KR20230123962A - 항-il1rap 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 더욱이, 이는 상기 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 이는 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이는 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터 및/또는 상기 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 이는 의약에 사용하기 위한 및/또는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 경감 및/또는 검출 및/또는 진단, 및/또는 여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 20 연관되는 것에 사용하기 위한 상기 항체 또는 항원-결합 단편, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 벡터, 상기 숙주 세포 및/또는 상기 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항-염증, 항-섬유화 및/또는 항-신생물성 특성을 갖는 항-IL1RAP 항체 또는 이의 단편, 및 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링과 연관된 질환 또는 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단에서의 그의 용도에 관한 것이다.
인터류킨-1(IL-1) 패밀리의 사이토카인 리간드와 그 수용체는 염증, 자가면역, 면역 조절, 섬유증, 세포 증식, 종양 성장, 종양 전이 및 숙주 방어와 연관되어 있다. 그것은 염증, 자가면역, 면역 조절, 섬유성 및 퇴행성 질환 및 장애의 병리학뿐만 아니라 암과 같은 세포 증식성 또는 신생물성 질환 또는 장애에 기여한다(Garlanda C, The interleukin-1 family: back to the future. Immunity, 39:1003-1018 (2013)).
모든 이들 질환은 개인과 사회에 엄청난 부담을 야기하고 IL-1 패밀리의 사이토카인 리간드 및 수용체와 연관된 염증, 자가면역, 면역 조절, 섬유성, 퇴행성 및 세포 증식성 질환 또는 장애를 치료, 개선, 예방, 진단 또는 검출하기 위한 요법에 대한 필요성이 남아 있다.
IL-1 패밀리는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ를 포함하는 다수의 작용제 사이토카인을 포함하고, 이들 각각의 사이토카인은 그의 특정한 IL-1 패밀리 세포막 수용체에 결합한다. 사이토카인이 그의 동족 수용체에 결합하면 IL-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)이라는 보조-수용체가 동원되어, 세포내 신호 전달 및, 염증 반응을 촉발하는 NF-κB를 포함한, 일련의 전사 인자의 활성화를 촉발하는 수용체 복합체를 형성한다. IL1RAP는 IL-1 수용체 I(IL1R1; 결합 IL-1α 및 IL-1β), IL-33 수용체(ST2, IL1RL1; 결합 IL-33) 및 IL-36 수용체(IL1RL2; 결합 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ)에 대한 보조-수용체이고 사이토카인 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 신호 전달 다운스트림에 필요하다.
IL1RAP에 결합하는 항체는 IL1RAP-의존성 수용체의 사이토카인 시그널링 다운스트림을 차단할 수 있다. 흥미롭게도, 이 차단 기능과는 별로로, IL1RAP에 결합하는 항체는 또한 다른 기능에 관하여, 예를 들어 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포의 식세포작용(ADCP)을 유도하기 위해 사용될 수 있어, 이에 의해 IL1RAP-발현 종양 세포와 같은 표적 세포의 사멸을 초래한다.
과거에는, 각각의 항체의 특성에 따라 IL-1 패밀리의 사이토카인 리간드의 시그널링 경로를 감소, 억제 및/또는 차단할 수 있는 항체가 생성되었다. 예를 들어, WO 2015/132602는 다양한 정도로 IL-1α, IL-1β 및 IL-33의 시그널링을 억제하는 항 IL1RAP 항체를 개시한다.
6가지 사이토카인(IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ) 모두를 차단하는 것은 사이토카인 리간드 및 수용체의 IL-1 패밀리를 표적화하는 치료적 접근법과 관련하여 유익할 것으로 예상된다. IL-1α와 IL-1β는 2가지 강력한 향-염증성 사이토카인이고 급성 염증에 이들의 관여가 광범위하게 기술되었다. IL-33은 전통적으로 IL-5 및 IL-13과 같은 유형 2 사이토카인의 생성을 유도하는 Th2 사이토카인으로 생각된다. IL-36의 기능은 잘 설명되어 있지 않지만 여러 연구에서 IL-36이 면역 세포 활성화에 관여하고 향-염증성 사이토카인의 방출을 유도한다고 제안한다. 이들 모든 사이토카인의 경로를 표적화함에 의해, 질환-관련된 과정, 예를 들어 염증 과정의 보다 완전한 하향조절이 달성되어, 염증성 질환 또는 장애가 있는 환자에 대한 치료 결과를 개선할 것이다.
현재까지, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링과 연관된 것과 같은 인터루킨-1(IL-1) 패밀리의 사이토카인 리간드 및 수용체와 연관된 질환 또는 장애의 다양한 양태를 다루는 치료 옵션이 부족하다. 현재 치료는 별개의 IL-1 패밀리 사이토카인 리간드와 연관된 별도의 경로만을 표적화하고, 예를 들어 염증 및 섬유증의 양태에서 IL-1 패밀리 사이토카인 리간드와 연관된 여러 경로의 동시적인 하향조절은 여전히 임상적 과제로 남아 있다. 결과적으로, IL-1 패밀리의 사이토카인 리간드 및 수용체와 연관된 다면적 양태를 표적화하는 개선된 요법에 대한 긴급한 요구가 남아 있다.
본 발명의 발명자들은 6개의 IL1RAP 의존성 리간드; IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링 다운스트림을 억제하는 능력을 갖는 IL-1RAP 도메인 2에 결합하는 항체 및 이의 변이체를 생성하였다. 이 우수한 특성에 기인하여 이 항체는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링과 연관된 질환 및 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단에 사용될 수 있으며, 이에 의해 이들 사이토카인과 연관된 여러 다운스트림 경로를 동시적으로 표적화한다. 결과적으로, 이 항체는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링과 연관된 질환 및 장애의 여러 양태 및 과정, 예를 들어 염증성 또는 섬유성 질환 또는 장애에서의 염증성 및 섬유성 양태, 또는 신생물성 질환 또는 장애에서의 염증성, 섬유성 또는 증식성 양태를 표적화하는데 사용될 수 있다. 여기에 기술된 항체는 다중 사이토카인 경로의 동시 표적화, 예를 들어 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 표적화 경로를 허용하며, 이는 단지 하나 또는 몇 개의 사이토카인만 차단하는 것이 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 충분히 효과적이지 않은 질환 또는 장애를 치료할 때 임상적 이점이 있다. 미세-조정된 특성을 갖는 항체 변이체를 초래하는, 인간화 및 탈-면역화 절차에 의한 이 항체의 최적화가 추가로 개시된다.
발명의 제1 양태는 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역
a) ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1;
b) KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및
c) QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3;
및/또는
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역
d) GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1;
e) ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및
f) ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3.
발명의 제2 양태는 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 그의 구성요소 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
발명의 제3 양태는 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
발명의 제4 양태는 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 발명의 제3 양태에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
발명의 제5 양태는 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드 또는 발명의 제3 양태의 벡터를 포함하는 발명의 제4 양태의 숙주 세포를 인코딩된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다.
발명의 제6 양태는
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터, 및/또는
발명의 제4 양태의 숙주 세포를,
약학적 조성물에 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 여기서 조성물은 약학적으로-허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
발명의 제7 양태는 의학에 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이다.
발명의 제8 양태는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화 및/또는 검출 및/또는 진단에 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이고, 및/또는
여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다.
발명의 제9 양태는, 세포가 IL1RAP를 발현하는 것인, 세포 사멸을 유도하고/하거나 대상체에서 신생물성 장애와 연관된 병리학적 세포, 또는 그의 줄기 세포 또는 전구 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는데 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이다.
발명의 제10 양태는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단을 위한 약제의 제조에
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물의 사용에 관한 것이고,
및/또는 여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다.
발명의 제11 양태는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 검출 및/또는 진단을 위한 약제의 제조에 있어서
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물의 사용에 관한 것이다.
발명의 제12 양태는 다음의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 경감 및/또는 검출 및/또는 진단을 위한 방법에 관한 것이고, 및/또는 질환 또는 장애는 대상체에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물.
발명의 제13 양태는 대상체에서 IL1RAP를 발현하는 세포의 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) 생검 조직 또는 혈액 샘플과 같이 테스트되는 대상체로부터의 세포의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 샘플에 존재하는 세포를 추출 및/또는 정제하는 단계;
(c) 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 샘플에 존재하는 세포와 접촉시키는 단계;
(d) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포에 대한 결합은 대상체의 조직에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타낸다.
발명의 제14 양태는 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편으로의 치료로부터 이익을 얻을 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 환자를 식별하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) 테스트되는 환자로부터 생검 조직 또는 혈액 샘플과 같은 세포의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 샘플에 존재하는 세포를 추출 및/또는 정제하는 단계;
(c) 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 샘플에 존재하는 세포와 접촉시키는 단계;
(d) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 IL1RAP를 발현하는 세포에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편으로의 치료로부터 이익을 얻을 환자를 나타낸다.
발명의 제15 양태는 IL1RAP 발현 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 발명의 제14 양태에 따른 방법을 사용하여 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 것으로 식별된 환자를 선정하는 단계; 및
b) 상기 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제16 양태는 IL1RAP를 발현하는 세포의 검출을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) IL1RAP의 그 발현에 대해 분석되어 지는 세포와 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계;
(b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포에 대한 결합은 대상체의 조직에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타낸다.
발명의 제17 양태는 복막염이 있는 대상체에서 염증을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제18 양태는 건선 또는 건선성 관절염이 있는 대상체에서 질환 중증도를 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제19 양태는 죽상동맥경화증이 있는 대상체에서 죽상동맥경화 플라크 염증을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제20 양태는 죽상동맥경화증이 있는 대상체에서 죽상동맥경화 플라크 부피 및/또는 죽상동맥경화 플라크 크기를 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제21 양태는 심근염이 있는 대상체에서 염증 및/또는 섬유증을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제22 양태는 심근염 또는 자가면역 심근염이 있는 대상체에서 심장 기능에서의 저하에 대응하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제23 양태는 전신 경화증이 있는 대상체에서 피부 섬유증을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제24 양태는 전신 경화증이 있는 대상체에서 폐 섬유증을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 급성 복막염에 대한 모델에서 염증을 감소시킨다.
WT 또는 KO 마우스를 MSU 결정으로 면역화하고, 면역화 6시간 후, 침윤 세포의 정량화를 위해 복막 세척에 대해 유세포분석을 수행하였다(a). WT 마우스는 mCAN10, IL1RA, 동형 대조군 항체(동형) 또는 PBS로 MSU 결정으로 면역화하기 불과 1시간 이전에 처리되었다. 면역화 6시간 후, 복막 세척을 침윤 세포의 정량화(b) 또는 루미넥스 검정에 의한 사이토카인 및 케모카인의 정량화(c)를 위한 유세포분석을 위해 수집하였다.
도 2: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 건선 및 건선성 관절염에 대한 모델에서 질환 중증도를 감소시킨다.
건선은 BALB/c 마우스에서 7일 동안 마우스의 면도한 등에 이미퀴모드의 투여에 의해 유발되었다. 이 기간 동안 마우스는 mCAN10, 항-IL-1β 항체(항-IL-1β), 동형 대조군 항체(동형 항-IL-1β, 동형 mCAN10), 덱사메타손 또는 PBS 단독(비히클)으로 3회에 걸쳐 처리되었다. 등 영역의 염증 및 홍반의 점수화에 의해 7-일 기간에 걸쳐 질환 중증도를 평가하였다(a 및 b). B6N.Q.NCF1 마우스에서 사카로마이세스 세레비시애로부터 만난의 투여에 의해 건선성 관절염을 유도했다. 마우스를 a 및 b에서와 같이 처리하고 모든 발의 관절 염증을 점수화하여 7-일 동안에 걸쳐 질환 중증도를 평가하였다(c 및 d). 7일차에, 마우스를 희생시키고 혈장 내 IL-17 수준의 분석을 위해 혈액을 수집하였다(e).
도 3: mCAN10은 죽상동맥경화증에 대한 모델에서 대동맥 플라크 염증을 감소시킨다.
죽상동맥경화성 병변의 전개가 고콜레스테롤 식이(HCD)를 마우스에게 먹임에 의해 아포지단백 E(Apoe) KO 마우스에서 유도되었다. HCD에서 4주 후, 마우스를 mCAN10 또는 동형 대조군 항체(Iso)로 6주 동안 격주로(매주 2회) 처리했다. 이 기간 동안 마우스는 HCD에서 유지되었다. 실험의 종료 시 마우스를 희생시키고 총 CD45+ 세포(a), CD11b+ 세포 및 Ly6G+ 호중구와 같은 골수 세포(b 및 c), TCR-β+ 세포, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포와 같은 T 림프구(d-f)의 유세포분석을 위해 대동맥을 수집했다.
도 4: mCAN10은 죽상동맥경화증에 대한 모델에서 대동맥 플라크의 크기를 감소시킨다.
마우스를 도 3에 기술된 대로 처리했다. 실험의 종료 시 마우스를 희생시키고, 심장을 수집하고 대동맥 뿌리에서 절편을 플라크 부피(a)와 면적(b) 둘 모두의 비교를 위해 오일-레드 O에 의한 지질 축적을 위해 염색했다.
도 5: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 실험적 자가면역 심근염(EAM)에서 염증과 섬유증을 감소시킨다.
EAM은 완전 프로인트 아쥬반트에 유화된 α-미오신 중쇄 펩티드로 2회에 걸쳐 면역화에 의하여 BALB/c 마우스에서 유도되었다. 최종 면역 후 7일차부터 시작하여 마우스에 mCAN10, 동형 대조군 항체(동형) 또는 PBS 단독을 격주로 4주 동안 처리하였다. 실험의 종료 시, 마우스를 희생시키고, 심장을 수집하고, 심장 절편을 염증의 정도를 평가하기 위해 H&E 염색(a 및 b) 또는 섬유화의 정도를 평가하기 위해 Masson의 트리크롬 염색(c 및 d)으로 염색하였다.
도 6: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 실험적 자가면역 심근염에서 심장 기능에서 저하를 상쇄한다.
EAM은 완전 프로인트 아쥬반트에 유화된 α-미오신 중쇄 펩티드로 2회에 걸쳐 면역화에 의하여 BALB/c 마우스에서 유도되었다. 최종 면역일(7일차)로부터 시작하여 마우스에 mCAN10, 항-IL-1β 항체(항-IL-1β) 또는 동형 대조군 항체(동형 항-IL-1β, 동형 mCAN10)를 격주로 5주 동안 투여하였다(a). 대안적으로, 마우스를 5주 동안 매일 mCAN10, 동형 대조군 항체(동형 mCAN10), IL1RA, 프레드니손 또는 비히클 대조군(비히클 IL1RA, 비히클 프레드니손)으로 처리하였다(b). 선택적으로, 마우스에는 a에서와 같이 mCAN10, 동형 대조군 항체(동형) 또는 비히클 대조군(PBS)을 투여했지만, 최종 면역화 후 7일차(14일차)부터 치료를 시작하였다(c). 심장 기능은 연구의 시작과 28일차 및 42일차에 경흉부 심초음파에 의해 평가되었다.
도 7: mCAN10은 경피성 만성 이식편대숙주병(scl cGvHD)에 대한 마우스 모델에서 피부 섬유증을 개선한다.
암컷 BALB/c(H-2d) 수령자 마우스는 scl cGvHD를 전개하는 MHC 불일치 모델을 생성하기 위해 동종 이식 방식으로 수컷 B10.D2 공여자 마우스(H-2d)로부터 골수를 받았다. 대조군으로서 동일한 수령자 마우스가 동계 이식 방식으로 암컷 BALB/c(H-2d) 공여자 마우스로부터 골수를 받아, 질환 전개를 초래하지 않았다. 치료는 이식 21일 후 시작되었고 마우스는 mCAN10(1차 용량에서 20mg/kg; 후속 용량에서 10mg/kg) 또는 동일한 용량의 동형 대조군 항체(Iso)를 i.p.로 4주 동안 격주로 받았다. 대안적으로, 이들 마우스를 50mg/kg p.o.에서 닌테다닙으로 4주 동안 매일 처리하였다. 동계 이식을 받은 마우스는 동형 대조군 항체(Iso)로만 처리되었다. 49일차에 마우스를 희생시키고, 상부 등으로부터 피부 샘플을 피부 두께(a) 및 섬유아세포의 수(b)를 분석하기 위한 조직학적 평가 또는 하이드록시프롤린 함량의 정량화(c)를 위해 수집하였다.
도 8: mCAN10은 scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서 폐 섬유증을 개선한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식 후 49일차에 마우스를 희생시킨 후 폐를 Ashcroft 점수(a) 및 시리우스 레드로 염색된 영역(b)을 결정하기 위한 조직학적 평가를 위해, 또는 하이드록시프롤린 함량의 정량화(c)를 위해 수집하였다.
도 9: mCAN10은 scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서 체중 감소를 개선한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식에 이어서 마우스는 연구의 기간 동안 지속적으로 계량되었으며 이식 후 49일에 완료되었다.
도 10: mCAN10은 scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서 IL-1 패밀리 유전자 발현 프로필을 변경한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식 후 49일차에 마우스를 희생시킨 후 상부 등으로부터 피부 샘플을 RNA 시퀀싱에 사용하여 표시된 IL-1 패밀리 구성원에 대한 유전자 발현 수준에서 변화를 시각화하는 히트맵을 생성했다. 동종으로-이식된 마우스(Allo), 동계로-이식된 마우스(Syn) 및 mCAN10으로 처리된 동종으로-이식된 마우스(Treat)인, 각 그룹으로부터 4개 샘플로부터의 결과가 도시된다.
도 11: scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서, mCAN10은 전신 경화증 환자에서도 차별적으로 발현되는 유전자의 발현을 변경한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식 후 49일차에 마우스를 희생시킨 후, 상부 등으로부터 피부 샘플을 RNA 시퀀싱 분석에 사용했다. 전신 경화증(SSc) 환자의 전사체 프로필은 143명의 환자와 22명의 건강한 개체를 포함하는 환자 코호트, NCBI/GEO/GSE130955에서 검색되었다. 중첩하는 유전자의 수는 벤 다이어그램에 의해 시각화되었다.
도 12: 세포막 IL1RAP에 대한 키메라 48D2의 용량-의존적 결합
키메라 48D2 또는 hIgG1(hIg=인간 면역글로불린) 동형 대조군 항체를 증가하는 농도로 SKMEL-5 세포에 첨가하고 세포외 결합을 유세포분석에 의해 분석하였다. 키메라 48D2는 hIgG1 동형 대조군 항체에 비해 더 높은 평균 형광 강도(MFI)로 용량-의존 방식으로 세포막 상의 IL1RAP에 특이적으로 결합했다.
도 13: 키메라 48D2에 의한 인터루킨 시그널링의 억제
IL-1알파(a), IL-1베타(b), IL-33(c), IL-36알파(d), IL-36베타(e) 및 IL-36감마(f) 시그널링을 차단하는 키메라 48D2의 능력은 HEK-Blue™ 검정에서 조사되었다. hIgG1 동형 항체가 대조군으로 포함되었다. 점선은 억제의 윈도우를 예시하기 위해 양성(사이토카인으로 자극된 세포) 및 음성(세포 단독) 대조군을 나타낸다. 키메라 48D2는 6개의 사이토카인 모두의 시그널링 다운스트림를 차단한다.
도 14: 키메라 48D2는 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 피그 IL1RAP에 결합한다
키메라 48D2와 IL1RAP 오르토로그의 교차 반응성을 ELISA로 측정했다. 키메라 48D2는 인간(hIL1RAP), 사이노몰거스 원숭이(mfIL1RAP) 및 피그(ssIL1RAP) IL1RAP와 교차 반응하지만, 마우스(mIL1RAP), 랫트(rnIL1RAP), 토끼(ocIL1RAP) 또는 개(cIL1RAP) IL1RAP와는 교차 반응하지 않는다.
도 15: 인간화된 48D2 변이체에 의한 인터루킨 시그널링의 억제
VL 변이체 VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5와 조합된 인간화된(h) 48D2 VH 변이체 VH1, VH2, VH3, VH4 및 VH5의 IL-1알파(a-e), IL-1베타(f-j), 및 IL-33(k-o) 시그널링을 차단하는 능력은 HEK-Blue™ 검정에서 조사되었다. VH5를 담지하는 h48D2의 변이체는 키메라 48D2와 유사한 정도로 다운스트림 시그널링을 차단하고 IL-36알파(p), IL-36베타(q) 및 IL-36감마(r)의 억제에 대해 추가로 조사되었다. VH1, VH2, VH3 또는 VH4를 담지하는 h48D2의 변이체는 다양한 정도로 IL-1알파, IL-1베타 및 IL-33의 시그널링을 억제했다. hIgG1 동형 항체 및 키메라 48D2가 대조군으로 포함되었다. 점선은 억제의 윈도우를 예시하기 위해 양성(사이토카인으로 자극된 세포) 및 음성(세포 단독) 대조군을 나타낸다. 임의의 VL 변이체와 조합된 VH5를 담지하는 h48D2의 변이체(VL1-VL5)는 키메라 48D2와 유사한 정도로 모든 6개의 인터루킨의 다운스트림 시그널링을 차단한다.
도 16: 세포막 IL1RAP에 대한 2개의 인간화된 및 탈-면역화된 클론의 용량-의존적 결합
인간화된 및 탈-면역화된 48D2 클론 중 2개인, h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL을 증가하는 농도에서 SKMEL-5 세포에 첨가하고 세포외 결합을 유세포분석에 의해 분석하였다. 키메라 48D2 및 hIgG1 동형 항체가 대조군으로 포함되었다. h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL은 hIgG1 동형 대조군 항체 및 키메라 48D2 항체와 비교하여 더 높은 평균 형광 강도(MFI)로 용량-의존적 방식으로 세포막 상의 IL1RAP에 특이적으로 결합했다.
도 17: 탈-면역화된 h48D2 클론은 모든 6개의 인터루킨 경로에 대한 억제 활성을 보존했다.
IL-1알파(a), IL-1베타(b), IL-33(c), IL-36알파(d), IL-36베타(e) 및 IL-36감마(f) 시그널링에 대한 탈-면역화된 h48D2 클론의 억제 활성은 HEK-Blue™ 검정에서 평가되었다. hIgG1 동형 항체 및 h48D2 VH5:VL4 및 h48D2 VH5:VL5를 대조군으로 포함시켰다. 점선은 억제의 윈도우를 예시하기 위해 양성(사이토카인으로 자극된 세포) 및 음성(세포 단독) 대조군을 나타낸다. 6개의 탈-면역화된 클론 모두는 h48D2 VH5:VL4 및 VH5:VL5와 유사한 억제 활성을 가졌다. IL-33(g), IL-36알파(h), IL-36베타(i), IL-36감마(j)에 대한 h48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 억제 활성은 IL-36 수용체의 안정한 발현을 갖는 HEK-Blue™에서 추가로 평가되었다.
도 18: 탈-면역화된 h48D2 클론은 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 피그 IL1RAP에 결합한다
교차 반응성은 ELISA로 측정하였다. h48D2 VH5.GL:VL4(a) 및 VH5.GL:VL5.GL(b)는 인간(hIL1RAP), 사이노몰거스 원숭이(mfIL1RAP) 및 피그(ssIL1RAP) IL1RAP와 교차 반응하지만 마우스(mIL1RAP), 랫트(rnIL1RAP), 토끼(ocIL1RAP) 또는 개(cIL1RAP) IL1RAP와는 교차 반응하지 않는다.
도 19: hIgG1 포맷에서 48D2는 SKMEL-5 세포를 발현하는 IL1RAP의 ADCC를 유도한다
ADCC 검정은 SKMEL-5 세포 및 인간 NK 세포를 발현하는 IL1RAP로 시험관내에서 수행되었고 죽어가는 SKMEL-5 세포의 수는 유세포분석에 의해 분석되었고 % 사멸(DAPI 양성) 세포로 표시되었다. hIgG1 포맷에서 48D2는 용량-의존적 방식으로 NK 세포가 SKMEL-5 세포를 사멸하도록 지시할 수 있다. 48D2가 hIgG1-LALA 포맷에서 발현되는 경우 용량-의존적 ADCC가 유도되지 않았다. 동형 hIgG1 및 동형-LALA는 처리되지 않은 세포에서 관찰된 배경 세포 사멸보다 더 큰 ADCC를 유도하지 않았다.
도 20: 48D2는 인간 피부 섬유아세포에서 사이토카인-유도된 IL-6 mRNA 발현을 억제한다
일차 인간 피부 섬유아세포는 시험관내에서 배양되었고, 키메라 48D2를 추가하거나 추가하지 않고, IL-1알파 또는 IL-1베타(a) 또는 IL-36알파, IL-36베타 또는 IL-36감마(b)로 자극되었다. 데이터는 비자극된 대조군(0ng/mL)과 비교하여 변화 배수(2-ddCT)로 표시된다. 모든 사이토카인은 용량-의존적 방식으로 IL-6 mRNA 발현을 유도했고, 48D2는 비자극된 대조군과 비슷한 수준 아래로 증가를 억제했다.
도 21: VH5.GL:VL4는 인간 전혈에서 IL-1β-유도된 사이토카인 및 케모카인 방출을 억제한다
혈액을 2명의 인간 공여자로부터 수집하고 VH5.GL:VL4와 함께 30분 동안 인큐베이션했다. 이후 혈액을 IL-1β 또는 지질다당류(LPS)로 20시간 동안 자극했다. 플레이트를 원심분리하고, 인간 사이토카인/케모카인 71-플렉스 발견 검정 어레이에 의해 분석하기 위해 혈장층을 수집했다. G-CSF(a), GROα/CXCL1(b), IL-17A(c) 및 TNF-α(d)의 수준은 두 공여자 중 하나에 대해 표시된다.
도 22: VH5.GL:VL4는 혈액-루프 시스템에서 IL-1β-유도된 사이토카인 방출을 억제한다
혈액을 10명의 인간 공여자로부터 수집하고 혈액-루프 시스템으로 옮겼다. VH5.GL:VL4를 32μg/ml에서 혈액에 투여하고 1ng/ml에서 IL-1β를 15분 후에 첨가했다. 루프는 4시간 동안 실행되었다. 혈액 샘플에서 혈장을 얻었고 MSD로부터 MULTI-ARRAY® 기술을 사용하여 IL-6(a) 및 IL-8(b)의 수준을 측정했다.
도 23: VH5.GL:VL4는 IL1RAP-발현 세포에 의해 내재화된다
WT 및 IL1RAP KO SKMEL 세포를 Ibidi-처리 현미경 챔버 슬라이드에서 1, 2 또는 4시간 동안 형광으로-접합된 VH5.GL:VL4 또는 동형 대조군(Iso Ctrl)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 핵은 DAPI에 의해 염색되었다. VH5.GL:VL4(화살표로 표시됨)의 막 결합 및 내재화를 평가하기 위해 캡처된 대표적인 이미지 및 세포를 통해 스캔된 광학 섹션의 쌍방향 시각적 분석을 수행했다.
도 24: VH5.GL:VL4는 IL1RAP-발현 세포에 의한 내재화 시 리소좀 또는 엔도좀으로 국소화된다
WT SKMEL 세포를 Ibidi-처리 현미경 챔버 슬라이드에서 1, 2 또는 4시간 동안 형광으로-접합된 VH5.GL:VL4와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 엔도좀 및 리소좀을 각각 검출하기 위해 마커 EEA1 및 Lamp1에 대해 추가로 염색하였다. 세포 핵은 DAPI에 의해 염색하였다. VH5.GL:VL4 염색과 EEA1 및 Lamp1 염색의 중첩을 평가하기 위해 캡처된 대표적인 이미지 및 세포를 통해 스캔된 광학 섹션의 쌍방향 시각적 분석을 수행했다.
도 25: hIgG1-LALA 포맷에서 VH5.GL:VL4는 Fc-매개된 사이토카인 방출을 유도하지 않는다
혈액을 10명의 인간 공여자로부터 수집하여 혈액-루프 시스템으로 옮겼다. VH5.GL:VL4를 지시된 대로 증가하는 농도로 혈액에 첨가했다. 대안적으로, 항-CD52 항체 알렘투주맙을 추가했다. 루프는 4시간 동안 실행되었다. 혈장을 혈액 샘플에서 얻었고 MSD로부터 MULTI-ARRAY® 기술을 사용하여 IFN-γ(a), IL-6(b), IL-8(c) 및 TNF-α(d)의 수준을 측정했다.
도 26: hIgG1-LALA 포맷에서 VH5.GL:VL4는 Fc-매개된 보체 활성화를 유도하지 않는다
혈액을 10명의 인간 공여자로부터 수집하여 혈액 루프 시스템으로 옮겼다. VH5.GL:VL4를 지시된 대로 증가하는 농도로 혈액에 첨가했다. 대안적으로, 항-CD52 항체 알렘투주맙을 추가했다. 루프는 15분 동안 실행되었다. 혈장을 혈액 샘플로부터 얻었고 보체 활성화를 RayBiotech으로부터 ELISA 키트를 사용하여 보체 분할 생성물 C3a(a) 및 C5a(b)의 측정에 의해 분석했다.
도 27: 사이노몰거스 원숭이에게 단일 정맥내 투여 후 VH5.GL:VL4의 혈청 농도
VH5.GL:VL4는 평가된 각 용량 수준에 대해 한 마리의 수컷(M) 및 한 마리의 암컷(F) 사이노몰거스 원숭이에게 단일 용량으로 5, 20 또는 50mg/kg으로 정맥내로 투여되었다. 혈액 샘플을 투여 후 0.083, 1, 3, 6, 24, 48, 96, 168, 264 및 336시간에 수집하고 혈청을 얻었다. 혈청 샘플을 전기화학발광 라벨에 접합된 항-인간 IgG 항체를 첨가하고 방출된 빛의 강도를 측정함에 의해 검출된 샘플에서 IL1RAP-코팅된 MSD 플레이트 및 VH5.GL:VL4로 옮겼다.
도 28: 사이노몰거스 원숭이에게 단일 정맥내 또는 피하 투여 후 VH5.GL:VL4의 혈청 농도
VH5.GL:VL4를 2마리의 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 단일 용량으로 10mg/kg으로 정맥내로 또는 피하로 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 후 0.083, 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 96, 168, 264, 336, 480 및 672시간에 수집하고 혈청을 얻었다. 혈청 샘플을 전기화학발광 라벨에 접합된 항-인간 IgG 항체를 첨가하고 방출된 빛의 강도를 측정함에 의해 검출된 샘플에서 IL1RAP-코팅된 MSD 플레이트 및 VH5.GL:VL4로 옮겼다.
WT 또는 KO 마우스를 MSU 결정으로 면역화하고, 면역화 6시간 후, 침윤 세포의 정량화를 위해 복막 세척에 대해 유세포분석을 수행하였다(a). WT 마우스는 mCAN10, IL1RA, 동형 대조군 항체(동형) 또는 PBS로 MSU 결정으로 면역화하기 불과 1시간 이전에 처리되었다. 면역화 6시간 후, 복막 세척을 침윤 세포의 정량화(b) 또는 루미넥스 검정에 의한 사이토카인 및 케모카인의 정량화(c)를 위한 유세포분석을 위해 수집하였다.
도 2: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 건선 및 건선성 관절염에 대한 모델에서 질환 중증도를 감소시킨다.
건선은 BALB/c 마우스에서 7일 동안 마우스의 면도한 등에 이미퀴모드의 투여에 의해 유발되었다. 이 기간 동안 마우스는 mCAN10, 항-IL-1β 항체(항-IL-1β), 동형 대조군 항체(동형 항-IL-1β, 동형 mCAN10), 덱사메타손 또는 PBS 단독(비히클)으로 3회에 걸쳐 처리되었다. 등 영역의 염증 및 홍반의 점수화에 의해 7-일 기간에 걸쳐 질환 중증도를 평가하였다(a 및 b). B6N.Q.NCF1 마우스에서 사카로마이세스 세레비시애로부터 만난의 투여에 의해 건선성 관절염을 유도했다. 마우스를 a 및 b에서와 같이 처리하고 모든 발의 관절 염증을 점수화하여 7-일 동안에 걸쳐 질환 중증도를 평가하였다(c 및 d). 7일차에, 마우스를 희생시키고 혈장 내 IL-17 수준의 분석을 위해 혈액을 수집하였다(e).
도 3: mCAN10은 죽상동맥경화증에 대한 모델에서 대동맥 플라크 염증을 감소시킨다.
죽상동맥경화성 병변의 전개가 고콜레스테롤 식이(HCD)를 마우스에게 먹임에 의해 아포지단백 E(Apoe) KO 마우스에서 유도되었다. HCD에서 4주 후, 마우스를 mCAN10 또는 동형 대조군 항체(Iso)로 6주 동안 격주로(매주 2회) 처리했다. 이 기간 동안 마우스는 HCD에서 유지되었다. 실험의 종료 시 마우스를 희생시키고 총 CD45+ 세포(a), CD11b+ 세포 및 Ly6G+ 호중구와 같은 골수 세포(b 및 c), TCR-β+ 세포, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포와 같은 T 림프구(d-f)의 유세포분석을 위해 대동맥을 수집했다.
도 4: mCAN10은 죽상동맥경화증에 대한 모델에서 대동맥 플라크의 크기를 감소시킨다.
마우스를 도 3에 기술된 대로 처리했다. 실험의 종료 시 마우스를 희생시키고, 심장을 수집하고 대동맥 뿌리에서 절편을 플라크 부피(a)와 면적(b) 둘 모두의 비교를 위해 오일-레드 O에 의한 지질 축적을 위해 염색했다.
도 5: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 실험적 자가면역 심근염(EAM)에서 염증과 섬유증을 감소시킨다.
EAM은 완전 프로인트 아쥬반트에 유화된 α-미오신 중쇄 펩티드로 2회에 걸쳐 면역화에 의하여 BALB/c 마우스에서 유도되었다. 최종 면역 후 7일차부터 시작하여 마우스에 mCAN10, 동형 대조군 항체(동형) 또는 PBS 단독을 격주로 4주 동안 처리하였다. 실험의 종료 시, 마우스를 희생시키고, 심장을 수집하고, 심장 절편을 염증의 정도를 평가하기 위해 H&E 염색(a 및 b) 또는 섬유화의 정도를 평가하기 위해 Masson의 트리크롬 염색(c 및 d)으로 염색하였다.
도 6: 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 실험적 자가면역 심근염에서 심장 기능에서 저하를 상쇄한다.
