CN114230663A - TrkA的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种能够特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段及其用途。该抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～27，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:28～54。根据本发明实施例的上述抗体能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合。

Description

TrkA的抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及TrkA的抗体及其应用，更具体地，本发明涉及能够特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途、检测TrkA的试剂盒以及小鼠B细胞。
背景技术
目前临床上对于轻至中度疼痛，主要使用非阿片类镇痛药，如非甾体类抗炎药(NSAIDs)；对于中至重度疼痛，主要使用阿片类镇痛药。然而，NSAIDs存在“封顶效应”，阿片仅能使不到30％的非肿瘤性慢性疼痛得到有效缓解，20％的癌痛患者存在阿片类药物耐药。此外，NSAIDs存在胃肠道和心血管安全性隐患，长期用药过程中尤其明显。对于阿片类镇痛药，多年的药物改进实验未能有效的降低其成瘾性和其它诸多副作用，患者期许新的更安全有效的药物。
神经生长因子(NGF，nerve growth factor)参与疼痛的病理生理过程，主要通过结合高亲和力的酪氨酸激酶(tyrosine-nase，TrkA)受体激活NGF/TrKA信号通路，影响炎症介质的释放、离子通道的开放以及促进神经纤维的生长，从而参与疼痛的发生，传导以及增敏过程。研究表明，阻断NGF-TrkA信号通路可以有效的缓解疼痛和痛觉过敏，NGF-TrkA信号通路是开发新型镇痛药物的有效靶点。对于NGF-TrkA靶点镇痛药物，目前在研的药物主要分为两大类：大分子抗NGF单克隆抗体和小分子TrkA激酶抑制剂。由于TrKA受体并不是NGF的唯一受体，NGF还存在一种低亲和力的受体P75，而NGF与P75的结合对于神经系统的功能以及损伤修复是有重要作用的，大分子抗NGF单克隆抗体作为一种新型的镇痛药物存在很大的安全性隐患。从目前的临床数据来看，最常见毒副作用包括骨组织坏死(潜在)、感官异常等。而小分子TrkA激酶抑制剂存在着更多的问题。首先，小分子药物的半衰期一般较短，给药频繁，病人的依从性差。其次，小分子Trka激酶抑制剂是受体酪氨酸激酶抑制剂，机体内存在多种受体酪氨酸激酶，因此，药物对于特定靶点的特异性和选择性很难保证，药物的不良反应多，毒副作用大。
因此，针对NGF-TrkA靶点的镇痛药物，仍然需要科研工作者不断的开发和改进。
发明内容
本申请是基于发明人对下列问题和事实的发现而提出的：
NGF-TrkA信号通路作为开发新型镇痛药物的有效靶点，如果通过TrkA单克隆抗体选择性的靶向结合TrkA受体，不仅可以阻断NGF对TrkA信号通路的激活，有效的抑制疼痛信号的传递，又不会发生像抑制NGF受体所造成的诸多神经毒性，以及使用抗NGF抗体过度中和NGF所带来的骨关节坏死等不可预测的毒副作用。但由于TrkA分子是受体膜蛋白，筛选阻断型抗TrkA单克隆抗体的难度比较大，其次，设计阻断TrkA受体抗体存在由于抗体介导免疫反应导致的安全性风险，因此，设计开发针对TrkA的单克隆抗体难度比较大。
然而本申请的发明人却成功地筛选到了一种新型的具有长效镇痛作用的抗TrkA单克隆抗体，同时，发明人通过选取特定的Fc亚型并对其进行改造有效避免了免疫毒性的风险。具体地，本研究通过杂交瘤技术筛选出一系列阻断NGF和TrkA结合的高亲和力抗TrkA单克隆抗体，并将鼠源抗TrkA单克隆抗体的恒定区人源化，保留鼠源抗TrkA单克隆抗体的可变区，得到一系列的抗TrkA嵌合单克隆抗体。发明人发现，本申请所获得的这些嵌合抗体候选物，不仅能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合，有效的抑制疼痛，而且具有免疫毒性低，基本没有抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的特点。
在本发明的的第一方面，本发明提出了一种能够特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～27，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:28～54。
VYSFTAYT(SEQ ID NO:1)。
INPHNGGT(SEQ ID NO:2)。
AISRYGSSSFYFDV(SEQ ID NO:3)。
GYAFTNYW(SEQ ID NO:4)。
FYPRTGNT(SEQ ID NO:5)。
ARAGTGFDY(SEQ ID NO:6)。
GYRFSSYW(SEQ ID NO:7)。
ILPGRGII(SEQ ID NO:8)。
ARTDPPYFGV(SEQ ID NO:9)。
GYTFSTYW(SEQ ID NO:10)。
NLPGRHIT(SEQ ID NO:11)。
ARGRGTYYFDY(SEQ ID NO:12)。
GYSFTGYT(SEQ ID NO:13)。
INPYNGGT(SEQ ID NO:14)。
AFSYYGSRGFYFDY(SEQ ID NO:15)。
GYSFTGYT(SEQ ID NO:16)。
INPYNGGT(SEQ ID NO:17)。
ASSSYRNDGNWYFDV(SEQ ID NO:18)。
GYSITGYT(SEQ ID NO:19)。
VNPYNGGT(SEQ ID NO:20)。
AISRYGSESWYFDV(SEQ ID NO:21)。
GYTFNIYW(SEQ ID NO:22)。
ILPGSGNT(SEQ ID NO:23)。
ARTDGRGYFDY(SEQ ID NO:24)。
GYTFSSYW(SEQ ID NO:25)。
FLPRSGKT(SEQ ID NO:26)。
ARTDPPYFGV(SEQ ID NO:27)。
SSISY(SEQ ID NO:28)。
ATS(SEQ ID NO:29)。
QQWSSNPPT(SEQ ID NO:30)。
ENVGGY(SEQ ID NO:31)。
GAS(SEQ ID NO:32)。
GQNYIYPFT(SEQ ID NO:33)。
TGAVTISNY(SEQ ID NO:34)。
GTN(SEQ ID NO:35)。
VLWYSNHWV(SEQ ID NO:36)。
QSLLHSNGITY(SEQ ID NO:37)。
QMS(SEQ ID NO:38)。
AQNLEFPFT(SEQ ID NO:39)。
SSVSY(SEQ ID NO:40)。
LTS(SEQ ID NO:41)。
QQWSSNPPT(SEQ ID NO:42)。
SSVSY(SEQ ID NO:43)。
DTS(SEQ ID NO:44)。
QQWSSNPPT(SEQ ID NO:45)。
SSVSY(SEQ ID NO:46)。
ATS(SEQ ID NO:47)。
QQWSSNPPT(SEQ ID NO:48)。
KSVSSSAYSY(SEQ ID NO:49)。
LAS(SEQ ID NO:50)。
QHSRELPFT(SEQ ID NO:51)。
SNISY(SEQ ID NO:52)。
DTS(SEQ ID NO:53)。
QQWSSVPLT(SEQ ID NO:54)。
根据本发明实施例的上述抗体能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合。
根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述抗体包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:13、14和15或者与SEQ ID NO:13、14和15具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:16、17和18或者与SEQ ID NO:16、17和18具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO19、20和21或者与SEQ ID NO:19、20和21具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:22、23和24或者与SEQ ID NO:22、23和24具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:25、26和27或者与SEQ ID NO:25、26和27具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体包括：
分别如SEQ ID NO:28、29和30或者与SEQ ID NO:28、29和30具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:31、32和33或者与SEQ ID NO:31、32和33具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:34、35和36或者与SEQ ID NO:34、35和36具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:37、38和39或者与SEQ ID NO:37、38和39具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:40、41和42或者与SEQ ID NO:40、41和42具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:43、44和45或者与SEQ ID NO:43、44和45具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:46、47和48或者与SEQ ID NO:46、47和48具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:49、50和51或者与SEQ ID NO:49、50和51具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:52、53和54或者与SEQ ID NO:52、53和54具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别TrkA的胞外区。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：55～63任一项所示氨基酸序列的重链可变区。
