CN115703834A - 一种抗人cd47单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗人CD47单克隆抗体及其制备方法和应用，同时提供了该抗体的编码核酸分子、表达载体、宿主细胞、以及用于表达该抗体的方法，还提供了包含本发明抗体的药物组合物及用途。本发明的抗人CD47单克隆抗体与人CD47亲和力较高，相较于现有抗人CD47单克隆抗体，具有较强的促肿瘤细胞吞噬作用。

Description

一种抗人CD47单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抗人CD47单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

CD47是一个分子量为50kD、广泛表达的膜表面受体，属于免疫球蛋白超家族成员。CD47具有一个V-型Ig-样胞外结构域和五次跨膜区以及短的胞内尾部；CD47可以结合多种蛋白，包括整合素、凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，TSP-1)，参与多种生理和病理过程，包括细胞迁移，T细胞和DC的激活以及轴突发育、细胞凋亡、增殖和炎症等。此外，CD47还可以结合信号调节蛋白α链(Signal-regulatory proteinα，SIRPα)。研究表明，在CD47-SIRPα信号通路中，CD47是一种“别吃我”(“don’t eat me”)信号，在机体正常生理状态下，可维持自身细胞的免疫耐受，而在病理状态下，CD47在多种血液系统恶性肿瘤和实体瘤细胞表面上高表达，通过与吞噬细胞(巨噬细胞、树突状细胞等)上的SIRPα受体结合进而启动一系列抑制性信号，这些抑制性信号可以转导到吞噬细胞内部，最终使吞噬细胞的吞噬功能消失，不能吞噬消除恶性增殖的细胞。

近年来，在众多的免疫治疗方案中，CD47是一个非常热门的靶点。然而，目前已开发的抗人CD47单克隆抗体还存在亲和力较低、作用靶点如抗原表位不明确等问题。因此，亟需一种亲和力较高、具有较好阻断活性的治疗性候选CD47抗体。

发明内容

本发明的目的是为了解决以上现有技术的不足，提供一种一种抗人CD47单克隆抗体及其制备方法和应用，该单克隆抗体与人CD47具有较高亲和力，同时具有较强促肿瘤细胞吞噬作用。

本发明提供了一种抗人CD47单克隆抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

优选地，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

优选地，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

优选地，所述的重链和轻链都还包括恒定区，该恒定区为鼠或人IgG的恒定区，优选为IgG4的恒定区。

本发明进一步提供了一种编码上述抗人CD47单克隆抗体的核苷酸分子。

优选地，所述核苷酸分子的序列选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17；

序列SEQ ID NO：7编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：17编码所述的抗体的轻链可变区。

本发明进一步提供了一种含有所述的核苷酸分子的表达载体。

本发明进一步提供了一种含有所述的表达载体的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞。

本发明进一步提供了上述抗人CD47单克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：

(1)制备含有表达所述的抗人CD47单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

(2)用步骤(1)得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；

(3)分离纯化，获得抗人CD47单克隆抗体。

本发明进一步提供了包括上述抗人CD47单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

进一步地，所述的药物组合物，包含治疗有效量的所述的抗人CD47单克隆抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明进一步提供了所述的抗人CD47单克隆抗体在制备抗肿瘤药物或纤维化疾病的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为血液瘤或实体瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓母细胞白血病(AML)、卵巢癌、输卵管癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈部癌、胰腺癌、肺癌、胶质瘤和胶质母细胞瘤。

优选地，所述纤维化疾病包括心绞痛、骨关节炎、肺纤维化、哮喘和支气管炎。

有益效果：

本发明的抗人CD47单克隆抗体与人CD47具有较好的亲和力，同时相较于现有抗人CD47单克隆抗体，还具有较强的促肿瘤细胞吞噬作用和较好的CD47-SIRPα阻断活性。

附图说明

图1为捕获ELISA测定抗体对人CD47蛋白的结合能力；

图2为捕获ELISA测定抗体对食蟹猴CD47蛋白的结合能力；

图3为流式细胞术测评抗体与表面过表达人CD47的293F细胞的结合；

图4为配体结合阻断ELISA；

图5为参照抗体阻断ELISA。

具体实施方式

术语

“结合CD47”或“与CD47结合”，指能与人CD47相互作用。

“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本文的抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

