CN115703835A - 一种抗人crr9单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN115703835A CN202110896378.4A CN202110896378A CN115703835A CN 115703835 A CN115703835 A CN 115703835A CN 202110896378 A CN202110896378 A CN 202110896378A CN 115703835 A CN115703835 A CN 115703835A
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陈明久
马志清
彭则羽
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Boaoxin Biotechnology Nanjing Co ltd
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Boaoxin Biotechnology Nanjing Co ltd
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种抗人CRR9单克隆抗体及其制备方法和应用,同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法,还提供了包含本发明抗体的药物组合物及用途。本发明的抗人CRR9单克隆抗体具有高亲和力,具有较好的CRR9‑GRP78阻断活性,同时对肺癌细胞具有杀伤作用。

Description

一种抗人CRR9单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种抗人CRR9的单克隆抗体或抗体片段及其制备方法和应用,还涉及该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法。
背景技术
CRR9蛋白(英文全称:Cisplatin Resistance-Related Protein 9,中文全称:顺铂耐药相关蛋白9),别名CLPTM1L(Cleft Lip And Palate Transmembrane Protein 1-Like Protein)。人CRR9蛋白(Uniprot蛋白质数据库编号是Q96KA5,https://www.uniprot.org/uniprot/Q96KA5)是一种具六次跨膜、全长为538个氨基酸组成的多跨膜型蛋白质,其蛋白的N端和C端都位于细胞质内,蛋白中有3段(分别为32-284位氨基酸,343-346位氨基酸,424-428位氨基酸)位于细胞膜外,其中位于细胞膜外的肽段从32位到284位是由253氨基酸组成的该蛋白最大的胞外结构。
顺铂(Cisplatin),也称顺-二氯二氨基铂(II)(cis-Diammineplatinum(II)dichloride),CAS NO.15663-27-1,是一种基于铂结构的强效抗肿瘤药物,一种烷化剂,与DNA形成细胞毒性加合物,诱导链内和链间交联,阻断DNA复制和转录,最终引起凋亡。顺铂是最常用的化疗药物之一,目前临床上用来治疗多种癌症类型如睾丸癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、膀胱癌、胃癌和其他恶性肿瘤。但顺铂常常出现固有耐药或者在治疗过程中获得耐药的现象,成为许多肿瘤患者治疗失败的原因。为此,解决铂类耐药是医学界迫切需要解决的重大课题之一。研究发现,对顺铂耐药主要归因于三个分子机制:癌细胞增加了DNA修复能力,改变了细胞积累(如降低对铂类的细胞吸收和促进外排机制),增加铂类药物失活(Amable L.Pharmacol Res.2016Apr;106:27-36)。
CRR9最早是2001年由日本教授K Yamamoto在研究卵巢癌细胞对顺铂药物的抗性时发现的新基因,由于其与顺铂耐药密切相关,故命名为顺铂耐药相关蛋白9。人CRR9蛋白是一种具六次跨膜、全长为538个氨基酸组成的多跨膜型蛋白质,其蛋白的N端和C端都位于细胞质内,蛋白中有3段(分别为32-284位氨基酸,343-346位氨基酸,424-428位氨基酸)位于细胞膜外,其中位于细胞膜外的肽段从32位到284位是由253氨基酸组成的该蛋白最大的胞外结构。CRR9也被发现在人的肺癌组织中广泛高表达,且CRR9高表达和肺癌病人的存活预后呈负相关,另外,采用体外干预方式降低肺癌细胞系CRR9蛋白表达水平,可以阻碍肿瘤细胞的迁移和侵袭(Ni Z,et al.Cancer Biomark.2016;16(3):445-52)。
CRR9膜蛋白有望作为一个新的肺癌和卵巢癌治疗和诊断的靶标,通过靶向CRR9可以潜在提高肺癌和卵巢癌的治疗效果,同时可以减少癌症治疗上顺铂类化疗药物的耐药,大大改善治疗效果和延长癌症病人的生存期,但目前市场上还没有被开发的成熟的靶向CRR9的单克隆抗体。
因此,现阶段迫切需要开发一种靶向CRR9的高亲和力且具有较好阻断活性的单克隆抗体。
发明内容
本发明提供一种抗人CRR9单克隆抗体及其制备方法和应用,所述单克隆抗体与人CRR9亲和力较高,具有较好的CRR9-GRP78阻断活性,同时对肺癌细胞具有杀伤作用。
本发明提供的技术方案如下:
本发明提供了一种抗人CRR9单克隆抗体,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区;
所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3;
所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;
所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地,重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地,重链和轻链都包括恒定区,重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示;轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
优选地,所述的重链和轻链都还包括恒定区,该恒定区为鼠或人IgG的恒定区,优选为IgG1的恒定区。
本发明进一步提供了一种编码所述的抗人CRR9单克隆抗体的核苷酸分子。
优选地,所述核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12;