EVLLQQSGPELVKPGASMKISCKASVYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPHNGGTRYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCAISRYGSSSFYFDVWGAGTTVAVSS(SEQ ID NO:55)。
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:56)。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKTTGYRFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEILPGRGIINYNENFRGKATFTADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYFCARTDPPYFGVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:57)。
QVQLQQSGAELMKPGASMKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWIGENLPGRHITNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRGTYYFDYWGQGTPLTVSS(SEQ ID NO:58)。
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAFSYYGSRGFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:59)。
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCASSSYRNDGNWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:60)。
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSITGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLVNPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLKSEDSAVYYCAISRYGSESWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:61)。
QVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFNIYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTHYNENFKGKATMTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARTDGRGYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:62)。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEFLPRSGKTNYNEEFRGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTDPPYFGVWGAGTMVAVSS(SEQ ID NO:63)。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：64～72任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSISYMHWYQQKPGSSPKPWISATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTNLEIK(SEQ ID NO:64)。
SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:65)。
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSNHWVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:66)。
DIVMTQAAFSTPVTLGTSASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPFTFGSGTKLEIK(SEQ IDNO:67)。
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSATSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:68)。
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLELK(SEQ ID NO:69)。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRATSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEKK(SEQ ID NO:70)。
DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRTSKSVSSSAYSYMHWYQQKPGQPPKVLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:71)。
QIVLTQSPPIMSASPGEKVTMTCSASSNISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSVPLTFGAGTKLEIK(SEQ ID NO:72)。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。进而所述抗体的免疫原性可以得到有效降低。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG4。
根据本发明的实施例，所述抗体的Fc区域与人源IgG4野生型的Fc相比具有S10P，F16A，L17A，R191K突变以及229K缺失突变。其中，上述氨基酸位置的定位是以人源IgG4野生型Fc序列SEQ ID NO:73所示氨基酸序列进行定位的，如S10P，是指SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的第10位S突变为P，依次类推。发明人发现，所述抗体的Fc区域具有上述突变以及缺失后，抗体的安全性、稳定性可以得到显著提高，抗体在体内的半衰期也显著延长。
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:73)。
根据本发明的实施例，所述抗体恒定区的全长序列如SEQ ID NO:74或75所示。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:74)。
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:75)。
其中，上述SEQ ID NO:74所示的抗体恒定区的全长序列包括IgG4重链恒定区和Fc区，其中，IgG4重链恒定区序列为ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV，Fc区序列为ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。上述SEQ ID NO:75所示的抗体恒定区的全长序列为IgG4轻链恒定区。
根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO:76～84任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:85～93任一项所示氨基酸序列的轻链。
EVLLQQSGPELVKPGASMKISCKASVYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPHNGGTRYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCAISRYGSSSFYFDVWGAGTTVAVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:76)。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSISYMHWYQQKPGSSPKPWISATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:85)。
QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ IDNO:77)。
SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:86)。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKTTGYRFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEILPGRGIINYNENFRGKATFTADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYFCARTDPPYFGVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:78)。
