JP2024500920A - 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体 - Google Patents

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Abstract

【要約】【解決手段】 本発明は、インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。さらに、抗体を符号化するポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、及びポリヌクレオチド、又はベクターを含む組換え宿主細胞に関するものである。さらに、抗体又は抗原結合フラグメントの産生方法に関するものである。さらに、抗体又は抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組成物に関するものである。さらに、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤での治療に感受性がある疾患又は障害の医薬に使用するための、及び／又は予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断に使用するための、及び／又は、ここで、疾患又は障害が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、抗体又は抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び／又は組成物に関連するものである。【選択図】図１－１

Description

本発明は、抗炎症性、抗線維化性、及び／又は抗腫瘍性の物性を有する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体又はそのフラグメント、ならびにＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達に関連する疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断におけるその使用に関するものである。
サイトカインリガンドのインターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーとその受容体は、炎症、自己免疫、免疫制御、線維化、細胞増殖、腫瘍成長、腫瘍転移、及び宿主防御に関連している。炎症性、自己免疫性、免疫制御性、線維性、及び変性性の疾患や障害、またがんなどの細胞増殖性及び腫瘍性の疾患や障害の病態に寄与する（Ｇａｒｌａｎｄａ Ｃ，Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｆａｍｉｌｙ：ｂａｃｋ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３９：１００３－１０１８（２０１３））．
これらの疾患は、いずれも個人及び社会に多大な負担をもたらすものであり、サイトカインリガンドのＩＬ－１ファミリー及び受容体に関連する炎症性、自己免疫性、免疫制御性、線維化、変性、及び細胞増殖性の疾患又は障害を治療、改善、予防、診断、又は検出する治療法が依然として必要とされている。
ＩＬ－１ファミリーは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γを含む多数のアゴニストサイトカインを含み、これらのサイトカインはそれぞれ固有のＩＬ－１ファミリー細胞膜受容体と結合する。サイトカインが同族受容体に結合すると、ＩＬ－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）と呼ばれる共受容体が受容体複合体を形成し、細胞内のシグナル伝達及びＮＦ－κＢを含む転写因子の活性化を引き起こし、炎症反応を引き起こす。ＩＬ１ＲＡＰは、ＩＬ－１受容体Ｉ（ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを結合）、ＩＬ－３３受容体（ＳＴ２、ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ－３３を結合）、及びＩＬ－３６受容体（ＩＬ１ＲＬ２；ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γを結合）の共受容体で、サイトカインＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γの下流のシグナル伝達に必要である。
ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、ＩＬ１ＲＡＰ依存性受容体の下流のサイトカインシグナルを遮断することができる。興味深いことに、この遮断機能とは別に、ＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体は、他の機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導し、それによってＩＬ１ＲＡＰ発現腫瘍細胞などの標的細胞を死滅させることつながること関しても使用することが可能である。
従来、ＩＬ－１ファミリーのサイトカインリガンドのシグナル伝達経路を減少、阻害、及び／又は遮断することが可能な抗体が、それぞれの抗体の特性に合わせて生成されてきた。例えば、ＷＯ２０１５／１３２６０２は、程度の差こそあれ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３のシグナル伝達を阻害する抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を開示する。
６種類のサイトカイン（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γ）すべてを遮断することは、ＩＬ－１ファミリーのサイトカインリガンド及び受容体を標的とした治療アプローチに関して有益であると期待される。ＩＬ－１α及びＩＬ－１βは強力な炎症性サイトカインであり、急性炎症におけるこれらの関与は広く説明されている。ＩＬ－３３は従来、ＩＬ－５及びＩＬ－１３などの２型サイトカインの産生を誘導するＴｈ２サイトカインと考えられてきた。ＩＬ－３６の機能についてはあまりよく知られていないが、いくつかの研究から、ＩＬ－３６は免疫細胞の活性化に関与し、炎症性サイトカインの放出を誘導することが示唆されている。これらのサイトカインの経路をすべて標的とすることで、疾患関連プロセス、例えば、炎症プロセスをより完全にダウンレギュレーションすることができ、炎症性疾患又は障害を有する患者の治療結果を向上させることができるだろう。
今日まで、インターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーのサイトカインリガンド及び受容体（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達に関連する疾患又は障害の種々の態様に対処する治療オプションが欠如している。現在の治療法は、ＩＬ－１ファミリーサイトカインリガンドに関連する別々の経路を標的にしているだけであり、例えば、炎症及び線維化の態様において、ＩＬ－１ファミリーサイトカインリガンドに関連する複数の経路を同時にダウンレギュレーションすることは、依然として臨床上の課題のままである。結果として、ＩＬ－１ファミリーのサイトカインリガンド及び受容体に関連する多面的な態様を標的とした治療法の改善が急務のままである。
本発明の発明者らは、ＩＬ－１ＲＡＰドメイン２に結合し、６つのＩＬ１ＲＡＰ依存性リガンド；ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γの下流のシグナル伝達を阻害する能力を有する抗体、及びそのバリアントを生成してきた。この優れた特性により、本抗体は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達に関連する疾患及び障害の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断に使用でき、それによりこれらのサイトカインに関連するいくつかの下流経路を同時に標的とすることができる。結果として、本抗体は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達に関連する疾患及び障害のいくつかの態様及びプロセス、例えば炎症性又は線維性の疾患又は障害における炎症性及び線維性の態様、あるいは腫瘍性の疾患又は障害における炎症性、線維性、又は増殖性の態様を標的とすることに使用することができる。本明細書に記載された抗体は、複数のサイトカイン経路を同時に標的とすることができ、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γの経路を標的とし、これは、１つ又はいくつかのサイトカインのみを遮断しても、疾患又は障害の治療又は予防に十分に効果がないであろう疾患又は障害の治療時に臨床的に有利である。さらに、この抗体をヒト化及び脱免疫化することで最適化し、微調整された特性を有する抗体変異となることも開示されている。
本発明の第１の態様は、インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又は抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ１と、
ｂ）ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ２と、及び
ｃ）ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び／又は
重鎖可変領域であって、
ｄ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ１と、
ｅ）ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ２と、及び
ｆ）ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ３と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチドに関するものである。
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関するものである。
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド又は本発明の第３の態様にかかるベクターを含む組換え宿主細胞に関するものである。
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法に関し、前記方法は、本発明の第２の態様のポリヌクレオチド又は本発明の第３の態様のベクターを含む本発明の第４の態様の宿主細胞を、符号化された抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む。
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、及び／又は
本発明の第４の態様の宿主細胞、
を医薬組成物に含み、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物に関するものである。
本発明の第７の態様は、
医療に使用するための、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様の組成物に関するものである。
本発明の第８の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様の組成物に関するものであり、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断に使用するためのものであり、及び／又はここで、前記疾患又は障害は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する。
本発明の第９の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様に係る宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様の組成物に関するものであり、
対象の腫瘍性の疾患に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導し、及び／又は成長及び／又は増殖を阻害するために使用するためのものであり、ここで、前記細胞が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する。
本発明の第１０の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様に係る宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様の組成物の使用に関するものであり、
ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断のための医薬品の調製における使用に関するものであり、
及び／又は、前記疾患又は障害が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する。
本発明の第１１の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様に係る宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様の組成物の使用に関するものであり、
ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び／又は診断のための医薬品の調製に使用する。
本発明の第１２の態様は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナルの阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断のための方法、及び／又は前記疾患又は障害が、対象のＩＬ１ＲＡＰ発現細胞に関するものであり、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第１３の態様は、対象においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞を検出するためのインビトロ方法に関するものであり、前記方法は、
（ａ）生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
（ｂ）任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び／又は精製する工程と、
（ｃ）本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
（ｄ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
本発明の第１４の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有する患者を同定するためのインビトロ方法に関するものであり、
（ａ）検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び／又は精製する工程と、
（ｃ）本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
（ｄ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るだろう患者を示すものである。
本発明の第１５の態様は、細胞の発現ＩＬ１ＲＡＰに関連する疾患又は障害を有する患者を治療するための方法に関し、前記方法は、
ａ）本発明の第１４の態様にかかる方法を用いて、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、及び
ｂ）前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む、方法。
本発明の第１６の態様は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞を検出するための方法に関するものであり、前記方法は、
（ａ）第１の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントを、ＩＬ１ＲＡＰの発現について分析すべき細胞と接触させる工程と、
（ｂ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
本発明の第１７の態様は、腹膜炎を有する対象における炎症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第１８の態様は、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第１９の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減する方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２０の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象においてアテローム性動脈硬化症プラーク体積及び／又はアテローム性動脈硬化症プラークサイズを低減する方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２１の態様は、心筋炎を有する対象における炎症及び／又は線維化を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２２の態様は、心筋炎又は自己免疫性心筋炎を有する対象における心機能の悪化を打ち消すための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２３の態様は、全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２４の態様は、全身性硬化症を有する対象の肺線維症を軽減する方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
図１：抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０が急性腹膜炎モデルで炎症を抑制する ＷＴ又はＫＯマウスにＭＳＵ結晶を免疫し、免疫後６時間後に、浸潤細胞の定量化のため腹膜洗浄液でフローサイトメトリーを行った（Ａ）。ＷＴマウスは、ＭＳＵ結晶で免疫する１時間前に、ｍＣＡＮ１０、ＩＬ１ＲＡ、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）、又はＰＢＳのみで処理した。免疫後６時間後に腹膜洗浄液は、フローサイトメトリーによる浸潤細胞の定量化（Ｂ）、又はルミネックスアッセイによるサイトカイン及びケモカインの定量化（Ｃ）のために採取された。 図２：抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０が乾癬及び乾癬性関節炎モデルにおいて重症度を抑制する ＢＡＬＢ／ｃマウスの剃毛した背中にイミキモドを７日間投与し、乾癬を誘発させた。この間、マウスをｍＣＡＮ１０、抗ＩＬ－１β抗体（抗ＩＬ－１β）、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプ抗ＩＬ－１β，アイソタイプｍＣＡＮ１０）、デキサメタゾン、又はＰＢＳのみ（ビヒクル）で３度処理した。重症度は７日間を通して、背部領域の炎症と紅斑をスコア化することで評価した（Ａ及びＢ）。Ｂ６Ｎ．Ｑ．ＮＣＦ１マウスにサッカロマイセス・セレビシエ由来のマンナンを投与し、乾癬性関節炎を誘発した。マウスをＡ及びＢと同様に処理し、７日間を通して、すべての前足の関節の炎症をスコア化することによって疾患の重症度を評価した（Ｃ及びＤ）。７日目にマウスを犠牲にして採血し、血漿中のＩＬ－１７濃度を分析した（Ｅ）。 図３：ｍＣＡＮ１０は動脈硬化モデルにおける大動脈プラークの炎症を抑制する アポリポタンパク質Ｅ（アポｅ）ＫＯマウスに高コレステロール食（ＨＣＤ）を与えることによって、動脈硬化性病変の発生を誘導した。ＨＣＤ投与４週後、マウスにｍＣＡＮ１０又はアイソタイプ対照抗体（アイソ）を隔週（週２回）で６週間投与した。この間、マウスはＨＣＤで飼育された。実験終了後、マウスを犠牲にし、ＣＤ４５＋細胞（Ａ）、ＣＤ１１ｂ＋細胞及びＬｙ６Ｇ＋好中球などの骨髄系細胞（Ｂ及びＣ）、ならびにＴＣＲ－β＋細胞、ＣＤ４＋細胞、及びＣＤ８＋細胞などのＴリンパ球（Ｄ－Ｆ）のフローサイトメトリー分析のために大動脈を採取した。 図４：ｍＣＡＮ１０は動脈硬化モデルにおいて大動脈プラークのサイズを縮小する マウスは、図３について説明したように処理した。実験終了後、マウスを犠牲にし、心臓を採取し、大動脈起始部の切片をオイルレッドＯで脂質蓄積を染色し、プラーク体積（Ａ）及び面積（Ｂ）の両方を比較した。 図５：抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０が実験的自己免疫性心筋炎（ＥＡＭ）の炎症と線維化を抑制する ＢＡＬＢ／ｃマウスに、完全フロイントアジュバントで乳化したα－ミオシン重鎖ペプチドを２回免疫することにより、ＥＡＭを誘導した。最終免疫後７日目から、マウスにｍＣＡＮ１０、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）又はＰＢＳのみを隔週で４週間投与した。実験終了後、マウスを犠牲にして心臓を採取し、心臓切片をＨ＆Ｅ染色して炎症の程度を評価（Ａ及びＢ）し、又はマッソン三色染色して線維化の程度を評価（Ｃ及びＤ）した。 図６：抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は実験的自己免疫性心筋炎における心機能低下に対応する ＢＡＬＢ／ｃマウスに、完全フロイントアジュバントで乳化したα－ミオシン重鎖ペプチドを２回免疫することにより、ＥＡＭを誘導した。最終免疫の日（７日目）から、マウスにｍＣＡＮ１０、抗ＩＬ－１β抗体（抗ＩＬ－１β）、又はアイソタイプ対照抗体（アイソタイプ抗ＩＬ－１β，アイソタイプｍＣＡＮ１０）を隔週で５週間投与した（Ａ）。代替的に、マウスをｍＣＡＮ１０、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプｍＣＡＮ１０）、ＩＬ１ＲＡ、プレドニゾン、又はビヒクル対照（ビヒクルＩＬ１ＲＡ，ビヒクルプレドニゾン）で毎日５週間処理した（Ｂ）。任意に、マウスは、Ａと同様にｍＣＡＮ１０、アイソタイプ対照抗体（アイソタイプ）、又はビヒクル対照（ＰＢＳ）を受けたが、治療は最終免疫後（１４日目）７日目から開始した（Ｃ）。試験開始時、及び２８日目及び４２日目に経胸壁心エコーで心機能を評価した。 図７：ｍＣＡＮ１０が強皮症慢性移植片対宿主病（ｓｃｌ ｃＧｖＨＤ）モデルマウスにおける皮膚線維化を改善する 雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｄ）レシピエントマウスに、雄のＢ１０．Ｄ２ドナーマウス（Ｈ－２ｄ）の骨髄を同種移植し、ｓｃｌ ｃＧｖＨＤを発症するＭＨＣミスマッチモデルを作成した。対照として、同じレシピエントマウスに、雌のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｄ）ドナーマウスの骨髄をシンジェニック移植で投与したところ、発病はなかった。移植後２１日目にｍＣＡＮ１０（初回２０ｍｇ／ｋｇ、以降１０ｍｇ／ｋｇ）、又は同量のアイソタイプ対照抗体（アイソ）を隔週で４週間投与した。代替的に、これらのマウスに５０ｍｇ／ｋｇのニンテダニブを経口投与で毎日４週間投与した。シンジェニック移植を受けたマウスは、アイソタイプ対照抗体（アイソ）のみで処理した。４９日目にマウスを犠牲にし、背中上部の皮膚サンプルを採取して、皮膚の厚さ（Ａ）、線維芽細胞の数（Ｂ）、又はヒドロキシプロリン含有量の定量化（Ｃ）のための組織学的評価を行った。 図８：ｍＣＡＮ１０はｓｃｌ ｃＧｖＨＤのマウスモデルで肺線維症を改善する マウスは、図７について説明したように処理した。移植後４９日目にマウスを犠牲にした後、肺を採取し、アシュクロフトスコア（Ａ）の決定、及びシリウスレッドで染色した領域（Ｂ）、又はヒドロキシプロリン含有量の定量化（Ｃ）のための組織学的評価を実施した。 図９：ｍＣＡＮ１０はｓｃｌ ｃＧｖＨＤのマウスモデルで体重減少を改善する マウスは、図７について説明したように処理した。移植後、マウスは試験期間中継続して体重を測定し、移植後４９日目に最終的な判定を行った。 図１０：ｍＣＡＮ１０は、ｓｃｌ ｃＧｖＨＤモデルマウスにおいて、ＩＬ－１ファミリー遺伝子の発現プロファイルを変化させる マウスは、図７について説明したように処理した。移植後４９日目にマウスを犠牲にした後、背中上部の皮膚サンプルをＲＮＡシークエンスに用い、表示されたＩＬ－１ファミリーメンバーの遺伝子発現レベルの変化を視覚化したヒートマップを生成した。同種移植マウス（Ａｌｌｏ）、同種移植マウス（Ｓｙｎ）、ｍＣＡＮ１０を投与した同種移植マウス（Ｔｒｅａｔ）の各群から４試料ずつ採取した結果を示す。 図１１：ｍＣＡＮ１０はｓｃｌ ｃＧｖＨＤのマウスモデルにおいて、全身性硬化症患者でも発現が異なる遺伝子の発現を変化させる マウスは、図７について説明したように処理した。移植後４９日目にマウスを犠牲にした後、背中上部の皮膚サンプルをＲＮＡ配列解析に使用した。全身性硬化症（ＳＳｃ）患者のトランスクリプトームプロファイルは、患者１４３名と健常者２２名を含む患者コホートＮＣＢＩ／ＧＥＯ／ＧＳＥ１３０９５５から検索された。重複する遺伝子の数は、ベン図で可視化した。 図１２：キメラ４８Ｄ２の細胞膜ＩＬ１ＲＡＰへの用量依存的な結合 キメラ４８Ｄ２又はｈＩｇＧ１（ｈＩｇ＝ヒト免疫グロブリン）アイソタイプ対照抗体をＳＫＭＥＬ－５細胞に濃度を上げて添加し、細胞外結合をフローサイトメトリーで分析した。キメラ４８Ｄ２は、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較して、用量依存的に細胞膜上のＩＬ１ＲＡＰと高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）をもって特異的に結合した。 図１３：キメラ４８Ｄ２によるインターロイキンシグナル伝達の阻害 キメラ４８Ｄ２のＩＬ－１α（Ａ）、ＩＬ－１β（Ｂ）、ＩＬ－３３（Ｃ）、ＩＬ－３６α（Ｄ）、ＩＬ－３６β（Ｅ）、及びＩＬ－３６γ（Ｆ）シグナル伝達を遮断する能力をＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）アッセイで調べた。ｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体は対照として含まれた。点線は陽性対照（サイトカインで刺激した細胞）と陰性対照（細胞のみ）を示し、阻害の窓を説明する。キメラ４８Ｄ２は、６種類のサイトカインすべての下流のシグナルを遮断する。 図１４：キメラ４８Ｄ２は、ヒト、カニクイザル、ブタのＩＬ１ＲＡＰに結合する キメラ４８Ｄ２とＩＬ１ＲＡＰオルソログの交差反応性をＥＬＩＳＡによって測定した。キメラ４８Ｄ２は、ヒト（ｈＩＬ１ＲＡＰ）、カニクイザル（ｍｆＩＬ１ＲＡＰ）、及びブタ（ｓｓＩＬ１ＲＡＰ）のＩＬ１ＲＡＰと反応し、マウス（ｍＩＬ１ＲＡＰ）、ラット（ｒｎＩＬ１ＲＡＰ）、ウサギ（ｏｃＩＬ１ＲＡＰ）、又はイヌ（ｃｌＩＬ１ＲＡＰ）ＩＬ１ＲＡＰとは反応しない。 図１５：ヒト化４８Ｄ２バリアントによるインターロイキンシグナル伝達の阻害 ヒト化（ｈ）４８Ｄ２ ＶＨバリアントＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、及びＶＬバリアントＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、及びＶＬ５の組み合わせによるＩＬ－１α（Ａ－Ｅ）、ＩＬ－１β（Ｆ－Ｊ）、及びＩＬ－３３（Ｋ－Ｏ）シグナル伝達を遮断する能力をＨＥＫ－ＢＬＵＥ（商標）試験で調査した。 ＶＨ５を持つｈ４８Ｄ２のバリアントは、キメラ４８Ｄ２と同程度に下流シグナル伝達を遮断し、さらにＩＬ－３６α（Ｐ）、ＩＬ－３６β（Ｑ）、及びＩＬ－３６γ（Ｒ）の阻害について調査した。ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、又はＶＨ４を持つｈ４８Ｄ２のバリアントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３のシグナルを様々な程度で阻害した。ｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体とキメラ４８Ｄ２は対照として含まれる。点線は、阻害の窓を説明するために、陽性（サイトカインで刺激した細胞）と陰性（細胞のみ）の対照を示す。ＶＨ５を保有するｈ４８Ｄ２のバリアントと任意のＶＬバリアント（ＶＬ１－ＶＬ５）の組み合わせは、キメラ４８Ｄ２と同程度に６種類のインターロイキンの下流シグナル伝達を遮断する。 図１６：ヒト化及び非免疫化クローン２種の細胞膜ＩＬ１ＲＡＰへの用量依存的な結合 ヒト化及び非免疫化４８Ｄ２クローンの２種のうち、ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬをＳＫＭＥＬ－５細胞に濃度を上げて添加し、フローサイトメトリーで細胞外結合を解析した。キメラ４８Ｄ２及びｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体は、対照として含めた。ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬは、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体及びキメラ４８Ｄ２抗体と比較して、用量依存的に、高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）で細胞膜上のＩＬ１ＲＡＰと特異的に結合した。 図１７：脱免疫化したｈ４８Ｄ２クローンは、６つ全てのインターロイキン経路上で阻害活性を維持した ＩＬ－１α（Ａ）、ＩＬ－１β（Ｂ）、ＩＬ－３３（Ｃ）、ＩＬ－３６α（Ｄ）、ＩＬ－３６β（Ｅ）、及びＩＬ－３６γ（Ｆ）シグナル伝達上での脱免疫ｈ４８Ｄ２クローンの阻害活性を、ＨＥＫ－ＢＬＵＥ（商標）アッセイで評価した。ｈＩｇＧ１アイソタイプ抗体、ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ５は対照として含めた。点線は、阻害の窓を説明するために、陽性（サイトカインで刺激した細胞）と陰性（細胞のみ）の対照を示す。６つの非免疫化クローンとも、ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ４及びＶＨ５：ＶＬ５、ならびに同様の阻害活性を有した。さらに、ＩＬ－３６受容体を安定発現させたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）で、ｈ４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４のＩＬ－３３（Ｇ），ＩＬ－３６α（Ｈ），ＩＬ－３６β（Ｉ），ＩＬ－３６γ（Ｊ）に対する阻害活性を評価した。 図１８：脱免疫ｈ４８Ｄ２クローンは、ヒト、カニクイザル、及びブタのＩＬ１ＲＡＰに結合する 交差反応性はＥＬＩＳＡで測定した。ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４（Ａ）及びＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬ（Ｂ）は、ヒト（ｈＩＬ１ＲＡＰ）、カニクイザル（ｍｆＩＬ１ＲＡＰ）、及びブタ（ｓｓＩＬ１ＲＡＰ）ＩＬ１ＲＡＰと交差反応し、マウス（ｍＩＬ１ＲＡＰ）、ラット（ｒｎＩＬ１ＲＡＰ）、ウサギ（ｏｃＩＬ１ＲＡＰ）、又はイヌ（ｃｌＩＬ１ＲＡＰ）ＩＬ１ＲＡＰとは反応しない。 図１９：ｈＩｇＧ１フォーマットの４８Ｄ２がＩＬ１ＲＡＰを発現するＳＫＭＥＬ－５細胞のＡＤＣＣを誘導する ＩＬ１ＲＡＰ発現ＳＫＭＥＬ－５細胞とヒトＮＫ細胞を用いてインビトロでＡＤＣＣアッセイを行い、死滅したＳＫＭＥＬ－５細胞の数をフローサイトメトリーで解析し、％死滅（ＤＡＰＩ陽性）細胞として示した。ｈＩｇＧ１フォーマットの４８Ｄ２は、用量依存的にＳＫＭＥＬ－５細胞を死滅させるＮＫ細胞を誘導することができる。４８Ｄ２をｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡで発現させた場合、用量依存的なＡＤＣＣは誘導されなかった。アイソタイプ－ｈＩｇＧ１及びアイソタイプ－ＬＡＬＡは、未処理細胞で観察されるバックグラウンド細胞死以上のＡＤＣＣを誘導しなかった。 図２０：４８Ｄ２は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるサイトカイン誘発性ＩＬ－６ｍＲＮＡ発現を阻害する ヒト初代皮膚線維芽細胞をインビトロで培養し、キメラ４８Ｄ２の添加の有無にかかわらず、ＩＬ－１αもしくはＩＬ－１β（Ａ）又はＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β又はＩＬ－３６γ（Ｂ）で刺激した。データは、未刺激の対照（０ｎｇ／ｍＬ）と比較したときの倍率変化（２－ｄｄＣＴ）で示す。すべてのサイトカインは用量依存的にＩＬ－６ｍＲＮＡの発現を誘導し、４８Ｄ２は刺激していない対照と同程度のレベルまでその増加を阻害した。 図２１：ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、ヒト全血においてＩＬ－１βによるサイトカイン及びケモカイン放出を阻害する ２人のヒトドナーから血液を採取し、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４と３０分間インキュベートした。続いて、血液をＩＬ－１β又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のいずれかで２０時間刺激した。プレートを遠心分離し、血漿層を採取し、ヒトサイトカイン／ケモカイン７１－Ｐｌｅｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｓｓａｙ Ａｒｒａｙで分析した。Ｇ－ＣＳＦ（Ａ）、ＧＲＯα／ＣＸＣＬ１（Ｂ）、ＩＬ－１７Ａ（Ｃ）、及びＴＮＦ－α（Ｄ）のレベルは、２人のドナーのうちの１人について示される。 図２２：ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、血液ループシステムでＩＬ－１βによるサイトカイン放出を阻害する １０人のヒトドナーから血液を採取し、血液ループシステムに移し替えた。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を３２μｇ／ｍｌで血液に投与し、１５分後に１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βを添加した。ループを４時間実行した。血液サンプルから血漿を採取し、ＭＳＤのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）テクノロジーを用いてＩＬ－６（Ａ）及びＩＬ－８（Ｂ）のレベルを測定した。 図２３：ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４はＩＬ１ＲＡＰ発現細胞で内在化される ＷＴ及びＩＬ１ＲＡＰ ＫＯ ＳＫＭＥＬ細胞を、蛍光標識ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４又はアイソタイプ対照（アイソＣｔｒｌ）とともに、Ｉｂｉｄｉ－ｔｒｅａｔ顕微鏡チャンバースライドで１、２又は４時間インキュベートした。細胞核はＤＡＰＩで染色した。細胞内をスキャンした光学切片を相互作用的に視覚解析し、代表的な画像を撮影して、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の膜結合と内在化（矢印で示す）を評価した。 図２４：ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞による内在化によりリソソーム又はエンドソームに局在する ＷＴ ＳＫＭＥＬ細胞をＩｂｉｄｉ－ｔｒｅａｔ顕微鏡チャンバースライドで１、２、又は４時間、蛍光標識ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４とインキュベートした。さらに、エンドソーム及びリソソームを検出するために、それぞれＥＥＡ１及びＬａｍｐ１というマーカーを染色した。細胞核はＤＡＰＩで染色した。細胞をスキャンした光学切片を相互作用的に視覚解析し、代表的な画像を撮影して、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４染色とＥＥＡ１及びＬａｍｐ１染色の重複を評価した。 図２５：ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットのＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、Ｆｃを介したサイトカイン放出を誘導しない １０人のヒトドナーから血液を採取し、血液ループシステムに移し替えた。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、指示されたように濃度を上げて血液に添加した。代替的に、抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブを添加した。ループを４時間実行した。血液サンプルから血漿を採取し、ＭＳＤのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）テクノロジーを用いてＩＦＮ－γ（Ａ），ＩＬ－６（Ｂ），ＩＬ－８（Ｃ），ＴＮＦ－α（Ｄ）のレベルを測定した。 図２６：ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットのＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、Ｆｃを介した補体活性化を誘導しない １０人のヒトドナーから血液を採取し、血液ループシステムに移し替えた。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、指示されたように濃度を上げて血液に添加した。代替的に、抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブを添加した。ループは１５分間実行した。血液サンプルから血漿を採取し、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈのＥＬＩＳＡキットを用いて補体分割産物Ｃ３ａ（Ａ）及びＣ５ａ（Ｂ）を測定することにより補体の活性化を分析した。 図２７：カニクイザルへの単回静脈内投与後のＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の血清中濃度 ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、各用量レベルについて、１匹の雄（Ｍ）及び１匹の雌（Ｆ）カニクイザルに５、２０、又は５０ｍｇ／ｋｇを単回で静脈内投与した。投与後０．０８３、１、３、６、２４、４８、９６、１６８、２６４、及び３３６時間に血液を採取し、血清を採取した。血清サンプルをＩＬ１ＲＡＰコートしたＭＳＤプレートに移し、電気化学発光ラベルと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、発光強度を測定することでサンプル中のＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４が検出された。 図２８：カニクイザルへの単回静脈内又は皮下投与後のＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の血清中濃度 ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を雌のカニクイザル２頭に単回で１０ｍｇ／ｋｇを静脈内又は皮下に投与した。投与後０．０８３、０．５、１、３、６、２４、４８、９６、１６８、２６４、３３６、４８０、及び６７２時間に採血し、血清を得た。血清サンプルをＩＬ１ＲＡＰコートしたＭＳＤプレートに移し、電気化学発光ラベルと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を加え、発光強度を測定することでサンプル中のＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４が検出された。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別途言及されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「抗体」への言及は、１つ以上の抗体、少なくとも１つの抗体、又は２つ以上の抗体など、そのような抗体の複数を含む。同様に、「１つの抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体」は、例えば実施例９～２２に記載された抗体バリアントのように、「複数の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体」を指すこともできる。
用語「いくつかの実施形態」は、１つの実施形態、又は１つを超える実施形態を含み得る。
「ａ」又は「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語とともに使用される場合、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１又は１を超える」の意味とも一致してもよい。
ＩＬ１ＲＡＰ抗体
本発明の第１の態様は、インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントに関し、抗体又は抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ１と、
ｂ）ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ２と、及び
ｃ）ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び／又は
重鎖可変領域であって、
ｄ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ１と、
ｅ）ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ２と、及び
ｆ）ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ３と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは：
軽鎖可変領域であって、
ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１と、
ｂ）ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２と、及び
ｃ）ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、前記軽鎖可変領域、
及び／又は
重鎖可変領域であって、
ｄ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１と、
ｅ）ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２と、及び
ｆ）ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３と、を含む前記重鎖可変領域、を含む。
本明細書で使用される用語「インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質」、「ＩＬ１ＲＡＰ」、及び「ＩＬ１－ＲＡＰ」は、例えば、ジェンバンクアクセッション番号ＡＡＢ８４０５９、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１７３．１及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＰＨ３－１に記載のようなヒトＩＬ１ＲＡＰタンパク質を特に含む。ＩＬ１ＲＡＰは、科学文献ではＩＬ１Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、ＦＬＪ３７７８８、ＩＬ－１ＲＡｃＰ、及びＥＧ３５５６としても知られる。
本明細書で使用する用語「ｍＣＡＮ１０」（「ｍｕｒｉｎｅ ＣＡＮ１０」の略称）は、マウスＩＬ１ＲＡＰに対する抗体を意味する。本抗体は、マウス代用物抗－ＩＬ１ＲＡＰ抗体とも表記される。ｍＣＡＮ１０は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γによるシグナル伝達を遮断することができるため、マウスＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性を欠く可能性がある抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体の代用として、同様の機能特性を有し、マウス疾患モデルにおけるＩＬ１ＲＡＰ遮断の治療効果評価に使用することができる。
本明細書で使用する「４８Ｄ２」という用語は、抗体が他の種由来のＩＬ１ＲＡＰにも結合し得ることにかかわらず、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する抗体を指す。例えば、４８Ｄ２がヒト、カニクイザル、及びブタ由来のＩＬ１ＲＡＰと交差反応することは、実施例１０から理解されるだろう。実施例９及び実施例１０から理解されるだろうように、用語「４８Ｄ２」は、実施例９に記載され、実施例１０で特徴付けられるように取得されるキメラ抗体（「ｃｈ４８Ｄ２」とも呼ばれる）を示すために使用され得る。
本明細書で使用する「ｈ４８Ｄ２」という用語は、実施例１１で生成され、実施例１２でさらに特徴付けられるようにヒト化された抗体４８Ｄ２を指す。実施例１２に記載したように、ｈ４８Ｄ２のいくつかのバリアントが得られた（例えば、表８参照）。実施例１３に記載したように、ｈ４８Ｄ２のいくつかのさらなるバリアントが、脱免疫化によって得られる。
