涤(PBS+0.1％Tween 20)以后，向所述板中加入hCM101(5μg)，持续1小时。再次洗涤后，用抗-人辣根过氧化物酶(以1：5000稀释在PBS中，孵育1小时)缀合物检测CM101，并使用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物(Sigma Chemical，Gillingham，UK)定量。10分钟后用硫酸(50μl，2M)停止反应，并在450nm下测定光密度。

免疫组化:

对于人嗜酸粒细胞趋化因子2/CCR3的免疫组化染色在来自硬皮病患者的皮肤/肺活检物的5-μm厚的冰冻切片上进行。用甲醇和丙酮固定后，切片用未免疫的兔和山羊的血清封闭，然后用CAS封闭试剂孵育。随后，在室温下加入一抗(抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2或抗CCR3抗体)，持续1小时。洗涤后，加入生物素化的亲和纯化的山羊抗小鼠/兔抗体(Jackson)。然后将玻片用0.3％H₂O₂孵育，然后是另外的漂洗和用链霉亲和素-过氧化物酶缀合物(Jackson)室温下孵育30分钟。玻片用3-氨基-9乙基咔唑(Dako)显影15分钟，并用苏木精复染。使用H&E和Masson’s三色染色分析肺部炎症以及皮肤和肺切片的纤维化变化。

拉下测定(Pulldown assay)

利用dynabeads免疫磁珠方案(lifetechnology)进行拉下。在室温下将递增浓度的CM101与磁珠(1mg)孵育1.5小时。然后，进行磁性分离，之后与人血清(来自系统性硬化病患者)孵育过夜。进行从磁珠上磁性分离并洗脱趋化因子，然后转移到硝酸纤维素膜上并暴露于市售抗Eox2抗体。还用SDS凝胶电泳评价hCM101结合嗜酸粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3的能力。

趋化检验

将Aml 14.3D10，稳定表达CCR3的嗜酸性细胞系，在PBS中洗涤一次，并以10⁷细胞ml^–1重悬在测定缓冲液(RPMI 1640、1％不含内毒素的BSA、100U ml^–1青霉素、和100μg ml^–1链霉素)中。将不同浓度的hCM101(10^-7M-10^-9M)与5nM人嗜酸粒细胞趋化因子-1和嗜酸粒细胞趋化因子-2或MCP-3和RANTES(30分钟，37℃)的组合孵育，并放置到具有5-μm孔的24孔Transwell板(Costar)的下腔室中；将100μl细胞(1×10⁶细胞)放置到每个Transwell板的上腔室中，并将测定物在37℃下孵育4小时(5％CO₂)。利用流式细胞仪(FACSCalibur，BDBiosciences，Cowley,UK)对迁移到下腔室的活细胞进行计数。结果用百分比对照(即，趋化因子诱导的)迁移表示。

还用表达CCR1、CCR3和CCR5的U937单核细胞系进行实验。为评价hCM101抑制其迁移的能力，将hCM101与5nM的MCP-3和RANTES的混合物孵育，并放入具有5-μm孔的24孔Transwell板(Costar)的下腔室中。如上所描述地进行测定。

对于CD14阳性细胞，我们对从硬皮病患者的全血中分离的FicollPBMC使用MACS分离磁珠(Milteny)。如上所述地评价CD14+细胞向MCP3和RANES的迁移。此外，检验用hCM101处理的CD14-细胞向嗜酸粒细胞趋化因子1、2和RANTES的迁移。

为了评价粘附细胞(纤维原细胞-NHDF)响应于嗜酸粒细胞趋化因子2的趋化性，我们采用纤维连接蛋白包被的具有8μm孔径的Transwell(Costar)。嗜酸粒细胞趋化因子2与hCM101孵育30分钟后，将NHDF细胞(5x104细胞)添加到上腔室中并在37℃下孵育4小时。然后，用棉签从插入膜(insert membranes)中去除未迁移细胞。所述膜用4％多聚甲醛固定，并然后用考马斯蓝对迁移的细胞染色。用倒置显微镜在三个随机视野中对迁移细胞数计数，并用图像处理软件(image pro software)进行分析。

钙活化检验：

在37℃下将细胞(2x10⁶细胞/ml)与终浓度4μM的钙传感器(Flou4-AM，invitrogen)孵育在PBS+/+(钙、镁++)，持续30分钟。然后洗涤细胞，并在37℃下在500μl的PBS+/+中再孵育30分钟。细胞用流式细胞仪分析30秒(488激光器、滤波器520)，然后用100ng/ml的嗜酸粒细胞趋化因子2刺激(用或不用hCM101预孵育)并立即进行流式读数(flow read)。