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSNHWVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO:87)。
QVQLQQSGAELMKPGASMKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWIGENLPGRHITNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRGTYYFDYWGQGTPLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:79)。
DIVMTQAAFSTPVTLGTSASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:88)。
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAFSYYGSRGFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:80)。
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSATSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:89)。
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCASSSYRNDGNWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:81)。
DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:90)。
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSITGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLVNPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLKSEDSAVYYCAISRYGSESWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:82)。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRATSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEKKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:91)。
QVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFNIYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTHYNENFKGKATMTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARTDGRGYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:83)。
DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRTSKSVSSSAYSYMHWYQQKPGQPPKVLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:92)。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEFLPRSGKTNYNEEFRGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTDPPYFGVWGAGTMVAVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:84)。
QIVLTQSPPIMSASPGEKVTMTCSASSNISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSVPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:93)。
其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:76和85所组成的抗体被称为20C8嵌合抗体，上述SEQ ID NO:77和86所组成的抗体被称为23E12嵌合抗体，上述SEQ ID NO:78和87所组成的抗体被称为27H3嵌合抗体，上述SEQ ID NO:79和88所组成的抗体被称为21E5嵌合抗体，上述SEQ ID NO:80和89所组成的抗体被称为2A5嵌合抗体，上述SEQ ID NO:81和SEQ IDNO:90所组成的抗体被称为4H4嵌合抗体，上述SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:91所组成的抗体被称为22D12嵌合抗体，上述SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:92所组成的抗体被称为1B9嵌合抗体，上述SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:93所组成的抗体被称为15D4嵌合抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。
根据本发明的实施例，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段可特异性靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合，且具有免疫原性低，ADCC低的优势。
根据本发明的实施例，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:112～120任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:121～129任一项所示核苷酸序列。
GAAGTGCTGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGTGTACAGCTTCACAGCCTACACAATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCACACAATGGCGGCACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTCTGGATAAGTCCAGCAGCACTGCCTACATGGATCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTCTACTATTGCGCCATCTCTAGGTACGGCAGCAGCAGCTTCTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGGCTGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC(SEQ IDNO:112)。
CAAGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGACCCGGCACTAGCGTGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCACTAATTACTGGCTGGGCTGGATGAAGCAGAGACCCGGCCATGGACTGGAGTGGATCGGCGACTTCTACCCAAGGACTGGCAACACTTTCTACAACGAGAACTTTAAGGGCAAGGTGACTCTGACTGCCGATAAGTCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGTCCTCTCTGACTAGCGAAGATAGCGCCGTGTATCTGTGTGCTAGGGCTGGCACTGGCTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:113)。
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CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCTGAGCTCATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGAGAGTTTCTGCCTAGAAGCGGCAAGACAAACTACAACGAGGAGTTTAGGGGCAAGGCTACATTCACTGCCGACACATCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTCACAAGCGAGGATTCCGCCGTCTACTACTGTGCTAGGACTGATCCTCCTTACTTCGGAGTGTGGGGCGCTGGCACAATGGTGGCTGTGAGCAGCGCCTCCACTAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:120)。
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CAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCTCTGATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGCGCCACATCCAGCGTGAGCTACATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTAGGAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACCTCACAAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCAGCTAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGCATGGAAGCCGAAGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCACCTACATTCGGAGGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:125)。