EAM은 완전 프로인트 아쥬반트에 유화된 α-미오신 중쇄 펩티드로 2회에 걸쳐 면역화에 의하여 BALB/c 마우스에서 유도되었다. 최종 면역일(7일차)로부터 시작하여 마우스에 mCAN10, 항-IL-1β 항체(항-IL-1β) 또는 동형 대조군 항체(동형 항-IL-1β, 동형 mCAN10)를 격주로 5주 동안 투여하였다(a). 대안적으로, 마우스를 5주 동안 매일 mCAN10, 동형 대조군 항체(동형 mCAN10), IL1RA, 프레드니손 또는 비히클 대조군(비히클 IL1RA, 비히클 프레드니손)으로 처리하였다(b). 선택적으로, 마우스에는 a에서와 같이 mCAN10, 동형 대조군 항체(동형) 또는 비히클 대조군(PBS)을 투여했지만, 최종 면역화 후 7일차(14일차)부터 치료를 시작하였다(c). 심장 기능은 연구의 시작과 28일차 및 42일차에 경흉부 심초음파에 의해 평가되었다.
도 7: mCAN10은 경피성 만성 이식편대숙주병(scl cGvHD)에 대한 마우스 모델에서 피부 섬유증을 개선한다.
암컷 BALB/c(H-2d) 수령자 마우스는 scl cGvHD를 전개하는 MHC 불일치 모델을 생성하기 위해 동종 이식 방식으로 수컷 B10.D2 공여자 마우스(H-2d)로부터 골수를 받았다. 대조군으로서 동일한 수령자 마우스가 동계 이식 방식으로 암컷 BALB/c(H-2d) 공여자 마우스로부터 골수를 받아, 질환 전개를 초래하지 않았다. 치료는 이식 21일 후 시작되었고 마우스는 mCAN10(1차 용량에서 20mg/kg; 후속 용량에서 10mg/kg) 또는 동일한 용량의 동형 대조군 항체(Iso)를 i.p.로 4주 동안 격주로 받았다. 대안적으로, 이들 마우스를 50mg/kg p.o.에서 닌테다닙으로 4주 동안 매일 처리하였다. 동계 이식을 받은 마우스는 동형 대조군 항체(Iso)로만 처리되었다. 49일차에 마우스를 희생시키고, 상부 등으로부터 피부 샘플을 피부 두께(a) 및 섬유아세포의 수(b)를 분석하기 위한 조직학적 평가 또는 하이드록시프롤린 함량의 정량화(c)를 위해 수집하였다.
도 8: mCAN10은 scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서 폐 섬유증을 개선한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식 후 49일차에 마우스를 희생시킨 후 폐를 Ashcroft 점수(a) 및 시리우스 레드로 염색된 영역(b)을 결정하기 위한 조직학적 평가를 위해, 또는 하이드록시프롤린 함량의 정량화(c)를 위해 수집하였다.
도 9: mCAN10은 scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서 체중 감소를 개선한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식에 이어서 마우스는 연구의 기간 동안 지속적으로 계량되었으며 이식 후 49일에 완료되었다.
도 10: mCAN10은 scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서 IL-1 패밀리 유전자 발현 프로필을 변경한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식 후 49일차에 마우스를 희생시킨 후 상부 등으로부터 피부 샘플을 RNA 시퀀싱에 사용하여 표시된 IL-1 패밀리 구성원에 대한 유전자 발현 수준에서 변화를 시각화하는 히트맵을 생성했다. 동종으로-이식된 마우스(Allo), 동계로-이식된 마우스(Syn) 및 mCAN10으로 처리된 동종으로-이식된 마우스(Treat)인, 각 그룹으로부터 4개 샘플로부터의 결과가 도시된다.
도 11: scl cGvHD에 대한 마우스 모델에서, mCAN10은 전신 경화증 환자에서도 차별적으로 발현되는 유전자의 발현을 변경한다.
마우스는 도 7에 기술된 바와 같이 처리되었다. 이식 후 49일차에 마우스를 희생시킨 후, 상부 등으로부터 피부 샘플을 RNA 시퀀싱 분석에 사용했다. 전신 경화증(SSc) 환자의 전사체 프로필은 143명의 환자와 22명의 건강한 개체를 포함하는 환자 코호트, NCBI/GEO/GSE130955에서 검색되었다. 중첩하는 유전자의 수는 벤 다이어그램에 의해 시각화되었다.
도 12: 세포막 IL1RAP에 대한 키메라 48D2의 용량-의존적 결합
키메라 48D2 또는 hIgG1(hIg=인간 면역글로불린) 동형 대조군 항체를 증가하는 농도로 SKMEL-5 세포에 첨가하고 세포외 결합을 유세포분석에 의해 분석하였다. 키메라 48D2는 hIgG1 동형 대조군 항체에 비해 더 높은 평균 형광 강도(MFI)로 용량-의존 방식으로 세포막 상의 IL1RAP에 특이적으로 결합했다.
도 13: 키메라 48D2에 의한 인터루킨 시그널링의 억제
IL-1알파(a), IL-1베타(b), IL-33(c), IL-36알파(d), IL-36베타(e) 및 IL-36감마(f) 시그널링을 차단하는 키메라 48D2의 능력은 HEK-Blue™ 검정에서 조사되었다. hIgG1 동형 항체가 대조군으로 포함되었다. 점선은 억제의 윈도우를 예시하기 위해 양성(사이토카인으로 자극된 세포) 및 음성(세포 단독) 대조군을 나타낸다. 키메라 48D2는 6개의 사이토카인 모두의 시그널링 다운스트림를 차단한다.
도 14: 키메라 48D2는 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 피그 IL1RAP에 결합한다
키메라 48D2와 IL1RAP 오르토로그의 교차 반응성을 ELISA로 측정했다. 키메라 48D2는 인간(hIL1RAP), 사이노몰거스 원숭이(mfIL1RAP) 및 피그(ssIL1RAP) IL1RAP와 교차 반응하지만, 마우스(mIL1RAP), 랫트(rnIL1RAP), 토끼(ocIL1RAP) 또는 개(cIL1RAP) IL1RAP와는 교차 반응하지 않는다.
도 15: 인간화된 48D2 변이체에 의한 인터루킨 시그널링의 억제
VL 변이체 VL1, VL2, VL3, VL4 및 VL5와 조합된 인간화된(h) 48D2 VH 변이체 VH1, VH2, VH3, VH4 및 VH5의 IL-1알파(a-e), IL-1베타(f-j), 및 IL-33(k-o) 시그널링을 차단하는 능력은 HEK-Blue™ 검정에서 조사되었다. VH5를 담지하는 h48D2의 변이체는 키메라 48D2와 유사한 정도로 다운스트림 시그널링을 차단하고 IL-36알파(p), IL-36베타(q) 및 IL-36감마(r)의 억제에 대해 추가로 조사되었다. VH1, VH2, VH3 또는 VH4를 담지하는 h48D2의 변이체는 다양한 정도로 IL-1알파, IL-1베타 및 IL-33의 시그널링을 억제했다. hIgG1 동형 항체 및 키메라 48D2가 대조군으로 포함되었다. 점선은 억제의 윈도우를 예시하기 위해 양성(사이토카인으로 자극된 세포) 및 음성(세포 단독) 대조군을 나타낸다. 임의의 VL 변이체와 조합된 VH5를 담지하는 h48D2의 변이체(VL1-VL5)는 키메라 48D2와 유사한 정도로 모든 6개의 인터루킨의 다운스트림 시그널링을 차단한다.
도 16: 세포막 IL1RAP에 대한 2개의 인간화된 및 탈-면역화된 클론의 용량-의존적 결합
인간화된 및 탈-면역화된 48D2 클론 중 2개인, h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL을 증가하는 농도에서 SKMEL-5 세포에 첨가하고 세포외 결합을 유세포분석에 의해 분석하였다. 키메라 48D2 및 hIgG1 동형 항체가 대조군으로 포함되었다. h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL은 hIgG1 동형 대조군 항체 및 키메라 48D2 항체와 비교하여 더 높은 평균 형광 강도(MFI)로 용량-의존적 방식으로 세포막 상의 IL1RAP에 특이적으로 결합했다.
도 17: 탈-면역화된 h48D2 클론은 모든 6개의 인터루킨 경로에 대한 억제 활성을 보존했다.
IL-1알파(a), IL-1베타(b), IL-33(c), IL-36알파(d), IL-36베타(e) 및 IL-36감마(f) 시그널링에 대한 탈-면역화된 h48D2 클론의 억제 활성은 HEK-Blue™ 검정에서 평가되었다. hIgG1 동형 항체 및 h48D2 VH5:VL4 및 h48D2 VH5:VL5를 대조군으로 포함시켰다. 점선은 억제의 윈도우를 예시하기 위해 양성(사이토카인으로 자극된 세포) 및 음성(세포 단독) 대조군을 나타낸다. 6개의 탈-면역화된 클론 모두는 h48D2 VH5:VL4 및 VH5:VL5와 유사한 억제 활성을 가졌다. IL-33(g), IL-36알파(h), IL-36베타(i), IL-36감마(j)에 대한 h48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 억제 활성은 IL-36 수용체의 안정한 발현을 갖는 HEK-Blue™에서 추가로 평가되었다.
도 18: 탈-면역화된 h48D2 클론은 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 피그 IL1RAP에 결합한다
교차 반응성은 ELISA로 측정하였다. h48D2 VH5.GL:VL4(a) 및 VH5.GL:VL5.GL(b)는 인간(hIL1RAP), 사이노몰거스 원숭이(mfIL1RAP) 및 피그(ssIL1RAP) IL1RAP와 교차 반응하지만 마우스(mIL1RAP), 랫트(rnIL1RAP), 토끼(ocIL1RAP) 또는 개(cIL1RAP) IL1RAP와는 교차 반응하지 않는다.
도 19: hIgG1 포맷에서 48D2는 SKMEL-5 세포를 발현하는 IL1RAP의 ADCC를 유도한다
ADCC 검정은 SKMEL-5 세포 및 인간 NK 세포를 발현하는 IL1RAP로 시험관내에서 수행되었고 죽어가는 SKMEL-5 세포의 수는 유세포분석에 의해 분석되었고 % 사멸(DAPI 양성) 세포로 표시되었다. hIgG1 포맷에서 48D2는 용량-의존적 방식으로 NK 세포가 SKMEL-5 세포를 사멸하도록 지시할 수 있다. 48D2가 hIgG1-LALA 포맷에서 발현되는 경우 용량-의존적 ADCC가 유도되지 않았다. 동형 hIgG1 및 동형-LALA는 처리되지 않은 세포에서 관찰된 배경 세포 사멸보다 더 큰 ADCC를 유도하지 않았다.
도 20: 48D2는 인간 피부 섬유아세포에서 사이토카인-유도된 IL-6 mRNA 발현을 억제한다
일차 인간 피부 섬유아세포는 시험관내에서 배양되었고, 키메라 48D2를 추가하거나 추가하지 않고, IL-1알파 또는 IL-1베타(a) 또는 IL-36알파, IL-36베타 또는 IL-36감마(b)로 자극되었다. 데이터는 비자극된 대조군(0ng/mL)과 비교하여 변화 배수(2-ddCT)로 표시된다. 모든 사이토카인은 용량-의존적 방식으로 IL-6 mRNA 발현을 유도했고, 48D2는 비자극된 대조군과 비슷한 수준 아래로 증가를 억제했다.
도 21: VH5.GL:VL4는 인간 전혈에서 IL-1β-유도된 사이토카인 및 케모카인 방출을 억제한다
혈액을 2명의 인간 공여자로부터 수집하고 VH5.GL:VL4와 함께 30분 동안 인큐베이션했다. 이후 혈액을 IL-1β 또는 지질다당류(LPS)로 20시간 동안 자극했다. 플레이트를 원심분리하고, 인간 사이토카인/케모카인 71-플렉스 발견 검정 어레이에 의해 분석하기 위해 혈장층을 수집했다. G-CSF(a), GROα/CXCL1(b), IL-17A(c) 및 TNF-α(d)의 수준은 두 공여자 중 하나에 대해 표시된다.
도 22: VH5.GL:VL4는 혈액-루프 시스템에서 IL-1β-유도된 사이토카인 방출을 억제한다
혈액을 10명의 인간 공여자로부터 수집하고 혈액-루프 시스템으로 옮겼다. VH5.GL:VL4를 32μg/ml에서 혈액에 투여하고 1ng/ml에서 IL-1β를 15분 후에 첨가했다. 루프는 4시간 동안 실행되었다. 혈액 샘플에서 혈장을 얻었고 MSD로부터 MULTI-ARRAY® 기술을 사용하여 IL-6(a) 및 IL-8(b)의 수준을 측정했다.
도 23: VH5.GL:VL4는 IL1RAP-발현 세포에 의해 내재화된다
WT 및 IL1RAP KO SKMEL 세포를 Ibidi-처리 현미경 챔버 슬라이드에서 1, 2 또는 4시간 동안 형광으로-접합된 VH5.GL:VL4 또는 동형 대조군(Iso Ctrl)과 함께 인큐베이션하였다. 세포 핵은 DAPI에 의해 염색되었다. VH5.GL:VL4(화살표로 표시됨)의 막 결합 및 내재화를 평가하기 위해 캡처된 대표적인 이미지 및 세포를 통해 스캔된 광학 섹션의 쌍방향 시각적 분석을 수행했다.
도 24: VH5.GL:VL4는 IL1RAP-발현 세포에 의한 내재화 시 리소좀 또는 엔도좀으로 국소화된다
WT SKMEL 세포를 Ibidi-처리 현미경 챔버 슬라이드에서 1, 2 또는 4시간 동안 형광으로-접합된 VH5.GL:VL4와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 엔도좀 및 리소좀을 각각 검출하기 위해 마커 EEA1 및 Lamp1에 대해 추가로 염색하였다. 세포 핵은 DAPI에 의해 염색하였다. VH5.GL:VL4 염색과 EEA1 및 Lamp1 염색의 중첩을 평가하기 위해 캡처된 대표적인 이미지 및 세포를 통해 스캔된 광학 섹션의 쌍방향 시각적 분석을 수행했다.
도 25: hIgG1-LALA 포맷에서 VH5.GL:VL4는 Fc-매개된 사이토카인 방출을 유도하지 않는다
혈액을 10명의 인간 공여자로부터 수집하여 혈액-루프 시스템으로 옮겼다. VH5.GL:VL4를 지시된 대로 증가하는 농도로 혈액에 첨가했다. 대안적으로, 항-CD52 항체 알렘투주맙을 추가했다. 루프는 4시간 동안 실행되었다. 혈장을 혈액 샘플에서 얻었고 MSD로부터 MULTI-ARRAY® 기술을 사용하여 IFN-γ(a), IL-6(b), IL-8(c) 및 TNF-α(d)의 수준을 측정했다.
도 26: hIgG1-LALA 포맷에서 VH5.GL:VL4는 Fc-매개된 보체 활성화를 유도하지 않는다
혈액을 10명의 인간 공여자로부터 수집하여 혈액 루프 시스템으로 옮겼다. VH5.GL:VL4를 지시된 대로 증가하는 농도로 혈액에 첨가했다. 대안적으로, 항-CD52 항체 알렘투주맙을 추가했다. 루프는 15분 동안 실행되었다. 혈장을 혈액 샘플로부터 얻었고 보체 활성화를 RayBiotech으로부터 ELISA 키트를 사용하여 보체 분할 생성물 C3a(a) 및 C5a(b)의 측정에 의해 분석했다.
도 27: 사이노몰거스 원숭이에게 단일 정맥내 투여 후 VH5.GL:VL4의 혈청 농도
VH5.GL:VL4는 평가된 각 용량 수준에 대해 한 마리의 수컷(M) 및 한 마리의 암컷(F) 사이노몰거스 원숭이에게 단일 용량으로 5, 20 또는 50mg/kg으로 정맥내로 투여되었다. 혈액 샘플을 투여 후 0.083, 1, 3, 6, 24, 48, 96, 168, 264 및 336시간에 수집하고 혈청을 얻었다. 혈청 샘플을 전기화학발광 라벨에 접합된 항-인간 IgG 항체를 첨가하고 방출된 빛의 강도를 측정함에 의해 검출된 샘플에서 IL1RAP-코팅된 MSD 플레이트 및 VH5.GL:VL4로 옮겼다.
도 28: 사이노몰거스 원숭이에게 단일 정맥내 또는 피하 투여 후 VH5.GL:VL4의 혈청 농도
VH5.GL:VL4를 2마리의 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 단일 용량으로 10mg/kg으로 정맥내로 또는 피하로 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 후 0.083, 0.5, 1, 3, 6, 24, 48, 96, 168, 264, 336, 480 및 672시간에 수집하고 혈청을 얻었다. 혈청 샘플을 전기화학발광 라벨에 접합된 항-인간 IgG 항체를 첨가하고 방출된 빛의 강도를 측정함에 의해 검출된 샘플에서 IL1RAP-코팅된 MSD 플레이트 및 VH5.GL:VL4로 옮겼다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "항체"에 대한 언급은 하나 이상의 항체, 적어도 하나의 항체 또는 둘 이상의 항체와 같은 다수의 그러한 항체를 포함한다. 유사하게, "항-IL1RAP 항체"는 또한 예를 들어 실시예 9 내지 22에 기재된 항체 변이체와 같은 "항-IL1RAP 항체"를 지칭할 수 있다.
용어 "일부 실시형태"는 하나 또는 하나 초과의 실시형태를 포함할 수 있다.
본문 전반에 걸쳐서 또는 청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 조합하여 사용될 때 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만 그것은 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다.
IL1RAP 항체
발명의 제1 양태는 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역
a) ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1;
b) KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및/또는
c) QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3;
및/또는
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역
d) GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1;
e) ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및
f) ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역
a) ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-L1;
b) KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-L2; 및
c) QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-L3;
및/또는
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역
d) GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-H1;
e) ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-H2; 및
f) ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-H3.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인터루킨-1 수용체 부속 단백질", "IL1RAP" 및 "IL1-RAP"는 구체적으로, 예를 들어 GenBank 수탁 번호 AAB84059, NCBI 참조 서열: NP_002173.1 및 UniProtKB/Swiss-Prot 수탁 번호 Q9NPH3-1에 기술된 바와 같은 인간 IL1RAP 단백질을 포함한다. IL1RAP는 과학 문헌에서 IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1RAcP 및 EG3556으로도 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "mCAN10"("뮤어라인 CAN10"에 대한 약어)은 뮤어라인 IL1RAP에 대한 항체를 지칭한다. 이 항체는 또한 뮤어라인 대용물 항-IL1RAP 항체로 표시된다. mCAN10은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ에 의한 시그널링을 차단할 수 있다. 따라서 mCAN10은 유사한 기능적 특성을 가진 마우스 IL1RAP에 대한 교차-반응성을 결할 수 있는 항-인간 IL1RAP 항체에 대한 대용물로서 뮤어라인 질환 모델에서 IL1RAP 차단의 치료 효능을 평가하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "48D2"는 항체가 다른 종으로부터의 IL1RAP에도 결합할 수 있음에도 불구하고 인간 IL1RAP에 대한 항체를 지칭한다. 예를 들어, 실시예 10으로부터 48D2가 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 피그로부터의 IL1RAP에 대해 교차 반응성임을 이해할 것이다. 실시예 9 및 실시예 10으로부터 이해되는 바와 같이, 용어 "48D2"는 실시예 9에 기재된 바와 같이 수득되고 실시예 10에서 특성화된 키메라 항체("ch48D2"로도 지칭됨)를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "h48D2"는 실시예 11에서 생성된 바와 같이 인간화되고 실시예 12에서 추가로 특성화된 항체 48D2를 지칭한다. 실시예 12에서 기술된 바와 같이, h48D2의 여러 변이체가 얻어졌다(예를 들어 표 8 참조). 실시예 13에 기술된 바와 같이 h48D2의 몇 가지 추가 변이체가 탈-면역화에 의해 얻어졌다.
"발명의 항체 또는 항원-결합 단편"은 항체 또는 그의 단편이 폴리펩티드이기 때문에, "발명의 폴리펩티드" 또는 "항체 폴리펩티드 또는 그의 항원-결합 단편"으로 언급될 수 있음이 이해될 것이다.
발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 IL1RAP에 대한 특이성을 갖는다. "특이성"은 항체 또는 항원-결합 단편이 생체내에서, 즉 IL1RAP가 인체 내에 존재하는 생리학적 조건 하에서 IL1RAP에 결합할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 생체내에서 임의의 다른 단백질에 결합하지 않는다. 대안적으로, 이는 항체 또는 항원-결합 단편이 생체외 또는 시험관내에서 IL1RAP에 결합할 수 있음을 의미한다. 이러한 결합 특이성은 IL1RAP를 발현하는 형질감염된 세포를 사용하는 ELISA, 면역조직화학, 면역침강법, 웨스턴 블롯 및 유세포분석과 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 유리하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 IL1RAP에 선택적으로 결합할 수 있으며, 즉 그것은 임의의 다른 단백질보다 IL1RAP에 적어도 10배 더 강력하게 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IL1RAP에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-인간 IL1RAP에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이노몰거스 원숭이로부터의 IL1RAP에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 피그로부터의 IL1RAP에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포의 표면 상에 발현되는 IL1RAP에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 세포외 도메인 상의 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 가용성 IL1RAP에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 도메인 2에 결합한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 아미노산 135 내지 234에서 또는 그 내에서 IL1RAP에 결합한다.
따라서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IL1RAP의 도메인 2에/내(Wang 등, 2010, Nature Immunology, 11:905-912를 참조하며, 그 개시내용은 본 명세서에 포함됨), 즉 IL1RAP의 아미노산 135 내지 234 내(UniProtKB/Swiss-Prot 내의 수탁 번호 Q9NPH3 참조) 위치한 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편이 IL1RAP의 아미노산 135 내지 154, 155 내지 174, 175 내지 194, 195 내지 214 내에 또는 아미노산 215 내지 234 사이, 또는 아미노산 174 내지 191 사이에 위치될 수 있는 에피토프. 그러나, 에피토프는 비-선형일 수 있음을 이해할 것이다.
추가 실시형태에서, 상기 논의된 바와 같이, 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 어피바디, 테트라넥틴(CTLD), 애드넥틴(모노바디), 안티칼린, DARPin(안키린), 아비머, iMab, 마이크로바디, 펩티드 앱타머, 쿠니츠 도메인 및 아필린을 포함하거나 이로 구성된 군으로부터 선택된 항체 모방체를 포함하거나 이로 구성된다.
용어 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 실질적으로 온전한 항체 뿐만 아니라 항체의 단편 및 유도체를 포함한다. 온전한 항체는 가변 경쇄 영역, 가변 중쇄 영역, 불변 경쇄 영역 및 불변 중쇄 영역을 포함하는 항체로 간주될 수 있다. 용어는 추가로 키메라 항체, 인간화된 항체, 단리된 인간 항체, 단일 사슬 항체, 이중특이성 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종이량체, 및 그의 항원-결합 단편 및 유도체를 포함한다. 적합한 항원-결합 단편 및 유도체는 Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예를 들어 VH 및 VL 도메인) 및 도메인 항체(단일 및 이중 포맷을 포함하는 dAb[즉, dAb-링커-dAb])을 포함하지만 반드시 이에 제한되지는 않는다. 전체 항체가 아닌 항체 단편을 사용하는 것의 잠재적 이점은 여러 가지이다. 단편의 크기가 작을수록 고형 조직의 더 나은 침투와 같은 개선된 약리학적 특성을 초래할 수 있다. 더욱이, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편과 같은 항원-결합 단편은 대장균에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있으므로, 상기 단편의 대량의 생산이 용이하다.
어구 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 또한 항체 모방체(예를 들어, 높은 정도의 안정성을 갖음에도 특정 위치에서 가변성을 도입할 수 있는 비-항체 스캐폴드 구조)를 포괄하도록 의도된다. 생화학 분야의 당업자는 Gebauer & Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-255(이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨)에서 논의된 바와 같이 많은 그러한 분자에 익숙할 것이다. 예시적인 항체 모방체는 다음을 포함한다: 아피바디(트리넥틴으로도 불림; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLD(테트라넥틴으로도 불림; Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30); 애드넥틴(모노바디으로도 불림; Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); 안티칼린(Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPin(안키린; Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); 아비머(Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); 마이크로바디(FEBS J, (2007), 274, 86-95); 펩티드 앱타머(Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); 쿠니츠 도메인(J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); 아필린(Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522); 아피머(Avacta Life Sciences, 영국 웨더비 소재).
또한 키메라 T 세포 수용체(키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체 및 키메라 항원 수용체 또는 CAR로도 알려짐)가 발명의 범주 내에 포함된다(Pule 등, 2003, Cytotherapy 5(3):211-26을 참조하며, 그 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 이들은 임의의 특이성을 면역 이펙터 세포 상에 이식하는 조작된 수용체이다. 전형적으로, CAR은 레트로바이러스 벡터에 의해 촉진되는 그의 코딩 서열의 전달로; 단일클론 항체의 특이성을 T 세포 상에 이식하는데 사용된다. 이러한 분자의 가장 일반적인 형태는 CD3-제타 막횡단 및 엔도도메인에 융합된 단일클론 항체로부터 유도된 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 융합체이다. T 세포가 이 융합 분자를 발현할 때, 그들은 전달된 단일클론 항체 특이성을 발현하는 표적 세포를 인식하고 사멸한다.
당업자는 발명이 또한 현재 또는 미래에 존재하든, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 적합한 중합체(아래 참조)의 공유 부착에 의해 변형된, 항체 및 이의 항원-결합 단편의 변형된 버전을 포괄함을 추가로 이해할 것이다.
항체 및 항체 단편을 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체는 항체 분자의 생체내 생성의 유도, 면역글로불린 라이브러리의 스크리닝(Orlandi. 등, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter 등, 1991, Nature 349:293-299, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨) 또는 배양 중인 세포주에 의한 단일클론 항체 분자의 생성을 이용하는 여러 방법 중 어느 하나를 통해 생성될 수 있다. 이들은 하이브리도마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법, 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)-하이브리도마 기법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Kohler 등, 1975. Nature 256:4950497; Kozbor 등, 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote 등, 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole 등, 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
단일클론 항체의 생산에 적합한 방법은 또한 "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola(CRC Press, 1988, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨) 및 "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell(CRC Press, 1982, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
마찬가지로, 항체 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 획득될 수 있다(예를 들어, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York을 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 단편은 항체의 단백질분해 가수분해에 의해 또는 대장균이나 포유동물 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포 배양 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서 단편을 인코딩하는 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 단리에 의해 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 표준 20개 유전적으로-인코딩된 아미노산 및 'D' 형태(천연 'L' 형태와 비교됨), 오메가-아미노산 및 기타 자연으로-발생하는 아미노산, 비통상적인 아미노산(예를 들어, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산 등) 및 화학적으로 유도된 아미노산(아래 참조)에서의 그의 상응하는 입체이성질체를 포함한다.
"알라닌" 또는 "Ala" 또는 "A"와 같이 아미노산이 구체적으로 열거되는 경우, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 용어는 L-알라닌 및 D-알라닌 둘 모두를 지칭한다. 원하는 기능적 특성이 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 유지되는 한, 다른 비통상적인 아미노산이 또한 본 발명의 폴리펩티드(항체 또는 이의 항원-결합 단편)에 적합한 성분일 수 있다. 도시된 아미노산 서열에 대해, 각각의 인코딩된 아미노산 잔기는 적절한 경우 통상적인 아미노산의 관용명에 상응하는 단일 문자 지정에 의해 표시된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 L-아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
인간 요법의 경우, 인간 또는 인간화된 항체가 바람직하게 사용됨을 당업자는 인지할 것이다. 비-인간 항체의 인간화된 형태(예를 들어, 실시예 9 및 10에 기술된 바와 같은 토끼 항체)는 유전적으로 조작된 키메라 항체 또는 바람직하게는 비-인간 항체로부터 유래된 최소-부분을 갖는 항체 단편이다. 인간화된 항체는 인간 항체(수용체 항체)의 상보적 결정 영역이 원하는 기능성을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 상보적 결정 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 항체를 포함한다. 일부 경우에, 인간 항체의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용체 항체에서도, 이입된 상보성 결정 영역 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 상보성 결정 영역은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 관련 인간 컨센서스 서열의 것에 상응한다. 인간화된 항체는 최적으로 또한 항체 불변 영역, 예컨대 전형적으로 인간 항체로부터 유도된 Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다. 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 인간화된 항체는 마우스 IL1RAP에 대한 교차-반응성을 결할 수 있다. 이와 같이, 인간화된 항체와 유사한 기능적 특성을 나타내는 적합한 대리물(예를 들어 mCAN10)은 뮤어라인 질환 모델에서 사용될 수 있으며, 여기서 대리물 결과는 인간화된 항체의 기능을 반영하는 것으로 해석될 수 있다.
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그 안으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 종종 이입된 잔기로 언급되는 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 전형적으로 이입된 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 인간 상보성 결정 영역을 상응하는 설치류 상보성 결정 영역으로 대체함에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화된 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 것이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 상보성 결정 영역 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체에서 유사 부위로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 항체일 수 있다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 식별될 수 있다.
예를 들어, 인간화에 의한 항체의 최적화(예를 들어, Jones 등, 1986, Nature 321:522-525; Reichmann 등, 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen 등, 1988, Science 239:1534-15361; US 4,816,567을 참조하며, 그 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨) 및/또는 예를 들어 Jones 등 (Methods Mol Biol. 2009;525:405-23) 또는 실시예 11 및 13에서 기술된 탈-면역화는 미세-조정된 특성을 갖는 항체 변이체의 생성을 유도한다.
CDR
본 발명의 항체는 그의 특징적인 상보성-결정 영역(CDR) 서열에 의해 정의된다. 항체의 CDR 서열을 정의하기 위한 몇 가지 접근법이 있다. 본 발명의 항체의 CDR은 3개의 서로 다른 잘-알려진 접근법(3개의 CDR-정의 범주를 초래함): 1) Kabat에 따른 정의, 2) IMGT에 따른 정의 또는 3) IMGT와 Kabat의 조합에 따른 정의를 사용하여 정의되었다.
각 CDR-정의 범주(각각 Kabat, IMGT 또는 IMGT와 Kabat의 조합) 내에서 CDR 서열은 키메라 항체 48D2 및 이의 모든 최적화된 항체 변이체, 예컨대 인간화된 항체 변이체 또는 인간화된/탈-면역화된 항체 변이체("서열" 섹션에서 각 서열에 표시된 것 참조)에 대해 동일하다는 것에 유의하는 것이 중요하다.
당업자는 6개 CDR의 세트(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)가 i) IMGT 또는 ii) Kabat 또는 iii) Kabat와 IMGT의 조합에 따라 정의될 수 있음을 이해할 것이다.
더욱이, 당업자는 발명의 항체의 CDR을 당업계에 공지된 다른 접근법, 예를 들어 Chothia(Al-Lazikani 등, (1997) JMB 273,927-948), Martin (Enhanced Chothia), Gelfand 또는 Honneger에 따른 CDR의 정의에 의해 정의할 수 있음을 이해할 것이다. AbM 정의(Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된 Kabat 정의와 Chothia 정의의 조합) 또는 접촉 정의(결정 구조의 분석에 기초함)와 같은 추가 접근법이 존재하고 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1987 and 1991, NIH, Bethesda, Md.), Lefranc 등 (IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev Comp Immunol. 2005;29(3):185-203) 및 Dondelinger 등 (Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-Binding Surface/Residue Definition, Front. Immunol., 16 October 2018) 참조.
당업자는 본 명세서에 제시된 바와 같은 IMGT 및 Kabat CDR이 제공될 때 공지된 정보를 사용하여 다른 CDR 명명 규칙 또는 접근법(예를 들어, Chothia)을 나열할 수 있다. 따라서, 모든 CDR 명명 규칙 또는 접근법이 포괄된다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, IMGT 및 Kabat의 넘버링 시스템은 약간 상이한 잔기를 CDR로 식별하였다. 특정 경우에, IMGT 또는 Kabat와 같은 하나의 넘버링 시스템에 따라 CDR을 정의하는 것이 유리할 수 있다. 종종, 이들 CDR 서열은 짧고(예를 들어, 넘버링 시스템을 조합한 접근법보다 짧음), 따라서 결합에 중요한 핵심 서열을 제공한다. 다른 경우에, 예를 들어 IMGT 및 Kabat CDR 서열의 조합을 사용하는 것이 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
다음을 포함하는 경쇄 가변 영역
a) ESISTA(서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1; KAS의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3; 또는
b) QASESISTALA(서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1; KASTLPS(서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3; 또는
c) QASESISTALA(서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1; KASTLPS(서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3
및/또는
다음을 포함하는 중쇄 가변 영역
d) GPSLSHFD(서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1; ISPGVST(서열번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3; 또는
e) HFDIT(서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1; TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및 GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3; 또는
f) GPSLSHFDIT(서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1; TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3.
항체 48D2의 상이하게 정의된 CDR 서열의 세트 사이의 관계는 다음과 같이 기술될 수 있다:
- IMGT 넘버링 시스템을 사용하여 식별된 굵게 강조표시된 CDR 잔기,
- Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 식별된 밑줄로 강조표시된 CDR 잔기
- IMGT와 Kabat 넘버링 시스템의 조합(굵은 글씨와 밑줄쳐진 서열의 조합)으로 정의된 CDR 잔기
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
QAS
ESISTA
LA
(각각 서열번호: 1, 서열번호: 7, 서열번호: 13)
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KAS
TLPS
(각각 서열번호: 8, 서열번호: 14)
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
(각각 서열번호: 3, 서열번호: 9, 서열번호: 15)
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
GPSLS
HFD
IT
(각각 서열번호: 4, 서열번호: 10, 서열번호: 16)
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
T
ISPGVST
YYASWAKS
(각각 서열번호: 5, 서열번호: 11, 서열번호: 17)
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
AR
GGVGSSWKAFDL
(각각 서열번호: 6, 서열번호: 12, 서열번호: 18)
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR 서열은 IMGT에 따라 정의된다:
서열번호: 1
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
ESISTA
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KAS
서열번호: 3
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
서열번호: 4
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
GPSLSHFD
서열번호: 5
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
ISPGVST
서열번호: 6
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR 서열은 Kabat에 따라 정의된다:
서열번호: 7
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
QASESISTALA
서열번호: 8
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KASTLPS
서열번호: 9
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
서열번호: 10
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
HFDIT
서열번호: 11
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
서열번호: 12
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 CDR 서열은 IMGT 및 Kabat의 조합에 따라 정의된다:
서열번호: 13
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
QASESISTALA
서열번호: 14
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KASTLPS
서열번호: 15
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
서열번호: 16
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
GPSLSHFDIT
서열번호: 17
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
서열번호: 18
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
그러나, 당업자는 IL1RAP에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 특이성의 손실 없이 CDR 서열 내의 낮은 수준의 돌연변이(전형적으로 단지 1개 또는 2개의 아미노산)가 용인될 수 있음을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같은 CDR(서열번호 1 내지 18로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성됨)을 포함하며, 여기서 CDR의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며, 조건부로 예를 들어, 1개 아미노산과 같이 2개 이하의 아미노산이 그렇게 변경되었다.
