CN112638946A - 抗il1rap抗体组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及针对白细胞介素1受体辅助蛋白(IL1RAP)的抗体组合物及其在治疗和诊断IL1RAP相关联疾病(如炎性、自身免疫性、自身炎性和肿瘤性病症)中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及针对白细胞介素1受体辅助蛋白(IL1RAP)的抗体及其在治疗和诊断IL1RAP 相关联疾病(如炎性病症、自身免疫性病症和肿瘤性病症)中的用途。
背景技术
炎性和自身免疫性病症，在一定程度上还有肿瘤性病症，都具有与细胞因子介导的炎性相关的病因。白细胞介素-1细胞因子家族被认为与这些适应症的病因特别相关。
白细胞介素-1家族信号转导中的白细胞介素-1受体相关联蛋白
白细胞介素-1(IL-1)细胞因子家族包含IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ。这些细胞因子具有结构关系并且介导促炎作用。每个细胞因子结合特定受体，后者又与共同受体二聚化，从而导致信号转导。通过这些受体复合物进行的信号传导涉及 MyD88衔接蛋白和随后的NFκB激活。除了上述促炎细胞因子之外，IL-1家族还包含两种受体拮抗剂IL-1Ra和IL-36Ra，它们分别与IL-1和IL-36竞争与其受体的结合。受体拮抗剂的结合是非生产性的，并且不诱导信号。
IL1RAP是白细胞介素-1受体(IL1R1)、IL-33受体(ST2)和IL-36受体(IL1Rrp2)的共同受体，并且对介导这些细胞因子的作用至关重要(Garlanda等人,《免疫(Immunity.)》2013 年12月12日；39(6):1003-18)。IL-1受体与IL1RAP的结构已得到解析(Wang,D.等人,《自然·免疫学(Nat Immunol.)》2010 11(10):905-11，Thomas,C.等人,《自然结构与分子生物学(Nat Struct Mol Biol)》2012 19(4):455-7)，并且IL1RAP与ST2或IL1Rrp2之间的相互作用最可能与IL1R1-IL1RAP相互作用非常类似(Liu,X.等人,《PNAS》2013 110(37):14918-23，Gunther, S.等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》2014 193:921-30)。
针对IL1RAP产生的抗体具有阻断IL1RAP介导的信号传导的能力(
M.等人,《PNAS》2010 107(37):16280-5，图3)。结合表位对效果至关重要，因为并非所有抗体都具有阻断信号传导的能力，即使它们具有结合IL1RAP和介导高效ADCC的能力(
H. 等人,《PNAS》2015 112(34):10786-91)。
从WO 2015/132602和WO 2016/020502已知结合IL1RAP的不同结构域的抗IL1RAP抗体。其中CAN03和CAN04分别结合结构域3和结构域2，并且两者都显示出对IL-1信号传导的完全抑制和对IL-33信号传导的部分抑制。
白细胞介素-1生物学
白细胞介素-1(IL-1)是一种强有效的促炎性细胞因子，可由多种细胞类型(包含单核吞噬细胞)生产，以应对感染和炎性。IL-1家族由包含IL-1α和IL-1β的七种激动剂和包含IL-1 受体拮抗剂(IL-1Ra)的三种天然受体拮抗剂组成(Dinarello,CA,《血液(Blood)》1996, 87(6):2095-147)。已经鉴定出两种IL-1受体，IL-1R I型和IL-1R II型。两种受体都可以与IL-1 家族分子的所有三种形式相互作用。IL-1RI负责介导IL-1诱导的细胞活化。然而，IL-1/IL-1RI 复合物自身不能发出信号，而是依赖于与第二个受体链，IL-1R辅助蛋白(IL1RAP)的关联 (Dinarello,CA,《血液》1996,87(6):2095-147)。与IL-1RI相比，IL-1RII在结合IL-1时不诱导细胞活化，并且因此IL-1RII起调节性诱饵受体的作用，导致可用于结合IL-1RI的IL-1净减少。
IL-1是一种有效的促炎性细胞因子，在局部感染或炎性部位被诱导，并且参与多种生理和细胞事件的调节(总结于Dinarello CA,《胸部(CHEST)》,2000,118:503-508和Dinarello,CA, 《临床与实验风湿病学(Clin Exp Rheumatol)》,2002,20(5增刊27):S1-13)。它能够激活几种细胞类型，包含白细胞和内皮细胞。IL-1通过促进粘附分子、细胞因子、趋化因子和其它炎性介质(如前列腺素E2和一氧化氮(NO))的生产和表达来诱导和放大免疫反应。结果，局部炎症被放大并且持续。另外，IL-1诱导的炎性介质的生产导致发烧、头痛、低血压和体重减轻。此外，IL-1是造血生长因子，并且已显示出可减少骨髓移植患者白细胞和血小平板的最低谷。IL-1还被显示出通过诱导血管内皮生长因子的生产来促进血管生成，从而促进风湿性关节中血管翳的形成和血液供应。最后，IL-1已显示出在风湿性疾病中促进骨骼和软骨降解。
IL-1与从痛风到癌症的多种疾病和病症相关(综述参见Dinarello等人,2012,《自然综述 (Nature Reviews)》11:633-652和Dinarello,2014,《分子医学(Mol.Med.)》20(增刊1):S43-S58；其公开内容通过引用并入本文)，包含：
●关节、骨骼和肌肉疾病，如类风湿性关节炎和骨关节炎；
●遗传性全身性自身炎性疾病，如家族性地中海热；
●全身性自身炎性疾病，如全身性幼年特发性关节炎和成人发病的斯蒂尔病；
●常见的炎性疾病，如痛风和2型糖尿病；
●急性发作性缺血性疾病，如心肌梗塞；以及
●癌症。
多种阻断IL-1活性的疗法已获批准并且正在开发中。针对IL-1的研究始于1993年，引入了阿那白滞素(anakinra)(Kineret；安进(Amgen))，这是天然存在的IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)的重组形式，其阻断IL-1α和IL-1β两者的活性，此后，这种疗法已经被用于证明IL-1在许多疾病中的作用(见上文)。Anakinra目前在IL-1治疗领域占据主导地位，因为它具有良好的安全记录、短半-衰期和多种给药途径。用抗体或可溶性受体中和IL-1也被证明是有效的，并且可溶性诱饵受体利纳西普(rilonacept)(Arcalyst；再生元(Regeneron))和抗-IL-1β中和性单克隆抗体康纳单抗(canakinumab)(Ilaris；诺华(Novartis))已获批准。包含IL-1α中和，靶向IL-1β的治疗性疫苗和嵌合IL-1Ra在内的其它治疗方法正在早期临床试验中。另外，口服活性小-分子IL-1生产抑制剂，如半胱天冬酶1抑制剂，已经开发出来，并且正在测试中
白细胞介素-33生物学
白细胞介素-33(IL-33)被鉴定为通过激活如T辅助细胞2(TH2)细胞和肥大细胞等细胞诱导2型免疫反应的IL-1家族成员(Schmitz,J.等人,《免疫》2005 23:479-90)。然而，随后的研究扩大了IL-33的作用，现在也认为它具有其它促炎作用(Yew Liew,F.等人,《自然综述·免疫学(Nat Rev Immunol.)》2016 16:676-89)。IL-33由受损或坏死细胞释放作为应激信号，即所谓的警报蛋白，并且通过与其受体ST2结合来发挥作用。IL-33与ST2的结合募集IL1RAP，并且诱导通过MYD88的信号传导。存在可溶形式的ST2，已经提出其充当诱饵受体。有趣的是，IL-33在诱导限制免疫反应并且诱导组织修复的细胞(如Treg和M2巨噬细胞)的同时还具有强大的促炎作用。
IL-33参与炎性疾病，既作为炎性介质通过应激或细胞死亡释放，也作为未能诱导调节反应(如诱导Treg和M2巨噬细胞)释放。IL-33已与多种疾病偶联(综述参见Yew Liew,F.等人,《自然综述·免疫学》2016 16:676-89)，如：
●哮喘
●过敏性疾病，如过敏性鼻炎和特应性皮炎
●心血管疾病
●类风湿关节炎
●IBD
●糖尿病和肥胖
●COPD
●癌症
IL-33抑制性抗体的开发正在进行中(Pfizer，Johnson&Johnson)，并且针对哮喘和特应性皮炎的针对IL-33功能的临床试验已经启动。
白细胞介素-36生物学
IL1Rrp2在人的单核细胞和树突细胞上表达，所述细胞被IL-36细胞因子诱导生产多种炎性细胞因子(Foster,A.M.等人,《免疫学杂志(J Immunol)》2014 192:6053-61，Mutamba,S. 等人,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》2012 42:607-17)。IL-36在如银屑病等皮肤疾病方面受到了特别关注，其中有证据表明IL-36在上游起作用以诱导许多其它病理细胞因子(综述参见Gabay C.和Owne,E.,《白细胞生物学杂志(J Leukocyte Biol)》2015 97:645-52)。用阻断IL1Rrp2功能的抗体处理小鼠导致移植有人银屑病皮肤的免疫缺陷小鼠中的皮肤病理学减少(Blumberg.H.等人,《免疫学杂志》2010 185:4354-62)并且一种严重的威胁生命的银屑病(GPP)是由天然IL-36受体拮抗剂(IL-36Ra)的突变引起的。报告还支持IL-36细胞因子在包含COPD和哮喘在内的肺部病理学中的功能，但是这些细胞因子在这些疾病中的作用尚不清楚。
目前对炎性和自身免疫性疾病的治疗不能以协调方式抑制上述关键细胞因子。
发明内容
本发明人已经开发了新的抗体和抗体组合物，发现它们以协调和协同的方式经由关键的炎性细胞因子阻断IL1RAP介导的信号传导。这种出乎意料的特性使得本发明的试剂特别适合于治疗炎性和自身免疫性疾病以及与IL1RAP相关和/或对IL-1信号传导、IL-33信号传导和/或IL-36信号传导的抑制有反应的其它病症。
在一个方面，本发明涉及一种组合物，其至少包括对抗白细胞介素-1受体辅助蛋白 (IL1RAP)具有特异性的第一结合剂和对IL1RAP具有特异性的第二结合剂，其中第一结合剂和第二结合剂结合IL1RAP的至少两个不同胞外结构域。
在另一个方面，本发明涉及双表位结合剂，其包括：
第一抗原结合区；以及
第二抗原结合区，
其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区结合人白细胞介素受体辅助蛋白 (IL1RAP)的不同胞外结构域。
一个方面，本发明涉及包括一种或多种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸共同或单独地编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii)双表位结合剂。在另一个方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii) 双表位结合剂。在另一个方面，本发明涉及包括一种或多种多核苷酸的表达载体，所述一种或多种多核苷酸共同或单独地编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii)双表位结合剂。在另一个方面，本发明涉及包括一种或多种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸共同或单独地编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii)双表位抗体。在又一个方面，本发明涉及包括一种或多种如本文所描述的表达载体的宿主细胞。
一个方面，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用作药剂。
一个方面，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用作诊断和/或预后剂。
一个方面，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估IL1RAP相关联疾病或病症。
附图说明
图1.在间接ELISA中示范性抗体与人IL-1RAP的结合。发现本发明的示范性抗体CAN03和CAN04对人IL-1RAP具有最高亲和力。
图2.示范性抗体与表达人IL1RAP的KU812 CML细胞的结合。所述图显示了平均荧光强度(MFI)值，所述值是通过对以0.1μg/mL的IL1RAP靶向单克隆抗体染色的KU812细胞进行流式细胞术来测量的。本发明的示范性抗体CAN03和CAN04在所比较的抗体中具有最高的MFI。
图3.示范性抗体CAN03和CAN04及其组合阻断在IL-1/IL-33反应性HEK报告系统中IL-1β或IL-33信号传导的能力。(A)CAN03和CAN04两者都完全阻断了IL-1β信号传导，但CAN04具有更出色的效能。CAN03和CAN04(1:1)的组合具有与CAN04自身相同的效能和效力。(B)CAN03和CAN04以70％(CAN03)或50％(CAN04)的效力抑制IL-33信号传导。与单独的抗体相比，CAN03和CAN04(1:1)的组合显示出效能和效力的协同增加。
图4.示范性抗体CAN03和CAN04及其组合阻断在IL-36反应性经过修饰的HEK报告系统中IL-36α信号传导的能力。在最大测试浓度下，CAN04阻断IL-36α信号传导，在1ng/ml的IL-36α时阻断信号传导达到信号的45％(A)，并且在10ng/ml时达到信号的75％(B)，CAN03在两种IL-36α浓度下的作用都很小。但是，与单独的抗体相比，CAN03和CAN04(1:1)的组合显示出效能和效力的协同增加。
图5.示范性抗体CAN03和CAN04及其组合阻断在Hs578T(HTB-126)乳腺癌细胞系中IL-1β诱导的IL-6产生的能力。在存在或不存在所示抗体的情况下，用IL1β刺激细胞。10 μg/mL的CAN03和CAN04将IL-6产生抑制至对照的70％(CAN03)或50％(CAN04)，而 CAN03和CAN04的组合(5+5μg/ml)显示出抑制协同增加，达到对照的10％。
图6.示范性双表位抗体bsACAN03xCAN04(包括一个CAN04 VH/VL结构域和一个CAN03 VH/VL结构域)和CAN04阻断IL-1β或IL-33在IL-1/IL-33反应的HEK报告系统中的信号传导的能力。(A)CAN04和bsACAN03xCAN04完全阻断IL-1β信号传导。(B)CAN04 抑制IL-33信号传导，但仅具有部分效力。然而，双表位bsACAN03xCAN04抗体中包含CAN03 结构域可以完全抑制IL-33信号传导。
具体实施方式
本发明如权利要求书中所限定。
限定
本文所用术语“试剂”是指能够与白细胞介素-1辅助蛋白(IL1RAP)相互作用的化合物或物质。试剂如权利要求中所限定，优选抗体、抗体模拟物或抗体组合物。
术语“亲和力成熟抗体”是指一种抗体，与其不具有这些改变的亲本抗体相比，其一个或多个hvr具有一种或多种改变，导致所述抗体对抗原的亲和力提高。优选的亲和力成熟抗体将对靶抗原具有纳摩尔或什至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的技术提供一种增强抗体的抗原中和能力的方法，并且可以通过在抗体可变结构域的CDR和/或框架区的氨基酸残基中引入突变来提高抗原结合活性。改善抗体的抗原结合特性可以改善抗体的体外生物活性或减少剂量，并且还可以改善体内(体内)效力。
本文使用的术语“氨基酸”包含标准的20种遗传编码的氨基酸及其“D”形式(与天然的“L”形式相比)的对应的立体异构体、ω-氨基酸和其它天然存在的氨基酸、非常规氨基酸 (例如，α，α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸等)和化学衍生氨基酸(见下文)。
当具体列举氨基酸时，如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，除非另有明确说明，否则所述术语是指L-丙氨酸和D-丙氨酸两者。其它非常规氨基酸还可以是本发明多肽的合适组分，只要所述多肽保留了期望的功能特性即可。对于示出的肽，在适当的情况下，每个编码的氨基酸残基均由单个字母表示，对应于常规氨基酸的简称。
在一个实施例中，如本文所限定的抗体多肽包括L-氨基酸或由L-氨基酸组成。
术语“双表位抗体”是对同一抗原的两个不同表位具有特异性的抗体，如其中两个表位是IL1RAP的不同结构域。
双表位抗体可以制备成全长抗体或其低分子量形式(例如，F(ab')2双表位抗体，sc(Fv)2 双表位抗体，双抗体双表位抗体，三体和小抗体)。
制备双表位抗体的方法是本领域已知的。传统上，双表位抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性[Milstein和Cuello,《自然 (Nature)》,305:537-539(1983)]。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分类，这些杂交瘤(四源杂交瘤)生产了十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通过创造嵌合四元体，进一步改善了四元体技术，这便于富集具有正确双表位结构的抗体 (Lindhofer等人,《免疫学》,155:219-225(1995)。正确分子的纯化通常通过亲和色谱步骤完成。在1993年5月13日公开的WO 93/08829和在Traunecker等人,《EMBOJ.》,10:3655-3659 (1991)中公开了类似的程序。
具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)可以与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合体优选地具有免疫球蛋白重链恒定结构域，所述免疫球蛋白重链恒定结构域包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分。优选第一重链恒定区(CHI)包括融合体中的至少一个中存在的轻链结合所需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入到单独的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物中。对于产生双特异性抗体的其它细节，参见例如Suresh等人,《酶学方法(Methods inEnzymology)》, 121:210(1986)。
根据WO 96/27011中描述的另一种方法，可以改造一对抗体分子之间的界面，以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。优选的界面包括抗体恒定结构域的CH3区的至少一部分。在所述方法中，将来自第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生与(一个或多个)较大侧链大小相同或类似的补偿性“空腔”。这提供一种机制，可以提高异二聚体的产量，而不是其它不需要的最终产物，如同二聚体。
可以将双表位抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双表位抗体)。
