CN116724055A - 抗il1rap抗体 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及一种对白细胞介素‑1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段。此外，它涉及编码所述抗体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体，以及包含所述多核苷酸或所述载体的重组宿主细胞。此外，它涉及用于产生所述抗体或抗原结合片段的方法。此外，它涉及包含所述抗体或抗原结合片段、所述多核苷酸、所述载体和/或所述宿主细胞的组合物。此外，它涉及所述抗体或抗原结合片段、所述多核苷酸、所述载体、所述宿主细胞和/或所述组合物，其用于医药中，和/或用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患，所述疾病或疾患对用IL‑1α、IL‑1β、IL‑33、IL‑36α、IL‑36β和/或IL‑36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者其中所述疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
Description
技术领域
本发明涉及具有抗炎、抗纤维化和/或抗肿瘤特性的抗IL1RAP抗体或其片段，并且涉及其在与IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导相关联的疾病或疾患的预防、治疗、缓解、检测和/或诊断中的用途。
背景技术
白细胞介素-1(IL-1)家族的细胞因子配体及其受体与炎症、自身免疫、免疫调节、纤维化、细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤转移和宿主防御相关联。它导致炎性、自身免疫性、免疫调节性、纤维化和退行性疾病和疾患的病理学，以及导致细胞增殖性或肿瘤疾病或疾患，诸如癌症(Garlanda C,白细胞介素-1家族：回到未来。(The interleukin-1 family:back tothe future.)《免疫(Immunity)》,39:1003-1018(2013))。
所有这些疾病对个体和社会造成巨大负担，并且仍然需要用于治疗、改善、预防、诊断或检测与IL-1家族的细胞因子配体和受体相关联的炎性、自身免疫性、免疫调节性、纤维化、退行性和细胞增殖性疾病或疾患的疗法。
IL-1家族包含许多激动剂细胞因子，其包括IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ，并且这些细胞因子中的每种细胞因子均与它们的特异性IL-1家族细胞膜受体结合。在细胞因子与其同源受体结合后，一种称为IL-1受体辅助蛋白(IL1RAP)的共受体被募集以形成受体复合物，该受体复合物触发细胞内信号转导和一组转录因子(包括NF-κB)的活化，这会触发炎性应答。IL1RAP是针对IL-1受体I(IL1R1；结合IL-1α和IL-1β)、IL-33受体(ST2、IL1RL1；结合IL-33)和IL-36受体(IL1RL2；结合IL-36α、IL-36β和IL-36γ)的共受体，并且是细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ下游的信号转导所必需的。
与IL1RAP结合的抗体可以阻断IL1RAP依赖性受体下游的细胞因子信号传导。有趣的是，除了该阻断功能外，结合IL1RAP的抗体还可以用于其他功能，例如用于诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，从而导致杀伤靶细胞，诸如表达IL1RAP的肿瘤细胞。
过去，已经生成了能够减少、抑制和/或阻断IL-1家族细胞因子配体的信号传导通路的抗体，这取决于相应抗体的特性。例如，WO 2015/132602公开了一种抗IL1RAP抗体，其将IL-1α、IL-1β和IL-33的信号传导抑制到不同程度。
阻断所有六种细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ)预期有益于靶向IL-1家族的细胞因子配体和受体的治疗方法。IL-1α和IL-1β为两种有效的促炎细胞因子，并且这些促炎细胞因子在急性炎症中的参与已经被广泛描述。IL-33传统上被认为是一种Th2细胞因子，其诱导2型细胞因子(诸如IL-5和IL-13)的产生。IL-36的功能的描述不太充分，但若干研究表明IL-36参与免疫细胞活化并且诱导促炎细胞因子的释放。通过靶向所有这些细胞因子的通路，将实现疾病相关的过程(例如炎性过程)的更完全下调，这将改善患有炎性疾病或疾患的患者的治疗结果。
迄今为止，缺乏解决与白细胞介素-1(IL-1)家族的细胞因子配体和受体相关联的疾病或疾患(诸如与IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导相关联的那些疾病或疾患)的各个方面的治疗选项。当前的治疗仅靶向与不同IL-1家族细胞因子配体相关联的独立通路，并且同时下调与IL-1家族细胞因子配体相关联的若干通路(例如在炎性和纤维化方面)仍然是一个临床挑战。因此，仍然迫切需要经改善的疗法，该经改善的疗法靶向与IL-1家族的细胞因子配体和受体相关联的多个方面。
发明内容
本发明的发明人已经生成了抗体及其变体，其与IL-1RAP结构域2结合，该结构域具有抑制六种IL1RAP依赖性配体下游的信号传导的能力；IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ。由于这种优越的特性，该抗体可以用于预防、治疗、缓解、检测和/或诊断与IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导相关联的疾病或疾患，从而同时靶向与这些细胞因子相关联的若干下游通路。因此，该抗体可以用于靶向与IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导相关联的疾病和疾患的若干方面和过程，例如炎性或纤维化疾病或疾患中的炎性和纤维化方面，或者肿瘤疾病或疾患中的炎性、纤维化或增殖性方面。此处描述的抗体允许同时靶向多个细胞因子通路，例如靶向IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的通路，这在治疗疾病或疾患时(其中仅阻断一种或几种细胞因子不足以有效治疗或预防疾病或疾患)具有临床优势。进一步公开了通过人源化和去免疫化程序来优化该抗体，这产生具有微调特性的抗体变体。
本发明的第一方面涉及一种对白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：
轻链可变区，其包含
a)CDR-L1，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQ ID NO:13)；
b)CDR-L2，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ ID NO:8)和KASTLPS(SEQ ID NO:14)；以及
c)CDR-L3，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)、QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)；
和/或
重链可变区，其包含
d)CDR-H1，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:10)和GPSLSHFDIT(SEQID NO:16)；
e)CDR-H2，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；以及
f)CDR-H3，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
本发明的第二方面涉及一种多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，或其组件多肽链。
本发明的第三方面涉及一种载体，该载体包含根据本发明的第二方面的多核苷酸。
本发明的第四方面涉及一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据本发明的第二方面的多核苷酸或根据本发明的第三方面的载体。
本发明的第五方面涉及一种用于产生本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括在允许表达经编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的第四方面的宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的第二方面的多核苷酸或本发明的第三方面的载体。
本发明的第六方面涉及一种药物组合物，其包含
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，和/或
本发明的第四方面的宿主细胞，
在药物组合物中，其中组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
本发明的第七方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于医药中。
本发明的第八方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，其用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者
其中疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
本发明的第九方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于诱导受试者中与肿瘤疾患相关联的病理细胞或其干细胞或祖细胞的细胞死亡和/或抑制受试者中与肿瘤疾患相关联的病理细胞或其干细胞或祖细胞的生长和/或增殖，其中细胞表达IL1RAP。
本发明的第十方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其在制备用于预防、治疗、缓解、检测和/或诊断疾病或疾患的药物中的用途，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，
并且/或者其中疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
本发明的第十一方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其在制备用于检测和/或诊断疾病或疾患的药物中的用途，该疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
本发明的第十二方面涉及一种用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患的方法，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者其中疾病或疾患与受试者中表达IL1RAP的细胞相关联，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第十三方面涉及一种用于检测受试者中表达IL1RAP的细胞的体外方法，该方法包括：
(a)提供来自待测试的受试者的细胞的样品，诸如活检组织或血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化样品中存在的细胞；
(c)使本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段与样品中存在的细胞接触；
(d)确定抗体或其抗原结合片段是否与细胞结合
其中抗体或其抗原结合片段与细胞的结合指示受试者的组织中存在与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患。
本发明的第十四方面涉及一种用于鉴别患有与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患的患者的体外方法，该患者将受益于用本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段进行的治疗，该方法包括:
(a)提供细胞的样品，诸如来自待测试的患者的活检组织或血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化所述样品中存在的所述细胞；
(c)使本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段与样品中存在的细胞接触；
(d)确定抗体或其抗原结合片段是否与细胞结合
其中抗体或其抗原结合片段与表达IL1RAP的细胞的结合指示将受益于用本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段进行的治疗的患者。
本发明的第十五方面涉及一种用于治疗患有与细胞表达IL1RAP相关联的疾病或疾患的患者的方法，该方法包括：
a)选择使用根据本发明的第十四方面的方法被鉴别为患有与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患的患者；以及
b)向所述患者施用有效治疗所述疾病或疾患的治疗剂。
本发明的第十六方面涉及一种用于检测表达IL1RAP的细胞的方法，该方法包括：
(a)使根据第一方面的抗体或其抗原结合片段与待分析其IL1RAP表达的细胞接触；
(b)确定抗体或其抗原结合片段是否与细胞结合
其中抗体或其抗原结合片段与细胞的结合指示受试者的组织中存在与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患。
本发明的第十七方面涉及一种用于减轻患有腹膜炎的受试者中炎症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第十八方面涉及一种用于减轻患有银屑病或银屑病关节炎的受试者中的疾病严重性的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第十九方面涉及一种用于减轻患有动脉粥样硬化的受试者中的动脉粥样硬化斑块炎症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十方面涉及一种用于减少患有动脉粥样硬化的受试者中的动脉粥样硬化斑块体积和/或动脉粥样硬化斑块大小的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十一方面涉及一种用于减轻患有心肌炎的受试者中的炎症和/或纤维化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十二方面涉及一种用于抵消患有心肌炎或自身免疫性心肌炎的受试者中的心脏功能恶化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十三方面涉及一种用于减轻患有系统性硬化症的受试者中的皮肤纤维化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十四方面涉及一种用于减轻患有系统性硬化症的受试者中的肺纤维化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
附图说明
图1：抗IL1RAP抗体mCAN10在急性腹膜炎模型中减轻炎症
WT或KO小鼠用MSU晶体免疫化，并且在免疫后6小时，对腹腔灌洗液执行流式细胞术，以用于浸润细胞(A)的定量。在用MSU晶体免疫化前仅1小时，WT小鼠用mCAN10、IL1RA、同种型对照抗体(同种型)或PBS进行处理。在免疫后六小时，为流式细胞术收集腹腔灌洗液，以用于浸润细胞(B)的定量，或用于通过Luminex测定来进行细胞因子和趋化因子(C)的定量。
图2：抗IL1RAP抗体mCAN10在银屑病和银屑病关节炎模型中减轻疾病严重性
通过在小鼠剃光的背部上施用咪喹莫特7天，在BALB/c小鼠中诱导银屑病。在此期间，小鼠用mCAN10、抗IL-1β抗体(抗IL-1β)、同种型对照抗体(同种型抗IL-1β、同种型mCAN10)、地塞米松或仅PBS(媒介物)处理三次。通过对背部区域的炎症和红斑进行评分，在整个7天期间评估疾病严重性(A和B)。通过施用来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的甘露聚糖，在B6N.Q.NCF1小鼠中诱导银屑病关节炎。小鼠如在A和B中那样进行处理，并且在整个7天期间通过对所有爪子的关节炎症进行评分来评估该小鼠的疾病严重性(C和D)。在第7天，处死小鼠并且收集血液以用于血浆中的IL-17水平的分析(E)。
图3：mCAN10在动脉粥样硬化模型中减轻主动脉斑块炎症
通过用高胆固醇饮食(HCD)喂食小鼠，在载脂蛋白E(Apoe)KO小鼠中诱导动脉粥样硬化病变的发展。在喂食HCD持续4周后，小鼠每周两次用mCAN10或同种型对照抗体(Iso)进行处理，持续6周。在此期间，小鼠保持喂食HCD。在实验结束时，处死小鼠并且收集主动脉，以用于总CD45+细胞(A)、骨髓细胞(诸如CD11b+细胞和Ly6G+中性粒细胞)(B和C)以及T淋巴细胞(诸如TCR-β+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞)(D-F)的流式细胞术分析。
图4：mCAN10在动脉粥样硬化模型中减小主动脉斑块的大小
如图3所述处理小鼠。在实验结束时，处死小鼠，收集心脏，并且针对脂质堆积，通过油红O将主动脉根处的切片进行染色，以用于比较斑块体积(A)和面积(B)。
图5：抗IL1RAP抗体mCAN10减轻实验性自身免疫性心肌炎(EAM)中的炎症和纤维化
通过用在完全弗氏佐剂中乳化的α-肌球蛋白重链肽进行免疫化两次，在BALB/c小鼠中诱导EAM。从最终免疫化后第7天开始，小鼠每周两次用mCAN10、同种型对照抗体(同种型)或仅PBS进行处理，持续4周。在实验结束时，处死小鼠，收集心脏，心脏切片用H&E染色法进行染色以评估炎症程度(A和B)，或通过马松氏三色染色法以评估纤维化程度(C和D)。
图6：抗IL1RAP抗体mCAN10抵消实验性自身免疫性心肌炎中的心脏功能恶化
通过用在完全弗氏佐剂中乳化的α-肌球蛋白重链肽进行免疫化两次，在BALB/c小鼠中诱导EAM。从最终免疫化后的那天(第7天)开始，小鼠每周两次用mCAN10、抗IL-1β抗体(抗IL-1β)或同种型对照抗体(同种型抗IL-1β、同种型mCAN10)进行处理，持续5周(A)。可替代地，小鼠每天用mCAN10、同种型对照抗体(同种型mCAN10)、IL1RA、泼尼松或媒介物对照(媒介物IL1RA、媒介物泼尼松)进行处理，持续5周(B)。任选地，小鼠如在A中那样接受了mCAN10、同种型对照抗体(同种型)或媒介物对照(PBS)，但从最终免疫化后第7天(第14天)开始进行处理(C)。在研究开始时并且在第28天和第42天，心脏功能通过经胸超声心动图来进行评估。
图7：mCAN10在硬皮病慢性移植物抗宿主病(scl cGvHD)的小鼠模型中改善皮肤纤维化
雌性BALB/c(H-2d)受体小鼠以同种异基因移植方式接受了来自雄性B10.D2供体小鼠(H-2d)的骨髓，以创建将发展为scl cGvHD的MHC失配模型。作为对照，相同的受体小鼠以同基因移植方式接受了来自雌性BALB/c(H-2d)供体小鼠的骨髓，从而未导致疾病发展。在移植后21天开始处理，并且小鼠腹膜内(i.p.)接受了mCAN10(第一剂量为20mg/kg；后续剂量为10mg/kg)或相同剂量的同种型对照抗体(Iso)，每周两次，持续4周。可替代地，这些小鼠每天用50mg/kg的尼达尼布口服(p.o.)进行处理，持续4周。接受同基因移植物的小鼠仅用同种型对照抗体(Iso)进行处理。在第49天处死小鼠，收集来自上背部的皮肤样品，以用于进行组织学评估以分析皮肤厚度(A)和成纤维细胞数量(B)，或用于羟脯氨酸含量(C)的定量。
图8：mCAN10在scl cGvHD的小鼠模型中改善肺纤维化
如图7所述处理小鼠。在移植后第49天处死小鼠后，收集肺，以用于进行组织学评估以确定Ashcroft评分(A)和由天狼星红染色的区域(B)，或用于羟脯氨酸含量(C)的定量。
图9：mCAN10在scl cGvHD的小鼠模型中改善体重减轻
如图7所述处理小鼠。移植后，小鼠在研究期间连续称重，该研究在移植后49天完成。
图10：mCAN10在scl cGvHD的小鼠模型中改变IL-1家族基因表达谱
如图7所述处理小鼠。在移植后第49天处死小鼠后，来自上背部的皮肤样品用于RNA测序以生成热图，该热图将所指示的IL-1家族成员的基因表达水平的变化可视化。示出了来自每个组的四个样品的结果，同种异基因移植小鼠(Allo)、同基因移植小鼠(Syn)和用mCAN10处理的同种异基因移植小鼠(处理)。
图11：在scl cGvHD的小鼠模型中，mCAN10改变了在系统性硬化症患者中也进行差异表达的基因的表达
如图7所述处理小鼠。在移植后第49天处死小鼠后，来自上背部的皮肤样品用于RNA测序分析。从患者群组NCBI/GEO/GSE130955中检索系统性硬化症(SSc)患者的转录组学谱，在该患者群组中包括143名患者和22名健康个体。重叠基因的数量通过维恩图而可视化。
图12：嵌合48D2与细胞膜IL1RAP的剂量依赖性结合
将嵌合48D2或hIgG1(hIg＝人免疫球蛋白)同种型对照抗体以增加的浓度添加到SKMEL-5细胞，并且将胞外结合通过流式细胞术来进行分析。与hIgG1同种型对照抗体相比，嵌合48D2以剂量依赖性方式特异性结合细胞膜上的IL1RAP，并且具有更高的平均荧光强度(MFI)。
图13：嵌合48D2对白细胞介素信号传导的抑制
在HEK-Blue测定中研究了嵌合48D2阻断IL-1α(A)、IL-1β(B)、IL-33(C)、IL-36α(D)、IL-36β(E)和IL-36γ(F)信号传导的能力。hIgG1同种型抗体作为对照被包括在内。虚线示出阳性(用细胞因子刺激的细胞)和阴性(仅细胞)对照，以说明抑制的窗口。嵌合48D2阻断所有六种细胞因子下游的信号传导。
图14：嵌合48D2结合人、食蟹猴和猪IL1RAP
嵌合48D2与IL1RAP同源基因序列的交叉反应性通过ELISA来进行测量。嵌合48D2与人(hIL1RAP)、食蟹猴(mfIL1RAP)和猪(ssIL1RAP)IL1RAP交叉反应，但不与小鼠(mIL1RAP)、大鼠(rnIL1RAP)、兔(ocIL1RAP)或狗(clIL1RAP)IL1RAP交叉反应。
图15：人源化48D2变体对白细胞介素信号传导的抑制
在HEK-BlueTM测定中研究了人源化(h)48D2 VH变体VH1、VH2、VH3、VH4和VH5与VL变体VL1、VL2、VL3、VL4和VL5组合阻断IL-1α(A-E)、IL-1β(F-J)和IL-33(K-O)信号传导的能力。含有VH5的h48D2变体以与嵌合48D2类似的程度阻断下游信号传导，并且进一步研究了该变体对IL-36α(P)、IL-36β(Q)和IL-36γ(R)的抑制。含有VH1、VH2、VH3或VH4的h48D2变体在不同程度上抑制了IL-1α、IL-1β和IL-33的信号传导。hIgG1同种型抗体和嵌合48D2作为对照被包括在内。虚线示出阳性(用细胞因子刺激的细胞)和阴性(仅细胞)对照，以说明抑制的窗口。含有VH5的h48D2变体与任何VL变体(VL1-VL5)组合，以与嵌合48D2类似的程度阻断所有六种白细胞介素的下游信号传导。
图16：两种人源化和去免疫化克隆与细胞膜IL1RAP的剂量依赖性结合
将人源化和去免疫化48D2克隆h48D2 VH5.GL:VL4和h48D2 VH5.GL:VL5.GL中的两者以增加的浓度添加到SKMEL-5细胞，并且将胞外结合通过流式细胞术来进行分析。嵌合48D2和hIgG1同种型抗体作为对照被包括在内。与hIgG1同种型对照抗体和嵌合48D2抗体相比，h48D2 VH5.GL:VL4和h48D2 VH5.GL:VL5.GL以剂量依赖性方式特异性结合细胞膜上的IL1RAP，并且具有更高的平均荧光强度(MFI)。
图17：去免疫化h48D2克隆已经保留了对所有六种白细胞介素通路的抑制活性
在HEK-BlueTM测定中评估了去免疫化h48D2克隆对IL-1α(A)、IL-1β(B)、IL-33(C)、IL-36α(D)、IL-36β(E)和IL-36γ(F)信号传导的抑制活性。hIgG1同种型抗体以及h48D2VH5:VL4和h48D2 VH5:VL5作为对照被包括在内。虚线示出阳性(用细胞因子刺激的细胞)和阴性(仅细胞)对照，以说明抑制的窗口。所有六种去免疫化克隆均具有与h48D2VH5:VL4和VH5:VL5类似的抑制活性。在HEK-BlueTM中进一步评估了h48D2变体VH5.GL:VL4对IL-33(G)、IL-36α(H)、IL-36β(I)、IL-36γ(J)的抑制活性，其中IL-36受体稳定表达。
图18：去免疫化h48D2克隆结合人、食蟹猴和猪IL1RAP
交叉反应性通过ELISA来进行测量。h48D2 VH5.GL:VL4(A)和VH5.GL:VL5.GL(B)与人(hIL1RAP)、食蟹猴(mfIL1RAP)和猪(ssIL1RAP)IL1RAP交叉反应，但不与小鼠(mIL1RAP)、大鼠(rnIL1RAP)、兔(ocIL1RAP)或狗(clIL1RAP)IL1RAP交叉反应。
图19：呈hIgG1格式的48D2诱导表达IL1RAP的SKMEL-5细胞的ADCC
用表达IL1RAP的SKMEL-5细胞和人NK细胞在体外执行ADCC测定，并且垂死的SKMEL-5细胞的数量通过流式细胞术来进行分析并且示出为死亡(DAPI阳性)细胞％。呈hIgG1格式的48D2可以引导NK细胞以剂量依赖性方式杀伤SKMEL-5细胞。当48D2以hIgG1-LALA格式进行表达时，不会诱导剂量依赖性ADCC。与在未处理细胞中观察到的背景细胞死亡相比，同种型hIgG1和同种型LALA并未诱导更大的ADCC。
图20：48D2抑制人皮肤成纤维细胞中细胞因子诱导的IL-6mRNA表达
原代人皮肤成纤维细胞在体外培养并且用IL-1α或IL-1β(A)或者IL-36α、IL-36β或IL-36γ(B)刺激，其中添加或不添加嵌合48D2。与未刺激的对照(0ng/mL)相比，数据示出为倍数变化(2-ddCT)。所有细胞因子均以剂量依赖性方式诱导了IL-6mRNA表达，并且48D2将增加抑制到与未刺激的对照相当的水平。
图21：VH5.GL:VL4抑制人全血中IL-1β诱导的细胞因子和趋化因子释放
血液从两个人类供体进行收集并且与VH5.GL:VL4一起孵育30min。血液随后用IL-1β或脂多糖(LPS)刺激20小时。将板离心，并且收集血浆层，以用于通过人细胞因子/趋化因子71-Plex Discovery Assay Array来进行分析。针对两个供体中的一个供体，示出了G-CSF(A)、GROα/CXCL1(B)、IL-17A(C)和TNF-α(D)的水平。
图22：VH5.GL:VL4抑制血液循环系统中IL-1β诱导的细胞因子释放
血液从十个人类供体进行收集，并且转移到血液循环系统。以32μg/ml的浓度向血液施用VH5.GL:VL4，并且15min后以1ng/ml的浓度添加IL-1β。将循环运行4小时。从血液样品中获得血浆，并且使用来自MSD的技术来测量IL-6(A)和IL-8(B)的水平。
图23：VH5.GL:VL4由表达IL1RAP的细胞来进行内化
WT和IL1RAP KO SKMEL细胞与荧光缀合的VH5.GL:VL4或同种型对照(Iso Ctrl)在Ibidi处理显微镜室载玻片中一起孵育1小时、2小时或4小时。细胞核由DAPI染色。对穿过细胞的扫描光学切片执行交互式视觉分析，并且捕获代表性图像以评估VH5.GL:VL4的膜结合和内化作用(由箭头指示)。
图24：VH5.GL:VL4在由表达IL1RAP的细胞进行内化后定位于溶酶体或核内体
WT SKMEL细胞与荧光缀合的VH5.GL:VL4在Ibidi处理显微镜室载玻片中一起孵育1小时、2小时或4小时。针对标志物EEA1和Lamp1将细胞另外进行染色，以分别检测核内体和溶酶体。细胞核由DAPI染色。对穿过细胞的扫描光学切片执行交互式视觉分析，并且捕获代表性图像以评估VH5.GL:VL4染色与EEA1和Lamp1染色的重叠。
图25：呈hIgG1-LALA格式的VH5.GL:VL4不诱导Fc介导的细胞因子释放
血液从十个人类供体进行收集，并且转移到血液循环系统。如图所指示的，将VH5.GL:VL4以增加的浓度添加到血液。可替代地，添加抗CD52抗体阿仑单抗。将循环运行4小时。从血液样品中获得血浆，并且使用来自MSD的技术来测量IFN-γ(A)、IL-6(B)、IL-8(C)和TNF-α(D)的水平。
图26：呈hIgG1-LALA格式的VH5.GL:VL4不诱导Fc介导的补体活化
血液从十个人类供体进行收集，并且转移到血液循环系统。如图所指示的，将VH5.GL:VL4以增加的浓度添加到血液。可替代地，添加抗CD52抗体阿仑单抗。将循环运行15min。从血液样品中获得血浆，并且使用来自瑞博奥(RayBiotech)公司的ELISA试剂盒通过测量补体裂解产物C3a(A)和C5a(B)来分析补体活化。
图27：向食蟹猴单次静脉内施用后，VH5.GL:VL4的血清浓度
对于所评估的每个剂量水平，VH5.GL:VL4以5mg/kg、20mg/kg或50mg/kg的浓度作为单剂量静脉内施用给一只雄性(M)和一只雌性(F)食蟹猴。在施用后0.083小时、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、264小时和336小时处收集血液样品，并且获得血清。将血清样品转移到IL1RAP涂覆的MSD板，并且通过添加与电化学发光标记缀合的抗人IgG抗体并测量发射光的强度来检测样品中的VH5.GL:VL4。
图28：向食蟹猴单次静脉内或皮下施用后，VH5.GL:VL4的血清浓度
VH5.GL:VL4以10mg/kg的浓度作为单剂量静脉内或皮下施用给两只雌性食蟹猴。在施用后0.083小时、0.5小时、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、264小时、336小时、480小时和672小时处收集血液样品，并且获得血清。将血清样品转移到IL1RAP涂覆的MSD板，并且通过添加与电化学发光标记缀合的抗人IgG抗体并测量发射光的强度来检测样品中的VH5.GL:VL4。
具体实施方式
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”可以包含复数个提及物。因此，例如，提及“抗体”包括多种此类抗体，诸如一种或多种抗体、至少一种抗体或者两种或更多种抗体。类似地，“抗IL1RAP抗体(antibody)”也可以是指“抗IL1RAP抗体(antibodies)”，如例如在实例9至22中描述的抗体变体。
术语“一些实施例”可以包括一个或多于一个实施例。
在权利要求书和/或说明书中，当在整个文本中或结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以意指“一个/一种(one)”，但其还与“一个或多个/一种或多种(one or more)”、“至少一个/至少一种(at least one)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”的含义一致。
IL1RAP抗体
本发明的第一方面涉及一种对白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含：
轻链可变区，其包含
a)CDR-L1，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA
(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQ ID NO:13)；
b)CDR-L2，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ ID NO:8)和KASTLPS
(SEQ ID NO:14)；和/或
c)CDR-L3，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)、
QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:
15)；
和/或
重链可变区，其包含
d)CDR-H1，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:10)和GPSLSHFDIT(SEQID NO:16)；
e)CDR-H2，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；以及
f)CDR-H3，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含
a)CDR-L1，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQ ID NO:13)；
b)CDR-L2，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ IDNO:8)和KASTLPS(SEQ ID NO:14)；以及
c)CDR-L3，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ IDNO:3)、QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)；
和/或
重链可变区，其包含
d)CDR-H1，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:10)和GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)；
e)CDR-H2，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；以及
f)CDR-H3，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQID NO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
如本文所用，术语“白细胞介素-1受体辅助蛋白”、“IL1RAP”和“IL1-RAP”具体地包括人IL1RAP蛋白，例如如以下文献中描述的：GenBank登录号AAB84059、NCBI参考序列：NP_002173.1和UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NPH3-1。IL1RAP在科学文献中也称为IL1R3、C3orf13、FLJ37788、IL-1RAcP和EG3556。
如本文所用，术语“mCAN10”(“鼠CAN10”的缩写)是指针对鼠IL1RAP的抗体。该抗体也表示为鼠替代抗IL1RAP抗体。mCAN10能够阻断由IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ进行的信号传导。因此，mCAN10可以作为抗人IL1RAP抗体的替代物而用于评估鼠疾病模型中IL1RAP阻断的治疗功效，该抗体可能缺乏与小鼠IL1RAP的交叉反应性并且具有类似的功能特性。
如本文所用，术语“48D2”是指针对人IL1RAP的抗体，尽管该抗体也可以与来自其他物种的IL1RAP结合。例如，从实例10可以理解，48D2与来自人、食蟹猴和猪的IL1RAP具有交叉反应性。从实例9和实例10可以理解，术语“48D2”可以用于表示如实例9所述获得的并且在实例10中表征的嵌合抗体(也称为“ch48D2”)。
如本文所用，术语“h48D2”是指已经人源化抗体48D2，该抗体如在实例11中生成并且如实例12中进一步表征。如实例12所述，已经获得了h48D2的若干变体(参见例如表8)。如实例13所述，已经通过去免疫化获得了h48D2的若干其他变体。
应当理解，“本发明的抗体或抗原结合片段”可以称为“本发明的多肽”或“抗体多肽或其抗原结合片段”，因为抗体及其片段为多肽。
本发明的抗体或抗原结合片段对IL1RAP具有特异性。“特异性”意指抗体或抗原结合片段能够在体内(即IL1RAP在人体内存在的生理条件下)与IL1RAP结合。优选地，抗体或抗原结合片段在体内不与任何其他蛋白质结合。可替代地，这意味着抗体或抗原结合片段能够离体或在体外与IL1RAP结合。此类结合特异性可以通过本领域众所周知的方法(诸如ELISA、免疫组织化学、免疫沉淀、蛋白质印迹和流式细胞术，其使用表达IL1RAP的转染细胞)来确定。有利地，抗体或抗原结合片段能够与IL1RAP选择性地结合，即它与IL1RAP的结合比与任何其他蛋白质的结合强至少10倍。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与人IL1RAP结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与非人IL1RAP结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与来自食蟹猴的IL1RAP结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与来自猪的IL1RAP结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与在细胞的表面上表达的IL1RAP结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与IL1RAP的胞外结构域上的表位结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与可溶性IL1RAP结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段与IL1RAP的结构域2结合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段在IL1RAP的氨基酸135至234处或内与IL1RAP结合。
因此，抗体或抗原结合片段可能能够与表位结合，该表位位于IL1RAP的结构域2处/内(参见Wang等人,2010,《自然免疫学(Nature Immunology)》,11:905-912，所述文献的公开内容通过引用并入本文)，即位于IL1RAP的氨基酸135至234内(参见UniProtKB/Swiss-Prot内的登录号Q9NPH3)。例如，与抗体或抗原结合片段的表位可以位于IL1RAP的氨基酸135至154、155至174、175至194、195至214内、或氨基酸215至234之间或氨基酸174至191之间。然而，应当理解，表位可以是非线性的。
在其他实施例中，如上文所讨论的，本发明的抗体或抗原结合片段包含抗体模拟物或由抗体模拟物组成，该抗体模拟物选自包含以下项或由以下项组成的组：亲和体、四连接素(CTLD)、adnectin(单体)、anticalin、DARPin(锚蛋白)、avimer、iMab、微体、肽适体、Kunitz结构域和affilin。