抗体及びそのフラグメントはポリペプチドであるため、「本発明の抗体又は抗原結合フラグメント」は、「本発明のポリペプチド」又は「抗体ポリペプチド、又はその抗原結合フラグメント」と言及され得ることは理解されるだろう。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰに対して特異性を有する。「特異性」とは、抗体又は抗原結合フラグメントが、インビボ、すなわちＩＬ１ＲＡＰが人体内に存在する生理的条件下でＩＬ１ＲＡＰに結合できることを意味する。好ましくは、抗体又は抗原結合フラグメントは、インビボで他のタンパク質に結合しない。代替的に、抗体又は抗原結合フラグメントが、エックスビボ又はインビトロでＩＬ１ＲＡＰに結合することができることを意味する。このような結合特異性は、ＩＬ１ＲＡＰを発現するトランスフェクト細胞を用いたＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの当該技術分野で周知の方法によって決定することができる。有利なことに、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰに選択的に結合することができる、すなわち、他のタンパク質よりもＩＬ１ＲＡＰに少なくとも１０倍以上強く結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ１ＲＡＰに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、非ヒトＩＬ１ＲＡＰに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、カニクイザル由来のＩＬ１ＲＡＰに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ブタ由来のＩＬ１ＲＡＰに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞の表面上に発現したＩＬ１ＲＡＰに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰの細胞外ドメイン上のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、可溶性ＩＬ１ＲＡＰに結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に結合する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸１３５～２３４において、又はその内部でＩＬ１ＲＡＰを結合する。
したがって、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２における／その内部の（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：９０５－９１２を参照，その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）、すなわちＩＬ１ＲＡＰ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ内のアクセッション番号Ｑ９ＮＰＨ３を参照）のアミノ酸１３５から２３４内にあるエピトープに結合できる可能性を有する。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントが結合するエピトープは、ＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸１３５～１５４、１５５～１７４、１７５～１９４、１９５～２１４、又はアミノ酸２１５～２３４の間、又はアミノ酸１７４～１９１の間に位置しうる。しかしながら、エピトープが非直線状であってもよいことは理解されるだろう。
さらなる実施形態において、上述したように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、アフィボディ、テトラネクチン（ＣＴＬＤ）、アデクチン（モノボディ）、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎｓ（アンカリン）、アビマー、ｉＭａｂｓ、マイクロボディ、ペプチドアプタマー、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、及びアフィリンを含むか、又はそれらからなる群から選択される抗体模倣物を含むか、又はそれからなるものである。
「抗体又はその抗原結合フラグメント」という用語は、実質的にインタクトな抗体だけでなく、抗体のフラグメントや誘導体も含む。インタクトな抗体とは、可変光領域、可変重領域、定常光領域、及び定常重領域を含む抗体としてみなすことができる。さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、単離ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖、及び／又は軽鎖のホモダイマー及びヘテロダイマー、ならびに抗原結合フラグメント及びその誘導体も含む。好適な抗原結合フラグメント及び誘導体としては、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント及びＦ（ａｂ）２フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨ及びＶＬドメイン）及びドメイン抗体（ｄＡｂｓ、単一フォーマット及びデュアルフォーマットを含む［すなわち、ｄＡｂ－ｌｉｎｋｅｒ－ｄＡｂ］］）があるが、必ずしも限定されない。抗体全体ではなく、抗体フラグメントを使用することの潜在的な利点は、数倍になる。フラグメントのサイズが小さくなることで、固形組織への浸透性が向上するなど、薬理学的特性が改善される可能性がある。さらに、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントは、大腸菌で発現させ、及びそこから分泌させることができるので、大量に生産することが容易にできる。
また、「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、抗体模倣体（例えば、高い安定性を持ちながら特定の位置で可変性を導入できる非抗体足場構造）を包含することを意図する。生化学の技術分野の当業者であれば、多くのそのような分子に精通しており、Ｇｅｂａｕｅｒ ＆ Ｓｋｅｒｒａ，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３（３）：２４５－２５５（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。例示的な抗体模倣体は：アフィボディ（トリネクチンとも呼ばれる；Ｎｙｇｒｅｎ，２００８，ＦＥＢＳ Ｊ，２７５，２６６８－２６７６）；ＣＴＬＤｓ（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎｓ とも呼ばれるＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００６），２７－３０）；アドネクチン（モノボディとも呼ばれる；Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５２（２００７）、９５－１０９）；アンチカリン（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ（２００５）、１０、２３－３３）；ＤＡＲＰｉｎｓ（アンカリン；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４），２２，５７５－５８２）；ａｖｉｍｅｒｓ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３，１５５６－１５６１）；微小体（ＦＥＢＳ Ｊ，（２００７），２７４，８６－９５）；ｐｅｐｔｉｄｅ ペプチドアプタマー（Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００５），５，７８３－７９７）；Ｋｕｎｉｔｚドメイン（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２００６）３１８，８０３－８０９）；ａｆｆｉｌｉｎｓ（Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００５），２３，５１４－５２２）；ａｆｆｉｍｅｒｓ（Ａｖａｃｔａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｔｈｅｒｂｙ，ＵＫ）を含む。
また、本発明の範囲に含まれるのは、キメラＴ細胞受容体（キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体、及びキメラ抗原受容体又はＣＡＲとしても知られている）（Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ ５（３）：２１１－２６，その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。これは、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を移植する操作された受容体である。通常、ＣＡＲはモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に移植するために使用され、そのコード配列の移植はレトロウイルスベクターによって促進される。そのような分子の最も一般的な形態は、ＣＤ３－ｚｅｔａの膜貫通部及びエンドドメインが融合したモノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む融合体である。Ｔ細胞はこの融合分子を発現すると、転移したモノクローナル抗体の特異性を発現する標的細胞を認識し、殺傷する。
当業者はさらに、本発明が、現在存在するか将来存在するかを問わず、例えば、ポリエチレングリコール又は他の適切なポリマー（下記参照）の共有結合によって修飾される、抗体及びその抗原結合フラグメントの修飾バージョンも包含することを理解するだろう。
抗体及び抗体フラグメントを生成する方法は、当技術分野でよく知られる。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Ｏｒｌａｎｄｉ．ｅｔ ａｌ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３８３３－３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３－２９９，これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）又は培養中の細胞株によるモノクローナル抗体分子の生成を用いたいくつかの方法のうちの任意の１つを介して生成され得る。ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ ．，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５０４９７；Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１－４２；Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６－２０３０；Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２：１０９－１２０，これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）などを含むが、これらに限定されない。
モノクローナル抗体の製造のための好適な方法は、また、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８，これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）ａｎｄ ｉｎ “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８２，これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。
同様に、抗体フラグメントは、当技術分野で周知の方法を用いて得ることができる（例えば、参照、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，１９８８，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、又は大腸菌もしくは哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物又は他のタンパク質発現系）において、フラグメントをコード化するＤＮＡを発現させることによって調製される。また、抗体全体を常法によりペプシン又はパパインで消化することにより、抗体フラグメントを得ることができる。
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語には、標準的な２０種類の遺伝子符号化アミノ酸と、（天然の「Ｌ」形と比較して）「Ｄ」形のそれらの対応する立体異性体、オメガアミノ酸及び他の天然に存在するアミノ酸、非従来型アミノ酸（例えば、α，α－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸など）及び化学的に誘導体化（下記参照）したアミノ酸が含まれる。
「アラニン」、「Ａｌａ」、「Ａ」のようにアミノ酸を具体的に列挙する場合、明示的に別段の記載がない限り、Ｌ－アラニン及びＤ－アラニンの両方を指す。また、本発明のポリペプチド（抗体又はその抗原結合フラグメント）は、所望の機能特性が抗体又は抗原結合フラグメントに保持される限り、他の非従来型アミノ酸も好適な構成要素となり得る。示されたアミノ酸配列について、適切な場合、各符号化されたアミノ酸残基は、従来のアミノ酸のトリビア名に対応する１文字の指定によって表される。
いくつかの実施形態において、本発明の、本明細書で定義される抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｌ－アミノ酸を含む、又はそれらからなる。
ヒト治療の場合、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましく使用されることは、当業者には理解されることだろう。非ヒト抗体のヒト化体（例えば、実施例９及び１０に記載のウサギ抗体）は、非ヒト抗体由来の好ましくは最小部分を有する遺伝子操作されたキメラ抗体又は抗体フラグメントである。ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補的な決定領域を、所望の機能を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の相補的な決定領域の残基で置換した抗体を含む。いくつかの実施例において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入された相補性決定領域やフレームワーク配列にも存在しない残基も含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変ドメインの実質的なすべてを含み、相補性決定領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域のすべて、又は実質的にすべてが関連するヒトコンセンサス配列のものに対応する。ヒト化抗体は、最適には、一般的にヒト抗体由来のＦｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部を含む。本明細書の他の箇所で議論したように、ヒト化抗体はマウスＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性を欠く場合がある。このように、ヒト化抗体と同様の機能特性を示す適切なサロゲート（代用）（例えば、ｍＣＡＮ１０）をマウス疾患モデルで使用することができ、サロゲートの結果はヒト化抗体の機能性を反映していると解釈することができる。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトであるソースからその中に導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基と呼ばれ、通常、輸入された可変ドメインから取り出される。ヒト化は、ヒトの相補性決定領域を対応するげっ歯類の相補性決定領域で置き換えることによって実質的に行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が、非ヒト種からの対応する配列で置換されているものである。実際には、ヒト化抗体は、相補性決定領域残基の一部と、場合によってはフレームワーク残基が齧歯類抗体の類似部位の残基で置換された、典型的なヒト抗体であると考えられる。
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーなど、当技術分野で知られる様々な技術を用いて同定することもできる。
抗体の最適化、例えばヒト化によって（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－ ５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８．Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６１；ＵＳ４，８１６，５６７を参照、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる） 及び／又は脱免疫化、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５２５：４０５－２３）又は実施例１１及び１３に記載され、微調整された特性を持つ抗体バリアントの生成につながる。
ＣＤＲｓ
本発明の抗体は、その特徴的な相補性決定領域（ＣＤＲ）配列によって定義される。抗体のＣＤＲ配列を定義するには、いくつかのアプローチがある。本発明の抗体のＣＤＲは、３つの異なるよく知られたアプローチで定義されてきた（結果として、３つのＣＤＲ定義カテゴリーがある）：１）Ｋａｂａｔによる定義、２）ＩＭＧＴによる定義、又は３）ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの組み合わせにかかる定義。
各ＣＤＲ定義カテゴリー（それぞれＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ、又はＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの組み合わせ）内で、ＣＤＲ配列は、キメラ抗体４８Ｄ２及びそのすべての最適化抗体変異体、例えばヒト化抗体変異体又はヒト化／脱免疫化抗体変異体（「配列」の項におけるそれぞれの配列に示される参照）で同じであることに注目することが重要である。
当業者は、６つのＣＤＲのセット（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）は、ｉ）ＩＭＧＴ、又はｉｉ）Ｋａｂａｔ、又はｉｉｉ）Ｋａｂａｔ及びＩＭＧＴの組み合わせのいずれかに従って定義することができると理解するだろう。
さらに、当業者は、当技術分野で知られている他のアプローチ、例えば、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７） ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８）、Ｍａｒｔｉｎ（強化したＣｈｏｔｈｉａ）、Ｇｅｌｆａｎｄ又はＨｏｎｎｅｇｅｒによるＣＤＲの定義によって、本発明の抗体のＣＤＲを定めることが可能であることを理解するであろう。さらに、ＡｂＭ定義（Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアで使用されるＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の組み合わせ）又は接触定義（結晶構造の分析に基づく）などのアプローチが存在し、当技術分野で知られる。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９８７ ａｎｄ １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．），Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｃ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；２９（３）：１８５－２０３）及び Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ／Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１８）を参照。
当業者は、本明細書で提示したＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ ＣＤＲを提供された場合、既知の情報を使用して、他のＣＤＲ命名規則又はアプローチ（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ）をリストすることができる。したがって、ＣＤＲの命名規則やアプローチはすべて包含される。
明細書に示すように、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの番号付けシステムでは、ＣＤＲとしてわずかに異なる残基が同定された。場合によっては、ＩＭＧＴ又はＫａｂａｔのような１つの番号体系に従ってＣＤＲを定義することが有益なこともある。多くの場合、これらのＣＤＲ配列は短く（例えば、番号付けシステムを組み合わせたアプローチよりも短い）、したがって、結合に重要なコア配列を提供する。他の場合において、例えばＩＭＧＴ及びＫａｂａｔのＣＤＲ配列を組み合わせて使用することが有益となり得る。
いくつかの実施形態において、インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
軽鎖可変領域であって、
ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ１；ＫＡＳのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ２；及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ３；
ｂ）ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ１；ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ２；及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ３；又は
ｃ）ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ１；ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ２；及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ３、
及び／又は
重鎖可変領域であって、
ｄ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ１；ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ２；及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ３；又は
ｅ）ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ１；ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ２；及び
ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ３；又は
ｆ）ＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ１；ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ２；及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ３を含む。
抗体４８Ｄ２のＣＤＲ配列の異なる定義されたセット間の関係は、以下のように説明され得る、
－太字で強調されたＣＤＲ残基は、ＩＭＧＴ番号付けシステムを使って同定された、
－下線で強調されたＣＤＲ残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使って同定された。
－ＣＤＲ残基は、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号システムの組み合わせで定義された（太字及び下線の組み合わせの配列）。
Figure 2024500920000002
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴに従って定義される：
配列番号：１
可変型軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＥＳＩＳＴＡ
可変型軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＫＡＳ
配列番号：３
可変型軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ
配列番号：４
可変型重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＧＰＳＬＳＨＦＤ
配列番号：５
可変型重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＩＳＰＧＶＳＴ
配列番号：６
可変型重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔに従って定義される：
配列番号：７
可変型軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ
配列番号：８
可変型軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＫＡＳＴＬＰＳ
配列番号：９
可変型軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ
配列番号：１０
可変型重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＨＦＤＩＴ
配列番号：１１
可変型重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ
配列番号：１２
可変型重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントのＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの組み合わせに従って定義される：
配列番号：１３
可変型軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ
配列番号：１４
可変型軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＫＡＳＴＬＰＳ
配列番号：１５
可変型軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ
配列番号：１６
可変型重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ
配列番号：１７
可変型重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ
配列番号：１８
可変型重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ
しかしながら、ＣＤＲ配列内の低レベルのバリアント（典型的には、わずか１又は２つのアミノ酸）が、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体又は抗原結合フラグメントの特異性を損なうことなく許容され得ることを、当業者は理解するだろう。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のようなＣＤＲ（配列番号１～１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる）を含み、ここで、ＣＤＲのアミノ酸のうちの任意の１つが別のアミノ酸に対して変更されており、例えば、１つのアミノ酸など、２つのアミノ酸より多くはそのように変更されていないとの但し書き付きである。
軽鎖可変領域
実施例９で詳述したように、ウサギをヒト及びネズミのＩＬ１ＲＡＰで免疫化した。その後、得られた抗体について、ＩＬ１ＲＡＰへの結合、及びＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害する能力など、望ましい特性を分析した。４８Ｄ２は、これらの特徴に関して、優れた特徴を有する抗体として同定され、その後、臨床及び治療への応用のための抗体を改善させる目的を持って、改良及び最適化されてきた。この最適化により、アミノ酸配列の異なる可変軽鎖領域と可変重鎖領域を有する抗体バリアントをもたらした。しかしながら、ＣＤＲはすべての抗体バリアントで同一である。言い換えれば、各ＣＤＲ定義カテゴリー（ｉ）Ｋａｂａｔ、ｉｉ）ＩＭＧＴ、又はｉｉｉ）ＩＭＧＴとＫａｂａｔの組み合わせ）内で、ＣＤＲ配列（夫々、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、又はＣＤＲ－Ｈ３）は、キメラ抗体４８Ｄ２及びそのすべての最適化抗体バリアントで同じである。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり；
ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり；及び／又はＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それらからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲは、
ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ１；ＫＡＳのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ２；及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ３；
ｂ）ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ１；ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ２；及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ３；又は
ｃ）ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ１；ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ２；及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｌ３である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：１９のアミノ酸配列；又は配列番号：１９に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。この軽鎖可変領域は、例えば、実施例９及び１０に記載されるキメラ（非ヒト化、非最適化）４８Ｄ２抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、及び配列番号：２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域を含み；又は配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、又は配列番号：２５に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖可変領域は、例えば、実施例１１及び１２に記載されるヒト化ｈ４８Ｄ２抗体バリアントの一部である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：３１のアミノ酸配列；又は、配列番号：３１に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この軽鎖可変領域は、例えば、実施例１３及び１４に記載されるヒト化及び非免疫化４８Ｄ２抗体バリアントの一部である。
パーセント同一性（又は配列同一性）は、例えば、パラメーターとしてグローバルアライメントオプション、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、オープニングギャップペナルティ－１４、エクステンドギャップペナルティ－４を使用して、Ｅｘｐａｓｙ施設サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）のＬＡＬＩＧＮプログラムにより決定することができる。代替的に、抗体の一部などの２つのポリペプチド間の配列同一性割合は、適切なコンピュータプログラム、例えば、ウィスコンシン大学遺伝計算グループのＧＡＰプログラムを用いて決定することができ、同一性パーセントは、配列が最適に整列されたポリペプチドに関連して計算されることが理解されるだろう。
配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ プログラムを使用して実行されてもよい。使用されるパラメーターは、以下のようであってもよい：
－高速ペアワイズアライメントパラメーター：Ｋ－ｔｕｐｌｅ（ワード）サイズ；１、窓の大きさ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナルの数；５．スコアリング方法：ｘ％。
－複数の配列パラメーター：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップエクステンションペナルティ；０．０５
－スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ。
代替的に、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムは、ローカル配列の配列を決定するために使用されてもよい。
当業者は、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントをさらに最適化するために、上述した軽鎖可変領域のさらなる改変を考慮するだろう。例えば、当業者は、ヒト化及び非免疫化手順の間に行われるように、フレームワーク領域、すなわち、エピトープ結合ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸を変更し、それによってＣＤＲ領域を変更しないことを考慮する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のような軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のうちの任意の１つが別のアミノ酸に対して変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない。
重鎖可変領域
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、及び
ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる、ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
ａ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ１；ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ２；及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ３；
ｂ）ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ１；ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ２；及びＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ３；又は
ｃ）ＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ１；ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ２；及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＣＤＲ－Ｈ３を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２０のアミノ酸配列；
又は、配列番号：２０に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この重鎖可変領域は、例えば、実施例９及び１０に記載されるキメラ（非ヒト化、非最適化）４８Ｄ２抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、及び配列番号：３０からなる群から選択されるアミノ酸配列；
又は、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、又は配列番号：３０に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの重鎖可変領域は、例えば、実施例１１及び１２に記載されるヒト化ｈ４８Ｄ２抗体バリアントの一部である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：３２、配列番号：３３、及び配列番号：３４からなる群から選択されるアミノ酸配列；
又は、配列番号：３２、配列番号：３３、又は配列番号：３４に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの重鎖可変領域は、例えば、実施例１３及び１４に記載されるヒト化及び非免疫化４８Ｄ２抗体バリアントの一部である。
当業者は、例えば、抗体又は抗原結合フラグメントをさらに最適化するために、上述した重鎖可変領域のさらなる改変を検討するだろう。例えば、当業者は、ヒト化及び非免疫化手順の間に行われるように、フレームワーク領域、すなわち、エピトープ結合ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸を変更し、それによってＣＤＲ領域を変更しないことを考慮する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のような重鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のうちの任意の１つが別のアミノ酸に対して変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない。
可変軽鎖及び可変重鎖の組合せ
当業者は、軽鎖可変領域の上述したバリアントのいずれもが、重鎖可変領域の上述したバリアントのいずれかと組み合わせることができることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域、又は配列番号：１９又は配列番号：２０に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
この軽鎖と重鎖の可変領域の組み合わせは、例えば、実施例９及び１０に記載されるキメラ（非ヒト化、非最適化）４８Ｄ２抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは：
ａ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｂ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｃ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２８のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｄ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｅ）配列番号：２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｆ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｇ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｈ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２８のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｉ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｊ）配列番号：２２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｋ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｌ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｍ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２８のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｎ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｏ）配列番号：２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｐ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含むか、又はからなる重鎖可変領域；
ｑ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｒ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２８のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｓ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｔ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｕ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｖ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｗ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２８のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｘ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｙ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
又は配列番号：２１から配列番号：３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖と重鎖の可変領域の組み合わせは、例えば、実施例１１及び１２に記載されるヒト化ｈ４８Ｄ２抗体バリアントの一部である。
以下の表は、ヒト化軽鎖及び重鎖の可変領域の例示的な組み合わせを描写する代替的な方法である：
Figure 2024500920000003
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは：
ａ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｂ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｃ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｄ）配列番号：２４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｅ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｆ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｇ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｈ）配列番号：２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｉ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｊ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
ｋ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；又は
ｌ）配列番号：３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域及び配列番号：３４のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域；
又は配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：３１、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、又は配列番号：３４に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
これらの軽鎖及び重鎖可変領域の組み合わせは、例えば、実施例１３及び１４に記載されるヒト化及び／又は非免疫化ｈ４８Ｄ２抗体バリアントの一部である。
以下の表は、ヒト化及び／又はヒト化及び非免疫化軽鎖及び重鎖可変領域の例示的な組み合わせを描写する代替方法である：
Figure 2024500920000004
上記で定義した軽鎖可変領域、重鎖可変領域及びそれらの組み合わせは、さらに軽／重鎖定常領域又はその一部と組み合わせてもよいことが当業者には理解されるだろう（下記参照）。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：３１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記のような重鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に対して変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つのアミノ酸は、そのように変更されていない。
定常領域及びＦｃ部
