JP2024500920A - 抗il1rap抗体 - Google Patents
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Abstract
【要約】【解決手段】 本発明は、インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。さらに、抗体を符号化するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、及びポリヌクレオチド、又はベクターを含む組換え宿主細胞に関するものである。さらに、抗体又は抗原結合フラグメントの産生方法に関するものである。さらに、抗体又は抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター及び/又は宿主細胞を含む組成物に関するものである。さらに、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤での治療に感受性がある疾患又は障害の医薬に使用するための、及び/又は予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するための、及び/又は、ここで、疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する、抗体又は抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び/又は組成物に関連するものである。【選択図】図1-1
Description
本発明は、抗炎症性、抗線維化性、及び/又は抗腫瘍性の物性を有する抗IL1RAP抗体又はそのフラグメント、ならびにIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達に関連する疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断におけるその使用に関するものである。
サイトカインリガンドのインターロイキン-1(IL-1)ファミリーとその受容体は、炎症、自己免疫、免疫制御、線維化、細胞増殖、腫瘍成長、腫瘍転移、及び宿主防御に関連している。炎症性、自己免疫性、免疫制御性、線維性、及び変性性の疾患や障害、またがんなどの細胞増殖性及び腫瘍性の疾患や障害の病態に寄与する(Garlanda C,The interleukin-1 family:back to the future.Immunity,39:1003-1018(2013)).
これらの疾患は、いずれも個人及び社会に多大な負担をもたらすものであり、サイトカインリガンドのIL-1ファミリー及び受容体に関連する炎症性、自己免疫性、免疫制御性、線維化、変性、及び細胞増殖性の疾患又は障害を治療、改善、予防、診断、又は検出する治療法が依然として必要とされている。
IL-1ファミリーは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γを含む多数のアゴニストサイトカインを含み、これらのサイトカインはそれぞれ固有のIL-1ファミリー細胞膜受容体と結合する。サイトカインが同族受容体に結合すると、IL-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)と呼ばれる共受容体が受容体複合体を形成し、細胞内のシグナル伝達及びNF-κBを含む転写因子の活性化を引き起こし、炎症反応を引き起こす。IL1RAPは、IL-1受容体I(IL1R1;IL-1α及びIL-1βを結合)、IL-33受容体(ST2、IL1RL1;IL-33を結合)、及びIL-36受容体(IL1RL2;IL-36α、IL-36β、及びIL-36γを結合)の共受容体で、サイトカインIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γの下流のシグナル伝達に必要である。
IL1RAPに結合する抗体は、IL1RAP依存性受容体の下流のサイトカインシグナルを遮断することができる。興味深いことに、この遮断機能とは別に、IL1RAPに結合する抗体は、他の機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)及び/又は抗体依存性細胞貪食(ADCP)を誘導し、それによってIL1RAP発現腫瘍細胞などの標的細胞を死滅させることつながること関しても使用することが可能である。
従来、IL-1ファミリーのサイトカインリガンドのシグナル伝達経路を減少、阻害、及び/又は遮断することが可能な抗体が、それぞれの抗体の特性に合わせて生成されてきた。例えば、WO2015/132602は、程度の差こそあれ、IL-1α、IL-1β、及びIL-33のシグナル伝達を阻害する抗IL1RAP抗体を開示する。
6種類のサイトカイン(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ)すべてを遮断することは、IL-1ファミリーのサイトカインリガンド及び受容体を標的とした治療アプローチに関して有益であると期待される。IL-1α及びIL-1βは強力な炎症性サイトカインであり、急性炎症におけるこれらの関与は広く説明されている。IL-33は従来、IL-5及びIL-13などの2型サイトカインの産生を誘導するTh2サイトカインと考えられてきた。IL-36の機能についてはあまりよく知られていないが、いくつかの研究から、IL-36は免疫細胞の活性化に関与し、炎症性サイトカインの放出を誘導することが示唆されている。これらのサイトカインの経路をすべて標的とすることで、疾患関連プロセス、例えば、炎症プロセスをより完全にダウンレギュレーションすることができ、炎症性疾患又は障害を有する患者の治療結果を向上させることができるだろう。
今日まで、インターロイキン-1(IL-1)ファミリーのサイトカインリガンド及び受容体(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達に関連する疾患又は障害の種々の態様に対処する治療オプションが欠如している。現在の治療法は、IL-1ファミリーサイトカインリガンドに関連する別々の経路を標的にしているだけであり、例えば、炎症及び線維化の態様において、IL-1ファミリーサイトカインリガンドに関連する複数の経路を同時にダウンレギュレーションすることは、依然として臨床上の課題のままである。結果として、IL-1ファミリーのサイトカインリガンド及び受容体に関連する多面的な態様を標的とした治療法の改善が急務のままである。
本発明の発明者らは、IL-1RAPドメイン2に結合し、6つのIL1RAP依存性リガンド;IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γの下流のシグナル伝達を阻害する能力を有する抗体、及びそのバリアントを生成してきた。この優れた特性により、本抗体は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達に関連する疾患及び障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断に使用でき、それによりこれらのサイトカインに関連するいくつかの下流経路を同時に標的とすることができる。結果として、本抗体は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達に関連する疾患及び障害のいくつかの態様及びプロセス、例えば炎症性又は線維性の疾患又は障害における炎症性及び線維性の態様、あるいは腫瘍性の疾患又は障害における炎症性、線維性、又は増殖性の態様を標的とすることに使用することができる。本明細書に記載された抗体は、複数のサイトカイン経路を同時に標的とすることができ、例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γの経路を標的とし、これは、1つ又はいくつかのサイトカインのみを遮断しても、疾患又は障害の治療又は予防に十分に効果がないであろう疾患又は障害の治療時に臨床的に有利である。さらに、この抗体をヒト化及び脱免疫化することで最適化し、微調整された特性を有する抗体変異となることも開示されている。
本発明の第1の態様は、インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又は抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチドに関するものである。
本発明の第3の態様は、本発明の第2の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関するものである。
本発明の第4の態様は、本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド又は本発明の第3の態様にかかるベクターを含む組換え宿主細胞に関するものである。
本発明の第5の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法に関し、前記方法は、本発明の第2の態様のポリヌクレオチド又は本発明の第3の態様のベクターを含む本発明の第4の態様の宿主細胞を、符号化された抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む。
本発明の第6の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、及び/又は
本発明の第4の態様の宿主細胞、
を医薬組成物に含み、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関するものである。
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、及び/又は
本発明の第4の態様の宿主細胞、
を医薬組成物に含み、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関するものである。
本発明の第7の態様は、
医療に使用するための、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものである。
医療に使用するための、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものである。
本発明の第8の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものであり、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものであり、及び/又はここで、前記疾患又は障害は、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものであり、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものであり、及び/又はここで、前記疾患又は障害は、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第9の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様に係る宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものであり、
対象の腫瘍性の疾患に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導し、及び/又は成長及び/又は増殖を阻害するために使用するためのものであり、ここで、前記細胞が、IL1RAPを発現する。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様に係る宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものであり、
対象の腫瘍性の疾患に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導し、及び/又は成長及び/又は増殖を阻害するために使用するためのものであり、ここで、前記細胞が、IL1RAPを発現する。
本発明の第10の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様に係る宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物の使用に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断のための医薬品の調製における使用に関するものであり、
及び/又は、前記疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様に係る宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物の使用に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断のための医薬品の調製における使用に関するものであり、
及び/又は、前記疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第11の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様に係る宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物の使用に関するものであり、
IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び/又は診断のための医薬品の調製に使用する。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様に係る宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物の使用に関するものであり、
IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び/又は診断のための医薬品の調製に使用する。
本発明の第12の態様は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナルの阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断のための方法、及び/又は前記疾患又は障害が、対象のIL1RAP発現細胞に関するものであり、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第13の態様は、対象においてIL1RAPを発現する細胞を検出するためのインビトロ方法に関するものであり、前記方法は、
(a)生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
(a)生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
本発明の第14の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有する患者を同定するためのインビトロ方法に関するものであり、
(a)検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、IL1RAPを発現する細胞に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るだろう患者を示すものである。
(a)検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、IL1RAPを発現する細胞に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るだろう患者を示すものである。
本発明の第15の態様は、細胞の発現IL1RAPに関連する疾患又は障害を有する患者を治療するための方法に関し、前記方法は、
a)本発明の第14の態様にかかる方法を用いて、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、及び
b)前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む、方法。
a)本発明の第14の態様にかかる方法を用いて、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、及び
b)前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む、方法。
本発明の第16の態様は、IL1RAPを発現する細胞を検出するための方法に関するものであり、前記方法は、
(a)第1の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントを、IL1RAPの発現について分析すべき細胞と接触させる工程と、
(b)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
(a)第1の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントを、IL1RAPの発現について分析すべき細胞と接触させる工程と、
(b)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
本発明の第17の態様は、腹膜炎を有する対象における炎症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第18の態様は、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第19の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減する方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第20の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象においてアテローム性動脈硬化症プラーク体積及び/又はアテローム性動脈硬化症プラークサイズを低減する方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第21の態様は、心筋炎を有する対象における炎症及び/又は線維化を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第22の態様は、心筋炎又は自己免疫性心筋炎を有する対象における心機能の悪化を打ち消すための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第23の態様は、全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第24の態様は、全身性硬化症を有する対象の肺線維症を軽減する方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明白に別途言及されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体」への言及は、1つ以上の抗体、少なくとも1つの抗体、又は2つ以上の抗体など、そのような抗体の複数を含む。同様に、「1つの抗IL1RAP抗体」は、例えば実施例9~22に記載された抗体バリアントのように、「複数の抗IL1RAP抗体」を指すこともできる。
用語「いくつかの実施形態」は、1つの実施形態、又は1つを超える実施形態を含み得る。
「a」又は「an」という単語の使用は、特許請求の範囲及び/又は明細書において「含む」という用語とともに使用される場合、「1つ」を意味してもよいが、「1つ以上」、「少なくとも1つ」、及び「1又は1を超える」の意味とも一致してもよい。
IL1RAP抗体
本発明の第1の態様は、インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又は抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
本発明の第1の態様は、インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又は抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは:
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
本明細書で使用される用語「インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質」、「IL1RAP」、及び「IL1-RAP」は、例えば、ジェンバンクアクセッション番号AAB84059、NCBI参照配列:NP_002173.1及びUniProtKB/Swiss-Protアクセッション番号Q9NPH3-1に記載のようなヒトIL1RAPタンパク質を特に含む。IL1RAPは、科学文献ではIL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1RAcP、及びEG3556としても知られる。
本明細書で使用する用語「mCAN10」(「murine CAN10」の略称)は、マウスIL1RAPに対する抗体を意味する。本抗体は、マウス代用物抗-IL1RAP抗体とも表記される。mCAN10は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γによるシグナル伝達を遮断することができるため、マウスIL1RAPとの交差反応性を欠く可能性がある抗ヒトIL1RAP抗体の代用として、同様の機能特性を有し、マウス疾患モデルにおけるIL1RAP遮断の治療効果評価に使用することができる。
本明細書で使用する「48D2」という用語は、抗体が他の種由来のIL1RAPにも結合し得ることにかかわらず、ヒトIL1RAPに対する抗体を指す。例えば、48D2がヒト、カニクイザル、及びブタ由来のIL1RAPと交差反応することは、実施例10から理解されるだろう。実施例9及び実施例10から理解されるだろうように、用語「48D2」は、実施例9に記載され、実施例10で特徴付けられるように取得されるキメラ抗体(「ch48D2」とも呼ばれる)を示すために使用され得る。
本明細書で使用する「h48D2」という用語は、実施例11で生成され、実施例12でさらに特徴付けられるようにヒト化された抗体48D2を指す。実施例12に記載したように、h48D2のいくつかのバリアントが得られた(例えば、表8参照)。実施例13に記載したように、h48D2のいくつかのさらなるバリアントが、脱免疫化によって得られる。
抗体及びそのフラグメントはポリペプチドであるため、「本発明の抗体又は抗原結合フラグメント」は、「本発明のポリペプチド」又は「抗体ポリペプチド、又はその抗原結合フラグメント」と言及され得ることは理解されるだろう。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、IL1RAPに対して特異性を有する。「特異性」とは、抗体又は抗原結合フラグメントが、インビボ、すなわちIL1RAPが人体内に存在する生理的条件下でIL1RAPに結合できることを意味する。好ましくは、抗体又は抗原結合フラグメントは、インビボで他のタンパク質に結合しない。代替的に、抗体又は抗原結合フラグメントが、エックスビボ又はインビトロでIL1RAPに結合することができることを意味する。このような結合特異性は、IL1RAPを発現するトランスフェクト細胞を用いたELISA、免疫組織化学、免疫沈降、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの当該技術分野で周知の方法によって決定することができる。有利なことに、抗体又は抗原結合フラグメントは、IL1RAPに選択的に結合することができる、すなわち、他のタンパク質よりもIL1RAPに少なくとも10倍以上強く結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトIL1RAPに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、非ヒトIL1RAPに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、カニクイザル由来のIL1RAPに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ブタ由来のIL1RAPに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞の表面上に発現したIL1RAPに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPの細胞外ドメイン上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、可溶性IL1RAPに結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPのドメイン2に結合する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPのアミノ酸135~234において、又はその内部でIL1RAPを結合する。
したがって、抗体又は抗原結合フラグメントは、IL1RAPのドメイン2における/その内部の(Wang et al.,2010,Nature Immunology,11:905-912を参照,その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる)、すなわちIL1RAP(UniProtKB/Swiss-Prot内のアクセッション番号Q9NPH3を参照)のアミノ酸135から234内にあるエピトープに結合できる可能性を有する。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントが結合するエピトープは、IL1RAPのアミノ酸135~154、155~174、175~194、195~214、又はアミノ酸215~234の間、又はアミノ酸174~191の間に位置しうる。しかしながら、エピトープが非直線状であってもよいことは理解されるだろう。
さらなる実施形態において、上述したように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、アフィボディ、テトラネクチン(CTLD)、アデクチン(モノボディ)、アンチカリン、DARPins(アンカリン)、アビマー、iMabs、マイクロボディ、ペプチドアプタマー、Kunitzドメイン、及びアフィリンを含むか、又はそれらからなる群から選択される抗体模倣物を含むか、又はそれからなるものである。
「抗体又はその抗原結合フラグメント」という用語は、実質的にインタクトな抗体だけでなく、抗体のフラグメントや誘導体も含む。インタクトな抗体とは、可変光領域、可変重領域、定常光領域、及び定常重領域を含む抗体としてみなすことができる。さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖、及び/又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、ならびに抗原結合フラグメント及びその誘導体も含む。好適な抗原結合フラグメント及び誘導体としては、Fvフラグメント(例えば、単鎖Fv及びジスルフィド結合Fv)、Fab様フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント及びF(ab)2フラグメント)、単一可変ドメイン(例えば、VH及びVLドメイン)及びドメイン抗体(dAbs、単一フォーマット及びデュアルフォーマットを含む[すなわち、dAb-linker-dAb]])があるが、必ずしも限定されない。抗体全体ではなく、抗体フラグメントを使用することの潜在的な利点は、数倍になる。フラグメントのサイズが小さくなることで、固形組織への浸透性が向上するなど、薬理学的特性が改善される可能性がある。さらに、Fab、Fv、ScFv、及びdAb抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントは、大腸菌で発現させ、及びそこから分泌させることができるので、大量に生産することが容易にできる。
また、「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、抗体模倣体(例えば、高い安定性を持ちながら特定の位置で可変性を導入できる非抗体足場構造)を包含することを意図する。生化学の技術分野の当業者であれば、多くのそのような分子に精通しており、Gebauer & Skerra,2009,Curr Opin Chem Biol 13(3):245-255(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載される。例示的な抗体模倣体は:アフィボディ(トリネクチンとも呼ばれる;Nygren,2008,FEBS J,275,2668-2676);CTLDs(Tetranectins とも呼ばれるInnovations Pharmac.Technol.(2006),27-30);アドネクチン(モノボディとも呼ばれる;Meth.Mol.Biol.,352(2007)、95-109);アンチカリン(Drug Discovery Today(2005)、10、23-33);DARPins(アンカリン;Nat.Biotechnol.(2004),22,575-582);avimers(Nat.Biotechnol.(2005),23,1556-1561);微小体(FEBS J,(2007),274,86-95);peptide ペプチドアプタマー(Expert.Opin.Biol.Ther.(2005),5,783-797);Kunitzドメイン(J.Pharmacol.Exp.Ther.(2006)318,803-809);affilins(Trends.Biotechnol.(2005),23,514-522);affimers(Avacta Life Sciences,Wetherby,UK)を含む。
また、本発明の範囲に含まれるのは、キメラT細胞受容体(キメラT細胞受容体、キメラ免疫受容体、及びキメラ抗原受容体又はCARとしても知られている)(Pule et al.,2003,Cytotherapy 5(3):211-26,その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる)。これは、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を移植する操作された受容体である。通常、CARはモノクローナル抗体の特異性をT細胞に移植するために使用され、そのコード配列の移植はレトロウイルスベクターによって促進される。そのような分子の最も一般的な形態は、CD3-zetaの膜貫通部及びエンドドメインが融合したモノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント(scFv)を含む融合体である。T細胞はこの融合分子を発現すると、転移したモノクローナル抗体の特異性を発現する標的細胞を認識し、殺傷する。
当業者はさらに、本発明が、現在存在するか将来存在するかを問わず、例えば、ポリエチレングリコール又は他の適切なポリマー(下記参照)の共有結合によって修飾される、抗体及びその抗原結合フラグメントの修飾バージョンも包含することを理解するだろう。
抗体及び抗体フラグメントを生成する方法は、当技術分野でよく知られる。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング(Orlandi.et al,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:3833-3837;Winter et al.,1991,Nature 349:293-299,これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)又は培養中の細胞株によるモノクローナル抗体分子の生成を用いたいくつかの方法のうちの任意の1つを介して生成され得る。ハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法、及びエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)ハイブリドーマ法(Kohler et al .,1975.Nature 256:4950497;Kozbor et al.,1985.J.Immunol.Methods 81:31-42;Cote et al.,1983.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2026-2030;Cole et al.,1984.Mol.Cell.Biol.62:109-120,これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)などを含むが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体の製造のための好適な方法は、また、“Monoclonal Antibodies:A manual of techniques”,H Zola(CRC Press,1988,これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)and in “Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications”,J G R Hurrell(CRC Press,1982,これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)に開示される。
同様に、抗体フラグメントは、当技術分野で周知の方法を用いて得ることができる(例えば、参照、Harlow & Lane,1988,“Antibodies:A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)。例えば、本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、又は大腸菌もしくは哺乳類細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物又は他のタンパク質発現系)において、フラグメントをコード化するDNAを発現させることによって調製される。また、抗体全体を常法によりペプシン又はパパインで消化することにより、抗体フラグメントを得ることができる。
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語には、標準的な20種類の遺伝子符号化アミノ酸と、(天然の「L」形と比較して)「D」形のそれらの対応する立体異性体、オメガアミノ酸及び他の天然に存在するアミノ酸、非従来型アミノ酸(例えば、α,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸など)及び化学的に誘導体化(下記参照)したアミノ酸が含まれる。
「アラニン」、「Ala」、「A」のようにアミノ酸を具体的に列挙する場合、明示的に別段の記載がない限り、L-アラニン及びD-アラニンの両方を指す。また、本発明のポリペプチド(抗体又はその抗原結合フラグメント)は、所望の機能特性が抗体又は抗原結合フラグメントに保持される限り、他の非従来型アミノ酸も好適な構成要素となり得る。示されたアミノ酸配列について、適切な場合、各符号化されたアミノ酸残基は、従来のアミノ酸のトリビア名に対応する1文字の指定によって表される。
いくつかの実施形態において、本発明の、本明細書で定義される抗体又はその抗原結合フラグメントは、L-アミノ酸を含む、又はそれらからなる。
ヒト治療の場合、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましく使用されることは、当業者には理解されることだろう。非ヒト抗体のヒト化体(例えば、実施例9及び10に記載のウサギ抗体)は、非ヒト抗体由来の好ましくは最小部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体又は抗体フラグメントである。ヒト化抗体は、ヒト抗体(レシピエント抗体)の相補的な決定領域を、所望の機能を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)の相補的な決定領域の残基で置換した抗体を含む。いくつかの実施例において、ヒト抗体のFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入された相補性決定領域やフレームワーク配列にも存在しない残基も含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、及び典型的には2つの可変ドメインの実質的なすべてを含み、相補性決定領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域のすべて、又は実質的にすべてが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する。ヒト化抗体は、最適には、一般的にヒト抗体由来のFc領域などの抗体定常領域の少なくとも一部を含む。本明細書の他の箇所で議論したように、ヒト化抗体はマウスIL1RAPとの交差反応性を欠く場合がある。このように、ヒト化抗体と同様の機能特性を示す適切なサロゲート(代用)(例えば、mCAN10)をマウス疾患モデルで使用することができ、サロゲートの結果はヒト化抗体の機能性を反映していると解釈することができる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからその中に導入される1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基と呼ばれ、通常、輸入された可変ドメインから取り出される。ヒト化は、ヒトの相補性決定領域を対応するげっ歯類の相補性決定領域で置き換えることによって実質的に行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列で置換されているものである。実際には、ヒト化抗体は、相補性決定領域残基の一部と、場合によってはフレームワーク残基が齧歯類抗体の類似部位の残基で置換された、典型的なヒト抗体であると考えられる。
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーなど、当技術分野で知られる様々な技術を用いて同定することもできる。
抗体の最適化、例えばヒト化によって(例えば、Jones et al.,1986,Nature 321:522- 525;Reichmann et al.,1988.Nature 332:323-327;Verhoeyen et al.,1988,Science 239:1534-15361;US4,816,567を参照、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる) 及び/又は脱免疫化、例えば、Jones et al.(Methods Mol Biol.2009;525:405-23)又は実施例11及び13に記載され、微調整された特性を持つ抗体バリアントの生成につながる。
CDRs
本発明の抗体は、その特徴的な相補性決定領域(CDR)配列によって定義される。抗体のCDR配列を定義するには、いくつかのアプローチがある。本発明の抗体のCDRは、3つの異なるよく知られたアプローチで定義されてきた(結果として、3つのCDR定義カテゴリーがある):1)Kabatによる定義、2)IMGTによる定義、又は3)IMGT及びKabatの組み合わせにかかる定義。
本発明の抗体は、その特徴的な相補性決定領域(CDR)配列によって定義される。抗体のCDR配列を定義するには、いくつかのアプローチがある。本発明の抗体のCDRは、3つの異なるよく知られたアプローチで定義されてきた(結果として、3つのCDR定義カテゴリーがある):1)Kabatによる定義、2)IMGTによる定義、又は3)IMGT及びKabatの組み合わせにかかる定義。
各CDR定義カテゴリー(それぞれKabat、IMGT、又はIMGT及びKabatの組み合わせ)内で、CDR配列は、キメラ抗体48D2及びそのすべての最適化抗体変異体、例えばヒト化抗体変異体又はヒト化/脱免疫化抗体変異体(「配列」の項におけるそれぞれの配列に示される参照)で同じであることに注目することが重要である。
当業者は、6つのCDRのセット(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)は、i)IMGT、又はii)Kabat、又はiii)Kabat及びIMGTの組み合わせのいずれかに従って定義することができると理解するだろう。
さらに、当業者は、当技術分野で知られている他のアプローチ、例えば、Al-Lazikani et al.,(1997) JMB 273,927-948)、Martin(強化したChothia)、Gelfand又はHonnegerによるCDRの定義によって、本発明の抗体のCDRを定めることが可能であることを理解するであろう。さらに、AbM定義(Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアで使用されるKabat定義とChothia定義の組み合わせ)又は接触定義(結晶構造の分析に基づく)などのアプローチが存在し、当技術分野で知られる。例えば、Kabat et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest,1987 and 1991,NIH,Bethesda,Md.),Lefranc et al.(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains,Dev Comp Immunol.2005;29(3):185-203)及び Dondelinger et al.(Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-Binding Surface/Residue Definition,Front.Immunol.,16 October 2018)を参照。
当業者は、本明細書で提示したIMGT及びKabat CDRを提供された場合、既知の情報を使用して、他のCDR命名規則又はアプローチ(例えば、Chothia)をリストすることができる。したがって、CDRの命名規則やアプローチはすべて包含される。
明細書に示すように、IMGT及びKabatの番号付けシステムでは、CDRとしてわずかに異なる残基が同定された。場合によっては、IMGT又はKabatのような1つの番号体系に従ってCDRを定義することが有益なこともある。多くの場合、これらのCDR配列は短く(例えば、番号付けシステムを組み合わせたアプローチよりも短い)、したがって、結合に重要なコア配列を提供する。他の場合において、例えばIMGT及びKabatのCDR配列を組み合わせて使用することが有益となり得る。
いくつかの実施形態において、インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:3)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;
b)QASESISTALA(配列番号:7)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:8)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:9)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;又は
c)QASESISTALA(配列番号:13)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:14)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;ISPGVST(配列番号:5)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;又は
e)HFDIT(配列番号:10)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及び
GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;又は
f)GPSLSHFDIT(配列番号:16)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3を含む。
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:3)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;
b)QASESISTALA(配列番号:7)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:8)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:9)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;又は
c)QASESISTALA(配列番号:13)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:14)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;ISPGVST(配列番号:5)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;又は
e)HFDIT(配列番号:10)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及び
GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;又は
f)GPSLSHFDIT(配列番号:16)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3を含む。
抗体48D2のCDR配列の異なる定義されたセット間の関係は、以下のように説明され得る、
-太字で強調されたCDR残基は、IMGT番号付けシステムを使って同定された、
-下線で強調されたCDR残基は、Kabat番号付けシステムを使って同定された。
-CDR残基は、IMGT及びKabat番号システムの組み合わせで定義された(太字及び下線の組み合わせの配列)。
-太字で強調されたCDR残基は、IMGT番号付けシステムを使って同定された、
-下線で強調されたCDR残基は、Kabat番号付けシステムを使って同定された。
-CDR残基は、IMGT及びKabat番号システムの組み合わせで定義された(太字及び下線の組み合わせの配列)。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントのCDR配列は、IMGTに従って定義される:
配列番号:1
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
ESISTA
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
ESISTA
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KAS
KAS
配列番号:3
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
配列番号:4
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFD
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFD
配列番号:5
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
ISPGVST
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
ISPGVST
配列番号:6
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントのCDR配列は、Kabatに従って定義される:
配列番号:7
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
配列番号:8
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
配列番号:9
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
配列番号:10
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
HFDIT
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
HFDIT
配列番号:11
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
配列番号:12
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントのCDR配列は、IMGT及びKabatの組み合わせに従って定義される:
配列番号:13
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
配列番号:14
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
配列番号:15
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
配列番号:16
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFDIT
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFDIT
配列番号:17
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
配列番号:18
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
しかしながら、CDR配列内の低レベルのバリアント(典型的には、わずか1又は2つのアミノ酸)が、IL1RAPに対する抗体又は抗原結合フラグメントの特異性を損なうことなく許容され得ることを、当業者は理解するだろう。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のようなCDR(配列番号1~18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる)を含み、ここで、CDRのアミノ酸のうちの任意の1つが別のアミノ酸に対して変更されており、例えば、1つのアミノ酸など、2つのアミノ酸より多くはそのように変更されていないとの但し書き付きである。
軽鎖可変領域
実施例9で詳述したように、ウサギをヒト及びネズミのIL1RAPで免疫化した。その後、得られた抗体について、IL1RAPへの結合、及びIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害する能力など、望ましい特性を分析した。48D2は、これらの特徴に関して、優れた特徴を有する抗体として同定され、その後、臨床及び治療への応用のための抗体を改善させる目的を持って、改良及び最適化されてきた。この最適化により、アミノ酸配列の異なる可変軽鎖領域と可変重鎖領域を有する抗体バリアントをもたらした。しかしながら、CDRはすべての抗体バリアントで同一である。言い換えれば、各CDR定義カテゴリー(i)Kabat、ii)IMGT、又はiii)IMGTとKabatの組み合わせ)内で、CDR配列(夫々、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、又はCDR-H3)は、キメラ抗体48D2及びそのすべての最適化抗体バリアントで同じである。
実施例9で詳述したように、ウサギをヒト及びネズミのIL1RAPで免疫化した。その後、得られた抗体について、IL1RAPへの結合、及びIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害する能力など、望ましい特性を分析した。48D2は、これらの特徴に関して、優れた特徴を有する抗体として同定され、その後、臨床及び治療への応用のための抗体を改善させる目的を持って、改良及び最適化されてきた。この最適化により、アミノ酸配列の異なる可変軽鎖領域と可変重鎖領域を有する抗体バリアントをもたらした。しかしながら、CDRはすべての抗体バリアントで同一である。言い換えれば、各CDR定義カテゴリー(i)Kabat、ii)IMGT、又はiii)IMGTとKabatの組み合わせ)内で、CDR配列(夫々、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、又はCDR-H3)は、キメラ抗体48D2及びそのすべての最適化抗体バリアントで同じである。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり;
KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり;及び/又はQQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それらからなる。
KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり;及び/又はQQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それらからなる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、CDRを含む軽鎖可変領域を含み、前記CDRは、
a)ESISTA(配列番号:1)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:3)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;
b)QASESISTALA(配列番号:7)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:8)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:9)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;又は
c)QASESISTALA(配列番号:13)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:14)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3である。
a)ESISTA(配列番号:1)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:3)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;
b)QASESISTALA(配列番号:7)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:8)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:9)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3;又は
c)QASESISTALA(配列番号:13)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L1;KASTLPS(配列番号:14)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L2;及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-L3である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:19のアミノ酸配列;又は配列番号:19に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。この軽鎖可変領域は、例えば、実施例9及び10に記載されるキメラ(非ヒト化、非最適化)48D2抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、及び配列番号:25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域を含み;又は配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、又は配列番号:25に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖可変領域は、例えば、実施例11及び12に記載されるヒト化h48D2抗体バリアントの一部である。
これらの軽鎖可変領域は、例えば、実施例11及び12に記載されるヒト化h48D2抗体バリアントの一部である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:31のアミノ酸配列;又は、配列番号:31に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この軽鎖可変領域は、例えば、実施例13及び14に記載されるヒト化及び非免疫化48D2抗体バリアントの一部である。
この軽鎖可変領域は、例えば、実施例13及び14に記載されるヒト化及び非免疫化48D2抗体バリアントの一部である。
パーセント同一性(又は配列同一性)は、例えば、パラメーターとしてグローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスBLOSUM62、オープニングギャップペナルティ-14、エクステンドギャップペナルティ-4を使用して、Expasy施設サイト(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)のLALIGNプログラムにより決定することができる。代替的に、抗体の一部などの2つのポリペプチド間の配列同一性割合は、適切なコンピュータプログラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝計算グループのGAPプログラムを用いて決定することができ、同一性パーセントは、配列が最適に整列されたポリペプチドに関連して計算されることが理解されるだろう。
配列は、Clustal W プログラムを使用して実行されてもよい。使用されるパラメーターは、以下のようであってもよい:
-高速ペアワイズアライメントパラメーター:K-tuple(ワード)サイズ;1、窓の大きさ;5、ギャップペナルティ;3、トップダイアゴナルの数;5.スコアリング方法:x%。
-複数の配列パラメーター:ギャップオープンペナルティ;10、ギャップエクステンションペナルティ;0.05
-スコアリングマトリックスBLOSUM。
-高速ペアワイズアライメントパラメーター:K-tuple(ワード)サイズ;1、窓の大きさ;5、ギャップペナルティ;3、トップダイアゴナルの数;5.スコアリング方法:x%。
-複数の配列パラメーター:ギャップオープンペナルティ;10、ギャップエクステンションペナルティ;0.05
-スコアリングマトリックスBLOSUM。
代替的に、BESTFITプログラムは、ローカル配列の配列を決定するために使用されてもよい。
当業者は、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントをさらに最適化するために、上述した軽鎖可変領域のさらなる改変を考慮するだろう。例えば、当業者は、ヒト化及び非免疫化手順の間に行われるように、フレームワーク領域、すなわち、エピトープ結合CDR領域の外側のアミノ酸を変更し、それによってCDR領域を変更しないことを考慮する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のような軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のうちの任意の1つが別のアミノ酸に対して変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない。
重鎖可変領域
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、及び
ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる、CDRを含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、及び
ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる、CDRを含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
a)GPSLSHFD(配列番号:4)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;ISPGVST(配列番号:5)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;
b)HFDIT(配列番号:10)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びGGVGSSWKAFDL(配列番号:12)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;又は
c)GPSLSHFDIT(配列番号:16)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3を含む。
a)GPSLSHFD(配列番号:4)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;ISPGVST(配列番号:5)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;
b)HFDIT(配列番号:10)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びGGVGSSWKAFDL(配列番号:12)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3;又は
c)GPSLSHFDIT(配列番号:16)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H1;TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H2;及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるCDR-H3を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:20のアミノ酸配列;
又は、配列番号:20に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この重鎖可変領域は、例えば、実施例9及び10に記載されるキメラ(非ヒト化、非最適化)48D2抗体の一部である。
又は、配列番号:20に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この重鎖可変領域は、例えば、実施例9及び10に記載されるキメラ(非ヒト化、非最適化)48D2抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、及び配列番号:30からなる群から選択されるアミノ酸配列;
又は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、又は配列番号:30に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの重鎖可変領域は、例えば、実施例11及び12に記載されるヒト化h48D2抗体バリアントの一部である。
又は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、又は配列番号:30に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの重鎖可変領域は、例えば、実施例11及び12に記載されるヒト化h48D2抗体バリアントの一部である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:32、配列番号:33、及び配列番号:34からなる群から選択されるアミノ酸配列;
又は、配列番号:32、配列番号:33、又は配列番号:34に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの重鎖可変領域は、例えば、実施例13及び14に記載されるヒト化及び非免疫化48D2抗体バリアントの一部である。
又は、配列番号:32、配列番号:33、又は配列番号:34に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの重鎖可変領域は、例えば、実施例13及び14に記載されるヒト化及び非免疫化48D2抗体バリアントの一部である。
当業者は、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントをさらに最適化するために、上述した重鎖可変領域のさらなる改変を検討するだろう。例えば、当業者は、ヒト化及び非免疫化手順の間に行われるように、フレームワーク領域、すなわち、エピトープ結合CDR領域の外側のアミノ酸を変更し、それによってCDR領域を変更しないことを考慮する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のような重鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のうちの任意の1つが別のアミノ酸に対して変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない。
可変軽鎖及び可変重鎖の組合せ
当業者は、軽鎖可変領域の上述したバリアントのいずれもが、重鎖可変領域の上述したバリアントのいずれかと組み合わせることができることを理解するだろう。
当業者は、軽鎖可変領域の上述したバリアントのいずれもが、重鎖可変領域の上述したバリアントのいずれかと組み合わせることができることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:19のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、配列番号:20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域、又は配列番号:19又は配列番号:20に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この軽鎖と重鎖の可変領域の組み合わせは、例えば、実施例9及び10に記載されるキメラ(非ヒト化、非最適化)48D2抗体の一部である。
この軽鎖と重鎖の可変領域の組み合わせは、例えば、実施例9及び10に記載されるキメラ(非ヒト化、非最適化)48D2抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは:
a)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
b)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
c)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
d)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
e)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
f)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
g)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
h)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
i)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
j)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
k)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
l)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
m)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
n)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
o)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
p)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はからなる重鎖可変領域;
q)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
r)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
s)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
t)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
u)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
v)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
w)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
x)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
y)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
又は配列番号:21から配列番号:30のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖と重鎖の可変領域の組み合わせは、例えば、実施例11及び12に記載されるヒト化h48D2抗体バリアントの一部である。
以下の表は、ヒト化軽鎖及び重鎖の可変領域の例示的な組み合わせを描写する代替的な方法である:
a)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
b)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
c)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
d)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
e)配列番号:21のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
f)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
g)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
h)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
i)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
j)配列番号:22のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
k)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
l)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
m)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
n)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
o)配列番号:23のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
p)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はからなる重鎖可変領域;
q)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
r)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
s)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
t)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
u)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:26のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
v)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:27のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
w)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:28のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
x)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:29のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
y)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
又は配列番号:21から配列番号:30のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖と重鎖の可変領域の組み合わせは、例えば、実施例11及び12に記載されるヒト化h48D2抗体バリアントの一部である。
以下の表は、ヒト化軽鎖及び重鎖の可変領域の例示的な組み合わせを描写する代替的な方法である:
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは:
a)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
b)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:32のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
c)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:33のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
d)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:34のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
e)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
f)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:32のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
g)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:33のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
h)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:34のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
i)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
j)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:32のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
k)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:33のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;又は
l)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:34のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
又は配列番号:24、配列番号:25、配列番号:31、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:33、又は配列番号:34に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
a)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
b)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:32のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
c)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:33のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
d)配列番号:24のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:34のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
e)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
f)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:32のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
g)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:33のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
h)配列番号:25のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:34のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
i)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:30のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
j)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:32のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
k)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:33のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;又は
l)配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号:34のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域;
又は配列番号:24、配列番号:25、配列番号:31、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:33、又は配列番号:34に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖及び重鎖可変領域の組み合わせは、例えば、実施例13及び14に記載されるヒト化及び/又は非免疫化h48D2抗体バリアントの一部である。
以下の表は、ヒト化及び/又はヒト化及び非免疫化軽鎖及び重鎖可変領域の例示的な組み合わせを描写する代替方法である:
上記で定義した軽鎖可変領域、重鎖可変領域及びそれらの組み合わせは、さらに軽/重鎖定常領域又はその一部と組み合わせてもよいことが当業者には理解されるだろう(下記参照)。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:31を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のような重鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域及び/又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか1つが別のアミノ酸に対して変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つのアミノ酸は、そのように変更されていない。
定常領域及びFc部
当業者は、当該技術分野で知られている任意の軽質定常領域を、上述の軽質可変領域のバリアントのいずれかと組み合わせることができ、当該技術分野で知られている任意の重質定常領域を、上述の重質可変領域のバリアントのいずれかと組み合わせて、完全抗体を形成することができることを理解するだろう。
当業者は、当該技術分野で知られている任意の軽質定常領域を、上述の軽質可変領域のバリアントのいずれかと組み合わせることができ、当該技術分野で知られている任意の重質定常領域を、上述の重質可変領域のバリアントのいずれかと組み合わせて、完全抗体を形成することができることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域又はその一部を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、κ又はλ軽鎖である軽鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、κ軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、λ軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:35のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域を含むか、又は配列番号:35に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域又はその一部を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、α、δ、γ、ε、及びμからなる群から選択される重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgA、IgD、IgG、IgE、及びIgMからなる群から選択される免疫グロブリンアイソタイプである重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG免疫グロブリンアイソタイプである重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG抗体である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される免疫グロブリンサブクラスの重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG1抗体である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG2抗体である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG3抗体である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IgG4抗体である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号:36又は配列番号:2のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖定常領域を含むか、又はそれからなるか、
又は配列番号:36又は配列番号:2に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
又は配列番号:36又は配列番号:2に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域及び/又は重鎖定常領域を含むか、又はそれからなり、上記軽鎖定常領域及び/又は上記重鎖定常領域のアミノ酸のいずれか1つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、IgG重鎖(IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4重鎖など)のCH1、CH2、及び/又はCH3領域を含む。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントは、IgG1重鎖からの定常領域の一部又は全部を含んでもよい。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、CH1及びCL定常領域を、それぞれ上記で定義された重及び軽可変領域のいずれかと組み合わせて構成されるFabフラグメントであってもよい。
同様に、本発明の上記抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域又はその一部をさらに含んでいてもよい。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、κ又はλ軽鎖からのCL領域を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
-上記の軽鎖可変領域のいずれか1つ;及び/又は
-上記の重鎖可変領域のいずれか1つ;及び/又は
-上記の軽鎖定常領域のいずれか1つ;及び/又は
-上記の重鎖定常領域のいずれか1つ、を含むか、又はそれからなる。
-上記の軽鎖可変領域のいずれか1つ;及び/又は
-上記の重鎖可変領域のいずれか1つ;及び/又は
-上記の軽鎖定常領域のいずれか1つ;及び/又は
-上記の重鎖定常領域のいずれか1つ、を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
-配列番号19、21、22、23、24、25、及び31のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域;及び/又は
-配列番号20、26、27、28、29、30、32、33、及び34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域;及び/又は
-配列番号35のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域;及び/又は
-配列番号36又は2のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖定常領域、を含む。
-配列番号19、21、22、23、24、25、及び31のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域;及び/又は
-配列番号20、26、27、28、29、30、32、33、及び34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域;及び/又は
-配列番号35のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域;及び/又は
-配列番号36又は2のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖定常領域、を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fc領域を含む。
Fc領域はまた、Fcドメインを指す場合もある。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、天然に存在するFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、非天然に存在するFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、修飾された、例えば、変異した、IgG定常領域を有するFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fc領域を含み、Fc領域は、表1において同定された変異の1つ以上を含む。
Fc領域は、天然に存在するもの(例えば、内因的に産生される抗体の一部)であってもよいし、人工的なもの(例えば、天然に存在するFc領域に対して1つ以上の点変異を含む)であってもよい。
当技術分野でよく知られているように、抗体のFc領域は、その血清中半減期と、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、及び抗体依存性細胞貪食(ADCP)などのエフェクター機能を仲介する。
治療用モノクローナル抗体やFc融合タンパク質のFc領域を操作することで、求められる薬理活性に適した分子を生成できる(Strohl,2009,Curr Opin Biotechnol20(6):685-91,その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
(a)半減期を延長するための操作されたFc領域
抗体医薬の有効性を向上させる1つのアプローチは、抗体の血清持続性を高めることで、より高い循環レベル、より少ない投与回数、より少ない投与量を可能にする。
抗体医薬の有効性を向上させる1つのアプローチは、抗体の血清持続性を高めることで、より高い循環レベル、より少ない投与回数、より少ない投与量を可能にする。
IgGの半減期は、新生児受容体FcRnとのpH依存的な結合に依存する。内皮細胞表面に発現しているFcRnは、pH依存的にIgGと結合し、分解からそれを保護する。
pH7.4ではなく、pH6.0でFcRnに選択的に結合する抗体の中には、様々な動物モデルで高い半減期を示す。
CH2ドメイン及びCH3ドメインの間の界面に位置するいくつかの変異、例えば、T250Q/M428L(Hinton et al.,2004,J Biol Chem.279(8):6213-6、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)及びM252Y/S254T/T256E + H433K/N434F(Vaccaro et al.,2005,Nat.Biotechnol.23(10):1283-8、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)が、インビボでFcRnへの結合親和性及びIgG1の半減期を増加させることが示されてきた。
(b)エフェクター機能を変化させるための操作されたFc領域
抗体医薬やFc融合タンパク質の用途によっては、エフェクター機能(ADCCなど)を低下させるか増加させることが望まれる場合がある。
細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体の場合、エフェクター機能を奪うことが特定の臨床適応に必要となる場合がある。
抗体医薬やFc融合タンパク質の用途によっては、エフェクター機能(ADCCなど)を低下させるか増加させることが望まれる場合がある。
細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体の場合、エフェクター機能を奪うことが特定の臨床適応に必要となる場合がある。
逆に、オンコロジー用途(白血病及び固形腫瘍の治療など;下記参照)の抗体では、エフェクター機能を高めることで、治療活性を向上させることができる。
4種類のヒトIgGアイソタイプは、活性化Fcγ受容体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、阻害FcγRIIb受容体、及び補体の第1成分(C1q)に異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす(Bruhns et al.,2009,Blood.113(16):3716-25、その開示は参照により本明細書書に組み込まれる)。
4種類のヒトIgGアイソタイプは、活性化Fcγ受容体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、阻害FcγRIIb受容体、及び補体の第1成分(C1q)に異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす(Bruhns et al.,2009,Blood.113(16):3716-25、その開示は参照により本明細書書に組み込まれる)。
IgGとFcγRs又はC1qとの結合は、ヒンジ領域とCH2ドメインに位置する残基によって決まる。CH2ドメインの2つの領域は、FcγR及びC1qの結合に重要であり、IgG2及びIgG4では固有の配列を有する。ヒトIgG1の233-236位のIgG2残基及び327、330及び331位のIgG4残基の置換は、ADCC及びCDCを大幅に減少させることが示された(Armour et al.,1999,Eur J Immunol.29(8):2613-24;Shields et al.,2001,J Biol Chem.276(9):6591-604、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)。「LALA」変異、L234A/LL235Aは、エフェクター機能サイレントFc領域の作成のために、いくつかの治療用IgG1抗体において導入されてきた、例えば、Xu et al.,2000,Cell.Immuno.200:16-26。さらに、Idusogieらは、K322を含む異なる位置でのアラニン置換が補体の活性化を著しく低下させることを実証した(Idusogie et al.,2000,J Immunol.164(8):4178-84、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。同様に、マウスIgG2AのCH2ドメインの変異は、FcγRI、及びC1qへの結合を減少させることが示された(Steurer.et al.,1995.J Immunol.155(3):1165-74、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
ヒトIgG1のCH2ドメインに数多くの変異が加えられ、ADCC及びCDCへの影響がインビトロで試されてきた(上記引用文献を参照)。とりわけ、333位のアラニン置換は、ADCC及びCDCの両方を増加させることが報告された(Shields et al.,2001,supra; Steurer et al.,1995,supra)。Lazarらは、FcγRIIIaに対する親和性が高く、FcγRIIbに対する親和性が低い三重変異体(S239D/I332E/A330L)を記載し、ADCCの強化をもたらした(Lazar et al.,2006,PNAS 103(11):4005-4010、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。同じ変異を利用して、ADCCが増加した抗体を生成した(Ryan et al.,2007,Mol.Cancer Ther.6:3009-3018、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。Richards らは、マクロファージによる標的細胞の貪食作用の強化を媒介するFcγRIIIa親和性とFcγRIIa/FcγRIIb比を改善したわずかに異なる三重変異体(S239D/I332E/G236A)を研究した(Richards et al.,2008.Mol Cancer Ther.7(8):2517-27、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
エフェクター機能を持たないため、IgG4抗体は、細胞枯渇を伴わない受容体遮断(すなわち、IL-1シグナルの阻害)に適したIgGサブクラスを表示する。IgG4分子は、Fab-arm交換と呼ばれる動的なプロセスで半分子を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性IgG4との間のインビボでも起こりうる。
S228P変異は、この組換えプロセスを阻止することが示されてきており、予測不可能な治療用IgG4抗体の設計を可能にする(Labrijn et al.,2009,Nat Biotechnol.27(8):767-71、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
操作されたFc領域の例を以下の表1に示す。
*Fcアミノ酸変異の位置は、EU番号付けスキーム(Edelman et al.,1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,63:78-85を参照)を使用して定義され、例えば、配列番号:36及び2における実際の番号付けとは異なる場合があるが、以下の変異の番号付けに関するさらなる詳細説明を参照。
表1への参照
1.Hinton et al 2004 J.Biol.Chem.279(8):6213-6)
2.Vaccaro et al.2005 Nat Biotechnol.23(10):1283-8)
3.Zalevsky et al 2010 Nat.Biotechnology 28(2):157-159
4.Armour KL.et al.,1999.Eur J Immunol.29(8):2613-24
5.Shields RL.et al.,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604
6.Masuda et al.2007,Mol Immunol.44(12):3122-31
7.Bushfield et al 2014,Leukemia 28(11):2213-21
8.Okazaki et al.2004,J Mol Biol.;336(5):1239-49
9.Idusogie et al.,2000.J Immunol.164(8):4178-84
10.Datta-Mannan A.et al.,2007.Drug Metab.Dispos.35:86-94
11.Steurer W.et al.,1995.J Immunol.155(3):1165-74
12.Richards et al.2008 Mol Cancer There.7(8):2517-27
13.US 7,960,512 B2
14.EP 2213683
15.Labrijn AF.et al.,2009.Nat Biotechnol.27(8):767-71
1.Hinton et al 2004 J.Biol.Chem.279(8):6213-6)
2.Vaccaro et al.2005 Nat Biotechnol.23(10):1283-8)
3.Zalevsky et al 2010 Nat.Biotechnology 28(2):157-159
4.Armour KL.et al.,1999.Eur J Immunol.29(8):2613-24
5.Shields RL.et al.,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604
6.Masuda et al.2007,Mol Immunol.44(12):3122-31
7.Bushfield et al 2014,Leukemia 28(11):2213-21
8.Okazaki et al.2004,J Mol Biol.;336(5):1239-49
9.Idusogie et al.,2000.J Immunol.164(8):4178-84
10.Datta-Mannan A.et al.,2007.Drug Metab.Dispos.35:86-94
11.Steurer W.et al.,1995.J Immunol.155(3):1165-74
12.Richards et al.2008 Mol Cancer There.7(8):2517-27
13.US 7,960,512 B2
14.EP 2213683
15.Labrijn AF.et al.,2009.Nat Biotechnol.27(8):767-71
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fc領域を含み、Fc領域は、EUインデックスによって定義されるL234A、L235A、P329G、G237A、P238S、H269A、A330S、及びP331Sからなる群から選択される1つ以上の変異を含む。
これらの変異は、抗体のエフェクター機能を低下させる可能性がある。
EUインデックスは、当技術分野で従来から使用されている(一般に、Kabat et al,1991を参照)。
これらの変異は、抗体のエフェクター機能を低下させる可能性がある。
EUインデックスは、当技術分野で従来から使用されている(一般に、Kabat et al,1991を参照)。
当業者は、本明細書に記載されたFc変異の正確な位置が、本発明の抗体において異なる可能性があることを理解するであろう。これは、可変領域の種差により、キメラ抗体(及びそこから生まれたヒト化抗体やヒト化/脱免疫抗体)の種差が生じるためである。可変重領域の領域の長さを変えることで、EUインデックスのものと比べてアミノ酸の位置のシフトにつながる。しかし、Fc部分のアミノ酸の相対的な位置は保たれる。
例えば、LALA変異は、EUインデックスにより、L234A、L235Aの位置にあることが定義される。
発明の例示的な抗体は、例えば、
配列番号:20の重鎖可変領域(非ヒト化、非免疫化)可変重鎖領域を含んでもよい。
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
及び、例えば、配列番号:36の定常の重鎖(LALA変異を含まない)である。
免疫グロブリンIgG1定常重鎖(重鎖定常領域)(zaアロタイプ)
(太字及び下線のアミノ酸残基は、後述の配列番号:2に示すように、LALA-変異を導入した場合に変化する残基を示す)。
配列番号:20の重鎖可変領域(非ヒト化、非免疫化)可変重鎖領域を含んでもよい。
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
及び、例えば、配列番号:36の定常の重鎖(LALA変異を含まない)である。
免疫グロブリンIgG1定常重鎖(重鎖定常領域)(zaアロタイプ)
代替的に、本発明の例示的な抗体は、例えば、
配列番号:20の可変重鎖領域を含んでもよい。
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
及び、例えば、
配列番号:2の定常の重鎖(LALA変異を含む)である。
「LALA」変異を有する免疫グロブリンIgG1定常重鎖(重鎖定常領域)(zaアロタイプ)
配列番号:20の可変重鎖領域を含んでもよい。
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
及び、例えば、
配列番号:2の定常の重鎖(LALA変異を含む)である。
「LALA」変異を有する免疫グロブリンIgG1定常重鎖(重鎖定常領域)(zaアロタイプ)