术语“抗体或其抗原结合片段”包括基本上完整的抗体以及抗体的片段和衍生物。完整抗体可以被认为是包含可变轻区、可变重区、恒定轻区和恒定重区的抗体。该术语进一步包括嵌合抗体、人源化抗体、分离的人抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和异二聚体，及其抗原结合片段和衍生物。合适的抗原结合片段和衍生物包括但不一定限于Fv片段(例如单链Fv和二硫键结合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)、单可变结构域(例如VH和VL结构域)和结构域抗体(dAb，其包括单一格式和双重格式[即dAb-接头-dAb])。使用抗体片段而不是整个抗体的潜在优势是多方面的。片段的较小大小可能导致经改善的药理学特性，诸如更好地穿透实体组织。此外，抗原结合片段(诸如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段)可以在大肠杆菌中表达并且从大肠杆菌中分泌，从而允许容易地产生大量所述片段。
短语“抗体或其抗原结合片段”也旨在涵盖抗体模拟物(例如，具有高度稳定性但允许在某些位置处引入可变性的非抗体支架结构)。生物化学领域的技术人员将熟悉许多此类分子，如以下文献中所讨论：Gebauer&Skerra,2009,《生物技术当代视点(Curr OpinChem Biol)》13(3):245–255(所述文献的公开内容通过引用并入本文)。示例性抗体模拟物包括：亲和体(也称为Trinectin；Nygren,2008,FEBS J,275,2668-2676)；CTLD(也称为Tetranectin；《制药技术创新(Innovations Pharmac.Technol.)》(2006),27-30)；adnectin(也称为单体；《分子生物学方法(Meth.Mol.Biol.)》,352(2007),95-109)；anticalin(《今日药物发现(Drug Discovery Today)》(2005),10,23-33)；DARPin(锚蛋白；《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》(2004),22,575-582)；avimer(《自然生物技术》(2005),23,1556-1561)；微体(FEBS J,(2007),274,86-95)；肽适体(《生物疗法专家视点(Expert.Opin.Biol.Ther.)》(2005),5,783-797)；Kunitz结构域(《药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》(2006)318,803-809)；affilin(《生物技术趋势(Trends.Biotechnol.)》(2005),23,514-522)；affimer(Avacta生物科技，韦瑟比，英国(Avacta Life Sciences,Wetherby,UK))。
本发明的范围内还包括嵌合T细胞受体(也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体和嵌合抗原受体或CAR)(参见Pule等人.,2003,《细胞疗法(Cytotherapy)》5(3):211–26，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。这些是工程化受体，其可以将任意特异性移植到免疫效应细胞上。通常，CAR用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；其中由逆转录病毒载体来促进其编码序列的转移。此类分子最常见的形式是包含单链可变片段(scFv)的融合物，该片段衍生自与CD3-ζ跨膜和胞内域融合的单克隆抗体。当T细胞表达该融合分子时，它们会识别并且杀伤表达经转移的单克隆抗体特异性的靶细胞。
本领域技术人员将进一步理解，本发明还涵盖抗体及其抗原结合片段的经修饰的形式，无论存在于现在还是将来，例如通过聚乙二醇或另一种合适的聚合物的共价连接来进行修饰(参见下文)。
生成抗体和抗体片段的方法是本领域众所周知的。例如，抗体可以经由若干方法中的任何一种方法生成，该方法采用诱导抗体分子的体内产生、筛选免疫球蛋白文库(Orlandi等人,1989.《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》86:3833-3837；Winter等人,1991,《自然(Nature)》349:293-299，所述文献的公开内容通过引用并入本文)或通过培养物中的细胞系来生成单克隆抗体分子。这些包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和艾巴氏病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler等人,1975.《自然》256:4950497；Kozbor等人,1985.《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》81:31-42；Cote等人,1983.《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》80:2026-2030；Cole等人,1984.《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》62:109-120，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
用于生产单克隆抗体的合适方法也公开于以下文献中：“单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies:A manual of techniques)”，H Zola(CRC出版社,1988，所述文献的公开内容通过引用并入本文)和“单克隆杂交瘤抗体：技术及应用(MonoclonalHybridoma Antibodies:Techniques and Applications)”,J G R Hurrell(CRC出版社，1982，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
同样，可以使用本领域众所周知的方法来获得抗体片段(参见，例如，Harlow&Lane,1988,“抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)”，纽约冷泉港实验室，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。例如，根据本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过编码该片段的DNA在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其他蛋白质表达系统)中的表达来进行制备。可替代地，可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得抗体片段。
如本文所用，术语“氨基酸”包括标准的二十种基因编码的氨基酸及其对应的‘D’型立体异构体(与天然‘L’型相比)、ω-氨基酸和其他天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸等)以及化学衍生氨基酸(参见下文)。
除非另有明确说明，否则当具体列举氨基酸时，诸如“丙氨酸”或“Ala”或“A”，该术语是指L-丙氨酸和D-丙氨酸。其他非常规氨基酸也可以是用于本发明的多肽(抗体或其抗原结合片段)的合适组分，只要由抗体或抗原结合片段来保留所需功能特性即可。对于示出的氨基酸序列，每个经编码的氨基酸残基在适当的情况下由单个字母名称表示，其对应于常规氨基酸的惯用名称。
在一些实施例中，本发明的和如本文所定义的抗体或其抗原结合片段包含L-氨基酸或由该氨基酸组成。
本领域技术人员将理解，对于人类疗法，优选地使用人类或人源化抗体。人源化形式的非人抗体(例如如实例9和10所述的兔抗体)是基因工程化嵌合抗体或抗体片段，该基因工程化嵌合抗体或抗体片段具有优选地衍生自非人抗体的极小部分。人源化抗体包括一种抗体，在该抗体中人抗体(受体抗体)的互补决定区被来自具有所需功能性的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔)的互补决定区的残基取代。在一些情况下，人抗体的Fv框架残基被对应的非人残基取代。人源化抗体还可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于输入互补决定区或框架序列中的残基。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的互补决定区对应于非人抗体的那些互补决定区，并且所有或基本上所有的框架区对应于相关人共有序列的那些框架区。人源化抗体最佳地还包括抗体恒定区(诸如Fc区)的至少一部分，该抗体恒定区通常衍生自人抗体。如本文别处所讨论的，人源化抗体可能缺乏与小鼠IL1RAP的交叉反应性。因此，表现出与人源化抗体类似的功能特性的合适替代物(例如mCAN10)可以用于鼠疾病模型，其中替代物结果可以解释为反映人源化抗体的功能性。
用于将非人抗体人源化的方法是本领域众所周知的。一般而言，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基往往被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。基本上可以通过用对应的啮齿动物互补决定区取代人互补决定区来执行人源化。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上不到一个完整的人可变结构域已经被来自非人物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体通常可以是人抗体，其中一些互补决定区残基和可能地一些框架残基被来自啮齿动物抗体中相似位点中的残基取代。
也可以使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)来鉴定人抗体。
抗体的优化，例如通过人源化(参见例如，Jones等人,1986,《自然》321:522-525；Reichmann等人,1988.《自然》332:323-327；Verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-15361；US 4,816,567，所述文献的公开内容通过引用并入本文)和/或去免疫化，如例如在以下文献中描述：Jones等人《分子生物学方法》2009；525:405-23)或在实例11和13中描述，从而导致生成具有微调特性的抗体变体。
CDR
本发明的抗体由其特征性互补决定区(CDR)序列来进行定义。存在若干方法以用于定义抗体的CDR序列。本发明的抗体的CDR已经使用三种不同并且众所周知的方法来进行定义(产生三个CDR定义类别)：1)根据Kabat的定义、2)根据IMGT的定义或3)根据IMGT和Kabat的组合的定义。
重要的是要注意，在每个CDR定义类别(分别为Kabat、IMGT或IMGT和Kabat的组合)内，CDR序列对于嵌合抗体48D2及其所有经优化的抗体变体(诸如人源化抗体变体或人源化/去免疫化抗体变体)均是相同的(参见章节“序列”中相应序列中所指示的)。
本领域技术人员将理解一组6个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)可以根据i)IMGT、或ii)Kabat或iii)Kabat和IMGT的组合来进行定义。
此外，本领域技术人员将理解，有可能通过本领域已知的其他方法来定义本发明的抗体的CDR，例如通过根据Chothia(Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948)、Martin(Enhanced Chothia),Gelfand或Honneger的CDR进行的定义。其他方法也存在并且是本领域已知的，诸如AbM定义(由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的Kabat定义和Chothia定义的组合)或接触定义(基于晶体结构分析)。参见，例如，Kabat等人(具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),1987和1991,NIH,贝塞斯达，马里兰州(Bethesda,Md.))，Lefranc等人(《免疫球蛋白和T细胞受体恒定结构域和Ig超家族C样结构域的IMGT独特编号(IMGT unique numbering forimmunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-likedomains)》，《发育与比较免疫学(Dev Comp Immunol.)》2005；29(3):185-203)和Dondelinger等人(了解抗体编号和抗原结合表面/残基定义的意义和影响(Understandingthe Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-BindingSurface/Residue Definition),《免疫学前沿(Front.Immunol.)》,2018年10月16日)。
本领域技术人员在被提供有如本文所呈现的IMGT和Kabat CDR时，可以使用已知信息以列出其他CDR命名约定或方法(例如，Chothia)。因此，涵盖了所有CDR命名约定或方法。
如本文所示，IMGT和Kabat的编号系统将略有不同的残基鉴定为CDR。在某些情况下，根据一种编号系统(诸如IMGT或Kabat)定义CDR可能是有益的。通常，这些CDR序列很短(比例如组合编号系统的方法更短)，因此提供了对结合至关重要的核心序列。在其他情况下，使用例如IMGT和Kabat CDR序列的组合可能是有益的。
在一些实施例中，对白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：
轻链可变区，其包含
a)CDR-L1，其包含以下或由以下组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；CDR-L2，其包含以下或由以下组成：KAS的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含以下或由以下组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；或者
b)CDR-L1，其包含以下或由以下组成：QASESISTALA(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；CDR-L2，其包含以下或由以下组成：KASTLPS(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含以下或由以下组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；或者
c)CDR-L1，其包含以下或由以下组成：QASESISTALA(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；CDR-L2，其包含以下或由以下组成：KASTLPS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含以下或由以下组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列
和/或
重链可变区，其包含
d)CDR-H1，其包含以下或由以下组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；CDR-H2，其包含以下或由以下组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含以下或由以下组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列；或者
e)CDR-H1，其包含以下或由以下组成：HFDIT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；CDR-H2，其包含以下或由以下组成：TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含以下或由以下组成：GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；或者
f)CDR-H1，其包含以下或由以下组成：GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列；CDR-H2，其包含以下或由以下组成：TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含以下或由以下组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
抗体48D2的不同定义的CDR序列组之间的关系可以如下所述，其具有
-以粗体突出显示的CDR残基，其使用IMGT编号系统来进行鉴定，
-由下划线突出显示CDR残基，其使用Kabat编号系统来进行鉴定，
-由IMGT和Kabat编号系统的组合来进行定义的CDR残基(以粗体显示和以下划线显示的序列的组合)
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
(分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13)
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
(分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14)
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
(分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15)
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
(分别为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16)
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17)
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
(分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18)
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段的CDR序列根据IMGT来进行定义：
SEQ ID NO:1
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
ESISTA
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
KAS
SEQ ID NO:3
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
SEQ ID NO:4
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
GPSLSHFD
SEQ ID NO:5
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
ISPGVST
SEQ ID NO:6
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段的CDR序列根据Kabat来进行定义：
SEQ ID NO:7
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
QASESISTALA
SEQ ID NO:8
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
KASTLPS
SEQ ID NO:9
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
SEQ ID NO:10
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
HFDIT
SEQ ID NO:11
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
SEQ ID NO:12
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段的CDR序列根据IMGT和Kabat的组合来进行定义：
SEQ ID NO:13
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
QASESISTALA
SEQ ID NO:14
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
KASTLPS
SEQ ID NO:15
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
SEQ ID NO:16
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
GPSLSHFDIT
SEQ ID NO:17
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
SEQ ID NO:18
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
然而，本领域技术人员将理解，可以耐受CDR序列内的低水平突变(通常，仅一个或两个氨基酸)而不损失抗体或抗原结合片段对IL1RAP的特异性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含如上所述的CDR(其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 18)，其中CDR的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，例如，条件是不超过2种氨基酸已经被如此改变，诸如1种氨基酸。
轻链可变区
如实例9所详述，用人和鼠IL1RAP使兔免疫化。随后，分析所得抗体的所需特性(诸如与IL1RAP结合)以及抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导的能力。48D2被鉴定为在这些特征方面具有优异特性的抗体，并且随后已经对其进行了修饰和优化，目的是改善抗体以用于临床和治疗应用。该优化程序导致抗体变体含有具有不同氨基酸序列的可变轻链区和可变重链区。然而，对于所有抗体变体，CDR都是相同的。换句话说，在每个CDR定义类别(i)Kabat、ii)IMGT或iii)IMGT和Kabat的组合)内，CDR序列(分别为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)对于嵌合抗体48D2及其所有经优化的抗体变体均是相同的。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含含有CDR的轻链可变区，该CDR
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQ ID NO:13)；
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ ID NO:8)和KASTLPS(SEQ ID NO:14)；和/或
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)、QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含含有CDR的轻链可变区，该CDR包括
a)CDR-L1，其包含以下或由以下组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；CDR-L2，其包含以下或由以下组成：KAS的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含以下或由以下组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)；
b)CDR-L1，其包含以下或由以下组成：QASESISTALA(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列；CDR-L2，其包含以下或由以下组成：KASTLPS(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含以下或由以下组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列；或者
c)CDR-L1，其包含以下或由以下组成：QASESISTALA(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；CDR-L2，其包含以下或由以下组成：KASTLPS(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；和CDR-L3，其包含以下或由以下组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:19具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。该轻链可变区是例如如实例9和10所述的嵌合(非人源化、非优化)48D2抗体的一部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下或由以下组成：选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
这些轻链可变区是例如如实例11和12所述的人源化h48D2抗体变体的一部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:31具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
该轻链可变区是例如如实例13和14所述的人源化和去免疫化48D2抗体变体的一部分。
同一性百分比(或序列同一性)可以通过例如Expasy设施站点(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)处的LALIGN程序来进行确定，该程序使用全局比对选项、评分矩阵BLOSUM62、开放空位罚分–14、扩展空位罚分–4作为参数。可替代地，可以使用合适的计算机程序(例如威斯康星大学遗传计算小组的GAP程序)来确定两个多肽(诸如抗体的部分)之间的序列同一性百分比，并且应当理解，同一性百分比根据其序列已经被最佳比对的多肽来进行计算。
可替代地，可以使用Clustal W程序来执行比对。使用的参数可能如下：
-快速成对比对参数：K元组(字)大小；1，窗口大小；5，空位罚分；3，顶对角线的数量；5。评分方法：x％。
-多重比对参数：空位开放罚分；10，空位扩展罚分；0.05。
-评分矩阵：BLOSUM。
可替代地，可以使用BESTFIT程序以确定局部序列比对。
本领域技术人员将考虑对上述轻链可变区进行进一步改变，例如进一步优化抗体或抗原结合片段。例如，如在人源化和去免疫化程序期间所做的那样，本领域技术人员将考虑改变框架区中的氨基酸(即结合CDR区的表位的外侧)，从而不改变CDR区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含如上所述的轻链可变区，其中轻链可变区的框架区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
重链可变区
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含含有CDR的重链可变区，该CDR
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:10)和GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)；
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；以及
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区
a)CDR-H1，其包含以下或由以下组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；CDR-H2，其包含以下或由以下组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含以下或由以下组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)；
b)CDR-H1，其包含以下或由以下组成：HFDIT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；CDR-H2，其包含以下或由以下组成：TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含以下或由以下组成：GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；或者
c)CDR-H1，其包含以下或由以下组成：GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列；CDR-H2，其包含以下或由以下组成：TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列；和CDR-H3，其包含以下或由以下组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
该重链可变区是例如如实例9和10所述的嵌合(非人源化、非优化)48D2抗体的一部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下或由以下组成：选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成的组的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
这些重链可变区是例如如实例11和12所述的人源化h48D2抗体变体的一部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含以下或由以下组成：选自由SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34组成的组的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
这些重链可变区是例如如实例13和14所述的人源化和去免疫化48D2抗体变体的一部分。
本领域技术人员将考虑对上述重链可变区进行进一步改变，例如进一步优化抗体或抗原结合片段。例如，如在人源化和去免疫化程序期间所做的那样，本领域技术人员将考虑改变框架区中的氨基酸(即结合CDR区的表位的外侧)，从而不改变CDR区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含如上所述的重链可变区，其中重链可变区的框架区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
可变轻链和可变重链的组合
本领域技术人员将理解，上述轻链可变区的变体中的任何变体可以与上述重链可变区的变体中的任何变体组合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
该轻链和重链可变区的组合是例如如实例9和10所述的嵌合(非人源化、非优化)48D2抗体的一部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：
a)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
b)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
c)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
d)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
e)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
f)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
g)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
h)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
i)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
j)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
k)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
l)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
m)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
n)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
o)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
p)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
q)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
r)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
s)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29的氨基酸序列；
t)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
u)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
v)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27的氨基酸序列；
w)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
x)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29的氨基酸序列；或
y)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:30中的任何一者具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
这些轻链和重链可变区的组合是例如如实例11和12所述的人源化h48D2抗体变体的一部分。
下表是描绘人源化轻链和重链可变区的示例性组合的可替代方式：
/>
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：
a)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
b)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
c)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
d)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
e)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
f)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
g)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
h)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
i)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30的氨基酸序列；
j)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
k)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:33的氨基酸序列；或
l)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34
或与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
这些轻链和重链可变区的组合是例如如实例13和14所述的人源化和/或去免疫化h48D2抗体变体的一部分。
下表是描绘人源化和/或人源化和去免疫化轻链和重链可变区的示例性组合的可替代方式：
本领域技术人员应当理解，上文定义的轻链可变区、重链可变区以及它们的组合可以进一步与轻链/重链恒定区或它们的部分组合(参见下文)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含如上所述的重链可变区，其中轻链可变区和/或重链可变区的框架区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
恒定区和Fc部分