当業者は、当該技術分野で知られている任意の軽質定常領域を、上述の軽質可変領域のバリアントのいずれかと組み合わせることができ、当該技術分野で知られている任意の重質定常領域を、上述の重質可変領域のバリアントのいずれかと組み合わせて、完全抗体を形成することができることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域又はその一部を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、κ又はλ軽鎖である軽鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、κ軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、λ軽鎖を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域を含むか、又は配列番号：３５に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域又はその一部を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、α、δ、γ、ε、及びμからなる群から選択される重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンアイソタイプである重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ免疫グロブリンアイソタイプである重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ抗体である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンサブクラスの重鎖定常領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１抗体である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ２抗体である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ３抗体である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号：３６又は配列番号：２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖定常領域を含むか、又はそれからなるか、
又は配列番号：３６又は配列番号：２に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域を含むか、又はそれからなり、上記軽鎖定常領域及び／又は上記重鎖定常領域のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４重鎖など）のＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域を含む。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１重鎖からの定常領域の一部又は全部を含んでもよい。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＨ１及びＣＬ定常領域を、それぞれ上記で定義された重及び軽可変領域のいずれかと組み合わせて構成されるＦａｂフラグメントであってもよい。
同様に、本発明の上記抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域又はその一部をさらに含んでいてもよい。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、κ又はλ軽鎖からのＣＬ領域を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
－上記の軽鎖可変領域のいずれか１つ；及び／又は
－上記の重鎖可変領域のいずれか１つ；及び／又は
－上記の軽鎖定常領域のいずれか１つ；及び／又は
－上記の重鎖定常領域のいずれか１つ、を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
－配列番号１９、２１、２２、２３、２４、２５、及び３１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域；及び／又は
－配列番号２０、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、及び３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域；及び／又は
－配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域；及び／又は
－配列番号３６又は２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖定常領域、を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域を含む。
Ｆｃ領域はまた、Ｆｃドメインを指す場合もある。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、天然に存在するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、非天然に存在するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、修飾された、例えば、変異した、ＩｇＧ定常領域を有するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域は、表１において同定された変異の１つ以上を含む。
Ｆｃ領域は、天然に存在するもの（例えば、内因的に産生される抗体の一部）であってもよいし、人工的なもの（例えば、天然に存在するＦｃ領域に対して１つ以上の点変異を含む）であってもよい。
当技術分野でよく知られているように、抗体のＦｃ領域は、その血清中半減期と、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などのエフェクター機能を仲介する。
治療用モノクローナル抗体やＦｃ融合タンパク質のＦｃ領域を操作することで、求められる薬理活性に適した分子を生成できる（Ｓｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０（６）：６８５－９１，その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
（ａ）半減期を延長するための操作されたＦｃ領域
抗体医薬の有効性を向上させる１つのアプローチは、抗体の血清持続性を高めることで、より高い循環レベル、より少ない投与回数、より少ない投与量を可能にする。
ＩｇＧの半減期は、新生児受容体ＦｃＲｎとのｐＨ依存的な結合に依存する。内皮細胞表面に発現しているＦｃＲｎは、ｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、分解からそれを保護する。
ｐＨ７．４ではなく、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに選択的に結合する抗体の中には、様々な動物モデルで高い半減期を示す。
ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの間の界面に位置するいくつかの変異、例えば、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ ＋ Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３－８、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）が、インビボでＦｃＲｎへの結合親和性及びＩｇＧ１の半減期を増加させることが示されてきた。
（ｂ）エフェクター機能を変化させるための操作されたＦｃ領域
抗体医薬やＦｃ融合タンパク質の用途によっては、エフェクター機能（ＡＤＣＣなど）を低下させるか増加させることが望まれる場合がある。
細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体の場合、エフェクター機能を奪うことが特定の臨床適応に必要となる場合がある。
逆に、オンコロジー用途（白血病及び固形腫瘍の治療など；下記参照）の抗体では、エフェクター機能を高めることで、治療活性を向上させることができる。
４種類のヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び補体の第１成分（Ｃ１ｑ）に異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６－２５、その開示は参照により本明細書書に組み込まれる）。
ＩｇＧとＦｃγＲｓ又はＣ１ｑとの結合は、ヒンジ領域とＣＨ２ドメインに位置する残基によって決まる。ＣＨ２ドメインの２つの領域は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑの結合に重要であり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４では固有の配列を有する。ヒトＩｇＧ１の２３３－２３６位のＩｇＧ２残基及び３２７、３３０及び３３１位のＩｇＧ４残基の置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に減少させることが示された（Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。「ＬＡＬＡ」変異、Ｌ２３４Ａ／ＬＬ２３５Ａは、エフェクター機能サイレントＦｃ領域の作成のために、いくつかの治療用ＩｇＧ１抗体において導入されてきた、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００：１６－２６。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が補体の活性化を著しく低下させることを実証した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８－８４、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメインの変異は、ＦｃγＲＩ、及びＣ１ｑへの結合を減少させることが示された（Ｓｔｅｕｒｅｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５－７４、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメインに数多くの変異が加えられ、ＡＤＣＣ及びＣＤＣへの影響がインビトロで試されてきた（上記引用文献を参照）。とりわけ、３３３位のアラニン置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増加させることが報告された（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，ｓｕｐｒａ； Ｓｔｅｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ｓｕｐｒａ）。Ｌａｚａｒらは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性が高く、ＦｃγＲＩＩｂに対する親和性が低い三重変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）を記載し、ＡＤＣＣの強化をもたらした（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，ＰＮＡＳ １０３（１１）：４００５－４０１０、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。同じ変異を利用して、ＡＤＣＣが増加した抗体を生成した（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６：３００９－３０１８、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。Ｒｉｃｈａｒｄｓ らは、マクロファージによる標的細胞の貪食作用の強化を媒介するＦｃγＲＩＩＩａ親和性とＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を改善したわずかに異なる三重変異体（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）を研究した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７－２７、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
エフェクター機能を持たないため、ＩｇＧ４抗体は、細胞枯渇を伴わない受容体遮断（すなわち、ＩＬ－１シグナルの阻害）に適したＩｇＧサブクラスを表示する。ＩｇＧ４分子は、Ｆａｂ－ａｒｍ交換と呼ばれる動的なプロセスで半分子を交換することができる。この現象は、治療用抗体と内因性ＩｇＧ４との間のインビボでも起こりうる。
Ｓ２２８Ｐ変異は、この組換えプロセスを阻止することが示されてきており、予測不可能な治療用ＩｇＧ４抗体の設計を可能にする（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７－７１、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
操作されたＦｃ領域の例を以下の表１に示す。
Figure 2024500920000005
Figure 2024500920000006
＊Ｆｃアミノ酸変異の位置は、ＥＵ番号付けスキーム（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６３：７８－８５を参照）を使用して定義され、例えば、配列番号：３６及び２における実際の番号付けとは異なる場合があるが、以下の変異の番号付けに関するさらなる詳細説明を参照。
表１への参照
１．Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６）
２．Ｖａｃｃａｒｏ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３－８）
３．Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８（２）：１５７－１５９
４．Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３－２４
５．Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６０４
６．Ｍａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４（１２）：３１２２－３１
７．Ｂｕｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ ２０１４，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２８（１１）：２２１３－２１
８．Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；３３６（５）：１２３９－４９
９．Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８－８４
１０．Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３５：８６－９４
１１．Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５－７４
１２．Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒｅ．７（８）：２５１７－２７
１３．ＵＳ ７，９６０，５１２ Ｂ２
１４．ＥＰ ２２１３６８３
１５．Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７６７－７１
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域は、ＥＵインデックスによって定義されるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。
これらの変異は、抗体のエフェクター機能を低下させる可能性がある。
ＥＵインデックスは、当技術分野で従来から使用されている（一般に、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，１９９１を参照）。
当業者は、本明細書に記載されたＦｃ変異の正確な位置が、本発明の抗体において異なる可能性があることを理解するであろう。これは、可変領域の種差により、キメラ抗体（及びそこから生まれたヒト化抗体やヒト化／脱免疫抗体）の種差が生じるためである。可変重領域の領域の長さを変えることで、ＥＵインデックスのものと比べてアミノ酸の位置のシフトにつながる。しかし、Ｆｃ部分のアミノ酸の相対的な位置は保たれる。
例えば、ＬＡＬＡ変異は、ＥＵインデックスにより、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの位置にあることが定義される。
発明の例示的な抗体は、例えば、
配列番号：２０の重鎖可変領域（非ヒト化、非免疫化）可変重鎖領域を含んでもよい。
ＱＥＱＬＥＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＴＬＴＣＴＶＳＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴＷＶＲＱＡＰＧＳＧＬＥＷＩＧＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＳＴＩＴＳＮＴＮＬＮＴＶＴＬＫＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＩＳＳ
及び、例えば、配列番号：３６の定常の重鎖（ＬＡＬＡ変異を含まない）である。
免疫グロブリンＩｇＧ１定常重鎖（重鎖定常領域）（ｚａアロタイプ）
Figure 2024500920000007
 （太字及び下線のアミノ酸残基は、後述の配列番号：２に示すように、ＬＡＬＡ－変異を導入した場合に変化する残基を示す）。
代替的に、本発明の例示的な抗体は、例えば、
配列番号：２０の可変重鎖領域を含んでもよい。
ＱＥＱＬＥＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＴＬＴＣＴＶＳＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴＷＶＲＱＡＰＧＳＧＬＥＷＩＧＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＳＴＩＴＳＮＴＮＬＮＴＶＴＬＫＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬＷＧＰＧＴＬＶＴＩＳＳ
及び、例えば、
配列番号：２の定常の重鎖（ＬＡＬＡ変異を含む）である。
「ＬＡＬＡ」変異を有する免疫グロブリンＩｇＧ１定常重鎖（重鎖定常領域）（ｚａアロタイプ）
Figure 2024500920000008
アミノ酸変異（上記配列中の
Figure 2024500920000009
 ）は２３７位及び２３８位（つまりＬ２３７Ａ、Ｌ２３８Ａ）であり、重鎖定常領域のアミノ酸配列からすると、ＥＵインデックスによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ－変異に相当する。
当業者は、同じ理由が、ＥＵインデックスによって定義されるＰ３２９Ｇ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓなどの当技術分野で知られる他の名称付き変異に適用することを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合した糖鎖は、フコースが欠如する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、フコースが欠如するＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域を含み、Ｆｃ領域に結合した糖鎖は、フコースが低い。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、フコースが少ないＦｃ領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＵＴ８陰性細胞株において産生される。
いくつかの実施形態において、抗体は、ＦＵＴ８陰性細胞株で産生される。
フコース転移を触媒するａ－（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ酵素を符号化するＦＵＴ８遺伝子をノックアウトすることにより、ＦＵＴ８陰性細胞株を作成することが可能である。Ｆｃ領域のフコシル化が低減されてなる抗体は、ＷＯ００／６１７３９Ａ１に記載されるように、ＡＤＣＣ活性が向上していることを示す。ＡＤＣＣ活性が向上した抗体を産生する場合、ＦＵＴ８陰性細胞株が有用であることは、当業者には理解されるだろう。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体、又はインタクトな抗体の一部である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦ（ａｂ）２フラグメント）及びドメイン抗体（例えば、単一ＶＨ可変ドメイン又はＶＬ可変ドメイン）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むか、又はそれらからなる。
以下の「配列」のセクションは、本明細書で開示され、請求範囲である抗体の特定の例示的な実施形態の配列を提供する。
シグナル伝達の阻害
インターロイキンは、様々な疾患や障害に関与する。
インターロイキンは、サイトカインと同様に、ＩＬ－１ファミリーのインターロイキンなどである。サイトカイン（例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンパカイン、及び腫瘍壊死因子など）は、細胞シグナル伝達に重要である。言い換えると、サイトカインは、それぞれの受容体への結合などを介して、細胞へのシグナル伝達機能を有する。例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達は、本明細書に記載されるように、これらのサイトカインが細胞表面又は細胞内で引き起こす事象を包含する。細胞表面では、これらのシグナル伝達事象は、例えば、受容体の確認、共受容体や他の分子の特性、細胞外、細胞表面、細胞膜内又は細胞内での分子の結合に影響を与える。これらの事象は、生理的なものである場合と病的なものである場合がある。これらの事象は、例えば、シグナル伝達に対する反応として細胞内の反応につながる生物学的経路である可能性がある。この反応は、生理的なものである場合と病的なものである場合がある。
本明細書で使用する「シグナル伝達の阻害」とは、前記シグナル伝達事象、又は、例えば、受容体又は生物学的経路又は分子活性の活性、確認、又は産生を減少させることと定義される。この阻害は、阻害因子（本発明の場合、ＩＬ１ＲＡＰに結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメント）が存在する状況と、阻害因子が存在しない状況とを比較するものと理解される。当業者であれば、阻害の程度は、測定すべきシグナル伝達事象もしくは経路又は活性に応じて、当技術分野で周知の方法によって決定され得ることを理解するだろう。この方法は、例えば、実施例１０、１２、又は１４に記載されるような実施例のための、細胞アッセイであり得る。
本明細書で使用する場合、「（例えば）ＩＬ－１αのシグナル伝達を阻害する」などの表現は、「阻害（例えば）ＩＬ－１αシグナル伝達」という表現と互換的に使用されることに留意されるものとする。
ＩＬ－１
インターロイキン－１（ＩＬ－１）は、強力な炎症性サイトカインであり、感染や炎症に応答して、単核食細胞を含む様々な種類の細胞から産生されることがある。ＩＬ－１ファミリーは、ＩＬ－１α及びＩＬ－１βを含む７つのアゴニストと、ＩＬ－１受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１Ｒａ又はＩＬ１ＲＡ）を含む３つの天然に存在する受容体アンタゴニストからなる（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８７（６）：２０９５－１４７）。ＩＬ－１受容体は、ＩＬ－１Ｒ型ＩとＩＬ－１Ｒ型ＩＩの２つが同定されてきた。どちらの受容体も、ＩＬ－１ファミリー分子の３つの形態すべてと相互作用することができる。ＩＬ－１ＲＩは、ＩＬ－１による細胞活性化を媒介する役割を担っている。しかしながら、ＩＬ－１／ＩＬ－１ＲＩ複合体はそれ自体ではシグナルを発することができず、第２の受容体鎖であるＩＬ－１Ｒアクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）との関連に依存している（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８７（６）：２０９５－１４７）。ＩＬ－１ＲＩとは対照的に、ＩＬ－１ＲＩＩはＩＬ－１と結合しても細胞の活性化を誘導しないため、ＩＬ－１ＲＩＩは調節性のデコイ受容体として機能し、ＩＬ－１ＲＩに結合できるＩＬ－１を純減することになる。
ＩＬ１シグナルに加えて、ＩＬ１ＲＡＰは、ＳＴ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体を介したＩＬ３３と、ＩＬ１Ｒｒｐ２／ＩＬ１ＲＡＰ複合体を介したＩＬ３６の効果を媒介するために重要である（Ｇａｒｌａｎｄａ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１３ Ｄｅｃ １２；３９（６）：１００３－１８）。
また、ＩＬ－１αは傷ついた細胞から放出され、アラーミンとして機能することができる。ＩＬ－１は強力な炎症性サイトカインであり、局所感染又は炎症部位で誘導され、様々な生理的及び細胞的事象の制御に関与する（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＣＡ，ＣＨＥＳＴ，２０００，１１８：５０３－５０８ ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，ＣＡ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２００２，２０（５ Ｓｕｐｐｌ ２７）：Ｓ１－１３）にまとめられている）。白血球や内皮細胞など、いくつかの細胞種を活性化することができる。ＩＬ－１は、接着分子、サイトカイン、ケモカイン、プロスタグランジンＥ２、及び一酸化窒素（ＮＯ）などの炎症性メディエーターの産生と発現を促進し、免疫反応を誘導し増幅させる。その結果、局所的な炎症が増幅され、持続することになる。加えて、ＩＬ－１による炎症性メディエーターの産生により、発熱、頭痛、低血圧、及び体重減少をもたらす。さらに、ＩＬ－１は造血成長因子であり、骨髄移植中の患者の白血球と血小板のナディアを減少させることが示されてきた。また、ＩＬ－１は血管内皮増殖因子の産生を誘導して血管新生を促進し、それによってパンヌス形成及びリウマチ性関節の血液供給を促進することが示されてきた。ＩＬ－１は、リウマチ性疾患において、骨や軟骨の分解を促進することが知られてきた。最後に、ＩＬ－１は、心血管疾患及び線維性疾患における炎症反応の重要なプレーヤーとして関与している。
ＩＬ－３３
ＩＬ－３３は通常、損傷又は壊死したバリア細胞（内皮細胞や上皮細胞）から放出され、外傷や感染時の組織損傷を免疫系に知らせるための内因性危険信号であるアラーミンとして機能する（Ｌｉｅｗ ＦＹ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６，６７６－６８９（２０１６））。ＩＬ－３３は、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）細胞、マスト細胞、２型自然リンパ球、好酸球、及び好塩基球に２型サイトカイン（ＩＬ－５、ＩＬ－１３など）を産生させる。また、ＩＬ－３３は内皮細胞を標的とし、血管新生を誘導することが知られている。ＩＬ－３３は、Ｔｈ２誘導性サイトカインとして、喘息、アレルギー性疾患、炎症性腸疾患、及び皮膚炎などに関与してきた。ＩＬ－３３は、様々な細胞を強力に刺激することができ、その多面的な性質は、組織や代謝の恒常性、感染、炎症、がん、及び中枢神経系の疾患におけるＩＬ－３３の役割に反映される。
ＩＬ－３６
ＩＬ－３６サイトカインα、β、γは様々な細胞種で発現し、例えば、ケラチノサイト、気管支上皮、神経細胞、樹状細胞、及びマクロファージなどで豊富に発現する。ＩＬ－３６はバリア組織（皮膚、肺、腸など）で最も活性が高く、環境と身体の相互作用を調節することが主な役割であることが示唆される。ＩＬ－３６は、ケラチノサイト、単球、樹状細胞、及びＣＤ４Ｔ細胞などのＩＬ－３６受容体を発現する標的細胞において、ＮＦ－κＢ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼを活性化することが知られています。新たな証拠は、ＩＬ－３６シグナルが自然免疫及び適応免疫応答の活性化に関与していることを示す（Ｄｉｎｇ Ｌ，ＩＬ－３６ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｖｏｌ．９，（Ｎｏ．２），ｐｐ：２８９５－２９０１（２０１８））。
異常なＩＬ－３６は、乾癬及びアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患において重要な役割を果たしているほか、異常なＩＬ－３６活性が、肺、腎臓、及び腸の炎症性疾患を促進することを示唆し、共通の炎症性疾患の治療標的としてのＩＬ－３６の可能性を強調する。
興味深いことに、本明細書に記載のすべてのサイトカイン（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、ＩＬ－３６γ）は、線維芽細胞及び内皮細胞などの間質細胞も標的とすることが示されてきた。その結果、これらのサイトカインは、炎症性疾患や障害においてよく確立された影響とは別に、線維性疾患や障害にも関与している。
本発明の第１の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントは、インターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーのサイトカインリガンド及び／又は受容体のシグナル伝達を阻害する能力を有する。当業者であれば、ＩＬ１ＲＡＰ上のエピトープに抗体又は抗原結合フラグメントが結合することにより阻害が起こることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰに結合する際にシグナル伝達を阻害することができる。
当業者であれば、抗体又はその抗原結合フラグメントのＩＬ１ＲＡＰへの結合が、例えば、分子レベル又はコンフォメーションレベルで、異なる方法でＩＬ１ＲＡＰに影響を与え得ることを理解するだろう。しかしながら、抗体又はその抗原結合フラグメントのＩＬ１ＲＡＰへの結合がＩＬ１ＲＡＰにどのように影響するかは、今日では完全に知られていないかもしれないことを、当業者は理解するだろう。
一つの可能性は、抗体又はその抗原結合フラグメントのＩＬ１ＲＡＰへの結合が、ＩＬ１ＲＡＰとＩＬ－１受容体、ＩＬ－３３受容体、及び／又はＩＬ－３６受容体のそれぞれの関連に影響を与えることである。その結果、ＩＬ１ＲＡＰを共受容体として、ＩＬ－１受容体、ＩＬ－３３受容体、又はＩＬ－３６受容体のいずれか１つからなる適切な受容体複合体が形成されない可能性がある。その結果、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γなどのサイトカインがそれらの同族受容体（それぞれＩＬ－１受容体、ＩＬ－３３受容体、又はＩＬ－３６受容体）に結合すると、これらのサイトカインのシグナル伝達が阻害される、例えば阻害される、例えば遮断される、例えば本質的に完全に阻害される、例えば部分的に阻害されるなどの可能性がある。
当業者は、ＩＬ１ＲＡＰの任意の１つのエピトープに結合する、全てのＩＬ１ＲＡＰ結合抗体が、ＩＬ１ＲＡＰとＩＬ－１受容体、ＩＬ－３３受容体、及び／又はＩＬ－３６受容体の間の関連をそれぞれ妨害し、それによってシグナル伝達を阻害できるわけではないことを理解するだろう。本発明は、このような抗体を提供することを成果とする。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、インターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーサイトカインリガンド及び／又は受容体のシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰ依存性のインターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーのサイトカインリガンド及び／又は受容体のシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、そのＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１αのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１βのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３３のシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、そのＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３６αのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３６βのシグナル伝達を阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害することができる。
当業者であれば、シグナル伝達の阻害は様々な程度であり得ることを理解するであろう。シグナル伝達の阻害は、シグナル伝達の遮断するような、完全なものでも、又は実質的に完全なものでもよい。シグナル伝達の阻害は、シグナル伝達を減少するような、非完全なような部分的なものでもよい。シグナル伝達の阻害を測定するために使用された方法論に関連する完全性の評価の不確実性を考慮すると、「実質的に完全」は「完全」と理解されるものとする。
例えば、シグナル伝達は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントが存在しない場合のシグナル伝達に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上阻害され得る。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達の阻害は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの非存在下におけるシグナル伝達と比較して１０～１００％の間である。より好ましくは、シグナル伝達の阻害は、２５～１００％である。さらに好ましくは、シグナル伝達の阻害は、５０～１００％である。
シグナル伝達は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの非存在下でのシグナル伝達と比較して１００％阻害され得る。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントによるＩＬ－１、ＩＬ－３３、及び／又はＩＬ－３６シグナルの阻害の程度は、当該技術分野で周知の方法、例えば、実施例１０、１２、及び１４で使用した方法によって決定することができる。
好ましい実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、シグナル伝達を実質的に完全に阻害することができる。
好ましい実施形態において、シグナル伝達を阻害することは、シグナル伝達を実質的に完全に阻害することである。
好ましい実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインのシグナルを実質的に完全に阻害することができる。
好ましい実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのシグナル伝達を実質的に完全に阻害することができる。
この抗体はさらに、シグナル伝達をある程度、つまり実質的に完全にではなく、部分的に阻害するかもしれない。結果として、シグナル伝達の阻害は、実質的に完全な阻害ではなく、部分的な阻害を意味し得る。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、シグナル伝達を部分的に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達を阻害することは、シグナル伝達の部分的な阻害である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γ、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインのシグナル伝達を部分的に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのシグナル伝達を部分的に阻害することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの非存在下でのシグナル伝達に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％でＩＬ－１α、ＩＬ－β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害することができる。
当業者は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達に依存するプロセス、例えば疾患プロセスが、疾患を緩和又は治療するために完全かつ迅速に影響を受けるべきいくつかの状況において、完全阻害が望ましいことを理解するだろう。他の状況において、部分的な阻害は、プロセス、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達に依存するプロセス、例えば疾患プロセスが、例えば完全阻害の副作用を避けるために、修飾すべきであるが完全に影響を受けないことが望ましい。当業者はさらに、生物系は複雑であり、様々な既知又は未知のフィードバックループを伴うため、あるプロセスが完全に阻害されたかどうかを評価することが困難であることを理解するであろう。さらに、この評価はまた、シグナル伝達などのプロセスを測定する手法の感度にも依存する。当業者であれば、シグナル伝達の阻害の完全性もしくは実質的な完全性を評価するため、又はシグナル伝達の部分的な阻害の程度を評価するために、どの方法及びカットオフ値を用いることが当該分野で確立し受け入れられているかを知るだろう。
以下の実施例で詳細に示し、説明するように、抗体は、特定の特性を最適化するために修飾を受けることができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、脱免疫される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト化され、及び脱免疫化される。
いくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、モノクローナルである。
抗体の特性
本発明の抗体は、炎症性、線維性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害の診断及び治療薬として特に好適な特性を示すことに基づいて、多数の抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を広範囲にスクリーニングした後、同定されたものである。
したがって、いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特性の１つ以上を示す：
ａ）ＫＤ値が３ｎＭ以下であることを特徴とするＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）；
ｂ）ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に結合し、好ましくはドメイン２のＨ２領域に結合し、ここで、Ｈ２領域は配列番号：３９のアミノ酸；
ｃ）カニクイザル又はブタ由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性；
ｄ）ＩＬ－１αのシグナル伝達の阻害作用；
ｅ）ＩＬ－１βシグナル伝達の阻害作用；
ｆ）ＩＬ－３３のシグナル伝達の阻害作用；
ｇ）ＩＬ－３６αのシグナル伝達の阻害作用；
ｈ）ＩＬ－３６βのシグナル伝達の阻害作用；
ｉ）ＩＬ－３６γのシグナル伝達の阻害作用；
ｊ）ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞による内在化。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの１つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの２つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの３つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの４つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの５つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの６つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの７つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの８つを示す。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性のうちの９つを示す。
有利なことに、いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記命名された特性の全てを示す。
他の実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特性の全てを示す：
ａ）ＫＤ値が３ｎＭ以下であることを特徴とするＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）；
ｂ）ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に結合し、好ましくはドメイン２のＨ２領域に結合し、ここで、Ｈ２領域は配列番号：３９のアミノ酸；
ｃ）カニクイザル又はブタ由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性；
ｄ）ＩＬ－１αのシグナル伝達の阻害作用；
ｅ）ＩＬ－１βシグナル伝達の阻害作用；
ｆ）ＩＬ－３３のシグナル伝達の阻害作用；
ｇ）ＩＬ－３６αのシグナル伝達の阻害作用；
ｈ）ＩＬ－３６βのシグナル伝達の阻害作用；
ｉ）ＩＬ－３６γのシグナル伝達の阻害作用；
ｊ）ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞による内在化。
Ｈ２領域は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９ＮＰＨ３のＩＬ１ＲＡＰアミノ酸配列に基づくと、アミノ酸１７４－１９１に相当する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合親和性（ＫＤ）は、３ｎＭ以下、２．７５ｎＭなど、例えば２．５ｎＭ、２ｎＭなど、例えば１．７５ｎＭ、１．５ｎＭなど、例えば１．２５ｎＭ、１ｎＭなど、例えば０．７５ｎＭ、０．５ｎＭなど、又は例えば０．５ｎＭである。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合親和性（ＫＤ）は、３０００ｐＭ以下、２７５０ｐＭなど、例えば２５００ｐＭ、２０００ｐＭなど、例えば１７５０ｐＭ、１５００ｐＭなど、例えば１２５０ｐＭ、１０００ｐＭなど、例えば７５０ｐＭ、７００ｐＭなど、例えば６５０ｐＭ、６００ｐＭなど、例えば５５０ｐＭ、５００ｐＭなど、例えば４５０ｐＭ、４００ｐＭなど、例えば３５０ｐＭ、３００ｐＭなど、例えば２５０ｐＭ、２００ｐＭなど、例えば１５０ｐＭ、１００ｐＭなど、例えば５０ｐＭである。
当業者は、抗体又は抗原結合フラグメントの結合親和性の決定が、その結合親和性を決定するための方法に依存することを理解するだろう。
当業者は、ＩＬ１ＲＡＰ抗体が、サイトカインシグナル伝達（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γの）を阻害できることとは別に、１つ以上のさらなる機能を示し得ることを理解するだろう。これらの機能は、抗体の定数領域又はＦｃ領域によって伝達され得る。例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）があり、それによってＩＬ１ＲＡＰ発現腫瘍細胞などの標的細胞を死滅させる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣを誘導することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣを誘導することができない。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＰを誘導することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＰを誘導することができない。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを誘導することができる。
抗体の修飾