序列SEQ ID NO:11编码所述抗体的重链可变区;
序列SEQ ID NO:12编码所述抗体的轻链可变区。
本发明进一步提供了一种含有所述的核苷酸分子的表达载体。
本发明进一步提供了一种含有所述的表达载体的宿主细胞。
优选地,所述宿主细胞为真核细胞,优选为哺乳动物细胞。
本发明进一步提供了一种抗人CRR9单克隆抗体的制备方法,包含如下步骤:
(1)制备含有表达所述的抗人CRR9单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体;
(2)用步骤(1)得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养;
(3)分离纯化,获得抗人CRR9单克隆抗体。
本发明进一步提供了包括所述的抗人CRR9单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
进一步地,所述的药物组合物,包含治疗有效量的所述的抗人CRR9单克隆抗体,以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明进一步提供了所述的抗人CRR9单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地,所述肿瘤包括睾丸癌、头颈部癌、膀胱癌、胃癌、肺癌和卵巢癌。
有益效果
本发明的抗人CRR9单克隆抗体与人CRR9亲和力较高,具有较好的CRR9-GRP78阻断活性,同时对肺癌细胞具有杀伤作用。
附图说明
图1为捕获ELISA测定抗体对人CRR9蛋白的结合能力;
图2为流式细胞术测评抗体与表面表达人CRR9的A549细胞的结合;
图3为配体结合阻断ELISA,其中NC表示negative control即normal mouse IgG;
图4为抗CRR9单克隆抗体处理72h后A549细胞的相对活率柱状图。
具体实施方式
术语
“单克隆抗体”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物,而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,本文中,“结合亲和力”指反映抗体与抗原之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括现有技术已知以及本文中所描述的方法。
术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况时,意指在抗原结合蛋白之间竞争,其通过以下测定法来测定:在所述测定法中,待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CRR9或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括:结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白;和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白,所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和公开的,如冷泉港的抗体实验技术指南。如小鼠可以用人CRR9或其片段免疫,所得到的抗体能被复性、纯化,并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂,诸如包含CRR9抗体或其抗原结合片段的组合物,所述患者具有一种或多种疾病症状。通常,在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂,无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化,例如患者的疾病状态、年龄和体重,以及药物对患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法,可评价疾病症状是否已被减轻。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化:如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述CRR9抗体或其抗原结合片段与其他药学组分的混合物,其他药学组分如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。
实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗CRR9的小鼠单克隆抗体
1.1动物免疫
根据文献(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)中通用的方法免疫小鼠。以重组人CRR9蛋白(即human CRR9-TEV-Fc蛋白,内部制备,其中human CRR9蛋白序列选用Uniprot No.Q96KA5,32-284aa)作为免疫原。
为了增加免疫应答,首次免疫和增强免疫分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma,St.Louis,Mo.,USA)。简要地,用PBS配制人CRR9-TEV-Fc抗原蛋白溶液,加入需要量的福氏佐剂配制佐剂-抗原混合物,振荡混匀佐剂和蛋白抗原溶液,通过注射器互推充分乳化抗原形成稳定油包水的溶液,然后进行动物注射。根据血清效价测定结果,首次免疫后通常需要进行2到3次加强免疫后才能达到良好的免疫效果。选择血清效价高的免疫小鼠进行腹腔注射,终免后进行细胞融合。
1.2杂交瘤融合和筛选
细胞融合前,培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)处于对数生长期。根据Kohler G和Milstein C在“Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity,”Nature,256:495-497(1975)所述的方法,处死免疫后小鼠无菌环境取脾,并与骨髓瘤细胞融合。