本领域技术人员将理解，本领域已知的任何轻恒定区可以与上述轻可变区的变体中的任何变体组合，并且本领域已知的任何重恒定区可以与上述重可变区的变体中的任何变体组合，以形成完整的抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区或其部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区属于κ或λ轻链。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含κ轻链。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含λ轻链。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:35的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:35具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区或其部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的重链恒定区：α、δ、γ、ε和μ。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区属于选自由以下项组成的组的免疫球蛋白同种型：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区属于IgG免疫球蛋白同种型。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是IgG抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区属于选自由以下项组成的组的免疫球蛋白亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是IgG1抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是IgG2抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是IgG3抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是IgG4抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区或由重链恒定区组成，该重链恒定区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:2的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区和/或重链恒定区或由轻链恒定区和/或重链恒定区组成，其中上文提及的轻链恒定区和/或上文提及的重链恒定区的氨基酸中的任意一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
在一些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段包含IgG重链(诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链)的CH1、CH2和/或CH3区。因此，抗体或抗原结合片段可以包含来自IgG1重链的部分或所有恒定区。例如，抗体或抗原结合片段可以是包含CH1和CL恒定区的Fab片段，该抗体或抗原结合片段分别与上文定义的重可变区和轻可变区中的任何一者组合。
同样，本发明的上文定义的抗体或抗原结合片段可以进一步包含轻链恒定区或其部分。例如，抗体或抗原结合片段可以包含来自κ或λ轻链的CL区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含以下或由以下组成
-上文提及的轻链可变区中的任何一个轻链可变区；和/或
-上文提及的重链可变区中的任何一个重链可变区；和/或
-上文提及的轻链恒定区中的任何一个轻链恒定区；和/或
-上文提及的重链恒定区中的任何一个重链恒定区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含-轻链可变区，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQID NO 25和SEQ ID NO 31的氨基酸序列；和/或
-重链可变区，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 34；和/或
-轻链恒定区，该轻链恒定区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO 35的氨基酸序列；和/或
-重链恒定区，该重链恒定区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO 36或SEQ ID NO2的氨基酸序列。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含Fc区。
Fc区也可以称为Fc结构域。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含天然存在的Fc区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含非天然存在的Fc区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含具有经修饰的，例如具有突变的IgG恒定区的Fc区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含Fc区，其中Fc区包含表1中鉴定的突变中的一个或多个突变。
Fc区可以是天然存在的(例如内源性产生的抗体的一部分)或可以是人工的(例如包含相对于天然存在的Fc区的一个或多个点突变)。
如本领域所充分记载的，抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应子功能，诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
对治疗性单克隆抗体或Fc融合蛋白的Fc区进行工程化允许生成更适合它们所需药理学活性的分子(Strohl,2009,《生物技术当代视点(Curr Opin Biotechnol)》20(6):685-91，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
(a)用于经增加的半衰期的工程化Fc区
一种用于改善治疗性抗体功效的方法是增加其血清持久性，从而允许更高的循环水平、更低频率的施用和经减少的剂量。
IgG的半衰期取决于其与新生儿受体FcRn的pH依赖性结合。FcRn在内皮细胞的表面上进行表达，以pH依赖性方式结合IgG并且保护其免于降解。
一些在pH 6.0而非pH 7.4下选择性结合FcRn的抗体在多种动物模型中表现出更长的半衰期。
若干突变位于CH2结构域与CH3结构域之间的界面，诸如T250Q/M428L(Hinton等人,2004,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》279(8):6213-6，所述文献的公开内容通过引用并入本文)和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(Vaccaro等人,2005,《自然生物技术》23(10):1283-8，所述文献的公开内容通过引用并入本文)已经示出增加对FcRn的结合亲和力和体内IgG1的半衰期。
(b)用于经改变的效应子功能的工程化Fc区
取决于治疗性抗体或Fc融合蛋白应用，可能需要减少或增加效应子功能(诸如ADCC)。
对于靶向细胞表面分子的抗体，尤其是免疫细胞上的那些抗体，某些临床适应症可能需要消除效应子功能。
相反，对于旨在用于肿瘤学用途(诸如用于治疗白血病和实体瘤；参见下文)的抗体，增加效应子功能可能会改善治疗活性。
四种人IgG同种型以不同的亲和力结合活化性Fcγ受体(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性FcγRIIb受体以及补体的第一组分(C1q)，从而产生非常不同的效应子功能(Bruhns等人,2009,《血液(Blood.)》113(16):3716-25，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
IgG与FcγR或C1q的结合取决于位于铰链区和CH2结构域的残基。CH2结构域的两个区域对于FcγR和C1q结合至关重要，并且在IgG2和IgG4中具有独特的序列。取代到位置233-236处的人IgG1和IgG2残基和位置327、330和331处的IgG4残基中，其示出可大大减少ADCC和CDC(Armour等人,1999,《欧洲免疫学杂志(Eur JImmunol.)》29(8):2613-24；Shields等人,2001,《生物化学杂志》.276(9):6591-604，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。‘LALA’突变，L234A/LL235A，已经被引入若干治疗性IgG1抗体中，以用于产生效应子功能沉默Fc区，参见例如Xu等人,2000,《细胞免疫(Cell.Immuno.)》200:16-26。此外，Idusogie等人证明了不同位置处的丙氨酸取代(包括K322)显著减少了补体活化(Idusogie等人,2000,《免疫学杂志》164(8):4178-84，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。类似地，鼠IgG2A的CH2结构域中的突变示出了会降低与FcγRI和C1q的结合(Steurer等人,1995.《免疫学杂志》155(3):1165-74，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
在人IgG1的CH2结构域中已经发生了许多突变，并且在体外测试了它们对ADCC和CDC的影响(参见上面引用的参考文献)。值得注意的是，据报道，位置333处的丙氨酸取代增加了ADCC和CDC两者(Shields等人,2001,同上；Steurer等人,1995,同上)。Lazar等人描述了一种三重突变体(S239D/I332E/A330L)，该三重突变体对FcγRIIIa具有较高的亲和力并且对FcγRIIb具有较低的亲和力，从而导致ADCC增强(Lazar等人,2006,PNAS 103(11):4005–4010，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。相同的突变用于生成具有增加的ADCC的抗体(Ryan等人,2007,《分子癌症治疗(Mol.Cancer Ther.)》6:3009-3018，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。Richards等人研究了一种略有不同的三重突变体(S239D/I332E/G236A)，该三重突变体具有经改善的FcγRIIIa亲和力和FcγRIIa/FcγRIIb比率，该三重突变体介导巨噬细胞对靶细胞的增强吞噬作用(Richards等人.,2008.《分子癌症治疗》7(8):2517-27，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
由于IgG4抗体缺乏效应子功能，因此该抗体表示优选的IgG亚类，以用于在不耗尽细胞的情况下阻断受体(即抑制IL-1信号传导)。IgG4分子可以在称为Fab臂交换的动态过程中交换半分子。在治疗性抗体与内源性IgG4之间，该现象也可能在体内发生。
S228P突变已经示出可阻止该重组过程，从而允许设计更不可预测的治疗性IgG4抗体(Labrijn等人,2009,《自然生物技术》27(8):767-71，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
工程化Fc区的实例在下表1中示出。
表1：工程化Fc的实例
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*Fc氨基酸突变的位置使用EU编号方案来进行定义(参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,63:78–85)，其可能与SEQ ID NO:36和SEQID NO:2中的实际编号不同，例如参见下文对突变编号的进一步详述。
参考表1
1.Hinton等人2004《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279(8):6213-6)
2.Vaccaro等人2005《自然生物技术》23(10):1283-8)
3.Zalevsky等人2010《自然生物技术》28(2):157-159
4.Armour KL.等人,1999.《欧洲免疫学杂志》29(8):2613-24
5.Shields RL.等人,2001.J Biol Chem.276(9):6591-604
6.Masuda等人2007,《分子免疫学(Mol Immunol.)》44(12):3122-31
7.Bushfield等人2014,《白血病(Leukemia)》28(11):2213-21
8.Okazaki等人2004,《分子生物学杂志》；336(5):1239-49
9.Idusogie等人,2000.《免疫学杂志》164(8):4178-84
10.Datta-Mannan A.等人,2007.《药物代谢和处置(Drug Metab.Dispos.)》35:86–94
11.Steurer W.等人,1995.《免疫学杂志》155(3):1165-74
12.Richards等人2008《分子癌症治疗》7(8):2517-27
13.US 7,960,512 B2
14.EP 2 213 683
15.Labrijn AF.等人,2009.《自然生物技术》27(8):767-71
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含Fc区，其中Fc区包含选自由以下项组成的组的突变中的一个或多个突变：如由EU索引所定义的L234A、L235A、P329G、G237A、P238S、H269A、A330S和P331S。
这些突变可能减少抗体的效应子功能。
EU索引惯常用于本领域(一般参见，Kabat等人，1991)。
本领域技术人员将理解，本文所述的Fc突变的确切位置在本发明的抗体中可能不同。这是由于可变区中的物种差异导致的嵌合抗体中的物种变化(以及由此而来的人源化或人源化/去免疫化抗体)。与EU索引中的氨基酸位置相比，可变重区中区的不同长度导致氨基酸位置的移位。然而，Fc部分中氨基酸的相对位置被保留。
例如，LALA突变由EU索引定义为处于位置L234A、L235A。
本发明的示例性抗体可以包含例如以下的可变重链区
SEQ ID NO:20
重链可变区(非人源化、非去免疫化)
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
和例如以下的恒定重链(不含有LALA突变)
SEQ ID NO:36
免疫球蛋白IgG1恒定重链(重链恒定区)(za同种异型)
(以粗体显示和以下划线显示的氨基酸残基指示当引入LALA突变时，发生改变的残基，如下文SEQ ID NO:2所示。)
可替代地，本发明的示例性抗体可以包含例如以下的可变重链区
SEQ ID NO:20
重链可变区(非人源化、非去免疫化)
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
和例如以下的恒定重链(含有LALA突变)
SEQ ID NO:2
具有‘LALA’突变的免疫球蛋白IgG1恒定重链(重链恒定区)(za同种异型)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
氨基酸突变(上述序列中的LL至AA)处于位置237和238处(因此L237A、L238A)，并且在重链恒定区的氨基酸序列的背景中，相当于根据EU索引的L234A、L235A突变。
本领域技术人员将理解，相同的推理适用于本领域已知的其他命名的突变，诸如如由EU索引所定义的P329G、G237A、P238S、H269A、A330S和P331S。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含Fc区，其中连接至Fc区的聚糖缺乏岩藻糖。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含缺乏岩藻糖的Fc区。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含Fc区，其中连接至Fc区的聚糖的岩藻糖含量低。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含岩藻糖含量低的Fc区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段对IL1RAP具有结合特异性，其中抗体或抗原结合片段在FUT8阴性细胞系中产生。
在一些实施例中，抗体在FUT8阴性细胞系中产生。
有可能通过敲除FUT8基因来创建FUT8阴性细胞系，该基因针对a-(1,6)-岩藻糖基转移酶进行编码，这进而催化岩藻糖转移。如WO 00/61739A1所述，包含Fc区的经减少的岩藻糖基化的抗体表现出增强的ADCC活性。本领域技术人员将理解，当产生具有增强的ADCC活性的抗体时，FUT8阴性细胞系是有用的。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是完整抗体或完整抗体的一部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下项组成的组的抗原结合片段或由选自由以下项组成的组的抗原结合片段组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫键结合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单个VH可变结构域或VL可变结构域)。
以下“序列”章节提供了本文公开和要求保护的抗体的某些示例性实施例的序列。
信号传导的抑制
白细胞介素与各种疾病和疾患有关。
白细胞介素，诸如IL-1家族的白细胞介素，也是细胞因子。细胞因子(包括，例如，趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子)对细胞信号传导很重要。换句话说，细胞因子对细胞具有信号传导功能，例如经由与相应受体结合。例如，如本文所述，IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导涵盖这些细胞因子在细胞表面上或细胞内触发的事件。在细胞表面上，这些信号传导事件会影响例如受体的确认，共受体和其他分子的特性，分子在胞外、在细胞表面上、在细胞膜中或细胞膜处、或细胞中的结合。这些事件可能是生理性的或病理性的。这些事件可能是生物通路，从而例如导致细胞中作为对信号传导的反应的应答。该应答可能是生理性的或病理性的。
如本文所用，“信号传导的抑制”定义为所述信号传导事件的减少，或例如受体或生物通路或分子活性的活性、确认或产生的减少。该抑制应理解为将存在抑制因子(在本发明的情况下，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段)的情况与不存在抑制因子的情况进行比较。本领域技术人员将理解，抑制程度可以通过本领域众所周知的方法来确定，这取决于待测量的信号传导事件或通路或活性。该方法可以是例如细胞测定，例如如实例10、12或14所描述的。
应注意，如本文所用，短语诸如“抑制(例如)IL-1α的信号传导”可以与短语“抑制(例如)IL-1α信号传导”互换使用。
IL-1
白细胞介素-1(IL-1)是有效的促炎细胞因子，其可以响应于感染和炎症，由多种细胞类型(包括单核吞噬细胞)产生。IL-1家族由七种激动剂(包括IL-1α和IL-1β)以及三种天然存在的受体拮抗剂(包括IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra或IL1RA))组成(Dinarello,CA,《血液》1996,87(6):2095-147)。已经鉴定了两种IL-1受体，即IL-1R I型和IL-1RII型。两种受体均可以与所有三种形式的IL-1家族分子相互作用。IL-1RI负责介导IL-1诱导的细胞活化。然而，IL-1/IL-1RI复合物不能自行进行信号传导，而是取决于与第二受体链IL-1R辅助蛋白(IL1RAP)的缔合(Dinarello,CA,《血液》1996,87(6):2095-147)。与IL-1RI相反，IL-1RII在与IL-1结合后不会诱导细胞活化，因此IL-1RII作为调节诱饵受体发挥作用，从而导致可与IL-1RI结合的IL-1净减少。
除了IL1信号传导之外，IL1RAP对于通过ST2/IL1RAP复合物来介导IL33的效应和通过IL1Rrp2/IL1RAP复合物来介导IL36的效应至关重要(Garlanda等人,《免疫》2013年12月12日；39(6):1003-18)。
IL-1α也从受损细胞中释放出来，并且可以充当警报素。IL-1是有效的促炎细胞因子，其在局部感染或炎症的部位被诱导，并且参与调节多种生理和细胞事件(总结于Dinarello CA,《胸膛(CHEST)》,2000,118:503-508和Dinarello,CA,《临床和实验性风湿病学(Clin Exp Rheumatol)》,2002,20(5增刊27):S1-13)。它能够活化若干细胞类型，该若干细胞类型包括白细胞和内皮细胞。IL-1通过促进粘附分子、细胞因子、趋化因子和其他炎性介质(诸如前列腺素E2和一氧化氮(NO))的产生和表达来诱导和放大免疫应答。结果，局部炎症被放大和持续。另外，IL-1诱导的炎性介质产生会导致发热、头痛、低血压和体重减轻。此外，IL-1是一种造血生长因子，并且已经示出会减少骨髓移植期间患者中白细胞和血小板的最低值。IL-1还已经示出会通过诱导血管内皮生长因子的产生来促进血管生成，从而促进风湿性关节中的血管翳形成和血液供给。IL-1已经示出会促进风湿性疾病中的骨骼和软骨降解。最后，IL-1被认为是心血管疾病和纤维化疾病中炎性应答的重要参与者。
IL-33
IL-33通常由受损或坏死的屏障细胞(内皮细胞和上皮细胞)释放，充当警报素(内源性危险信号)，以在创伤或感染期间警告免疫系统出现组织损伤(Liew FY,《白细胞介素-33在健康和疾病中的作用(Interleukin-33in health and disease.)》《自然评论免疫学(Nature Reviews Immunology)》,16,676–689(2016))。IL-33诱导T辅助2(Th2)细胞、肥大细胞、2型先天淋巴样细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞以产生2型细胞因子(例如IL-5、IL-13)。还已知IL-33靶向内皮细胞并且诱导血管生成。作为Th2诱导细胞因子，IL-33已经与例如哮喘、过敏性疾病、炎性肠病和皮炎有关。IL-33可以有效刺激多种细胞，并且其多效性的本质反映在IL-33在组织和代谢稳态、感染、炎症、癌症和中枢神经系统疾病中的作用中。
IL-36
IL-36细胞因子α、β、γ在多种细胞类型中表达，其中在例如角质形成细胞、支气管上皮细胞、神经元细胞、树突状细胞和巨噬细胞中大量表达。IL-36在屏障组织(如皮肤、肺和肠道)中最为活跃，这表明它们的主要职责是调节环境和身体的相互作用。已知IL-36会活化表达IL-36受体的靶细胞(诸如角质形成细胞、单核细胞、树突状细胞和CD4 T细胞)中的NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶。新出现的证据指示IL-36信号传导参与先天性和适应性免疫应答的活化(Ding L,《在自身免疫性和炎性疾病中的IL-36细胞因子(IL-36cytokinesin autoimmunity and inflammatory disease)》,《肿瘤靶标(Oncotarget)》,第9卷,(第2期),第2895-2901页(2018))。
除了其在炎性皮肤病(诸如银屑病和特应性皮炎)中起关键作用外，新出现的证据也表明异常的IL-36活性还会促进肺、肾脏和肠道中的炎性疾病，这强调IL-36作为针对常见炎性疾病的治疗靶标的潜力。
有趣的是，本文所述的所有细胞因子(IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ)也已经示出会靶向基质细胞，诸如成纤维细胞和内皮细胞。因此，除了这些细胞因子在炎性疾病和疾患中的公认影响外，这些细胞因子还与纤维化疾病或疾患有关。
根据本发明的第一方面，抗体或其抗原结合片段具有抑制白细胞介素-1(IL-1)家族的细胞因子配体和/或受体的信号传导的能力。本领域技术人员将理解，在抗体或抗原结合片段与IL1RAP上的表位进行结合后，发生抑制。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够在与IL1RAP结合后抑制信号传导。
本领域技术人员将理解，抗体或其抗原结合片段与IL1RAP的结合可以不同方式影响IL1RAP，例如在分子水平或构象水平上。然而，本领域技术人员将理解，今天可能不完全了解抗体或其抗原结合片段与IL1RAP的结合会如何影响IL1RAP。
一种可能性是抗体或其抗原结合片段与IL1RAP的结合可以影响IL1RAP分别与IL-1受体、IL-33受体和/或IL-36受体的缔合。因此，可能不会形成适当的受体复合物，该受体复合物由作为共受体的IL1RAP以及IL-1受体、IL-33受体或IL-36受体中的任何一种受体组成。因此，当细胞因子(诸如IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ)与其同源受体(分别为IL-1受体、IL-33受体或IL-36受体)结合时，这些细胞因子的信号传导可能受损，诸如被抑制，诸如被阻断，诸如基本上完全被抑制，诸如部分被抑制。
本领域技术人员将理解，并非所有与IL1RAP的任何一个表位结合的IL1RAP结合抗体均可以分别干扰IL1RAP与IL-1受体、IL-33受体和/或IL-36受体之间的缔合，从而抑制信号传导。提供此类抗体是本发明的一个成就。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制白细胞介素-1(IL-1)家族细胞因子配体和/或受体的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL1RAP依赖性白细胞介素-1(IL-1)家族的细胞因子配体和/或受体的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制选自由以下项组成的组的至少一种细胞因子的信号传导：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ或它们的任何组合。
在一些实施例中，对其IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1α的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1β的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-33的信号传导。
在一些实施例中，对其IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-36α的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-36β的信号传导。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-36γ的信号传导。
本领域技术人员将理解，信号传导的抑制可以具有不同程度。信号传导的抑制可以是完全的或基本上完全的，诸如信号传导的阻断。信号传导的抑制也可以是部分的，诸如减少信号传导，诸如不完全的。考虑到与用于测量信号传导抑制的方法相关联的评估完整性的不确定性，“基本上完全的”应理解为“完全的”。
例如，相对于在不存在本发明的抗体或抗原结合片段的情况下的信号传导，信号传导可以被抑制至少10％、20％、30％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多。
在一些实施例中，相对于在不存在本发明的抗体或抗原结合片段的情况下的信号传导，信号传导的抑制在10％至100％之间。更优选地，信号传导的抑制在25％至100％之间。甚至更优选地，信号传导的抑制在50％至100％之间。
相对于在不存在本发明的抗体或抗原结合片段的情况下的信号传导，信号传导可以被抑制100％。
本发明的抗体或抗原结合片段对IL-1、IL-33和/或IL-36信号传导的抑制程度可以使用本领域众所周知的方法来确定，例如通过实例10、12和14中使用的方法。
在优选实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够基本上完全抑制信号传导。
在优选实施例中，抑制信号传导是信号传导的基本上完全抑制。
在优选实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够基本上完全抑制选自由以下项组成的组的至少一种细胞因子的信号传导：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ或它们的任何组合。
在优选实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够基本上完全抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导。
抗体可能在一定程度上进一步抑制信号传导，这意指不是基本上完全地，这意指部分地。因此，信号传导的抑制可以不是基本上完全抑制，这意指部分抑制。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够部分抑制信号传导。
在一些实施例中，抑制信号传导是信号传导的部分抑制。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够部分抑制选自由以下项组成的组的至少一种细胞因子的信号传导：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ或它们的任何组合。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够部分抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导。
在一些实施例中，相对于在不存在本发明的抗体或抗原结合片段的情况下的信号传导，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导至少10％、20％、30％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％。
本领域技术人员将理解，在一些情况下，完全抑制是所需的，在该情况中，过程(例如取决于IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导的疾病过程)应当完全和快速地受到影响，以缓解或治疗疾病。在其他情况下，部分抑制是所需的，其中过程(例如，取决于IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的疾病过程)应该被修饰但不能完全受到影响，例如以避免完全抑制的副作用。本领域技术人员将进一步理解，生物系统是复杂的并且需要各种已知或未知的反馈循环，这使得评估一个过程是否被完全抑制具有挑战性。此外，该评估还取决于测量该过程(例如信号传导)所用方法的敏感性。本领域技术人员将了解，在本领域中建立和接受哪种方法和截止值，以用于评估信号传导的抑制的完整性或基本完整性或用于评估信号传导的部分抑制程度。
如以下实例中详细示出和解释的，可以对抗体进行修饰以优化某些特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是人抗体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是去免疫化的。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段是人源化和去免疫化的。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是单克隆的。
抗体的特性
本发明的抗体在广泛筛选大量抗IL1RAP抗体之后，基于表现出的特性进行鉴定，该特性使它们特别适合作为炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患的诊断和治疗剂。
因此，在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出以下特性中的一种或多种特性：
a)对IL1RAP的结合亲和力(KD)，其特征在于KD值是3nM或更小；
b)与IL1RAP的结构域2结合，优选地与结构域2的H2区结合，其中H2区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:39的氨基酸；
c)与来自食蟹猴或猪的IL1RAP的交叉反应性；
d)对IL-1α信号传导的抑制作用；
e)对IL-1β信号传导的抑制作用；
f)对IL-33信号传导的抑制作用；
g)对IL-36α信号传导的抑制作用；
h)对IL-36β信号传导的抑制作用；
i)对IL-36γ信号传导的抑制作用；
j)由表达IL1RAP的细胞进行的内化作用。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的一个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的两个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的三个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的四个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的五个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的六个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的七个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的八个特性。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出上述特性中的九个特性。
有利地，在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出所有上述特性。
在其他实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段表现出所有以下特性：
a)对IL1RAP的结合亲和力(KD)，其特征在于KD值是3nM或更小；
b)与IL1RAP的结构域2结合，优选地与结构域2的H2区结合，其中H2区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:39的氨基酸；
c)与来自食蟹猴或猪的IL1RAP的交叉反应性；
d)对IL-1α信号传导的抑制作用；
e)对IL-1β信号传导的抑制作用；
f)对IL-33信号传导的抑制作用；
g)对IL-36α信号传导的抑制作用；
h)对IL-36β信号传导的抑制作用；
i)对IL-36γ信号传导的抑制作用；
j)由表达IL1RAP的细胞进行的内化作用。
基于来自Uniprot ID Q9NPH3的IL1RAP氨基酸序列，H2区对应于氨基酸174-191。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段对IL1RAP的结合亲和力(KD)为3nM或更小，诸如2.75nM、例如2.5nM、诸如2nM、例如1.75nM、诸如1.5nM、例如1.25nM、诸如1nM、例如0.75nM、诸如0.5nM或例如0.5nM。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段对IL1RAP的结合亲和力(KD)为3000pM或更小，诸如2750pM、例如2500pM、诸如2000pM、例如1750pM、诸如1500pM、例如1250pM、诸如1000pM、例如750pM、诸如700pM、例如650pM、诸如600pM、例如550pM、诸如500pM、例如450pM、诸如400pM、例如350pM、诸如300pM、例如250pM、诸如200pM、例如150pM、诸如100pM、例如50pM。
本领域技术人员将理解，抗体或抗原结合片段的结合亲和力的确定取决于用于确定该结合亲和力的方法。
本领域技术人员将理解，IL1RAP抗体除了能够抑制细胞因子信号传导(例如IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的细胞因子信号传导)，还可以表现出一种或多种其他功能。这些功能可以通过抗体的恒定区或者Fc区来传递。这些功能的实例是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，从而导致靶细胞(诸如表达IL1RAP的肿瘤细胞)的杀伤。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段不能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCP。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段不能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCP。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC和ADCP。
抗体的修饰
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段进一步包含用于增加药剂的体内半衰期的部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段进一步包含用于增加药剂的体内半衰期的部分，其中用于增加体内半衰期的部分选自由以下项组成的组：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段被聚乙二醇化。