文献中已经描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以使用化学连接来制备双表位抗体。Brennan等人,《科学》229:81(1985)描述了一种程序，其中完整的抗体被蛋白水解切割以产生F(ab')2片段。在一个实施例中，双表位抗体可以被认为是一种双特异性抗体，因此可以以与双特异性抗体相同的方式制备。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原本文上面提及的片段，以稳定邻位二硫醇并且防止分子间二硫化物的形成。产生的Fab'片段然后被转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，通过用巯基乙胺还原将Fab'-TNB衍生物中的一个转化为Fab'-硫醇，并且与等摩尔量的另一个Fab'-TNB衍生物混合以形成双表位抗体。生产的双表位抗体可以用作选择性固定酶的试剂。
Fab'片段可直接从大肠杆菌中回收并且化学偶联以形成双表位抗体。Shalaby等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med)》175:217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生产。每个Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来，并且在体外进行定向化学偶联以形成双表位抗体。如此形成的双表位抗体能够结合过度表达ErbB2受体的细胞和正常人的T细胞，并且触发人的细胞毒性淋巴细胞对人的乳腺肿瘤靶标的溶解活性。
还描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链生产双表位抗体。Kostelny等人,《免疫学杂志》.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接到两种不同抗体的Fab'部分。抗体同二聚体在铰链区还原形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。所述方法还可以用于抗体同二聚体的生产。Hollinger等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》 90:6444-6448(1993)所描述的“双抗体”技术提供制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包括通过接头连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，所述接头太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一个片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。还报告了通过使用单链Fv (sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一个策略。参见，Gruber等人,《免疫学杂志》 152:5368(1994)。设想了具有两个以上效价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人, 《免疫学杂志》147:60(1991)。Kontermann&Brinkmann,(2015)《今日药物发现(Drug Discovery Today)》20(7)中描述了制造双特异性抗体的最新方法。本领域技术人员可以直接应用其中描述的方法来生产双表位抗体。
制造和使用双特异性或多特异性构建体的另一种方法是众所周知的对接锁技术(2006年 3月24日提交的美国专利申请序列号11/389,358；2006年3月28日提交的11/391,584；2006 年6月29日提交的11/478,021；2006年12月5日提交的11/633,729)。DNL双特异性抗体是通过利用环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚单位和激酶锚定蛋白(AKAPs) 的锚定结构域之间的特异性相互作用设计的，其机制已应用于产生不同蛋白质和非蛋白质分子的生物活性缀合物。产生的双特异性抗体没有Fc区，并且具有相当短的半衰期，适合于预靶向方法。
另一种方法是产生双可变区免疫球蛋白(DVD-Ig)抗体，所述双可变区免疫球蛋白抗体通过天然存在的接头串联结合来自两种不同抗体的可变区。可以保留两个可变区的结合亲和力并且独立地起作用而没有明显的空间位阻(Wu C.等人,《自然·生物技术(Nat，Biotechnol.)》 25；1290:-1297(2007)。所述方法已经用于产生同时结合IL-1α和IL-1β的抗体(Wu C.等人, 《MAbs》1:339-347(2009)。
如本文所用，术语“胞外结构域”是指当IL1RAP与IL1受体形成细胞膜结合复合物(例如IL1R I型或II型)时，全部或部分位于胞外的IL1RAP的结构域。在人IL1RAP中，已知存在三个胞外结构域：
结构域1:氨基酸21至134
结构域2：氨基酸135至234
结构域3：氨基酸235至367
(其中氨基酸编号根据UniProtKB/Swiss-Prot中的登记号Q9NPH3)。
IL1RAP的结构在Wang等人,2010,《自然·免疫学(Nature Immunolgy)》,11:905-912中进一步限定(其公开内容通过引用并入本文；也参见下面的实例C)。
因此，本发明组合物的第一结合剂或第二结合剂，或本发明双表位抗体的第一抗原结合区或第二抗原结合区，可以对IL1RAP的结构域1具有特异性。例如，抗体或抗原结合片段结合的表位可以位于IL1RAP的氨基酸21至39、40至59、60至79、80至99、100至119 内，或者在氨基酸120至134之间。然而，应理解，表位可以是非线性的。
另外或替代地，本发明组合物的第一结合剂或第二结合剂，或者本发明双表位抗体的第一抗原结合区或第二抗原结合区，可以对IL1RAP的结构域2具有特异性。例如，抗体或抗原结合片段结合的表位可以位于IL1RAP的氨基酸135至154、155至174、175至194、195至214内或氨基酸215至234之间。然而，应理解，表位可以是非线性的。
另外或替代地，本发明组合物的第一结合剂或第二结合剂，或者本发明双表位抗体的第一抗原结合区或第二抗原结合区，可以对IL1RAP的结构域3具有特异性。例如，抗体或抗原结合片段结合的表位可以位于IL1RAP的氨基酸235至249、250至269、270至289、290至309、310至329、330至349内或氨基酸350至367之间。然而，应理解，表位可以是非线性的。
本文使用的术语“序列同一性”是指两个氨基酸或多核苷酸序列的比较测量。序列同一性水平指示从第二序列衍生出第一序列的可能性。氨基酸序列同一性要求两个对准的序列之间具有相同的氨基酸序列。因此，候选序列与参考序列具有70％的氨基酸同一性，要求在比对后，候选序列中70％的氨基酸与参考序列中对应的氨基酸相同。身份可以借助于计算机分析来确定，如但不限于ClustalW计算机对准程序(Higgins D.,Thompson J.,Gibson T., Thompson J.D.,Higgins D.G.,Gibson T.J.,1994.CLUSTAL W：通过序列加权、位置特异性缺口惩罚和权重矩阵选择来提高渐进多序列比对的灵敏度。《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》 22:4673-4680)，以及其中建议的默认参数。欧洲生物信息学研究所的Clustal WWWW服务可以从http：//www.ebi.ac.uk/clustalw获得ClustalW软件。使用具有默认设置的所述程序，可以将查询的成熟(生物活性)部分与参考多肽对准。计算完全保守残基的数量并且除以参考多肽的长度。
ClustalW算法可以类似地用于比对核苷酸序列。可以以与氨基酸序列所示类似的方式计算序列同一性。
抗体和抗原结合片段
在一个实施例中，所述结合剂中的一种或两种分别是抗体或抗原结合片段。
通过“抗体或抗原结合片段”，我们包含基本上完整的抗体分子，以及嵌合抗体、人源化抗体、分离的人的抗体、单链抗体、双表位抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体，以及它们的抗原结合片段和衍生物。合适的抗原结合片段和衍生物包含但不限于Fv片段(例如，单链Fv和二硫键Fv)、Fab样片段(例如， Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)、单一可变结构域(例如，VH和VL结构域)和结构域抗体(dAbs，包含单一和双重形式[即dAb-linker-dAb])。使用抗体片段而不是完整抗体的潜在优势是多方面的。片段的较小尺寸可以导致改善的药理特性，如更好地穿透实体组织。而且，抗原结合片段如Fab，Fv，ScFv和dAb抗体片段可在大肠杆菌中表达和从大肠杆菌分泌，因此可以容易地生产大量所述片段。
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一个的衍生物。术语“免疫球蛋白分子”又指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链、一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成，所有四条链都通过二硫键相互连接。每个重链通常由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链通常由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区通常由一个结构域CL组成。 VH和VL区可进一步细分为高变区(或高变区，其序列和/或结构上确定的环的形式可能是高变的)，也称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语“抗原”是指包括至少一个表位的分子。抗原例如可以是多肽、多糖、蛋白质、脂蛋白或糖蛋白。
术语“抗原结合片段”是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的片段。
如本文所用，“双表位抗体”是指能够同时结合两个不同表位的抗体。双表位抗体可以是双特异性抗体。如本文所用，“双特异性抗体”是指能够结合两种不同分子上的两种不同表位的抗体。
术语“嵌合抗体”是指包括源自不同物种的区的抗体。嵌合抗体可以例如包括来自一个动物物种的可变区和来自另一个动物物种的恒定区。例如，嵌合抗体可以是具有源自小鼠单克隆抗体的可变区和人的恒定区的抗体。此类抗体还可以称为人源化抗体。
抗体的抗原结合片段还可以是“双抗体”，其是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。双抗体优选包括重链可变结构域(VH)，所述重链可变结构域连接到同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)。
术语“结构域抗体”(dAbs)是指抗体的抗原结合片段，优选范围从11kDa至15kDa。
术语“双可变结构域抗体”是指具有两种不同结合特异性的抗体分子。每个轻链和重链都包括由短接头序列接合的两个不同可变区。重链和轻链的N末端可变区具有一种结合特异性，而相同重链和轻链的相邻可变区具有不同的特异性。这些延伸的重链和轻链被合成并且组装成含有两个重链和两个轻链的共价分子。
术语“表位”是指能够特异性结合抗体的决定簇。例如，表位可以包括在多肽、多糖、蛋白质、脂蛋白或糖蛋白内。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或糖侧链，通常具有具体的三维结构特征以及具体的电荷特征。表位可以是构象的或非构象的，其中在存在变性溶剂的情况下失去与前者的结合而不失去与后者的结合。表位可以是连续的或不连续的，其中不连续的表位是蛋白质抗原上的构象表位，其由蛋白质一级序列中的至少两个独立区形成。
术语“Fab片段”是指抗体的抗原结合片段，其由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域组成。
术语“人源化抗体”是指来自非人的物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人的天然生产的抗体变体的类似性。
根据本发明的抗体可以是人的抗体或人源化抗体。本文所用的人的抗体是从使用人的免疫球蛋白序列的系统获得的抗体。人的抗体可以例如是从动物(例如，小鼠)分离的抗体，其是人的免疫球蛋白基因的转基因或跨染色体的，或由其制备的杂交瘤。人的抗体还可以从转化成表达抗体的宿主细胞中分离，例如从转染瘤中分离。人的抗体还可以从重组的组合人的抗体文库分离。
人的抗体具有源自人的种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组人的抗体可以进行体外诱变或体内体细胞诱变，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人的种系VH和VL序列并且与之相关但可能不天然存在于体内的人的抗体种系库内的序列。
人的抗体的氨基酸序列优选与野生型人的免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少96％，97％，98％或99％相同。
所述转染色体动物的转基因可以包括编码未重排的人的重链(μ和/或γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人的免疫球蛋白基因微基因座。此外，动物可能含有一个或多个使内源性重链和轻链基因座失活的突变。此类动物的实例在Lonberg,N.等人,(1994)《自然》368(6474):856-859和WO 02/43478中有所描述。
根据本发明的抗体可以是嵌合抗体，即包括源自不同物种的区的抗体。嵌合抗体可以例如包括来自一种动物的可变区和来自另一个动物的恒定区。例如，嵌合抗体可以是具有源自小鼠单克隆抗体的可变区和人的恒定区的抗体。此类抗体还可以称为人源化抗体。
因此，根据本发明的抗体还可以是人源化抗体，其部分地由从人的种系免疫球蛋白序列获得的序列编码，部分地由其它序列编码。所述其它序列优选是来自其它物种，更优选来自其它哺乳动物物种的种系免疫球蛋白。特别地，人源化抗体可以是这种抗体，其中抗原结合位点源自非人的物种的免疫球蛋白，优选源自非人的哺乳动物，源自小鼠或大鼠，而分子中剩余的免疫球蛋白衍生部分的一部分或全部源自人的免疫球蛋白。来自所述非人的物种的抗原结合位点可以例如由完整的VL或VH或两者组成，或一个或多个CDR移植到VL或VH或两者中的适当人的框架区上。因此，在人源化抗体中，CDR可以来自小鼠或大鼠单克隆抗体，并且所述抗体的其它区是人的来源的。
通过“参考抗体‘CAN03’”，我们包含完整的IgG抗体，其包括重链可变区，其具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列；轻链可变区，其具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列；重链恒定区，其具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列；以及轻链恒定区，其具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列。替代地，人源化版本的CAN03可以用作参考抗体。WO 2016/020502中描述了参考抗体CAN03。
通过“参考抗体‘CAN04’”，我们包含完整IgG抗体，所述完整IgG抗体包括：重链可变区，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO： 7；轻链可变区，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；重链恒定区，其具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列；以及轻链恒定区，其具有SEQ ID NO： 32的氨基酸序列。在优选的实施例中，重链可变区是SEQ ID NO：4，并且轻链可变区选自由SEQ ID NO：1组成的组。替代地，人源化版本的CAN04可以用作参考抗体。WO 2015/132602中描述了参考抗体CAN04。
术语“scFv”是指单链Fv。Fv片段是其中重链(VH)和轻链(VL)的可变区结合形成抗体结合位点的片段。柔性接头可以用于共价接合VH和VL链，形成保持原始抗体结合特异性的scFv。
术语“单链抗体”是指包括一个或多个抗原结合位点的单个多肽抗体。单链抗体可能包括Fv片段的两个结构域，VL和VH。
结合IL1RAP的胞外结构域
在一个方面，本发明涉及一种组合物，其至少包括对抗白细胞介素-1受体辅助蛋白 (IL1RAP)具有特异性的第一结合剂和对IL1RAP具有特异性的第二结合剂，其中第一结合剂和第二结合剂结合IL1RAP的至少两个不同胞外结构域。例如，第一结合剂和第二结合剂可以分别结合下列胞外结构域od IL1RAP：
(a)结构域1和结构域2；
(b)结构域1和结构域3；或者
(c)结构域2和结构域3。
在一个实施例中，组合物包括结合剂，所述结合剂共同结合IL1RAP的所有三个胞外结构域，即结构域1、结构2和结构3。
通过“白细胞介素-1受体辅助蛋白”，“IL1RAP”和“IL1-RAP”，我们具体包含人IL1RAP 蛋白，例如，如GenBank登记号：AAB84059，NCBI参考序列：NP_002173.1和UniProtKB/Swiss-Prot登记号：Q9NPH3-1(另见Huang等人,1997,《美国科学院院报》94(24), 12829-12832，其公开内容通过引用并入本文)。IL1RAP在科学文献中也称为IL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1RAcP和EG3556。
因此，本发明的结合剂对IL1RAP具有特异性。“特异性”是指结合剂能够在体内，即在人的体内存在IL1RAP的生理条件下结合IL1RAP。优选地，结合剂在体内不结合任何其它蛋白质。此类结合特异性可以通过本领域公知的方法(如ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀、蛋白质印迹和使用表达IL1RAP的转染细胞的流式细胞术)来确定。有利地，结合剂能够选择性地结合IL1RAP，即，它与IL1RAP结合比与任何其它蛋白质结合强至少10倍。
参考抗体“CAN04”结合IL1RAP的结构域2(参见Wang等人,2010,《自然·免疫学》,11:905-912，其公开内容通过引用并入本文)，即在IL1RAP的氨基酸135至234内(参见UniProtKB/Swiss-Prot内的登记号Q9NPH3)。例如，抗体或抗原结合片段所针对的表位可以位于IL1RAP的氨基酸135至154、155至174、175至194、195至214内或氨基酸215至234 之间。然而，应理解，表位可以是非线性的。
在一个实施例中，本发明组合物中的抗体或抗原结合片段能够结合IL1RAP的胞外结构域上的表位，所述表位至少部分与参考抗体CAN04能够结合的IL1RAP上的表位重叠。因此，抗体或抗原结合片段可能能够结合位于IL1RAP的结构域2处/之内的表位。
参考抗体“CAN03”结合IL1RAP的结构域3。因此，应理解，本发明组合物中的抗体或抗原结合片段也结合IL1RAP的结构域3。