경쇄 가변 영역
실시예 9에 상세히 기술된 바와 같이, 토끼를 인간 및 뮤어라인 IL1RAP로 면역화하였다. 이어서, 생성된 항체를 IL1RAP에 대한 결합 및 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링을 억제하는 능력과 같은 원하는 특성에 대해 분석하였다. 48D2는 이들 특징과 관련하여 우수한 특성을 가진 항체로 식별되었고 이후 임상적 및 치료적 적용을 위해 항체를 개선하기 위한 목적으로 변형되고 최적화되었다. 이 최적화 절차는 상이한 아미노산 서열을 갖는 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 담지하는 항체 변이체를 초래하였다. 그러나, CDR은 모든 항체 변이체에 대해 동일하다. 즉, 각각의 CDR-정의 카테고리 (i) Kabat, ii) IMGT 또는 iii) IMGT와 Kabat의 조합) 내에서, CDR 서열(각각 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3)은 키메라 항체 48D2 및 이의 모든 최적화된 항체 변이체에 대해 동일하다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고;
KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고/되거나;
QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다
a) ESISTA(서열번호: 1)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1; KAS의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3;
b) QASESISTALA(서열번호: 7)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1; KASTLPS(서열번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3; 또는
c) QASESISTALA(서열번호: 13)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1; KASTLPS(서열번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 19의 아미노산 서열; 또는 서열번호: 19에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이 경쇄 가변 영역은, 예를 들어, 실시예 9 및 10에 기술된 키메라(비-인간화된, 비-최적화된) 48D2 항체의 일부이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
또는 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이들 경쇄 가변 영역은, 예를 들어, 실시예 11 및 12에 기술된 인간화된 h48D2 항체 변이체의 일부이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 31의 아미노산 서열;
또는 서열번호: 31에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이 경쇄 가변 영역은, 예를 들어, 실시예 13 및 14에 기재된 인간화된 및 탈-면역화된 48D2 항체 변이체의 일부이다.
퍼센트 동일성(또는 서열 동일성)은, 예를 들어, 글로벌 정렬 옵션, 스코어링 매트릭스 BLOSUM62, 오프닝 갭 페널티-14, 연장 갭 페널티-4를 매개변수로 사용하는 Expasy 시설 사이트(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)에서의 LALIGN 프로그램에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 항체의 일부와 같은 2개 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 적절한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 위스콘신 대학 유전자 컴퓨팅 그룹의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고, 퍼센트 동일성은 그 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩티드에 관하여 계산된다는 것이 인지될 것이다.
정렬은 대안적으로 Clustal W 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 사용되는 매개변수는 다음과 같을 수 있다:
- 빠른 쌍-형 정렬 매개변수: K-튜플(단어) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 페널티; 3, 상단 대각선의 수; 5. 채점 방법: x 퍼센트.
- 다중 정렬 매개변수: 갭 오픈 페널티; 10, 갭 확장 페널티; 0.05.
- 채점 매트릭스: BLOSUM.
대안적으로, BESTFIT 프로그램을 사용하여 로컬 서열 정렬을 결정할 수 있다.
당업자는, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 최적화하기 위해 상기 기재된 경쇄 가변 영역에 대한 추가 변경을 고려할 것이다. 예를 들어, 당업자는 인간화 및 탈-면역화 절차 동안 행해지는 것으로 프레임워크 영역 내의 아미노산, 즉 에피토프 결합 CDR 영역 외부의 아미노산을 변경하여, CDR 영역을 변경하지 않는 것을 고려할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며 단, 4개 아미노산과 같이 5개 이하의 아미노산, 2개 아미노산과 같이 3개 이하의 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경된다.
중쇄 가변 영역
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고;
ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고; 그리고
ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
a) GPSLSHFD(서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1; ISPGVST(서열번호: 5)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3;
b) HFDIT(서열번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1; TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및 GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3; 또는
c) GPSLSHFDIT(서열번호: 16)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1; TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 20의 아미노산 서열;
또는 서열번호: 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
이 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 실시예 9 및 10에 기술된 키메라(비-인간화된, 비-최적화된) 48D2 항체의 일부이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
또는 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29 또는 서열번호: 30에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
이들 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 실시예 11 및 12에 기술된 인간화된 h48D2 항체 변이체의 일부이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 32, 서열번호: 33 및 서열번호: 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
또는 서열번호: 32, 서열번호: 33 또는 서열번호: 34에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
이들 중쇄 가변 영역은, 예를 들어, 실시예 13 및 14에 기재된 인간화된 및 탈-면역화된 48D2 항체 변이체의 일부이다.
당업자는, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편을 추가로 최적화하기 위해 상기 기재된 중쇄 가변 영역에 대한 추가 변경을 고려할 것이다. 예를 들어, 당업자는 인간화된 및 탈-면역화된 절차 동안 행해지는 바와 같이 프레임워크 영역 내의 아미노산, 즉 에피토프 결합 CDR 영역 외부의 아미노산을 변경하여 CDR 영역을 변경하지 않는 것을 고려할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며 단, 4개 아미노산과 같이 5개 이하의 아미노산, 2개 아미노산과 같이 3개 이하의 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경된다.
가변 경쇄와 가변 중쇄의 조합
당업자는 경쇄 가변 영역의 임의의 상기 기술된 변이체가 중쇄 가변 영역의 임의의 상기 기술된 변이체와 조합될 수 있음을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 19의 아미노산 서열 및 서열번호: 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역, 또는 서열번호: 19 또는 서열번호: 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
이 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합은, 예를 들어, 실시예 9 및 10에 기재된 키메라(비-인간화된, 비-최적화된) 48D2 항체의 일부이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
b) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
c) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
d) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
e) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
f) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
g) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
h) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
i) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
j) 서열번호: 22의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
k) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
l) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
m) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
n) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
o) 서열번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
p) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
q) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
r) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
s) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
t) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
u) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
v) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
w) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
x) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역; 또는
y) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
또는 서열번호: 21 내지 서열번호: 30 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
이들 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합은, 예를 들어, 실시예 11 및 12에 기술된 인간화된 h48D2 항체 변이체의 일부이다.
다음 표는 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 예시적인 조합을 묘사하는 대안적인 방법이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
a) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
b) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
c) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
d) 서열번호: 24의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
e) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
f) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 32의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
g) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
h) 서열번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
i) 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
j) 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
k) 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
l) 서열번호: 31의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역
또는 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 31, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33 또는 서열번호: 34에 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
이들 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 조합은, 예를 들어, 실시예 13 및 14에 기재된 인간화된 및/또는 탈-면역화된 h48D2 항체 변이체의 일부이다.
다음 표는 인간화된 및/또는 인간화된 및 탈-면역화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 예시적인 조합을 묘사하는 대안적 방식이다:
상기-정의된 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역 및 이들의 조합이 추가로 경쇄/중쇄 불변 영역 또는 이들의 일부와 조합될 수 있다(하기 참조)는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며 단, 4개 아미노산과 같이 5개 이하의 아미노산, 2개 아미노산과 같이 3개 이하의 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경된다.
불변 영역 및 Fc 부분
당업자는 당업계에 공지된 임의의 가벼운 불변 영역이 가벼운 가변 영역의 임의의 상기 기술된 변이체와 조합될 수 있고, 당업계에 공지된 임의의 무거운 불변 영역이 무거운 가변 영역의 임의의 상기 기술된 변이체와 조합될 수 있어 전체 항체를 형성할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 카파 또는 람다 경쇄의 것인 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 카파 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 람다 경쇄를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 35의 아미노산 서열,
또는 서열번호: 35에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 α, δ, γ, ε 및 μ로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgA, IgD, IgG, IgE 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택된 면역글로불린 동형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 면역글로불린 동형의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 항체이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 면역글로불린 서브클래스의 것인 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 항체이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG2 항체이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG3 항체이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG4 항체이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 36 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열,
또는 서열번호: 36 또는 서열번호: 2에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 불변 영역을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시형태에서 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역을 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 상기 언급된 경쇄 불변 영역 및/또는 상기 언급한 중쇄 불변 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산에 대해 변경되며 단, 4개 아미노산과 같이 5개 이하의 아미노산, 2개 아미노산과 같이 3개 이하의 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG 중쇄(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄)의 CH1, CH2 및/또는 CH3 영역을 포함한다. 따라서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 중쇄로부터의 불변 영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 각각 상기-정의된 무거운 및 가벼운 가변 영역 중 임의의 것과 조합된 CH1 및 CL 불변 영역을 포함하는 Fab 단편일 수 있다.
마찬가지로, 발명의 상기-정의된 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 카파 또는 람다 경쇄로부터의 CL 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하거나 이로 구성된다
- 상기 언급된 경쇄 가변 영역 중 임의의 하나; 및/또는
- 상기 언급된 중쇄 가변 영역 중 임의의 하나; 및/또는
- 상기 언급된 경쇄 불변 영역 중 임의의 하나; 및/또는
- 상기 언급된 중쇄 불변 영역 중 임의의 하나.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함한다:
- 서열번호: 19, 21, 22, 23, 24, 25 및 31의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역; 및/또는
- 서열번호: 20, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33 및 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역; 및/또는
- 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 불변 영역; 및/또는
- 서열번호: 36 또는 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 불변 영역.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함한다.
Fc 영역은 Fc 도메인으로도 지칭될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 자연적으로 발생하는에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-자연적으로 발생 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 변형된, 예를 들어 돌연변이된 IgG 불변 영역을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함하며 여기서 Fc 영역은 표 1에서 식별된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
Fc 영역은 자연적으로 발생할 수 있거나(예를 들어, 내인성으로 생산된 항체의 일부) 또는 인공적일 수 있다(예를 들어, 자연적으로-발생하는 Fc 영역에 비해 하나 이상의 점 돌연변이를 포함함).
당업계에 잘 기록된 바와 같이, 항체의 Fc 영역은 그 혈청 반감기 및 이펙터 기능, 예컨대 보체-의존성 세포독성(CDC), 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 및 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP)을 매개한다.
치료적 단일클론 항체 또는 Fc 융합 단백질의 Fc 영역을 조작하면 그의 필요한 약리 활성에 더 적합한 분자를 생성할 수 있다(Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20(6):685-91, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
(a)
증가된 반감기를 위해 조작된 Fc 영역
치료적 항체의 효능을 개선시키기 위한 한 가지 접근법은 그 혈청 지속성을 증가시켜, 순환하는 수준을 높이고 투여 빈도를 줄이고 용량을 감소시키는 것이다.
IgG의 반감기는 신생아 수용체 FcRn에 대한 그 pH-의존적 결합에 따라 달라진다. 내피 세포의 표면에 발현되는 FcRn은 pH-의존적 방식으로 IgG와 결합하여 분해로부터 보호한다.
pH 7.4가 아닌 pH 6.0에서 FcRn에 선택적으로 결합하는 일부 항체는 다양한 동물 모델에서 더 높은 반감기를 나타낸다.
CH2와 CH3 도메인 사이의 경계면에 위치된 여러 돌연변이, 예컨대 T250Q/M428L(Hinton 등, 2004, J Biol Chem. 279(8):6213-6, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨) 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F(Vaccaro 등, 2005, Nat. Biotechnol. 23(10):1283-8, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨)는 FcRn에 대한 결합 친화도 및 생체내 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 나타났다.
(b)
변경된 이펙터 기능을 위해 조작된 Fc 영역
치료적 항체 또는 Fc 융합 단백질 적용에 따라 이펙터 기능(예컨대 ADCC)을 감소시키거나 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
세포-표면 분자, 특히 면역 세포에 대한 것을 표적화하는 항체의 경우 특정 임상 적응증에 대해 이펙터 기능을 무효화하는 것이 요구될 수 있다.
반대로, 종양학 용도(예컨대 백혈병 및 고형 종양의 치료; 아래 참조)를 위해 의도된 항체의 경우 이펙터 기능을 증가시키는 것은 치료적 활성을 개선할 수 있다.
4가지 인간 IgG 동형은 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제성 FcγRIIb 수용체 및 보체의 제1 성분(C1q)에 서로 다른 친화도로 결합하여, 매우 상이한 이펙터 기능을 생성한다(Bruhns 등, 2009, Blood 113(16):3716-25, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
FcγR 또는 C1q에 대한 IgG의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치된 잔기에 따라 달라진다. CH2 도메인의 두 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하고 IgG2 및 IgG4에서 고유한 서열을 가지고 있다. 위치 233-236에서 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331에서 IgG4 잔기의 인간 IgG1으로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 나타났다(Armour 등, 1999, Eur J Immunol. 29(8):2613-24; Shields 등, 2001, J Biol Chem. 276(9):6591-604, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 'LALA' 돌연변이, L234A/LL235A는 이펙터 기능 침묵 Fc 영역의 생성을 위해 여러 치료적 IgG1 항체에 도입되었다, 예를 들어 Xu 등, 2000, Cell. Immuno. 200: 16-26 참조. 더욱이, Idusogie 등은 K322를 포함하는 상이한 위치에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 상당하게 감소시켰다는 것을 입증하였다(Idusogie 등, 2000, J Immunol. 164(8):4178-84, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 유사하게, 뮤어라인 IgG2A의 CH2 도메인에서의 돌연변이는 FcγRI 및 C1q에 대한 결합을 감소시키는 것으로 나타났다(Steurer. 등, 1995. J Immunol. 155(3):1165-74, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
수많은 돌연변이가 인간 IgG1의 CH2 도메인에서 이루어졌고 ADCC 및 CDC에 대한 그의 효과가 시험관내에서 테스트되었다(상기에서 인용된 참고문헌 참조). 현저히, 위치 333에서의 알라닌 치환은 ADCC 및 CDC 둘 모두를 증가시키는 것으로 보고되었다(Shields 등, 2001, supra; Steurer 등, 1995, supra). Lazar 등은 FcγRIIIa에 대한 친화도가 더 높고 FcγRIIb에 대한 친화도가 더 낮아 향상된 ADCC를 초래하는 삼중 돌연변이(S239D/I332E/A330L)를 기술하였다(Lazar 등, 2006, PNAS 103(11):4005-4010, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 동일한 돌연변이를 사용하여 증가된 ADCC를 갖는 항체를 생성하였다(Ryan 등, 2007, Mol. Cancer Ther. 6:3009-3018, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). Richardset 등은 대식세포에 의한 표적 세포의 향상된 식균작용을 매개하는 개선된 FcγRIIIa 친화도 및 FcγRIIa/FcγRIIb 비율을 갖는 약간 상이한 삼중 돌연변이(S239D/I332E/G236A)를 연구하였다(Richards 등, 2008. Mol Cancer Ther. 7(8):2517- 27, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
그 이펙터 기능의 결여에 기인하여, IgG4 항체는 세포 고갈 없이 수용체 차단(즉, IL-1 시그널링의 억제)을 위한 바람직한 IgG 서브클래스를 나타낸다. IgG4 분자는 Fab-arm 교환이라고 하는 동적 과정에서 절반-분자를 교환할 수 있다. 이 현상은 치료적 항체와 내인성 IgG4 사이에서 생체내에서 또한 발생할 수 있다.
S228P 돌연변이는 이 재조합 과정이 거의 예측가능하지 않은 치료적 IgG4 항체의 설계를 허용하는 것을 방지하는 것으로 나타났다(Labrijn 등, 2009, Nat Biotechnol. 27(8):767-71, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
조작된 Fc 영역의 예는 하기 표 1에 나타나 있다.
표 1: 조작된 Fc 영역의 예
*Fc 아미노산 돌연변이의 위치는 EU 넘버링 체계를 사용하여 정의되며(Edelman 등, 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63:78-85 참조), 이는 서열번호: 36 및 2에서 실제 넘버링과 다를 수 있으며, 아래 돌연변이의 넘버링에 대한 추가 설명을 참조한다.
표 1에 대한 참고문헌
1. Hinton 등 2004 J. Biol. Chem. 279(8):6213-6)
2. Vaccaro 등 2005 Nat Biotechnol. 23(10):1283-8)
3. Zalevsky 등 2010 Nat. Biotechnology 28(2):157-159
4. Armour KL. 등, 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24
5. Shields RL. 등, 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604
6. Masuda 등 2007, Mol Immunol. 44(12):3122-31
7. Bushfield 등 2014, Leukemia 28(11):2213-21
8. Okazaki 등 2004, J Mol Biol. ;336(5):1239-49
9. Idusogie 등, 2000. J Immunol. 164(8):4178-84
10.
Datta-Mannan A. 등, 2007. Drug Metab. Dispos. 35: 86 - 94
11. Steurer W. 등, 1995. J Immunol. 155(3):1165-74
12. Richards 등 2008 Mol Cancer There. 7(8):2517-27
13. US 7,960,512 B2
14. EP 2 213 683
15. Labrijn AF. 등, 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함하며 여기서 Fc 영역은 EU 인덱스에 의해 정의된 바와 같은 L234A, L235A, P329G, G237A, P238S, H269A, A330S 및 P331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
이들 돌연변이는 항체의 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다.
EU 인덱스는 당업계에서 통상적으로 사용된다(일반적으로, Kabat 등, 1991 참조).
당업자는 본 명세서에 기술된 Fc 돌연변이의 정확한 위치가 발명의 항체에서 상이할 수 있음을 인지할 것이다. 이는 가변 영역에서 종 차이에 기인하여 키메라 항체(및 그로부터의 인간화된 또는 인간화된/탈-면역화된 항체)에서 종 변이에 기인한다. 가변 중쇄 영역에서 다양한 길이의 영역은 EU 인덱스에 있는 것과 비교하여 아미노산 위치의 이동을 초래한다. 그러나, Fc 부분에서 아미노산의 상대적 위치는 보존된다.
예를 들어, LALA 돌연변이는 EU 인덱스에 의해 위치 L234A, L235A에 있는 것으로 정의된다.
본 발명의 예시적인 항체는, 예를 들어, 다음의 가변 중쇄 영역
서열번호: 20
중쇄 가변 영역(비-인간화, 탈-면역화됨)
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
및, 예를 들어, 다음의 불변 중쇄(LALA 돌연변이를 함유하지 않음)을 포함할 수 있다
서열번호: 36
면역글로불린 IgG1 불변 중쇄(중쇄 불변 영역)(za 알로타이프)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(굵고 밑줄친 아미노산 잔기는 하기 서열번호: 2에 도시된 바와 같이 LALA-돌연변이가 도입되었을 때 변형되는 잔기를 나타낸다.)
대안적으로, 본 발명의 예시적인 항체는 예를 들어 다음의 가변 중쇄 영역
서열번호: 20
중쇄 가변 영역(비-인간화, 탈-면역화됨)
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLSHFDITWVRQAPGSGLEWIGTISPGVSTYYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCARGGVGSSWKAFDLWGPGTLVTISS
및, 예를 들어 다음의 불변 중쇄(LALA 돌연변이를 함유함)을 포함할 수 있다
서열번호: 2
'LALA' 돌연변이가 있는 면역글로불린 IgG1 불변 중쇄(중쇄 불변 영역)(za 알로타이프)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
아미노산 돌연변이(상기 서열에서 LL 에서 AA 로)는 위치 237 및 238에 있고(따라서 L237A, L238A), 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열과 관련하여 EU 인덱스에 따른 L234A, L235A-돌연변이와 동등하다.
당업자는 동일한 추론이 EU 인덱스에 의해 정의된 P329G, G237A, P238S, H269A, A330S 및 P331S와 같은 당업계에 공지된 다른 명명된 돌연변이에 적용됨을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역에 부착된 글리칸은 푸코스를 결한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 푸코스를 결하는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역에 부착된 글리칸은 푸코스가 적다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 푸코스가 적은 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 FUT8 음성 세포주에서 생산된다.
일부 실시형태에서, 항체는 FUT8 음성 세포주에서 생산된다.
α-(1,6)-푸코실트랜스퍼라제 효소를 인코딩하는 FUT8 유전자를 녹아웃시킴에 의해 FUT8 음성 세포주를 생성하는 것이 가능하며, 이는 차례로 푸코스 전이를 촉매한다. Fc 영역의 감소된 푸코실화를 포함하는 항체는 WO 00/61739 A1에 기재된 바와 같이 향상된 ADCC 활성을 나타낸다. FUT8 음성 세포주가 향상된 ADCC 활성을 가진 항체를 생산할 때 유용하다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 무손상 항체 또는 무손상 항체의 일부이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체(예를 들어, 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)로 구성된 군으로부터 선택된 항원-결합 단편을 포함하거나 이로 구성된다.
아래 "서열" 하의 섹션은 본 명세서에 개시되고 청구된 항체의 특정 예시적인 실시형태의 서열을 제공한다.
시그널링의 억제
인터루킨은 다양한 질환 및 장애와 관련이 있다.
IL-1 패밀리의 인터루킨과 같은 인터루킨은 사이토카인과 같다. 사이토카인(예를 들어 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인 및 종양 괴사 인자 포함)은 세포 시그널링에 중요하다. 즉, 사이토카인은, 예를 들어 각각의 수용체에 대한 결합을 통해 세포에 대한 시그널링 기능을 갖는다. 예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링은 본 명세서에 기술된 바와 같이 이들 사이토카인이 세포 표면 상에서 또는 세포에서 촉발하는 이벤트를 포괄한다. 세포 표면 상에서 이들 시그널링 이벤트는, 예를 들어 수용체의 확인, 공동-수용체 및 기타 분자의 특성, 세포 외부로, 세포 표면 상에, 세포막 내 또는 세포막에 또는 세포 내에서 분자의 결합에 영향을 미친다. 이들 이벤트는 생리학적이거나 병리학적일 수 있다. 이들 이벤트는 생물학적 경로일 수 있으며, 예를 들어 시그널링에 대한 반응으로서 세포에서 반응을 초래한다. 이 반응은 생리학적이거나 병리학적일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "시그널링의 억제"는 상기 시그널링 이벤트, 또는 예를 들어 수용체의 활성, 확인 또는 생성 또는 생물학적 경로 또는 분자 활성의 감소로 정의된다. 이 억제는 억제 인자(본 발명의 경우 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편)가 존재하는 상황을 억제 인자가 존재하지 않는 상황에 비교하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 억제의 정도가 시그널링 이벤트 또는 측정되어 지는 경로 또는 활성에 따라 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있음을 인지할 것이다. 이 방법은, 예를 들어, 실시예 10, 12 또는 14에 기술된 바와 같은, 예를 들어 세포 검정일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "(예를 들어) IL-1α의 시그널링 억제"와 같은 문구는 "(예를 들어) IL-1α 시그널링을 억제하는" 문구와 상호교환적으로 사용된다는 점에 유의해야 한다.
IL-1
인터루킨-1(IL-1)은 감염 및 염증에 대한 반응으로 단핵 식세포를 비롯한 다양한 세포 유형에 의해 생성될 수 있는 강력한 향-염증성 사이토카인이다. IL-1 패밀리는 IL-1α 및 IL-1β를 포함하는 7개의 작용제와 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra 또는 IL1RA)를 포함하는 3개의 자연적으로 발생하는 수용체 길항제로 구성된다(Dinarello, CA, Blood 1996, 87(6): 2095-147). 2개의 IL-1 수용체인, IL-1R 유형 I 및 IL-1R 유형 II가 식별되었다. 두 수용체 모두는 IL-1 패밀리 분자의 3가지 형태 모두와 상호작용할 수 있다. IL-1RI는 IL-1-유도된 세포 활성화를 매개하는 역할을 한다. 그러나, IL-1/IL-1RI 복합체는 그 자체로 신호를 보낼 수 없고, 그러나 제2 수용체 사슬인, IL-1R 부속 단백질(IL1RAP)과의 회합에 의존한다(Dinarello, CA, Blood 1996, 87(6): 2095- 147). IL-1RI에 대비하여, IL-1RII는 IL-1에 결합 시 세포 활성화를 유도하지 않으므로 IL-1RII는 조절 미끼 수용체로 기능하여, IL-1RI에 대한 결합에 이용가능한 IL-1에서의 순 감소를 초래한다.
IL1-시그널링에 부가하여, IL1RAP는 ST2/IL1RAP 복합체를 통한 IL33의 효과와 IL1Rrp2/IL1RAP 복합체를 통한 IL36의 효과를 매개하는데 중요하다(Garlanda 등, Immunity. 2013 Dec 12;39(6):1003 -18).
IL-1α는 또한 손상된 세포에서 방출되고 알라르민으로 작용할 수 있다. IL-1은 국소 감염 또는 염증의 부위에서 유도되고 다양한 생리학적 및 세포적 이벤트의 조절에 관여하는 강력한 향-염증성 사이토카인이다(Dinarello CA, CHEST, 2000, 118: 503-508 및 Dinarello, CA, Clin Exp Rheumatol, 2002, 20(5 Suppl 27): S1-13에 요약됨). 그것은 백혈구 및 내피 세포를 포함한 여러 세포 유형을 활성화할 수 있다. IL-1은 접착 분자, 사이토카인, 케모카인 및 기타 염증 매개체 예컨대 프로스타글란딘 E2 및 산화질소(NO)의 생성 및 발현을 촉진함에 의해 면역 반응을 유도 및 증폭한다. 결과적으로, 국소 염증이 증폭되고 지속된다. 부가하여, 염증성 매개체의 IL-1-유도된 생산은 발열, 두통, 저혈압 및 체중 감소를 초래한다. 더욱이, IL-1은 조혈 성장 인자이고 골수 이식 동안 환자에서 백혈구 및 혈소판의 최저점을 감소시키는 것으로 나타났다. IL-1은 또한 혈관 내피 성장 인자의 생산을 유도함에 의해 혈관신생을 촉진하는 것으로 나타났으며, 이에 의해 류마티스 관절에서 판누스 형성 및 혈액 공급을 촉진한다. IL-1은 류마티스 질환에서 뼈와 연골 분해를 촉진하는 것으로 나타났다. 마지막으로, IL-1은 심혈관 및 섬유성 질환에서의 염증 반응에 중요한 역할자로 연루되어 있다.
IL-33
IL-33은 일반적으로 손상되거나 괴사된 장벽 세포(내피 및 상피 세포)에 의해 방출되며, 내인성 위험 신호인 알라르민으로 작용하여 외상이나 감염 동안 조직 손상의 면역 체계에 경고한다(Liew FY, Interleukin-33 in health and disease. Nature Reviews Immunology, 16, 676-689 (2016)). IL-33은 T 헬퍼 2(Th2) 세포, 비만 세포, 유형 2 선천 림프구 세포, 호산구 및 호염구가 유형 2 사이토카인(예를 들어 IL-5, IL-13)을 생성하도록 유도한다. IL-33은 또한 내피 세포를 표적으로 하고 혈관신생을 유도하는 것으로 알려져 있다. Th2 유도 사이토카인으로서 IL-33은 예를 들어 천식, 알레르기 질환, 염증성 장 질환 및 피부염에 연루되어 있다. IL-33은 광범위한 세포를 강력하게 자극할 수 있고 그의 다발성 성질은 조직 및 대사 항상성, 감염, 염증, 암 및 중추 신경계의 질환에서 IL-33의 역할에 반영된다.
IL-36
IL-36 사이토카인 α, β, γ는 다양한 세포 유형에서, 예를 들어 각질 세포, 기관지 상피, 신경 세포, 수지상 세포 및 대식세포에서 풍부한 발현으로 발현된다. IL-36은 (피부, 폐, 및 장 같은) 장벽 조직에서 가장 활성이어서, 그의 주요 책임은 환경과 신체의 상호작용을 조절하는 것임을 시사한다. IL-36은 각질세포, 단핵구, 수지상 세포 및 CD4 T 세포와 같은 IL-36 수용체를 발현하는 표적 세포에서 NF-κB 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 부상하는 증거는 IL-36 시그널링이 선천적 및 후천적 면역 반응의 활성화에 관여한다는 것을 나타낸다(Ding L, IL-36 cytokines in autoimmunity and inflammatory disease, Oncotarget, Vol. 9, (No. 2), pp: 2895-2901 (2018)).
건선 및 아토피성 피부염과 같은 염증성 피부 질환에서의 그 중요한 역할 외에도, 부상하는 증거는 비정상적인 IL-36 활성이 또한 폐, 신장 및 내장에서 염증성 질환을 촉진한다는 것을 제시하여, 일반적인 염증성 질환에 대한 치료적 표적으로서 IL-36의 잠재력을 강조한다.
흥미롭게도, 본 명세서에 기재된 모든 사이토카인(IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β, IL-36γ)은 또한 섬유아세포 및 내피 세포와 같은 간질 세포를 표적화하는 것으로 나타났다. 결과적으로, 염증성 질환 및 장애에서 이들 사이토카인의 잘-확립된 영향과는 별도로, 이들 사이토카인은 또한 섬유성 질환 또는 장애와 관련이 있다.
발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이토카인 리간드 및/또는 수용체의 인터류킨-1(IL-1) 패밀리의 시그널링을 억제하는 능력을 갖는다. 당업자는 항체 또는 항원-결합 단편이 IL1RAP 상의 에피토프에 결합할 때 억제가 일어난다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP에 결합 시 시그널링을 억제할 수 있다.
당업자는 IL1RAP에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합이 상이한 방식으로, 예를 들어 분자 수준 또는 형태적 수준에서 IL1RAP에 영향을 미칠 수 있음을 인지할 것이다. 그러나, 당업자는 IL1RAP에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합이 IL1RAP에 어떻게 영향을 미치는지는 오늘날 완전히 알려지지 않았을 수 있음을 이해할 것이다.
하나의 가능성은 IL1RAP에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합이 각각 IL-1 수용체, IL-33 수용체 및/또는 IL-36 수용체와 IL1RAP의 회합에 영향을 미칠 수 있다는 것이다. 결과적으로, 공동-수용체로 IL1RAP와, IL-1 수용체, IL-33 수용체 또는 IL-36 수용체 중 어느 하나로 구성되는 적절한 수용체 복합체가 형성되지 않을 수 있다. 결과적으로, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ와 같은 사이토카인이 그의 동족 수용체(각각, IL-1 수용체, IL-33 수용체 또는 IL-36 수용체)에 결합할 때, 이들 사이토카인의 시그널링은 억제, 차단, 본질적으로 완전 억제, 부분적으로 억제되는 것과 같이 손상될 수 있다.
당업자는 IL1RAP의 어느 하나의 에피토프에 결합하는 모든 IL1RAP 결합 항체가 각각 IL-1 수용체, IL-33 수용체 및/또는 IL-36 수용체와 IL1RAP 사이의 회합을 방해할 수 없고, 이에 의해 시그널링을 억제한다는 것을 인지할 것이다. 이러한 항체를 제공하는 것이 본 발명의 성과이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인터루킨-1(IL-1) 패밀리 사이토카인 리간드 및/또는 수용체의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이토카인 리간드 및/또는 수용체의 IL1RAP-의존성 인터류킨-1(IL-1) 패밀리의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 그의 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1β의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 그의 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-36α의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-36β의 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-36γ의 시그널링을 억제할 수 있다.
당업자는 시그널링의 억제가 다양한 정도일 수 있음을 인지할 것이다. 시그널링의 억제는 시그널링의 차단과 같이 완전하거나 본질적으로 완전할 수 있다. 시그널링의 억제는 또한 비-완전한 것과 같은, 시그널링을 감소시키는 것과 같이 부분적일 수 있다. "본질적으로 완전한"은 시그널링의 억제를 측정하는데 사용되는 방법론과 연관된 완전성을 평가하는 불확실성을 고려할 때 "완전한"으로 이해되어야 한다.
예를 들어, 시그널링은 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 부재에서 시그널링에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 억제될 수 있다.
일부 실시형태에서, 시그널링의 억제는 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 부재에서 시그널링에 비해 10 내지 100% 사이이다. 보다 바람직하게는, 시그널링의 억제는 25 내지 100% 사이이다. 훨씬 더 바람직하게는, 시그널링의 억제는 50 내지 100% 사이이다.
시그널링은 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 부재에서 시그널링에 비해 100% 억제될 수 있다.
발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 의한 IL-1, IL-33 및/또는 IL-36 시그널링의 억제의 정도는 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 실시예 10, 12 및 14에서 사용된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본질적으로 시그널링을 완전히 억제할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 시그널링을 억제하는 것은 본질적으로 시그널링의 완전한 억제이다.
바람직한 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 시그널링을 본질적으로 완전히 억제할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본질적으로 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 시그널링을 완전히 억제할 수 있다.
항체는 시그널링을 어느 정도까지 더 억제할 수 있으며, 이는 본질적으로 완전하지 않음을 의미하고 부분적으로를 의미한다. 결과적으로, 시그널링의 억제는 본질적으로 완전한 억제가 아닐 수 있어, 부분적 억제를 의미한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 부분적으로 시그널링을 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, 시그널링을 억제하는 것은 시그널링의 부분적 억제이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 시그널링을 부분적으로 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 시그널링을 부분적으로 억제할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링을 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 부재에서 시그널링에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 억제할 수 있다.
당업자는 과정, 예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링에 의존하는 질환 과정이 질환을 완화하거나 치료하기 위해 완전하고 빠르게 영향을 받아야 한다는 일부 상황에서 완전한 억제가 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 다른 상황에서, 과정, 예를 들어 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링에 의존하는 질환 과정이, 예를 들어 완전한 억제의 부작용을 피하기 위해 변형되어야 하지만 완전히 영향을 받아서는 안된다는 부분적인 억제가 바람직하다. 당업자는 생물학적 시스템이 복잡하고 다양한 알려진 또는 알려지지 않은 피드백 루프를 수반하여 과정이 완전히 억제되는지 평가하는 것을 어렵게 만들 수 있음을 추가로 인지할 것이다. 더욱이, 이 평가는 과정, 예를 들어 시그널링이 측정되는 방법의 민감도에 또한 의존한다. 당업자는 시그널링의 억제의 완전성 또는 필수적인 완전성을 평가하거나 시그널링의 부분적 억제 정도를 평가하기 위해 사용하기 위해 어떤 방법 및 컷-오프 값이 현장에서 확립되고 허용되는지 알 것이다.
하기 실시예에서 상세하게 나타내고 설명되는 바와 같이, 항체는 특정 특성을 최적화하기 위해 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 탈-면역화된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화되고 탈-면역화된다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단일클론이다.
항체의 특성
본 발명의 항체는 이를 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애에 대한 진단 및 치료적 제제로서 특히 적합하게 만드는 특성을 나타내는 것에 기반하여 다수의 항-IL1RAP 항체의 광범위한 스크리닝 후에 식별되었다.