在一些实施例中，对IL1RAP片段具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段直接或间接地与功能部分，诸如细胞毒性或可检测部分共价结合(诸如经由螯合剂)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，其中细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，该细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成，其中放射性同位素选自由以下项组成的组：β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体和低光子能量发射体。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，该细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成，其中放射性同位素具有在药剂附近产生高剂量吸光度的局部吸收能量的发射模式。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，该细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成，其中放射性同位素选自由以下项组成的组：长程β-发射体，诸如90Y、32P、186Re/186Re；166Ho、76As/77As、153Sm；中程β发射体，诸如131I、177Lu、67Cu、161Tb；低能量β发射体，诸如45Ca、35S或14C；转换或俄歇发射体，诸如51Cr、67Ga、99Tcm、111In、123I、125I、201Tl；以及α发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac和221At。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，该细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成，其中放射性同位素是177Lu。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，其中细胞毒性部分包含细胞毒性药物或由细胞毒性药物组成。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，该细胞毒性部分包含细胞毒性药物或由细胞毒性药物组成，其中细胞毒性药物选自由以下项组成的组：细胞抑制药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜素及其代谢物；毒素(诸如皂草素或卡奇霉素)；化学治疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗肿瘤疾患的任何其他细胞毒性药物。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分，该细胞毒性部分包含细胞毒性药物或由细胞毒性药物组成，其中细胞毒性药物适用于活化疗法，诸如光子活化疗法、中子活化疗法、中子诱导的俄歇电子疗法、同步加速器辐射疗法、或低能量X射线光子活化疗法。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分，其中可检测部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分，该可检测部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成，其中放射性同位素选自由以下项组成的组：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分，该可检测部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成，其中放射性同位素是89Zr。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含一对可检测和细胞毒性放射性同位素，诸如86Y/90Y或124I/211At。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含放射性同位素，该放射性同位素能够以多模态方式同时充当可检测部分和细胞毒性部分。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分，该可检测部分包含顺磁性同位素或由顺磁性同位素组成。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分，该可检测部分包含顺磁性同位素或由顺磁性同位素组成，其中顺磁性同位素选自由以下项组成的组：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含可检测部分，其中可检测部分是通过成像技术诸如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像可检测的。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分和/或可检测部分，其中细胞毒性部分和/或可检测部分经由连接部分来间接地接合至抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分和/或可检测部分，其中细胞毒性部分和/或可检测部分经由连接部分来间接地接合至抗体或其抗原结合片段，其中连接部分是螯合剂。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段包含细胞毒性部分和/或可检测部分，其中细胞毒性部分和/或可检测部分经由连接部分来间接地接合至抗体或其抗原结合片段，其中连接部分是螯合剂，并且其中螯合剂选自由以下项组成的组：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段不包含细胞毒性部分或可检测部分。
本发明进一步包括对人白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段能够抑制本文所公开的抗体48D2与IL1RAP的结合。
如本文所用，术语“能够抑制抗体48D2与IL1RAP的结合”意指另一种抗体的存在全部或部分抑制48D2与IL1RAP的结合。此类竞争性结合抑制可以使用本领域众所周知的测定和方法来进行确定，例如使用具有固定化IL1RAP的BIAcore芯片并且与48D2一起孵育(具有或没有待测试的抗体)。可替代地，可以使用成对映射方法，其中将抗体48D2固定到BIAcore芯片的表面，IL1RAP抗原与固定化抗体结合，然后测试第二抗体的同时IL1RAP结合能力(参见‘BIAcore测定手册(BIAcore Assay Handbook)’,GE医疗生命科学部(GE HealthcareLife Sciences),29-0194-00AA05/2012；所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
在其他替代方案中，竞争性结合抑制可以使用流式细胞术来进行确定。例如，为了测试测试抗体是否能够抑制48D2抗体与细胞表面抗原的结合，表达抗原的细胞可以与测试抗体一起预孵育20min，然后将细胞洗涤并且与与缀合至荧光团的48D2抗体一起孵育，该荧光团可以通过流式细胞术来进行检测。如果与测试抗体的预孵育降低了流式细胞术中48D2抗体的检测，则测试抗体抑制参考抗体与细胞表面抗原的结合。如果待测试的抗体对IL1RAP表现出高亲和力，则可以使用缩短的预孵育期(或甚至根本不进行预孵育)。
抗体的产生
本发明的第二方面涉及一种多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，或其组件多肽链。
如本文所用，术语“多核苷酸”包括DNA(例如基因组DNA或互补DNA)和mRNA分子，其可以是单链或双链的。
在一些实施例中，多核苷酸是分离的多核苷酸。
在一些实施例中，多核苷酸是cDNA分子。
本领域技术人员应当理解，多核苷酸可以是密码子优化的，以用于在特定宿主细胞中表达(例如，用于在人细胞中表达)抗体或抗原结合片段(例如，参见，Angov,2011,《生物技术杂志(Biotechnol.J.)》6(6):650-659，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
在一些实施例中，编码本发明的抗体或抗原结合片段的多核苷酸正在编码抗体轻链或其可变区。
在一些实施例中，编码本发明的抗体或抗原结合片段的多核苷酸正在编码抗体重链或其可变区。
本发明的第三方面涉及一种载体，该载体包含根据本发明的第二方面的多核苷酸。
在一些实施例中，所述载体是表达载体。
术语“表达载体”在本文被定义为DNA分子，例如线性或环状的，其包含编码本发明的多肽(抗体或其抗原结合片段)的多核苷酸并且可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸。术语“质粒”、“表达载体”和“载体”可互换使用，因为质粒通常是目前最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括提供本领域已知的等效功能的此类其他形式的表达载体。如本文所用，“表达载体”或“载体”是指含有DNA序列的DNA构建体，该序列可操作地连接至能够影响DNA在合适宿主中的表达的合适对照序列。此类对照序列可以例如包括影响转录的启动子、控制此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译的终止的序列。载体可以是例如质粒、噬菌体或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化至合适的宿主中，载体可以例如独立于宿主基因组而复制并且发挥作用，或者在某些情况下可以整合至基因组本身中。表达载体例如如以下文献所述进行设计：Li等人(《开发用于在CHO细胞中生产重组单克隆抗体的表达载体的构建策略(Construction strategiesfor developing expression vectors for recombinant monoclonal antibodyproduction in CHO cells)》,《分子生物学报告(Mol Biol Rep.)》2018年12月；45(6):2907-2912)。
本发明的第四方面涉及一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含根据本发明的第二方面的多核苷酸或根据本发明的第三方面的载体。
在一些实施例中，重组宿主细胞是细菌细胞。
在一些实施例中，重组宿主细胞是酵母细胞。
在一些实施例中，重组宿主细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施例中，重组宿主细胞是人细胞。
本发明的第五方面涉及一种用于产生本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括在允许表达经编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的第四方面的宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的第二方面的多核苷酸或本发明的第三方面的载体。
药物组合物
本发明的第六方面涉及一种药物组合物，其包含
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，和/或
本发明的第四方面的宿主细胞，
在药物组合物中，其中组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
在一些实施例中，组合物包含有效量的以下物质
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，和/或
本发明的第四方面的宿主细胞。
本领域技术人员应当理解，药物组合物中还可以包括额外化合物，其包括螯合剂(诸如EDTA、柠檬酸盐、EGTA或谷胱甘肽)。
药物组合物可以以本领域已知的方式制备，该方式足够储存稳定并且适用于向人类和动物进行施用。例如，药物组合物可以被冻干，例如通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾冷却或通过使用来自超临界颗粒形成的颗粒形成。
术语“药学上可接受的”旨在意指不降低本发明的抗体或抗原结合片段的IL1RAP结合活性的有效性的无毒材料。药学上可接受的缓冲液、载体、稀释剂或赋形剂例如是本领域众所周知的。
术语“缓冲液”旨在意指以稳定pH为目的的含有酸碱混合物的水溶液。缓冲液的实例是Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、二甲胂酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO和TES。
术语“稀释剂”旨在意指以稀释药物制剂中的抗体或抗原结合片段为目的的水溶液或非水溶液。稀释剂可以是盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)中的一者或多者。
术语“佐剂”旨在意指被添加到调配物以增加本发明的抗体或抗原结合片段的生物效应的任何化合物。佐剂可以是与不同阴离子的锌盐、铜盐或银盐中的一种或多种盐，该阴离子例如但不限于氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、硫氰酸根、亚硫酸根、氢氧根、磷酸根、碳酸根、乳酸根、乙醇酸根、柠檬酸根、硼酸根、酒石酸根和不同酰基组合物的乙酸根。佐剂还可以是阳离子聚合物(诸如阳离子纤维素醚、阳离子纤维素酯)、脱乙酰透明质酸、壳聚糖、阳离子树枝状聚合物、阳离子合成聚合物(诸如聚(乙烯基咪唑))和阳离子多肽(诸如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸和含有这些氨基酸的肽)。
赋形剂可以是碳水化合物、聚合物、脂质和矿物质中的一者或多者。碳水化合物的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和环糊精，它们被添加到组合物中，例如以用于促进冻干。聚合物的实例是淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯，以及聚乙烯吡咯烷酮，所有这些均具有不同的分子量，它们被添加到组合物，例如以用于粘度控制，用于实现生物粘附，或用于保护脂质免于化学和蛋白水解降解。脂质的实例是脂肪酸、磷脂、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯、神经酰胺、鞘脂和糖脂(它们均具有不同的酰基链长度和饱和度)、蛋卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化蛋卵磷脂和大豆卵磷脂(出于与聚合物类似的原因，它们被添加到组合物)。矿物质的实例是滑石粉、氧化镁、氧化锌和氧化钛，它们被添加到组合物以获得益处，诸如液体积聚的减少或有利的颜料特性。
可以将本发明的抗体或抗原结合片段调配为适用于其递送的本领域已知的任何类型的药物组合物。
在一些实施例中，本发明的药物组合物可以呈脂质体的形式，其中除了其他药学上可接受的载体外，抗体或抗原结合片段还与两亲性药剂(诸如脂质)结合，该两亲性药剂以聚集形式作为胶束、不溶性单分子层和液晶而存在。用于脂质体调配物的合适的脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。合适的脂质还包括上述脂质，该脂质在极性首基中由聚(乙二醇)来进行修饰，以用于延长血流循环时间。此类脂质体调配物的制备可以在例如US 4,235,871中找到，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
本发明的药物组合物也可以呈生物可降解微球的形式。脂族聚酯，诸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA和PGA的共聚物(PLGA)或聚(己内酯)(PCL)以及聚酸酐已经在微球的生产中被广泛用作生物可降解聚合物。此类微球的制备可以在US 5,851,451和EP 0213 303中找到，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
在其他实施例中，本发明的药物组合物以聚合物凝胶的形式进行提供，其中聚合物(诸如淀粉、纤维素醚、纤维素羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、藻酸盐、角叉菜胶、透明质酸及其衍生物、聚丙烯酸、聚乙烯基咪唑、聚磺酸盐、聚乙二醇/聚环氧乙烷、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙酸乙烯酯，以及聚乙烯吡咯烷酮)用于含有该药剂的溶液的增稠。聚合物还可以包含明胶或胶原蛋白。
可替代地，可以将抗体或抗原结合片段简单地溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(诸如红花油、玉米油、花生油、棉籽油或芝麻油)、黄芪胶和/或各种缓冲液。
应当理解，本发明的药物组合物可以包括用于增强活性抗体或抗原结合片段的作用的离子和经定义的pH。此外，组合物可以进行常规制药操作(诸如灭菌)和/或可以含有常规佐剂(诸如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、缓冲液、填料等)。
根据本发明的药物组合物可以经由本领域技术人员已知的任何合适的途径来进行施用。因此，可能的施用途径包括肠胃外(静脉内、皮下和肌内)、局部、眼部、鼻腔、肺部、口腔、口服、肠胃外、阴道和直肠。而且，从植入物中施用也是可能的。
在一个优选实施例中，药物组合物以如下方式进行施用：肠胃外，例如静脉内、脑室内、关节内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下，或者它们可以通过输注技术来进行施用。优选地，药物组合物是静脉内施用的。它们方便地以无菌水溶液的形式使用，该无菌水溶液可以含有其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果有必要，则水溶液应当适当地缓冲(优选地，缓冲至pH为3至9)。通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术容易地实现在无菌条件下制备合适的肠胃外调配物。
适用于肠胃外施用的调配物包含水性和非水性无菌注射溶液，这些注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使该调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，这些悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。该调配物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以储存在仅需要紧接着在使用之前添加无菌液体载体(例如，注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。可以由前述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
因此，本发明的药物组合物特别适用于肠胃外(例如静脉内)施用。
可替代地，药物组合物可以鼻内施用或通过吸入施用(例如，呈来自加压容器、泵、喷雾器或雾化器中的气溶胶喷雾形式，使用合适的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃诸如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3)、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以含有活性抗体或抗原结合片段的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可能另外地含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可以被调配为含有本发明的化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
优选地安排气溶胶或干粉调配物，使得每个计量剂量或‘抽吸(puff)’含有至少1mg的本发明的化合物，以用于递送至患者。应当理解，具有气溶胶的总每日剂量将因患者而异，并且可以在一整天内以单剂量或更通常地以分次剂量施用。
可替代地，本发明的抗体或抗原结合片段可以以栓剂或阴道药栓的形式进行施用，或者它们可以以洗剂、溶液、乳膏、软膏或扑粉的形式进行局部应用。本发明的化合物也可以经皮施用，例如，通过使用皮肤贴片。它们也可以通过眼部途径来进行施用。
对于眼科使用，本发明的抗体或抗原结合片段可以被调配为于等渗、pH经调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选地，调配为于等渗、pH经调节的无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂(诸如苄扎氯铵)组合。可替代地，它们可以在软膏(诸如凡士林)中进行调配。
为了局部应用于皮肤，本发明的抗体或抗原结合片段可以被调配为合适的软膏，该软膏含有悬浮或溶解在例如与以下中的一者或多者的混合物中的活性化合物：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替代地，它们可以被调配为合适的洗剂或乳膏，其悬浮或溶解在例如以下中的一者或多者的混合物中：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
药物组合物将以药学上有效的剂量向患者进行施用。如本文所用，“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”是指向给定病症和施用方案提供治疗效果的量。这是预先确定的量的活性材料，该活性材料经计算与所需的添加剂和稀释剂(即载体或施用媒介物)一起产生所需治疗效果。此外，它旨在意指足以减少并且最优选地预防宿主在的活性、功能和应答中的临床上显著缺陷的量。可替代地，治疗有效量足以引起宿主中的在临床上显著的病症中的改善。如本领域技术人员所理解的，化合物的量可以取决于其比活性而变化。合适的剂量可以含有预先确定的量的活性组合物，该活性组合物经计算与所需的稀释剂一起产生所需治疗效果。在制造本发明的组合物的方法和用途中，提供了治疗有效量的活性组分。治疗有效量可以由普通熟练的医学工作者或兽医工作者基于患者特征(诸如年龄、体重、性别、状况、并发症、其他疾病等)来进行确定，如本领域众所周知的。药学上有效的剂量的施用可以通过以单个剂量单位或若干较小剂量单位的形式进行单次施用来执行，并且也可以通过以特定间隔多次施用细分剂量来执行。可替代地，该剂量可以作为长时间内的连续输注来进行提供。
在本发明的抗体或抗原结合片段的诊断用途的上下文中，如本文所用，“药学上有效量”或“有效量”或“诊断上有效”是指提供用于诊断(例如用于体内成像目的)的可检测信号的量。
抗体或抗原结合片段可以被调配为各种浓度，这取决于所使用的抗体或抗原结合片段的功效/毒性。例如，调配物可以包含活性抗体或抗原结合片段，该活性抗体或抗原结合片段的浓度在0.1μM与1mM之间、更优选地在1μM与500μM之间、500μM与1mM之间、300μM与700μM之间、1μM与100μM之间、100μM与200μM之间、200μM与300μM之间、300μM与400μM之间、400μM与500μM之间、500μM与600μM之间、600μM与700μM之间、800μM与900μM之间或900μM与1mM之间。通常，该调配物包含浓度在300μM与700μM之间的活性抗体或抗原结合片段。
通常，人类患者中的抗体或抗原结合片段(具有或没有治疗部分)的治疗剂量将在每次施用100μg至1g的范围内(基于70kg的体重，例如介于每次施用300μg至700mg之间)。例如，最大治疗剂量可以在每次施用0.1mg/kg至10mg/kg，例如0.1mg/kg与5mg/kg之间、或1mg/kg与5mg/kg之间或0.1mg/kg与2mg/kg之间的范围内。在一些实施例中，治疗剂量可以是5mg/kg、20mg/kg或50mg/kg，或由这些值形成的任何范围。例如，治疗剂量可以是5mg/kg至50mg/kg、5mg/kg至20mg/kg或20mg/kg至50mg/kg。应当理解，此类剂量可以以不同间隔进行施用，如由肿瘤学家/医师所确定的；例如，剂量可以每天、每周两次、每周、每两周或每月施用。
本领域技术人员将理解，本发明的药物组合物可以单独施用或与用于治疗炎性、纤维化和/或肿瘤疾患或疾病的其他治疗剂组合施用。
在一些实施例中，所述组合物适于肠胃外递送。
在一些实施例中，所述组合物适于静脉内递送。
在一些实施例中，所述组合物适于局部递送。
在一些实施例中，所述组合物适于皮下递送。
在一些实施例中，所述组合物适于肌内递送。
本领域技术人员将进一步理解，本发明的抗体或抗原结合片段以及药物组合物或调配物在医学领域和兽医领域两者均具有实用性。因此，本发明的方法可以用于治疗人类和非人类动物(诸如马、狗和猫)两者。然而，优选地，患者是人。
抗体的适应症和用途
本发明的第七方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于医药中。
本发明的第八方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者
其中疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
在本发明的第八方面的可替代方面，本发明涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的。
在本发明的第八方面的另一个可替代方面，本发明涉及本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患，其中疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
在一些实施例中，所述疾病或疾患与IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导相关联。
在一些实施例中，所述疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
我们所说的“治疗”包括对患者的治疗性治疗以及预防性或防备性治疗两者。术语“防备性的”或“预防性的”用于涵盖如本文所述的抗体或其抗原结合片段或其调配物的用途，其预防或减轻炎性疾病或疾患、纤维化疾病或疾患、肿瘤疾患或疾患的可能性，其还包括预防或减轻在患者或受试者中肿瘤细胞的扩散、传播或转移。术语“预防性”还涵盖如本文所述的抗体或其抗原结合片段或其调配物的用途，以预防先前已经针对这些疾病或疾患中的任何疾病或疾患进行了治疗的患者中的炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患的复发。
我们所说的“诊断”或“检测”包括对与炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患相关联的细胞的检测，该细胞为体内(即在患者的身体内)或离体(即在从患者的身体中移除的组织或细胞样品内)。
我们所说的“缓解”意指但不限于与疾病或疾患相关联的症状或过程减轻，即导致较温和的疾病或疾患。
我们所说的“与表达IL1RAP的细胞相关联的炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患”包括此类疾病或疾患，其中对该疾患直接或间接负责的病理细胞在细胞表面上表达IL1RAP。应当理解，表达IL1RAP的细胞可以是免疫细胞、结缔组织细胞(诸如成纤维细胞)或肿瘤细胞(癌细胞，例如肿瘤细胞本身)。另外，此类细胞包括病理干细胞(即癌症干细胞或CSC)和祖细胞，它们直接或间接负责个体中炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患的发展。CSC的实例在Visvader和Lindeman,2008,《自然癌症综述(Nat Rev Cancer)》8:755-768中公开，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
可替代地或另外地，表达IL1RAP的细胞可以与炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患间接相关联，例如，它们可能介导细胞存活所需的细胞过程。在该事件中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以靶向维持炎性和/或纤维化过程或例如肿瘤的血液供给(血管生成)所必需的细胞，或靶向抑制针对恶性肿瘤细胞的有益免疫应答的细胞(例如抑制性巨噬细胞或T细胞)。
取决于治疗上是否需要杀伤表达IL1RAP的靶细胞，例如在肿瘤细胞的情况下，可以使用能够诱导ADCC的根据本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段。例如，其中表达IL1RAP的靶细胞是癌细胞(诸如CML、AML、ALL、黑色素瘤、肺癌细胞等)，抗体或抗原结合片段能够诱导ADCC可能是有利的，以便于消除此类细胞。然而，应当理解，使用缺乏ADCC活性的抗体或抗原结合片段也可以实现治疗益处，例如通过抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导，从而导致癌症或肿瘤附近的血管生成减少。类似地，在炎性和/或纤维化疾病或疾患的情况下，影响细胞行为但不杀伤细胞可能是有益的。
对用IL-1和/或其他物质(该其他物质可能构成与表达IL1RAP的细胞相关联的炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患)的抑制剂进行治疗易感的病症或疾病状态是本领域众所周知的(参见Dinarello等人,2012,《自然评论(Nature Reviews)》11:633-652和Dinarello,2014,《分子医学(Mol.Med.)》20(增刊1):S43-S58，所述文献的公开内容通过引用并入本文)，并且包括但不限于以下：
类风湿性关节炎、所有类型的关节炎、银屑病关节炎、所有类型的幼年型关节炎，其包括系统性发病幼年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)、穆-韦氏病、新生儿发病多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)综合征、成年发病斯蒂尔氏病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、Sweet病、狼疮性关节炎、阿尔茨海默氏病、银屑病、哮喘、过敏、动脉粥样硬化、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、肝炎、丙型肝炎、缺血再灌注损伤、多发性硬化症、奈瑟氏球菌或肺炎球菌性脑膜炎、结核病、白塞氏综合征、感染性休克、移植物抗宿主病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如，代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、心肌梗塞、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、卒中和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎、反常性痤疮、白塞氏病、心肌纤维化、心血管疾病、cryopyin相关周期性综合征、囊性纤维化、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化(lung fibrosis/pulmonary fibrosis)、皮肤纤维化(skin fibrosis/dermalfibrosis)、心肌炎、自身免疫性心肌炎、与器官移植相关联的器官功能障碍、胰腺炎、腹膜炎、葡萄膜炎、血管炎、肺炎、肺动脉高压、硬皮病慢性移植物抗宿主病、败血症、干燥综合征、高安氏动脉炎和痛风。
还据信阻断IL-1信号传导有益于治疗心肌梗塞。寻求广泛的临床试验来确认心肌梗塞后抗IL-1β抗体阻断(使用卡那单抗)的功效(CANTOS试验；参见Ridker等人.,2011,《美国心脏学杂志(Am Heart Journal)》162(4):597-605，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
对于此类适应症，应当理解，治疗益处也可以使用抗体或抗原结合片段来实现，该抗体或抗原结合片段结合IL1RAP并且由此阻断与免疫细胞相关联的IL-1和/或IL-33和/或IL-36信号传导。此类抗体可以被修饰为缺乏ADCC活性。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是炎性和/或纤维化和/或肿瘤疾病或疾患。
关于本发明的治疗和预防方面，本领域技术人员将理解抗体或其抗原结合片段与存在于与炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患相关联的细胞表面上的IL1RAP的结合可能导致IL1RAP生物活性的调节(即增加或降低)。然而，此类调节效应不是必需的；例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以仅仅借助于结合与疾病或疾患相关联的细胞表面上的IL1RAP而引发治疗和预防效应，这进而可以触发免疫系统以诱导过程，诸如细胞死亡(例如通过ADCC和/或通过药剂内的细胞毒性/放射性部分的存在)。
在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段抑制IL1RAP的生物活性。
我们所说的“IL1RAP的生物活性”包括任何相互作用或信号传导事件，该相互作用或信号传导事件涉及与炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患相关联的细胞上的IL1RAP。例如，在一个实施例中，抗体或其抗原结合片段能够阻断一种或多种共受体与IL1RAP(诸如IL1R1、ST2、C-KIT和/或IL1RL2)的结合。此外，如上文所详述，在一些实施例中，对IL1RAP具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导。
本领域技术人员将理解，“抑制细胞因子的信号传导”(诸如IL-1家族的细胞因子，诸如抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导)导致IL1RAP的生物活性的抑制。
本发明的抗体或其抗原结合片段对IL1RAP的生物活性的此类抑制可以是全部的或部分的。例如，相比于与炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患相关联的细胞(该细胞未暴露于抗体或其抗原结合片段的)中的IL1RAP的生物活性，抗体或其抗原结合片段可以抑制IL1RAP的生物活性至少10％，优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，并且最优选地抑制100％。在优选实施例中，相比于与炎性、纤维化和/或肿瘤疾病或疾患相关联的细胞(该细胞未暴露于抗体或其抗原结合片段的)中的IL1RAP的生物活性，抗体或其抗原结合片段能够抑制IL1RAP的生物活性50％或更多。
同样，应当理解，与肿瘤疾病或疾患相关联的细胞的生长和/或增殖的抑制可以是全部的或部分的。例如，相比于与肿瘤疾病或疾患相关联的细胞(该细胞未暴露于抗体或其抗原结合片段的)的生长和/或增殖，抗体或其抗原结合片段可以抑制与肿瘤疾病或疾患相关联的细胞的生长和/或增殖至少10％，优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，并且最优选地抑制100％。
疾病中的IL-1、IL-33和IL-36
IL-1与范围为从痛风到癌症的多种疾病和病症有关(对于评论，参见Dinarello等人,2012,《自然评论》11:633-652和Dinarello,2014,《分子医学(Mol.Med.)》20(增刊1):S43-S58；所述文献的公开内容通过引用并入本文)，其包括：
·关节、骨骼和肌肉疾病，诸如类风湿性关节炎和骨关节炎；
·遗传性系统性自身炎性疾病，诸如家族性地中海热；
·系统性自身炎性疾病，诸如系统性幼年特发性关节炎和成年发病斯蒂尔氏病；
·常见炎性疾病，诸如痛风和2型糖尿病；
·急性发病缺血性疾病，诸如心肌梗塞；以及
·癌症。
许多用于阻断IL-1活性的疗法获得批准并且正在开发中。靶向IL-1开始于1993年，其中引入阿那白滞素(Kineret；安进(Amgen)公司)，即一种天然存在的IL-1受体拮抗剂的重组形式(IL-1Ra或IL1RA)，其阻断IL-1α和IL-1β的活性；该治疗药物后来已经被用于证明IL-1在许多疾病中的作用(参见上文)。由于其良好的安全记录、半衰期短和多种施用途径，阿那白滞素当前在IL-1治疗领域占据主导地位。用抗体或可溶性受体来中和IL-1也被证明是有效的，并且可溶性诱饵受体利纳西普(Arcalyst；美国再生元制药(Regeneron)公司)和抗IL-1β中和单克隆抗体卡那单抗(Ilaris；诺华(Novartis)公司)现在已经获得批准。其他治疗方法(包括IL-1α中和、靶向IL-1β的治疗性疫苗和嵌合IL-1Ra)处于早期临床试验中。另外，已经开发并且正在测试具有口服活性的IL-1产生的小分子抑制剂，诸如半胱天冬酶1抑制剂。
类似地，如上文所详述，新出现的证据表明IL-33在疾病中的影响。如上文所详述，IL-33已经与例如哮喘、过敏性疾病、炎性肠病和皮炎有关。重要的是，IL-33与纤维化和炎症有关(Kotsiou等人2018,《器官纤维化中的IL-33/ST2轴(IL-33/ST2 Axis in OrganFibrosis)》,《免疫学前沿》2018年10月24日；9:2432)。IL-33可以有效刺激多种细胞，并且其多效性的本质反映在IL-33在组织和代谢稳态、感染、炎症、癌症和中枢神经系统疾病中的作用中。
类似地，如上文所详述，有新出现的证据表明IL-36在疾病中的影响，尽管该领域仍在演进，并且与IL-1相比，与IL-36有关的知识仍然有限。如上文所详述，新出现的证据指示IL-36信号传导参与先天性和适应性免疫应答的活化(Ding L,《在自身免疫性和炎性疾病中的IL-36细胞因子》,《肿瘤靶标》,第9卷,(第2期),第2895-2901页(2018))。除了其在炎性皮肤病(诸如银屑病和特应性皮炎)中起作用外，新出现的证据也表明异常的IL-36活性还会促进肺、肾脏和肠道中的炎性疾病，这强调IL-36作为针对常见炎性疾病的治疗靶标的潜力。
