ES2926700T3

ES2926700T3 - Anticuerpos anti Eotaxina-2 que reconocen quimiocinas de unión a CCR3 adicionales

Info

Publication number: ES2926700T3
Application number: ES15714963T
Authority: ES
Inventors: Adi Mor
Original assignee: Chemomab Ltd
Current assignee: Chemomab Ltd
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2022-10-27
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: CN106103479B; RU2016136639A3; WO2015132790A3; US20190153088A1; EP3114139B1; WO2015132790A2; BR112016020366A2; JP6553075B2; PT3114139T; DK3114139T3; IL247219B; BR112016020366B1; RU2705255C2; JP2017508461A; EP4155317A1; CN106103479A; RU2016136639A; IL247219A0; US20160368979A1; US10246508B2

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos poliespecíficos aislados dirigidos a un epítopo único en la quimiocina eotaxina 2, por lo que los anticuerpos se unen a quimiocinas adicionales que se unen a CCR3. La invención se refiere además al uso de estos anticuerpos para atenuar la migración de varias células y para tratar enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con monocitos o trastornos atópicos alérgicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti Eotaxina-2 que reconocen quimiocinas de unión a CCR3 adicionales

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de anticuerpos monoclonales anti eotaxina-2 (CCL24) que poseen propiedades de unión poliespecífica a otras quimiocinas en el tratamiento de enfermedades fibróticas, inflamatorias, autoinmunitarias y alérgicas.

Antecedentes de la invención

Los trastornos autoinmunitarios son el resultado de una respuesta inmunitaria hiperactiva del organismo que trabaja contra sus propias células (1). Casi todas las enfermedades autoinmunitarias son crónicas y no tienen cura permanente. Más de 300 millones de pacientes en todo el mundo padecen estos trastornos. Las mujeres constituyen aproximadamente el 70 %-75 % de todos los pacientes autoinmunitarios.

La Eotaxina-2 es una quimiocina que promueve el tráfico celular y regula las actividades inflamatorias en el sitio del complejo del gen de CCR3, especialmente al inducir la quimiotaxia de eosinófilos (2-4), basófilos (4) y linfocitos de tipo Th2 (5).

Hasta ahora, la Eotaxina-2 era muy conocida en el contexto de la alergia. Está bien documentado que hay un aumento significativo en los niveles de Eotaxina-2 durante la respuesta alérgica (6-8). Recientemente, los inventores descubrieron que la Eotaxina-2 también está implicada en enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias (documento WO 2010/086854). El documento WO 2010/086854 también divulga un anticuerpo que se une a Eotaxina-2 pero carece de unión a Eotaxina-1. Como se describe en Ablin et al. (9), la inhibición de la Eotaxina-2 demostró un efecto protector en el modelo de rata de artritis reumatoide. Además, se observó que el bloqueo de la Eotaxina-2 atenuaba la encefalomielitis autoinmunitaria experimental según lo publicado por Mausner et al. (10). El documento WO 2011/025962 divulga anticuerpos anticina que pueden unirse a varias quimiocinas y pueden bloquear la quimiotaxia in vitro.

La esclerodermia, o esclerosis generalizada (EG), es una enfermedad inmunitaria multisistémica, crónica y rara, que se caracteriza por la activación del sistema inmunitario, disfunción endotelial y un proceso fibrótico activo que implica a fibroblastos (11). La fase más temprana en el desarrollo de las lesiones de esclerodermia es la activación de células endoteliales y el daño vascular. A esto le sigue la migración de células inflamatorias, principalmente, monocitos y luego linfocitos. Finalmente, se activa una población de fibroblastos. Los fibroblastos activados siguen produciendo la matriz extracelular que subyace a la patología fibrótica final de la esclerodermia (11). Los estudios revelaron que los fibroblastos dérmicos humanos expresan constitutivamente el ARNm de la Eotaxina 1, 2 y 3 (13). Además, se observaron niveles elevados de Eotaxina en la fibrosis pulmonar y en un modelo de ratones de esclerosis inducida por bleomicina (14). Ratones genosuprimidos para Eotaxina y CCR3 desarrollan fibrosis pulmonar significativamente reducida (14, 15).

Las quimiocinas proinflamatorias de unión a CCR3 Eotaxina 1, Rantes y MCP-3 pertenecen también a la familia de quimiocinas CC y actúan como ligandos del receptor de CCR3. También están implicadas en la migración de células inmunitarias, hecho que explica su eficacia en modelos preclínicos inflamatorios (16, 17).

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI) es una enfermedad fibrótica progresiva limitada a los pulmones, que se produce en personas mayores, más frecuentemente hombres, y se caracteriza por un pronóstico sombrío, con una mediana de supervivencia de 3 a 5 años desde el diagnóstico. Las características clínicas que caracterizan a la FPI incluyen disnea, infiltrados pulmonares difusos radiográficamente evidentes y grados variables de inflamación, fibrosis, o ambas, en la biopsia. La causa de la FPI sigue siendo desconocida, sin embargo, se cree que los mecanismos subyacentes al reclutamiento y la proliferación de fibroblastos y células inmunitarias, así como su diferenciación patológica, son un sello distintivo de la progresión de la enfermedad. Además, parece haber una gran cantidad de mediadores implicados en el progreso de la FPI, incluidas citocinas, quimiocinas, factores fibrogénicos, proteínas coagulantes, oxidantes y reguladores de la apoptosis (18, 19). A su vez, el depósito de componentes de la matriz extracelular, incluido el colágeno, es parte integral de este proceso fibrótico (20).

El tratamiento de la enfermedad generalmente incluye alguna combinación de cuidados paliativos, por ejemplo, oxígeno suplementario, rehabilitación pulmonar, la consideración de la evaluación de un trasplante de pulmón y la identificación y tratamiento de posibles comorbilidades (21). La Pirfenidona (Esbriet) y el Nintedanib son los únicos tratamientos aprobados por la FDA/EMA actualmente disponibles para individuos con FPI (22-24). La Pirfenidona tiene propiedades antifibróticas y antiinflamatorias en diversos sistemas in vitro y modelos animales de fibrosis.

Breve descripción de los dibujos

Para entender la invención y ver cómo se puede llevar a cabo en la práctica, a continuación, se describirán realizaciones, a modo de ejemplo no limitante únicamente, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en que:

Las Fig. 1A-1C son gráficos que muestran los niveles sistémicos circulantes de Eotaxina 2 (Fig. 1A), Rantes (Fig. 1B) y Eotaxina 1 (Fig. 1C) en pacientes con esclerosis generalizada medidos por Elisa. Los resultados se presentan en picogramos por mililitro.

Las Fig. 2A-2B son gráficos que demuestran el efecto del tratamiento con CM101 sobre distintos parámetros en un modelo de prevención en ratones con esclerodermia inducida por bleomicina. La Fig. 2A es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 10, 20 o 50 pg), IgG y PBS sobre el grosor dérmico (± error típico). La Fig. 2B es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 10, 20 o 50 pg), IgG y PBS sobre la concentración de colágeno (± error típico), * indica p<0,05. (Vehículo - sin tratamiento (PBS); BLM-bleomicina)

Las Figura 3A-3B son gráficos que muestran el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 10 pg o 50 pg) sobre linfocitos (Fig. 3A) y eosinófilos (Fig. 3B) dentro del líquido broncoalveolar de ratones en un modelo de esclerodermia inducida por bleomicina (modo de prevención) (± error típico). * indica p<0,05. (Vehículo - sin tratamiento (PBS); BLM-bleomicina)

La Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101, 50 pg) y PBS (vehículo) sobre la concentración de colágeno de la piel de ratones en un protocolo de tratamiento (± error típico), *p<0,05 (vehículo - sin tratamiento (PBS); BLM-bleomicina).

Las Fig. 5A-5B son gráficos que muestran el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101, 50 pg) y PBS (vehículo) sobre la infiltración de células mononucleares (Fig. 5A) y glóbulos blancos (GB) (Fig. 5B) dentro del líquido broncoalveolar de ratones en modo de tratamiento (± error típico), *p<0,05 (vehículo -sin tratamiento (PBS); BLM-bleomicina). Las Figuras 5C-5F son resultados de FACS representativos (recuento de células en 30 segundos en citometría de flujo): 5C - PBS; 5D - BLM 8 días; 5E - BLM 21 días; 5F - BLM CM101. Las Fig. 6A-6D son fotografías que muestran el aspecto representativo de la piel de ratones (tinción con hematoxilina y eosina (H y E)). Fig. 6A - PBS; Fig. 6B - valores de referencia de BLM; Fig. 6C - final de BLM; Fig. 6D ratones tratados con CM101 (tratamiento con CM 101 iniciado después de la enfermedad establecida). La Fig. 6E-6H son fotografías que muestran el aspecto representativo de la piel de ratones (tinción tricrómica de Masson). Fig. 6E - PBS; Fig. 6F - valores de referencia de BLM; Fig. 6G - final de BLM; Fig. 6H ratones tratados con CM101 (el tratamiento con CM 101 se inicia cuando se establece la EG experimental).

Las Fig. 7A-7B son fotografías de lesiones pulmonares de pacientes con FPI teñidas con hCM101.

La Fig. 8 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 10, 100 pg), IgG y PBS (vehículo) sobre la concentración de colágeno de ratones en modo de prevención de la FPI (± error típico). *vp<0,05.** *vp<0,01. (BLM-bleomicina).

La Fig. 9 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 10, 100 pg), IgG y PBS (vehículo) sobre células mononucleares dentro del líquido broncoalveolar de ratones en modo de prevención en el modelo de FPI (± error típico). *vp<0,05. (BLM-bleomicina).

La Fig. 10 es un gráfico que muestra la influencia de CM101 (10, 100 pg) sobre los niveles de Eotaxina 2 en el líquido BAL en modo de prevención de la FPI (± error típico). *vp<0,05. (BLM-bleomicina, Vehículo-PBS).

La Fig. 11 es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 50 pg), IgG y PBS (vehículo) sobre la concentración de colágeno pulmonar de ratones en modo de tratamiento de la FPI (± error típico). *vp<0,05.** vp<0,01. (BLM-bleomicina).

Las Fig. 12A-12B es un gráfico que muestra el efecto del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-eotaxina-2 (CM101 en 50 pg), IgG y PBS (vehículo) en células mononucleares (Fig. 12A) y polimorfonucleares (Fig. 12B) dentro del líquido broncoalveolar de ratones en modo de tratamiento en el modelo de FPI (± error típico). *vp<0,05. (BLM-bleomicina).

Las Fig. 13A-13H son fotografías que muestran el aspecto representativo de las lesiones pulmonares de ratones tratados con CM101 o PBS teñidas con hematoxilina y eosina (H y E) (Fig. 13D y Fig. 13A, respectivamente) o con tinción tricrómica de Masson (Fig. 13H y Fig. 13E, respectivamente). Las lesiones pulmonares de ratones tratados con bleomicina (BLM) durante el número de días indicado y teñidas con H y E aparecen en la Fig. 13B y la Fig. 13C. Las lesiones pulmonares de ratones tratados con bleomicina (BLM) durante el número de días indicado y teñidas con tinción tricrómica de Masson aparecen en la Fig. 13F y la Fig. 13G.

La Fig. 14 es un gráfico que presenta el efecto de CM101 (100 pg) en comparación con Pirfenidona (100 mg/kg/día) sobre la concentración de colágeno pulmonar de ratones con FPI (± error típico). *vp<0,05. (BLM-bleomicina).

Las Fig. 15A-15C son gráficos que presentan el efecto de CM101 (100 pg) en comparación con Pirfenidona (100 mg/kg/día) sobre células mononucleares (Fig. 15A), polimorfonucleares (Fig. 15B) y glóbulos blancos (Fig. 15C) dentro del líquido broncoalveolar de ratones en el modelo de FPI (± error típico). *vp<0,05.** vp<0,01. (BLM-bleomicina).

La Fig. 16 es un gráfico que muestra la unión de un Acm anti eotaxina-2 (hCM101) a eotaxina-2. Los resultados se presentan como lecturas de densidad óptica (DO) a 405 nm. (± error típico). vp<0,05. (BSA = seroalbúmina bovina).

La Fig. 17 es un gráfico que muestra la unión de un Acm anti eotaxina-2 (hCM101) a eotaxina-1. Los resultados se presentan como lecturas de densidad óptica (DO) a 405 nm. (± error típico). vp<0,05. (BSA = seroalbúmina bovina).

La Fig. 18 es un gráfico que muestra la unión de un Acm anti eotaxina-2 (hCM101) a RANTES. Los resultados se presentan como lecturas de densidad óptica (DO) a 405 nm. (± error típico). vp<0,05. (BSA = seroalbúmina bovina). La Fig. 19 es un gráfico que muestra la unión de un Acm anti eotaxina-2 (hCM101) a MCP-3. Los resultados se presentan como lecturas de densidad óptica (DO) a 405 nm. (± error típico). vp<0,05. (BSA = seroalbúmina bovina). La Fig.20A es una representación gráfica del sitio de unión de hCM101 en el bucle en N de la Eotaxina 1, eotaxina 2, Rantes y MCP-3 (las estructuras de las proteínas están superpuestas);

La Fig. 20B muestra la comparación de la secuencia de aminoácidos del epítopo de unión asumido en las cuatro proteínas.

Las Fig. 21A-21H son representaciones gráficas de la superficie proteica y en diagrama de cintas del mapeo epitópico que representan el sitio de unión similar de hCM101 a, respectivamente, Eotaxina 2 (Fig. 21A y Fig. 21E), eotaxina 1 (Fig. 21B y Fig. 21F), RANTES (Fig. 21C y Fig.21G) y MCP3 (Fig. 21D y Fig. 21H). La superficie proteica está rodeada por un círculo de acuerdo con la carga; la línea gruesa representa el área con carga positiva. El sitio del giro está indicado por un círculo y el sitio del bucle en N está indicado por un óvalo.