GATATCGTGATGACTCAGTCCCCAGCCATCATGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGCTCCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACATCCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACAAGCTACTCTCTGACTATCAGCAGCATGGAGACAGAGGACGCTGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCTCCAACTTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGGAGCTGAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:126)。
CAGATTGTGCTGTCCCAGTCCCCAGCCATTCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCACAAGCAGCGTGAGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACGCCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCGTCCCAGCTAGATTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACTAGCTATTCTCTGACTATCTCTAGGGTCGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAATCCTCCAACATTCGGCGGCGGAACTAAGCTGGAGAAGAAGAGGACAGTGGCTGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCAAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACTGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:127)。
GATATCGTGCTGACTCAGAGCCCAGCCTCTCTGGTGGTGTCTCTGGGACAGAGGGCCACAATCAGCTGTAGGACTTCCAAGAGCGTGAGCAGCTCCGCCTACAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGGTGCTGATCTATCTGGCCAGCAATCTGGAGAGCGGCGTCCCAGCTAGATTCAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTGACTTCACTCTGAACATCCACCCAGTGGAAGAGGAGGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCACTCTAGGGAGCTGCCTTTCACATTTGGCAGCGGAACTAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTCGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTCCCTCCAAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACTGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:128)。
CAAATTGTTCTCACACAGAGCCCTCCTATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTTCCGCCAGCAGCAACATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCCGGCACAAGCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACAATCAGCAGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACATACTACTGCCAGCAGTGGAGCTCCGTCCCACTGACTTTCGGCGCTGGCACTAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTGGCCGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAACAGCTCAAGAGCGGCACTGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:129)。
其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:112和121所示核苷酸序列分别编码20C8嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:113和122所示核苷酸序列分别编码23E12嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:114和123所示核苷酸序列分别编码27H3嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:115和124所示核苷酸序列分别编码21E5嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQ ID NO:116和125所示核苷酸序列分别编码2A5嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQ IDNO:117和SEQ ID NO:126所示核苷酸序列分别编码4H4嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQ IDNO:118和SEQ ID NO:127所示核苷酸序列分别编码22D12嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQID NO:119和SEQ ID NO:128所示核苷酸序列分别编码1B9嵌合抗体的重链和轻链，上述SEQID NO:120和SEQ ID NO:129所示核苷酸序列分别编码15D4嵌合抗体的重链和轻链。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述抗体或抗原结合片段的体外大量获得。
根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。进而实现前面所述的特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段在真核细胞中的表达，如CHO细胞。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，或者表达前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的抗体或表达的抗体不仅能够特异性的靶向结合TrkA受体，阻断NGF和TrkA结合，有效的抑制疼痛，而且具有免疫原性低，基本没有抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的特点。
在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病。
根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化、非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种检测TrkA的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面任一所述的抗体。前面所述的TrkA抗体能够特异性靶向结合TrkA，根据本发明实施例的试剂盒可以实现TrkA的特异性检测，如当抗体结合有荧光基团时，可以采用荧光检测装置实现对TrkA的定位或实时检测。
在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测TrkA或者诊断TrkA相关的疾病。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种小鼠B细胞。根据本发明的实施例，所述B细胞的基因组中携带编码恒定区的序列，所述恒定区序列与人IgG4的恒定区相比，存在S108P，F114A，L115A，R289K突变以及327K缺失突变。其中，人IgG4的恒定区具有SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:148)。
根据本发明实施例的小鼠B细胞可用于分泌鼠源抗体，所分泌的鼠源抗体在人体内的免疫原性进一步降低，稳定性得到显著提高，在体内的半衰期显著延长。
在本发明的第十方面，本发明提出了前面所述的小鼠B细胞在制备单克隆抗体中的用途。
附图说明
图1是根据本发明实施例的通过ELISA方法筛选得到的9株能产生分子水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株的实验结果图；
图2是根据本发明实施例的流式筛选得到的9株能产生细胞水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株的实验结果图，％parent(百分比)；
图3是根据本发明实施例的ELISA方法检测各阳性克隆上清产生的单克隆抗体与Mouse-TrKA受体的结合情况的实验结果图；
