TW202110888A - TrkA的抗體及其應用 - Google Patents

TrkA的抗體及其應用 Download PDF

Info

Publication number
TW202110888A
TW202110888A TW109118203A TW109118203A TW202110888A TW 202110888 A TW202110888 A TW 202110888A TW 109118203 A TW109118203 A TW 109118203A TW 109118203 A TW109118203 A TW 109118203A TW 202110888 A TW202110888 A TW 202110888A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
seq
trka
amino acid
nos
Prior art date
Application number
TW109118203A
Other languages
English (en)
Inventor
陳超
任志衡
何轉娣
盧傑聯
林樹珊
于婷婷
危喜玲
王旭昉
徐樂
董軍紀
李想
張闊
楊雪堯
郭林峰
李曉平
陳小鋒
李文佳
Original Assignee
大陸商廣東東陽光藥業有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商廣東東陽光藥業有限公司 filed Critical 大陸商廣東東陽光藥業有限公司
Publication of TW202110888A publication Critical patent/TW202110888A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

本發明提供一種能夠特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段及其用途。該抗體含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95 %同一性的氨基酸序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~27，輕鏈可變區CDR序列：SEQ IN NO: 28~54。根據本發明實施例的上述抗體能夠特異性的靶向結合TrkA受體，阻斷NGF和TrkA結合。

Description

TrkA的抗體及其應用
本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及TrkA的抗體及其應用，更具體地，本發明涉及能夠特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段、核酸分子、表達載體、重組細胞、藥物組合物、製藥用途、檢測TrkA的試劑盒以及小鼠B細胞。
目前臨床上對於輕至中度疼痛，主要使用非阿片類鎮痛藥，如非類固醇抗發炎藥（NSAIDs）；對於中度至重度疼痛，主要使用阿片類鎮痛藥。然而，NSAIDs 存在“封頂效應”，阿片僅能使不到30%的非腫瘤性慢性疼痛得到有效緩解，20%的癌痛患者存在阿片類藥物耐藥。此外，NSAIDs存在胃腸道和心血管安全性隱患，長期用藥過程中尤其明顯。對於阿片類鎮痛藥，多年的藥物改進實驗未能有效的降低其成癮性和其它諸多副作用，患者期許新的更安全有效的藥物。
神經生長因數（NGF，nerve growth factor） 參與疼痛的病理生理過程，主要通過結合高親和力的酪氨酸激酶( tyrosine-nase，TrkA) 受體啟動NGF/TrKA信號通路，影響炎症介質的釋放、離子通道的開放以及促進神經纖維的生長，從而參與疼痛的發生，傳導以及增敏過程。研究表明，阻斷NGF-TrkA 信號通路可以有效的緩解疼痛和痛覺過敏，NGF-TrkA信號通路是開發新型鎮痛藥物的有效靶點。對於NGF-TrkA靶點鎮痛藥物，目前在研的藥物主要分為兩大類：大分子抗NGF單克隆抗體和小分子TrkA激酶抑制劑。由於TrKA受體並不是NGF的唯一受體，NGF還存在一種低親和力的受體P75，而NGF與P75的結合對於神經系統的功能以及損傷修復是有重要作用的，大分子抗NGF單克隆抗體作為一種新型的鎮痛藥物存在很大的安全性隱患。從目前的臨床資料來看，最常見毒副作用包括骨組織壞死（潛在）、感官異常等。而小分子TrkA激酶抑制劑存在著更多的問題。首先，小分子藥物的半衰期一般較短，給藥頻繁，病人的依從性差。其次，小分子Trka激酶抑制劑是受體酪氨酸激酶抑制劑，機體記憶體在多種受體酪氨酸激酶，因此，藥物對於特定靶點的特異性和選擇性很難保證，藥物的不良反應多，毒副作用大。
因此，針對NGF-TrkA靶點的鎮痛藥物，仍然需要科研工作者不斷的開發和改進。
本申請是基於發明人對下列問題和事實的發現而提出的：
NGF-TrkA信號通路作為開發新型鎮痛藥物的有效靶點，如果通過TrkA單克隆抗體選擇性的靶向結合TrkA受體，不僅可以阻斷NGF對TrkA信號通路的啟動，有效的抑制疼痛信號的傳遞，又不會發生像抑制NGF受體所造成的諸多神經毒性，以及使用抗NGF抗體過度中和NGF所帶來的骨關節壞死等不可預測的毒副作用。但由於TrkA分子是受體膜蛋白，篩選阻斷型抗TrkA單克隆抗體的難度比較大，其次，設計阻斷TrkA受體抗體存在由於抗體介導免疫反應導致的安全性風險，因此，設計開發針對TrkA的單克隆抗體難度比較大。
然而本申請的發明人卻成功地篩選到了一種新型的具有長效鎮痛作用的抗TrkA單克隆抗體，同時，發明人通過選取特定的Fc亞型並對其進行改造有效避免了免疫毒性的風險。具體地，本研究通過雜交瘤技術篩選出一系列阻斷NGF和TrkA結合的高親和力抗TrkA單克隆抗體，並將鼠源抗TrkA單克隆抗體的恒定區人源化，保留鼠源抗TrkA單克隆抗體的可變區，得到一系列的抗TrkA嵌合單克隆抗體。發明人發現，本申請所獲得的這些嵌合抗體候選物，不僅能夠特異性的靶向結合TrkA受體，阻斷NGF和TrkA結合，有效的抑制疼痛，而且具有免疫毒性低，基本沒有抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）的特點。
在本發明的第一方面，本發明提出了一種能夠特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段。根據本發明的實施例，所述抗體含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~27，輕鏈可變區CDR序列：SEQ IN NO: 28~54。 VYSFTAYT（SEQ ID NO:1）。 INPHNGGT（SEQ ID NO:2）。 AISRYGSSSFYFDV（SEQ ID NO:3）。 GYAFTNYW（SEQ ID NO:4）。 FYPRTGNT（SEQ ID NO:5）。 ARAGTGFDY（SEQ ID NO:6）。 GYRFSSYW（SEQ ID NO:7）。 ILPGRGII（SEQ ID NO:8）。 ARTDPPYFGV（SEQ ID NO:9）。 GYTFSTYW（SEQ ID NO:10）。 NLPGRHIT（SEQ ID NO:11）。 ARGRGTYYFDY（SEQ ID NO:12）。 GYSFTGYT（SEQ ID NO:13）。 INPYNGGT（SEQ ID NO:14）。 AFSYYGSRGFYFDY（SEQ ID NO:15）。 GYSFTGYT（SEQ ID NO:16）。 INPYNGGT（SEQ ID NO:17）。 ASSSYRNDGNWYFDV（SEQ ID NO:18）。 GYSITGYT（SEQ ID NO:19)。 VNPYNGGT（SEQ ID NO:20）。 AISRYGSESWYFDV（SEQ ID NO:21）。 GYTFNIYW（SEQ ID NO:22）。 ILPGSGNT（SEQ ID NO:23）。 ARTDGRGYFDY（SEQ ID NO:24）。 GYTFSSYW（SEQ ID NO:25）。 FLPRSGKT（SEQ ID NO:26）。 ARTDPPYFGV（SEQ ID NO:27）。 SSISY（SEQ ID NO:28）。 ATS（SEQ ID NO:29）。 QQWSSNPPT（SEQ ID NO:30）。 ENVGGY（SEQ ID NO:31）。 GAS（SEQ ID NO:32）。 GQNYIYPFT（SEQ ID NO:33）。 TGAVTISNY（SEQ ID NO:34）。 GTN（SEQ ID NO:35）。 VLWYSNHWV（SEQ ID NO:36）。 QSLLHSNGITY（SEQ ID NO:37）。 QMS（SEQ ID NO:38）。 AQNLEFPFT（SEQ ID NO:39）。 SSVSY（SEQ ID NO:40）。 LTS（SEQ ID NO:41）。 QQWSSNPPT（SEQ ID NO:42）。 SSVSY（SEQ ID NO:43）。 DTS（SEQ ID NO:44）。 QQWSSNPPT（SEQ ID NO:45）。 SSVSY（SEQ ID NO:46）。 ATS（SEQ ID NO:47）。 QQWSSNPPT（SEQ ID NO:48）。 KSVSSSAYSY（SEQ ID NO:49）。 LAS（SEQ ID NO:50）。 QHSRELPFT（SEQ ID NO:51）。 SNISY（SEQ ID NO:52）。 DTS（SEQ ID NO:53）。 QQWSSVPLT（SEQ ID NO:54）。
根據本發明實施例的上述抗體能夠特異性的靶向結合TrkA受體，阻斷NGF和TrkA結合。
根據本發明的實施例，上述抗體或抗原結合片段還可以進一步包含如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述抗體包含：分別如SEQ ID NO: 1、2和3或者與SEQ ID NO: 1、2和3具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 4、5和6或者與SEQ ID NO:4、5和6具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 7、8和9或者與SEQ ID NO: 7、8和9具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO:10、11和12或者與SEQ ID NO: 10、11和12具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO:13、14和15或者與SEQ ID NO: 13、14和15具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO:16、17和18或者與SEQ ID NO: 16、17和18具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO19、20和21或者與SEQ ID NO: 19、20和21具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO:22、23和24或者與SEQ ID NO: 22、23和24具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO:25、26和27或者與SEQ ID NO: 25、26和27具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列。
根據本發明的實施例，所述抗體包含：分別如SEQ ID NO: 28、29和30或者與SEQ ID NO: 28、39和30具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 31、32和33或者與SEQ ID NO: 31、32和33具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 34、35和36或者與SEQ ID NO: 34、35和36具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 37、38和39或者與SEQ ID NO: 37、38和39具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 40、41和42或者與SEQ ID NO: 40、41和42具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 43、44和45或者與SEQ ID NO: 43、44和45具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 46、47和48或者與SEQ ID NO: 46、47和48具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 49、50和51或者與SEQ ID NO: 49、50和51具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分別如SEQ ID NO: 52、53和54或者與SEQ ID NO: 52、53和54具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列。
根據本發明的實施例，所述抗體或其抗原結合片段特異性識別TrkA的胞外區。
根據本發明的實施例，所述抗體含有重鏈框架區序列和輕鏈框架區序列的至少之一，所述重鏈框架區序列和輕鏈框架區序列的至少之一的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
根據本發明的實施例，所述抗體具有如SEQ ID NO：55~63任一項所示氨基酸序列的重鏈可變區。 EVLLQQSGPELVKPGASMKISCKASVYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPHNGGTRYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCAISRYGSSSFYFDVWGAGTTVAVSS（SEQ ID NO:55）。 QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:56）。 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKTTGYRFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEILPGRGIINYNENFRGKATFTADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYFCARTDPPYFGVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO:57）。 QVQLQQSGAELMKPGASMKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWIGENLPGRHITNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRGTYYFDYWGQGTPLTVSS（SEQ ID NO:58）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAFSYYGSRGFYFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:59）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCASSSYRNDGNWYFDVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO:60）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSITGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLVNPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLKSEDSAVYYCAISRYGSESWYFDVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO:61）。 QVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFNIYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTHYNENFKGKATMTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARTDGRGYFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:62）。 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEFLPRSGKTNYNEEFRGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTDPPYFGVWGAGTMVAVSS（SEQ ID NO:63）。
根據本發明的實施例，所述抗體具有如SEQ ID NO：64~72任一項所示氨基酸序列的輕鏈可變區。 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSISYMHWYQQKPGSSPKPWISATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTNLEIK （SEQ ID NO:64）。 SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO:65）。 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSNHWVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO:66）。 DIVMTQAAFSTPVTLGTSASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO:67）。 QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSATSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO:68）。 DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLELK（SEQ ID NO:69）。 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRATSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEKK（SEQ ID NO:70）。 DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRTSKSVSSSAYSYMHWYQQKPGQPPKVLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO:71）。 QIVLTQSPPIMSASPGEKVTMTCSASSNISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSVPLTFGAGTKLEIK（SEQ ID NO:72）。