当業者は、同じ理由が、EUインデックスによって定義されるP329G、G237A、P238S、H269A、A330S、及びP331Sなどの当技術分野で知られる他の名称付き変異に適用することを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fc領域を含み、Fc領域に結合した糖鎖は、フコースが欠如する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、フコースが欠如するFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fc領域を含み、Fc領域に結合した糖鎖は、フコースが低い。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、フコースが少ないFc領域を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、抗体又は抗原結合フラグメントは、FUT8陰性細胞株において産生される。
いくつかの実施形態において、抗体は、FUT8陰性細胞株で産生される。
フコース転移を触媒するa-(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ酵素を符号化するFUT8遺伝子をノックアウトすることにより、FUT8陰性細胞株を作成することが可能である。Fc領域のフコシル化が低減されてなる抗体は、WO00/61739A1に記載されるように、ADCC活性が向上していることを示す。ADCC活性が向上した抗体を産生する場合、FUT8陰性細胞株が有用であることは、当業者には理解されるだろう。
フコース転移を触媒するa-(1,6)-フコシルトランスフェラーゼ酵素を符号化するFUT8遺伝子をノックアウトすることにより、FUT8陰性細胞株を作成することが可能である。Fc領域のフコシル化が低減されてなる抗体は、WO00/61739A1に記載されるように、ADCC活性が向上していることを示す。ADCC活性が向上した抗体を産生する場合、FUT8陰性細胞株が有用であることは、当業者には理解されるだろう。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体、又はインタクトな抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Fvフラグメント(例えば、単鎖Fv及びジスルフィド結合Fv)、Fab様フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、及びF(ab)2フラグメント)及びドメイン抗体(例えば、単一VH可変ドメイン又はVL可変ドメイン)からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むか、又はそれらからなる。
以下の「配列」のセクションは、本明細書で開示され、請求範囲である抗体の特定の例示的な実施形態の配列を提供する。
シグナル伝達の阻害
インターロイキンは、様々な疾患や障害に関与する。
インターロイキンは、様々な疾患や障害に関与する。
インターロイキンは、サイトカインと同様に、IL-1ファミリーのインターロイキンなどである。サイトカイン(例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンパカイン、及び腫瘍壊死因子など)は、細胞シグナル伝達に重要である。言い換えると、サイトカインは、それぞれの受容体への結合などを介して、細胞へのシグナル伝達機能を有する。例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達は、本明細書に記載されるように、これらのサイトカインが細胞表面又は細胞内で引き起こす事象を包含する。細胞表面では、これらのシグナル伝達事象は、例えば、受容体の確認、共受容体や他の分子の特性、細胞外、細胞表面、細胞膜内又は細胞内での分子の結合に影響を与える。これらの事象は、生理的なものである場合と病的なものである場合がある。これらの事象は、例えば、シグナル伝達に対する反応として細胞内の反応につながる生物学的経路である可能性がある。この反応は、生理的なものである場合と病的なものである場合がある。
本明細書で使用する「シグナル伝達の阻害」とは、前記シグナル伝達事象、又は、例えば、受容体又は生物学的経路又は分子活性の活性、確認、又は産生を減少させることと定義される。この阻害は、阻害因子(本発明の場合、IL1RAPに結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメント)が存在する状況と、阻害因子が存在しない状況とを比較するものと理解される。当業者であれば、阻害の程度は、測定すべきシグナル伝達事象もしくは経路又は活性に応じて、当技術分野で周知の方法によって決定され得ることを理解するだろう。この方法は、例えば、実施例10、12、又は14に記載されるような実施例のための、細胞アッセイであり得る。
本明細書で使用する場合、「(例えば)IL-1αのシグナル伝達を阻害する」などの表現は、「阻害(例えば)IL-1αシグナル伝達」という表現と互換的に使用されることに留意されるものとする。
IL-1
インターロイキン-1(IL-1)は、強力な炎症性サイトカインであり、感染や炎症に応答して、単核食細胞を含む様々な種類の細胞から産生されることがある。IL-1ファミリーは、IL-1α及びIL-1βを含む7つのアゴニストと、IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra又はIL1RA)を含む3つの天然に存在する受容体アンタゴニストからなる(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):2095-147)。IL-1受容体は、IL-1R型IとIL-1R型IIの2つが同定されてきた。どちらの受容体も、IL-1ファミリー分子の3つの形態すべてと相互作用することができる。IL-1RIは、IL-1による細胞活性化を媒介する役割を担っている。しかしながら、IL-1/IL-1RI複合体はそれ自体ではシグナルを発することができず、第2の受容体鎖であるIL-1Rアクセサリータンパク質(IL1RAP)との関連に依存している(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):2095-147)。IL-1RIとは対照的に、IL-1RIIはIL-1と結合しても細胞の活性化を誘導しないため、IL-1RIIは調節性のデコイ受容体として機能し、IL-1RIに結合できるIL-1を純減することになる。
インターロイキン-1(IL-1)は、強力な炎症性サイトカインであり、感染や炎症に応答して、単核食細胞を含む様々な種類の細胞から産生されることがある。IL-1ファミリーは、IL-1α及びIL-1βを含む7つのアゴニストと、IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra又はIL1RA)を含む3つの天然に存在する受容体アンタゴニストからなる(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):2095-147)。IL-1受容体は、IL-1R型IとIL-1R型IIの2つが同定されてきた。どちらの受容体も、IL-1ファミリー分子の3つの形態すべてと相互作用することができる。IL-1RIは、IL-1による細胞活性化を媒介する役割を担っている。しかしながら、IL-1/IL-1RI複合体はそれ自体ではシグナルを発することができず、第2の受容体鎖であるIL-1Rアクセサリータンパク質(IL1RAP)との関連に依存している(Dinarello,CA,Blood 1996,87(6):2095-147)。IL-1RIとは対照的に、IL-1RIIはIL-1と結合しても細胞の活性化を誘導しないため、IL-1RIIは調節性のデコイ受容体として機能し、IL-1RIに結合できるIL-1を純減することになる。
IL1シグナルに加えて、IL1RAPは、ST2/IL1RAP複合体を介したIL33と、IL1Rrp2/IL1RAP複合体を介したIL36の効果を媒介するために重要である(Garlanda et al,Immunity.2013 Dec 12;39(6):1003-18)。
また、IL-1αは傷ついた細胞から放出され、アラーミンとして機能することができる。IL-1は強力な炎症性サイトカインであり、局所感染又は炎症部位で誘導され、様々な生理的及び細胞的事象の制御に関与する(Dinarello CA,CHEST,2000,118:503-508 and Dinarello,CA,Clin Exp Rheumatol,2002,20(5 Suppl 27):S1-13)にまとめられている)。白血球や内皮細胞など、いくつかの細胞種を活性化することができる。IL-1は、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、プロスタグランジンE2、及び一酸化窒素(NO)などの炎症性メディエーターの産生と発現を促進し、免疫反応を誘導し増幅させる。その結果、局所的な炎症が増幅され、持続することになる。加えて、IL-1による炎症性メディエーターの産生により、発熱、頭痛、低血圧、及び体重減少をもたらす。さらに、IL-1は造血成長因子であり、骨髄移植中の患者の白血球と血小板のナディアを減少させることが示されてきた。また、IL-1は血管内皮増殖因子の産生を誘導して血管新生を促進し、それによってパンヌス形成及びリウマチ性関節の血液供給を促進することが示されてきた。IL-1は、リウマチ性疾患において、骨や軟骨の分解を促進することが知られてきた。最後に、IL-1は、心血管疾患及び線維性疾患における炎症反応の重要なプレーヤーとして関与している。
IL-33
IL-33は通常、損傷又は壊死したバリア細胞(内皮細胞や上皮細胞)から放出され、外傷や感染時の組織損傷を免疫系に知らせるための内因性危険信号であるアラーミンとして機能する(Liew FY,Interleukin-33 in health and disease.Nature Reviews Immunology,16,676-689(2016))。IL-33は、Tヘルパー2(Th2)細胞、マスト細胞、2型自然リンパ球、好酸球、及び好塩基球に2型サイトカイン(IL-5、IL-13など)を産生させる。また、IL-33は内皮細胞を標的とし、血管新生を誘導することが知られている。IL-33は、Th2誘導性サイトカインとして、喘息、アレルギー性疾患、炎症性腸疾患、及び皮膚炎などに関与してきた。IL-33は、様々な細胞を強力に刺激することができ、その多面的な性質は、組織や代謝の恒常性、感染、炎症、がん、及び中枢神経系の疾患におけるIL-33の役割に反映される。
IL-33は通常、損傷又は壊死したバリア細胞(内皮細胞や上皮細胞)から放出され、外傷や感染時の組織損傷を免疫系に知らせるための内因性危険信号であるアラーミンとして機能する(Liew FY,Interleukin-33 in health and disease.Nature Reviews Immunology,16,676-689(2016))。IL-33は、Tヘルパー2(Th2)細胞、マスト細胞、2型自然リンパ球、好酸球、及び好塩基球に2型サイトカイン(IL-5、IL-13など)を産生させる。また、IL-33は内皮細胞を標的とし、血管新生を誘導することが知られている。IL-33は、Th2誘導性サイトカインとして、喘息、アレルギー性疾患、炎症性腸疾患、及び皮膚炎などに関与してきた。IL-33は、様々な細胞を強力に刺激することができ、その多面的な性質は、組織や代謝の恒常性、感染、炎症、がん、及び中枢神経系の疾患におけるIL-33の役割に反映される。
IL-36
IL-36サイトカインα、β、γは様々な細胞種で発現し、例えば、ケラチノサイト、気管支上皮、神経細胞、樹状細胞、及びマクロファージなどで豊富に発現する。IL-36はバリア組織(皮膚、肺、腸など)で最も活性が高く、環境と身体の相互作用を調節することが主な役割であることが示唆される。IL-36は、ケラチノサイト、単球、樹状細胞、及びCD4T細胞などのIL-36受容体を発現する標的細胞において、NF-κB及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化することが知られています。新たな証拠は、IL-36シグナルが自然免疫及び適応免疫応答の活性化に関与していることを示す(Ding L,IL-36 cytokines in autoimmunity and inflammatory disease,Oncotarget,Vol.9,(No.2),pp:2895-2901(2018))。
IL-36サイトカインα、β、γは様々な細胞種で発現し、例えば、ケラチノサイト、気管支上皮、神経細胞、樹状細胞、及びマクロファージなどで豊富に発現する。IL-36はバリア組織(皮膚、肺、腸など)で最も活性が高く、環境と身体の相互作用を調節することが主な役割であることが示唆される。IL-36は、ケラチノサイト、単球、樹状細胞、及びCD4T細胞などのIL-36受容体を発現する標的細胞において、NF-κB及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化することが知られています。新たな証拠は、IL-36シグナルが自然免疫及び適応免疫応答の活性化に関与していることを示す(Ding L,IL-36 cytokines in autoimmunity and inflammatory disease,Oncotarget,Vol.9,(No.2),pp:2895-2901(2018))。
異常なIL-36は、乾癬及びアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患において重要な役割を果たしているほか、異常なIL-36活性が、肺、腎臓、及び腸の炎症性疾患を促進することを示唆し、共通の炎症性疾患の治療標的としてのIL-36の可能性を強調する。
興味深いことに、本明細書に記載のすべてのサイトカイン(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ)は、線維芽細胞及び内皮細胞などの間質細胞も標的とすることが示されてきた。その結果、これらのサイトカインは、炎症性疾患や障害においてよく確立された影響とは別に、線維性疾患や障害にも関与している。
本発明の第1の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントは、インターロイキン-1(IL-1)ファミリーのサイトカインリガンド及び/又は受容体のシグナル伝達を阻害する能力を有する。当業者であれば、IL1RAP上のエピトープに抗体又は抗原結合フラグメントが結合することにより阻害が起こることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPに結合する際にシグナル伝達を阻害することができる。
当業者であれば、抗体又はその抗原結合フラグメントのIL1RAPへの結合が、例えば、分子レベル又はコンフォメーションレベルで、異なる方法でIL1RAPに影響を与え得ることを理解するだろう。しかしながら、抗体又はその抗原結合フラグメントのIL1RAPへの結合がIL1RAPにどのように影響するかは、今日では完全に知られていないかもしれないことを、当業者は理解するだろう。
一つの可能性は、抗体又はその抗原結合フラグメントのIL1RAPへの結合が、IL1RAPとIL-1受容体、IL-33受容体、及び/又はIL-36受容体のそれぞれの関連に影響を与えることである。その結果、IL1RAPを共受容体として、IL-1受容体、IL-33受容体、又はIL-36受容体のいずれか1つからなる適切な受容体複合体が形成されない可能性がある。その結果、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γなどのサイトカインがそれらの同族受容体(それぞれIL-1受容体、IL-33受容体、又はIL-36受容体)に結合すると、これらのサイトカインのシグナル伝達が阻害される、例えば阻害される、例えば遮断される、例えば本質的に完全に阻害される、例えば部分的に阻害されるなどの可能性がある。
一つの可能性は、抗体又はその抗原結合フラグメントのIL1RAPへの結合が、IL1RAPとIL-1受容体、IL-33受容体、及び/又はIL-36受容体のそれぞれの関連に影響を与えることである。その結果、IL1RAPを共受容体として、IL-1受容体、IL-33受容体、又はIL-36受容体のいずれか1つからなる適切な受容体複合体が形成されない可能性がある。その結果、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γなどのサイトカインがそれらの同族受容体(それぞれIL-1受容体、IL-33受容体、又はIL-36受容体)に結合すると、これらのサイトカインのシグナル伝達が阻害される、例えば阻害される、例えば遮断される、例えば本質的に完全に阻害される、例えば部分的に阻害されるなどの可能性がある。
当業者は、IL1RAPの任意の1つのエピトープに結合する、全てのIL1RAP結合抗体が、IL1RAPとIL-1受容体、IL-33受容体、及び/又はIL-36受容体の間の関連をそれぞれ妨害し、それによってシグナル伝達を阻害できるわけではないことを理解するだろう。本発明は、このような抗体を提供することを成果とする。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、インターロイキン-1(IL-1)ファミリーサイトカインリガンド及び/又は受容体のシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAP依存性のインターロイキン-1(IL-1)ファミリーのサイトカインリガンド及び/又は受容体のシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのサイトカインのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、そのIL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1αのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1βのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-33のシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、そのIL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-36αのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-36βのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-36γのシグナル伝達を阻害することができる。
当業者であれば、シグナル伝達の阻害は様々な程度であり得ることを理解するであろう。シグナル伝達の阻害は、シグナル伝達の遮断するような、完全なものでも、又は実質的に完全なものでもよい。シグナル伝達の阻害は、シグナル伝達を減少するような、非完全なような部分的なものでもよい。シグナル伝達の阻害を測定するために使用された方法論に関連する完全性の評価の不確実性を考慮すると、「実質的に完全」は「完全」と理解されるものとする。
例えば、シグナル伝達は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントが存在しない場合のシグナル伝達に対して、少なくとも10%、20%、30%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%以上阻害され得る。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達の阻害は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの非存在下におけるシグナル伝達と比較して10~100%の間である。より好ましくは、シグナル伝達の阻害は、25~100%である。さらに好ましくは、シグナル伝達の阻害は、50~100%である。
シグナル伝達は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの非存在下でのシグナル伝達と比較して100%阻害され得る。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントによるIL-1、IL-33、及び/又はIL-36シグナルの阻害の程度は、当該技術分野で周知の方法、例えば、実施例10、12、及び14で使用した方法によって決定することができる。
好ましい実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、シグナル伝達を実質的に完全に阻害することができる。
好ましい実施形態において、シグナル伝達を阻害することは、シグナル伝達を実質的に完全に阻害することである。
好ましい実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つのサイトカインのシグナルを実質的に完全に阻害することができる。
好ましい実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を実質的に完全に阻害することができる。
この抗体はさらに、シグナル伝達をある程度、つまり実質的に完全にではなく、部分的に阻害するかもしれない。結果として、シグナル伝達の阻害は、実質的に完全な阻害ではなく、部分的な阻害を意味し得る。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、シグナル伝達を部分的に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達を阻害することは、シグナル伝達の部分的な阻害である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つのサイトカインのシグナル伝達を部分的に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を部分的に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの非存在下でのシグナル伝達に対して、少なくとも10%、20%、30%、50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%でIL-1α、IL-β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害することができる。
当業者は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達に依存するプロセス、例えば疾患プロセスが、疾患を緩和又は治療するために完全かつ迅速に影響を受けるべきいくつかの状況において、完全阻害が望ましいことを理解するだろう。他の状況において、部分的な阻害は、プロセス、例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達に依存するプロセス、例えば疾患プロセスが、例えば完全阻害の副作用を避けるために、修飾すべきであるが完全に影響を受けないことが望ましい。当業者はさらに、生物系は複雑であり、様々な既知又は未知のフィードバックループを伴うため、あるプロセスが完全に阻害されたかどうかを評価することが困難であることを理解するであろう。さらに、この評価はまた、シグナル伝達などのプロセスを測定する手法の感度にも依存する。当業者であれば、シグナル伝達の阻害の完全性もしくは実質的な完全性を評価するため、又はシグナル伝達の部分的な阻害の程度を評価するために、どの方法及びカットオフ値を用いることが当該分野で確立し受け入れられているかを知るだろう。
以下の実施例で詳細に示し、説明するように、抗体は、特定の特性を最適化するために修飾を受けることができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、脱免疫される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化され、及び脱免疫化される。
いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナルである。
抗体の特性
本発明の抗体は、炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害の診断及び治療薬として特に好適な特性を示すことに基づいて、多数の抗IL1RAP抗体を広範囲にスクリーニングした後、同定されたものである。
本発明の抗体は、炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害の診断及び治療薬として特に好適な特性を示すことに基づいて、多数の抗IL1RAP抗体を広範囲にスクリーニングした後、同定されたものである。
したがって、いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特性の1つ以上を示す:
a)KD値が3nM以下であることを特徴とするIL1RAPに対する結合親和性(KD);
b)IL1RAPのドメイン2に結合し、好ましくはドメイン2のH2領域に結合し、ここで、H2領域は配列番号:39のアミノ酸;
c)カニクイザル又はブタ由来のIL1RAPとの交差反応性;
d)IL-1αのシグナル伝達の阻害作用;
e)IL-1βシグナル伝達の阻害作用;
f)IL-33のシグナル伝達の阻害作用;
g)IL-36αのシグナル伝達の阻害作用;
h)IL-36βのシグナル伝達の阻害作用;
i)IL-36γのシグナル伝達の阻害作用;
j)IL1RAP発現細胞による内在化。
a)KD値が3nM以下であることを特徴とするIL1RAPに対する結合親和性(KD);
b)IL1RAPのドメイン2に結合し、好ましくはドメイン2のH2領域に結合し、ここで、H2領域は配列番号:39のアミノ酸;
c)カニクイザル又はブタ由来のIL1RAPとの交差反応性;
d)IL-1αのシグナル伝達の阻害作用;
e)IL-1βシグナル伝達の阻害作用;
f)IL-33のシグナル伝達の阻害作用;
g)IL-36αのシグナル伝達の阻害作用;
h)IL-36βのシグナル伝達の阻害作用;
i)IL-36γのシグナル伝達の阻害作用;
j)IL1RAP発現細胞による内在化。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの1つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの2つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの3つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの4つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの5つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの6つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの7つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの8つを示す。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの9つを示す。
有利なことに、いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性の全てを示す。
他の実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特性の全てを示す:
a)KD値が3nM以下であることを特徴とするIL1RAPに対する結合親和性(KD);
b)IL1RAPのドメイン2に結合し、好ましくはドメイン2のH2領域に結合し、ここで、H2領域は配列番号:39のアミノ酸;
c)カニクイザル又はブタ由来のIL1RAPとの交差反応性;
d)IL-1αのシグナル伝達の阻害作用;
e)IL-1βシグナル伝達の阻害作用;
f)IL-33のシグナル伝達の阻害作用;
g)IL-36αのシグナル伝達の阻害作用;
h)IL-36βのシグナル伝達の阻害作用;
i)IL-36γのシグナル伝達の阻害作用;
j)IL1RAP発現細胞による内在化。
a)KD値が3nM以下であることを特徴とするIL1RAPに対する結合親和性(KD);
b)IL1RAPのドメイン2に結合し、好ましくはドメイン2のH2領域に結合し、ここで、H2領域は配列番号:39のアミノ酸;
c)カニクイザル又はブタ由来のIL1RAPとの交差反応性;
d)IL-1αのシグナル伝達の阻害作用;
e)IL-1βシグナル伝達の阻害作用;
f)IL-33のシグナル伝達の阻害作用;
g)IL-36αのシグナル伝達の阻害作用;
h)IL-36βのシグナル伝達の阻害作用;
i)IL-36γのシグナル伝達の阻害作用;
j)IL1RAP発現細胞による内在化。
H2領域は、Uniprot ID Q9NPH3のIL1RAPアミノ酸配列に基づくと、アミノ酸174-191に相当する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合親和性(KD)は、3nM以下、2.75nMなど、例えば2.5nM、2nMなど、例えば1.75nM、1.5nMなど、例えば1.25nM、1nMなど、例えば0.75nM、0.5nMなど、又は例えば0.5nMである。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合親和性(KD)は、3000pM以下、2750pMなど、例えば2500pM、2000pMなど、例えば1750pM、1500pMなど、例えば1250pM、1000pMなど、例えば750pM、700pMなど、例えば650pM、600pMなど、例えば550pM、500pMなど、例えば450pM、400pMなど、例えば350pM、300pMなど、例えば250pM、200pMなど、例えば150pM、100pMなど、例えば50pMである。
当業者は、抗体又は抗原結合フラグメントの結合親和性の決定が、その結合親和性を決定するための方法に依存することを理解するだろう。
当業者は、IL1RAP抗体が、サイトカインシグナル伝達(例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γの)を阻害できることとは別に、1つ以上のさらなる機能を示し得ることを理解するだろう。これらの機能は、抗体の定数領域又はFc領域によって伝達され得る。例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)及び/又は抗体依存性細胞貪食作用(ADCP)があり、それによってIL1RAP発現腫瘍細胞などの標的細胞を死滅させる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPを発現する細胞のADCCを誘導することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPを発現する細胞のADCCを誘導することができない。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPを発現する細胞のADCPを誘導することができる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPを発現する細胞のADCPを誘導することができない。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPを発現する細胞のADCC及びADCPを誘導することができる。
抗体の修飾
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、薬剤のインビボ半減期を増加させるための部分をさらに含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、薬剤のインビボ半減期を増加させるための部分をさらに含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、薬剤のインビボ半減期を増加させるための部分をさらに含み、インビボ半減期を増加させるための部分は、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸、及びデキストランからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、PEG化される。
いくつかの実施形態では、IL1RAPフラグメントに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、直接又は間接的に(例えばキレーターを介して)、細胞傷害又は検出可能な部位などの機能部分に共有結合される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位を含み、ここで、前記細胞傷害性部位は、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、前記放射性同位元素は、β-エミッター、オージェエミッター、変換電子-エミッター、α-エミッター、及び低光子エネルギー-エミッターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで前記放射性同位元素は、薬剤の近傍で高線量吸光度を生じる局所吸収エネルギーの放出パターンを有する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又は放射性同位元素からなる細胞傷害性部位を含み、ここで、放射性同位元素は、90Y、32P、186Re/186Reなどの長距離βエミッター;166Ho,76As/77As,153Sm;131I,177Lu,67Cu,161Tbなどの中距離βエミッター;45Ca,35S、又は14Cなどの低エネルギーβエミッター;51Cr,67Ga,99Tcm,111In,123I,125I,201Tlなどのなどの変換又はオージェエミッター;及び212Bi,213Bi,223Ac,及び221Atなどのα-エミッターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、放射性同位元素は177Luである。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位を含み、ここで、細胞傷害性部位は、細胞傷害性薬物を含むか、又は細胞傷害性薬物からなる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬物を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、前記細胞傷害性薬物は、細胞賦活薬;抗アンドロゲン薬;コルチゾン及びその誘導体;ホスホネート;テストステロン-5-α-レダクターゼ阻害剤;ホウ素添加剤;サイトカイン;タプシガルギン及びその代謝物;毒素(サポリン又はカリケアマイシンなど);化学療法剤(代謝拮抗剤など);又は腫瘍性の障害の治療に有用な他の細胞毒性薬物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬物を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、前記細胞傷害性薬物は、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘導オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、又は低エネルギーX線光子活性化療法などの活性化療法に用いるのに適する。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位を含み、ここで、前記検出可能な部位は、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含み、ここで、前記放射性同位体は、99mTc,111In,67Ga,68Ga,72As,89Zr,123I、及び201Tlからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含み、ここで、前記放射性同位体は89Zrである。
いくつかの実施形態では、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、86Y/90Y、又は124I/211Atなどの検出可能で細胞傷害性を有する放射性同位元素の対を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位として及び細胞傷害性として同時にマルチモーダルな方法で作用することができる放射性アイソタイプを含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、常磁性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含む。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、常磁性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含み、ここで、前記常磁性同位体は、157Gd,55Mn,162Dy,52Cr、及び56Feからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位を含み、ここで、前記検出可能な部位は、SPECT、PET、MRI、光学、又は超音波イメージングなどのイメージング技術によって検出可能である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位及び/又は検出可能な部位を含み、ここで、前記細胞傷害性部位及び/又は検出可能な部位は、連結部分を介して、抗体又はその抗原結合フラグメントに間接的に接合される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位及び/又は検出可能な部位を含み、ここで、前記細胞毒性部分及び/又は検出可能な部位は、連結部分を介して、抗体又はその抗原結合フラグメントに間接的に結合し、ここで、前記連結部分はキレート剤である。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位及び/又は検出可能な部位を含み、ここで、前記細胞傷害性部位及び/又は検出可能な部位は、連結部分を介して間接的に、抗体又はその抗原結合フラグメントに結合し、ここで、前記連結部分はキレート剤であり、前記キレート剤は、1,4,7,10--テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,四酢酸の誘導体(DOTA)、デフェロキサミン(DFO)、ジエチレントリアミン五酢酸の誘導体(DTPA)、S-2-(4-イソチオシアナトベンジル)-1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリ酢酸の誘導体(NOTA)、及び1,4,8,11-テトラアザシクロドデカン-1,4,8,11-四酢酸(TETA)の誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位又は検出可能な部位を含まない。
本発明はさらに、ヒトインターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、明細書に開示される抗体48D2のIL1RAPに対する結合を阻害することができる。
本明細書で使用する場合、「抗体48D2のIL1RAPへの結合を阻害することができる」という用語は、別の抗体の存在が、48D2のIL1RAPへの結合を全体的又は部分的に阻害することを意味する。このような競合的結合阻害は、例えば、IL1RAPを固定化したBIAcoreチップを用い、試験すべき抗体の有無にかかわらず48D2とインキュベートするなど、当技術分野で周知のアッセイ及び方法を用いて決定することができる。
代替的に、抗体48D2をBIAcoreチップの表面に固定化し、IL1RAP抗原を固定化抗体に結合させ、次に第2の抗体を同時にIL1RAP結合能力について試験する、一対のマッピングアプローチを用いることもできる(‘BIAcore Assay Handbook’,GE Healthcare Life Sciences,29-0194-00 AA 05/2012を参照;その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
さらなる代替案として、競合的結合阻害はフローサイトメトリーを用いて決定することができる。例えば、試験抗体が48D2抗体と細胞表面抗原との結合を阻害できるかどうかを試験するには、抗原を発現している細胞を試験抗体と20分間プレインキュベートしてから細胞を洗浄し、蛍光色素を結合した48D2抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーによって検出することができる。試験抗体とのプレインキュベーションにより、フローサイトメトリーにおける48D2抗体の検出が低下する場合、試験抗体は参照抗体の細胞表面抗原への結合を阻害する。試験された抗体がIL1RAPに対して高い親和性を示す場合、期間を短くしたプレインキュベーションが使用される(又は、プレインキュベーションを全くしない)。
抗体の産生
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチドに関するものである。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA(例えば、ゲノムDNA又は相補的DNA)及びmRNA分子を含み、これらは一本鎖又は二本鎖であることができる。
本発明の第2の態様は、本発明の第1の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチドに関するものである。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA(例えば、ゲノムDNA又は相補的DNA)及びmRNA分子を含み、これらは一本鎖又は二本鎖であることができる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、cDNA分子である。
ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞における抗体又は抗原結合フラグメントの発現、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得ることが当業者には理解されよう(例えば、Angov,2011,Biotechnol.J.6(6):650-659を参照、その開示は参照により本書に組み込まれる)。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント符号化するポリヌクレオチドは、抗体軽鎖又はその可変領域を符号化する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを符号化するポリヌクレオチドは、抗体重鎖又はその可変領域を符号化する。
本発明の第3の態様は、本発明の第2の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関するものである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
「発現ベクター」という用語は、本明細書では、本発明のポリペプチド(抗体又はその抗原結合フラグメント)を符号化するポリヌクレオチドを含み、その発現を提供する追加のヌクレオチドと作動可能に連結された、例えば線状又は環状のDNA分子と定義される。「プラスミド」、「発現ベクター」、及び「ベクター」という用語は、プラスミドが現在一般的に最もよく使われるベクターの形態であるため、互換的に使用される。しかしながら、本発明は、当技術分野で知られている同等の機能を果たす発現ベクターのそのような他の形態を含むことを意図するものである。本明細書で使用する「発現ベクター」又は「ベクター」は、適切な宿主においてDNAの発現をもたらすことができる適切な制御配列に動作可能に連結されたDNA配列を含むDNA構築物を指す。このような制御配列は、例えば、転写をもたらすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位を符号化する配列、及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含み得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、又は単に潜在的なゲノムの挿入物であってもよい。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、例えば、宿主ゲノムから独立して複製し機能することもあれば、場合によっては、ゲノム自体に統合されることもある。発現ベクターは、例えば、Li et al.(Construction strategies for developing expression vectors for recombinant monoclonal antibody production in CHO cells,Mol Biol Rep.2018 Dec;45(6):2907-2912)に記載されているように設計される。
本発明の第4の態様は、本発明の第2の態様にかかるポリヌクレオチド又は本発明の第3の態様にかかるベクターを含む組換え宿主細胞に関するものである。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、細菌細胞である。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、ヒト細胞である。
本発明の第5の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法に関し、前記方法は、本発明の第2の態様のポリヌクレオチド又は本発明の第3の態様のベクターを含む本発明の第4の態様の宿主細胞を、符号化された抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む。
医薬組成物
本発明の第6の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、及び/又は
本発明の第4の態様の宿主細胞、
を医薬組成物内に含む医薬組成物に関するものであり、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む。
本発明の第6の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、及び/又は
本発明の第4の態様の宿主細胞、
を医薬組成物内に含む医薬組成物に関するものであり、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、及び/又は
本発明の第4の態様の宿主細胞、の有効量を含む。
医薬組成物には、EDTA、クエン酸塩、EGTA、又はグルタチオンなどのキレート剤を含む、追加の化合物もまた含まれ得ることが当業者によって理解されるだろう。
医薬組成物は、十分に貯蔵安定性があり、ヒト及び動物への投与に適した、当該技術分野で既知の方法で調製することができる。例えば、医薬組成物は、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷却、又は超臨界粒子形成からの粒子形成の使用によって、凍結乾燥され得る。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、及び/又は
本発明の第4の態様の宿主細胞、の有効量を含む。
医薬組成物には、EDTA、クエン酸塩、EGTA、又はグルタチオンなどのキレート剤を含む、追加の化合物もまた含まれ得ることが当業者によって理解されるだろう。
医薬組成物は、十分に貯蔵安定性があり、ヒト及び動物への投与に適した、当該技術分野で既知の方法で調製することができる。例えば、医薬組成物は、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷却、又は超臨界粒子形成からの粒子形成の使用によって、凍結乾燥され得る。
「薬学的に許容される」という用語は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのIL1RAP結合活性の有効性を低下させない非毒性物質を意味することが意図される。薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤、又は賦形剤などは、例えば、当技術分野でよく知られる。
「緩衝剤」という用語は、pHを安定させる目的で酸-塩基混合物を含む水溶液を意味することが意図される。緩衝液の実施例としては、Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、リン酸、炭酸、酢酸、クエン酸、グリコール酸、乳酸、ボレート、ACES、ADA、酒石酸、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、カコディレート、CHES、DIPSO、EPPS、エタノールアミン、グリシン、HEPPSO、イミダゾール、イミダゾール乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、及びTESである。
「希釈剤」という用語は、医薬製剤中の抗体又は抗原結合フラグメントを希釈する目的を持つ水性又は非水性溶液を意味することを意図する。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、油類(サフラワー油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油など)から選択される1種以上であってもよい。
「アジュバント」という用語は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的効果を高めるために製剤に添加される任意の化合物を意味することを意図する。アジュバントは、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、糖酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及びアシル組成の異なる酢酸塩など、アニオンが異なる亜鉛、銅、又は銀塩の1つ以上であってもよいが、これらに限定されない。また、アジュバントは、カチオン化セルロースエーテル、カチオン化セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン化デンドリマー、ポリ(ビニルイミダゾール)などのカチオン化合成高分子、及びポリヒスチン、ポリリジン、ポリアルギニン、ならびにこれらのアミノ酸を含むペプチドなどのカチオニックポリペプチドのようなカチオン化ポリペプチドであってもよい。
賦形剤は、糖質、高分子、脂質、及びミネラルの1つ以上であってもよい。炭水化物の実施例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、シクロデキストリンなどがあり、これらは、例えば、凍結乾燥を促進するために組成物に添加される。高分子の実施例としては、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール/ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド/ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解度の異なるポリビニルアルコール/ポリ酢酸ビニル、及びポリビニルピロリドン、全ての分子量が異なるもの、例えば、これらは、粘度調整、生体接着、又は化学的分解及びタンパク質分解から脂質を保護するため、組成物に添加される。脂質の実施例としては、脂肪酸、リン脂質、モノ-、ジ-、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、及び糖脂質などがあり、全てのアシル鎖長や飽和度が異なるもの、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵及び大豆レシチンなどは、ポリマーのそれらと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの実施例としては、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、及び酸化チタンなどがあり、液溜まりの軽減や有利な顔料特性などの利点を得るために組成物に添加される。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、その送達に適するように、当該技術分野で知られている任意の種類の医薬組成物に配合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であってもよく、抗体又は抗原結合フラグメントは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単分子膜、及び液晶として会合形態で存在する脂質などの両親媒性薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質としては、特に限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸類、及び類似物を含む。また、好適な脂質としては、血流循環時間を延長するための極性ヘッドグループにおけるポリ(エチレングリコール)によって修飾された上記脂質を含む。このようなリポソーム製剤の調製は、例えばUS4,235,871に見い出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