流式细胞法细胞内染色:

将纤维原细胞与CM101(10μg/ml或5μg/ml)和人血清孵育24h。然后用胰酶消化细胞，用70％乙醇固定，并在室温下将所述细胞与抗αSMAAb(Biolegend)孵育0.5h。然后洗涤细胞并在室温下经受第二Ab Cye3驴抗兔IgG(1:300于PBS中)0.5小时。通过流式细胞仪分析细胞。

体内硬皮病模型

将博来霉素(sigma)以100μg/ml溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。

预防模型：

通过向6周龄的雌性C3H小鼠每天皮下注射50μg博来霉素持续21天以诱导系统性硬化病。与开始注射博来霉素平行地，每隔一天注射CM-101(以5μg、10μg、20μg或50μg的剂量)、免疫球蛋白G1(IgG1)或PBS。

治疗模型：

用博来霉素的皮下注射液治疗6周龄的雌性C3H小鼠(每天50μg)，持续20天。在开始每天施用博来霉素后的第8天，开始每天以100μlCM-101的腹膜注射液(50μg/天)或PBS处理小鼠，并在第21天处死小鼠。显然，用CM-101治疗的起点发生在疾病症状的发作之后。

然后处死小鼠，并且从注射部位获取全层6-mm的钻取活检物。将得到的皮肤组织用于石蜡和冰冻分块(block)，并用于胶原测定。另外，从眼窝窦(Orbital Sinus)中收集血液。最后，收集肺用于组织学分析，并且进行支气管肺泡灌洗(BAL)以检验白细胞百分比(在含有0.1％BSA和0.05mMEDTA的PBS中)。

体内IPF模型：

预防模型-

在异氟醚麻醉下，通过气管内注射用单一剂量的BLM(60μg/小鼠)处理7周龄的雄性C57BL小鼠。将BLM溶于PBS中。注射后，将小鼠以垂直位置放置并旋转1min。与开始博来霉素注射平行地，每隔一天(从第一天开始)注射CM-101(在10μg、50μg或100μg的剂量下)、免疫球蛋白G1(IgG1)或PBS。

治疗模型：

在异氟醚麻醉下，通过气管内注射用单一剂量的BLM(60μg/鼠)处理7周龄的雄性C57BL小鼠。将BLM溶于PBS中。注射后，将小鼠以垂直位置放置并旋转1min。施用博来霉素9天后，每天用100μl的CM-101的腹膜注射液(以10或50μg/天)、IgG或PBS处理小鼠，并在第21天处死小鼠。显然，用CM-101治疗的起点发生在疾病症状发作后。博来霉素注射9天后，将PBS组和博来霉素组处死，用于评价基线纤维化和炎症。在第21天，将剩余组也处死。

处死小鼠并获取肺用于组织学和胶原测定(sircol)。收集支气管肺泡灌洗液(BAL)以检验白细胞百分比(在含有0.1％BSA和0.05mM EDTA的PBS中)。

胶原含量的测量

使用Sircol可溶性胶原测定(Biocolor，Belfast，UK)对可溶性胶原进行定量。从用CM101(5、20或100μg/ml)、IgG或PBS处理的硬皮病小鼠得到皮肤样品。将样品提取至酸-胃蛋白酶溶液中。根据制造商的方案分析样品的胶原含量。简而言之，将100μl样品加入的1ml比色试剂(溶于苦味酸中的染料SR)并搅拌30分钟，之后在10,000g下离心10分钟。SR染料从含有碱试剂(1N NaOH)的颗粒(pellet)中释放，并且在酶标仪上在555nm下读取分光光度读数。

BAL测定：

如前所述(Komai等，2010)进行BAL测定。气管插管并且用0.5ml不含钙和镁的含有0.1％BSA和0.05mM EDTA-2Na的PBS洗涤肺4次。重复该程序3次(总体积：1.3ml，回收率>85％)。将来自每只动物的BAL收集在塑料管中，在冰上冷却，并在4℃下离心(150×g)10分钟。将细胞团在相同的缓冲液中重悬(0.5ml)。利用流式细胞仪进行分类细胞计数(Differential cell count)。

趋化因子水平

根据制造商的方案，使用以下Elisa试剂盒确定硬皮病患者和健康供体的血清中的嗜酸粒细胞趋化因子-1、嗜酸粒细胞趋化因-2和Rantes水平：Quantikine human CCL11/Eotaxin、CCL24/Eotaxin-2和CCL5/Rantes(R&D)。