本领域技术人员将理解，本发明的抗体或其抗原结合片段可能或预期对炎性和/或纤维化疾病或疾患具有深远影响，例如由于抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导的能力，从而同时靶向若干IL依赖性通路。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是炎性和/或纤维化疾病或疾患。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是炎性和/或纤维化疾病或疾患，其中炎性和/或纤维化疾病或疾患选自由以下项组成的组：类风湿性关节炎、所有类型的关节炎、银屑病关节炎、所有类型的幼年型关节炎，其包括系统性发病幼年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)、穆-韦氏病、新生儿发病多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)综合征、成年发病斯蒂尔氏病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、Sweet病、狼疮性关节炎、阿尔茨海默氏病、银屑病、哮喘、过敏、动脉粥样硬化、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、肝炎、丙型肝炎、缺血再灌注损伤、多发性硬化症、奈瑟氏球菌或肺炎球菌性脑膜炎、结核病、白塞氏综合征、感染性休克、移植物抗宿主病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如，代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、心肌梗塞、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、卒中和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎、反常性痤疮、白塞氏病、心肌纤维化、心血管疾病、cryopyin相关周期性综合征、囊性纤维化、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化(lung fibrosis/pulmonaryfibrosis)、皮肤纤维化(skin fibrosis/dermal fibrosis)、心肌炎、自身免疫性心肌炎、与器官移植相关联的器官功能障碍、胰腺炎、腹膜炎、葡萄膜炎、血管炎、肺炎、肺动脉高压、硬皮病慢性移植物抗宿主病、败血症、干燥综合征、高安氏动脉炎和痛风。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是系统性硬化症，也称为硬皮病或系统性硬皮病。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是腹膜炎，诸如急性腹膜炎。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是银屑病。在一些实施例中，所述疾病或疾患是银屑病关节炎。在一个实施例中，所述疾病或疾患是银屑病和银屑病关节炎。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是动脉粥样硬化。在一些实施例中，本发明的本文所公开的在预防、治疗、缓解、检测和/或诊断动脉粥样硬化中的用途包括：减轻动脉粥样硬化，例如减轻动脉粥样硬化的临床体征、症状或病理生理相关性，例如减轻动脉粥样硬化斑块炎症(诸如主动脉斑块炎症)，和/或减轻斑块大小(例如，斑块体积和/或斑块面积)。
斑块炎症可以使用主动脉的流式细胞术分析基于CD45+白细胞的细胞计数来进行评估(例如，如实例4所示)。相对于健康对照主动脉，测试主动脉(例如，被怀疑或诊断为动脉粥样硬化主动脉的主动脉)中CD45+白细胞计数较高指示动脉粥样硬化斑块炎症。在一些实施例中，白细胞计数可以基于骨髓CD11b+细胞(包括Ly6G+中性粒细胞)和/或TCR-β+细胞(包括CD4+和/或CD8+细胞)来进行评估。
斑块大小可以基于斑块体积和/或斑块面积来进行评估。相对于健康对照主动脉(其可能不存在斑块)，测试主动脉(例如，被怀疑或诊断为动脉粥样硬化主动脉的主动脉)中的斑块大小(例如斑块体积和/或斑块面积)增加指示存在动脉粥样硬化斑块。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是肺纤维化(lung fibrosis)，也称为肺纤维化(pulmonary fibrosis)。
纤维化是众多疾病的标志。在一些情况下，纤维化可能是疾病的组成部分，这意味着纤维化可能是导致胞外基质蛋白病理性沉积的异常或病理性细胞行为的结果。在其他情况下，纤维化可能是病变组织中发生的继发事件，该纤维化与原发疾病平行或在愈合过程中发生。例如，纤维化可能是瘢痕形成。任何类型的纤维化均可能被如本文所公开的抗体靶向，例如治疗或预防。纤维化可以归类为不受控制或失调的瘢痕组织形成，这可能是由胞外基质组分(诸如胶原蛋白)的过度积聚引起的。因此，本发明的本文所公开的在纤维化的预防、治疗、缓解、检测和/或诊断中的用途可以在疾病(对于该疾病，纤维化作为标志)的预防、治疗、缓解、检测和/或诊断的上游。可替代地或另外地，本发明的本文所公开的在纤维化的预防、治疗、缓解、检测和/或诊断中的用途可以在疾病(对于该疾病，纤维化是所述疾病中的继发事件)的下游。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是心肌炎。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是自身免疫性心肌炎。
在一些实施例中，本发明的本文所公开的在预防、治疗、缓解、检测和/或诊断心肌炎(诸如自身免疫性心肌炎)中的用途包括：减轻心肌炎(诸如自身免疫性心肌炎)，例如减轻心肌炎(诸如自身免疫性心肌炎)的临床体征、症状或病理生理相关性，例如减轻心脏功能恶化、减轻炎症和/或减轻纤维化。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是移植物抗宿主病，其包括慢性移植物抗宿主病和硬皮病慢性移植物抗宿主病。在一个实施例中，所述疾病或疾患是移植物抗宿主病中的皮肤纤维化和/或肺纤维化。在特定实施例中，移植物抗宿主病是由同基因移植引起的。在可替代实施例中，移植物抗宿主病是由同种异基因移植引起的。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是急性炎性疾病或疾患。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是慢性炎性疾病或疾患。
本领域技术人员将理解，疾病或疾患以不同方式分组。虽然疾病或疾患可能未明确标记为炎性或纤维化疾病，但它可能仍具有炎性和/或纤维化组分，例如形成疾病或疾患的一部分或有助于疾病或疾患的炎性和/或纤维化过程。
在一些实施例中，所述疾病或疾患具有炎性和/或纤维化组分。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是自身免疫性疾病或疾患。
在一些实施例中，本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段抑制炎性过程。
在一些实施例中，本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段抑制纤维化过程。
在一些实施例中，本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段抑制增殖性过程。
IL1RAP作为肿瘤疾病或疾患的生物标志物
瘤指示肿瘤疾病或疾患(即癌症)，是组织或细胞(例如肿瘤)的一种类型的异常和过度生长(也称为瘤形成)。
肿瘤生物标志物或者肿瘤疾病或疾患的生物标志物是内源性蛋白质或代谢物，其数量或修饰指示肿瘤状态、进展特征和对疗法的应答。它们存在于肿瘤组织或体液中并且涵盖多种分子，该多种分子包括转录因子、细胞表面受体和分泌蛋白。对有效的肿瘤标志物的需求量很大，因为它们有可能通过促进早期癌症诊断并且通过有助于个性化来治疗减少癌症死亡率。在过去十年期间，对致癌作用和肿瘤进展的理解得到改善，这已经揭示了大量潜在的肿瘤标志物。据预测，随着当前技术(诸如组织微阵列、抗体阵列和质谱法)的应用，在不久的将来还将发现甚至更多。
白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)先前已经被鉴定为与血液肿瘤疾患(诸如慢性髓样白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS))相关联的细胞表面生物标志物(例如，参见对Cantargia AB的WO 2011/021014,等人,2010,《美国国家科学院院刊》107(37):16280-5,Askmyr等人,2013,《血液》.121(18):3709-13和Barreyro等人,2012,《血液》120(6):1290-8，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。最近，也已经揭示了IL1RAP作为用于实体瘤(诸如黑色素瘤)的诊断和治疗生物标志物的有用性(参见对Cantargia AB的WO 2012/098407，所述文献的公开内容通过引用并入本文)。
因此，在本发明的上述方面的一些实施例中，所述疾病或疾患是肿瘤疾病或疾患。
本领域技术人员将理解，本发明的抗体可能对肿瘤疾病或疾患具有深远影响，例如由于能够抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导的能力，从而同时靶向若干IL依赖性通路。
在一些实施例中，所述疾病或疾患是肿瘤疾病或疾患，其中肿瘤疾病或疾患是血液疾病或疾患，或实体瘤。
在一些实施例中，所述肿瘤疾病或疾患是血液疾病，其中肿瘤血液疾病或疾患选自由以下项组成的组：慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性疾患(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
在一些实施例中，所述肿瘤疾病或疾患是实体瘤，其中实体瘤选自由以下项组成的组：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、泌尿器官癌、胆道癌(也称为胆道癌)、宫颈癌、食道癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。
本领域技术人员将理解，预期本发明的抗体对肿瘤疾病或疾患具有深远影响，例如由于能够抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的信号传导的能力，从而同时靶向若干IL依赖性通路。
本领域技术人员，例如根据上述证据，将理解本发明的抗体可以用于预防、治疗、缓解、检测和/或诊断受IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ的活性影响的任何疾病或疾患。
本发明的第九方面涉及本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其用于诱导受试者中与肿瘤疾患相关联的病理细胞或其干细胞或祖细胞的细胞死亡和/或抑制受试者中与肿瘤疾患相关联的病理细胞或其干细胞或祖细胞的生长和/或增殖，其中细胞表达IL1RAP。
本发明的第十方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其在制备用于预防、治疗、缓解、检测和/或诊断疾病或疾患的药物中的用途，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，
并且/或者其中疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
本发明的第十一方面涉及
本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
本发明的第二方面的多核苷酸，
本发明的第三方面的载体，
本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
本发明的第六方面的组合物，
其在制备用于检测和/或诊断疾病或疾患的药物中的用途，该疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
本发明的第十二方面涉及一种用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患的方法，该疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者其中疾病或疾患与受试者中表达IL1RAP的细胞相关联，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第十三方面涉及一种用于检测受试者中表达IL1RAP的细胞的体外方法，该方法包括：
(a)提供来自待测试的受试者的细胞的样品，诸如活检组织或血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化样品中存在的细胞；
(c)使本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段与样品中存在的细胞接触；
(d)确定抗体或其抗原结合片段是否与细胞结合
其中抗体或其抗原结合片段与细胞的结合指示受试者的组织中存在与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患。
本发明的第十四方面涉及一种用于鉴别患有与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患的患者的体外方法，该患者将受益于用本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段进行的治疗，该方法包括:
(a)提供细胞的样品，诸如来自待测试的患者的活检组织或血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化样品中存在的细胞；
(c)使本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段与样品中存在的细胞接触；
(d)确定抗体或其抗原结合片段是否与细胞结合
其中抗体或其抗原结合片段与表达IL1RAP的细胞的结合指示将受益于用本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段进行的治疗的患者。
本发明的第十五方面涉及一种用于治疗患有与细胞表达IL1RAP相关联的疾病或疾患的患者的方法，该方法包括：
a)选择使用根据本发明的第十四方面的方法被鉴别为患有与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患的患者；以及
b)向所述患者施用有效治疗所述疾病或疾患的治疗剂。
本发明的第十六方面涉及一种用于检测表达IL1RAP的细胞的方法，该方法包括：
(a)使根据第一方面的抗体或其抗原结合片段与待分析其IL1RAP表达的细胞接触；
(b)确定抗体或其抗原结合片段是否与细胞结合
其中抗体或其抗原结合片段与细胞的结合指示受试者的组织中存在与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患。
在一些实施例中，第十六方面的方法是体外方法。
在一些实施例中，第十六方面的方法是体内方法。
本领域技术人员将理解，如果应用第十六方面的方法，则向受试者施用对IL1RAP具有结合特异性的抗体或抗原结合片段，例如根据本文的描述。
本发明的第十七方面涉及一种用于减轻患有腹膜炎的受试者中炎症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
在一些实施例中，用于减轻患有腹膜炎的受试者中炎症的所述方法包括：减少将免疫细胞(例如中性粒细胞和单核细胞)浸润到腹膜中。
在一些实施例中，用于减轻患有腹膜炎的受试者中炎症的所述方法包括：减少细胞因子的水平，例如减少嗜酸细胞活化趋化因子、G-CSF、IL-5、MCP-1、MIP-1β、IL-6和/或KC(也称为CXCL1)的水平。
本发明的第十八方面涉及一种用于减轻患有银屑病或银屑病关节炎的受试者中的疾病严重性的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
在一些实施例中，用于减轻患有银屑病或银屑病关节炎的受试者中疾病严重性的所述方法包括：减少皮肤炎症和/或皮肤的红斑。
在一些实施例中，用于减轻患有银屑病或银屑病关节炎的受试者中疾病严重性的所述方法包括：减少细胞因子的水平，例如减少IL-17的水平。
本发明的第十九方面涉及一种用于减轻患有动脉粥样硬化的受试者中的动脉粥样硬化斑块炎症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
在一些实施例中，用于减轻患有动脉粥样硬化的患者中动脉粥样硬化斑块炎症的所述方法包括：减少CD45+白细胞(例如骨髓CD11b+细胞，例如Ly6G+中性粒细胞)的数量，和/或减少TCR-β+细胞(例如CD4+和/或CD8+细胞)的数量。
本发明的第二十方面涉及一种用于减少患有动脉粥样硬化的受试者中的动脉粥样硬化斑块体积和/或动脉粥样硬化斑块大小的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十一方面涉及一种用于减轻患有心肌炎的受试者中的炎症和/或纤维化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十二方面涉及一种用于抵消患有心肌炎或自身免疫性心肌炎的受试者中的心脏功能恶化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
本发明的第二十三方面涉及一种用于减轻患有系统性硬化症的受试者中的皮肤纤维化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
在一些实施例中，用于减轻患有系统性硬化症的受试者中皮肤纤维化的所述方法包括：减少皮肤厚度，减少肌成纤维细胞的数量和/或减少皮肤中胶原蛋白的量。
本发明的第二十四方面涉及一种用于减轻患有系统性硬化症的受试者中的肺纤维化的方法，该方法包括向受试者施用有效量的以下的步骤
-本发明的第一方面的抗体或抗原结合片段，
-本发明的第二方面的多核苷酸，
-本发明的第三方面的载体，
-本发明的第四方面的宿主细胞，和/或
-本发明的第六方面的组合物。
在一些实施例中，用于减轻患有系统性硬化症的受试者中肺纤维化的所述方法包括：减少肺中的Ashcroft评分和/或胶原蛋白的量。
与第八方面有关(例如与以下有关：对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗易感的疾病或疾患；和/或与以下有关：与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患)的实施例和解释也应当应用于本发明的第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五和/或第十六方面。它们也可以应用于本发明的第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三或第二十四方面。
实例
实例1：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)对细胞因子信号传导的抑制
目的
该实例说明鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)关于阻断IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导的表征。
材料和方法
鸡用小鼠IL1RAP抗原进行免疫化，并且鉴定出多种抗小鼠IL1RAP结合物。将这些的一部分克隆到小鼠IgG2a骨架中。一种此类克隆，mCAN10，其能够结合小鼠IL1RAP的结构域2，被评估其抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导的能力。
对于该评估，使用了用鼠IL-1R稳定转染的HEK-BlueTM细胞。可替代地，为了也允许分析鼠IL-33和IL-36信号传导，HEK-BlueTM细胞在测定前一天用鼠IL-33和IL-36受体瞬时转染。将HEK-BlueTM细胞接种到96孔板中，并且允许其在继续之前静置最少2小时。然后，在添加鼠细胞因子之前，将细胞暴露于浓度增加的mCAN10(0μg/ml、0.001μg/ml、0.003μg/ml、0.01μg/ml、0.03μg/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml)，并且在37℃、5％ CO2下孵育1小时。以下列浓度添加细胞因子：3pg/ml IL-1α、30pg/mlIL-1β、5ng/ml IL-33、4ng/ml IL-36α、5ng/ml IL-36β和10ng/ml IL-36γ。由于小鼠IL-1α和IL-1β可能与由HEK-BlueTM细胞内源性表达的人IL-1R进行交叉反应，因此在用小鼠IL-1α和IL-1β刺激这些细胞之前，使用抗人IL1RAP抗体以经由IL-1R来阻断信号传导。将细胞在37℃、5％ CO2下培养16-18小时，然后使用QUANTI-BlueTM溶液来分析NF-κB的活化以及后续的SEAP生产，该溶液使用SpectraMax i3x分光光度计在620nm处进行测量。
结果
将mCAN10以增加的浓度添加到HEK-BlueTM细胞，并且小鼠IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β或IL-36γ以恒定浓度添加。620nm处的光密度值图表用于计算表2中示出的IC50值。mCAN10诱导了IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ信号传导的抑制。
表2：mCAN10在不同信号传导通路上的IC50值[nM]，其从HEK-BlueTM测定中获得
| IC50[nM] | IL-1α | IL-1β | IL-33 | IL-36α | IL-36β | IL-36γ |
| mCAN10 | 1.79 | 2.59 | 3.74E-15 | 0.0394 | 0.108 | 0.0376 |
结论
mCAN10是鼠替代抗小鼠IL1RAP抑制剂，其能够阻断IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导。因此，mCAN10向评估IL1RAP阻断在各种鼠疾病模型中的治疗功效提供了有用的工具。由于抗人IL1RAP抗体可能缺乏与小鼠IL1RAP的交叉反应性(诸如实例9-22中描述的抗人IL1RAP抗体)，因此mCAN10是具有类似功能特性的抗人IL1RAP抗体的合适替代物。在后续的体内实验(实例2-8)中，使用了呈效应子功能沉默小鼠IgG2a格式的mCAN10。
实例2：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)在急性腹膜炎模型中减轻炎症
目的
这些实验的目的是评估用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何在急性腹膜炎小鼠模型中影响炎性应答。额外的目的是将该抗体的作用与重组IL-1R拮抗剂(IL1RA)蛋白，即阿那白滞素(其仅阻断IL-1α/β信号传导)进行比较。
材料和方法
雌性C57Bl/6小鼠(10-18周龄)是野生型(WT)或IL1RAP敲除型(KO)，用2.5mg尿酸单钠(MSU)晶体腹膜内(i.p.)进行免疫化。未用MSU晶体进行免疫化的WT小鼠作为对照被包括在内(无MSU)。免疫化后6小时处死所有小鼠，收集腹腔灌洗液，以用于通过流式细胞术来进行浸润细胞(B细胞、T细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)的定量(图1A)。
可替代地，雌性C57Bl/6WT小鼠(8-9周龄)用处于摩尔当量剂量(2.3mg/kg)的20mg/kg mCAN10或IL1RA进行处理。用同种型对照抗体或PBS进行处理的小鼠作为对照被包括在内。治疗后一小时(hr)，小鼠用2.5mg MSU晶体腹膜内(i.p.)进行免疫化。未接受任何处理且未用MSU晶体进行免疫化的小鼠也作为对照被包括在内(无MSU)。免疫化后6小时处死所有小鼠，并且收集腹腔灌洗液，以用于通过流式细胞术来进行浸润细胞的定量(图1B)，或用于通过Luminex测定来进行各种细胞因子和趋化因子(嗜酸细胞活化趋化因子、G-CSF、IL-5、MCP-1、MIP-1β、IL-6和KC(也称为CXCL1))的定量(图1C)。
结果
在用MSU晶体进行免疫化后，与WT小鼠相比，IL1RAP KO小鼠展示出细胞浸润到腹膜的情况显著减少，其中对浸润性中性粒细胞和单核细胞的影响最大(图1A)。与同种型和PBS对照相比，分别用mCAN10和IL1RA进行处理显著减少了用MSU晶体进行免疫化的WT小鼠中腹膜腔中的浸润细胞(诸如中性粒细胞和单核细胞)的数量。然而，mCAN10对单核细胞和中性粒细胞的抗炎作用比IL1RA更强(图1B)。与同种型和PBS对照相比，mCAN10和IL1RA也分别显著降低了G-CSF和IL-6。与同种型对照相比，mCAN10还减少了嗜酸细胞活化趋化因子、IL-5、MCP-1和MIP-1β，并且与IL1RA相比，示出了显著更强的IL-6减少(图1C)。
结论
mCAN10(其阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导)比IL1RA(其仅阻断IL-1α/β信号传导)在急性腹膜炎小鼠模型中更有效地减轻炎性应答。
实例3：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)在银屑病和银屑病关节炎模型中减轻疾病严重性
目的
这些实验的目的是评估用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响咪喹莫特诱导的银屑病和甘露聚糖诱导的银屑病关节炎中的疾病严重性。额外的目的是将该抗体的作用与抗IL-1β抗体(其仅阻断IL-1β信号传导)进行比较。
材料和方法
在雌性BALB/c小鼠(8-10周龄)中诱导银屑病，该小鼠从第0天开始直到第7天终止，每天局部施用Zyclara乳膏(3.75％咪喹莫特；大约71.4mg/天)。在小鼠剃光的背部上应用乳膏。在该疾病诱导期间，小鼠在第0天、第3天和第5天腹膜内(i.p.)接受了治疗。小鼠用mCAN10(10mg/kg)、抗IL-1β抗体(0.5mg/kg)或与这些抗体相同剂量的同种型对照来进行处理。仅用PBS(媒介物)处理或用地塞米松(10mg/kg)处理的小鼠分别作为阴性和阳性对照被包括在内。在整个实验期间，每天通过使用范围为0-4的评分(对于每只小鼠总共8)对剃光的背部区域的皮肤炎症和红斑进行评分来评估疾病严重性(图2A-B)。
可替代地，在雄性和雌性B6N.Q.NCF1小鼠(8-14周龄)中诱导了银屑病关节炎，该小鼠在第0天腹膜内(i.p.)接受了来自酿酒酵母的20mg甘露聚糖。在第0天、第3天和第5天，这些小鼠以与上文类似的方式进行处理。通过对爪子的关节炎症进行评分并且使用范围为0-15(对于每只小鼠总共60)的四肢的宏观评分系统来评估疾病严重性(图2C-D)。在实验结束时，收集血液，以用于分析IL-17(其为银屑病关节炎中的主要促成细胞因子)(图2E)。
结果
mCAN10，而非抗IL-1β抗体，减轻了咪喹莫特诱导的银屑病中的疾病严重性(图2A-B)。类似地，与媒介物相比，mCAN10，而非抗IL-1β抗体，减轻了甘露聚糖诱导的银屑病关节炎中的疾病严重性(图2C-D)，并且还减少了循环IL-17水平(图2E)。
结论
mCAN10(其阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导)，而非抗IL-1β抗体(其仅阻断IL-1β信号传导)，降低咪喹莫特诱导的银屑病和甘露聚糖诱导的银屑病关节炎两者的疾病严重性。
实例4：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)减少Apoe KO小鼠中的动脉粥样硬化和主动脉斑块炎症
目的
这些实验的目的是评估用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响载脂蛋白E(Apoe)KO小鼠中的动脉粥样硬化。
材料和方法
向雌性Apoe KO小鼠(10-12周龄)喂食高胆固醇饮食(HCD；21％脂肪，0.21％胆固醇)以发展动脉粥样硬化病变。在喂食HCD持续4周后，开始对小鼠进行处理，并且向小鼠腹膜内(i.p.)施用mCAN10(第一剂量为20mg/kg；后续剂量为10mg/kg)或相同剂量的同种型对照抗体，每周两次，持续6周。在这整个6周期间，向小鼠连续喂食HCD。为了减少笼间变异性，将每个笼子的小鼠分成多个处理组。在最终给药后48小时，小鼠被麻醉并且处死，然后收集主动脉以通过流式细胞术来研究免疫细胞组成的变化，该免疫细胞组成包括骨髓细胞(总CD11b+细胞，及其Ly6G+中性粒细胞亚群)(图3A-C)和T淋巴细胞(总TCR-β+细胞，及其CD4+和CD8+亚群)(图3D-F)。收获心脏，在主动脉根处进行切片，并且针对脂质堆积，通过油红O将切片进行染色，并且在各组之间比较斑块大小(图4A-B)。
结果
动脉粥样硬化主动脉的流式细胞术分析示出，mCAN10降低斑块炎症。这是通过减少的CD45+白细胞数量来观察到的(图3A)。在这些中，骨髓CD11b+细胞减少，该细胞包括Ly6G+中性粒细胞(图3B-C)。TCR-β+细胞的数量也减少，该细胞包括CD4+和CD8+细胞(图3D-F)。此外，与同种型对照相比，mCAN10显著减少了喂食HCD的Apoe KO小鼠的主动脉斑块体积和面积(图4A-B)。
结论
mCAN10对IL1RAP的阻断会减少Apoe KO小鼠中的动脉粥样硬化并且限制斑块炎症。
实例5：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)减少实验性自身免疫性心肌炎中的炎症和纤维化
目的
这些实验的目的是评估用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响实验性自身免疫性心肌炎(EAM)中的炎症和纤维化的发展。
材料和方法
在第0天和第7天，通过用在完全弗氏佐剂中乳化的100μg小鼠α-肌球蛋白重链(αMHC)肽将小鼠皮下(s.c.)进行免疫化，在雄性BALB/c小鼠(7-8周龄)中诱导EAM。小鼠用mCAN10(第一剂量为20mg/kg；后续剂量为10mg/kg)或相同剂量的同种型对照抗体腹膜内(i.p.)进行了处理，每周两次，持续4周。用PBS处理的小鼠作为对照被包括在内。在第14天，用αMHC进行最终免疫化后一周开始进行处理。在实验结束时，在第42天，处死小鼠并且收集心脏。心脏用10％缓冲福尔马林固定，包埋在石蜡中，并且纵向进行切片。每颗心脏的一个中间切片用苏木精和伊红(H&E)染色，以通过使用范围为0-5的评分系统对造血细胞浸润的区域进行分级，评估左心室(LV)中的炎症程度(图5A-B)。可替代地，每颗心脏的一个中间切片用马松氏三色染色法进行染色以检测胶原蛋白沉积，作为纤维化组织的量度。使用计算机化面积测量法(ImageJ)来测量纤维化蓝色面积和整个面积。纤维化面积呈现为占整个面积的百分比(图5C-D)。
结果
mCAN10显著降低了心肌中的浸润性炎性细胞，这通过对来自EAM诱导的小鼠中的心脏的H&E染色切片进行评分来进行评估(图5A-B)。此外，mCAN10还减少了心肌纤维化，如通过马松氏三色染色法染色的心脏切片的分析所确定的(图5C-D)。
结论
mCAN10能够减少EAM中的炎症和纤维化的发展。
实例6：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)抵消实验性自身免疫性心肌炎中的心脏功能恶化
目的
这些实验的目的是评估用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响实验性自身免疫性心肌炎(EAM)中的心脏功能。额外的目的是将该抗体的作用与抗IL-1β抗体(其仅阻断IL-1β信号传导)、重组IL-1R拮抗剂(IL1RA)蛋白，即阿那白滞素(其仅阻断IL-1α/β信号传导)，以及泼尼松(一种抗炎糖皮质激素)进行比较。
材料和方法
在第0天和第7天，通过用在完全弗氏佐剂中乳化的100μg小鼠α-肌球蛋白重链(αMHC)肽将小鼠皮下(s.c.)进行免疫化，在雄性BALB/c小鼠(7-8周龄)中诱导EAM。在第7天，用αMHC进行最终免疫化的同一天开始进行处理。小鼠用mCAN10(第一剂量为20mg/kg；后续剂量为10mg/kg)、抗IL-1β抗体(0.5mg/kg)或与这些抗体相同剂量的同种型对照腹膜内(i.p.)进行了处理，每周两次，持续5周。可替代地，小鼠每天用25mg/kg的IL1RA皮下(s.c.)进行处理，通过口服强饲法用5mg/kg的泼尼松进行处理，或用相关媒介物对照进行处理，持续5周。用PBS处理的小鼠作为对照被包括在内。为了评估心脏功能，在研究开始时并且在第28天和第42天，对小鼠执行了经胸超声心动图以用于测量左心室射血分数(LVEF)(图6A-C)。
结果
与同种型和抗IL-1β抗体相比，如通过测量EAM诱导的小鼠中的LVEF所评估的，mCAN10显著保留了心脏功能(图6A)。然而，与它们的相应对照组相比，IL1RA和泼尼松对心脏功能未示出显著影响(图6B)。此外，当在第14天而不是第7天开始处理时，mCAN10也保留了心脏功能(图6C)。
结论
mCAN10对EAM诱导的小鼠中的心脏功能具有治疗效果，而抗IL-1β抗体、IL1RA和泼尼松未证明此类效果。
实例7：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)在硬皮病慢性移植物抗宿主病模型中改善皮肤纤维化和肺纤维化
目的
这些实验的目的是评估用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响硬皮病慢性移植物抗宿主病(scl cGvHD)的小鼠模型中的纤维化。
材料和方法
鼠硬皮病慢性移植物抗宿主病
受体雌性BALB/c小鼠(H-2d；8周龄；n＝每组10只)接受了700cGy的全身照射。照射后六小时，所有BALB/c(H-2d)受体均以同基因移植方式接受了来自雌性BALB/c小鼠(H-2d)的骨髓，或以同种异基因移植方式接受了来自雄性B10.D2小鼠(H-2d)的骨髓。由于MHC失配，同种异基因移植小鼠会发展为scl cGvHD，伴有皮肤和多个内部器官的纤维化。对于移植，将来自供体小鼠的5x106个脾细胞和2x106个骨髓细胞重新悬浮在PBS中，并且经由尾静脉来进行注射。在骨髓移植后21天开始处理。接受同种异基因移植物的小鼠用以下物质腹膜内(i.p.)进行了处理：mCAN10(第一剂量为20mg/kg；后续剂量为10mg/kg)或相同剂量的同种型对照抗体(Iso)，每周两次，持续4周。可替代地，这些小鼠每天用50mg/kg的小分子酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布口服(p.o.)进行处理，持续4周。尼达尼布获得批准用于治疗患有间质性肺病的系统性硬化症患者，并且在此用作阳性对照。接受同基因移植物的小鼠仅用同种型对照抗体进行处理。在实验结束时，在第49天，处死小鼠并且收集皮肤样品和肺。
皮肤纤维化和肺纤维化的组织学评估
将上背部上的1cm2限定区域的皮肤样品在4％福尔马林中固定6小时，并且包埋在石蜡中。切片被切割成5μm，并且用苏木精和伊红(H&E)染色。使用用光显微镜(NikonEclipse 80i)以100倍放大倍率捕获的图像，通过手动测量在每只小鼠四个部位处的表皮-皮肤交界处与皮肤-皮下脂肪交界处之间的距离，在H&E染色切片上定量皮肤厚度。肺样品的右叶类似地被固定、石蜡包埋并且切片，随后用三色染色和天狼星红进行染色。组织学读数包括对天狼星红染色切片(每只小鼠两个切片)中染色(纤维化)面积占肺总面积的百分比的评估，以及通过Ashcroft评分对肺部变化进行定量，该评分是用于确定肺标本中纤维化程度的数字量表(每只小鼠四个切片)。
羟脯氨酸定量
皮肤和肺样品中胶原蛋白的量通过羟脯氨酸的定量来进行确定。在120℃下在6M氯化氢中消化3小时后，将样品的pH用6M氢氧化钠调节至6。随后，添加0.06M氯胺T，并且将样品在室温下孵育20min。接下来，添加3.15M高氯酸和20％对二甲基氨基苯甲醛，并且将样品在60℃下孵育20min。用Spectra MAX 190微孔板分光光度计在557nm处确定吸光度。使用用I型胶原蛋白生成的标准曲线来确定绝对值。
肌成纤维细胞的检测
通过与单克隆抗α-SMA抗体(克隆1A4)一起孵育来检测对α-SMA(平滑肌肌动蛋白)呈阳性的肌成纤维细胞。该表达用辣根过氧化物酶标记的二抗和3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)进行可视化。单克隆小鼠IgG抗体用于对照。在光显微镜(Nikon Eclipse80i)上捕获了针对αSMA进行染色的切片图像。以200倍放大倍率在四个不同区域处手动评估图像。肌成纤维细胞被定义为皮肤中的单个纺锤形αSMA阳性细胞。
结果
与同基因移植相比，同种异基因移植诱导了突出的皮肤纤维化，其中皮肤厚度、肌成纤维细胞计数和羟脯氨酸含量增加(图7A-C)。与用同种型对照抗体处理的同种异基因移植小鼠相比，用mCAN10处理的小鼠展示出显著减少的皮肤增厚(图7A)和肌成纤维细胞计数(图7B)，以及羟脯氨酸的降低(图7C)(一种胶原蛋白含量的量度)。mCAN10对这些参数的作用处于用尼达尼布观察到的那些参数的范围内(图7A-C)。
同种异基因骨髓移植诱导了中度肺纤维化，其中Ashcroft评分、由天狼星红染色的面积以及羟脯氨酸含量增加(图8A-C)。与用同种型对照抗体处理的同种异基因移植小鼠相比，用mCAN10进行处理显著减少了Ashcroft评分(图8A)、天狼星红染色(图8B)和羟脯氨酸含量(图8C)。mCAN10对这些参数的作用再次处于用尼达尼布观察到的那些参数的范围内(图8A-C)。
mCAN10具有良好的耐受性，在临床检查、肉眼尸检或组织学结果中没有毒性迹象。此外，用mCAN10进行处理比尼达尼布更有效地改善了scl cGvHD诱导的体重减轻(图9)。
结论
mCAN10对IL1RAP的阻断是减少scl cGvHD诱导的皮肤纤维化和肺纤维化的有效策略。
实例8：鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10(小鼠IL1RAP的特异性抑制剂)会改变与炎性过程相关的基因表达谱
目的
本研究的目的是在硬皮病慢性移植物抗宿主病(scl cGvHD)的小鼠模型中，评估受使用鼠替代抗IL1RAP抗体mCAN10阻断IL1RAP影响的分子通路。目的还在于鉴定在来自scl cGvHD小鼠的皮肤中，受IL1RAP抑制影响的疾病相关差异表达基因(DEG)，并且将这些基因与来自系统性硬化症(SSc)患者的皮肤活检组织中的疾病相关基因进行比较。
材料和方法
小鼠样品
如实例7所报道的，样品是从经历过同基因或同种异基因移植并且用或未用mCAN10进行处理的小鼠中获得的。
RNASeq预处理和分析
原始双末端读数与GRCm39参考基因组对齐，并且使用R(v 4.1.1)中的Rsubread(v2.6.4)对映射读数进行计数。执行主成分分析(PCA)，以确定每批样品中的潜在离群值。在PCA之后，三个样品(每种条件一个)被排除在外。对于每个组，选择了四个导致密集组特异性聚类的样品。使用DESeq2包(v 1.32.0)来执行比率归一化的中值和差异表达分析。重要的DEG列表被认为是经调节的p值≤0.05和|log2FC|≥1.5以用于进行比较。