根据UniProtKB/Swiss-Prot的保藏号Q9NPH3中使用的编号，IL1RAP的“结构域3”包含由IL1RAP的氨基酸235至369限定的结构区(另见Wang等人,2010,《自然·免疫学》,11:905-912，其公开内容通过引用并入本文)。例如，抗体或抗原结合片段结合的表位可以位于IL1RAP的氨基酸235至239、240至249、250至259、260至269、270至279、280至289、 290至299、300至309、310至319、320至329、330至229、240至349、350至359或氨基酸360至369之间。
表达“能够抑制参考抗体‘CAN04’(或‘CAN03’)与人IL1RAP的结合”是指存在全部或部分抑制‘CAN04’(或‘CAN03’)与人IL1RAP结合的抗体多肽。能够抑制抗体CAN04 (或CAN03)结合的抗体应理解为与CAN04(或CAN03)竞争结合IL1RAP的抗体。可以使用本领域公知的测定和方法(例如使用表面等离子共振、或流式细胞术、或ELISA)来确定此类竞争性结合抑制。
包括至少两种结合剂的组合物，所述结合剂结合IL1RAP的至少两种不同胞外结构域
在一个实施例中，本发明涉及一种组合物，其中：
a)第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，选自由以下组成的组：
i)参考抗体“CAN04”，
ii)抗体，其包括可变轻链(VL)氨基酸序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)和可变重链(VH)氨基酸序列： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGDGNT HYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：4)，
iii)抗体，其包括以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个：
轻链CDR1：SASQGINNYLN(SEQ ID NO：8)或ASQGINNYLN(SEQ ID NO：29)
轻链CDR2：YTSGLHAGV(SEQ ID NO：9)或YTSGLHA(SEQ ID NO：22)
轻链CDR3：QQYSILPWT(SEQ ID NO：10)或QYSILPWT(SEQ ID NO：23)
重链CDR1：GYAFTSSSWMN(SEQ ID NO：11)或GYAFTSS(SEQ ID NO：24)
重链CDR2：RIYPGDGNTHYAQKFQG(SEQ ID NO：12)或YPGDGN(SEQ ID NO： 25)
重链CDR3：GYLDPMDY(SEQ ID NO：13)；以及
iv)与上述部分(i)的抗体结合相同表位的抗体，
v)能够抑制上述部分(i)的抗体与人IL1RAP结合的抗体；
vi)能够结合IL1RAP的胞外结构域2的抗体；以及
vii)上述(I)至(vi)的抗体的抗原结合片段；
以及
b)其中第二种结合剂是选自由以下组成的组的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段：
i)参考抗体“CAN03”；
ii)包括可变轻链(VL)氨基酸序列的抗体： DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQRRTNGSPRLLIKSASESISGIPSRFSGSG SGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO：14)，
和可变重链(VH)氨基酸序列： DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYINYPD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：15)；
iii)抗体，其包括以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个：
轻链CDR1：RASQSIGTSIH
(SEQ ID NO：16)或ASQSIGTSIH(SEQ ID NO：30)
轻链CDR2：SASESIS(SEQ ID NO：17)
轻链CDR3：QQSNSWPTT(SEQ ID NO：18)或QSNSWPTT(SEQ ID NO：26)
重链CDR1：GFTFSIYTMS(SEQ ID NO：19)或GFTFSIY(SEQ ID NO：27)
重链CDR2：TISIGGSYINYPDSVKG(SEQ ID NO：20)或SIGGSY(SEQ ID NO：28)
重链CDR3：EVDGSYAMDY(SEQ ID NO：21)；
iv)与上述部分(i)的抗体结合相同表位的抗体；
v)能够抑制上述部分(i)的抗体与人IL1RAP结合的抗体；
vi)能够结合IL1RAP的胞外结构域3的抗体；以及
vii)上述(i)至(vi)的抗体的抗原结合片段。
在一个实施例中，上述(a)(iii)的抗体包括CDR中的至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如所有六个CDR。在另一个实施例中，所述抗体包括所有三个轻链CDR和/或所有三个重链CDR。
在一个实施例中，(b)(iii)的抗体包括CDR中的至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如所有六个CDR。在另一个实施例中，所述抗体包括所有三个轻链CDR和/或所有三个重链CDR。
在一个实施例中，所述第一结合剂是包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)的抗IL1RAP 抗体或其抗原结合片段，所述可变重链和可变轻链选自由以下组成的组：
a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
c)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
d)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
e)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
f)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
g)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
h)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
i)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
j)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
k)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
以及
l)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
在一个实施例中，所述第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：4、5、6或7的氨基酸序列组成；以及
所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸组成。
优选地，所述第一结合剂是包括轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变结构域包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成，所述重链可变结构域包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成，并且所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)，所述轻链可变结构域包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成，所述重链可变结构域包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是包括可变轻链(VL)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：1的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是包括可变重链(VH)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：4的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是包括轻链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：29组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：8、 SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：29具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是包括轻链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：29组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是包括重链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：25组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO： 12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25具有至少80％序列同一性，如至少 90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一结合剂是包括轻链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：25组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：14的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：15具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：15的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是包括轻链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：30组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQID NO：18、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：30具有至少80％序列同一性，如至少 90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是包括轻链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：30组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是包括重链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：19、SEQ ID NO： 20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28具有至少80％序列同一性，如至少 90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二结合剂是包括重链CDR的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述组合物中所述第一结合剂相对于所述第二结合剂的比例在10:1和 1:10之间，如在5:1和1:5之间，如在2:1和1:2之间，如在3:2和2:3之间，如在11:9和9:11 之间，如1:1。
在一些实施例中，所述第一结合剂和第二结合剂是同种亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 的抗体分子。
在一些实施例中，所述组合物能够诱导细胞膜结合的IL1RAP的内化。内化是指当本发明组合物中的结合剂与位于细胞膜内的IL1RAP结合时，结合剂-IL1RAP复合物在细胞内被内化。
在一些实施例中，所述第一结合剂和/或第二结合剂缺乏诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。
结合IL1RAP至少两个不同胞外结构域的双表位结合剂
在一个方面，本发明涉及双表位结合剂，其包括：
第一抗原结合区；以及
第二抗原结合区，
其中所述第一不同抗原结合区和所述第二不同抗原结合区结合人白细胞介素受体辅助蛋白(IL1RAP)的两个不同胞外结构域。
如本文所用，“双表位结合剂”是指能够同时结合两个不同表位的分子。双表位结合剂可以是双特异性试剂。如本文所用，“双特异性试剂”是指能够结合两种不同分子上的两种不同表位的分子。
在一些实施例中，所述双表位结合剂是双可变结构域抗体、双表位Fab片段、双表位scFv、双价双特异性抗体(如IgG-scFv双特异性抗体)、单价双特异性抗体(如
GenmabAS，哥本哈根，丹麦)、“杵入臼式”双特异性抗体(例如，scFv-KIH，scFv-KIHr， BiTE-KIH或BiTE-KIHr；参见Xu等人,2015,mAbs 7(1)):231-242)、scFv2-Fc双特异性抗体、BiTE/scFv2双特异性抗体、DVD-Ig双特异性抗体、IgG-Fab双特异性抗体、FAb-IgG双特异性抗体、基于DART的双特异性抗体(如DART2-Fc、DART2-Fc或DART)、DNL-Fab3双特异性抗体或scFv-HSA-scFv双特异性抗体。
在一个实施例中，所述双表位结合剂是多肽，如抗体。
在一个实施例中，本发明涉及所述双表位结合剂，其中：
a)第一抗原结合区选自由以下组成的组：
i)抗原结合区，其与参考抗体“CAN04”结合相同的抗原；
ii)抗原结合区，其与抗体CAN04结合相同的表位；
iii)抗原结合区，其能够抑制抗体CAN04与人IL1RAP结合；
iv)能够结合IL1RAP的结构域2的抗原结合区；
v)包括或由以下组成的氨基酸序列：
抗体CAN04的可变轻链(VL)氨基酸序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：1)和
可变重链(VH)氨基酸序列： DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYINYPD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：4)
vi)氨基酸序列，其包括或由以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个组成：
轻链CDR1：SASQGINNYLN(SEQ ID NO：8)或ASQGINNYLN(SEQ ID NO：29)
轻链CDR2：YTSGLHAGV(SEQ ID NO：9)或YTSGLHA(SEQ ID NO：22)
轻链CDR3：QQYSILPWT(SEQ ID NO：10)或QYSILPWT(SEQ ID NO：23)
重链CDR1：GYAFTSSSWMN(SEQ ID NO：11)或GYAFTSS(SEQ ID NO：24)
重链CDR2：RIYPGDGNTHYAQKFQG(SEQ ID NO：12)或YPGDGN(SEQ ID NO： 25)
重链CDR3：GYLDPMDY(SEQ ID NO：13)；
vii)上述(I)至(vi)的抗体的抗原结合片段；
以及
b)第二抗原结合区选自由以下组成的组：
i)抗原结合区，其与参考抗体“CAN03”结合相同的抗原；
ii)抗原结合区，其与抗体CAN03结合相同的表位；
iii)抗原结合区，其能够抑制抗体CAN03与人IL1RAP结合；
iv)抗原结合区，其能够结合IL1RAP的胞外结构域3；
v)包括或由以下组成的氨基酸序列：抗体CAN03的可变轻链(VL)氨基酸序列： DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQRRTNGSPRLLIKSASESISGIPSRFSGSG SGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO：14)，
和可变重链(VH)氨基酸序列： DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYINYPD SVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：15)，
vi)抗原结合区，其包括以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个：
轻链CDR1：RASQSIGTSIH
(SEQ ID NO：16)或ASQSIGTSIH(SEQ ID NO：30)
轻链CDR2：SASESIS(SEQ ID NO：17)
轻链CDR3：QQSNSWPTT(SEQ ID NO：18)或QSNSWPTT(SEQ ID NO：26)
重链CDR1：GFTFSIYTMS(SEQ ID NO：19)或GFTFSIY(SEQ ID NO：27)
重链CDR2：TISIGGSYINYPDSVKG(SEQ ID NO：20)或SIGGSY(SEQ ID NO：28)
重链CDR3：EVDGSYAMDY(SEQ ID NO：21)；以及
vii)上述(i)至(vi)的抗体的抗原结合片段。
在一个实施例中，所述第一抗原结合区包括以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括或由重链氨基酸序列SEQ ID NO：35和轻链氨基酸序列SEQ ID NO：36组成，并且其中所述第二抗原结合区包括重链氨基酸序列SEQ ID NO：37和轻链氨基酸序列SEQ ID NO：38。
在一个实施例中，所述第一抗原结合区包括选自由以下组成的组的可变重链(VH)和可变轻链(VL)：
a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
c)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
d)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
e)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
f)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
g)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