따라서, 일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
a) 3nM 이하의 KD-값을 특징으로 하는 IL1RAP에 대한 결합 친화성(KD);
b) IL1RAP의 도메인 2에 대한 결합, 바람직하게는 도메인 2의 H2 영역에 대한 결합, 여기서 H2 영역은 서열번호: 39의 아미노산을 포함하거나 이로 구성됨;
c) 사이노몰거스 원숭이 또는 피그로부터 IL1RAP와 교차-반응성;
d) IL-1α 시그널링에 대한 억제 작용;
e) IL-1β 시그널링에 대한 억제 작용;
f) IL-33 시그널링에 대한 억제 작용;
g) IL-36α 시그널링에 대한 억제 작용;
h) IL-36β 시그널링에 대한 억제 작용;
i) IL-36γ 시그널링에 대한 억제 작용;
j) IL1RAP-발현 세포에 의한 내재화.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 하나를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 2가지를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 3가지를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 4가지를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 5가지를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 7가지를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 8가지를 나타낸다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 중 9가지를 나타낸다.
유리하게는, 일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 명명된 특성 모두를 나타낸다.
다른 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 모두를 나타낸다:
a) 3nM 이하의 KD-값을 특징으로 하는 IL1RAP에 대한 결합 친화성(KD);
b) IL1RAP의 도메인 2에 대한 결합, 바람직하게는 도메인 2의 H2 영역에 대한 결합, 여기서 H2 영역은 서열번호: 39의 아미노산을 포함하거나 이로 구성됨;
c) 사이노몰거스 원숭이 또는 피그로부터 IL1RAP와 교차-반응성;
d) IL-1α 시그널링에 대한 억제 작용;
e) IL-1β 시그널링에 대한 억제 작용;
f) IL-33 시그널링에 대한 억제 작용;
g) IL-36α 시그널링에 대한 억제 작용;
h) IL-36β 시그널링에 대한 억제 작용;
i) IL-36γ 시그널링에 대한 억제 작용;
j) IL1RAP-발현 세포에 의한 내재화.
H2 영역은 Uniprot ID Q9NPH3으로부터 IL1RAP 아미노산 서열을 기반으로 하는 아미노산 174-191에 상응한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 친화도(KD)는 3nM 이하, 예컨대 2.75nM, 예를 들어 2.5nM, 예컨대 2nM, 예를 들어 1.75nM, 예컨대 1.5nM, 예를 들어 1.25nM, 예컨대 1nM, 예를 들어 0.75nM, 예컨대 어 0.5nM 또는 예를 들어 0.5nM이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 친화도(KD)는 3000pM 이하, 예컨대 2750pM, 예를 들어 2500pM, 예컨대 2000pM, 예를 들어 1750pM, 예컨대 1500pM, 예를 들어 1250pM, 예컨대 1000pM, 예를 들어 750pM, 예컨대 700pM, 예를 들어 650pM, 예컨대 600pM, 예를 들어 550pM, 예컨대 500pM, 예를 들어 450pM, 예컨대 400pM, 예를 들어 350pM, 예컨대 300pM, 예를 들어 250pM, 예컨대 200pM, 예를 들어 150pM, 예컨대 100pM, 예를 들어 50pM이다.
당업자는 항체 또는 항원-결합 단편의 결합 친화도의 결정이 그 결합 친화도를 결정하는 방법에 의존한다는 것을 인지할 것이다.
당업자는 IL1RAP 항체가 (예를 들어 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL- 36γ의) 사이토카인 시그널링을 억제할 수 있는 것과는 별도로, 하나 이상의 추가 기능을 나타낼 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이들 기능은 항체의 불변 영역 또는 Fc 영역에 의해 전달될 수 있다. 이들 기능의 예는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포 식균작용(ADCP)이며, 이에 의해 IL1RAP-발현 종양 세포와 같은 표적 세포의 사멸을 초래한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCC를 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCC를 유도할 수 없다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCP를 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCP를 유도할 수 없다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCC 및 ADCP를 유도할 수 있다.
항체의 변형
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제제의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제제의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 추가로 포함하며, 여기서 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기, 지방산 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 PEG화된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP 단편에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 또는 검출가능한 모이어티와 같은 기능적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 킬레이터를 통해) 공유적으로 결합된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티를 포함하며, 여기서 세포독성 모이어티는 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된 세포독성 모이어티를 포함하며 여기서 방사성동위원소는 베타-이미터, 오거-이미터, 전환 전자-이미터, 알파 이미터 및 낮은 광자 에너지-이미터로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된 세포독성 모이어티를 포함하고, 여기서 방사성동위원소는 제제의 근처에서 고선량 흡광도를 생성하는 국부적으로 흡수된 에너지의 방출 패턴을 갖는다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된 세포독성 모이어티를 포함하며, 여기서 방사성동위원소는 긴-범위 베타-이미터, 예컨대 90Y, 32P, 186Re/186Re; 166Ho, 76As/77As, 153Sm; 중간-범위 베타-이미터, 예컨대 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb; 저-에너지 베타-이미터, 예컨대 45Ca, 35S 또는 14C; 변환 또는 오거-이미터, 예컨대 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 123I, 125I, 201Tl; 및 알파-이미터, 예컨대 212Bi, 213Bi, 223Ac, 및 221At로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된 세포독성 모이어티를 포함하며, 여기서 방사성동위원소는 177Lu이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 부분을 포함하며, 여기서 세포독성 부분은 세포독성 약물을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 약물을 포함하거나 이로 구성된 세포독성 모이어티를 포함하며, 여기서 세포독성 약물은 세포증식억제 약물; 항-안드로겐 약물; 코르티손 및 이의 유도체; 포스포네이트; 테스토스테론-5-α-리덕타제 억제제; 붕소 부가물; 사이토카인; 탑시가르긴 및 그 대사산물; 독소(예컨대 사포린 또는 칼리케아미신); 화학요법제(예컨대 항대사제); 또는 신생물성 장애의 치료에 유용한 임의의 기타 세포독성 약물로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 약물을 포함하거나 이로 구성된 세포독성 모이어티를 포함하며, 여기서 세포독성 약물은 활성화 요법, 예컨대 광자 활성화 요법, 중성자 활성화 요법, 중성자 유도된 오거 전자 요법, 싱크로트론 조사 요법 또는 저에너지 X-선 광자 활성화 요법에 사용하기에 적합하다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 모이어티를 포함하고, 여기서 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성동위원소형을 포함하거나 이로 구성된 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 방사성동위원소는 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I 및 201Tl로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성된 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 방사성동위원소는 89Zr이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 86Y/90Y 또는 124I/211At와 같은 한 쌍의 검출가능하고 세포독성인 방사성동위원소를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 모이어티 및 세포독성 모이어티로서 다중-모드 방식에서 동시적으로 작용할 수 있는 방사성동위원소형을 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상자성 동위원소를 포함하거나 이로 구성된 검출가능한 모이어티를 포함한다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상자성 동위원소를 포함하거나 이로 구성된 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 상자성 동위원소는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr 및 56Fe로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 검출가능한 모이어티는 SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 이미징과 같은 이미징 기술에 의해 검출가능하다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티는 연결 모이어티를 통해, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 간접적으로 조합된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티는 연결 모이어티를 통해, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 간접적으로 조합되며, 여기서 연결 모이어티는 킬레이터이다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티를 포함하며, 여기서 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티는 연결 모이어티를 통해, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 간접적으로 조합되며, 여기서 연결 모이어티는 킬레이터이고, 여기서 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 데페록사민(DFO), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)의 유도체, S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자사이클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티 또는 검출가능한 모이어티를 포함하지 않는다.
발명은 더욱이 인간 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 IL1RAP에 대한 본 명세서에 개시된 항체 48D2의 결합을 억제할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "IL1RAP에 대한 항체 48D2의 결합을 억제할 수 있는"은 또 다른 항체의 존재가 IL1RAP에 대한 48D2의 결합을 전체적으로 또는 부분적으로 억제함을 의미한다. 이러한 경쟁적 결합 억제는, 예를 들어 고정된 IL1RAP와 함께 BIAcore 칩을 사용하고 시험되어 지는 항체와 함께 및 항체 없이 48D2와 함께 인큐베이션하는 것과 같이 당업계에 잘 알려진 검정 및 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 항체 48D2를 BIAcore 칩의 표면에 고정화하고, IL1RAP 항원을 고정된 항체에 결합한 다음, 제2 항체를 동시적인 IL1RAP-결합 능력에 대해 테스트하는 쌍-형 매핑 접근법이 사용될 수 있다('BIAcore Assay Handbook', GE Healthcare Life Sciences, 29-0194-00 AA 05/2012를 참조하며, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
추가의 대안에서, 경쟁적 결합 억제는 유세포분석을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 테스트 항체가 48D2 항체가 세포 표면 항원에 결합하는 것을 억제할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 항원을 발현하는 세포를 테스트 항체와 20분 동안 사전-인큐베이션한 후 세포를 세정하고 유세포분석에 의해 검출될 수 있는 형광단에 접합된 48D2 항체로 인큐베이션할 수 있다. 테스트 항체와의 사전-인큐베이션이 유세포분석에서 48D2 항체의 검출을 감소시키는 경우, 테스트 항체는 세포 표면 항원에 대한 참조 항체의 결합을 억제한다. 테스트되어 지는 항체가 IL1RAP에 대해 높은 친화도를 나타내는 경우, 감소된 사전-인큐베이션 기간이 사용될 수 있다(또는 더욱이 사전-인큐베이션이 전혀 없음).
항체의 생산
발명의 제2 양태는 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 구성요소 폴리펩티드 사슬에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는, DNA(예를 들어, 게놈 DNA 또는 상보적 DNA) 및 mRNA 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 폴리뉴클레오티드다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오티드는 cDNA 분자이다.
폴리뉴클레오티드가 특정 숙주 세포에서 항체 또는 항원-결합 단편의 발현을 위해, 예를 들어 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다(예를 들어, Angov, 2011, Biotechnol. J. 6(6):650-659를 참조하며, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
일부 실시형태에서, 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항체 경쇄 또는 이의 가변 영역을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항체 중쇄 또는 이의 가변 영역을 인코딩한다.
발명의 제3 양태는 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
용어 "발현 벡터"는 본 명세서에서 본 발명의 폴리펩티드(항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그 발현을 위해 제공하는 부가 뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 선형 또는 환형의 DNA 분자로 정의된다. 용어 "플라스미드", "발현 벡터" 및 "벡터"는 플라스미드가 일반적으로 현재 가장 일반적으로 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 발명은 당업계에 공지된 동등한 기능을 제공하는 발현 벡터의 그러한 다른 형태를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 사용된 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 적합한 숙주에서 DNA의 발현에 영향을 미칠 수 있는 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 작제물을 지칭한다. 이러한 제어 서열은, 예를 들어, 전사를 수행하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 선택적인 작동자 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 인코딩하는 서열 및 전사와 번역의 종료를 제어하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 파지 또는 단순히 잠재적인 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주 안으로 형질전환되면, 벡터는 예를 들어 숙주 게놈에 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나, 일부 경우에 게놈 자체 안으로 통합될 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, Li 등(Construction strategies for developing expression vectors for recombinant monoclonal antibody production in CHO cells, Mol Biol Rep. 2018 Dec;45(6):2907-2912)에 기술된 바와 같이 설계된다.
발명의 제4 양태는 발명의 제2 양태에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 발명의 제3 양태에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 박테리아 세포이다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 효모 세포이다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
일부 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 인간 세포이다.
발명의 제5 양태는 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 인코딩된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서, 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드 또는 발명의 제3 양태의 벡터를 포함하는 발명의 제4 양태의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
약학적 조성물
발명의 제6 양태는 약학적 조성물에
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터, 및/또는
발명의 제4 양태의 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 여기서 조성물은 약학적으로-허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 유효량의
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터, 및/또는
발명의 제4 양태의 숙주 세포를 포함한다.
EDTA, 시트레이트, EGTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제를 포함하는 추가 화합물이 약학적 조성물에 또한 포함될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다.
약학적 조성물은 충분히 저장 안정성이 있고 인간 및 동물에 대한 투여에 적합한 당업계에 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은, 예를 들어 동결 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해 또는 초임계 입자 형성으로부터 입자 형성의 사용을 통해 동결건조될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한"은 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 IL1RAP-결합 활성의 유효성을 감소시키지 않는 비-독성 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 완충제, 담체, 희석제 또는 부형제가 당업계에 잘 알려져 있다.
용어 "완충제"는 pH를 안정화할 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충제의 예는 트리즈마, 비신, 트리신, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 약학적 제제에서 항체 또는 항원-결합 단편을 희석할 목적을 갖는 수성 또는 비-수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름) 중 하나 이상일 수 있다.
용어 "아쥬반트"는 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 첨가되는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 아쥬반트는, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 티오시아네이트, 설파이트, 하이드록사이드, 포스페이트, 카보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르타르산염 및 아세테이트의 다른 아실 조성인, 상이한 음이온을 갖는 하나 이상의 아연, 구리 또는 은 염일 수 있다. 아쥬반트는 또한 양이온성 중합체 예컨대 양이온성 셀룰로오스 에테르, 양이온성 셀룰로오스 에스테르, 탈아세틸화된 히알루론산, 키토산, 양이온성 덴드리머, 양이온성 합성 중합체 예컨대 폴리(비닐 이미다졸), 및 양이온성 폴리펩티드 예컨대 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리아르기닌 및 이들 아미노산을 함유하는 펩티드일 수 있다.
부형제는 탄수화물, 중합체, 지질 및 미네랄 중 하나 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는, 예를 들어 동결건조를 촉진하기 위해 조성물에 첨가되는 락토스, 글루코스, 수크로스, 만니톨 및 사이클로덱스트린을 포함한다. 중합체의 예는 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 그의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 다양한 가수분해 정도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈이며, 모두 상이한 분자량의 것이며, 이는 예를 들어, 점도 조절을 위해, 생체접착을 달성하기 위해, 또는 화학적 및 단백질 분해로부터 지질을 보호하기 위해 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 모노-, 디- 및 트리글리세리드, 세라마이드, 스핑고지질 및 당지질, 모두 다른 아실 사슬 길이 및 포화도, 계란 레시틴, 대두 레시틴, 경화 계란 및 대두 레시틴이며, 이는 중합체에 대한 것과 유사한 이유로 조성물에 첨가된다. 미네랄의 예는 활석, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티타늄이며, 이는 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이점을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 그의 전달에 적합한 것으로 당업계에 공지된 임의의 유형의 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 발명의 약학적 조성물은 항체 또는 항원-결합 단편이 다른 약학적으로 허용가능한 담체에 부가하여 미셀, 불용성 단일층 및 액정과 같이 응집된 형태로 존재하는 지질과 같은 양친매성 제제와 조합된 리포솜의 형태일 수 있다. 리포솜 제형에 적합한 지질은 제한 없이 모노글리세리드, 디글리세리드, 술파티드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 적합한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장하기 위해 극성 헤드기에서 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 상기 지질을 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 예를 들어 US 4,235,871에서 찾아볼 수 있으며, 그 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
발명의 약학적 조성물은 또한 생분해성 마이크로스피어의 형태일 수 있다. 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA와 PGA의 공중합체(PLGA) 또는 폴리(카프로락톤)(PCL), 및 폴리무수물과 같은 지방족 폴리에스테르는 마이크로스피어의 생산에 생분해성 중합체로 널리 사용되어 왔다. 이러한 마이크로스피어의 제조는 US 5,851,451 및 EP 0 213 303에서 찾아볼 수 있으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
추가의 실시형태에서, 발명의 약학적 조성물은 중합체 겔의 형태로 제공되며, 여기서 중합체 예컨대 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐이미다졸, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트 및 폴리비닐피롤리돈이 제제를 함유하는 용액의 증점을 위해 사용된다. 중합체는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 항체 또는 항원-결합 단편은 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름), 트래거캔스 검 및 /또는 다양한 완충제에 간단히 용해될 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 활성 항체 또는 항원-결합 단편의 작용의 강화를 위해 이온 및 정의된 pH를 포함할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 추가로, 조성물은 살균과 같은 통상적인 약학적 작업에 적용될 수 있고/있거나 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충전제 등과 같은 통상적인 아쥬반트를 함유할 수 있다.
발명에 따른 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 가능한 투여 경로는 비경구(정맥내, 피하 및 근육내), 국소, 안구, 비강, 폐, 협측, 경구, 비경구, 질 및 직장을 포함한다. 또한, 임플란트로부터 투여가 가능하다.
하나의 바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물은 비경구적으로, 예를 들어 정맥내, 뇌실내, 관절내, 동맥내, 복강내, 척수강내, 심실내, 흉골내, 두개내, 근육내 또는 피하로 투여되거나, 주입 기술에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 이들은 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장액으로 만들기에 충분한 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 멸균 수성 용액의 형태로 편리하게 사용된다. 수성 용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 한다(바람직하게는 3 내지 9의 pH). 무균 상태 하에서 적합한 비경구 제형의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약학적 기술에 의해 쉽게 달성된다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제 및 제형을 의도된 수용체의 혈액과 등장액으로 부여하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 제공될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 요하는 동결-건조(냉동건조) 상태로 보관할 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기술된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
따라서, 발명의 약학적 조성물은 특히 비경구, 예를 들어 정맥내 투여에 적합하다.
대안적으로, 약학적 조성물은 비강내로 또는 흡입에 의해(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로-메탄, 디클로로테트라플루오로-에탄, 하이드로플루오로알칸 예컨대 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3), 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스)과 같은, 적절한 추진제의 사용으로 가압된 용기, 펌프, 스프레이 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 제시의 형태로) 투여될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 복용량 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함에 의해 결정될 수 있다. 가압된 용기, 펌프, 스프레이 또는 네뷸라이저는, 예를 들어 에탄올과 용매로서 추진제의 혼합물을 사용하여, 활성 항체 또는 항원-결합 단편의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있으며, 이는 윤활제, 예를 들어 솔비탄 트리올레이트를 추가로 함유할 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들어, 젤라틴으로부터 제조됨)는 발명의 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 베이스의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
에어로졸 또는 건조 분말 제형은 바람직하게는 각각의 정량화된 용량 또는 '퍼프'가 환자에게 전달하기 위한 발명의 화합물 적어도 1mg을 함유하도록 배열된다. 에어로졸로의 전반적인 1일 용량은 환자마다 다를 것이며, 단일 용량으로 또는 보다 일반적으로는 하루에 걸쳐서 분할된 용량으로 투여될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
대안적으로, 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 좌약 또는 페서리의 형태로 투여될 수 있거나, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 가루형 분말의 형태로 국소적으로 적용될 수 있다. 발명의 화합물은 또한, 예를 들어, 피부 패치의 사용에 의하여 경피적으로 투여될 수 있다. 이들은 또한 안구 경로에 의해 투여될 수 있다.
안과용으로 사용하기 위해, 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 등장성, pH 조정된 멸균 식염수 중 미분화된 현탁액으로, 또는 바람직하게는 등장성, pH 조정된 멸균 식염수 중 용액으로서, 선택적으로 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제와 조합하여 제형화될 수 있다. 대안적으로, 바셀린과 같은 연고에 제형화될 수 있다.
피부에 국소적으로 적용하기 위해, 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어 다음 중 하나 이상과의 혼합물에 현탁되거나 용해된 활성 화합물을 함유하는 적합한 연고로서 제형화될 수 있다: 광유, 액체 바셀린, 화이트 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물. 대안적으로, 그것은 예를 들어 다음 중 하나 이상의 혼합물에 현탁 또는 용해된 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다: 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 파라핀, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물.
약학적 조성물은 약학적으로 유효한 용량으로 환자에게 투여될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "치료적으로 유효한 양" 또는 "유효량" 또는 "치료적으로 유효한"은 주어진 상태 및 투여 요법에 대한 치료적 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 이는 필요한 첨가제 및 희석제, 즉 담체 또는 투여 비히클과 연관하여 원하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리결정된 양이다. 더욱이, 이는 숙주의 활성, 기능 및 반응에서 임상적으로 현저한 결손을 감소시키고 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 의미하는 것으로 의도된다. 대안적으로, 치료적으로 유효한 양은 숙주에서 임상적으로 유의미한 상태에서 개선을 야기하기에 충분하다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 화합물의 양은 그의 비활성에 따라 달라질 수 있다. 적합한 투여량은 필요한 희석제와 연관하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 조성물의 미리결정정된 양을 함유할 수 있다. 발명의 조성물의 제조에 대한 방법 및 용도에서, 활성 성분의 치료적으로 유효한 양이 제공된다. 치료적으로 유효한 양은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증, 기타 질환 등과 같은 환자 특성에 기반하여 통상의 숙련된 의료 또는 수의사에 의해 결정될 수 있다. 약학적으로 유효한 용량의 투여는 개별 용량 단위 또는 더 작은 여러 용량 단위 형태에서 단일 투여 및 또한 특정 간격으로 세분화된 용량의 다중 투여 둘 모두에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 용량은 장기간에 걸쳐 연속 주입으로 제공될 수 있다.
발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 진단적 사용과 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 유효한 양" 또는 "유효량" 또는 "진단학적으로 유효한"은 진단을 위해, 예를 들어 생체내 이미징 목적을 위해 검출가능한 신호를 제공하는 양을 지칭한다.
항체 또는 항원-결합 단편은 사용되는 항체 또는 항원-결합 단편의 효능/독성에 의존하여 다양한 농도로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제형은 활성 항체 또는 항원-결합 단편을 0.1μM 내지 1mM, 보다 바람직하게는 1μM 내지 500μM, 500μM 내지 1mM, 300μM 내지 700μM, 1μM 내지 100μM, 100μM 내지 200μM, 200μM 내지 300μM, 300μM 내지 400μM, 400μM 내지 500μM, 500μM 내지 600μM, 600μM 내지 700μM, 800μM 내지 900μM 또는 900μM 내지 1mM의 농도로 포함할 수 있다. 전형적으로, 제형은 활성 항체 또는 항원-결합 단편을 300μM 내지 700μM의 농도로 포함한다.
전형적으로, 인간 환자에서 (치료적 모이어티가 있거나 없는) 항체 또는 항원-결합 단편의 치료적 용량은 투여당 100μg 내지 1g의 범위일 것이다(70kg의 체중을 기준으로, 예를 들어 투여 당 300μg 내지 700mg). 예를 들어, 최대 치료적 용량은 투여당 0.1 내지 10mg/kg의 범위, 예를 들어 0.1 내지 5mg/kg 또는 1 내지 5mg/kg 또는 0.1 내지 2mg/kg일 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료적 용량은 5, 20 또는 50mg/kg, 또는 이들 값으로부터 형성된 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 치료적 용량은 5 내지 50mg/kg, 5 내지 20mg/kg, 또는 20 내지 50mg/kg일 수 있다. 이러한 용량은 종양학자/의사에 의해 결정되는 바와 같이 상이한 간격으로 투여될 수 있고; 예를 들어, 용량은 매일, 매주 2회, 매주, 격주 또는 매월 투여될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
발명의 약학적 조성물이 단독으로 또는 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 장애 또는 질환의 치료에 사용되는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 비경구 전달에 적합하다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 정맥내 전달에 적합하다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 국소 전달에 적합하다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 피하 전달에 적합하다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 근육내 전달에 적합하다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 및 약학적 조성물 또는 제형이 의학 및 수의학 분야 둘 모두에서 유용성을 갖는다는 것이 당업자에 의해 추가로 인지될 것이다. 따라서, 발명의 방법은 인간 및 비-인간 동물(예컨대 말, 개 및 고양이) 둘 모두의 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 환자는 인간이다.
항체의 적응증 및 용도
발명의 제7 양태는 의학에 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이다.
발명의 제8 양태는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료에 민감한 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화 및/또는 검출 및/또는 진단에 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이고/이거나,
여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다.
발명의 제8 양태에 대한 대안적인 양태에서, 발명은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료에 민감한 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화 및/또는 검출 및/또는 진단에 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이다.
발명의 제8 양태에 대한 또 다른 대안적 양태에서, 발명은 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화 및/또는 검출 및/또는 진단에 사용하기 위한
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것으로, 여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링과 연관된다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다.
"치료"로는 본 발명자들은 환자의 치료적 및 예방적 또는 방지적 치료 둘 모두를 포함한다. 용어 "방지적" 또는 "예방적"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 염증성 질환 또는 장애, 섬유성 질환 또는 장애, 신생물성 장애 또는 장애의 가능성을 예방하거나 감소시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이의 제형의 사용을 포괄하는데 사용되며, 이는 환자 또는 대상체에서 신생물성 세포의 확산, 파종 또는 전이의 예방 또는 감소를 또한 포함한다. 용어 "예방적"은 또한 임의의 이들 질환 또는 장애에 대해 이전에 치료를 받은 환자에서 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애의 재발을 방지하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 이의 제형의 사용을 포괄한다.
"진단" 또는 "검출"로는 본 발명자들은 생체내(즉, 환자의 신체 내) 또는 생체외(즉, 환자의 신체에서 제거된 조직 또는 세포 샘플 내)에서 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포의 검출을 포함한다.
"경감"으로는 본 발명자들은, 이에 제한됨이 없이, 질환 또는 장애와 연관된 감소된 증상 또는 과정, 즉 더 가벼운 질환 또는 장애를 초래하는 것을 의미한다.
"IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애"로는 본 발명자들은 장애에 직접적으로 또는 간접적으로 책임이 있는 병리학적 세포가 세포 표면 상에서 IL1RAP를 발현하는 그러한 질환 또는 장애를 포함한다. IL1RAP를 발현하는 세포는 면역 세포, 섬유아세포 또는 신생물 세포(암 세포)와 같은 결합 조직의 세포, 예를 들어, 종양 세포, 그 자체일 수 있음이 인지될 것이다. 부가하여, 그러한 세포는 병리학적 줄기 세포(즉, 암 줄기 세포 또는 CSC) 및 개체에서 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애의 발달에 직접적으로 또는 간접적으로 책임이 있는 전구 세포를 포함한다. CSC의 예는 Visvader & Lindeman, 2008, Nat Rev Cancer 8:755-768에 개시되어 있으며, 그의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
대안적으로 또는 추가로, IL1RAP를 발현하는 세포는 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애와 간접적으로 연관될 수 있으며, 예를 들어 이들은 세포가 생존하기 위해 필요한 세포 과정을 매개할 수 있다. 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이 경우에 염증성 및/또는 섬유성 과정의 유지에 필수적인 세포, 또는, 예를 들어 종양의 혈액 공급(혈관신생) 또는 악성 세포에 대항하는 유익한 면역 반응을 억제하는 세포(예를 들어 억제성 대식세포 또는 T 세포)를 표적으로 할 수 있다.
예를 들어, 신생물 세포의 경우, IL1RAP를 발현하는 표적 세포를 사멸하는 것이 치료적으로 바람직한지 여부에 따라 ADCC를 유도할 수 있는 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 항원-결합 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어, IL1RAP를 발현하는 표적 세포가 암 세포(예컨대 CML, AML, ALL, 흑색종, 폐암 세포 등)인 경우, 항체 또는 항원-결합 단편이 그러한 세포를 제거하기 위해 ADCC를 유도할 수 있는 것이 유리할 수 있다. 그러나, ADCC 활성을 결하는 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하여, 예를 들어 암 또는 종양의 부근에서 감소된 혈관신생을 유도하는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제를 통해 치료적 이점이 또한 달성될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 유사하게, 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애의 경우에, 세포 거동에 영향을 미치지만 세포를 사멸하지 않는 것이 유익할 수 있다.
IL-1의 억제제에 의한 치료에 민감하고/하거나 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애를 구성할 수 있는 병태 또는 질환 상태는 당업계에 잘 알려져 있고(Dinarello 등, 2012, Nature Reviews 11:633-652 및 Dinarello, 2014, Mol. Med. 20(suppl. 1):S43-S58를 참조하며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨), 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
류마티스 관절염, 모든 유형의 관절염, 건선성 관절염, 모든 유형의 소아 관절염으로, 전신 발병 소아 특발성 관절염(SOJIA), 골관절염 포함, 가족성 한랭 자가-염증성 증후군(FCAS), 머클-웰스병, 신생아 발병 다-기관 염증성 질환(NOMID), 가족성 지중해열(FMF), 화농성 관절염 괴저성 농피증 및 여드름(PAPA) 증후군, 성인 발병 스틸병, 고 IgD 증후군, 제2형 진성 당뇨병, 대식세포 활성화 증후군, TNF 수용체-연관된 주기 증후군, 블라우병, 강직성 척추염, 스위트병, 루푸스 관절염, 알츠하이머병, 건선, 천식, 알레르기, 죽상동맥경화증, 유육종증, 아토피성 피부염, 전신성 홍반성 루푸스, 수포성 유천포창, 제1형 진성 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐질환, 헬리코박터 파일로리 위염, 염증성 장질환 (궤양성 대장염 및 크론병 포함), 간염, C형 간염, 허혈-재관류 손상, 다발성 경화증, 나이세리아 또는 폐렴구균성 수막염, 결핵, 베체트 증후군, 패혈성 쇼크, 이식편대숙주병, 성인 T 세포 백혈병, 다발성 골수종, 치주염, 비만 및 비만-관련된 질환(예를 들어, 대사 증후군, 심비대, 울혈성 심부전, 심근 경색, 정맥류, 다낭성 난소 증후군, 위식도 역류 질환(GERD), 지방간 질환, 대장암, 유방암, 자궁암, 만성 신부전, 뇌졸중 및 고요산혈증), 척추추간판 질환, 과민성 대장 증후군, 슈니츨러 증후군, 알레르기/아토피성 피부염, 역위 여드름, 베체트병, 심장 섬유증, 심혈관 질환, 크리오피인-연관된 주기 증후군, 낭포성 섬유증, 굿파스쳐 증후군, 길랑-바레 증후군, 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증(폐의 섬유증), 피부 섬유증(진피의 섬유증), 심근염, 자가면역 심근염, 장기 이식과 연관된 장기 기능 장애, 췌장염, 복막염, 포도막염, 맥관염, 폐렴, 폐 고혈압, 공피증의 만성 이식편대숙주병, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 타카야수 동맥염 및 통풍.
IL-1 시그널링의 차단은 또한 심근 경색의 치료에 유익한 것으로 여겨진다. 심근 경색에 이은 항-IL-1β 항체 차단(카나키누맙 사용)의 효능을 확인하기 위해 광범위한 임상 시험을 모색하고 있다(CANTOS 트레일; Ridker 등, 2011, Am Heart Journal 162(4):597-605를 참조하며, 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
그러한 적응증에 대해, IL1RAP에 결합하고 이에 의해 면역 세포와 연관된 IL-1 및/또는 IL-33 및/또는 IL-36 시그널링을 차단하는 항체 또는 항원-결합 단편을 사용하여 치료적 이점이 또한 달성될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 그러한 항체는 ADCC 활성을 결하도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애이다.
발명의 치료적 및 예방적 양태와 관련하여, 염증성, 섬유성 질환 및/또는 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포의 표면 상에 존재하는 IL1RAP에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합이 IL1RAP의 생물학적 활성의 조절(즉, 증가 또는 감소)로 이어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 인지될 것이다. 그러나, 이러한 조절 효과가 필수적인 것은 아니다; 예를 들어, 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 질환 또는 장애와 연관된 세포 표면 상의 IL1RAP에 대한 결합의 이점에 의해 단순히 치료적 및 예방적 효과를 이끌어낼 수 있으며, 이는 차례로 (예를 들어 ADCC에 의해 및/또는 세포독성/방사성 모이어티의 제제 내 존재에 의해) 세포 사멸과 같은 과정을 유도하도록 면역계를 촉발할 수 있다.
일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 생물학적 활성을 억제한다.
"IL1RAP의 생물학적 활성"으로 본 발명자들은 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포 상에 IL1RAP를 포함하는 임의의 상호작용 또는 시그널링 이벤트를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP(예컨대 IL1R1, ST2, C-KIT 및/또는 IL1RL2)에 대한 하나 이상의 공동-수용체의 결합을 차단할 수 있다. 추가로, 상기에 상세히 설명한 바와 같이, 일부 실시형태에서, IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링을 억제한다.
당업자는 "사이토카인의 시그널링 억제"(예컨대 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링 억제와 같은 IL-1 패밀리의 사이토카인)는 IL1RAP의 생물학적 활성의 억제를 초래한다는 것을 이해할 것이다.
발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의한 IL1RAP의 생물학적 활성의 그러한 억제는 전체적으로 또는 부분적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 생물학적 활성을, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 노출되지 않은 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포에서 IL1RAP의 생물학적 활성과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 가장 바람직하게는 100% 억제할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 생물학적 활성을, 항체 또는 항원-결합 단편에 노출되지 않은 염증성, 섬유성 및/또는 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포에서 IL1RAP의 생물학적 활성과 비교하여 50% 이상 억제할 수 있다.
마찬가지로, 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포의 성장 및/또는 증식의 억제가 전체적으로 또는 부분적으로 이루어질 수 있음을 인지될 것이다. 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포의 성장 및/또는 증식을, 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 노출되지 않은 신생물성 질환 또는 장애와 연관된 세포의 성장 및/또는 증식과 비교하여 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 가장 바람직하게는 100% 억제할 수 있다.
질환에서 IL-1, IL-33 및 IL-36
IL-1은 다음을 포함하는 통풍에서 암에 이르는 광범위한 질환 및 병태에 연루되어 있다(검토를 위해, Dinarello 등, 2012, Nature Reviews 11:633-652 및 Dinarello, 2014, Mol. Med. 20(suppl. 1):S43-S58을 참조하며; 그의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨):
ㆍ 류마티스 관절염 및 골관절염과 같은 관절, 뼈 및 근육 질환;
ㆍ 가족성 지중해열과 같은 유전성 전신 자가염증성 질환;
ㆍ 전신성 소아 특발성 관절염 및 성인-발병 스틸병과 같은 전신 자가염증성 질환;
ㆍ 통풍 및 제2형 당뇨병과 같은 일반적인 염증성 질환;
ㆍ 심근 경색과 같은 급성-발병 허혈성 질환; 및
ㆍ 암.