从由143名SSc患者和22名健康个体组成的北美SSc患者群组(NCBI/GEO/GSE130955)中检索SSc患者的转录组学谱。为了在小鼠样品与人类样品之间进行比较，并且检测相互表达的基因，使用r包“biomaRt”(v 2.48.3)来将人直系同源物映射到鼠基因符号。
治疗应答签名
由于样品大小，通过应用R stats包使用逻辑回归建模来针对基因组合治疗应答签名执行特征选择。逻辑回归模型允许在两组之间进行分类(二进制结果系统：1[＝例如，处理]，0[＝例如，健康])，其中逐步特征选择鉴定出用于进行组分类的最佳基因集组合。使用MASS和ROCR包基于Akaike信息标准(AIC)和曲线下面积(AUC)值来选择基因组合模型。AIC值是统计学基因组合模型描述数据好坏如何的质量指标，其考虑到所使用的特征的数量，而AUC描述模型性能。
结果
RNASeq数据分析示出在同种异基因移植小鼠(Allo)、同基因移植小鼠(Syn)和用mCAN10处理的同种异基因移植小鼠(经处理的)之间存在分离，其中经处理组接近Syn组。Allo与Syn之间的比较鉴定了2308个DEG(1023个上调，1285个下调；经调节的p值≤0.05，|log2FC|≥1.5)，其中观察到与炎症和纤维化相关的过程和通路的失调。相反，经处理的与Allo之间的比较鉴定了495个DEG(398个上调，106个下调；经调节的p值≤0.05，|log2FC|≥1.5)，其中通过用mCAN10抑制IL1RAP来观察到与炎症相关的若干过程的失调。有趣的是，mCAN10改变了多个IL-1家族基因的基因表达，使得该谱更类似于Syn组，而不是Allo组(图10)。
Allo DEG(Allo与Syn)、经处理的DEG(经处理的与Allo)与SSc DEG(SSc与健康；从先前发布的数据集NCBI/GEO/GSE130955中检索到的信息)之间的重叠的分析鉴定了小鼠模型(Allo与Syn)与人数据集(SSc与健康)之间的449个重叠基因。其中，177个(39.4％)基因在所有三组DEG之间重叠(图11)，其中58个基因(20个上调，38个下调；经调节的p值≤0.05并且|log2FC|≥0.25)在经处理的DEG与SSc DEG之间相互调节。
结论
mCAN10影响与scl GvHD小鼠中炎症相关的过程和通路，这支持mCAN10在该模型中对疾病表现的所观察到的作用。与健康对照相比，scl GvHD小鼠中受mCAN10影响的大量基因在SSc患者中差异表达，这表明IL1RAP抑制也可能影响人类疾病。
实例9：用IL1RAP进行免疫化以生成抗IL1RAP抗体
目的
该实例说明如何从用IL1RAP进行免疫化的兔中分离出抗IL1RAP抗体。
材料和方法
将兔免疫化四次，然后使用重组表达的人和鼠IL1RAP胞外域的混合物来进行加强，每次注射0.2mg抗原。每三周后通过肩胛下注射来执行免疫化。第一次免疫化在弗氏完全佐剂中执行，并且第二次至第四次免疫化在弗氏不完全佐剂中执行。为了加强，将一半抗原量在弗氏不完全佐剂中进行肩胛下注射，并且将另一半进行静脉内注射。
在第三次免疫化后大约十天，使用血清通过ELISA来测量每只动物的免疫应答。通过ELISA来测量特异性抗体滴度，分别用人和小鼠IL1RAP涂覆该板，以用于免疫应答比较。在第四次免疫化后二至三周，将动物加强一次，并且在加强后四至五天收集脾脏。将测试动物的脾脏均化，进行细胞冷冻并且储存在液氮中。
使用以下文献中描述的方法，从免疫化的兔中分离单克隆抗体序列：Kivi等人(Kivi G,《HybriFree：一种用于发展来自不同宿主物种的单克隆抗体的稳健且快速的方法(HybriFree:a robust and rapid method for the development of monoclonalantibodies from different host species.)》《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》16:2(2016))。将链霉亲和素涂覆的96孔板用生物素化的人或鼠IL1RAP或两者的混合物以5μg/ml的浓度进行涂覆。对于每次淘选，使用一万个脾细胞。总共执行了48次淘选反应。孵育45分钟后，将孔用PBS进行洗涤，以移除未结合的细胞。从结合的细胞中分离出RNA，并且VH和VL cDNA被合成并用于构建呈人IgG表达质粒格式的组合VH-VL文库。质粒DNA被纯化并且转染到CHO细胞中，以用于产生嵌合兔/人IgG1库。转染后48小时使用ELISA来分析抗体库的上清液，并且鉴定了阳性库。将含有来自阳性库的质粒DNA的细菌接种在LB-氨苄青霉素固体培养基上，并且单菌落被分离并在液体培养基中生长。质粒DNA从液体培养物中进行纯化并且转染到CHO细胞中，以用于瞬时抗体生产。转染后48-72小时通过ELISA来分析上清液。
结果
鉴定了与人和/或鼠IL1RAP结合的抗体。通过测序来进一步分析嵌合兔/人IgG1ELISA IL1RAP阳性克隆。进一步分析嵌合抗体的特性，诸如例如用于抑制IL-1、IL-33或IL-36信号传导的能力。选择嵌合抗体48D2，以用于进一步表征和优化(参见以下实例)。该抗体的轻链可变区包含轻链可变区，该轻链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19.该抗体的重链可变区包含重链可变区，该重链可变区包含以下或由以下组成：SEQ IDNO:20.为了产生完整抗体，将可变区与包含以下或由以下组成的轻链恒定区组合：SEQ IDNO:35的氨基酸序列，并且与包含以下或由以下组成的IgG1重链恒定区组合：SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:2所示。
结论
分离出针对IL1RAP的单克隆嵌合兔/人IgG1抗体。
实例10：与IL1RAP结合并且阻断IL-1、IL-33和IL-36信号传导的抗体的鉴定和表征
目的
该实例说明所选抗体，即48D2嵌合(ch)兔/人抗人IL1RAP，的表征，该抗体如实例9所述而生成。目标是鉴定对食蟹猴和人IL1RAP两者均具有高亲和力并且完全阻断所有IL1RAP调节的信号传导通路的抗体。
材料和方法
抗体与表达IL1RAP的细胞的结合
在细胞表面上表达IL1RAP的恶性黑色素瘤(malignant melanoma/malignmelanoma)细胞系SKMEL-5被用于进行分析。根据标准程序来培养SKMEL-5细胞。5x104SKMEL-5细胞用人Fc块进行阻断，然后用嵌合48D2或同种型对照抗体的8步连续稀释液(100μg/ml-0.03μg/ml)进行染色。在使用Alexa488缀合的抗人IgG抗体进行二次染色后，在CytoFlex(贝克曼库尔特司(Beckman Coulter)有限公司)上分析10000个细胞/样品。表达低水平表面IL1RAP的HTB183细胞被用作阴性对照。
细胞因子信号传导的抑制
对于IL-1和IL-33抑制的分析，按规定使用HEK-BlueTM(IL-33/IL-1)细胞。对于IL-36分析，在测定前一天HEK-BlueTM(IL-33/IL-1)细胞用IL-36受体进行瞬时转染，或者稳定表达IL-36受体的HEK-BlueTM克隆(内部生成)被使用。简而言之，将HEK-BlueTM细胞接种到384孔板中，并且允许其在继续之前静置最少2小时。然后，在添加细胞因子之前，将细胞暴露于增加浓度的嵌合48D2(如图所描绘)，并且在37℃、5％ CO2下孵育1小时。以下列浓度添加细胞因子：2ng/ml IL-1α、0.1ng/ml IL-1β、0.2ng/ml IL-33、1ng/ml IL-36α、3ng/mlIL-36β和0.2ng/ml IL-36γ。将细胞在37℃、5％ CO2下培养16-18小时，然后使用QUANTI-BlueTM溶液来分析NF-κB的活化以及后续的SEAP生产，该溶液使用SpectraMax i3x分光光度计在620nm处进行测量。
嵌合48D2的表达和纯化
嵌合48D2在CHO细胞中瞬时表达。使用蛋白A亲和色谱法和凝胶过滤来执行纯化。
通过生物层干涉技术进行的亲和力测量
使用来自美谷分子仪器(Molecular Devices)公司的BLItz Pro 1.3.1.3软件中的Basic Kinetics模块，在来自ForteBio公司的BLItzTM无标记蛋白质分析系统上进行亲和力测量。涂覆前，蛋白A生物传感器在封闭缓冲液(PBS、0.5％ BSA、0.05％吐温20、pH 7.4)中在室温下水合最少10min。通过在室温下将生物传感器浸入200μl抗体溶液(10μg/ml，在封闭缓冲液中)30min，蛋白A生物传感器用抗体进行涂覆。然后在使用前，将传感器在200μl封闭缓冲液中孵育至少10min。在封闭缓冲液中以四种不同浓度的hIL1RAP(21-367)分析每种抗体；0.8nM(0.032μg/ml)、4nM(0.16μg/ml)、20nM(0.8μg/ml)和100nM(4μg/ml)。基准在封闭缓冲液中进行制备，其中持续时间为30秒。在hIL1RAP中缔合120秒，然后在封闭缓冲液中解离120秒。
结构域映射
IL1RAP胞外域由三个结构域(结构域1、结构域2、结构域3)组成。为了了解48D2在何处与IL1RAP结合，对应于不同结构域而生成了一系列IL1RAP构建体，并且使用重复样品来在间接ELISA测定中测试了与这些结构域的结合。使用Uniprot，ID Q9NPH3中给出的IL1RAP的氨基酸序列来创建构建体。微量滴定板用100ng重组hIL1RAP结构域1+2+3(由结构域1、结构域2和结构域3制成)(aa21-367)(阳性对照)、重组hIL1RAP结构域1+2(由结构域1和结构域2制成)(aa21-234)、结构域1(aa21-134)或重组hIL1RAP结构域3(aa235-367)(100μl/孔)进行涂覆，其稀释在0.01M PBS、pH 7.4中并且在4℃下孵育过夜。该板用ELISA洗涤缓冲液(0.01M PBS、0.05％吐温20、pH 7.4)进行洗涤，然后进行使用150μl/孔的ELISA封闭溶液(PBS、0.5％ BSA、0.05％吐温20、pH 7.4)的封闭步骤。在室温下搅拌孵育一小时后，使用ELISA洗涤缓冲液来再次洗涤该板。制备一系列48D2在ELISA封闭溶液中的稀释液(范围为1ng/ml至10000ng/ml)，然后以100μl/孔转移到孔。将板在室温下搅拌孵育一小时，然后用ELISA洗涤液进行洗涤。添加一百μl/孔的与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG，并且在室温下搅拌孵育一小时。该板使用ELISA洗涤液进行洗涤，然后添加底物(4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物，Sigma-Aldrich，1mg/ml)，100μl/孔。此后将该板在室温下搅拌孵育，并且连续测量405nm处的吸光度，持续30min。将0min处的吸光度作为背景信号。多克隆抗hIL1RAP抗体KMT-1用作对照。
表位作图
基于结构域映射和交叉反应性数据，IL1RAP的结构域2中的两个区被鉴定为48D2(人源化和去免疫化48D2变体VH5.GL:VL4(参见实例13))的潜在相互作用位点，其对应于aa141-157(命名为H1)和174-191(命名为H2)(基于来自Uniprot，ID Q9NPH3的人IL1RAP氨基酸序列)。创建了鼠/人IL1RAP的两个嵌合构建体，其中两个目标区的人序列被移植到鼠IL1RAP：嵌合IL1RAP.H1和嵌合IL1RAP.H2上。微量滴定板用嵌合IL1RAP构建体进行涂覆，并且如上文针对结构域映射所述执行ELISA测量。将多克隆抗hIL1RAP抗体KMT-2(针对人IL1RAP的亲和纯化兔多克隆抗体)和KMT-3(针对鼠IL1RAP的亲和纯化兔多克隆抗体)用作阳性对照。
交叉反应性
微量滴定板孔用IL1RAP直系同源物(小家鼠(Mus musculus)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、食蟹猴(Macaca fascicularis)(Mf，食蟹猴(cynomolgus monkey)的同义词)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)、犬(Canis lupus familiaris)、野猪(Sus scrofa))进行涂覆，并且在37℃下孵育1小时。洗涤该板，然后进行封闭步骤。在室温下搅拌孵育1小时后，再次洗涤该板。抗体在ELISA封闭溶液中以四倍连续稀释液进行稀释，范围为4000ng/ml至0.24ng/ml，然后转移到ELISA板。将板在37℃下搅拌孵育30min，然后洗涤。添加与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人抗体，并且在37℃下搅拌孵育30min。洗涤该板，然后添加底物(4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物)。此后将该板在室温下搅拌孵育，并且连续测量405nm处的吸光度，持续50min。将0min处的吸光度作为背景信号。
结果
抗体与表达IL1RAP的细胞的结合
用嵌合48D2或同种型对照染色的表达IL1RAP的SKMEL-5细胞的流式细胞术分析揭示出，与同种型对照抗体相比，48D2的平均荧光强度(MFI)更高(图12)。48D2和同种型对照以增加的浓度添加到细胞。未观察到与具有IL1RAP的低表面表达的HTB183细胞的结合(数据未示出)。
细胞因子信号传导的抑制
图13示出ch48D2对HEK细胞中IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ信号传导的抑制活性。以增加的浓度添加抗体，然后以恒定浓度添加所描绘的细胞因子。该图表示出620nm处的光密度(OD)值，其中高OD表示细胞因子受体下游的信号传导。嵌合抗体48D2诱导了IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ信号传导的显著抑制，直至这些细胞因子的信号传导的完全抑制(阻断)。IC50值在表3中示出。
表3：嵌合48D2在不同信号传导通路上的IC50值[nM]，其从HEK-BlueTM测定中获得
| IC50[nM] | IL-1α | IL-1β | IL-33 | IL-36α | IL-36β | IL-36γ |
| 48D2 | 1.92 | 0.70 | 2.917 | 0.0083 | 0.0081 | 0.0111 |
亲和力测量
在表4中示出了针对嵌合48D2以及针对人源化48D2变体VH5:VL4(参见实例11)和针对人源化和去免疫化48D2变体VH5.GL:VL4(参见实例13)的亲和力测量结果。ka是缔合速率常数，其用于表征抗体与靶标的结合，kd是解离速率常数，其用于表征抗体与靶标的解离，并且KD是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即kd/ka的比率。KD对应于在平衡时，50％的抗原结合位点被占据的抗体浓度。KD值越低(浓度越低)，则亲和力越高。
48D2变体展示出与人(h)IL1RAP的快速结合和缓慢的解离，这导致亲和力在nM范围内。与嵌合48D2相比，对于人源化或者人源化和去免疫化变体，未看到对人IL1RAP亲和力的损失。
表4：亲和力测量
| 抗体名称 | KD(nM) | ka(1/Ms) | kd(1/s) |
| 嵌合48D2 | 2.673 | 6.521E4 | 1.743E-4 |
| h48D2 VH5:VL4 | 2.742 | 6.022E4 | 1.716E-4 |
| h48D2 VH5.GL:VL4 | 2.532 | 7.797E4 | 1.974E-4 |
结构域映射
下表5中总结了结构域映射数据。对照多克隆抗体KMT-1与所有结构域结合，而48D2仅与含有结构域2的IL1RAP构建体结合，这表明抗体与该结构域结合。
表5：嵌合48D2的结构域映射
表位作图
使用具有区H1和H2的经移植的人序列的鼠IL1RAP的表位作图结果在表6中示出。当将H2区的人序列引入鼠IL1RAP中时，恢复h48D2 VH5.GL:VL4(参见实例13)与鼠IL1RAP的结合，这表明H2参与与48D2的相互作用(比较表5和6)。阳性对照多克隆抗体KMT-2和KMT-3与两种嵌合形式的IL1RAP结合。
表6：使用嵌合IL1RAP的48D2表位作图
交叉反应性
图14示出嵌合48D2与来自不同物种的IL1RAP的交叉反应性。以增加的浓度添加抗体，并且使用405nm处的吸光度以检测抗体与IL1RAP同源基因序列的结合。48D2与来自人、食蟹猴(cyno)和猪的IL1RAP具有交叉反应性，但与来自小鼠、大鼠、兔或狗的IL1RAP不具有交叉反应性(图14和表7)。
表7：嵌合48D2的交叉反应性
结论
嵌合48D2被发现与hIL1RAP的结构域2结合，对食蟹猴和人IL1RAP两者均具有高亲和力，选择性结合了细胞膜上的IL1RAP，并且完全抑制了IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ信号传导，因此被选择用于人源化。嵌合48D2表现出优于如实例9所述生成的其他抗体的特性。
实例11：嵌合48D2的人源化
目的
该实例说明如何获得48D2的人源化变体。
材料和方法
计算机模拟的人源化
针对含有成熟人抗体序列和人种系抗体序列的数据库，搜索了48D2的抗体轻可变区和重可变区的序列。CDR根据IMGT和Kabat编号系统进行了定义，并且氨基酸残基作为两者的组合被包括在内(参见SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3至SEQ ID NO 18，以及具有KAS序列的CDR-L2)。用于人源化的受体框架的选择基于序列同源性，并且基于使用软件工具Maestro创建的后续从头计算结构预测。选择框架以维持关键结构框架残基。VL和VH各自获得了五个序列，从而创建了25种不同的人源化抗体变体以进一步表征(VL1-VL5与VH1-VH5组合)。对于基于人种系抗体序列的受体框架，引入回复突变以确保抗体的结构和功能。人源化的一部分也是免疫原性(MHC II类结合亲和力)和可制造性的预测。使用NetMHCII服务器来执行MHC II类结合亲和力预测。
结果
根据WHO的人源化抗体的定义，VL的五个计算机模拟的人源化变体和VH的五个计算机模拟的人源化变体被创建并且验证已经被人源化。评估免疫原性以避免引入具有潜在MHC II类结合亲和力的序列。评估可制造性以避免引入易于发生脱酰胺基、异构化或断裂的糖基化基序或序列。序列在表8中描绘。
表8：计算机模拟的VL和VH(48D2)的人源化变体
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结论
VL的五个计算机模拟的人源化变体和VH的五个计算机模拟的人源化变体被创建，并且将其用IgG1恒定结构域进行框内合成，以用于生产和表征25种人源化抗体变体(参见实例12)。
实例12：人源化48D2的表征
目的
该实例说明人源化48D2变体(参见实例11)是如何被表达和表征的，其目的是找到具有保留亲和力、细胞因子抑制和经优化的生物化学特性的人源化抗体。
材料和方法
人源化变体的表达、纯化和表征
将48D2的25种人源化变体的重可变结构域和轻可变结构域(参见表8)亚克隆到含有人恒定结构域的载体中：
-(Km3同种异型的)κ恒定结构域与形成整个轻链的VL结构域组合(SEQ ID NO:35)。
-(za同种异型的)IgG1za重链恒定结构域与形成整个重链的VH结构域组合。重链恒定结构域还含有LALA突变(SEQ ID NO:2)(对应于例如以下文献中所描述的突变：Xu等人,2000,《细胞免疫(Cell.Immuno.)》200:16-26)，以便避免Fc-γ受体介导的抗体效应子功能。
人源化抗体(h48D2)在HEK-293细胞中瞬时表达，从50ml培养物的所收获培养基中纯化蛋白A，并且将缓冲液交换到PBS pH 7.4中。
抗体的特征在于：A)结合(ELISA分析，人和食蟹猴IL1RAP)，B)细胞因子信号传导的抑制(HEK-BlueTM测定)，C)亲和力(生物层干涉技术)，D)大小异质性(SE-HPLC)，以及E)产量(浓度，A280)。使用重组hIL1RAP aa21-367或重组mfIL1RAP aa21-367作为涂覆试剂，以与实例10中被呈现用于结构域映射的间接ELISA类似的方式执行结合ELISA。使用标准程序和PBS作为运行缓冲液，执行SE-HPLC。如实例10先前所述，测量亲和力和细胞因子抑制。分析所有25种人源化克隆对IL-1α、IL-1β和IL-33信号传导的阻断活性，而仅分析已经保留与嵌合48D2类似的抑制活性的克隆的IL-36抑制。
结果
A)人源化抗体克隆与IL1RAP的结合(ELISA)
使用ELISA测量获得的IC50值在表9中示出。使用结合ELISA，在不同克隆之间仅可以看到结合的微小差异。而且，对于每种克隆，对人和食蟹猴(cyno)IL1RAP的结合亲和力是类似的。
表9：人源化抗体克隆与IL1RAP的结合
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B)细胞因子信号传导的抑制
图15A-O示出人源化48D2抗体克隆对HEK细胞中IL-1α、IL-1β和IL-33信号传导的抑制活性。以增加的浓度添加抗体，然后以恒定浓度添加所描绘的细胞因子。该图表示出620nm处的光密度(OD)值，其中高OD表示细胞因子受体下游的信号传导。含有VH5变体的抗体克隆诱导了IL-1α、IL-1β和IL-33信号传导的完全抑制，其具有与嵌合48D2抗体类似的效力(图15E、15J、15O)。含有变体VH1-VH4的抗体克隆在不同程度上抑制了IL-1α、IL-1β和IL-33的信号传导，其具有与嵌合48D2相比不同的效力。这些变体对IL-1α(图15A-D)和IL-33(图15K-N)实现了部分抑制；并且对IL-1β实现了完全抑制(图15F-I)。未分析含有变体VH1-VH4的抗体克隆的IL-36抑制。相应IC50值在表10中示出。图15P-R示出，含有VH5变体的抗体克隆也诱导了IL-36α、IL-36β和IL-36γ信号传导的完全抑制，其具有与嵌合48D2抗体类似的效力。
表10：来自HEK-BlueTM测定的人源化抗体的IC50值[nM]
/>
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C)亲和力测量
对于人源化48D2变体，对人IL1RAP的亲和力的KD值在表11中示出。使用生物层干涉技术来测量亲和力。所有抗体变体均表现出处于纳摩尔范围中的亲和力。对于KD值处于1-4nM范围中的VH5系列，获得了最高亲和力。另外参见表4，以用于嵌合48D2、人源化48D2变体VH5:VL4，以及人源化和去免疫化48D2变体VH5.GL:VL4的直接比较。
表11：人源化抗体的亲和力测量
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D)大小异质性
使用尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)来确定大小异质性(表12)。完整单体抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，它们通过二硫键共价连接在一起。高分子量(HMW)物质可能含有可溶性抗体聚集体，例如二聚体。低分子量(LMW)物质可能含有抗体，其中例如，肽键已被切割，即片段化抗体。几乎所有变体均为高度单体的(≥97％)，除了含有>5％高分子量物质(HMW)的h48D2 VH4:VL3。对于所有经分析的变体，未检测到少量低分子量(LMW)物质。
表12：人源化抗体的大小异质性分析
/>
E)产量
对于人源化48D2变体，使用280nm处的吸光度测量来确定蛋白质浓度，并且计算50ml培养物的产量(表13)。VL影响了产量，其中用VL4变体获得了最高产量，并且用VL3变体获得了最低产量。因此，产量部分取决于VL序列。
表13：人源化抗体的产量
/>
结论
含有VH5变体的人源化抗体变体保留了完全抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导的全部能力，其具有与嵌合48D2抗体类似的效力。含有变体VH1-VH4的抗体变体完全抑制了IL-1β的信号传导并且部分抑制了IL-1α和IL-33的信号传导，其具有与嵌合48D2相比不同的效力。VH5系列对人IL1RAP的亲和力最高，并且在该系列内，变体h48D2 VH5:VL4和h48D2 VH5:VL5两者在SE-HPLC中均获得了良好的产量和高单体含量。因此，使用这些变体进行了进一步研究。
实例13：人源化48D2克隆中的两种克隆的去免疫化
目的
该实例说明h48D2 VL5和VH5中对MHC II类分子具有预测亲和力的序列如何通过种系化进行去免疫化。
材料和方法
移除对MHC II类分子具有预测亲和力的序列
使用种系抗体序列来创建人源化48D2 VL5和VH5序列。对于这两个序列，引入了对原始兔序列的多个回复突变，以确保保留抗体结构和功能(参见实例11)。这些引入的回复突变产生了对MHC II类分子具有预测亲和力的序列。
对于VH5，框架区2中的两个回复突变导致潜在的免疫原性，并且对于VL5，框架区1中的六个回复突变。对于VH5的去免疫化，回复突变恢复为种系序列作为单个突变和两个残基的突变(产生三种不同的序列变体)。对于VL5，所有六个回复突变都恢复为种系序列作为一个新序列(产生一种序列变体)。
这产生了去免疫化VH5的以下新序列：
h48D2 VH5.AP(丙氨酸到脯氨酸)(SEQ ID No.32)，
h48D2 VH5.SK(丝氨酸到赖氨酸)(SEQ ID No.33)，
h48D2.VH5.GL(“种系”，两个残基均恢复为种系序列)(SEQ ID No.34)；
以及去免疫化VL5的以下新序列；
h48D2 VL5.GL(“种系”，所有六个残基均恢复为种系序列)(SEQ ID No.31)。
结果和结论
对VL5和VH5执行去免疫化。新的VL5和VH5与先前获得的h48D2 VL4、h48D2VL5和h48D2 VH5的序列进行组合，从而创造了用于表达和表征的十个新的、额外的变体：
h48D2 VH5:VL5.GL
h48D2 VH5.AP:VL4
h48D2 VH5.AP:VL5
h48D2 VH5.AP:VL5.GL
h48D2 VH5.SK:VL4
h48D2 VH5.SK:VL5
h48D2 VH5.SK:VL5.GL
h48D2 VH5.GL:VL4
h48D2 VH5.GL:VL5
h48D2 VH5.GL:VL5.GL
实例14：人源化去免疫化48D2克隆的表征
目的
该实例说明人源化和去免疫化48D2变体是如何被表达和表征的，其目的是找到具有保留亲和力、细胞因子抑制和经优化的生物化学特性的人源化和去免疫化抗体。
材料和方法
去免疫化h48D2的表达、纯化和表征
如先前针对实例10和12中的嵌合48D2和人源化变体所描述的，执行表达、纯化和表征。
结果
人源化和去免疫化抗体克隆与IL1RAP的结合(ELISA)
对于去免疫化h48D变体，使用ELISA测量获得的IC50值在表14中示出。使用结合ELISA，在不同变体之间仅可以看到结合的微小差异。对于每种克隆，对人和食蟹猴(cyno)IL1RAP的结合亲和力是类似的。
表14：人源化和去免疫化抗体克隆与IL1RAP的结合
| 名称 | IC50人IL1RAP | IC50食蟹猴IL1RAP |
| h48D2 VH5:VL5.GL | 29.91 | 29.78 |
| h48D2 VH5.AP:VL4 | 24.15 | 30.53 |
| h48D2 VH5.AP:VL5 | 28.07 | 35.62 |
| h48D2 VH5.AP:VL5.GL | 25.23 | 35.08 |
| h48D2 VH5.SK:VL4 | 26.26 | 33.93 |
| h48D2 VH5.SK:VL5 | 34.91 | 46.95 |
| h48D2 VH5.SK:VL5.GL | 39.95 | 58.36 |
| h48D2 VH5.GL:VL4 | 36.71 | 57.35 |
| h48D2 VH5.GL:VL5 | 34.57 | 43.95 |
| h48D2 VH5.GL:VL5.GL | 58.52 | 60.06 |
人源化和去免疫化抗体克隆与表达IL1RAP的细胞的结合
用h48D2 VH5.GL:VL4和h48D2 VH5.GL:VL5.GL或同种型对照染色的表达IL1RAP的SKMEL-5细胞的流式细胞术分析揭示出，与同种型对照抗体相比，当以增加的浓度添加抗体时，VH5.GL:VL4和VH5.GL:VL5.GL的平均荧光强度(MFI)更高(图16)。
细胞因子信号传导的抑制
图17示出人源化和去免疫化48D2抗体克隆对HEK细胞中IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ信号传导的抑制活性。以增加的浓度添加抗体，并且以恒定浓度添加所描绘的细胞因子。人源化变体h48D2 VH5:VL4和h48D2 VH5:VL5作为对照被包括在内。该图表示出620nm处的OD值，其中高OD表示细胞因子受体下游的信号传导。所有变体均表现出对IL-1α(A)、IL-1β(B)、IL-33(C)、IL-36α(D)、IL-36β(E)和IL-36γ(F)的保留抑制作用。IC50值在表15中示出。
表15：去免疫化抗体克隆的IC50值[nM]
在用于获得图17A-F中的结果的实验设置中，在前一天HEK-BlueTM(IL-33/IL-1)细胞用IL-36受体进行瞬时转染。随后，使用用IL-36受体稳定转染的HEK-BlueTM细胞，对h48D2VH5.GL:VL4执行了IL-33和IL-36细胞因子信号传导抑制的进一步评估。来自该评估的结果还示出对IL-33(图17G)、IL-36α(图17H)、IL-36β(图17I)和IL-36γ(图17J)的抑制作用。IC50值在表16中示出。
表16：h48D2变体VH5.GL:VL4的IC50值[nM]
亲和力测量
对于去免疫化h48D2变体，对人IL1RAP的亲和力的KD值在表17中示出。使用生物层干涉技术来测量亲和力。对于KD值为1-2nM的所有去免疫化变体，亲和力是类似的。另外参见表4，以用于48D2、人源化48D2和去免疫化h48D2的直接比较。
表17：去免疫化h48D2抗体的亲和力测量
| 名称 | KD(nM) |
| h48D2 VH5:VL5.GL | 0.752 |
| h48D2 VH5.AP:VL4 | 1.7 |
| h48D2 VH5.AP:VL5 | 1.96 |
| h48D2 VH5.AP:VL5.GL | 1.5 |
| h48D2 VH5.SK:VL4 | 2 |
| h48D2 VH5.SK:VL5 | 2.8 |
| h48D2 VH5.SK:VL5.GL | 2.28 |
| h48D2 VH5.GL:VL4 | 2.53 |
| h48D2 VH5.GL:VL5 | 1.87 |
| h48D2 VH5.GL:VL5.GL | 1.47 |
大小异质性
使用尺寸排阻HPLC(SE-HPLC)来确定大小异质性(表18)。几乎所有变体均为高度单体的(≥98％)，除了具有VL5.GL的h48D2变体，该变体含有一些HMW物质。对于所有经分析的变体，未检测到LMW物质。
表18：去免疫化h48D2抗体的大小异质性分析
| 名称 | 聚集体HMW(％) | 单体(％) |
| h48D2 VH5:VL5.GL | 4.6 | 95.4 |
| h48D2 VH5.AP:VL4 | 0.7 | 99.3 |
| h48D2 VH5.AP:VL5 | 1.2 | 98.8 |
| h48D2 VH5.AP:VL5.GL | 2.6 | 97.4 |
| h48D2 VH5.SK:VL4 | 0.3 | 99.7 |
| h48D2 VH5.SK:VL5 | 0.5 | 99.5 |
| h48D2 VH5.SK:VL5.GL | 3.8 | 96.2 |
| h48D2 VH5.GL:VL4 | 0.6 | 99.4 |
| h48D2 VH5.GL:VL5 | 1.3 | 98.7 |
| h48D2 VH5.GL:VL5.GL | 4.1 | 95.9 |
产量
对于去免疫化h48D2变体，使用280nm处的吸光度测量来确定蛋白质浓度，并且计算50ml培养物的产量(表19)。与其他变体相比，含有VL变体VL5.GL的抗体变体表现出较低的可获得产量。
表19：去免疫化h48D2抗体的产量
| 名称 | 产量(mg) |
| h48D2 VH5:VL5.GL | 1.5 |
| h48D2 VH5.AP:VL4 | 7.8 |
| h48D2 VH5.AP:VL5 | 7.0 |
| h48D2 VH5.AP:VL5.GL | 1.8 |
| h48D2 VH5.SK:VL4 | 6.2 |
| h48D2 VH5.SK:VL5 | 3.8 |
| h48D2 VH5.SK:VL5.GL | 1.5 |
| h48D2 VH5.GL:VL4 | 10.1 |
| h48D2 VH5.GL:VL5 | 10.0 |
| h48D2 VH5.GL:VL5.GL | 1.7 |
交叉反应性
图18示出h48D2 VH5.GL:VL4和h48D2 VH5.GL:VL5.GL与来自不同物种的IL1RAP的交叉反应性。以增加的浓度添加抗体，并且使用405nm处的吸光度以检测与IL1RAP的结合。至于嵌合48D2，人源化和去免疫化变体h48D2 VH5.GL:VL4和h48D2VH5.GL:VL5.GL与来自食蟹猴(cyno)和猪的IL1RAP具有交叉反应性，但与来自小鼠、大鼠、兔或狗的IL1RAP不具有交叉反应性(图18和表20)。
表20：h48D2 VH5.GL:VL4和VH5.GL.VL5.GL的交叉反应性
结论
所有去免疫化变体均展示出KD值为1-3nM的高亲和力，并且保留了生物功能。变体h48D2 VH5.GL:VL4在SE-HPLC中以良好的产量和高单体含量表现出色。
实例15：嵌合48D2的ADCC效应
目的
该实例旨在研究当以hIgG1野生型(WT)或效应子功能沉默IgG1-LALA格式进行表达时，嵌合48D2的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应。
材料和方法
在细胞表面上表达IL1RAP的恶性黑色素瘤细胞系SKMEL-5被用作用于体外ADCC测定的靶标。将靶细胞以每孔10000个细胞的密度接种到96孔板中。随后，将不同浓度的48D2-WT、48D2-LALA或同种型对照抗体添加到孔并且孵育30min，然后将100000个NK效应细胞添加到每个孔。根据制造商的说明书(德国美天旎生物技术(Miltenyi Biotech)有限公司，贝吉施格拉德巴赫，德国(Bergisch Gladbach,Germany))，通过使用NK细胞阴性细胞分离试剂盒来从白细胞浓缩物中提取NK细胞。在实验中，非特异性人IgG1-WT和IgG1-LALA抗体用作对照。通过在培养物中18小时后使用FACS LSR Fortessa流式细胞仪(BD)检测DAPI阳性细胞来评估细胞死亡程度。
结果
体外ADCC测定示出，呈hIgG1格式的嵌合48D2引导NK细胞以抗体特异性、剂量依赖性方式杀伤SKMEL-5细胞(图19)。与同种型对照和未处理细胞(未处理细胞对应于0ng/ml抗体)相比，用以hIgG1-LALA格式进行表达的嵌合48D2进行处理后，死亡SKMEL-5细胞的百分比没有增加。
该效应示出为剂量依赖性的。当嵌合48D2以hIgG1-LALA格式进行表达时，ADCC效应消失。可以假设，当以hIgG1-WT或hIgG1 LALA格式进行表达时，48D2抗体的抗体变体(诸如上文实例中描述的抗体，例如人源化或者人源化和去免疫化抗体变体)可以具有类似的效应。事实上，下面的实例19证明，呈hIgG1 LALA格式的抗体变体VH5.GL:VL4在血液循环测定中不诱导Fc介导的免疫活化。
结论
实验示出，48D2可以引导NK细胞对黑色素瘤细胞系进行特异性细胞杀伤，在表面上表达IL1RAP，并且示出由48D2诱导的细胞毒性效应为剂量依赖性的。此外，可以通过以效应子功能沉默hIgG1-LALA格式表达48D2来消除ADCC效应。
实例16：嵌合48D2对人成纤维细胞中细胞因子信号传导的抑制
目的
该实例的目的是研究嵌合48D2在体外对人成纤维细胞中IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ刺激的IL-6基因表达的抑制活性。
材料和方法
来自健康人皮肤的成纤维细胞是商业上获得的，并且在完全成纤维细胞生长培养基中生长。在24孔板中每孔接种75000个细胞。80％汇合细胞在含有仅1％ FBS的成纤维细胞培养基中血清饥饿过夜。将培养基更换为含有1％ FBS且不含生长因子的新的成纤维细胞培养基，并且在用不同浓度的细胞因子刺激前1小时，将20ug/ml嵌合48D2添加到孔(如图20所描绘)。细胞被刺激24小时，然后根据制造商的说明书来分离RNA。IL-6mRNA水平使用SYBR Green来进行分析，并且数据使用ΔΔCT方法来进行分析并示出为与未处理对照相比的倍数变化2-ΔΔCT。
结果
IL-1α、IL-1β、IL-36α、IL-36β和IL-36γ以剂量依赖性方式诱导了皮肤成纤维细胞中的IL-6基因表达(图20)。在该实验中，嵌合48D2将基因表达的增加抑制到与未刺激的对照相当的水平。IL-33对这些细胞中的IL-6表达没有影响(数据未示出)。可以假设，48D2抗体的抗体变体(诸如上文实例中描述的抗体，例如人源化或者人源化和去免疫化抗体变体)可以具有类似的效应。实际上，实例17证明，抗体变体VH5.GL:VL4抑制人全血中的IL-1β信号传导。
结论
48D2可以阻断人成纤维细胞中细胞因子诱导的IL-6基因表达的增加。
实例17：48D2变体VH5.GL:VL4对人全血中IL-1β信号传导的抑制
目的
本研究的目的是研究通过将人全血与48D2变体VH5.GL:VL4一起预孵育来阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响响应于用IL-1β进行刺激而发生的各种下游细胞因子和趋化因子的释放。
材料和方法
在肝素管中从两个不同的供体收集人血。将血液转移到96孔板的孔，并且在搅拌期间在37℃和5％ CO2下，与150μg/ml VH5.GL:VL4孵育30min。随后将IL-1β或LPS添加到孔(均为1ng/ml)，并且在搅拌期间持续20小时在37℃和5％ CO2下，将血液孵育30min。将血液样品仅与调配物缓冲液一起孵育的孔作为阴性对照(Ctrl)被包括在内。将板以1500rpm离心以将血浆与血细胞分离。血浆按1:2稀释，并且在血浆样品中，71种不同细胞因子和趋化因子(6CKine、BCA-1、CTACK、EGF、ENA-78、嗜酸细胞活化趋化因子、嗜酸细胞活化趋化因子-2、嗜酸细胞活化趋化因子-3、FGF-2、Flt3L、Fractalkine、G-CSF、GM-CSF、GROα/CXCL1、I-309、IFNα2、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-18、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-28、IL-33、IP-10、LIF、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、M-CSF、MDC、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-1δ、PDGF-AA、PDGF-AB/BB、RANTES、sCD40L、SCF、SDF-1α+β、TARC、TGFα、TNFα、TNFβ、TPO、TRAIL、TSLP、VEGF-A)的水平通过使用人细胞因子/趋化因子71-Plex Discovery Assay Array(Eve Technologies；HD71)来进行测量，以上根据制造商的说明书。下文讨论了其中四者，即G-CSF、GROα/CXCL1、IL-17A和TNF-α的结果。