根據本發明的實施例，所述抗體含有重鏈恒定區和輕鏈恒定區的至少之一，所述重鏈恒定區和輕鏈恒定區的至少之一的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
根據本發明的實施例，所述抗體的輕鏈恒定區和重鏈恒定區均來自於人源IgG抗體或其突變體。進而所述抗體的免疫原性可以得到有效降低。
根據本發明的實施例，所述抗體的輕鏈恒定區和重鏈恒定區均來自於人源IgG4。
根據本發明的實施例，所述抗體的Fc區域與人源IgG4野生型的Fc相比具有S10P，F16A，L17A，R191K突變以及229 K缺失突變。其中，上述氨基酸位置的定位是以人源IgG4野生型Fc序列SEQ ID NO:73所示氨基酸序列進行定位的，如S10P，是指SEQ ID NO:75所示氨基酸序列的第10位S突變為P，依次類推。發明人發現，所述抗體的Fc區域具有上述突變以及缺失後，抗體的安全性、穩定性可以得到顯著提高，抗體在體內的半衰期也顯著延長。 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO:73）。
根據本發明的實施例，所述抗體恒定區的全長序列如SEQ ID NO:74或75所示。 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:74）。 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:75）。
其中，上述SEQ ID NO:74所示的抗體恒定區的全長序列包括IgG4重鏈恒定區和Fc區，其中，IgG4重鏈恒定區序列為ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV，Fc區序列為ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG。上述SEQ ID NO:75所示的抗體恒定區的全長序列為IgG4輕鏈恒定區。
根據本發明的實施例，所述抗體具有SEQ ID NO:76~84任一項所示氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:85~93任一項所示氨基酸序列的輕鏈。 EVLLQQSGPELVKPGASMKISCKASVYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPHNGGTRYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCAISRYGSSSFYFDVWGAGTTVAVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:76）。 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSISYMHWYQQKPGSSPKPWISATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:85）。 QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:77）。 SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:86）。 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKTTGYRFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEILPGRGIINYNENFRGKATFTADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYFCARTDPPYFGVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:78）。 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSNHWVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:87）。 QVQLQQSGAELMKPGASMKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWIGENLPGRHITNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRGTYYFDYWGQGTPLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:79）。 DIVMTQAAFSTPVTLGTSASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:88）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAFSYYGSRGFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:80）。 QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSATSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:89）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCASSSYRNDGNWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:81）。 DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:90）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSITGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLVNPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLKSEDSAVYYCAISRYGSESWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:82）。 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRATSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEKKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:91）。 QVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFNIYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTHYNENFKGKATMTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARTDGRGYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:83）。 DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRTSKSVSSSAYSYMHWYQQKPGQPPKVLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:92）。 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEFLPRSGKTNYNEEFRGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTDPPYFGVWGAGTMVAVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:84)。 QIVLTQSPPIMSASPGEKVTMTCSASSNISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSVPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:93)。
其中，在本申請中，上述SEQ ID NO:76和85所組成的抗體被稱為20C8 嵌合抗體，上述SEQ ID NO:77和86所組成的抗體被稱為23E12嵌合抗體，上述SEQ ID NO:78和87所組成的抗體被稱為27H3嵌合抗體，上述SEQ ID NO:79和88所組成的抗體被稱為21E5嵌合抗體，上述SEQ ID NO:80和89所組成的抗體被稱為2A5嵌合抗體，上述SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:90所組成的抗體被稱為4H4嵌合抗體，上述SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:91所組成的抗體被稱為22D12嵌合抗體，上述SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:92所組成的抗體被稱為1B9嵌合抗體，上述SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:93所組成的抗體被稱為15D4嵌合抗體。
根據本發明的實施例，所述抗體為單鏈抗體、多聚體抗體、CDR移植抗體或小分子抗體。
根據本發明的實施例，所述抗體為單鏈抗體，所述抗體具有SEQ ID NO:94~111所示的氨基酸序列。 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSISYMHWYQQKPGSSPKPWISATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTNLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVLLQQSGPELVKPGASMKISCKASVYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPHNGGTRYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCAISRYGSSSFYFDVWGAGTTVAVSS（SEQ ID NO:94）。 EVLLQQSGPELVKPGASMKISCKASVYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPHNGGTRYNQKFKGKATLTLDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYYCAISRYGSSSFYFDVWGAGTTVAVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSISYMHWYQQKPGSSPKPWISATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISGVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTNLEIK(SEQ ID NO:95）。 SIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:96）。 QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWMKQRPGHGLEWIGDFYPRTGNTFYNENFKGKVTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYLCARAGTGFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGGYVSWYQQKPDQSPKLLIYGASSRHTGVPDRFTGSGSETDFTLTISSVQAEDLAAYHCGQNYIYPFTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO:97）。 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSNHWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKTTGYRFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEILPGRGIINYNENFRGKATFTADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYFCARTDPPYFGVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO:98）。 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKTTGYRFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEILPGRGIINYNENFRGKATFTADTSSNTAYVQLSSLTSEDSAVYFCARTDPPYFGVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTISNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRPPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSNHWVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO:99）。 DIVMTQAAFSTPVTLGTSASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASMKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWIGENLPGRHITNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRGTYYFDYWGQGTPLTVSS（SEQ ID NO:100）。 QVQLQQSGAELMKPGASMKISCKATGYTFSTYWIEWVKQRPGHGLEWIGENLPGRHITNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGRGTYYFDYWGQGTPLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAFSTPVTLGTSASISCRSSQSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO:101）。 QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSATSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAFSYYGSRGFYFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:102）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCAFSYYGSRGFYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSATSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO:103）。 DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCASSSYRNDGNWYFDVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO:104）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCASSSYRNDGNWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLELK（SEQ ID NO:105）。 QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRATSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEKKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSITGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLVNPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLKSEDSAVYYCAISRYGSESWYFDVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO:106）。 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSITGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLVNPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLKSEDSAVYYCAISRYGSESWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRATSSVSYMYWYQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEKK（SEQ ID NO:107）。 DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRTSKSVSSSAYSYMHWYQQKPGQPPKVLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFNIYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTHYNENFKGKATMTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARTDGRGYFDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID NO:108）。 QVHLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFNIYWIDWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGNTHYNENFKGKATMTADTSSNTAYMQLTSLTSEDSAVYYCARTDGRGYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRTSKSVSSSAYSYMHWYQQKPGQPPKVLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID NO:109）。 QIVLTQSPPIMSASPGEKVTMTCSASSNISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSVPLTFGAGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEFLPRSGKTNYNEEFRGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTDPPYFGVWGAGTMVAVSS（SEQ ID NO:110）。 QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWLGEFLPRSGKTNYNEEFRGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARTDPPYFGVWGAGTMVAVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPPIMSASPGEKVTMTCSASSNISYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSVPLTFGAGTKLEIK（SEQ ID NO:111）。