表位定位

在4℃下，用在TBS缓冲液(pH 7.0)中的0.05％Tween-20、0.05％Triton过夜封闭芯片KMC。芯片用含有0.05％Tween-20和0.05％Triton的1mL1×TBS(pH7.0)洗涤，并在635nm和PMT 700下扫描。然后，为了检测CM101的表位结合，用在4℃下的1ml的结合缓冲液洗涤CHIP 20min，并且与4℃下的结合缓冲液(pH 7.4)中的1μg/ml hCM101孵育2小时。孵育后，洗涤芯片，并与4℃下的结合缓冲液(pH 7.4)中的10ng/ml抗人IgG Alexa 647缀合物孵育1小时。再次洗涤芯片，并且在635nm和PMT 700下扫描。

Biacore测定

使用Biacore T100评价hCM101或鼠CM101的亲和常数。此方法使用表面等离子体共振(SPR)电光现象来测量结合常数以及结合配偶体之间的结合/解离速率(on/offrate)。将嗜酸粒细胞趋化因子2共价地固定在CM-5芯片的表面上，并使CM101的溶液通过表面。对SPR角度的变化进行测量并使其能确定KD。

Episcreen时程T细胞增殖测定

将来自20个健康供体的PBMC解冻，计数和评价成活力。对于每个供体，建立批量培养物，其中将1ml增殖细胞储备液加入到24孔板的适当孔中。将培养基0.5ml和0.5ml的每种稀释hCM101加入PBMC中以提供得到每个样品50μg/ml的终浓度。对于每个供体，也包括重复性对照(100μg/ml KLH)和单独的培养液的孔。在37℃和5％CO2下孵育培养物共计8天。在第5、6、7和8天，用在100μl AIM-V培养基中的0.75uCi[3H]-胸腺嘧啶(Perkin Elmer，UK)刺激每个孔的细胞，并在收获前使用TomTec MachIII孵育18小时。通过闪烁计数Meltilex(Perkin Elmer，UK)确定每分钟的计数(cpm)。

实施例1在小鼠模型中用抗嗜酸粒细胞趋化因子2mAb CM101治疗减少了硬皮病的特征

为了检验硬皮病中CCR3-结合趋化因子的潜在参与，将硬皮病患者血清中的嗜酸粒细胞趋化因子1、2和RANTES与健康受试者相比进行评价。分别如图1A和1B所示，结果指示嗜酸粒细胞趋化因子2和RANTES水平的显著增加(pv≤0.05)。此外，在取自硬皮病患者的皮肤活检物中检测到显著升高的嗜酸粒细胞趋化因子2及其受体CCR3的表达(数据未示出)。因此，可能的是，嗜酸粒细胞趋化因子-2/CCR3途径的活化在硬皮病中是可操作的。

使用CM101进一步评价嗜酸粒细胞趋化因子2与硬皮病的相关性。CM101是针对嗜酸粒细胞趋化因子2的小鼠单克隆抗体(WO2010/086854)。通过Biacore确定CM-101对鼠嗜酸粒细胞趋化因子2的亲和常数(Kd)，并且发现为7nM。为了评价用CM101治疗对硬皮病的影响，使用博来霉素诱导的硬皮病鼠模型。通过每天对C3H小鼠注射50μg的博来霉素，持续21天来诱导硬皮病。每隔一天腹膜内注射CM-101(10μg、20μg或50μg)、IgG或PBS。在开始注射博来霉素的21天后，从所有组获取皮肤和BAL液体样品。处死小鼠以评价纤维化和支气管肺泡炎症。

与用IgG1或PBS处理的那些小鼠相比，在用CM-101处理的小鼠中观察到硬皮病相关特征的严重程度的显著下降。如图2和图3所示，CM-101防止了所有测试参数的增加(真皮厚度、皮肤胶原含量和白细胞向肺的浸润)。在真皮厚度试验(图2A)中，与用PBS或对照IgG1处理相比，对于CM-101的每个剂量均得到统计学上显著的差异(p<0.05)。CM-101的预防效果在以剂量依赖的方式显著减少皮肤胶原浓度方面的也是明显的(如图2B所示，CM-101的10μg、20μg和50μg剂量水平分别减少30％、60％和84％)。对鼠支气管肺泡不同白细胞亚群的确定揭示淋巴细胞和嗜酸粒细胞百分比的显著的剂量响应性减少(分别为图3A和3B)。

在该治疗模式中，博来霉素注射8天后，从第一(PBS)和第二(仅博来霉素)组中获取皮肤和BAL液体样品。博来霉素注射开始21天后，从第三(博来霉素)和第四(博来霉素+CM101)组中获得皮肤和BAL液样品。处死小鼠以评价纤维化和支气管肺泡炎症。