结果
VH5.GL:VL4对IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导的阻断降低了人全血中响应于用IL-1β进行刺激而发生的G-CSF、GROα/CXCL1、IL-17A和TNF-α的释放(图21A-D)。当用LPS刺激血液时，观察到类似的效应，因为VH5.GL:VL4显著降低了G-CSF、GROα/CXCL1和TNF-α的水平并且略微降低了IL-17A的水平(图21A-D)。
结论
VH5.GL:VL4对IL1RAP的阻断影响由IL-1β和LPS介导的IL-1R信号传导的下游效应，使得减少了多种细胞因子和趋化因子的释放。
实例18：48D2变体VH5.GL:VL4对血液循环系统中IL-1β信号传导的抑制
目的
本研究的目的是研究通过将人全血与48D2变体VH5.GL:VL4一起预孵育来阻断IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导会如何影响在模拟人血液循环的血液循环系统中响应于用IL-1β进行刺激而发生的IL-6和IL-8的释放。
材料和方法
从十个健康供体收集新鲜全血，并且添加少量可溶性肝素。将血液立即转移到预涂覆的塑料管，以形成血液循环系统的循环。将循环放置在旋转轮上并且平行运行样品。以32μg/ml的浓度向样品施用VH5.GL:VL4，并且15min后以1ng/ml的浓度添加IL-1β。PBS用于对照。4小时后对每个循环进行采样，并且以10mM的浓度向每个样品中添加EDTA以在采样时间点处停止反应。血浆样品通过离心来进行制备、等分并且储存在≤-60℃下，直到进一步的细胞因子分析。
使用来自Meso Scale Discovery的技术来测量细胞因子IL-6和IL-8。所有样品均按1:4稀释，并且根据制造商的说明书来重复运行样品。
结果
VH5.GL:VL4对IL-1α/β、IL-33和IL-36α/β/γ信号传导的阻断降低了血液循环系统中的人全血循环中响应于用IL-1β进行刺激而发生的IL-6和IL-8的释放(图22A-B)。
结论
在模拟人血液循环的血液循环系统中，VH5.GL:VL4对IL1RAP的阻断会影响由IL-1β介导的IL-1R信号传导的下游效应，使得减少了细胞因子IL-6和IL-8的释放.
实例19：表达IL1RAP的细胞对48D2变体VH5.GL:VL4的内化作用
目的
该实验的目的是研究表达IL1RAP的细胞对荧光标记的48D2变体VH5.GL:VL4的膜结合和潜在内化作用。
材料和方法
WT和IL1RAP KO SKMEL人黑色素瘤细胞生长至60-80％汇合度，随后以每孔12500个细胞的密度转移到8孔Ibidi处理显微镜室载玻片。将细胞与3μg/ml AlexaFluor647(AF647)缀合的VH5.GL:VL4在37℃下一起孵育1小时、2小时或4小时。将对照细胞与AF647缀合的同种型对照抗体一起孵育。可替代地，将与A647缀合的VH5.GL:VL4一起孵育2小时的WTSKMEL细胞另外地与5μg/ml兔抗EEA1抗体和10μg/ml小鼠抗Lamp1抗体一起孵育3小时，以分别针对内体标志物和溶酶体标志物进行染色。将细胞进行洗涤并且与AlexaFluor488(AF488)缀合的抗兔抗体和罗丹明(RX)缀合的抗小鼠抗体一起孵育30min。孵育后，将细胞进行洗涤并且用2％多聚甲醛进行固定。将细胞再次进行洗涤，随后用DAPI进行标记以染色细胞核。蔡司(Zeiss)LSM800共聚焦显微镜用于用63x油浸镜头分析细胞。检测水平根据未与A647缀合的VH5.GL:VL4、或者抗EEA1或抗Lamp1一起孵育的对照细胞来进行设定，并且在整个分析过程中使用了相同的设定。对穿过细胞的扫描500nm光学切片执行了交互式视觉分析，并且捕获了代表性图像。
结果
对于表达IL1RAP的WT SKMEL细胞，A647缀合的VH5.GL:VL4的初始膜结合和细胞内化作用得到证明，该初始膜结合和细胞内化作用在1小时的孵育后是可检测到的(图23；左上图像；箭头指示膜结合和内化作用)。在约2小时的孵育处指示最大内化作用(图23；中上图像)。IL1RAP KO细胞缺乏对A647缀合的VH5.GL:VL4的结合和内化作用，这指示在WT细胞中观察到的效应由与IL1RAP的相互作用来进行介导(图23；中间行；仅观察到DAPI对细胞核的染色)。此外，没有观察到同种型对照抗体与WT细胞的结合或内化作用(图23；底部行；仅观察到DAPI对细胞核的染色)。对EEA1和Lamp1(分别是核内体和溶酶体的标志物)的额外共染色示出与A647标记的VH5.GL:VL4的信号的重叠(图24)。这指示VH5.GL:VL4在内化作用时被定位到这些区室。
结论
VH5.GL:VL4在与表达IL1RAP的SKMEL细胞结合后被内化。该内化作用取决于VH5.GL:VL4与IL1RAP的结合。
实例20：48D2变体VH5.GL:VL4对血液循环系统中Fc介导的免疫活化
目的
本研究的目的是研究以效应子功能沉默hIgG1-LALA格式表达的48D2变体VH5.GL:VL4是否以及在何种程度上可以在模拟人血液循环的血液循环系统中不存在其他刺激的情况下诱导免疫活化。免疫活化将通过促炎细胞因子的释放和循环人全血中的补体活化来进行评估。
材料和方法
从十个健康供体收集新鲜全血，并且添加少量可溶性肝素，以允许分析对补体系统的药物相关影响。将血液立即转移到预涂覆的塑料管，以形成血液循环系统的循环，然后添加0.0125mg/ml、0.125mg/ml或1.25mg/ml的VH5.GL:VL4。添加了3μg/ml抗CD52抗体阿仑单抗或仅添加调配物缓冲液(媒介物)的样品分别用作阳性和阴性对照。将循环放置在旋转轮上并且平行运行样品。在15min和4小时后对每个循环进行采样，并且以10mM的浓度向每个样品中添加EDTA以在采样时间点处停止反应。将在15min处收集的样品处理成血浆以用于补体分析，而将在4小时处收集的血液样品处理成血浆以用于细胞因子分析。血浆样品通过离心来进行制备、等分并且储存在≤-60℃下，直到进行分析。
使用来自Meso Scale Discovery的技术来测量细胞因子IFNγ、IL-6、IL-8、TNFα。所有样品均按1:4稀释，并且根据制造商的说明书来重复运行样品。
使用ELISA试剂盒(人C3a ELISA试剂盒和/>人C5a ELISA试剂盒)通过测量补体裂解产物C3a和C5a来分析补体活化。血浆样品用样品稀释剂按1:500稀释以用于C3a分析并用样品稀释剂按1:50稀释以用于C5a分析，并且根据制造商的说明书来重复运行。
结果
在血液循环系统中，在所评估的三个浓度中的任何一个浓度下，VH5.GL:VL4对IFNγ、IL-6、IL-8或TNFα的释放(图25A-D)未展示出影响，或对如通过C3a和C5a的水平测量的补体活化(图26A-B)未展示出影响。相反，抗CD52抗体阿仑单抗诱导了细胞因子释放以及补体活化。
结论
具有效应子功能沉默Fc区的VH5.GL:VL4不诱导Fc介导的免疫活化。
实例21：静脉内给药的48D2变体VH5.GL:VL4的初始安全性以及药代动力学和毒代动力学特性
目的
本研究的目的是确定VH5.GL:VL4的药代动力学和潜在毒性，将其作为单剂量以三个递增剂量水平静脉内施用给雄性和雌性食蟹猴，直至最大耐受剂量。
材料和方法
对于所评估的每个剂量水平，VH5.GL:VL4以5mg/kg、20mg/kg或50mg/kg的浓度作为单剂量(推注)经由外周静脉而静脉内施用给一只雄性和一只雌性食蟹猴。施用后，持续两周每天观察动物的死亡率、临床体征和食物消耗。在测试前和研究的第8天执行血液学和血清化学。在测试前以及第8天和第15天记录体重。在给药前并且在施用后0.083小时、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、264小时和336小时处，经由股静脉来收集用于生物分析和毒代动力学评估的采样(对于每次采样，至少0.6ml血液)。允许血液样品在管中凝结，以用于在室温下进行血清分离，持续30min。通过在4℃下以1200g离心10min来使凝块离心沉降。将所得血清储存在-80℃下，直到进行分析。
将生物素化的人IL1RAP添加到用链霉亲和素进行预涂覆的Meso ScaleDiscovery(MSD)板，并且在室温下进行孵育。洗涤后，将血清样品添加到板，然后在室温下孵育。洗涤该板，并且将与电化学发光标记(MSD SULFO-TAG)缀合的抗人IgG添加到该板。在最终孵育和洗涤后，添加读取缓冲液(read buffer)。当MSD仪器中的电压被应用于板电极时，SULFO-TAG会发光。该仪器测量发射光的强度，以提供样品中VH5.GL:VL4的定量测量。使用WinNonlin包(v.8.1，Pharsight公司，科盛达公司，美国(Pharsight Inc,CertaraCompany,USA))根据标准非房室法来执行血清毒代动力学分析。
结果
在体重和临床病理学调查中，不存在异常临床体征并且不存在相关毒理变化。未观察到血清化学和血液学的毒理学相关变化。
在所研究的剂量范围内，化合物的剂量归一化最大浓度是类似的。在每个剂量水平处，VH5.GL:VL4的雄性和雌性血清毒代动力学参数是类似的。在5mg/kg剂量后，VH5.GL:VL4的终末半衰期平均为98小时(4天)；在20mg/kg和50mg/kg剂量后，大约220小时(9天)的参数比5mg/kg处的参数高两倍(表21)。VH5.GL:VL4被发现以双指数方式下降(图27)。在所有剂量后，VH5.GL:VL4的血清清除率较低，并且末期分布容积与猴身体总水量处于同一数量级(≈700ml/kg)。
表21：向食蟹猴单次静脉内给药5mg/kg、20mg/kg和50mg/kg后，VH5.GL:VL4的毒代动力学参数
结论
向食蟹猴单次静脉内给药VH5.GL:VL4后，抗体的药代动力学特征在于低清除率、低分布容积和长半衰期。在所研究的剂量范围内，虽然化合物的最大浓度与剂量成正比增加，但50mg/kg处的AUClast示出了增加的趋势大于与剂量成正比。
实例22：皮下给药的48D2变体VH5.GL:VL4的药代动力学特性
目的
本研究的目的是确定在向雌性食蟹猴单次皮下施用抗体后，VH5.GL:VL4的药代动力学和生物利用度。
材料和方法
VH5.GL:VL4在背部区域以10mg/kg的浓度作为单剂量静脉内或皮下施用给两只雌性食蟹猴(以每个施用途径)。在给药前并且在施用后1小时、3小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时、264小时、336小时、480小时和672小时处，收集用于药代动力学评估的采样(对于每次采样，至少0.6ml血液)。此外，在静脉内施用后0.083小时处和皮下施用后0.5小时处收集第一剂量。允许血液样品在管中凝结，以用于在室温下进行血清分离，持续30min。通过在4℃下以1200g离心10min来使凝块离心沉降。将所得血清储存在-80℃下，直到进行分析。
如实例21所述，通过MSD来分析血清。使用Phoenix-WinNonlin包(科盛达公司，美国)执行对于VH5.GL:VL4的血清药代动力学分析。
结果
在向雌性食蟹猴单次静脉内施用10mg/kg的VH5.GL:VL4后，VH5.GL:VL4的血清浓度下降，其中终末半衰期平均为86.9小时(图28和表22)。VH5.GL:VL4的血清清除率以及分布容积均较低。分布容积大约占猴身体总水量的十分之一(表22)。
在皮下给药10mg/kg剂量的VH5.GL:VL4后，化合物的吸收缓慢，从而导致给药后48-96小时的Tmax(图28和表23)。达到Cmax后，化合物的血清浓度降低，其中平均终末半衰期平均为112小时(表23)。皮下生物利用度较高，为93％。
表22：向食蟹猴单次静脉内给药10mg/kg后，VH5.GL:VL4的药代动力学参数
表23：向食蟹猴单次皮下给药10mg/kg后，VH5.GL:VL4的药代动力学参数
结论
向食蟹猴单次静脉内给药10mg/kg VH5.GL:VL4后，化合物的药代动力学特征在于低清除率和分布容积以及长半衰期。在皮下给药10mg/kg VH5.GL:VL4后，化合物的吸收缓慢。达到Cmax后，化合物的血清浓度降低，其中平均终末半衰期与静脉内施用后的平均终末半衰期相当。皮下生物利用度较高。
序列
CDR序列(根据IMGT来进行定义)
SEQ ID NO:1
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
ESISTA
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
KAS
SEQ ID NO:3
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
SEQ ID NO:4
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
GPSLSHFD
SEQ ID NO:5
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
ISPGVST
SEQ ID NO:6
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
CDR序列(根据Kabat来进行定义)
SEQ ID NO:7
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
QASESISTALA
SEQ ID NO:8
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
KASTLPS
SEQ ID NO:9
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
SEQ ID NO:10
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
HFDIT
SEQ ID NO:11
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
SEQ ID NO:12
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
CDR序列(根据IMGT和Kabat的组合来进行定义)
SEQ ID NO:13
可变轻链互补决定区1(CDR-L1)
QASESISTALA
SEQ ID NO:14
可变轻链互补决定区2(CDR-L2)
KASTLPS
SEQ ID NO:15
可变轻链互补决定区3(CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
SEQ ID NO:16
可变重链互补决定区1(CDR-H1)
GPSLSHFDIT
SEQ ID NO:17
可变重链互补决定区2(CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
SEQ ID NO:18
可变重链互补决定区3(CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
重要的是要注意，在每个CDR定义类别(i)Kabat、ii)IMGT或iii)IMGT和Kabat的组合)内，CDR序列(分别为CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3)对于嵌合抗体48D2及其所有经优化的抗体变体(诸如人源化抗体变体或人源化/去免疫化抗体变体)均是相同的(参见下文轻链可变区和重链可变区的序列中所指示的。
-以粗体突出显示的CDR残基，其使用IMGT编号系统来进行鉴定，
-由下划线突出显示CDR残基，其使用Kabat编号系统来进行鉴定，
-由IMGT和Kabat编号系统的组合来进行定义的CDR残基(以粗体显示和以下划线显示的序列的组合)
嵌合48D2抗体中的可变链区
(非人源化、非去免疫化)(例如在实例9和10中)
SEQ ID NO:19
轻链可变区(非人源化、非去免疫化)
SEQ ID NO:20
重链可变区(非人源化、非去免疫化)
人源化可变链区
(例如在实例11和12中)
SEQ ID NO:21
人源化轻链可变区VL1
SEQ ID NO:22
人源化轻链可变区VL2
SEQ ID NO:23
人源化轻链可变区VL3
SEQ ID NO:24
人源化轻链可变区VL4
SEQ ID NO:25
人源化轻链可变区VL5
SEQ ID NO:26
人源化重链可变区VH1
SEQ ID NO:27
人源化重链可变区VH2
SEQ ID NO:28
人源化重链可变区VH3
SEQ ID NO:29
人源化重链可变区VH4
SEQ ID NO:30
人源化重链可变区VH5
人源化和去免疫化可变链区
(例如在实例13和14中)
以粗体显示和以斜体显示的氨基酸残基指示在去免疫化过程中恢复的残基。
SEQ ID NO:31
人源化和去免疫化VL5.GL
SEQ ID NO:32
人源化和去免疫化的VH5.AP
SEQ ID NO:33
人源化和去免疫化的VH5.SK
SEQ ID NO:34
人源化和去免疫化的VH5.GL
恒定区
SEQ ID NO:35
免疫球蛋白κ恒定轻链(轻链恒定区)(Km3同种异型)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
以粗体显示和以下划线显示的氨基酸残基指示当引入LALA突变时，发生改变的残基。
SEQ ID NO:36
免疫球蛋白IgG1恒定重链(重链恒定区)(za同种异型)
SEQ ID NO:2
具有‘LALA’突变的免疫球蛋白IgG1恒定重链(重链恒定区)(za同种异型)
PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
人IL1RAP
SEQ ID NO:37
全长人IL1RAP
MTLLWCVVSLYFYGILQSDASERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEEPINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCTVYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSYVCHARSAKGEVAKAAKVKQKGNRCGQ
SEQ ID NO:38
IL1RAP的结构域2
KDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVV
SEQ ID NO:39
人IL1RAP的结构域2的H2区
TITWYMGCYKIQNFNNVI。
序列表
<110> 坎塔吉亚有限责任公司
<120> 抗IL1RAP抗体
<130> CANBG/P79764PC
<150> EP20216926.4
<151> 2020-12-23
<150> GB2105933.2
<151> 2021-04-26
<150> EP21212368.1
<151> 2021-12-03
<160> 39
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 根据IMGT的CDR-L1
<400> 1
Glu Ser Ile Ser Thr Ala
1 5
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(329)
<223> 具有LALA突变的免疫球蛋白IgG1恒定重链
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 根据IMGT的CDR-L3
<400> 3
Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn Val His Asn Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(8)
<223> 根据IMGT的CDR-H1
<400> 4
Gly Pro Ser Leu Ser His Phe Asp
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 根据IMGT的CDR-H2
<400> 5
Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 根据IMGT的CDR-H3
<400> 6
Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 根据Kabat的CDR-L1
<400> 7
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 根据Kabat的CDR-L2
<400> 8
Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 根据Kabat的CDR-L3
<400> 9
Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn Val His Asn Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> 根据Kabat的CDR-H1
<400> 10
His Phe Asp Ile Thr
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 根据Kabat的CDR-H2
<400> 11
Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 根据Kabat的CDR-H3
<400> 12
Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> 根据IMGT和Kabat的组合的CDR-L1
<400> 13
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> 根据IMGT和Kabat的组合的CDR-L2
<400> 14
Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> 根据IMGT和Kabat的组合的CDR-L3
<400> 15
Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn Val His Asn Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 根据IMGT和Kabat的组合的CDR-H1
<400> 16
Gly Pro Ser Leu Ser His Phe Asp Ile Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> 根据IMGT和Kabat的组合的CDR-H2
<400> 17
Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> 根据IMGT和Kabat的组合的CDR-H3
<400> 18
Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 轻链可变区（非人源化、非去免疫化）
<400> 19
Ala Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 重链可变区（非人源化、非去免疫化）
<400> 20
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Ser Thr Ile Thr Ser Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 人源化轻链可变区VL1
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 人源化轻链可变区VL2
<400> 22
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 人源化轻链可变区VL3
<400> 23
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Ser Val Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 人源化轻链可变区VL4
<400> 24
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 人源化轻链可变区VL5
<400> 25
Ala Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Glu Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化重链可变区VH1
<400> 26
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化重链可变区VH2
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化重链可变区VH3
<400> 28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Leu
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化重链可变区VH4
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化重链可变区VH5
<400> 30
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> 人源化和去免疫化VL5.GL
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化和去免疫化VH5.AP
<400> 32
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化和去免疫化VH5.SK
<400> 33
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 人源化和去免疫化VH5.GL
<400> 34
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 免疫球蛋白κ恒定轻链
<400> 35
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(330)
<223> 免疫球蛋白IgG1恒定重链
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 37
<211> 356
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(356)
<223> 全长人IL1RAP
<400> 37
Met Thr Leu Leu Trp Cys Val Val Ser Leu Tyr Phe Tyr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Gln Ser Asp Ala Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met
20 25 30
Arg Gln Ile Gln Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro
35 40 45
Leu Phe Glu His Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala
50 55 60
Gly Leu Thr Leu Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu
65 70 75 80
Glu Pro Ile Asn Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys
85 90 95
Asp Val Leu Trp Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Met Leu Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro
115 120 125
Leu Glu Val Val Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu
130 135 140
Pro Val His Lys Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys
145 150 155 160
Pro Asn Val Asp Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr
165 170 175
Trp Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro
180 185 190
Glu Gly Met Asn Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly
195 200 205
Asn Tyr Thr Cys Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His
210 215 220
Leu Thr Arg Thr Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala
225 230 235 240
Val Pro Pro Val Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys
245 250 255
Glu Pro Gly Glu Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe
260 265 270
Leu Met Asp Ser Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys
275 280 285
Pro Asp Asp Ile Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His
290 295 300
Ser Arg Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys
305 310 315 320
Val Thr Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser
325 330 335
Ala Lys Gly Glu Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Gly Asn
340 345 350
Arg Cys Gly Gln
355
<210> 38
<211> 101
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(101)
<223> IL1RAP的结构域2
<400> 38
Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro Val His Lys Leu
1 5 10 15
Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp Gly
20 25 30
Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly Cys
35 40 45
Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu Gly Met Asn Leu
50 55 60
Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys Val
65 70 75 80
Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His Leu Thr Arg Thr Leu
85 90 95
Thr Val Lys Val Val
100
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(18)
<223> 人IL1RAP的结构域2的H2区
<400> 39
Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn
1 5 10 15
Val Ile
Claims (126)
1.一种对白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL1RAP)具有结合特异性的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
轻链可变区，其包含
a)CDR-L1，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQID NO:13)；
b)CDR-L2，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ ID NO:8)和KASTLPS(SEQ ID NO:14)；以及
c)CDR-L3，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)、QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)；
和/或
重链可变区，其包含
d)CDR-H1，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:
10)和GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)；
e)CDR-H2，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；以及
f)CDR-H3，其包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
轻链可变区，其包含
a)CDR-L1，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQ ID NO:13)；
b)CDR-L2，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ ID NO:8)和KASTLPS(SEQ ID NO:14)；以及
c)CDR-L3，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)、QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:15)；
和/或
重链可变区，其包含
d)CDR-H1，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:10)和GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)；
e)CDR-H2，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；以及
f)CDR-H3，其由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ IDNO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IL1RAP是人IL1RAP。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述IL1RAP在细胞的表面上进行表达。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与IL1RAP的结构域2结合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有CDR的轻链可变区，所述CDR
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ESISTA(SEQ ID NO:1)、QASESISTALA(SEQ ID NO:7)和QASESISTALA(SEQ ID NO:13)；
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：KAS、KASTLPS(SEQ ID NO:8)和KASTLPS(SEQ ID NO:14)；和/或
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:3)、QQGFSSGNVHNA(SEQ ID NO:9)和QQGFSSGNVHNA(SEQ IDNO:15)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:19具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下或由以下组成：选自由SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:31具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区的框架区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含含有CDR的重链可变区，所述CDR
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：GPSLSHFD(SEQ ID NO:4)、HFDIT(SEQ ID NO:10)和GPSLSHFDIT(SEQ ID NO:16)；
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ISPGVST(SEQ ID NO:5)、TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:11)和TISPGVSTYYASWAKS(SEQ ID NO:17)；和/或