其中，在本申請中，上述SEQ ID NO:94或95所示氨基酸序列的抗體被稱為20C8 單鏈抗體，上述SEQ ID NO: 96或97所示氨基酸序列的抗體被稱為23E12單鏈抗體，上述SEQ ID NO:98或99所示氨基酸序列的抗體被稱為27H3單鏈抗體，上述SEQ ID NO:100或101所示氨基酸序列的抗體被稱為21E5單鏈抗體，上述SEQ ID NO:102和103所示氨基酸序列的抗體被稱為2A5單鏈抗體，上述SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105所示氨基酸序列的抗體被稱為4H4單鏈抗體，上述SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107所示氨基酸序列的抗體被稱為22D12單鏈抗體，上述SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109所示氨基酸序列的抗體被稱為1B9單鏈抗體，上述SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111所示氨基酸序列的抗體被稱為15D4單鏈抗體。其中，SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106、108、110所示氨基酸序列的抗體從N端到C端可表示為VL-Link-VH（VL表示輕鏈可變區，VH表示重鏈可變區，Link表示連接VL和VH的連接鏈），SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111所示氨基酸序列的抗體從N端到C端可表示為VH-Link-VL（VL表示輕鏈可變區，VH表示重鏈可變區，Link表示連接VL和VH的連接鏈）。
根據本發明的實施例，所述小分子抗體包括Fab抗體、Fv抗體、單域抗體以及最小識別單位的至少之一。
在本發明的第二方面，本發明提出了一種核酸分子。根據本發明的實施例，所述核酸分子編碼前面所述的抗體或其抗原結合片段。根據本發明實施例的核酸分子所編碼的抗體或抗原結合片段可特異性靶向結合TrkA受體，阻斷NGF和TrkA結合，且具有免疫原性低，ADCC低的優勢。
根據本發明的實施例，上述核酸分子還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述核酸分子為DNA。
根據本發明的實施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:112~120任一項所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:121~129任一項所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:130~147所示的核苷酸序列。 GAAGTGCTGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGTGTACAGCTTCACAGCCTACACAATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCACACAATGGCGGCACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTCTGGATAAGTCCAGCAGCACTGCCTACATGGATCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTCTACTATTGCGCCATCTCTAGGTACGGCAGCAGCAGCTTCTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGGCTGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:112）。 CAAGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGACCCGGCACTAGCGTGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCACTAATTACTGGCTGGGCTGGATGAAGCAGAGACCCGGCCATGGACTGGAGTGGATCGGCGACTTCTACCCAAGGACTGGCAACACTTTCTACAACGAGAACTTTAAGGGCAAGGTGACTCTGACTGCCGATAAGTCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGTCCTCTCTGACTAGCGAAGATAGCGCCGTGTATCTGTGTGCTAGGGCTGGCACTGGCTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGAGCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:113）。 CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCTGAGCTGATGAAGCCCGGCGCTTCCGTCAAGATCAGCTGCAAGACTACTGGCTATAGGTTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGCGAAATCCTCCCCGGAAGGGGCATCATCAACTACAATGAGAACTTTAGGGGCAAGGCCACATTCACAGCCGACACAAGCAGCAACACTGCCTACGTGCAGCTGAGCTCTCTGACTTCCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAACAGACCCTCCTTATTTCGGCGTGTGGGGCGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:114）。 CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCACATACTGGATCGAGTGGGTCAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAGTGGATCGGAGAGAATCTGCCCGGAAGGCACATCACTAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTCACAGCCGACACTAGCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCTCTCTGACAAGCGAAGATAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGGAAGGGGCACTTACTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACTCCACTGACTGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:115）。 GAGGTGCAGCTCCAACAGAGCGGACCAGAGCTGGTGAAACCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACTATGAACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCATACAACGGCGGCACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTCTGACAGTCGATAAGAGCTCCAGCACTGCCTACATGGAGCTGCTGAGCCTCACTAGCGAGGACAGCGCTGTGTACTACTGTGCCTTCTCCTACTACGGCTCTAGGGGCTTCTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:116）。 GAAGTGCAGCTGCAACAGAGCGGCCCAGAGCTCGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACAATGAACTGGGTCAAGCAGAGCCACGGAAAAAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCTTACAACGGCGGCACAAGGTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTCTCACTGTGGATAAGAGCAGCAGCACTGCCTACATGGAGCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGCTCCTCCTATAGGAACGACGGCAACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACTACTGTGACAGTGAGCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:117）。 GAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACAGCATCACTGGCTACACTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTCGAGTGGATTGGCCTCGTGAACCCATACAACGGCGGCACTTCCTACAACCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTCACAGTCGATAAGTCCAGCTCCACAGCCTACATGGAGCTGCTGTCTCTGAAGAGCGAGGATAGCGCTGTCTACTACTGTGCCATCAGCAGATACGGCAGCGAGAGCTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGACAGTGAGCAGCGCCAGCACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:118）。 CAAGTGCATCTGCAGCAGAGCGGCGCTGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATTAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAACATCTACTGGATCGACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGACTGGAATGGATCGGCGAAATTCTGCCCGGCAGCGGCAACACTCACTACAACGAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACAGCCGACACAAGCTCCAACACTGCTTACATGCAGCTGACTTCTCTGACTAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTATTGCGCTAGGACAGACGGAAGGGGCTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACTACACTCACAGTGAGCAGCGCCAGCACTAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:119）。 CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCTGAGCTCATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGAGAGTTTCTGCCTAGAAGCGGCAAGACAAACTACAACGAGGAGTTTAGGGGCAAGGCTACATTCACTGCCGACACATCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTCACAAGCGAGGATTCCGCCGTCTACTACTGTGCTAGGACTGATCCTCCTTACTTCGGAGTGTGGGGCGCTGGCACAATGGTGGCTGTGAGCAGCGCCTCCACTAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCAGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTAACTTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:120）。 CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCAGCTATTCTGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCAGCTCCAGCATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCAAAGCCTTGGATCAGCGCCACTAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACTATCTCCGGCGTGGAAGCTGAGGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAACCCTCCTACTTTCGGCGGCGGCACAAATCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:121）。 AGCATCGTCATGACACAAAGCCCTAAGAGCATGAGCATGAGCGTGGGCGAGAGAGTGACTCTGAGCTGTAAGGCCAGCGAGAATGTGGGCGGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGATCAGAGCCCAAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCAGCAGACACACTGGCGTGCCAGATAGGTTCACTGGCAGCGGCTCCGAGACAGACTTCACTCTGACTATCAGCAGCGTCCAAGCCGAAGATCTGGCCGCCTATCACTGCGGCCAGAACTACATCTACCCATTCACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:122）。 CAAGCCGTCGTGACACAAGAGTCCGCTCTGACAACTTCCCCCGGCGAGACTGTGACACTGACTTGTAGGAGCAGCACTGGCGCCGTGACTATCAGCAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAGAAGCCAGATCATCTGTTCACTGGACTGATCGGCGGCACAAATAATAGGCCTCCCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCTCTGATTGGCGATAAGGCTGCTCTGACAATCACTGGCGCCCAGACTGAGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGTCCTCTGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCGGCGGCACTAAGCTGACTGTGCTGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:123）。 GATATCGTCATGACTCAAGCCGCCTTCAGCACTCCAGTCACTCTCGGCACAAGCGCCAGCATCAGCTGTAGGTCCAGCCAGTCTCTGCTGCACAGCAACGGCATCACTTATCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAAAGCCCACAGCTGCTGATCTACCAGATGAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCAGCAGCGGAAGCGGAACAGACTTCACACTGAGGATCTCTAGGGTGGAAGCCGAAGATGTGGGCGTCTATTACTGCGCCCAGAACCTCGAGTTCCCTTTCACATTCGGCAGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:124）。 CAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCTCTGATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGCGCCACATCCAGCGTGAGCTACATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTAGGAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACCTCACAAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCAGCTAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGCATGGAAGCCGAAGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCACCTACATTCGGAGGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:125）。 