与21天博来霉素处理组相比，CM-101处理的组中皮肤胶原浓度显着减少了60％(图4)。

此外，使用流式细胞术测试BAL液体中白细胞的存在。如图5A和5B所示，与博来霉素处理的组相比，CM-101处理的组中单核细胞和白细胞浸润显著降低(分别为55％和30％)。代表性的流式细胞术的图在图5C-5F中示出。

为了评价真皮厚度，在皮肤伤口处用苏木精伊红(H&E，图6A-D)和Masson’s三色染色(图6E-H)进行组织病理学染色。首先，如从图6C和6G中可以看出的，21天的博来霉素处理后，真皮厚度显著升高。该升高在从第8天开始用CM-101处理的小鼠中未观察到。此外，H&E和Masson三色染色显示出与BLM处理的组相比，CM-101处理的组的皮肤病灶中的炎症和纤维化显著减弱(图6D和6H)。

实施例2在小鼠模型中抗嗜酸粒细胞趋化因子2mAb CM101的治疗减少了IPF

为了检验特发性肺纤维化(IPF)中嗜酸粒细胞趋化因子2的潜在参与，评价IPF患者肺活检物中的嗜酸粒细胞趋化因子2水平。在取自IPF患者的皮肤活检物中发现显著升高的嗜酸粒细胞趋化因子-2的表达(图7所示)。这些数据支持嗜酸粒细胞趋化因子-2通路在IPF中可能被激活的观点。

常见的博来霉素诱导的肺纤维化模型用于评价CM101的功效。在第1天向C57/Bl小鼠气管内注射博来霉素(每只小鼠60μg)。在预防方案中，从第1天至第14天腹膜内注射CM101或IgG。博来霉素注射14天后，从所有组获取肺和BAL液体样品。处死小鼠以评价纤维化和支气管肺泡炎症。

与用免疫球蛋白(IgG)或PBS处理的那些小鼠相比，在用CM-101处理的小鼠中观察到对IPF相关特征的显著抑制。如图8和图9所示，在所有测试参数方面CM-101的抑制是明显的(胶原浓度和白细胞向肺的浸润)。CM-101的抑制效果在以剂量依赖的方式显著减少胶原浓度方面是明显的(如图8所示，CM-101的10μg和100μg剂量水平分别减少60％和70％)。对鼠支气管肺泡(BAL)中的单核细胞的测量揭示了在CM101处理后的显著减少(图9)。对BAL液中嗜酸粒细胞趋化因子2水平的测量揭示了在CM-101处理组中，BAL液内嗜酸粒细胞趋化因子2的减少(图10)。

为了评价疾病发作后CM101的功效，进行这样的处理方案，其中在BLM气管内注射后仅10天，每天施用CM101持续2周的时间段。肺胶原评价揭示了在50μg的CM-101每日治疗之后的显著减少(75％)(图11)。

此外，利用流式细胞术分析检测BAL液体中白细胞的存在。如图12A和12B所示，与博来霉素处理的组相比，CM-101处理的组中单核细胞和多形核细胞的浸润显著降低(分别为55％和65％)。如图13所示，对来自各组的肺切片上进行病理学染色，并示出炎症(H&E染色)和胶原沉积(Masson’s三色染色)的显著减少。

所进行的第三个体内模型是在CM101与近来被批准的对IPF的治疗(吡非尼酮)之间的比较。吡非尼酮(5-甲基-1-苯基吡啶-2[1H]-酮)是具有抗纤维化特性和一定的羟基清除剂特性的小分子，由于其被表明减慢患有IPF的患者的疾病进展，已经被FDA和EMA批准用于IPF的治疗。

如在之前的实验中描述的诱导IPF。在BLM注射之前，对小鼠腹膜内注射100μgCM101或每天喂食100mg/kg/天的吡非尼酮。抗体注射每周进行三次，持续两周，而吡非尼酮口腔喂食每天进行，持续两周。

如图14和15所示，在所有测试参数方面CM101胜过吡非尼酮。与用吡非尼酮处理的小鼠相比，CM101处理的小鼠中的肺胶原浓度下降更剧烈。另外，对鼠支气管肺泡灌洗(BAL)液中单核细胞、白细胞(WBC)和多形核细胞的测量揭示了与吡非尼酮处理的组相对的CM101处理的组中的显著下降(图15)。组织学染色通过示出与吡非尼酮处理的组相比，从CM101处理的组获得的肺部病灶中的炎症和纤维化更少而支持这些结果(数据未示出)。