h)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
i)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
j)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
k)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
以及
l)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
在一个实施例中，所述第一抗原结合区包括：轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列组成；以及重链可变结构域，其包括或由SEQ ID NO：4、5、6或7的氨基酸序列组成；并且所述第二抗原结合区包括：轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及重链可变结构域，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸组成。
优选地，所述第一抗原结合区包括：轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1 的氨基酸序列组成；以及重链可变结构域，其包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成；并且所述第二抗原结合区包括：轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及重链可变结构域，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：1的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：4的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有轻链CDR，所述轻链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：29组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO： 10、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：29具有至少80％序列同一性，如至少 90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有轻链CDR，所述轻链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：29组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一种抗IL1RAP抗体具有重链CDR，所述重链CDR包括或由选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO： 25组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、 SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第一抗原结合区具有轻链CDR，所述轻链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少 99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：14的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3 个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：15具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少 99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或其中SEQ ID NO：15的任一个氨基酸被改变(条件是不超过3 个氨基酸残基被改变)为另一个氨基酸的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有轻链CDR，所述轻链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：30组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26和SEQID NO：30具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有轻链CDR，所述轻链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：30组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有重链CDR，所述重链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28组成的组的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27和SEQID NO：28具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在一些实施例中，所述第二抗原结合区具有重链CDR，所述重链CDR包括或由选自由 SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28组成的组的氨基酸序列，或其中所述氨基酸序列的任一个氨基酸已被另一个氨基酸改变(条件是不超过3个氨基酸残基已被如此改变)的氨基酸序列组成。
在一个实施例中，所述双表位结合剂对人IL1RAP的结合亲和力(KD)为200pM或更大。
多核苷酸、载体和宿主细胞
一个方面，本发明涉及包括一种或多种多核苷酸的组合物，所述多核苷酸共同或单独地编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii)双表位结合剂。在另一个方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii) 双表位结合剂。在另一个方面，本发明涉及包括一种或多种多核苷酸的表达载体，所述一种或多种多核苷酸共同或单独地编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii)双表位结合剂。在另一个方面，本发明涉及包括一种或多种多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸共同或单独地编码如本文所限定的(i)第一结合剂和第二结合剂或(ii)双表位抗体。在又一个方面，本发明涉及包括一种或多种如本文所描述的表达载体的宿主细胞。
药物组合物
如上所描述的，尽管本发明的结合剂或盐可以作为原料化合物给药，但是优选以药物制剂的形式存在。因此，本发明还提供一种药物制剂，其包括如本文所限定的本发明的结合剂或其药学上可接受的盐或酯，以及其药学上可接受的载体。所描述的药物制剂可以通过常规技术制备，例如药学上可接受的，如Remington中所描述的：The Science andPractice of Pharmacy 2005，Lippincott，Williams&Wilkins。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包含任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于肠胃外(例如，静脉内、肌肉内或皮下)给药(例如，通过注射或输注)。取决于给药途径，可以将结合剂包被在材料中以保护多肽免受酸和可能使多肽失活或变性的其它自然条件的作用。
任选的药学上可接受的载体包括水性载体或稀释剂。可在本发明组合物中采用的合适的水性载体的实例包含水，缓冲水和盐水。其他载体的实例包括乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，通过使用例如卵磷脂的包衣材料，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中将包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。
本发明的组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。还可能期望在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
治疗性组合物通常必须在制造和储存条件下是无菌和稳定的。所述组合物可以配制成溶液、微乳液、脂质体或适用于高药物浓度的其它有序结构。
可以通过将所需量的活性剂(例如抗体)掺入合适的溶剂中，并且根据需要与上述列举的一种或多种成分组合，然后进行灭菌微滤来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性剂掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包括碱性分散介质和上述列举的所需其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性药物加上任何另外期望成分的粉末。
在一个实施例中，组合物被配制成用于全身给药或局部给药。局部给药可在肿瘤部位或进入肿瘤引流淋巴结。所述组合物可以任选地配制成在一段时间内持续释放。因此，所述组合物可以被提供在便于持续释放的基质中或作为基质的一部分。示范性的持续释放基质可以包括褐煤或褐煤-γ-聚谷氨酸(PGA)纳米颗粒。
本领域技术人员应理解，本发明组合物可以包括另外的活性成分，以及本发明的一种或多种试剂。
给药途径和剂量
根据本发明的药物组合物可以经由本领域技术人员已知的任何合适的途径给药。因此，可能的给药途径包含肠胃外(静脉内，皮下和肌内)、局部、眼、鼻、肺、颊、口服、肠胃外、阴道和直肠。从植入物给药也是可能的。
如上所述，本发明的药物组合物可以被配制成用于全身给药或局部给药。局部给药可在肿瘤部位或进入肿瘤引流淋巴结。在一个实施例中，组合物被配制成在一段时间(例如，超过1小时或更长时间，例如，超过两个、三个、四个、五个、六个、十二个或二十四个小时或更多)内持续释放。
本发明的结合剂和组合物可以用于治疗或预防。在治疗应用中，将结合剂和组合物以足以治愈、减轻或部分阻止病状或其一种或多种病征的量给药于已经患有病症或病状的受试者。此类治疗可能导致疾病病征严重程度降低，或无病征时期的频率或持续时间增加。足以完成此目的的量限定为“治疗有效量”。在预防性应用中，将结合剂和组合物以足以预防或延迟症状发展的量给药于尚未表现出病症或病状的病征的受试者。此类量被限定为“预防有效量”。受试者可能已经通过任何合适的方式被确定有发展成所述疾病或条件的风险。
本发明的结合剂或组合物的合适剂量可由熟练的医学从业者确定。本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对特定患者、组合物和给药方式有效实现期望治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包含所用特定药物的活性、给药途径、给药时间、多肽的排泄率、治疗持续时间、与所用特定组合物结合采用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、通常健康条件和既往病史，以及医学领域中众所周知的类似因素。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次团注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于给药和剂量均匀是特别有利的。本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，所述活性化合物经计算可以与期望的药物载体一起生产期望的治疗效果。
结合剂和组合物可以单剂量或多剂量给药。多剂量可以经由相同或不同的途径和相同或不同的位置给药。替代地，可以如上所描述的将结合剂或组合物作为缓释制剂给药，在这种情况下，需要较少的频繁给药。剂量和频率可以取决于患者中多肽的半衰期和期望的治疗持续时间而变化。给药的剂量和频率也可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，可以在相对不频繁的间隔内长时间施用相对低的剂量。在治疗应用中，可以施用相对高的剂量，例如直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。
可以通过多种不同的方式实现两种或多种药物的联合给药。在一个实施例中，第一结合剂和其它试剂可在单一组合物中一起给药。在另一个实施例中，第一结合剂和(一种或多种) 其它试剂可以作为结合疗法的一部分以单独的组合物给药。
治疗、改善、预防、诊断或预后评估的方法
一个方面，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用作药剂。
一个方面，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用作诊断和/或预后剂。
一个方面，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估哺乳动物中的IL1RAP相关联疾病或病症。在一些实施例中，所述IL1RAP相关联疾病或病症选自由以下组成的组：增殖性病症、自身免疫性病症和炎性病症，如自身炎性病症。
一个实施方式中，本发明涉及本文所描述的包括至少两种结合剂的组合物；或双表位结合剂；或多核苷酸；或载体；或宿主细胞；或药物组合物，其用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估选自由以下组成的疾病或病症：类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化症、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化症)、狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、(急性)肾小球肾炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、炎性肠病、结肠炎、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、特应性皮炎、脱发、鼻炎(过敏性鼻炎)、过敏性结膜炎、重症肌无力、硬皮病、结节病、银屑病关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、格雷夫斯病、干燥综合征、子宫内膜异位症、克罗恩病、贝切特病、乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、家族性地中海热(FMF)、伴有复发性发热的高免疫球蛋白D血症(HIDS)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、低温蛋白相关周期性综合征(CAPS，如穆-韦二氏综合征综合征、家族性寒冷性荨麻疹和新生儿发病)、多系统炎性疾病(NOMID)、周期性发热、口疮性口炎、咽炎和腺炎(PFAPA综合征)、布劳综合征、化脓性无菌性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮(PAPA)、白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏(DIRA)、成人发病的斯蒂尔病和全身发病的幼年特发性关节炎。
一个方面，本发明涉及根据本文中所述的用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估哺乳动物中的IL1RAP相关联疾病或病症的对IL1RAP具有特异性的第一结合剂，其中第一结合剂与一种或多种对IL1RAP具有特异性的其它结合剂结合使用，其中第一结合剂和其它结合剂结合IL1RAP的至少两个不同胞外结构域。
炎性疾病和病症
在一个实施例中，所述IL1RAP相关联疾病或病症是炎性疾病或病症。
在一个实施例中，所述炎性疾病或病症选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化症、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化症)、狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、 (急性)肾小球肾炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、炎性肠病、结肠炎、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、特应性皮炎、脱发、鼻炎(过敏症)、过敏性结膜炎、重症肌无力、巩膜炎、结节病、银屑病关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、格雷夫斯病、干燥综合征、子宫内膜异位症、克罗恩病和贝切特病。
自身免疫性疾病和病症
在一个实施例中，所述IL1RAP相关联疾病或病症是自身免疫性疾病或病症。
在一个实施例中，所述自身免疫性病症选自由以下组成的组：乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮。
自身炎性疾病和病症
在一个实施例中，所述IL1RAP相关联疾病或病症是自身炎性疾病或病症。
在一个实施例中，所述自身炎性疾病或病症选自由以下组成的组：家族性地中海热 (FMF)、伴有反复发热的高免疫球蛋白D血症(HIDS)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、低温蛋白相关周期性综合征(CAPS，如穆-韦二氏综合征综合征、家族性寒冷性荨麻疹和新生儿发病)、多系统炎性疾病(NOMID)、周期性发热、口疮性口炎、咽炎和腺炎(PFAPA综合征)、布劳综合征、化脓性无菌性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮(PAPA)、白细胞介素-1受体拮抗剂(DIRA)缺乏、成人发病的斯蒂尔病和全身发病的幼年特发性关节炎。
肿瘤性病症
在一个实施例中，所述IL1RAP相关联疾病或病症是哺乳动物中的肿瘤性病症。
在一个实施例中，所述肿瘤性病症选自由以下组成的组：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、肉瘤、慢性髓细胞白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)。
实例
A.示范性抗体对IL1RAP蛋白的结合亲和力
(i)Biacore研究–鼠源抗IL1RAP抗体
材料和方法
根据捕获试剂盒技术手册和BIAcore T200(BIAcore Life Sciences、GEHealthcareEurope GmbH、乌普萨拉、瑞典)标准操作原理，将山羊抗鼠IgG固定在CM5芯片上。