“单克隆抗体”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，本文中，“结合亲和力”指反映抗体与抗原之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的方法。

术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD47或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。

生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和公开的，如冷泉港的抗体实验技术指南。如小鼠可以用人CD47或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含CD47抗体或其抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物对患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。

“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述CD47抗体或其抗原结合片段与其他药学组分的混合物，其他药学组分如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1通过融合杂交瘤技术获得特异性抗CD47的小鼠单克隆抗体

1.1动物免疫

根据文献中(E Harlow,D.Lane,Antibody:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)通用的方法免疫小鼠。以重组人CD47蛋白(Sino biological inc.，cat#12283-H02H)作为免疫原。

为了增加免疫应答，首次免疫和增强免疫分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(Sigma,St.Louis,Mo.，USA)。简单地说，佐剂-抗原混合物的制备首先使用旋涡法在小瓶中轻轻混合佐剂。从小瓶中取出所需量的佐剂，放入高压灭菌的1.5mL微型离心管中。抗原在PBS或浓度为0.5-1.0mg/ml的生理盐水中制备。将计算量的抗原与佐剂一起加入微离心管中，轻轻搅拌2分钟，重复乳化混匀形成油包水的溶液。然后将佐剂-抗原溶液吸入适当的注射器进行动物注射。每只动物进行免疫，然后根据抗血清滴度进行2～3次加强免疫。滴度好的动物在融合前通过腹腔注射进行终免。

1.2杂交瘤融合和筛选

细胞融合前，培养小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14,ATCC#CRL-1581)处于对数生长期。根据Kohler G和Milstein C在“Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity,”Nature,256:495-497(1975)所述的方法，处死免疫后小鼠无菌环境取脾，并与骨髓瘤细胞融合。

融合的“杂交细胞”随后被分配到含有HAT的96孔细胞板培养基中。通常融合后7-10天后显微镜下可观察到存活的杂交瘤细胞生长出来。细胞铺板两周后，收集各孔培养上清，以ELISA方法用重组人CD47-his蛋白抗原进行杂交瘤筛选。简单地说，ELISA板在4℃条件下用人CD47-his蛋白(ACRO biosystems,cat#CD7-H5227,2.0μg/ml in PBS)包被过夜。用PBST洗板4次，再用封闭缓冲液(含5％脱脂奶粉的PBST)进行封闭。每孔加入稀释的小鼠免疫血清(用于测定小鼠血清效价)或杂交瘤上清，37℃孵育40分钟。再用PBST洗板4次，用辣根过氧化物酶-山羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno research,cat#115-036-071)进行检测并测定450纳米处各孔的吸收值。然后选择分泌与人CD47-his结合抗体的阳性杂交瘤并转移到24孔板。

将产生高特异性结合人CD47且具有CD47/SIRPα配体阻断活性抗体的杂交瘤克隆通过有限稀释法亚克隆，以确保细胞系的克隆性，然后进行纯化。对杂交瘤克隆产生的具有高特异性细胞表面CD47 FACS结合和CD47/SIRPα配体阻断活性的抗体进行亚克隆，以确保细胞系的克隆性，然后纯化单克隆抗体。

实施例2使用BIACORE表面等离子体共振技术测定小鼠抗CD47单克隆抗体的亲和力

将实施例1中杂交瘤克隆产生的抗CD47小鼠单克隆抗体(mAbs)通过Biacore T200系统(GE healthcare,Pittsburgh,PA,USA)进行亲和力动力学表征测定。

简单地说，山羊抗小鼠IgG通过伯胺共价连接到CM5芯片(羧基甲基葡聚糖包被芯片)，使用Biacore提供的标准胺偶联试剂盒。生物传感器表面未反应的部分被乙醇胺封闭。纯化实施例1中产生的小鼠抗CD47抗体，并将参照抗体CC-9000(Celgene)和Hu5F9-G4(Forty Seven)以66.7nM的浓度，10μL/min的流速流到芯片上。然后，将HBS EP缓冲液(Biacore提供)中的重组人CD47-his蛋白(Acro biosystems,cat#CD7-H5227,MW:15.6kDa)或食蟹猴CD47-his蛋白(Acro biosystems,cat#CD7-C52H1,MW:15.8kDa)以30μL/min的流速流到芯片上。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用BIA评价软件拟合出结合与解离为1:1的Langmuir binding model曲线。