包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下项组成的组的氨基酸序列组成：ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:6)、GGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:12)和ARGGVGSSWKAFDL(SEQ ID NO:18)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:20的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含以下或由以下组成：选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成的组的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含以下或由以下组成：选自由SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34组成的组的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区的框架区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:20的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26；
b)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27；
c)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28；
d)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29；
e)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:21，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
f)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26；
g)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27；
h)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28；
i)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29；
j)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:22，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
k)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26；
l)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27；
m)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28；
n)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29；
o)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:23，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
p)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26；
q)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27；
r)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28；
s)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29；
t)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
u)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:26；
v)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:27；
w)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:28；
x)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:29；或
y)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30，
或与SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:30中的任何一者具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
b)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32；
c)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:33；
d)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34；
e)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
f)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32；
g)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:33；
h)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:25，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34；
i)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:30；
j)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:32；
k)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:33；或
l)轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31，和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34；
或与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33或SEQ ID NO:34具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:24；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：轻链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:31；和重链可变区，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:34。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区和/或所述重链可变区的框架区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区或其部分。
23.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区属于κ或λ轻链。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区属于κ轻链。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:35的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO:35具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
26.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区或其部分。
27.根据权利要求26所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区属于选自由以下项组成的组的免疫球蛋白亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
28.根据权利要求26至27中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区属于免疫球蛋白亚类IgG1。
29.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区或由重链恒定区组成，所述重链恒定区包含以下：SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性，例如至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
30.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区和/或所述重链恒定区的氨基酸中的任何一种氨基酸已经被改变为另一种氨基酸，条件是不超过5种氨基酸已经被如此改变，诸如4种氨基酸，不超过3种氨基酸，诸如2种氨基酸，或不超过1种氨基酸。
31.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含以下或由以下组成
-根据权利要求6至10中任一项所述的轻链可变区；和/或
-根据权利要求11至15中任一项所述的重链可变区；和/或
-根据权利要求22至25中任一项所述的轻链恒定区；和/或
-根据权利要求26至30中任一项所述的重链恒定区。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区。
33.根据权利要求32所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区是非天然存在的。
34.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含具有突变的IgG恒定区的Fc区。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区包含影响所述抗体或其抗原结合片段的效应子功能的突变中的一个或多个突变。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区包含选自由以下项组成的组的所述突变中的一个或多个突变：如由EU索引所定义的L234A、L235A、P329G、G237A、P238S、H269A、A330S和P331S。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中连接至所述Fc区的聚糖缺乏岩藻糖。
38.根据权利要求32至36中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中连接至所述Fc区的所述聚糖的岩藻糖含量低。
39.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段在FUT8阴性细胞系中产生。
40.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含完整抗体或由完整抗体组成。
41.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自由以下项组成的组的抗原结合片段或由选自由以下项组成的组的抗原结合片段组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫键结合的Fv)、Fab样片段(例如Fab片段、Fab'片段和F(ab)2片段)和结构域抗体(例如单个VH可变结构域或VL可变结构域)。
42.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制白细胞介素-1(IL-1)家族细胞因子配体和/或受体的信号传导。
43.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制选自由以下项组成的组的至少一种细胞因子的信号传导：IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ或它们的任何组合。
44.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1α的信号传导。
45.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1β的信号传导。
46.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-33的信号传导。
47.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-36α的信号传导。
48.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-36β的信号传导。
49.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-36γ的信号传导。
50.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够抑制IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和IL-36γ的信号传导。
51.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抑制信号传导是基本上完全抑制信号传导。
52.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中抑制信号传导是部分抑制信号传导。
53.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段表现出以下特性中的一个或多个特性：
a)对IL1RAP的结合亲和力(KD)，其特征在于KD值是3nM或更小；
b)与IL1RAP的结构域2结合，优选地与结构域2的H2区结合，其中所述H2区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:39的氨基酸；
c)与来自食蟹猴或猪的IL1RAP的交叉反应性；
d)对IL-1α信号传导的抑制作用；
e)对IL-1β信号传导的抑制作用；
f)对IL-33信号传导的抑制作用；
g)对IL-36α信号传导的抑制作用；
h)对IL-36β信号传导的抑制作用；
i)对IL-36γ信号传导的抑制作用；
j)由表达IL1RAP的细胞进行的内化作用。
54.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段表现出所有以下特性：
a)对IL1RAP的结合亲和力(KD)，其特征在于KD值是3nM或更小；
b)与IL1RAP的结构域2结合，优选地与结构域2的H2区结合，其中所述H2区包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:39的氨基酸；
c)与来自食蟹猴或猪的IL1RAP的交叉反应性；
d)对IL-1α信号传导的抑制作用；
e)对IL-1β信号传导的抑制作用；
f)对IL-33信号传导的抑制作用；
g)对IL-36α信号传导的抑制作用；
h)对IL-36β信号传导的抑制作用；
i)对IL-36γ信号传导的抑制作用；
j)由表达IL1RAP的细胞进行的内化作用。
55.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC。
56.根据权利要求1至54中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不能够诱导表达IL1RAP的细胞的ADCC。
57.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段进一步包含用于增加药剂的体内半衰期的部分。
58.根据权利要求57所述的抗体或其抗原结合片段，其中用于增加所述体内半衰期的所述部分选自由以下项组成的组：聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。
59.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段被聚乙二醇化。
60.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段直接或间接地与功能部分，诸如细胞毒性或可检测部分共价结合。
61.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含细胞毒性部分。
62.根据权利要求60至61中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
63.根据权利要求62所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素选自由以下项组成的组：β发射体、俄歇发射体、转换电子发射体、α发射体和低光子能量发射体。
64.根据权利要求62至63中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素具有在所述药剂附近产生高剂量吸光度的局部吸收能量的发射模式。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素选自由以下项组成的组：长程β-发射体，诸如90Y、32P、186Re/186Re；166Ho、76As/77As、153Sm；中程β发射体，诸如131I、177Lu、67Cu、161Tb；低能量β发射体，诸如45Ca、35S或14C；转换或俄歇发射体，诸如51Cr、67Ga、99Tcm、111In、123I、125I、201Tl；以及α发射体，诸如212Bi、213Bi、223Ac和221At。
66.根据权利要求62至65中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素是177Lu。
67.根据权利要求60至66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分包含细胞毒性药物或由细胞毒性药物组成。
68.根据权利要求67所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性药物选自由以下项组成的组：细胞抑制药物；抗雄激素药物；可的松及其衍生物；膦酸盐；睾酮-5-α-还原酶抑制剂；硼附加物；细胞因子；毒胡萝卜素及其代谢物；毒素(诸如皂草素或卡奇霉素)；化学治疗剂(诸如抗代谢物)；或可用于治疗肿瘤疾患的任何其他细胞毒性药物。
69.根据权利要求67或68中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性药物适用于活化疗法，诸如光子活化疗法、中子活化疗法、中子诱导的俄歇电子疗法、同步加速器辐射疗法、或低能量X射线光子活化疗法。
70.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含可检测部分。
71.根据权利要求70所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测部分包含放射性同位素或由放射性同位素组成。
72.根据权利要求71所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素选自由以下项组成的组：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。
73.根据权利要求71至72中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素是89Zr。
74.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含一对可检测和细胞毒性放射性同位素，诸如86Y/90Y或124I/211At。
75.根据权利要求60至74中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述放射性同位素能够以多模态方式同时充当可检测部分和细胞毒性部分。
76.根据权利要求60至75中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测部分包含顺磁性同位素或由顺磁性同位素组成。
77.根据权利要求76所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述顺磁性同位素选自由以下项组成的组：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
78.根据权利要求60至77中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述可检测部分是通过成像技术诸如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像可检测的。
79.根据权利要求60至78中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞毒性部分和/或可检测部分经由连接部分来间接地接合至所述抗体或其抗原结合片段。
80.根据权利要求79所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述连接部分是螯合剂。
81.根据权利要求80所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述螯合剂选自由以下项组成的组：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物、去铁胺(DFO)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)的衍生物、S-2-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物和1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
82.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段不包含细胞毒性部分。
83.一种多核苷酸，其编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其组件多肽链。
84.根据权利要求83所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是cDNA分子。
85.根据权利要求83至84中任一项所述的多核苷酸，其编码抗体轻链或其可变区。
86.根据权利要求83至84中任一项所述的多核苷酸，其编码抗体重链或其可变区。
87.一种载体，其包含根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸。
88.根据权利要求87所述的载体，其中所述载体是表达载体。
89.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求87至88中任一项所述的载体。
90.根据权利要求89所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
91.根据权利要求89所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
92.根据权利要求89所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
93.根据权利要求89所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
94.一种用于产生根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许表达经编码的抗体或其抗原结合片段的条件下培养根据权利要求89至93中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求87至88中任一项所述的载体。
95.一种药物组合物，其包含
根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
根据权利要求87至88中任一项所述的载体，和/或
根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，
在药物组合物中，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
96.根据权利要求95所述的组合物，其中所述组合物包含有效量的所述抗体或其抗原结合片段、所述多核苷酸、所述载体和/或所述重组宿主细胞。
97.根据权利要求95至96中任一项所述的组合物，其适于肠胃外递送。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中所述肠胃外递送是静脉内递送、局部递送、皮下递送和/或肌内递送。
99.根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求87至88中任一项所述的载体、根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或根据权利要求95至98中任一项所述的组合物，其用于医药中。
100.根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求87至88中任一项所述的载体、根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或根据权利要求95至98中任一项所述的组合物，
其用于预防、治疗、缓解、检测和/或诊断疾病或疾患，所述疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者
其中所述疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
101.根据权利要求100所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病或疾患是炎性和/或纤维化疾病或疾患。
102.根据权利要求100至101中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，
其中所述炎性和/或纤维化疾病或疾患选自由以下项组成的组：心肌炎、系统性硬化症、银屑病、银屑病关节炎、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、所有类型的关节炎、所有类型的幼年型关节炎，其包括系统性发病幼年特发性关节炎(SOJIA)、骨关节炎、家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)、穆-韦氏病、新生儿发病多系统炎性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮(PAPA)
综合征、成年发病斯蒂尔氏病、高IgD综合征、2型糖尿病、巨噬细胞活化综合征、TNF受体相关周期性综合征、Blau病、强直性脊柱炎、Sweet病、狼疮性关节炎、阿尔茨海默氏病、哮喘、过敏、结节病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、大疱性类天疱疮、I型糖尿病、慢性阻塞性肺病、幽门螺杆菌胃炎、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、肝炎、丙型肝炎、缺血再灌注损伤、多发性硬化症、奈瑟氏球菌或肺炎球菌性脑膜炎、结核病、白塞氏综合征、感染性休克、移植物抗宿主病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、牙周炎、肥胖和肥胖相关疾病(例如，代谢综合征、心脏肥大、充血性心力衰竭、心肌梗塞、静脉曲张、多囊卵巢综合征、胃食管反流病(GERD)、脂肪肝病、结肠直肠癌、乳腺癌、子宫癌、慢性肾衰竭、卒中和高尿酸血症)、椎间盘疾病、肠易激综合征、施尼茨勒综合征、过敏/特应性皮炎、反常性痤疮、白塞氏病、心肌纤维化、心血管疾病、cryopyin相关周期性综合征、囊性纤维化、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化、皮肤纤维化、自身免疫性心肌炎、与器官移植相关联的器官功能障碍、胰腺炎、腹膜炎、葡萄膜炎、血管炎、肺炎、肺动脉高压、硬皮病慢性移植物抗宿主病、败血症、干燥综合征、高安氏动脉炎和痛风。
103.根据权利要求100至102中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病或疾患具有炎性和/或纤维化组分。
104.根据权利要求100至103中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病或疾患是自身免疫性疾病或疾患。
105.根据权利要求100所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病或疾患是肿瘤疾病或疾患。
106.根据权利要求100或105中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述肿瘤疾病或疾患是血液疾病或疾患，或实体瘤。
107.根据权利要求105至106中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中肿瘤血液疾病或疾患选自由以下项组成的组：慢性髓样白血病(CML)、骨髓增生性疾患(MPD)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓样白血病(AML)。
108.根据权利要求105至107中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述实体瘤选自由以下项组成的组：前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑/CNS癌、泌尿器官癌、胆道癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、头/颈癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、肉瘤、皮肤癌和子宫癌。
109.根据权利要求100至108中任一项所述使用的抗体、其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其中所述疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
110.根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求87至88中任一项所述的载体、根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或根据权利要求95至98中任一项所述的组合物，其用于诱导受试者中与肿瘤疾患相关联的病理细胞或其干细胞或祖细胞的细胞死亡和/或抑制受试者中与肿瘤疾患相关联的病理细胞或其干细胞或祖细胞的生长和/或增殖，其中所述细胞表达IL1RAP。
111.根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求87至88中任一项所述的载体、根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或根据权利要求95至98中任一项所述的组合物，
其在制备用于预防、治疗、缓解、检测和/或诊断疾病或疾患的药物中的用途，所述疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，
并且/或者其中所述疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
112.根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求87至88中任一项所述的载体、根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或根据权利要求95至98中任一项所述的组合物，
其在制备用于检测和/或诊断疾病或疾患的药物中的用途，所述疾病或疾患与表达IL1RAP的细胞相关联。
113.一种用于预防和/或治疗和/或缓解和/或检测和/或诊断疾病或疾患的方法，所述疾病或疾患对用IL-1α、IL-1β、IL-33、IL-36α、IL-36β和/或IL-36γ信号传导的抑制剂进行治疗是易感的，并且/或者其中所述疾病或疾患与受试者中表达IL1RAP的细胞相关联，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
114.一种用于检测受试者中表达IL1RAP的细胞的体外方法，所述方法包括：
(a)提供来自待测试的受试者的细胞的样品，诸如活检组织或血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化所述样品中存在的所述细胞；
(c)使根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与所述样品中存在的细胞接触；
(d)确定所述抗体或其抗原结合片段是否与所述细胞结合
其中所述抗体或其抗原结合片段与所述细胞的结合指示受试者的组织中存在与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患。
115.一种用于鉴定患有与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患的患者的体外方法，所述患者将受益于用根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段进行的治疗，所述方法包括：
(a)提供细胞的样品，诸如来自待测试的患者的活检组织或血液样品；
(b)任选地，提取和/或纯化所述样品中存在的所述细胞；
(c)使根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与所述样品中存在的细胞接触；
(d)确定所述抗体或其抗原结合片段是否与所述细胞结合
其中所述抗体或其抗原结合片段与表达IL1RAP的细胞的结合指示将受益于用根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段进行的治疗的患者。
116.一种用于治疗患有与细胞表达IL1RAP相关联的疾病或疾患的患者的方法，所述方法包括：
a)选择被鉴定为患有与根据权利要求114至115中任一项所述的表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患的患者；
b)向所述患者施用有效治疗所述疾病或疾患的治疗剂。
117.一种用于检测表达IL1RAP的细胞的方法，所述方法包括：
(a)使根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段与待分析其IL1RAP表达的细胞接触；
(b)确定所述抗体或其抗原结合片段是否与所述细胞结合
其中所述抗体或其抗原结合片段与所述细胞的结合指示受试者的组织中存在与表达IL1RAP的细胞相关联的疾病或疾患。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述方法是体内方法、离体方法或体外方法。
119.一种用于减轻患有腹膜炎的受试者中炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
120.一种用于减轻患有银屑病或银屑病关节炎的受试者中的疾病严重性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
121.一种用于减轻患有动脉粥样硬化的受试者中的动脉粥样硬化斑块炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
122.一种用于减少患有动脉粥样硬化的受试者中的动脉粥样硬化斑块体积和/或动脉粥样硬化斑块大小的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
123.一种用于减轻患有心肌炎的受试者中的炎症和/或纤维化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
124.一种用于抵消患有心肌炎或自身免疫性心肌炎的受试者中的心脏功能恶化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
125.一种用于减轻患有系统性硬化症的受试者中的皮肤纤维化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
-根据权利要求1至82中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，
-根据权利要求83至86中任一项所述的多核苷酸，
-根据权利要求87至88中任一项所述的载体，
-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
126.一种用于减轻患有系统性硬化症的受试者中的肺纤维化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的以下的步骤
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-根据权利要求89至93中任一项所述的重组宿主细胞，和/或
-根据权利要求95至98中任一项所述的组合物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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