IL-1 활성을 차단하기 위한 다수의 요법이 승인되고 개발 중이다. IL-1을 표적화하는 것은 1993년 IL-1α와 IL-1β 둘 모두의 활성을 차단하는 자연적으로 발생하는 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra 또는 IL1RA)의 재조합 형태인 아나킨라(Kineret; Amgen)의 도입으로 시작되었다; 이후 이 치료제는 수많은 질환(상기 참조)에서 IL-1의 역할을 입증하는데 사용되었다. 아나킨라는 그의 우수한 안전성 기록, 짧은 반감기 및 다양한 투여 경로로 인해 현재 IL-1 치료제의 분야를 지배하고 있다. 항체 또는 가용성 수용체로 IL-1을 중화하는 것도 효과적인 것으로 입증되었으며 가용성 유인 수용체 릴로나셉트(Arcalyst; Regeneron) 및 항-IL-1β 중화 단일클론 항체 카나키누맙(Ilaris; Novartis)가 현재 승인되었다. IL-1α 중화, IL-1β를 표적화하는 치료 백신 및 키메라 IL-1Ra를 포함한 다른 치료적 접근법은 초기 임상 시험에 있다. 부가하여, 카스파제 1 억제제와 같은 IL-1 생산의 경구로 활성인 저-분자 억제제가 개발되어 테스트 중이다.
유사하게, 상기에서 자세히 설명한 바와 같이 질환에서 IL-33의 연루의 증거가 부상하고 있다. 상기에서 자세히 설명한 바와 같이 IL-33은 예를 들어 천식, 알레르기 질환, 염증성 장 질환 및 피부염과 연관되어 있다. 중요하기로는, IL-33은 섬유증 및 염증에 연관되어 있다(Kotsiou 등 2018, IL-33/ST2 Axis in Organ Fibrosis, Front Immunol. 2018 Oct 24;9:2432). IL-33은 광범위한 세포를 강력하게 자극할 수 있고 그의 다면발현성의 성질은 조직 및 대사 항상성, 감염, 염증, 암 및 중추 신경계의 질환에서 IL-33의 역할에 반영된다.
유사하게, 상기에서 자세히 설명한 바와 같이, 이 분야가 여전히 진화하고 있고 IL-1과 비교하여 IL-36과 관련된 지식이 여전히 제한적임에도 불구하고 질환에서 IL-36의 연루의 증거가 부상하고 있다. 상기에서 자세히 설명한 바와 같이, 부상하는 증거는 IL-36 시그널링이 선천적 및 후천적 면역 반응의 활성화에 관여한다는 것을 나타낸다(Ding L, IL-36 cytokines in autoimmunity and inflammatory disease, Oncotarget, Vol. 9, (No. 2), pp: 2895-2901(2018)). 건선 및 아토피성 피부염과 같은 염증성 피부 질환에서 그의 역할 외에도 부상하는 증거는 비정상적인 IL-36 활동이 폐, 신장 및 내장에서 염증성 질환을 촉진하여, 일반적인 염증성 질환에 대한 치료적 표적으로서 IL-36의 잠재력을 강조하는 것을 시사한다.
당업자는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링을 억제하는 능력에 기인하여, 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애에 대한 심오한 영향을 미칠 수 있거나 가질 것으로 예상되고, 이에 의해 여러 IL-의존성 경로를 동시에 표적화한다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애이며,
여기서 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애는 류마티스 관절염, 모든 유형의 관절염, 건선성 관절염, 모든 유형의 소아 관절염으로, 전신 발병 소아 특발성 관절염(SOJIA), 골관절염 포함, 가족성 한랭 자가-염증성 증후군(FCAS), 머클-웰스병, 신생아 발병 다-기관 염증성 질환(NOMID), 가족성 지중해열(FMF), 화농성 관절염 괴저성 농피증 및 여드름(PAPA) 증후군, 성인 발병 스틸병, 고 IgD 증후군, 제2형 진성 당뇨병, 대식세포 활성화 증후군, TNF 수용체-연관된 주기 증후군, 블라우병, 강직성 척추염, 스위트병, 루푸스 관절염, 알츠하이머병, 건선, 천식, 알레르기, 죽상동맥경화증, 유육종증, 아토피성 피부염, 전신성 홍반성 루푸스, 수포성 유천포창, 제1형 진성 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐질환, 헬리코박터 파일로리 위염, 염증성 장질환 (궤양성 대장염 및 크론병 포함), 간염, C형 간염, 허혈-재관류 손상, 다발성 경화증, 나이세리아 또는 폐렴구균성 수막염, 결핵, 베체트 증후군, 패혈성 쇼크, 이식편대숙주병, 성인 T 세포 백혈병, 다발성 골수종, 치주염, 비만 및 비만-관련된 질환(예를 들어, 대사 증후군, 심비대, 울혈성 심부전, 심근 경색, 정맥류, 다낭성 난소 증후군, 위식도 역류 질환(GERD), 지방간 질환, 대장암, 유방암, 자궁암, 만성 신부전, 뇌졸중 및 고요산혈증), 척추추간판 질환, 과민성 대장 증후군, 슈니츨러 증후군, 알레르기/아토피성 피부염, 역위 여드름, 베체트병, 심장 섬유증, 심혈관 질환, 크리오피인-연관된 주기 증후군, 낭포성 섬유증, 굿파스쳐 증후군, 길랑-바레 증후군, 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증(폐의 섬유증), 피부 섬유증(진피의 섬유증), 심근염, 자가면역 심근염, 장기 이식과 연관된 장기 기능 장애, 췌장염, 복막염, 포도막염, 맥관염, 폐렴, 폐 고혈압, 공피증의 만성 이식편대숙주병, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 타카야수 동맥염 및 통풍으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 피부경화증 또는 전신성 피부경화증이라고도 하는 전신성 경화증이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 급성 복막염과 같은 복막염이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 건선이다. 일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 건선성 관절염이다. 일 실시형태에서 상기 질환 또는 장애는 건선 및 건선성 관절염이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 죽상동맥경화증이다. 일부 실시형태에서, 죽상동맥경화증의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단에 있어서 본 명세서에 개시된 발명의 사용은 죽상동맥경화증의 감소, 예를 들어 죽상동맥경화증의 임상 징후, 증상 또는 병태생리학적 상관물의 감소, 예를 들어 대동맥 플라크 염증과 같은 죽상동맥경화 플라크 염증의 감소 및/또는 플라크 크기(예를 들어, 플라크 부피 및/또는 플라크 면적)의 감소를 포함한다.
플라크 염증은 대동맥의 유세포분석을 사용하여 CD45+ 백혈구의 세포 수를 기준으로 평가될 수 있다(예를 들어, 실시예 4에 나타낸 바와 같음). 건강한 대조군 대동맥에 비해 테스트 대동맥(예를 들어, 죽상동맥경화 대동맥인 것으로 의심되거나 진단된 대동맥)에서 더 높은 계수의 CD45+ 백혈구는 죽상동맥경화 플라크 염증을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 백혈구 계수는 골수성 CD11b+ 세포(Ly6G+ 호중구 포함) 및/또는 TCR-β+ 세포(CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 포함)에 기반하여 평가될 수 있다.
플라크 크기는 플라크 부피 및/또는 플라크 면적을 기준으로 평가될 수 있다. 건강한 대조군 대동맥(플라크의 부재를 가질 수 있음)에 비해 테스트 대동맥(예를 들어, 죽상동맥경화 대동맥인 것으로 의심되거나 진단된 대동맥)에서 플라크 크기(예를 들어, 플라크 부피 및/또는 플라크 면적)에서 증가는 죽상동맥경화 플라크의 존재를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 폐의 섬유증으로도 알려진 폐 섬유증이다.
섬유증은 다중 질환의 특질이다. 일부 경우에는 섬유증이 질환의 필수적인 부분일 수 있으며, 이는 섬유증이 세포외 기질 단백질의 병리학적 침착을 초래하는 비정상적 또는 병리학적 세포 거동의 결과일 수 있음을 의미한다. 다른 경우에, 섬유증은 일차 질환과 병행하여 또는 치유 과정의 경과 중에 질환이 있는 조직에서 발생하는 이차 이벤트일 수 있다. 예를 들어, 섬유증은 흉터 형성일 수 있다. 임의의 유형의 섬유증은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체에 의해 표적화, 예를 들어 치료 또는 예방될 수 있다. 섬유증은 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분의 과도한 축적에 의해 야기될 수 있는 제어되지 않거나 조절되지 않는 반흔 조직 형성으로 분류될 수 있다. 따라서, 섬유증의 예방, 치료, 경감, 검출 및/또는 진단에서 본 명세서에 개시된 발명의 사용은 섬유증이 특질인 질환의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단의 업스트림일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 섬유증의 예방, 치료, 경감, 검출 및/또는 진단에서 본 명세서에 개시된 발명의 사용은 섬유증이 상기 질환에서 이차 이벤트인 질환의 다운스트림일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 심근염이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 자가면역 심근염이다.
일부 실시형태에서, 자가면역 심근염과 같은 심근염의 예방, 치료, 경감, 검출 및/또는 진단에서 본 명세서에 개시된 발명의 사용은 자가면역 심근염과 같은 심근염의 감소, 예를 들어 자가면역 심근염과 같은 심근염의 임상 징후, 증상 또는 병태생리학적 상관물의 감소, 예를 들어 심장 기능에서 저하의 감소, 염증에서 감소 및/또는 섬유증 감소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 만성 이식편대숙주병 및 공피증의 만성 이식편대숙주병을 포함하는 이식편대숙주병이다. 일 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 이식편대숙주병에서의 피부 섬유증 및/또는 폐의 섬유증이다. 특정 실시형태에서, 이식편대숙주병은 동계 이식에 의해 야기된다. 대안적 실시형태에서, 이식편대숙주병은 동종 이식에 의해 야기된다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 급성 염증성 질환 또는 장애이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 만성 염증성 질환 또는 장애이다.
당업자는 질환 또는 장애가 상이한 방식으로 그룹화됨을 인지할 것이다. 질환 또는 장애가 염증성 또는 섬유성 질환으로 명시적으로 표지되지 않을 수 있지만, 여전히 염증성 및/또는 섬유성 성분, 예를 들어 질환 또는 장애의 일부를 형성하거나 이에 기여하는 염증성 및/또는 섬유성 과정을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 성분을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애이다.
일부 실시형태에서, 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편은 염증성 과정을 억제한다.
일부 실시형태에서, 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편은 섬유성 과정을 억제한다.
일부 실시형태에서, 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편은 증식성 과정을 억제한다.
신생물성 질환 또는 장애에 대한 바이오마커로서의 IL1RAP
신생물성 질환 또는 장애(즉, 암)를 나타내는 신생물은 조직 또는 세포의 비정상적이고 과도한 성장(신조직형성이라고도 함), 예를 들어 종양의 한 유형이다.
종양 바이오마커 또는 신생물성 질환 또는 장애의 바이오마커는 그 양 또는 변형이 종양 상태, 진행 특성, 및 치료에 대한 반응을 나타내는 내인성 단백질 또는 대사산물이다. 그것은 종양 조직이나 체액에 존재하고 전사 인자, 세포 표면 수용체 및 분비된 단백질을 포함한 매우 다양한 분자를 포괄한다. 효과적인 종양 마커는 초기 단계에서 암의 진단을 용이하게 하고 치료를 개별화하는데 도움을 줌으로써 암 사망률을 감소시키는 잠재력을 가지고 있기 때문에 큰 수요가 있다. 지난 10년 동안 발암 및 종양 진행에 대한 이해가 향상되어 많은 수의 잠재적 종양 마커가 밝혀졌다. 가까운 미래에 조직 마이크로어레이, 항체 어레이, 질량 분석과 같은 현재 기술의 적용으로 훨씬 더 많이 발견될 것으로 예상된다.
인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)은 이전에 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 골수이형성 증후군(MDS)과 같은 혈액학적 신생물성 질환과 연관된 세포-표면 바이오마커로 식별되었다(예를 들어, Cantargia AB의 WO 2011/021014, 등, 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107(37):16280-5, Askmyr 등, 2013, Blood. 121(18):3709-13 및 Barreyro 등, 2012, Blood 120(6):1290-8을 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨). 보다 최근에, 흑색종과 같은 고형 종양에 대한 진단 및 치료 바이오마커로서 IL1RAP의 유용성이 또한 밝혀졌다(Cantargia AB의 WO 2012/098407을 참조하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨).
따라서, 발명의 상기 양태의 일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 신생물성 질환 또는 장애이다.
당업자는 본 발명의 항체가, 예를 들어 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 시그널링을 억제하는 능력으로 인해 신생물성 질환 또는 장애에 심대한 영향을 미칠 수 있고, 이에 의해 동시에 여러 IL-의존성 경로를 표적화한다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 신생물성 질환 또는 장애이며, 여기서 신생물성 질환 또는 장애는 혈액학적 질환 또는 장애 또는 고형 종양이다.
일부 실시형태에서, 상기 신생물성 질환 또는 장애는 혈액 질환이며, 여기서 신생물성 혈액 질환 또는 장애는 만성 골수성 백혈병(CML), 골수증식성 장애(MPD), 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 신생물성 질환 또는 장애는 고형 종양이며, 여기서 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장암, 결장직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 비뇨기의 암, 담도암(담관암으로도 알려짐), 자궁경부암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 육종, 피부암 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
당업자는 본 발명의 항체가, 예를 들어 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 시그널링을 억제하는 능력으로 인해 신생물성 질환 또는 장애에 심대한 영향을 미칠 것으로 예상되며, 이에 의해 동시에 여러 IL-의존성 경로를 표적화한다는 것을 인지할 것이다.
당업자는 예를 들어 상기 언급된 증거에 비추어 볼 때 본 발명의 항체가 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ의 활성에 의해 연루된 임의의 질환 또는 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
발명의 제9 양태는 세포 사멸을 유도하고/하거나 대상체에서 신생물성 장애와 연관된 병리학적 세포, 또는 그의 줄기 세포 또는 전구 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는데 사용하기 위한 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물에 관한 것이며, 여기서 세포는 IL1RAP를 발현한다.
발명의 제10 양태는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료에 민감한 질환 또는 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단을 위한 약제의 제조에 있어서
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물의 용도에 관한 것이며,
및/또는 여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된다.
발명의 제11 양태는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 검출 및/또는 진단을 위한 약제의 제조에 있어서
발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
발명의 제3 양태의 벡터,
발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
발명의 제6 양태의 조성물의 용도에 관한 것이다.
발명의 제12 양태는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료에 민감한 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 경감 및/또는 검출 및/또는 진단을 위한 방법에 관한 것이고/이거나 질환 또는 장애는 대상체에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관되며, 상기 방법은 다음의 유효한 양을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물.
발명의 제13 양태는 대상체에서 IL1RAP를 발현하는 세포의 검출을 위한 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) 생검 조직 또는 혈액 샘플과 같이 테스트되어 지는 대상체로부터 세포의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 샘플에 존재하는 세포를 추출 및/또는 정제하는 단계;
(c) 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 샘플에 존재하는 세포와 접촉시키는 단계;
(d) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포에 대한 결합은 대상체의 조직에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타낸다.
발명의 제14 양태는 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 환자를 식별하기 위한 시험관내 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) 테스트되어 지는 환자로부터 생검 조직 또는 혈액 샘플과 같은 세포의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 샘플에 존재하는 세포를 추출 및/또는 정제하는 단계;
(c) 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 샘플에 존재하는 세포와 접촉시키는 단계;
(d) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 IL1RAP를 발현하는 세포에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 환자를 나타낸다.
발명의 제15 양태는 IL1RAP 발현 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 발명의 제14 양태에 따른 방법을 사용하여 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 것으로 식별된 환자를 선택하는 단계; 및
b) 상기 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제16 양태는 IL1RAP를 발현하는 세포의 검출을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a) IL1RAP의 그 발현에 대해 분석되는 세포와 제1 양태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계;
(b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포에 대한 결합은 대상체의 조직에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 제16 양태의 방법은 시험관내 방법이다.
일부 실시형태에서, 제16 양태의 방법은 생체내 방법이다.
당업자는 제16 양태의 방법이 적용되는 경우, 예를 들어 본 명세서의 설명에 따라 IL1RAP에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편이 대상체에게 투여됨을 이해할 것이다.
발명의 제17 양태는 복막염이 있는 대상체에서 염증을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 복막염이 있는 대상체에서 염증을 감소시키는 상기 방법은 복막 안으로 면역 세포, 예를 들어 호중구 및 단핵구의 침윤을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 복막염이 있는 대상체에서 염증을 감소시키는 상기 방법은 사이토카인의 수준을 감소시키는 것, 예를 들어 에오탁신, G-CSF, IL-5, MCP-1, MIP-1β, IL-6 및/또는 또는 KC(CXCL1로도 알려짐)의 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
발명의 제18 양태는 건선 또는 건선성 관절염이 있는 대상체에서 질환 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 건선 또는 건선성 관절염이 있는 대상체에서 질환 중증도를 감소시키는 상기 방법은 피부 염증 및/또는 피부의 홍반을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 건선 또는 건선성 관절염이 있는 대상체에서 질환 중증도를 감소시키는 상기 방법은 사이토카인의 수준을 감소시키는 것, 예를 들어 IL-17의 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
발명의 제19 양태는 죽상동맥경화증이 있는 대상체에서 죽상동맥경화 플라크 염증을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 죽상동맥경화증이 있는 환자에서 죽상동맥경화 플라크 염증을 감소시키는 상기 방법은 CD45+ 백혈구, 예를 들어 골수성 CD11b+ 세포, 예를 들어 Ly6G+ 호중구의 수를 감소시키는 것, 및/또는 TCR-β+ 세포, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 수를 감소시키는 것을 포함한다.
발명의 제20 양태는 죽상동맥경화증이 있는 대상체에서 죽상동맥경화 플라크 부피 및/또는 죽상동맥경화 플라크 크기를 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제21 양태는 심근염이 있는 대상체에서 염증 및/또는 섬유증을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제22 양태는 심근염 또는 자가면역 심근염이 있는 대상체에서 심장 기능에서의 저하에 대응하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
발명의 제23 양태는 전신 경화증이 있는 대상체에서 피부 섬유증을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전신 경화증이 있는 대상체에서 피부 섬유증을 감소시키는 상기 방법은 피부 두께 감소, 근섬유아세포의 수 감소 및/또는 피부에서 콜라겐의 양 감소를 포함한다.
발명의 제24 양태는 전신 경화증이 있는 대상체에서 폐의 섬유증을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 유효량의
- 발명의 제1 양태의 항체 또는 항원-결합 단편,
- 발명의 제2 양태의 폴리뉴클레오티드,
- 발명의 제3 양태의 벡터,
- 발명의 제4 양태의 숙주 세포, 및/또는
- 발명의 제6 양태의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 전신 경화증이 있는 대상체에서 폐의 섬유증을 감소시키는 상기 방법은 Ashcroft 점수 및/또는 폐에서 콜라겐의 양을 감소시키는 것을 포함한다.
예를 들어, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료에 민감한 질환 또는 장애와 관련하여, 및/또는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애와 관련하여 제8 양태에 관련한 실시형태 및 설명은 발명의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 및/또는 제16 양태에도 적용할 것이다. 그것은 또한 발명의 제17, 제18, 제19, 제20, 제21, 제22, 제23 또는 제24 양태에 적용할 수 있다.
실시예
실시예 1: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10에 의한 사이토카인 시그널링의 억제
목표
이 실시예는 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 의한 시그널링을 차단하는 것과 관련하여, 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10의 특성화를 예시한다.
재료 및 방법
닭을 마우스 IL1RAP 항원으로 면역화하고 다중 항-마우스 IL1RAP 결합제를 식별하였다. 이들 중 선택된 것을 마우스 IgG2a 백본 안으로 클로닝했다. 마우스 IL1RAP의 도메인 2에 결합할 수 있는, 하나의 이러한 클론인 mCAN10은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 의한 시그널링을 억제하는 그 능력에 대해 평가되었다.
이 평가를 위해, 뮤어라인 IL-1R로 안정적으로 형질감염된 HEK-Blue™ 세포를 사용했다. 대안적으로 뮤어라인의 IL-33 및 IL-36 시그널링도 분석할 수 있도록 HEK-Blue™ 세포를 검정 전날 뮤어라인 IL-33 및 IL-36 수용체로 일시적으로 형질감염시켰다. HEK-Blue™ 세포를 96-웰 플레이트 안에 시딩하고 최소 2시간 동안 침전시킨 후 계속했다. 그런 다음 세포를 증가하는 농도의 mCAN10(0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 및 100μg/ml)에 노출시키고 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 뮤어라인 사이토카인을 첨가하였다. 사이토카인을 다음 농도에서 첨가하였다: 3pg/ml IL-1α, 30pg/ml IL-1β, 5ng/ml IL-33, 4ng/ml IL-36α, 5ng/ml IL-36β 및 10ng/ml IL-36γ. 마우스 IL-1α 및 IL-1β는 HEK-Blue™ 세포에 의해 내인성으로 발현되는 인간 IL-1R과 교차-반응할 수 있으므로, 항-인간 IL1RAP 항체를 사용하여, 마우스 IL-1α 및 IL-1β로 이들 세포의 자극 이전에 IL-1R을 통한 시그널링을 차단했다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 16-18시간 동안 배양한 다음 SpectraMax i3x 분광광도계를 사용하여 620nm에서 측정된 QUANTI-Blue™ 용액을 사용하여 NF-κB의 활성화 및 SEAP의 후속 생산에 대해 분석했다.
결과
mCAN10을 HEK-Blue™ 세포에 증가하는 농도에서 첨가하고 마우스 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 또는 IL-36γ를 일정한 농도에서 첨가했다. 620nm에서 광학 밀도 값의 그래프를 사용하여 표 2에 표시된 IC50 값을 계산했다. mCAN10은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 시그널링의 억제를 유도했다.
표 2: HEK-Blue™ 검정으로부터 얻은 다양한 시그널링 경로에 대한 mCAN10의 IC50 값[nM]
결론
mCAN10은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ에 의한 시그널링을 차단할 수 있는 뮤어라인 대리물 항-마우스 IL1RAP 억제제이다. 따라서, mCAN10은 다양한 뮤어라인 질환 모델에서 IL1RAP 차단의 치료적 효능을 평가하는데 유용한 도구를 제공한다. 항-인간 IL1RAP 항체는 마우스 IL1RAP(예컨대 실시예 9-22에 기술된 항-인간 IL1RAP 항체)에 대한 교차-반응성이 부족할 수 있으므로, mCAN10은 유사한 기능적 특성을 가진 항-인간 IL1RAP 항체에 대한 적합한 대리물이다. 후속 생체내 실험(실시예 2-8)에서, 이펙터 기능 침묵 마우스 IgG2a 포맷에서의 mCAN10이 사용되었다.
실시예 2: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 급성 복막염에 대한 모델에서 염증을 감소시킨다
목표
이들 실험의 목표는 마우스 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10으로 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 급성 복막염에 대한 마우스 모델에서 염증 반응에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 것이다. 추가적인 목표는 IL-1α/β 시그널링만 차단하는 재조합 IL-1R 길항제(IL1RA) 단백질인 아나킨라에 대한 이 항체의 효과를 비교하는 것이다.
재료 및 방법
야생형(WT) 또는 IL1RAP 녹-아웃(KO)인 암컷 C57Bl/6 마우스(10-18주령)는 2.5mg 요산일나트륨(MSU) 결정으로 복강내(ip) 면역화되었다. MSU 결정으로 면역화되지 않은 WT 마우스를 대조군(무 MSU)으로 포함시켰다. 모든 마우스는 면역화 6시간 후에 종료되었고 유세포측정법에 의해 침윤 세포(B 세포, T 세포, 단핵구, 호중구 및 호산구)의 정량화(도 1a)를 위해 복막 세척을 수집했다.
대안적으로, 암컷 C57Bl/6 WT 마우스(8-9주령)를 20mg/kg mCAN10 또는 IL1RA로 몰 등가 용량(2.3mg/kg)에서 치료했다. 동형 대조군 항체 또는 PBS로 처리된 마우스를 대조군으로 포함시켰다. 처리 후 1시간(hr)에 마우스는 2.5mg MSU 결정으로 i.p. 면역화되었다. 어떠한 치료도 받지 않고 MSU 결정으로 면역화되지 않은 마우스도 대조군(무 MSU)으로 포함되었다. 모든 마우스는 면역화 6시간 후 종료되었고 유세포분석법에 의한 침윤 세포의 정량화(도 1b) 또는 루미넥스 검정에 의한 다양한 사이토카인 및 케모카인(에오탁신, G-CSF, IL-5, MCP-1, MIP-1β, IL-6 및 KC(CXCL1이라고도 함))의 정량화(도 1c)를 위해 복막 세척을 수집했다.
결과
MSU 결정으로 면역화에 이어, IL1RAP KO 마우스는 호중구 및 단핵구 침윤에 대해 가장 큰 영향으로, WT 마우스에 비해 복막으로의 세포의 유의하게 감소된 침윤을 나타냈다(도 1a). mCAN10 및 IL1RA로의 처리는 MSU 결정으로 면역화된 WT 마우스에서 복막강에서 호중구 및 단핵구와 같은 침윤 세포의 수를 각각 동형 및 PBS 대조군과 비교하여 유의하게 감소시켰다. 그러나, mCAN10은 IL1RA보다 단핵구와 호중구에 대해 더 강력한 항-염증 효과를 가졌다(도 1b). mCAN10 및 IL1RA는 또한 동형 및 PBS 대조군에 비해 각각 G-CSF 및 IL-6을 유의하게 감소시켰다. mCAN10은 또한 동형 대조군과 비교하여 에오탁신, IL-5, MCP-1 및 MIP-1β를 감소시켰고, IL1RA와 비교하여 IL-6의 현저하게 더 강한 감소를 보였다(도 1c).
결론
mCAN10(IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링을 차단함)은 급성 복막염에 대한 마우스 모델에서 IL1RA(IL-1α/β 시그널링만 차단함)보다 더 강력하게 염증 반응을 감소시킨다.
실시예 3: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 건선 및 건선성 관절염에 대한 모델에서 질환 중증도를 감소시킨다
목표
이들 실험의 목표는 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10로 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 이미퀴모드-유도된 건선 및 만난-유도된 건선성 관절염에서 질환 중증도에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 것이다. 추가 목표는 이 항체의 효과를 IL-1β 시그널링만 차단하는 항-IL-1β 항체와 비교하는 것이다.
재료 및 방법
건선은 0일차부터 시작하여 7일차 종료까지 자이클라라 크림(3.75% 이미퀴모드; 대략적으로 71.4mg/일)의 매일 국소 투여를 받은 암컷 BALB/c 마우스(8-10주령)에서 유도되었다. 면도한 마우스의 등 상에 크림을 적용했다. 이 질환 유도의 기간 동안 마우스는 0, 3 및 5일차에 i.p. 처리를 받았다. 마우스는 mCAN10(10mg/kg), 항-IL-1β 항체(0.5mg/kg), 또는 이들 항체에 대해 동일한 용량의 동형 대조군으로 처리되었다. PBS 단독(비히클) 또는 덱사메타손(10mg/kg)으로 처리된 마우스는 각각 음성 및 양성 대조군으로 포함되었다. 질환 중증도는 0-4(각 마우스에 대해 총 8)의 범위인 점수를 사용하여 면도된 등 영역의 피부 염증 및 홍반을 채점함에 의해 실험 전반에 걸쳐 매일 평가되었다(도 2a-b).
대안적으로, 0일차에 사카로마이세스 세레비시애 i.p.로부터 20mg 만난을 받은 수컷 및 암컷 B6N.Q.NCF1 마우스(8-14주령)에서 건선성 관절염이 유도되었다. 이들 마우스는 상기와 유사한 방식으로 0, 3 및 5일차에 처리되었다. 질환 중증도는 발의 관절 염증을 채점하고 0-15(각 마우스에 대해 총 60)의 범위인 사지의 거시적 채점 시스템을 사용함에 의해 평가되었다(도 2c-d). 실험의 종료 시, 건선성 관절염에서 주요 기여자 사이토카인인 IL-17의 분석을 위해 혈액을 수집했다(도 2e).
결과
항-IL-1β 항체가 아닌 mCAN10은 이미퀴모드-유도된 건선에서 질환 중증도를 감소시켰다(도 2a-b). 유사하게, 항-IL-1β 항체가 아닌 mCAN10은 만난-유도된 건선성 관절염에서 질환 중증도를 감소시켰고(도 2c-d), 또한 비히클에 비해 순환 IL-17 수준을 감소시켰다(도 2e).
결론
항-IL-1β 항체(IL-1β 시그널링만 차단함)가 아닌 mCAN10(IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링을 차단함)은 이미퀴모드-유도된 건선 및 만난-유도된 건선성 관절염 둘 모두의 질환 중증도를 감소시켰다.
실시예 4: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 Apoe KO 마우스에서 죽상동맥경화증 및 대동맥 플라크 염증을 감소시킨다
목표
이들 실험의 목표는 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10으로 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 아포지단백 E(Apoe) KO 마우스의 죽상동맥경화증에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하는 것이다.
재료 및 방법
암컷 Apoe KO 마우스(10-12주령)에게 고-콜레스테롤 식이(HCD; 21% 지방, 0.21% 콜레스테롤)를 공급하여 죽상동맥경화성 병변을 발달시켰다. HCD에서 4주 후, 마우스의 치료를 개시하고 마우스에게 mCAN10(1차 용량에서 20mg/kg; 후속 용량에서 10mg/kg) 또는 동일한 용량의 동형 대조군 항체를 i.p.로 6주 동안 주2회(매주 2회) 투여하였다. 이들 6주 전반에 걸쳐 마우스에게 지속적으로 HCD를 공급했다. 케이지-간 가변성을 줄이기 위해, 각 케이지에 대해 마우스를 치료 그룹 간으로 나누었다. 최종 복용 48시간 후, 마우스를 마취하고 희생시킨 후 대동맥을 수집하여 골수 세포(총 CD11b+ 세포 및 이의 Ly6G+ 호중구 하위모집단)(도 3a-c) 및 T 림프구(총 TCR-β+ 세포, 및 이의 CD4+ 및 CD8+ 하위모집단)(도 3d-f)를 포함하는 유세포분석법에 의한 면역 세포 조성에서의 변화를 연구했다. 심장을 수확하고, 대동맥 뿌리에서 섹션화하고 오일-레드 O에 의한 지질 축적을 위해 염색된 섹션과 플라크 크기를 그룹 간에 비교했다(도 4a-b).
결과
죽상동맥경화성 대동맥의 유세포분석법 분석은 mCAN10이 플라크 염증을 감소시킨다는 것을 보여준다. 이것은 CD45+ 백혈구의 감소된 수에 의해 관찰된다(도 3a). 이들 중 Ly6G+ 호중구를 포함하여 골수성 CD11b+ 세포가 감소되었다(도 3b-c). TCR-β+ 세포 또한 CD4+ 및 CD8+ 세포 둘 모두를 포함하여 수에서 감소되었다(도 3d-f). 부가적으로, mCAN10은 동형 대조군과 비교하여 HCD를 공급한 Apoe KO 마우스에서의 대동맥 플라크 부피와 영역을 유의하게 감소시켰다(도 4a-b).
결론
mCAN10에 의한 IL1RAP 차단은 죽상동맥경화증을 감소시키고 Apoe KO 마우스에서 플라크 염증을 제한한다.
실시예 5: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 실험적 자가면역 심근염에서 염증 및 섬유증을 감소시킨다
목표
이들 실험의 목표는 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10으로 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 실험적 자가면역 심근염(EAM)에서 염증 및 섬유증의 발달에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하는 것이다.
재료 및 방법
0 및 7일차에 완전 프로인트 아쥬반트, s.c.로 유화된, 100μg 마우스 α-미오신 중쇄(αMHC) 펩티드로 마우스의 면역화에 의해 수컷 BALB/c 마우스(7-8주령)에서 EAM을 유도했다. 마우스를 mCAN10(1차 용량에서 20mg/kg; 후속 용량에서 10mg/kg) 또는 동일한 용량의 동형 대조군 항체를 4주 동안 주2회 i.p.로 처리했다. PBS로 처리된 마우스는 대조군으로 포함되었다. 치료를 αMHC로 최종 면역화한지 1주 후인 14일차에 개시하였다. 실험의 종료 시점인 42일차에 마우스를 희생시키고 심장을 수집하였다. 심장을 10% 완충 포르말린으로 고정하고 파라핀에 포매하고 종단으로 절단했다. 심장당 하나의 중간 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여 0-5의 범위인 채점 시스템을 사용하여 조혈 세포에 의해 침투된 영역을 등급을 매김에 의해 좌심실(LV)에서 염증의 정도를 평가하였다(도 5a-b). 대안적으로, 심장당 하나의 중간 섹션을 섬유성 조직의 척도로서 콜라겐 침착물을 검출하기 위해 Masson의 트리크롬으로 염색했다. 섬유성 블루 영역과 전체 영역은 컴퓨터화된 면적측정(ImageJ)을 사용하여 측정되었다. 섬유성 영역은 전체 영역의 백분율로 표시된다(도 5c-d).
결과
mCAN10은 EAM-유도된 마우스로부터 심장의 H&E-염색된 섹션을 채점함에 의해 평가된 바와 같이 심근에서 침윤성 염증 세포를 유의하게 감소시켰다(도 5a-b). 부가적으로, mCAN10은 또한 Masson의 트리크롬-염색된 심장 섹션의 분석에 의해 결정된 바와 같이 심장 섬유증을 감소시켰다(도 5c-d).
결론
mCAN10은 EAM에서 염증 및 섬유증의 전개를 감소시킬 수 있다.
실시예 6: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 실험적 자가면역 심근염에서 심장 기능에서의 저하를 중화시킨다
목표
이들 실험의 목표는 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10으로 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 실험적 자가면역 심근염(EAM)에서 심장 기능에 어떻게 영향을 미치는지를 평가하는 것이다. 추가적인 목표는 이 항체의 효과를 IL-1β 시그널링만 차단하는 항-IL-1β 항체, IL-1α/β 시그널링만 차단하는 재조합 IL-1R 길항제(IL1RA) 단백질인 아나킨라, 및 항-염증성 글루코코르티코이드인 프레드니손과 비교하는 것이다.
재료 및 방법
0 및 7일차에 완전 프로인트 아쥬반트, s.c.로 유화된, 100μg 마우스 α-미오신 중쇄(αMHC) 펩티드로 마우스의 면역화에 의해 수컷 BALB/c 마우스(7-8주령)에서 EAM을 유도했다. 치료는 αMHC로 최종 면역화한 날과 같은 날인 7일차에 개시하였다. 마우스를 mCAN10(1차 용량에서 20mg/kg; 후속 용량에서 10mg/kg), 항-IL-1β 항체(0.5mg/kg), 또는 이들 항체에 대한 동일한 용량의 동형 대조군을 5주 동안 주2회 i.p.로 처리했다. 대안적으로, 마우스를 5주 동안 매일 25mg/kg에서 s.c.로 IL1RA, 5mg/kg에서 경구 위관영양에 의해 프레드니손 또는 관련 비히클 대조군으로 처리하였다. PBS로 처리된 마우스는 대조군으로 포함되었다. 심장 기능을 평가하기 위해, 연구의 시작 시점과 28일차 및 42일차에 좌심실 박출률(LVEF)을 측정하기 위해 마우스에 대해 경흉부 심초음파를 수행했다(도 6a-c).