また、本発明の医薬組成物は、生分解性微粒子の形態であってもよい。ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸(PGA)、PLA及びPGAのコポリマー(PLGA)、又はポリカプロラクトン(PCL)などの脂肪族ポリエステル、及びポリアンヒドリドは、生分解性ポリマーとして微粒子の製造に広く使用されている。このような微粒子の調製は、US5,851,451及びEP0213303に見い出すことができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、ここで、ポリマー、例えば、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール/ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド/ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解度の異なるポリビニルアルコール/ポリビニール酢酸、ポリビニルピロリドンは、薬剤含有溶液の増粘に使用される。また、ポリマーは、ゼラチンやコラーゲンを含んでいてもよい。
代替的に、抗体又は抗原結合フラグメントは、単に生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油(サフラワー油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油など)、トラガカントガム、及び/又は種々の緩衝液に溶解され得る。
本発明の医薬組成物は、活性抗体又は抗原結合フラグメントの作用の増強のために、イオン及び定義されたpHを含むことができることが理解されるだろう。追加的に、組成物は、滅菌などの従来の製薬操作に供され、及び/又は、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などの従来のアジュバントを含有することができる。
本発明による医薬組成物は、当業者に知られている任意の適切な経路で投与することができる。したがって、投与経路は、非経口(静脈内、皮下、筋肉内)、局所、眼、鼻、肺、頬、口腔、非経口、膣、及び直腸を含む。また、インプラントからの投与も可能である。
好ましい一実施形態において、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳側室内(intracerebroventricularly)、関節内(intraarticularly)、動脈内、腹腔内、くも膜下内(intrathecally)、脳室内(intraventricularly)、胸腔内、頭蓋内、筋肉内、又は皮下に投与され、又はそれらは注入技術によって投与され得る。好ましくは、医薬組成物は静脈内に投与される。例えば、血液と等張になるように十分な塩類やグルコースなどの他の物質を含むことができる滅菌水溶液の形態で便利に使用される。水溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化(好ましくは、pH3~9に)されるべきである。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者によく知られた標準的な製薬技術によって容易に達成される。
非経口投与に適した製剤には、水性及び非水性の滅菌注射液があり、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができ;及び水性及び非水性の滅菌懸濁液があり、懸濁剤及び増粘剤を含むこともできる。製剤は、例えば密封されたアンプルやバイアルなどの単位用量又は複数用量容器で提供され得、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水、の添加を要するだけで凍結乾燥(凍結乾燥)状態で保存することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
したがって、本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与に特に適している。
代替的に、医薬組成物は、適切な推進剤を使用して、加圧された容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーから、鼻腔内又は吸入(例えば、エアゾールスプレーの形態で)投与され得、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA134A3又は1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA227EA3)などのハイドロフルオロアルカン、二酸化炭素又は他の適切なガス)によって投与され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーは、活性抗体又は抗原結合フラグメントの溶液又は懸濁液、例えば、エタノールと推進剤の混合物を溶媒として使用し、さらに潤滑剤、例えば、トリオレイン酸ソルビタンを含んでもよい。吸入器又は送気器に使用するカプセル及びカートリッジ(例えば、ゼラチンから作られる)は、本発明の化合物の粉末混合物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤を含むように配合することができる。
エアゾール又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各定量用量又は「パフ」が、患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも1mg含むように用意される。エアロゾルによる1日の総投与量は、患者によって異なり、1回の投与で、又はより通常、1日を通して分割して投与することができることが理解されるだろう。
代替的に、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、坐剤又はペッサリーの形態で投与することができ、それらはローション、溶液、クリーム、軟膏、又は粉剤の形態で局所的に適用することができる。また、本発明の化合物は、例えば、皮膚パッチの使用により、経皮投与されてもよい。また、それらは眼球経路で投与されてもよい。
眼科用として、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、等張、pH調整、滅菌生理食塩水中の微粉化懸濁液として、又は、好ましくは、等張、pH調整、滅菌生理食塩水中の溶液として、任意に塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせて配合することができる。代替的に、ペトロラタムのような軟膏に配合することもできる。
眼科用として、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、等張、pH調整、滅菌生理食塩水中の微粉化懸濁液として、又は、好ましくは、等張、pH調整、滅菌生理食塩水中の溶液として、任意に塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせて配合することができる。代替的に、ペトロラタムのような軟膏に配合することもできる。
皮膚に局所的に適用する場合、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、活性化合物を、例えば、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水から選ばれる1種以上との混合物に懸濁又は溶解させた適切な軟膏として配合され得る。代替的に、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水の1つ以上の混合物に懸濁又は溶解して、適切なローション又はクリームとして配合することができる。
医薬組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与されるだろう。「治療上有効な量」、又は「有効量」、又は「治療上有効な」が、本明細書で使用する場合、所定の状態及び投与レジメンに対して治療効果を提供するその量を指す。これは、必要な添加剤及び希釈剤、すなわち、担体又は投与ビヒクルと関連して、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性材料である。さらに、宿主の活性、機能、及び応答における臨床的に有意な欠損を軽減し、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味することが意図される。代替的に、治療上有効な量は、宿主における臨床的に重要な状態の改善を引き起こすのに十分な量である。当業者には理解されるように、化合物の量は、その特定の活性に依存して変化し得る。適切な投与量は、必要な希釈剤と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性組成物を含むことができる。本発明の組成物の製造方法及び使用において、治療上有効な量の活性成分が提供される。治療上有効な量は、当該技術分野でよく知られているように、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などの患者特性に基づいて、通常の熟練した医学又は獣医学従事者が決定することができる。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位又はいくつかのより小さい用量単位の形態での単一投与と、特定の間隔での細分化された用量の複数回の投与の両方によって実施することができる。代替的に、投与量は、長期にわたる連続注入として提供され得る。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの診断的使用の文脈では、「薬学的に有効な量」、又は「有効量」、又は「診断的に有効な量」は、本明細書で使用する場合、診断、例えば、インビボイメージング目的のために検出可能なシグナルを提供する量を指す。
抗体又は抗原結合フラグメントは、使用する抗体又は抗原結合フラグメントの有効性/毒性に応じて、様々な濃度で配合することができる。例えば、製剤は、活性抗体又は抗原結合フラグメントを0.1μM~1mMの間、より好ましくは1μM~500μMの間、500μM~1mMの間、300μM~700μMの間、1μM~100μMの間、100μM~200μMの間、200μM~300μMの間、300μM~400μMの間、400μM~500μMの間、500μM~600μMの間、600μM~700μMの間、800μM~900μMの間、又は900μM~1mMの間の濃度で含んでもよい。典型的には、製剤は、300μM~700μMの間の濃度の活性抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
典型的には、ヒト患者における抗体又は抗原結合フラグメント(治療用部分を含む又は含まない)の治療用量は、1回の投与で100μg~1gの範囲(体重70kgに基づく、例えば、1回の投与で300μg~700mgの間)だろう。例えば、最大治療量は、1回の投与につき0.1~10mg/kgの範囲、例えば0.1~5mg/kgの間、又は1~5mg/kgの間、又は0.1~2mg/kgの間であってもよい。いくつかの実施形態において、治療用量は、5、20、又は50mg/kg、もしくはこれらの値から形成される任意の範囲であってもよい。例えば、治療用量は、5~50mg/kg、5~20mg/kg、又は20~50mg/kgであってもよい。このような用量は、腫瘍医/医師によって決定されるように、異なる間隔で投与され得、例えば、用量は、毎日、週2回、毎週、隔週、又は毎月投与され得ることが理解されるだろう。
本発明の医薬組成物は、炎症性、線維性及び/又は腫瘍性の障害又は疾患の治療に用いられる他の治療剤と単独又は組み合わせて投与され得ることが、当業者には理解されるだろう。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、非経口送達に適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、静脈内送達に適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、局所的な送達のために適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、皮下送達に適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、筋肉内送達に適合される。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメント及び医薬組成物又は製剤は、医学及び獣医学の両分野において有用であることが、当業者によってさらに理解されるだろう。したがって、本発明の方法は、ヒト及び非ヒト動物(馬、犬、及び猫など)の両方の治療において使用され得る。しかし、好ましくは、患者は人間である。
抗体の指示及び使用
本発明の第7の態様は、
医療に使用するための、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものである。
本発明の第7の態様は、
医療に使用するための、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様の組成物に関するものである。
本発明の第8の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものであり、及び/又はここで、前記疾患又は障害は、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものであり、及び/又はここで、前記疾患又は障害は、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第8の態様に対する代替的な態様において、本発明は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものである。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものである。
本発明の第8の態様に対する別の代替的な態様において、本発明は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものであって、疾患又は障害がIL1RAPを発現する細胞に関連するものである。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するためのものであって、疾患又は障害がIL1RAPを発現する細胞に関連するものである。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達と関連する。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、IL1RAPを発現する細胞に関連する。
「治療」とは、患者の治療及び予防的又は防止的な治療の両方を含む。「防止的」又は「予防的」という用語は、炎症性疾患又は障害、線維性疾患又は障害、腫瘍性の疾患又は障害の可能性を予防又は低減する、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又はその製剤の使用を包含するために用いられ、これはまた、患者又は対象における腫瘍性の細胞の広がり、拡散、又は転移の予防又は低減を含むことも示す。「予防的」という用語は、これらの疾患又は障害のいずれかに対して以前に治療を受けた患者において、炎症性、線維化性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害の再発を予防するための、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又はその製剤の使用も包含する。
「診断」又は「検出」には、インビボ(すなわち、患者の体内)又はエックスビボ(すなわち、患者の体内から取り出した組織又は細胞サンプル内)のいずれかで、炎症性、線維化性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞を検出することが含まれる。
「緩和」とは、それに限定されることなく、疾患又は障害に関連する症状又はプロセスが減少すること、すなわち、疾患又は障害の軽快をもたらすことを意味する。
「IL1RAPを発現する細胞に関連する炎症性、線維性、腫瘍性の疾患又は障害」には、障害の直接的又は間接的な原因となる病的細胞が細胞表面にIL1RAPを発現するそのような疾患又は障害が含まれる。IL1RAPを発現する細胞は、免疫細胞、線維芽細胞などの結合組織の細胞、又は腫瘍細胞などの腫瘍性の細胞(がん細胞)、例えば、腫瘍細胞それ自体であり得ることが理解されるだろう。さらに、このような細胞には、病的幹細胞(すなわち、がん幹細胞、又はCSC)や、個体における炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患や障害の発症に直接的又は間接的に関与する前駆細胞も含まれる。CSCの実施例は、Visvader & Lindeman,2008,Nat Rev Cancer 8:755-768に開示されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
代替的に、又は加えて、IL1RAPを発現する細胞は、炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に間接的に関連し、例えば、それらが、細胞が生存するために必要な細胞プロセスを媒介してもよい。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、この場合、炎症性及び/又は線維化プロセスの維持に不可欠な細胞、又は例えば腫瘍の血液供給(血管新生)、又は悪性細胞に向けられた有益な免疫反応を阻害する細胞(例えば、抑制性マクロファージ又はT細胞)を標的とし得る。
IL1RAPを発現する標的細胞を死滅させることが治療上望ましいかどうかに応じて、例えば、腫瘍性の細胞の場合には、ADCCを誘導することができる本発明の第1の態様による抗体又は抗原結合フラグメントを使用されてもよい。例えば、IL1RAPを発現する標的細胞ががん細胞(CML、AML、ALL、メラノーマ、肺がん細胞など)である場合、抗体又は抗原結合フラグメントがADCCを誘導できることが、そのような細胞を排除するために有利である場合がある。しかしながら、ADCC活性を欠く抗体又は抗原結合フラグメントを使用しても、例えば、がん又は腫瘍の近傍における血管新生の減少につながるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナルの阻害を通じて、治療効果が得られることが理解されるだろう。同様に、炎症性及び/又は線維性の疾患や障害の場合、細胞の挙動に影響を与えることは有益であるが、細胞を死滅させることはないかもしれない。
IL-1の阻害剤による治療に感受性がある状態又は疾患状態、及び/又はIL1RAPを発現する細胞に関連する炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害を構成し得る状態は、当技術分野でよく知られ(Dinarello et al.,2012,Nature Reviews 11:633-652 及びDinarello,2014,Mol.Med.20(suppl.1):S43-S58を参照、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる)、これらに限定されないが、以下のものを含む:
関節リウマチ、関節炎全般、乾癬性関節炎、全身型発症若年性特発性関節炎(SOJIA)を含む若年性関節炎全般、変形性関節症、家族性低温自己炎症症候群(FCAS)、マックル-ウェルズ病、新生児発症多臓器炎症疾患(NOMID)、家族性地中海熱(FMF)、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・アクネ(PAPA)症候群、成人発症スティル病、高IgD症候群、2型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、TNF受容体関連周期性症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アレルギー、動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、I型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病を含む)、肝炎、C型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患(例えば、メタボリックシンドローム、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群など、胃食道逆流症(GERD)、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症)、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー/アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症(肺線維症)、皮膚線維症(皮膚線維症)、筋心炎、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、全身性硬化症、高安動脈炎、及び痛風。
また、IL-1シグナルの遮断は、心筋梗塞の治療にも有効であると考えられる。心筋梗塞後の抗IL-1β抗体(カナキヌマブ使用)遮断の有効性を確認するための大規模な臨床試験(CANTOS trail;Ridker et al.,2011,Am Heart Journal 162(4):597-605参照、その開示内容は参照により本書に組み込まれる)が求められる。
このような適応症の場合、IL1RAPに結合し、それによって免疫細胞に関連するIL-1及び/又はIL-33及び/又はIL-36シグナルを遮断する抗体又は抗原結合フラグメントを使用しても、治療効果が得られることが理解されるだろう。そのような抗体は、ADCC活性を欠くように修飾することも可能である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び/又は線維性及び/又は腫瘍性の疾患又は障害である。
本発明の治療的及び予防的態様に関連して、抗体又はその抗原結合フラグメントが、炎症性、線維化性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の表面に存在するIL1RAPに結合することにより、IL1RAPの生物活性を調節(すなわち、増加又は減少)し得ることが当業者には理解できるだろう。しかし、そのような調節効果は必須ではなく、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、疾患又は障害に関連する細胞の表面上のIL1RAPに結合することによって、単に治療及び予防効果を引き出すことができ、その結果、免疫系が細胞死(例えば、ADCCによって及び/又は細胞性傷害/放射能部分の薬剤内の存在によって)などのプロセスを誘導するきっかけになり得る。
いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAPの生物学的活性を阻害する。
「IL1RAPの生物学的活性」には、炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞上のIL1RAPが関与するあらゆる相互作用又はシグナル伝達事象を含む。例えば、一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAP(IL1R1、ST2、C-KIT、及び/又はIL1RL2など)に対する1つ以上の共受容体の結合を遮断することができる。さらに、上で詳述したように、いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害する。
「IL1RAPの生物学的活性」には、炎症性、線維性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞上のIL1RAPが関与するあらゆる相互作用又はシグナル伝達事象を含む。例えば、一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL1RAP(IL1R1、ST2、C-KIT、及び/又はIL1RL2など)に対する1つ以上の共受容体の結合を遮断することができる。さらに、上で詳述したように、いくつかの実施形態において、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害する。
当業者は、「サイトカインのシグナル伝達を阻害すること」(IL-1ファミリーのサイトカイン、例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達の阻害)が、IL1RAPの生物活性の阻害をもたらすことを理解するだろう。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントによるIL1RAPの生物学的活性のこのような阻害は、全体的であっても又は部分的であってもよい。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はその抗原結合フラグメントに曝露されていない炎症性、線維化性、及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞におけるIL1RAPの生物学的活性と比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%、及び最も好ましくは100%のIL1RAPの生物学的活性を阻害し得る。好ましい実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又は抗原結合フラグメントに曝露されていない炎症性、線維化性及び/又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞におけるIL1RAPの生物学的活性と比較して、50%以上の生物学的活性を阻害することが可能である。
同様に、腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の成長及び/又は増殖の阻害は、全体的であっても又は部分的であってもよいことが理解されるだろう。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はその抗原結合フラグメントに曝露されていない腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の成長及び/又は増殖と比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%、そして最も好ましくは100%の腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の成長及び/又は増殖を阻害することが可能である。
疾患におけるIL-1、IL-33、及びIL-36
IL-1は、痛風からがんに至る幅広い疾患及び状態に関与し(レビューについては、Dinarello et al.,2012,Nature Reviews 11:633-652 and Dinarello,2014,Mol.Med.20(suppl.1):S43-S58を参照;これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる):
・関節リウマチや変形性関節症などの関節、骨、及び筋肉の病気;
・家族性地中海熱などの遺伝性全身性自己炎症性疾患;
・全身型若年性特発性関節炎及び成人型スティル病などの全身性自己炎症性疾患;
・痛風及び2型糖尿病などの一般的な炎症性疾患;
・心筋梗塞などの急性発症の虚血性疾患;及び
・がんを含む。
IL-1は、痛風からがんに至る幅広い疾患及び状態に関与し(レビューについては、Dinarello et al.,2012,Nature Reviews 11:633-652 and Dinarello,2014,Mol.Med.20(suppl.1):S43-S58を参照;これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる):
・関節リウマチや変形性関節症などの関節、骨、及び筋肉の病気;
・家族性地中海熱などの遺伝性全身性自己炎症性疾患;
・全身型若年性特発性関節炎及び成人型スティル病などの全身性自己炎症性疾患;
・痛風及び2型糖尿病などの一般的な炎症性疾患;
・心筋梗塞などの急性発症の虚血性疾患;及び
・がんを含む。
IL-1活性を遮断するための多くの治療法が承認され、開発中である。IL-1を標的とした治療は、1993年に天然に存在するIL-1受容体拮抗薬(IL-1Ra又はIL1RA)の組み換え型であり、IL-1αとIL-1βの両方の活性を遮断するアナキンラ(Anakinra)(Kineret;アムゲン)の発表から始まり、この治療法は、その後、多くの病気(上記参照)におけるIL-1の役割を証明するために使用されてきた。Anakinraは、良好な安全性、短い半減-期、複数の投与経路を持つことから、現在IL-1治療薬の分野で優位を占める。IL-1を抗体や可溶性受容体で中和することも有効であり、可溶性デコイ受容体のリロナセプト(Arcalyst:リジェネロン)や抗-IL-1β中和モノクローナル抗体のカナキンウマブ(Ilaris:ノバルティス)が承認された。IL-1αの中和、IL-1βを標的とした治療用ワクチン、キメラIL-1Raなど、その他の治療アプローチも初期臨床試験中である。加えて、カスパーゼ1阻害剤のような経口活性のある小-分子のIL-1産生阻害剤も開発され、試験中である。
同様に、上記で詳述したように、IL-33が疾患に関与していることを示す新たな証拠も出てきている。上記で詳述したように、IL-33は、例えば、喘息、アレルギー性疾患、炎症性腸疾患、及び皮膚炎などに関与してきた。重要なことに、IL-33は線維症及び炎症に関与している(Kotsiou et al.2018,IL-33/ST2 Axis in Organ Fibrosis,Front Immunol.2018 Oct 24;9:2432)。IL-33は、様々な細胞を強力に刺激することができ、その多面的な性質は、組織や代謝の恒常性、感染、炎症、がん、及び中枢神経系の疾患におけるIL-33の役割に反映される。
同様に、上記のように、IL-36が疾患に関与していることを示す新たな証拠が得られているが、この分野はまだ発展途上であり、IL-1に比べてIL-36に関連する知識はまだ限られている。上記で詳述したように、IL-36シグナル伝達が自然免疫応答及び適応免疫応答の活性化に関与していることを示す新たな証拠が出てきている(Ding L,IL-36 cytokines in autoimmunity and inflammatory disease,Oncotarget,Vol.9,(No.2),pp:2895-2901(2018))。乾癬やアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患における役割に加え、肺、腎臓、及び腸の炎症性疾患においても異常なIL-36の活性を示すことが出てきた証拠によって示唆され、炎症性疾患に対する治療標的としてのIL-36の可能性を示す。
当業者は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントが、例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害する能力により、複数のIL依存経路を同時に標的とし、炎症性疾患及び/又は線維性疾患に深い影響を及ぼす可能性がある、又は期待できることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び/又は線維性の疾患又は障害である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び/又は線維性の疾患又は障害であり、
ここで、炎症性及び/又は線維性の疾患又は障害は、関節リウマチ、すべての種類の関節炎、乾癬性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎(SOJIA)を含むすべての種類の若年性関節炎、変形性関節症、家族性寒冷自己炎症症候群(FCAS)、マックル-ウェルズ疾患、新生児発症多臓器炎症性疾患(NOMID)、家族性地中海熱(FMF)、化膿性関節炎壊疽性膿皮症及びアクネ(PAPA)症候群、成人発症スティル病、高IgD症候群、2型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、TNF受容体関連周期症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、関節ループス、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アレルギー、動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、I型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病を含む)、肝炎、C型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患(例えば、メタボリック症候群、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症(GERD)、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症)、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー/アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症(肺線維症)、皮膚線維症(皮膚線維症)、筋心炎、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、全身性硬化症、高安動脈炎、及び痛風からなる群から選択される。
ここで、炎症性及び/又は線維性の疾患又は障害は、関節リウマチ、すべての種類の関節炎、乾癬性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎(SOJIA)を含むすべての種類の若年性関節炎、変形性関節症、家族性寒冷自己炎症症候群(FCAS)、マックル-ウェルズ疾患、新生児発症多臓器炎症性疾患(NOMID)、家族性地中海熱(FMF)、化膿性関節炎壊疽性膿皮症及びアクネ(PAPA)症候群、成人発症スティル病、高IgD症候群、2型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、TNF受容体関連周期症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、関節ループス、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アレルギー、動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、I型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病を含む)、肝炎、C型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患(例えば、メタボリック症候群、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症(GERD)、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症)、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー/アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症(肺線維症)、皮膚線維症(皮膚線維症)、筋心炎、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、全身性硬化症、高安動脈炎、及び痛風からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、全身性硬化症であり、強皮症又は全身性強皮症とも呼ばれる。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、急性腹膜炎などの腹膜炎である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、乾癬である。いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、乾癬性関節炎である。一実施形態において、前記疾患又は障害は、乾癬及び乾癬性関節炎である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、アテローム性動脈硬化症である。いくつかの実施形態において、アテローム性動脈硬化症の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、アテローム性動脈硬化症の減少、例えば、アテローム性動脈硬化症の臨床症状、症状又は病理生理学的相関の減少、例えば大動脈プラーク炎症などのアテローム性動脈硬化性プラーク炎症の減少、及び/又はプラークサイズ(例えば、プラーク量及び/又はプラーク面積)の減少を含む。
プラークの炎症は、大動脈のフローサイトメトリー分析によるCD45+白血球の細胞数に基づいて評価することができる(例えば、実施例4に示すように)。健常対照大動脈と比較して、試験大動脈(例えば、動脈硬化性大動脈と疑われる大動脈や診断された大動脈)のCD45+白血球の数が多ければ、動脈硬化性プラークの炎症を示す。いくつかの実施形態において、白血球数は、骨髄性CD11b+細胞(Ly6G+好中球を含む)及び/又はTCR-β+細胞(CD4+及び/又はCD8+細胞を含む)に基づいて評価され得る。
プラークのサイズは、プラーク体積及び/又はプラーク面積に基づいて評価することができる。健常対照大動脈(プラークがない場合もある)と比較して、試験大動脈(例えば、アテローム性大動脈であることが疑われる大動脈、又はアテローム性大動脈と診断された大動脈)においてプラークサイズ(例えば、プラーク体積及び/又はプラーク面積)が増加した場合、アテローム性硬化プラークの存在を示す。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、肺線維症としても知られる肺線維症である。
線維化は多くの疾患の特徴である。いくつかの場合において、線維化は疾患の不可欠な部分であり、線維化は細胞外マトリックスタンパク質の病的な沈着をもたらす異常な又は病的な細胞行動の結果である可能性があることを意味する。他の場合において、線維化は、原疾患と並行して、あるいは治癒の過程で、疾患組織で起こる二次的な事象である場合もある。例えば、線維化とは瘢痕形成であってもよい。本明細書に開示されるような抗体によって、あらゆるタイプの線維症が標的とされ、例えば、治療又は予防され得る。線維症は、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の過剰な蓄積によって引き起こされる、制御不能又は調節不能な瘢痕組織形成に分類されることがある。したがって、線維症の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、線維症が特徴である疾患の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断の上流に位置することが考えられる。代替的に、又は追加的に、線維症の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、線維症が前記疾患における二次的事象である疾患の下流であり得る。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、心筋炎である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、自己免疫性心筋炎である。
いくつかの実施形態において、自己免疫性心筋炎などの心筋炎の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、自己免疫性心筋炎などの心筋炎の減少、例えば自己免疫性心筋炎などの心筋炎の臨床兆候、症状又は病理生理学的相関の減少、例えば、心機能の悪化の減少、炎症の減少、及び/又は線維化の減少を含む。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、慢性移植片対宿主病及び硬化皮膚性慢性移植片対宿主病を含む、移植片対宿主病である。一実施形態において、前記疾患又は障害は、移植片対宿主病における真皮線維症及び/又は肺線維症である。特定の実施形態において、移植片対宿主病は、同系移植によって引き起こされる。代替実施形態において、移植片対宿主病は同種移植によって引き起こされる。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、急性炎症性疾患又は障害である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、慢性炎症性疾患又は障害である。
当業者であれば、疾患又は障害が様々な方法でグループ化されることを理解できるだろう。疾患又は障害は、炎症性疾患又は線維性疾患として明示的にラベル付けされていないかもしれないが、それでも、疾患又は障害の一部を形成又は寄与する例えば炎症性及び/又は線維性プロセスなど、炎症性及び/又は線維性成分を有するかもしれない。
当業者であれば、疾患又は障害が様々な方法でグループ化されることを理解できるだろう。疾患又は障害は、炎症性疾患又は線維性疾患として明示的にラベル付けされていないかもしれないが、それでも、疾患又は障害の一部を形成又は寄与する例えば炎症性及び/又は線維性プロセスなど、炎症性及び/又は線維性成分を有するかもしれない。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び/又は線維性成分を有する。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、自己免疫疾患又は障害である。
いくつかの実施形態において、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、炎症性プロセスを阻害する。
いくつかの実施形態において、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、線維化プロセスを阻害する。
いくつかの実施形態において、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、増殖プロセスを阻害する。
腫瘍性の疾患又は障害のバイオマーカーとしてのIL1RAP
腫瘍とは、腫瘍性の疾患や障害(すなわち、がん)を示すもので、組織や細胞の異常で過剰な増殖(異常増殖ともいう)の一種で、例えば、腫瘍のことである。
腫瘍とは、腫瘍性の疾患や障害(すなわち、がん)を示すもので、組織や細胞の異常で過剰な増殖(異常増殖ともいう)の一種で、例えば、腫瘍のことである。
腫瘍バイオマーカーや腫瘍性の疾患又は障害バイオマーカーは、腫瘍の状態、進行特性、及び治療に対する反応性を示す量や修飾を持つ内因性のタンパク質又は代謝産物である。腫瘍組織や体液中に存在し、転写因子、細胞表面受容体、及び分泌タンパク質など、多種多様な分子を包含する。有効な腫瘍マーカーは、がんの早期診断や治療の個別化により、がん死亡率を低下させる可能性があるため、大きな需要がある。この10年間で、発がんや腫瘍の進行に関する理解が深まり、多くの潜在的な腫瘍マーカーが明らかになってきた。組織マイクロアレイ、抗体アレイ、及び質量分析など、現在の技術を応用すれば、近い将来、さらに多くのことが発見されるだろうと予測される。
インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)は、以前に、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性白血病(AML)及び骨髄異形成症候群(MDS)などの血液学的腫瘍性障害に関連する細胞表面バイオマーカーとして特定されてきた(例えば、Cantargia ABに対するWO2011/021014,Jaras et al.,2010,Proc Natl Acad Sci USA 107(37):16280-5,Askmyr et al.,2013,Blood.121(18):3709-13 and Barreyro et al.,2012,Blood 120(6):1290-8を参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。さらに最近では、メラノーマなどの固形腫瘍の診断及び治療バイオマーカーとしてのIL1RAPの有用性も明らかにされてきた(Cantargia ABに対するWO2012/098407を参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる)。
したがって、本発明の上記態様のいくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、腫瘍性の疾患又は障害である。
当業者は、例えば、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を阻害し、それによって複数のIL依存性経路を同時に標的とする能力により、本発明の抗体が腫瘍性の疾患又は障害に深い効果をもたらす可能性があることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、腫瘍性の疾患又は障害であり、腫瘍性の疾患又は障害は、血液疾患又は障害又は固形腫瘍である。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍性の疾患又は障害は血液疾患であり、腫瘍性の血液疾患又は障害は、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄増殖性障害(MPD)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性リンパ芽球白血病(ALL)、及び急性骨髄性白血病(AML)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍性の疾患又は障害は、固形腫瘍であり、ここで、前記固形腫瘍は、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、メラノーマ、膀胱がん、脳/CNSがん、泌尿器系のがん、胆道がん(胆管がんとしても知られる)、子宮頸がん、食道がん、胃がん、頭/首がん、腎臓がん、肝臓がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される。
本発明の抗体は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γのシグナル伝達を阻害することにより、複数のIL依存性経路を同時に標的とできることから、例えば腫瘍性の疾患又は障害に対して深い効果が期待できることは、当業者であれば理解するだろう。
当業者であれば、例えば、上記の証拠に照らして、本発明の抗体が、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γの活性に関与する任意の疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断に使用できることを理解するだろう。
本発明の第9の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
対象の腫瘍性の疾患に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導し、及び/又は成長及び/又は増殖を阻害するために使用するためのものであり、ここで、前記細胞が、IL1RAPを発現する。
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
対象の腫瘍性の疾患に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導し、及び/又は成長及び/又は増殖を阻害するために使用するためのものであり、ここで、前記細胞が、IL1RAPを発現する。
本発明の第10の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断のための医薬品の調製における使用に関するものであり、
及び/又は、前記疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断のための医薬品の調製における使用に関するものであり、
及び/又は、前記疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する。
本発明の第11の態様は、
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び/又は診断のための医薬品の調製に使用される。
本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第3の態様のベクター、
本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
本発明の第6の態様に係る組成物、に関するものであり、
IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び/又は診断のための医薬品の調製に使用される。
本発明の第12の態様は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナルの阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断のための方法、及び/又は前記疾患又は障害が、対象のIL1RAP発現細胞に関するものであり、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第13の態様は、対象においてIL1RAPを発現する細胞を検出するためのインビトロ方法に関するものであり、前記方法は、
(a)生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す。
(a)生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す。
本発明の第14の態様は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有する患者を同定するためのインビトロ方法に関するものであり、
(a)検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、IL1RAPを発現する細胞に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るだろう患者を示すものである。
(a)検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、IL1RAPを発現する細胞に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るだろう患者を示すものである。
本発明の第15の態様は、細胞の発現IL1RAPに関連する疾患又は障害を有する患者を治療するための方法に関し、前記方法は、