其中k_a,k_d和K_D的值见表1。

表1.Biacore测定小鼠抗CD47单克隆抗体结合人或食蟹猴CD47的动力学参数

本发明的单克隆抗体1A5与人CD47的结合K_D值和参照抗体相似水平，表明其对人CD47具有高亲和力。

实施例3小鼠抗CD47单克隆抗体的结合活性研究

将实施例1中杂交瘤克隆产生的小鼠抗CD47单克隆抗体(mAbs)进一步用以下方法测试其结合活性。

3.1基于捕获ELSIA测定抗体的结合能力

96-孔ELISA板用PBS配制的终浓度为2μg/ml的山羊抗小鼠IgG Fcγ片段特异性抗体(Jackson immuno Research，#115-006-071，100μl/孔)进行包被，并于4℃孵育过夜。ELISA板用洗脱缓冲液(PBS+0.05％v/v吐温-20,PBST)清洗4次，然后加入200μl/孔的5％w/v的脱脂奶粉PBST缓冲液置于37℃封闭2小时。再次清洗平板，并用100μl/孔不同浓度的CD47鼠单克隆抗体于37℃孵育40分钟，然后再洗板4次。将含有捕获CD47抗体的酶标板与生物素标记的人CD47蛋白(ACRO Biosystems，cat#CD7-H5227)或猴CYNO-CD47-HIS-BIO(ACROBiosystems，cat No.#CD7-C52H1)(60nM,2.5％脱脂奶粉PBST缓冲液，100μl/孔)在37℃下孵育40分钟，再洗板4次，并用链霉亲和素结合的辣根过氧化物酶(用PBST进行1:10000的稀释,Jackson Immuno Research，#016-030-084,100μl/孔)于37℃孵育40分钟。终洗后，用100μl/孔ELISA底物TMB(Innoreagents，#TMB-S-002)孵育平板。15分钟内用50μl/孔1MH₂SO₄在25℃下终止反应，并测定450nm处的吸收值，测定结果见图1-2和表2。

图1和图2结果表明，本发明的抗体1A5对人和食蟹猴CD47蛋白都具有较好的结合能力。

3.2用流式细胞术(FACS)测定CD47单克隆抗体与表面过表达人CD47的293F细胞系的结合

从细胞培养瓶中收集表面过表达人CD47的稳定细胞系293F，洗两次，并用含有2％v/v胎牛血清的PBS磷酸盐缓冲液(FACS缓冲液)重悬。96孔板中每孔的2×l0⁵个细胞与含不同浓度CD47抗体的FACS缓冲液置于冰上孵育40分钟。用FACS缓冲液洗细胞3次，并继续添加100μL/孔的R-Phycoerythrin亲和纯化F(ab')₂片段山羊抗小鼠IgG特异性F(ab')₂片段(用FACS缓冲液按1:1000进行稀释，Jackson Immunoresearch,cat#115-116-072)二抗。4℃避光孵育40分钟后，洗细胞3次，然后用FACS缓冲液重悬。使用Becton Dickinson FACS CantoII-HTS设备进行荧光测量。使用Graphpad Prism软件分析数据，得出抗体结合细胞的EC₅₀浓度值，即CD47抗体与过表达CD47的细胞达到最大荧光结合信号50％时对应的抗体浓度值，测定结果见图3和表2。