图4是根据本发明实施例的应用HEK-293T-TrkA细胞模型评价受试抗体的阻断活性的结果图，％parent(百分比)；
图5是根据本发明实施例的Tanezumab验证NIH-3T3-TrkA细胞模型是否可以用于评价抑制NGF-TrkA通路药物(受试药物)的体外活性的结果图；
图6是根据本发明实施例的通过AlphaLISA的方法检测受试抗体及阳性抗体MNAC13作用下，TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水平的实验结果图，p-TrkA level(TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水平)；
图7是根据本发明实施例的通过流式细胞术检测受试抗体亲和力EC50的结果图；
图8A～8G是根据本发明实施例的ELISA方法评价受试抗体与靶标TrKA结合的特异性的结果图；
图9是根据本发明实施例的应用ELISA方法检测受试抗体对Mouse-TrKA蛋白的结合能力的结果图；
图10是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测受试抗体与Mouse-TrKA蛋白的结合能力的结果图；
图11是根据本发明实施例的应用ELISA方法检测受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用的结果图；
图12是根据本发明实施例的应用流式细胞术检测受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用的结果图；
图13是根据本发明实施例的应用ELISA方法检测受试抗体对Human-NGF和Human-TrKA结合的抑制作用的结果图；
图14是根据本发明实施例的应用福尔马林致痛模型评价受试抗体的体内镇痛活性的结果图；以及
图15是根据本发明实施例的应用完全弗氏佐剂诱导炎疼痛模型评价受试抗体的体内镇痛活性的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。
抗体
本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。
本发明利用TrkA胞外段，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗TrkA的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与TrkA抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗疼痛或肿瘤等疾病。
在一些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性识别TrkA的抗体或者抗原结合片段，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～27，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:28～54。在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链和轻链相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(ROR2)能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏TrkA抗体或者与TrkA抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者极性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO：55～63任一项所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：64～72任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(NCBI、IMGT)可得到上述抗重链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:1～27所示)和轻链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:28～54所示)。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:55～63所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:64～72任一项所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。
在一些优选方案中，本发明提供了一种抗TrkA抗体，该抗体具有SEQ ID NO:76～84任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:85～93任一项所示氨基酸序列的轻链。
在一些优选方案中，本发明提供了一种抗TrkA单链抗体，该抗体具有SEQ ID NO:94～111所示的氨基酸序列。
核酸分子、表达载体、重组细胞
在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。
为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:112～120任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:121～129任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:130～147所示的核苷酸序列.
在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:112～120所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:121～129所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:130～147所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:112～120或者SEQ ID NO:121～129或SEQ ID NO:130～147所示核苷酸序列具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:76～84和SEQ ID NO:85～93相似的氨基酸或与SEQ ID NO:94～111相似的氨基酸序列，从而能够与TrkA抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。
在一些优选实施方式中，所述分离的核酸分子具有SEQ ID NO:112～120所示的重链核苷酸序列和SEQ ID NO:121～129所示的轻链核苷酸序列。这些核苷酸序列经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。
本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。
药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。
本文提供的抗TrkA抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗TrkA抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
当然，本文中的抗TrkA抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述TrkA抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用TrkA抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗TrkA抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗TrkA抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括TrkA相关疾病，例如疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病等等。当然本文提供的抗体也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。
具体地，上述疼痛、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病包括神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化。
这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，可以是非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌等等。
在利用本发明所提供的抗TrkA抗体治疗上述疾病时，可以将本发明提供的抗TrkA抗体提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的的抗体或其抗原结合片段。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1杂交瘤技术筛选抗TrkA单克隆抗体