结合分析周期包括三个步骤：(i)通过固定的抗小鼠抗体在芯片表面捕获配体；(ii)分析物与捕获的配体的结合；以及(iii)结合分析物的解离。
在每个结合周期后，使用制造商推荐的条件再生捕获分子表面。
所有结合周期都在25℃下进行。
启动五个周期后，在周期开始时，以30μl/min的流速注射每种抗体(100nM)，持续120s；然后以30μl/min的流速注射分析物(100nM)，持续120s，然后监测解离阶段300s。
本发明组合物的示范性抗体(CAN03和CAN04)连同一种对照抗IL1RAP抗体(CAN01)一起测试。
结果和结论
结果显示在下表2中：
表2.Kon、Koff和KD的测量。
本发明的示范性抗体CAN03和CAN04表现出对人IL1RAP的高亲和力。
(ii)ELISA研究–鼠源抗IL1RAP抗体
材料和方法
进行间接ELISA测定。所有样品都是一式两份进行分析的。Nunc-MaxiSorp 96微孔平板涂有100ng在0.01M PBS，pH 7.4中稀释的重组hIL1RAP 21-367(100μl/孔)，并且在4℃下孵育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS，0.05％Tween 20，pH 7.4)洗涤平板，然后使用150μl/孔的ELISA阻断溶液(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween 20，pH 7.4)进行阻断步骤。在室温(RT)下搅拌孵育1小时后，再次使用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板。样品在 ELISA阻断溶液中以三倍系列稀释(范围从1000ng/ml到0.5ng/ml)稀释，然后转移到ELISA 平板，100μl/孔。平板在RT下搅拌孵育1小时，然后用ELISA洗涤液洗涤。加入100μl/孔的与碱性磷酸酶(DAKO，1:1000)缀合的兔抗小鼠IgG，并且在RT下搅拌孵育1小时。洗涤平板，然后加入底物(4-硝基苯基磷酸二钠二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/mL)，100μl/ 孔。此后将平板在搅拌下在RT下孵育，并且连续测量405nm处的吸光度30分钟。将0分钟时的吸光度作为背景信号。
结果和结论
结果如图1中示出的示范性抗体CAN03和CAN04被发现对人IL1RAP具有最高的结合信号。
B.示范性抗体与表达IL1RAP的细胞的结合
(i)流式细胞术研究–鼠源抗IL1RAP抗体
材料和方法
用针对IL1RAP或相关同种型对照的抗体对慢性髓性白血病(CML)细胞系KU812细胞进行染色。为了检测，使用了第二抗mIg-APC。
两种示范性抗体(CAN03和CAN04)连同六种对照抗IL1RAP抗体(CAN01、CAN02、CAN05、CAN07、CAN08和CAN09)一起测试。还包含同种型阴性对照抗体。
结果和结论
表达IL1RAP的KU812白血病细胞染色显示，与同种型对照和其它针对IL1RAP的对照抗体相比，CAN03和CAN04的平均荧光强度(MFI)更高(图2)。
C.示范性抗IL1RAP抗体的表位/结构域定位
材料和方法
为了了解不同的抗体克隆在IL1RAP上结合的位置，对所述蛋白进行了结构分析，揭示了所述受体的胞外部分可分为三个不同的结构域，以下称为结构域1、2和3(D1，D2，D3)(参见Wang等人,2010,《自然·免疫学》,11:905-912，其公开内容通过引用并入本文)。为了确定不同抗体克隆的结构域结合模式，产生了一系列受体构建体并且与它们的结合在ELISA 测定中进行了测试。
进行间接ELISA测定。所有样品都是一式两份进行分析的。Nunc-MaxiSorp96微孔平板涂有100ng Rec hIL1RAP Domain123(aa21-367)(阳性对照)、Rec hIL1RAP Domain12(aa21-234)、Domain1(aa21-134)或Rec hIL1RAP Domain3(aa235-367)(100μl/孔)用0.01M PBS，pH 7.4稀释，并且在4℃孵育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS，0.05％Tween20，pH 7.4)洗涤平板，然后使用150μl/孔的ELISA阻断溶液(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween20，pH 7.4)进行阻断步骤。在室温(RT)下搅拌孵育1小时后，再次使用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板。将CAN01、CAN03、CAN04、CAN05、CAN07、CAN08和KMT-1(阳性对照) 在ELISA阻断溶液中以三倍系列稀释(范围从1000ng/ml到0.5ng/ml)稀释，然后转移到 ELISA平板，100μl/孔。平板在RT下搅拌孵育1小时，然后用ELISA洗涤液洗涤。加入100 μl/孔的与碱性磷酸酶(DAKO，1:1000)缀合的兔抗小鼠IgG，并且在RT下搅拌孵育1小时。洗涤平板，然后加入底物(4-硝基苯基磷酸二钠二钠盐六水合物，SIGMA，1mg/mL)，100μl/ 孔。此后将平板在搅拌下在RT下孵育，并且连续测量405nm处的吸光度30分钟。将0分钟时的吸光度作为背景信号。
本发明组合物的示范性抗体(CAN03和CAN04)连同八种对照抗IL1RAP单克隆抗体(CAN01、CAN02、CAN05、CAN07、CAN08、CAN10和CAN11)以及作为阳性对照的多克隆抗IL1RAP抗体(KMT-1)一起进行测试。
结果和结论
测试用于靶标验证的大多数抗IL1RAP抗体结合结构域3(D3)，而本发明的示范性CAN04抗体的独特之处在于其结合结构域2(D2)。因此，示范性抗体(CAN03和CAN04) 结合IL1RAP的不同结构域(分别为D3和D2)。下表4总结了整个结构域映射数据。
表4.示范性抗IL1RAP抗体克隆的表位作图。
nd*＝未确定，因为表位作图数据不能清楚地识别这些构建体的具体结构域，这可能归因于结合包括来自一个以上结构域的序列元件的结构表位，例如，D2-D3交叉点。
D.示范性抗IL1RAP抗体的特异性/交叉反应性
材料和方法
良好的先导候选抗体的一个重要特征是，它们与相关毒理学物种中的同源蛋白质以相等或接近相等的效能发生交叉反应。根据通常监管指南，结合一种啮齿动物和一种非啮齿动物将是首选方案，但对于抗体来说，情况很少如此，相反，许多实验室努力识别除灵长类动物之外的任何相关毒理学物种。
在目前的研究中，对非人的灵长类动物如恒河猴(恒河猴)或食蟹猴(猕猴)的交叉反应性是预期的，因为这些物种中的IL1RAP蛋白与人IL1RAP蛋白有99％的同源性。
选择了许多潜在的先导抗体，并且在ELISA测定中测试了与重组食蟹猴IL1RAP(aa21-367)的结合。
将示范性抗体(CAN03和CAN04)连同七种对照抗IL1RAP单克隆抗体(来自R&D的CAN01、CAN02、CAN07、CAN08、CAN09、Mab676)和多克隆抗IL1RAP抗体(KMT-1) 一起进行测试。
结果和结论
令人惊讶的是，测试的若干对照抗IL1RAP抗体没有发现与猕猴IL1RAP交叉反应，其中包括来自R&D的商业参考抗体单克隆抗体mAb676，表5。然而，CAN03和CAN04两者都与猕猴蛋白反应。
表5.结合猕猴IL1RAP。粗体字的值表示被鉴定为与来自食蟹猴的IL1RAP交叉反应的克隆。
E.示范性抗IL1RAP抗体对IL-1β、IL-33、IL-36α信号传导的抑制
(i)不同抗体和抗体组合对HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞系中IL-1和IL-33信号传导的作用
材料和方法
由于IL1RAP是IL-1和IL-33受体复合物两者的功能部分，因此结合IL1RAP的抗体还可以抑制IL-1和IL-33的信号传导。
为了测试潜在的潜在候选候选抗体阻断IL-1和IL-33信号传导的能力，建立了IL-1和 IL-33依赖的报告基因测定。IL-33/IL-1β细胞(InvivoGen)通过释放碱性磷酸酶来对IL-1或 IL-33信号传导作出反应，碱性磷酸酶的释放可以通过比色测定进行定量。为了测试先导候选物的抑制能力，将HEK-Blue细胞以50 000个细胞/孔接种，并且在用IL-1β或IL-33刺激前与测试抗体一起孵育45分钟，最终测定浓度为每个配体0.3ng/ml。抗体的最终测定浓度为 200nM–0.01nM。在对照孔中，抗体被PBS代替。在测量释放的碱性磷酸酶的量之前，将细胞在37℃o/n下孵育。
本发明的示范性抗体(CAN03和CAN04)被单独测试并且以1:1组合测试对IL-1β和IL-33 信号传导的抑制。
结果和结论
如图3A所示，示范性抗体CAN04诱导了对IL-1β信号传导的显著抑制。示范性抗体CAN03也抑制信号传导，但效力低于CAN04。当CAN04和CAN03组合时，检测到类似于单独CAN04的抑制。
与IL-1β信号传导的抑制相反，CAN03和CAN04单独给药时不能完全抑制IL-33信号传导。两种抗体都以相当的效力阻断信号传导，但只能抑制
(CAN03)或
(CAN04)的信号(图3B)。但是，令人惊讶的是，与单独的每种抗体相比，CAN03和CAN04(1:1) 的组合将信号抑制到100％，并且更有效。因此，结合IL1RAP的不同结构域(CAN03至D3， CAN04至D2)的两种抗体协同作用以抑制IL1RAP信号传导。
(ii)不同抗体和抗体组合对IL-1Rrp2转染的HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞系中IL-36信号传导的作用
材料和方法
由于IL1RAP也是IL-36受体复合物的功能部分，因此结合IL1RAP的抗体还可以抑制 IL-36信号传导。
HEK-Blue IL-33/IL-1β系统(InvivoGen)对IL-36无反应，因为它缺少IL-36受体(IL1Rrp2)。为了测试潜在的先导候选抗体阻断IL-36信号传导的能力，通过用IL1Rrp2(IL36 受体)转染修饰了HEK-Blue IL-33/IL-1β系统，使IL-36诱导报告基因表达。使用LipofectamineLTX(ThermoFisher)用表达IL1Rrp2的载体瞬时转染HEK-Blue细胞，培养24h，以50 000个细胞/孔铺平板，并且在用不同浓度的IL-36α刺激之前与测试抗体孵育45分钟。抗体的测定浓度为0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml。在对照孔中，抗体被PBS代替。在测量释放的碱性磷酸酶的量之前，将细胞在37℃o/n下孵育。
示范性抗体(CAN03和CAN04)被单独测试，并且以1:1组合测试对信号传导的抑制。
结果和结论
如图4A和图4B所示，示范性抗体CAN04自身在1ng/ml IL-36α处诱导对IL-36α信号传导的中度抑制，而在10ng/ml IL-36α处诱导非常小的抑制。示范性抗体CAN03自身在这些IL-36α浓度下不抑制信号传导。然而，与单独的每种抗体相比，CAN03和CAN04的组合 (1:1)更有效，并且导致对IL-36α信号的协同抑制。因此，同样对于IL-36信号传导，结合 IL1RAP的不同结构域的两种抗体协同作用以抑制IL1RAP信号传导。
(iii)对细胞系的作用
材料和方法
为了测试在癌细胞模型中抑制IL1RAP依赖性信号传导的能力，建立了IL-1依赖性细胞测定。表达IL1RAP的乳腺癌细胞系Hs578T对生产IL-6的IL-1β刺激有反应，并且用于测试示范性抗体和同种型对照的抑制效果。将细胞以20 000个细胞/孔接种在12孔平板中，并且用0.1ng/ml IL1β温育24小时。通过ELISA测量上清液中的IL-6。细胞与指示的抗体一起或不与指示的抗体一起孵育，并且用IL-1β刺激。抗体的最终测定浓度为10μg/mL(单独测试时每种抗体为10μg/mL，当以1:1组合测试时每种抗体为5μg/ml)。
结果和结论
如图5所示，在10μg/mL的CAN04或CAN03存在下，用IL-1β刺激导致24小时后50％(CAN04)或30％(CAN03)的IL-6产生抑制，而同种型对照抗体没有任何作用。与实例D 中的HEK-Blue IL-33/IL-1β系统相同，CAN04和CAN03(5μg/ml CAN04+5μg/ml CAN03) 的组合导致效果的协同增强和90％的信号可能会被抑制。因此，当结合以减少乳腺癌细胞系中对IL-1β刺激的自然反应时，CAN03和CAN04具有协同作用。
F.筛选针对IL1RAP的结构域1、2和3的抗体
(i)筛选以结合IL1RAP
如上文实例A(ii)中筛选针对IL1RAP产生的抗体以结合IL1RAP，随后如实例B(i)中筛选针对表达高水平细胞表面IL1RAP的细胞(如KU812 CML细胞或SK-MEL-5)黑色素瘤细胞)。
(ii)结合不同结构域的分析
如实例C中所描述的测试与IL1RAP反应的抗体与D1、D2和D3的相互作用。
(iii)ELISA分析竞争性结合
为了验证与IL1RAP的类似区如CAN03(D3)或CAN04(D4)的结合，可以如下所描述的进行竞争性ELISA。
协议
●所有样品都是一式两份进行分析的。
●在Nunc-MaxiSorp 96微孔平板上涂100μl/孔的重组hIL1RAP 21-367(1μg/ml)，用 0.01M PBS(pH 7.4)稀释。
●将平板在4℃孵育过夜。
●用ELISA洗涤缓冲液
(0.01M PBS，0.05％Tween 20，pH 7.4)洗涤平板。
●加入150μl/孔的ELISA阻断溶液
(PBS，0.5％BSA，0.05％Tween 20，pH 7.4)。
●于室温(RT)搅拌下将平板孵育1小时。
●用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板。
●将测试项目的样品(例如mAb 1，mAb 2)加入到孔中(100μl/孔，10μg/ml)
●RT下孵育平板1小时。
●用ELISA洗涤液洗涤平板。
●向所有孔中加入参考抗体CAN03或CAN04(100μl/孔，1μg/ml)的溶液。
●RT下孵育平板1小时。
●用ELISA洗涤缓冲液洗涤平板。
●加入100μl/孔的与碱性磷酸酶偶联的碱性兔抗小鼠IgG偶联的合适的二抗(如果测试项目是人的抗体，则合适的二抗为山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)–碱性磷酸酶抗体，SIGMA， A1418)
●搅拌下在RT下孵育平板1小时。
●用洗涤缓冲液洗涤平板。
●每孔加入100μl pNPP底物。
(4-硝基苯基磷酸二钠六水合物，SIGMA，1mg/mL)。
●在搅拌下于RT孵育平板，并且连续测量405nm处的吸光度30分钟。在0分钟处的吸光度应作为背景信号。
G.抗体的亲和力成熟
针对IL1RAP产生并且被选择分别与IL1RAP和D2或D3结合的抗体可以是“亲和力成熟的”以增加亲和力。
通过本领域已知的程序生产亲和力成熟抗体。这些方法中的许多方法是基于通过诱变产生变异蛋白质组或文库，然后选择和/或筛选以提高亲和力的通常策略。诱变通常在DNA水平上进行，例如通过易错PCR(Thie,Voedisch等人,2009,《分子生物学方法(MethodsMol Biol)》525:309-322)，通过基因改组(Kolkman and Stemmer 2001，《自然·生物技术(Nat Biotechnol.)》5月；19(5):423-8)，通过使用诱变化学物质或辐射，通过使用具有易错复制机制的“突变”菌株(Greener 1996,《体外诱变方案(In Vitro MutagenesisProtocols.)》Humana press, NJ)或通过利用自然亲和力成熟机制的体细胞超突变方法(Peled,Kuang等人2008，《免疫学年度评论(Annu Rev Immunol.)》26:481-511)。诱变也可在RNA水平上进行，例如通过使用Q13复制酶(Kopsidas,Roberts等人,2006,《免疫学通讯(Immunol Lett.)》.2006年11月 15日；107(2):163-8)。HVR和/或框架残基的随机诱变描述于：Barbas等人,《美国科学院院报》91:3809-13(1994)；Schier等人,《基因(Gene)》169:147-55(1995)；Yelton等人,《免疫学杂志》1 55:1 994-2004(1995)；Jackson等人,《免疫学杂志》.154(7):331 0-19(1995)；以及Hawkins等人,《分子生物学杂志》226:889-96(1992)；Johnson&Hawkins,《使用噬菌体展示对抗体进行的亲和力成熟(Affinity Maturation ofAntibodies Using Phage Display)》，牛津大学出版社，1996年。
允许筛选改善的变体蛋白质的基于文库的方法可以基于各种展示技术，如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物细胞，并且在本领域中是众所周知的(Benhar 2007,《生物疗法专家意见(Expert Opin Biol Ther.)》5月,7(5):763-79)。亲和力成熟可以通过更具指导性/预测性的方法来实现，例如通过定点诱变或以3D蛋白质建模的发现为指导的基因合成(参见例如 Queen,Schneider等人,1989,《PNAS》,86(24):10029-33或美国专利第6,180,370号或美国专利第5,225,539号)。
Marks等人,《生物/技术(Bio/Technology)》10:779-83(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。
H.用于结合IL1RAP不同结构域的双表位抗体的生产。
材料和方法
双特异性抗体2C9x3F8是通过受控Fab臂交换(cFAE)生产的，描述于Labrijn等人(《美国科学院院报》.2013年3月26日；110(13):5145-5150)。所描述的过程涉及表达两种单独的亲本抗体，每种亲本抗体分别在相应的CH3结构域中包括一个单点突变F405L和K409R(EU 编号惯例如Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)》,第5版马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,MD.)(1991)中所描述)。将亲本抗体混合，并且在体外置于受控的还原条件下，将抗体分开成重链/轻链半分子(Fab臂)。再氧化后，Fab臂将重新组装。如以上所解释的，抗体CH3结构域中的点突变将以形成高纯度bsAb的方式影响重组过程。
对于bsab2C9x3F8，亲本抗体是ch2C9(代表CAN03)和hu3F8(代表CAN04)。ch2C9 是具有小鼠VL和VH和人的恒定部分(IgG1/kappa)的嵌合单克隆抗体。hu3F8是人源化IgG1/κ单克隆抗体。p2C9H4hG1是含有在哺乳动物细胞中表达ch2C9重链所需的所有遗传元件的表达载体。将点突变F405L引入p2C9H4hG1，新的表达载体命名为 p2C9-HC-hIgG1-F405L.p3F8-VH-v2是包括在哺乳动物细胞中表达hu3F8重链所需的所有遗传元件的表达载体。将点突变K409R引入p3F8-VH-v2，新的表达载体命名为 p3F8-HC-hIgG1-K409R.p2C9K9hK是包括在哺乳动物细胞中表达ch2C9轻链所需的所有遗传元件的表达载体，而p3F8-VL-v2是包括在哺乳动物细胞中表达hu3F8轻链所需的所有遗传元件的表达载体。