결과
mCAN10은 동형 및 항-IL-1β 항체와 비교하여 EAM-유도된 마우스에서 LVEF의 측정에 의해 평가된 바와 같이 심장 기능을 유의하게 보존했다(도 6a). 그러나, IL1RA와 프레드니손은 그 각각의 대조군과 비교하여 심장 기능에 유의한 영향을 나타내지 않았다(도 6b). 부가적으로, mCAN10은 치료가 7일차 대신에 14일차에 개시되었을 때도 심장 기능을 보존했다(도 6c).
결론
mCAN10은 EAM-유도된 마우스에서 심장 기능에 대한 치료 효과가 있는 반면 항-IL-1β 항체, IL1RA 및 프레드니손은 그러한 효과를 입증하지 않는다.
실시예 7: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 경피성 만성 이식편대숙주병의 모델에서 피부 및 폐의 섬유증을 개선한다
목표
이들 실험의 목표는 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10으로 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 경피성 만성 이식편대숙주병(scl cGvHD)의 마우스 모델에서 섬유증에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 것이다.
재료 및 방법
뮤어라인 경피성 만성 이식편대숙주병
수령자 암컷 BALB/c 마우스(H-2d; 8주령; 그룹당 n = 10)는 700cGy로 전신 방사선 조사를 받았다. 방사선 조사 6시간 후, 모든 BALB/c(H-2d) 수령자는 동종 이식 방식에서 수컷 B10.D2 마우스(H-2d), 또는 동계에서 암컷 BALB/c 마우스(H-2d)로부터 골수를 받았다. MHC 불일치로 인해 동종으로 이식된 마우스는 피부 및 다중 내부 장기의 섬유증과 함께 scl cGvHD를 전개한다. 이식을 위해 공여자 마우스로부터 5x106 비장세포와 2x106 골수 세포를 PBS에 재현탁하고 꼬리 정맥을 통해 주입했다. 치료는 골수 이식 21일 후에 개시되었다. 동종 이식을 받은 마우스는 mCAN10(1차 용량에서 20mg/kg; 후속 용량에서 10mg/kg) 또는 동일한 용량의 동형 대조군 항체(Iso)로 4주 동안 주2회 i.p.로 처리되었다. 대안적으로, 이들 마우스는 50mg/kg에서 4주 동안 매일 p.o.로 소분자 티로신 키나제 억제제 닌테다닙으로 처리되었다. 닌테다닙은 간질성 폐질환이 있는 전신 경화증 환자의 치료에 대해 승인되었으며 여기에서 양성 대조군으로 사용된다. 동계 이식을 받은 마우스는 동형 대조군 항체로만 처리되었다. 실험의 종료인 49일차에서 마우스를 희생시키고 피부 샘플과 폐를 수집하였다.
피부 및 폐의 섬유증의 조직학적 평가
상부 등에 있는 1㎠의 정의된 영역의 피부 샘플을 4% 포르말린에서 6시간 동안 고정하고 파라핀에 포매했다. 섹션을 5μm로 자르고 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색했다. 피부 두께는 H&E 염색 섹션에서 마우스당 4개 부위에서 표피-진피 접합부와 진피-피하 지방 접합부 사이의 거리를 수동으로 측정함에 의해 100-배 확대에서 광학 현미경(Nikon Eclipse 80i)으로 캡처된 이미지를 사용하여 정량화되었다. 폐 샘플의 우엽을 유사하게 고정하고, 파라핀-포매하고, 섹션화하고 이어서 트리크롬 및 시리우스 레드로 염색했다. 조직학적 판독은 시리우스 레드-염색된 섹션(마우스당 2개 섹션)에서 총 폐 영역의 백분율로 염색된(섬유성) 영역의 평가와 폐 표본(마우스당 4개 섹션)에서 섬유화의 정도를 결정하기 위한 숫자 척도인 Ashcroft 점수로 폐의 변화의 정량화를 포함했다.
하이드록시프롤린 정량화
피부 및 폐 샘플에서 콜라겐 단백질의 양은 하이드록시프롤린의 정량화에 의해 결정되었다. 120℃에서 3시간 동안 6M 염화수소에서 단리한 후, 샘플의 pH를 6M 수산화나트륨으로 6으로 조정하였다. 이어서, 0.06M 클로라민 T를 첨가하고 샘플을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 3.15M 과염소산 및 20% p-디메틸아미노벤즈알데히드를 첨가하고 샘플을 60℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 Spectra MAX 190 마이크로플레이트 분광광도계로 557nm에서 결정했다. 유형 I 콜라겐으로 생성된 표준 곡선을 사용하여 절대값을 결정했다.
근섬유아세포의 검출
α-SMA(평활근 액틴)에 대해 양성인 근섬유아세포는 단일클론 항-α-SMA 항체(클론 1A4)와의 인큐베이션에 의해 검출되었다. 발현은 양고추냉이 퍼옥시다제-표지된 2차 항체 및 3,3-디아미노벤지딘 테트라 하이드로클로라이드(DAB)로 가시화되었다. 단일클론 마우스 IgG 항체가 대조군으로 사용되었다. αSMA에 대해 염색된 섹션의 이미지를 광학 현미경(Nikon Eclipse 80i) 상에 캡처되었다. 이미지는 200-배 배율에서 4개의 서로 다른 영역에서 수동으로 평가되었다. 근섬유아세포는 진피에서 단일, 방추-형상의 αSMA-양성 세포로 정의되었다.
결과
동종 이식은 동계 이식에 비해 증가된 피부 두께, 근섬유아세포 계수 및 하이드록시프롤린 함량을 갖는 눈에 띄는 피부 섬유증을 유발했다(도 7a-c). mCAN10으로 처리된 마우스는 동형 대조군 항체로 처리된 동종으로 이식된 마우스와 비교하여 유의하게 감소된 피부 비후(도 7a) 및 근섬유아세포 계수(도 7b), 및 콜라겐 함량의 척도인 하이드록시프롤린의 감소(도 7c)를 나타냈다. 이들 매개변수에 대한 mCAN10의 효과는 닌테다닙으로 관찰된 것의 범위 내에 있었다(도 7a-c).
동종 골수 이식은 Ashcroft 점수, 시리우스 레드에 의해 염색된 영역 및 하이드록시프롤린 함량에서 증가로 중등도 폐의 섬유증을 유발했다(도 8a-c). mCAN10으로 처리는 동형 대조군 항체로 처리된 동종으로 이식된 마우스에 비해 Ashcroft 점수(도 8a), 시리우스 레드 염색(도 8b) 및 하이드록시프롤린 함량(도 8c)을 유의하게 감소시켰다. 이들 매개변수에 대한 mCAN10의 효과는 다시 닌테다닙으로 관찰된 것의 범위 내에 있었다(도 8a-c).
mCAN10은 임상 검사, 육안 부검 또는 조직학에서 독성의 징후 없이 내약성이 우수했다. 부가적으로, mCAN10으로 처리는 scl cGvHD-유도된 체중 감소를 닌테다닙보다 더 효과적으로 개선했다(도 9).
결론
mCAN10에 의한 IL1RAP 차단은 scl cGvHD-유도된 피부 및 폐의 섬유증을 줄이는 효율적인 전략이다.
실시예 8: 마우스 IL1RAP의 특이적 억제제인 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10은 염증 과정과 관련된 유전자 발현 프로필을 변경했다
목표
이들 연구의 목표는 경피성 만성 이식편대숙주병(scl cGvHD)의 마우스 모델에서 뮤어라인 대리물 항-IL1RAP 항체 mCAN10을 사용하여 IL1RAP 차단에 의해 영향을 받는 분자의 경로를 평가하는 것이다. 목표는 또한 scl cGvHD 마우스로부터 피부에서 IL1RAP-억제에 의해 영향을 받는 질환-관련된 차등으로 발현된 유전자(DEG)를 식별하고 이를 전신 경화증(SSc) 환자로부터의 피부 생검에서 질환-관련된 유전자와 비교하는 것이다.
재료 및 방법
마우스 샘플
샘플은 실시예 7에 보고된 바와 같이 mCAN10으로 처리하거나 처리하지 않은 동계 또는 동종 이식을 받은 마우스로부터 수득되었다.
RNASeq 전처리 및 분석
원시 페어드-엔드 판독은 GRCm39 참조 게놈에 정렬되었고 매핑된 판독은 R(v 4.1.1)에서의 Rsubread(v 2.6.4)를 사용하여 계산되었다. 주성분 분석(PCA)을 수행하여 각 배치에서 샘플 사이에서 잠재적 이상치를 결정했다. PCA에 따라 3개의 샘플(조건당 1개)이 제외되었다. 각 그룹에 대해, 밀집된 그룹-특이적 클러스터링을 생성하는 4개 샘플이 선택되었다. DESeq2 패키지(v 1.32.0)를 사용하여 비율 정규화 및 차등 발현 분석의 중앙값을 수행했다. 중요한 DEG 목록은 비교를 위해 조정된 p-값 ≤ 0.05 및 |log2FC| ≥ 1.5로 간주된다.
SSc 환자의 전사체의 프로필은 143명 SSc 환자와 22명 건강한 개체로 구성된 북미 SSc 환자 코호트(NCBI/GEO/GSE130955)에서 검색되었다. 마우스와 인간 샘플 간의 비교 및 상호 발현된 유전자의 검출을 위해, 인간 오르토로그는 r 패키지 "biomaRt"(v 2.48.3)를 사용하여 뮤어라인 유전자 기호에 매핑되었다.
치료 반응 시그니쳐
샘플 크기로 인해, 유전자 조합 치료 반응 시그니쳐에 대한 기능 선택은 R 통계 패키지를 적용함에 의해 로지스틱 회귀 모델링을 사용하여 수행되었다. 로지스틱 회귀 모델은 두 그룹(이진 결과 시스템: 1[=예를 들어 치료], 0[=예를 들어 건강]) 사이의 분류를 허용하며, 여기서 단계별 기능 선택은 그룹 분류를 위한 최상의 유전자 세트 조합을 식별한다. MASS 및 ROCR 패키지를 사용하여 아카이케 정보 기준(AIC) 및 곡선하면적(AUC) 값을 기반으로 유전자 조합 모델을 선택했다. AIC 값은 통계적 유전자 조합 모델이 사용된 특징의 수를 고려하여 데이터를 얼마나 잘 기술하는지에 대한 품질 지표인 반면 AUC는 모델 성능을 기술한다.
결과
RNASeq 데이터의 분석은 동종으로-이식된 마우스(Allo), 동계로-이식된 마우스(Syn) 및 mCAN10으로 처리된 동종으로-이식된 마우스(처리됨) 사이의 분리를 나타내며, 여기서 처리된 그룹은 Syn 그룹에 가깝다. Allo 대 Syn 사이의 비교는 2308 DEG(1023 상향-, 1285 하향조절됨; 조정된 p-값 ≤ 0.05, |log2FC| ≥ 1.5)를 식별했으며, 여기서 염증 및 섬유증과 관련된 과정 및 경로의 조절완화가 관찰되었다. 반대로, 처리됨 대 Allo 사이의 비교는 495 DEG(398 상향-, 106 하향조절됨; 조정된 p-값 ≤ 0.05, |log2FC| ≥ 1.5)를 식별했으며, 여기서 염증과 관련된 여러 과정의 조절완화가 mCAN10으로 IL1RAP 억제에 의해 관찰되었다. 흥미롭게도, mCAN10은 프로필이 Allo 그룹이 아닌 Syn 그룹과 더 유사하도록 다중 IL-1 패밀리 유전자의 유전자 발현을 변경했다(도 10).
Allo DEG(Allo 대 Syn), 처리된 DEG(처리된 대 Allo) 및 SSc DEG(SSc 대 건강체; 이전에 공개된 데이터 세트 NCBI/GEO/GSE130955에서 검색된 정보) 간의 중첩의 분석은 마우스 모델(Allo 대 Syn)과 인간 데이터 세트(SSc 대 건강체) 사이의 449개 중첩하는 유전자를 식별하였다. 이 중 177개(39.4%) 유전자가 DEG의 세 그룹 모두 사이에서 중첩되었으며(도 11), 그 중 58개 유전자(20 상향-, 38 하향조절됨; 조정된 p-값 ≤ 0.05 및 |log2FC| ≥ 0.25)는 처리된 DEG와 SSc DEG 사이에서 상반되게 조절되었다.
결론
mCAN10은 scl GvHD 마우스에서 염증과 관련된 과정 및 경로에 영향을 미치며, 이는 이 모델에서 질환 징후에 대한 mCAN10의 관찰된 효과를 뒷받침한다. scl GvHD 마우스에서 mCAN10에 의해 영향을 받는 상당수의 유전자가 건강한 대조군과 비교하여 SSc 환자에서 차등적으로 발현되었으며, 이는 IL1RAP 억제가 인간 질환에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
실시예 9: 항-IL1RAP 항체를 생성하기 위한 IL1RAP로의 면역화
목표
이 실시예는 항-IL1RAP 항체가 IL1RAP로 면역화된 토끼로부터 어떻게 단리되었는지를 예시한다.
재료 및 방법
토끼를 4회 면역화한 후 주사당 0.2mg의 항원인, 인간 및 뮤어라인 IL1RAP의 재조합적으로 발현된 엑토도메인의 혼합물을 사용하여 추가면역화했다. 매 3주 후 견갑하 주사에 의해 면역화를 수행하였다. 1차 면역화는 프로인트 완전 아쥬반트에서, 2차 내지 4차 면역화는 프로인트 불완전 아쥬반트에서 수행하였다. 추가면역화를 위해 항원 양의 절반을 프로인트 불완전 아쥬반트에 견갑하로 주사하고 나머지 절반을 정맥내로 주사했다.
각 동물의 면역 반응은 3차 면역화 후 대략적으로 10일에 혈청을 사용하여 ELISA에 의해 측정되었다. 특이적 항체 역가는 면역 반응 비교를 위해 인간 및 마우스 IL1RAP로 플레이트를 별도로 코팅한 ELISA에 의해 측정되었다. 4차 면역화 2 내지 3주 후, 동물을 1회 추가면역화하고 비장을 추가면역화 4 내지 5일 후에 수집하였다. 시험 동물의 비장을 균질화하고, 세포를 동결시키고 액체 질소에 보관하였다.
단일클론 항체 서열은 Kivi 등(Kivi G, HybriFree: a robust and rapid method for the development of monoclonal antibodies from different host species. BMC Biotechnology 16:2 (2016))에 기술된 접근법을 사용하여 면역화된 토끼로부터 단리하였다. 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 플레이트를 비오티닐화된 인간 또는 뮤어라인 IL1RAP 또는 둘 모두의 혼합물로 5μg/ml에서 코팅했다. 10,000개의 비장 세포가 각 패닝에 사용되었다. 총 48개 패닝 반응이 수행되었다. 45분 동안 인큐베이션 후, 결합되지 않은 세포를 제거하기 위해 웰을 PBS로 세정하였다. RNA를 결합된 세포로부터 단리하고 VH 및 VL cDNA를 합성하여 인간 IgG 발현 플라스미드 포맷에서 조합 VH-VL 라이브러리의 구성에 사용했다. 플라스미드 DNA를 키메라 토끼/인간 IgG1 풀의 생성을 위해 정제하고 CHO 세포 안으로 형질감염시켰다. 항체 풀의 상등액을 형질감염 48시간 후 ELISA를 사용하여 분석하였고 양성 풀을 식별하였다. 양성 풀로부터 플라스미드 DNA를 함유하는 박테리아를 LB-암피실린 고체 배지 상에 도말하고 단일 콜로니를 단리하여 액체 배지에서 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 액체 배양물로부터 정제하고 일시적인 항체 생성을 위해 CHO 세포 안으로 형질감염시켰다. 상등액을 형질감염 48-72시간 후에 ELISA에 의해 분석하였다.
결과
인간 및/또는 뮤어라인 IL1RAP에 결합하는 항체가 식별되었다. 키메라 토끼/인간 IgG1 ELISA IL1RAP 양성 클론을 시퀀싱에 의해 추가로 분석했다. 키메라 항체는 예를 들어 IL-1, IL-33 또는 IL-36 시그널링을 억제하는 능력과 같이, 그의 특성에서 추가로 분석되었다. 키메라 항체 48D2는 추가 특성화 및 최적화를 위해 선택되었다(다음 실시예 참조). 이 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호: 20의 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 전체 항체를 만들기 위해, 가변 영역을 서열번호: 35의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 불변 영역 및 서열번호: 36 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 IgG1 중쇄 불변 영역과 조합했다.
결론
IL1RAP에 대해 지향된 단일클론 키메라 토끼/인간 IgG1 항체가 단리되었다.
실시예 10: IL1RAP에 결합하고 IL-1, IL-33 및 IL-36 시그널링을 차단하는 항체의 식별 및 특성화
목표
이 실시예는 실시예 9에 기술된 바와 같이 생성된 선택된 항체, 48D2 키메라(ch) 토끼/인간 항-인간 IL1RAP의 특성화를 예시한다. 목표는 사이노몰거스 원숭이와 인간 IL1RAP 둘 모두에 대해 높은 친화성을 갖고 모든 IL1RAP 조절된 시그널링 경로를 완전하게 차단하는 항체를 식별하는 것이었다.
재료 및 방법
IL1RAP-발현 세포에 대한 항체의 결합
세포 표면 상에 IL1RAP를 발현하는 악성인 흑색종(또는 악성 흑색종) 세포주 SKMEL-5를 분석에 사용하였다. SKMEL-5 세포를 표준 절차에 따라 배양하였다. 5x104 SKMEL-5 세포를 인간 Fc 블록으로 차단한 다음 키메라 48D2 또는 동형 대조군 항체의 8-단계 일련의 희석액(100μg/ml - 0.03μg/ml)으로 염색했다. Alexa488-접합된 항-인간 IgG 항체를 사용한 2차 염색에 이어서, 10000개 세포/샘플을 CytoFlex(Beckman Coulter)에서 분석했다. 낮은 수준의 표면 IL1RAP를 발현하는 HTB183 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
사이토카인 시그널링의 억제
IL-1 및 IL-33 억제의 분석을 위해, HEK-Blue™(IL-33/IL-1) 세포를 제공된 대로 사용했다. IL-36 분석을 위해 HEK-Blue™(IL-33/IL-1) 세포를 검정 전날 IL-36 수용체로 일시적으로 형질감염시키거나 또는 IL-36 수용체의 안정적인 발현이 있는 HEK-Blue™ 클론(집에서 생성됨)을 사용했다. 간단히 말해서, HEK-Blue™ 세포를 384-웰 플레이트에 시딩하고 계속하기 전에 최소 2시간 동안 침전되도록 했다. 그런 다음 세포를 증가하는 농도의 키메라 48D2(도면에 묘사됨)에 노출시키고 사이토카인의 첨가 전에 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 사이토카인을 다음 농도로 첨가하였다: 2ng/ml IL-1α, 0.1ng/ml IL-1β, 0.2ng/ml IL-33, 1ng/ml IL-36α, 3ng/ml IL-36β 및 0.2ng/ml IL-36γ. 세포를 37℃, 5% CO2에서 16-18시간 동안 배양한 다음 SpectraMax i3x 분광광도계를 사용하여 620nm에서 측정한 QUANTI-Blue™ 용액을 사용하여 NF-κB의 활성화 및 SEAP의 후속 생산에 대해 분석했다.
키메라 48D2의 발현 및 정제
키메라 48D2는 CHO 세포에서 일시적으로 발현되었다. 정제는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과를 사용하여 수행되었다.
생물층 간섭계에 의한 친화도 측정
친화성 측정은 Molecular Devices로부터의 BLItz Pro 1.3.1.3 소프트웨어에서 기본 동역학 모듈을 사용하여 ForteBio로부터의 BLItz™ 라벨-유리 단백질 분석 시스템에서 수행되었다. 단백질 A 바이오센서는 코팅 전에 실온에서 최소 10분 동안 차단 완충액(PBS, 0.5% BSA, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)에서 수화되었다. 단백질 A 바이오센서는 실온에서 30분 동안 200μl의 항체 용액(차단 완충액에서 10μg/ml)에 바이오센서를 침지시킴에 의해 항체로 코팅되었다. 그런 다음 센서를 사용하기 전에 적어도 10분 동안 200μl 차단 완충액에서 인큐베이션되었다. 각각의 항체는 차단 완충액에서 hIL1RAP(21-367)의 4가지 상이한 농도; 0.8nM(0.032μg/ml), 4nM(0.16μg/ml), 20nM(0.8μg/ml) 및 100nM(4μg/ml)에서 분석되었다. 기준선은 지속 시간이 30초인 차단 완충액에서 만들어졌다. hIL1RAP에서 120초 동안 연관이 이루어진 후 차단 완충액에서 120초 해리되었다.
도메인 매핑
IL1RAP 엑토도메인은 3개 도메인(도메인 1, 도메인 2, 도메인 3)으로 구성된다. 48D2가 IL1RAP에 결합하는 위치를 이해하기 위해 서로 다른 도메인에 해당하는 일련의 IL1RAP 작제물을 생성하고 이중 샘플을 사용하여 간접 ELISA 검정에서 이들에 대한 결합을 테스트했다. 작제물은 Uniprot, ID Q9NPH3에 제공된 IL1RAP에 대한 아미노산 서열을 사용하여 생성했다. 마이크로타이터 플레이트를 pH 7.4, 0.01M PBS에 희석된 100ng의 재조합 hIL1RAP 도메인1+2+3(도메인 1, 도메인 2 및 도메인 3으로 구성)(aa21-367)(양성 대조군), 재조합 hIL1RAP 도메인1+2(도메인 1 및 도메인 2로 구성)(aa21-234), 도메인1(aa21-134) 또는 재조합 hIL1RAP 도메인3(aa235-367)(100μl/웰)로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 플레이트를 ELISA 세정 완충액(0.01M PBS, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)으로 세정한 후 150μl/웰의 ELISA 차단 용액(PBS, 0.5% BSA, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)을 사용한 차단 단계가 이어졌다. 교반하면서 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 ELISA 세정 완충액을 사용하여 다시 세정하였다. ELISA 차단 용액에서 일련의 48D2 희석액(1 내지 10000ng/ml 범위)을 준비한 다음 웰에 100μl/웰로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 교반하면서 인큐베이션한 후 ELISA 세정 용액으로 세정하였다. 알카라인 포스파타제에 접합된 염소 항-인간 IgG 100μl/웰을 첨가하고 교반하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 세정 용액을 사용하여 플레이트를 세정한 후 기질(4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물, Sigma-Aldrich, 1mg/ml), 100 μl/웰을 첨가했다. 그 후 플레이트를 실온에서 교반하면서 인큐베이션하고 405nm에서 흡광도를 30분 동안 연속적으로 측정하였다. 0분에서의 흡광도를 배경 신호로 취했다. 다클론성 항-hIL1RAP 항체 KMT-1을 대조군으로 사용하였다.
에피토프 매핑
도메인 맵핑 및 교차 반응성 데이터에 기반하여, IL1RAP의 도메인 2에서의 2개 영역이 aa 141-157(H1로 지정됨) 및 174-191(H2로 지정됨)(Uniprot, ID Q9NPH3으로부터 인간 IL1RAP 아미노산 서열에 기반함)에 상응하는 48D2(인간화된 및 탈-면역화된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4(실시예 13 참조))에 대한 잠재적 상호작용 부위로 식별되었다. 뮤어라인/인간 IL1RAP의 2개의 키메라 작제물이 생성되었으며, 여기서 2개의 관심있는 영역의 인간 서열이 뮤어라인 IL1RAP: 키메라 IL1RAP.H1 및 키메라 IL1RAP.H2 상에 그래프팅되었다. 마이크로타이터 플레이트를 키메라 IL1RAP 작제물로 코팅하고 ELISA 측정을 도메인 맵핑에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 다클론성 항-hIL1RAP 항체 KMT-2(인간 IL1RAP에 대한 친화성 정제된 토끼 다클론성 항체) 및 KMT-3(뮤어라인 IL1RAP에 대한 친화성 정제된 토끼 다클론성 항체)를 양성 대조군으로 사용하였다.
교차 반응성
마이크로타이터 플레이트 웰을 IL1RAP 오르토로그(무스 무스큘러스, 라투스 노르베기쿠스, 마카카 파시큘라리스(Mf, 사이노몰거스 원숭이와 동의어), 오릭토라구스 큐니큘러스, 카니스 루푸스 파밀리아리스, 수스 스크로파)로 코팅하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 세정한 후 차단 단계가 이어졌다. 교반하면서 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 다시 세정하였다. 항체를 ELISA 차단 용액에서 4000ng/ml 내지 0.24ng/ml의 범위인 4배수 일련의 희석액으로 희석한 다음 ELISA 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 교반하면서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 세정하였다. 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-인간 항체를 첨가하고 교반하면서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 세정한 다음 기질(4-니트로페닐 포스페이트 이나트륨 염 6수화물)을 첨가했다. 그 후 플레이트를 교반하면서 실온에서 인큐베이션하고 405nm에서 흡광도를 50분 동안 연속적으로 측정하였다. 0분에서의 흡광도를 배경 신호로 취했다.
결과
IL1RAP-발현 세포에 대한 항체의 결합
키메라 48D2 또는 동형 대조군으로 염색된 IL1RAP-발현 SKMEL-5 세포의 유세포분석법 분석은 동형 대조군 항체와 비교하여 48D2에 대해 더 높은 평균 형광 강도(MFI)를 밝혔다(도 12). 48D2 및 동형 대조군을 증가하는 농도에서 세포에 첨가한다. IL1RAP의 낮은 표면 발현을 갖는 HTB183 세포에 대한 결합은 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
사이토카인 시그널링의 억제
도 13은 HEK 세포에서 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 시그널링에 대한 ch48D2의 억제성 활성을 나타낸다. 항체를 증가하는 농도로 첨가한 다음 묘사된 사이토카인을 일정한 농도로 첨가했다. 그래프는 사이토카인 수용체의 시그널링 다운스트림를 나타내는 높은 OD와 함께 620nm에서의 광학 밀도(OD) 값을 나타낸다. 키메라 항체 48D2는, 이들 사이토카인의 시그널링의 완전히 억제(차단)까지 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 시그널링의 뚜렷한 억제를 유도하였다. IC50 값은 표 3에 나타나 있다.
표 3: HEK-Blue™ 검정에서 얻은 상이한 시그널링 경로에 대한 키메라 48D2의 IC50 값[nM]
친화성 측정
키메라 48D2, 뿐만 아니라 인간화된 48D2 변이체 VH5:VL4(실시예 11 참조) 및 인간화된 및 탈-면역화된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4(실시예 13 참조)에 대한 친화성 측정 결과를 표 4에 나타내었다. k a 는 표적에 결합하는 항체의 특성화를 위한 회합 속도 상수이고, k d 는 표적으로부터 항체 해리의 특성화를 위한 해리 속도 상수이고, K D 는 항체와 그의 항원 사이의 평형 해리 상수, k d /k a 의 비율이다. K D 는 항원 결합 부위의 50%가 평형에서 점유되는 항체 농도에 해당한다. K D 값이 낮을수록(농도가 낮을수록) 친화성이 높다.
48D2 변이체는 인간(h) IL1RAP에 대한 빠른 결합 및 느린 해리를 나타내어 nM 범위의 친화성을 생성했다. 인간 IL1RAP에 대한 친화성의 손실은 키메라 48D2와 비교하여 인간화된, 또는 인간화된 및 탈-면역화된 변이체에 대해 관찰되지 않았다.
표 4: 친화성 측정
도메인 매핑
도메인 매핑 데이터는 아래 표 5에 요약되어 있다. 대조군 다클론성 항체 KMT-1은 모든 도메인에 결합한 반면, 48D2는 도메인 2를 함유하는 IL1RAP 작제물에만 결합하여, 항체가 이 도메인에 결합함을 시사한다.
표 5: 키메라 48D2의 도메인 맵핑
에피토프 매핑
영역 H1 및 H2에 대한 그라프팅된 인간 서열로 뮤어라인 IL1RAP를 사용한 에피토프 맵핑 결과는 표 6에 도시되어 있다. 뮤어라인 IL1RAP에 결합하는 h48D2 VH5.GL:VL4(실시예 13 참조)는 H2 영역에 대한 인간 서열이 뮤어라인 IL1RAP에 도입될 때 복원되어, H2가 48D2와의 상호작용에 관여함을 시사한다(표 5 및 6 비교). 양성 대조군 다클론성 항체 KMT-2 및 KMT-3은 IL1RAP의 양 키메라 버전에 결합했다.
표 6: 키메라 IL1RAP를 사용한 48D2의 에피토프 매핑
교차 반응성
도 14는 상이한 종으로부터의 IL1RAP에 대한 키메라 48D2의 교차 반응성을 나타낸다. 항체는 증가하는 농도로 첨가되고 405nm에서의 흡광도는 IL1RAP 오르토로그에 대한 항체의 결합을 검출하는데 사용된다. 48D2는 인간, 사이노몰거스 원숭이(cyno) 및 피그로부터 IL1RAP에 대해 교차 반응성이 있지만, 마우스, 랫트, 토끼 또는 개로부터의 IL1RAP에 대해서는 교차 반응성이 없다(도 14 및 표 7).
표 7: 키메라 48D2의 교차 반응성
결론
키메라 48D2는 hIL1RAP의 도메인 2에 결합하고, 사이노몰거스 원숭이와 인간 IL1RAP 둘 모두에 대해 높은 친화성을 갖고, 세포막에서 IL1RAP에 선택적으로 결합하고, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β, 및 IL-36γ 시그널링을 완전하게 억제하고, 따라서 인간화를 위해 선택되었다. 키메라 48D2는 실시예 9에 기재된 바와 같이 생성된 다른 항체보다 우수한 특성을 나타냈다.
실시예 11: 키메라 48D2의 인간화
목표
이 실시예는 48D2의 인간화된 변이체를 얻은 방법을 예시한다.
재료 및 방법
인-실리코
인간화
48D2의 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열을 성숙 인간 항체 서열 및 인간 생식계열 항체 서열을 함유하는 데이터베이스에 대해 검색하였다. CDR은 IMGT 및 Kabat 넘버링 시스템에 따라 정의되었고 아미노산 잔기는 둘 모두의 조합으로 포함되었다(서열번호: 1, 3 내지 18, 뿐만 아니라 KAS 서열을 갖는 CDR-L2 참조). 인간화를 위한 억셉터 프레임워크의 선택은 서열 상동성 및 소프트웨어 도구 Maestro를 사용하여 생성된 후속 순이론적 구조 예측을 기반으로 했다. 프레임워크는 주요 구조적 프레임워크 잔류물을 유지하기 위해 선택되었다. VL 및 VH에 대해 각각 5개의 서열을 얻었고, 추가로 특성화하기 위해 25개의 상이한 인간화된 항체 변이체를 생성하였다(VL1-VL5는 VH1-VH5와 조합함). 인간 생식계열 항체 서열에 기반한 억셉터 프레임워크의 경우, 항체의 구조 및 기능을 보장하기 위해 역돌연변이를 도입하였다. 인간화의 일부는 또한 면역원성(MHC 클래스 II 결합 친화성) 및 제조가능성의 예측이었다. MHC 클래스 II 결합 친화성 예측은 NetMHCII 서버를 사용하여 수행되었다.
결과
VL의 5개 인-실리코 인간화된 변이체와 VH의 5개를 생성하고 인간화된 항체의 WHO의 정의에 따라 인간화되었음을 확인했다. 잠재적인 MHC 클래스 II 결합 친화성을 갖는 서열을 도입하는 것을 피하기 위해 면역원성을 평가하였다. 탈아미드화, 이성체화 또는 단편화 경향이 있는 글리코실화 모티프 또는 서열을 도입하는 것을 피하기 위해 제조가능성을 평가하였다. 서열은 표 8에 묘사되어 있다.
표 8: VL 및 VH의 인-실리코 인간화된 변이체(48D2)
결론
VL의 5개 인-실리코 인간화된 변이체 및 VH의 5개를 생성하고, 25개의 인간화된 항체 변이체의 생성 및 특성화를 위해 IgG1 불변 도메인으로 인-프레임 합성되도록 하였다(실시예 12 참조).
실시예 12: 인간화된 48D2의 특성화
목표
이 실시예는 인간화된 48D2 변이체(실시예 11 참조)가 유지된 친화성, 사이토카인 억제 및 최적화된 생화학적 특성을 갖는 인간화된 항체를 찾는 목표로 어떻게 발현되고 특성화되었는지를 예시한다.
재료 및 방법
인간화된 변이체의 발현, 정제 및 특성화
48D2의 25개 인간화된 변이체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(표 8 참조)을 인간 불변 도메인을 함유하는 벡터 안으로 서브-클로닝하였다:
- 카파 불변 도메인(Km3 알로타입의 것)은 전체 경쇄(서열번호: 35)를 형성하는 VL 도메인과 조합된다.
- IgG1za(za 알로타입의 것) 중쇄 불변 도메인은 전체 중쇄를 형성하는 VH 도메인과 조합된다. 중쇄 불변 도메인은 또한 Fc-감마-수용체 매개된 항체 이펙터 기능을 피하기 위해 LALA 돌연변이(서열번호: 2)(예를 들어, Xu 등, 2000, Cell. Immuno. 200: 16-26에 기재된 것에 상응함)를 함유하였다.
인간화된 항체(h48D2)를 HEK-293 세포에서 일시적으로 발현시키고, 50ml 배양물의 수확된 배지로부터 단백질 A-정제하고 PBS pH 7.4로 완충액-교환하였다.
항체는 A) 결합(ELISA 분석, 인간 및 사이노몰거스 원숭이 IL1RAP), B) 사이토카인 시그널링의 억제(HEK-Blue™ 검정), C) 친화성(생체-층 간섭계), D) 크기 이질성(SE-HPLC) 및 E) 수율(농도, A280)에 대해 특성화되었다. 결합 ELISA는 코팅 시약으로서 재조합 hIL1RAP aa21-367 또는 재조합 mfIL1RAP aa21-367을 사용하여 실시예 10에서 도메인 매핑을 위해 제시된 간접 ELISA와 유사한 방식으로 수행되었다. SE-HPLC는 표준 절차 및 실행 완충액로서 PBS를 사용하여 수행되었다. 친화성 및 사이토카인 억제는 실시예 10에 이미 기재된 바와 같이 측정되었다. 25개의 모든 인간화된 클론이 IL-1α, IL-1β 및 IL-33 시그널링에 대한 차단 활성에 대해 분석된 반면, 키메라 48D2와 유사한 억제 활성을 유지한 클론만 IL-36 억제에 대해 분석되었다.