实施例3产生人源化的mAb hCM101

将来自鼠抗体CM101的可变(V)区的基因克隆进Antitope载体以产生包含鼠V区与人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区的组合的嵌合抗体。鼠CM101抗体的VH和Vκ序列是使用以下引物来进行PCR扩增的，所述引物引入了侧翼限制酶位点以用于克隆入Antitope的IgG1VH和Vκ链表达载体中。利用MluI和HindIII位点克隆VH区，并且利用BssHII和BamHI限制性位点克隆Vκ区。两个构建体都通过DNA测序确定。另外，设计以下的一系列的IgG1的4个人源化的VH区以及4个人Vκ区，并利用Composite Human Antibody^TM技术(Antitope)构建。

嵌合抗体、以及人源化的V区基因的组合(共16种抗体)在NS0细胞中表达、纯化并在竞争ELISA测定中测试与人嗜酸粒细胞趋化因子-2的结合。该结合数据用于相比于嵌合CM101抗体对人源化的CM101变体排名。通过SDS PAGE检测到重链和轻链条带的特性(quality)没有显著差异(数据未示出)。

基于结合数据，选择人源化的变体VH1/VK3(hCM101)作为待在功能性测定中测试的先导化合物(lead compound)。

VH1/VK3序列：

SEQ ID NO:1:

CM101_VH1_DNA

SEQ ID NO：2：

CM101_VK3_DNA

*CDR核苷酸序列为粗体并加下划线的。

SEQ ID NO：3：

CM101_VH1_蛋白序列

QlQLVQSGPELKKPGASVKVSCRASGYPFTNSGMNWVKQAPGKCLKWMCWINTYNGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLRNEDTATYFCASHSYGSSYAMDNWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO：4：

＞CMM01_VK3_蛋白序列

DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNLKSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEEPWTFGGGTKVEIV

本文将上述VH变体1(重链或VH)的核酸序列定义为SEQ ID NO：1。

本文将上述VK变体3(轻链)的核酸序列定义为SEQ ID NO：2。

本文将上述VH变体1(重链或VH，113个氨基酸)的氨基酸序列定义为SEQ ID NO：3。

本文将上述VK变体3(轻链，107个氨基酸)的氨基酸序列定义为SEQ ID NO：4。

VH变体1(重链)包括三个互补决定区(CDR)：

VH CDR1具有氨基酸序列NSGMN(SEQ ID NO：5)。

VH CDR2具有氨基酸序列WINTYNGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO：6)。

VH CDR3具有氨基酸序列HSYGSSYAMDN(SEQ ID NO：7)。

VK变体3(轻链)包括三个互补决定区(CDR)：

VK CDR1具有氨基酸序列KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：8)。

VK CDR2具有氨基酸序列VASNLKS(SEQ ID NO：9)。

VK CDR3具有氨基酸序列QQSNEEPWT(SEQ ID NO：10)。

实施例4hCM101的亲和力和结合特异性

为了检验hCM101与嗜酸粒细胞趋化因子-2以及与其他相关趋化因子的结合亲和力，采用几种不同的方法：Elisa、Biacore和通过CHIP的表位定位。该抗体与嗜酸粒细胞趋化因子2的可观的结合由Biacore(图16)和Elisa示出，示出了3X10^-9M的亲和常数。

令人惊讶的是，发现hCM101也以中等的亲和力与其它相关趋化因子结合。如Elisa所示，发现hCM101结合嗜酸粒细胞趋化因子1(图17)、RANTES(图18)和MCP3(图19)。

表位定位分析揭示了这四种趋化因子之间的共同特征。似乎嗜酸粒细胞趋化因子1、2、Rantes和MCP-3示出位于N环区内的表位位点(图20)。该共同的结合位点的特征在于在大约相同位置的高浓度带正电残基(图21)。

如Elisa所示，这些结果表明hCM101是以高亲和力结合嗜酸粒细胞趋化因子2并且结合其它相关趋化因子的多特异性抗体。不期望受到理论的束缚，该特征可允许hCM101克服趋化因子的冗余性并达到功效。

为了评价hCM101的体外结合特异性，用完全人源化的CM101(hCM101)抗体在来自系统性硬化病患者的代表性血清中进行了循环中的嗜酸粒细胞趋化因子2的拉下。我们发现了通过hCM101对嗜酸粒细胞趋化因子2的剂量依赖性识别。

这一结果表明hCM101对血清内的嗜酸粒细胞趋化因子2的高特异性(图22)。

此外，使用硝基纤维素膜电泳测定，将递增浓度的嗜酸粒细胞趋化因子1、Rantes和MCP-3暴露于hCM101。发现了提高hCM101与这些趋化因子的特异性的剂量增加性结合(图23)。