GATATCGTGATGACTCAGTCCCCAGCCATCATGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGCTCCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACATCCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACAAGCTACTCTCTGACTATCAGCAGCATGGAGACAGAGGACGCTGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCTCCAACTTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGGAGCTGAAGCGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:126）。 CAGATTGTGCTGTCCCAGTCCCCAGCCATTCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCACAAGCAGCGTGAGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACGCCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCGTCCCAGCTAGATTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACTAGCTATTCTCTGACTATCTCTAGGGTCGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAATCCTCCAACATTCGGCGGCGGAACTAAGCTGGAGAAGAAGAGGACAGTGGCTGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCAAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACTGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:127）。 GATATCGTGCTGACTCAGAGCCCAGCCTCTCTGGTGGTGTCTCTGGGACAGAGGGCCACAATCAGCTGTAGGACTTCCAAGAGCGTGAGCAGCTCCGCCTACAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGGTGCTGATCTATCTGGCCAGCAATCTGGAGAGCGGCGTCCCAGCTAGATTCAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTGACTTCACTCTGAACATCCACCCAGTGGAAGAGGAGGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCACTCTAGGGAGCTGCCTTTCACATTTGGCAGCGGAACTAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTCGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTCCCTCCAAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACTGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:128）。 CAAATTGTTCTCACACAGAGCCCTCCTATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTTCCGCCAGCAGCAACATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCCGGCACAAGCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACAATCAGCAGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACATACTACTGCCAGCAGTGGAGCTCCGTCCCACTGACTTTCGGCGCTGGCACTAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTGGCCGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAACAGCTCAAGAGCGGCACTGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC（SEQ ID NO:129）。 CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCAGCTATTCTGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCAGCTCCAGCATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCAAAGCCTTGGATCAGCGCCACTAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACTATCTCCGGCGTGGAAGCTGAGGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAACCCTCCTACTTTCGGCGGCGGCACAAATCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTGCTGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGTGTACAGCTTCACAGCCTACACAATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCACACAATGGCGGCACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTCTGGATAAGTCCAGCAGCACTGCCTACATGGATCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTCTACTATTGCGCCATCTCTAGGTACGGCAGCAGCAGCTTCTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGGCTGTGAGCAGC（SEQ ID NO:130）。 GAAGTGCTGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGTGTACAGCTTCACAGCCTACACAATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCACACAATGGCGGCACTAGGTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTCTGGATAAGTCCAGCAGCACTGCCTACATGGATCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGACAGCGCCGTCTACTATTGCGCCATCTCTAGGTACGGCAGCAGCAGCTTCTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGGCTGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCAGCTATTCTGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCAGCTCCAGCATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCTCCTCCCCAAAGCCTTGGATCAGCGCCACTAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACTATCTCCGGCGTGGAAGCTGAGGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAACCCTCCTACTTTCGGCGGCGGCACAAATCTGGAGATCAAG（SEQ ID NO:131）。 AGCATCGTCATGACACAAAGCCCTAAGAGCATGAGCATGAGCGTGGGCGAGAGAGTGACTCTGAGCTGTAAGGCCAGCGAGAATGTGGGCGGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGATCAGAGCCCAAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCAGCAGACACACTGGCGTGCCAGATAGGTTCACTGGCAGCGGCTCCGAGACAGACTTCACTCTGACTATCAGCAGCGTCCAAGCCGAAGATCTGGCCGCCTATCACTGCGGCCAGAACTACATCTACCCATTCACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAAGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGACCCGGCACTAGCGTGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCACTAATTACTGGCTGGGCTGGATGAAGCAGAGACCCGGCCATGGACTGGAGTGGATCGGCGACTTCTACCCAAGGACTGGCAACACTTTCTACAACGAGAACTTTAAGGGCAAGGTGACTCTGACTGCCGATAAGTCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGTCCTCTCTGACTAGCGAAGATAGCGCCGTGTATCTGTGTGCTAGGGCTGGCACTGGCTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGAGCAGC（SEQ ID NO:132）。 CAAGTGCAGCTCCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGACCCGGCACTAGCGTGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCACTAATTACTGGCTGGGCTGGATGAAGCAGAGACCCGGCCATGGACTGGAGTGGATCGGCGACTTCTACCCAAGGACTGGCAACACTTTCTACAACGAGAACTTTAAGGGCAAGGTGACTCTGACTGCCGATAAGTCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGTCCTCTCTGACTAGCGAAGATAGCGCCGTGTATCTGTGTGCTAGGGCTGGCACTGGCTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTAGCATCGTCATGACACAAAGCCCTAAGAGCATGAGCATGAGCGTGGGCGAGAGAGTGACTCTGAGCTGTAAGGCCAGCGAGAATGTGGGCGGCTACGTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCAGATCAGAGCCCAAAGCTGCTGATCTACGGCGCCAGCAGCAGACACACTGGCGTGCCAGATAGGTTCACTGGCAGCGGCTCCGAGACAGACTTCACTCTGACTATCAGCAGCGTCCAAGCCGAAGATCTGGCCGCCTATCACTGCGGCCAGAACTACATCTACCCATTCACATTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG（SEQ ID NO:133）。 CAAGCCGTCGTGACACAAGAGTCCGCTCTGACAACTTCCCCCGGCGAGACTGTGACACTGACTTGTAGGAGCAGCACTGGCGCCGTGACTATCAGCAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAGAAGCCAGATCATCTGTTCACTGGACTGATCGGCGGCACAAATAATAGGCCTCCCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCTCTGATTGGCGATAAGGCTGCTCTGACAATCACTGGCGCCCAGACTGAGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGTCCTCTGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCGGCGGCACTAAGCTGACTGTGCTGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCTGAGCTGATGAAGCCCGGCGCTTCCGTCAAGATCAGCTGCAAGACTACTGGCTATAGGTTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGCGAAATCCTCCCCGGAAGGGGCATCATCAACTACAATGAGAACTTTAGGGGCAAGGCCACATTCACAGCCGACACAAGCAGCAACACTGCCTACGTGCAGCTGAGCTCTCTGACTTCCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAACAGACCCTCCTTATTTCGGCGTGTGGGGCGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCAGC（SEQ ID NO:134）。 CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCTGAGCTGATGAAGCCCGGCGCTTCCGTCAAGATCAGCTGCAAGACTACTGGCTATAGGTTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGCGAAATCCTCCCCGGAAGGGGCATCATCAACTACAATGAGAACTTTAGGGGCAAGGCCACATTCACAGCCGACACAAGCAGCAACACTGCCTACGTGCAGCTGAGCTCTCTGACTTCCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCAGAACAGACCCTCCTTATTTCGGCGTGTGGGGCGCCGGAACTACTGTGACTGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAAGCCGTCGTGACACAAGAGTCCGCTCTGACAACTTCCCCCGGCGAGACTGTGACACTGACTTGTAGGAGCAGCACTGGCGCCGTGACTATCAGCAACTACGCCAACTGGGTCCAAGAGAAGCCAGATCATCTGTTCACTGGACTGATCGGCGGCACAAATAATAGGCCTCCCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCTCTGATTGGCGATAAGGCTGCTCTGACAATCACTGGCGCCCAGACTGAGGACGAGGCCATCTACTTCTGCGTCCTCTGGTACAGCAACCACTGGGTGTTCGGCGGCGGCACTAAGCTGACTGTGCTG（SEQ ID NO:135）。 GATATCGTCATGACTCAAGCCGCCTTCAGCACTCCAGTCACTCTCGGCACAAGCGCCAGCATCAGCTGTAGGTCCAGCCAGTCTCTGCTGCACAGCAACGGCATCACTTATCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAAAGCCCACAGCTGCTGATCTACCAGATGAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCAGCAGCGGAAGCGGAACAGACTTCACACTGAGGATCTCTAGGGTGGAAGCCGAAGATGTGGGCGTCTATTACTGCGCCCAGAACCTCGAGTTCCCTTTCACATTCGGCAGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCACATACTGGATCGAGTGGGTCAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAGTGGATCGGAGAGAATCTGCCCGGAAGGCACATCACTAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTCACAGCCGACACTAGCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCTCTCTGACAAGCGAAGATAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGGAAGGGGCACTTACTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACTCCACTGACTGTGTCCAGC（SEQ ID NO:136）。 CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCCGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCTCCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCACATACTGGATCGAGTGGGTCAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAGTGGATCGGAGAGAATCTGCCCGGAAGGCACATCACTAACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTTTCACAGCCGACACTAGCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTCAGCTCTCTGACAAGCGAAGATAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGGGGAAGGGGCACTTACTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACTCCACTGACTGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTCATGACTCAAGCCGCCTTCAGCACTCCAGTCACTCTCGGCACAAGCGCCAGCATCAGCTGTAGGTCCAGCCAGTCTCTGCTGCACAGCAACGGCATCACTTATCTGTACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAAAGCCCACAGCTGCTGATCTACCAGATGAGCAATCTGGCCAGCGGCGTGCCAGATAGATTCAGCAGCAGCGGAAGCGGAACAGACTTCACACTGAGGATCTCTAGGGTGGAAGCCGAAGATGTGGGCGTCTATTACTGCGCCCAGAACCTCGAGTTCCCTTTCACATTCGGCAGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAG（SEQ ID NO:137）。 CAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCTCTGATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGCGCCACATCCAGCGTGAGCTACATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTAGGAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACCTCACAAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCAGCTAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGCATGGAAGCCGAAGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCACCTACATTCGGAGGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGCAGCTCCAACAGAGCGGACCAGAGCTGGTGAAACCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACTATGAACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCATACAACGGCGGCACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTCTGACAGTCGATAAGAGCTCCAGCACTGCCTACATGGAGCTGCTGAGCCTCACTAGCGAGGACAGCGCTGTGTACTACTGTGCCTTCTCCTACTACGGCTCTAGGGGCTTCTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGTCCAGC（SEQ ID NO:138）。 GAGGTGCAGCTCCAACAGAGCGGACCAGAGCTGGTGAAACCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACTATGAACTGGGTGAAGCAGTCCCACGGCAAGAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCATACAACGGCGGCACAAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTCTGACAGTCGATAAGAGCTCCAGCACTGCCTACATGGAGCTGCTGAGCCTCACTAGCGAGGACAGCGCTGTGTACTACTGTGCCTTCTCCTACTACGGCTCTAGGGGCTTCTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACAACACTGACAGTGTCCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGATCGTGCTGACACAGAGCCCAGCTCTGATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGCGCCACATCCAGCGTGAGCTACATCTACTGGTACCAGCAGAAGCCTAGGAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACCTCACAAGCAATCTGGCCAGCGGAGTGCCAGCTAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACAAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGCATGGAAGCCGAAGATGCCGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCACCTACATTCGGAGGCGGCACTAAGCTGGAGATCAAG（SEQ ID NO:139）。 GATATCGTGATGACTCAGTCCCCAGCCATCATGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGCTCCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACATCCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACAAGCTACTCTCTGACTATCAGCAGCATGGAGACAGAGGACGCTGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCTCCAACTTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGGAGCTGAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTGCAGCTGCAACAGAGCGGCCCAGAGCTCGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACAATGAACTGGGTCAAGCAGAGCCACGGAAAAAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCTTACAACGGCGGCACAAGGTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTCTCACTGTGGATAAGAGCAGCAGCACTGCCTACATGGAGCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGCTCCTCCTATAGGAACGACGGCAACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACTACTGTGACAGTGAGCTCC（SEQ ID NO:140）。 GAAGTGCAGCTGCAACAGAGCGGCCCAGAGCTCGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACTGGCTACACAATGAACTGGGTCAAGCAGAGCCACGGAAAAAATCTGGAGTGGATCGGACTGATCAACCCTTACAACGGCGGCACAAGGTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACTCTCACTGTGGATAAGAGCAGCAGCACTGCCTACATGGAGCTGCTGTCTCTGACAAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGCTCCTCCTATAGGAACGACGGCAACTGGTACTTCGATGTGTGGGGCGCCGGCACTACTGTGACAGTGAGCTCCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGATGACTCAGTCCCCAGCCATCATGTCCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGCTCCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGAGCGGCACATCCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTCAGCGGCTCCGGCAGCGGAACAAGCTACTCTCTGACTATCAGCAGCATGGAGACAGAGGACGCTGCCACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAATCCTCCAACTTTCGGCGGAGGCACTAAGCTGGAGCTGAAG（SEQ ID NO:141）。 CAGATTGTGCTGTCCCAGTCCCCAGCCATTCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCACAAGCAGCGTGAGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACGCCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCGTCCCAGCTAGATTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACTAGCTATTCTCTGACTATCTCTAGGGTCGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAATCCTCCAACATTCGGCGGCGGAACTAAGCTGGAGAAGAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACAGCATCACTGGCTACACTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTCGAGTGGATTGGCCTCGTGAACCCATACAACGGCGGCACTTCCTACAACCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTCACAGTCGATAAGTCCAGCTCCACAGCCTACATGGAGCTGCTGTCTCTGAAGAGCGAGGATAGCGCTGTCTACTACTGTGCCATCAGCAGATACGGCAGCGAGAGCTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGACAGTGAGCAGC（SEQ ID NO:142）。 GAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCAGAGCTGGTCAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACAGCATCACTGGCTACACTATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTCGAGTGGATTGGCCTCGTGAACCCATACAACGGCGGCACTTCCTACAACCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTCACAGTCGATAAGTCCAGCTCCACAGCCTACATGGAGCTGCTGTCTCTGAAGAGCGAGGATAGCGCTGTCTACTACTGTGCCATCAGCAGATACGGCAGCGAGAGCTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACAACAGTGACAGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGATTGTGCTGTCCCAGTCCCCAGCCATTCTGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTAGGGCCACAAGCAGCGTGAGCTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCTAAGCCTTGGATCTACGCCACAAGCAATCTGGCCAGCGGCGTCCCAGCTAGATTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACTAGCTATTCTCTGACTATCTCTAGGGTCGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAATCCTCCAACATTCGGCGGCGGAACTAAGCTGGAGAAGAAG（SEQ ID NO:143）。 GATATCGTGCTGACTCAGAGCCCAGCCTCTCTGGTGGTGTCTCTGGGACAGAGGGCCACAATCAGCTGTAGGACTTCCAAGAGCGTGAGCAGCTCCGCCTACAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGGTGCTGATCTATCTGGCCAGCAATCTGGAGAGCGGCGTCCCAGCTAGATTCAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTGACTTCACTCTGAACATCCACCCAGTGGAAGAGGAGGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCACTCTAGGGAGCTGCCTTTCACATTTGGCAGCGGAACTAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAAGTGCATCTGCAGCAGAGCGGCGCTGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATTAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAACATCTACTGGATCGACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGACTGGAATGGATCGGCGAAATTCTGCCCGGCAGCGGCAACACTCACTACAACGAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACAGCCGACACAAGCTCCAACACTGCTTACATGCAGCTGACTTCTCTGACTAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTATTGCGCTAGGACAGACGGAAGGGGCTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACTACACTCACAGTGAGCAGC（SEQ ID NO:144）。 CAAGTGCATCTGCAGCAGAGCGGCGCTGAGCTGATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATTAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAACATCTACTGGATCGACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCACGGACTGGAATGGATCGGCGAAATTCTGCCCGGCAGCGGCAACACTCACTACAACGAGAACTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACAGCCGACACAAGCTCCAACACTGCTTACATGCAGCTGACTTCTCTGACTAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTATTGCGCTAGGACAGACGGAAGGGGCTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACTACACTCACAGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGATATCGTGCTGACTCAGAGCCCAGCCTCTCTGGTGGTGTCTCTGGGACAGAGGGCCACAATCAGCTGTAGGACTTCCAAGAGCGTGAGCAGCTCCGCCTACAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGGTGCTGATCTATCTGGCCAGCAATCTGGAGAGCGGCGTCCCAGCTAGATTCAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTGACTTCACTCTGAACATCCACCCAGTGGAAGAGGAGGATGCCGCCACATACTACTGCCAGCACTCTAGGGAGCTGCCTTTCACATTTGGCAGCGGAACTAAGCTGGAGATCAAG（SEQ ID NO:145）。 CAAATTGTTCTCACACAGAGCCCTCCTATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTTCCGCCAGCAGCAACATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCCGGCACAAGCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACAATCAGCAGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACATACTACTGCCAGCAGTGGAGCTCCGTCCCACTGACTTTCGGCGCTGGCACTAAGCTGGAGATCAAGGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCTGAGCTCATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGAGAGTTTCTGCCTAGAAGCGGCAAGACAAACTACAACGAGGAGTTTAGGGGCAAGGCTACATTCACTGCCGACACATCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTCACAAGCGAGGATTCCGCCGTCTACTACTGTGCTAGGACTGATCCTCCTTACTTCGGAGTGTGGGGCGCTGGCACAATGGTGGCTGTGAGCAGC（SEQ ID NO:146）。 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCCGGCGCTGAGCTCATGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCACTGGCTACACATTCAGCAGCTACTGGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCCGGCCACGGACTGGAATGGCTGGGAGAGTTTCTGCCTAGAAGCGGCAAGACAAACTACAACGAGGAGTTTAGGGGCAAGGCTACATTCACTGCCGACACATCCAGCAACACTGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTCACAAGCGAGGATTCCGCCGTCTACTACTGTGCTAGGACTGATCCTCCTTACTTCGGAGTGTGGGGCGCTGGCACAATGGTGGCTGTGAGCAGCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCAAATTGTTCTCACACAGAGCCCTCCTATCATGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGTGACTATGACTTGTTCCGCCAGCAGCAACATCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCCGGCACAAGCCCAAAGAGGTGGATCTACGACACAAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCAGCCAGATTTAGCGGCTCCGGAAGCGGCACTAGCTACTCTCTGACAATCAGCAGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACATACTACTGCCAGCAGTGGAGCTCCGTCCCACTGACTTTCGGCGCTGGCACTAAGCTGGAGATCAAG（SEQ ID NO:147）。