a)本発明の第14の態様にかかる方法を用いて、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、及び
b)前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む。
a)本発明の第14の態様にかかる方法を用いて、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、及び
b)前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む。
本発明の第16の態様は、IL1RAPを発現する細胞を検出するための方法に関するものであり、前記方法は、
(a)第1の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントを、IL1RAPの発現について分析すべき細胞と接触させる工程と、
(b)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す。
(a)第1の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントを、IL1RAPの発現について分析すべき細胞と接触させる工程と、
(b)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す。
いくつかの実施形態において、第16の態様の方法は、インビトロ法である。
いくつかの実施形態において、第16の態様の方法は、インビボ法である。
当業者は、第16の態様の方法が適用される場合、IL1RAPに対する結合特異性を有する抗体又は抗原結合フラグメントが、例えば、本明細書の記載に従って、対象に投与されることを理解するだろう。
本発明の第17の態様は、腹膜炎を有する対象における炎症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、腹膜炎を有する対象における炎症を低減するための前記方法は、腹膜への免疫細胞、例えば、好中球及び単球の浸潤を低減する工程を含む。
いくつかの実施形態において、腹膜炎を有する対象における炎症を低減するための前記方法は、サイトカインのレベルを低減する工程を含み、例えば、エオタキシン、G-CSF、IL-5、MCP-1、MIP-1β、IL-6、及び/又はKC(CXCL1としても知られる)のレベルを低減する。
本発明の第18の態様は、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための前記方法は、皮膚の炎症及び/又は皮膚の紅斑を低減する工程を含む。
いくつかの実施形態では、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための前記方法は、サイトカインのレベルを低減すること、例えば、IL-17のレベルを低減する工程を含む。
本発明の第19の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減する方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、アテローム性動脈硬化症の患者におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減するための前記方法は、CD45+白血球、例えば、骨髄系CD11b+細胞、例えばLy6G+好中球の数を減らす工程、及び/又はTCR-β+細胞、例えばCD4+及び/又はCD8+細胞の数を減らす工程を含む。
本発明の第20の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象においてアテローム性動脈硬化症プラーク体積及び/又はアテローム性動脈硬化症プラークサイズを低減する方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第21の態様は、心筋炎を有する対象における炎症及び/又は線維化を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第22の態様は、心筋炎又は自己免疫性心筋炎を有する対象における心機能の悪化を打ち消すための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第23の態様は、全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を低減するための前記方法は、皮膚厚を低減する工程と、筋線維芽細胞の数を低減する工程と、及び/又は皮膚におけるコラーゲンの量を低減する工程と、を含む。
本発明の第24の態様は、全身性硬化症を有する対象の肺線維症を軽減する方法に関するものであり、前記方法は、
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
-本発明の第1の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
-本発明の第2の態様のポリヌクレオチド、
-本発明の第3の態様のベクター、
-本発明の第4の態様の宿主細胞、及び/又は
-本発明の第6の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、全身性硬化症を有する対象における肺線維症を低減するための前記方法は、Ashcroftスコア及び/又は肺のコラーゲンの量を低減する工程を含む。
例えばIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナルの阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害に関連して、及び/又はIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害に関連して、第8態様に係る実施形態及び説明は、本発明の第9、10、11、12、13、14、15、及び/又は16の態様にも適用するものとする。また、これらは、本発明の第17、18、19、20、21、22、23、又は24の態様に適用することも可能である。
実施例1:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるサイトカインシグナル伝達の阻害
目的
この実施例は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γによるシグナル伝達の遮断に関する、マウスILRAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10の特徴付けを例示する。
この実施例は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γによるシグナル伝達の遮断に関する、マウスILRAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10の特徴付けを例示する。
材料及び方法
ニワトリをマウスIL1RAP抗原で免疫化し、複数の抗マウスIL1RAPバインダーを同定した。これらの選択物をマウスIgG2a脊柱にクローンニングした。マウスILRAPのドメイン2に結合可能な1つのそのようなクローン、mCAN10をIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γによるシグナル伝達を阻害するその能力について評価した。
ニワトリをマウスIL1RAP抗原で免疫化し、複数の抗マウスIL1RAPバインダーを同定した。これらの選択物をマウスIgG2a脊柱にクローンニングした。マウスILRAPのドメイン2に結合可能な1つのそのようなクローン、mCAN10をIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γによるシグナル伝達を阻害するその能力について評価した。
この評価のために、マウスIL-1Rで安定的にトランスフェクトしたHEK-Blue(商標)細胞を使用した。代替的に、マウスIL-33及びIL-36シグナル伝達の分析も同様に可能とするために、HEK-Blue(商標)細胞を、アッセイの前日に、マウスIL-33及びIL-36受容体で一時的にトランスフェクトした。HEK-Blue(商標)細胞を96ウェルプレートに播種し、継続する前に少なくとも2時間落ち着かせた。次いで、マウスサイトカインの添加前に、濃度を増加させたmCAN10(0,0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、及び100μg/ml)に細胞を暴露し、37℃、5%のCO2で1時間インキュベートした。サイトカインを以下の濃度で添加した:3pg/mlのIL-1α、30pg/mlのIL-1β、5ng/mlのIL-33、4ng/mlのIL-36α、5ng/mlのIL-36β、及び10ng/mlのIL-36γ。マウスIL-1α及びIL-1βは、HEK-Blue(商標)細胞によって内因的に発現されるヒトIL-1Rと交差反応し得るため、これらの細胞をマウスIL-1α及びIL-1βで刺激する前に、抗ヒトIL1RAP抗体を使用して、IL-1Rを介したシグナル伝達を遮断した。細胞を37℃、5%のCO2で16~18時間培養し、次いで、NF-κBの活性化及びその後のSEAPの産生についてQUANTI-Blue(商標)溶液を用いて分析し、SpectraMax i3x分光光度計を使用して620nmで測定した。
結果
mCAN10は濃度を増加させてHEK-Blue(商標)に添加し、マウスIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、又はIL-36γを一定濃度で添加した。620nmで光学密度値のグラフを使用して、表2に示すIC50値を計算した。mCAN10は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達の阻害を誘導した。
mCAN10は濃度を増加させてHEK-Blue(商標)に添加し、マウスIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、又はIL-36γを一定濃度で添加した。620nmで光学密度値のグラフを使用して、表2に示すIC50値を計算した。mCAN10は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達の阻害を誘導した。
結論
mCAN10は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γによるシグナル伝達を遮断することが可能なマウス代用抗マウスIL1RAP阻害剤である。したがって、mCAN10は、様々なマウス疾患モデルにおけるIL1RAP遮断の治療有効性を評価するために有用なツールを提供する。抗ヒトIL1RAP抗体は、マウスIL1RAP(例えば、実施例9~22に記載される抗ヒトIL1RAP抗体)に対する交差反応性を欠く可能性があるため、mCAN10は、類似の機能特性を有する抗ヒトIL1RAP抗体の適切な代用である。その後のインビボ実験(実施例2~8)においては、エフェクター機能サイレントマウスIgG2aフォーマットのmCAN10を使用した。
mCAN10は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γによるシグナル伝達を遮断することが可能なマウス代用抗マウスIL1RAP阻害剤である。したがって、mCAN10は、様々なマウス疾患モデルにおけるIL1RAP遮断の治療有効性を評価するために有用なツールを提供する。抗ヒトIL1RAP抗体は、マウスIL1RAP(例えば、実施例9~22に記載される抗ヒトIL1RAP抗体)に対する交差反応性を欠く可能性があるため、mCAN10は、類似の機能特性を有する抗ヒトIL1RAP抗体の適切な代用である。その後のインビボ実験(実施例2~8)においては、エフェクター機能サイレントマウスIgG2aフォーマットのmCAN10を使用した。
実施例2:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は、急性腹膜炎のモデルにおいて、炎症反応を減少させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、急性腹膜炎のマウスモデルにおける炎症反応にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、IL-1α/βシグナル伝達のみを遮断する組み換えIL-1Rアンタゴニスト(IL1RA)タンパク質であるアナキンラと比較することである。
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、急性腹膜炎のマウスモデルにおける炎症反応にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、IL-1α/βシグナル伝達のみを遮断する組み換えIL-1Rアンタゴニスト(IL1RA)タンパク質であるアナキンラと比較することである。
材料及び方法
野生型(WT)又はIL1RAPノックアウト(KO)のいずれかである雌のC57Bl/6マウス(10~18週齢)を、2.5mgの尿酸ナトリウム(MSU)結晶で腹腔内投与(i.p.)免疫した。MSU結晶で免疫しなかったWTマウスを対照として含めた(MSUなし)。全てのマウスを免疫化6時間後に終わらせ、フローサイトメトリーによって浸潤細胞(B細胞、T細胞、単球、好中球、及び好酸球)の定量化のために腹腔洗浄液を収集した(図1A)。
野生型(WT)又はIL1RAPノックアウト(KO)のいずれかである雌のC57Bl/6マウス(10~18週齢)を、2.5mgの尿酸ナトリウム(MSU)結晶で腹腔内投与(i.p.)免疫した。MSU結晶で免疫しなかったWTマウスを対照として含めた(MSUなし)。全てのマウスを免疫化6時間後に終わらせ、フローサイトメトリーによって浸潤細胞(B細胞、T細胞、単球、好中球、及び好酸球)の定量化のために腹腔洗浄液を収集した(図1A)。
代替的には、雌のC57Bl/6 WTマウス(8~9週齢)を20mg/kgのmCAN10又はモル当量用量(2.3mg/kg)のIL1RAで処置した。アイソタイプ対照抗体又はPBSで処置したマウスを、対照として含めた。処置の1時間(hr)後、マウスは、2.5mgのMSU結晶で腹腔内投与免疫化した。いずれの処置も受けず、MSU結晶で免疫化しなかったマウスを、対照として含めた(MSUなし)。全てのマウスを免疫化6時間後に終わらせ、フローサイトメトリーによる湿潤細胞の定量化のために(図1B)、又はLuminexアッセイによる種々のサイトカイン及びケモカイン(エオタキシン、G-CSF、IL-5、MCP-1、MIP-1β、IL-6、及びKC(CXCL1としても知られる))の定量化のために(図1C)、腹腔洗浄液を収集した。
結果
MSU結晶で免疫化後、IL1RAP KOマウスは、WTマウスと比較して、腹腔への細胞の湿潤の有意な減少を示し、湿潤好中球及び単球に対して最大の効果を有した(図1A)。mCAN10及びIL1RAでの処置は、アイソタイプ及びPBS対照とそれぞれ比較して、MSU結晶で免疫化したWTマウスの腹膜腔において、好中球及び単球のような湿潤細胞の数を有意に減少させた。しかしながら、mCAN10は、IL1RAよりも、単球及び好中球に強力な抗炎症作用を有した(図1B)。mCan10及びIL1RAはまたアイソタイプ及びPBS対照それぞれと比較して、G-CSF及びIL-6を有意に減少させた。mCAN10はまたアイソタイプ対照と比較して、エオタキシン、IL-5、MCP-1及びMIP-1βを減少させ、IL1RAと比較して、IL-6の有意に大幅な減少を示した(図1C)。
MSU結晶で免疫化後、IL1RAP KOマウスは、WTマウスと比較して、腹腔への細胞の湿潤の有意な減少を示し、湿潤好中球及び単球に対して最大の効果を有した(図1A)。mCAN10及びIL1RAでの処置は、アイソタイプ及びPBS対照とそれぞれ比較して、MSU結晶で免疫化したWTマウスの腹膜腔において、好中球及び単球のような湿潤細胞の数を有意に減少させた。しかしながら、mCAN10は、IL1RAよりも、単球及び好中球に強力な抗炎症作用を有した(図1B)。mCan10及びIL1RAはまたアイソタイプ及びPBS対照それぞれと比較して、G-CSF及びIL-6を有意に減少させた。mCAN10はまたアイソタイプ対照と比較して、エオタキシン、IL-5、MCP-1及びMIP-1βを減少させ、IL1RAと比較して、IL-6の有意に大幅な減少を示した(図1C)。
結論
mCAN10(IL-1α/β、IL-33及びIL-36α/β/γのシグナル伝達を遮断する)は、急性腹膜炎のマウスモデルにおいて、IL1RA(IL-1α/βシグナル伝達のみを遮断する)よりも強力に炎症応答を低下させる。
mCAN10(IL-1α/β、IL-33及びIL-36α/β/γのシグナル伝達を遮断する)は、急性腹膜炎のマウスモデルにおいて、IL1RA(IL-1α/βシグナル伝達のみを遮断する)よりも強力に炎症応答を低下させる。
実施例3:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は、乾癬及び乾癬性関節炎のモデルにおいて疾患重症度を低下させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、イミキモド誘発性乾癬及びマンナン誘発性乾癬性関節炎における疾患重症度にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、IL-1βシグナル伝達のみを遮断する抗IL-1β抗体と比較することである。
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、イミキモド誘発性乾癬及びマンナン誘発性乾癬性関節炎における疾患重症度にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、IL-1βシグナル伝達のみを遮断する抗IL-1β抗体と比較することである。
材料及び方法
雌のBALB/cマウス(8~10週齢)に乾癬を誘発し、0日目から開始して7日目に終了するまで、毎日Zyclaraクリーム(3.75%イミキモド;約71.4mg/日)を局所投与した。このクリームをマウスの剃毛した背中に塗布した。疾患誘導のこの間に、マウスは0、3、及び5日目に腹腔内投与処置を受けた。mCAN10(10mg/kg)、抗IL-1β(0.5mg/kg)、又はこれらの抗体について同じ用量のアイソタイプ対照で、マウスを処置した。PBSのみ(ビヒクル)又はデキサメタゾン(10mg/kg)で処置したマウスは、それぞれ陰性及び陽性対照として含めた。0~4の範囲のスコアを用いて剃毛した背部領域の皮膚炎症及び紅斑をスコア化することによって実験を通じて毎日疾患重症度を評価した(各マウスについて合計8)(図2A~B)。
代替的には、乾癬性関節炎を、雄及び雌のB6N.Q.NCF1マウス(8~14週齢)において誘発し、0日目にサッカロマイセス・セレビシエ由来のマンナンを20mg、腹腔内投与にて受けた。これらのマウスを、0、3、5日目に上記と同様の方法で処置した。0~15の範囲で4本の足の肉眼的なスコアシステムを使用し、足の関節炎症をスコア化することによって、疾患重症度を評価した(各マウスについて合計60)(図2C~D)。実験の終わりに、乾癬性関節炎における主要な寄与サイトカインであるIL-17の分析のために血液を採取した(図2E)。
雌のBALB/cマウス(8~10週齢)に乾癬を誘発し、0日目から開始して7日目に終了するまで、毎日Zyclaraクリーム(3.75%イミキモド;約71.4mg/日)を局所投与した。このクリームをマウスの剃毛した背中に塗布した。疾患誘導のこの間に、マウスは0、3、及び5日目に腹腔内投与処置を受けた。mCAN10(10mg/kg)、抗IL-1β(0.5mg/kg)、又はこれらの抗体について同じ用量のアイソタイプ対照で、マウスを処置した。PBSのみ(ビヒクル)又はデキサメタゾン(10mg/kg)で処置したマウスは、それぞれ陰性及び陽性対照として含めた。0~4の範囲のスコアを用いて剃毛した背部領域の皮膚炎症及び紅斑をスコア化することによって実験を通じて毎日疾患重症度を評価した(各マウスについて合計8)(図2A~B)。
代替的には、乾癬性関節炎を、雄及び雌のB6N.Q.NCF1マウス(8~14週齢)において誘発し、0日目にサッカロマイセス・セレビシエ由来のマンナンを20mg、腹腔内投与にて受けた。これらのマウスを、0、3、5日目に上記と同様の方法で処置した。0~15の範囲で4本の足の肉眼的なスコアシステムを使用し、足の関節炎症をスコア化することによって、疾患重症度を評価した(各マウスについて合計60)(図2C~D)。実験の終わりに、乾癬性関節炎における主要な寄与サイトカインであるIL-17の分析のために血液を採取した(図2E)。
結果
mCAN10はイミキモド誘発性乾癬における疾患重症度を低下させたが、抗IL―1β抗体は低下させなかった(図2A~B)。同様に、mCAN10は、マンナン誘発性乾癬性関節炎における疾患重症度を低下させ(図2C~D)、ビヒクルと比較して、循環IL-17のレベルも低下させた(図2E)が、抗IL-1β抗体は低下させなかった。
mCAN10はイミキモド誘発性乾癬における疾患重症度を低下させたが、抗IL―1β抗体は低下させなかった(図2A~B)。同様に、mCAN10は、マンナン誘発性乾癬性関節炎における疾患重症度を低下させ(図2C~D)、ビヒクルと比較して、循環IL-17のレベルも低下させた(図2E)が、抗IL-1β抗体は低下させなかった。
結論
mCAN10(IL-1α/β、IL-33及びIL-36α/β/γシグナル伝達を遮断する)は、イミキモド誘発性乾癬及びマンナン誘発性乾癬性関節炎の両方の疾患重症度を低下させるが、抗IL-1β抗体(IL-1βシグナル伝達のみを遮断する)は低下させない。
mCAN10(IL-1α/β、IL-33及びIL-36α/β/γシグナル伝達を遮断する)は、イミキモド誘発性乾癬及びマンナン誘発性乾癬性関節炎の両方の疾患重症度を低下させるが、抗IL-1β抗体(IL-1βシグナル伝達のみを遮断する)は低下させない。
実施例4:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は、Apoe KOマウスにおけるアテローム性動脈硬化症及び大動脈プラーク炎症を低下させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、アポリポタンパク質E(Apoe)KOマウスにおけるアテローム性動脈硬化症にどのように影響を与えるか評価することである。
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、アポリポタンパク質E(Apoe)KOマウスにおけるアテローム性動脈硬化症にどのように影響を与えるか評価することである。
材料及び方法
雌のApoe KOマウス(10~12週齢)に高コレステロール食(HCD;21%脂肪、0.21%コレステロール)を与えて、アテローム性動脈硬化病変を発症させた。HCDの4週間後、マウスの処置を開始し、マウスにmCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体のいずれかを、6週間、隔週(週2回)腹腔内投与した。これらの6週間を通じて、マウスにHCDを継続して与えた。ケージ間のばらつきを低減するために、各ケージについて、マウスを処置群間で分けた。最終投与の48時間後、マウスを麻酔し、犠牲にし、その後大動脈を収集して、骨髄細胞(CD11b+細胞及びLy6G+好中球亜集団の合計)(図3A~C)及びTリンパ球(TCR-β+細胞、及びCD4+及びCD8+亜集団の合計)(図3D~F)を含む免疫細胞組成の変化をフローサイトメトリーによって研究した。心臓を採取し、大動脈根で切片化し、切片をOil-Red Oによって脂肪蓄積について染色し、プラークサイズを群間で比較した(図4A~B)。
雌のApoe KOマウス(10~12週齢)に高コレステロール食(HCD;21%脂肪、0.21%コレステロール)を与えて、アテローム性動脈硬化病変を発症させた。HCDの4週間後、マウスの処置を開始し、マウスにmCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体のいずれかを、6週間、隔週(週2回)腹腔内投与した。これらの6週間を通じて、マウスにHCDを継続して与えた。ケージ間のばらつきを低減するために、各ケージについて、マウスを処置群間で分けた。最終投与の48時間後、マウスを麻酔し、犠牲にし、その後大動脈を収集して、骨髄細胞(CD11b+細胞及びLy6G+好中球亜集団の合計)(図3A~C)及びTリンパ球(TCR-β+細胞、及びCD4+及びCD8+亜集団の合計)(図3D~F)を含む免疫細胞組成の変化をフローサイトメトリーによって研究した。心臓を採取し、大動脈根で切片化し、切片をOil-Red Oによって脂肪蓄積について染色し、プラークサイズを群間で比較した(図4A~B)。
結果
アテローム性硬化症の大動脈のフローサイトメトリー分析は、mCAN10がプラーク炎症を減少させることを示す。これは、CD45+白血球の数の減少によって観察される(図3A)。これらのうち、Ly6G+好中球を含む骨髄CD11b+細胞が減少した(図3B~C)。CD4+及びCD8+細胞の両方を含むTCR-β+細胞の数も減少した(図3D~F)。追加的に、mCAN10は、アイソタイプ対照と比較して、HCDを与えられたApoe KOマウスにおける大動脈プラークの体積及び面積を有意に減少させた(図4A~B)。
アテローム性硬化症の大動脈のフローサイトメトリー分析は、mCAN10がプラーク炎症を減少させることを示す。これは、CD45+白血球の数の減少によって観察される(図3A)。これらのうち、Ly6G+好中球を含む骨髄CD11b+細胞が減少した(図3B~C)。CD4+及びCD8+細胞の両方を含むTCR-β+細胞の数も減少した(図3D~F)。追加的に、mCAN10は、アイソタイプ対照と比較して、HCDを与えられたApoe KOマウスにおける大動脈プラークの体積及び面積を有意に減少させた(図4A~B)。
結論
mCAN10によるIL1RAP遮断は、Apoe KOマウスにおいて、アテローム動脈硬化症を減少させ、プラーク炎症を限定する。
mCAN10によるIL1RAP遮断は、Apoe KOマウスにおいて、アテローム動脈硬化症を減少させ、プラーク炎症を限定する。
実施例5:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は、実験的自己免疫心筋炎における炎症及び線維化を減少させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によってIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が実験的自己免疫心筋炎(EAM)における炎症及び線維化の発生にどのように影響を与えるかを評価することである。
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によってIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が実験的自己免疫心筋炎(EAM)における炎症及び線維化の発生にどのように影響を与えるかを評価することである。
材料及び方法
EAMは、雄のBALB/cマウス(7~8週齢)において、完全フロインドアジュバンドに乳化した100μgのマウスαーミオシン重鎖(αMHC)ペプチドで、0及び7日目に皮下でマウスを免疫化することによって誘導した。マウスを、mCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、4週間隔週で腹腔内投与処置した。PBSで処置したマウスを対照として含めた。処置は、αMHCによる最終免疫化の1週間後、14日目に開始した。実験の終わりに、42日目に、マウスを犠牲にして心臓を採取した。心臓を10%緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、縦方向に切片化した。心臓あたり一つの中央切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色し、0~5の範囲スコアシステムを使用して造血細胞によって湿潤された面積を等級付けすることによって、左心室(LV)における炎症の程度を評価した(図5A~B)。代替的には、心臓あたり一つの中央切片をマッソントリクロームで染色し、線維化組織の尺度としてコラーゲン沈着を検出した。コンピューター化された面積測定(ImageJ)を使用して、線維化青色領域及び全領域を測定した。線維化領域は、全領域の割合として提示される(図5C~D)。
EAMは、雄のBALB/cマウス(7~8週齢)において、完全フロインドアジュバンドに乳化した100μgのマウスαーミオシン重鎖(αMHC)ペプチドで、0及び7日目に皮下でマウスを免疫化することによって誘導した。マウスを、mCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、4週間隔週で腹腔内投与処置した。PBSで処置したマウスを対照として含めた。処置は、αMHCによる最終免疫化の1週間後、14日目に開始した。実験の終わりに、42日目に、マウスを犠牲にして心臓を採取した。心臓を10%緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、縦方向に切片化した。心臓あたり一つの中央切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色し、0~5の範囲スコアシステムを使用して造血細胞によって湿潤された面積を等級付けすることによって、左心室(LV)における炎症の程度を評価した(図5A~B)。代替的には、心臓あたり一つの中央切片をマッソントリクロームで染色し、線維化組織の尺度としてコラーゲン沈着を検出した。コンピューター化された面積測定(ImageJ)を使用して、線維化青色領域及び全領域を測定した。線維化領域は、全領域の割合として提示される(図5C~D)。
結果
mCAN10は、EAM誘発マウスからの心臓のH&E染色切片のスコア化によって評価されるように、心筋における湿潤性炎症細胞を減少させた(図5A~B)。追加的に、mCAN10はまた、マッソントリクローム染色した心臓切片の分析によって決定されるように、心臓線維化を減少させた(図5C~D)。
mCAN10は、EAM誘発マウスからの心臓のH&E染色切片のスコア化によって評価されるように、心筋における湿潤性炎症細胞を減少させた(図5A~B)。追加的に、mCAN10はまた、マッソントリクローム染色した心臓切片の分析によって決定されるように、心臓線維化を減少させた(図5C~D)。
結論
mCAN10は、EAMにおける炎症及び線維化の発生を減少させることができる。
mCAN10は、EAMにおける炎症及び線維化の発生を減少させることができる。
実施例6:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は、実験的自己免疫心筋炎における心機能の悪化を打ち消す
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によってIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が実験的自己免疫心筋炎(EAM)における心機能にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、IL-1βシグナル伝達のみを遮断する抗IL-1β抗体、IL-1α/βシグナル伝達のみを遮断する組み換えIL-1Rアンタゴニスト(IL1RA)タンパク質であるアナキンラ、及び抗炎症性グルココルチコイドであるプレドニゾンと比較することである。
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によってIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が実験的自己免疫心筋炎(EAM)における心機能にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、IL-1βシグナル伝達のみを遮断する抗IL-1β抗体、IL-1α/βシグナル伝達のみを遮断する組み換えIL-1Rアンタゴニスト(IL1RA)タンパク質であるアナキンラ、及び抗炎症性グルココルチコイドであるプレドニゾンと比較することである。
材料及び方法
EAMは、雄のBALB/cマウス(7~8週齢)において、完全フロインドアジュバンドに乳化した100μgのマウスαーミオシン重鎖(αMHC)ペプチドで、0及び7日目に皮下でマウスを免疫化することによって誘導した。処置は、αMHCによる最終免疫化と同じ日、7日目に開始した。マウスを、mCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)、抗ILー1β抗体(0.5mg/kg)、又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、5週間隔週で腹腔内投与処置した。代替的には、マウスを、25mg/kgのIL1RAを皮下で、強制経口による5mg/kgのプレドニゾンで、又は関連するビヒクル対照で、5週間毎日処置した。PBSで処置したマウスを対照として含めた。心機能を評価するために、研究の開始時及び28と42日目に、左心室駆出分率(LVEF)の測定のために、マウスに対して経胸壁心エコー検査を実施した(図6A~C)。
EAMは、雄のBALB/cマウス(7~8週齢)において、完全フロインドアジュバンドに乳化した100μgのマウスαーミオシン重鎖(αMHC)ペプチドで、0及び7日目に皮下でマウスを免疫化することによって誘導した。処置は、αMHCによる最終免疫化と同じ日、7日目に開始した。マウスを、mCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)、抗ILー1β抗体(0.5mg/kg)、又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、5週間隔週で腹腔内投与処置した。代替的には、マウスを、25mg/kgのIL1RAを皮下で、強制経口による5mg/kgのプレドニゾンで、又は関連するビヒクル対照で、5週間毎日処置した。PBSで処置したマウスを対照として含めた。心機能を評価するために、研究の開始時及び28と42日目に、左心室駆出分率(LVEF)の測定のために、マウスに対して経胸壁心エコー検査を実施した(図6A~C)。
結果
mCAN10は、アイソタイプ及び抗IL-1β抗体と比較して、EAM誘導マウスにおけるLVEFの測定によって評価されるように、心機能を有意に維持した(図6A)。しかしながら、IL1RA及びプレドニゾンは、それらのそれぞれの対照群と比較して、心機能に対して有意な効果を示さなかった(図6B)。追加的に、mCAN10は、処置が7日目の代わりに14日目に開始された場合にも、心機能を維持した(図6C)。
mCAN10は、アイソタイプ及び抗IL-1β抗体と比較して、EAM誘導マウスにおけるLVEFの測定によって評価されるように、心機能を有意に維持した(図6A)。しかしながら、IL1RA及びプレドニゾンは、それらのそれぞれの対照群と比較して、心機能に対して有意な効果を示さなかった(図6B)。追加的に、mCAN10は、処置が7日目の代わりに14日目に開始された場合にも、心機能を維持した(図6C)。
結論
mCAN10は、EAM誘導マウスにおける心機能に対して治療効果を有するが、抗IL-1β抗体、IL1RA及びプレドニゾンはそのような効果を示さない。
mCAN10は、EAM誘導マウスにおける心機能に対して治療効果を有するが、抗IL-1β抗体、IL1RA及びプレドニゾンはそのような効果を示さない。
実施例7:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は、硬化皮膚慢性移植片対宿主病のモデルにおいて真皮及び肺線維症を改善する
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、硬化皮膚慢性移植片対宿主病(scl cGvHD)のマウスモデルにおける線維症にどのように影響を与えるかを評価することである。
これらの実験の目的は、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナル伝達の遮断が、硬化皮膚慢性移植片対宿主病(scl cGvHD)のマウスモデルにおける線維症にどのように影響を与えるかを評価することである。
材料及び方法
硬化皮膚慢性移植片対宿主病
受容者の雌のBALB/cマウス(H-2d;8週齢;n=10/群)は、700cGyで全身照射を受けた。照射の6時間後、全てのBALB/c(H-2d)受容者は、同系の雌のBALB/cマウス(H-2d)又は同種異系移植様式の雄のB10.D2マウス(H-2d)のいずれかから、骨髄を受けた。MHCミスマッチの理由で、同種異系移植されたマウスは、皮膚及び複数の内部器官の線維症を伴うscl cGvHDを発症する。移植のために、ドナーマウス由来の5x106の脾細胞及び2x106の骨髄細胞をPBS中に再懸濁し、尾静脈を介して注射した。処置は、骨髄移植の21日後に開始した。同種異系移植を受けたマウスを、mCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、4週間隔週で腹腔内投与処置した。代替的に、これらのマウスに50mg/kgの小分子チロシンキナーゼ阻害剤ニンテダニブを経口投与で毎日4週間投与した。ニンテダニブは、間質性肺炎を有する全身性硬化症患者の処置のために承認されており、本明細書において陽性対照として使用される。同系移植を受けたマウスを、アイソタイプ対照抗体のみで処置した。実験の終わりに、49日目に、マウスを犠牲にして皮膚試料と肺を採取した。
硬化皮膚慢性移植片対宿主病
受容者の雌のBALB/cマウス(H-2d;8週齢;n=10/群)は、700cGyで全身照射を受けた。照射の6時間後、全てのBALB/c(H-2d)受容者は、同系の雌のBALB/cマウス(H-2d)又は同種異系移植様式の雄のB10.D2マウス(H-2d)のいずれかから、骨髄を受けた。MHCミスマッチの理由で、同種異系移植されたマウスは、皮膚及び複数の内部器官の線維症を伴うscl cGvHDを発症する。移植のために、ドナーマウス由来の5x106の脾細胞及び2x106の骨髄細胞をPBS中に再懸濁し、尾静脈を介して注射した。処置は、骨髄移植の21日後に開始した。同種異系移植を受けたマウスを、mCAN10(最初の用量で20mg/kg;その後の用量で10mg/kg)又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、4週間隔週で腹腔内投与処置した。代替的に、これらのマウスに50mg/kgの小分子チロシンキナーゼ阻害剤ニンテダニブを経口投与で毎日4週間投与した。ニンテダニブは、間質性肺炎を有する全身性硬化症患者の処置のために承認されており、本明細書において陽性対照として使用される。同系移植を受けたマウスを、アイソタイプ対照抗体のみで処置した。実験の終わりに、49日目に、マウスを犠牲にして皮膚試料と肺を採取した。
真皮及び肺線維症の組織学的評価
上背部の1cm2の規定された面積の皮膚試料を、4%ホルマリン中で6時間固定し、パラフィンに包埋した。切片を5μmに切断し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。100倍の倍率で、光学顕微鏡(Nikon Eclipse 80i)にて捕らえられた画像を使用して、マウスあたり4つの部分で表皮ー真皮接合部と真皮―皮下脂肪接合部との間の距離を手動で測定することによって、H&E染色された切片について、真皮の厚さを定量化した。肺試料の右葉を同様に固定し、パラフィン包埋し、切片化し、続いてトリクローム及びSirius Redで染色した。組織学的読み出しは、Sirius Red染色切片(マウスあたり2つの切片)における全肺面積の割合としての染色(線維症)面積の評価、及び肺標本(マウスあたり4つの切片)における線維症の程度を決定するための数値尺度であるAshcroftスコアによる肺の変化の定量化を含んだ。
上背部の1cm2の規定された面積の皮膚試料を、4%ホルマリン中で6時間固定し、パラフィンに包埋した。切片を5μmに切断し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。100倍の倍率で、光学顕微鏡(Nikon Eclipse 80i)にて捕らえられた画像を使用して、マウスあたり4つの部分で表皮ー真皮接合部と真皮―皮下脂肪接合部との間の距離を手動で測定することによって、H&E染色された切片について、真皮の厚さを定量化した。肺試料の右葉を同様に固定し、パラフィン包埋し、切片化し、続いてトリクローム及びSirius Redで染色した。組織学的読み出しは、Sirius Red染色切片(マウスあたり2つの切片)における全肺面積の割合としての染色(線維症)面積の評価、及び肺標本(マウスあたり4つの切片)における線維症の程度を決定するための数値尺度であるAshcroftスコアによる肺の変化の定量化を含んだ。
ヒドロキシプロリンの定量化
皮膚及び肺試料中のコラーゲンタンパク質の量を、ヒドロキシプロリンの定量化によって決定した。6M塩化水素に、120℃で3時間消化した後、試料のpHを6M水酸化ナトリウムで6に調整した。その後、0.06MクロラミンTを添加して、試料を室温で20分間インキュベートした。次に、3.15M過塩素酸及び20%p-ジメチルアミノベンズアルデヒドを添加し、試料を60℃で20分間インキュベートした。吸光度を、Spectra MAX 190マイクロプレート分光光度計にて557nmで決定した。I型コラーゲンを用いて作成した標準曲線を用いて、絶対値を決定した。
皮膚及び肺試料中のコラーゲンタンパク質の量を、ヒドロキシプロリンの定量化によって決定した。6M塩化水素に、120℃で3時間消化した後、試料のpHを6M水酸化ナトリウムで6に調整した。その後、0.06MクロラミンTを添加して、試料を室温で20分間インキュベートした。次に、3.15M過塩素酸及び20%p-ジメチルアミノベンズアルデヒドを添加し、試料を60℃で20分間インキュベートした。吸光度を、Spectra MAX 190マイクロプレート分光光度計にて557nmで決定した。I型コラーゲンを用いて作成した標準曲線を用いて、絶対値を決定した。
筋線維芽細胞の検出
α-SMA(平滑筋アクチン)についての筋線維芽細胞を、モノクローナル抗α-SMA抗体(クローン1A4)とのインキュベーションによって検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体及び3,3-ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)を用いて発現を可視化した。モノクローナルマウスIgG抗体を対照として使用した。αSMAについて染色された切片の画像を、光学顕微鏡(Nikon Eclipse 80i)で捕らえた。画像を、200倍の倍率で4つの異なる領域で手動で評価した。筋線維芽細胞は、真皮中の単一の紡錘形状のαSMA陽性細胞として定義された。
α-SMA(平滑筋アクチン)についての筋線維芽細胞を、モノクローナル抗α-SMA抗体(クローン1A4)とのインキュベーションによって検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体及び3,3-ジアミノベンジジン四塩酸塩(DAB)を用いて発現を可視化した。モノクローナルマウスIgG抗体を対照として使用した。αSMAについて染色された切片の画像を、光学顕微鏡(Nikon Eclipse 80i)で捕らえた。画像を、200倍の倍率で4つの異なる領域で手動で評価した。筋線維芽細胞は、真皮中の単一の紡錘形状のαSMA陽性細胞として定義された。
結果
同種異系移植は、同系移植と比較して、真皮の厚さ、筋線維芽細胞数、及びヒドロキシプロリン含有量の増加を伴う顕著な皮膚線維症を誘導した(図7A~C)。mCAN10で処置されたマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置された同種異系移植されたマウスと比較して、有意に減少した真皮肥厚(図7A)及び筋線維芽細胞数(図7B)、及びコラーゲン含有量の尺度であるヒドロキシプロリンの減少(図7C)を示した。これらのパラメーターに対するmCAN10の効果は、ニンテダニブで観察されたものの範囲内であった(図7A~C)。
同種異系骨髄移植は、Ashcroftスコア、Sirius Redによって染色された面積、及びヒドロキシプロリン含有量の増加を伴う中程度の肺線維症を誘導した(図8A~C)。mCAN10による処置は、アイソタイプ対照抗体で処置した同種異系移植されたマウスと比較して、Ashcroftスコア(図8A)、Sirius Red染色(図8B)、及びヒドロキシプロリン含有量(図8C)を有意に減少させた。これらのパラメーターに対するmCAN10の効果は、再びニンテダニブで観察されたものの範囲内であった(図8A~C)。
mCAN10は十分に許容され、臨床検査、倍検、又は組織学において毒性の徴候はなかった。追加的に、mCAN10での処置は、ニンテダニブよりも、効果的にscl cGvHD誘導性体重減少を改善した(図9)。
同種異系移植は、同系移植と比較して、真皮の厚さ、筋線維芽細胞数、及びヒドロキシプロリン含有量の増加を伴う顕著な皮膚線維症を誘導した(図7A~C)。mCAN10で処置されたマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置された同種異系移植されたマウスと比較して、有意に減少した真皮肥厚(図7A)及び筋線維芽細胞数(図7B)、及びコラーゲン含有量の尺度であるヒドロキシプロリンの減少(図7C)を示した。これらのパラメーターに対するmCAN10の効果は、ニンテダニブで観察されたものの範囲内であった(図7A~C)。
同種異系骨髄移植は、Ashcroftスコア、Sirius Redによって染色された面積、及びヒドロキシプロリン含有量の増加を伴う中程度の肺線維症を誘導した(図8A~C)。mCAN10による処置は、アイソタイプ対照抗体で処置した同種異系移植されたマウスと比較して、Ashcroftスコア(図8A)、Sirius Red染色(図8B)、及びヒドロキシプロリン含有量(図8C)を有意に減少させた。これらのパラメーターに対するmCAN10の効果は、再びニンテダニブで観察されたものの範囲内であった(図8A~C)。
mCAN10は十分に許容され、臨床検査、倍検、又は組織学において毒性の徴候はなかった。追加的に、mCAN10での処置は、ニンテダニブよりも、効果的にscl cGvHD誘導性体重減少を改善した(図9)。
結論
mCAN10によるIL1RAP遮断は、scl cGvHD誘導性真皮及び肺線維症を減少させるための効率的な戦略である。
mCAN10によるIL1RAP遮断は、scl cGvHD誘導性真皮及び肺線維症を減少させるための効率的な戦略である。
実施例8:マウスIL1RAPの特異的阻害剤であるマウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10は炎症プロセスに関連する遺伝子発現プロファイルを変化させる
目的
この試験の目的は、硬化皮膚慢性移植片対宿主病(scl cGvHD)のマウスモデルにおいて、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10を使用して、IL1RAP遮断によって影響を受ける分子経路を評価することである。目的はまたscl cGvHDマウスからの皮膚において、IL1RAP阻害によって影響を受ける疾患関連の異なって発現される遺伝子(DEG)を同定し、これらを全身硬化症(SSc)患者からの皮膚生検における疾患関連遺伝子と比較することである。
この試験の目的は、硬化皮膚慢性移植片対宿主病(scl cGvHD)のマウスモデルにおいて、マウス代用抗IL1RAP抗体mCAN10を使用して、IL1RAP遮断によって影響を受ける分子経路を評価することである。目的はまたscl cGvHDマウスからの皮膚において、IL1RAP阻害によって影響を受ける疾患関連の異なって発現される遺伝子(DEG)を同定し、これらを全身硬化症(SSc)患者からの皮膚生検における疾患関連遺伝子と比較することである。
材料及び方法
マウス試料
実施例7において報告されるように、mCAN10での処置を伴うか又は伴わない同系又は同種異系移植を受けたマウスから試料を得た。
マウス試料
実施例7において報告されるように、mCAN10での処置を伴うか又は伴わない同系又は同種異系移植を受けたマウスから試料を得た。
RNASeq前処理及び分析
RawペアエンドリードをGRCm39参照ゲノムに配列させ、マッピングされたリードをR(v4.1.1)においてRsubread(v2.6.4)を用いて数えた。主成分分析(PCA)を実施して、各バッチにおける試料間の潜在的な外れ値を決定した。PCAの後、3つの試料(条件につき1つ)を除外した。各群について、密な群特異的クラスタリングをもたらす4つの試料を選択した。DESeq2パッケージ(v1.32.0)を使用して、比の中央値の正規化及び異なる発現の分析を実施した。有意なDEGリストは、比較のために調整されたp値≦0.05及び|log2FC|≧1.5と考えられる。
SSc患者のトランスクリプトームプロファイルを、143人のSSc患者及び22人の健常な個体からなる北米SSc患者コホート(NCBI/GEO/GSE130955)から検索した。マウス及びヒト試料との間の比較、及び相互に発現される遺伝子の検出のために、ヒトオルソログを、rパッケージ「biomaRt」(v2.48.3)を使用してマウス遺伝子記号にマッピングした。
RawペアエンドリードをGRCm39参照ゲノムに配列させ、マッピングされたリードをR(v4.1.1)においてRsubread(v2.6.4)を用いて数えた。主成分分析(PCA)を実施して、各バッチにおける試料間の潜在的な外れ値を決定した。PCAの後、3つの試料(条件につき1つ)を除外した。各群について、密な群特異的クラスタリングをもたらす4つの試料を選択した。DESeq2パッケージ(v1.32.0)を使用して、比の中央値の正規化及び異なる発現の分析を実施した。有意なDEGリストは、比較のために調整されたp値≦0.05及び|log2FC|≧1.5と考えられる。
SSc患者のトランスクリプトームプロファイルを、143人のSSc患者及び22人の健常な個体からなる北米SSc患者コホート(NCBI/GEO/GSE130955)から検索した。マウス及びヒト試料との間の比較、及び相互に発現される遺伝子の検出のために、ヒトオルソログを、rパッケージ「biomaRt」(v2.48.3)を使用してマウス遺伝子記号にマッピングした。
処置応答シグネチャー
試料のサイズに起因して、遺伝子組み合わせ処置応答シグネチャーについての特徴の選択を、R統計パッケージを適用することによって、ロジスティック回帰モデリングを使用して行った。ロジスティック回帰モデルは、2つの群の間の分類(バイナリー結果システム:1[=例えば、処置]、0[=例えば、健常])を可能にし、ここで、段階的特徴の選択は、群分類のための最良の遺伝子セットの組み合わせを同定する。MASS及びROCRパッケージを使用して、赤池情報基準(AIC)及び曲線下面積(AUC)値に基づいて、遺伝子組み合わせモデルを選択した。AIC値は、統計的遺伝子組み合わせモデルが、使用される特徴の数を考慮してデータをどれほど良好に記載するかの品質指標である一方、AUCはモデル性能を記載する。
試料のサイズに起因して、遺伝子組み合わせ処置応答シグネチャーについての特徴の選択を、R統計パッケージを適用することによって、ロジスティック回帰モデリングを使用して行った。ロジスティック回帰モデルは、2つの群の間の分類(バイナリー結果システム:1[=例えば、処置]、0[=例えば、健常])を可能にし、ここで、段階的特徴の選択は、群分類のための最良の遺伝子セットの組み合わせを同定する。MASS及びROCRパッケージを使用して、赤池情報基準(AIC)及び曲線下面積(AUC)値に基づいて、遺伝子組み合わせモデルを選択した。AIC値は、統計的遺伝子組み合わせモデルが、使用される特徴の数を考慮してデータをどれほど良好に記載するかの品質指標である一方、AUCはモデル性能を記載する。
結果
RNASeqデータの分析は、同種異系移植マウス(Allo)、同系移植マウス(Syn)、及びmCAN10で処置された同種異系移植マウス(処置済)の間の分離を示し、そこで処置済群はSyn群に近い。Allo対Synとの間の比較は、2308DEG(1023上方調節、1285下方調節;調整p値≦0.05、|log2FC|≧1.5)を同定し、そこで、炎症及び線維症に関連するプロセス及び経路の調節解除が観察された。一方、処置済対Alloとの間の比較は、495DEG(398上方調節,106下方調節;調整p値≦0.05、|log2FC|≧1.5)を同定し、そこでmCAN10によるIL1RAP阻害によって炎症に関連するいくつかのプロセスの調節解除が観察された。興味深いことに、mCAN10は、プロフィールがAllo群よりもSyn群により類似するように、複数のIL-1ファミリー遺伝子の遺伝子発現を変化させた(図10)。