图3结果表明，本发明的抗体1A5与表面过表达人CD47的293F细胞的结合能力更强。

表2.小鼠抗CD47抗体的结合活性

实施例4小鼠抗CD47单克隆抗体对CD47-SIRPα相互作用的竞争性功能阻断能力

采用竞争ELISA检测抗体对CD47-SIRPα相互作用的阻断能力。

4.1配体阻断ELISA

使用竞争ELISA检测本发明的抗CD47抗体对CD47-SIRPα相互作用的阻断能力。简单地说，用人SIRPα-his蛋白(Sino biological inc.,cat#11612-H08H)以200ng/孔添加于96孔微板上，并于4℃孵育过夜。第二天，用清洗缓冲液(PBS+0.05％吐温-20,PBST)清洗平板，再用含5％w/v脱脂奶粉的PBST在37℃下封闭2小时。然后再用清洗缓冲液清洗平板。

用人CD47-生物素(ACRO biosystems,cat#CD7-H5227)溶液稀释CD47抗体或参照抗体(抗体从66.7nM开始，连续4倍稀释)，室温孵育40分钟，然后将抗体/CD47-生物素混合物加入SIRPα-包覆的平板。于37℃孵育40分钟后，用清洗缓冲液洗板4次。然后加入链霉亲和素结合的HRP，于37℃孵育40分钟，检测生物素标记的人CD47与底板SIRPα的结合。再用清洗缓冲液洗板。最后，加入TMB，用1M H₂SO₄终止反应，测定450nm处的吸收值。使用GraphpadPrism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值，具体结果见图4和表3。

4.2参照抗体阻断ELISA

本发明的抗CD47抗体阻断参照抗体(Hu5F9-G4,Forty Seven)-人CD47蛋白结合的能力，采用竞争ELISA法测定。简单地说，CD47参照抗体用含1μg/mL的PBS包被于96孔微板上，并于4℃孵育过夜。第二天，用清洗缓冲液清洗平板，用含5％脱脂奶粉的PBST在37℃下封闭2小时。阻断时，将生物素标记的人CD47(ACRO biosystems,cat#CD7-H5227)(10nM，含2.5％脱脂奶粉的PBST)与抗体混合(1.2pM-100nM，连续5倍稀释)，然后在25℃下孵育40分钟。洗板后，将抗体/人CD47-生物素混合物(100μl/孔)加入Hu5F9-G4平板，37℃孵育40分钟。用清洗缓冲液再次洗板，加入100μl/孔的SA-HRP，然后37℃孵育40分钟，检测结合于平板的生物素标记的人CD47。用清洗缓冲液进行终洗。加入TMB，用1M H₂SO₄终止反应，测定450nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出IC₅₀值，具体结果见图5和表3。

由表3可以看出，本发明的抗体能够阻断人CD47-SIRPα相互作用，同时表明本发明的抗体具有与参照抗体相似的抗原结合表位。与参照抗体相比，本发明的抗体1A5具有较好的CD47-SIRPα阻断活性。

表3.抗CD47抗体阻断CD47-SIRPα和CD47参照抗体相互作用的能力

实施例5小鼠抗CD47单克隆抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞

采用体外细胞实验检测抗CD47抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的生物活性。采用Ficoll(GE Healthcare,17-1440-02)从人新鲜血液中提取人外周血单个核细胞(PBMC)。为了将PBMC分化为单核来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages，MDM)，单核细胞在人M-CSF存在下接种RPMI 1640+10％FBS+1％青霉素-链霉素(Peprotech,300-25-100)。在第2天和第4天，清洗细胞，更换新鲜的含有细胞因子的培养基。第6天，分离贴壁细胞，用PBS洗2次。

从板上分离MDMs，置于96孔板中过夜。收集Jurkat细胞用于CFSE(5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯)(Sigma,87444)标记。将抗CD47单抗进行相应稀释。向MDM中加入100uL CFSE标记的Jurkat肿瘤细胞和稀释后的CD47单抗混合物，37℃孵育4h。分离所有细胞，再用FACS缓冲液清洗一次。用抗人CD14 APC(eBioscience,17-0149-42)进行细胞染色，用流式细胞仪(FACS)检测CD14+CFSE+细胞。使用Graphpad Prism软件分析数据(CD14+CFSE+细胞的百分比)，得到EC₅₀值，测定结果见表4。

表4结果显示，本发明的抗体能够诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，其EC₅₀值低于两个参照抗体，显示出比参照抗体更强的促肿瘤细胞吞噬作用。