Las Fig. 22A-22B son un gel representativo (Fig. 22A) y una densitometría de los niveles precipitados (pulldown) de Eotaxina 2 (Fig. 22B) mediante hCM101 a partir de sueros de esclerosis generalizada (5, 10 y 50 pg). D.O. -densidad óptica.

La Fig. 23 demuestra un análisis por gel representativo de dodecilsulfato de sodio (SDS) de Eotaxina 1, RANTES y MCP-3 (2, 1, 0,5 pg) detectados por hCM101.

La Fig. 24 es un gráfico que muestra el efecto de hCM101 (100, 50 y 10 nM), IgG (50 nM) o PBS ("0") sobre la migración de la línea celular de eosinófilos hacia la eotaxina 1 y la eotaxina 2 (± error típico). *vp<0,05.** vp<0,01. La Fig. 25 es un gráfico que muestra el efecto de hCM101 (100, 50 y 10 nM), IgG (50 nM) o PBS ("0") sobre la migración de la línea celular de monocitos hacia MCP-3 y RANTES (± error típico). *vp<0,05.

La Fig. 26A es un gráfico que muestra el efecto de hCM101 (100 y 10 nM), IgG (50 nM) o PBS ("0") sobre la migración de células CD14+ (aisladas de pacientes con esclerosis generalizada) hacia MCP-3 y RANTES (± error típico). *vp<0,05.

La Fig. 26B es un gráfico que muestra el efecto de hCM101 (100 y 10 nM), IgG (50 nM) o PBS ("0") sobre la migración de células CD14-(aisladas de pacientes con esclerosis generalizada) hacia eotaxina 1, 2 y RANTES (± error típico). *vp<0,05, ** vp<0,01.

La Figura 27A es un gráfico que muestra el efecto de hCM101 (100 nM) o PBS (EOX-2) sobre la migración de la línea celular de fibroblastos hacia la eotaxina 2 (± error típico).** vp<0,01. Las Fig. 27B-27D son imágenes representativas de un control (Fig. 27B), de fibroblastos tratados con PBS (Fig. 27C) y tratados con hCM101 (Fig. 27D) presentados en la Fig. 27 A.

La Fig. 28A es un gráfico que muestra el efecto de hCM101 (100 nM) o PBS (EOX-1) sobre la migración de la línea celular de fibroblastos hacia la eotaxina 1 (± error típico).* vp<0,05. Las Fig. 28B-28D son imágenes representativas de un control (Fig. 28B), de fibroblastos tratados con PBS (Fig. 28C) y tratados con hCM101 (Fig. 28D) presentados en la Fig. 28a .

Las Fig. 29A-29C son figuras de FACS representativas que demuestran el efecto de hCM101 sobre la expresión intracelular de a-SMA como indicador de la transición a miofibroblastos. vp<0,05. La Fig. 29A muestra un 44 % de células positivas para SMA en suero obtenido de un paciente con esclerodermia, La Fig. 29B muestra un 22 % de células positivas para SMA en suero obtenido de un paciente con esclerodermia tratado con hCM101 (10 pg/ml) y la Fig. 29C muestra un 27 % de células positivas para SMA en suero obtenido de un paciente con esclerodermia tratado con hCM101 (5 pg/ml).

Las Fig. 30A-30B son gráficos que presentan el índice de activación de calcio con resolución temporal bajo la influencia de CM101 (100, 50, 10, 5 o 0 nM) (Fig. 30A) y la variación en la señal de calcio inducida por eotaxina 2 en función de la concentración de CM101 (Fig. 30B) en eosinófilos. vp<0,05

La Fig. 31 es un gráfico que presenta la proliferación de linfocitos T después de la incubación con hCM101. Los resultados se presentan como índice de estimulación.

La Fig. 32 es un gráfico que muestra la correlación entre la inmunogenicidad clínica (respuesta de anticuerpos terapéuticos antiproteína) y la proliferación de linfocitos T en Episcreen.

Descripción general

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertas por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente invención proporciona un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos o trastornos atópicos alérgicos, en donde la presente invención proporciona en particular un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, ateroesclerosis o trastornos atópicos alérgicos, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está completamente humanizado y comprende una región variable de cadena pesada indicada por el SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera indicada por el SEQ ID NO: 4, y en donde las al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 se seleccionan del grupo que consiste en Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

Dicho fragmento de unión a antígeno del mismo puede seleccionarse del grupo que consiste en Fv, Fv monocatenario (scFv), región variable de cadena pesada capaz de unirse al antígeno, región variable de cadena ligera capaz de unirse al antígeno, Fab, F(ab)2' y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la enfermedad fibrótica como se define en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), esteatohepatitis no alcohólica (ENA), glomeruloesclerosis, cirrosis y síndromes metabólicos.

Dicho trastorno inflamatorio autoinmunitario puede seleccionarse del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide, psoriasis, colitis, uveítis, esclerosis múltiple y diabetes tipo I.

El trastorno relacionado con los monocitos de acuerdo con la invención puede ser ateroesclerosis.

El trastorno atópico alérgico como se define en el presente documento puede seleccionarse del grupo que consiste en asma, dermatitis atópica, urticaria y reacciones de hipersensibilidad.

En algunas realizaciones, el anticuerpo poliespecífico aislado para su uso de acuerdo con la invención es en donde las al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 se seleccionan del grupo que consiste en Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

En otras realizaciones, el anticuerpo poliespecífico aislado para su uso de acuerdo con la invención es en donde el anticuerpo se une a la Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

El anticuerpo poliespecífico aislado para su uso como se define en el presente documento puede atenuar las propiedades migratorias de células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 y CCR5.

El anticuerpo de acuerdo con la invención es un anticuerpo completamente humanizado que comprende la región variable de cadena pesada indicada por el SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma y la región variable de cadena ligera indicada por el SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma.

El anticuerpo aislado puede unirse a un epítopo conformacional en la región del bucle en N de una quimiocina de unión a c CR3, en donde dicho epítopo conformacional se caracteriza por una concentración relativamente alta de restos de aminoácido positivos ubicados entre las posiciones de aminoácidos 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3.

El epítopo conformacional como se define en el presente documento puede comprender al menos tres restos de aminoácido positivos entre las posiciones de aminoácido 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3.

Los restos de aminoácido positivos como se definen en el presente documento pueden seleccionarse del grupo que consiste en Arg, Lys y His.

El epítopo conformacional como se define en el presente documento puede comprender secuencias de aminoácidos seleccionadas de: las secuencias de aminoácidos indicadas por el SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

La presente invención proporciona además una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se define en el presente documento.

Todavía por otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado que se une a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia indicada por el SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2.

La presente invención proporciona además un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Por aún otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo como se define en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, ateroesclerosis o trastornos atópicos alérgicos.

La presente invención proporciona además un método de tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, ateroesclerosis o trastornos atópicos alérgicos que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéuticamente aceptable del anticuerpo o la composición farmacéutica como se define en el presente documento.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente de que un anticuerpo dirigido a un epítopo conformacional en el polipéptido eotaxina 2 (CCL24) se une e inhibe la actividad de la eotaxina 2, así como a otros agentes quimiotácticos, las quimiocinas proinflamatorias de unión a CCR3: Eotaxina 1, Rantes y MCP-3. Por tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal totalmente humanizado exclusivo (denominado en el presente documento hCM101) capaz de prevenir la migración de células inmunitarias neutralizando al menos una de las quimiocinas responsables de su quimiotaxia. El anticuerpo hCM101 inhibe la unión de estas quimiocinas de unión a CCR3 (algunas de las cuales se unen a receptores adicionales) a sus respectivos receptores y atenúa funcionalmente las propiedades migratorias de células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 y CCR5 (líneas celulares de eosinófilos y monocíticas, así como fibroblastos humanos).

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, estas propiedades exclusivas y excepcionales del anticuerpo son poliespecíficas, a saber, el direccionamiento a varias quimiocinas, pueden explicar su eficacia y su posible capacidad para superar la redundancia en las funciones de las quimiocinas. Como tal, este anticuerpo puede ser útil en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias que están asociadas con inflamación crónica y caracterizadas por la migración e infiltración de células inmunitarias, incluyendo enfermedades alérgicas y fibróticas.

La presente divulgación proporciona así un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se puede unir a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos o trastornos atópicos alérgicos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo poli-específico (o poliespecífico)" se refiere a anticuerpos polirreactivos que son capaces de reconocer múltiples antígenos, específicamente, la invención abarca anticuerpos poliespecíficos que son capaces de reconocer varias quimiocinas proinflamatorias distintas de unión a CCR3. El anticuerpo de la invención se generó contra la eotaxina 2 y posteriormente se descubrió que se unía y atenuaba de forma eficaz la actividad de quimiocinas adicionales (por ejemplo, eotaxina 1, Rantes y MCP-3). El anticuerpo poliespecífico divulgado en el presente documento puede unirse a diversas quimiocinas con afinidades similares. El anticuerpo puede tener una afinidad de unión diferencial a las diversas quimiocinas. El anticuerpo puede unirse con mayor afinidad a la eotaxina 2 que a las otras quimiocinas analizadas. Aparentemente, los anticuerpos poliespecíficos pueden reconocer un epítopo de reacción cruzada en estas quimiocinas proinflamatorias de unión a CCR3.

El CCR3 (receptor de quimiocinas C-C tipo 3) es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen CCR3.

CCR3 también se ha denominado CD193 (grupo de diferenciación 193). La proteína codificada por este gen es un receptor de quimiocinas de tipo C-C. Es un receptor de transmembrana de 7 dominios acoplado a proteína G que se expresa en los eosinófilos, así como en una amplia gama de tipos celulares, incluidos los macrófagos y las células endoteliales. Este receptor se une y responde a diversas quimiocinas, incluyendo la eotaxina (también denominada eotaxina 1 o CCL11), eotaxina-2 (CCL24), eotaxina-3 (CCL26), MCP-3 (CCL7), MCP-4 (CCL13) y RANTES (CCL5).

La expresión "quimioquinas de unión a CCR3" como se define en el presente documento, se refiere a cualquier quimiocina que se une a la proteína CCR3 y abarca, por ejemplo, pero sin limitación, la Eotaxina 1, Eotaxina-2, Eotaxina-3, Rantes, MCP-3 y MCP-4. Debe enfatizarse que algunas de las quimiocinas de unión a CCR3 también se unen a receptores de quimiocinas adicionales, por ejemplo, CCR1, CCR2 o CCR5.

El anticuerpo poliespecífico aislado para el uso de la invención puede unirse al menos a dos quimiocinas de unión a CCR3 que se seleccionan del grupo que consiste en Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

Las expresiones "eotaxina 2" (proteína quimiotáctica de eosinófilos 2), "CCL24" (ligando de quimiocina (motivo C-C 24)) o "MPIF-2" (factor inhibidor del progenitor mieloide 2) se utilizan indistintamente y se refieren a una citocina que pertenece a la familia de quimiocinas CC que está codificada por el gen CCL24 humano, situado en el cromosoma 7 humano. CCL24 interactúa con el receptor de quimiocinas ^cCR3. La actividad de CCL24 incluye la inducción de la quimiotaxia en eosinófilos, basófilos, linfocitos T y neutrófilos, así como la inducción de respuestas angiogénicas y migratorias en células endoteliales y musculares lisas. La secuencia de aminoácidos de la eotaxina 2 (sin el péptido señal N-terminal) se indica mediante el SEQ ID NO: 11.

Como se indica anteriormente, las quimiocinas de unión a CCR3 adicionales incluidas en el presente documento pueden ser la Eotaxina 1, Eotaxina-3, Rantes, MCP-3 y MCP-4, por nombrar solo algunas.

La expresión "Eotaxina 1" (también conocida como quimiocina de motivo C-C 11 y proteína quimiotáctica de eosinófilos) como se define en el presente documento se refiere a una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen CCL11. La eotaxina 1 recluta selectivamente eosinófilos al inducir su quimiotaxia y, por lo tanto, está implicada en las respuestas alérgicas. Los efectos de la Eotaxina 1 están mediados por su unión a un receptor unido a proteína G conocido como receptor de quimiocinas, incluido CCR2, CCR3 y CCR5. La secuencia de aminoácidos de la Eotaxina 1 humana (sin el péptido señal N-terminal) se indica, por ejemplo, mediante el SEQ ID NO: 12.

El término "Rantes" (forma siglada de regulated on activation, normal T cell expressed and secreted: regulado por activación de linfocito T normal expresado y secretado), también denominado ligando de quimiocina (motivo C-C) 5 (CCL5), como se define en el presente documento, se refiere a una proteína que en seres humanos está codificada por el gen CCL5. Rantes es una proteína de 8 kDa clasificada como citocina quimiotáctica o quimiocina para linfocitos T, eosinófilos y basófilos, y desempeña un papel activo en el reclutamiento de leucocitos en los sitios inflamatorios. Con la ayuda de citocinas particulares (es decir, IL-2 e IFN-gamma) que son liberadas por los linfocitos T, Rantes también induce la proliferación y activación de determinados linfocitos citolíticos naturales (NK) para formar células CHAK (CC-chemokine-activated killer, citolíticas activadas por quimiocina CC). Rantes se une, entre otros, el receptor de CCR3. La secuencia de aminoácidos de la Rantes humana (sin el péptido señal N-terminal) se indica, por ejemplo, mediante el SEQ ID NO: 13.