融合的“杂交细胞”随后被分配到含有HAT的96孔细胞板培养基中。通常融合后7-10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后,收集各孔培养上清,以ELISA方法用重组人CRR9-TEV-Fc蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简单地说,ELISA板在4℃条件下用人CRR9-TEV-Fc蛋白包被过夜。用PBST(含0.05%的吐温20的PBS溶液)洗板4次,再用200μl/孔的封闭缓冲液(含5%脱脂奶粉的PBST)进行封闭。每孔加入稀释的小鼠免疫血清(用于测定小鼠血清效价)或杂交瘤上清,37℃孵育40分钟。再用PBST洗板4次后,用GAM(Fc)-HRP(Jackson ImmunoResearch,Cat#115-035-071)进行检测。再用PBST洗板4次后,加入100μl/孔的TMB(InnoReagents,Cat#TMB-S-002)显色底物,室温显色5到15分钟,而后用1M的硫酸溶液终止,测定450纳米处各孔的吸光值。挑出ELISA结合阳性的杂交瘤孔细胞,转移到24孔板中,继续培养。
将产生高特异性结合人CRR9且具有CRR9/GRP78配体阻断活性抗体的杂交瘤克隆通过有限稀释法亚克隆,以确保细胞系的克隆性,然后进行小鼠单克隆抗体的制备和纯化。
实施例2小鼠抗CRR9单克隆抗体的结合活性研究
将实施例1中杂交瘤克隆产生的小鼠抗CRR9单克隆抗体(mAbs)进一步用以下方法测试其结合活性。
2.1基于捕获ELISA测定抗体的结合能力
96-孔ELISA板用PBS配制的终浓度为2μg/ml的GAM(Fc)(JacksonImmunoResearch,Cat#115-006-071,100μl/孔)进行包被,37℃孵育至少2h。ELISA板用PBST清洗4次,然后加入200μl/孔的5%w/v的脱脂奶粉PBST缓冲液进行封闭,于37℃孵育40min。用PBST洗板4次后,并用100μl/孔不同浓度(连续5倍稀释)的CRR9鼠单克隆抗体于37℃孵育40分钟,然后再洗板4次。将含有捕获CRR9抗体的酶标板与生物素标记的人CRR9-TEV-Fc蛋白(0.2ug/ml)100μl/孔在37℃下孵育40分钟,再用PBST洗板4次,并用二抗SA-HRP(JacksonImmunoResearch,Cat#016-030-084)于37℃孵育40分钟。最后,加入100μl/孔ELISA底物TMB,15分钟内用50μl/孔1M H2SO4在25℃下终止反应,并测定450nm处的吸收值,测定结果见表1和图1。
表1和图1的结果表明,本发明的抗体A1C3G3B2对人CRR9蛋白具有较好的结合能力。
2.2用流式细胞术(FACS)测定CRR9单克隆抗体与表面表达人CRR9的A549细胞系的结合
从细胞培养瓶中收集表面表达人CRR9的肺癌细胞系A549,洗两次,并用FACS缓冲液(含有2%v/v胎牛血清的PBS磷酸盐缓冲液)重悬。96孔板中每孔的2×l05个细胞与含不同浓度CRR9抗体的FACS缓冲液置于冰上孵育40分钟。用FACS缓冲液洗细胞3次,并继续添加100μL/孔的R-Phycoerythrin亲和纯化F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG特异性F(ab')2片段(用FACS缓冲液按1:1000进行稀释,Jackson Immunoresearch,cat#115-116-072)二抗。4℃避光孵育40分钟后,洗细胞3次,然后用FACS缓冲液重悬。使用Becton Dickinson FACS CantoII-HTS设备进行荧光测量。使用Graphpad Prism软件分析数据,得出抗体结合细胞的曲线,测定结果见图2。
图2结果表明,本发明的抗体A1C3G3B2与表面表达人CRR9的A549细胞的结合能力较强。
表1.小鼠抗CRR9抗体的结合活性
Figure BDA0003198029000000081
实施例3小鼠抗CRR9单克隆抗体对CRR9-GRP78相互作用的竞争性功能阻断能力
配体阻断ELISA,采用竞争ELISA检测抗体对CRR9-GRP78相互作用的阻断能力。有研究表明(William R Clarke et al.Int J Cancer.2019Mar15;144(6):1367-1378.)CRR9蛋白的胞外结构域与膜表面的GRP78蛋白相互作用,进而激活了细胞内的存活信号,CRR9/GRP78这一通路可能参与了癌细胞CRR9介导的化疗药物抗性,为此阻断CRR9/GRP78相互作用的抗体,可具有抑制癌细胞增殖的功能活性。简单地说,用人GRP78-his蛋白(内部表达,其中人的GRP78序列选择Uniprot No.P11021,19-654aa)以200ng/孔添加于96孔微板上,并于4℃孵育过夜。然后PBST清洗平板,用含5%w/v脱脂奶粉的PBST,于37℃封闭2h。再用PBST洗板4次。
用生物素标记的人CRR9-TEV-Fc(固定浓度0.2ug/ml)的缓冲液稀释CRR9抗体(抗体从66.7nM开始,连续5倍稀释),室温孵育40分钟,然后将抗体/CRR9-生物素混合物加入GRP78包覆的平板,于37℃孵育40分钟后,用PBST洗板4次。然后加入二抗SA-HRP(JacksonImmunoResearch,Cat#016-030-084),于37℃孵育40分钟,再用PBST洗板4次。最后,加入TMB,用1M H2SO4终止反应,测定450nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析,得出IC50值,具体结果见表2和图3。
由表2和图3可以看出,本发明的抗体A1C3G3B2能够阻断人CRR9-GRP78相互作用,并且具有较好的CRR9-GRP78阻断活性。
表2.抗CRR9抗体阻断CRR9-GRP78相互作用的能力
Figure BDA0003198029000000082
Figure BDA0003198029000000091
实施例4抗CRR9单克隆抗体对肺癌细胞的杀伤作用
为了验证抗CRR9单克隆抗体具有肿瘤细胞生长的抑制作用,使用A549细胞进行实验。实施例2显示了单克隆抗体A1C3G3B2能够检测到A549细胞表面CRR9的表达。用抗CRR9的拮抗剂型单克隆抗体A1C3G3B2处理A549细胞,观察在处理72h后A549细胞的相对活率,结果见图4。
图4结果表明,单克隆抗体A1C3G3B2能够抑制细胞增殖,呈现剂量依赖效应,即抗CRR9单克隆抗体对肺癌细胞具有杀伤作用。
实施例5DNA克隆及测序,抗CRR9抗体的序列分析
使用Trizol试剂(Invitrogen,catalog#15596-018)从实施例1的杂交瘤细胞中提取总RNA。