Allo DEG(Allo対Syn)、処置済DEG(処置済対Allo)及びSSc DEG(SSc対健常;以前に公開されたデータセットNCBI/GEO/GSE130955から検索された情報)間の重複の分析は、マウスモデル(Allo対Syn)及びヒトデータセット(SSc対健常)の間の449の重複遺伝子を同定した。これらのうち、177(39.4%)の遺伝子が、DEGの全ての3つの群の間で重複しており(図11)、そのうちの58の遺伝子(20が上方調節され、38が下方調節された;調整p値≦0.05及び|log2FC|≧0.25)が、処置済DEG及びSSc DEGとの間で相互に調節されている。
RNASeqデータの分析は、同種異系移植マウス(Allo)、同系移植マウス(Syn)、及びmCAN10で処置された同種異系移植マウス(処置済)の間の分離を示し、そこで処置済群はSyn群に近い。Allo対Synとの間の比較は、2308DEG(1023上方調節、1285下方調節;調整p値≦0.05、|log2FC|≧1.5)を同定し、そこで、炎症及び線維症に関連するプロセス及び経路の調節解除が観察された。一方、処置済対Alloとの間の比較は、495DEG(398上方調節,106下方調節;調整p値≦0.05、|log2FC|≧1.5)を同定し、そこでmCAN10によるIL1RAP阻害によって炎症に関連するいくつかのプロセスの調節解除が観察された。興味深いことに、mCAN10は、プロフィールがAllo群よりもSyn群により類似するように、複数のIL-1ファミリー遺伝子の遺伝子発現を変化させた(図10)。
Allo DEG(Allo対Syn)、処置済DEG(処置済対Allo)及びSSc DEG(SSc対健常;以前に公開されたデータセットNCBI/GEO/GSE130955から検索された情報)間の重複の分析は、マウスモデル(Allo対Syn)及びヒトデータセット(SSc対健常)の間の449の重複遺伝子を同定した。これらのうち、177(39.4%)の遺伝子が、DEGの全ての3つの群の間で重複しており(図11)、そのうちの58の遺伝子(20が上方調節され、38が下方調節された;調整p値≦0.05及び|log2FC|≧0.25)が、処置済DEG及びSSc DEGとの間で相互に調節されている。
結論
mCAN10は、scl GvHDマウスにおける炎症に関連するプロセス及び経路に影響を与え、これはこのモデルにおける疾患徴候に対するmCAN10の観察された効果を支持する。scl GvHDマウスにおいてmCAN10によって影響を受けるかなりの数の遺伝子が、健常対照と比較して、SSc患者において異なって発現し、IL1RAP阻害がヒト疾患にも影響を与える可能性があることが示唆された。
mCAN10は、scl GvHDマウスにおける炎症に関連するプロセス及び経路に影響を与え、これはこのモデルにおける疾患徴候に対するmCAN10の観察された効果を支持する。scl GvHDマウスにおいてmCAN10によって影響を受けるかなりの数の遺伝子が、健常対照と比較して、SSc患者において異なって発現し、IL1RAP阻害がヒト疾患にも影響を与える可能性があることが示唆された。
実施例9:抗IL1RAP抗体を産生するためのIL1RAPによる免疫化
目的
この実施例は、抗IL1RAP抗体が、IL1RAPで免疫化されたウサギからどのように単離されたかを例示する。
この実施例は、抗IL1RAP抗体が、IL1RAPで免疫化されたウサギからどのように単離されたかを例示する。
材料及び方法
ウサギを4回免疫化し、続いてヒト及びマウスIL1RAPの組換え発現された外部ドメインの混合物、注射あたり0.2mgの抗原を使用してブースターを行った。免疫化は、3週間毎後に肩甲骨下注射によって実施した。1回目の免疫化は、フロイント完全アジュバントで行い、2回目から4回目の免疫化は、フロイント不完全アジュバントで行った。ブースターのために、抗原量の半分をフロイント不完全アジュバントで肩甲骨下に注射し、他の半分を静脈中に注射した。
各動物の免疫応答を、3回目の免疫化の約10日後に、血清を用いてELISAによって測定した。特異的抗体力価をELISAによって測定し、免疫応答比較のためにプレートをヒト及びマウスIL1RAPで別々にコーティングした。4回目の免疫化の2~3週間後、動物に一度ブースターを行い、ブースターの4~5日後に脾臓を採取した。試験動物の脾臓をホモジナイズし、細胞凍結し、液体窒素中で保存した。
モノクローナル抗体配列を、Kivi et al.(Kivi G,HybriFree:a robust and rapid method for the development of monoclonal antibodies from different host species.BMC Biotechnology 16:2(2016))に記載されたアプローチを使用して免疫化ウサギから単離した。ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレートを、5μg/mlのビオチン化ヒト若しくはマウスIL1RAP又は両方の混合物でコーティングした。1万個の脾臓細胞を各パニングに使用した。合計48回のパニング反応を実施した。45分間インキュベートした後、ウェルをPBSで洗浄し、非結合細胞を除去した。RNAを結合細胞から単離し、VH及びVL cDNAを合成し、ヒトIgG発現プラスミド形式でのコンビナトリアルVH-VLライブラリーの構築に使用した。プラスミドDNAを精製し、キメラウサギ/ヒトIgG1プールの産生のためにCHO細胞にトランスフェクトした。抗体プールの上澄を、トランスフェクションの48時間後にELISAを使用して分析し、陽性プールを同定した。陽性プールからのプラスミドDNAを含む細菌を、LBーアンピシリン固体培地上にプレーティングし、単一コロニーを単離し、液体培地中で成長させた。プラスミドDNAを液体培養物から精製し、一過性抗体産生のためにCHO細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48~72時間後に上澄をELISAによって分析した。
ウサギを4回免疫化し、続いてヒト及びマウスIL1RAPの組換え発現された外部ドメインの混合物、注射あたり0.2mgの抗原を使用してブースターを行った。免疫化は、3週間毎後に肩甲骨下注射によって実施した。1回目の免疫化は、フロイント完全アジュバントで行い、2回目から4回目の免疫化は、フロイント不完全アジュバントで行った。ブースターのために、抗原量の半分をフロイント不完全アジュバントで肩甲骨下に注射し、他の半分を静脈中に注射した。
各動物の免疫応答を、3回目の免疫化の約10日後に、血清を用いてELISAによって測定した。特異的抗体力価をELISAによって測定し、免疫応答比較のためにプレートをヒト及びマウスIL1RAPで別々にコーティングした。4回目の免疫化の2~3週間後、動物に一度ブースターを行い、ブースターの4~5日後に脾臓を採取した。試験動物の脾臓をホモジナイズし、細胞凍結し、液体窒素中で保存した。
モノクローナル抗体配列を、Kivi et al.(Kivi G,HybriFree:a robust and rapid method for the development of monoclonal antibodies from different host species.BMC Biotechnology 16:2(2016))に記載されたアプローチを使用して免疫化ウサギから単離した。ストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレートを、5μg/mlのビオチン化ヒト若しくはマウスIL1RAP又は両方の混合物でコーティングした。1万個の脾臓細胞を各パニングに使用した。合計48回のパニング反応を実施した。45分間インキュベートした後、ウェルをPBSで洗浄し、非結合細胞を除去した。RNAを結合細胞から単離し、VH及びVL cDNAを合成し、ヒトIgG発現プラスミド形式でのコンビナトリアルVH-VLライブラリーの構築に使用した。プラスミドDNAを精製し、キメラウサギ/ヒトIgG1プールの産生のためにCHO細胞にトランスフェクトした。抗体プールの上澄を、トランスフェクションの48時間後にELISAを使用して分析し、陽性プールを同定した。陽性プールからのプラスミドDNAを含む細菌を、LBーアンピシリン固体培地上にプレーティングし、単一コロニーを単離し、液体培地中で成長させた。プラスミドDNAを液体培養物から精製し、一過性抗体産生のためにCHO細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48~72時間後に上澄をELISAによって分析した。
結果
ヒト及び/又はマウスIL1RAPに結合する抗体を同定した。キメラウサギ/ヒトIgG1 ELISA IL1RAP陽性クローンを、シーケンシングによってさらに分析した。キメラ抗体を、例えばIL-1、IL-33又はIL-36シグナル伝達を阻害する能力などのそれらの特性についてさらに分析した。キメラ抗体48D2を、更なる特徴付け及び最適化のために選択した(以下の実施例を参照)。この抗体の軽鎖可変領域は、配列番号:19のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。この抗体の重鎖可変領域は、配列番号:20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む。抗体全体を作製するために、可変領域を、配列番号:35のアミノ酸配列を含むか又は,それからなる軽鎖定常領域、及び配列番号:36又は配列番号:2のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるIgG1重鎖定常領域と組み合わせた。
ヒト及び/又はマウスIL1RAPに結合する抗体を同定した。キメラウサギ/ヒトIgG1 ELISA IL1RAP陽性クローンを、シーケンシングによってさらに分析した。キメラ抗体を、例えばIL-1、IL-33又はIL-36シグナル伝達を阻害する能力などのそれらの特性についてさらに分析した。キメラ抗体48D2を、更なる特徴付け及び最適化のために選択した(以下の実施例を参照)。この抗体の軽鎖可変領域は、配列番号:19のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。この抗体の重鎖可変領域は、配列番号:20のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む。抗体全体を作製するために、可変領域を、配列番号:35のアミノ酸配列を含むか又は,それからなる軽鎖定常領域、及び配列番号:36又は配列番号:2のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるIgG1重鎖定常領域と組み合わせた。
結論
IL1RAPに対するモノクローナルキメラウサギ/ヒトIgG1抗体を単離した。
IL1RAPに対するモノクローナルキメラウサギ/ヒトIgG1抗体を単離した。
実施例10:IL1RAPに結合し、IL-1、IL-33、及びIL-36シグナル伝達を遮断する抗体の同定及び特徴付け
目的
この実施例は、実施例9に記載されるように生成された選択された抗体である48D2キメラ(ch)ウサギ/ヒト抗ヒトIL1RAPの特徴付けを例示する。ゴールは、カニクイザル及びヒトIL1RAPの両方に対して高い親和性を有し、全てのIL1RAP調節シグナル伝達経路を完全に遮断する抗体を同定することであった。
この実施例は、実施例9に記載されるように生成された選択された抗体である48D2キメラ(ch)ウサギ/ヒト抗ヒトIL1RAPの特徴付けを例示する。ゴールは、カニクイザル及びヒトIL1RAPの両方に対して高い親和性を有し、全てのIL1RAP調節シグナル伝達経路を完全に遮断する抗体を同定することであった。
材料及び方法
IL1RAP発現細胞への抗体の結合
細胞表面上に、IL1RAPを発現する悪性黒色腫(又は悪性(malign)メラノーマ)細胞株SKMEL-5を分析に使用した。SKMEL-5細胞を、標準的な手順に従い培養した。5x104のSKMEL-5細胞を、ヒトFcブロックでブロックし、次いで、キメラ48D2又はアイソタイプ対照抗体の8段階連続希釈物(100μg/ml~0.03μg/ml)で染色した。Alexa488結合抗ヒトIgG抗体を用いた2次染色後、10000細胞/試料をCytoFlex(Beckman Coulter)で分析した。低いレベルの表面IL1RAPを発現するHTB183細胞を、陰性対照として使用した。
IL1RAP発現細胞への抗体の結合
細胞表面上に、IL1RAPを発現する悪性黒色腫(又は悪性(malign)メラノーマ)細胞株SKMEL-5を分析に使用した。SKMEL-5細胞を、標準的な手順に従い培養した。5x104のSKMEL-5細胞を、ヒトFcブロックでブロックし、次いで、キメラ48D2又はアイソタイプ対照抗体の8段階連続希釈物(100μg/ml~0.03μg/ml)で染色した。Alexa488結合抗ヒトIgG抗体を用いた2次染色後、10000細胞/試料をCytoFlex(Beckman Coulter)で分析した。低いレベルの表面IL1RAPを発現するHTB183細胞を、陰性対照として使用した。
サイトカインシグナル伝達の阻害
IL-1及びIL-33阻害の分析のために、HEK-Blue(商標)(IL-33/IL-1)細胞を提供されたように使用した。IL-36分析のために、HEK-Blue(商標)(IL-33/IL-1)細胞を、アッセイの前日にIL-36受容体で一過性にトランスフェクトしたか、又はIL-36受容体を安定に発現するHEK-Blue(商標)クローン(社内で作製)を使用した。簡潔には、HEK-Blue(商標)細胞を384ウェルプレートに播種し、継続する前に最低2時間落ち着かせた。次いで、サイトカインを追加する前に、細胞を濃度を増加させたキメラ48D2に暴露し(図に示されるように)、37℃で、5%のCO2で1時間インキュベーションした。サイトカインを以下の濃度で添加した:2ng/mlのIL-1α、0.1ng/mlのIL-1β、0.2ng/mlのIL-33、1ng/mlのIL-36α、3ng/mlのIL-36β、及び0.2ng/mlのIL-36γ。細胞を37℃、5%のCO2で16~18時間培養し、次いで、NF-κBの活性化及びその後のSEAPの産生についてQUANTI-Blue(商標)溶液を用いて分析し、SpectraMax i3x分光光度計を使用して620nmで測定した。
IL-1及びIL-33阻害の分析のために、HEK-Blue(商標)(IL-33/IL-1)細胞を提供されたように使用した。IL-36分析のために、HEK-Blue(商標)(IL-33/IL-1)細胞を、アッセイの前日にIL-36受容体で一過性にトランスフェクトしたか、又はIL-36受容体を安定に発現するHEK-Blue(商標)クローン(社内で作製)を使用した。簡潔には、HEK-Blue(商標)細胞を384ウェルプレートに播種し、継続する前に最低2時間落ち着かせた。次いで、サイトカインを追加する前に、細胞を濃度を増加させたキメラ48D2に暴露し(図に示されるように)、37℃で、5%のCO2で1時間インキュベーションした。サイトカインを以下の濃度で添加した:2ng/mlのIL-1α、0.1ng/mlのIL-1β、0.2ng/mlのIL-33、1ng/mlのIL-36α、3ng/mlのIL-36β、及び0.2ng/mlのIL-36γ。細胞を37℃、5%のCO2で16~18時間培養し、次いで、NF-κBの活性化及びその後のSEAPの産生についてQUANTI-Blue(商標)溶液を用いて分析し、SpectraMax i3x分光光度計を使用して620nmで測定した。
キメラ48D2の発現及び精製
キメラ48D2をCHO細胞中で一過性に発現させた。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて精製を行った。
キメラ48D2をCHO細胞中で一過性に発現させた。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて精製を行った。
バイオレイヤー干渉法による親和性測定
親和性測定は、Molecular DevicesのBLItz Pro 1.3.1.3ソフトウェアのBasic Kinetics Moduleを用いて、ForteBioのBLItz(商標)標識なしタンパク質分析システムによって行った。プロテインAバイオセンサーをブロッキング緩衝液(PBS、0.5%BSA,0.05%Tween20、pH7.4)にてコーティング前に最低10分間室温で中和させた。200μlの抗体溶液(ブロッキング緩衝液中10μg/ml)に室温でバイオセンサーを30分間浸漬することによって、プロテインAバイオセンサーをコーティングした。次いで、センサーを使用前に200μlのブロッキング緩衝液にて少なくとも10分間インキュベートした。各抗体を、ブロッキング緩衝液中のhIL1RAP(21-367)の4つの異なる濃度で分析した;0.8nM(0.032μg/ml)、4nM(0.16μg/ml)、20nM(0.8μg/ml)及び100nM(4μg/ml)。ベースラインは、30秒の継続時間でブロッキング緩衝液において作製した。hIL1RAP中で120秒会合させた後、ブロッキング緩衝液中で120秒間解離させた。
親和性測定は、Molecular DevicesのBLItz Pro 1.3.1.3ソフトウェアのBasic Kinetics Moduleを用いて、ForteBioのBLItz(商標)標識なしタンパク質分析システムによって行った。プロテインAバイオセンサーをブロッキング緩衝液(PBS、0.5%BSA,0.05%Tween20、pH7.4)にてコーティング前に最低10分間室温で中和させた。200μlの抗体溶液(ブロッキング緩衝液中10μg/ml)に室温でバイオセンサーを30分間浸漬することによって、プロテインAバイオセンサーをコーティングした。次いで、センサーを使用前に200μlのブロッキング緩衝液にて少なくとも10分間インキュベートした。各抗体を、ブロッキング緩衝液中のhIL1RAP(21-367)の4つの異なる濃度で分析した;0.8nM(0.032μg/ml)、4nM(0.16μg/ml)、20nM(0.8μg/ml)及び100nM(4μg/ml)。ベースラインは、30秒の継続時間でブロッキング緩衝液において作製した。hIL1RAP中で120秒会合させた後、ブロッキング緩衝液中で120秒間解離させた。
ドメインマッピング
IL1RAP外部ドメインは、3つのドメイン(ドメイン1、ドメイン2、ドメイン3)からなる。48D2が、IL1RAPに結合する場所を理解するために、異なるドメインに対応する一連のIL1RAP構成物を生成し、これらへの結合を、二重試料を使用して、間接ELISAアッセイにおいて試験した。Uniprot、ID Q9NPH3に示されるIL1RAPのアミノ酸配列を用いて構成物を作製した。マイクロタイタープレートを、0.01M PBS、pH7.4で希釈した、100ngの組み換えhIL1RAPドメイン1+2+3(ドメイン1、ドメイン2、及びドメイン3から構成される)(aa21-367)(陽性対照)、組み換えhIL1RAPドメイン1+2(ドメイン1及びドメイン2から構成される)(aa21-234)、又はドメイン1(aa21-134)、又は組み換えhIL1RAPドメイン3(aa235-367)、(100μl/ウェル)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液(0.01M PBS、0.05%Tween20、pH7.4)で洗浄した後、150μl/ウェルのELISAブロッキング溶液(PBS、0.5%BSA、0.05%Tween20、pH7.4)を使用してブロッキング工程を行った。撹拌しながら1時間室温でインキュベートした後、プレートを再びELISA洗浄緩衝液を用いて洗浄した。ELISAブロッキング溶液中の一連の48D2希釈物を調製し(1~10000ng/mlの範囲)、その後100μl/ウェルでウェルに移した。プレートを撹拌しながら1時間室温でインキュベートし、その後ELISA洗浄溶液で洗浄した。100μl/ウェルのアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトIgGを添加し、撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。ELISA洗浄溶液を用いてプレートを洗浄した後、基質(4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物、Sigma-Aldrich、1mg/ml)を100μl/ウェルで添加した。その後、プレートを撹拌しながら室温でインキュベートし、405nmでの吸光度を30分間連続して測定した。0分での吸光度をバックグランドシグナルとした。ポリクローナル抗hIL1RAP抗体KMT-1を対照として使用した。
IL1RAP外部ドメインは、3つのドメイン(ドメイン1、ドメイン2、ドメイン3)からなる。48D2が、IL1RAPに結合する場所を理解するために、異なるドメインに対応する一連のIL1RAP構成物を生成し、これらへの結合を、二重試料を使用して、間接ELISAアッセイにおいて試験した。Uniprot、ID Q9NPH3に示されるIL1RAPのアミノ酸配列を用いて構成物を作製した。マイクロタイタープレートを、0.01M PBS、pH7.4で希釈した、100ngの組み換えhIL1RAPドメイン1+2+3(ドメイン1、ドメイン2、及びドメイン3から構成される)(aa21-367)(陽性対照)、組み換えhIL1RAPドメイン1+2(ドメイン1及びドメイン2から構成される)(aa21-234)、又はドメイン1(aa21-134)、又は組み換えhIL1RAPドメイン3(aa235-367)、(100μl/ウェル)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液(0.01M PBS、0.05%Tween20、pH7.4)で洗浄した後、150μl/ウェルのELISAブロッキング溶液(PBS、0.5%BSA、0.05%Tween20、pH7.4)を使用してブロッキング工程を行った。撹拌しながら1時間室温でインキュベートした後、プレートを再びELISA洗浄緩衝液を用いて洗浄した。ELISAブロッキング溶液中の一連の48D2希釈物を調製し(1~10000ng/mlの範囲)、その後100μl/ウェルでウェルに移した。プレートを撹拌しながら1時間室温でインキュベートし、その後ELISA洗浄溶液で洗浄した。100μl/ウェルのアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトIgGを添加し、撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。ELISA洗浄溶液を用いてプレートを洗浄した後、基質(4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物、Sigma-Aldrich、1mg/ml)を100μl/ウェルで添加した。その後、プレートを撹拌しながら室温でインキュベートし、405nmでの吸光度を30分間連続して測定した。0分での吸光度をバックグランドシグナルとした。ポリクローナル抗hIL1RAP抗体KMT-1を対照として使用した。
エピトープマッピング
ドメインマッピング及び交差反応性データに基づいて、IL1RAPのドメイン2における2つの領域が、48D2の潜在的な相互作用部分として同定され(ヒト化及び脱免疫化48D2バリアントVH5.GL:VL4(実施例13を参照))、aa 141-157(H1として指定される)及び174-191(H2として指定される)に対応した(Uniprot、ID Q9NPH3からのヒトIL1RAPアミノ酸配列に基づく)。関心の2つの領域のヒト配列がマウスIL1RAPに移植された、マウス/ヒトIL1RAPの2つのキメラ構成物を作製した:キメラIL1RAP.H1及びキメラIL1RAP.H2。マイクロタイタープレートをキメラIL1RAP構成物でコーティングし、ドメインマッピングについて上述したようにELISA測定を実施した。ポリクローナル抗hIL1RAP抗体KMT-2(ヒトIL1RAPに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体)及びKMT-3(マウスIL1RAPに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体)を陽性対照とした。
ドメインマッピング及び交差反応性データに基づいて、IL1RAPのドメイン2における2つの領域が、48D2の潜在的な相互作用部分として同定され(ヒト化及び脱免疫化48D2バリアントVH5.GL:VL4(実施例13を参照))、aa 141-157(H1として指定される)及び174-191(H2として指定される)に対応した(Uniprot、ID Q9NPH3からのヒトIL1RAPアミノ酸配列に基づく)。関心の2つの領域のヒト配列がマウスIL1RAPに移植された、マウス/ヒトIL1RAPの2つのキメラ構成物を作製した:キメラIL1RAP.H1及びキメラIL1RAP.H2。マイクロタイタープレートをキメラIL1RAP構成物でコーティングし、ドメインマッピングについて上述したようにELISA測定を実施した。ポリクローナル抗hIL1RAP抗体KMT-2(ヒトIL1RAPに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体)及びKMT-3(マウスIL1RAPに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体)を陽性対照とした。
交差反応性
マイクロタイタープレートウェルを、IL1RAPオルソログ(Mus musculus、Rattus norvegicus、Macaca fascicularis(Mf、カニクイザルと同義)、Oryctolagus cuniculus、Canis lupus familiaris、Sus scrofa)でコーティングし、37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いてブロッキング工程を行った。撹拌しながら室温で1時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄した。抗体を、ELISAブロッキング溶液にて、4000ng/ml~0.24ng/mlの範囲の、4倍連続希釈で希釈し、その後ELISAプレートに移した。プレートを撹拌しながら37℃で30分間インキュベートし、次いで洗浄した。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒト抗体を添加し、撹拌しながら30分間37℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、続いて基質(4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物)を添加した。その後、プレートを撹拌しながら室温でインキュベートし、405nmでの吸光度を50分間連続して測定した。0分での吸光度をバックグランドシグナルとした。
マイクロタイタープレートウェルを、IL1RAPオルソログ(Mus musculus、Rattus norvegicus、Macaca fascicularis(Mf、カニクイザルと同義)、Oryctolagus cuniculus、Canis lupus familiaris、Sus scrofa)でコーティングし、37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いてブロッキング工程を行った。撹拌しながら室温で1時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄した。抗体を、ELISAブロッキング溶液にて、4000ng/ml~0.24ng/mlの範囲の、4倍連続希釈で希釈し、その後ELISAプレートに移した。プレートを撹拌しながら37℃で30分間インキュベートし、次いで洗浄した。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒト抗体を添加し、撹拌しながら30分間37℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、続いて基質(4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物)を添加した。その後、プレートを撹拌しながら室温でインキュベートし、405nmでの吸光度を50分間連続して測定した。0分での吸光度をバックグランドシグナルとした。
結果
IL1RAP発現細胞への抗体の結合
キメラ48D2又はアイソタイプ対照で染色されたIL1RAP発現SKMEL-5細胞のフローサイトメトリー分析は、アイソタイプ対照抗体と比較して、48D2についてより高い平均蛍光強度(MFI)を明らかにした(図12)。48D2及びアイソタイプ対照を濃度を増加させて細胞に添加する。IL1RAPの低い表面発現を有するHTB183細胞への結合は観察されなかった(データは示さない)。
IL1RAP発現細胞への抗体の結合
キメラ48D2又はアイソタイプ対照で染色されたIL1RAP発現SKMEL-5細胞のフローサイトメトリー分析は、アイソタイプ対照抗体と比較して、48D2についてより高い平均蛍光強度(MFI)を明らかにした(図12)。48D2及びアイソタイプ対照を濃度を増加させて細胞に添加する。IL1RAPの低い表面発現を有するHTB183細胞への結合は観察されなかった(データは示さない)。
サイトカインシグナル伝達の阻害
図13は、HEK細胞におけるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達に対するch48D2の阻害活性を示す。抗体を濃度を増加させて添加し、その後、示されたサイトカインを一定濃度で添加した。グラフは、620nmでの光学密度(OD)を示し、高いODはサイトカイン受容体の下流のシグナル伝達を示す。キメラ抗体48D2は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達の顕著な阻害、これらのサイトカインシグナル伝達の完全な阻害(遮断)まで、を誘導した。IC50値を表3に示す。
図13は、HEK細胞におけるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達に対するch48D2の阻害活性を示す。抗体を濃度を増加させて添加し、その後、示されたサイトカインを一定濃度で添加した。グラフは、620nmでの光学密度(OD)を示し、高いODはサイトカイン受容体の下流のシグナル伝達を示す。キメラ抗体48D2は、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達の顕著な阻害、これらのサイトカインシグナル伝達の完全な阻害(遮断)まで、を誘導した。IC50値を表3に示す。
親和性測定
キメラ48D2、及びヒト化48D2バリアントVH5:VL4(実施例11を参照)、ヒト化並びに脱免疫化48D2バリアントVH5.GL:VL4(実施例13)についての親和性測定結果が表4に示される。kaは、標的への抗体結合の特徴付けのための会合速度定数であり、kdは、標的からの抗体解離の特徴付けのための解離速度定数であり、そしてKDは抗体とその抗原との間の平衡解離定数であり、kd/kaの比である。KDは、抗原結合部分の50%が平衡状態で占められる抗体濃度に相当する。KD値が低いほど(濃度が低いほど)、親和性は高い。
48D2バリアントは、ヒト(h)IL1RAPへの速い結合及び遅い解離を示し、nM範囲の親和性をもたらした。キメラ48D2と比較して、ヒト化、又はヒト化及び脱免疫化バリアントについて、ヒトIL1RAPに対する親和性の損失は見られなかった。
キメラ48D2、及びヒト化48D2バリアントVH5:VL4(実施例11を参照)、ヒト化並びに脱免疫化48D2バリアントVH5.GL:VL4(実施例13)についての親和性測定結果が表4に示される。kaは、標的への抗体結合の特徴付けのための会合速度定数であり、kdは、標的からの抗体解離の特徴付けのための解離速度定数であり、そしてKDは抗体とその抗原との間の平衡解離定数であり、kd/kaの比である。KDは、抗原結合部分の50%が平衡状態で占められる抗体濃度に相当する。KD値が低いほど(濃度が低いほど)、親和性は高い。
48D2バリアントは、ヒト(h)IL1RAPへの速い結合及び遅い解離を示し、nM範囲の親和性をもたらした。キメラ48D2と比較して、ヒト化、又はヒト化及び脱免疫化バリアントについて、ヒトIL1RAPに対する親和性の損失は見られなかった。
ドメインマッピング
ドメインマッピングデータを以下の表5に要約する。対照ポリクローナル抗体KMT-1は全てのドメインに結合したが、48D2はドメイン2を含むIL1RAP構成物にのみ結合し、抗体はこのドメインに結合することを示唆した。
ドメインマッピングデータを以下の表5に要約する。対照ポリクローナル抗体KMT-1は全てのドメインに結合したが、48D2はドメイン2を含むIL1RAP構成物にのみ結合し、抗体はこのドメインに結合することを示唆した。
エピトープマッピング
領域H1及びH2についての移植されたヒト配列を有するマウスIL1RAPを用いたエピトープマッピング結果を表6に示す。マウスIL1RAPへのh48D2 VH5.GL:VL4(実施例13を参照)の結合は、H2領域のヒト配列がマウスIL1RAPに導入された場合に回復し、H2が48D2との相互作用に関与することを示唆する(表5及び6の比較)。陽性対照ポリクローナル抗体KMT-2及びKMT-3は、IL1RAPの両方のキメラバージョンに結合した。
領域H1及びH2についての移植されたヒト配列を有するマウスIL1RAPを用いたエピトープマッピング結果を表6に示す。マウスIL1RAPへのh48D2 VH5.GL:VL4(実施例13を参照)の結合は、H2領域のヒト配列がマウスIL1RAPに導入された場合に回復し、H2が48D2との相互作用に関与することを示唆する(表5及び6の比較)。陽性対照ポリクローナル抗体KMT-2及びKMT-3は、IL1RAPの両方のキメラバージョンに結合した。
交差反応性
図14は、異なる種からのIL1RAPに対するキメラ48D2の交差反応性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、405nmの吸光度を使用してIL1RAPオルソログへの抗体の結合を検出する。48D2は、ヒト、カニクイザル(cyno)、及びブタ由来のIL1RAPに対して交差反応性であるが、マウス、ラット、ウサギ、又はイヌ由来のIL1RAPに対しては交差反応性はない(図14及び表7)。
図14は、異なる種からのIL1RAPに対するキメラ48D2の交差反応性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、405nmの吸光度を使用してIL1RAPオルソログへの抗体の結合を検出する。48D2は、ヒト、カニクイザル(cyno)、及びブタ由来のIL1RAPに対して交差反応性であるが、マウス、ラット、ウサギ、又はイヌ由来のIL1RAPに対しては交差反応性はない(図14及び表7)。
結論
キメラ48D2は、hIL1RAPのドメイン2に結合することが見出され、カニクイザル及びヒトIL1RAPの両方に対して高い親和性を有し、細胞膜上のIL1RAPに選択的に結合し、そしてIL-1α、IL-1β、IL-33,、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達を完全に阻害し、よって、ヒト化のために選択された。キメラ48D2は、実施例9に記載されるように、生成された他の抗体よりも優れた特性を示した。
キメラ48D2は、hIL1RAPのドメイン2に結合することが見出され、カニクイザル及びヒトIL1RAPの両方に対して高い親和性を有し、細胞膜上のIL1RAPに選択的に結合し、そしてIL-1α、IL-1β、IL-33,、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナル伝達を完全に阻害し、よって、ヒト化のために選択された。キメラ48D2は、実施例9に記載されるように、生成された他の抗体よりも優れた特性を示した。
実施例11:キメラ48D2のヒト化
目的
この実施例は、どのようにして48D2のヒト化バリアントを得たかを例示する。
この実施例は、どのようにして48D2のヒト化バリアントを得たかを例示する。
材料及び方法
In-silico(インシリコ)ヒト化
48D2の抗体軽及び重鎖可変領域の配列を、成熟ヒト抗体配列及びヒト生殖系列配列を含むデータベースに対して検索した。CDRは、IMGT及びKabatの番号付けシステムに従って定義され、そしてアミノ酸残基は、両方の組み合わせとして含まれた(配列番号1並びに3~18及び、KASの配列を有するCDR-L2を参照)。
ヒト化のための受容体フレームワークの選択は、配列相同性及びソフトウェアツールMaestroを用いて作製されたその後のアブイニシオ構造予測に基づいた。フレームワークは、重要な構造フレームワーク残基を維持するように選択された。VL及びVHについてそれぞれ5つの配列を得て、25の異なるヒト化抗体バリアントを作製し、さらに特徴付けた(VH1~VH5と組み合わせるためのVL1~VL5)。ヒト生殖系列抗体配列に基づく受容体フレームワークについては、抗体の構造及び機能を確実にするために、逆変異を導入した。ヒト化の一部はまた、免疫原性(MHCクラスII結合親和性)及び製造可能性の予測であった。MHCクラスII結合親和性予測を、NetMHCIIサーバーを使用して行った。
In-silico(インシリコ)ヒト化
48D2の抗体軽及び重鎖可変領域の配列を、成熟ヒト抗体配列及びヒト生殖系列配列を含むデータベースに対して検索した。CDRは、IMGT及びKabatの番号付けシステムに従って定義され、そしてアミノ酸残基は、両方の組み合わせとして含まれた(配列番号1並びに3~18及び、KASの配列を有するCDR-L2を参照)。
ヒト化のための受容体フレームワークの選択は、配列相同性及びソフトウェアツールMaestroを用いて作製されたその後のアブイニシオ構造予測に基づいた。フレームワークは、重要な構造フレームワーク残基を維持するように選択された。VL及びVHについてそれぞれ5つの配列を得て、25の異なるヒト化抗体バリアントを作製し、さらに特徴付けた(VH1~VH5と組み合わせるためのVL1~VL5)。ヒト生殖系列抗体配列に基づく受容体フレームワークについては、抗体の構造及び機能を確実にするために、逆変異を導入した。ヒト化の一部はまた、免疫原性(MHCクラスII結合親和性)及び製造可能性の予測であった。MHCクラスII結合親和性予測を、NetMHCIIサーバーを使用して行った。
結果
VLの5つのインシリコヒト化バリアント及びVHの5つを作製し、WHOのヒト化抗体の定義に従って、ヒト化されていることを確認した。潜在的なMHCクラスII結合親和性を有する配列の導入を回避するために、免疫原性を評価した。脱アミド化、異性化、又は断片化を受けやすいグリコシル化モチーフ又は配列の導入を回避するために、製造可能性を評価した。配列を表8に示す。
VLの5つのインシリコヒト化バリアント及びVHの5つを作製し、WHOのヒト化抗体の定義に従って、ヒト化されていることを確認した。潜在的なMHCクラスII結合親和性を有する配列の導入を回避するために、免疫原性を評価した。脱アミド化、異性化、又は断片化を受けやすいグリコシル化モチーフ又は配列の導入を回避するために、製造可能性を評価した。配列を表8に示す。
結論
VLの5つのインシリコヒト化バリアント及びVHの5つを作製し、25のヒト化抗体バリアントの産生及び特徴付けのために、IgG1定常ドメインでインフレームで合成することとした(実施例12)。
VLの5つのインシリコヒト化バリアント及びVHの5つを作製し、25のヒト化抗体バリアントの産生及び特徴付けのために、IgG1定常ドメインでインフレームで合成することとした(実施例12)。
実施例12:ヒト化48D2の特性
目的
本実施例は、親和性、サイトカイン阻害、及び最適化された生化学的特性を保持するヒト化抗体を見出すことを目的として、どのようにヒト化48D2バリアント(実施例11参照)が発現され、特性づけられたかを説明する。
本実施例は、親和性、サイトカイン阻害、及び最適化された生化学的特性を保持するヒト化抗体を見出すことを目的として、どのようにヒト化48D2バリアント(実施例11参照)が発現され、特性づけられたかを説明する。
材料及び方法
ヒト化バリアントの発現、精製、及び特性
48D2のヒト化バリアント25種(表8参照)の重及び軽可変ドメインを、ヒト定常ドメインを含むベクターにサブクローニングした:
-カッパ定常ドメイン(Km3アロタイプ)は、軽鎖(配列番号:35)全体を形成するVLドメインと結合される。
-IgG1za(zaアロタイプ)の重鎖定常ドメインは、VHドメインと結合して重鎖全体を形成する。Fc-γ-受容体を介する抗体エフェクター機能を回避するために、重鎖定常ドメインはまた、LALA変異(配列番号:2)(例えば、Xu et al.,2000,Cell.Immuno.200:16-26に記載されるものに対応する)を含む。
ヒト化抗体(h48D2)をHEK-293細胞で一過性に発現させ、50ml培養の収穫培地からプロテインAを精製し、PBS pH7.4に緩衝液交換を行った。
抗体は、A)結合(ELISA分析、ヒト及びカニクイザルIL1RAP)、B)サイトカインシグナルの阻害(HEK-Blue(商標)アッセイ)、C)親和性(バイオレイヤー干渉計)、D)サイズ不均質(SE-HPLC)、及びE)収量(濃度、A280)についての特性を示した。結合ELISAは、コーティング試薬として組換えhIL1RAP aa21-367又は組換えmfIL1RAP aa21-367を用いて、実施例10のドメインマッピングについて示した間接ELISAと同様の方法で実施した。SE-HPLCは、標準的な手順で、ランニング緩衝液としてPBSを使用して実施した。親和性及びサイトカイン阻害は、実施例10に先に記載したように測定した。25個のヒト化クローンすべてをIL-1α、IL-1β、及びIL-33シグナルに対する遮断活性について解析し、キメラ48D2と同様の阻害活性を保持したクローンのみをIL-36阻害について解析した。
ヒト化バリアントの発現、精製、及び特性
48D2のヒト化バリアント25種(表8参照)の重及び軽可変ドメインを、ヒト定常ドメインを含むベクターにサブクローニングした:
-カッパ定常ドメイン(Km3アロタイプ)は、軽鎖(配列番号:35)全体を形成するVLドメインと結合される。
-IgG1za(zaアロタイプ)の重鎖定常ドメインは、VHドメインと結合して重鎖全体を形成する。Fc-γ-受容体を介する抗体エフェクター機能を回避するために、重鎖定常ドメインはまた、LALA変異(配列番号:2)(例えば、Xu et al.,2000,Cell.Immuno.200:16-26に記載されるものに対応する)を含む。
ヒト化抗体(h48D2)をHEK-293細胞で一過性に発現させ、50ml培養の収穫培地からプロテインAを精製し、PBS pH7.4に緩衝液交換を行った。
抗体は、A)結合(ELISA分析、ヒト及びカニクイザルIL1RAP)、B)サイトカインシグナルの阻害(HEK-Blue(商標)アッセイ)、C)親和性(バイオレイヤー干渉計)、D)サイズ不均質(SE-HPLC)、及びE)収量(濃度、A280)についての特性を示した。結合ELISAは、コーティング試薬として組換えhIL1RAP aa21-367又は組換えmfIL1RAP aa21-367を用いて、実施例10のドメインマッピングについて示した間接ELISAと同様の方法で実施した。SE-HPLCは、標準的な手順で、ランニング緩衝液としてPBSを使用して実施した。親和性及びサイトカイン阻害は、実施例10に先に記載したように測定した。25個のヒト化クローンすべてをIL-1α、IL-1β、及びIL-33シグナルに対する遮断活性について解析し、キメラ48D2と同様の阻害活性を保持したクローンのみをIL-36阻害について解析した。
結果
A)ヒト化抗体クローンのIL1RAPへの結合(ELISA法)
ELISA測定で得られたIC50値を表9に示す。結合ELISAを使用すると、異なるクローン間で結合のわずかな違いしか見ることができない。また、各クローンとも、ヒトとカニクイザル(cyno)のIL1RAPに対する結合親和性は同様であった。
A)ヒト化抗体クローンのIL1RAPへの結合(ELISA法)
ELISA測定で得られたIC50値を表9に示す。結合ELISAを使用すると、異なるクローン間で結合のわずかな違いしか見ることができない。また、各クローンとも、ヒトとカニクイザル(cyno)のIL1RAPに対する結合親和性は同様であった。
B)サイトカインシグナル伝達の阻害
図15A-Oは、HEK細胞におけるIL-1α、IL-1β、及びIL-33シグナル伝達に対するヒト化48D2抗体クローンの阻害活性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、その後、描かれたサイトカインを一定濃度で添加する。グラフは、620nmでの光学密度(OD)を示し、高いODはサイトカイン受容体の下流のシグナル伝達を示す。VH5バリアントを保有する抗体クローンは、キメラ48D2抗体と同様の効力を持って、IL-1α、IL-1β、及びIL-33シグナル伝達の完全なる阻害を誘導した(図15E、15J、15O)。バリアントVH1~VH4を保有する抗体クローンは、キメラ48D2と比較して、様々な力価でIL-1α、IL-1β、及びIL-33のシグナル伝達を阻害した。これらのバリアントは、IL-1α(図15A-D)及びIL-33(図15K-N)に関して部分的な阻害を達成し、IL-1β(図15F-I)に関しては完全な阻害を達成した。VH1~VH4のバリアントを保有する抗体クローンについては、IL-36阻害の解析は行わなかった。それぞれのIC50値を表10に示す。図15P-Rは、VH5バリアントを保有する抗体クローンも、キメラ48D2抗体と同様の効力を持って、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナルの完全阻害を誘導したことを示す。
図15A-Oは、HEK細胞におけるIL-1α、IL-1β、及びIL-33シグナル伝達に対するヒト化48D2抗体クローンの阻害活性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、その後、描かれたサイトカインを一定濃度で添加する。グラフは、620nmでの光学密度(OD)を示し、高いODはサイトカイン受容体の下流のシグナル伝達を示す。VH5バリアントを保有する抗体クローンは、キメラ48D2抗体と同様の効力を持って、IL-1α、IL-1β、及びIL-33シグナル伝達の完全なる阻害を誘導した(図15E、15J、15O)。バリアントVH1~VH4を保有する抗体クローンは、キメラ48D2と比較して、様々な力価でIL-1α、IL-1β、及びIL-33のシグナル伝達を阻害した。これらのバリアントは、IL-1α(図15A-D)及びIL-33(図15K-N)に関して部分的な阻害を達成し、IL-1β(図15F-I)に関しては完全な阻害を達成した。VH1~VH4のバリアントを保有する抗体クローンについては、IL-36阻害の解析は行わなかった。それぞれのIC50値を表10に示す。図15P-Rは、VH5バリアントを保有する抗体クローンも、キメラ48D2抗体と同様の効力を持って、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナルの完全阻害を誘導したことを示す。
C)親和性測定
ヒトIL1RAPに対する親和性のKD値は、ヒト化48D2バリアントについて表11に示す。親和性はバイオレイヤー干渉計で測定した。すべての抗体バリアントは、ナノモル領域の親和性を示した。最も高い親和性を示したのはVH5シリーズで、KD値は1-4nMの範囲にあった。キメラ48D2、ヒト化48D2バリアントVH5:VL4、及びヒト化脱免疫化48D2バリアントVH5.GL:VL4の直接比較については表4もご参照。
ヒトIL1RAPに対する親和性のKD値は、ヒト化48D2バリアントについて表11に示す。親和性はバイオレイヤー干渉計で測定した。すべての抗体バリアントは、ナノモル領域の親和性を示した。最も高い親和性を示したのはVH5シリーズで、KD値は1-4nMの範囲にあった。キメラ48D2、ヒト化48D2バリアントVH5:VL4、及びヒト化脱免疫化48D2バリアントVH5.GL:VL4の直接比較については表4もご参照。
D)サイズの不均質性
サイズ不均質性は、サイズ排除HPLC(SE-HPLC)を用いて決定した(表12)。インタクトな単量体抗体は、2本の同一の重鎖と2本の同一の軽鎖がジスルフィド結合で共有結合したものである。高分子量(HMW)種は、例えば、二量体の可溶性抗体凝集体を含む可能性がある。低分子(LMW)種は、例えばペプチド結合が切断された抗体、すなわち、フラグメント化した抗体を含む可能性がある。h48D2 VH4:VL3が>5%の高分子量種(HMW)を含む以外は、ほぼすべてのバリアントが高単量体(≧97%)であった。すべての解析対象バリアントにおいて、少量の低分子量(LMW)種も検出されなかった。
サイズ不均質性は、サイズ排除HPLC(SE-HPLC)を用いて決定した(表12)。インタクトな単量体抗体は、2本の同一の重鎖と2本の同一の軽鎖がジスルフィド結合で共有結合したものである。高分子量(HMW)種は、例えば、二量体の可溶性抗体凝集体を含む可能性がある。低分子(LMW)種は、例えばペプチド結合が切断された抗体、すなわち、フラグメント化した抗体を含む可能性がある。h48D2 VH4:VL3が>5%の高分子量種(HMW)を含む以外は、ほぼすべてのバリアントが高単量体(≧97%)であった。すべての解析対象バリアントにおいて、少量の低分子量(LMW)種も検出されなかった。
E)収量
ヒト化48D2バリアントについては、280nmの吸光度測定によりタンパク質濃度を測定し、50ml培養の収量を決定した(表13)。VLは収量に影響し、VL4バリアントで最も高い収量が得られ、VL3バリアントで最も低い収量が得られた。このように、収量はVL配列に依存する部分があった。
ヒト化48D2バリアントについては、280nmの吸光度測定によりタンパク質濃度を測定し、50ml培養の収量を決定した(表13)。VLは収量に影響し、VL4バリアントで最も高い収量が得られ、VL3バリアントで最も低い収量が得られた。このように、収量はVL配列に依存する部分があった。
結論
VH5バリアントを保有するヒト化抗体バリアントは、キメラ48D2抗体と同様の効力を持って、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を完全に阻害する能力を保持した。バリアントVH1~VH4を有する抗体バリアントは、キメラ48D2と比較してその効力は様々で、IL-1βのシグナル伝達を完全に阻害し、IL-1α及びIL-33のシグナル伝達を部分的に阻害した。ヒトIL1RAPに対する親和性はVH5シリーズで最も高く、このシリーズの中で、バリアントh48D2 VH5:VL4及びh48D2 VH5:VL5は、SE-HPLCで良好な収量と高いモノマー含有量を得た。そこで、これらのバリアントを用いて、さらなる研究を進めた。
VH5バリアントを保有するヒト化抗体バリアントは、キメラ48D2抗体と同様の効力を持って、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を完全に阻害する能力を保持した。バリアントVH1~VH4を有する抗体バリアントは、キメラ48D2と比較してその効力は様々で、IL-1βのシグナル伝達を完全に阻害し、IL-1α及びIL-33のシグナル伝達を部分的に阻害した。ヒトIL1RAPに対する親和性はVH5シリーズで最も高く、このシリーズの中で、バリアントh48D2 VH5:VL4及びh48D2 VH5:VL5は、SE-HPLCで良好な収量と高いモノマー含有量を得た。そこで、これらのバリアントを用いて、さらなる研究を進めた。
実施例13:ヒト化48D2クローンのうち2つのクローンの脱免疫
目的
この実施例は、h48D2のVL5及びVH5のうち、MHCクラスII分子との親和性が予測される配列が、生殖細胞分裂によって脱免疫化されたことを示す。
この実施例は、h48D2のVL5及びVH5のうち、MHCクラスII分子との親和性が予測される配列が、生殖細胞分裂によって脱免疫化されたことを示す。
材料及び方法
MHCクラスII分子との親和性が予測される配列の除去
ヒト化48D2 VL5及びVH5配列は、生殖細胞系列の抗体配列を使用して作成された。これら2つの配列については、抗体の構造と機能を保持を確実にするために、元のウサギの配列に多くの逆変異を導入した(実施例11参照)。これらの導入された逆変異により、MHCクラスII分子との親和性が予測される配列が生み出された。
VH5では、フレームワーク領域2の2つの逆変異が免疫原性の可能性をもたらし、VL5では、フレームワーク領域1の6つの逆変異がもたらした。VH5の脱免疫化のために、逆変異は、単一変異及び両残基の変異(結果として3種類の配列バリアント)として生殖細胞系列配列に戻された。VL5については、6つの逆変異をすべて1つの新しい配列として生殖細胞系列の配列に戻した(結果として1つの配列バリアントが生じた)。