El término "MCP-3" (quimiocina específica de monocitos 3) también denominada ligando de quimiocina (motivo C-C) 7 (CCL7) como se define en el presente documento se clasifica en la subfamilia de quimiocinas conocidas como quimiocinas CC. MCP-3 atrae específicamente a los monocitos y regula la función de los macrófagos. Es producida por determinadas líneas de células tumorales y por macrófagos. Esta quimiocina se encuentra en el cromosoma 17 en los seres humanos, en un agrupamiento grande que contiene muchas otras quimiocinas CC. Rantes se une, entre otros, el receptor de CCR3. La secuencia de aminoácidos de la MCP-3 humana (sin el péptido señal N-terminal) se indica, por ejemplo, mediante el SEQ ID NO: 14.

En algunas realizaciones, el anticuerpo poliespecífico aislado para el uso de la invención se une a la Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

Dicho anticuerpo poliespecífico aislado puede atenuar las propiedades migratorias de las células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 y CCR5.

Por la expresión "atenúa las propiedades migratorias" de células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 y CCR5 se quiere decir que el anticuerpo divulgado en el presente documento puede reducir la migración celular como puede medirse en un ensayo de quimiotaxia. Dichos ensayos de quimiotaxia son muy conocidos en la técnica. Los ensayos de quimiotaxia de ejemplo se muestran en la sección de Ejemplos a continuación. Atenuación de las propiedades migratorias significa cualquier reducción estadísticamente significativa de la migración celular en comparación con las células no tratadas. Por ejemplo, una reducción de al menos el 50 % del número de células migratorias.

Como se ejemplifica en la sección de Ejemplos a continuación, el anticuerpo divulgado en el presente documento puede unirse a varias quimiocinas proinflamatorias y puede inhibir sus diversas actividades, tales como la inhibición del reclutamiento celular o la quimiotaxia (por ejemplo, el reclutamiento o la quimiotaxia de eosinófilos o monocitos o fibroblastos), la inhibición de la transición de fibroblastos a mioblastos, así como la reducción de la activación celular. Como tales, estos anticuerpos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades cuyos efectos o síntomas nocivos están mediados, al menos en parte, por quimiocinas CCR3 proinflamatorias.

Específicamente, como se muestra en los ejemplos a continuación, el anticuerpo divulgado en el presente documento puede provocar una disminución significativa de varias características en modelos de fibrosis pulmonar idiopática (FPI) y esclerodermia, las cuales se clasifican como enfermedades fibróticas.

La fibrosis es la formación excesiva de tejido conjuntivo fibroso en un órgano o tejido en un proceso reparativo o reactivo. Puede ser un estado reactivo, benigno o patológico. La fibrosis se puede utilizar para describir el estado patológico de depósito excesivo de tejido fibroso, así como el proceso de depósito de tejido conectivo en la curación. Por tanto, como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad fibrótica" se refiere a una afección anómala en la que el tejido conjuntivo fibroso se extiende sobre el músculo liso normal u otro tejido normal de órganos, o lo sustituye. La fibrosis puede implicar al corazón, pulmón, peritoneo, piel o riñón. Los ejemplos no limitantes de una enfermedad fibrótica incluyen esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), esteatohepatitis no alcohólica (ENA), glomeruloesclerosis, cirrosis y síndromes metabólicos.

Por tanto, en algunas realizaciones, la enfermedad fibrótica se selecciona del grupo que consiste en esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), esteatohepatitis no alcohólica (ENA), glomeruloesclerosis, cirrosis y síndromes metabólicos.

El término "esclerodermia", también conocida como esclerosis generalizada como se define en el presente documento se refiere a una enfermedad autoinmunitaria sistémica crónica caracterizada por el endurecimiento (esclero) de la piel (dermia). En la forma más grave, también afecta a los órganos internos. La esclerodermia puede ser esclerodermia limitada e implica manifestaciones cutáneas que afectan principalmente a las manos, los brazos y la cara, o esclerodermia difusa, que progresa rápidamente y afecta una gran área de la piel y uno o más órganos internos, frecuentemente los riñones, el esófago, el corazón y/o los pulmones. Esta forma de esclerodermia puede ser bastante incapacitante. No existen tratamientos para la esclerodermia en sí, pero se tratan las complicaciones de aparatos y sistemas individuales.

La expresión "fibrosis pulmonar idiopática" (FPI) se refiere a la fibrosis progresiva de las paredes alveolares del pulmón, con disnea progresiva y falta de oxígeno potencialmente fatal o insuficiencia cardiaca derecha. La forma aguda se llama síndrome de Hamman-Rich.

Como se utiliza en el presente documento, el término "inflamación" se refiere a la compleja respuesta biológica del sistema inmunitario frente a los estímulos nocivos, tales como patógenos, células dañadas (provocado, por ejemplo, por quemaduras, traumatismos, neoplasia) o irritantes tales como productos químicos, el calor o el frío. La expresión "enfermedad inflamatoria" o "trastorno inflamatorio" se refiere a enfermedades asociadas con la inflamación, incluyendo, pero sin limitación, trastornos inflamatorios autoinmunitarios.

Como se usa en el presente documento, la expresión enfermedad autoinmunitaria describe una afección patológica que es el resultado de una respuesta inmunitaria hiperactiva del organismo contra sustancias y tejidos normalmente presentes en el cuerpo. El sistema inmunitario confunde alguna parte del organismo con un patógeno y la ataca. Esto puede limitarse a determinados órganos o implicar a un tejido particular en distintos lugares, lo que puede afectar la membrana basal tanto en el pulmón como en el riñón. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad celíaca, diabetes mellitus de tipo I (DMT1), lupus eritematoso sistémico (LES), síndrome de Sjogren, síndrome de Churg-Strauss, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), esclerodermia y pénfigo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastornos inflamatorios autoinmunitarios" se refiere a trastornos que son el resultado del ataque del sistema inmunitario a los propios tejidos del organismo que también se caracterizan por un aumento de la inflamación. Los ejemplos no limitantes de un trastorno inflamatorio autoinmunitarios incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide, psoriasis, colitis, uveítis, esclerosis múltiple y diabetes tipo I.

El trastorno inflamatorio autoinmunitario como se define en el presente documento puede seleccionarse del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide, psoriasis, colitis, uveítis, esclerosis múltiple y diabetes tipo I.

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno relacionado con los monocitos" se refiere a anomalías genéticas que afectan a la función de los monocitos y macrófagos y provocan la acumulación de desechos dentro de las células, dando como resultado, por ejemplo, lipidosis (tal como la enfermedad de Gaucher y la enfermedad de Niemann-Pick) o ateroesclerosis. Se produce un aumento de monocitos en la sangre (monocitosis) en respuesta a infecciones crónicas, en trastornos autoinmunitarios, en trastornos de la sangre y en determinados tipos de cáncer. Puede producirse una proliferación de macrófagos en los tejidos en respuesta a infecciones, sarcoidosis e histiocitosis de células de Langerhans.

Adicionalmente, el trastorno relacionado con los monocitos divulgado en el presente documento puede ser la ateroesclerosis.

Como se usa en el presente documento, el término "ateroesclerosis" (también conocida como Enfermedad vascular arteriosclerótica o EVA) es un proceso patológico en que la pared arterial se engrosa como resultado de una acumulación de materiales grasos tales como el colesterol. Este proceso es el resultado de una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, en gran parte debida a la acumulación de macrófagos y estimulada por las lipoproteínas de baja densidad sin la eliminación adecuada de grasas y colesterol de los macrófagos por lipoproteínas de alta densidad (HDL) funcionales. Este endurecimiento o engrosamiento de las arterias está provocado por la formación de múltiples placas dentro de las mismas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "trastorno alérgico atópico" se refiere a una forma de alergia que aqueja a personas con una predisposición genética a la hipersensibilidad a determinados alérgenos. Los ejemplos no limitantes de un trastorno atópico alérgico incluyen asma, dermatitis atópica, urticaria por polinosis y reacciones de hipersensibilidad.

Adicionalmente, el trastorno atópico alérgico divulgado en el presente documento puede seleccionarse del grupo que consiste en asma, dermatitis atópica, urticaria y reacciones de hipersensibilidad.

Como se indica anteriormente, la presente invención proporciona anticuerpos poliespecíficos aislados que se unen a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 proinflamatorias. El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido codificado por un gen de inmunoglobulina o fragmentos funcionales del mismo que se unen específicamente y reconocen un antígeno, a saber, las quimiocinas de unión a CCR3 proinflamatorias. Específicamente, el anticuerpo de la invención se une y reconoce al menos a la eotaxina 2, eotaxina 1, RANTES y MCP-3.

Preferentemente, el anticuerpo divulgado en el presente documento puede ser un anticuerpo monoclonal. La expresión "anticuerpo monoclonal", "anticuerpos monoclonales" o "Acm" como se define en el presente documento se refiere a una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales se dirigen contra un único sitio antigénico.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar y purificar mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse a partir de linfocitos B extraídos del bazo o de los ganglios linfáticos de animales inmunizados (por ejemplo, ratas o ratones), por fusión con linfocitos B inmortalizados en condiciones que favorecen el crecimiento de células híbridas.

La inmunización de ratones se puede llevar a cabo, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2010/086854. Brevemente, la inmunización de los ratones puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante inmunización primaria subcutánea (s.c.) con el antígeno deseado, a saber, con una quimiocina de unión a CCR3, por ejemplo, la eotaxina 2, o con un fragmento de una quimiocina de unión a CCR3 que comprende un epítopo conformacional en el bucle en N (por ejemplo, 50 pg) emulsionado con adyuvante completo de Freund. A continuación, se administran cada 2 semanas dos inyecciones subcutáneas de refuerzo con el antígeno (por ejemplo, 50 pg) emulsionado con adyuvante incompleto de Freund. Los ratones con el título de anticuerpos neutralizantes más alto reciben un refuerzo intravenoso (i.v.) adicional del antígeno (por ejemplo, 5 pg) en PBS cuatro días antes de la extracción del bazo.

Después del refuerzo final (por ejemplo, cuatro días), se retira el bazo del ratón con el título de anticuerpos neutralizantes más alto y los esplenocitos se fusionan con células de mieloma de ratón (por ejemplo, células NS0) utilizando polietilenglicol, como se describió anteriormente (Kohler, G. y Milstein, C. (1975) Nature 256: 495-497). Después de la fusión, las células de hibridoma se seleccionan cultivando las células en medio HAT (hipoxantinaaminopterina-timidina). Luego, los clones celulares se exploran en cuanto a la producción de anticuerpos específicos, por ejemplo, utilizando los ensayos ELISA que se describen a continuación.

La purificación de anticuerpos monoclonales puede basarse, por ejemplo, en cromatografía de afinidad, a saber, utilizando una columna de afinidad a la que se conjuga el epítopo específico.

Una unidad estructural de un anticuerpo ilustrativa comprende un tetrámero, como se conoce en la técnica. Cada tetrámero se compone de dos parejas idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada pareja una "cadena ligera "y una "cadena pesada". El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, principalmente responsable del reconocimiento de antígenos (o epítopos).

Por tanto, las expresiones "región variable de cadena pesada" (V^h) y "región variable de cadena ligera" (V^l) se refieren a estas cadenas pesadas y ligeras, respectivamente. Más específicamente, la región variable se subdivide en las regiones hipervariables y marco conservada (FR). Las regiones hipervariables tienen una alta proporción de distintos aminoácidos en una posición dada, con respecto a al aminoácido más común en esa posición. Cuatro regiones FR que tienen secuencias de aminoácidos más estables separan a las regiones hipervariables. Las regiones hipervariables contactan directamente con una parte de la superficie del antígeno. Por este motivo, las regiones hipervariables se denominan en el presente documento "regiones determinantes de complementariedad", o "CDR".

De N-terminal a C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR son responsables principalmente de la unión a un epítopo de un antígeno. Las CDR de cada cadena se denominan normalmente CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N, y también se identifican normalmente por la cadena en la que está ubicada la CDR particular.

Por tanto, las regiones determinantes de complementariedad CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se refieren a las tres regiones determinantes de complementariedad a partir del extremo N de la cadena pesada del anticuerpo y las regiones determinantes de complementariedad CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se refieren a las tres regiones determinantes de complementariedad a partir del extremo N de la cadena ligera del anticuerpo.

El anticuerpo monoclonal poliespecífico aislado divulgado en el presente documento puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humanizado.

La expresión anticuerpos "quiméricos" como se define en el presente documento se refiere a anticuerpos en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera se obtiene de una especie particular, mientras que el resto de la cadena (o cadenas) se obtiene de otra especie, así como fragmentos de tales anticuerpos, que presentan la misma actividad biológica.

Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe a continuación.

Puede prepararse un anticuerpo quimérico murino-humano mediante la amplificación y clonación de los genes de VH y VL murinos, que codifican las regiones variables del anticuerpo, seguido de la expresión de anticuerpos quiméricos murino-humano. Para este fin, el ARN total se aísla de células de hibridoma anti-eotaxina 2 murinas que se demuestra que secretan anticuerpos con las características deseadas y el ADNc se sintetiza usando un cebador con oligo (dT)15, transcriptasas inversas M-MLV y AMV. La amplificación de los genes variables pesados y ligeros (Vh y Vl) puede llevarse a cabo utilizando un panel de cebadores dirigidos al extremo 5' del armazón 1 de cada gen, esencialmente como se describe en Benhar y Reiter (Benhar, I. y Reiter, Y. (2002) Curr. Protoc. Immunol. Capítulo 10: Unidad 10 19B), y a la región constante (Ch1 o Ck, respectivamente) en el extremo 3'.