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、薬剤のインビボ半減期を増加させるための部分をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、薬剤のインビボ半減期を増加させるための部分をさらに含み、インビボ半減期を増加させるための部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸、及びデキストランからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＰＥＧ化される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰフラグメントに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、直接又は間接的に（例えばキレーターを介して）、細胞傷害又は検出可能な部位などの機能部分に共有結合される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位を含み、ここで、前記細胞傷害性部位は、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、前記放射性同位元素は、β－エミッター、オージェエミッター、変換電子－エミッター、α－エミッター、及び低光子エネルギー－エミッターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで前記放射性同位元素は、薬剤の近傍で高線量吸光度を生じる局所吸収エネルギーの放出パターンを有する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又は放射性同位元素からなる細胞傷害性部位を含み、ここで、放射性同位元素は、９０Ｙ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ／１８６Ｒｅなどの長距離βエミッター；１６６Ｈｏ，７６Ａｓ／７７Ａｓ，１５３Ｓｍ；１３１Ｉ，１７７Ｌｕ，６７Ｃｕ，１６１Ｔｂなどの中距離βエミッター；４５Ｃａ，３５Ｓ、又は１４Ｃなどの低エネルギーβエミッター；５１Ｃｒ，６７Ｇａ，９９Ｔｃｍ，１１１Ｉｎ，１２３Ｉ，１２５Ｉ，２０１Ｔｌなどのなどの変換又はオージェエミッター；及び２１２Ｂｉ，２１３Ｂｉ，２２３Ａｃ，及び２２１Ａｔなどのα－エミッターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、放射性同位元素は１７７Ｌｕである。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位を含み、ここで、細胞傷害性部位は、細胞傷害性薬物を含むか、又は細胞傷害性薬物からなる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬物を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、前記細胞傷害性薬物は、細胞賦活薬；抗アンドロゲン薬；コルチゾン及びその誘導体；ホスホネート；テストステロン－５－α－レダクターゼ阻害剤；ホウ素添加剤；サイトカイン；タプシガルギン及びその代謝物；毒素（サポリン又はカリケアマイシンなど）；化学療法剤（代謝拮抗剤など）；又は腫瘍性の障害の治療に有用な他の細胞毒性薬物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬物を含むか、又はそれからなる細胞傷害性部位を含み、ここで、前記細胞傷害性薬物は、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘導オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、又は低エネルギーＸ線光子活性化療法などの活性化療法に用いるのに適する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位を含み、ここで、前記検出可能な部位は、放射性同位元素を含むか、又はそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含み、ここで、前記放射性同位体は、９９ｍＴｃ，１１１Ｉｎ，６７Ｇａ，６８Ｇａ，７２Ａｓ，８９Ｚｒ，１２３Ｉ、及び２０１Ｔｌからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含み、ここで、前記放射性同位体は８９Ｚｒである。
いくつかの実施形態では、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、８６Ｙ／９０Ｙ、又は１２４Ｉ／２１１Ａｔなどの検出可能で細胞傷害性を有する放射性同位元素の対を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位として及び細胞傷害性として同時にマルチモーダルな方法で作用することができる放射性アイソタイプを含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、常磁性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含む。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、常磁性同位体を含むか、又はそれからなる検出可能な部位を含み、ここで、前記常磁性同位体は、１５７Ｇｄ，５５Ｍｎ，１６２Ｄｙ，５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な部位を含み、ここで、前記検出可能な部位は、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学、又は超音波イメージングなどのイメージング技術によって検出可能である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位及び／又は検出可能な部位を含み、ここで、前記細胞傷害性部位及び／又は検出可能な部位は、連結部分を介して、抗体又はその抗原結合フラグメントに間接的に接合される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位及び／又は検出可能な部位を含み、ここで、前記細胞毒性部分及び／又は検出可能な部位は、連結部分を介して、抗体又はその抗原結合フラグメントに間接的に結合し、ここで、前記連結部分はキレート剤である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位及び／又は検出可能な部位を含み、ここで、前記細胞傷害性部位及び／又は検出可能な部位は、連結部分を介して間接的に、抗体又はその抗原結合フラグメントに結合し、ここで、前記連結部分はキレート剤であり、前記キレート剤は、１，４，７，１０－－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，四酢酸の誘導体（ＤＯＴＡ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸の誘導体（ＤＴＰＡ）、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ酢酸の誘導体（ＮＯＴＡ）、及び１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性部位又は検出可能な部位を含まない。
本発明はさらに、ヒトインターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、明細書に開示される抗体４８Ｄ２のＩＬ１ＲＡＰに対する結合を阻害することができる。
本明細書で使用する場合、「抗体４８Ｄ２のＩＬ１ＲＡＰへの結合を阻害することができる」という用語は、別の抗体の存在が、４８Ｄ２のＩＬ１ＲＡＰへの結合を全体的又は部分的に阻害することを意味する。このような競合的結合阻害は、例えば、ＩＬ１ＲＡＰを固定化したＢＩＡｃｏｒｅチップを用い、試験すべき抗体の有無にかかわらず４８Ｄ２とインキュベートするなど、当技術分野で周知のアッセイ及び方法を用いて決定することができる。
代替的に、抗体４８Ｄ２をＢＩＡｃｏｒｅチップの表面に固定化し、ＩＬ１ＲＡＰ抗原を固定化抗体に結合させ、次に第２の抗体を同時にＩＬ１ＲＡＰ結合能力について試験する、一対のマッピングアプローチを用いることもできる（‘ＢＩＡｃｏｒｅ Ａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ’，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２９－０１９４－００ ＡＡ ０５／２０１２を参照；その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
さらなる代替案として、競合的結合阻害はフローサイトメトリーを用いて決定することができる。例えば、試験抗体が４８Ｄ２抗体と細胞表面抗原との結合を阻害できるかどうかを試験するには、抗原を発現している細胞を試験抗体と２０分間プレインキュベートしてから細胞を洗浄し、蛍光色素を結合した４８Ｄ２抗体とインキュベートし、フローサイトメトリーによって検出することができる。試験抗体とのプレインキュベーションにより、フローサイトメトリーにおける４８Ｄ２抗体の検出が低下する場合、試験抗体は参照抗体の細胞表面抗原への結合を阻害する。試験された抗体がＩＬ１ＲＡＰに対して高い親和性を示す場合、期間を短くしたプレインキュベーションが使用される（又は、プレインキュベーションを全くしない）。
抗体の産生
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の抗体もしくは抗原結合フラグメント、又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチドに関するものである。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ又は相補的ＤＮＡ）及びｍＲＮＡ分子を含み、これらは一本鎖又は二本鎖であることができる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ分子である。
ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞における抗体又は抗原結合フラグメントの発現、例えば、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得ることが当業者には理解されよう（例えば、Ａｎｇｏｖ，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．６（６）：６５０－６５９を参照、その開示は参照により本書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント符号化するポリヌクレオチドは、抗体軽鎖又はその可変領域を符号化する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを符号化するポリヌクレオチドは、抗体重鎖又はその可変領域を符号化する。
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関するものである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
「発現ベクター」という用語は、本明細書では、本発明のポリペプチド（抗体又はその抗原結合フラグメント）を符号化するポリヌクレオチドを含み、その発現を提供する追加のヌクレオチドと作動可能に連結された、例えば線状又は環状のＤＮＡ分子と定義される。「プラスミド」、「発現ベクター」、及び「ベクター」という用語は、プラスミドが現在一般的に最もよく使われるベクターの形態であるため、互換的に使用される。しかしながら、本発明は、当技術分野で知られている同等の機能を果たす発現ベクターのそのような他の形態を含むことを意図するものである。本明細書で使用する「発現ベクター」又は「ベクター」は、適切な宿主においてＤＮＡの発現をもたらすことができる適切な制御配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。このような制御配列は、例えば、転写をもたらすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位を符号化する配列、及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含み得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、又は単に潜在的なゲノムの挿入物であってもよい。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは、例えば、宿主ゲノムから独立して複製し機能することもあれば、場合によっては、ゲノム自体に統合されることもある。発現ベクターは、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ．２０１８ Ｄｅｃ；４５（６）：２９０７－２９１２）に記載されているように設計される。
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様にかかるポリヌクレオチド又は本発明の第３の態様にかかるベクターを含む組換え宿主細胞に関するものである。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、細菌細胞である。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、酵母細胞である。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は、ヒト細胞である。
本発明の第５の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法に関し、前記方法は、本発明の第２の態様のポリヌクレオチド又は本発明の第３の態様のベクターを含む本発明の第４の態様の宿主細胞を、符号化された抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む。
医薬組成物
本発明の第６の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、及び／又は
本発明の第４の態様の宿主細胞、
を医薬組成物内に含む医薬組成物に関するものであり、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、及び／又は
本発明の第４の態様の宿主細胞、の有効量を含む。
医薬組成物には、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ＥＧＴＡ、又はグルタチオンなどのキレート剤を含む、追加の化合物もまた含まれ得ることが当業者によって理解されるだろう。
医薬組成物は、十分に貯蔵安定性があり、ヒト及び動物への投与に適した、当該技術分野で既知の方法で調製することができる。例えば、医薬組成物は、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧冷却、又は超臨界粒子形成からの粒子形成の使用によって、凍結乾燥され得る。
「薬学的に許容される」という用語は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのＩＬ１ＲＡＰ結合活性の有効性を低下させない非毒性物質を意味することが意図される。薬学的に許容される緩衝剤、担体、希釈剤、又は賦形剤などは、例えば、当技術分野でよく知られる。
「緩衝剤」という用語は、ｐＨを安定させる目的で酸－塩基混合物を含む水溶液を意味することが意図される。緩衝液の実施例としては、Ｔｒｉｚｍａ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸、炭酸、酢酸、クエン酸、グリコール酸、乳酸、ボレート、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコディレート、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯ、及びＴＥＳである。
「希釈剤」という用語は、医薬製剤中の抗体又は抗原結合フラグメントを希釈する目的を持つ水性又は非水性溶液を意味することを意図する。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、油類（サフラワー油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油など）から選択される１種以上であってもよい。
「アジュバント」という用語は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的効果を高めるために製剤に添加される任意の化合物を意味することを意図する。アジュバントは、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、糖酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、及びアシル組成の異なる酢酸塩など、アニオンが異なる亜鉛、銅、又は銀塩の１つ以上であってもよいが、これらに限定されない。また、アジュバントは、カチオン化セルロースエーテル、カチオン化セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン化デンドリマー、ポリ（ビニルイミダゾール）などのカチオン化合成高分子、及びポリヒスチン、ポリリジン、ポリアルギニン、ならびにこれらのアミノ酸を含むペプチドなどのカチオニックポリペプチドのようなカチオン化ポリペプチドであってもよい。
賦形剤は、糖質、高分子、脂質、及びミネラルの１つ以上であってもよい。炭水化物の実施例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトール、シクロデキストリンなどがあり、これらは、例えば、凍結乾燥を促進するために組成物に添加される。高分子の実施例としては、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解度の異なるポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル、及びポリビニルピロリドン、全ての分子量が異なるもの、例えば、これらは、粘度調整、生体接着、又は化学的分解及びタンパク質分解から脂質を保護するため、組成物に添加される。脂質の実施例としては、脂肪酸、リン脂質、モノ－、ジ－、及びトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質、及び糖脂質などがあり、全てのアシル鎖長や飽和度が異なるもの、卵レシチン、大豆レシチン、水素添加卵及び大豆レシチンなどは、ポリマーのそれらと同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの実施例としては、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、及び酸化チタンなどがあり、液溜まりの軽減や有利な顔料特性などの利点を得るために組成物に添加される。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、その送達に適するように、当該技術分野で知られている任意の種類の医薬組成物に配合することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であってもよく、抗体又は抗原結合フラグメントは、他の薬学的に許容される担体に加えて、ミセル、不溶性単分子膜、及び液晶として会合形態で存在する脂質などの両親媒性薬剤と組み合わされる。リポソーム製剤に適した脂質としては、特に限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸類、及び類似物を含む。また、好適な脂質としては、血流循環時間を延長するための極性ヘッドグループにおけるポリ（エチレングリコール）によって修飾された上記脂質を含む。このようなリポソーム製剤の調製は、例えばＵＳ４，２３５，８７１に見い出すことができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
また、本発明の医薬組成物は、生分解性微粒子の形態であってもよい。ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡ及びＰＧＡのコポリマー（ＰＬＧＡ）、又はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）などの脂肪族ポリエステル、及びポリアンヒドリドは、生分解性ポリマーとして微粒子の製造に広く使用されている。このような微粒子の調製は、ＵＳ５，８５１，４５１及びＥＰ０２１３３０３に見い出すことができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物は、ポリマーゲルの形態で提供され、ここで、ポリマー、例えば、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸及びその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解度の異なるポリビニルアルコール／ポリビニール酢酸、ポリビニルピロリドンは、薬剤含有溶液の増粘に使用される。また、ポリマーは、ゼラチンやコラーゲンを含んでいてもよい。
代替的に、抗体又は抗原結合フラグメントは、単に生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール又は油（サフラワー油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、又はゴマ油など）、トラガカントガム、及び／又は種々の緩衝液に溶解され得る。
本発明の医薬組成物は、活性抗体又は抗原結合フラグメントの作用の増強のために、イオン及び定義されたｐＨを含むことができることが理解されるだろう。追加的に、組成物は、滅菌などの従来の製薬操作に供され、及び／又は、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などの従来のアジュバントを含有することができる。
本発明による医薬組成物は、当業者に知られている任意の適切な経路で投与することができる。したがって、投与経路は、非経口（静脈内、皮下、筋肉内）、局所、眼、鼻、肺、頬、口腔、非経口、膣、及び直腸を含む。また、インプラントからの投与も可能である。
好ましい一実施形態において、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、脳側室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ）、動脈内、腹腔内、くも膜下内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌｌｙ）、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）、胸腔内、頭蓋内、筋肉内、又は皮下に投与され、又はそれらは注入技術によって投与され得る。好ましくは、医薬組成物は静脈内に投与される。例えば、血液と等張になるように十分な塩類やグルコースなどの他の物質を含むことができる滅菌水溶液の形態で便利に使用される。水溶液は、必要に応じて、適切に緩衝化（好ましくは、ｐＨ３～９に）されるべきである。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者によく知られた標準的な製薬技術によって容易に達成される。
非経口投与に適した製剤には、水性及び非水性の滅菌注射液があり、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができ；及び水性及び非水性の滅菌懸濁液があり、懸濁剤及び増粘剤を含むこともできる。製剤は、例えば密封されたアンプルやバイアルなどの単位用量又は複数用量容器で提供され得、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水、の添加を要するだけで凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
したがって、本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与に特に適している。
代替的に、医薬組成物は、適切な推進剤を使用して、加圧された容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーから、鼻腔内又は吸入（例えば、エアゾールスプレーの形態で）投与され得、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３又は１，１，１，２，３，３，３－ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）などのハイドロフルオロアルカン、二酸化炭素又は他の適切なガス）によって投与され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーは、活性抗体又は抗原結合フラグメントの溶液又は懸濁液、例えば、エタノールと推進剤の混合物を溶媒として使用し、さらに潤滑剤、例えば、トリオレイン酸ソルビタンを含んでもよい。吸入器又は送気器に使用するカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンから作られる）は、本発明の化合物の粉末混合物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤を含むように配合することができる。
エアゾール又は乾燥粉末製剤は、好ましくは、各定量用量又は「パフ」が、患者に送達するための本発明の化合物を少なくとも１ｍｇ含むように用意される。エアロゾルによる１日の総投与量は、患者によって異なり、１回の投与で、又はより通常、１日を通して分割して投与することができることが理解されるだろう。
代替的に、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、坐剤又はペッサリーの形態で投与することができ、それらはローション、溶液、クリーム、軟膏、又は粉剤の形態で局所的に適用することができる。また、本発明の化合物は、例えば、皮膚パッチの使用により、経皮投与されてもよい。また、それらは眼球経路で投与されてもよい。
眼科用として、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、等張、ｐＨ調整、滅菌生理食塩水中の微粉化懸濁液として、又は、好ましくは、等張、ｐＨ調整、滅菌生理食塩水中の溶液として、任意に塩化ベンジルアルコニウムなどの保存剤と組み合わせて配合することができる。代替的に、ペトロラタムのような軟膏に配合することもできる。
皮膚に局所的に適用する場合、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、活性化合物を、例えば、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水から選ばれる１種以上との混合物に懸濁又は溶解させた適切な軟膏として配合され得る。代替的に、例えば、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水の１つ以上の混合物に懸濁又は溶解して、適切なローション又はクリームとして配合することができる。
医薬組成物は、薬学的に有効な用量で患者に投与されるだろう。「治療上有効な量」、又は「有効量」、又は「治療上有効な」が、本明細書で使用する場合、所定の状態及び投与レジメンに対して治療効果を提供するその量を指す。これは、必要な添加剤及び希釈剤、すなわち、担体又は投与ビヒクルと関連して、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性材料である。さらに、宿主の活性、機能、及び応答における臨床的に有意な欠損を軽減し、最も好ましくは防止するのに十分な量を意味することが意図される。代替的に、治療上有効な量は、宿主における臨床的に重要な状態の改善を引き起こすのに十分な量である。当業者には理解されるように、化合物の量は、その特定の活性に依存して変化し得る。適切な投与量は、必要な希釈剤と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性組成物を含むことができる。本発明の組成物の製造方法及び使用において、治療上有効な量の活性成分が提供される。治療上有効な量は、当該技術分野でよく知られているように、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などの患者特性に基づいて、通常の熟練した医学又は獣医学従事者が決定することができる。薬学的に有効な用量の投与は、個々の用量単位又はいくつかのより小さい用量単位の形態での単一投与と、特定の間隔での細分化された用量の複数回の投与の両方によって実施することができる。代替的に、投与量は、長期にわたる連続注入として提供され得る。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの診断的使用の文脈では、「薬学的に有効な量」、又は「有効量」、又は「診断的に有効な量」は、本明細書で使用する場合、診断、例えば、インビボイメージング目的のために検出可能なシグナルを提供する量を指す。
抗体又は抗原結合フラグメントは、使用する抗体又は抗原結合フラグメントの有効性／毒性に応じて、様々な濃度で配合することができる。例えば、製剤は、活性抗体又は抗原結合フラグメントを０．１μＭ～１ｍＭの間、より好ましくは１μＭ～５００μＭの間、５００μＭ～１ｍＭの間、３００μＭ～７００μＭの間、１μＭ～１００μＭの間、１００μＭ～２００μＭの間、２００μＭ～３００μＭの間、３００μＭ～４００μＭの間、４００μＭ～５００μＭの間、５００μＭ～６００μＭの間、６００μＭ～７００μＭの間、８００μＭ～９００μＭの間、又は９００μＭ～１ｍＭの間の濃度で含んでもよい。典型的には、製剤は、３００μＭ～７００μＭの間の濃度の活性抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
典型的には、ヒト患者における抗体又は抗原結合フラグメント（治療用部分を含む又は含まない）の治療用量は、１回の投与で１００μｇ～１ｇの範囲（体重７０ｋｇに基づく、例えば、１回の投与で３００μｇ～７００ｍｇの間）だろう。例えば、最大治療量は、１回の投与につき０．１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば０．１～５ｍｇ／ｋｇの間、又は１～５ｍｇ／ｋｇの間、又は０．１～２ｍｇ／ｋｇの間であってもよい。いくつかの実施形態において、治療用量は、５、２０、又は５０ｍｇ／ｋｇ、もしくはこれらの値から形成される任意の範囲であってもよい。例えば、治療用量は、５～５０ｍｇ／ｋｇ、５～２０ｍｇ／ｋｇ、又は２０～５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。このような用量は、腫瘍医／医師によって決定されるように、異なる間隔で投与され得、例えば、用量は、毎日、週２回、毎週、隔週、又は毎月投与され得ることが理解されるだろう。
本発明の医薬組成物は、炎症性、線維性及び／又は腫瘍性の障害又は疾患の治療に用いられる他の治療剤と単独又は組み合わせて投与され得ることが、当業者には理解されるだろう。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、非経口送達に適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、静脈内送達に適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、局所的な送達のために適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、皮下送達に適合される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、筋肉内送達に適合される。
本発明の抗体又は抗原結合フラグメント及び医薬組成物又は製剤は、医学及び獣医学の両分野において有用であることが、当業者によってさらに理解されるだろう。したがって、本発明の方法は、ヒト及び非ヒト動物（馬、犬、及び猫など）の両方の治療において使用され得る。しかし、好ましくは、患者は人間である。
抗体の指示及び使用
本発明の第７の態様は、
医療に使用するための、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様の組成物に関するものである。
本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様に係る組成物、に関するものであり、
ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断に使用するためのものであり、及び／又はここで、前記疾患又は障害は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する。
本発明の第８の態様に対する代替的な態様において、本発明は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様に係る組成物、に関するものであり、
ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断に使用するためのものである。
本発明の第８の態様に対する別の代替的な態様において、本発明は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様に係る組成物、に関するものであり、
疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断に使用するためのものであって、疾患又は障害がＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連するものである。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達と関連する。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する。
「治療」とは、患者の治療及び予防的又は防止的な治療の両方を含む。「防止的」又は「予防的」という用語は、炎症性疾患又は障害、線維性疾患又は障害、腫瘍性の疾患又は障害の可能性を予防又は低減する、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又はその製剤の使用を包含するために用いられ、これはまた、患者又は対象における腫瘍性の細胞の広がり、拡散、又は転移の予防又は低減を含むことも示す。「予防的」という用語は、これらの疾患又は障害のいずれかに対して以前に治療を受けた患者において、炎症性、線維化性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害の再発を予防するための、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、又はその製剤の使用も包含する。
「診断」又は「検出」には、インビボ（すなわち、患者の体内）又はエックスビボ（すなわち、患者の体内から取り出した組織又は細胞サンプル内）のいずれかで、炎症性、線維化性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞を検出することが含まれる。
「緩和」とは、それに限定されることなく、疾患又は障害に関連する症状又はプロセスが減少すること、すなわち、疾患又は障害の軽快をもたらすことを意味する。
「ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する炎症性、線維性、腫瘍性の疾患又は障害」には、障害の直接的又は間接的な原因となる病的細胞が細胞表面にＩＬ１ＲＡＰを発現するそのような疾患又は障害が含まれる。ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞は、免疫細胞、線維芽細胞などの結合組織の細胞、又は腫瘍細胞などの腫瘍性の細胞（がん細胞）、例えば、腫瘍細胞それ自体であり得ることが理解されるだろう。さらに、このような細胞には、病的幹細胞（すなわち、がん幹細胞、又はＣＳＣ）や、個体における炎症性、線維性、及び／又は腫瘍性の疾患や障害の発症に直接的又は間接的に関与する前駆細胞も含まれる。ＣＳＣの実施例は、Ｖｉｓｖａｄｅｒ ＆ Ｌｉｎｄｅｍａｎ，２００８，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ８：７５５－７６８に開示されており、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
代替的に、又は加えて、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞は、炎症性、線維性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害に間接的に関連し、例えば、それらが、細胞が生存するために必要な細胞プロセスを媒介してもよい。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、この場合、炎症性及び／又は線維化プロセスの維持に不可欠な細胞、又は例えば腫瘍の血液供給（血管新生）、又は悪性細胞に向けられた有益な免疫反応を阻害する細胞（例えば、抑制性マクロファージ又はＴ細胞）を標的とし得る。
ＩＬ１ＲＡＰを発現する標的細胞を死滅させることが治療上望ましいかどうかに応じて、例えば、腫瘍性の細胞の場合には、ＡＤＣＣを誘導することができる本発明の第１の態様による抗体又は抗原結合フラグメントを使用されてもよい。例えば、ＩＬ１ＲＡＰを発現する標的細胞ががん細胞（ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＡＬＬ、メラノーマ、肺がん細胞など）である場合、抗体又は抗原結合フラグメントがＡＤＣＣを誘導できることが、そのような細胞を排除するために有利である場合がある。しかしながら、ＡＤＣＣ活性を欠く抗体又は抗原結合フラグメントを使用しても、例えば、がん又は腫瘍の近傍における血管新生の減少につながるＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナルの阻害を通じて、治療効果が得られることが理解されるだろう。同様に、炎症性及び／又は線維性の疾患や障害の場合、細胞の挙動に影響を与えることは有益であるが、細胞を死滅させることはないかもしれない。
ＩＬ－１の阻害剤による治療に感受性がある状態又は疾患状態、及び／又はＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する炎症性、線維性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害を構成し得る状態は、当技術分野でよく知られ（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：６３３－６５２ 及びＤｉｎａｒｅｌｌｏ，２０１４，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ４３－Ｓ５８を参照、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）、これらに限定されないが、以下のものを含む：
関節リウマチ、関節炎全般、乾癬性関節炎、全身型発症若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含む若年性関節炎全般、変形性関節症、家族性低温自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、マックル－ウェルズ病、新生児発症多臓器炎症疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・アクネ（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スティル病、高ＩｇＤ症候群、２型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、ループス関節炎、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アレルギー、動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病を含む）、肝炎、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、メタボリックシンドローム、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群など、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症（肺線維症）、皮膚線維症（皮膚線維症）、筋心炎、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、全身性硬化症、高安動脈炎、及び痛風。
また、ＩＬ－１シグナルの遮断は、心筋梗塞の治療にも有効であると考えられる。心筋梗塞後の抗ＩＬ－１β抗体（カナキヌマブ使用）遮断の有効性を確認するための大規模な臨床試験（ＣＡＮＴＯＳ ｔｒａｉｌ；Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６２（４）：５９７－６０５参照、その開示内容は参照により本書に組み込まれる）が求められる。
このような適応症の場合、ＩＬ１ＲＡＰに結合し、それによって免疫細胞に関連するＩＬ－１及び／又はＩＬ－３３及び／又はＩＬ－３６シグナルを遮断する抗体又は抗原結合フラグメントを使用しても、治療効果が得られることが理解されるだろう。そのような抗体は、ＡＤＣＣ活性を欠くように修飾することも可能である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び／又は線維性及び／又は腫瘍性の疾患又は障害である。
本発明の治療的及び予防的態様に関連して、抗体又はその抗原結合フラグメントが、炎症性、線維化性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の表面に存在するＩＬ１ＲＡＰに結合することにより、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性を調節（すなわち、増加又は減少）し得ることが当業者には理解できるだろう。しかし、そのような調節効果は必須ではなく、例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、疾患又は障害に関連する細胞の表面上のＩＬ１ＲＡＰに結合することによって、単に治療及び予防効果を引き出すことができ、その結果、免疫系が細胞死（例えば、ＡＤＣＣによって及び／又は細胞性傷害／放射能部分の薬剤内の存在によって）などのプロセスを誘導するきっかけになり得る。
いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰの生物学的活性を阻害する。
「ＩＬ１ＲＡＰの生物学的活性」には、炎症性、線維性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞上のＩＬ１ＲＡＰが関与するあらゆる相互作用又はシグナル伝達事象を含む。例えば、一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ１ＲＡＰ（ＩＬ１Ｒ１、ＳＴ２、Ｃ－ＫＩＴ、及び／又はＩＬ１ＲＬ２など）に対する１つ以上の共受容体の結合を遮断することができる。さらに、上で詳述したように、いくつかの実施形態において、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害する。
当業者は、「サイトカインのシグナル伝達を阻害すること」（ＩＬ－１ファミリーのサイトカイン、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達の阻害）が、ＩＬ１ＲＡＰの生物活性の阻害をもたらすことを理解するだろう。
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントによるＩＬ１ＲＡＰの生物学的活性のこのような阻害は、全体的であっても又は部分的であってもよい。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はその抗原結合フラグメントに曝露されていない炎症性、線維化性、及び／又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞におけるＩＬ１ＲＡＰの生物学的活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、及び最も好ましくは１００％のＩＬ１ＲＡＰの生物学的活性を阻害し得る。好ましい実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又は抗原結合フラグメントに曝露されていない炎症性、線維化性及び／又は腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞におけるＩＬ１ＲＡＰの生物学的活性と比較して、５０％以上の生物学的活性を阻害することが可能である。
同様に、腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の成長及び／又は増殖の阻害は、全体的であっても又は部分的であってもよいことが理解されるだろう。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗体又はその抗原結合フラグメントに曝露されていない腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の成長及び／又は増殖と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％、そして最も好ましくは１００％の腫瘍性の疾患又は障害に関連する細胞の成長及び／又は増殖を阻害することが可能である。
疾患におけるＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６
ＩＬ－１は、痛風からがんに至る幅広い疾患及び状態に関与し（レビューについては、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：６３３－６５２ ａｎｄ Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，２０１４，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ４３－Ｓ５８を参照；これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）：
・関節リウマチや変形性関節症などの関節、骨、及び筋肉の病気；
・家族性地中海熱などの遺伝性全身性自己炎症性疾患；
・全身型若年性特発性関節炎及び成人型スティル病などの全身性自己炎症性疾患；
・痛風及び２型糖尿病などの一般的な炎症性疾患；
・心筋梗塞などの急性発症の虚血性疾患；及び
・がんを含む。
ＩＬ－１活性を遮断するための多くの治療法が承認され、開発中である。ＩＬ－１を標的とした治療は、１９９３年に天然に存在するＩＬ－１受容体拮抗薬（ＩＬ－１Ｒａ又はＩＬ１ＲＡ）の組み換え型であり、ＩＬ－１αとＩＬ－１βの両方の活性を遮断するアナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）（Ｋｉｎｅｒｅｔ；アムゲン）の発表から始まり、この治療法は、その後、多くの病気（上記参照）におけるＩＬ－１の役割を証明するために使用されてきた。Ａｎａｋｉｎｒａは、良好な安全性、短い半減－期、複数の投与経路を持つことから、現在ＩＬ－１治療薬の分野で優位を占める。ＩＬ－１を抗体や可溶性受容体で中和することも有効であり、可溶性デコイ受容体のリロナセプト（Ａｒｃａｌｙｓｔ：リジェネロン）や抗－ＩＬ－１β中和モノクローナル抗体のカナキンウマブ（Ｉｌａｒｉｓ：ノバルティス）が承認された。ＩＬ－１αの中和、ＩＬ－１βを標的とした治療用ワクチン、キメラＩＬ－１Ｒａなど、その他の治療アプローチも初期臨床試験中である。加えて、カスパーゼ１阻害剤のような経口活性のある小－分子のＩＬ－１産生阻害剤も開発され、試験中である。