通过杂交瘤技术和ELISA方法筛选可以产生分子水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用NCBI数据库设计出TrkA蛋白胞外区编码基因，构建到哺乳动物真核表达系统中，表达得到TrkA蛋白胞外区，用于抗TrkA单克隆抗体筛选。免疫原TrkA蛋白胞外区来源于北京义翘神州生物科技有限公司，Balb/C小鼠三次腹腔注射免疫后，ELISA方法测定免疫小鼠血清抗体滴度，达到105级。脾脏注射加强免疫后，与骨髓瘤细胞融合。采用HAT选择培养基和HT选择培养基选择性培养筛选融合的杂交瘤细胞株，采用ELISA方法筛选能产生抗TrkA抗体的阳性杂交瘤细胞株，采用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆化培养，筛选稳定的能产生抗TrkA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经三次克隆化培养，四次ELISA检测后，共筛选得到147株阳性单克隆杂交瘤细胞株。将NGF生物素化，利用NGF可以结合TrkA蛋白胞外区，抗TrkA单克隆抗体也可以结合TrkA蛋白胞外区，设计竞争性实验，通过ELISA方法，检测抗TrkA单克隆抗体作用下，NGF与TrkA蛋白胞外区结合情况，筛选分子水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体。图1是147株阳性单克隆杂交瘤细胞株中能产生分子水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的9株杂交瘤细胞株的阻断实验结果，即经筛选共得到9株能产生分子水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株，实验结果见图1。图中，OD450反映了与TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号，读值越高，表明与TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号越强，抗体阻断NGF与TrkA结合的效果越差；如图所示，与阴性克隆组相比，9个阳性克隆组的ELISA读值显著性的降低，与TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号显著性降低；可见，这9个阳性克隆能通过产生抗TrkA单克隆抗体阻断NGF与TrkA蛋白胞外区结合，降低与TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号。
实施例2HEK-293T-TrkA细胞模型筛选抗TrkA单克隆抗体
利用慢病毒技术构建HEK-293T-TrkA细胞模型，通过流式细胞术，筛选可以产生细胞水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将NGF生物素化，利用NGF可以结合HEK-293T-TrkA细胞上的TrkA蛋白胞外区，抗TrkA单克隆抗体也可以结合HEK-293T-TrkA细胞上的TrkA蛋白胞外区，设计竞争性实验，通过流式细胞术，检测抗TrkA单克隆抗体作用下，NGF与HEK-293T-TrkA细胞上TrkA蛋白胞外区结合情况，筛选细胞水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体。经筛选共得到9株能产生细胞水平阻断NGF和TrkA结合的抗TrkA单克隆抗体的单克隆杂交瘤细胞株，与分子水平阻断实验结果一致，实验结果见图2，图中，％parent值反映了与HEK-293T-TrKA细胞上TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号，读值越高，表明与HEK-293T-TrKA细胞上TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号越强，抗体阻断NGF与TrkA结合的效果越差；如图所示，与阴性克隆组相比，9个阳性克隆组的％parent值显著性的降低，与TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号显著性降低；可见，这9个阳性克隆能通过产生抗TrkA单克隆抗体阻断NGF与HEK-293T-TrkA细胞上TrkA蛋白胞外区结合，降低与HEK-293T-TrkA细胞上TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号。
实施例3应用ELISA方法检测阳性克隆产生单克隆抗体的人鼠交叉反应
通过ELISA方法检测各阳性克隆上清产生的单克隆抗体与Mouse-TrKA受体的结合情况，检测阳性克隆产生单克隆抗体的人鼠交叉反应，结果见图3，图中，OD450值反映抗体与蛋白的结合强弱，读值越大表示抗体与蛋白的结合越强。如图所示，23E12、21E5、15D4、27H3组的OD450值在3.5左右，与阴性对照组相比有显著性差异；20C8、1B9、4H4、3A5、22D12组的OD450值几乎接近于0，与阴性克隆组相比没有显著性差异。可见，克隆23E12、21E5、15D4、27H3能产生与Human-TrKA和Mouse-TrKA都结合的单克隆抗体，存在人鼠交叉反应。
实施例4载体的构建
采用分子克隆的方法构建一系列(20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4)嵌合抗体表达载体，在CHO表达系统中，重组表达嵌合抗体。编码一系列(20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4)嵌合单克隆抗体轻重链的核苷酸序列是委托金唯智生物科技有限公司通过化学合成获得的，所获得的序列经双酶切后，插入到真核表达载体的相同酶切位点间，构建一系列(20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4)嵌合抗体表达载体。然后采用Invitrogen质粒提取试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，并用限制性内切酶进行线性化后纯化回收，-20℃保藏。
实施例5编码一系列嵌合抗体载体转染并在细胞中表达
将CHO宿主细胞用CD CHO培养基复苏培养后，当细胞密度约8*105cell/mL时收集细胞进行转染。转染细胞约1*107cell，载体约40μg，通过电击方法转染(Bio-Rad，Genepulser Xcell)。电击后细胞于20mL CD CHO培养基中培养。培养第二天，离心收集细胞，并在加入MSX至终浓度50μM的20mL CD CHO培养基中重悬培养。当细胞密度约0.6*106cell/mL时，对获得的混合克隆株用CD CHO培养基进行传代，传代细胞密度约0.2*106cell/mL。当细胞存活率约90％时，收集细胞培养液。
实施例6收集细胞发酵培养液纯化嵌合抗体
对一系列的嵌合抗体进行翻译水平上的检测。采用Protein A层析柱对收集的细胞培养液进行纯化，并收集吸收峰，进行质谱检测，质谱检测一系列嵌合抗体分子量150KD左右，与理论分子量一致。同时对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测，还原型SDS-PAGE电泳图谱显示二条带，分别在25KD和50KD左右，非还原型SDS-PAGE电泳图谱显示单一条带，在150KD左右，电泳图谱条带大小与理论一致。纯化后样品采用pH7.4的0.02M PBS缓冲液在4℃透析过夜。
在以下实施例7～16中，发明人评价了所构建纯化获得的嵌合抗体20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4的与TrkA的亲和力和结合TrkA、阻断NGF与TrkA蛋白胞外区结合的活性。
实施例7应用HEK-293T-TrkA细胞模型评价受试抗体的阻断活性
将NGF生物素化，利用NGF可以结合HEK-293T-TrkA细胞上的TrkA蛋白胞外区，抗TrkA单克隆抗体也可以结合HEK-293T-TrkA细胞上的TrkA蛋白胞外区，设计竞争性实验，通过流式细胞术，检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)受试抗体作用下，NGF与HEK-293T-TrkA细胞上TrkA蛋白胞外区结合情况，研究受试抗体对NGF和TrKA结合的抑制作用。实验结果见图4。图中，parent％值反映了与HEK-293T-TrkA细胞上TrKA蛋白胞外区结合的NGF信号，读值越低，与HEK-293T-TrkA细胞上TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号越弱，抗体抑制NGF与TrKA结合的作用越大；如图所示，随着受试抗体浓度的增加，parent％值逐渐降低，直到趋近于零，即与TrkA蛋白胞外区结合的NGF信号逐渐降低，直到没有NGF结合TrkA蛋白胞外区，NGF与TrkA的结合全部抑制。可见，一定的浓度范围内，各受试抗体在细胞水平上能够剂量依赖性的抑制NGF与TrkA的结合。
实施例8应用NIH-3T3-TrkA细胞模型评价受试抗体的体外活性
在NGF刺激下，NIH-3T3-TrkA细胞膜上的TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水平上调，TrkA下游信号通路激活。受试抗体可以结合NIH-3T3-TrkA细胞膜表面的TrkA蛋白，抑制NGF的刺激，下调TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水平。试验中，以IgG4为阴性对照(该抗体不结合NGF及TrkA)，tanezumab(抗NGF单克隆抗体，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:149所示，重链氨基酸序列如SEQID NO:150所示，抑制NGF-TrkA通路药物)、MNAC13(抗TrKA单克隆抗体，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:151所示，重链氨基酸序列如SEQID NO:152所示，抑制NGF-TrkA通路药物)为阳性对照，其中，Tanezumab用于验证NIH-3T3-TrkA细胞模型是否可以用于评价抑制NGF-TrkA通路药物(受试药物)的体外活性，实验数据如图5所示。通过AlphaLISA的方法检测不同浓度受试抗体及阳性抗体MNAC13作用下，TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水平下调情况，衡量受试抗体的体外活性，p-TrkA检测结果见图6，实验结果显示，受试抗体及阳性抗体MNAC13均能抑制NGF-TrKA通路，剂量依赖性地下调TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水平，其中，受试抗体23E12、20C8、27H3、21E5、1B9、4H4的半数抑制浓度IC50小于阳性抗体MNAC13。可见，受试抗体23E12、20C8、27H3、21E5、1B9、4H4的体外活性优于阳性抗体MNAC13。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:149)。