Luego, los genes variables se reamplifican utilizando cebadores no degenerados que introducen sitios de restricción en ambos extremos para la clonación, por ejemplo, en un vector de expresión de anticuerpos basado en pCMV.

Los genes variables pesados y ligeros amplificados se purifican por separado, se digieren y clonan en vectores de expresión de Ig de longitud completa de mamífero apropiados, proporcionando a cada cadena un péptido señal correspondiente y un gen constante, dando como resultado la expresión del anticuerpo quimérico humano murino IgG1/k.

Para preparar grandes cantidades del anticuerpo, se puede preparar una línea celular estable que exprese el anticuerpo, mediante la transfección de células (por ejemplo, células CHO) con el vector de expresión de Ig que contiene las cadenas pesada y ligera del anticuerpo quimérico. Los clones altamente productores de anticuerpos antieotaxina 2 (o cualquier otra quimiocina de unión a CCR3 utilizada para la producción de anticuerpos) pueden seleccionarse y expandirse en función de los niveles de anticuerpos en el sobrenadante, como se comprueba por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, un ensayo de ELISA específico para quimiocinas de unión a CCR3, como se detalla en el presente documento a continuación.

La expresión anticuerpos "humanizados" se refiere tradicionalmente a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que contienen un armazón de inmunoglobulina obtenido de ser humano con secuencias mínimas obtenidas de inmunoglobulinas no humanas en las CDR y, opcionalmente, en posiciones de importancia adicionales. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la que los restos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y actividad deseadas.

Como se utiliza en el presente documento, anticuerpos "totalmente humanizados" se refiere a anticuerpos diseñados para tener solo secuencias humanas. Los anticuerpos totalmente humanizados de la presente invención se prepararon utilizando la tecnología Composite Human Antibodies™ que minimiza la inmunogenicidad de los anticuerpos en los pacientes. En esta tecnología de humanización, se utilizan múltiples segmentos de secuencia obtenidos de regiones variables (V) de anticuerpos humanos no relacionados como aceptadores de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos iniciales. A través de una cuidadosa selección de segmentos de secuencia humana y la aplicación de herramientas informáticas, se evitan los epítopos de linfocitos T CD4+, por lo que se reduce el riesgo de inmunogenicidad en comparación con los anticuerpos humanizados convencionales, mientras que se mantienen la afinidad y la especificidad del anticuerpo. Dichos anticuerpos contienen solo secuencias humanas y, por tanto, se definen como "totalmente humanizados".

La expresión "anticuerpo humano" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos conocidas en la técnica. Esta definición excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígenos no humanos.

La preparación de anticuerpos humanizados y humanos es bien conocida en la técnica. Los anticuerpos también se pueden preparar utilizando presentación en fagos. Como se conoce en la técnica, la presentación de anticuerpos en fagos (PAF) se basa en la ingeniería genética de bacteriófagos y rondas repetidas de selección guiada por antígenos y propagación de fagos.

El proceso de PAF comienza con la preparación de la biblioteca de anticuerpos, mediante la preparación de ARN de calidad a partir de la fuente celular elegida (por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica). Este ARN se transcribe inversamente en ADNc, que se utiliza para la PCR de las cadenas VH y VL de los anticuerpos codificados. A esta etapa le sigue el ligamiento de los productos de PCR de la variable pesada (VH) y variable ligera (VL) en un vector de presentación en fagos, culminando en el análisis de clones de los Acm.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal poliespecífico completamente humanizado aislado, que puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende la CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos de NSGMN indicada por el SEQ ID NO: 5, o una variante de la misma, la CDRH2 que comprende la secuencia de aminoácidos WINTYNGEPTYTDDFKG indicada por el SEQ ID NO: 6, o una variante de la misma, y la CDRH3 que comprende la secuencia de aminoácidos HSYGSSYAMDN indicada por el SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma; y una región variable de cadena ligera que comprende: la CDRL1 que comprende la secuencia de aminoácidos Ka SQSVDYDGDSYMN indicada por el Se Q ID NO: 8 o una variante de la misma; la CDRL2 que comprende la secuencia de aminoácidos VASNLKS indicada por el SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma; y la CDRL3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQSNEEPWT indicada por el SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma.

En otras palabras, la presente divulgación proporciona un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se puede unir a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3, en donde el anticuerpo puede ser un anticuerpo completamente humanizado y puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende:

a) la región determinante de complementariedad CDR1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 5 o una variante de la misma;

b) la región determinante de complementariedad CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 6 o una variante de la misma; y

c) la región determinante de complementariedad CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma; y

una región variable de cadena ligera que comprende

d) la región determinante de complementariedad CDR1 de VK que comprende la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma;

e) la región determinante de complementariedad CDR2 de VK que comprende la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma; y

f) la región determinante de complementariedad CDR3 de VK que comprende la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se puede unir a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 proinflamatorias para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos o trastornos atópicos alérgicos, en donde dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo completamente humanizado y puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende

Las secuencias de CDR anteriores CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 indicadas por el SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y el SEQ ID NO: 10, respectivamente, también pueden presentarse en el contexto de sus respectivas secuencias de cadenas pesadas y ligeras:

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal poliespecífico completamente humanizado aislado ejemplificado en el presente documento se indica mediante el SEQ ID NO: 3 y es de la secuencia de aminoácidos: QIQLVQSGPELKKPGASVKVSCRASGYPFTNSGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYNGEPTYTDDFKGRFAFSLETS ASTAYLQINNLRNEDTATYFCASHSY GSSYAMDNWGQGTSVTVSS

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal poliespecífico humanizado aislado ejemplificado en el presente documento se indica en el presente documento mediante el SEQ ID NO: 4 y es de la secuencia de aminoácidos:

DIVLTQ SPD SLA V SLGERATIN CKAS Q S VD YDGD S YMNWYQQKPGQPPKLLIYV

ASNLKSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEEPWTFGGGTKVEI

K

Por lo tanto, en realizaciones adicionales, el anticuerpo poliespecífico aislado para su uso de acuerdo con la invención es un anticuerpo completamente humanizado que comprende la región variable de cadena pesada indicada por el SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma y la región variable de cadena ligera indicada por el SEQ ID NO: 4 o una variante de la misma.

La presente divulgación también puede abarcar variantes de las regiones variables de cadena pesada y ligera. Las variantes pueden incluir mutaciones en las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas pesada y ligera que no alteran la actividad de los anticuerpos descritos en el presente documento, o en la región marco conservada.

Por el término "variante" se entiende secuencias de aminoácidos o nucleótidos distintas a las secuencias específicamente identificadas en el presente documento, en la que se delecionan, sustituyen o añaden uno o más restos de aminoácido o nucleótidos.

Debe apreciarse que por el término "añadido", como se usa en el presente documento, se entiende cualquier adición de restos de aminoácido a las secuencias descritas en el presente documento.

Las variantes abarcan diversas sustituciones de aminoácidos. Un "sustitución" de aminoácido es el resultado del reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares o distintas. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse sobre la base de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o en la naturaleza anfipática de los restos implicados.

Normalmente, las variantes abarcan sustituciones conservativas de aminoácidos. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. #

Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene otros aminoácidos ilustrativos que son sustituciones conservativas entre sí:

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1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M).

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Las sustituciones de ácidos nucleicos conservativas son sustituciones de ácidos nucleicos que dan como resultado sustituciones de aminoácidos conservativas como se define anteriormente.

Las variantes divulgadas en el presente documento también pueden abarcar sustituciones de aminoácidos no polares a polares y viceversa.

Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" o "resto de aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que actúan de manera similar a los aminoácidos de origen natural.

Las secuencias variantes se refieren a secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos que pueden caracterizarse por el porcentaje de identidad de sus secuencias de aminoácidos o de nucleótidos con las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos descritas en el presente documento (por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos descritos en el presente documento).

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Las secuencias variantes como se definen en el presente documento pueden referirse a secuencias de ácido nucleico que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera, cada una con una secuencia de nucleótidos con al menos el 70 % o el 75 % de identidad de secuencia, aproximadamente el 80 % o el 85 % de identidad de secuencia, aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia en comparación con las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas en el presente documento.

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El anticuerpo monoclonal humanizado poliespecífico aislado que se divulga en el presente documento puede ser en donde su región variable de cadena pesada está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 70 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico del dominio variable de cadena pesada indicado por el SEQ ID NO: 1 y en donde su región variable de cadena ligera está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es al menos el 70 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico del dominio variable de cadena ligera indicado por el SEQ ID NO: 2.

Por la expresión "actividad de los anticuerpos" se entiende la capacidad de los anticuerpos de unirse a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3, y preferentemente de inhibir una función biológica mediada por tales quimiocinas de unión a CCR3.

Los ejemplos no limitantes de tales funciones biológicas son: la inhibición del reclutamiento celular o la quimiotaxia (por ejemplo, el reclutamiento o la quimiotaxia de eosinófilos o monocitos o fibroblastos), la inhibición de la transición de fibroblastos a mioblastos o la reducción de la activación celular (por ejemplo, medida por la captación de Ca+). Las funciones biológicas se pueden medir in vivo o in vitro utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Varios de estos ensayos se describen en los Ejemplos a continuación.

Los experimentos in vitro adicionales para determinar la unión del anticuerpo preparado de acuerdo con la invención a su proteína diana incluyen, por ejemplo, ensayos de ELISA.

La presente divulgación puede abarcar además cualquier fragmento de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal poliespecífico aislado divulgado en el presente documento. Dichos fragmentos de unión a antígeno pueden ser, por ejemplo, Fab y F (ab')2, que son capaces de unirse al antígeno. Dichos fragmentos pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2).

El anticuerpo monoclonal poliespecífico aislado divulgado en el presente documento puede ser un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en Fv, Fv monocatenario (scFv), región variable de cadena pesada capaz de unirse al antígeno, región variable de cadena ligera capaz de unirse al antígeno, Fab, F(ab)2' y cualquier combinación de los mismos.

De manera interesante, utilizando mapeo epitópico, los inventores identificaron un epítopo específico en la Eotaxina 1, eotaxina 2, Rantes y MCP-3 a los que se une el anticuerpo de la invención (hCM101).

El epítopo al que se une el anticuerpo de la invención (hCM101) en Eotaxina-2 comprende la secuencia de aminoácidos CMFFVSKRIP indicada por el SEQ ID NO: 15, en Eotaxina-1, el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos CFNLANRKIPLQRL indicada por el SEQ ID NO: 16, en rantes, el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos AYIARPLPRAHIKEYFY indicadas por el SEQ ID NO: 17 y en MCP3 el epítopo comprende la secuencia de aminoácidos CCYRFINKKI indicada por el SEQ ID NO: 18 (la "primera parte del bucle en N") y la secuencia de aminoácidos SYRRTTSSH indicada por el SEQ ID NO: 19 (la "segunda parte del bucle en N").

Como es evidente a partir del alineamiento de secuencias de estos epítopos mostrado en la Figura 20B, las secuencias de aminoácidos de estos epítopos no son idénticas. Sin embargo, como se demuestra esquemáticamente en la Figura 21 A-D, todos estos epítopos están ubicados en la misma región dentro de la quimiocina de unión a CCR3, a saber, en la región del bucle en N y evidentemente forman una estructura tridimensional exclusiva que es reconocida por hCM101. En otras palabras, hay un epítopo conformacional común en el bucle en N de la Eotaxina 1, eotaxina 2, Rantes y MCP-3 al que se une un anticuerpo de la invención (hCM101).

Como se usa en el presente documento, la expresión "epítopo conformacional" se refiere a un determinante antigénico, la parte de un antígeno que es reconocida por el anticuerpo, que se compone de secciones continuas o discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno. Los epítopos conformacionales interactúan con el sitio de unión del anticuerpo en función de las características y la forma de la superficie tridimensional, o estructura terciaria, del antígeno. En determinados casos, tales epítopos pueden identificarse en parte por una secuencia lineal y por su posición relativa en la estructura del polipéptido y por los aminoácidos característicos que se encuentran dentro del epítopo identificado.

Por la expresión "región del bucle en N" se entiende el bucle en N y el giro hacia la primera cadena beta situados en el extremo N de las quimiocinas de unión a CCR3. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 21A (donde se muestra la superficie proteica de la Eotaxina-2) y en la Figura 21E (un diagrama de cintas de Eotaxina-2), en la quimiocina de unión a CCR3 Eotaxina-2, la región del bucle en N comprende la secuencia de aminoácidos CMFFVSKRIP denominada SEQ ID NO: 15.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado, en donde el epítopo conformacional puede comprender secuencias de aminoácidos seleccionadas de las secuencias de aminoácidos indicadas por el SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

De manera interesante, el análisis bioinformático del epítopo conformacional que se encuentra en la región del bucle en N de la Eotaxina 1, eotaxina 2, Rantes y MCP-3 reveló varios restos de aminoácidos con carga positiva colocados dentro de la porción de secuencia de aminoácidos consecutiva del epítopo como se definió anteriormente, o en sus proximidades. Los esquemáticamente se muestran esquemáticamente en las Figuras 20 y 21. De acuerdo con el análisis bioinformático, el anticuerpo se une a una región dentro de la quimiocina de unión a CCR3 que incluye una estructura formada en la región del bucle en N e implica restos de aminoácidos en las posiciones Lys-14 y Arg-15 (ubicados dentro del epítopo indicado por el SEQ ID NO: 15) y Arg -20 en la Eotaxina 2, las posiciones Arg-16 y Lys-17 (ubicadas dentro del epítopo indicado por el SEQ ID NO: 16) y Arg-22 en la Eotaxina 1, las posiciones Arg-17 (ubicadas dentro del epítopo indicado por el SEQ ID NO: 17), His-23 y Arg-21 en Rantes, y las posiciones Lys-18 y Lys-19 (ubicadas dentro del epítopo indicado por el SEQ ID NO: 18) y Arg-24 en MCP3. Posiciones de aminoácidos identificadas dentro de cada una de las secuencias de las quimiocinas se refiere a la secuencia de la quimiocina sin el péptido señal N-terminal, como se muestra en los SEQ ID NO: 11-14 que corresponden respectivamente a la secuencia de aminoácidos (sin el péptido señal N-terminal) de la eotaxina 2, eotaxina 1, Rantes y MCP3.