同様に、上記で詳述したように、ＩＬ－３３が疾患に関与していることを示す新たな証拠も出てきている。上記で詳述したように、ＩＬ－３３は、例えば、喘息、アレルギー性疾患、炎症性腸疾患、及び皮膚炎などに関与してきた。重要なことに、ＩＬ－３３は線維症及び炎症に関与している（Ｋｏｔｓｉｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１８，ＩＬ－３３／ＳＴ２ Ａｘｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｏｃｔ ２４；９：２４３２）。ＩＬ－３３は、様々な細胞を強力に刺激することができ、その多面的な性質は、組織や代謝の恒常性、感染、炎症、がん、及び中枢神経系の疾患におけるＩＬ－３３の役割に反映される。
同様に、上記のように、ＩＬ－３６が疾患に関与していることを示す新たな証拠が得られているが、この分野はまだ発展途上であり、ＩＬ－１に比べてＩＬ－３６に関連する知識はまだ限られている。上記で詳述したように、ＩＬ－３６シグナル伝達が自然免疫応答及び適応免疫応答の活性化に関与していることを示す新たな証拠が出てきている（Ｄｉｎｇ Ｌ，ＩＬ－３６ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｖｏｌ．９，（Ｎｏ．２），ｐｐ：２８９５－２９０１（２０１８））。乾癬やアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患における役割に加え、肺、腎臓、及び腸の炎症性疾患においても異常なＩＬ－３６の活性を示すことが出てきた証拠によって示唆され、炎症性疾患に対する治療標的としてのＩＬ－３６の可能性を示す。
当業者は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントが、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害する能力により、複数のＩＬ依存経路を同時に標的とし、炎症性疾患及び／又は線維性疾患に深い影響を及ぼす可能性がある、又は期待できることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び／又は線維性の疾患又は障害である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び／又は線維性の疾患又は障害であり、
ここで、炎症性及び／又は線維性の疾患又は障害は、関節リウマチ、すべての種類の関節炎、乾癬性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含むすべての種類の若年性関節炎、変形性関節症、家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、マックル－ウェルズ疾患、新生児発症多臓器炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎壊疽性膿皮症及びアクネ（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スティル病、高ＩｇＤ症候群、２型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、関節ループス、アルツハイマー病、乾癬、喘息、アレルギー、動脈硬化、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病を含む）、肝炎、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、メタボリック症候群、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症（肺線維症）、皮膚線維症（皮膚線維症）、筋心炎、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、全身性硬化症、高安動脈炎、及び痛風からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、全身性硬化症であり、強皮症又は全身性強皮症とも呼ばれる。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、急性腹膜炎などの腹膜炎である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、乾癬である。いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、乾癬性関節炎である。一実施形態において、前記疾患又は障害は、乾癬及び乾癬性関節炎である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、アテローム性動脈硬化症である。いくつかの実施形態において、アテローム性動脈硬化症の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、アテローム性動脈硬化症の減少、例えば、アテローム性動脈硬化症の臨床症状、症状又は病理生理学的相関の減少、例えば大動脈プラーク炎症などのアテローム性動脈硬化性プラーク炎症の減少、及び／又はプラークサイズ（例えば、プラーク量及び／又はプラーク面積）の減少を含む。
プラークの炎症は、大動脈のフローサイトメトリー分析によるＣＤ４５＋白血球の細胞数に基づいて評価することができる（例えば、実施例４に示すように）。健常対照大動脈と比較して、試験大動脈（例えば、動脈硬化性大動脈と疑われる大動脈や診断された大動脈）のＣＤ４５＋白血球の数が多ければ、動脈硬化性プラークの炎症を示す。いくつかの実施形態において、白血球数は、骨髄性ＣＤ１１ｂ＋細胞（Ｌｙ６Ｇ＋好中球を含む）及び／又はＴＣＲ－β＋細胞（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞を含む）に基づいて評価され得る。
プラークのサイズは、プラーク体積及び／又はプラーク面積に基づいて評価することができる。健常対照大動脈（プラークがない場合もある）と比較して、試験大動脈（例えば、アテローム性大動脈であることが疑われる大動脈、又はアテローム性大動脈と診断された大動脈）においてプラークサイズ（例えば、プラーク体積及び／又はプラーク面積）が増加した場合、アテローム性硬化プラークの存在を示す。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、肺線維症としても知られる肺線維症である。
線維化は多くの疾患の特徴である。いくつかの場合において、線維化は疾患の不可欠な部分であり、線維化は細胞外マトリックスタンパク質の病的な沈着をもたらす異常な又は病的な細胞行動の結果である可能性があることを意味する。他の場合において、線維化は、原疾患と並行して、あるいは治癒の過程で、疾患組織で起こる二次的な事象である場合もある。例えば、線維化とは瘢痕形成であってもよい。本明細書に開示されるような抗体によって、あらゆるタイプの線維症が標的とされ、例えば、治療又は予防され得る。線維症は、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分の過剰な蓄積によって引き起こされる、制御不能又は調節不能な瘢痕組織形成に分類されることがある。したがって、線維症の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、線維症が特徴である疾患の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断の上流に位置することが考えられる。代替的に、又は追加的に、線維症の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、線維症が前記疾患における二次的事象である疾患の下流であり得る。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、心筋炎である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、自己免疫性心筋炎である。
いくつかの実施形態において、自己免疫性心筋炎などの心筋炎の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断における本明細書に開示された発明の使用は、自己免疫性心筋炎などの心筋炎の減少、例えば自己免疫性心筋炎などの心筋炎の臨床兆候、症状又は病理生理学的相関の減少、例えば、心機能の悪化の減少、炎症の減少、及び／又は線維化の減少を含む。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、慢性移植片対宿主病及び硬化皮膚性慢性移植片対宿主病を含む、移植片対宿主病である。一実施形態において、前記疾患又は障害は、移植片対宿主病における真皮線維症及び／又は肺線維症である。特定の実施形態において、移植片対宿主病は、同系移植によって引き起こされる。代替実施形態において、移植片対宿主病は同種移植によって引き起こされる。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、急性炎症性疾患又は障害である。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、慢性炎症性疾患又は障害である。
当業者であれば、疾患又は障害が様々な方法でグループ化されることを理解できるだろう。疾患又は障害は、炎症性疾患又は線維性疾患として明示的にラベル付けされていないかもしれないが、それでも、疾患又は障害の一部を形成又は寄与する例えば炎症性及び／又は線維性プロセスなど、炎症性及び／又は線維性成分を有するかもしれない。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、炎症性及び／又は線維性成分を有する。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、自己免疫疾患又は障害である。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、炎症性プロセスを阻害する。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、線維化プロセスを阻害する。
いくつかの実施形態において、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントは、増殖プロセスを阻害する。
腫瘍性の疾患又は障害のバイオマーカーとしてのＩＬ１ＲＡＰ
腫瘍とは、腫瘍性の疾患や障害（すなわち、がん）を示すもので、組織や細胞の異常で過剰な増殖（異常増殖ともいう）の一種で、例えば、腫瘍のことである。
腫瘍バイオマーカーや腫瘍性の疾患又は障害バイオマーカーは、腫瘍の状態、進行特性、及び治療に対する反応性を示す量や修飾を持つ内因性のタンパク質又は代謝産物である。腫瘍組織や体液中に存在し、転写因子、細胞表面受容体、及び分泌タンパク質など、多種多様な分子を包含する。有効な腫瘍マーカーは、がんの早期診断や治療の個別化により、がん死亡率を低下させる可能性があるため、大きな需要がある。この１０年間で、発がんや腫瘍の進行に関する理解が深まり、多くの潜在的な腫瘍マーカーが明らかになってきた。組織マイクロアレイ、抗体アレイ、及び質量分析など、現在の技術を応用すれば、近い将来、さらに多くのことが発見されるだろうと予測される。
インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）は、以前に、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの血液学的腫瘍性障害に関連する細胞表面バイオマーカーとして特定されてきた（例えば、Ｃａｎｔａｒｇｉａ ＡＢに対するＷＯ２０１１／０２１０１４，Ｊａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７（３７）：１６２８０－５，Ａｓｋｍｙｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｌｏｏｄ．１２１（１８）：３７０９－１３ ａｎｄ Ｂａｒｒｅｙｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｌｏｏｄ １２０（６）：１２９０－８を参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに最近では、メラノーマなどの固形腫瘍の診断及び治療バイオマーカーとしてのＩＬ１ＲＡＰの有用性も明らかにされてきた（Ｃａｎｔａｒｇｉａ ＡＢに対するＷＯ２０１２／０９８４０７を参照、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。
したがって、本発明の上記態様のいくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、腫瘍性の疾患又は障害である。
当業者は、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害し、それによって複数のＩＬ依存性経路を同時に標的とする能力により、本発明の抗体が腫瘍性の疾患又は障害に深い効果をもたらす可能性があることを理解するだろう。
いくつかの実施形態において、前記疾患又は障害は、腫瘍性の疾患又は障害であり、腫瘍性の疾患又は障害は、血液疾患又は障害又は固形腫瘍である。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍性の疾患又は障害は血液疾患であり、腫瘍性の血液疾患又は障害は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍性の疾患又は障害は、固形腫瘍であり、ここで、前記固形腫瘍は、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、メラノーマ、膀胱がん、脳／ＣＮＳがん、泌尿器系のがん、胆道がん（胆管がんとしても知られる）、子宮頸がん、食道がん、胃がん、頭／首がん、腎臓がん、肝臓がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される。
本発明の抗体は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害することにより、複数のＩＬ依存性経路を同時に標的とできることから、例えば腫瘍性の疾患又は障害に対して深い効果が期待できることは、当業者であれば理解するだろう。
当業者であれば、例えば、上記の証拠に照らして、本発明の抗体が、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γの活性に関与する任意の疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断に使用できることを理解するだろう。
本発明の第９の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様に係る組成物、に関するものであり、
対象の腫瘍性の疾患に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導し、及び／又は成長及び／又は増殖を阻害するために使用するためのものであり、ここで、前記細胞が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する。
本発明の第１０の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様に係る組成物、に関するものであり、
ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断のための医薬品の調製における使用に関するものであり、
及び／又は、前記疾患又は障害が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する。
本発明の第１１の態様は、
本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
本発明の第３の態様のベクター、
本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
本発明の第６の態様に係る組成物、に関するものであり、
ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び／又は診断のための医薬品の調製に使用される。
本発明の第１２の態様は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナルの阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断のための方法、及び／又は前記疾患又は障害が、対象のＩＬ１ＲＡＰ発現細胞に関するものであり、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第１３の態様は、対象においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞を検出するためのインビトロ方法に関するものであり、前記方法は、
（ａ）生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
（ｂ）任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び／又は精製する工程と、
（ｃ）本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
（ｄ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す。
本発明の第１４の態様は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有する患者を同定するためのインビトロ方法に関するものであり、
（ａ）検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
（ｂ）任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び／又は精製する工程と、
（ｃ）本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
（ｄ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に対する抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るだろう患者を示すものである。
本発明の第１５の態様は、細胞の発現ＩＬ１ＲＡＰに関連する疾患又は障害を有する患者を治療するための方法に関し、前記方法は、
ａ）本発明の第１４の態様にかかる方法を用いて、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、及び
ｂ）前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む。
本発明の第１６の態様は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞を検出するための方法に関するものであり、前記方法は、
（ａ）第１の態様による抗体又はその抗原結合フラグメントを、ＩＬ１ＲＡＰの発現について分析すべき細胞と接触させる工程と、
（ｂ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す。
いくつかの実施形態において、第１６の態様の方法は、インビトロ法である。
いくつかの実施形態において、第１６の態様の方法は、インビボ法である。
当業者は、第１６の態様の方法が適用される場合、ＩＬ１ＲＡＰに対する結合特異性を有する抗体又は抗原結合フラグメントが、例えば、本明細書の記載に従って、対象に投与されることを理解するだろう。
本発明の第１７の態様は、腹膜炎を有する対象における炎症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、腹膜炎を有する対象における炎症を低減するための前記方法は、腹膜への免疫細胞、例えば、好中球及び単球の浸潤を低減する工程を含む。
いくつかの実施形態において、腹膜炎を有する対象における炎症を低減するための前記方法は、サイトカインのレベルを低減する工程を含み、例えば、エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－５、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－６、及び／又はＫＣ（ＣＸＣＬ１としても知られる）のレベルを低減する。
本発明の第１８の態様は、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための前記方法は、皮膚の炎症及び／又は皮膚の紅斑を低減する工程を含む。
いくつかの実施形態では、乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための前記方法は、サイトカインのレベルを低減すること、例えば、ＩＬ－１７のレベルを低減する工程を含む。
本発明の第１９の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減する方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、アテローム性動脈硬化症の患者におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減するための前記方法は、ＣＤ４５＋白血球、例えば、骨髄系ＣＤ１１ｂ＋細胞、例えばＬｙ６Ｇ＋好中球の数を減らす工程、及び／又はＴＣＲ－β＋細胞、例えばＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋細胞の数を減らす工程を含む。
本発明の第２０の態様は、アテローム性動脈硬化症を有する対象においてアテローム性動脈硬化症プラーク体積及び／又はアテローム性動脈硬化症プラークサイズを低減する方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２１の態様は、心筋炎を有する対象における炎症及び／又は線維化を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２２の態様は、心筋炎又は自己免疫性心筋炎を有する対象における心機能の悪化を打ち消すための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
本発明の第２３の態様は、全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を軽減するための方法に関するものであり、前記方法は、前記対象に、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を低減するための前記方法は、皮膚厚を低減する工程と、筋線維芽細胞の数を低減する工程と、及び／又は皮膚におけるコラーゲンの量を低減する工程と、を含む。
本発明の第２４の態様は、全身性硬化症を有する対象の肺線維症を軽減する方法に関するものであり、前記方法は、
－本発明の第１の態様の抗体又は抗原結合フラグメント、
－本発明の第２の態様のポリヌクレオチド、
－本発明の第３の態様のベクター、
－本発明の第４の態様の宿主細胞、及び／又は
－本発明の第６の態様に係る組成物、の有効量を投与する工程を含む。
いくつかの実施形態において、全身性硬化症を有する対象における肺線維症を低減するための前記方法は、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア及び／又は肺のコラーゲンの量を低減する工程を含む。
例えばＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナルの阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害に関連して、及び／又はＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害に関連して、第８態様に係る実施形態及び説明は、本発明の第９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び／又は１６の態様にも適用するものとする。また、これらは、本発明の第１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４の態様に適用することも可能である。
実施例１：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によるサイトカインシグナル伝達の阻害
目的
この実施例は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γによるシグナル伝達の遮断に関する、マウスＩＬＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０の特徴付けを例示する。
材料及び方法
ニワトリをマウスＩＬ１ＲＡＰ抗原で免疫化し、複数の抗マウスＩＬ１ＲＡＰバインダーを同定した。これらの選択物をマウスＩｇＧ２ａ脊柱にクローンニングした。マウスＩＬＲＡＰのドメイン２に結合可能な１つのそのようなクローン、ｍＣＡＮ１０をＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γによるシグナル伝達を阻害するその能力について評価した。
この評価のために、マウスＩＬ－１Ｒで安定的にトランスフェクトしたＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞を使用した。代替的に、マウスＩＬ－３３及びＩＬ－３６シグナル伝達の分析も同様に可能とするために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞を、アッセイの前日に、マウスＩＬ－３３及びＩＬ－３６受容体で一時的にトランスフェクトした。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞を９６ウェルプレートに播種し、継続する前に少なくとも２時間落ち着かせた。次いで、マウスサイトカインの添加前に、濃度を増加させたｍＣＡＮ１０（０，０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、及び１００μｇ／ｍｌ）に細胞を暴露し、３７℃、５％のＣＯ２で１時間インキュベートした。サイトカインを以下の濃度で添加した：３ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１α、３０ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１β、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３３、４ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３６α、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３６β、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３６γ。マウスＩＬ－１α及びＩＬ－１βは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞によって内因的に発現されるヒトＩＬ－１Ｒと交差反応し得るため、これらの細胞をマウスＩＬ－１α及びＩＬ－１βで刺激する前に、抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体を使用して、ＩＬ－１Ｒを介したシグナル伝達を遮断した。細胞を３７℃、５％のＣＯ２で１６～１８時間培養し、次いで、ＮＦ－κＢの活性化及びその後のＳＥＡＰの産生についてＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を用いて分析し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ分光光度計を使用して６２０ｎｍで測定した。
結果
ｍＣＡＮ１０は濃度を増加させてＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）に添加し、マウスＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、又はＩＬ－３６γを一定濃度で添加した。６２０ｎｍで光学密度値のグラフを使用して、表２に示すＩＣ５０値を計算した。ｍＣＡＮ１０は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害を誘導した。
Figure 2024500920000010
結論
ｍＣＡＮ１０は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γによるシグナル伝達を遮断することが可能なマウス代用抗マウスＩＬ１ＲＡＰ阻害剤である。したがって、ｍＣＡＮ１０は、様々なマウス疾患モデルにおけるＩＬ１ＲＡＰ遮断の治療有効性を評価するために有用なツールを提供する。抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体は、マウスＩＬ１ＲＡＰ（例えば、実施例９～２２に記載される抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体）に対する交差反応性を欠く可能性があるため、ｍＣＡＮ１０は、類似の機能特性を有する抗ヒトＩＬ１ＲＡＰ抗体の適切な代用である。その後のインビボ実験（実施例２～８）においては、エフェクター機能サイレントマウスＩｇＧ２ａフォーマットのｍＣＡＮ１０を使用した。
実施例２：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は、急性腹膜炎のモデルにおいて、炎症反応を減少させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によるＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達の遮断が、急性腹膜炎のマウスモデルにおける炎症反応にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、ＩＬ－１α／βシグナル伝達のみを遮断する組み換えＩＬ－１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ１ＲＡ）タンパク質であるアナキンラと比較することである。
材料及び方法
野生型（ＷＴ）又はＩＬ１ＲＡＰノックアウト（ＫＯ）のいずれかである雌のＣ５７Ｂｌ／６マウス（１０～１８週齢）を、２．５ｍｇの尿酸ナトリウム（ＭＳＵ）結晶で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）免疫した。ＭＳＵ結晶で免疫しなかったＷＴマウスを対照として含めた（ＭＳＵなし）。全てのマウスを免疫化６時間後に終わらせ、フローサイトメトリーによって浸潤細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、好中球、及び好酸球）の定量化のために腹腔洗浄液を収集した（図１Ａ）。
代替的には、雌のＣ５７Ｂｌ／６ ＷＴマウス（８～９週齢）を２０ｍｇ／ｋｇのｍＣＡＮ１０又はモル当量用量（２．３ｍｇ／ｋｇ）のＩＬ１ＲＡで処置した。アイソタイプ対照抗体又はＰＢＳで処置したマウスを、対照として含めた。処置の１時間（ｈｒ）後、マウスは、２．５ｍｇのＭＳＵ結晶で腹腔内投与免疫化した。いずれの処置も受けず、ＭＳＵ結晶で免疫化しなかったマウスを、対照として含めた（ＭＳＵなし）。全てのマウスを免疫化６時間後に終わらせ、フローサイトメトリーによる湿潤細胞の定量化のために（図１Ｂ）、又はＬｕｍｉｎｅｘアッセイによる種々のサイトカイン及びケモカイン（エオタキシン、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－５、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＬ－６、及びＫＣ（ＣＸＣＬ１としても知られる））の定量化のために（図１Ｃ）、腹腔洗浄液を収集した。
結果
ＭＳＵ結晶で免疫化後、ＩＬ１ＲＡＰ ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較して、腹腔への細胞の湿潤の有意な減少を示し、湿潤好中球及び単球に対して最大の効果を有した（図１Ａ）。ｍＣＡＮ１０及びＩＬ１ＲＡでの処置は、アイソタイプ及びＰＢＳ対照とそれぞれ比較して、ＭＳＵ結晶で免疫化したＷＴマウスの腹膜腔において、好中球及び単球のような湿潤細胞の数を有意に減少させた。しかしながら、ｍＣＡＮ１０は、ＩＬ１ＲＡよりも、単球及び好中球に強力な抗炎症作用を有した（図１Ｂ）。ｍＣａｎ１０及びＩＬ１ＲＡはまたアイソタイプ及びＰＢＳ対照それぞれと比較して、Ｇ－ＣＳＦ及びＩＬ－６を有意に減少させた。ｍＣＡＮ１０はまたアイソタイプ対照と比較して、エオタキシン、ＩＬ－５、ＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１βを減少させ、ＩＬ１ＲＡと比較して、ＩＬ－６の有意に大幅な減少を示した（図１Ｃ）。
結論
ｍＣＡＮ１０（ＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３及びＩＬ－３６α／β／γのシグナル伝達を遮断する）は、急性腹膜炎のマウスモデルにおいて、ＩＬ１ＲＡ（ＩＬ－１α／βシグナル伝達のみを遮断する）よりも強力に炎症応答を低下させる。
実施例３：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は、乾癬及び乾癬性関節炎のモデルにおいて疾患重症度を低下させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によるＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達の遮断が、イミキモド誘発性乾癬及びマンナン誘発性乾癬性関節炎における疾患重症度にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、ＩＬ－１βシグナル伝達のみを遮断する抗ＩＬ－１β抗体と比較することである。
材料及び方法
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（８～１０週齢）に乾癬を誘発し、０日目から開始して７日目に終了するまで、毎日Ｚｙｃｌａｒａクリーム（３．７５％イミキモド；約７１．４ｍｇ／日）を局所投与した。このクリームをマウスの剃毛した背中に塗布した。疾患誘導のこの間に、マウスは０、３、及び５日目に腹腔内投与処置を受けた。ｍＣＡＮ１０（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＩＬ－１β（０．５ｍｇ／ｋｇ）、又はこれらの抗体について同じ用量のアイソタイプ対照で、マウスを処置した。ＰＢＳのみ（ビヒクル）又はデキサメタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスは、それぞれ陰性及び陽性対照として含めた。０～４の範囲のスコアを用いて剃毛した背部領域の皮膚炎症及び紅斑をスコア化することによって実験を通じて毎日疾患重症度を評価した（各マウスについて合計８）（図２Ａ～Ｂ）。
代替的には、乾癬性関節炎を、雄及び雌のＢ６Ｎ．Ｑ．ＮＣＦ１マウス（８～１４週齢）において誘発し、０日目にサッカロマイセス・セレビシエ由来のマンナンを２０ｍｇ、腹腔内投与にて受けた。これらのマウスを、０、３、５日目に上記と同様の方法で処置した。０～１５の範囲で４本の足の肉眼的なスコアシステムを使用し、足の関節炎症をスコア化することによって、疾患重症度を評価した（各マウスについて合計６０）（図２Ｃ～Ｄ）。実験の終わりに、乾癬性関節炎における主要な寄与サイトカインであるＩＬ－１７の分析のために血液を採取した（図２Ｅ）。
結果
ｍＣＡＮ１０はイミキモド誘発性乾癬における疾患重症度を低下させたが、抗ＩＬ―１β抗体は低下させなかった（図２Ａ～Ｂ）。同様に、ｍＣＡＮ１０は、マンナン誘発性乾癬性関節炎における疾患重症度を低下させ（図２Ｃ～Ｄ）、ビヒクルと比較して、循環ＩＬ－１７のレベルも低下させた（図２Ｅ）が、抗ＩＬ－１β抗体は低下させなかった。
結論
ｍＣＡＮ１０（ＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達を遮断する）は、イミキモド誘発性乾癬及びマンナン誘発性乾癬性関節炎の両方の疾患重症度を低下させるが、抗ＩＬ－１β抗体（ＩＬ－１βシグナル伝達のみを遮断する）は低下させない。
実施例４：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は、Ａｐｏｅ ＫＯマウスにおけるアテローム性動脈硬化症及び大動脈プラーク炎症を低下させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によるＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達の遮断が、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏｅ）ＫＯマウスにおけるアテローム性動脈硬化症にどのように影響を与えるか評価することである。
材料及び方法
雌のＡｐｏｅ ＫＯマウス（１０～１２週齢）に高コレステロール食（ＨＣＤ；２１％脂肪、０．２１％コレステロール）を与えて、アテローム性動脈硬化病変を発症させた。ＨＣＤの４週間後、マウスの処置を開始し、マウスにｍＣＡＮ１０（最初の用量で２０ｍｇ／ｋｇ；その後の用量で１０ｍｇ／ｋｇ）又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体のいずれかを、６週間、隔週（週２回）腹腔内投与した。これらの６週間を通じて、マウスにＨＣＤを継続して与えた。ケージ間のばらつきを低減するために、各ケージについて、マウスを処置群間で分けた。最終投与の４８時間後、マウスを麻酔し、犠牲にし、その後大動脈を収集して、骨髄細胞（ＣＤ１１ｂ＋細胞及びＬｙ６Ｇ＋好中球亜集団の合計）（図３Ａ～Ｃ）及びＴリンパ球（ＴＣＲ－β＋細胞、及びＣＤ４＋及びＣＤ８＋亜集団の合計）（図３Ｄ～Ｆ）を含む免疫細胞組成の変化をフローサイトメトリーによって研究した。心臓を採取し、大動脈根で切片化し、切片をＯｉｌ－Ｒｅｄ Ｏによって脂肪蓄積について染色し、プラークサイズを群間で比較した（図４Ａ～Ｂ）。
結果
アテローム性硬化症の大動脈のフローサイトメトリー分析は、ｍＣＡＮ１０がプラーク炎症を減少させることを示す。これは、ＣＤ４５＋白血球の数の減少によって観察される（図３Ａ）。これらのうち、Ｌｙ６Ｇ＋好中球を含む骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞が減少した（図３Ｂ～Ｃ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の両方を含むＴＣＲ－β＋細胞の数も減少した（図３Ｄ～Ｆ）。追加的に、ｍＣＡＮ１０は、アイソタイプ対照と比較して、ＨＣＤを与えられたＡｐｏｅ ＫＯマウスにおける大動脈プラークの体積及び面積を有意に減少させた（図４Ａ～Ｂ）。
結論
ｍＣＡＮ１０によるＩＬ１ＲＡＰ遮断は、Ａｐｏｅ ＫＯマウスにおいて、アテローム動脈硬化症を減少させ、プラーク炎症を限定する。
実施例５：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は、実験的自己免疫心筋炎における炎症及び線維化を減少させる
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によってＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達の遮断が実験的自己免疫心筋炎（ＥＡＭ）における炎症及び線維化の発生にどのように影響を与えるかを評価することである。
材料及び方法
ＥＡＭは、雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（７～８週齢）において、完全フロインドアジュバンドに乳化した１００μｇのマウスαーミオシン重鎖（αＭＨＣ）ペプチドで、０及び７日目に皮下でマウスを免疫化することによって誘導した。マウスを、ｍＣＡＮ１０（最初の用量で２０ｍｇ／ｋｇ；その後の用量で１０ｍｇ／ｋｇ）又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、４週間隔週で腹腔内投与処置した。ＰＢＳで処置したマウスを対照として含めた。処置は、αＭＨＣによる最終免疫化の１週間後、１４日目に開始した。実験の終わりに、４２日目に、マウスを犠牲にして心臓を採取した。心臓を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、縦方向に切片化した。心臓あたり一つの中央切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、０～５の範囲スコアシステムを使用して造血細胞によって湿潤された面積を等級付けすることによって、左心室（ＬＶ）における炎症の程度を評価した（図５Ａ～Ｂ）。代替的には、心臓あたり一つの中央切片をマッソントリクロームで染色し、線維化組織の尺度としてコラーゲン沈着を検出した。コンピューター化された面積測定（ＩｍａｇｅＪ）を使用して、線維化青色領域及び全領域を測定した。線維化領域は、全領域の割合として提示される（図５Ｃ～Ｄ）。
結果
ｍＣＡＮ１０は、ＥＡＭ誘発マウスからの心臓のＨ＆Ｅ染色切片のスコア化によって評価されるように、心筋における湿潤性炎症細胞を減少させた（図５Ａ～Ｂ）。追加的に、ｍＣＡＮ１０はまた、マッソントリクローム染色した心臓切片の分析によって決定されるように、心臓線維化を減少させた（図５Ｃ～Ｄ）。
結論
ｍＣＡＮ１０は、ＥＡＭにおける炎症及び線維化の発生を減少させることができる。
実施例６：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は、実験的自己免疫心筋炎における心機能の悪化を打ち消す
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によってＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達の遮断が実験的自己免疫心筋炎（ＥＡＭ）における心機能にどのように影響を与えるかを評価することである。更なる目的は、この抗体の効果を、ＩＬ－１βシグナル伝達のみを遮断する抗ＩＬ－１β抗体、ＩＬ－１α／βシグナル伝達のみを遮断する組み換えＩＬ－１Ｒアンタゴニスト（ＩＬ１ＲＡ）タンパク質であるアナキンラ、及び抗炎症性グルココルチコイドであるプレドニゾンと比較することである。
材料及び方法
ＥＡＭは、雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（７～８週齢）において、完全フロインドアジュバンドに乳化した１００μｇのマウスαーミオシン重鎖（αＭＨＣ）ペプチドで、０及び７日目に皮下でマウスを免疫化することによって誘導した。処置は、αＭＨＣによる最終免疫化と同じ日、７日目に開始した。マウスを、ｍＣＡＮ１０（最初の用量で２０ｍｇ／ｋｇ；その後の用量で１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＩＬー１β抗体（０．５ｍｇ／ｋｇ）、又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、５週間隔週で腹腔内投与処置した。代替的には、マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＩＬ１ＲＡを皮下で、強制経口による５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾンで、又は関連するビヒクル対照で、５週間毎日処置した。ＰＢＳで処置したマウスを対照として含めた。心機能を評価するために、研究の開始時及び２８と４２日目に、左心室駆出分率（ＬＶＥＦ）の測定のために、マウスに対して経胸壁心エコー検査を実施した（図６Ａ～Ｃ）。
結果
ｍＣＡＮ１０は、アイソタイプ及び抗ＩＬ－１β抗体と比較して、ＥＡＭ誘導マウスにおけるＬＶＥＦの測定によって評価されるように、心機能を有意に維持した（図６Ａ）。しかしながら、ＩＬ１ＲＡ及びプレドニゾンは、それらのそれぞれの対照群と比較して、心機能に対して有意な効果を示さなかった（図６Ｂ）。追加的に、ｍＣＡＮ１０は、処置が７日目の代わりに１４日目に開始された場合にも、心機能を維持した（図６Ｃ）。
結論
ｍＣＡＮ１０は、ＥＡＭ誘導マウスにおける心機能に対して治療効果を有するが、抗ＩＬ－１β抗体、ＩＬ１ＲＡ及びプレドニゾンはそのような効果を示さない。
実施例７：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は、硬化皮膚慢性移植片対宿主病のモデルにおいて真皮及び肺線維症を改善する
目的
これらの実験の目的は、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０によるＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナル伝達の遮断が、硬化皮膚慢性移植片対宿主病（ｓｃｌ ｃＧｖＨＤ）のマウスモデルにおける線維症にどのように影響を与えるかを評価することである。
材料及び方法
硬化皮膚慢性移植片対宿主病
受容者の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ－２ｄ；８週齢；ｎ＝１０／群）は、７００ｃＧｙで全身照射を受けた。照射の６時間後、全てのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２ｄ）受容者は、同系の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ－２ｄ）又は同種異系移植様式の雄のＢ１０．Ｄ２マウス（Ｈ－２ｄ）のいずれかから、骨髄を受けた。ＭＨＣミスマッチの理由で、同種異系移植されたマウスは、皮膚及び複数の内部器官の線維症を伴うｓｃｌ ｃＧｖＨＤを発症する。移植のために、ドナーマウス由来の５ｘ１０６の脾細胞及び２ｘ１０６の骨髄細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、尾静脈を介して注射した。処置は、骨髄移植の２１日後に開始した。同種異系移植を受けたマウスを、ｍＣＡＮ１０（最初の用量で２０ｍｇ／ｋｇ；その後の用量で１０ｍｇ／ｋｇ）又は同じ用量のアイソタイプ対照抗体で、４週間隔週で腹腔内投与処置した。代替的に、これらのマウスに５０ｍｇ／ｋｇの小分子チロシンキナーゼ阻害剤ニンテダニブを経口投与で毎日４週間投与した。ニンテダニブは、間質性肺炎を有する全身性硬化症患者の処置のために承認されており、本明細書において陽性対照として使用される。同系移植を受けたマウスを、アイソタイプ対照抗体のみで処置した。実験の終わりに、４９日目に、マウスを犠牲にして皮膚試料と肺を採取した。