表4.抗CD47抗体诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力

实施例6DNA克隆及测序，抗CD47抗体的序列分析

使用Trizol试剂(Invitrogen,catalog#15596-018)从实施例1的杂交瘤细胞中提取总RNA。

过程简述如下，离心收集5×10⁶的细胞到1.5ml离心管中，吸干上清。添加1ml的Trizol试剂并反复吹打数次后25℃放置5分钟用于裂解细胞。紧接着，每管加入0.2ml的氯仿溶液，剧烈震荡15秒后室温放置3分钟。而后，离心管4℃12000g离心10分钟，取出离心管，吸取上层水相溶液到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml的异丙醇用于从水相中沉淀RNA。手动混匀EP管并放置25℃下10min后，4℃12000g离心10分钟，弃上清。加入1ml 75％的乙醇，再次4℃7500rpm离心5min，弃上清。管底RNA沉淀于室温干燥10分钟后，加入30到50ul的无菌DEPC处理水溶解RNA样品。

紧接着，选用Taraka的逆转录cDNA试剂盒(catalog#6110A)把总RNA变为cDNA。实验体系配制如下：5μl的总RNA+0.5μl Oligo(dT)+8.5μl RNase-free水(共14μl)先置于65度5min预变性，而后放冰上2分钟。进一步加入4μl的5×缓冲液+1μl的dNTP混合物+0.5μl的RNase抑制剂+1μl逆转录酶(总共20.5μl体系)，混匀，于40℃度孵育50分钟，然后70℃10min，完成cDNA合成。cDNA进一步在3’端加poly-G，反应体系配制如下：5μl的cDNA样品+33.5μl的ddH₂O+5μl的10×TdT缓冲液+5μl的CoCl₂+1μl的dGTP+0.5μl的末端脱氧核苷酸转移酶(总体积50ul)，于37℃孵育30分钟，然后70℃10min，完成poly-G加尾。

进一步，以加尾的cDNA为模板进行抗体可变区的基因扩增。对于扩增抗体重链可变区序列，配制PCR反应体系：10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG1反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA 1μl+ddH₂O 41μl。对于扩增抗体轻链可变区序列，配制PCR反应体系：10×Taq酶缓冲液5μl+通用poly C引物(正向引物)0.5μl+小鼠IgG kappa链反向引物0.5μl+dNTP 1μl+Taq聚合酶1μl+cDNA 1μl+ddH₂O 41μl。抗体重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复25个循环)：

1)预变性95℃，5min；

2)变性95℃，20sec；

3)退火56℃，20sec；

4)延伸72℃，30sec；

5)保存25℃，60min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH约600bp，VK约500bp)，用QIAquick的凝胶DNA回收试剂盒(catalog#28704)进行DNA的抽提。简述如下：凝胶称重，加3倍凝胶体积的QG缓冲液，而后50℃孵育10分钟直到凝胶完全溶解。加入1倍胶体积的异丙醇混匀后，样品移至QIA纯化柱，13000rpm离心1分钟。加入750μl的PE缓冲液到柱中，而后13000rpm离心1分钟。并再次13000rpm离心去除柱中液体残留。加入30μl水13000rpm离心1分钟进行洗脱，获得制备的DNA样品，纯化的PCR产物经测序获得抗体的可变区序列。

本发明克隆的序列信息见表5。

表5.抗CD47抗体的序列信息

NA:核苷酸；AA:氨基酸。

序列表

<110> 博奥信生物技术（南京）有限公司

<120> 一种抗人CD47单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcttcaaca ttaaagacta ctat 24

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attggtcctg aaaatggtga tact 24

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Gly Pro Glu Asn Gly Asp Thr

1 5

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgcggggg gacgaggggg gtttccttac 30

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asn Ala Gly Gly Arg Gly Gly Phe Pro Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcacgttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgaattgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attggtcctg aaaatggtga tactgaaaat 180

gacccgaggt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcctccaa cacagccttc 240

ctgcaactca gcagcctgac atctgaggac actgccttct attactgtaa tgcgggggga 300

cgaggggggt ttccttactg gggccagggg actctggtca ctgtctctac a 351

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Gly Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Asn Asp Pro Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Gly Gly Arg Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Thr