其中，在本申請中，上述SEQ ID NO:112和121所示核苷酸序列分別編碼20C8 嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:113和122所示核苷酸序列分別編碼23E12嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:114和123所示核苷酸序列分別編碼27H3嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:115和124所示核苷酸序列分別編碼21E5嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:116和125所示核苷酸序列分別編碼2A5嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:126所示核苷酸序列分別編碼4H4嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:127所示核苷酸序列分別編碼22D12嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:128所示核苷酸序列分別編碼1B9嵌合抗體的重鏈和輕鏈，上述SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:129所示核苷酸序列分別編碼15D4嵌合抗體的重鏈和輕鏈。SEQ ID NO:130、132、134、136、138、140、142、144、146所示核苷酸序列分別編碼SEQ ID NO:94、96、98、100、102、104、106、108、110所示氨基酸序列的單鏈抗體，SEQ ID NO:131、133、135、137、139、141、143、145、147所示核苷酸序列分別編碼SEQ ID NO:95、97、99、101、103、105、107、109、111所示氨基酸序列的單鏈抗體。
在本發明的協力廠商面，本發明提出了一種表達載體。根據本發明的實施例，所述表達載體攜帶前面所述的核酸分子。根據本發明實施例的表達載體導入合適的受體細胞後，可在調控系統的介導下，有效實現前面所述的特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段表達，進而實現所述抗體或抗原結合片段的體外大量獲得。
根據本發明的實施例，上述表達載體還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述表達載體為真核表達載體。進而實現前面所述的特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段在真核細胞中的表達，如CHO細胞。
在本發明的第四方面，本發明提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，所述重組細胞攜帶前面所述的核酸分子，或者表達前面所述的抗體或其抗原結合片段。根據本發明實施例的重組細胞可用於前面所述的特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段體外表達和大量獲得。
根據本發明的實施例，上述重組細胞還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述重組細胞是通過將前面所述的表達載體引入至宿主細胞中而獲得的。
根據本發明的實施例，通過電轉導的方法將所述表達載體引入所述宿主細胞中。
根據本發明的實施例，所述重組細胞為真核細胞。
根據本發明的實施例，所述重組細胞為哺乳動物細胞。
在本發明的第五方面，本發明提出了一種藥物組合物。根據本發明的實施例，所述藥物組合物含有前面所述的抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的表達載體或前面所述的重組細胞。根據本發明實施例的藥物組合物中所包含的抗體或表達的抗體不僅能夠特異性的靶向結合TrkA受體，阻斷NGF和TrkA結合，有效的抑制疼痛，而且具有免疫原性低，基本沒有抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）的特點。
在本發明的第六方面，本發明提出了前面所述的抗體、前面所述的核酸分子、前面所述的表達載體或前面所述的重組細胞、前面所述的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或者預防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神經變性疾病、舍葛籣氏綜合征、子宮內膜異位、糖尿病性周圍神經病變、前列腺炎、盆腔疼痛綜合征、與骨重塑調節失衡相關 的疾病以及由結締組織生長因數異常信號傳導引起的疾病。
根據本發明的實施例，上述用途還可以進一步包括如下附加技術特徵至少之一：
根據本發明的實施例，所述藥物用於治療或預防神經性疼痛、炎性疼痛、與癌症有關的疼痛、與骨折有關的疼痛、與手術有關的疼痛、炎性肺病、間質性膀胱炎、痛性膀胱綜合征、炎性腸疾病、炎性皮膚病、雷諾氏綜合征、特發性肺纖維化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心內膜心肌纖維化、心房纖維化、骨髓纖維化、進行性塊狀纖維化(肺)、腎源性系統性纖維化、硬皮病、系統性硬化、關節纖維化、眼部纖維化、非小細胞肺癌、乳頭狀甲狀腺癌、多形性成膠質細胞瘤、結腸直腸癌、黑色素瘤、膽管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大細胞神經內分泌癌、成神經細胞瘤、前列腺癌、成神經細胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌或胃癌。
在本發明的第七方面，本發明提出了一種檢測TrkA的試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑盒包括前面任一所述的抗體。前面所述的TrkA抗體能夠特異性靶向結合TrkA，根據本發明實施例的試劑盒可以實現TrkA的特異性檢測，如當抗體結合有螢光基團時，可以採用螢光檢測裝置實現對TrkA的定位或即時檢測。
在本發明的第八方面，本發明提出了前面所述的抗體、前面所述的核酸分子、前面所述的表達載體或前面所述的重組細胞在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測TrkA或者診斷TrkA相關的疾病。
在本發明的第九方面，本發明提出了一種小鼠B細胞。根據本發明的實施例，所述B細胞的基因組中攜帶編碼恒定區的序列，所述恒定區序列與人IgG4的恒定區相比，存在S108P，F114A，L115A，R289K突變以及327 K缺失突變。其中，人IgG4的恒定區具有SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列。 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID NO:148）。
根據本發明實施例的小鼠B細胞可用於分泌鼠源抗體，所分泌的鼠源抗體在人體內的免疫原性進一步降低，穩定性得到顯著提高，在體內的半衰期顯著延長。
在本發明的第十方面，本發明提出了前面所述的小鼠B細胞在製備單克隆抗體中的用途。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
在對本發明描述的過程中，對於本文中有關的術語進行了解釋和說明，這些解釋和說明僅僅是為了方便對於方案的理解，並不能看做是對本發明保護方案的限制。
抗體
本文中，術語“抗體”是能夠與特異性抗原結合的免疫球蛋白分子。包括兩條分子量較輕的輕鏈和兩條分子量較重的重鏈，重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）由二硫鍵連接形成一個四肽鏈分子。其中，肽鏈的氨基端（N端）氨基酸序列變化很大，稱為可變區（V區），羧基端（C端）相對穩定，變化很小，稱為恒定區（C區）。L鏈和H鏈的V區分別稱為VL和VH。
在可變區中某些區域氨基酸組成和排列順序具有更高的變化程度，稱為高變區（Hypervariable region，HVR），高變區為抗原和抗體結合的位置，因此也稱為決定簇互補區（complementarity-determining region，CDR）。重鏈可變區和輕鏈可變區上均有三個CDR區。
本發明利用TrkA胞外段，通過免疫獲得了高特異性的高親和力的抗TrkA的Fab（antigen-binding fragment）抗體片段。利用該抗體片段能夠與TrkA抗原特異性結合，從而可以靶向性治療疼痛或腫瘤等疾病。
在一些實施方案中，本發明提供了一種能夠特異性識別TrkA的抗體或者抗原結合片段，所述抗體含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列：重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~27，輕鏈可變區CDR序列：SEQ IN NO: 28~54。在另一些實施方案中，本發明所提供的抗體或者抗原結合片段與上述重鏈和輕鏈相比，具有保守氨基酸取代。“抗原結合片段”是指保持特異性結合抗原（ROR2）能力的抗體片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸發生生物學上、化學上或者結構上相似的殘基所取代。生物學上相似的指的是該取代不破壞TrkA抗體或者與TrkA抗原的生物學活性。結構上相似指的是氨基酸具有相似長度的側鏈，如丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸，或具有相似大小的側鏈。化學相似性指的是氨基酸具有相同的荷電或者都是親水或者疏水的。例如疏水殘基異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者極性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代賴氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、穀氨醯胺取代天冬醯胺，絲氨酸取代蘇氨酸等等。
在一些實施方案中，本發明提供了一種抗體或抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段具有SEQ ID NO：55~63任一項所示氨基酸序列的重鏈可變區和具有如SEQ ID NO：64~72任一項所示氨基酸序列的輕鏈可變區。發明人通過抗體序列比對資料庫（NCBI、IMGT）可得到上述抗重鏈可變區序列的CDR區（如SEQ ID NO:1~27所示）和輕鏈可變區序列的CDR區（如SEQ ID NO:28~54所示）。在另一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段的重鏈可變區序列與SEQ ID NO: 55~63所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些實施方案中，所述抗體或抗原結合片段的輕鏈可變區序列與SEQ ID NO: 64~72任一項所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。當然，這些保守氨基酸取代不會對抗體或者抗原結合片段的生物學功能帶來改變。在一些具體方式中，這些保守氨基酸取代可以發生在重鏈可變區和輕鏈可變區中除了CDR區之外的氨基酸上。
在一些優選方案中，本發明提供了一種抗TrkA抗體，該抗體具有SEQ ID NO:76~84任一項所示氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:85~93任一項所示氨基酸序列的輕鏈。
在一些優選方案中，本發明提供了一種抗TrkA單鏈抗體，該抗體具有SEQ ID NO:94~111所示的氨基酸序列。
核酸分子、表達載體、重組細胞
在製備或者獲取這些抗體的過程中，可以利用表達這些抗體的核酸分子，與不同的載體連接，然後在不同細胞中表達，來獲得相應抗體。
為此，本發明還提供了一種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼上述所述的抗體或抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述分離核酸分子具有如SEQ ID NO:112~120任一項所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:121~129任一項所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:130~147所示的核苷酸序列。
在一些實施方案中，所述分離的核酸分子與上述SEQ ID NO: 112~120所示的核苷酸序列至少具有90%以上的同源性，優選具有95%以上的同源性，更優選具有98%、99%以上的同源性。在至少一些實施方案中，所述分離的多核苷酸與所述SEQ ID NO: 121~129所示的核苷酸序列至少具有90%以上的同源性，優選具有95%以上的同源性，更優選具有98%、99%以上的同源性。在至少一些實施方案中，所述分離的多核苷酸與所述SEQ ID NO: 130~147所示的核苷酸序列至少具有90%以上的同源性，優選具有95%以上的同源性，更優選具有98%、99%以上的同源性。這些與SEQ ID NO: 112~120或者SEQ ID NO: 121~129或SEQ ID NO: 130~147所示核苷酸序列具有同源性的序列，能夠表達與SEQ ID NO: 76~84和SEQ ID NO: 85~93相似的氨基酸或與SEQ ID NO:94~111相似的氨基酸序列，從而能夠與TrkA抗原特異性結合，實現抗體的靶向性功能。
在一些優選實施方式中，所述分離的核酸分子具有SEQ ID NO: 112~120所示的重鏈核苷酸序列和SEQ ID NO: 121~129所示的輕鏈核苷酸序列。這些核苷酸序列經過種屬優化，更易在哺乳動物細胞中表達。
本發明還提供了一種表達載體，所述表達載體包含上述分離的核酸分子。在將上述分離的多核苷酸連接到載體上時，可以將多核苷酸與載體上的控制元件直接或者間接相連，只要這些控制元件能夠控制多核苷酸的翻譯和表達等即可。當然這些控制元件可以直接來自於載體本身，也可以是外源性的，即並非來自於載體本身。當然，多核苷酸與控制元件進行可操作地連接即可。本文中“可操作地連接”是指將外源基因連接到載體上，使得載體內的控制元件，例如轉錄控制序列和翻譯控制序列等等，能夠發揮其預期的調節外源基因的轉錄和翻譯的功能。當然用來編碼抗體重鏈和輕鏈的多核苷酸，可以分別獨立的插入到不同的載體上，常見的是插入到同一載體上。常用的載體例如可以為質粒、噬菌體等等。例如Plasmid-X質粒。
本發明還提供了一種重組細胞，該重組細胞中包含有該表達載體。可以將表達載體導入到哺乳動物細胞中，構建獲得重組細胞，然後利用這些重組細胞表達本發明提供的抗體或者抗原結合片段。通過該重組細胞進行培養，即可以獲得相應抗體。這些可用的哺乳動物細胞例如可以為CHO細胞等。
藥物組合物、試劑盒及製藥用途和在製備試劑盒中的用途。
本發明還提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括上述所述的抗體或者抗原結合片段和藥學可接受的載體。
本文提供的抗TrkA抗體可以摻入適合受試者施用的藥物組合物中。通常，這些藥物組合物包括本文提供的抗TrkA抗體以及藥學上可接受的載體。“藥學上可接受的載體”可以包括生理學上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等等。具體實例可以是水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它們的組合物中的一種或多種。有許多情況下，藥物組合物中包括等滲劑，例如糖類、多元醇( 如甘露醇、山梨醇) 或氯化鈉等。當然藥學上可接受的載體還可包括微量的輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩衝劑，用來延長抗體的保存限期或效力。
例如，本發明的抗體可摻入適用於胃腸外施用( 例如靜脈內、皮下、腹膜內、肌肉內) 的藥物組合物中。這些藥物組合物可以被製備成各種形式。例如液體、半固體和固體劑型等，包括但不限於液體溶液( 例如，注射溶液和輸注溶液)、分散劑或懸浮劑、片劑、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。典型的藥物組合物為注射溶液或輸注溶液形式。所述抗體可通過靜脈輸注或注射或肌肉內或皮下注射來施用。
當然，本文中的抗TrkA抗體還可以根據需要被製成試劑盒或者其他診斷性試劑的一部分。根據本發明的實施例，本發明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括上述TrkA抗體。應用本發明提供的試劑盒，例如可以用於免疫印跡、免疫沉澱等涉及到利用TrkA抗原和抗體特異性結合性能，來檢測的試劑盒等。這些試劑盒可包含下列中的任意一種或多種：拮抗劑、抗TrkA抗體或者藥物參照材料；蛋白純化柱；免疫球蛋白親和純化緩衝劑；細胞的測定稀釋劑；說明書或者文獻等。抗TrkA抗體可被用於不同類型的診斷測試，例如可以在體外或者體內檢測各種各樣的疾病或者藥物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通過對受試者的血清或者血液進行檢測，用來測試相關疾病。這種相關疾病可包括TrkA相關疾病，例如疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神經變性疾病、舍葛籣氏綜合征、子宮內膜異位、糖尿病性周圍神經病變、前列腺炎、盆腔疼痛綜合征、與骨重塑調節失衡相關 的疾病以及由結締組織生長因數異常信號傳導引起的疾病等等。當然本文提供的抗體也可以用於上述疾病的放射免疫檢測和放射免疫治療等等。