真皮及び肺線維症の組織学的評価
上背部の１ｃｍ２の規定された面積の皮膚試料を、４％ホルマリン中で６時間固定し、パラフィンに包埋した。切片を５μｍに切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。１００倍の倍率で、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ）にて捕らえられた画像を使用して、マウスあたり４つの部分で表皮ー真皮接合部と真皮―皮下脂肪接合部との間の距離を手動で測定することによって、Ｈ＆Ｅ染色された切片について、真皮の厚さを定量化した。肺試料の右葉を同様に固定し、パラフィン包埋し、切片化し、続いてトリクローム及びＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色した。組織学的読み出しは、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色切片（マウスあたり２つの切片）における全肺面積の割合としての染色（線維症）面積の評価、及び肺標本（マウスあたり４つの切片）における線維症の程度を決定するための数値尺度であるＡｓｈｃｒｏｆｔスコアによる肺の変化の定量化を含んだ。
ヒドロキシプロリンの定量化
皮膚及び肺試料中のコラーゲンタンパク質の量を、ヒドロキシプロリンの定量化によって決定した。６Ｍ塩化水素に、１２０℃で３時間消化した後、試料のｐＨを６Ｍ水酸化ナトリウムで６に調整した。その後、０．０６ＭクロラミンＴを添加して、試料を室温で２０分間インキュベートした。次に、３．１５Ｍ過塩素酸及び２０％ｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒドを添加し、試料を６０℃で２０分間インキュベートした。吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａ ＭＡＸ １９０マイクロプレート分光光度計にて５５７ｎｍで決定した。Ｉ型コラーゲンを用いて作成した標準曲線を用いて、絶対値を決定した。
筋線維芽細胞の検出
α－ＳＭＡ（平滑筋アクチン）についての筋線維芽細胞を、モノクローナル抗α－ＳＭＡ抗体（クローン１Ａ４）とのインキュベーションによって検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体及び３，３－ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）を用いて発現を可視化した。モノクローナルマウスＩｇＧ抗体を対照として使用した。αＳＭＡについて染色された切片の画像を、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ）で捕らえた。画像を、２００倍の倍率で４つの異なる領域で手動で評価した。筋線維芽細胞は、真皮中の単一の紡錘形状のαＳＭＡ陽性細胞として定義された。
結果
同種異系移植は、同系移植と比較して、真皮の厚さ、筋線維芽細胞数、及びヒドロキシプロリン含有量の増加を伴う顕著な皮膚線維症を誘導した（図７Ａ～Ｃ）。ｍＣＡＮ１０で処置されたマウスは、アイソタイプ対照抗体で処置された同種異系移植されたマウスと比較して、有意に減少した真皮肥厚（図７Ａ）及び筋線維芽細胞数（図７Ｂ）、及びコラーゲン含有量の尺度であるヒドロキシプロリンの減少（図７Ｃ）を示した。これらのパラメーターに対するｍＣＡＮ１０の効果は、ニンテダニブで観察されたものの範囲内であった（図７Ａ～Ｃ）。
同種異系骨髄移植は、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄによって染色された面積、及びヒドロキシプロリン含有量の増加を伴う中程度の肺線維症を誘導した（図８Ａ～Ｃ）。ｍＣＡＮ１０による処置は、アイソタイプ対照抗体で処置した同種異系移植されたマウスと比較して、Ａｓｈｃｒｏｆｔスコア（図８Ａ）、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色（図８Ｂ）、及びヒドロキシプロリン含有量（図８Ｃ）を有意に減少させた。これらのパラメーターに対するｍＣＡＮ１０の効果は、再びニンテダニブで観察されたものの範囲内であった（図８Ａ～Ｃ）。
ｍＣＡＮ１０は十分に許容され、臨床検査、倍検、又は組織学において毒性の徴候はなかった。追加的に、ｍＣＡＮ１０での処置は、ニンテダニブよりも、効果的にｓｃｌ ｃＧｖＨＤ誘導性体重減少を改善した（図９）。
結論
ｍＣＡＮ１０によるＩＬ１ＲＡＰ遮断は、ｓｃｌ ｃＧｖＨＤ誘導性真皮及び肺線維症を減少させるための効率的な戦略である。
実施例８：マウスＩＬ１ＲＡＰの特異的阻害剤であるマウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０は炎症プロセスに関連する遺伝子発現プロファイルを変化させる
目的
この試験の目的は、硬化皮膚慢性移植片対宿主病（ｓｃｌ ｃＧｖＨＤ）のマウスモデルにおいて、マウス代用抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体ｍＣＡＮ１０を使用して、ＩＬ１ＲＡＰ遮断によって影響を受ける分子経路を評価することである。目的はまたｓｃｌ ｃＧｖＨＤマウスからの皮膚において、ＩＬ１ＲＡＰ阻害によって影響を受ける疾患関連の異なって発現される遺伝子（ＤＥＧ）を同定し、これらを全身硬化症（ＳＳｃ）患者からの皮膚生検における疾患関連遺伝子と比較することである。
材料及び方法
マウス試料
実施例７において報告されるように、ｍＣＡＮ１０での処置を伴うか又は伴わない同系又は同種異系移植を受けたマウスから試料を得た。
ＲＮＡＳｅｑ前処理及び分析
ＲａｗペアエンドリードをＧＲＣｍ３９参照ゲノムに配列させ、マッピングされたリードをＲ（ｖ４．１．１）においてＲｓｕｂｒｅａｄ（ｖ２．６．４）を用いて数えた。主成分分析（ＰＣＡ）を実施して、各バッチにおける試料間の潜在的な外れ値を決定した。ＰＣＡの後、３つの試料（条件につき１つ）を除外した。各群について、密な群特異的クラスタリングをもたらす４つの試料を選択した。ＤＥＳｅｑ２パッケージ（ｖ１．３２．０）を使用して、比の中央値の正規化及び異なる発現の分析を実施した。有意なＤＥＧリストは、比較のために調整されたｐ値≦０．０５及び｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧１．５と考えられる。
ＳＳｃ患者のトランスクリプトームプロファイルを、１４３人のＳＳｃ患者及び２２人の健常な個体からなる北米ＳＳｃ患者コホート（ＮＣＢＩ／ＧＥＯ／ＧＳＥ１３０９５５）から検索した。マウス及びヒト試料との間の比較、及び相互に発現される遺伝子の検出のために、ヒトオルソログを、ｒパッケージ「ｂｉｏｍａＲｔ」（ｖ２．４８．３）を使用してマウス遺伝子記号にマッピングした。
処置応答シグネチャー
試料のサイズに起因して、遺伝子組み合わせ処置応答シグネチャーについての特徴の選択を、Ｒ統計パッケージを適用することによって、ロジスティック回帰モデリングを使用して行った。ロジスティック回帰モデルは、２つの群の間の分類（バイナリー結果システム：１［＝例えば、処置］、０［＝例えば、健常］）を可能にし、ここで、段階的特徴の選択は、群分類のための最良の遺伝子セットの組み合わせを同定する。ＭＡＳＳ及びＲＯＣＲパッケージを使用して、赤池情報基準（ＡＩＣ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）値に基づいて、遺伝子組み合わせモデルを選択した。ＡＩＣ値は、統計的遺伝子組み合わせモデルが、使用される特徴の数を考慮してデータをどれほど良好に記載するかの品質指標である一方、ＡＵＣはモデル性能を記載する。
結果
ＲＮＡＳｅｑデータの分析は、同種異系移植マウス（Ａｌｌｏ）、同系移植マウス（Ｓｙｎ）、及びｍＣＡＮ１０で処置された同種異系移植マウス（処置済）の間の分離を示し、そこで処置済群はＳｙｎ群に近い。Ａｌｌｏ対Ｓｙｎとの間の比較は、２３０８ＤＥＧ（１０２３上方調節、１２８５下方調節；調整ｐ値≦０．０５、｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧１．５）を同定し、そこで、炎症及び線維症に関連するプロセス及び経路の調節解除が観察された。一方、処置済対Ａｌｌｏとの間の比較は、４９５ＤＥＧ（３９８上方調節，１０６下方調節；調整ｐ値≦０．０５、｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧１．５）を同定し、そこでｍＣＡＮ１０によるＩＬ１ＲＡＰ阻害によって炎症に関連するいくつかのプロセスの調節解除が観察された。興味深いことに、ｍＣＡＮ１０は、プロフィールがＡｌｌｏ群よりもＳｙｎ群により類似するように、複数のＩＬ－１ファミリー遺伝子の遺伝子発現を変化させた（図１０）。
Ａｌｌｏ ＤＥＧ（Ａｌｌｏ対Ｓｙｎ）、処置済ＤＥＧ（処置済対Ａｌｌｏ）及びＳＳｃ ＤＥＧ（ＳＳｃ対健常；以前に公開されたデータセットＮＣＢＩ／ＧＥＯ／ＧＳＥ１３０９５５から検索された情報）間の重複の分析は、マウスモデル（Ａｌｌｏ対Ｓｙｎ）及びヒトデータセット（ＳＳｃ対健常）の間の４４９の重複遺伝子を同定した。これらのうち、１７７（３９．４％）の遺伝子が、ＤＥＧの全ての３つの群の間で重複しており（図１１）、そのうちの５８の遺伝子（２０が上方調節され、３８が下方調節された；調整ｐ値≦０．０５及び｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧０．２５）が、処置済ＤＥＧ及びＳＳｃ ＤＥＧとの間で相互に調節されている。
結論
ｍＣＡＮ１０は、ｓｃｌ ＧｖＨＤマウスにおける炎症に関連するプロセス及び経路に影響を与え、これはこのモデルにおける疾患徴候に対するｍＣＡＮ１０の観察された効果を支持する。ｓｃｌ ＧｖＨＤマウスにおいてｍＣＡＮ１０によって影響を受けるかなりの数の遺伝子が、健常対照と比較して、ＳＳｃ患者において異なって発現し、ＩＬ１ＲＡＰ阻害がヒト疾患にも影響を与える可能性があることが示唆された。
実施例９：抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体を産生するためのＩＬ１ＲＡＰによる免疫化
目的
この実施例は、抗ＩＬ１ＲＡＰ抗体が、ＩＬ１ＲＡＰで免疫化されたウサギからどのように単離されたかを例示する。
材料及び方法
ウサギを４回免疫化し、続いてヒト及びマウスＩＬ１ＲＡＰの組換え発現された外部ドメインの混合物、注射あたり０．２ｍｇの抗原を使用してブースターを行った。免疫化は、３週間毎後に肩甲骨下注射によって実施した。１回目の免疫化は、フロイント完全アジュバントで行い、２回目から４回目の免疫化は、フロイント不完全アジュバントで行った。ブースターのために、抗原量の半分をフロイント不完全アジュバントで肩甲骨下に注射し、他の半分を静脈中に注射した。
各動物の免疫応答を、３回目の免疫化の約１０日後に、血清を用いてＥＬＩＳＡによって測定した。特異的抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定し、免疫応答比較のためにプレートをヒト及びマウスＩＬ１ＲＡＰで別々にコーティングした。４回目の免疫化の２～３週間後、動物に一度ブースターを行い、ブースターの４～５日後に脾臓を採取した。試験動物の脾臓をホモジナイズし、細胞凍結し、液体窒素中で保存した。
モノクローナル抗体配列を、Ｋｉｖｉ ｅｔ ａｌ．（Ｋｉｖｉ Ｇ，ＨｙｂｒｉＦｒｅｅ：ａ ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｉｅｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：２（２０１６））に記載されたアプローチを使用して免疫化ウサギから単離した。ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレートを、５μｇ／ｍｌのビオチン化ヒト若しくはマウスＩＬ１ＲＡＰ又は両方の混合物でコーティングした。１万個の脾臓細胞を各パニングに使用した。合計４８回のパニング反応を実施した。４５分間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、非結合細胞を除去した。ＲＮＡを結合細胞から単離し、ＶＨ及びＶＬ ｃＤＮＡを合成し、ヒトＩｇＧ発現プラスミド形式でのコンビナトリアルＶＨ－ＶＬライブラリーの構築に使用した。プラスミドＤＮＡを精製し、キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１プールの産生のためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。抗体プールの上澄を、トランスフェクションの４８時間後にＥＬＩＳＡを使用して分析し、陽性プールを同定した。陽性プールからのプラスミドＤＮＡを含む細菌を、ＬＢーアンピシリン固体培地上にプレーティングし、単一コロニーを単離し、液体培地中で成長させた。プラスミドＤＮＡを液体培養物から精製し、一過性抗体産生のためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８～７２時間後に上澄をＥＬＩＳＡによって分析した。
結果
ヒト及び／又はマウスＩＬ１ＲＡＰに結合する抗体を同定した。キメラウサギ／ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ ＩＬ１ＲＡＰ陽性クローンを、シーケンシングによってさらに分析した。キメラ抗体を、例えばＩＬ－１、ＩＬ－３３又はＩＬ－３６シグナル伝達を阻害する能力などのそれらの特性についてさらに分析した。キメラ抗体４８Ｄ２を、更なる特徴付け及び最適化のために選択した（以下の実施例を参照）。この抗体の軽鎖可変領域は、配列番号：１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む。この抗体の重鎖可変領域は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む。抗体全体を作製するために、可変領域を、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むか又は，それからなる軽鎖定常領域、及び配列番号：３６又は配列番号：２のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＩｇＧ１重鎖定常領域と組み合わせた。
結論
ＩＬ１ＲＡＰに対するモノクローナルキメラウサギ／ヒトＩｇＧ１抗体を単離した。
実施例１０：ＩＬ１ＲＡＰに結合し、ＩＬ－１、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６シグナル伝達を遮断する抗体の同定及び特徴付け
目的
この実施例は、実施例９に記載されるように生成された選択された抗体である４８Ｄ２キメラ（ｃｈ）ウサギ／ヒト抗ヒトＩＬ１ＲＡＰの特徴付けを例示する。ゴールは、カニクイザル及びヒトＩＬ１ＲＡＰの両方に対して高い親和性を有し、全てのＩＬ１ＲＡＰ調節シグナル伝達経路を完全に遮断する抗体を同定することであった。
材料及び方法
ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞への抗体の結合
細胞表面上に、ＩＬ１ＲＡＰを発現する悪性黒色腫（又は悪性（ｍａｌｉｇｎ）メラノーマ）細胞株ＳＫＭＥＬ－５を分析に使用した。ＳＫＭＥＬ－５細胞を、標準的な手順に従い培養した。５ｘ１０４のＳＫＭＥＬ－５細胞を、ヒトＦｃブロックでブロックし、次いで、キメラ４８Ｄ２又はアイソタイプ対照抗体の８段階連続希釈物（１００μｇ／ｍｌ～０．０３μｇ／ｍｌ）で染色した。Ａｌｅｘａ４８８結合抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた２次染色後、１００００細胞／試料をＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。低いレベルの表面ＩＬ１ＲＡＰを発現するＨＴＢ１８３細胞を、陰性対照として使用した。
サイトカインシグナル伝達の阻害
ＩＬ－１及びＩＬ－３３阻害の分析のために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）（ＩＬ－３３／ＩＬ－１）細胞を提供されたように使用した。ＩＬ－３６分析のために、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）（ＩＬ－３３／ＩＬ－１）細胞を、アッセイの前日にＩＬ－３６受容体で一過性にトランスフェクトしたか、又はＩＬ－３６受容体を安定に発現するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）クローン（社内で作製）を使用した。簡潔には、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞を３８４ウェルプレートに播種し、継続する前に最低２時間落ち着かせた。次いで、サイトカインを追加する前に、細胞を濃度を増加させたキメラ４８Ｄ２に暴露し（図に示されるように）、３７℃で、５％のＣＯ２で１時間インキュベーションした。サイトカインを以下の濃度で添加した：２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１α、０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１β、０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３３、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３６α、３ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３６β、及び０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ－３６γ。細胞を３７℃、５％のＣＯ２で１６～１８時間培養し、次いで、ＮＦ－κＢの活性化及びその後のＳＥＡＰの産生についてＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液を用いて分析し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘ分光光度計を使用して６２０ｎｍで測定した。
キメラ４８Ｄ２の発現及び精製
キメラ４８Ｄ２をＣＨＯ細胞中で一過性に発現させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過を用いて精製を行った。
バイオレイヤー干渉法による親和性測定
親和性測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＢＬＩｔｚ Ｐｒｏ １．３．１．３ソフトウェアのＢａｓｉｃ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｍｏｄｕｌｅを用いて、ＦｏｒｔｅＢｉｏのＢＬＩｔｚ（商標）標識なしタンパク質分析システムによって行った。プロテインＡバイオセンサーをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）にてコーティング前に最低１０分間室温で中和させた。２００μｌの抗体溶液（ブロッキング緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）に室温でバイオセンサーを３０分間浸漬することによって、プロテインＡバイオセンサーをコーティングした。次いで、センサーを使用前に２００μｌのブロッキング緩衝液にて少なくとも１０分間インキュベートした。各抗体を、ブロッキング緩衝液中のｈＩＬ１ＲＡＰ（２１－３６７）の４つの異なる濃度で分析した；０．８ｎＭ（０．０３２μｇ／ｍｌ）、４ｎＭ（０．１６μｇ／ｍｌ）、２０ｎＭ（０．８μｇ／ｍｌ）及び１００ｎＭ（４μｇ／ｍｌ）。ベースラインは、３０秒の継続時間でブロッキング緩衝液において作製した。ｈＩＬ１ＲＡＰ中で１２０秒会合させた後、ブロッキング緩衝液中で１２０秒間解離させた。
ドメインマッピング
ＩＬ１ＲＡＰ外部ドメインは、３つのドメイン（ドメイン１、ドメイン２、ドメイン３）からなる。４８Ｄ２が、ＩＬ１ＲＡＰに結合する場所を理解するために、異なるドメインに対応する一連のＩＬ１ＲＡＰ構成物を生成し、これらへの結合を、二重試料を使用して、間接ＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＩＤ Ｑ９ＮＰＨ３に示されるＩＬ１ＲＡＰのアミノ酸配列を用いて構成物を作製した。マイクロタイタープレートを、０．０１Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した、１００ｎｇの組み換えｈＩＬ１ＲＡＰドメイン１＋２＋３（ドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３から構成される）（ａａ２１－３６７）（陽性対照）、組み換えｈＩＬ１ＲＡＰドメイン１＋２（ドメイン１及びドメイン２から構成される）（ａａ２１－２３４）、又はドメイン１（ａａ２１－１３４）、又は組み換えｈＩＬ１ＲＡＰドメイン３（ａａ２３５－３６７）、（１００μｌ／ウェル）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（０．０１Ｍ ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄した後、１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を使用してブロッキング工程を行った。撹拌しながら１時間室温でインキュベートした後、プレートを再びＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液を用いて洗浄した。ＥＬＩＳＡブロッキング溶液中の一連の４８Ｄ２希釈物を調製し（１～１００００ｎｇ／ｍｌの範囲）、その後１００μｌ／ウェルでウェルに移した。プレートを撹拌しながら１時間室温でインキュベートし、その後ＥＬＩＳＡ洗浄溶液で洗浄した。１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧを添加し、撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄溶液を用いてプレートを洗浄した後、基質（４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ウェルで添加した。その後、プレートを撹拌しながら室温でインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を３０分間連続して測定した。０分での吸光度をバックグランドシグナルとした。ポリクローナル抗ｈＩＬ１ＲＡＰ抗体ＫＭＴ－１を対照として使用した。
エピトープマッピング
ドメインマッピング及び交差反応性データに基づいて、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２における２つの領域が、４８Ｄ２の潜在的な相互作用部分として同定され（ヒト化及び脱免疫化４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４（実施例１３を参照））、ａａ １４１－１５７（Ｈ１として指定される）及び１７４－１９１（Ｈ２として指定される）に対応した（Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＩＤ Ｑ９ＮＰＨ３からのヒトＩＬ１ＲＡＰアミノ酸配列に基づく）。関心の２つの領域のヒト配列がマウスＩＬ１ＲＡＰに移植された、マウス／ヒトＩＬ１ＲＡＰの２つのキメラ構成物を作製した：キメラＩＬ１ＲＡＰ．Ｈ１及びキメラＩＬ１ＲＡＰ．Ｈ２。マイクロタイタープレートをキメラＩＬ１ＲＡＰ構成物でコーティングし、ドメインマッピングについて上述したようにＥＬＩＳＡ測定を実施した。ポリクローナル抗ｈＩＬ１ＲＡＰ抗体ＫＭＴ－２（ヒトＩＬ１ＲＡＰに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体）及びＫＭＴ－３（マウスＩＬ１ＲＡＰに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体）を陽性対照とした。
交差反応性
マイクロタイタープレートウェルを、ＩＬ１ＲＡＰオルソログ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（Ｍｆ、カニクイザルと同義）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）でコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、続いてブロッキング工程を行った。撹拌しながら室温で１時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄した。抗体を、ＥＬＩＳＡブロッキング溶液にて、４０００ｎｇ／ｍｌ～０．２４ｎｇ／ｍｌの範囲の、４倍連続希釈で希釈し、その後ＥＬＩＳＡプレートに移した。プレートを撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートし、次いで洗浄した。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒト抗体を添加し、撹拌しながら３０分間３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、続いて基質（４－ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物）を添加した。その後、プレートを撹拌しながら室温でインキュベートし、４０５ｎｍでの吸光度を５０分間連続して測定した。０分での吸光度をバックグランドシグナルとした。
結果
ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞への抗体の結合
キメラ４８Ｄ２又はアイソタイプ対照で染色されたＩＬ１ＲＡＰ発現ＳＫＭＥＬ－５細胞のフローサイトメトリー分析は、アイソタイプ対照抗体と比較して、４８Ｄ２についてより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を明らかにした（図１２）。４８Ｄ２及びアイソタイプ対照を濃度を増加させて細胞に添加する。ＩＬ１ＲＡＰの低い表面発現を有するＨＴＢ１８３細胞への結合は観察されなかった（データは示さない）。
サイトカインシグナル伝達の阻害
図１３は、ＨＥＫ細胞におけるＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γシグナル伝達に対するｃｈ４８Ｄ２の阻害活性を示す。抗体を濃度を増加させて添加し、その後、示されたサイトカインを一定濃度で添加した。グラフは、６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を示し、高いＯＤはサイトカイン受容体の下流のシグナル伝達を示す。キメラ抗体４８Ｄ２は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γシグナル伝達の顕著な阻害、これらのサイトカインシグナル伝達の完全な阻害（遮断）まで、を誘導した。ＩＣ５０値を表３に示す。
Figure 2024500920000011
親和性測定
キメラ４８Ｄ２、及びヒト化４８Ｄ２バリアントＶＨ５：ＶＬ４（実施例１１を参照）、ヒト化並びに脱免疫化４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４（実施例１３）についての親和性測定結果が表４に示される。ｋａは、標的への抗体結合の特徴付けのための会合速度定数であり、ｋｄは、標的からの抗体解離の特徴付けのための解離速度定数であり、そしてＫＤは抗体とその抗原との間の平衡解離定数であり、ｋｄ／ｋａの比である。ＫＤは、抗原結合部分の５０％が平衡状態で占められる抗体濃度に相当する。ＫＤ値が低いほど（濃度が低いほど）、親和性は高い。
４８Ｄ２バリアントは、ヒト（ｈ）ＩＬ１ＲＡＰへの速い結合及び遅い解離を示し、ｎＭ範囲の親和性をもたらした。キメラ４８Ｄ２と比較して、ヒト化、又はヒト化及び脱免疫化バリアントについて、ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する親和性の損失は見られなかった。
Figure 2024500920000012
ドメインマッピング
ドメインマッピングデータを以下の表５に要約する。対照ポリクローナル抗体ＫＭＴ－１は全てのドメインに結合したが、４８Ｄ２はドメイン２を含むＩＬ１ＲＡＰ構成物にのみ結合し、抗体はこのドメインに結合することを示唆した。
Figure 2024500920000013
エピトープマッピング
領域Ｈ１及びＨ２についての移植されたヒト配列を有するマウスＩＬ１ＲＡＰを用いたエピトープマッピング結果を表６に示す。マウスＩＬ１ＲＡＰへのｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４（実施例１３を参照）の結合は、Ｈ２領域のヒト配列がマウスＩＬ１ＲＡＰに導入された場合に回復し、Ｈ２が４８Ｄ２との相互作用に関与することを示唆する（表５及び６の比較）。陽性対照ポリクローナル抗体ＫＭＴ－２及びＫＭＴ－３は、ＩＬ１ＲＡＰの両方のキメラバージョンに結合した。
Figure 2024500920000014
交差反応性
図１４は、異なる種からのＩＬ１ＲＡＰに対するキメラ４８Ｄ２の交差反応性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、４０５ｎｍの吸光度を使用してＩＬ１ＲＡＰオルソログへの抗体の結合を検出する。４８Ｄ２は、ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏ）、及びブタ由来のＩＬ１ＲＡＰに対して交差反応性であるが、マウス、ラット、ウサギ、又はイヌ由来のＩＬ１ＲＡＰに対しては交差反応性はない（図１４及び表７）。
Figure 2024500920000015
結論
キメラ４８Ｄ２は、ｈＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に結合することが見出され、カニクイザル及びヒトＩＬ１ＲＡＰの両方に対して高い親和性を有し、細胞膜上のＩＬ１ＲＡＰに選択的に結合し、そしてＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３，、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γシグナル伝達を完全に阻害し、よって、ヒト化のために選択された。キメラ４８Ｄ２は、実施例９に記載されるように、生成された他の抗体よりも優れた特性を示した。
実施例１１：キメラ４８Ｄ２のヒト化
目的
この実施例は、どのようにして４８Ｄ２のヒト化バリアントを得たかを例示する。
材料及び方法
Ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ（インシリコ）ヒト化
４８Ｄ２の抗体軽及び重鎖可変領域の配列を、成熟ヒト抗体配列及びヒト生殖系列配列を含むデータベースに対して検索した。ＣＤＲは、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの番号付けシステムに従って定義され、そしてアミノ酸残基は、両方の組み合わせとして含まれた（配列番号１並びに３～１８及び、ＫＡＳの配列を有するＣＤＲ－Ｌ２を参照）。
ヒト化のための受容体フレームワークの選択は、配列相同性及びソフトウェアツールＭａｅｓｔｒｏを用いて作製されたその後のアブイニシオ構造予測に基づいた。フレームワークは、重要な構造フレームワーク残基を維持するように選択された。ＶＬ及びＶＨについてそれぞれ５つの配列を得て、２５の異なるヒト化抗体バリアントを作製し、さらに特徴付けた（ＶＨ１～ＶＨ５と組み合わせるためのＶＬ１～ＶＬ５）。ヒト生殖系列抗体配列に基づく受容体フレームワークについては、抗体の構造及び機能を確実にするために、逆変異を導入した。ヒト化の一部はまた、免疫原性（ＭＨＣクラスＩＩ結合親和性）及び製造可能性の予測であった。ＭＨＣクラスＩＩ結合親和性予測を、ＮｅｔＭＨＣＩＩサーバーを使用して行った。
結果
ＶＬの５つのインシリコヒト化バリアント及びＶＨの５つを作製し、ＷＨＯのヒト化抗体の定義に従って、ヒト化されていることを確認した。潜在的なＭＨＣクラスＩＩ結合親和性を有する配列の導入を回避するために、免疫原性を評価した。脱アミド化、異性化、又は断片化を受けやすいグリコシル化モチーフ又は配列の導入を回避するために、製造可能性を評価した。配列を表８に示す。
Figure 2024500920000016
結論
ＶＬの５つのインシリコヒト化バリアント及びＶＨの５つを作製し、２５のヒト化抗体バリアントの産生及び特徴付けのために、ＩｇＧ１定常ドメインでインフレームで合成することとした（実施例１２）。
実施例１２：ヒト化４８Ｄ２の特性
目的
本実施例は、親和性、サイトカイン阻害、及び最適化された生化学的特性を保持するヒト化抗体を見出すことを目的として、どのようにヒト化４８Ｄ２バリアント（実施例１１参照）が発現され、特性づけられたかを説明する。
材料及び方法
ヒト化バリアントの発現、精製、及び特性
４８Ｄ２のヒト化バリアント２５種（表８参照）の重及び軽可変ドメインを、ヒト定常ドメインを含むベクターにサブクローニングした：
－カッパ定常ドメイン（Ｋｍ３アロタイプ）は、軽鎖（配列番号：３５）全体を形成するＶＬドメインと結合される。
－ＩｇＧ１ｚａ（ｚａアロタイプ）の重鎖定常ドメインは、ＶＨドメインと結合して重鎖全体を形成する。Ｆｃ－γ－受容体を介する抗体エフェクター機能を回避するために、重鎖定常ドメインはまた、ＬＡＬＡ変異（配列番号：２）（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏ．２００：１６－２６に記載されるものに対応する）を含む。
ヒト化抗体（ｈ４８Ｄ２）をＨＥＫ－２９３細胞で一過性に発現させ、５０ｍｌ培養の収穫培地からプロテインＡを精製し、ＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換を行った。
抗体は、Ａ）結合（ＥＬＩＳＡ分析、ヒト及びカニクイザルＩＬ１ＲＡＰ）、Ｂ）サイトカインシグナルの阻害（ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）アッセイ）、Ｃ）親和性（バイオレイヤー干渉計）、Ｄ）サイズ不均質（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、及びＥ）収量（濃度、Ａ２８０）についての特性を示した。結合ＥＬＩＳＡは、コーティング試薬として組換えｈＩＬ１ＲＡＰ ａａ２１－３６７又は組換えｍｆＩＬ１ＲＡＰ ａａ２１－３６７を用いて、実施例１０のドメインマッピングについて示した間接ＥＬＩＳＡと同様の方法で実施した。ＳＥ－ＨＰＬＣは、標準的な手順で、ランニング緩衝液としてＰＢＳを使用して実施した。親和性及びサイトカイン阻害は、実施例１０に先に記載したように測定した。２５個のヒト化クローンすべてをＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３シグナルに対する遮断活性について解析し、キメラ４８Ｄ２と同様の阻害活性を保持したクローンのみをＩＬ－３６阻害について解析した。
結果
Ａ）ヒト化抗体クローンのＩＬ１ＲＡＰへの結合（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ測定で得られたＩＣ５０値を表９に示す。結合ＥＬＩＳＡを使用すると、異なるクローン間で結合のわずかな違いしか見ることができない。また、各クローンとも、ヒトとカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性は同様であった。
Figure 2024500920000017
Figure 2024500920000018
Ｂ）サイトカインシグナル伝達の阻害
図１５Ａ－Ｏは、ＨＥＫ細胞におけるＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３シグナル伝達に対するヒト化４８Ｄ２抗体クローンの阻害活性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、その後、描かれたサイトカインを一定濃度で添加する。グラフは、６２０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を示し、高いＯＤはサイトカイン受容体の下流のシグナル伝達を示す。ＶＨ５バリアントを保有する抗体クローンは、キメラ４８Ｄ２抗体と同様の効力を持って、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３シグナル伝達の完全なる阻害を誘導した（図１５Ｅ、１５Ｊ、１５Ｏ）。バリアントＶＨ１～ＶＨ４を保有する抗体クローンは、キメラ４８Ｄ２と比較して、様々な力価でＩＬ－１α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－３３のシグナル伝達を阻害した。これらのバリアントは、ＩＬ－１α（図１５Ａ－Ｄ）及びＩＬ－３３（図１５Ｋ－Ｎ）に関して部分的な阻害を達成し、ＩＬ－１β（図１５Ｆ－Ｉ）に関しては完全な阻害を達成した。ＶＨ１～ＶＨ４のバリアントを保有する抗体クローンについては、ＩＬ－３６阻害の解析は行わなかった。それぞれのＩＣ５０値を表１０に示す。図１５Ｐ－Ｒは、ＶＨ５バリアントを保有する抗体クローンも、キメラ４８Ｄ２抗体と同様の効力を持って、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γシグナルの完全阻害を誘導したことを示す。
Figure 2024500920000019
Figure 2024500920000020
Figure 2024500920000021
Ｃ）親和性測定
ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する親和性のＫＤ値は、ヒト化４８Ｄ２バリアントについて表１１に示す。親和性はバイオレイヤー干渉計で測定した。すべての抗体バリアントは、ナノモル領域の親和性を示した。最も高い親和性を示したのはＶＨ５シリーズで、ＫＤ値は１－４ｎＭの範囲にあった。キメラ４８Ｄ２、ヒト化４８Ｄ２バリアントＶＨ５：ＶＬ４、及びヒト化脱免疫化４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の直接比較については表４もご参照。
Figure 2024500920000022
Figure 2024500920000023
Ｄ）サイズの不均質性
サイズ不均質性は、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を用いて決定した（表１２）。インタクトな単量体抗体は、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖がジスルフィド結合で共有結合したものである。高分子量（ＨＭＷ）種は、例えば、二量体の可溶性抗体凝集体を含む可能性がある。低分子（ＬＭＷ）種は、例えばペプチド結合が切断された抗体、すなわち、フラグメント化した抗体を含む可能性がある。ｈ４８Ｄ２ ＶＨ４：ＶＬ３が＞５％の高分子量種（ＨＭＷ）を含む以外は、ほぼすべてのバリアントが高単量体（≧９７％）であった。すべての解析対象バリアントにおいて、少量の低分子量（ＬＭＷ）種も検出されなかった。
Figure 2024500920000024
Figure 2024500920000025
Ｅ）収量
ヒト化４８Ｄ２バリアントについては、２８０ｎｍの吸光度測定によりタンパク質濃度を測定し、５０ｍｌ培養の収量を決定した（表１３）。ＶＬは収量に影響し、ＶＬ４バリアントで最も高い収量が得られ、ＶＬ３バリアントで最も低い収量が得られた。このように、収量はＶＬ配列に依存する部分があった。
Figure 2024500920000026
Figure 2024500920000027
結論
ＶＨ５バリアントを保有するヒト化抗体バリアントは、キメラ４８Ｄ２抗体と同様の効力を持って、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのシグナル伝達を完全に阻害する能力を保持した。バリアントＶＨ１～ＶＨ４を有する抗体バリアントは、キメラ４８Ｄ２と比較してその効力は様々で、ＩＬ－１βのシグナル伝達を完全に阻害し、ＩＬ－１α及びＩＬ－３３のシグナル伝達を部分的に阻害した。ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する親和性はＶＨ５シリーズで最も高く、このシリーズの中で、バリアントｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ５は、ＳＥ－ＨＰＬＣで良好な収量と高いモノマー含有量を得た。そこで、これらのバリアントを用いて、さらなる研究を進めた。
実施例１３：ヒト化４８Ｄ２クローンのうち２つのクローンの脱免疫
目的
この実施例は、ｈ４８Ｄ２のＶＬ５及びＶＨ５のうち、ＭＨＣクラスＩＩ分子との親和性が予測される配列が、生殖細胞分裂によって脱免疫化されたことを示す。
材料及び方法
ＭＨＣクラスＩＩ分子との親和性が予測される配列の除去
ヒト化４８Ｄ２ ＶＬ５及びＶＨ５配列は、生殖細胞系列の抗体配列を使用して作成された。これら２つの配列については、抗体の構造と機能を保持を確実にするために、元のウサギの配列に多くの逆変異を導入した（実施例１１参照）。これらの導入された逆変異により、ＭＨＣクラスＩＩ分子との親和性が予測される配列が生み出された。
ＶＨ５では、フレームワーク領域２の２つの逆変異が免疫原性の可能性をもたらし、ＶＬ５では、フレームワーク領域１の６つの逆変異がもたらした。ＶＨ５の脱免疫化のために、逆変異は、単一変異及び両残基の変異（結果として３種類の配列バリアント）として生殖細胞系列配列に戻された。ＶＬ５については、６つの逆変異をすべて１つの新しい配列として生殖細胞系列の配列に戻した（結果として１つの配列バリアントが生じた）。
この結果、脱免疫化ＶＨ５の新しい配列は以下のようになった：
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＡＰ（アラニン→プロリン）（配列番号．３２）、
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＳＫ（セリン→リジン）（配列番号．３３）、
ｈ４８Ｄ２．ＶＨ５．ＧＬ（「生殖細胞系」、両残基とも生殖細胞系の配列に戻したもの）（配列番号．３４）；
及び、脱免疫化されたＶＬ５については、以下の新しい配列になる；
ｈ４８Ｄ２ ＶＬ５．ＧＬ（「生殖細胞系列」、６つの残基すべてが生殖細胞系列配列に戻される）（配列番号．３１）。
結果及び結論
ＶＬ５、ＶＨ５で脱免疫を実施した。新しいＶＬ５及びＶＨ５は、ｈ４８Ｄ２ ＶＬ４、ｈ４８Ｄ２ ＶＬ５、及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５について以前に得られた配列と組み合わせ、発現と特性評価のために新たに１０種類の追加バリアントを作成した：
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ５．ＧＬ
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＡＰ：ＶＬ４
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＡＰ：ＶＬ５
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＡＰ：ＶＬ５．ＧＬ
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＳＫ：ＶＬ４
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＳＫ：ＶＬ５
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＳＫ：ＶＬ５．ＧＬ
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５
ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬ
実施例１４：ヒト化脱免疫化４８Ｄ２クローンの特性
目的
この例は、親和性、サイトカイン阻害、及び最適化された生化学的特性を保持するヒト化抗体及び脱免疫化抗体を見つけることを目的として、ヒト化及び脱免疫化４８Ｄ２バリアントがどのように発現及び特徴付けられたかを示す。
材料及び方法
脱免疫化ｈ４８Ｄ２の発現、精製、及び特性
発現、精製、及び特性は、キメラ４８Ｄ２及び実施例１０及び１２のヒト化バリアントについて先に述べたように実施した。
結果
ヒト化抗体クローン及び脱免疫化抗体クローンのＩＬ１ＲＡＰへの結合（ＥＬＩＳＡ）ＥＬＩＳＡ測定で得られたＩＣ５０値を、脱免疫化されたｈ４８Ｄバリアントについて表１４に示す。結合ＥＬＩＳＡを使用すると、異なるバリアント間で結合の小さな違いしか見ることができない。各クローンについて、ヒトとカニクイザル（ｃｙｎｏ）のＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性はほぼ同様であった。
Figure 2024500920000028
ヒト化抗体クローン及び脱免疫化抗体クローンのＩＬ１ＲＡＰへの結合
ＩＬ１ＲＡＰ発現ＳＫＭＥＬ－５細胞をｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬ又はアイソタイプ対照で染色したフローサイトメトリー解析では、抗体を高濃度で添加すると、アイソタイプ対照抗体と比較してＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４及びＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬの高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）が現れた（図１６）。
サイトカインシグナル伝達の阻害
図１７は、ＨＥＫ細胞におけるＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γシグナルに対するヒト化抗体及び脱免疫化４８Ｄ２抗体クローンの阻害活性を示す。抗体は濃度を上げて添加し、描かれたサイトカインは一定濃度で添加した。ヒト化バリアントｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５：ＶＬ５を対照として含めた。グラフは６２０ｎｍでのＯＤ値を示し、ＯＤが高いほどサイトカイン受容体の下流でのシグナル伝達を表す。すべてのバリアントは、ＩＬ－１α（Ａ），ＩＬ－１β（Ｂ），ＩＬ－３３（Ｃ），ＩＬ－３６α（Ｄ），ＩＬ－３６β（Ｅ）及びＩＬ－３６γ（Ｆ）に対して阻害効果を保持した。ＩＣ５０値は表１５に示す。
Figure 2024500920000029
図１７Ａ－Ｆの結果を得るために使用した実験セットアップでは、前日にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）（ＩＬ－３３／ＩＬ－１）細胞にＩＬ－３６受容体を一過性に遺伝子導入した。その後、ＩＬ－３６受容体を安定的に導入したＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）細胞を用いて、ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４について、ＩＬ－３３及びＩＬ－３６サイトカインのシグナル伝達阻害のさらなる評価を実施した。この評価の結果、ＩＬ－３３（図１７Ｇ）ＩＬ－３６α（図１７Ｈ），ＩＬ－３６β（図１７Ｉ）及びＩＬ－３６γ（図１７Ｊ）にも阻害効果を示した。ＩＣ５０値は表１６に示す。