결과
A) IL1RAP에 대한 인간화된 항체 클론의 결합(ELISA)
ELISA 측정을 사용하여 얻은 IC50 값은 표 9에 나타나 있다. 결합 ELISA를 사용하면 서로 다른 클론 사이에 결합에서의 작은 차이만 관찰될 수 있다. 또한, 각각의 클론에 대해, 인간 및 사이노몰거스 원숭이(cyno) IL1RAP에 대한 결합 친화성은 유사하였다.
표 9: IL1RAP에 대한 인간화된 항체 클론의 결합
B) 사이토카인 시그널링의 억제
도 15a-o는 HEK 세포에서 IL-1α, IL-1β 및 IL-33 시그널링에 대한 인간화된 48D2 항체 클론의 억제 활성을 나타낸다. 항체를 증가하는 농도로 첨가한 다음 묘사된 사이토카인을 일정한 농도에서 첨가한다. 그래프는 사이토카인 수용체의 시그널링 다운스트림를 나타내는 높은 OD로 620nm에서의 광학 밀도(OD) 값을 보여준다. VH5 변이체를 보유하는 항체 클론은 키메라 48D2 항체와 유사한 효능으로 IL-1α, IL-1β 및 IL-33 시그널링의 완전한 억제를 유도하였다(도 15e, 15j, 15o). 변이체 VH1-VH4를 보유하는 항체 클론은 IL-1α, IL-1β 및 IL-33의 시그널링을 키메라 48D2와 비교하여 다양한 효능으로 다양한 정도로 억제하였다. 부분적 억제는 IL-1α(도 15a-d) 및 IL-33(도 15k-n)과 관련하여 이들 변이체에 의해 달성되었고; 완전한 억제는 IL-1β(도 15f-i)와 관련하여 달성되었다. 변이체 VH1-VH4를 보유하는 항체 클론은 IL-36 억제에 대해 분석되지 않았다. 각각의 IC50 값을 표 10에 나타나 있다. 도 15p-r은 VH5 변이체를 보유하는 항체 클론이 또한 키메라 48D2 항체와 유사한 효능으로 IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 시그널링의 완전한 억제를 유도함을 보여준다.
표 10: HEK-Blue™ 검정으로부터 인간화된 항체의 IC50 값[nM]
C) 친화성 측정
인간 IL1RAP에 대한 친화성에 대한 KD 값은 인간화된 48D2 변이체에 대해 표 11에 도시되어 있다. 친화성은 생물-층 간섭계를 사용하여 측정되었다. 모든 항체 변이체는 나노몰 범위에서 친화성을 나타냈다. 가장 높은 친화성은 1-4nM의 범위에서 KD 값을 갖는 VH5 시리즈에 대해 수득되었다. 또한 키메라 48D2, 인간화된 48D2 변이체 VH5:VL4, 및 인간화된 및 탈-면역화된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 직접 비교에 대해서는 표 4를 참조한다.
표 11: 인간화된 항체의 친화성 측정
D) 크기 이질성
크기 이질성은 크기-배제 HPLC(SE-HPLC)를 사용하여 결정되었다(표 12). 온전한 단량체 항체는 이황화 결합에 의해 함께 공유적으로 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된다. 고-분자량(HMW) 종은 잠재적으로 가용성 항체 응집체, 예를 들어 이량체를 함유한다. 저-분자량(LMW) 종은 잠재적으로, 예를 들어 펩티드 결합이 절단된 항체, 즉 단편화된 항체를 함유한다. 거의 모든 변이체는 >5% 고-분자량 종(HMW)을 함유하는 h48D2 VH4:VL3을 제외하고는 고도로 단량체성(≥97%)이었다. 모든 분석된 변이체에 대해 저-분자량(LMW) 종은 소량도 검출되지 않았다.
표 12: 인간화된 항체의 크기 이질성 분석
E) 수율
인간화된 48D2 변이체의 경우, 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도 측정을 사용하여 결정되었고 수율은 50ml 배양물에 대해 계산되었다(표 13). VL은 VL4 변이체로 얻어진 가장 높은 수율과 VL3 변이체로 얻어진 가장 낮은 수율로 수율에 영향을 미쳤다. 따라서, 수율은 VL 서열에 부분적으로 의존하였다.
표 13: 인간화된 항체의 수율
결론
VH5 변이체를 보유하는 인간화된 항체 변이체는 키메라 48D2 항체와 유사한 효능으로 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 시그널링을 완전하게 억제하는 전체 능력을 유지했다. 변이체 VH1-VH4를 보유하는 항체 변이체는 키메라 48D2와 비교하여 다양한 효능으로 IL-1β의 시그널링을 완전하게 억제하고 IL-1α 및 IL-33의 시그널링을 부분적으로 억제했다. 인간 IL1RAP에 대한 친화성은 VH5 시리즈에서 가장 높았고, 이 시리즈 내에서 변이체 h48D2 VH5:VL4 및 h48D2 VH5:VL5 둘 모두는 SE-HPLC에서 우수한 수율과 높은 단량체 함량을 얻었다. 따라서, 이들 변이체를 사용하여 추가 연구가 추진되었다.
실시예 13: 인간화된 48D2 클론 중 2개의 탈면역화
목표
이 실시예는 MHC 클래스 II 분자에 대해 예측된 친화성을 갖는 h48D2 VL5 및 VH5에서의 서열이 어떻게 생식계열화에 의해 탈-면역화되는지를 예시한다.
재료 및 방법
MHC 클래스 II 분자에 대해 예측된 친화성을 갖는 서열의 제거
인간화된 48D2 VL5 및 VH5 서열을 생식계열 항체 서열을 사용하여 생성하였다. 이들 2개의 서열에 대해, 보유된 항체 구조 및 기능을 보장하기 위해 원래의 토끼 서열에 대한 다수의 역돌연변이가 도입되었다(실시예 11 참조). 이들 도입된 역돌연변이는 MHC 클래스 II 분자에 대해 예측된 친화성을 갖는 서열을 발생시켰다.
VH5의 경우 프레임워크 영역 2에서 2개의 역돌연변이는 잠재적인 면역원성을 초래했고, VL5의 경우 프레임워크 영역 1에서 6개의 역돌연변이가 있다. VH5의 탈-면역화 경우, 역돌연변이는 단일 돌연변이 및 두 잔기의 돌연변이로서 생식계열 서열로 복귀되었다(결과적으로 3개의 상이한 서열 변이체를 생성함). VL5의 경우, 6개의 모든 역돌연변이가 하나의 새로운 서열로서 생식계열 서열로 복귀되었다(결과적으로 하나의 서열 변이체를 생성함).
이것은 탈-면역화된 VH5에 대한 다음의 새로운 서열:
h48D2 VH5.AP(알라닌에서 프롤린으로)(서열번호: 32),
h48D2 VH5.SK(세린에서 라이신으로)(서열번호: 33),
h48D2.VH5.GL("생식계열", 두 잔기 모두 생식계열 서열로 복귀됨)(서열번호: 34);
및 탈-면역화된 VL5에 대한 다음의 새로운 서열을 초래했다;
h48D2 VL5.GL("생식계열", 6개 잔기 모두 생식계열 서열로 복귀됨)(서열번호: 31).
결과 및 결론
탈-면역화를 VL5 및 VH5에 대해 수행하였다. 새로운 VL5 및 VH5는 h48D2 VL4, h48D2 VL5 및 h48D2 VH5에 대해 이전에 수득된 서열과 조합되었고, 따라서 발현 및 특성화를 위한 10개의 새로운 추가 변이체를 생성했다:
h48D2 VH5:VL5.GL
h48D2 VH5.AP:VL4
h48D2 VH5.AP:VL5
h48D2 VH5.AP:VL5.GL
h48D2 VH5.SK:VL4
h48D2 VH5.SK:VL5
h48D2 VH5.SK:VL5.GL
h48D2 VH5.GL:VL4
h48D2 VH5.GL:VL5
h48D2 VH5.GL:VL5.GL
실시예 14: 인간화된 탈-면역화된 48D2 클론의 특성화
목표
이 실시예는 인간화되고 탈-면역화된 48D2 변이체가 어떻게 발현되고 유지된 친화성, 사이토카인 억제 및 최적화된 생화학적 특성을 갖는 인간화되고 탈-면역화된 항체를 찾는 목적으로 특성화되었는지를 예시한다.
재료 및 방법
탈-면역화된 h48D2의 발현, 정제 및 특성화
발현, 정제 및 특성화를 실시예 10 및 12에서 키메라 48D2 및 인간화된 변이체에 대해 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과
IL1RAP에 대한 인간화되고 탈-면역화된 항체 클론의 결합(ELISA)
ELISA 측정을 사용하여 수득된 IC50 값은 탈-면역화된 h48D 변이체에 대해 표 14에 나타나 있다. 결합 ELISA를 사용하여, 서로 다른 변이체 간에 결합에서의 작은 차이만 볼 수 있다. 각각의 클론에 대해, 인간 및 사이노몰거스 원숭이(cyno) IL1RAP에 대한 결합 친화성은 유사하였다.
표 14: IL1RAP에 대한 인간화되고 탈-면역화된 항체 클론의 결합
IL1RAP 발현 세포에 대한 인간화되고 탈-면역화된 항체 클론의 결합
h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL 또는 동형 대조군으로 염색된 IL1RAP-발현 SKMEL-5 세포의 유세포분석법 분석은 항체가 증가하는 농도에서 첨가될 때 동형 대조군 항체와 비교하여 VH5.GL:VL4 및 VH5.GL:VL5.GL에 대해 더 높은 평균 형광 강도(MFI)를 밝힌다(도 16).
사이토카인 시그널링의 억제
도 17은 HEK 세포에서 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ 시그널링에 대한 인간화되고 탈-면역화된 48D2 항체 클론의 억제 활성을 나타낸다. 항체는 증가하는 농도에서 첨가되었고 묘사된 사이토카인은 일정한 농도에서 첨가되었다. 인간화된 변이체 h48D2 VH5:VL4 및 h48D2 VH5:VL5는 대조군으로 포함되었다. 그래프는 사이토카인 수용체의 시그널링 다운스트림를 나타내는 높은 OD와 함께 620nm에서의 OD 값을 나타낸다. 모든 변이체는 IL-1α(a), IL-1β(b), IL-33(c), IL-36α(d), IL-36β(e) 및 IL-36γ(f)에 대해 유지된 억제 효과를 나타냈다. IC50 값은 표 15에 나타나 있다.
표 15: 탈-면역화된 항체 클론의 IC50 값[nM]
도 17a-f의 결과를 얻기 위해 사용된 실험 설정에서, HEK-Blue™(IL-33/IL-1) 세포를 전날 IL-36 수용체로 일시적으로 형질감염시켰다. 이어서, IL-36 수용체로 안정적으로 형질감염된 HEK-Blue™ 세포를 사용하여 h48D2 VH5.GL:VL4에 대해 IL-33 및 IL-36 사이토카인 시그널링의 억제의 추가 평가를 수행하였다. 이 평가로부터의 결과는 또한 IL-33(도 17g) IL-36α(도 17h), IL-36β(도 17i) 및 IL-36γ(도 17j)에 대한 억제 효과를 나타낸다. IC50 값은 표 16에 나타나 있다.
표 16: h48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 IC50 값[nM]
친화성 측정
인간 IL1RAP에 대한 친화도에 대한 KD 값은 탈면역화된 h48D2 변이체에 대해 표 17에 나타나 있다. 친화성은 생물-층 간섭계를 사용하여 측정되었다. 친화성은 1-2nM의 KD 값을 갖는 모든 탈-면역화된 변이체에 대해 유사하였다. 48D2, 인간화된 48D2 및 탈-면역화된 h48D2의 직접 비교에 대해서는 표 4를 참조한다.
표 17: 탈-면역화된 h48D2 항체의 친화성 측정
크기 이질성
크기-이질성은 크기-배제 HPLC(SE-HPLC)를 사용하여 결정되었다(표 18). 거의 모든 변이체는 일부 HMW 종을 함유하는 VL5.GL을 갖는 h48D2 변이체를 제외하고 고도로 단량체성(≥98%)이였다. 분석된 모든 변이체에 대해 LMW 종은 검출되지 않았다.
표 18: 탈-면역화된 h48D2 항체의 크기 이질성 분석
수율
탈-면역화된 h48D2 변이체에 대해, 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도 측정을 사용하여 결정되었고 수율은 50ml 배양물에 대해 계산되었다(표 19). VL 변이체 VL5.GL을 보유하는 항체 변이체는 다른 변이체에 비해 낮은 획득가능한 수율을 나타냈다.
표 19: 탈-면역화된 h48D2 항체의 수율
교차 반응성
도 18은 상이한 종으로부터의 IL1RAP에 대한 h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL의 교차 반응성을 나타낸다. 항체는 증가하는 농도에서 첨가되고 405nm에서의 흡광도는 IL1RAP에 대한 결합을 검출하는데 사용된다. 키메라 48D2의 경우, 인간화되고 탈-면역화된 변이체 h48D2 VH5.GL:VL4 및 h48D2 VH5.GL:VL5.GL은 사이노몰거스 원숭이(cyno) 및 피그의 IL1RAP에 대해 교차 반응성이었지만, 마우스, 랫트, 토끼 또는 개로부터의 IL1RAP에 대해서는 교차 반응성을 갖지 않는다(도 18 및 표 20).
표 20: h48D2 VH5.GL:VL4 및 VH5.GL.VL5.GL의 교차 반응성
결론
모든 탈-면역화된 변이체는 1-3 nM에서 K D 값으로 친화성을 나타내었고 생물학적 기능을 유지했다. 변이체 h48D2 VH5.GL:VL4는 SE-HPLC에서 우수한 수율 및 높은 단량체의 함량으로 탁월했다.
실시예 15: 키메라 48D2의 ADCC 효과
목표
이 실시예는 hIgG1-야생형(WT) 또는 이펙터-기능 사일런트 IgG1-LALA 포맷에서 발현될 때 키메라 48D2의 항체-의존성 세포독성(ADCC) 효과를 조사하는 것을 목표로 했다.
재료 및 방법
세포 표면 상에 IL1RAP를 발현하는 악성 흑색종 세포주 SKMEL-5를 시험관내 ADCC 검정을 위한 표적으로 사용하였다. 표적 세포를 웰당 10000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트 안으로 시딩하였다. 이어서, 48D2-WT, 48D2-LALA 또는 동형 대조군 항체를 상이한 농도에서 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션한 후 100000개 NK 이펙터 세포를 각 웰에 첨가하였다. NK 세포를 제조업체의 지침(Miltenyi Biotech, 독일 베르기슈 글라드바흐 소재)에 따라 NK 세포 음성 세포 단리 키트를 사용함에 의해 백혈구 농축액으로부터 추출했다. 비-특이적 인간 IgG1-WT 및 IgG1-LALA 항체가 실험에서 대조군으로 사용되었다. 세포 사멸의 정도는 배양 18시간 후 FACS LSR Fortessa 유세포분석기(BD)를 사용한 DAPI 양성 세포의 검출에 의해 평가되었다.
결과
시험관내 ADCC 검정은 hIgG1 포맷에서 키메라 48D2가 NK 세포에 항체-특이적, 용량-의존적 방식으로 SKMEL-5 세포를 사멸하도록 지시함을 보여준다(도 19). 동형 대조군 및 처리되지 않은 세포(처리되지 않은 세포는 0ng/ml 항체에 상응함)와 비교하여 hIgG1-LALA 포맷에서 발현된 키메라 48D2로 처리 후 죽은 SKMEL-5 세포의 백분율에서 증가가 없었다.
효과는 용량-의존적인 것으로 나타났다. 키메라 48D2가 hIgG1-LALA 포맷에서 발현될 때 ADCC 효과가 사라진다. 48D2 항체의 항체 변이체(예컨대, 상기 실시예에 기재된 항체, 예를 들어 인간화된, 또는 인간화되고 탈-면역화된 항체 변이체)는 hIgG1-WT 또는 hIgG1 LALA 포맷에서 발현될 때 유사한 효과를 가질 수 있다고 가정할 수 있다. 실제로, 하기 실시예 19는 hIgG1 LALA 포맷에서 항체 변이체 VH5.GL:VL4가 혈액 루프 검정에서 Fc-매개된 면역 활성화를 유도하지 않는다는 것을 입증한다.
결론
실험은 48D2가 NK 세포에 표면에 IL1RAP를 발현하는 흑색종 세포주의 특정 세포 사멸에 대해 지시할 수 있고 48D2에 의해 유도된 세포독성 효과는 용량-의존적임을 보여준다. 더욱이, ADCC 효과는 48D2를 이펙터 기능 사일런트 hIgG1-LALA 포맷에서 발현함에 의해 폐지될 수 있다.
실시예 16: 키메라 48D2에 의한 인간 섬유모세포에서 사이토카인 시그널링의 억제
목표
이 실시예의 목표는 시험관내 인간 섬유아세포에서 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ-자극된 IL-6 유전자 발현에 대한 키메라 48D2의 억제 활성을 조사하는 것이다.
재료 및 방법
건강한 인간 피부로부터 섬유아세포를 상업적으로 획득하고 완전한 섬유아세포 성장 배지에서 성장시켰다. 75000개 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 시딩하였다. 80% 컨플루언트 세포는 밤새 1% FBS만 함유하는 섬유아세포 배지에서 혈청이 고갈되었다. 배지는 1% FBS를 갖고 성장 인자가 없는 새로운 섬유아세포 배지로 변경되었고, 20ug/ml 키메라 48D2는 상이한 농도의 사이토카인으로 자극하기 1시간 전에 웰에 첨가되었다(도 20에 묘사됨). 세포를 24시간 동안 자극한 후 제조업체의 지침에 따라 RNA를 단리했다. IL-6 mRNA 수준은 SYBR Green을 사용하여 분석하였고 데이터는 ΔΔCT 방법을 사용하여 분석하였고 처리되지 않은 대조군과 비교하여 배수 변화 2-ΔΔCT로 나타내었다.
결과
IL-1α, IL-1β, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ는 피부 섬유아세포에서 용량-의존적 방식으로 IL-6 유전자 발현을 유도하였다(도 20). 이 실험에서, 키메라 48D2는 유전자 발현에서의 증가를 비자극된 대조군과 비슷한 수준까지 억제했다. IL-33은 이들 세포에서 IL-6 발현에 영향을 미치지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 48D2 항체의 항체 변이체(예컨대 상기 실시예에서 기술된 항체, 예를 들어 인간화된, 또는 인간화되고 탈-면역화된 항체 변이체)가 유사한 효과를 가질 수 있다고 가정할 수 있다. 실제로, 실시예 17은 항체 변이체 VH5.GL:VL4가 인간 전혈에서 IL-1β 시그널링을 억제함을 입증한다.
결론
48D2는 인간 섬유아세포에서 IL-6 유전자 발현에서 사이토카인-유도된 증가를 차단할 수 있다.
실시예 17: 48D2 변이체 VH5.GL:VL4에 의한 인간 전혈에서의 IL-1β 시그널링의 억제
목표
이 연구의 목적은 48D2 변이체 VH5.GL:VL4와 인간 전혈의 사전-인큐베이션에 의해 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 IL-1β로 자극에 반응하여 다양한 다운스트림 사이토카인 및 케모카인의 방출에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것이다.
재료 및 방법
인간 혈액은 헤파린 튜브에서의 두 상이한 공여자로부터 수집되었다. 혈액을 96-웰 플레이트의 웰로 옮기고 교반하는 동안 30분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 150μg/ml VH5.GL:VL4와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 IL-1β 또는 LPS를 둘 모두 1ng/ml로 웰에 첨가하고, 혈액을 교반하는 동안 30분 동안 37℃ 및 5% CO2에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 혈액 샘플이 제형 완충액만으로 인큐베이션된 웰은 음성 대조군(Ctrl)으로 포함되었다. 플레이트를 1500rpm에서 원심분리하여 혈액 세포로부터 혈장을 분리했다. 혈장을 1:2로 희석하고 71개의 서로 다른 사이토카인 및 케모카인(6CKine, BCA-1, CTACK, EGF, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3, FGF-2, Flt3L, 프랙탈킨, G- CSF, GM-CSF, GROα/CXCL1, I-309, IFNα2, IFNγ, IL-1α, IL-1β, IL-1RA, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL- 17F, IL-18, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-28, IL-33, IP-10, LIF, MCP-1, MCP-2, MCP- 3, MCP-4, M-CSF, MDC, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1δ, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, sCD40L, SCF, SDF-1α+β, TARC, TGFα, TNFα, TNFβ, TPO, TRAIL, TSLP, VEGF-A)의 수준을 제조업체의 지침에 따라 인간 사이토카인/케모카인 71-플렉스 디스커버리 어세이 어레이(Eve Technologies; HD71)의 사용에 의해 혈장 샘플에서 측정하였다. 이들 중 4가지인 G-CSF, GROα/CXCL1, IL-17A 및 TNF-α에 대한 결과는 아래에 논의된다.
결과
VH5.GL:VL4에 의한 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단은 IL-1β로 자극에 반응하여 인간 전혈에서 G-CSF, GROα/CXCL1, IL-17A 및 TNF-α의 방출을 감소시켰다(도 21a-d). VH5.GL:VL4가 G-CSF, GROα/CXCL1 및 TNF-α의 수준을 현저하게 감소시키고 IL-17A의 수준을 약간 감소시켰기 때문에, 혈액이 LPS로 자극되었을 때 유사한 효과가 관찰되었다(도 21a-d).
결론
VH5.GL:VL4에 의한 IL1RAP 차단은 IL-1β 및 LPS에 의해 매개되는 IL-1R 시그널링의 다운스트림 효과에 영향을 미쳐 다중 사이토카인 및 케모카인의 방출이 감소된다.
실시예 18: 48D2 변이체 VH5.GL:VL4에 의한 혈액-루프 시스템에서의 IL-1β 시그널링의 억제
목표
이 연구의 목적은 48D2 변이체 VH5.GL:VL4로 인간 전혈의 사전-인큐베이션에 의한 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단이 인간 혈액 순환을 모방하는 혈액-루프 시스템에서 IL-1β로 자극에 반응하여 IL-6 및 IL-8의 방출에 어떻게 영향을 미치는지 조사하는 것이다.
재료 및 방법
신선한 전혈을 10명의 건강한 공여자로부터 수집하고 소량의 용해성 헤파린을 첨가했다. 혈액은 즉시 사전-코팅된 플라스틱 튜브로 옮겨져 혈액-루프 시스템의 루프를 형성했다. 루프를 회전하는 휠 상에 놓고 샘플을 병렬로 실행했다. VH5.GL:VL4는 32μg/ml에서 샘플에 투여되었고 1ng/ml에서의 IL-1β는 15분 후에 첨가되었다. PBS를 대조군으로 사용하였다. 각 루프는 4시간 후에 샘플링되었고 EDTA는 샘플링 시점에서 반응을 중지하기 위해 각 샘플에 10mM의 농도로 첨가되었다. 혈장 샘플을 원심분리에 의해 준비하고, 분주하고 추가 사이토카인 분석까지 ≤-60℃에서 보관했다.
사이토카인 IL-6 및 IL-8은 Meso Scale Discovery로부터 MULTI-ARRAY® 기술을 사용하여 측정되었다. 모든 샘플을 1:4로 희석하고 제조업체의 지침에 따라 샘플을 이중으로 실행했다.
결과
VH5.GL:VL4에 의한 IL-1α/β, IL-33 및 IL-36α/β/γ 시그널링의 차단은 IL-1β로 자극에 대한 반응에서 혈액-루프 시스템에서 순환하는 인간 전혈에서 IL-6 및 IL-8의 방출을 감소시켰다(도 22a-b).
결론
인간 혈액 순환을 모방한 혈액-루프 시스템에서, VH5.GL:VL4에 의한 IL1RAP 차단은 IL-1β에 의해 매개된 IL-1R 시그널링의 다운스트림 효과에 영향을 미쳐 사이토카인 IL-6 및 IL-8의 방출이 감소된다.
실시예 19: IL1RAP-발현 세포에 의한 48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 내재화
목표
이 실험의 목표는 IL1RAP-발현 세포에 의한 형광으로-표지된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 막 결합 및 잠재적 내재화를 조사하는 것이다.
재료 및 방법
WT 및 IL1RAP KO SKMEL 인간 흑색종 세포를 60-80% 컨플루언스로 성장시키고 이어서 웰당 12500개 세포로 8-웰 Ibidi-처리 현미경 챔버 슬라이드로 옮겼다. 세포를 3μg/ml AlexaFluor647 (AF647)-접합된 VH5.GL:VL4로 37℃에서 1, 2 또는 4시간 동안 인큐베이션했다. 대조군 세포를 AF647-접합된 동형 대조군 항체로 인큐베이션하였다. 대안적으로, A647-접합된 VH5.GL:VL4로 2시간 동안 인큐베이션된 WT SKMEL 세포는 각각 엔도좀 및 리소좀 마커에 대해 염색하기 위해 3시간 동안 5μg/ml 토끼 항-EEA1 항체 및 10μg/ml 마우스 항-Lamp1 항체로 추가로 인큐베이션되었다. 세포를 세정하고 AlexaFluor488(AF488)-접합된 항-토끼 항체 및 로다민(RX)-접합된 항-마우스 항체로 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서, 세포를 세정하고 2% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 세포를 다시 세정하고 이어서 DAPI로 표지하여 세포 핵을 염색했다. Zeiss LSM800 공초점 현미경을 사용하여 63x 오일 침지 렌즈로 세포를 분석했다. 검출 수준은 A647-접합된 VH5.GL:VL4, 또는 항-EEA1 또는 항-Lamp1로 인큐베이션되지 않은 대조군 세포로부터 설정되었고, 분석 전반에 걸쳐 동일한 설정이 사용되었다. 쌍방향 시각적 분석이 세포를 통해 스캔된 500nm 광학 섹션과 캡처된 대표적인 이미지에 대해 수행되었다.
결과
A647-접합된 VH5.GL:VL4의 초기 막 결합 및 세포 내재화는 인큐베이션 1시간 후에 검출가능한, IL1RAP-발현 WT SKMEL 세포에 대해 입증되었다(도 23; 상단 좌측 이미지; 화살표는 막 결합 및 내재화를 나타냄). 최대 내재화는 대략 2시간의 인큐베이션에서 표시되었다(도 23; 상단 중앙 이미지). IL1RAP KO 세포에 의한 A647-접합된 VH5.GL:VL4의 결합 및 내재화의 결여는 WT 세포에서 관찰된 효과가 IL1RAP와의 상호작용에 의해 매개된다는 것을 나타낸다(도 23; 중앙 줄; DAPI에 의한 핵의 염색만 관찰됨). 더욱이, WT 세포에 대한 동형 대조군 항체에 대한 결합 또는 내재화는 관찰되지 않았다(도 23; 하단 줄; DAPI에 의한 핵의 염색만이 관찰됨). 각각 엔도좀 및 리소좀에 대한 마커인 EEA1 및 Lamp1에 대한 추가적인 공동-염색은 A647-표지된 VH5.GL:VL4에 대한 신호와 중첩을 나타낸다(도 24). 이는 VH5.GL:VL4가 내재화 시 이들 구획으로 국지화된다는 것을 나타낸다.
결론
VH5.GL:VL4는 IL1RAP-발현 SKMEL 세포에 결합 시 내재화된다. 이 내재화는 IL1RAP에 대한 VH5.GL:VL4의 결합에 의존한다.
실시예 20: 48D2 변이체 VH5.GL:VL4에 의한 혈액-루프 시스템에서의 Fc-매개된 면역 활성화
목표
이 연구의 목적은 이펙터 기능 사일런트 hIgG1-LALA 포맷에서 발현된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4가 인간 혈액 순환을 모방한 혈액-루프 시스템에서 다른 자극의 부재에서 면역 활성화를 유도할 수 있는지 여부와 그 정도를 조사하는 것이다. 면역 활성화는 향염증성 사이토카인의 방출 및 순환하는 인간 전혈에서의 보체 활성화에 의해 평가될 것이다.
재료 및 방법
신선한 전혈을 10명의 건강한 공여자로부터 수집하고 소량의 가용성 헤파린을 보체 시스템에 대한 약물-관련된 효과를 분석할 수 있도록 첨가했다. 혈액을 사전-코팅된 플라스틱 튜브로 즉시 옮겨 혈액-루프 시스템의 루프를 형성한 다음 0.0125mg/ml, 0.125mg/ml 또는 1.25mg/ml에서 VH5.GL:VL4를 첨가했다. 항-CD52 항체 알렘투주맙이 3μg/ml로 첨가된 샘플 또는 제형 완충액만(비히클)을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 루프를 회전하는 휠 상에 놓고 샘플을 병렬로 실행했다. 각 루프는 15분 및 4시간 후 샘플링되었고, 샘플링 시점에서 반응을 중지시키기 위해 각 샘플에 10mM의 농도로 EDTA를 첨가하였다. 15분에 수집된 샘플은 보체 분석을 위해 혈장으로 처리된 반면 4시간에 수집된 혈액 샘플은 사이토카인 분석을 위해 혈장으로 처리되었다. 혈장 샘플은 원심분리에 의해 준비하고, 분주하여 분석할 때까지 ≤-60℃에서 보관했다.
사이토카인 IFNγ, IL-6, IL-8, TNFα는 Meso Scale Discovery로부터 MULTI-ARRAY® 기술을 사용하여 측정되었다. 모든 샘플을 1:4로 희석하고 제조업체의 지침에 따라 샘플을 이중으로 실행했다.
보체 활성화는 ELISA 키트(RayBio® Human C3a ELISA Kit 및 RayBio® Human C5a ELISA Kit)를 사용하여 보체 분할 생성물 C3a 및 C5a의 측정에 의해 분석되었다. 혈장 샘플을 C3a 분석을 위한 샘플 희석제로 1:500으로 희석하고 C5a 분석을 위한 샘플 희석제로 1:50으로 희석하고 제조업체의 지침에 따라 이중으로 실행했다.
결과
VH5.GL:VL4는 임의의 평가된 3가지 농도에서의 혈액-루프 시스템에서, IFNγ, IL-6, IL-8 또는 TNFα의 방출(도 25a-d) 또는 C3a 및 C5a의 수준에 의해 측정된 보체 활성화(도 26a-b)에 대해 어떠한 영향도 나타내지 않았다. 대조적으로, 항-CD52 항체 알렘투주맙은 사이토카인 방출뿐만 아니라 보체 활성화를 유도하였다.
결론
이펙터 기능 사일런트 Fc 영역을 갖는 VH5.GL:VL4는 Fc-매개된 면역 활성화를 유도하지 않는다.
실시예 21: 정맥내로 투여된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 초기 안전성 및 약물- 및 독성동태학적 특성
목표
이 연구의 목표는 수컷 및 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 최대 허용 용량까지 3단계 증량 용량으로 단일 용량으로 정맥내로 투여된 VH5.GL:VL4의 약동학 및 잠재적 독성을 결정하는 것이다.
재료 및 방법
VH5.GL:VL4는 평가된 각 용량 수준에 대해 한 마리 수컷 및 한 마리 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 단일 용량(볼루스)으로 말초 정맥을 통해 5, 20 또는 50mg/kg으로 정맥내로 투여되었다. 동물은 투여 후 2주 동안 매일 사망률, 임상 징후 및 음식 소비에 대해 관찰되었다. 혈액학 및 혈청 화학은 사전-테스트 및 연구 8일차에 수행되었다. 체중은 사전-테스트 및 8일차와 15일차에 기록되었다. 생체분석 및 독성동태학적 평가를 위한 샘플링은 투여-전 및 투여 후 0.083, 1, 3, 6, 24, 48, 96, 168, 264 및 336시간에서 대퇴 정맥을 통해 수집되었다(각 샘플링에 대해 적어도 0.6ml 혈액). 혈액 샘플을 실온에서 30분 동안 혈청 분리를 위해 튜브에서 응고시켰다. 응고물을 4℃에서 10분 동안 1200g에서 원심분리에 의해 회전시켰다. 생성된 혈청은 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.
비오티닐화된 인간 IL1RAP를 스트렙타비딘으로 사전-코팅된 Meso Scale Discovery(MSD) 플레이트에 첨가하고 실온에서 인큐베이션했다. 세정 후, 혈청 샘플을 플레이트에 첨가한 후 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세정하고 전기화학발광 라벨(MSD SULFO-TAG)에 접합된 항-인간 IgG를 플레이트에 첨가하였다. 최종 인큐베이션 및 세정 후 판독 완충액를 첨가했다. SULFO-TAG는 MSD 기기에서의 전압이 플레이트 전극에 가해질 때 빛을 방출한다. 기기는 샘플에서 VH5.GL:VL4의 정량적 측정을 제공하기 위해 방출된 빛의 강도를 측정한다. 혈청 독성동태학 분석은 WinNonlin 패키지(v. 8.1, Pharsight Inc, Certara Company, USA)를 사용하여 표준 비구획 접근법에 따라 수행하였다.
결과
체중 및 임상 병리학 조사에서 비정상적인 임상 징후 및 관련 독성 변화가 없었다. 혈청 화학 및 혈액학에서 독성학적으로 관련된 변화는 관찰되지 않았다.
조사된 용량 범위에서, 화합물의 용량-정규화된 최대 농도는 유사했다. 각 용량 수준에서, VH5.GL:VL4의 남성 및 여성 혈청 독성동태 매개변수는 유사했다. VH5.GL:VL4의 말단 반감기는 평균적으로 5mg/kg 용량 후 98시간(4일)이었다; 20mg/kg 및 50mg/kg 용량 후 220시간(9일) 정도의 매개변수는 5mg/kg에서의 것보다 2-배 더 높았다(표 21). VH5.GL:VL4는 이중-지수 방식으로 감소하는 것으로 밝혀졌다(도 27). 모든 용량 후, VH5.GL:VL4의 혈청 청소율은 낮았고 말단기의 분포 부피는 원숭이 총 체수분과 동일한 크기 정도의 것이었다(≒ 700 ml/kg).
표 21: 사이노몰거스 원숭이에게 5, 20 및 50mg/kg의 단일 정맥내 투여 후 VH5.GL:VL4의 독성동력학 매개변수
결론
사이노몰거스 원숭이에게 VH5.GL:VL4의 단일 정맥내 투여 후, 항체의 약동학은 낮은 청소율, 낮은 분포 부피 및 긴 반감기를 특징으로 했다. 조사된 용량 범위에서, 화합물의 최대 농도가 용량에 정비례하여 증가한 반면, 50mg/kg에서의 AUClast는 용량에 정비례에서보다 더 증가하는 경향을 보였다.