具體地，上述疼痛、炎症或炎性疾病、神經變性疾病、舍葛籣氏綜合征、子宮內膜異位、糖尿病性周圍神經病變、前列腺炎、盆腔疼痛綜合征、與骨重塑調節失衡相關 的疾病以及由結締組織生長因數異常信號傳導引起的疾病包括神經性疼痛、炎性疼痛、與癌症有關的疼痛、與骨折有關的疼痛、與手術有關的疼痛、炎性肺病、間質性膀胱炎、痛性膀胱綜合征、炎性腸疾病、炎性皮膚病、雷諾氏綜合征、特發性肺纖維化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心內膜心肌纖維化、心房纖維化、骨髓纖維化、進行性塊狀纖維化(肺)、腎源性系統性纖維化、硬皮病、系統性硬化、關節纖維化、眼部纖維化。
這些癌症或者腫瘤可以是任何不受調控的細胞生長。具體地，可以是非小細胞肺癌、乳頭狀甲狀腺癌、多形性成膠質細胞瘤、結腸直腸癌、黑色素瘤、膽管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大細胞神經內分泌癌、前列腺癌、成神經細胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌或胃癌等等。
在利用本發明所提供的抗TrkA抗體治療上述疾病時，可以將本發明提供的抗TrkA抗體提供給受試者即可。為此，本發明提供了一種用於治療上述疾病的方法，包括向有需要的受試者施用本發明所提供的的抗體或其抗原結合片段。
下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
實施例1 雜交瘤技術篩選抗TrkA單克隆抗體
通過雜交瘤技術和ELISA方法篩選可以產生分子水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的雜交瘤細胞株。採用NCBI資料庫設計出TrkA蛋白胞外區編碼基因，構建到哺乳動物真核表達系統中，表達得到TrkA蛋白胞外區，用於抗TrkA單克隆抗體篩選。免疫原TrkA蛋白胞外區來源於北京義翹神州生物科技有限公司，Balb/C小鼠三次腹腔注射免疫後，ELISA方法測定免疫小鼠血清抗體滴度，達到105級。脾臟注射加強免疫後，與骨髓瘤細胞融合。採用HAT選擇培養基和HT選擇培養基選擇性培養篩選融合的雜交瘤細胞株，採用ELISA方法篩選能產生抗TrkA抗體的陽性雜交瘤細胞株，採用有限稀釋法進行陽性雜交瘤細胞的克隆化培養，篩選穩定的能產生抗TrkA單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經三次克隆化培養，四次ELISA檢測後，共篩選得到147株陽性單克隆雜交瘤細胞株。將NGF生物素化，利用NGF可以結合TrkA蛋白胞外區，抗TrkA單克隆抗體也可以結合TrkA蛋白胞外區，設計競爭性實驗，通過ELISA方法，檢測抗TrkA單克隆抗體作用下，NGF與TrkA蛋白胞外區結合情況，篩選分子水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體。圖1是147株陽性單克隆雜交瘤細胞株中能產生分子水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的9株雜交瘤細胞株的阻斷實驗結果，即經篩選共得到9株能產生分子水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞株，實驗結果見圖1。圖中，OD450反映了與TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號，讀值越高，表明與TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號越強，抗體阻斷NGF與TrkA結合的效果越差；如圖所示，與陰性克隆組相比，9個陽性克隆組的ELISA讀值顯著性的降低，與TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號顯著性降低；可見，這9個陽性克隆能通過產生抗TrkA單克隆抗體阻斷NGF與TrkA蛋白胞外區結合，降低與TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號。
實施例2 HEK-293T-TrkA細胞模型篩選抗TrkA單克隆抗體
利用慢病毒技術構建HEK-293T-TrkA細胞模型，通過流式細胞術，篩選可以產生細胞水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將NGF生物素化，利用NGF可以結合HEK-293T-TrkA細胞上的TrkA蛋白胞外區，抗TrkA單克隆抗體也可以結合HEK-293T-TrkA細胞上的TrkA蛋白胞外區，設計競爭性實驗，通過流式細胞術，檢測抗TrkA單克隆抗體作用下，NGF與HEK-293T-TrkA細胞上TrkA蛋白胞外區結合情況，篩選細胞水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體。經篩選共得到9株能產生細胞水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞株，與分子水準阻斷實驗結果一致，實驗結果見圖2，圖中， % parent值反映了與HEK-293T-TrKA細胞上TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號，讀值越高，表明與HEK-293T-TrKA細胞上TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號越強，抗體阻斷NGF與TrkA結合的效果越差；如圖所示，與陰性克隆組相比，9個陽性克隆組的% parent值顯著性的降低，與TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號顯著性降低；可見，這9個陽性克隆能通過產生抗TrkA單克隆抗體阻斷NGF與HEK-293T-TrkA細胞上TrkA蛋白胞外區結合，降低與HEK-293T-TrkA細胞上TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號。
實施例3 應用ELISA方法檢測陽性克隆產生單克隆抗體的人鼠交叉反應
通過ELISA方法檢測各陽性克隆上清產生的單克隆抗體與Mouse-TrKA受體的結合情況，檢測陽性克隆產生單克隆抗體的人鼠交叉反應，結果見圖3，圖中，OD450值反映抗體與蛋白的結合強弱，讀值越大表示抗體與蛋白的結合越強。如圖所示，23E12、21E5、15D4、27H3組的OD450值在3.5左右，與陰性對照組相比有顯著性差異；20C8、1B9、4H4、3A5、22D12組的OD450值幾乎接近於0，與陰性克隆組相比沒有顯著性差異。可見，克隆23E12、21E5、15D4、27H3能產生與Human-TrKA和Mouse-TrKA都結合的單克隆抗體，存在人鼠交叉反應。
實施例4 載體的構建
採用分子克隆的方法構建一系列（20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4）嵌合抗體表達載體，在CHO表達系統中，重組表達嵌合抗體。編碼一系列（20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4）嵌合單克隆抗體輕重鏈的核苷酸序列是委託金唯智生物科技有限公司通過化學合成獲得的，所獲得的序列經雙酶切後，插入到真核表達載體的相同酶切位點間，構建一系列（20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4）嵌合抗體表達載體。然後採用Invitrogen質粒提取試劑盒提取一系列經驗證正確的表達載體，並用限制性內切酶進行線性化後純化回收，-20 ℃保藏。
實施例5 編碼一系列嵌合抗體載體轉染並在細胞中表達
將CHO宿主細胞用CD CHO培養基復蘇培養後，當細胞密度約8*105 cell/mL時收集細胞進行轉染。轉染細胞約1*107 cell，載體約40 μg，通過電擊方法轉染（Bio-Rad，Gene pulser Xcell）。電擊後細胞於20 mL CD CHO培養基中培養。培養第二天，離心收集細胞，並在加入MSX至終濃度50 μM的20 mL CD CHO培養基中重懸培養。當細胞密度約0.6*106 cell/mL時，對獲得的混合克隆株用CD CHO培養基進行傳代，傳代細胞密度約0.2*106 cell/mL。當細胞存活率約90%時，收集細胞培養液。
實施例6收集細胞發酵培養液純化嵌合抗體
對一系列的嵌合抗體進行翻譯水準上的檢測。採用Protein A層析柱對收集的細胞培養液進行純化，並收集吸收峰，進行質譜檢測，質譜檢測一系列嵌合抗體分子量150 KD左右，與理論分子量一致。同時對收集的樣品經還原與非還原後通過10% SDS-PAGE電泳檢測，還原型SDS-PAGE電泳圖譜顯示二條帶，分別在25 KD和50 KD左右，非還原型SDS-PAGE電泳圖譜顯示單一條帶，在150 KD左右，電泳圖譜條帶大小與理論一致。純化後樣品採用pH7.4的0.02M PBS緩衝液在4 ℃透析過夜。
在以下實施例7至16中，發明人評價了所構建純化獲得的嵌合抗體20C8、23E12、27H3、21E5、2A5、4H4、1B9、22D12、15D4的與TrkA的親和力和結合TrkA、阻斷NGF與TrkA蛋白胞外區結合的活性。
實施例 7 應用HEK-293T-TrkA細胞模型評價受試抗體的阻斷活性
將NGF生物素化，利用NGF可以結合HEK-293T-TrkA細胞上的TrkA蛋白胞外區，抗TrkA單克隆抗體也可以結合HEK-293T-TrkA細胞上的TrkA蛋白胞外區，設計競爭性實驗，通過流式細胞術，檢測不同濃度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL）受試抗體作用下，NGF與HEK-293T-TrkA細胞上TrkA蛋白胞外區結合情況，研究受試抗體對NGF和TrKA結合的抑制作用。實驗結果見圖4。圖中，parent %值反映了與HEK-293T-TrkA細胞上TrKA蛋白胞外區結合的NGF信號，讀值越低，與HEK-293T-TrkA細胞上TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號越弱，抗體抑制NGF與TrKA結合的作用越大；如圖所示，隨著受試抗體濃度的增加，parent %值逐漸降低，直到趨近於零，即與TrkA蛋白胞外區結合的NGF信號逐漸降低，直到沒有NGF結合TrkA蛋白胞外區，NGF與TrkA的結合全部抑制。可見，一定的濃度範圍內，各受試抗體在細胞水準上能夠劑量依賴性的抑制NGF與TrkA的結合。
實施例8 應用NIH-3T3-TrkA細胞模型評價受試抗體的體外活性
在NGF刺激下， NIH-3T3-TrkA細胞膜上的TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水準上調，TrkA下游信號通路啟動。受試抗體可以結合NIH-3T3-TrkA細胞膜表面的TrkA蛋白，抑制 NGF的刺激，下調TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水準。試驗中，以IgG4為陰性對照（該抗體不結合NGF及TrkA），tanezumab(抗NGF單克隆抗體，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO:149所示，重鏈氨基酸序列如SEQID NO:150所示，抑制NGF-TrkA通路藥物)、MNAC13(抗TrKA單克隆抗體，輕鏈氨基酸序列如SEQ ID NO:151所示，重鏈氨基酸序列如SEQID NO:152所示，抑制NGF-TrkA通路藥物)為陽性對照，其中，Tanezumab用於驗證NIH-3T3-TrkA細胞模型是否可以用於評價抑制NGF-TrkA通路藥物（受試藥物）的體外活性，實驗資料如圖5所示。通過AlphaLISA的方法檢測不同濃度受試抗體及陽性抗體MNAC13作用下，TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水準下調情況，衡量受試抗體的體外活性，p-TrkA檢測結果見圖6，實驗結果顯示，受試抗體及陽性抗體MNAC13均能抑制NGF-TrKA通路，劑量依賴性地下調TrkA蛋白酪氨酸磷酸化水準，其中，受試抗體23E12、20C8、27H3、21E5、1B9、4H4的半數抑制濃度IC50小於陽性抗體MNAC13。可見，受試抗體23E12、20C8、27H3、21E5、1B9、4H4的體外活性優於陽性抗體MNAC13。 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:149）。 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO:150）。 DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPKLLIYTTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCHQWSSYPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO:151）。 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYTMSWARQAPGKGLEWVAYISKGGGSTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDSAVYYCARGAMFGNDFFFPMDRWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG（SEQ ID NO:152）。
實施例9 應用Fortebio方法評價受試抗體與TrkA的親和力
將受試抗體（23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5）樣品分別用緩衝液（PBS緩衝液100 ml，加入0.1 gBSA攪拌至充分溶解，再加入20 μL的吐溫20，混合均勻）稀釋至4個濃度梯度(80 nM、26.67 nM、8.89 nM、2.93 nM)，分別加入到樣品板的各孔中，通過親和力檢測系統 （OCTET RED 96 SYSTEM），用帶有Ni-NTA感測器（廠家：PALL，貨號：18-5101）結合帶有組氨酸標籤的TRKA（50μg/ml，75 kDa ，HEC實驗室提供）蛋白後，自動檢測其與各受試抗體的結合情況，結果見表1。KD 值是抗體與其抗原之間的平衡解離常數，KD 值與親和力成反比。KD 值與抗體的濃度（特定實驗所需的抗體量）有關，KD 值越低（濃度越低），抗體的親和力越高。通常認為，高親和力抗體處於低納摩爾範圍內 (10-9 )。表1結果顯示，受試抗體（23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5）的KD 值處於低納摩爾範圍內(10-9)，表明，受試抗體都具有很高的親和力。 [表1]
Sample ID KD (M) kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error Full  R^2
23E12 5.70E-11 1.90E+06 6.33E+04 1.09E-04 7.47E-06 0.944
4H4 1.68E-09 1.39E+05 6.01E+03 2.34E-04 1.55E-05 0.961
20C8 1.15E-10 5.51E+05 2.34E+04 6.33E-05 1.17E-05 0.949
27H3 1.78E-10 1.57E+06 4.53E+04 2.79E-04 7.91E-06 0.929
21E5 1.73E-10 1.01E+06 2.08E+04 1.75E-04 5.60E-06 0.977
1B9 8.99E-10 1.01E+06 6.65E+04 9.04E-04 6.29E-05 0.910
2A5 1.62E-11 2.22E+05 1.42E+04 3.60E-06 1.96E-05 0.944
實施例10 應用流式細胞術評價受試抗體的親和力
將受試抗體（23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5）樣品分別用PBS緩衝液稀釋至11個濃度梯度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL），通過流式細胞術檢測各濃度梯度受試抗體與HEK-293T-TrKA細胞表面TrKA受體的結合情況，從細胞水準評價受試抗體的親和力，結果見圖7。圖中，EC50 (半數結合濃度)值反映抗體的親和力高低，EC50 值越小，抗體的親和力越高，通常認為，高親和力抗體的EC50 值低於1.5 μg/mL。圖中結果顯示，受試抗體23E12、20C8、21E5、27H3、1B9、4H4、2A5的EC50 值均低於1.5 μg/mL，表明，受試抗體都具有很高的親和力。
實施例11 應用ELISA方法評價受試抗體與靶標TrKA結合的特異性
TrkA受體家族屬於受體酪氨酸激酶(RTKs) ，包括TrkA、TrkB和TrkC，它們具有很高的同源性。TrkA 是神經生長因數( NGF) 的受體酪氨酸激酶，選擇性結合NGF，是NGF的功能性受體。除高親和力受體TrkA 外，NGF 還可與其低親和力受體p75 結合。試驗中，通過ELISA方法檢測不同濃度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL）受試抗體分別與TrKA、TrKB、TrKC、p75的結合情況，評價受試抗體與靶標TrKA結合的特異性，結果如圖8A至8G所示。圖中，一定的抗體濃度下，OD450值反映抗體與蛋白的結合強弱，讀值越大抗體與蛋白的結合越強。實驗結果顯示，受試抗體23E12、20C8、27H3、21E5、1B9、4H4、2A5與TrKA受體都有很好的結合（受試抗體濃度由0μg/mL增加到20μg/mL，OD450 值逐漸增加直至趨近穩定，接近3左右），與TrKB、TrKC、p75基本不結合（各受試抗體濃度由0 μg/mL增加到20 μg/mL，OD450 值基本沒有變化，接近於0）。可見，受試抗體與靶標TrKA結合的特異性都很好。
實施例12 應用ELISA方法檢測受試抗體與Mouse-TrKA蛋白的結合能力
將受試抗體（23E12、21E5）樣品分別用PBS緩衝液稀釋至11個濃度梯度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL），通過ELISA方法檢測各濃度梯度受試抗體與Mouse-TrKA受體的結合情況，檢測受試抗體與Mouse-TrKA蛋白的結合能力，結果見圖9。圖中，一定的抗體濃度下，OD450 值反映抗體與蛋白的結合強弱，讀值越大抗體與蛋白的結合越強。實驗結果顯示，受試抗體的濃度由0 μg/mL增加到20 μg/mL，OD450 值逐漸增加直至趨近穩定，接近3.5左右。可見，受試抗體23E12、21E5和Mouse-TrKA蛋白都有很好的結合能力。
實施例13 應用流式細胞術檢測受試抗體與Mouse-TrKA蛋白的結合能力