115

<210> 9

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcacgttg 60

tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgaattgggt gaagcagagg 120

cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attggtcctg aaaatggtga tactgaaaat 180

gacccgaggt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcctccaa cacagccttc 240

ctgcaactca gcagcctgac atctgaggac actgccttct attactgtaa tgcgggggga 300

cgaggggggt ttccttactg gggccagggg actctggtca ctgtctctac agccaaaacg 360

acacccccat ctgtctatcc actggcccct ggatctgctg cccaaactaa ctccatggtg 420

accctgggat gcctggtcaa gggctatttc cctgagccag tgacagtgac ctggaactct 480

ggatccctgt ccagcggtgt gcacaccttc ccagctgtcc tgcagtctga cctctacact 540

ctgagcagct cagtgactgt cccctccagc acctggccca gcgagaccgt cacctgcaac 600

gttgcccacc cggccagcag caccaaggtg gacaagaaaa ttgtgcccag ggattgtggt 660

tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 720

cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 780

agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 840

gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 900

cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 960

gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 1020

caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 1080

tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 1140

ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 1200

tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 1260

gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 1320

aaa 1323

<210> 10

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Gly Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Asn Asp Pro Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Ala Gly Gly Arg Gly Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp

180 185 190

Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys

210 215 220

Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala

305 310 315 320

Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg

325 330 335

Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met

340 345 350

Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro

355 360 365

Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn

370 375 380

Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr

405 410 415

Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu

420 425 430

Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agatctagtc agaacattgt tcatattaat ggaaaaacct atttagaa 48

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ile Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agagtttcca accgattttc t 21

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttcaaggtt cacatgttcc tcggacg 27

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr

1 5

<210> 17

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatattttgt tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

ttctcttgca gatctagtca gaacattgtt catattaatg gaaaaaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgtt ttcaaggttc acatgttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac caagttggaa atcaaa 336

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gatattttgt tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

ttctcttgca gatctagtca gaacattgtt catattaatg gaaaaaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgtt ttcaaggttc acatgttcct 300

cggacgttcg gtggaggcac caagttggaa atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta 360

tccatcttcc caccatccag tgagcagtta acatctggag gtgcctcagt cgtgtgcttc 420

ttgaacaact tctaccccaa agacatcaat gtcaagtgga agattgatgg cagtgaacga 480

caaaatggcg tcctgaacag ttggactgat caggacagca aagacagcac ctacagcatg 540

agcagcaccc tcacgttgac taaggacgag tatgaacgac ataacagcta tacctgtgag 600

gccactcaca agacatcaac ttcacccatt gtcaagagct tcaacagggg agagtgt 657

<210> 20

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Phe Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ile

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

145 150 155 160

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

180 185 190

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

195 200 205

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims (10)

1.一种抗人CD47单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链可变区包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；

所述的CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述的CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述的CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；

所述的CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗人CD47单克隆抗体，其特征在于，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。

3.根据权利要求1所述的一种抗人CD47单克隆抗体，其特征在于，重链氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

4.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1～3中任一项所述的抗人CD47单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的序列选自SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：17；

序列SEQ ID NO：7编码所述的抗体的重链可变区；

序列SEQ ID NO：17编码所述的抗体的轻链可变区。

6.一种表达载体，其特征在于，该表达载体含有如权利要求4或5所述的核苷酸分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有如权利要求6所述的表达载体。

8.如权利要求1～3中任一项所述抗人CD47单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

制备含有表达如权利要求1～3任一项所述的抗人CD47单克隆抗体的核苷酸分子的表达载体；

将得到的表达载体转染真核宿主细胞并培养；

分离纯化，获得抗人CD47单克隆抗体。

9.包括如权利要求1～3中任一项所述的抗人CD47单克隆抗体的抗体免疫偶联缀合物、双特异性分子、嵌和抗原受体或药物组合物。

10.如权利要求1～3中任一项所述的抗人CD47单克隆抗体在制备抗肿瘤药物或纤维化疾病的药物中的应用。

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