Por el término "posición" se refiere a la ubicación dentro de la secuencia de aminoácidos, en dónde la "posición 1" indica el primer resto de aminoácido N-terminal después del péptido señal (a saber, la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro), la "posición 2" indica el resto de aminoácido que está secuencia abajo del resto de aminoácido N-terminal y así sucesivamente en la dirección de N-terminal a C-terminal, como se conoce en la técnica.

Por el término "concentración relativamente alta" de restos de aminoácido positivos significa al menos tres restos de aminoácido positivos, por ejemplo, tres restos de aminoácido positivos.

Por lo tanto, la divulgación proporciona adicionalmente un anticuerpo aislado que puede unirse a un epítopo conformacional en la región del bucle en N de una quimiocina de unión a Cc r 3, en donde dicho epítopo conformacional se caracteriza por una concentración relativamente alta de restos de aminoácido positivos ubicados entre las posiciones de aminoácidos 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3.

La presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado, en donde el epítopo conformacional puede comprender al menos tres restos de aminoácido positivos entre las posiciones de aminoácido 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3.

Dichos restos de aminoácido positivos pueden seleccionarse del grupo que consiste en Arg, Lys y His.

El anticuerpo aislado divulgado en el presente documento puede unirse a un epítopo que comprende los restos de aminoácido en las posiciones Lys-14, Arg-15 y Arg-20 en la Eotaxina 2, posiciones Arg-16, Lys-17 y Arg-22 en la Eotaxina 1, posiciones Arg-17, His-23 y Arg-21 en Rantes, y posiciones Lys-18, Lys-19 y Arg-24 en MCP3.

El epítopo común como se define anteriormente también puede servir para la exploración e identificación de anticuerpos adicionales que tienen capacidades de unión poliespecífica a varias quimiocinas de unión a CCR3. Dichos anticuerpos tendrían una alta probabilidad de ser activos en la atenuación de la migración celular mediada por estas quimiocinas.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de exploración e identificación de anticuerpos capaces de atenuar de forma eficaz las propiedades migratorias de al menos una de las células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 o CCR5.

Dicho método puede comprender:

a. obtener anticuerpos dirigidos contra una quimiocina de unión a CCR3; y

b. evaluar la unión de dichos anticuerpos a un epítopo conformacional en la región del bucle en N de una quimiocina de unión a CCR3, en donde dicho epítopo conformacional se caracteriza por una concentración relativamente alta de restos de aminoácido positivos ubicados entre las posiciones de aminoácidos 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3;

c. seleccionar anticuerpos que se unan a dicho epítopo conformacional;

en donde los anticuerpos que se unen específicamente a dicho epítopo conformacional son capaces de atenuar de forma eficaz las propiedades migratorias de células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 y CCR5.

Dicho epítopo conformacional puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos indicadas por el SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, S^eQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 19.

La etapa de evaluación de la unión se puede realizar poniendo los anticuerpos en contacto con dicho epítopo conformacional, por ejemplo, incubando los anticuerpos con un fragmento de la quimiocina que comprende el bucle en N, o incubando los anticuerpos con al menos una de las secuencias de aminoácidos indicadas por el SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 19. La incubación se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica para evaluar la unión antígeno-anticuerpo, por ejemplo, mediante ELISA o mediante el uso de un chip que contenga múltiples fragmentos de aminoácidos. La incubación se realiza en presencia de un tampón de unión y la unión del anticuerpo se evalúa, por ejemplo, mediante una incubación adicional con un segundo anticuerpo marcado de forma detectable.

Como se usa en el presente documento, la expresión "exploración e identificación" se refiere a la evaluación de la capacidad de un anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos para unirse al epítopo de la invención como se define anteriormente y a la selección de anticuerpos que se unen al epítopo y, por lo tanto, se espera que atenúen la actividad de la quimiocina de unión a CCR tras la unión a la quimiocina.

Específicamente, un epítopo conformacional puede comprender restos de aminoácido en las siguientes posiciones: Lys-14, Arg-15 y Arg-20 en la Eotaxina 2 (la secuencia de aminoácidos de la misma se indica mediante el SEQ ID NO: 11), Arg-16, Lys-17 y Arg-22 en la Eotaxina 1 (la secuencia de aminoácidos de la misma se indica mediante el SEQ ID NO: 12), Arg-17, His-23 y Arg-21 en Rantes (la secuencia de aminoácidos de la misma se indica mediante el SEQ ID NO: 13), y Lys-18, Lys-19 y Arg-24 en MCP3 (la secuencia de aminoácidos de la misma se indica mediante el SEQ ID NO: 14).

El epítopo conformacional identificado que se divulga en el presente documento también se puede utilizar como antígeno para generar anticuerpos capaces de atenuar de forma eficaz las propiedades migratorias de al menos una de las células que expresan CCR3, CCR1, CCR2 o CCR5. Por lo tanto, adicionalmente, la presente divulgación proporciona una región de bucle en N aislada de una quimiocina de unión a CCR3 que comprende un epítopo conformacional, en donde dicho epítopo conformacional puede caracterizarse por una concentración relativamente alta de restos de aminoácido positivos ubicados entre las posiciones de aminoácidos 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3, para la generación de anticuerpos contra dicha quimiocina de unión a CCR3. Dicha región del bucle en N aislada puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos indicadas por el SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 19.

La presente divulgación proporciona una región de bucle en N aislada de una quimiocina de unión a CCR3 que comprende un epítopo conformacional, en donde dicho epítopo conformacional puede caracterizarse por una concentración relativamente alta de restos de aminoácido positivos ubicados entre las posiciones de aminoácidos 14 y 24 en la secuencia de aminoácidos de dicha quimiocina de unión a CCR3, para su uso en un método de generación de anticuerpos contra dicha quimiocina de unión a CCR3. Específicamente, dicha región del bucle en N aislada puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos indicadas por el SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y el SEQ ID NO: 19.

La presente divulgación proporciona además un método para la generación de anticuerpos capaces de atenuar de forma eficaz las propiedades migratorias de al menos una de las células que expresan ^cCR3, CCR1, CCR2 o CCR5, que comprende la obtención del epítopo de la invención y la producción de un anticuerpo contra dicho epítopo utilizando cualquier método conocido en la técnica.

Los métodos para vacunar animales y generar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica.

En otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención.

La expresión "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" como se define en el presente documento se refiere a un polímero de nucleótidos, que puede ser monocatenaria o bicatenaria, que es un polinucleótido tal como el ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando sea apropiado, el ácido ribonucleico (ARN). También debe entenderse que las expresiones incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN elaborados a partir de análogos de nucleótidos y, polinucleótidos monocatenarios (tal como de sentido o antisentido) y bicatenarios. El término ADN utilizado en el presente documento también incluye ADNc, es decir, ADN complementario o copia producido a partir de un molde de ARN por la acción de la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de Ar N).

La invención proporciona además un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada como se define en el presente documento.

"Vector de expresión" a veces denominado "vehículo de expresión" o "construcción de expresión", como se usa en el presente documento, abarca vectores tales como plásmidos, virus, bacteriófago, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos, que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del hospedador. Los vectores de expresión son normalmente construcciones de ADN o ARN autorreplicantes que contienen el gen deseado o sus fragmentos, y elementos de control genético unidos operativamente que son reconocidos en una célula hospedadora adecuada y efectúan la expresión de los genes deseados. Estos elementos de control son capaces de efectuar la expresión dentro de un hospedador adecuado. El vector de expresión divulgado en el presente documento puede ser competente con la expresión en células hospedadoras bacterianas, de levadura o de mamífero, por nombrar algunas.

En aún otro de sus aspectos, la presente invención proporciona una célula hospedadora transfectada con la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la invención o con el vector de expresión de acuerdo con la invención.

La expresión "células hospedadoras" como se usa en el presente documento se refiere a células que son susceptibles de introducirles la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la invención o el vector de expresión de acuerdo con la invención. Preferentemente, dichas células son células de mamífero, por ejemplo, células CHO o células NS0. La transfección de la molécula de ácido nucleico aislada o el vector de expresión de acuerdo con la invención en la célula hospedadora se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica.

La presente divulgación proporciona un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación y un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antiinflamatorio.

El término "inmunoconjugado" como se define en el presente documento se refiere a un anticuerpo o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación que puede conjugarse (ligarse o unirse) a un agente adicional. Los inmunoconjugados pueden prepararse por cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, entrecruzando el agente adicional con el anticuerpo de la presente divulgación o mediante métodos de ^aDⁿrecombinante.

El anticuerpo poliespecífico divulgado en el presente documento puede administrarse en combinación con al menos un agente terapéutico adicional.

La expresión "agente terapéutico adicional" usado en el presente documento se refiere a cualquier agente que pueda usarse para tratar enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos o trastornos atópicos alérgicos. El agente terapéutico adicional puede ser un agente antiinflamatorio o un agente antifibrótico adicional. Dicho al menos un agente terapéutico adicional puede seleccionarse de un grupo que consiste en quimioterápicos, citocinas, péptidos, anticuerpos y antibióticos.

Dicho agente terapéutico adicional puede incluir, pero sin limitación, metotrexato, un esteroide, ciclosporina, los AINE (fármacos antiinflamatorios no esteroideos), esteroides, interferón beta, inmunoglobulina intravenosa (IGIV), pirfenidona, nintedanib, bosentán o macicentán.

El agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo adicional. La expresión "anticuerpo adicional" como se define en el presente documento se refiere a un anticuerpo, que no es el anticuerpo divulgado en el presente documento, que puede usarse en combinación con el anticuerpo divulgado en el presente documento. Dicho anticuerpo puede estar dirigido, como un ejemplo no limitante, contra TNFa, el receptor de TNF, el receptor de IL6 o CD20.

La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende como principio activo el anticuerpo poliespecífico aislado de la invención, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo o el inmunoconjugado como se define en el presente documento y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La "composición farmacéutica" divulgada en el presente documento puede comprender en general el anticuerpo o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en el presente documento y un agente tamponante, un agente que ajuste la osmolaridad de la composición y, opcionalmente, uno o más vehículoes, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos y similares, como se conoce en la técnica. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. Cada vehículo debe ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes y no dañino para el sujeto. Salvo que algún medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en la composición terapéutica.

Como se divulga en el presente documento, la composición farmacéutica puede comprender además un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente antiinflamatorio.

En realizaciones específicas, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 proinflamatorias, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma y una región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 4, o una variante de la misma.

Además, se proporciona un método de profilaxis, tratamiento o mejora de trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos atópicos alérgicos o enfermedades fibróticas, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo poliespecífico aislado o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica divulgada en el presente documento.

La divulgación proporciona además un método de profilaxis, tratamiento o mejora de trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos atópicos alérgicos o enfermedades fibróticas que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede unirse a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 proinflamatorias, en donde el anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma y una región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 4, o una variante de la misma.

Los términos "sujeto" o "paciente" se usan indistintamente y se refieren a un sujeto que puede beneficiarse de la presente divulgación, tal como un mamífero (por ejemplo, un cánido, un felino, un ovino, un porcino, un equino, un bovino o un ser humano). Específicamente, dicho paciente puede ser un ser humano.

Por el término "profilaxis", como se define en el presente documento, significa proporcionar un "tratamiento preventivo" o "tratamiento profiláctico", a saber, actuar de manera protectora, para defenderse de o prevenir trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos atópicos alérgicos o enfermedades fibróticas, o un episodio de dicha enfermedad.

Debe entenderse que los términos "que incluye", "que trata", "tratamiento" o formas de los mismos, como se usan en el presente documento, significan reducir, prevenir, curar, invertir, mejorar, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener los efectos perjudiciales de una enfermedad o afección, o retrasar la aparición de uno o más indicios clínicos de una enfermedad que se ve afectada por quimiocinas de unión a CCR3. Dichas enfermedades incluyen trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos alérgicos atópicos o enfermedades fibróticas.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a reducir, prevenir, curar, invertir, atenuar, aliviar, minimizar la supresión o detener los efectos perjudiciales de una enfermedad o afección mediada por la eotaxina 2.

La administración como se divulga en el presente documento puede realizarse por cualquiera de las siguientes vías: administración oral, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal o subcutánea; administración intrarrectal; administración intranasal, administración ocular o administración tópica.

La administración como se divulga en el presente documento puede realizarse por vía intravenosa. Dicha administración puede realizarse por vía intraperitoneal. Dicha administración puede realizarse por inhalación.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos como se define en el presente documento, cualquier composición farmacéutica que comprenda a los mismos o cualquier conjugado que los comprenda, pueden administrarse a un sujeto antes o después del inicio de la enfermedad.