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:150)。
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCHQWSSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:151)。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWARQAPGKGLEWVAYISKGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDSAVYYCARGAMFGNDFFFPMDRWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:152)。
实施例9应用Fortebio方法评价受试抗体与TrkA的亲和力
将受试抗体(23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5)样品分别用缓冲液(PBS缓冲液100ml，加入0.1gBSA搅拌至充分溶解，再加入20μL的吐温20，混合均匀)稀释至4个浓度梯度(80nM、26.67nM、8.89nM、2.93nM)，分别加入到样品板的各孔中，通过亲和力检测系统(OCTET RED 96SYSTEM)，用带有Ni-NTA传感器(厂家：PALL，货号：18-5101)结合带有组氨酸标签的TRKA(50μg/ml，75kDa，HEC实验室提供)蛋白后，自动检测其与各受试抗体的结合情况，结果见表1。KD值是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，KD值与亲和力成反比。KD值与抗体的浓度(特定实验所需的抗体量)有关，KD值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。通常认为，高亲和力抗体处于低纳摩尔范围内(10-9)。表1结果显示，受试抗体(23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5)的KD值处于低纳摩尔范围内(10-9)，表明，受试抗体都具有很高的亲和力。
表1：
Figure BDA0003368448500000321
实施例10应用流式细胞术评价受试抗体的亲和力
将受试抗体(23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5)样品分别用PBS缓冲液稀释至11个浓度梯度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)，通过流式细胞术检测各浓度梯度受试抗体与HEK-293T-TrKA细胞表面TrKA受体的结合情况，从细胞水平评价受试抗体的亲和力，结果见图7。图中，EC50(半数结合浓度)值反映抗体的亲和力高低，EC50值越小，抗体的亲和力越高，通常认为，高亲和力抗体的EC50值低于1.5μg/mL。图中结果显示，受试抗体23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5的EC50值均低于1.5μg/mL，表明，受试抗体都具有很高的亲和力。
实施例11应用ELISA方法评价受试抗体与靶标TrKA结合的特异性
TrkA受体家族属于受体酪氨酸激酶(RTKs)，包括TrkA、TrkB和TrkC，它们具有很高的同源性。TrkA是神经生长因子(NGF)的受体酪氨酸激酶，选择性结合NGF，是NGF的功能性受体。除高亲和力受体TrkA外，NGF还可与其低亲和力受体p75结合。试验中，通过ELISA方法检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)受试抗体分别与TrKA、TrKB、TrKC、P75的结合情况，评价受试抗体与靶标TrKA结合的特异性，结果如图8A～8G所示。图中，一定的抗体浓度下，OD450值反映抗体与蛋白的结合强弱，读值越大抗体与蛋白的结合越强。实验结果显示，受试抗体23E12、20C8、27H3、21E5、1B9、4H4、2A5与TrKA受体都有很好的结合(受试抗体浓度由0μg/mL增加到20μg/mL，OD450值逐渐增加直至趋近稳定，接近3左右)，与TrKB、TrKC、P75基本不结合(各受试抗体浓度由0μg/mL增加到20μg/mL，OD450值基本没有变化，接近于0)。可见，受试抗体与靶标TrKA结合的特异性都很好。
实施例12应用ELISA方法检测受试抗体与Mouse-TrKA蛋白的结合能力
将受试抗体(23E12、21E5)样品分别用PBS缓冲液稀释至11个浓度梯度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)，通过ELISA方法检测各浓度梯度受试抗体与Mouse-TrKA受体的结合情况，检测受试抗体与Mouse-TrKA蛋白的结合能力，结果见图9，图中，一定的抗体浓度下，OD450值反映抗体与蛋白的结合强弱，读值越大抗体与蛋白的结合越强。实验结果显示，受试抗体的浓度由0μg/mL增加到20μg/mL，OD450值逐渐增加直至趋近稳定，接近3.5左右。可见，受试抗体23E12、21E5和Mouse-TrKA蛋白都有很好的结合能力。
实施例13应用流式细胞术检测受试抗体与Mouse-TrKA蛋白的结合能力
将受试抗体23E12样品分别用PBS缓冲液稀释至11个浓度梯度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)，通过流式细胞术检测各浓度梯度受试抗体与HEK293T-Mouse-TrKA细胞表面Mouse-TrKA受体的结合情况，检测受试抗体与Mouse-TrKA蛋白的结合能力，结果见图10。图中，EC50(半数结合浓度)值反映抗体的结合能力，EC50值越小，抗体的结合能力越强，实验结果显示，受试抗体的浓度由0μg/mL增加到20μg/mL，％Parent值逐渐增加直至趋近稳定，EC50值＝0.08012μg/mL。可见，受试抗体23E12与HEK293T-Mouse-TrKA细胞表面Mouse-TrKA受体有很好的结合能力。
实施例14应用ELISA方法检测受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用
试验中，以IgG4为阴性对照(该抗体不结合Mouse-NGF及Mouse-TrkA)，将Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以结合Mouse-TrkA蛋白，抗Mouse-TrkA单克隆抗体也可以结合Mouse-TrkA蛋白，设计竞争性实验，通过ELISA方法，检测不同浓度(2.5μg/mL，0.25μg/mL)受试抗体(23E12，21E5)作用下，Mouse-NGF与Mouse-TrkA蛋白结合情况，研究受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用。实验结果见图11。图中，OD450值反映了与Mouse-TrkA结合的Mouse-NGF信号。读值越低，与Mouse-TrkA结合的Mouse-NGF信号越弱，抗体抑制Mouse-NGF与Mouse-TrKA结合的作用越大；如图所示，与阴性对照组相比，不同浓度(2.5μg/mL，0.25μg/mL)受试抗体(23E12，21E5)作用下，与Mouse-TrkA结合的Mouse-NGF信号显著性降低。可见，受试抗体23E12、21E5能够抑制Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合。
实施例15应用流式细胞术检测受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用
将Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以结合HEK293T-Mouse-TrkA细胞上的Mouse-TrkA蛋白胞外区，抗Mouse-TrkA单克隆抗体也可以结合HEK293T-Mouse-TrkA细胞上的Mouse-TrkA蛋白胞外区，设计竞争性实验，通过流式细胞术，检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)受试抗体作用下，Mouse-NGF与HEK-293T-Mouse-TrkA细胞上Mouse-TrkA蛋白胞外区结合情况，研究受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用。实验结果见图12。图中，parent％值反映了与HEK293T-Mouse-TrkA细胞上Mouse-TrKA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号，读值越低，与HEK293T-Mouse-TrkA细胞上Mouse-TrkA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号越弱，抗体抑制Mouse-NGF与Mouse-TrKA结合的作用越大；如图所示，随着受试抗体浓度的增加，％parent值逐渐降低，直到趋近于零，即与Mouse-TrkA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号逐渐降低，直到没有Mouse-NGF结合Mouse-TrkA蛋白胞外区，Mouse-NGF与Mouse-TrkA的结合全部抑制，IC50＝0.05147μg/mL。可见，一定的浓度范围内，受试抗体23E12在细胞水平上能够剂量依赖性的抑制Mouse-NGF与Mouse-TrkA的结合。
实施例16应用ELISA方法检测受试抗体对Human-NGF和Human-TrKA结合的抑制作用
将Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以结合Mouse-TrkA蛋白，抗Mouse-TrkA单克隆抗体也可以结合Mouse-TrkA蛋白，设计竞争性实验，通过Elisa方法，检测不同浓度(20μg/mL，10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.313μg/mL，0.156μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.019μg/mL)受试抗体作用下，Mouse-NGF与Mouse-TrkA蛋白结合情况，研究受试抗体对Mouse-NGF和Mouse-TrKA结合的抑制作用。实验结果见图13。图中，OD450值反映了与Mouse-TrkA结合的Mouse-NGF信号。读值越低，与Mouse-TrkA结合的Mouse-NGF信号越弱，抗体抑制Mouse-NGF与Mouse-TrKA结合的作用越大；如图所示，随着受试抗体浓度的增加，OD450值逐渐降低，直到趋近于零，即与Mouse-TrkA蛋白胞外区结合的Mouse-NGF信号逐渐降低，直到几乎没有Mouse-NGF结合Mouse-TrkA蛋白胞外区，Mouse-NGF与Mouse-TrkA的结合几乎完全抑制。可见，一定的浓度范围内，受试抗体23E12、20C8、21E5、27H3、4H4、2A5在分子水平上能够剂量依赖性的抑制NGF与TrkA的结合。
实施例17应用福尔马林致痛模型评价受试抗体的体内镇痛活性
福尔马林炎症痛模型是通过注射福尔马林来产生持续而非短暂的疼痛刺激及应答的验证痛模型。该模型产生两相疼痛，分别是第I相化学刺激疼痛和第II相炎症疼痛，造成的疼痛应答具有可重复性、可计量性，是临床前疼痛研究最佳的模型之一，且被广泛应用于评估不同药物的镇痛效果。试验中，选用6-8周雄性ICR小鼠，造模前根据体重随机分为6组：模型组(皮下注射生理盐水)、Tanezumab 60μg/mouse剂量组、20C8 60μg/mouse剂量组、21E560μg/mouse剂量组、23E12 15μg/mouse剂量组、23E12 60μg/mouse剂量组，每组10只。药物经皮下给药，18个小时后于小鼠右后爪足背皮下注射2.5％福尔马林溶液15μL，观察其后45分钟内小鼠抬脚次数，记1-15min为第I相疼痛，16-45min为第II相疼痛，一般而言，第I相疼痛反映的是急性疼痛，第II相疼痛反映的是慢性疼痛。结果见图14(图中数据展示为Mean±SEM,n＝10/组，*p<0.05与溶剂模型组比较，使用单因素方差分析附加LSD多重比较检验)，图中抬脚次数反映小鼠造模后的疼痛强度，抬脚次数越少，疼痛越弱。结果显示，与模型组相比，23E12 60μg/mouse剂量组能显著减少小鼠第II相疼痛的抬脚次数，其它剂量组未能降低小鼠造模后的抬脚次数。结论：在福尔马林致痛模型中，皮下注射60μg/mouse的受试抗体23E12对于慢性疼痛有效，而阳性药Tanezumab未体现镇痛效果，可能对福尔马林致痛模型不敏感。
实施例18应用完全弗氏佐剂诱导炎症疼痛模型评价受试抗体的体内镇痛活性
完全弗氏佐剂诱导炎症痛模型通过在小鼠掌心注射完全弗氏佐剂来产生类似骨关节炎症的慢性炎症疼痛刺激及应答的疼痛模型，通过机械痛测试对疼痛测量，机械刺激力度越大，说明动物对疼痛的耐受性越强。试验中，选用8周龄雄性ICR小鼠，在造模前根据疼痛敏感随机分为6组(15只/组)：对照组(小鼠左后肢足底注射生理盐水25μl+皮下注射生理盐水)，模型组(小鼠左后肢足底注射25μl CFA诱导炎性痛+皮下注射生理盐水)、Tanezumab 60μg/mouse剂量组，23E12 60μg/mouse剂量组，在造模后第4天皮下注射药物，给药后36hr进行机械痛测试。结果见图15(图中数据展示为Mean±SEM，n＝15/组，#p＜0.05，##p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01与模型组比较，使用非参数统计分析附加独立样本T检验)，纵坐标表示机械刺激力度，小鼠爪子撤离的压力阈值越大，镇痛效果越好。结果显示：与模型组比较，皮下注射60μg/mouse 23E12、60μg/mouse tanezumab能够显著增加小鼠爪子撤离的压力阈值(P＜0.01；P＜0.05)，呈现镇痛作用，两者镇痛效果作用效果相当。结论：皮下注射60μg/mouse的受试抗体23E12，在完全弗氏佐剂诱导的炎症痛模型中呈现镇痛作用。
实施例19受试抗体毒理实验
在本实施例中，发明人所要进行的毒性测试如下表2所示。
表2：
Figure BDA0003368448500000361
Figure BDA0003368448500000371
其中，上述实验过程和实验结论如下所述：
毒理实验：
单次给药毒性
SD大鼠、食蟹猴，观察是否出现靶器官毒性。观察相关的症状，对体重、摄食、检眼镜检查、心电图、血液学、临床生化、尿液、脏器重量的影响，提供最大耐受剂量MTD，足够的安全系数。结果显示：无动物死亡，在器官和组织上观察到弥散型炎症浸润，但是无论临床病理还是组织学分析，都没有显示出靶器官毒性。对体重、摄食、检眼镜检查、心电图、血液学、临床生化、尿液、脏器重量无显著影响。大体解剖无显著异常。
重复给药毒性：SD大鼠、食蟹猴，一周一次静脉注射药物，连续4周，观察临床病理学和组织学确定是否存在靶器官毒性NOAEL，观察对体重、摄食、检眼镜检查、心电图、血液学、临床生化、尿液、脏器重量的影响，免疫原性(ADA(抗药抗体)分析方法)，免疫毒性研究(评价内容包括：血液学白细胞分类计数(包括巨噬细胞)、临床化学(球蛋白和白蛋白：球蛋白比值))，器官质量(胸腺、脾脏、淋巴结)和组织病理学(淋巴器官和组织)计算安全窗。结果显示：无动物死亡，在器官和组织上观察到弥散型炎症浸润，但是无论临床病理还是组织学分析，都没有显示出靶器官毒性。没有出现纳武单抗相关的症状，对体重、摄食、检眼镜检查、心电图、血液学、临床生化、尿液、脏器重量无显著影响。大体解剖无显著异常。
一般安全药理学：SD大鼠单次静脉注射药物，观察药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的影响。结果显示：药物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的无影响。
局部给药安全性实验(血管刺激性实验和体外溶血实验)：新西兰大白兔静脉注射药物，检验药物对血管和血液是否有影响。结果显示：无影响。
高致敏性试验(豚鼠全身主动过敏实验)：豚鼠单次静脉注射药物，观察其是否有致敏作用。结果显示：无致敏作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.一种能够特异性识别TrkA的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
分别如SEQ ID NO:28、29和30或者与SEQ ID NO:28、29和30具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
分别如SEQ ID NO:37、38和39或者与SEQ ID NO:37、38和39具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别TrkA的胞外区。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ IDNO：55所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO：64所示氨基酸序列的轻链可变区；或者所述抗体具有如SEQ ID NO：58所示氨基酸序列的重链可变区和SEQ ID NO：67所示氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体恒定区的全长序列如SEQ ID NO:74或75所示。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ IDNO:76所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的轻链；或者所述抗体具有如SEQ ID NO:79所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:88所示氨基酸序列的轻链。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体；其中，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～7任一项所述的抗体或其抗原结合片段；所述核酸分子具有如SEQ ID NO:112所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:121所示核苷酸序列；或者，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:115所示核苷酸序列或具有SEQID NO:124所示核苷酸序列。
9.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求8所述的核酸分子。
10.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求8所述的核酸分子，或者表达权利要求1～7任一项所述的抗体或其抗原结合片段；其中，所述重组细胞是通过将权利要求9所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
11.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～7任一项所述的抗体，权利要求8所述的核酸分子，权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的重组细胞。
12.权利要求1～7任一项所述的抗体、权利要求8所述的核酸分子、权利要求9所述的表达载体或权利要求10所述的重组细胞、权利要求11所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化、非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌。
14.一种检测TrkA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的抗体；其中，所述试剂盒用于检测TrkA或者诊断TrkA相关的疾病。
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