诱变：为了引入F405L或K409R突变，用BstEII和NsiI双重消化p2C9H4hG1和 p3F8-VH-v2，并且通过融合内克隆方法(Clontech)将含有点突变的合成基因串(Geneart) 克隆到线性化载体上。
抗体生产：根据制造商的说明，通过在Freestyle 293F细胞(Life Techologies)中共转染相关的重链和轻链表达载体，生产ch2C9-F405L和hu3F8-K409R单克隆抗体。使用了以下载体：ch2C9-F405L；HC载体p2C9-HC-hIgG1-F405L和LC载体p2C9K9hK；hu3F8-K409R；HC载体p3F8-HC-hIgG1-K409R和LC载体p3F8-VL-v2。
纯化：通过蛋白A亲和色谱纯化抗体。将细胞培养上清液施加到MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)，用PBS洗涤并且用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱。在馏分收集期间，直接用1.0MTris-HCl(pH 9.0)中和洗脱液。纯化后，立即用PD-10色谱柱(GE Healthcare)进行凝胶过滤，将缓冲液更换为pH 7.4的PBS。通过SDS-PAGE确定纯度，并且通过在280nm处的吸光度测量浓度。纯化的抗体储存在4℃。
受控的Fab臂交换：双特异性抗体是通过化学反应产生的，其中在75mM2-巯基乙酰胺 -HCL存在下，将等摩尔量的ch2C9-F405L和hu3F8-K409R混合至终浓度为0.5mg/mL (2-MAE，Sigma)，并且在31℃下孵育5小时。通过超滤除去2-MAE(Viva-spin 6 10kDa,Satorius)后，将样品在4℃下储存过夜，以允许二硫键再氧化。
结果和结论
本实例证明可以生产针对IL1RAP的两个不同结构域的纯抗体。
I.单特异性和双表位抗体的人源化
不总是期望使用非人的抗体用于人的治疗，因此根据本发明的抗体可以是人的抗体或人源化抗体。
人源化例如通过按照Winter及其同事的方法进行(Jones等人,《自然》, 321:522-525(1986)；Riechmann等人,《自然》,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,《科学》, 239:1534-1536(1988)，通过用啮齿动物CDR或CDR序列替代人的抗体的对应序列。(另见美国专利第5,225,539号)。在一些情况下，人的免疫球蛋白的Fv框架残基被对应的非人的残基代替。人源化抗体还包括，例如，既不在受体抗体中也不在导入的CDR或框架序列中发现的残基。通常，人源化抗体包含基本上所有的至少一个(通常是两个)可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人的免疫球蛋白的那些可变结构域，并且所有或基本上所有的框架区是人的免疫球蛋白共有序列的那些可变结构域。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人的免疫球蛋白的恒定区(Jones等人,1986；Riechmann 等人,1988；以及Presta，《结构生物学评论(Curr.Op.Struct.Biol.)》,2:593-596(1992))。
J.双特异性抗体或单特异性抗体组合的体外和体内活性
单特异性抗体、单特异性抗体的组合或双特异性抗体可在实例E中描述的HEK系统中测试对IL-1、IL-33或IL-36信号传导的抑制。还可以测试单特异性抗体、单特异性抗体的组合或双特异性抗体对细胞系(例如在实例E中)或具有适当受体的原代细胞中对IL-1、IL-33 或IL-36信号传导的抑制作用。后一种系统中的读数可以是细胞内信号通路(包含NFκB)或下游细胞因子或其它诱导蛋白的激活。
还可以测试单特异性抗体、单特异性抗体或双特异性抗体的组合对LPS诱导的人的细胞离体炎症的抑制。在不存在或存在单特异性抗体、单特异性抗体或双特异性抗体的组合的情况下，将脂多糖给药到2×105人的外周血单个核细胞，在37℃孵育6、24和48小时后，分析上清液中的IL-6和其它细胞因子(如IL-1β、TNFα和IL-8)。IL-1信号在所述系统中的阻断减少了炎性信号和细胞因子(如IL-6)的分泌。
还可在体内IL-1、IL-33和/或IL-36依赖性疾病模型中测试单特异性抗体、单特异性抗体的组合或双特异性抗体。一个此类实例是银屑病异种移植模型，例如，如WO 2013/074569 中所描述的；其中将银屑病患者的人的皮肤活检移植到免疫缺陷小鼠(例如，SCID小鼠)，并且允许移植至少四周。移植的移植物显示出与银屑病类似的组织学特征，包含如表皮增厚等可用作治疗效果衡量标准的特征。为了增加炎症和银屑病的病理特征，可以将源自供体银屑病斑块的自体T细胞经皮内或静脉内给药于移植小鼠。注射T细胞的替代方法是皮内注射由葡萄球菌肠毒素(SEB和/或SEC)和IL-2刺激的自体PBMC。细胞注射后几周，通过组织学分析移植物，测量表皮厚度并且计算治疗效果。在Gudjonsson等人,(2007)《皮肤病学研究杂志(J Invest Der)》,127:1292-1308和Kundu-Raychaudhuri等人,(2014)《印度皮肤病学、性病学和麻风学杂志(Indian J Dermatology,Venereology,and Leprology)》80(3)：204-213中描述了适用于本发明的其它银屑病模型。
材料
进行以下研究以确定单表位抗体CAN04和双表位抗体bsACAN03xCAN04是否能够抑制 IL-1β和IL-33信号传导。
抗体的制备
将所有抗体在PBS中稀释以进行测试。用于报告基因测定的工作溶液HEK-BlueIL-33/IL-1β在PBS中以最终测定浓度制成20倍。最终测定体积为200μl(包括10μl抗体或稀释液(PBS)+180μl细胞+10μl配体)。抗体的最终测定浓度如下：10至0.0001nM(通过 3倍稀释步骤的连续稀释)。
人的配体的制备(IL-1β和IL-33)
将IL-1β和IL-33在PBS中稀释至10μg/mL的储备浓度。在使用前，将10μg/mL配体的储备浓度储存在-80℃的等分试样中。对于报告基因测定，配体的最终浓度为100ng/mL的hIL-1β和2ng/mL的hIL-33；这些浓度给出了在测定前实验中测定的70-80％的最大效果。
配体稀释至最终测定浓度
(a)hIL-1β，100ng/mL
●将10μg/mL的配体储备液稀释为1:5(200μl+800μl选择性培养基，参见下文)＝2000 ng/mL
●在测定中，以1:20稀释2000ng/mL；10μl LPS 2000ng/mL+190μl细胞和化合物/孔，最终浓度为100ng/mL
(b)hIL-33，2ng/mL
●将10μg/mL的配体储备液以1:250(10μl+2490μl选择性培养基，见下文)＝40ng/mL 稀释
●在测定中，以1:20稀释40ng/mL；10μl LPS 200ng/mL+190μl细胞和化合物/孔，最终浓度为2ng/mL
细胞系
通过用IL1RL1稳定转染HEK-Blue IL-1β细胞而产生的HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞被用作IL-33/IL-1β传感器细胞(Cat no.hkb-IL-33，InvivoGen，美国圣地亚哥)。
方法
学习设计
在PBS中制备抗体的储备溶液。用于报告基因测定的工作溶液HEK-Blue IL-33/IL-1β在 PBS中以最终测定浓度制成20倍。最终测定体积为200μl(包括10μl抗体或稀释液(PBS) +180μl细胞+10μl配体)。抗体的最终测定浓度如下：10至0.0001nM(通过3倍稀释步骤的连续稀释)。在对照孔(刺激/未刺激的细胞)中，抗体被10μl PBS代替。
HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞的培养和刺激
由于IL1RAP是IL-1受体复合物的功能部分，因此结合IL1RAP的抗体具有抑制IL-1信号传导的潜力。由于据报告肿瘤细胞使用IL1RAP依赖的配体(如IL-1β和IL-33)作为生长因子，阻断所述信号可能为介导抗肿瘤效应(单独或与ADCC效应结合)提供重要机制。为了测试抗体阻断白细胞介素-1信号传导的能力，建立了白细胞介素-1依赖性报告基因测定。HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞(InvivoGen)通过释放碱性磷酸酶来对IL-1信号作出反应，碱性磷酸酶的释放可以通过比色测定进行定量。为了测试先导候选物的抑制能力，将HEK-Blue 细胞以50，000个细胞/孔接种，并且在用最终浓度的人的IL-1α、IL-1β和IL-33刺激前与测试抗体一起孵育45分钟，以给出最佳刺激。抗体的最终测定浓度为10nM-0.0001nM。在对照孔中，抗体被PBS代替。在测量用于检测和定量碱性磷酸酶的QUANT-Blue–Medium培养基释放的碱性磷酸酶的量之前，将细胞在37℃o/n下孵育。
将HEK-Blue IL-33/IL-1β细胞在DMEM、10％流式细胞仪(HI)和PEST及Normocin中解冻培养两次。在两次传代后，在实验前和实验期间，用加入到上述培养基中的选择抗生素(Zeocin，HygroGold和Blasticidin)培养细胞至少一次传代。需要HygroGold来维持对细胞系的IL-1β特异性，并且需要Blasticidin和Zeocin分别维持编码IL1RL1和SEAP的质粒。实验在70％汇合的细胞上进行。细胞每周分裂2-3次，或者当它们达到80-90％融合时。
配体的滴定剂量范围为300ng/ml至0.01ng/ml。为了产生用于测试抗体影响IL-1信号传导(刺激或抑制碱性磷酸酶释放的量)的能力的良好测定，优选在剂量-反应曲线的线性斜率上产生强信号的浓度。对于所述系统，选定的hIL-1β浓度为100ng/mL，并且hIL-33浓度为 2ng/mL。
结果评估
使用等式1将原始数据转换为％抑制：
％抑制＝(1-(A-B)/(C-B))×100
其中：
A＝加入化合物溶于PBS后的配体活性
B＝阴性对照，无配体，仅PBS(载体)
C＝阳性对照，配体与PBS(载体)，
IC50代表对最大反应产生50％抑制的浓度。
EC50代表相对于曲线顶部和底部的计算值产生50％抑制的抑制的浓度。
结论和结果
本实例表明单表位抗体CAN04以及双表位抗体bsACAN03xCAN04完全阻断IL-1β信号传导。CAN04也抑制IL-33信号传导，但具有部分效力。然而，双表位的bsACAN03xCAN04 抗体可完全抑制IL-33信号传导，如图6所绘示。
序列概述
SEQ ID NO：1：CAN04变体6可变轻链(VL)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：2：CAN04可变轻链(VL)VL1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：3：CAN04可变轻链(VL)VL3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR
SEQ ID NO：4：CAN04变体6可变重链(VH)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGD GNTHYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO：5：CAN04可变重链(VH)VH1
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGD GNTHYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO：6：CAN04可变重链(VH)VH3
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSSWMNWVRQAPGKGLEWMGRIYPGD GQTHYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO：7：CAN04可变重链(VH)VH4
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSSWMNWVRQAPGKGLEWMGRIYPGD GQTHYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO：8：CAN04变体6轻链CDR1(根据Chotia)
SASQGINNYLN
SEQ ID NO：9：CAN04变体6轻链CDR2(根据Chotia)
YTSGLHAGV
SEQ ID NO：10：CAN04变体6轻链CDR3(根据Chotia)
QQYSILPWT
SEQ ID NO：11：CAN04变体6重链CDR1(根据Chotia)
GYFTSSSWMN
SEQ ID NO：12：CAN04变体6重链CDR2(根据Chotia)
RIYPGDGNTHYAQKFQG
SEQ ID NO：13：CAN04变体6重链CDR3(根据Chotia)
GYLDPMDY
SEQ ID NO：14：CAN03可变轻链(VL)
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQRRTNGSPRLLIKSASESISGIPSRFS GSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELKR
SEQ ID NO：15：CAN03可变重链(VH)
DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYIN YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO：16：CAN03轻链CDR1(根据Chotia)
RASQSIGTSIH
SEQ ID NO：17：CAN03轻链CDR2(根据Chotia)
SASESIS
SEQ ID NO：18：CAN03轻链CDR3(根据Chotia)
QQSNSWPTT
SEQ ID NO：19：CAN03重链CDR1(根据Chotia)
GFTFSIYTMS
SEQ ID NO：20：CAN03重链CDR2(根据Chotia)
TISIGGSYINYPDSVKG
SEQ ID NO：21：CAN03重链CDR3(根据Chotia)
EVDGSYAMDY
SEQ ID NO：22：CAN04变体6可变轻链CDR2(根据Kabat)
YTSGLHA
SEQ ID NO：23：CAN04变体6可变轻链CDR3(根据Kabat)
QYSILPWT
SEQ ID NO：24：CAN04变体6可变重链CDR1(根据Kabat)
GYAFTSS
SEQ ID NO：25：CAN04变体6可变重链CDR2(根据Kabat)
YPGDGN
SEQ ID NO：26：CAN03可变轻链CDR3(根据Kabat)
QSNSWPTT
SEQ ID NO：27：CAN03可变重链CDR1(根据Kabat)
GFTFSIY
SEQ ID NO：28：CAN03可变重链CDR2(根据Kabat)
SIGGSY
SEQ ID NO：29：CAN04变体6轻链CDR1(根据Kabat)
ASQGINNYLN
SEQ ID NO：30：CAN03轻链CDR1(根据Kabat)
ASQSIGTSIH
SEQ ID NO：31：CAN04重链恒定区
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：32：CAN04轻链恒定区
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：33：CAN03重链恒定区，Iggamma-1链C区(智人)(UnitProt登记号P01857)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYT
SEQ ID NO：34：CAN03轻链恒定区，Igκ链C区(智人)(UnitProt登记号P01834)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：35：>hu3F8-HC-hIgG1-K409R
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGD GNTHYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：36：>hu3F8-LC-hk
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGV PSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：37：>ch2C9-HC-hIgG1-F405L
DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYIN YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：38：>ch2C9-LC-hk
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQRRTNGSPRLLIKSASESISGIPSRFS GSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
Claims (73)
1.一种组合物，其至少包括对白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有特异性的第一结合剂和对IL1RAP具有特异性的第二结合剂，其中所述第一结合剂和所述第二结合剂结合IL1RAP的至少两个不同胞外结构域。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一结合剂和第二结合剂中的每一种都是抗IL1RAP抗体或抗原结合片段。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，
a)其中第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，选自由以下组成的组：
i)参考抗体“CAN04”；
ii)抗体，其包括可变轻链(VL)氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR(SEQID NO：1)和可变重链(VH)氨基酸序列：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFTSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGDGNTHYAQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCGEGYLDPMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)；
iii)抗体，其包括以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个：