この結果、脱免疫化VH5の新しい配列は以下のようになった:
h48D2 VH5.AP(アラニン→プロリン)(配列番号.32)、
h48D2 VH5.SK(セリン→リジン)(配列番号.33)、
h48D2.VH5.GL(「生殖細胞系」、両残基とも生殖細胞系の配列に戻したもの)(配列番号.34);
及び、脱免疫化されたVL5については、以下の新しい配列になる;
h48D2 VL5.GL(「生殖細胞系列」、6つの残基すべてが生殖細胞系列配列に戻される)(配列番号.31)。
MHCクラスII分子との親和性が予測される配列の除去
ヒト化48D2 VL5及びVH5配列は、生殖細胞系列の抗体配列を使用して作成された。これら2つの配列については、抗体の構造と機能を保持を確実にするために、元のウサギの配列に多くの逆変異を導入した(実施例11参照)。これらの導入された逆変異により、MHCクラスII分子との親和性が予測される配列が生み出された。
VH5では、フレームワーク領域2の2つの逆変異が免疫原性の可能性をもたらし、VL5では、フレームワーク領域1の6つの逆変異がもたらした。VH5の脱免疫化のために、逆変異は、単一変異及び両残基の変異(結果として3種類の配列バリアント)として生殖細胞系列配列に戻された。VL5については、6つの逆変異をすべて1つの新しい配列として生殖細胞系列の配列に戻した(結果として1つの配列バリアントが生じた)。
この結果、脱免疫化VH5の新しい配列は以下のようになった:
h48D2 VH5.AP(アラニン→プロリン)(配列番号.32)、
h48D2 VH5.SK(セリン→リジン)(配列番号.33)、
h48D2.VH5.GL(「生殖細胞系」、両残基とも生殖細胞系の配列に戻したもの)(配列番号.34);
及び、脱免疫化されたVL5については、以下の新しい配列になる;
h48D2 VL5.GL(「生殖細胞系列」、6つの残基すべてが生殖細胞系列配列に戻される)(配列番号.31)。
結果及び結論
VL5、VH5で脱免疫を実施した。新しいVL5及びVH5は、h48D2 VL4、h48D2 VL5、及びh48D2 VH5について以前に得られた配列と組み合わせ、発現と特性評価のために新たに10種類の追加バリアントを作成した:
h48D2 VH5:VL5.GL
h48D2 VH5.AP:VL4
h48D2 VH5.AP:VL5
h48D2 VH5.AP:VL5.GL
h48D2 VH5.SK:VL4
h48D2 VH5.SK:VL5
h48D2 VH5.SK:VL5.GL
h48D2 VH5.GL:VL4
h48D2 VH5.GL:VL5
h48D2 VH5.GL:VL5.GL
VL5、VH5で脱免疫を実施した。新しいVL5及びVH5は、h48D2 VL4、h48D2 VL5、及びh48D2 VH5について以前に得られた配列と組み合わせ、発現と特性評価のために新たに10種類の追加バリアントを作成した:
h48D2 VH5:VL5.GL
h48D2 VH5.AP:VL4
h48D2 VH5.AP:VL5
h48D2 VH5.AP:VL5.GL
h48D2 VH5.SK:VL4
h48D2 VH5.SK:VL5
h48D2 VH5.SK:VL5.GL
h48D2 VH5.GL:VL4
h48D2 VH5.GL:VL5
h48D2 VH5.GL:VL5.GL
実施例14:ヒト化脱免疫化48D2クローンの特性
目的
この例は、親和性、サイトカイン阻害、及び最適化された生化学的特性を保持するヒト化抗体及び脱免疫化抗体を見つけることを目的として、ヒト化及び脱免疫化48D2バリアントがどのように発現及び特徴付けられたかを示す。
この例は、親和性、サイトカイン阻害、及び最適化された生化学的特性を保持するヒト化抗体及び脱免疫化抗体を見つけることを目的として、ヒト化及び脱免疫化48D2バリアントがどのように発現及び特徴付けられたかを示す。
材料及び方法
脱免疫化h48D2の発現、精製、及び特性
発現、精製、及び特性は、キメラ48D2及び実施例10及び12のヒト化バリアントについて先に述べたように実施した。
脱免疫化h48D2の発現、精製、及び特性
発現、精製、及び特性は、キメラ48D2及び実施例10及び12のヒト化バリアントについて先に述べたように実施した。
結果
ヒト化抗体クローン及び脱免疫化抗体クローンのIL1RAPへの結合(ELISA)ELISA測定で得られたIC50値を、脱免疫化されたh48Dバリアントについて表14に示す。結合ELISAを使用すると、異なるバリアント間で結合の小さな違いしか見ることができない。各クローンについて、ヒトとカニクイザル(cyno)のIL1RAPに対する結合親和性はほぼ同様であった。
ヒト化抗体クローン及び脱免疫化抗体クローンのIL1RAPへの結合(ELISA)ELISA測定で得られたIC50値を、脱免疫化されたh48Dバリアントについて表14に示す。結合ELISAを使用すると、異なるバリアント間で結合の小さな違いしか見ることができない。各クローンについて、ヒトとカニクイザル(cyno)のIL1RAPに対する結合親和性はほぼ同様であった。
ヒト化抗体クローン及び脱免疫化抗体クローンのIL1RAPへの結合
IL1RAP発現SKMEL-5細胞をh48D2 VH5.GL:VL4及びh48D2 VH5.GL:VL5.GL又はアイソタイプ対照で染色したフローサイトメトリー解析では、抗体を高濃度で添加すると、アイソタイプ対照抗体と比較してVH5.GL:VL4及びVH5.GL:VL5.GLの高い平均蛍光強度(MFI)が現れた(図16)。
IL1RAP発現SKMEL-5細胞をh48D2 VH5.GL:VL4及びh48D2 VH5.GL:VL5.GL又はアイソタイプ対照で染色したフローサイトメトリー解析では、抗体を高濃度で添加すると、アイソタイプ対照抗体と比較してVH5.GL:VL4及びVH5.GL:VL5.GLの高い平均蛍光強度(MFI)が現れた(図16)。
サイトカインシグナル伝達の阻害
図17は、HEK細胞におけるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナルに対するヒト化抗体及び脱免疫化48D2抗体クローンの阻害活性を示す。抗体は濃度を上げて添加し、描かれたサイトカインは一定濃度で添加した。ヒト化バリアントh48D2 VH5:VL4及びh48D2 VH5:VL5を対照として含めた。グラフは620nmでのOD値を示し、ODが高いほどサイトカイン受容体の下流でのシグナル伝達を表す。すべてのバリアントは、IL-1α(A),IL-1β(B),IL-33(C),IL-36α(D),IL-36β(E)及びIL-36γ(F)に対して阻害効果を保持した。IC50値は表15に示す。
図17は、HEK細胞におけるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γシグナルに対するヒト化抗体及び脱免疫化48D2抗体クローンの阻害活性を示す。抗体は濃度を上げて添加し、描かれたサイトカインは一定濃度で添加した。ヒト化バリアントh48D2 VH5:VL4及びh48D2 VH5:VL5を対照として含めた。グラフは620nmでのOD値を示し、ODが高いほどサイトカイン受容体の下流でのシグナル伝達を表す。すべてのバリアントは、IL-1α(A),IL-1β(B),IL-33(C),IL-36α(D),IL-36β(E)及びIL-36γ(F)に対して阻害効果を保持した。IC50値は表15に示す。
図17A-Fの結果を得るために使用した実験セットアップでは、前日にHEK-Blue(商標)(IL-33/IL-1)細胞にIL-36受容体を一過性に遺伝子導入した。その後、IL-36受容体を安定的に導入したHEK-Blue(商標)細胞を用いて、h48D2 VH5.GL:VL4について、IL-33及びIL-36サイトカインのシグナル伝達阻害のさらなる評価を実施した。この評価の結果、IL-33(図17G)IL-36α(図17H),IL-36β(図17I)及びIL-36γ(図17J)にも阻害効果を示した。IC50値は表16に示す。
親和性測定
ヒトIL1RAPに対する親和性のKD値は、脱免疫化48D2バリアントについて表17に示す。親和性はバイオレイヤー干渉計で測定した。親和性は、すべての脱免疫化バリアントで同様であり、KD値は1-2nMであった。48D2、ヒト化48D2、及び脱免疫化h48D2の直接比較については、表4も参照。
ヒトIL1RAPに対する親和性のKD値は、脱免疫化48D2バリアントについて表17に示す。親和性はバイオレイヤー干渉計で測定した。親和性は、すべての脱免疫化バリアントで同様であり、KD値は1-2nMであった。48D2、ヒト化48D2、及び脱免疫化h48D2の直接比較については、表4も参照。
サイズの不均質性
サイズ不均質性は、サイズ排除HPLC(SE-HPLC)を用いて決定した(表18)。いくつかのHMW種を含んだVL5.GLを有するh48D2バリアントは例外として、ほぼすべてのバリアントが高単量体(≧98%)であった。すべての解析対象バリアントにおいて、LMW種は検出されなかった。
サイズ不均質性は、サイズ排除HPLC(SE-HPLC)を用いて決定した(表18)。いくつかのHMW種を含んだVL5.GLを有するh48D2バリアントは例外として、ほぼすべてのバリアントが高単量体(≧98%)であった。すべての解析対象バリアントにおいて、LMW種は検出されなかった。
収量
脱免疫化したh48D2バリアントについて、280nmでの吸光度測定によりタンパク質濃度を測定し、50ml培養の収量を決定した(表19)。VLバリアントVL5.GLを有する抗体バリアントは、他のバリアントに比べて低い取得可能な収量を示した。
脱免疫化したh48D2バリアントについて、280nmでの吸光度測定によりタンパク質濃度を測定し、50ml培養の収量を決定した(表19)。VLバリアントVL5.GLを有する抗体バリアントは、他のバリアントに比べて低い取得可能な収量を示した。
交差反応性
図18は、h48D2 VH5.GL:VL4及びh48D2 VH5.GL:VL5.GLの異なる種由来のIL1RAPに対する交差反応性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、405nmの吸光度によりIL1RAPとの結合を検出する。キメラ48D2については、ヒト化及び脱免疫化バリアントh48D2 VH5.GL:VL4及びh48D2 VH5.GL:VL5.GLは、カニクイザル(cyno)及びブタのIL1RAPと交差反応したが、マウス、ラット、ウサギ、及びイヌのIL1RAPとは交差反応しなかった(図18及び表20)。
図18は、h48D2 VH5.GL:VL4及びh48D2 VH5.GL:VL5.GLの異なる種由来のIL1RAPに対する交差反応性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、405nmの吸光度によりIL1RAPとの結合を検出する。キメラ48D2については、ヒト化及び脱免疫化バリアントh48D2 VH5.GL:VL4及びh48D2 VH5.GL:VL5.GLは、カニクイザル(cyno)及びブタのIL1RAPと交差反応したが、マウス、ラット、ウサギ、及びイヌのIL1RAPとは交差反応しなかった(図18及び表20)。
結論
脱免疫化したバリアントは、いずれもKD値が1-3nMと高い親和性を示し、生物学的機能を保持した。バリアントh48D2 VH5.GL:VL4は、SE-HPLCにおいて収量が良く、高いモノマー含有量で優れていた。
脱免疫化したバリアントは、いずれもKD値が1-3nMと高い親和性を示し、生物学的機能を保持した。バリアントh48D2 VH5.GL:VL4は、SE-HPLCにおいて収量が良く、高いモノマー含有量で優れていた。
実施例15:キメラ48D2のADCC効果
目的
本実施例では、キメラ48D2をhIgG1-野生型(WT)又はエフェクター機能サイレントIgG1-LALAフォーマットで発現させた場合の抗体依存性細胞傷害(ADCC)効果を調査することを目的とした。
本実施例では、キメラ48D2をhIgG1-野生型(WT)又はエフェクター機能サイレントIgG1-LALAフォーマットで発現させた場合の抗体依存性細胞傷害(ADCC)効果を調査することを目的とした。
材料及び方法
細胞表面にIL1RAPを発現している悪性黒色腫細胞株SKMEL-5をターゲットとして、インビトロADCCアッセイを実施した。ターゲット細胞を96ウェルプレートに10000個/ウェルの密度で播種した。その後、48D2-WT、48D2-LALA又はアイソタイプ対照抗体を異なる濃度でウェルに加え、30分間インキュベートした後、100000個のNKエフェクター細胞を各ウェルに加えた。NK細胞は、製造者の指示に従い、NK細胞陰性細胞分離キット(Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、ドイツ)を用いて白血球濃縮液から抽出した。実験において、非特異的ヒトIgG1-WT抗体及びIgG1-LALA抗体を対照として使用した。細胞死の程度は、培養18時間後にFACS LSR Fortessaフローサイトメーター(BD)を用いてDAPI陽性細胞の検出により評価した。
細胞表面にIL1RAPを発現している悪性黒色腫細胞株SKMEL-5をターゲットとして、インビトロADCCアッセイを実施した。ターゲット細胞を96ウェルプレートに10000個/ウェルの密度で播種した。その後、48D2-WT、48D2-LALA又はアイソタイプ対照抗体を異なる濃度でウェルに加え、30分間インキュベートした後、100000個のNKエフェクター細胞を各ウェルに加えた。NK細胞は、製造者の指示に従い、NK細胞陰性細胞分離キット(Miltenyi Biotech、Bergisch Gladbach、ドイツ)を用いて白血球濃縮液から抽出した。実験において、非特異的ヒトIgG1-WT抗体及びIgG1-LALA抗体を対照として使用した。細胞死の程度は、培養18時間後にFACS LSR Fortessaフローサイトメーター(BD)を用いてDAPI陽性細胞の検出により評価した。
結果
インビトロADCCアッセイにおいて、hIgG1フォーマットのキメラ48D2が、抗体特異的、用量依存的にSKMEL-5細胞を死滅させるようNK細胞を誘導することが示す(図19)。hIgG1-LALAフォーマットで発現させたキメラ48D2で処理した後、アイソタイプ対照及び未処理細胞(未処理細胞は0ng/mlの抗体に対応)と比較して、SKMEL-5細胞の死細胞の割合に増加はみられなかった。
その効果は、用量依存的であることが示された。キメラ48D2をhIgG1-LALAフォーマットで発現させると、ADCC効果は消失する。48D2抗体の抗体バリアント(上記の実施例に記載された抗体、例えば、ヒト化抗体、又はヒト化及び脱免疫化抗体バリアント)は、hIgG1-WT又はhIgG1 LALAフォーマットで発現した場合に同様の効果を有することが想定され得る。実際、以下の実施例19は、hIgG1 LALAフォーマットの抗体バリアントVH5.GL:VL4が、血液ループアッセイにおいてFc媒介免疫活性化を誘導しないことを実証する。
インビトロADCCアッセイにおいて、hIgG1フォーマットのキメラ48D2が、抗体特異的、用量依存的にSKMEL-5細胞を死滅させるようNK細胞を誘導することが示す(図19)。hIgG1-LALAフォーマットで発現させたキメラ48D2で処理した後、アイソタイプ対照及び未処理細胞(未処理細胞は0ng/mlの抗体に対応)と比較して、SKMEL-5細胞の死細胞の割合に増加はみられなかった。
その効果は、用量依存的であることが示された。キメラ48D2をhIgG1-LALAフォーマットで発現させると、ADCC効果は消失する。48D2抗体の抗体バリアント(上記の実施例に記載された抗体、例えば、ヒト化抗体、又はヒト化及び脱免疫化抗体バリアント)は、hIgG1-WT又はhIgG1 LALAフォーマットで発現した場合に同様の効果を有することが想定され得る。実際、以下の実施例19は、hIgG1 LALAフォーマットの抗体バリアントVH5.GL:VL4が、血液ループアッセイにおいてFc媒介免疫活性化を誘導しないことを実証する。
結論
この実験により、48D2は、NK細胞を、表面にIL1RAPを発現しているメラノーマ細胞株への特異的殺傷に誘導でき、及び48D2によって誘導される細胞傷害作用が用量依存的であることを示す。さらに、48D2をエフェクター機能サイレントhIgG1-LALAフォーマットで発現させることにより、ADCC効果を消失させることができる。
この実験により、48D2は、NK細胞を、表面にIL1RAPを発現しているメラノーマ細胞株への特異的殺傷に誘導でき、及び48D2によって誘導される細胞傷害作用が用量依存的であることを示す。さらに、48D2をエフェクター機能サイレントhIgG1-LALAフォーマットで発現させることにより、ADCC効果を消失させることができる。
実施例16:キメラ48D2によるヒト線維芽細胞のサイトカインシグナル伝達の阻害
目的
本実施例の目的は、ヒト線維芽細胞におけるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ刺激IL-6遺伝子発現に対するキメラ48D2の阻害活性をインビトロで調査することである。
本実施例の目的は、ヒト線維芽細胞におけるIL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ刺激IL-6遺伝子発現に対するキメラ48D2の阻害活性をインビトロで調査することである。
材料及び方法
健康なヒト皮膚から採取した線維芽細胞は、商業的に入手し、完全な線維芽細胞増殖培地で増殖させた。ウェルあたり75000個の細胞を24ウェルプレートに播種した。80%コンフルエントの細胞を、1%FBSのみを含む線維芽細胞培地で一晩血清飢餓状態にした。培地を1%FBSと成長因子を含まない新しい線維芽細胞培地に変更し、異なる濃度のサイトカインで刺激する1時間前に20ug/mlキメラ48D2をウェルに添加した(図20に描かれるように)。細胞を24時間刺激した後、製造者の指示に従ってRNAを単離した。IL-6mRNA量はSYBR Greenを用いて解析し、データはΔΔCT法で解析し、無処置の対照と比較したときの変化量2-ΔΔCTで示した。
健康なヒト皮膚から採取した線維芽細胞は、商業的に入手し、完全な線維芽細胞増殖培地で増殖させた。ウェルあたり75000個の細胞を24ウェルプレートに播種した。80%コンフルエントの細胞を、1%FBSのみを含む線維芽細胞培地で一晩血清飢餓状態にした。培地を1%FBSと成長因子を含まない新しい線維芽細胞培地に変更し、異なる濃度のサイトカインで刺激する1時間前に20ug/mlキメラ48D2をウェルに添加した(図20に描かれるように)。細胞を24時間刺激した後、製造者の指示に従ってRNAを単離した。IL-6mRNA量はSYBR Greenを用いて解析し、データはΔΔCT法で解析し、無処置の対照と比較したときの変化量2-ΔΔCTで示した。
結果
IL-1α、IL-1β、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γは、用量依存的に真皮線維芽細胞のIL-6遺伝子発現を誘導した(図20)。この実験において、キメラ48D2が遺伝子発現の増加を阻害し、非刺激の対照と同程度のレベルまで低下させた。IL-33は、これらの細胞におけるIL-6の発現に影響を与えなかった(データは示さず)。48D2抗体の抗体バリアント(上記実施例で説明した抗体、例えばヒト化抗体、又はヒト化抗体及び脱免疫化抗体バリアントなど)は、同様の効果を有することが想定できる。実際、実施例17は、抗体バリアントVH5.GL:VL4がヒト全血においてIL-1βシグナルを阻害することを実証する。
IL-1α、IL-1β、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γは、用量依存的に真皮線維芽細胞のIL-6遺伝子発現を誘導した(図20)。この実験において、キメラ48D2が遺伝子発現の増加を阻害し、非刺激の対照と同程度のレベルまで低下させた。IL-33は、これらの細胞におけるIL-6の発現に影響を与えなかった(データは示さず)。48D2抗体の抗体バリアント(上記実施例で説明した抗体、例えばヒト化抗体、又はヒト化抗体及び脱免疫化抗体バリアントなど)は、同様の効果を有することが想定できる。実際、実施例17は、抗体バリアントVH5.GL:VL4がヒト全血においてIL-1βシグナルを阻害することを実証する。
結論
48D2は、ヒト線維芽細胞におけるサイトカイン誘発のIL-6遺伝子発現の増加を遮断することができる。
48D2は、ヒト線維芽細胞におけるサイトカイン誘発のIL-6遺伝子発現の増加を遮断することができる。
実施例17:48D2バリアントVH5.GL:VL4によるヒト全血中のIL-1βシグナル伝達の阻害
目的
本研究の目的は、ヒト全血を48D2バリアントVH5.GL:VL4とプレインキュベーションすることにより、IL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルを遮断することが、IL-1βの刺激に応答して様々な下流のサイトカインやケモカインの放出にどのように影響するかを調査することである。
本研究の目的は、ヒト全血を48D2バリアントVH5.GL:VL4とプレインキュベーションすることにより、IL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルを遮断することが、IL-1βの刺激に応答して様々な下流のサイトカインやケモカインの放出にどのように影響するかを調査することである。
材料及び方法
ヒト血液は、2人の異なるドナーからヘパリンチューブで採取した。血液を96ウェルプレートのウェルに移し、150μg/ml VH5.GL:VL4と共に37℃、5%CO2で30分間攪拌しながらインキュベートした。その後、IL-1β又はLPSをともに1ng/mlでウェルに添加し、血液を37℃、5%CO2で30分間撹拌しながら20時間インキュベートした。血液試料を製剤緩衝液だけでインキュベートしたウェルは、陰性対照(Ctrl)として含まれた。このプレートを1500rpmで遠心分離し、血漿と血球を分離した。血漿を1:2に希釈し、71の異なるサイトカイン及びケモカインのレベル(6CKine、BCA-1、CTACK、EGF、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3、FGF-2、Flt3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GROα/CXCL1、I-309.IFNα2、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-18、IL-20.IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28、IL-33、IP-10、LIF、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、M-CSF、MDC、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、PDGF-AA、PDGF-AB/BB、RANTES、sCD40L、SCF、SDF-1α+β.TARC、TGFα、TNFα、TNFβ、TPO、TRAIL、TSLP、VEGF-A)は、血漿試料において、サイトカイン/ケモカイン71-Plex Discovery Assay Array(Eve Technologies; HD71)を用いて、製造者の説明書に従って測定した。これらのうち、G-CSF、GROα/CXCL1、IL-17A、及びTNF-αの4つの結果については、後述する。
ヒト血液は、2人の異なるドナーからヘパリンチューブで採取した。血液を96ウェルプレートのウェルに移し、150μg/ml VH5.GL:VL4と共に37℃、5%CO2で30分間攪拌しながらインキュベートした。その後、IL-1β又はLPSをともに1ng/mlでウェルに添加し、血液を37℃、5%CO2で30分間撹拌しながら20時間インキュベートした。血液試料を製剤緩衝液だけでインキュベートしたウェルは、陰性対照(Ctrl)として含まれた。このプレートを1500rpmで遠心分離し、血漿と血球を分離した。血漿を1:2に希釈し、71の異なるサイトカイン及びケモカインのレベル(6CKine、BCA-1、CTACK、EGF、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エオタキシン-3、FGF-2、Flt3L、フラクタルカイン、G-CSF、GM-CSF、GROα/CXCL1、I-309.IFNα2、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-18、IL-20.IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28、IL-33、IP-10、LIF、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、M-CSF、MDC、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、PDGF-AA、PDGF-AB/BB、RANTES、sCD40L、SCF、SDF-1α+β.TARC、TGFα、TNFα、TNFβ、TPO、TRAIL、TSLP、VEGF-A)は、血漿試料において、サイトカイン/ケモカイン71-Plex Discovery Assay Array(Eve Technologies; HD71)を用いて、製造者の説明書に従って測定した。これらのうち、G-CSF、GROα/CXCL1、IL-17A、及びTNF-αの4つの結果については、後述する。
結果
VH5.GL:VL4によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルの遮断は、IL-1βによる刺激に応答したヒト全血中のG-CSF、GROα/CXCL1、IL-17A、及びTNF-αの放出を減少させた(図21A-D)。同様の効果は、血液をLPSで刺激した場合にも認められ、VH5.GL:VL4はG-CSF、GROα/CXCL1、及びTNF-αのレベルを顕著に低下させ、IL-17Aのレベルはわずかに低下した(図21A-D)。
VH5.GL:VL4によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルの遮断は、IL-1βによる刺激に応答したヒト全血中のG-CSF、GROα/CXCL1、IL-17A、及びTNF-αの放出を減少させた(図21A-D)。同様の効果は、血液をLPSで刺激した場合にも認められ、VH5.GL:VL4はG-CSF、GROα/CXCL1、及びTNF-αのレベルを顕著に低下させ、IL-17Aのレベルはわずかに低下した(図21A-D)。
結論
VH5.GL:VL4によるIL1RAP遮断は、IL-1β及びLPSを介したIL-1Rシグナルの下流効果に影響を与え、複数のサイトカインやケモカインの放出を減少させる。
VH5.GL:VL4によるIL1RAP遮断は、IL-1β及びLPSを介したIL-1Rシグナルの下流効果に影響を与え、複数のサイトカインやケモカインの放出を減少させる。
実施例18:48D2バリアントVH5.GL:VL4による血液ループシステムでのIL-1βシグナル阻害
目的
本研究の目的は、ヒト全血を48D2バリアントVH5.GL:VL4でプレインキュベーションすることにより、IL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルを遮断することが、ヒト血液循環を模した血液ループシステムにおいてIL-1βによる刺激に応答したIL-6及びIL-8の放出にいかに影響するかを調査することである。
本研究の目的は、ヒト全血を48D2バリアントVH5.GL:VL4でプレインキュベーションすることにより、IL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルを遮断することが、ヒト血液循環を模した血液ループシステムにおいてIL-1βによる刺激に応答したIL-6及びIL-8の放出にいかに影響するかを調査することである。
材料及び方法
10人の健康なドナーから新鮮な全血を採取し、低量の可溶性ヘパリンを添加した。血液は直ちにプレコートプラスチックチューブに移され、血液ループシステムのループを形成した。ループを回転ホイールに乗せ、並行して試料を走らせた。VH5.GL:VL4を32μg/mlで試料に投与し、15分後に1ng/mlのIL-1βを添加した。対照にはPBSを使用した。各ループは4時間後にサンプリングされ、サンプリング時点の反応を停止させるために、各試料に10mMの濃度でEDTAが添加された。血漿試料は遠心分離によって調製し、アリコートし、さらなるサイトカイン分析まで≦-60℃で保存した。
サイトカインIL-6及びIL-8は、Meso Scale DiscoveryのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使って測定した。すべての試料は1:4に希釈し、製造元の説明書に従って試料を二重に実行した。
10人の健康なドナーから新鮮な全血を採取し、低量の可溶性ヘパリンを添加した。血液は直ちにプレコートプラスチックチューブに移され、血液ループシステムのループを形成した。ループを回転ホイールに乗せ、並行して試料を走らせた。VH5.GL:VL4を32μg/mlで試料に投与し、15分後に1ng/mlのIL-1βを添加した。対照にはPBSを使用した。各ループは4時間後にサンプリングされ、サンプリング時点の反応を停止させるために、各試料に10mMの濃度でEDTAが添加された。血漿試料は遠心分離によって調製し、アリコートし、さらなるサイトカイン分析まで≦-60℃で保存した。
サイトカインIL-6及びIL-8は、Meso Scale DiscoveryのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使って測定した。すべての試料は1:4に希釈し、製造元の説明書に従って試料を二重に実行した。
結果
VH5.GL:VL4によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルの遮断は、血液ループシステムで循環するヒト全血において、IL-1βによる刺激に応答してIL-6及びIL-8の放出を減少させた(図22A-B)。
VH5.GL:VL4によるIL-1α/β、IL-33、及びIL-36α/β/γシグナルの遮断は、血液ループシステムで循環するヒト全血において、IL-1βによる刺激に応答してIL-6及びIL-8の放出を減少させた(図22A-B)。
結論
ヒトの血液循環を模した血液ループシステムにおいて、VH5.GL:VL4によるIL1RAP遮断は、IL-1βを介したIL-1Rシグナルの下流効果に影響を与え、サイトカインIL-6及びIL-8の放出を減少させることが確認された。
ヒトの血液循環を模した血液ループシステムにおいて、VH5.GL:VL4によるIL1RAP遮断は、IL-1βを介したIL-1Rシグナルの下流効果に影響を与え、サイトカインIL-6及びIL-8の放出を減少させることが確認された。
実施例19:IL1RAP発現細胞による48D2バリアントVH5.GL:VL4の内在化
目的
この実験の目的は、IL1RAPを発現する細胞による蛍光標識48D2バリアントVH5.GL:VL4の膜結合と潜在的な内在化を調査することである。
この実験の目的は、IL1RAPを発現する細胞による蛍光標識48D2バリアントVH5.GL:VL4の膜結合と潜在的な内在化を調査することである。
材料及び方法
WT及びIL1RAP KO SKMELヒトメラノーマ細胞を60-80%コンフルエンスまで増殖させ、その後、8ウェルIbidi-treat顕微鏡チャンバースライドに1ウェルあたり12500細胞で移した。細胞を3μg/ml AlexaFluor647(AF647)-結合VH5.GL:VL4とともに37℃で1、2、又は4時間インキュベートした。対照細胞は、AF647結合アイソタイプ対照抗体でインキュベートした。代替的に、A647結合VH5.GL:VL4で2時間インキュベートしたWT SKMEL細胞を、さらに5μg/mlウサギ抗EEA1抗体及び10μg/mlマウス抗Lamp1抗体で3時間インキュベートし、それぞれエンドソーム及びリソソームのマーカーを染色した。細胞を洗浄し、AlexaFluor488(AF488)結合抗ウサギ抗体およびローダミン(RX)結合抗マウス抗体と30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を再び洗浄し、その後DAPIで標識して細胞核を染色した。Zeiss LSM800共焦点顕微鏡を使用し、63倍の油浸レンズで細胞を解析した。検出レベルは、A647結合VH5.GL:VL4、又は抗EEA1、抗Lamp1とインキュベートしていない対照細胞から設定し、解析を通して同じ設定を使用した。細胞内の500nmの光切片をスキャンし、代表的な画像を撮影することで、相互作用的な視覚的解析を行った。
WT及びIL1RAP KO SKMELヒトメラノーマ細胞を60-80%コンフルエンスまで増殖させ、その後、8ウェルIbidi-treat顕微鏡チャンバースライドに1ウェルあたり12500細胞で移した。細胞を3μg/ml AlexaFluor647(AF647)-結合VH5.GL:VL4とともに37℃で1、2、又は4時間インキュベートした。対照細胞は、AF647結合アイソタイプ対照抗体でインキュベートした。代替的に、A647結合VH5.GL:VL4で2時間インキュベートしたWT SKMEL細胞を、さらに5μg/mlウサギ抗EEA1抗体及び10μg/mlマウス抗Lamp1抗体で3時間インキュベートし、それぞれエンドソーム及びリソソームのマーカーを染色した。細胞を洗浄し、AlexaFluor488(AF488)結合抗ウサギ抗体およびローダミン(RX)結合抗マウス抗体と30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を再び洗浄し、その後DAPIで標識して細胞核を染色した。Zeiss LSM800共焦点顕微鏡を使用し、63倍の油浸レンズで細胞を解析した。検出レベルは、A647結合VH5.GL:VL4、又は抗EEA1、抗Lamp1とインキュベートしていない対照細胞から設定し、解析を通して同じ設定を使用した。細胞内の500nmの光切片をスキャンし、代表的な画像を撮影することで、相互作用的な視覚的解析を行った。
結果
IL1RAPを発現しているWT SKMEL細胞では、1時間のインキュベーションでA647結合VH5.GL:VL4の初期膜結合と細胞内在化が検出された(図23;左上画像;矢印は膜結合と内在化を示す)。最大内在化は、インキュベーションの約2時間後に示された(図23;上中図)。IL1RAP KO細胞によるA647結合VH5.GL:VL4の結合と内在化の欠如は、WT細胞で観察された効果がIL1RAPとの相互作用によって媒介されることを示す(図23;中段;DAPIによる核の染色のみ観察)。さらに、WT細胞に対するアイソタイプ対照抗体の結合や内在化は観察されなかった(図23;下段;DAPIによる核の染色のみ観察)。エンドソームとリソソームのマーカーであるEEA1及びLamp1の共染色を追加すると、A647標識のVH5.GL:VL4のシグナルととの重複を示す(図24)。これは、VH5.GL:VL4は内在化時にこれらのコンパートメントに局在することを示す。
IL1RAPを発現しているWT SKMEL細胞では、1時間のインキュベーションでA647結合VH5.GL:VL4の初期膜結合と細胞内在化が検出された(図23;左上画像;矢印は膜結合と内在化を示す)。最大内在化は、インキュベーションの約2時間後に示された(図23;上中図)。IL1RAP KO細胞によるA647結合VH5.GL:VL4の結合と内在化の欠如は、WT細胞で観察された効果がIL1RAPとの相互作用によって媒介されることを示す(図23;中段;DAPIによる核の染色のみ観察)。さらに、WT細胞に対するアイソタイプ対照抗体の結合や内在化は観察されなかった(図23;下段;DAPIによる核の染色のみ観察)。エンドソームとリソソームのマーカーであるEEA1及びLamp1の共染色を追加すると、A647標識のVH5.GL:VL4のシグナルととの重複を示す(図24)。これは、VH5.GL:VL4は内在化時にこれらのコンパートメントに局在することを示す。
結論
VH5.GL:VL4はIL1RAP発現SKMEL細胞への結合により内在化する。この内在化は、VH5.GL:VL4のIL1RAPへの結合に依存する。
VH5.GL:VL4はIL1RAP発現SKMEL細胞への結合により内在化する。この内在化は、VH5.GL:VL4のIL1RAPへの結合に依存する。
実施例20:48D2バリアントVH5.GL:VL4による血液ループシステムでのFcを介した免疫活性化
目的
本研究の目的は、エフェクター機能サイレントhIgG1-LALAフォーマットで発現させた48D2バリアントVH5.GL:VL4が、人間の血液循環を模した血液ループシステムにおいて、他の刺激がない状態で免疫活性化を誘導できるか、またどの程度誘導できるかを調査することである。免疫活性化は、循環するヒト全血中の炎症性サイトカインの放出及び補体の活性化によって評価されるだろう。
本研究の目的は、エフェクター機能サイレントhIgG1-LALAフォーマットで発現させた48D2バリアントVH5.GL:VL4が、人間の血液循環を模した血液ループシステムにおいて、他の刺激がない状態で免疫活性化を誘導できるか、またどの程度誘導できるかを調査することである。免疫活性化は、循環するヒト全血中の炎症性サイトカインの放出及び補体の活性化によって評価されるだろう。
材料及び方法
10人の健康なドナーから新鮮な全血を採取し、補体系に対する薬剤の影響を分析できるように、低量の可溶性ヘパリンを添加した。血液を直ちにプレコートプラスチックチューブに移し、血液ループシステムのループを形成した後、0.0125mg/ml、0.125mg/ml、又は1.25mg/mlのVH5.GL:VL4を添加した。抗CD52抗体アレムツズマブを3μg/ml添加した試料、又は製剤緩衝剤のみ(ビヒクル)をそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。ループを回転ホイールに乗せ、並行して試料を走らせた。15分後及び4時間後に各ループをサンプリングし、サンプリング時点の反応を停止させるために、各試料に10mMの濃度でEDTAを添加した。15分後に採取した試料は補体分析用の血漿に、4時間後に採取した血液試料はサイトカイン分析用の血漿に加工された。血漿試料は遠心分離により調製し、アリコートし、分析まで≦-60℃で保存した。
サイトカインIFNγ、IL-6、IL-8、TNFαは、Meso Scale DiscoveryのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使って測定した。すべての試料は1:4に希釈し、製造元の説明書に従って試料を二重に実行した。
補体活性化は、ELISAキット(RayBio(登録商標)Human C3a ELISAキット及びRayBio(登録商標)Human C5a ELISAキット)を用いて補体分割産物C3a及びC5aを測定することにより解析した。血漿試料は、C3a分析には試料希釈液で1:500、C5a分析には試料希釈液で1:50に希釈し、製造元の指示に従って二重に実行した。
10人の健康なドナーから新鮮な全血を採取し、補体系に対する薬剤の影響を分析できるように、低量の可溶性ヘパリンを添加した。血液を直ちにプレコートプラスチックチューブに移し、血液ループシステムのループを形成した後、0.0125mg/ml、0.125mg/ml、又は1.25mg/mlのVH5.GL:VL4を添加した。抗CD52抗体アレムツズマブを3μg/ml添加した試料、又は製剤緩衝剤のみ(ビヒクル)をそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。ループを回転ホイールに乗せ、並行して試料を走らせた。15分後及び4時間後に各ループをサンプリングし、サンプリング時点の反応を停止させるために、各試料に10mMの濃度でEDTAを添加した。15分後に採取した試料は補体分析用の血漿に、4時間後に採取した血液試料はサイトカイン分析用の血漿に加工された。血漿試料は遠心分離により調製し、アリコートし、分析まで≦-60℃で保存した。
サイトカインIFNγ、IL-6、IL-8、TNFαは、Meso Scale DiscoveryのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使って測定した。すべての試料は1:4に希釈し、製造元の説明書に従って試料を二重に実行した。
補体活性化は、ELISAキット(RayBio(登録商標)Human C3a ELISAキット及びRayBio(登録商標)Human C5a ELISAキット)を用いて補体分割産物C3a及びC5aを測定することにより解析した。血漿試料は、C3a分析には試料希釈液で1:500、C5a分析には試料希釈液で1:50に希釈し、製造元の指示に従って二重に実行した。
結果
VH5.GL:VL4は、IFNγ、IL-6、IL-8、TNFαの放出(図25A-D)、及びC3a及びC5aのレベルで測定した補体の活性化(図26A-B)に対して、評価した3濃度のいずれにおいても血液ループシステムで影響を与えなかった。対照的に、抗CD52抗体アレムツズマブは、サイトカイン放出と同時に補体活性化を誘導した。
VH5.GL:VL4は、IFNγ、IL-6、IL-8、TNFαの放出(図25A-D)、及びC3a及びC5aのレベルで測定した補体の活性化(図26A-B)に対して、評価した3濃度のいずれにおいても血液ループシステムで影響を与えなかった。対照的に、抗CD52抗体アレムツズマブは、サイトカイン放出と同時に補体活性化を誘導した。
結論
エフェクター機能サイレントFc領域を持つVH5.GL:VL4は、Fcを介した免疫活性化を誘導しない。
エフェクター機能サイレントFc領域を持つVH5.GL:VL4は、Fcを介した免疫活性化を誘導しない。
実施例21:48D2バリアントVH5.GL:VL4の静脈内投与による初期安全性と薬物及び毒物動態の特性
目的
本試験の目的は、VH5.GL:VL4を雌雄のカニクイザルに単回静脈内投与し、最大耐容量まで3段階に漸増投与した場合の薬物動態及び潜在的毒性を決定することである。
本試験の目的は、VH5.GL:VL4を雌雄のカニクイザルに単回静脈内投与し、最大耐容量まで3段階に漸増投与した場合の薬物動態及び潜在的毒性を決定することである。
材料及び方法
VH5.GL:VL4は、各投与量レベルについて、雌雄1匹のカニクイザルに単回投与(ボーラス)として5、20、又は50mg/kgを末梢静脈から静脈内投与した。投与後2週間、毎日動物を観察し、死亡率、臨床症状、及び食物摂取量を調べた。試験前と試験8日目に血液学と血清化学を実施した。体重は試験前と8日目及び15日目に記録した。生物分析及び毒物動態評価のためのサンプリングは、投与前及び投与後0.083、1、3、6、24、48、96、168、264、及び336時間に大腿静脈から採取した(各試料に少なくとも0.6ml血液)。血液試料は、血清分離用のチューブで室温で30分間凝固させた。血栓を1200g、4℃で10分間遠心分離することでスピンダウンさせた。得られた血清は、分析まで-80℃で保存した。
VH5.GL:VL4は、各投与量レベルについて、雌雄1匹のカニクイザルに単回投与(ボーラス)として5、20、又は50mg/kgを末梢静脈から静脈内投与した。投与後2週間、毎日動物を観察し、死亡率、臨床症状、及び食物摂取量を調べた。試験前と試験8日目に血液学と血清化学を実施した。体重は試験前と8日目及び15日目に記録した。生物分析及び毒物動態評価のためのサンプリングは、投与前及び投与後0.083、1、3、6、24、48、96、168、264、及び336時間に大腿静脈から採取した(各試料に少なくとも0.6ml血液)。血液試料は、血清分離用のチューブで室温で30分間凝固させた。血栓を1200g、4℃で10分間遠心分離することでスピンダウンさせた。得られた血清は、分析まで-80℃で保存した。
ビオチン化したヒトIL1RAPをストレプトアビジンでプレコートしたMeso Scale Discovery(MSD)プレートに加え、室温でインキュベートした。洗浄後、血清試料をプレートに添加し、室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、電気化学発光標識(MSD SULFO-TAG)に結合した抗ヒトIgGをプレートに添加した。最終インキュベーションと洗浄の後、リード緩衝液を添加した。SULFO-TAGは、プレート電極にMSD装置内の電圧をかけると発光する。この装置では、発光強度を測定することで、試料中のVH5.GL:VL4を定量的に測定する。血清毒物動態解析は、WinNonlinパッケージ(v.8.1,Pharsight Inc,Certara Company,米国)を用いて、標準的なノンコンパートメントアプローチに従って実施した。
結果
体重及び臨床病理検査において、異常な臨床症状及び関連する毒性学的変化は存在しなかった。血清化学及び血液学に毒性学的に関連する変化は観察されなかった。
調査した用量範囲において、本化合物の用量規格化された最大濃度は同程度であった。各投与量レベルにおいて、VH5.GL:VL4の雌雄の血清毒物動態学パラメーターは同様だった。VH5.GL:VL4の終末半減期は、5mg/kg投与後で平均98時間(4日)、20mg/kg及び50mg/kg投与パラメーター後では220時間(9日)と、5mg/kgでの投与よりも2倍高かった(表21)。VH5.GL:VL4は、二指数関数的に減少することがわかった(図27)。すべての投与量において、VH5.GL:VL4の血清クリアランスは低く、終末期の分配容積はサルの全身水(≒700ml/kg)と同じオーダーであることがわかった。
体重及び臨床病理検査において、異常な臨床症状及び関連する毒性学的変化は存在しなかった。血清化学及び血液学に毒性学的に関連する変化は観察されなかった。
調査した用量範囲において、本化合物の用量規格化された最大濃度は同程度であった。各投与量レベルにおいて、VH5.GL:VL4の雌雄の血清毒物動態学パラメーターは同様だった。VH5.GL:VL4の終末半減期は、5mg/kg投与後で平均98時間(4日)、20mg/kg及び50mg/kg投与パラメーター後では220時間(9日)と、5mg/kgでの投与よりも2倍高かった(表21)。VH5.GL:VL4は、二指数関数的に減少することがわかった(図27)。すべての投与量において、VH5.GL:VL4の血清クリアランスは低く、終末期の分配容積はサルの全身水(≒700ml/kg)と同じオーダーであることがわかった。
結論
VH5.GL:VL4をカニクイザルに単回静脈内投与した後、本抗体の薬物動態は、低クリアランス、低分布容量、及び長半減期を特徴とした。検討した用量範囲において,化合物の最大濃度は用量に直接比例して増加したが、50mg/kgでのAUC最終は用量に直接比例して増加するよりも増加する傾向がみられた。
VH5.GL:VL4をカニクイザルに単回静脈内投与した後、本抗体の薬物動態は、低クリアランス、低分布容量、及び長半減期を特徴とした。検討した用量範囲において,化合物の最大濃度は用量に直接比例して増加したが、50mg/kgでのAUC最終は用量に直接比例して増加するよりも増加する傾向がみられた。
実施例22:48D2バリアントVH5.GL:VL4の皮下投与による薬物動態の特性
目的
本試験の目的は、雌のカニクイザルにVH5.GL:VL4の抗体を単回皮下投与した後の薬物動態及びバイオアベイラビリティを決定することである。
本試験の目的は、雌のカニクイザルにVH5.GL:VL4の抗体を単回皮下投与した後の薬物動態及びバイオアベイラビリティを決定することである。
材料及び方法
VH5.GL:VL4を、投与経路ごとに雌のカニクイザル2匹に単回投与として10mg/kgを静脈内又は背部皮下に投与した。薬物動態評価用のサンプリングは、投与前及び投与後1、3、6、24、48、96、168、264、336、480、及び672時間に採取した(各試料に少なくとも0.6mlの血液)。追加的に、静脈内投与から0.083時間後、皮下投与から0.5時間後に初回投与分を採取した。血液試料は、血清分離用のチューブで室温で30分間凝固させた。血栓を1200g、4℃で10分間遠心分離することでスピンダウンさせた。得られた血清は、分析まで-80℃で保存した。
血清は、実施例21に記載したようにMSDで分析した。VH5.GL:VL4の血清薬物動態解析は、Phoenix-WinNonlinパッケージ(Certara Company,米国)を用いて実施した。
VH5.GL:VL4を、投与経路ごとに雌のカニクイザル2匹に単回投与として10mg/kgを静脈内又は背部皮下に投与した。薬物動態評価用のサンプリングは、投与前及び投与後1、3、6、24、48、96、168、264、336、480、及び672時間に採取した(各試料に少なくとも0.6mlの血液)。追加的に、静脈内投与から0.083時間後、皮下投与から0.5時間後に初回投与分を採取した。血液試料は、血清分離用のチューブで室温で30分間凝固させた。血栓を1200g、4℃で10分間遠心分離することでスピンダウンさせた。得られた血清は、分析まで-80℃で保存した。
血清は、実施例21に記載したようにMSDで分析した。VH5.GL:VL4の血清薬物動態解析は、Phoenix-WinNonlinパッケージ(Certara Company,米国)を用いて実施した。
結果
雌のカニクイザルにVH5.GL:VL4を10mg/kg単回静脈内投与したところ、VH5.GL:VL4の血清濃度は平均86.9時間で減少した(図28及び表22)。VH5.GL:VL4の血清クリアランス、分配量ともに低かった。サルの体内水量の合計の約10分の1を占めるのが分配量である(表22)。VH5.GL:VL4の10mg/kg量を皮下投与したところ、化合物の吸収は遅く、Tmaxは投与後48~96時間だった(図28及び表23)。Cmaxに達した後、化合物の血清濃度は減少し、平均終末半減期は平均112時間であった(表23)。皮下バイオアベイラビリティは93%と高かった。
雌のカニクイザルにVH5.GL:VL4を10mg/kg単回静脈内投与したところ、VH5.GL:VL4の血清濃度は平均86.9時間で減少した(図28及び表22)。VH5.GL:VL4の血清クリアランス、分配量ともに低かった。サルの体内水量の合計の約10分の1を占めるのが分配量である(表22)。VH5.GL:VL4の10mg/kg量を皮下投与したところ、化合物の吸収は遅く、Tmaxは投与後48~96時間だった(図28及び表23)。Cmaxに達した後、化合物の血清濃度は減少し、平均終末半減期は平均112時間であった(表23)。皮下バイオアベイラビリティは93%と高かった。
結論
カニクイザルにVH5.GL:VL4を10mg/kg単回静脈内投与した後の薬物動態は、低いクリアランス及び分布容積、ならびに長い半減期によって特徴づけられた。VH5.GL:VL4 10mg/kgを皮下投与後、その化合物の吸収は緩やかであった。Cmaxに達した後、血清中の化合物の濃度は静脈内投与と同程度の平均終末半減期で減少した。皮下バイオアベイラビリティは高かった。
カニクイザルにVH5.GL:VL4を10mg/kg単回静脈内投与した後の薬物動態は、低いクリアランス及び分布容積、ならびに長い半減期によって特徴づけられた。VH5.GL:VL4 10mg/kgを皮下投与後、その化合物の吸収は緩やかであった。Cmaxに達した後、血清中の化合物の濃度は静脈内投与と同程度の平均終末半減期で減少した。皮下バイオアベイラビリティは高かった。
配列
CDR配列(IMGTに従って定義される)
配列番号:1
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
ESISTA
CDR配列(IMGTに従って定義される)
配列番号:1
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
ESISTA
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KAS
KAS
配列番号:3
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
配列番号:4
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFD
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFD
配列番号:5
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
ISPGVST
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
ISPGVST
配列番号:6
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
CDR配列(Kabatに従って定義される)
配列番号:7
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
配列番号:7
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