Figure 2024500920000030
親和性測定
ヒトＩＬ１ＲＡＰに対する親和性のＫＤ値は、脱免疫化４８Ｄ２バリアントについて表１７に示す。親和性はバイオレイヤー干渉計で測定した。親和性は、すべての脱免疫化バリアントで同様であり、ＫＤ値は１－２ｎＭであった。４８Ｄ２、ヒト化４８Ｄ２、及び脱免疫化ｈ４８Ｄ２の直接比較については、表４も参照。
Figure 2024500920000031
サイズの不均質性
サイズ不均質性は、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を用いて決定した（表１８）。いくつかのＨＭＷ種を含んだＶＬ５．ＧＬを有するｈ４８Ｄ２バリアントは例外として、ほぼすべてのバリアントが高単量体（≧９８％）であった。すべての解析対象バリアントにおいて、ＬＭＷ種は検出されなかった。
Figure 2024500920000032
収量
脱免疫化したｈ４８Ｄ２バリアントについて、２８０ｎｍでの吸光度測定によりタンパク質濃度を測定し、５０ｍｌ培養の収量を決定した（表１９）。ＶＬバリアントＶＬ５．ＧＬを有する抗体バリアントは、他のバリアントに比べて低い取得可能な収量を示した。
Figure 2024500920000033
Figure 2024500920000034
交差反応性
図１８は、ｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬの異なる種由来のＩＬ１ＲＡＰに対する交差反応性を示す。抗体を濃度を上げて添加し、４０５ｎｍの吸光度によりＩＬ１ＲＡＰとの結合を検出する。キメラ４８Ｄ２については、ヒト化及び脱免疫化バリアントｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４及びｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ５．ＧＬは、カニクイザル（ｃｙｎｏ）及びブタのＩＬ１ＲＡＰと交差反応したが、マウス、ラット、ウサギ、及びイヌのＩＬ１ＲＡＰとは交差反応しなかった（図１８及び表２０）。
Figure 2024500920000035
結論
脱免疫化したバリアントは、いずれもＫＤ値が１－３ｎＭと高い親和性を示し、生物学的機能を保持した。バリアントｈ４８Ｄ２ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて収量が良く、高いモノマー含有量で優れていた。
実施例１５：キメラ４８Ｄ２のＡＤＣＣ効果
目的
本実施例では、キメラ４８Ｄ２をｈＩｇＧ１－野生型（ＷＴ）又はエフェクター機能サイレントＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットで発現させた場合の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を調査することを目的とした。
材料及び方法
細胞表面にＩＬ１ＲＡＰを発現している悪性黒色腫細胞株ＳＫＭＥＬ－５をターゲットとして、インビトロＡＤＣＣアッセイを実施した。ターゲット細胞を９６ウェルプレートに１００００個／ウェルの密度で播種した。その後、４８Ｄ２－ＷＴ、４８Ｄ２－ＬＡＬＡ又はアイソタイプ対照抗体を異なる濃度でウェルに加え、３０分間インキュベートした後、１０００００個のＮＫエフェクター細胞を各ウェルに加えた。ＮＫ細胞は、製造者の指示に従い、ＮＫ細胞陰性細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を用いて白血球濃縮液から抽出した。実験において、非特異的ヒトＩｇＧ１－ＷＴ抗体及びＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体を対照として使用した。細胞死の程度は、培養１８時間後にＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ）を用いてＤＡＰＩ陽性細胞の検出により評価した。
結果
インビトロＡＤＣＣアッセイにおいて、ｈＩｇＧ１フォーマットのキメラ４８Ｄ２が、抗体特異的、用量依存的にＳＫＭＥＬ－５細胞を死滅させるようＮＫ細胞を誘導することが示す（図１９）。ｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットで発現させたキメラ４８Ｄ２で処理した後、アイソタイプ対照及び未処理細胞（未処理細胞は０ｎｇ／ｍｌの抗体に対応）と比較して、ＳＫＭＥＬ－５細胞の死細胞の割合に増加はみられなかった。
その効果は、用量依存的であることが示された。キメラ４８Ｄ２をｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットで発現させると、ＡＤＣＣ効果は消失する。４８Ｄ２抗体の抗体バリアント（上記の実施例に記載された抗体、例えば、ヒト化抗体、又はヒト化及び脱免疫化抗体バリアント）は、ｈＩｇＧ１－ＷＴ又はｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡフォーマットで発現した場合に同様の効果を有することが想定され得る。実際、以下の実施例１９は、ｈＩｇＧ１ ＬＡＬＡフォーマットの抗体バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４が、血液ループアッセイにおいてＦｃ媒介免疫活性化を誘導しないことを実証する。
結論
この実験により、４８Ｄ２は、ＮＫ細胞を、表面にＩＬ１ＲＡＰを発現しているメラノーマ細胞株への特異的殺傷に誘導でき、及び４８Ｄ２によって誘導される細胞傷害作用が用量依存的であることを示す。さらに、４８Ｄ２をエフェクター機能サイレントｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットで発現させることにより、ＡＤＣＣ効果を消失させることができる。
実施例１６：キメラ４８Ｄ２によるヒト線維芽細胞のサイトカインシグナル伝達の阻害
目的
本実施例の目的は、ヒト線維芽細胞におけるＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γ刺激ＩＬ－６遺伝子発現に対するキメラ４８Ｄ２の阻害活性をインビトロで調査することである。
材料及び方法
健康なヒト皮膚から採取した線維芽細胞は、商業的に入手し、完全な線維芽細胞増殖培地で増殖させた。ウェルあたり７５０００個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。８０％コンフルエントの細胞を、１％ＦＢＳのみを含む線維芽細胞培地で一晩血清飢餓状態にした。培地を１％ＦＢＳと成長因子を含まない新しい線維芽細胞培地に変更し、異なる濃度のサイトカインで刺激する１時間前に２０ｕｇ／ｍｌキメラ４８Ｄ２をウェルに添加した（図２０に描かれるように）。細胞を２４時間刺激した後、製造者の指示に従ってＲＮＡを単離した。ＩＬ－６ｍＲＮＡ量はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて解析し、データはΔΔＣＴ法で解析し、無処置の対照と比較したときの変化量２－ΔΔＣＴで示した。
結果
ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γは、用量依存的に真皮線維芽細胞のＩＬ－６遺伝子発現を誘導した（図２０）。この実験において、キメラ４８Ｄ２が遺伝子発現の増加を阻害し、非刺激の対照と同程度のレベルまで低下させた。ＩＬ－３３は、これらの細胞におけるＩＬ－６の発現に影響を与えなかった（データは示さず）。４８Ｄ２抗体の抗体バリアント（上記実施例で説明した抗体、例えばヒト化抗体、又はヒト化抗体及び脱免疫化抗体バリアントなど）は、同様の効果を有することが想定できる。実際、実施例１７は、抗体バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４がヒト全血においてＩＬ－１βシグナルを阻害することを実証する。
結論
４８Ｄ２は、ヒト線維芽細胞におけるサイトカイン誘発のＩＬ－６遺伝子発現の増加を遮断することができる。
実施例１７：４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４によるヒト全血中のＩＬ－１βシグナル伝達の阻害
目的
本研究の目的は、ヒト全血を４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４とプレインキュベーションすることにより、ＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナルを遮断することが、ＩＬ－１βの刺激に応答して様々な下流のサイトカインやケモカインの放出にどのように影響するかを調査することである。
材料及び方法
ヒト血液は、２人の異なるドナーからヘパリンチューブで採取した。血液を９６ウェルプレートのウェルに移し、１５０μｇ／ｍｌ ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４と共に３７℃、５％ＣＯ２で３０分間攪拌しながらインキュベートした。その後、ＩＬ－１β又はＬＰＳをともに１ｎｇ／ｍｌでウェルに添加し、血液を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間撹拌しながら２０時間インキュベートした。血液試料を製剤緩衝液だけでインキュベートしたウェルは、陰性対照（Ｃｔｒｌ）として含まれた。このプレートを１５００ｒｐｍで遠心分離し、血漿と血球を分離した。血漿を１：２に希釈し、７１の異なるサイトカイン及びケモカインのレベル（６ＣＫｉｎｅ、ＢＣＡ－１、ＣＴＡＣＫ、ＥＧＦ、ＥＮＡ－７８、エオタキシン、エオタキシン－２、エオタキシン－３、ＦＧＦ－２、Ｆｌｔ３Ｌ、フラクタルカイン、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＲＯα／ＣＸＣＬ１、Ｉ－３０９．ＩＦＮα２、ＩＦＮγ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０．ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－３３、ＩＰ－１０、ＬＩＦ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＤＣ、ＭＩＧ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－１δ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ／ＢＢ、ＲＡＮＴＥＳ、ｓＣＤ４０Ｌ、ＳＣＦ、ＳＤＦ－１α＋β．ＴＡＲＣ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＰＯ、ＴＲＡＩＬ、ＴＳＬＰ、ＶＥＧＦ－Ａ）は、血漿試料において、サイトカイン／ケモカイン７１－Ｐｌｅｘ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｓｓａｙ Ａｒｒａｙ（Ｅｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ； ＨＤ７１）を用いて、製造者の説明書に従って測定した。これらのうち、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＲＯα／ＣＸＣＬ１、ＩＬ－１７Ａ、及びＴＮＦ－αの４つの結果については、後述する。
結果
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４によるＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナルの遮断は、ＩＬ－１βによる刺激に応答したヒト全血中のＧ－ＣＳＦ、ＧＲＯα／ＣＸＣＬ１、ＩＬ－１７Ａ、及びＴＮＦ－αの放出を減少させた（図２１Ａ－Ｄ）。同様の効果は、血液をＬＰＳで刺激した場合にも認められ、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４はＧ－ＣＳＦ、ＧＲＯα／ＣＸＣＬ１、及びＴＮＦ－αのレベルを顕著に低下させ、ＩＬ－１７Ａのレベルはわずかに低下した（図２１Ａ－Ｄ）。
結論
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４によるＩＬ１ＲＡＰ遮断は、ＩＬ－１β及びＬＰＳを介したＩＬ－１Ｒシグナルの下流効果に影響を与え、複数のサイトカインやケモカインの放出を減少させる。
実施例１８：４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４による血液ループシステムでのＩＬ－１βシグナル阻害
目的
本研究の目的は、ヒト全血を４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４でプレインキュベーションすることにより、ＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナルを遮断することが、ヒト血液循環を模した血液ループシステムにおいてＩＬ－１βによる刺激に応答したＩＬ－６及びＩＬ－８の放出にいかに影響するかを調査することである。
材料及び方法
１０人の健康なドナーから新鮮な全血を採取し、低量の可溶性ヘパリンを添加した。血液は直ちにプレコートプラスチックチューブに移され、血液ループシステムのループを形成した。ループを回転ホイールに乗せ、並行して試料を走らせた。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を３２μｇ／ｍｌで試料に投与し、１５分後に１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１βを添加した。対照にはＰＢＳを使用した。各ループは４時間後にサンプリングされ、サンプリング時点の反応を停止させるために、各試料に１０ｍＭの濃度でＥＤＴＡが添加された。血漿試料は遠心分離によって調製し、アリコートし、さらなるサイトカイン分析まで≦－６０℃で保存した。
サイトカインＩＬ－６及びＩＬ－８は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使って測定した。すべての試料は１：４に希釈し、製造元の説明書に従って試料を二重に実行した。
結果
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４によるＩＬ－１α／β、ＩＬ－３３、及びＩＬ－３６α／β／γシグナルの遮断は、血液ループシステムで循環するヒト全血において、ＩＬ－１βによる刺激に応答してＩＬ－６及びＩＬ－８の放出を減少させた（図２２Ａ－Ｂ）。
結論
ヒトの血液循環を模した血液ループシステムにおいて、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４によるＩＬ１ＲＡＰ遮断は、ＩＬ－１βを介したＩＬ－１Ｒシグナルの下流効果に影響を与え、サイトカインＩＬ－６及びＩＬ－８の放出を減少させることが確認された。
実施例１９：ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞による４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の内在化
目的
この実験の目的は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞による蛍光標識４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の膜結合と潜在的な内在化を調査することである。
材料及び方法
ＷＴ及びＩＬ１ＲＡＰ ＫＯ ＳＫＭＥＬヒトメラノーマ細胞を６０－８０％コンフルエンスまで増殖させ、その後、８ウェルＩｂｉｄｉ－ｔｒｅａｔ顕微鏡チャンバースライドに１ウェルあたり１２５００細胞で移した。細胞を３μｇ／ｍｌ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ＡＦ６４７）－結合ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４とともに３７℃で１、２、又は４時間インキュベートした。対照細胞は、ＡＦ６４７結合アイソタイプ対照抗体でインキュベートした。代替的に、Ａ６４７結合ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４で２時間インキュベートしたＷＴ ＳＫＭＥＬ細胞を、さらに５μｇ／ｍｌウサギ抗ＥＥＡ１抗体及び１０μｇ／ｍｌマウス抗Ｌａｍｐ１抗体で３時間インキュベートし、それぞれエンドソーム及びリソソームのマーカーを染色した。細胞を洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ＡＦ４８８）結合抗ウサギ抗体およびローダミン（ＲＸ）結合抗マウス抗体と３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を再び洗浄し、その後ＤＡＰＩで標識して細胞核を染色した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡を使用し、６３倍の油浸レンズで細胞を解析した。検出レベルは、Ａ６４７結合ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４、又は抗ＥＥＡ１、抗Ｌａｍｐ１とインキュベートしていない対照細胞から設定し、解析を通して同じ設定を使用した。細胞内の５００ｎｍの光切片をスキャンし、代表的な画像を撮影することで、相互作用的な視覚的解析を行った。
結果
ＩＬ１ＲＡＰを発現しているＷＴ ＳＫＭＥＬ細胞では、１時間のインキュベーションでＡ６４７結合ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の初期膜結合と細胞内在化が検出された（図２３；左上画像；矢印は膜結合と内在化を示す）。最大内在化は、インキュベーションの約２時間後に示された（図２３；上中図）。ＩＬ１ＲＡＰ ＫＯ細胞によるＡ６４７結合ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の結合と内在化の欠如は、ＷＴ細胞で観察された効果がＩＬ１ＲＡＰとの相互作用によって媒介されることを示す（図２３；中段；ＤＡＰＩによる核の染色のみ観察）。さらに、ＷＴ細胞に対するアイソタイプ対照抗体の結合や内在化は観察されなかった（図２３；下段；ＤＡＰＩによる核の染色のみ観察）。エンドソームとリソソームのマーカーであるＥＥＡ１及びＬａｍｐ１の共染色を追加すると、Ａ６４７標識のＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４のシグナルととの重複を示す（図２４）。これは、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は内在化時にこれらのコンパートメントに局在することを示す。
結論
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４はＩＬ１ＲＡＰ発現ＳＫＭＥＬ細胞への結合により内在化する。この内在化は、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４のＩＬ１ＲＡＰへの結合に依存する。
実施例２０：４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４による血液ループシステムでのＦｃを介した免疫活性化
目的
本研究の目的は、エフェクター機能サイレントｈＩｇＧ１－ＬＡＬＡフォーマットで発現させた４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４が、人間の血液循環を模した血液ループシステムにおいて、他の刺激がない状態で免疫活性化を誘導できるか、またどの程度誘導できるかを調査することである。免疫活性化は、循環するヒト全血中の炎症性サイトカインの放出及び補体の活性化によって評価されるだろう。
材料及び方法
１０人の健康なドナーから新鮮な全血を採取し、補体系に対する薬剤の影響を分析できるように、低量の可溶性ヘパリンを添加した。血液を直ちにプレコートプラスチックチューブに移し、血液ループシステムのループを形成した後、０．０１２５ｍｇ／ｍｌ、０．１２５ｍｇ／ｍｌ、又は１．２５ｍｇ／ｍｌのＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を添加した。抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブを３μｇ／ｍｌ添加した試料、又は製剤緩衝剤のみ（ビヒクル）をそれぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。ループを回転ホイールに乗せ、並行して試料を走らせた。１５分後及び４時間後に各ループをサンプリングし、サンプリング時点の反応を停止させるために、各試料に１０ｍＭの濃度でＥＤＴＡを添加した。１５分後に採取した試料は補体分析用の血漿に、４時間後に採取した血液試料はサイトカイン分析用の血漿に加工された。血漿試料は遠心分離により調製し、アリコートし、分析まで≦－６０℃で保存した。
サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦαは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使って測定した。すべての試料は１：４に希釈し、製造元の説明書に従って試料を二重に実行した。
補体活性化は、ＥＬＩＳＡキット（ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｃ３ａ ＥＬＩＳＡキット及びＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｃ５ａ ＥＬＩＳＡキット）を用いて補体分割産物Ｃ３ａ及びＣ５ａを測定することにより解析した。血漿試料は、Ｃ３ａ分析には試料希釈液で１：５００、Ｃ５ａ分析には試料希釈液で１：５０に希釈し、製造元の指示に従って二重に実行した。
結果
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、ＩＦＮγ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦαの放出（図２５Ａ－Ｄ）、及びＣ３ａ及びＣ５ａのレベルで測定した補体の活性化（図２６Ａ－Ｂ）に対して、評価した３濃度のいずれにおいても血液ループシステムで影響を与えなかった。対照的に、抗ＣＤ５２抗体アレムツズマブは、サイトカイン放出と同時に補体活性化を誘導した。
結論
エフェクター機能サイレントＦｃ領域を持つＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、Ｆｃを介した免疫活性化を誘導しない。
実施例２１：４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の静脈内投与による初期安全性と薬物及び毒物動態の特性
目的
本試験の目的は、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を雌雄のカニクイザルに単回静脈内投与し、最大耐容量まで３段階に漸増投与した場合の薬物動態及び潜在的毒性を決定することである。
材料及び方法
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、各投与量レベルについて、雌雄１匹のカニクイザルに単回投与（ボーラス）として５、２０、又は５０ｍｇ／ｋｇを末梢静脈から静脈内投与した。投与後２週間、毎日動物を観察し、死亡率、臨床症状、及び食物摂取量を調べた。試験前と試験８日目に血液学と血清化学を実施した。体重は試験前と８日目及び１５日目に記録した。生物分析及び毒物動態評価のためのサンプリングは、投与前及び投与後０．０８３、１、３、６、２４、４８、９６、１６８、２６４、及び３３６時間に大腿静脈から採取した（各試料に少なくとも０．６ｍｌ血液）。血液試料は、血清分離用のチューブで室温で３０分間凝固させた。血栓を１２００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することでスピンダウンさせた。得られた血清は、分析まで－８０℃で保存した。
ビオチン化したヒトＩＬ１ＲＡＰをストレプトアビジンでプレコートしたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートに加え、室温でインキュベートした。洗浄後、血清試料をプレートに添加し、室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、電気化学発光標識（ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ）に結合した抗ヒトＩｇＧをプレートに添加した。最終インキュベーションと洗浄の後、リード緩衝液を添加した。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧは、プレート電極にＭＳＤ装置内の電圧をかけると発光する。この装置では、発光強度を測定することで、試料中のＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を定量的に測定する。血清毒物動態解析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎパッケージ（ｖ．８．１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｉｎｃ，Ｃｅｒｔａｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ，米国）を用いて、標準的なノンコンパートメントアプローチに従って実施した。
結果
体重及び臨床病理検査において、異常な臨床症状及び関連する毒性学的変化は存在しなかった。血清化学及び血液学に毒性学的に関連する変化は観察されなかった。
調査した用量範囲において、本化合物の用量規格化された最大濃度は同程度であった。各投与量レベルにおいて、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の雌雄の血清毒物動態学パラメーターは同様だった。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の終末半減期は、５ｍｇ／ｋｇ投与後で平均９８時間（４日）、２０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ投与パラメーター後では２２０時間（９日）と、５ｍｇ／ｋｇでの投与よりも２倍高かった（表２１）。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４は、二指数関数的に減少することがわかった（図２７）。すべての投与量において、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の血清クリアランスは低く、終末期の分配容積はサルの全身水（≒７００ｍｌ／ｋｇ）と同じオーダーであることがわかった。
Figure 2024500920000036
結論
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４をカニクイザルに単回静脈内投与した後、本抗体の薬物動態は、低クリアランス、低分布容量、及び長半減期を特徴とした。検討した用量範囲において，化合物の最大濃度は用量に直接比例して増加したが、５０ｍｇ／ｋｇでのＡＵＣ最終は用量に直接比例して増加するよりも増加する傾向がみられた。
実施例２２：４８Ｄ２バリアントＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の皮下投与による薬物動態の特性
目的
本試験の目的は、雌のカニクイザルにＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の抗体を単回皮下投与した後の薬物動態及びバイオアベイラビリティを決定することである。
材料及び方法
ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を、投与経路ごとに雌のカニクイザル２匹に単回投与として１０ｍｇ／ｋｇを静脈内又は背部皮下に投与した。薬物動態評価用のサンプリングは、投与前及び投与後１、３、６、２４、４８、９６、１６８、２６４、３３６、４８０、及び６７２時間に採取した（各試料に少なくとも０．６ｍｌの血液）。追加的に、静脈内投与から０．０８３時間後、皮下投与から０．５時間後に初回投与分を採取した。血液試料は、血清分離用のチューブで室温で３０分間凝固させた。血栓を１２００ｇ、４℃で１０分間遠心分離することでスピンダウンさせた。得られた血清は、分析まで－８０℃で保存した。
血清は、実施例２１に記載したようにＭＳＤで分析した。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の血清薬物動態解析は、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＷｉｎＮｏｎｌｉｎパッケージ（Ｃｅｒｔａｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ，米国）を用いて実施した。
結果
雌のカニクイザルにＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を１０ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与したところ、ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の血清濃度は平均８６．９時間で減少した（図２８及び表２２）。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の血清クリアランス、分配量ともに低かった。サルの体内水量の合計の約１０分の１を占めるのが分配量である（表２２）。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４の１０ｍｇ／ｋｇ量を皮下投与したところ、化合物の吸収は遅く、Ｔｍａｘは投与後４８～９６時間だった（図２８及び表２３）。Ｃｍａｘに達した後、化合物の血清濃度は減少し、平均終末半減期は平均１１２時間であった（表２３）。皮下バイオアベイラビリティは９３％と高かった。
Figure 2024500920000037
Figure 2024500920000038
結論
カニクイザルにＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４を１０ｍｇ／ｋｇ単回静脈内投与した後の薬物動態は、低いクリアランス及び分布容積、ならびに長い半減期によって特徴づけられた。ＶＨ５．ＧＬ：ＶＬ４ １０ｍｇ／ｋｇを皮下投与後、その化合物の吸収は緩やかであった。Ｃｍａｘに達した後、血清中の化合物の濃度は静脈内投与と同程度の平均終末半減期で減少した。皮下バイオアベイラビリティは高かった。
配列
ＣＤＲ配列（ＩＭＧＴに従って定義される）
配列番号：１
可変型軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＥＳＩＳＴＡ
可変型軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＫＡＳ
配列番号：３
可変型軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ
配列番号：４
可変型重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＧＰＳＬＳＨＦＤ
配列番号：５
可変型重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＩＳＰＧＶＳＴ
配列番号：６
可変型重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ
ＣＤＲ配列（Ｋａｂａｔに従って定義される）
配列番号：７
可変型軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ
配列番号：８
可変型軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＫＡＳＴＬＰＳ
配列番号：９
可変型軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ
配列番号：１０
可変型重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＨＦＤＩＴ
配列番号：１１
可変型重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ
配列番号：１２
可変型重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ
ＣＤＲ配列（ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの組み合わせに従って定義される）
配列番号：１３
可変型軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｌ１）
ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ
配列番号：１４
可変型軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｌ２）
ＫＡＳＴＬＰＳ
配列番号：１５
可変型軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｌ３）
ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ
配列番号：１６
可変型重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲ－Ｈ１）
ＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ
配列番号：１７
可変型重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ－Ｈ２）
ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ
配列番号：１８
可変型重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲ－Ｈ３）
ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ
各ＣＤＲ定義カテゴリー（ｉ）Ｋａｂａｔ、ｉｉ）ＩＭＧＴ又はｉｉｉ）ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔの組み合わせ内で、ＣＤＲ配列（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、又はＣＤＲ－Ｈ３、それぞれ）は、キメラ抗体４８Ｄ２及びそのすべての最適化抗体バリアント、例えばヒト化抗体バリアント又はヒト化／脱免疫化抗体バリアントについて同じである（以下の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列で示されるものを参照）ことを注意することは重要である。
－太字で強調表示されたＣＤＲ残基は、ＩＭＧＴ番号付けシステムで同定され、
－下線で強調されたＣＤＲ残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムで同定され、
－ＣＤＲ残基は、ＩＭＧＴ及びＫａｂａｔ番号システムの組み合わせで定義された（太字及び下線の組み合わせの配列）。
キメラ４８Ｄ２抗体と同じ可変鎖領域
（非ヒト化、非脱免疫化）（例：実施例９及び１０において）
Figure 2024500920000039
ヒト化可変鎖領域
（例えば、実施例１１及び１２）
Figure 2024500920000040
Figure 2024500920000041
ヒト化及び脱免疫化可変鎖領域
（例えば、実施例１３、１４）
太字及び斜体のアミノ酸残基は、脱免疫の過程で元に戻る残基を示す。
Figure 2024500920000042
定常領域
配列番号：３５
免疫グロブリンカッパ定常軽鎖（軽鎖定常領域）（Ｋｍ３アロタイプ）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
太字及び下線のアミノ酸残基は、ＬＡＬＡ－変異が導入された場合に変化する残基を示
す。
配列番号：３６
免疫グロブリンＩｇＧ１定常重鎖（重鎖定常領域）（ｚａアロタイプ）
Figure 2024500920000043
配列番号：２
「ＬＡＬＡ」変異を有する免疫グロブリンＩｇＧ１定常重鎖（重鎖定常領域）（ｚａアロタイプ）
Figure 2024500920000044
ヒトＩＬ１ＲＡＰ
配列番号：３７
ヒトＩＬ１ＲＡＰ全長
ＭＴＬＬＷＣＶＶＳＬＹＦＹＧＩＬＱＳＤＡＳＥＲＣＤＤＷＧＬＤＴＭＲＱＩＱＶＦＥＤＥＰＡＲＩＫＣＰＬＦＥＨＦＬＫＦＮＹＳＴＡＨＳＡＧＬＴＬＩＷＹＷＴＲＱＤＲＤＬＥＥＰＩＮＦＲＬＰＥＮＲＩＳＫＥＫＤＶＬＷＦＲＰＴＬＬＮＤＴＧＮＹＴＣＭＬＲＮＴＴＹＣＳＫＶＡＦＰＬＥＶＶＱＫＤＳＣＦＮＳＰＭＫＬＰＶＨＫＬＹＩＥＹＧＩＱＲＩＴＣＰＮＶＤＧＹＦＰＳＳＶＫＰＴＩＴＷＹＭＧＣＹＫＩＱＮＦＮＮＶＩＰＥＧＭＮＬＳＦＬＩＡＬＩＳＮＮＧＮＹＴＣＶＶＴＹＰＥＮＧＲＴＦＨＬＴＲＴＬＴＶＫＶＶＧＳＰＫＮＡＶＰＰＶＩＨＳＰＮＤＨＶＶＹＥＫＥＰＧＥＥＬＬＩＰＣＴＶＹＦＳＦＬＭＤＳＲＮＥＶＷＷＴＩＤＧＫＫＰＤＤＩＴＩＤＶＴＩＮＥＳＩＳＨＳＲＴＥＤＥＴＲＴＱＩＬＳＩＫＫＶＴＳＥＤＬＫＲＳＹＶＣＨＡＲＳＡＫＧＥＶＡＫＡＡＫＶＫＱＫＧＮＲＣＧＱ
配列番号：３８
ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２
ＫＤＳＣＦＮＳＰＭＫＬＰＶＨＫＬＹＩＥＹＧＩＱＲＩＴＣＰＮＶＤＧＹＦＰＳＳＶＫＰＴＩＴＷＹＭＧＣＹＫＩＱＮＦＮＮＶＩＰＥＧＭＮＬＳＦＬＩＡＬＩＳＮＮＧＮＹＴＣＶＶＴＹＰＥＮＧＲＴＦＨＬＴＲＴＬＴＶＫＶＶ
配列番号：３９
ヒトＩＬ１ＲＡＰのドメイン２のＨ２領域
ＴＩＴＷＹＭＧＣＹＫＩＱＮＦＮＮＶＩ

Claims (126)

  1. インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ１ＲＡＰ）に対する結合特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体又は抗原結合フラグメントは、
    軽鎖可変領域であって、
    ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ１と、
    ｂ）ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ２と、及び
    ｃ）ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、前記軽鎖可変領域、
    及び／又は
    重鎖可変領域であって、
    ｄ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ１と、
    ｅ）ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ２と、及び
    ｆ）ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるＣＤＲ－Ｈ３と、を含む前記重鎖可変領域、を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
    軽鎖可変領域であって、
    ａ）ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ１と、
    ｂ）ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ２と、及び
    ｃ）ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｌ３と、を含む、前記軽鎖可変領域、
    及び／又は
    重鎖可変領域であって、
    ｄ）ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ１と、
    ｅ）ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ２と、及び
    ｆ）ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ－Ｈ３と、を含む前記重鎖可変領域、を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 前記ＩＬ１ＲＡＰが、ヒトＩＬ１ＲＡＰである、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 前記ＩＬ１ＲＡＰが、細胞表面に発現する、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に結合する、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、前記ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み、
    ＥＳＩＳＴＡ（配列番号：１）、ＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：７）、及びＱＡＳＥＳＩＳＴＡＬＡ（配列番号：１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
    ＫＡＳ、ＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：８）及びＫＡＳＴＬＰＳ（配列番号：１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり；及び／又は
    ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：３）、ＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：９）、及びＱＱＧＦＳＳＧＮＶＨＮＡ（配列番号：１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それらからなる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  7. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域を含む、
    もしくは、配列番号：１９に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、及び配列番号：２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域を含む、
    又は、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、又は配列番号：２５に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる軽鎖可変領域を含む、
    又は、配列番号：３１に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. 前記軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つのアミノ酸は、そのように変更されていない、請求項７～９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  11. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含み、ＧＰＳＬＳＨＦＤ（配列番号：４）、ＨＦＤＩＴ（配列番号：１０）、及びＧＰＳＬＳＨＦＤＩＴ（配列番号：１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
    ＩＳＰＧＶＳＴ（配列番号：５）、ＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１１）、及びＴＩＳＰＧＶＳＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、及び
    ＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：６）、ＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１２）、及びＡＲＧＧＶＧＳＳＷＫＡＦＤＬ（配列番号：１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる、ＣＤＲを含む重鎖可変領域を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域を含む、
    又は、配列番号：２０に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、及び配列番号：３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる重鎖可変領域を含む、
    又は、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、又は配列番号：３０に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  14. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：３２、配列番号：３３、及び配列番号：３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む、
    又は、配列番号：３２、配列番号：３３、又は配列番号：３４に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  15. 前記重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つのアミノ酸は、そのように変更されていない、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  16. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
    配列番号：１９のアミノ酸配列を含むか、又はからなる軽鎖可変領域及び配列番号：２０のアミノ酸配列を含む、又はからなる重鎖可変領域を含む、又は配列番号：１９又は配列番号：２０に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  17. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