El método de profilaxis, tratamiento o mejora de trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos atópicos alérgicos o enfermedades fibróticas divulgado en el presente documento es cuando dicho anticuerpo poliespecífico humanizado aislado o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo divulgado en el presente documento, o la composición farmacéutica como se divulga en el presente documento, puede administrarse a dicho sujeto antes o después del inicio de la enfermedad.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo monoclonal aislado o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo divulgado en el presente documento, o la composición farmacéutica divulgada en el presente documento para los fines definidos en el presente documento se determina mediante las consideraciones que se conocen en la técnica con el fin de curar, detener o al menos aliviar o mejorar la afección médica. Para cualquier preparación utilizada en los métodos divulgados en el presente documento, la dosificación o la cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro de cultivo celular o basados en modelos animales tales como los modelos animales detallados en el presente documento.

Dicha cantidad terapéuticamente eficaz divulgada en el presente documento puede estar en el intervalo de 0,01 a 100 mg/kg.

Dicha cantidad terapéuticamente eficaz divulgada en el presente documento puede estar en el intervalo de 0,01 a 40 mg/kg, 0,1 a 40 mg/kg o 1 a 10 mg/kg.

El anticuerpo poliespecífico humanizado aislado o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo divulgado en el presente documento o la composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede administrarse al sujeto como una dosis única o como dosis múltiples.

La expresión "sujeto que lo necesita" como se divulga en el presente documento significa animales de sangre caliente, tales como, por ejemplo, ratas, ratones, perros, gatos, cobayas, primates y humanos que padecen trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos alérgicos atópicos o enfermedades fibróticas.

La presente divulgación proporciona además el anticuerpo poliespecífico humanizado aislado o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo como se divulga en el presente documento o la composición farmacéutica como se divulga en el presente documento para su uso en un método de profilaxis, tratamiento o mejora de trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos alérgicos atópicos o enfermedades fibróticas.

Específicamente, la divulgación proporciona además un anticuerpo poliespecífico humanizado aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede unirse a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 proinflamatorias, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 3 o una variante de la misma y una región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos indicada por el SEQ ID NO: 4, o una variante de la misma para uso en un método de profilaxis, tratamiento o mejora de trastornos inflamatorios autoinmunitarios, trastornos relacionados con los monocitos, trastornos alérgicos atópicos o enfermedades fibróticas.

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Se aprecia que el término " purificado" o "aislado" se refiere a moléculas, tales como secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico, péptidos, polipéptidos o anticuerpos que se extraen de su entorno natural, aislado o separado. Por lo tanto, un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo purificado. Como se usa en el presente documento, la expresión "purificado" o "purificar" también se refiere a la eliminación de contaminantes de una muestra.

Materiales y métodos

ELISA de especificidad

La especificidad de CM101 se evaluó mediante ELISA. Las placas se recubrieron con los siguientes antígenos: eotaxina 1, eotaxina 2, proteína quimiotaxina de monocitos -3 (CCL7) y RANTES (CCL5). Todo recubierto a 1 pg ml-1 a 4 °C durante una noche. Después de lavar (PBS Tween 20 al 0,1 %), se añadió hCM101 (5 pg) a la placa durante 1 h. Después de lavar de nuevo, CM101 se detectó con conjugado de anti-humano peroxidasa de rábano picante (1 h de incubación con una dilución 1:5000 en PBS) y se cuantificó usando sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma Chemical, Gillingham, RU). La reacción se detuvo después de 10 min con ácido sulfúrico (50 pl 2 M) y se midió la densidad óptica a 450 nM.

Inmunohistoquímica:

Se realizó tinción inmunohistoquímica para Eotaxina 2 /CCR3 humanas en cortes congelados de 5 pm de grosor de biopsias de piel/pulmón de pacientes con esclerodermia. Después de la fijación con metanol y acetona, los cortes se bloquearon con sueros no inmunes de conejo y cabra, seguido de incubación con reactivo de bloqueo CAS. Posteriormente, se añadió el anticuerpo primario (anticuerpos anti-Eotaxina-2 o anti-CCR3) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron anticuerpos de cabra anti-ratón/conejo biotinilados y purificados por afinidad (Jackson). A continuación, los portaobjetos se incubaron con H2O2 al 0,3 %, seguido de aclarados adicionales e incubación con conjugado de estreptavidina-peroxidasa (Jackson) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se revelaron con sustrato 3-amino-9 etilcarbazol (Dako) durante 15 minutos y se contratiñeron con hematoxilina. Se usaron tinciones de H y E y tricrómico de Masson para el análisis de cambios de la inflamación pulmonar y de la fibrosis en cortes de piel y pulmón.

Ensayo de precipitación

Se empleó precipitación usando el protocolo de dynabeads (lifetechnology). Se incubaron concentraciones crecientes de CM101 con perlas magnéticas (1 mg) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Después, se realizó separación magnética seguida de incubación durante la noche con sueros humanos (de pacientes con esclerosis generalizada). La separación magnética y la elución de la quimiocina a partir de las perlas se realizaron después de la transferencia a una membrana de nitrocelulosa y la exposición a un anticuerpo comercial anti Eox2. La capacidad de hCM101 para unirse a la eotaxina 1, Rantes y MCP-3 también se evaluó mediante electroforesis en gel SDS.

Ensayos de quim iotaxia

Aml 14.3D10, una línea celular eosinofílica que expresa de forma estable CCR3 se lavó una vez en PBS y se resuspendió a 107 células ml-1 en tampón de ensayo (RPMI 1640, BSA sin de endotoxinas al 1 %, penicilina 100 U ml-1 y estreptomicina 100 pg ml-1). Se incubó hCM101 en diferentes concentraciones (10‘7 M-10'9 M) con una combinación de eotaxina-1 humana 5 nM y eotaxina-2 o MCP-3 y RANTES (30 min, 37 °C) y se colocó en las cámaras inferiores de placas Transwell de 24 pocillos con poros de 5 pm (Costar); se colocaron 100 pl de células (1 x 106 células) en la cámara superior de cada placa Transwell, y el ensayo se incubó a 37 °C durante 4 h (CO2 al 5 %). Las células vivas que migran a la cámara inferior se contaron usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, Cowley, RU). Los resultados se expresan como porcentaje de la migración de control (es decir, inducida por quimiocinas).

También se realizaron experimentos con la línea celular de monocitos U937 que expresa CCR1, CCR3 y CCR5. Para evaluar la capacidad de hCM101 para inhibir su migración, hCM101 se incubó con una mezcla 5 nM de MCP-3 y RANTES y se colocó en las cámaras inferiores de placas Transwell de 24 pocillos con poros de 5 pm (Costar). El ensayo se realizó como se describe anteriormente.

Para las células positivas para CD14, se utilizaron perlas magnéticas de separación MACS (Milteny) en las CMSP en Ficoll aisladas de sangre entera de pacientes con esclerodermia. La migración de células CD14+ hacia MCP3 y RANTES se evaluó como se describe anteriormente. Además, se examinó la migración de células CD14- hacia Eotaxina 1, 2 y RANTES tratadas con hCM101.

Para evaluar la quimiotaxia de las células adherentes (fibroblastos-NHDF) en respuesta a la Eotaxina 2, se utilizó un transpocillo con un tamaño de poro de 8 pm (Costar) recubierto con fibronectina. Después de que la eotaxina 2 se incubó con hCM101 durante 30 minutos, se añadieron células NHDF (5X104 células) a la cámara superior y se incubaron a 37 °C durante 4 h. Después, las células que no migraban se eliminaron de las membranas de inserción con hisopos de algodón. La membrana se fijó con paraformaldehído al 4 % y luego las células migradas se tiñeron con azul de commassie. El número de células que migran se contó en tres campos aleatorios usando un microscopio invertido y se analizó usando el programa informático image pro.

Ensayo de activación de calcio:

Se incubaron las células (2x106 células/ml) en PBS / (calcio magnesio +) con sensor de calcio (Flou4-AM, invitrogen) hasta una concentración final de 4 pM durante 30 min a 370. Después, las células se lavaron y se incubaron durante otros 30 min en 370 en 500 ul de PBS /+. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo durante 30 segundos (láser 488, filtro 520), luego se estimularon con eotaxina 2100 ng/ml (con o sin preincubación con hCM101) y se procedió inmediatamente a la lectura de flujo.

Tinción intracelular de citometría de flujo:

Los fibroblastos se incubaron durante 24 h con CM101 (10 o 5 pg/ml) y sueros humanos. Luego las células se trataron con tripsina, se fijaron con etanol al 70 % y se incubaron con Ac anti a SMA con las células (Biolegend) durante 0,5 h a temperatura ambiente. A continuación, las células se lavaron y se sometieron a Ac secundario de burro a IgG de conejo Cye3 (1:300 en PBS) durante 0,5 h a temperatura ambiente. Las células se analizaron a través de un citómetro de flujo.

Modelo in vivo de esclerodermia

Se disolvió bleomicina (sigma) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 100 pg/ml.

Modelo de prevención:

La esclerosis generalizada se indujo mediante inyecciones subcutáneas diarias de 50 pg de bleomicina en ratones C3H hembra con una edad de 6 semanas durante 21 días. Se inyectó CM-101 (en dosis de 5 pg, 10 pg, 20 pg o 50 pg), inmunoglobulina G1 (IgG1) o PBS en días alternos (comenzando el día 1) en paralelo con el inicio de las inyecciones de bleomicina.

Modelo de tratamiento:

Se trataron ratones C3H hembra de 6 semanas de edad con inyecciones subcutáneas de bleomicina (50 pg al día) durante 20 días. A partir de los ocho días siguientes al inicio de la administración diaria de bleomicina, los ratones se trataron diariamente con 50 pg/día en inyecciones intraperitoneales de 100 pl de CM-101 o PBS y se sacrificaron el día 21. De manera significativa, el inicio del tratamiento con CM-101 se produjo después del inicio de los síntomas de la enfermedad.

A continuación, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron biopsias en sacabocados de 6 mm de grosor total del sitio de inyección. Se recogió tejido cutáneo para obtener bloques de parafina y congelados y para un ensayo de colágeno. Además, se recolectó sangre del seno orbital. Para finalizar, se recogieron los pulmones para las características histológicas y se realizó un lavado broncoalveolar (BAL) para examinar los porcentajes de leucocitos (en PBS que contenía Bs A al 0,1 % y EDTA 0,05 mM).

Modelo FPI in vivo:

Modelo de prevención-

Se trataron ratones C57BL macho de 7 semanas de edad con una dosis única de BLM (60 pg/ratón) mediante inyección intratraqueal con anestesia con isoflurano. Se disolvió BLM en PBS. Después de la inyección, los ratones se colocaron en posición vertical y se rotaron durante 1 min. Se inyectó CM-101 (en dosis de 10 pg, 50 pg o 100 pg), inmunoglobulina G1 (IgG1) o PBS en días alternos (comenzando el día 1) en paralelo con el inicio de la inyección de bleomicina.

Modelo de tratamiento:

Se tratarán ratones C57BL macho de 7 semanas de edad con una dosis única de BLM (60 pg/ratón) mediante inyección intratraqueal con anestesia con isoflurano. Se disolvió BLM en PBS. Después de la inyección, los ratones se colocaron en posición vertical y se rotaron durante 1 min. Nueve días después de la administración de bleomicina, los ratones se trataron diariamente con 10 o 50 pg/día en inyecciones intraperitoneales de 100 pl de CM-101, IgG o PBS y se sacrificaron el día 21. De manera significativa, el inicio del tratamiento con CM-101 se produjo después del inicio de los síntomas de la enfermedad. Nueve días después de las inyecciones de bleomicina, se sacrificó el grupo de PBS y bleomicina para evaluar la fibrosis e inflamación de referencia. El día 21 también se sacrificaron los grupos restantes.

Se sacrificaron los ratones y se recogieron los pulmones para las características histológicas y la medición de colágeno (sircol). Se recogió lavado broncoalveolar (BAL) para examinar los porcentajes de leucocitos (en PBS que contenía BSA al 0,1 % y EDTA 0,05 mM).

Medición del contenido de colágeno

El colágeno soluble se cuantificó utilizando el ensayo de colágeno soluble Sircol (Biocolor, Belfast, RU). Se obtuvieron muestras de piel de ratones esclerodérmicos tratados con CM101 (5, 20 o 100 pg/ml), IgG o PBS. Las muestras se extrajeron en solución de ácido-pepsina. Se analizó el contenido de colágeno de las muestras de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 100 pl de muestra a 1 ml del reactivo colorimétrico (el colorante SR en ácido pícrico) y se agitó durante 30 min seguido de centrifugación a 10.000 g durante 10 min. El colorante SR se liberó del sedimento con reactivo alcalino (NaOH 1 N) y se tomaron lecturas espectrofotométricas a 555 nm en un lector de microplacas.

Ensayo de BAL:

El ensayo de BAL se realizó como se describió anteriormente (Komai et al, 2010). Se canuló la tráquea y se lavó el pulmón 4 veces con 0,5 ml de PBS sin calcio y magnesio que contenía BSA al 0,1 % y EDTA-2Na 0,05 mM. Este procedimiento se repitió tres veces (volumen total: 1,3 ml, recuperación > 85 %). El BAL de cada animal se agrupó en un tubo de plástico, enfriado en hielo y se centrifugó (150 x g) a 4 °C durante 10 min. Los sedimentos celulares se resuspendieron en el mismo tampón (0,5 ml). El recuento diferencial de células se realizó mediante citometría de flujo.