配列番号:8
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
配列番号:9
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
配列番号:10
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
HFDIT
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
HFDIT
配列番号:11
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
配列番号:12
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
CDR配列(IMGT及びKabatの組み合わせに従って定義される)
配列番号:13
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
配列番号:13
可変型軽鎖相補性決定領域1(CDR-L1)
QASESISTALA
配列番号:14
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
可変型軽鎖相補性決定領域2(CDR-L2)
KASTLPS
配列番号:15
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
可変型軽鎖相補性決定領域3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
配列番号:16
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFDIT
可変型重鎖相補性決定領域1(CDR-H1)
GPSLSHFDIT
配列番号:17
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
可変型重鎖相補性決定領域2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
配列番号:18
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
可変型重鎖相補性決定領域3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
各CDR定義カテゴリー(i)Kabat、ii)IMGT又はiii)IMGT及びKabatの組み合わせ内で、CDR配列(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、又はCDR-H3、それぞれ)は、キメラ抗体48D2及びそのすべての最適化抗体バリアント、例えばヒト化抗体バリアント又はヒト化/脱免疫化抗体バリアントについて同じである(以下の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列で示されるものを参照)ことを注意することは重要である。
-太字で強調表示されたCDR残基は、IMGT番号付けシステムで同定され、
-下線で強調されたCDR残基は、Kabat番号付けシステムで同定され、
-CDR残基は、IMGT及びKabat番号システムの組み合わせで定義された(太字及び下線の組み合わせの配列)。
-太字で強調表示されたCDR残基は、IMGT番号付けシステムで同定され、
-下線で強調されたCDR残基は、Kabat番号付けシステムで同定され、
-CDR残基は、IMGT及びKabat番号システムの組み合わせで定義された(太字及び下線の組み合わせの配列)。
定常領域
配列番号:35
免疫グロブリンカッパ定常軽鎖(軽鎖定常領域)(Km3アロタイプ)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号:35
免疫グロブリンカッパ定常軽鎖(軽鎖定常領域)(Km3アロタイプ)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
太字及び下線のアミノ酸残基は、LALA-変異が導入された場合に変化する残基を示
す。
す。
ヒトIL1RAP
配列番号:37
ヒトIL1RAP全長
MTLLWCVVSLYFYGILQSDASERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEEPINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCTVYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSYVCHARSAKGEVAKAAKVKQKGNRCGQ
配列番号:37
ヒトIL1RAP全長
MTLLWCVVSLYFYGILQSDASERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEEPINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCTVYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSYVCHARSAKGEVAKAAKVKQKGNRCGQ
配列番号:38
IL1RAPのドメイン2
KDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVV
IL1RAPのドメイン2
KDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVV
配列番号:39
ヒトIL1RAPのドメイン2のH2領域
TITWYMGCYKIQNFNNVI
ヒトIL1RAPのドメイン2のH2領域
TITWYMGCYKIQNFNNVI
Claims (126)
- インターロイキン-1受容体アクセサリータンパク質(IL1RAP)に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
a)ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L1と、
b)KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L2と、及び
c)QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-L3と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び/又は
重鎖可変領域であって、
d)GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H1と、
e)ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H2と、及び
f)ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR-H3と、を含む前記重鎖可変領域、を含む、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記IL1RAPが、ヒトIL1RAPである、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記IL1RAPが、細胞表面に発現する、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、IL1RAPのドメイン2に結合する、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記CDRを含む軽鎖可変領域を含み、
ESISTA(配列番号:1)、QASESISTALA(配列番号:7)、及びQASESISTALA(配列番号:13)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
KAS、KASTLPS(配列番号:8)及びKASTLPS(配列番号:14)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり;及び/又は
QQGFSSGNVHNA(配列番号:3)、QQGFSSGNVHNA(配列番号:9)、及びQQGFSSGNVHNA(配列番号:15)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それらからなる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:19のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む、
もしくは、配列番号:19に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、及び配列番号:25からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域を含む、
又は、配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、又は配列番号:25に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:31のアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域を含む、
又は、配列番号:31に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか1つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つのアミノ酸は、そのように変更されていない、請求項7~9のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、CDRを含む重鎖可変領域を含み、GPSLSHFD(配列番号:4)、HFDIT(配列番号:10)、及びGPSLSHFDIT(配列番号:16)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
ISPGVST(配列番号:5)、TISPGVSTYYASWAKS(配列番号:11)、及びTISPGVSTYYASWAKS(配列番号:17)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、及び
ARGGVGSSWKAFDL(配列番号:6)、GGVGSSWKAFDL(配列番号:12)、及びARGGVGSSWKAFDL(配列番号:18)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる、CDRを含む重鎖可変領域を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:20のアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域を含む、
又は、配列番号:20に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、及び配列番号:30からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域を含む、
又は、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、又は配列番号:30に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:32、配列番号:33、及び配列番号:34からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む、
又は、配列番号:32、配列番号:33、又は配列番号:34に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。 - 前記重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか1つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つのアミノ酸は、そのように変更されていない、請求項12~14のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
配列番号:19のアミノ酸配列を含むか、又はからなる軽鎖可変領域及び配列番号:20のアミノ酸配列を含む、又はからなる重鎖可変領域を含む、又は配列番号:19又は配列番号:20に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
a)配列番号:21を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:26を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
b)配列番号:21を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:27を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
c)配列番号:21を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:28を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
d)配列番号:21を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:29を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
e)配列番号:21を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
f)配列番号:22を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:26を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
g)配列番号:22を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:27を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
h)配列番号:22を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:28を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
i)配列番号:22を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:29を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
j)配列番号:22を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
k)配列番号:23を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:26を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
l)配列番号:23を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:27を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
m)配列番号:23を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:28を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
n)配列番号:23を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:29を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
o)配列番号:23を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
p)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:26を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
q)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:27を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
r)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:28を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
s)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:29を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
t)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
u)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:26を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
v)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:27を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
w)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:28を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
x)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:29を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
y)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
又は配列番号:21から配列番号:30のいずれか1つに対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
a)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
b)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:32を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
c)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:33を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
d)配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
e)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
f)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:32を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
g)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:33を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
h)配列番号:25を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
i)配列番号:31を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:30を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
j)配列番号:31を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:32を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
k)配列番号:31を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:33を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
l)配列番号:31を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み;
又は配列番号:24、配列番号:25、配列番号:31、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:33、又は配列番号:34に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:24を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:31を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域、及び配列番号:34を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記軽鎖可変領域及び/又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか1つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つ以下のアミノ酸、又は1つのアミノ酸は、そのように変更されていない、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、軽鎖定常領域又はその一部を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記軽鎖定常領域が、κ又はλ軽鎖のものである、請求項22に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記軽鎖定常領域が、κ軽鎖のものである、請求項22~23のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:35のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域を含む、又は、配列番号:35に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、重鎖定常領域又はその一部を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記重鎖定常領域が、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される免疫グロブリンサブクラスのものである、請求項26に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記重鎖定常領域が、免疫グロブリンサブクラスIgG1である、請求項26~27のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号:36又は配列番号:2のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含むか、又はそれらからなる、
又は配列番号:36又は配列番号:2に対して少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、もしくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 軽鎖定常領域及び/又は重鎖定常領域のアミノ酸のいずれか1つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、4つのアミノ酸のような、5つ以下のアミノ酸、例えば、2つのアミノ酸のような、3つの以下アミノ酸、又は1つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
-請求項6~10のいずれか1項に記載の軽鎖可変領域;及び/又は
-請求項11~15のいずれか1項に記載の重鎖可変領域;及び/又は
-請求項22~25のいずれか1項に記載の軽鎖定常領域;及び/又は
-請求項26~30のいずれか1項に記載の重鎖定常領域を含むか、又はそれらからなる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、Fc領域を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記Fc領域は、非天然起源である、請求項32に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体は、IgG定常領域が変異したFc領域を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記Fc領域が、前記抗体又はその抗原結合フラグメントのエフェクター機能に影響を及ぼす変異の1つ以上を含む、請求項32~34のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記Fc領域が、EU Indexによって定義されるL234A、L235A、P329G、G237A、P238S、H269A、A330S、及びP331Sからなる群から選択される1つ以上の変異を含む、請求項32~35いずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記Fc領域に結合した糖鎖がフコースを欠いている、請求項32~36のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記Fc領域に結合した糖鎖が低フコースである、請求項32~36のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、FUT8陰性細胞株で産生される、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- インタクトな抗体を含むか、又はそれからなる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- Fvフラグメント(例えば、単鎖Fv及びジスルフィド結合Fv)、Fab様フラグメント(例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、及びF(ab)2フラグメント)、及びドメイン抗体(例えば、単一のVH可変ドメイン又はVL可変ドメイン)からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むか、又はそれからなる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、インターロイキン-1(IL-1)ファミリーサイトカインリガンド及び/又は受容体のシグナル伝達を阻害することができる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つのサイトカインのシグナル伝達を阻害することができる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1αのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-1βのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-33のシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-36αのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-36βのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、IL-36γのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及びIL-36γのシグナル伝達を阻害することができる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記シグナル伝達を阻害する工程が、シグナル伝達を本質的に完全に阻害することである、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記シグナル伝達を阻害する工程が、シグナル伝達の部分的な阻害である、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下:
a)KD-値が3nM以下であることを特徴とするIL1RAPに対する結合親和性(KD);
b)前記IL1RAPのドメイン2に対する結合であって、好ましくはドメイン2のH2領域に対する結合であり、ここで、前記H2領域は、配列番号:39のアミノ酸を含むか、それからなる、前記結合;
c)カニクイザル又はブタ由来のIL1RAPとの交差反応性;
d)IL-1αのシグナル伝達の阻害作用;
e)IL-1βシグナル伝達の阻害作用;
f)IL-33のシグナル伝達の阻害作用;
g)IL-36αのシグナル伝達の阻害作用;
h)IL-36βのシグナル伝達の阻害作用;
i)IL-36γのシグナル伝達の阻害作用;
j)IL1RAP発現細胞による内在化、の一つ以上の特性を示す、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、以下:
a)KD-値が3nM以下であることを特徴とするIL1RAPに対する結合親和性(KD);
b)前記IL1RAPのドメイン2に対する結合であって、好ましくはドメイン2のH2領域に対する結合であり、ここで、前記H2領域は、配列番号:39のアミノ酸を含むか、それからなる、前記結合;
c)カニクイザル又はブタ由来のIL1RAPとの交差反応性;
d)IL-1αのシグナル伝達の阻害作用;
e)IL-1βシグナル伝達の阻害作用;
f)IL-33のシグナル伝達の阻害作用;
g)IL-36αのシグナル伝達の阻害作用;
h)IL-36βのシグナル伝達の阻害作用;
i)IL-36γのシグナル伝達の阻害作用;
j)IL1RAP発現細胞による内在化、の一つ以上の特性を示す、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、IL1RAPを発現する細胞のADCCを誘導することができる、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、IL1RAPを発現する細胞のADCCを誘導する能力を有しない、請求項1~54のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、前記薬剤のインビボ半減期を増加させるための部位をさらに含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記インビボインビボ半減期を増加させるための部位が、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸、及びデキストランからなる群から選択される、請求項57に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがPEG化されている、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、直接又は間接的に、細胞傷害性又は検出可能な部位などの機能性部位に共有結合している、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、細胞傷害性部位を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記細胞傷害性部位が放射性同位元素を含むか、又はそれからなる、請求項60~61のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、β-エミッター、オージェエミッター、変換電子-エミッター、α-エミッター、及び低光子エネルギー-エミッターからなる群から選択される、請求項62に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、前記薬剤の近傍で高線量吸光度を作成する局所吸収エネルギーの放出パターンを有する、請求項62~63のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、90Y、32P、186Re/186Re;166Ho、76As/77As、153Smなどの長距離βエミッター;131I、177Lu、67Cu、161Tbなどの中距離ベータエミッター;45Ca、35Sまたは14Cなどの低エネルギーβエミッター;51Cr、67Ga、99Tcm、111In、123I、125I、201Tlなどの転換又はオージェエミッター;及び212Bi、213Bi、223Ac、及び221Atなどのα-エミッターからなる群から選択される、請求項62~64のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、177Luである、請求項62~65のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記細胞傷害性部位が、細胞傷害性薬剤を含むか、又はそれからなる、請求項60~66のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記細胞傷害性薬剤が、細胞賦活剤;抗アンドロゲン剤;コルチゾン及びその誘導体;ホスホネート;テストステロン-5-α-レダクターゼ阻害剤;ホウ素添加剤;サイトカイン;タプシガルギン及びその代謝物;毒素(サポリン又はカリケアミシンなど);化学療法剤(代謝拮抗剤など);又は腫瘍性の障害の治療に有用な他の細胞障害性薬物からなる群から選択される、請求項67に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記細胞傷害性薬剤が、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘導オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、又は低エネルギーX線光子活性化療法などの活性化療法における使用に適している、請求項67又は68のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、検出可能な部位を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記検出可能な部位が、放射性同位元素を含むか、又は放射性同位元素からなる、請求項70に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I、及び201Tlからなる群から選択される、請求項71に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、89Zrである、請求項71~72のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、86Y/90Y又は124I/211Atなどの検出可能で細胞障害性を有する放射性同位元素の対を含む、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記放射性同位元素が、検出可能な部位として、及び細胞障害性部位として同時にマルチモーダルな作用をすることができる、請求項60~74のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記検出可能な部位が、常磁性同位体からなる、又はそれからなる、請求項60~75のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記常磁性同位体が、157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、及び56Feからなる群から選択される、請求項76に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記検出可能な部位が、SPECT、PET、MRI、光学、又は超音波イメージングなどのイメージング技術によって検出可能である、請求項60~77のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記細胞障害性部位及び/又は検出可能な部位が、連結部位を介して、前記抗体又はその抗原結合フラグメントに間接的に接合される、請求項60~78のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記連結部位が、キレート剤である、請求項79に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記キレート剤が、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10,テトラ酢酸(DOTA)の誘導体、デフェロキサミン(DFO)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)の誘導体、S-2-(4-イソチオシアナトベンジル)-1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリ酢酸(NOTA)の誘導体、及び1,4,8,11-テトラザシクロドセダン-1,4,8,11-トリ酢酸の(TETA)誘導体からなる群から選択される、請求項80に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、細胞傷害性部位を含まない、前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
- 前述の請求項のいずれか1項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、cDNA分子である、請求項83に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗体軽鎖又はその可変領域を符号化する、請求項83~84のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記抗体重鎖又はその可変領域を符号化する、請求項83~84のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項87に記載のベクター。
- 請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド又は請求項87~88のいずれか1項に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
- 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項89に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項89に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項89に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項89に記載の宿主細胞。
- 請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法であって、前記方法は、請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド又は請求項87~88のいずれか1項に記載のベクターを含む請求項89~93のいずれかに記載の宿主細胞を、前記符号化された抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件で培養する工程を含む、方法。
- 医薬組成物であって、
請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、及び/又は
請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、
を医薬組成物中に含み、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物。 - 請求項95に記載の組成物であって、前記組成物が、有効量の抗体又はその抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び/又は組換え宿主細胞を含む、組成物。
- 非経口送達のために適合された、請求項95~96のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記非経口送達が、静脈内送達、局所送達、皮下送達、及び/又は筋肉内送達である、請求項97に記載の組成物。
- 医薬に使用するための、請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物。
- IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断に使用するための、及び/又は、ここで、前記疾患又は障害は、IL1RAPを発現する細胞と関連する、医薬に使用するための、請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記疾患又は障害が、炎症性及び/又は線維性の疾患又は障害である、請求項100に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物。
- 前記炎症性及び/又は線維性の疾患又は障害が、心筋炎、全身性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、すべての種類の関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎(SOJIA)を含むすべての種類の若年性関節炎、変形性関節症、家族性寒冷自己炎症症候群(FCAS)、マックル-ウェルズ疾患、新生児発症多臓器炎症性疾患(NOMID)、家族性地中海熱(FMF)、化膿性関節炎壊疽性膿皮症及びアクネ(PAPA)症候群、成人発症スティル病、高IgD症候群、2型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、TNF受容体関連周期症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、関節ループス、アルツハイマー病、喘息、アレルギー、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、I型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病を含む)、肝炎、C型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人T細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患(例えば、メタボリック症候群、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症(GERD)、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症)、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー/アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症、皮膚線維症、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、高安動脈炎、及び痛風からなる群から選択される、請求項100~101のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物。
- 前記疾患又は障害が、炎症性及び/又は線維性成分を有する、請求項100~102のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記疾患又は障害が、自己免疫疾患又は障害である、請求項100~103のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記疾患又は障害が、腫瘍性の疾患又は障害である、請求項100に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記腫瘍性の疾患又は障害が、血液疾患又は障害、もしくは固形腫瘍である、請求項100ないし105のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記腫瘍性の性血液疾患又は障害が、慢性骨髄性白血病(CML)、骨髄増殖障害(MPD)、骨髄異形成症候群(MDS)、急性リンパ性白血病(ALL)、及び急性骨髄性白血病(AML)からなる群から選択される、請求項105~106のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記固形腫瘍が、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、メラノーマ、膀胱がん、脳/CNSがん、泌尿器系のがん、胆道がん、子宮頸がん、食道がん、胃がん、頭/首がん、腎臓がん、肝臓がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される、請求項105~107のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
- 前記疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する、請求項100~108のいずれか1項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又、は組成物。
- 対象の腫瘍性の障害に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導及び/又は成長及び/又は増殖を阻害するために使用され、ここで、前記細胞がIL1RAPを発現する、請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞及び/又は請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物。
- IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び/又は診断のための医薬品の調製において、及び/又は、前記疾患又は障害が、IL1RAPを発現する細胞と関連する、請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び/又は診断のための医薬品の調製における、請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物の使用。
- 対象において、IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、及び/又はIL-36γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防及び/又は治療及び/又は軽減及び/又は検出及び/又は診断のための方法であって、及び/又は疾患又は障害がIL1RAPを発現する細胞と関連し、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 対象においてIL1RAPを発現する細胞を検出するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
(a)生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。 - 請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう、IL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有する患者を同定するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
(a)検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
(b)任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び/又は精製する工程と、
(c)請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
(d)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、IL1RAPを発現する細胞への抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう患者を示す、方法。 - 細胞発現IL1RAPに関連する疾患又は障害を有する患者を治療するための方法であって、前記方法は、
a)請求項114~115のいずれか1項に記載のIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、
b)前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む、方法。 - IL1RAPを発現している細胞を検出する方法であって、前記方法は、
(a)請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、IL1RAPの発現について分析されるべき細胞と接触させる工程と、
(b)前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてIL1RAPを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。 - 前記方法がインビボ法、エックスビボ法又はインビトロ法である、請求項117に記載の方法。
- 腹膜炎を有する対象における炎症を軽減するための方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減するための方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラーク体積及び/又はアテローム性動脈硬化症プラークサイズを低減する方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 心筋炎を有する対象における炎症及び/又は線維化を軽減する方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 心筋炎又は自己免疫性心筋炎を有する対象における心機能の悪化を打ち消すための方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を低減するための方法であって、前記方法は、
-請求項1~82のいずれか1項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
-請求項83~86のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、
-請求項87~88のいずれか1項に記載のベクター、
-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。 - 全身性硬化症を有する対象における肺線維症を軽減する方法であって、前記方法は、
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-請求項89~93のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞、及び/又は、
-請求項95~98のいずれか1項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
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