    ａ）配列番号：２１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２６を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｂ）配列番号：２１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２７を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｃ）配列番号：２１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２８を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｄ）配列番号：２１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２９を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｅ）配列番号：２１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｆ）配列番号：２２を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２６を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｇ）配列番号：２２を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２７を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｈ）配列番号：２２を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２８を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｉ）配列番号：２２を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２９を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｊ）配列番号：２２を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｋ）配列番号：２３を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２６を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｌ）配列番号：２３を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２７を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｍ）配列番号：２３を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２８を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｎ）配列番号：２３を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２９を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｏ）配列番号：２３を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｐ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２６を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｑ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２７を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｒ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２８を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｓ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２９を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｔ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｕ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２６を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｖ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２７を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｗ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２８を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｘ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：２９を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｙ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    又は配列番号：２１から配列番号：３０のいずれか１つに対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  18. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
    ａ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｂ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３２を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｃ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３３を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｄ）配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｅ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｆ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３２を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｇ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３３を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｈ）配列番号：２５を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｉ）配列番号：３１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３０を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｊ）配列番号：３１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３２を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｋ）配列番号：３１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３３を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    ｌ）配列番号：３１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域と、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域とを含み；
    又は配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：３１、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３３、又は配列番号：３４に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  19. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：２４を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  20. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：３１を含むか、又はそれからなる軽鎖可変領域、及び配列番号：３４を含むか、又はそれからなる重鎖可変領域を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  21. 前記軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つ以下のアミノ酸、又は１つのアミノ酸は、そのように変更されていない、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  22. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、軽鎖定常領域又はその一部を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  23. 前記軽鎖定常領域が、κ又はλ軽鎖のものである、請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  24. 前記軽鎖定常領域が、κ軽鎖のものである、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  25. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる軽鎖定常領域を含む、又は、配列番号：３５に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  26. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、重鎖定常領域又はその一部を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  27. 前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４からなる群から選択される免疫グロブリンサブクラスのものである、請求項２６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  28. 前記重鎖定常領域が、免疫グロブリンサブクラスＩｇＧ１である、請求項２６～２７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  29. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号：３６又は配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含むか、又はそれらからなる、
    又は配列番号：３６又は配列番号：２に対して少なくとも７０％の配列同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  30. 軽鎖定常領域及び／又は重鎖定常領域のアミノ酸のいずれか１つが別のアミノ酸に変更されており、但し、例えば、４つのアミノ酸のような、５つ以下のアミノ酸、例えば、２つのアミノ酸のような、３つの以下アミノ酸、又は１つ以下のアミノ酸は、そのように変更されていない、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  31. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、
    －請求項６～１０のいずれか１項に記載の軽鎖可変領域；及び／又は
    －請求項１１～１５のいずれか１項に記載の重鎖可変領域；及び／又は
    －請求項２２～２５のいずれか１項に記載の軽鎖定常領域；及び／又は
    －請求項２６～３０のいずれか１項に記載の重鎖定常領域を含むか、又はそれらからなる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  32. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、Ｆｃ領域を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  33. 前記Ｆｃ領域は、非天然起源である、請求項３２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  34. 前記抗体は、ＩｇＧ定常領域が変異したＦｃ領域を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  35. 前記Ｆｃ領域が、前記抗体又はその抗原結合フラグメントのエフェクター機能に影響を及ぼす変異の１つ以上を含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  36. 前記Ｆｃ領域が、ＥＵ Ｉｎｄｅｘによって定義されるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６９Ａ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓからなる群から選択される１つ以上の変異を含む、請求項３２～３５いずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  37. 前記Ｆｃ領域に結合した糖鎖がフコースを欠いている、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  38. 前記Ｆｃ領域に結合した糖鎖が低フコースである、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  39. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、ＦＵＴ８陰性細胞株で産生される、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  40. インタクトな抗体を含むか、又はそれからなる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  41. Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ及びジスルフィド結合Ｆｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦ（ａｂ）２フラグメント）、及びドメイン抗体（例えば、単一のＶＨ可変ドメイン又はＶＬ可変ドメイン）からなる群から選択される抗原結合フラグメントを含むか、又はそれからなる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  42. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、インターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーサイトカインリガンド及び／又は受容体のシグナル伝達を阻害することができる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  43. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインのシグナル伝達を阻害することができる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  44. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１αのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  45. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－１βのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  46. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３３のシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  47. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３６αのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  48. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３６βのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  49. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害することが可能である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  50. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及びＩＬ－３６γのシグナル伝達を阻害することができる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  51. 前記シグナル伝達を阻害する工程が、シグナル伝達を本質的に完全に阻害することである、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  52. 前記シグナル伝達を阻害する工程が、シグナル伝達の部分的な阻害である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  53. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下：
    ａ）ＫＤ－値が３ｎＭ以下であることを特徴とするＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）；
    ｂ）前記ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に対する結合であって、好ましくはドメイン２のＨ２領域に対する結合であり、ここで、前記Ｈ２領域は、配列番号：３９のアミノ酸を含むか、それからなる、前記結合；
    ｃ）カニクイザル又はブタ由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性；
    ｄ）ＩＬ－１αのシグナル伝達の阻害作用；
    ｅ）ＩＬ－１βシグナル伝達の阻害作用；
    ｆ）ＩＬ－３３のシグナル伝達の阻害作用；
    ｇ）ＩＬ－３６αのシグナル伝達の阻害作用；
    ｈ）ＩＬ－３６βのシグナル伝達の阻害作用；
    ｉ）ＩＬ－３６γのシグナル伝達の阻害作用；
    ｊ）ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞による内在化、の一つ以上の特性を示す、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  54. 前記抗体又は抗原結合フラグメントは、以下：
    ａ）ＫＤ－値が３ｎＭ以下であることを特徴とするＩＬ１ＲＡＰに対する結合親和性（ＫＤ）；
    ｂ）前記ＩＬ１ＲＡＰのドメイン２に対する結合であって、好ましくはドメイン２のＨ２領域に対する結合であり、ここで、前記Ｈ２領域は、配列番号：３９のアミノ酸を含むか、それからなる、前記結合；
    ｃ）カニクイザル又はブタ由来のＩＬ１ＲＡＰとの交差反応性；
    ｄ）ＩＬ－１αのシグナル伝達の阻害作用；
    ｅ）ＩＬ－１βシグナル伝達の阻害作用；
    ｆ）ＩＬ－３３のシグナル伝達の阻害作用；
    ｇ）ＩＬ－３６αのシグナル伝達の阻害作用；
    ｈ）ＩＬ－３６βのシグナル伝達の阻害作用；
    ｉ）ＩＬ－３６γのシグナル伝達の阻害作用；
    ｊ）ＩＬ１ＲＡＰ発現細胞による内在化、の一つ以上の特性を示す、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  55. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣを誘導することができる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  56. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞のＡＤＣＣを誘導する能力を有しない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  57. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、前記薬剤のインビボ半減期を増加させるための部位をさらに含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  58. 前記インビボインビボ半減期を増加させるための部位が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン、グリコシル化基、脂肪酸、及びデキストランからなる群から選択される、請求項５７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  59. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがＰＥＧ化されている、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  60. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、直接又は間接的に、細胞傷害性又は検出可能な部位などの機能性部位に共有結合している、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  61. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、細胞傷害性部位を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  62. 前記細胞傷害性部位が放射性同位元素を含むか、又はそれからなる、請求項６０～６１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  63. 前記放射性同位元素が、β－エミッター、オージェエミッター、変換電子－エミッター、α－エミッター、及び低光子エネルギー－エミッターからなる群から選択される、請求項６２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  64. 前記放射性同位元素が、前記薬剤の近傍で高線量吸光度を作成する局所吸収エネルギーの放出パターンを有する、請求項６２～６３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  65. 前記放射性同位元素が、９０Ｙ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ／１８６Ｒｅ；１６６Ｈｏ、７６Ａｓ／７７Ａｓ、１５３Ｓｍなどの長距離βエミッター；１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１６１Ｔｂなどの中距離ベータエミッター；４５Ｃａ、３５Ｓまたは１４Ｃなどの低エネルギーβエミッター；５１Ｃｒ、６７Ｇａ、９９Ｔｃｍ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、２０１Ｔｌなどの転換又はオージェエミッター；及び２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２３Ａｃ、及び２２１Ａｔなどのα－エミッターからなる群から選択される、請求項６２～６４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  66. 前記放射性同位元素が、１７７Ｌｕである、請求項６２～６５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  67. 前記細胞傷害性部位が、細胞傷害性薬剤を含むか、又はそれからなる、請求項６０～６６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  68. 前記細胞傷害性薬剤が、細胞賦活剤；抗アンドロゲン剤；コルチゾン及びその誘導体；ホスホネート；テストステロン－５－α－レダクターゼ阻害剤；ホウ素添加剤；サイトカイン；タプシガルギン及びその代謝物；毒素（サポリン又はカリケアミシンなど）；化学療法剤（代謝拮抗剤など）；又は腫瘍性の障害の治療に有用な他の細胞障害性薬物からなる群から選択される、請求項６７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  69. 前記細胞傷害性薬剤が、光子活性化療法、中性子活性化療法、中性子誘導オージェ電子療法、シンクロトロン照射療法、又は低エネルギーＸ線光子活性化療法などの活性化療法における使用に適している、請求項６７又は６８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  70. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、検出可能な部位を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  71. 前記検出可能な部位が、放射性同位元素を含むか、又は放射性同位元素からなる、請求項７０に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  72. 前記放射性同位元素が、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、１２３Ｉ、及び２０１Ｔｌからなる群から選択される、請求項７１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  73. 前記放射性同位元素が、８９Ｚｒである、請求項７１～７２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  74. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、８６Ｙ／９０Ｙ又は１２４Ｉ／２１１Ａｔなどの検出可能で細胞障害性を有する放射性同位元素の対を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  75. 前記放射性同位元素が、検出可能な部位として、及び細胞障害性部位として同時にマルチモーダルな作用をすることができる、請求項６０～７４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  76. 前記検出可能な部位が、常磁性同位体からなる、又はそれからなる、請求項６０～７５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  77. 前記常磁性同位体が、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅからなる群から選択される、請求項７６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  78. 前記検出可能な部位が、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩ、光学、又は超音波イメージングなどのイメージング技術によって検出可能である、請求項６０～７７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  79. 前記細胞障害性部位及び／又は検出可能な部位が、連結部位を介して、前記抗体又はその抗原結合フラグメントに間接的に接合される、請求項６０～７８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  80. 前記連結部位が、キレート剤である、請求項７９に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  81. 前記キレート剤が、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０，テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、デフェロキサミン（ＤＦＯ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ－２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－トリ酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１－テトラザシクロドセダン－１，４，８，１１－トリ酢酸の（ＴＥＴＡ）誘導体からなる群から選択される、請求項８０に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  82. 前記抗体又は抗原結合フラグメントが、細胞傷害性部位を含まない、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  83. 前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメント又はその構成成分ポリペプチド鎖を符号化するポリヌクレオチド。
  84. 前記ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡ分子である、請求項８３に記載のポリヌクレオチド。
  85. 前記抗体軽鎖又はその可変領域を符号化する、請求項８３～８４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  86. 前記抗体重鎖又はその可変領域を符号化する、請求項８３～８４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  87. 請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  88. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項８７に記載のベクター。
  89. 請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
  90. 前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項８９に記載の宿主細胞。
  91. 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項８９に記載の宿主細胞。
  92. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項８９に記載の宿主細胞。
  93. 前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項８９に記載の宿主細胞。
  94. 請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントを製造する方法であって、前記方法は、請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクターを含む請求項８９～９３のいずれかに記載の宿主細胞を、前記符号化された抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件で培養する工程を含む、方法。
  95. 医薬組成物であって、
    請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、及び／又は
    請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、
    を医薬組成物中に含み、ここで、前記組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤をさらに含む、医薬組成物。
  96. 請求項９５に記載の組成物であって、前記組成物が、有効量の抗体又はその抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／又は組換え宿主細胞を含む、組成物。
  97. 非経口送達のために適合された、請求項９５～９６のいずれか１項に記載の組成物。
  98. 前記非経口送達が、静脈内送達、局所送達、皮下送達、及び／又は筋肉内送達である、請求項９７に記載の組成物。
  99. 医薬に使用するための、請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物。
  100. ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に対して感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断に使用するための、及び／又は、ここで、前記疾患又は障害は、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、医薬に使用するための、請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物。
  101. 前記疾患又は障害が、炎症性及び／又は線維性の疾患又は障害である、請求項１００に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物。
  102. 前記炎症性及び／又は線維性の疾患又は障害が、心筋炎、全身性硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、すべての種類の関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎（ＳＯＪＩＡ）を含むすべての種類の若年性関節炎、変形性関節症、家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）、マックル－ウェルズ疾患、新生児発症多臓器炎症性疾患（ＮＯＭＩＤ）、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎壊疽性膿皮症及びアクネ（ＰＡＰＡ）症候群、成人発症スティル病、高ＩｇＤ症候群、２型糖尿病、マクロファージ活性化症候群、ＴＮＦ受容体関連周期症候群、ブラウ病、強直性脊椎炎、スイーツ病、関節ループス、アルツハイマー病、喘息、アレルギー、サルコイドーシス、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、水疱性類天疱瘡、Ｉ型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、ヘリコバクター・ピロリ胃炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病を含む）、肝炎、Ｃ型肝炎、虚血再灌流障害、多発性硬化症、新生児又は肺炎球菌性髄膜炎、結核、ベーチェット症候群、敗血症性ショック、移植片対宿主病、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、歯周炎、肥満及び肥満関連疾患（例えば、メタボリック症候群、心肥大、鬱血性心不全、心筋梗塞、静脈瘤、多嚢胞性卵巣症候群、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、脂肪肝、大腸がん、乳がん、子宮がん、慢性腎不全、脳卒中、及び高尿酸血症）、椎間板疾患、過敏性腸症候群、シュニッツラー症候群、アレルギー／アトピー性皮膚炎、ざ瘡、ベーチェット病、心臓線維症、心血管疾患、クリオピン関連周期性症候群、嚢胞性線維症、グッドパスチャー症候群、ギランバレー症候群、腎臓線維症、肝臓線維症、肺線維症、皮膚線維症、自己免疫性筋心炎、臓器移植に伴う臓器機能障害、膵炎、腹膜炎、ぶどう膜炎、血管炎、肺炎、肺高血圧症、硬化性皮膚慢性移植片対宿主病、敗血症、シェーグレン症候群、高安動脈炎、及び痛風からなる群から選択される、請求項１００～１０１のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又は組成物。
  103. 前記疾患又は障害が、炎症性及び／又は線維性成分を有する、請求項１００～１０２のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
  104. 前記疾患又は障害が、自己免疫疾患又は障害である、請求項１００～１０３のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
  105. 前記疾患又は障害が、腫瘍性の疾患又は障害である、請求項１００に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
  106. 前記腫瘍性の疾患又は障害が、血液疾患又は障害、もしくは固形腫瘍である、請求項１００ないし１０５のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
  107. 前記腫瘍性の性血液疾患又は障害が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖障害（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）からなる群から選択される、請求項１０５～１０６のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
  108. 前記固形腫瘍が、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、メラノーマ、膀胱がん、脳／ＣＮＳがん、泌尿器系のがん、胆道がん、子宮頸がん、食道がん、胃がん、頭／首がん、腎臓がん、肝臓がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、肉腫、皮膚がん、及び子宮がんからなる群から選択される、請求項１０５～１０７のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、又は組成物。
  109. 前記疾患又は障害が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、請求項１００～１０８のいずれか１項に記載の使用のための抗体、その抗原結合フラグメント、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又、は組成物。
  110. 対象の腫瘍性の障害に関連する病的細胞、又はその幹細胞、もしくは前駆細胞の細胞死を誘導及び／又は成長及び／又は増殖を阻害するために使用され、ここで、前記細胞がＩＬ１ＲＡＰを発現する、請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞及び／又は請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物。
  111. ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防、治療、緩和、検出、及び／又は診断のための医薬品の調製において、及び／又は、前記疾患又は障害が、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連する、請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  112. ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の検出及び／又は診断のための医薬品の調製における、請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  113. 対象において、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６α、ＩＬ－３６β、及び／又はＩＬ－３６γシグナル伝達の阻害剤による治療に感受性がある疾患又は障害の予防及び／又は治療及び／又は軽減及び／又は検出及び／又は診断のための方法であって、及び／又は疾患又は障害がＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞と関連し、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  114. 対象においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞を検出するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
    （ａ）生検組織や血液試料など、検査対象から細胞の試料を提供する工程と、
    （ｂ）任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び／又は精製する工程と、
    （ｃ）請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
    （ｄ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
    ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
  115. 請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有する患者を同定するためのインビトロ方法であって、前記方法は、
    （ａ）検査対象の患者から生検組織や血液サンプルなど、細胞サンプルを提供する工程と、
    （ｂ）任意に、前記試料に存在する細胞を抽出及び／又は精製する工程と、
    （ｃ）請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、前記試料中に存在する細胞と接触させる工程と、
    （ｄ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
    ここで、ＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞への抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療から利益を得るであろう患者を示す、方法。
  116. 細胞発現ＩＬ１ＲＡＰに関連する疾患又は障害を有する患者を治療するための方法であって、前記方法は、
    ａ）請求項１１４～１１５のいずれか１項に記載のＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害を有すると同定された患者を選択する工程と、
    ｂ）前記患者に、前記疾患又は障害の治療に有効な治療剤を投与する工程と、を含む、方法。
  117. ＩＬ１ＲＡＰを発現している細胞を検出する方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、ＩＬ１ＲＡＰの発現について分析されるべき細胞と接触させる工程と、
    （ｂ）前記抗体又はその抗原結合フラグメントが前記細胞に結合するかどうかを決定する工程と、を含み、
    ここで、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞への前記結合は、対象の前記組織においてＩＬ１ＲＡＰを発現する細胞に関連する疾患又は障害の存在を示す、方法。
  118. 前記方法がインビボ法、エックスビボ法又はインビトロ法である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 腹膜炎を有する対象における炎症を軽減するための方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  120. 乾癬又は乾癬性関節炎を有する対象における疾患の重症度を低減するための方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  121. アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラークの炎症を低減するための方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  122. アテローム性動脈硬化症を有する対象におけるアテローム性動脈硬化症プラーク体積及び／又はアテローム性動脈硬化症プラークサイズを低減する方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  123. 心筋炎を有する対象における炎症及び／又は線維化を軽減する方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  124. 心筋炎又は自己免疫性心筋炎を有する対象における心機能の悪化を打ち消すための方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  125. 全身性硬化症を有する対象における皮膚線維症を低減するための方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
  126. 全身性硬化症を有する対象における肺線維症を軽減する方法であって、前記方法は、
    －請求項１～８２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、
    －請求項８３～８６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、
    －請求項８７～８８のいずれか１項に記載のベクター、
    －請求項８９～９３のいずれか１項に記載の組換え宿主細胞、及び／又は、
    －請求項９５～９８のいずれか１項に記載の組成物、の有効量を前記対象に投与する工程を含む、方法。
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