轻链CDR1：SASQGINNYLN(SEQ ID NO：8)或ASQGINNYLN(SEQ ID NO：29)
轻链CDR2：YTSGLHAGV(SEQ ID NO：9)或YTSGLHA(SEQ ID NO：22)
轻链CDR3：QQYSILPWT(SEQ ID NO：10)或QYSILPWT(SEQ ID NO：23)
重链CDR1：GYAFTSSSWMN(SEQ ID NO：11)或GYAFTSS(SEQ ID NO：24)
重链CDR2：RIYPGDGNTHYAQKFQG(SEQ ID NO：12)或YPGDGN(SEQ ID NO：25)；
重链CDR3：GYLDPMDY(SEQ ID NO：13)；以及
iv)与上述部分(i)的抗体结合相同表位的抗体；
v)能够抑制上述部分(i)的抗体结合人IL1RAP的抗体；
vi)能够结合IL1RAP的胞外结构域2的抗体；以及
vii)上述(i)至(vi)的抗体的抗原结合片段；
并且
b)其中第二结合剂是选自由以下组成的组的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段：
i)参考抗体“CAN03”；
ii)抗体，其包括可变轻链(VL)氨基酸序列：DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQRRTNGSPRLLIKSASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELKR(SEQID NO：14)
和可变重链(VH)氨基酸序列：DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYINYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQID NO：15)；
iii)抗体，其包括以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个：
轻链CDR1：RASQSIGTSIH
(SEQ ID NO：16)或ASQSIGTSIH(SEQ ID NO：30)
轻链CDR2：SASESIS(SEQ ID NO：17)
轻链CDR3：QQSNSWPTT(SEQ ID NO：18)或QSNSWPTT(SEQ ID NO：26)
重链CDR1：GFTFSIYTMS(SEQ ID NO：19)或GFTFSIY(SEQ ID NO：27)
重链CDR2：TISIGGSYINYPDSVKG(SEQ ID NO：20)或SIGGSY(SEQ ID NO：28)；
重链CDR3：EVDGSYAMDY(SEQ ID NO：21)；
iv)与上述部分(i)的抗体结合相同表位的抗体；
v)能够抑制上述部分(i)的抗体与人IL1RAP结合的抗体；以及
vi)能够结合IL1RAP的胞外结构域3的抗体；以及
vii)上述(i)至(vi)的抗体的抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中(a)(iii)的抗体包括所述CDR中的至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如所有六个所述CDR。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述抗体包括所有三个轻链CDR和/或所有三个重链CDR。
6.根据权利要求3所述的组合物，其中(b)(iii)的抗体包括所述CDR中的至少一个，如至少两个，如至少三个，如至少四个，如至少五个，如所有六个所述CDR。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述抗体包括所有三个轻链CDR和/或所有三个重链CDR。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变重链和可变轻链选自由以下组成的组：
a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
c)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
d)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
e)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
f)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
g)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
h)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
i)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
j)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
k)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
以及
l)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中：
a)所述第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：4、5、6或7的氨基酸序列组成；并且
b)所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸组成。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中：
a)所述第一结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成；并且
b)所述第二结合剂是抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，其包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸组成。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括可变轻链(VL)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括可变重链(VH)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括轻链CDR1的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR1包括或由SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：29具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括轻链CDR2的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR2包括或由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括轻链CDR3的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR3包括或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：23具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括重链CDR1的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR1包括或由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：24具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
17.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括重链CDR2的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR2包括或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：25的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：25具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
18.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂是包括重链CDR3的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR3包括或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
19.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括可变轻链(VL)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
20.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括可变重链(VH)的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：15具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
21.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括轻链CDR1的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR1包括或由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：30具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
22.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括轻链CDR2的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR2包括或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
23.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括轻链CDR3的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述轻链CDR3包括或由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：26的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：26具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
24.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括重链CDR1的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR1包括或由SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：27的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：27具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
25.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括重链CDR2的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR2包括或由SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：28具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二结合剂是包括重链CDR3的抗IL1RAP抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR3包括或由SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
27.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述第一结合剂相对于所述第二结合剂的比例在10:1和1:10之间，如在5:1和1:5之间，如在2:1和1:2之间，如在3:2和2:3之间，如在11:9和9:11之间，如1:1。
28.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂和第二结合剂是同种亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗体分子。
29.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物能够诱导细胞膜结合的IL1RAP的内化。
30.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一结合剂和/或所述第二结合剂缺乏诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。
31.一种双表位结合剂，其包括：
第一抗原结合区和
第二抗原结合区，
其中所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区结合人白细胞介素受体辅助蛋白(IL1RAP)的不同胞外结构域。
32.根据权利要求31所述的双表位结合剂，其中所述双表位结合剂是多肽。
33.根据权利要求31至32中任一项所述的双表位结合剂，其中所述双表位结合剂是抗体。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的双表位结合剂，
a)其中所述第一抗原结合区选自由以下组成的组：
i)抗原结合区，其与参考抗体“CAN04”结合相同的抗原；
ii)抗原结合区，其与所述抗体CAN04结合相同的表位；
iii)抗原结合区，其能够抑制所述抗体CAN04与人IL1RAP结合；
iv)能够结合IL1RAP的结构域2的抗原结合区；
v)包括或由以下组成的氨基酸序列：
所述抗体CAN04的可变轻链(VL)氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGINNYLNWYQQKPGKAPKLLIHYTSGLHAGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDVATYYCQQYSILPWTFGGGTKVEIKR(SEQID NO：1)和
可变重链(VH)氨基酸序列：DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYINYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO：4)，
vi)包括或由以下组成的氨基酸序列：
重链氨基酸序列SEQ ID NO：35和轻链氨基酸序列SEQ ID NO：36，
vii)氨基酸序列，其包括或由以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个组成：
轻链CDR1：SASQGINNYLN(SEQ ID NO：8)或ASQGINNYLN(SEQ ID NO：29)
轻链CDR2：YTSGLHAGV(SEQ ID NO：9)或YTSGLHA(SEQ ID NO：22)
轻链CDR3：QQYSILPWT(SEQ ID NO：10)或QYSILPWT(SEQ ID NO：23)
重链CDR1：GYAFTSSSWMN(SEQ ID NO：11)或GYAFTSS(SEQ ID NO：24)
重链CDR2：RIYPGDGNTHYAQKFQG(SEQ ID NO：12)或YPGDGN(SEQ ID NO：25)；
重链CDR3：GYLDPMDY(SEQ ID NO：13)；
以及
viii)上述(i)至(vi)的抗体的抗原结合片段；并且
b)其中所述第二抗原结合区选自由以下组成的组：
i)抗原结合区，其与参考抗体“CAN03”结合相同的抗原；
ii)抗原结合区，其与所述抗体CAN03结合相同的表位；
iii)抗原结合区，其能够抑制所述抗体CAN03结合人IL1RAP；
iv)抗原结合区，其能够结合IL1RAP的胞外结构域3；
v)包括或由以下组成的氨基酸序列：所述抗体CAN03的可变轻链(VL)氨基酸序列：DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQRRTNGSPRLLIKSASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQSNSWPTTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO：14)，
和可变重链(VH)氨基酸序列：DVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSIYTMSWVRQTPEKRLEWVATISIGGSYINYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCSREVDGSYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQID NO：15)，
vi)包括或由以下组成的氨基酸序列：
重链氨基酸序列SEQ ID NO：37和轻链氨基酸序列SEQ ID NO：38，
vii)抗原结合区，其包括以下六个互补决定区(CDR)中的至少一个：
轻链CDR1：RASQSIGTSIH
(SEQ ID NO：16)或ASQSIGTSIH(SEQ ID NO：30)
轻链CDR2：SASESIS(SEQ ID NO：17)
轻链CDR3：QQSNSWPTT(SEQ ID NO：18)或QSNSWPTT(SEQ ID NO：26)
重链CDR1：GFTFSIYTMS(SEQ ID NO：19)或GFTFSIY(SEQ ID NO：27)
重链CDR2：TISIGGSYINYPDSVKG(SEQ ID NO：20)或SIGGSY(SEQ ID NO：28)；
重链CDR3：EVDGSYAMDY(SEQ ID NO：21)；以及
viii)上述(i)至(vi)的抗体的抗原结合片段。