실시예 22: 피하로 투여된 48D2 변이체 VH5.GL:VL4의 약동학적 특성
목표
이 연구의 목표는 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 항체의 단일 피하 투여 후 VH5.GL:VL4의 약동학 및 생체이용률을 결정하는 것이다.
재료 및 방법
VH5.GL:VL4는 투여의 경로당 2마리의 암컷 사이노몰거스 원숭이에게 단일 용량으로 10mg/kg에서 등 부위에 정맥내로 또는 피하로 투여되었다. 약동학적 평가를 위한 샘플링은 투여-전 및 투여 후 1, 3, 6, 24, 48, 96, 168, 264, 336, 480 및 672시간에 수집되었다(각 샘플링에 대해 적어도 0.6ml 혈액). 추가로, 제1 용량은 정맥내 투여 후 0.083시간 및 피하 투여 후 0.5시간에 수집하였다. 실온에서 30분 동안 혈청 분리를 위해 혈액 샘플을 튜브에서 응고시켰다. 응고물을 4℃에서 10분 동안 1200g에서 원심분리에 의해 회전시켰다. 생성된 혈청은 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다.
혈청을 실시예 21에 기재된 바와 같이 MSD에 의해 분석하였다. VH5.GL:VL4에 대한 혈청 약동학적 분석을 Phoenix-WinNonlin 패키지(Certara Company, USA)를 사용하여 수행하였다.
결과
암컷 사이노몰거스 원숭이에게 10mg/kg의 VH5.GL:VL4의 단일 정맥내 투여 후, VH5.GL:VL4의 혈청 농도는 평균 86.9시간의 말단 반감기로 감소했다(도 28 및 표 22). VH5.GL:VL4의 혈청 청소율 및 분포의 부피 둘 모두 낮았다. 분포의 부피는 원숭이에서 전체 체수분의 대략적으로 10분의 1을 차지했다(표 22).
VH5.GL:VL4의 10mg/kg 용량의 피하 투여 후, 화합물의 흡수는 느려서 투여-후 48-96시간의 Tmax를 초래했다(도 28 및 표 23). Cmax에 도달한 후, 화합물의 혈청 농도는 평균 112시간의 평균 말단 반감기로 감소하였다(표 23). 피하 생체이용률은 93%로 높았다.
표 22: 사이노몰거스 원숭이에게 10mg/kg의 단일 정맥내 투여 후 VH5.GL:VL4의 약동학적 매개변수
표 23: 사이노몰거스 원숭이에게 10mg/kg의 단일 피하 투여 후 VH5.GL:VL4의 약동학적 매개변수
결론
사이노몰거스 원숭이에게 10mg/kg VH5.GL:VL4의 단일 정맥내 투여 후, 화합물의 약동학은 낮은 청소율 및 분포의 부피 및 긴 반감기를 특징으로 했다. 10mg/kg VH5.GL:VL4의 피하 투여 후, 화합물의 흡수는 느렸다. Cmax에 도달한 후, 화합물의 혈청 농도는 정맥내 투여 후의 것과 유사한 평균 말단 반감기로 감소하였다. 피하 생체이용률이 높았다.
서열
CDR 서열(IMGT에 따라 정의됨)
서열번호: 1
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
ESISTA
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KAS
서열번호: 3
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
서열번호: 4
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
GPSLSHFD
서열번호: 5
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
ISPGVST
서열번호: 6
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
CDR 서열 (Kabat에 따라 정의됨)
서열번호: 7
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
QASESISTALA
서열번호: 8
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KASTLPS
서열번호: 9
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
서열번호: 10
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
HFDIT
서열번호: 11
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
서열번호: 12
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
GGVGSSWKAFDL
CDR 서열 (IMGT 및 Kabat의 조합에 따라 정의됨)
서열번호: 13
가변 경쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-L1)
QASESISTALA
서열번호: 14
가변 경쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-L2)
KASTLPS
서열번호: 15
가변 경쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-L3)
QQGFSSGNVHNA
서열번호: 16
가변 중쇄 상보성-결정 영역 1 (CDR-H1)
GPSLSHFDIT
서열번호: 17
가변 중쇄 상보성-결정 영역 2 (CDR-H2)
TISPGVSTYYASWAKS
서열번호: 18
가변 중쇄 상보성-결정 영역 3 (CDR-H3)
ARGGVGSSWKAFDL
각 CDR-정의 범주(i) Kabat, ii) IMGT 또는 iii) IMGT와 Kabat의 조합) 내에서, CDR 서열(각각 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3)은 키메라 항체 48D2 및 이의 모든 최적화된 항체 변이체 예컨대 인간화된 항체 변이체 또는 인간화된/탈-면역화된 항체 변이체에 대해 동일하다(아래 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 서열에 표시된 것 참조.
- 굵게 강조 표시된 CDR 잔기는 IMGT 넘버링 시스템을 사용하여 식별되었고,
- 밑줄로 강조 표시된 CDR 잔기는 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 식별되었고
- IMGT와 Kabat 넘버링 시스템의 조합(굵은 서열과 밑줄쳐진 서열의 조합)에 의해 정의된 CDR 잔기
키메라 48D2 항체에서와 같은 가변 사슬 영역
(비-인간화된, 비-면역화된)(예를 들어 실시예 9 및 10에서의 것)
서열번호: 19
경쇄 가변 영역 (비-인간화된, 탈-면역화된)
APVLTQTPASVEVAVGGTVTIKCQAS ESISTA LAWYQQKPGQPPKLLIY KAS TLPSGVSSRFKGSGSGTEFALTISDLECDDAATYYC QQGFSSGNVHNA FGGGTEVVVK
서열번호: 20
중쇄 가변 영역 (비-인간화된, 탈-면역화된)
QEQLEESGGGLVKPGGSLTLTCTVSGPSLS HFD ITWVRQAPGSGLEWIGT ISPGVST YYASWAKSRSTITSNTNLNTVTLKMTSLTAADTATYFCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTISS
인간화된 가변 사슬 영역
(예를 들어 실시예 11 및 12에서의 것)
서열번호: 21
인간화된 경쇄 가변 영역 VL1
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQAS ESISTA LAWYQQKPGKAPKLLIY KAS TLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQGFSSGNVHNA FGGGTKVVIK
서열번호: 22
인간화된 경쇄 가변 영역 VL2
QIVLTQSPATLSASVGDRVTITCQAS ESISTA LAWYQQKPGKAPKLLIY KAS TLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDSATYYC QQGFSSGNVHNA FGQGTKLEIK
서열번호: 23
인간화된 경쇄 가변 영역 VL3
DILLTQTPSVVSASVGDRVTITCQAS ESISTA LAWYQQKPGQAPRLLIY KAS TLPSGVPSRFRGSGSGTDFTLTITSLQPEDFATYYC QQGFSSGNVHNA FGGGTRLEIK
서열번호: 24
인간화된 경쇄 가변 영역 VL4
ELVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQAS ESISTA LAWYQQKPGKAPKLLIY KAS TLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYC QQGFSSGNVHNA FGGGTKVEIK
서열번호: 25
인간화된 경쇄 가변 영역 VL5
APVLTQSPATLEASVGDRVTITCQAS ESISTA LAWYQQKPGQPPKLLIY KAS TLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISDLESDDAATYYC QQGFSSGNVHNA FGGGTEVVVK
서열번호: 26
인간화된 중쇄 가변 영역 VH1
EVQLEESGGGLVKPGGSLRLSCAASGPSLS HFD ITWVRQAPGKGLEWVST ISPGVST YYASWAKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GGVGSSWKAFDL WGRGTLVTVSS
서열번호: 27
인간화된 중쇄 가변 영역 VH2
EVQLVESGGALVQPGGSLRLSCIVSGPSLS HFD ITWFRQAPGKGLEWVAT ISPGVST YYASWAKSRFTISTDTSKNTLFLQMDSLRAEDTAVYYCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTVSS
서열번호: 28
인간화된 중쇄 가변 영역 VH3
EVQLLESGGGLVLPGGSLRLSCAASGPSLS HFD ITWVRQAPGKGLEWVST ISPGVST YYASWAKSRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAR GGVGSSWKAFDL WGLGTTVTVSS
서열번호: 29
인간화된 중쇄 가변 영역 VH4
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGPSLS HFD ITWIRQPPGKGLEWIGT ISPGVST YYASWAKSRFTISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTATYYCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTVSS
서열번호: 30
인간화된 중쇄 가변 영역 VH5
QEQLEESGGGLVKPGGTLSLTCTVSGPSLS HFD ITWIRQAPGSGLEWIGT ISPGVST YYASWAKSRVTISVDTSLNTVSLKLSSVTAADTATYFCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTISS
인간화되고 탈-면역화된 가변 사슬 영역
(예를 들어 실시예 13 및 14에서의 것)
굵고 이태릭체인 아미노-산 잔기는 탈-면역화 과정 동안 복귀된 잔기를 나타낸다.
서열번호: 31
인간화되고 탈-면역화된 VL5.GL
DIQM TQSP S TL S ASVGDRVTITCQAS ESISTA LAWYQQKPGQPPKLLIY KAS TLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISDLESDDAATYYC QQGFSSGNVHNA FGGGTEVVVK
서열번호: 32
인간화되고 탈-면역화된 VH5.AP
QEQLEESGGGLVKPGGTLSLTCTVSGPSLS HFD ITWIRQ P PGSGLEWIGT ISPGVST YYASWAKSRVTISVDTSLNTVSLKLSSVTAADTATYFCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTISS
서열번호: 33
인간화되고 탈-면역화된 VH5.SK
QEQLEESGGGLVKPGGTLSLTCTVSGPSLS HFD ITWIRQAPG K GLEWIGT ISPGVST YYASWAKSRVTISVDTSLNTVSLKLSSVTAADTATYFCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTISS
서열번호: 34
인간화되고 탈-면역화된 VH5.GL
QEQLEESGGGLVKPGGTLSLTCTVSGPSLS HFD ITWIRQ P PG K GLEWIGT ISPGVST YYASWAKSRVTISVDTSLNTVSLKLSSVTAADTATYFCAR GGVGSSWKAFDL WGPGTLVTISS
불변 영역
서열번호: 35
면역글로불린 카파 불변 경쇄(경쇄 불변 영역)(Km3 알로타입)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
굵고 밑줄쳐진 아미노-산 잔기는 LALA-돌연변이가 도입될 때 변경되는 잔기를 나타낸다.
서열번호: 36
면역글로불린 IgG1 불변 중쇄(중쇄 불변 영역)(za 알로타입)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호: 2
'LALA' 돌연변이를 갖는 면역글로불린 IgG1 불변 중쇄(중쇄 불변 영역)(za 알로타입)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
인간 IL1RAP
서열번호: 37
전장 인간 IL1RAP
MTLLWCVVSLYFYGILQSDASERCDDWGLDTMRQIQVFEDEPARIKCPLFEHFLKFNYSTAHSAGLTLIWYWTRQDRDLEEPINFRLPENRISKEKDVLWFRPTLLNDTGNYTCMLRNTTYCSKVAFPLEVVQKDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVVGSPKNAVPPVIHSPNDHVVYEKEPGEELLIPCTVYFSFLMDSRNEVWWTIDGKKPDDITIDVTINESISHSRTEDETRTQILSIKKVTSEDLKRSYVCHARSAKGEVAKAAKVKQKGNRCGQ
서열번호: 38
IL1RAP의 도메인 2
KDSCFNSPMKLPVHKLYIEYGIQRITCPNVDGYFPSSVKPTITWYMGCYKIQNFNNVIPEGMNLSFLIALISNNGNYTCVVTYPENGRTFHLTRTLTVKVV
서열번호: 39
인간 IL1RAP의 도메인 2의 H2 영역
TITWYMGCYKIQNFNNVI
SEQUENCE LISTING
<110> Cantargia AB
<120> Anti-IL1RAP antibody
<130> CANBG/P79764PC
<150> EP20216926.4
<151> 2020-12-23
<150> GB2105933.2
<151> 2021-04-26
<150> EP21212368.1
<151> 2021-12-03
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> CDR-L1 according to IMGT
<400> 1
Glu Ser Ile Ser Thr Ala
1 5
<210> 2
<211> 329
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(329)
<223> Immunoglobulin IgG1 constant heavy chain with LALA mutation
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> CDR-L3 according to IMGT
<400> 3
Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn Val His Asn Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(8)
<223> CDR-H1 according to IMGT
<400> 4
Gly Pro Ser Leu Ser His Phe Asp
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR-H2 according to IMGT
<400> 5
Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> CDR-H3 according to IMGT
<400> 6
Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR-L1 according to Kabat
<400> 7
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR-L2 according to Kabat
<400> 8
Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> CDR-L3 according to Kabat
<400> 9
Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn Val His Asn Ala
1 5 10
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> CDR-H1 according to Kabat
<400> 10
His Phe Asp Ile Thr
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> CDR-H2 according to Kabat
<400> 11
Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> CDR-H3 according to Kabat
<400> 12
Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR-L1 according to combination of IMGT and Kabat
<400> 13
Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR-L2 according to combination of IMGT and Kabat
<400> 14
Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(12)
<223> CDR-L3 according to combination of IMGT and Kabat
<400> 15
Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn Val His Asn Ala
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> CDR-H1 according to combination of IMGT and Kabat
<400> 16
Gly Pro Ser Leu Ser His Phe Asp Ile Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(16)
<223> CDR-H2 according to combination of IMGT and Kabat
<400> 17
Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
1 5 10 15
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> CDR-H3 according to combination of IMGT and Kabat
<400> 18
Ala Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Light chain variable region (non-humanized, non-deimmunized)
<400> 19
Ala Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Heavy chain variable region (non-humanized, non-deimmunized)
<400> 20
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Ser Thr Ile Thr Ser Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Lys Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Humanized light chain variable region VL1
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Val Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Humanized light chain variable region VL2
<400> 22
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Humanized light chain variable region VL3
<400> 23
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Thr Pro Ser Val Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Humanized light chain variable region VL4
<400> 24
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 25
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Humanized light chain variable region VL5
<400> 25
Ala Pro Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Glu Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized heavy chain variable region VH1
<400> 26
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Arg
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized heavy chain variable region VH2
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized heavy chain variable region VH3
<400> 28
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Leu
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized heavy chain variable region VH4
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized heavy chain variable region VH5
<400> 30
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Humanized and de-immunized VL5.GL
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65 70 75 80
Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Ser Ser Gly Asn
85 90 95
Val His Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized and de-immunized VH5.AP
<400> 32
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Ser Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized and de-immunized VH5.SK
<400> 33
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 34
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> Humanized and de-immunized VH5.GL
<400> 34
Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser Leu Ser His Phe
20 25 30
Asp Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Pro Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Leu Asn Thr Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Val Gly Ser Ser Trp Lys Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> Immunoglobulin kappa constant light chain
<400> 35
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 36
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(330)
<223> Immunoglobulin IgG1 constant heavy chain
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 37
<211> 356
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(356)
<223> Full-length human IL1RAP
<400> 37
Met Thr Leu Leu Trp Cys Val Val Ser Leu Tyr Phe Tyr Gly Ile Leu
1 5 10 15
Gln Ser Asp Ala Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met
20 25 30
Arg Gln Ile Gln Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro
35 40 45
Leu Phe Glu His Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala
50 55 60
Gly Leu Thr Leu Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu
65 70 75 80
Glu Pro Ile Asn Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys
85 90 95
Asp Val Leu Trp Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Met Leu Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro
115 120 125
Leu Glu Val Val Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu
130 135 140
Pro Val His Lys Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys
145 150 155 160
Pro Asn Val Asp Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr
165 170 175
Trp Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro
180 185 190
Glu Gly Met Asn Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly
195 200 205
Asn Tyr Thr Cys Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His
210 215 220
Leu Thr Arg Thr Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala
225 230 235 240
Val Pro Pro Val Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys
245 250 255
Glu Pro Gly Glu Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe
260 265 270
Leu Met Asp Ser Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys
275 280 285
Pro Asp Asp Ile Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His
290 295 300
Ser Arg Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys
305 310 315 320
Val Thr Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser
325 330 335
Ala Lys Gly Glu Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Gly Asn
340 345 350
Arg Cys Gly Gln
355
<210> 38
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(101)
<223> Domain 2 of IL1RAP
<400> 38
Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro Val His Lys Leu
1 5 10 15
Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro Asn Val Asp Gly
20 25 30
Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly Cys
35 40 45
Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu Gly Met Asn Leu
50 55 60
Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly Asn Tyr Thr Cys Val
65 70 75 80
Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His Leu Thr Arg Thr Leu
85 90 95
Thr Val Lys Val Val
100
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(18)
<223> H2 region of domain 2 of human IL1RAP
<400> 39
Thr Ile Thr Trp Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn
1 5 10 15
Val Ile
Claims (126)
- 인터류킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAP)에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은,
a) ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L1;
b) KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L2; 및
c) QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-L3
를 포함하는 경쇄 가변 영역,
및/또는
d) GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H1;
e) ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H2; 및
f) ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR-H3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은,
a) ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-L1;
b) KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-L2; 및
c) QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-L3
을 포함하는 경쇄 가변 영역,
및/또는
d) GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-H1;
e) ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-H2; 및
f) ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 CDR-H3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, IL1RAP는 인간 IL1RAP인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IL1RAP는 세포의 표면 상에서 발현되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL1RAP의 도메인 2에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
ESISTA(서열번호: 1), QASESISTALA(서열번호: 7) 및 QASESISTALA(서열번호: 13)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고;
KAS, KASTLPS(서열번호: 8) 및 KASTLPS(서열번호: 14)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고/되거나;
QQGFSSGNVHNA(서열번호: 3), QQGFSSGNVHNA(서열번호: 9) 및 QQGFSSGNVHNA(서열번호: 15)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 19의 아미노산 서열;
또는 서열번호: 19에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24 및 서열번호: 25로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
또는 서열번호: 21, 서열번호: 22, 서열번호: 23, 서열번호: 24 또는 서열번호: 25에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 31의 아미노산 서열;
또는 서열번호: 31에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며, 조건부로 5개 이하의 아미노산, 예컨대 4개 아미노산, 3개 이하의 아미노산, 예컨대 2개 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
GPSLSHFD(서열번호: 4), HFDIT(서열번호: 10) 및 GPSLSHFDIT(서열번호: 16)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고;
ISPGVST(서열번호: 5), TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 11) 및 TISPGVSTYYASWAKS(서열번호: 17)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되고/되거나;
ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 6), GGVGSSWKAFDL(서열번호: 12) 및 ARGGVGSSWKAFDL(서열번호: 18)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 20의 아미노산 서열;
또는 서열번호: 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29 및 서열번호: 30으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
또는 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29 또는 서열번호: 30에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 32, 서열번호: 33 및 서열번호: 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열;
또는 서열번호: 32, 서열번호: 33 또는 서열번호: 34에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며, 조건부로 5개 이하의 아미노산, 예컨대 4개 아미노산, 3개 이하의 아미노산, 예컨대 2개 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역,
또는 서열번호: 19 또는 서열번호: 20에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a) 서열번호: 21을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
b) 서열번호: 21을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
c) 서열번호: 21을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
d) 서열번호: 21을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
e) 서열번호: 21을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
f) 서열번호: 22를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
g) 서열번호: 22를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
h) 서열번호: 22를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
i) 서열번호: 22를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
j) 서열번호: 22를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
k) 서열번호: 23을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
l) 서열번호: 23을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
m) 서열번호: 23을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
n) 서열번호: 23을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
o) 서열번호: 23을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
p) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
q) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
r) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
s) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
t) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
u) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 26을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
v) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 27을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
w) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 28을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
x) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 29를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역; 또는
y) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
또는 서열번호: 21 내지 서열번호: 30 중 어느 하나에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
b) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 32를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
c) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
d) 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
e) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
f) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 32를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
g) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
h) 서열번호: 25를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
i) 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 30을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
j) 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 32를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
k) 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 33을 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역; 또는
l) 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역;
또는 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 31, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33 또는 서열번호: 34에 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 24를 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 31을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 가변 영역 및 서열번호: 34를 포함하거나 이로 구성된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며, 조건부로 5개 이하의 아미노산, 예컨대 4개 아미노산, 3개 이하의 아미노산, 예컨대 2개 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제22항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 경쇄인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제22항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 경쇄인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 35의 아미노산 서열,
또는 서열번호: 35에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제26항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택된 면역글로불린 서브클래스인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 면역글로불린 서브클래스 IgG1인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 36 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열,
또는 서열번호: 36 또는 서열번호: 2에 대해 적어도 70% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역의 아미노산 중 임의의 하나는 다른 아미노산으로 변경되며, 조건부로 5개 이하의 아미노산, 예컨대 4개 아미노산, 3개 이하의 아미노산, 예컨대 2개 아미노산 또는 1개 이하의 아미노산이 그렇게 변경되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은
- 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 경쇄 가변 영역; 및/또는
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 중쇄 가변 영역; 및/또는
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 경쇄 불변 영역; 및/또는
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 중쇄 불변 영역을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제32항에 있어서, Fc 영역은 비-천연적으로 발생하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 돌연변이된 IgG 불변 영역을 갖는 Fc 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 이펙터 기능에 영향을 미치는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 EU 인덱스에 의해 정의된 L234A, L235A, P329G, G237A, P238S, H269A, A330S 및 P331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역에 부착된 글리칸은 푸코스를 결하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역에 부착된 글리칸은 푸코스가 낮은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 FUT8 음성 세포주에서 생산되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 무손상 항체를 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, Fv 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv 및 이황화-결합된 Fv), Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체(예를 들어, 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)로 구성된 군으로부터 선택된 항원-결합 단편을 포함하거나 이로 구성된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인터루킨-1(IL-1) 패밀리 사이토카인 리간드 및/또는 수용체의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 사이토카인의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1β의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-33의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-36α의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-36β의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-36γ의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및 IL-36γ의 시그널링을 억제할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제50중 어느 한 항에 있어서, 시그널링을 억제하는 것은 본질적으로 시그널링의 완전한 억제인,항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제51중 어느 한 항에 있어서, 시그널링을 억제하는 것은 시그널링의 부분적 억제인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제52중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a) 3nM 이하의 KD-값을 특징으로 하는 IL1RAP에 대한 결합 친화성(KD);
b) IL1RAP의 도메인 2에 대한 결합, 바람직하게는 도메인 2의 H2 영역에 대한 결합, 여기서 H2 영역은 서열번호: 39의 아미노산을 포함하거나 이로 구성됨;
c) 사이노몰거스 원숭이 또는 피그로부터 IL1RAP와 교차-반응성;
d) IL-1α 시그널링에 대한 억제 작용;
e) IL-1β 시그널링에 대한 억제 작용;
f) IL-33 시그널링에 대한 억제 작용;
g) IL-36α 시그널링에 대한 억제 작용;
h) IL-36β 시그널링에 대한 억제 작용;
i) IL-36γ 시그널링에 대한 억제 작용;
j) IL1RAP-발현 세포에 의한 내재화. - 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 특성 모두를 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
a) 3nM 이하의 KD-값을 특징으로 하는 IL1RAP에 대한 결합 친화성(KD);
b) IL1RAP의 도메인 2에 대한 결합, 바람직하게는 도메인 2의 H2 영역에 대한 결합, 여기서 H2 영역은 서열번호: 39의 아미노산을 포함하거나 이로 구성됨;
c) 사이노몰거스 원숭이 또는 피그로부터 IL1RAP와 교차-반응성;
d) IL-1α 시그널링에 대한 억제 작용;
e) IL-1β 시그널링에 대한 억제 작용;
f) IL-33 시그널링에 대한 억제 작용;
g) IL-36α 시그널링에 대한 억제 작용;
h) IL-36β 시그널링에 대한 억제 작용;
i) IL-36γ 시그널링에 대한 억제 작용;
j) IL1RAP-발현 세포에 의한 내재화. - 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCC를 유도할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IL1RAP를 발현하는 세포의 ADCC를 유도할 수 없는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 작용제의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편
- 제57항에 있어서, 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 글리코실화기, 지방산 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 페길화되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 세포독성 또는 검출가능한 모이어티와 같은 기능적 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 결합되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제60항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 모이어티는 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제62항에 있어서, 방사성동위원소는 베타-이미터, 오거-이미터, 전환 전자-이미터, 알파-이미터 및 낮은 광자 에너지-이미터로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제62항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소는 작용제의 근처에서 고선량 흡광도를 생성하는 국부적으로 흡수된 에너지의 방출 패턴을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소는 긴-범위 베타-이미터, 예컨대 90Y, 32P, 186Re/186Re; 166Ho, 76As/77As, 153Sm; 중간 범위 베타-이미터, 예컨대 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb; 저-에너지 베타-이미터, 예컨대 45Ca, 35S 또는 14C; 변환 또는 오거-이미터, 예컨대 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 123I, 125I, 201Tl; 및 알파-이미터, 예컨대 212Bi, 213Bi, 223Ac, 및 221At로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소는 177Lu인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 모이어티는 세포독성 약물을 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제67항에 있어서, 세포독성 약물은 세포증식억제 약물; 항-안드로겐 약물; 코르티손 및 이의 유도체; 포스포네이트; 테스토스테론-5-α-리덕타제 억제제; 붕소 부가물; 사이토카인; 탑시가르긴 및 그 대사산물; 독소(예컨대 사포린 또는 칼리케아미신); 화학요법제(예컨대 항대사제); 또는 신생물성 장애의 치료에 유용한 임의의 기타 세포독성 약물로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제67항 또는 제68항에 있어서, 세포독성 약물은 활성화 요법, 예컨대 광자 활성화 요법, 중성자 활성화 요법, 중성자 유도 오거 전자 요법, 싱크로트론 조사 요법 또는 저에너지 X-선 광자 활성화 요법에 사용하기에 적합한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 검출가능한 모이어티를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제70항에 있어서, 검출가능한 모이어티는 방사성동위원소를 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제71항에 있어서, 방사성동위원소는 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123I 및 201Tl로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제71항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소는 89Zr인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편은 86Y/90Y 또는 124I/211At와 같은 한 쌍의 검출가능하고 세포독성 방사성동위원소를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제60항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 방사성동위원소는 검출가능한 모이어티 및 세포독성 모이어티로서 다중-모드 방식에서 동시적으로 작용할 수 있는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제60항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 모이어티는 상자성(paramagnetic) 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제76항에 있어서, 상자성 동위원소는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr 및 56Fe로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제60항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 모이어티는 SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 이미징과 같은 이미징 기술에 의해 검출가능한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제60항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 모이어티 및/또는 검출가능한 모이어티는 연결 모이어티를 통해 간접적으로 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 조합되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제79항에 있어서, 연결 모이어티는 킬레이터인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제80항에 있어서, 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 데페록사민(DFO), 디에틸렌트리아민펜타아세트 아비드(DTPA)의 유도체, S-2-(4-이소티오시아나토벤질)-1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자사이클로도세단-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 세포독성 모이어티를 포함하지 않는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 이의 구성요소 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제83항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 cDNA 분자인, 폴리뉴클레오티드.
- 제83항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 경쇄 또는 이의 가변 영역을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제83항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 또는 이의 가변 영역을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제87항에 있어서, 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
- 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
- 제89항에 있어서, 숙주 세포는 박테리아 세포인, 숙주 세포.
- 제89항에 있어서, 숙주 세포는 효모 세포인, 숙주 세포.
- 제89항에 있어서, 숙주 세포는 포유동물 세포인, 숙주 세포.
- 제89항에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포인, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 인코딩된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서, 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 약학적 조성물로서,
제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드,
제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 및/또는
제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포를 약학적 조성물에 포함하며, 여기서 조성물은 약학적으로-허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물. - 제95항에 있어서, 조성물은 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및/또는 재조합 숙주 세포를 포함하는, 조성물.
- 제95항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 전달에 적합한, 조성물.
- 제97항에 있어서, 비경구 전달은 정맥내 전달, 국소적 전달, 피하 전달 및/또는 근육내 전달인, 조성물.
- 의약에 사용하기 위한, 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포 및/또는 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단에 사용하기 위한, 및/또는 여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된, 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- 제100항에 있어서, 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애인, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제100항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 염증성 및/또는 섬유성 질환 또는 장애는 심근염, 전신 경화증, 건선, 건선성 관절염, 죽상동맥경화증, 류마티스성 관절염, 모든 유형의 관절염, 전신 발병 소아 특발성 관절염(SOJIA)을 포함하는 모든 유형의 소아 관절염, 골관절염, 가족성 한랭 자가-염증성 증후군(FCAS), 머클-웰스병, 신생아 발병 다-기관 염증성 질환(NOMID), 가족성 지중해열(FMF), 화농성 괴저성 농피증 및 여드름(PAPA) 증후군, 성인 발병 스틸병, 고 IgD 증후군, 제2형 당뇨병, 대식세포 활성화 증후군, TNF 수용체-연관된 주기성 증후군, 블라우병, 강직성 척추염, 스위트병, 루푸스 관절염, 알츠하이머병, 천식, 알레르기, 유육종증, 아토피성 피부염, 전신성 홍반성 루푸스, 수포성 유천포창, 제1형 진성 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐질환, 헬리코박터 파일로리 위염, 염증성 장질환(궤양성 대장염 및 크론병 포함), 간염, C형 간염, 허혈-재관류 손상, 다발성 경화증, 나이세리아 또는 폐렴구균성 수막염, 결핵, 베체트 증후군, 패혈성 쇼크, 이식편대숙주병, 성인 T 세포 백혈병, 다발성 골수종, 치주염, 비만 및 비만 관련된 질환(예를 들어, 대사 증후군, 심비대, 울혈성 심부전, 심근 경색, 정맥류, 다낭성 난소 증후군, 위식도 역류 질환(GERD), 지방간 질환, 대장암, 유방암, 자궁암, 만성 신부전, 뇌졸중, 고요산혈증), 척추추간판 질환, 과민성 대장 증후군, 슈니츨러 증후군, 알레르기/아토피성 피부염, 역위 여드름 , 베체트병, 심장 섬유증, 심혈관 질환, 크라이오피인-연관된 주기 증후군, 낭포성 섬유증, 굿파스쳐 증후군, 길랭-바레 증후군, 신장 섬유증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 피부 섬유증, 자가면역 심근염, 장기 이식과 연관된 장기 기능 장애, 췌장염, 복막염, 포도막염, 맥관염, 폐렴, 폐 고혈압, 공피증의 만성 이식편대숙주병, 패혈증, 쇼그렌 증후군, 타카야수 동맥염 및 통풍으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 염증성 및/또는 섬유성 성분을 갖는, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 장애인, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제100항에 있어서, 질환 또는 장애는 신생물성 질환 또는 장애인, 사용하기 위한 항체, 이의 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제100항 또는 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 신생물성 질환 또는 장애는 혈액학적 질환 또는 장애, 또는 고형 종양인, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제105항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 신생물성 혈액학적 질환 또는 장애는 만성 골수성 백혈병(CML), 골수증식성 질환(MPD), 골수이형성 증후군(MDS), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 급성 골수성 백혈병(AML)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 대장암, 직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 비뇨기의 암, 담도암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암, 육종, 피부암 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 제100항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관되는, 사용하기 위한 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물.
- 대상체에서 신생물성 장애와 연관된 병리학적 세포, 또는 그의 줄기 세포 또는 전구 세포로서, 여기서 세포는 IL1RAP를 발현하는 세포의 세포 사멸을 유도하고/하거나 그의 성장 및/또는 증식을 억제하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포 및/또는 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물.
- IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방, 치료, 완화, 검출 및/또는 진단을 위한 약제의 제조에서, 여기서 질환 또는 장애는 IL1RAP를 발현하는 세포와 연련되는, 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 검출 및/또는 진단을 위한 약제의 제조에서, 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
- 대상체에게 유효량의
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드,
- 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터,
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, IL-1α, IL-1β, IL-33, IL-36α, IL-36β 및/또는 IL-36γ 시그널링의 억제제로 치료하기 쉬운 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 완화 및/또는 검출 및/또는 진단을 위한 것이고, 그리고/또는 여기서 질환 또는 장애는 대상체에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관되는, 방법. - 대상체에서 IL1RAP를 발현하는 세포의 검출을 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법은
(a) 생검 조직 또는 혈액 샘플과 같이 테스트되는 대상체로부터의 세포의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 샘플에 존재하는 세포를 추출 및/또는 정제하는 단계;
(c) 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 샘플에 존재하는 세포와 접촉시키는 단계;
(d) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포에 대한 결합은 대상체의 조직에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타내는, 방법. - 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로의 치료로부터 이익을 얻을, IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 환자를 식별하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법은
(a) 테스트되는 환자로부터 생검 조직 또는 혈액 샘플과 같은 세포의 샘플을 제공하는 단계;
(b) 선택적으로, 샘플에 존재하는 세포를 추출 및/또는 정제하는 단계;
(c) 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원-결합 단편을 샘플에 존재하는 세포와 접촉시키는 단계;
(d) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 IL1RAP를 발현하는 세포에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합은 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로의 치료로부터 이익을 얻을 환자를 나타내는, 방법. - IL1RAP 발현 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 제114항 내지 제115항 중 어느 한 항에 따라 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 것으로 식별된 환자를 선정하는 단계;
b) 상기 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 치료제를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - IL1RAP를 발현하는 세포의 검출을 위한 방법으로서, 상기 방법은:
(a) IL1RAP의 그 발현에 대해 분석되어지는 세포와 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 접촉시키는 단계;
(b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 세포에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며
여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 세포에 대한 결합은 대상체의 조직에서 IL1RAP를 발현하는 세포와 연관된 질환 또는 장애의 존재를 나타내는, 방법. - 제117항에 있어서, 방법은 생체내 방법, 생체외 방법 또는 시험관내 방법인, 방법.
- 복막염이 있는 대상체에서 염증을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드,
- 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터,
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 건선 또는 건선성 관절염이 있는 대상체에서 질환 중증도를 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
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- 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터,
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 죽상동맥경화증이 있는 대상체에서 죽상동맥경화 플라크 염증을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편,
- 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드,
- 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터,
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 죽상동맥경화증이 있는 대상체에서 죽상동맥경화 플라크 부피 및/또는 죽상동맥경화 플라크 크기를 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
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- 제87항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 벡터,
- 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 재조합 숙주 세포, 및/또는
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 심근염이 있는 대상체에서 염증 및/또는 섬유증을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
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- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 심근염 또는 자가면역 심근염이 있는 대상체에서 심장 기능에서의 저하에 대응하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
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- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 전신 경화증이 있는 대상체에서 피부 섬유증을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
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- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 전신 경화증이 있는 대상체에서 폐 섬유증을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 유효량의
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