Niveles de quim iocinas

Se determinaron los niveles de Eotaxina -1, Eotaxina -2 y Rantes en el suero de pacientes con esclerodermia y de donantes sanos utilizando los siguientes kits de Elisa: Quantikine human CCL11/Eotaxin, CCL24/Eotaxina-2 y CCL5/Rantes (R&D), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Mapeo epitópico

El CHIP KMC se bloqueó con Tween-20 al 0,05 %, Triton X-100 al 0,05 % en tampón TBS, pH 7,0, 4 °C, durante una noche. El CHIP se lavó con 1 ml de 1 xTBS con Tween-20 al 0,05 % y Triton X-100 al 0,05 %, pH 7,0 y exploró a 635 nm y TFM 700. Después, para detectar la unión al epítopo de CM101, el CHIP se lavó con 1 ml de tampón de unión a 4 °C durante 20 min y se incubó con 1 pg/ml de hCM101 en tampón de unión (pH 7,4) a 4 °C durante 2 horas; Después de la incubación, el CHIP se lavó y se incubó con conjugado de IgG anti-humano Alexa 647 10 ng/ml en tampón de unión (pH 7,4) a 4 °C durante 1 hora. El CHIP se lavó nuevamente y se exploró a 635 nm y TFM 700.

Ensayo de Biacore

La constante de afinidad de hCM101 o CM101 murino se evaluó usando Biacore T100. Este método utiliza el fenómeno electroóptico de resonancia de plasmón superficial (RPS) para medir las constantes de unión y las tasas on/off entre los compañeros de unión. La Eotaxina 2 se inmovilizó covalentemente sobre la superficie de un chip CM-5 y se pasó una solución de CM101 sobre la superficie. Se midieron los cambios en el ángulo de RPS y permitieron determinar la KD.

Ensayo de proliferación de linfocitos T de evolución temporal Episcreen

Se descongelaron CMSP de 20 donantes sanos, se contaron y se evaluó la viabilidad. Para cada donante, se establecieron cultivos grandes en los que se añadió 1 ml de reserva de células de proliferación a los pocillos apropiados de una placa de 24 pocillos. Se añadieron 0,5 ml de medio de cultivo y 0,5 ml de cada hCM101 diluido a las CMSP para obtener una concentración final de 50 ug/ml por muestra. Para cada donante también se incluyó un control de reproducibilidad (KLH 100 ug/ml) y un pocillo con medio de cultivo solo. Los cultivos se incubaron durante un total de 8 días a 37 °C con CO2 al 5 %. En los días 5, 6, 7 y 8, las células de cada pocillo se pulsaron con 0,75 uCi de [3H]-timidina (Perkin Elmer, RU) en 100 ul de medio de cultivo AIM-V y se incubaron durante 18 horas antes de la recogida utilizando TomTec Mach III. Las cuentas por minuto (cpm) se determinaron mediante recuento de centelleo Meltilex (Perkin Elmer, RU).

Ejemplo 1 El tratam iento con Acm anti eotaxina 2 CM101 reduce las características de la esclerodermia en un modelo de ratón

Para examinar la participación potencial de las quimiocinas de unión a CCR3 en la esclerodermia, se evaluaron los niveles de Eotaxina 1, 2 y RANTES en el suero de pacientes con esclerodermia en comparación con sujetos sanos. Los resultados indicaron un aumento significativo en los niveles de Eotaxina 2 y RANTES (vp<0,05) como se muestra en la figura 1A y 1B, respectivamente. Además, se detectó una expresión significativamente elevada tanto de Eotaxina 2 como de su receptor, CCR3, en biopsias de piel tomadas de pacientes con esclerodermia (datos no mostrados). Por tanto, es posible que la activación de la ruta de Eotaxina-2/CCR3 pueda estar operativa en la esclerodermia.

La importancia de la eotaxina 2 para la esclerodermia se evaluó adicionalmente utilizando CM101. CM101 es un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la eotaxina 2 (documento WO2010/086854). La constante de afinidad (Kd) de CM-101 por la eotaxina-2 murina se determinó mediante Biacore y se encontró que era 7 nM. Para evaluar el efecto del tratamiento con CM101 sobre la esclerodermia, se usó un modelo murino de esclerodermia inducida por bleomicina. Se indujo esclerodermia mediante una inyección diaria de 50 pg de bleomicina a ratones C3H durante 21 días. Se inyectó CM101 (10 pg, 20 pg o 50 pg), IgG o PBS por vía intraperitoneal cada dos días. Veintiún días después del inicio de las inyecciones de bleomicina, se obtuvieron muestras de piel y líquido BAL de todos los grupos. Los ratones se sacrificaron para evaluar la fibrosis y la inflamación broncoalveolar.

Se observó una disminución significativa de la gravedad de las características relacionadas con la esclerodermia en ratones tratados con CM-101, en comparación con los tratados con IgG1 o PBS. Como se muestra en la Figura 2 y en la Figura 3, CM-101 impidió el aumento de todos los parámetros analizados (grosor dérmico, contenido de colágeno de la piel e infiltración de leucocitos al pulmón). En la prueba de grosor dérmico (Figura 2A) se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) para cada dosis de CM-101, en comparación con el tratamiento con PBS o con IgG1 de control. El efecto preventivo de CM-101 también fue evidente en la reducción significativa de la concentración de colágeno de la piel de una manera dependiente de la dosis (reducciones del 30 %, 60 % y 84 % en los niveles de dosis de 10 pg, 20 pg y 50 pg de CM-101, respectivamente, como se muestra en la figura 2B). La determinación de distintas subpoblaciones de leucocitos en el lavado broncoalveolar murino reveló una reducción significativa de la respuesta a la dosis de los porcentajes de linfocitos y eosinófilos (Figura 3A y 3B, respectivamente).

En el modo de tratamiento, ocho días después de las inyecciones de bleomicina, se obtuvieron muestras de líquidos BAL y de piel del primer (PBS) y del segundo grupo (solo bleomicina). 21 días después del inicio de las inyecciones de bleomicina, se obtuvieron muestras de líquido BAL y de piel del tercer (bleomicina) y cuarto grupo (bleomicina CM101). Los ratones se sacrificaron para evaluar la fibrosis y la inflamación broncoalveolar.

La concentración de colágeno de la piel se redujo significativamente en un 60 % en el grupo tratado con CM-101 en comparación con el grupo tratado con bleomicina durante 21 días (Figura 4)

Además, se analizó la presencia de leucocitos en el líquido BAL utilizando análisis por citometría de flujo. La infiltración de células mononucleares y glóbulos blancos se redujo significativamente (55 % y 30 %, respectivamente) en el grupo tratado con CM-101 en comparación con el grupo tratado con bleomicina, como se muestra en la Figura 5A y 5B. En la Figura 5C-5F se presentan las figuras representativas de citometría de flujo.

Para evaluar el grosor dérmico, se realizó una tinción histopatológica con hematoxilina y eosina (H y E, Fig. 6A-D) y tricrómica de Masson (Fig. 6E-H) en las lesiones cutáneas. En primer lugar, se observó una elevación significativa del grosor dérmico después de 21 días de tratamiento con bleomicina, como puede verse en la Figura 6C y 6G. Esta elevación no se observó cuando los ratones se trataron con CM-101 a partir del día 8. Además, la tinción con H y E y tricrómica de Masson reveló una atenuación significativa de la inflamación y la fibrosis en las lesiones cutáneas del grupo tratado con CM-101 (Figura 6D y 6H) en comparación con el grupo tratado con BLM.

Ejemplo 2 El tratamiento con Acm anti eotaxina 2 CM101 reduce la FPI en un modelo de ratón

Para examinar la participación potencial de la eotaxina 2 en la fibrosis pulmonar idiopática (FPI), se evaluaron los niveles de eotaxina-2 en biopsias de pulmón de pacientes con FPI. Se encontró una expresión significativamente elevada de eotaxina-2 en biopsias de piel tomadas de pacientes con FPI (mostrado en la Figura 7). Estos datos respaldan la idea de que la vía de la eotaxina-2 puede activarse en la FPI.

El modelo común de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina se utilizó para evaluar la eficacia de CM101. Se inyectó bleomicina (60 pg por ratón) por vía intratraqueal a ratones C57/Bl el día 1. En un protocolo de profilaxis, se inyectó CM101 o IgG i.p. desde el día 1 hasta el día 14. 14 días después de la inyección de bleomicina, se obtuvieron muestras de pulmón y líquido BAL de todos los grupos. Los ratones se sacrificaron para evaluar la fibrosis y la inflamación broncoalveolar.

Se observó una inhibición significativa de las características relacionadas con la FPI en ratones tratados con CM-101, en comparación con los tratados con inmunoglobulina (IgG) o PBS. Como se muestra en la Figura 8 y en la Figura 9, la inhibición por CM-101 fue evidente en todos los parámetros analizados (concentración de colágeno e infiltración de leucocitos al pulmón). El efecto inhibidor de CM-101 fue evidente en la reducción significativa de la concentración de colágeno de una manera dependiente de la dosis (reducciones del 60 % y 70 % en los niveles de dosis de 10 pg y 100 pg de CM-101, respectivamente, como se muestra en la Figura 8). La medición de células mononucleares en el lavado broncoalveolar murino (BAL) reveló una reducción significativa (Figura 9) después del tratamiento con CM101. La medición de los niveles de Eotaxina 2 dentro del líquido BAL reveló una reducción de Eotaxina 2 dentro del líquido BAL en el grupo tratado con CM101 (Figura 10).

Para evaluar la eficacia de CM101 después del inicio de la enfermedad, se realizó un protocolo de tratamiento en el que se administró CM101 diariamente solo 10 días después de la inyección intratraqueal de BLM durante 2 semanas. La evaluación del colágeno pulmonar reveló una reducción significativa (75 %) después de tratamientos diarios con 50 pg de CM101 (Figura 11).

Además, se analizó la presencia de leucocitos en el líquido BAL utilizando análisis de citometría de flujo. La infiltración de células mononucleares y de células polimorfonucleares se redujo significativamente (55 % y 65 %, respectivamente) en el grupo tratado con CM-101 en comparación con el grupo tratado con bleomicina, como se muestra en la Figura 12A y 12B. Se realizó tinción patológica en cortes de pulmón de cada grupo y presentó una reducción significativa de la inflamación (tinción de H y E) y la deposición de colágeno (tinción tricrómica de Masson) como se muestra en la figura 13.

Un tercer modelo in vivo que se realizó fue una comparación entre CM101 y el tratamiento recientemente aprobado para la FPI: pirfenidona. La pirfenidona (5-metil-1-fenilpiridin-2[1H]-ona) es una molécula pequeña con propiedades antifibróticas y algunas depuradoras de hidroxilo que han aprobado la FDA y la EMA para el tratamiento de la FPI, ya que se demostró que ralentiza la progresión de la enfermedad en pacientes con FPI.

Se indujo la FPI como se describe en el experimento anterior. Antes de la inyección de BLM, se inyectaron ratones con 100 pg de CM101 i.p. o se los alimentó diariamente con pirfenidona 100 mg/kg/día. Las inyecciones de anticuerpos se realizaron tres veces por semana durante dos semanas, mientras que la sonda oral de pirfenidona se aplicó diariamente durante dos semanas.

Como se muestra en las figuras 14 y 15, CM101 supera a la pirfenidona en todos los parámetros analizados. La concentración de colágeno pulmonar se redujo más profundamente en los ratones tratados con CM101 en comparación con los ratones tratados con pirfenidona. Además, la medición de células mononucleares, glóbulos blancos (GB) y células polimorfonucleares en el lavado broncoalveolar (BAL) murino reveló una reducción significativa en el grupo tratado con CM101 en comparación con el grupo tratado con pirfenidona (Figura 15). La tinción histológica respalda estos resultados al mostrar menos inflamación y fibrosis en la lesión pulmonar obtenida del grupo tratado con CM101 en comparación con el grupo tratado con pirfenidona (datos no mostrados).

Ejemplo 3 Producción del Acm humanizado hCM101

Los genes de la región variable (V) del anticuerpo murino CM101 se clonaron en vectores de Antitope para generar un anticuerpo quimérico que comprende las regiones V murinas combinadas con la región constante de cadena pesada de IgG1 humana y las regiones constantes de cadena ligera K. Las secuencias de VH y Vk del anticuerpo CM101 murino se amplificaron por PCR utilizando cebadores que introdujeron sitios de enzimas de restricción flanqueantes para la clonación en vectores de expresión de la cadena VH y Vk de IgG1 de Antitope. La región VH se clonó utilizando los sitios MluI y HindlII, y la región Vk se clonó utilizando los sitios de restricción BssHIl y BamHI. Ambas construcciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Adicionalmente, se diseñó y construyó una serie de cuatro regiones VH humanizadas para IgG1 y cuatro regiones Vk humanizadas utilizando la tecnología Composite Human Antibody™ (Antitope).

El anticuerpo quimérico y las combinaciones de genes de la región V humanizada (16 anticuerpos en total) se expresaron en células NS0, se purificaron y se analizó su unión a eotaxina-2 humana en un ensayo de ELISA de competición. Los datos de unión se usaron para clasificar las variantes de CM101 humanizado en comparación con el anticuerpo CM101 quimérico. No se detectaron diferencias significativas en la calidad de las bandas de la cadena pesada y ligera mediante SDS PAGE (datos no mostrados).

Basándose en los datos de unión, se selecciona la variante VH1/VK3 humanizada (hCM101) como compuesto de partida a analizar en los ensayos funcionales.