35.根据权利要求31至33中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区包括以下氨基酸序列，所述氨基酸序列包括或由所述重链氨基酸序列SEQ ID NO：35和所述轻链氨基酸序列SEQ ID NO：36组成，并且其中所述第二抗原结合区包括所述重链氨基酸序列SEQ ID NO：37和所述轻链氨基酸序列SEQ ID NO：38。
36.根据权利要求31和34中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区包括选自由以下组成的组的可变重链(VH)和可变轻链(VL)：
a)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
b)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
c)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
d)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：1的可变轻链(VL)；
e)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
f)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
g)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
h)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：2的可变轻链(VL)；
i)包括氨基酸序列SEQ ID NO：4的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
j)包括氨基酸序列SEQ ID NO：5的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
k)包括氨基酸序列SEQ ID NO：6的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)；
以及
l)包括氨基酸序列SEQ ID NO：7的可变重链(VH)和包括氨基酸序列SEQ ID NO：3的可变轻链(VL)。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的双表位结合剂，其中：
a)所述第一抗原结合区包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1、2或3的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：4、5、6或7的氨基酸序列组成；并且
b)所述第二抗原结合区包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸组成。
38.根据权利要求31至37中任一项所述的双表位结合剂，其中：
a)所述第一抗原结合区包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成；并且
b)所述第二抗原结合区包括：
轻链可变结构域(VL)，其包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成；以及
重链可变结构域(VH)，其包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：4具有至少60％序列同一性，如至少70％序列同一性，如至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
41.根据权利要求31至40中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有轻链CDR1，所述轻链CDR1包括或由SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：29的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：29具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
42.根据权利要求31至41中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有轻链CDR2，所述轻链CDR2包括或由SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：22具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
43.根据权利要求31至42中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有轻链CDR3，所述轻链CDR3包括或由SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：23具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
44.根据权利要求31至43中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有重链CDR1，所述重链CDR1包括或由SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：24具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
45.根据权利要求31至44中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有重链CDR2，所述重链CDR2包括或由SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：25的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：25具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
46.根据权利要求31至45中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第一抗原结合区具有重链CDR3，所述重链CDR3包括或由SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：13具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
47.根据权利要求31至46中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有可变轻链(VL)，所述可变轻链包括或由SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：14具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
48.根据权利要求31至47中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有可变重链(VH)，所述可变重链包括或由SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：15具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
49.根据权利要求31至48中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有轻链CDR1，所述轻链CDR1包括或由SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：30具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
50.根据权利要求31至49中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有轻链CDR2，所述轻链CDR2包括或由SEQ ID NO：17的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：17具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
51.根据权利要求31至50中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有轻链CDR3，所述轻链CDR3包括或由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：26的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：26具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
52.根据权利要求31至51中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有重链CDR1，所述重链CDR1包括或由SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：27的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：27具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
53.根据权利要求31至52中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有重链CDR2，所述重链CDR2包括或由SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：28的氨基酸序列，或分别与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：28具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
54.根据权利要求31至53中任一项所述的双表位结合剂，其中所述第二抗原结合区具有重链CDR3，所述重链CDR3包括或由SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：21具有至少80％序列同一性，如至少90％序列同一性，如至少95％序列同一性，如至少97％序列同一性，如至少98％序列同一性，如至少99％序列同一性的氨基酸序列组成。
55.根据权利要求31至54中任一项所述的双表位结合剂，其中所述双表位结合剂是双可变结构域抗体、双表位Fab片段、双表位scFv、双价双特异性抗体、单价双特异性抗体、“杵入臼式”双特异性抗体、scFv2_Fc双特异性抗体、BiTE/ScFv2双特异性抗体、DVD-Ig双特异性抗体、IgG-Fab双特异性抗体、FAb-IgG双特异性抗体、基于DART的双特异性抗体、DNL-Fab3双特异性抗体或scFv-HAS-scFv双特异性抗体。
56.一种组合物，其包括一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸共同或单独编码(i)如权利要求1所限定的第一结合剂和第二结合剂或(ii)根据权利要求31所述的双表位结合剂。
57.一种分离的多核苷酸，其编码(i)如权利要求1所限定的第一结合剂和第二结合剂或(ii)根据权利要求31所述的双表位结合剂。
58.一种表达载体，其包括一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸共同或单独编码(i)如权利要求1所限定的第一结合剂和第二结合剂或(ii)根据权利要求31所述的双表位结合剂。
59.一种宿主细胞，其包括一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸共同或单独编码(i)如权利要求1所限定的第一结合剂和第二结合剂或(ii)根据权利要求31所述的双表位结合剂。
60.一种宿主细胞，其包括一种或多种根据权利要求58所述的表达载体。
61.根据权利要求59至60中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核或原核宿主细胞。
62.一种药物组合物，其包括：权利要求1至30中任一项所述的组合物；根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求58所述的载体；或根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；以及药学上可接受的赋形剂。
63.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物；根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求58所述的载体；根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；或根据权利要求62所述的药物组合物，其用作药剂。
64.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物；根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求58所述的载体；根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；或根据权利要求62所述的药物组合物，其用作诊断和/或预后剂。
65.根据权利要求1至30中任一项所述的组合物；根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求58所述的载体；根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；根据权利要求62所述的药物组合物，其用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估哺乳动物中的IL1RAP相关联疾病或病症。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述IL1RAP相关联疾病或病症选自由以下组成的组：增殖性病症、自身免疫性病症和炎性病症，如自身炎性病症。
67.根据权利要求1至30或权利要求65至66中任一项所述的组合物；根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求58所述的载体；根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；或根据权利要求62所述的药物组合物，其用于治疗选自由以下组成的组的疾病或病症：增殖性病症、自身免疫性病症和炎性病症，如自身炎性病症。
68.根据权利要求66和68中任一项所述的组合物、双表位结合剂、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化症、动脉粥样硬化、硬皮病(全身性硬化症)、狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)、(急性)肾小球肾炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸窘迫综合征(ARDS)、炎性肠病、结肠炎、血管炎、葡萄膜炎、皮炎、特应性皮炎、脱发、鼻炎(过敏症)、过敏性结膜炎、重症肌无力、硬皮病、结节病、银屑病关节炎、银屑病、强直性脊柱炎、幼年特发性关节炎、格雷夫斯病(Graves’disease)、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、子宫内膜异位症、克罗恩病(Crohns disease)、贝切特病(
disease)、乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、家族性地中海热(FMF)、伴有反复发热的高免疫球蛋白D血症(HIDS)、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、低温蛋白相关周期性综合征(CAPS，如穆-韦二氏综合征(Muckle-Wells syndrome)、家族性寒冷性荨麻疹和新生儿发病)、多系统炎性疾病(NOMID)、周期性发热、口疮性口炎、咽炎和腺炎(periodicfever,aphthous stomatitis,pharyngitis and adenitis，PFAPA综合征)、布劳综合征(Blau syndrome)、化脓性无菌性关节炎、坏疽性脓皮病、痤疮(PAPA)、白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏(DIRA)、成人发病的斯蒂尔病(Still's disease)和全身发病的幼年特发性关节炎、心血管疾病。
69.根据权利要求66和68中任一项所述的组合物、双表位结合剂、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述疾病或病症是肿瘤性病症。
70.根据权利要求69所述的组合物、双表位结合剂、多核苷酸、载体、宿主细胞或药物组合物，其中所述肿瘤性病症选自由以下组成的组：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、肉瘤、慢性髓细胞白血病(CML)、骨髓增生性病症(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)。
71.一种根据权利要求1至30中任一项所述的组合物；或根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；或根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；或根据权利要求58所述的载体；或根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；或根据权利要求62所述的药物组合物在制备用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估哺乳动物中的IL1RAP相关联疾病或病症的药剂中的用途。
72.一种治疗、改善、预防、诊断或预后评估IL1RAP相关联疾病或病症的方法，其包括将根据权利要求1至30中任一项所述的组合物；或根据权利要求31至55中任一项所述的双表位结合剂；或根据权利要求56至57中任一项所述的多核苷酸；或根据权利要求58所述的载体；或根据权利要求59至61中任一项所述的宿主细胞；或根据权利要求62所述的药物组合物给药于需要其的受试者。
73.一种根据权利要求1至30中任一项所限定的对IL1RAP具有特异性的第一结合剂，其用于治疗、改善、预防、诊断或预后评估哺乳动物中的IL1RAP相关联疾病或病症，其中所述第一结合剂与对IL1RAP具有特异性的一种或多种其它结合剂结合使用，其中所述第一结合剂和其它结合剂结合IL1RAP的至少两个不同胞外结构域。
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