实施例5利用hCM101的功能性测定

嗜酸粒细胞趋化因子1和嗜酸粒细胞趋化因子2是通过CCR3的结合和活化而参与将嗜酸粒细胞募集到组织中的趋化因子。

为了研究hCM101的潜在的抗迁移功能，在37℃下将该抗体与这些趋化因子孵育30分钟并检查嗜酸粒细胞的趋化性。结果示出了hCM101对嗜酸粒细胞的显著的剂量依赖性抑制作用。在10^-7至10^-8M抗体处理中分别观察到16％至45％的细胞迁移(图24)，pv≤0.05。

已知单核细胞谱系的细胞因其与CCR 1、2、3、5受体结合而成为RANTES和MCP-3的主要靶标。因此，通过将hCM101与MCP-3和RANTES孵育来检验该抗体对U937单核细胞系迁移的影响。单核细胞的趋化性被显著减弱，显示在10^-7M浓度的hCM101下仅有26％的迁移(图25)。

另外，使用分离的人单核细胞及其相关化学诱导剂进行体外单核细胞趋化性测定。

为此目的，在有或无不同剂量的hCM101情况下，允许从硬皮病患者获得的PBMC中分选的CD14+单核细胞朝向作为诱导剂的人MCP-3和RANTES迁移。在高剂量下用hCM101处理将单核细胞的趋化性显著减弱了～55％(图26A)。

对于CD14阴性细胞(主要是淋巴细胞)朝向嗜酸粒细胞趋化因子1、2和Rantes的迁移进行了类似的实验。发现对于高剂量的hCM101，该抗体显著降低了大约90％(图26B)。

硬皮病和IPF是这样的纤维化疾病，其显著特征为纤维原细胞的增殖和迁移。为了检验hCM101对纤维原细胞迁移的影响，在hCM101存在或不存在的情况下进行朝向嗜酸粒细胞趋化因子2的趋化性检验。当加入hCM101时，观察到迁移的显著减少，因为与对照相比，仅9％的细胞黏附在transwell上(图27)。探寻hCM101对嗜酸粒细胞趋化因子-1的影响表现出对纤维原细胞迁移的60％的抑制(图28)。

纤维原细胞向成肌纤维细胞的转变通过升高的平滑肌肌动蛋白的表达反映。

纤维原细胞向成肌纤维细胞的转变涉及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，并且是纤维化中的一个重要程序。它们的出现可通过细胞因子和趋化因子在血清中的存在而诱导。为了评价hCM-101对纤维原细胞向成肌纤维细胞的转变的影响，将hCM-101与来自SSc患者的血清孵育，然后将这些血清与人纤维原细胞孵育来测量它们诱导α-SMA的能力。通过流式细胞术评价α-SMA表达。如图30所示，当血清与CM-101(10μg/ml)孵育时，α-SMA的升高被减弱了50％。这些结果表明，CM-101减弱了由来自系统性硬化病(SSc)患者的血清刺激的纤维原细胞向成肌纤维细胞的转变。该转变是表征SSc的细胞外基质(ECM)的过量合成和重建的原因。

趋化因子的活化效力通常是通过进入细胞溶质的钙摄入来测量的。如图30所示，表达CCR3的细胞与嗜酸粒细胞趋化因子-2以及不同浓度的hCM-101的孵育表明钙摄入(代表细胞活化)的显著下降。

实施例6如在Episcreen免疫原性测试中测量的，hCM101无免疫原性

为了确定免疫原性的相对风险，利用EpiScreen^TM时程T细胞测定(EpiScreen^TMtime course T cell assay)，测试针对一组20个健康供体的前导性完全人源化的抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2抗体(hCM101)。基于表明50μg/ml hCM101的饱和浓度足以刺激可检测的抗体特异性T细胞反应的先前研究，在50μg/ml hCM101的终浓度下测试样品。为了评价每个样本的免疫原性潜力，伴随增殖分析使用了EpiScreen^TM时程T细胞测定以测量T细胞的活化。

图31示出了在整个时程期间，对hCM101的供体SI反应。在增殖测定的任意供体中使用SI≥2.0、p<0.05的阈值，完全人源化的抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2抗体未诱导阳性反应。

使用一系列生物制剂的前述EpiScreen^TM时程T细胞测定已经示出了在EpiScreen^TM测定中供体T细胞反应的百分比与临床观察到的免疫原性(抗-蛋白质治疗性抗体反应)水平之间的明显关联。在EpiScreen^TM检验中，观察到对于免疫原性抗体诸如Campath的高频率供体反应，而对于非免疫原性抗体诸如索雷尔(Xolair)和赫赛汀观察到相对低频率的供体反应。一般来说，在EpiScreen^TM测定中诱导<10％阳性反应的蛋白治疗剂与临床中的低风险免疫原性相关。目前的研究表明，与在EpiScreen^TM测定中测试的其他蛋白治疗剂相比(图32)，完全人源化的抗-嗜酸粒细胞趋化因子-2抗体hCM101落入与索雷尔、赫赛汀和阿伐斯汀相同的范围，并且将被认为具有低风险的免疫原性。

参考文献

1.Goodnow CC等,Cellular and genetic mechanisms of self tolerance andautoimmunity.Nature 2005；2；435(7042):590-7.