过程简述如下,离心收集5×106的细胞到1.5ml离心管中,吸干上清。添加1ml的Trizol试剂并反复吹打数次后25℃放置5分钟用于裂解细胞。紧接着,每管加入0.2ml的氯仿溶液,剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。而后,离心管4℃12000g离心10分钟,取出离心管,吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中,再加入0.4ml的异丙醇用于从水相中沉淀RNA。手动混匀EP管并放置25℃下10min后,4℃12000g离心10分钟,弃上清。加入1ml 75%的乙醇,再次4℃7500rpm离心5min,弃上清。管底RNA沉淀于室温干燥10分钟后,加入30到50ul的无菌DEPC处理水溶解RNA样品。
紧接着,选用Taraka的逆转录cDNA试剂盒(catalog#6110A)把总RNA变为cDNA。实验体系配制如下:5μl的总RNA+0.5μl Oligo(dT)+8.5μl RNase-free水(共14μl)先置于65度5min预变性,而后放冰上2分钟。进一步加入4μl的5×缓冲液+1μl的dNTP混合物+0.5μl的RNase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5μl体系),混匀,于40℃度孵育50分钟,然后70℃10min,完成cDNA合成。cDNA进一步在3’端加poly-G,反应体系配制如下:5μl的cDNA样品+33.5μl的ddH2O+5μl的10×TdT缓冲液+5μl的CoCl2+1μl的dGTP+0.5μl的末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul),于37℃孵育30分钟,然后70℃10min,完成poly-G加尾。
进一步,以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列,配制PCR反应体系:10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG1反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA 1μl+ddH2O 41μl。对于扩增抗体轻链可变区序列,配制PCR反应体系:10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG kappa链反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA1μl+ddH2O 41μl。抗体重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4,重复25个循环):
1)预变性95℃,5min;
2)变性95℃,20sec;
3)退火56℃,20sec;
4)延伸72℃,30sec;
5)保存25℃,60min。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,切出对应大小的DNA区段条带(VH约600bp,VK约500bp),用QIAquick的凝胶DNA回收试剂盒(catalog#28704)进行DNA的抽提。简述如下:凝胶称重,加3倍凝胶体积的QG缓冲液,而后50℃孵育10分钟直到凝胶完全溶解。加入1倍胶体积的异丙醇混匀后,样品移至QIA纯化柱,13000rpm离心1分钟。加入750μl的PE缓冲液到柱中,而后13000rpm离心1分钟。并再次13000rpm离心去除柱中液体残留。加入30μl水13000rpm离心1分钟进行洗脱,获得制备的DNA样品,纯化的PCR产物经测序获得抗体的可变区序列。
本发明克隆的序列信息见表3。
表3.抗人CRR9抗体的序列信息
Figure BDA0003198029000000101
Figure BDA0003198029000000111
VH的核苷酸序列SEQ ID NO:11
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAACTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAGCTGGGTGAGGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCAACACTGGAGAGCCAACATATGCTGAAGAGTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTTCAAGAGATTATTACTATGGTGGTAGAGGCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA;
VL的核苷酸序列SEQ ID NO:12
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCACCTCAATTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGCAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTTATAATCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAG。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍,但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后,对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此,本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 博奥信生物技术(南京)有限公司
<120> 一种抗人CRR9单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
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85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Tyr Tyr Tyr Gly Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ser Ala Thr Ser Ile Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Gln Trp Ser Tyr Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys
85 90 95
Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu
130 135 140
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro
145 150 155 160
Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala
165 170 175
Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val
180 185 190
Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe
195 200 205
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr
210 215 220
Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu
225 230 235 240
Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys
245 250 255
Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser
260 265 270
Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp
275 280 285
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser
290 295 300
Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly
305 310 315 320
Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 11
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgagctgggt gaggcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaacatat 180
gctgaagagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgttc aagagattat 300
tactatggtg gtagaggcta ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 12
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccacctc aattgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgca 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttataatc cgctcacgtt cggttctggg 300
accaagctgg agctgaag 318

Claims (10)

1.一种抗人CRR9单克隆抗体,其特征在于,所述抗体包含重链可变区和轻链可变区;
所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3;
所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;
所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;
所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;
所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示;
所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗人CRR9单克隆抗体,其特征在于,重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的一种抗人CRR9单克隆抗体,其特征在于,重链和轻链都包括恒定区,重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示;轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.一种核苷酸分子,其特征在于,所述核苷酸分子编码如权利要求1~3中任一项所述的抗人CRR9单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子,其特征在于,所述核苷酸分子的序列选自SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12;
序列SEQ ID NO:11编码所述抗体的重链可变区;
序列SEQ ID NO:12编码所述抗体的轻链可变区。
6.一种表达载体,其特征在于,该表达载体含有如权利要求4或5所述的核苷酸分子。
7.一种宿主细胞,其特征在于,该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1~3中任一项所述抗人CRR9单克隆抗体的制备方法,其特征在于,包含如下步骤:
制备含有表达如权利要求1~3任一项所述的抗人CRR9单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体;
将得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养;
分离纯化,获得抗人CRR9单克隆抗体。
9.包括如权利要求1~3中任一项所述的抗人CRR9单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。
10.如权利要求1~3中任一项所述的抗人CRR9单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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