Secuencia de VH1/VK3:

SEQ ID NO: 1:

CM101_VH1_DNA

CAGATCCAATTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGCCTCAG

TCAAGGTCTCCTGCAGGGCTTCTGGGTATCCCTTCACAAACTCTGGAATGAA

CTGGGTAAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATCAA

CACCTACAATGGAGAGCCAACATATACTGATGACTTCAAGGGACGGTTTG

CCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTC

AGAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGTCATTCCTACGGTAGT

AGCTACGCTATGGACAACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 2:

CM101 VK3 DNA

GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGACTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGGAGAG

GGCCACCATCAACTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATA

GTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCA

TCTATGTTGCATCCAATCTAAAATCTGGCATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAG

TGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGAT

TTTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGAACCGTGGACGTTCGGT

GGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAA

*Las secuencias de nucleótidos de la CDR están en negrita y subrayadas.

SEQ ID NO: 3:

CM101_VH1_PROTEIN SEQUENCE

QIQLVQSGPELKKPGASYKVSCRASGYPFTNSGMNWVKQAPGKGLKWMGWIN

TYNGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLRNEDTATYFCASHSYGSSYAM

DNWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 4:

>CMM01_VK3_PROTEIN SEQUENCE

DIVLTQ SPD SL AV SLGERATIN CKAS Q S VD YDGD S YMNWYQQKP GQPPKLLIYV

ASNLKSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEEPWTFGGGTKVEI

K

La secuencia de ácido nucleico anterior de la variante 1 de VH (cadena pesada o VH) se define en el presente documento como el SEQ ID NO: 1.

La secuencia de ácido nucleico anterior de la variante 3 de VK (cadena ligera) se define en el presente documento como el SEQ ID NO: 2.

La secuencia de aminoácidos anterior de la variante 1 de VH (cadena pesada o VH, 113 aminoácidos) se define en el presente documento como el SEQ ID NO: 3.

La secuencia de aminoácidos anterior de la variante 3 de VK (cadena ligera, 107 aminoácidos) se define en el presente documento como el SEQ ID NO: 4.

La variante 1 de VH (la cadena pesada) incluye tres regiones determinantes de complementariedad (CDR):

VH CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos NSGMN (SEQ ID NO: 5).

VH CDR2 tiene la secuencia de aminoácidos WINTYNGEPTYTDDFKG (SEQ ID NO: 6).

VH CDR3 tiene la secuencia de aminoácidos HSYGSSYAMDN (SEQ ID NO: 7).

La variante 3 de VK (la cadena ligera) incluye tres regiones determinantes de complementariedad (CDR):

VK CDR1 tiene la secuencia de aminoácidos KASQSVDYDGDSYMN (SEQ ID NO: 8).

VK CDR2 tiene la secuencia de aminoácidos VASNLKS (SEQ ID NO: 9).

VK CDR3 tiene la secuencia de aminoácidos QQSNEEPWT (SEQ ID NO: 10).

Ejemplo 4 Afinidad y especificidad de unión de hCM101

Para examinar la afinidad de unión de hCM101 a Eotaxina-2, pero también a otras quimiocinas relacionadas, se utilizaron varios métodos diferentes: Elisa, Biacore y mapeo epitópicos mediante CHIP. Biacore (Fig. 16) y el Elisa demostraron una unión considerable del anticuerpo a la eotaxina 2, revelando una constante de afinidad de 3X10 M.

Sorprendentemente, se descubrió que hCM101 también se unía con afinidad moderada a otras quimiocinas relacionadas. Como muestra el Elisa, se descubrió que hCM101 se unía a la Eotaxina 1 (Fig. 17), a RANTES (Fig. 18) y a MCP3 (Fig. 19).

El análisis de mapeo epitópico reveló una característica común entre estas cuatro quimiocinas. Parece que la Eotaxina 1, 2, Rantes y MCP-3 presentan un sitio epitópico que se encuentra dentro del bucle en N (Fig. 20). Este sitio de unión mutuo se caracteriza por una alta concentración de restos positivos en aproximadamente la misma posición (Fig. 21).

Estos resultados sugieren que hCM101 es un anticuerpo poliespecífico que se une a la Eotaxina 2 con alta afinidad y a otras quimiocinas relacionadas, como demostró el Elisa. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, esta característica puede permitir que hCM101 supere la redundancia de quimiocinas y logre eficacia.

Para evaluar ex vivo la especificidad de unión de hCM101, se realizó una precipitación de Eotaxina 2 circulante a partir de un suero representativo de un paciente con esclerosis generalizada con el anticuerpo CM101 completamente humanizado (hCM101). Los inventores encontraron un reconocimiento dependiente de la dosis de la Eotaxina 2 por hCM101.

Este resultado sugiere una alta especificidad de hCM101 por la eotaxina 2 dentro de los sueros (figura 22).

Además, utilizando el ensayo de electroforesis en membrana de nitrocelulosa, se expusieron al hCM101 concentraciones crecientes de eotaxina 1, Rantes y MCP-3. Se encontró que una dosis específica aumentaba la unión de hCM101 a estas quimiocinas (figura 23).

Ejemplo 5 Ensayos funcionales usando hCM101

La Eotaxina 1 y la Eotaxina 2 son quimiocinas implicadas en el reclutamiento de eosinófilos en los tejidos a través de la unión y activación de CCR3.

Para investigar la posible función antimigratoria de hCM101, el anticuerpo se incubó con estas quimiocinas durante 30 minutos a 37 °C y se examinó la quimiotaxia de los eosinófilos. Los resultados indican un efecto inhibidor dependiente de la dosis significativo de hCM101 sobre la migración de los eosinófilos. Se observó una migración del 16 % al 45 % de las células en un tratamiento con anticuerpos de 10-7 a 10-8 M, respectivamente (figura 24), vp<0,05.

Se sabe que las células del linaje de los monocitos son objetivos primarios de RANTES y MCP-3 por su unión a los receptores CCR 1, 2, 3, 5. Por tanto, se examinó el efecto de hCM101 sobre la migración de la línea celular de monocitos U937 incubando el anticuerpo con MCP-3 y RANTES. La quimiotaxia de los monocitos se atenuó significativamente, demostrando solo el 26 % de migración en una concentración de 10-7 M de hCM101 (figura 25).

Además, se realizaron ensayos in vitro de quimiotaxia de monocitos usando monocitos humanos aislados y sus quimiotaxinas pertinentes.

Con este fin, se permitió que monocitos CD14+ clasificados a partir de CMSP obtenidas de pacientes con esclerodermia migraran hacia MCP-3 y RANTES humanas como factor quimiotáctico con o sin distintas dosis de hCM101. El tratamiento con hCM101 atenuó significativamente la quimiotaxia de monocitos en ~55 % en la dosis alta (figura 26A).

Se realizó un experimento similar sobre la migración de células CD14 negativas (principalmente linfocitos) hacia Eotaxina 1, 2 y Rantes. Se encontró que el hCM101 la reducía significativamente en aproximadamente el 90 % para la dosis alta del anticuerpo (fig. 26B).

La esclerodermia y la FPI son enfermedades fibróticas que se caracterizan bien por la proliferación y migración de fibroblastos. Para examinar el efecto de hCM101 sobre la migración de fibroblastos, se realizó un ensayo de quimiotaxia hacia Eotaxina 2 con o sin hCM101. Se observó una reducción significativa de la migración cuando se añadió hCM101, ya que solo el 9 % de las células eran adherentes en el transpocillo en comparación con el control (fig. 27). El abordaje del efecto de hCM101 sobre Eotaxina-1, presentó una inhibición del 60 % de la migración de fibroblastos (fig. 28).

La transición de fibroblastos a miofibroblastos se refleja en una expresión elevada de actina del músculo liso.

La conversión de fibroblastos en miofibroblastos implica la expresión de actina de músculo liso alfa (a-SMA) y es un proceso significativo en la fibrosis. Su aparición puede inducirse por la presencia de citocinas y quimiocinas en el suero. Para evaluar la influencia de hCM-101 sobre la transición de fibroblastos a miofibroblastos, se incubó hCM-101 con sueros de pacientes con EG y luego se incubaron estos sueros con fibroblastos humanos para medir su capacidad para inducir a a-SMA. La expresión de a-SMA mediante citometría de flujo. Como se ha demostrado en la Figura 30, la elevación de a-SMA se atenuó en un 50 % cuando los sueros se incubaron con CM-101 (10 pg/ml). Estos resultados sugieren que CM-101 atenúa la conversión de fibroblastos en miofibroblastos estimulados por sueros de pacientes con esclerosis generalizada (EG). Esta conversión es responsable de la excesiva síntesis y remodelado de la matriz extracelular (MEC) que caracteriza a la EG.

La potencia de activación de las quimiocinas normalmente se mide a través de la captación de calcio en el citosol. La incubación de células que expresan CCR3 con eotaxina-2 y distintas concentraciones de hCM-101 demostró una reducción significativa de la captación de calcio (que representa la activación celular), como se muestra en la Figura 30.

Ejemplo 6 hCM101 no es inmunogénico según se mide en una prueba de inmunogenicidad Episcreen

El anticuerpo de partida anti-Eotaxina-2 totalmente humanizado (hCM101) se analizó frente a una cohorte de 20 donantes sanos utilizando el ensayo de linfocitos T de evolución temporal EpiScreen™ para determinar el riesgo relativo de inmunogenicidad. Las muestras se analizaron a una concentración final de hcM101 50 pg/ml basándose en estudios previos que muestran que esta concentración de saturación es suficiente para estimular respuestas detectables de linfocitos T específicas de anticuerpos. Con el fin de evaluar el potencial inmunogénico de cada muestra, se usó el ensayo de linfocitos T de evolución temporal EpiScreen™ con análisis de proliferación para medir la activación de linfocitos T.

La Figura 31 ilustra las respuestas de IE del donante a hCM101 con el transcurso del tiempo. El anticuerpo anti-Eotaxina-2 completamente humanizado no indujo respuestas positivas usando un umbral de IE > 2,0, p < 0,05 en cualquiera de los donantes en el ensayo de proliferación.

Los ensayos anteriores de linfocitos T de evolución temporal EpiScreen™ con una gama de productos biológicos (figura 32) han mostrado una clara correlación entre el porcentaje de respuestas de los linfocitos T del donante en el ensayo EpiScreen™ y el nivel de inmunogenicidad (respuestas de anticuerpos terapéuticos antiproteínas) observada en la clínica. Se observaron respuestas de donantes de alta frecuencia en los ensayos EpiScreen™ para anticuerpos inmunogénicos tales como Campath, al tiempo que se observaron respuestas de donantes de frecuencia relativamente baja para anticuerpos no inmunogénicos tales como Xolair y Herceptin. En general, las opciones terapéuticas con proteínas que inducen <10 % de respuestas positivas en el ensayo EpiScreen™ se asocian con un bajo riesgo de inmunogenicidad en la clínica. El estudio actual muestra que, en comparación con otras proteínas terapéuticas analizadas en los ensayos EpiScreen™ (figura 32), el anticuerpo anti-Eotaxina-2 totalmente humanizado hCM101 se encuentra en el mismo intervalo que Xolair, Herceptin y Avastin, y se consideraría que tiene un bajo riesgo de inmunogenicidad.

Referencias

1. Goodnow CC et al, Cellular and genetic mechanisms of self tolerance and autoimmunity. Nature 2005; 2; 435(7042):590-7.

2. Jose PJ, Griffiths-Johnson DA, Collins PD et al., Eotaxin: a potent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation, J Exp Med 1994; 179: 881-887.

3. Kitaura M, Nakajima T, Imai T, et al., Molecular cloning of human eotaxin, an eosinophil-selective CC chemokine, and identification of a specific eosinophil eotaxin receptor, CC chemokine receptor 3, J Biol Chem 1996; 271: 7725 7730.

4. Ponath PD, Qin S, Ringler DJ, et al., Cloning of the human eosinophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils. J Clin Invest 1996; 97: 604-612.

5. Bocchino V, Bertorelli G, Bertrand CP, et al., Eotaxin and CCR3 are up-regulated in exacerbations of chronic bronchitis, Allergy 2002; 57: 17-22.

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8. Pope SM, et al,The eotaxin chemokines and CCR3 are fundamental regulators of allergen-induced pulmonary eosinophilia.J Immunol. 2005 15;175(8):5341-50.

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10. Mausner et al, Eotaxin-2 blockade ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis World J Immunol

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 para su uso en el tratamiento de enfermedades fibróticas, trastornos inflamatorios autoinmunitarios, ateroesclerosis o trastornos atópicos alérgicos, en donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, está completamente humanizado y comprende una región variable de cadena pesada indicada por el SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera indicada por el SEQ ID NO: 4, y en donde las al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 se seleccionan del grupo que consiste en Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

2. El anticuerpo poliespecífico aislado para el uso de la reivindicación 1, en donde dicho fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fv monocatenario (scFv), Fab, F(ab)2' y cualquier combinación de los mismos.

3. El anticuerpo poliespecífico aislado para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha enfermedad fibrótica se selecciona del grupo que consiste en esclerodermia, fibrosis pulmonar idiopática (FPI), esteatohepatitis no alcohólica (ENA), glomeruloesclerosis, cirrosis y síndromes metabólicos.

4. Un anticuerpo poliespecífico aislado, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a al menos dos quimiocinas de unión a CCR3, en donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, está completamente humanizado y comprende una región variable de cadena pesada indicada por el SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena ligera indicada por el SEQ ID NO: 4, y en donde las al menos dos quimiocinas de unión a CCR3 se seleccionan del grupo que consiste en Eotaxina 1, Eotaxina-2, Rantes y MCP-3.

5. El anticuerpo poliespecífico aislado de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho fragmento de unión a antígeno del mismo se selecciona del grupo que consiste en Fv, Fv monocatenario (scFv), Fab, F(ab)2' y cualquier combinación de los mismos.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5.

7. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia indicada por el SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2.

8. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7.

9. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.