2.Jose PJ,Griffiths-Johnson DA,Collins PD等,Eotaxin:a potenteosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model ofallergic airways inflammation,J Exp Med 1994；179:881–887.

3.Kitaura M,Nakajima T,Imai T,等,Molecular cloning of human eotaxin,an eosinophil-selective CC chemokine,and identification of a specificeosinophil eotaxin receptor,CC chemokine receptor 3,J Biol Chem 1996；271:7725–7730.

4.Ponath PD,Qin S,Ringler DJ,等,Cloning of the human eosinophilchemoattractant,eotaxin.Expression,receptor binding,and functional propertiessuggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils.J ClinInvest 1996；97:604–612.

5.Bocchino V,Bertorelli G,Bertrand CP,等,Eotaxin and CCR3 are up–regulated in exacerbations of chronic bronchitis,Allergy 2002；57:17–22.

6.Fulkerson PC等,Targeting eosinophils in allergy,inflammation andbeyond；Nat Rev Drug Discov.2013Feb；12(2):117-29.

7.Amerio.p等,Eotaxins and CCR3receptor in inflammatory and allergicskin diseases:therapeutical implications.Curr Drug Targets InflammAllergy.2003；2(1):81-94.

8.Pope SM等,The eotaxin chemokines and CCR3 are fundamentalregulators of allergen-induced pulmonary eosinophilia.J Immunol.2005 15；175(8):5341-50.

9.Ablin,JN.Protective effect of eotaxin-2inhibition in adjuvant-induced arthritis.Clin Exp Immunol.2010；161(2):276-83.

10.Mausner等,Eotaxin-2blockade ameliorates experimental autoimmuneencephalomyelitis World J Immunol 2013 27；3(1):7-14

11.Gu YS等,The immunobiology of systemic sclerosis.Semin ArthritisRheum.2008Oct；38(2):132-60.

12.Bhattacharyya S等.Understanding fibrosis in systemic sclerosis:shifting paradigms,emerging opportunities Nat Rev Rheumatol.2011 Oct 25；8(1):42-54.

13.Dulkys Y等.Detection of mRNA for eotaxin-2and eotaxin-3in humandermal fibroblasts and their distinct activation profile on humaneosinophils.J Invest Dermatol.2001.

14.Huaux等.Role of Eotaxin-1(CCL11)and CC chemokine receptor 3(CCR3)in bleomycin-induced lung injury and fibrosis.Am J Pathol.2005；167(6):1485-96.

15.Martin Kohan等.Eotaxin-2/CCL24and eotaxin-3/CCL26 exertdifferential profibrogenic effects on humanlung fibroblasts.

16.Baggiolini,M.等Eotaxin:a VIC(very important chemokine)of allergicinflammation？1996J.Clin.Invest.97:587.

17.Baggiolini,M.,B.等Human chemokines:an update.1997,Annu.Rev.Immunol.15:675–705.

18.Noble P.W.,Barkauskas C.E.,Jiang D.等:Pulmonary fibrosis:patternsand perpetrators.J Clin Invest 2012；122:2756-2762.

19.Maher T.M.:Beyond the diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis:the growing role of systems biology and stratified medicine.Curr Opin PulmMed 2013；19:460-465.

20.Shimbori C.,Gauldie J.,Kolb M.等:Extracellular matrixmicroenvironment contributes actively to pulmonary fibrosis.Curr Opin PulmMed 2013；19:446-452.

21.Raghu G,Collard HR,Egan JJ,Martinez FJ,Behr J,Brown KK,等.Anofficial ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidence-based guidelines for diagnosis and management.Am J Respir Crit Care Med 2011；183(6):788-824.

22.Maher TM.Pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis.Drugs Today2010；46(7):473-482.

23.Bouros D.Pirfenidone for idiopathic pulmonary fibrosis.Lancet2011；377(9779):1727-1729.

24.Taniguchi H,Ebina M,Kondoh Y,Ogura T,Azuma A,Suga M,等.Pirfenidonein idiopathic pulmonary fibrosis.Eur Respir J 2010；35(4):821-829.

Claims

1.一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，所述分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段与至少两种CCR3-结合趋化因子结合而在纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关病患或过敏性特异反应性疾患的治疗中使用。

2.如权利要求1所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述单克隆抗体为嵌合抗体、人抗体、人源化的抗体或完全人源化的抗体。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述分离的多特异性抗体的抗原结合片段选自由以下组成的组：Fv、单链Fv(scFv)、能够结合抗原的重链可变区、能够结合抗原的轻链可变区、Fab、F(ab)₂′以及它们的任意组合。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述纤维化疾病选自由硬皮病、特发性肺纤维化(IPF)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾小球硬化症、肝硬化和代谢综合征组成的组。

6.如前述权利要求中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述自身免疫性炎性疾患选自由以下组成的组：系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、牛皮癣、结肠炎、葡萄膜炎、多发性硬化症和I型糖尿病。

7.如权利要求1-4中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述单核细胞相关疾患为动脉粥样硬化。

8.如权利要求1-4中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述过敏性特异反应性疾患症选自由哮喘、特应性皮炎、荨麻疹和超敏反应组成的组。

9.如前述权利要求中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述至少两种CCR3-结合趋化因子选自由嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Rantes和MCP-3组成的组。

10.如权利要求9所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述抗体结合嗜酸粒细胞趋化因子1、嗜酸粒细胞趋化因子-2、Rantes和MCP-3。

11.如前述权利要求中任一项所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述抗体减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性。

12.如权利要求1所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述抗体为包含重链可变区和轻链可变区的完全人源化的抗体，所述重链可变区包含：

所述轻链可变区包含：

13.如权利要求1所述的用于使用的分离的多特异性抗体，其中所述抗体是完全人源化的抗体，所述完全人源化的抗体包含由SEQ ID NO:3或其变体表示的重链可变区以及由SEQID NO:4或其变体表示的轻链可变区。

14.一种分离的抗体，所述分离的抗体与CCR3-结合趋化因子的N环区的构象表位结合，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。

15.如权利要求14所述的分离的多特异性抗体，其中所述构象表位在所述CCR3结合趋化因子的氨基酸序列中氨基酸位置14和24之间包含至少3个带正电氨基酸残基。

16.如权利要求14或权利要求15所述的分离的多特异性抗体，其中所述带正电氨基酸残基选自由Arg、Lys和His组成的组。

17.如权利要求14-16中任一项所述的分离的多特异性抗体，其中所述构象表位包含选自以下的氨基酸序列：由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQID NO:19表示的氨基酸序列。

18.一种分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段，所述分离的多特异性抗体或其任意抗原结合片段与至少两种CCR3-结合趋化因子结合，其中所述抗体为完全人源化的抗体并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含：

所述轻链可变区包含：

d)互补决定区VKCDR1，包含由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列或其变体；

e)互补决定区VKCDR2，包含由SEQ ID NO.9表示的氨基酸序列或其变体；和

19.一种编码如前述权利要求中任一项所述的抗体的核酸分子。

20.一种核酸分子，所述核酸分子编码与至少两种CCR3-结合趋化因子结合的人源化的抗体，其中所述核酸分子包含由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2表示的序列。

21.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求19或20中任一项所述的核酸分子。

22.一种包含如权利要求21所述的核酸分子的宿主细胞。

23.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-18中任一项所述的抗体和药学可接受的载体。

24.如权利要求23所述的药物组合物，用于治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患。

25.一种治疗纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关疾患或过敏性特异反应性疾患的方法，包括向需要其的患者施用治疗可接受量的如权利要求1-18中任一项所述的抗体或如权利要求23所述的药物组合物。

26.一种在纤维化疾病、自身免疫性炎性疾患、单核细胞相关病症或过敏性特异反应性疾患中减弱表达CCR3、CCR1、CCR2和CCR5的细胞的迁移特性的方法，包括向患有一种所述疾病的患者施用治疗可接受量的如权利要求1-18中任一项所述的抗体或如权利要求23所述的药物组合物。

27.一种筛选和鉴定能够减弱表达CCR3、CCR1、CCR2或CCR5中的至少一者的细胞迁移特性的抗体的方法，所述方法包括：

a.获得针对CCR3-结合趋化因子的抗体；以及

b.评价所述抗体与CCR3-结合趋化因子的N环区中的构象表位的结合，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基；

c.选择与所述构象表位结合的抗体；

28.如权利要求27所述的方法，其中所述构象表位包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。

29.一种包含构象表位的分离的CCR3-结合趋化因子的N环区，用于产生针对所述CCR3-结合趋化因子的抗体，其中所述构象表位的特征在于位于所述CCR3-结合趋化因子的氨基酸序列中的氨基酸位置14和24之间的相对高浓度的带正电氨基酸残基。

30.如权利要求29所述的分离的N环区，其中所述分离的N环区包含选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19表示的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。