將受試抗體23E12樣品分別用PBS緩衝液稀釋至11個濃度梯度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL），通過流式細胞術檢測各濃度梯度受試抗體與HEK293T-Mouse-TrKA細胞表面Mouse-TrKA受體的結合情況，檢測受試抗體與Mouse-TrKA蛋白的結合能力，結果見圖10。圖中，EC50 (半數結合濃度)值反映抗體的結合能力，EC50 值越小，抗體的結合能力越強，實驗結果顯示，受試抗體的濃度由0 μg/mL增加到20 μg/mL，%Parent值逐漸增加直至趨近穩定，EC50 值=0.08012 μg/mL。可見，受試抗體23E12與HEK293T-Mouse-TrKA細胞表面Mouse-TrKA受體有很好的結合能力。
實施例14 應用ELISA方法檢測受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用
試驗中，以IgG4為陰性對照（該抗體不結合Mouse-NGF及Mouse-TrkA），將Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以結合Mouse-TrkA蛋白，抗Mouse-TrkA單克隆抗體也可以結合Mouse-TrkA蛋白，設計競爭性實驗，通過ELISA方法，檢測不同濃度（2.5 μg/mL，0.25 μg/mL）受試抗體（23E12，21E5）作用下，Mouse-NGF與Mouse-TrkA蛋白結合情況，研究受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用。實驗結果見圖11。圖中，OD450 值反映了與Mouse-TrkA結合的Mouse-NGF信號。讀值越低，與Mouse-TrkA結合的Mouse-NGF信號越弱，抗體抑制Mouse-NGF與Mouse-TrKA結合的作用越大；如圖所示，與陰性對照組相比，不同濃度（2.5 μg/mL，0.25 μg/mL）受試抗體（23E12，21E5）作用下，與Mouse-TrkA結合的Mouse-NGF信號顯著性降低。可見，受試抗體23E12、21E5能夠抑制Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合。
實施例15  應用流式細胞術檢測受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用
將Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以結合HEK293T-Mouse-TrkA細胞上的Mouse-TrkA蛋白胞外區，抗Mouse-TrkA單克隆抗體也可以結合HEK293T-Mouse-TrkA細胞上的Mouse-TrkA蛋白胞外區，設計競爭性實驗，通過流式細胞術，檢測不同濃度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL）受試抗體作用下，Mouse-NGF與HEK-293T-Mouse-TrkA細胞上Mouse-TrkA蛋白胞外區結合情況，研究受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用。實驗結果見圖12。圖中，parent %值反映了與HEK293T-Mouse-TrkA細胞上Mouse-TrKA蛋白胞外區結合的Mouse-NGF信號，讀值越低，與HEK293T-Mouse-TrkA細胞上Mouse-TrkA蛋白胞外區結合的Mouse-NGF信號越弱，抗體抑制Mouse-NGF與Mouse-TrKA結合的作用越大；如圖所示，隨著受試抗體濃度的增加，%parent 值逐漸降低，直到趨近於零，即與Mouse-TrkA蛋白胞外區結合的Mouse-NGF信號逐漸降低，直到沒有Mouse-NGF結合Mouse-TrkA蛋白胞外區，Mouse-NGF與Mouse-TrkA的結合全部抑制，IC50=0.05147 μg/mL。可見，一定的濃度範圍內，受試抗體23E12在細胞水準上能夠劑量依賴性的抑制Mouse-NGF與Mouse-TrkA的結合。
實施例16 應用ELISA方法檢測受試抗體對Human-NGF和Human-TrKA結合的抑制作用
將Mouse-NGF生物素化，利用Mouse-NGF可以結合Mouse-TrkA蛋白，抗Mouse-TrkA單克隆抗體也可以結合Mouse-TrkA蛋白，設計競爭性實驗，通過Elisa方法，檢測不同濃度（20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL）受試抗體作用下，Mouse-NGF與Mouse-TrkA蛋白結合情況，研究受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用。實驗結果見圖13。圖中，OD450 值反映了與Mouse-TrkA結合的Mouse-NGF信號。讀值越低，與Mouse-TrkA結合的Mouse-NGF信號越弱，抗體抑制Mouse-NGF與Mouse-TrKA結合的作用越大；如圖所示，隨著受試抗體濃度的增加，OD450 值逐漸降低，直到趨近於零，即與Mouse-TrkA蛋白胞外區結合的Mouse-NGF信號逐漸降低，直到幾乎沒有Mouse-NGF結合Mouse-TrkA蛋白胞外區，Mouse-NGF與Mouse-TrkA的結合幾乎完全抑制。可見，一定的濃度範圍內，受試抗體23E12、20C8、21E5、27H3、4H4、2A5在分子水準上能夠劑量依賴性的抑制NGF與TrkA的結合。
實施例17 應用福馬林致痛模型評價受試抗體的體內鎮痛活性
福馬林炎症痛模型是通過注射福馬林來產生持續而非短暫的疼痛刺激及應答的驗證痛模型。該模型產生兩相疼痛，分別是第I相化學刺激疼痛和第II相炎症疼痛，造成的疼痛應答具有可重複性、可計量性，是臨床前疼痛研究最佳的模型之一，且被廣泛應用於評估不同藥物的鎮痛效果。試驗中，選用6-8周雄性ICR小鼠，造模前根據體重隨機分為6組：模型組（皮下注射生理鹽水）、Tanezumab 60 μg/mouse劑量組、20C8 60 μg/mouse劑量組 、21E5 60 μg/mouse劑量組、23E12 15 μg/mouse劑量組、23E12 60 μg/mouse劑量組，每組10只。藥物經皮下給藥，18個小時後於小鼠右後爪足背皮下注射2.5%福馬林溶液15 μL，觀察其後45分鐘內小鼠抬腳次數，記1-15 min為第I相疼痛，16-45 min為第II相疼痛，一般而言，第I相疼痛反映的是急性疼痛，第II相疼痛反映的是慢性疼痛。結果見圖14（圖中資料展示為Mean±SEM, n=10/組，*p>0.05與溶劑模型組比較，使用單因素方差分析附加LSD多重比較檢驗），圖中抬腳次數反映小鼠造模後的疼痛強度，抬腳次數越少，疼痛越弱。結果顯示，與模型組相比，23E12 60 μg/mouse劑量組能顯著減少小鼠第II相疼痛的抬腳次數，其它劑量組未能降低小鼠造模後的抬腳次數。結論：在福馬林致痛模型中，皮下注射60 μg/mouse的受試抗體23E12對於慢性疼痛有效，而陽性藥Tanezumab未體現鎮痛效果，可能對福馬林致痛模型不敏感。
實施例18 應用完全弗氏佐劑誘導炎症疼痛模型評價受試抗體的體內鎮痛活性
完全弗氏佐劑誘導炎症痛模型通過在小鼠掌心注射完全弗氏佐劑來產生類似骨關節炎症的慢性炎症疼痛刺激及應答的疼痛模型，通過機械痛測試對疼痛測量，機械刺激力度越大，說明動物對疼痛的耐受性越強。試驗中，選用8周齡雄性ICR小鼠，在造模前根據疼痛敏感隨機分為6組（15只/組）：對照組（小鼠左後肢足底注射生理鹽水25 μl+皮下注射生理鹽水），模型組（小鼠左後肢足底注射25 μl CFA誘導炎性痛+皮下注射生理鹽水）、Tanezumab 60 μg/mouse 劑量組，23E12 60 μg/mouse 劑量組，在造模後第4天皮下注射藥物，給藥後36 hr 進行機械痛測試。結果見圖15（圖中資料展示為Mean±SEM，n=15/組，#p＜0.05，##p＜0.01與空白對照組比較， *p＜0.05，**p＜0.01與模型組比較，使用非參數統計分析附加獨立樣本T檢驗），縱坐標表示機械刺激力度，小鼠爪子撤離的壓力閾值越大，鎮痛效果越好。結果顯示：與模型組比較，皮下注射60 μg/mouse 23E12、60 μg/mouse tanezumab能夠顯著增加小鼠爪子撤離的壓力閾值（P＜0.01；P＜0.05），呈現鎮痛作用，兩者鎮痛效果作用效果相當。結論：皮下注射60 μg/mouse的受試抗體23E12，在完全弗氏佐劑誘導的炎症痛模型中呈現鎮痛作用。
實施例19 受試抗體毒理實驗
在本實施例中，發明人所要進行的毒性測試如下表2所示。 [表2]
研究專案 給藥方式 種屬 or 探究系統 主要研究 結果
單次給藥毒性 i.v． SD大鼠 觀察是否出現靶器官毒性。觀察相關的症狀，對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量的影響，提供最大耐受劑量MTD，足夠的安全係數， 無動物死亡，在器官和組織上觀察到彌散型炎症浸潤，但是無論臨床病理還是組織學分析，都沒有顯示出靶器官毒性。對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量無顯著影響。大體解剖無顯著異常。
食蟹猴
重複給藥毒性 i.v．/（一週一次，4周） SD大鼠 觀察臨床病理學和組織學確定是否存在靶器官毒性NOAEL，觀察對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量的影響，免疫原性（ADA（抗藥抗體）分析方法），免疫毒性研究（評價內容包括：血液學白細胞分類計數（包括巨噬細胞）、臨床化學（球蛋白和白蛋白：球蛋白比值）），器官品質（胸腺、脾臟、淋巴結）和組織病理學（淋巴器官和組織）計算安全窗 無動物死亡，在器官和組織上觀察到彌散型炎症浸潤，但是無論臨床病理還是組織學分析，都沒有顯示出靶器官毒性。沒有出現納武單抗相關的症狀，對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量無顯著影響。大體解剖無顯著異常。
食蟹猴
一般安全藥理學 i.v．/單次給藥 中樞神經系統 主要研究藥物在治療範圍內或治療範圍以上的劑量時，潛在的不期望出現的對生理功能的不良影響，即觀察藥物對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的影響。 藥物對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的無影響。
呼吸系統
心血管系統
局部給藥安全性實驗 血管刺激性實驗和體外溶血實驗 兔 檢驗藥物對血管和血液是否有影響 無影響
高致敏性試驗 豚鼠全身主動過敏實驗 豚鼠 判斷是否有致敏作用 無致敏作用
其中，上述實驗過程和實驗結論如下所述：
毒理實驗：
單次給藥毒性
SD大鼠、食蟹猴，觀察是否出現靶器官毒性。觀察相關的症狀，對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量的影響，提供最大耐受劑量MTD，足夠的安全係數。結果顯示：無動物死亡，在器官和組織上觀察到彌散型炎症浸潤，但是無論臨床病理還是組織學分析，都沒有顯示出靶器官毒性。對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量無顯著影響。大體解剖無顯著異常。
重複給藥毒性：SD大鼠、食蟹猴，一週一次靜脈注射藥物，連續4周，觀察臨床病理學和組織學確定是否存在靶器官毒性NOAEL，觀察對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量的影響，免疫原性「ADA（抗藥抗體）分析方法」，免疫毒性研究「評價內容包括：血液學白細胞分類計數（包括巨噬細胞）、臨床化學（球蛋白和白蛋白：球蛋白比值）」，器官品質（胸腺、脾臟、淋巴結）和組織病理學（淋巴器官和組織）計算安全窗。結果顯示：無動物死亡，在器官和組織上觀察到彌散型炎症浸潤，但是無論臨床病理還是組織學分析，都沒有顯示出靶器官毒性。沒有出現納武單抗相關的症狀，對體重、攝食、檢眼鏡檢查、心電圖、血液學、臨床生化、尿液、臟器重量無顯著影響。大體解剖無顯著異常。
一般安全藥理學：SD大鼠單次靜脈注射藥物，觀察藥物對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的影響。結果顯示：藥物對中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統的無影響。
局部給藥安全性實驗（血管刺激性實驗和體外溶血實驗）：紐西蘭大白兔靜脈注射藥物，檢驗藥物對血管和血液是否有影響。結果顯示：無影響。
高致敏性試驗（豚鼠全身主動過敏實驗）：豚鼠單次靜脈注射藥物，觀察其是否有致敏作用。結果顯示：無致敏作用。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、 “示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特徵進行結合和組合。
儘管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的範圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
圖1為根據本發明實施例的通過ELISA方法篩選得到的9株能產生分子水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞株的實驗結果圖。 圖2為根據本發明實施例的流式篩選得到的9株能產生細胞水準阻斷NGF和TrkA結合的抗TrkA單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞株的實驗結果圖，%parent(百分比)。 圖3為根據本發明實施例的ELISA方法檢測各陽性克隆上清產生的單克隆抗體與Mouse-TrKA受體的結合情況的實驗結果圖。 圖4為根據本發明實施例的應用HEK-293T-TrkA細胞模型評價受試抗體的阻斷活性的結果圖， %parent（百分比）。 圖5為根據本發明實施例的Tanezumab驗證NIH-3T3-TrkA細胞模型是否可以用於評價抑制NGF-TrkA通路藥物（受試藥物）的體外活性的結果圖。 圖6為根據本發明實施例的通過AlphaLISA的方法檢測受試抗體及陽性抗體MNAC13作用下，TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水準的實驗結果圖，p-TrkA level(TrkA蛋白的酪氨酸磷酸化水準)。 圖7為根據本發明實施例的通過流式細胞術檢測受試抗體親和力EC50的結果圖。 圖8A至8G為根據本發明實施例的ELISA方法評價受試抗體與靶標TrKA結合的特異性的結果圖。 圖9為根據本發明實施例的應用ELISA方法檢測受試抗體對Mouse-TrKA蛋白的結合能力的結果圖。 圖10為根據本發明實施例的應用流式細胞術檢測受試抗體與Mouse-TrKA蛋白的結合能力的結果圖。 圖11為根據本發明實施例的應用ELISA方法檢測受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用的結果圖。 圖12為根據本發明實施例的應用流式細胞術檢測受試抗體對Mouse-NGF和Mouse-TrKA結合的抑制作用的結果圖。 圖13為根據本發明實施例的應用ELISA方法檢測受試抗體對Human-NGF和Human-TrKA結合的抑制作用的結果圖。 圖14為根據本發明實施例的應用福馬林致痛模型評價受試抗體的體內鎮痛活性的結果圖；以及 圖15為根據本發明實施例的應用完全弗氏佐劑誘導炎疼痛模型評價受試抗體的體內鎮痛活性的結果圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120
Figure 12_A0101_SEQ_0121
Figure 12_A0101_SEQ_0122
Figure 12_A0101_SEQ_0123
Figure 12_A0101_SEQ_0124
Figure 12_A0101_SEQ_0125
Figure 12_A0101_SEQ_0126
Figure 12_A0101_SEQ_0127
Figure 12_A0101_SEQ_0128
Figure 12_A0101_SEQ_0129
Figure 12_A0101_SEQ_0130
Figure 12_A0101_SEQ_0131
Figure 12_A0101_SEQ_0132
Figure 12_A0101_SEQ_0133

Claims (33)

  1. 一種能夠特異性識別TrkA的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體含有選自下列至少之一的CDR序列或與其具有至少95%同一性的氨基酸序列： 重鏈可變區CDR序列：SEQ ID NO: 1~27， 輕鏈可變區CDR序列：SEQ IN NO: 28~54。
  2. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體包括： 分別如SEQ ID NO: 1、2和3或者與SEQ ID NO: 1、2和3具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 4、5和6或者與SEQ ID NO:4、5和6具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 7、8和9或者與SEQ ID NO: 7、8和9具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO:10、11和12或者與SEQ ID NO: 10、11和12具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO:13、14和15或者與SEQ ID NO: 13、14和15具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO:16、17和18或者與SEQ ID NO: 16、17和18具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO19、20和21或者與SEQ ID NO: 19、20和21具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO:22、23和24或者與SEQ ID NO: 22、23和24具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO:25、26和27或者與SEQ ID NO: 25、26和27具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的重鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列。
  3. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體包括： 分別如SEQ ID NO: 28、29和30或者與SEQ ID NO: 28、39和30具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 31、32和33或者與SEQ ID NO: 31、32和33具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 34、35和36或者與SEQ ID NO: 34、35和36具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 37、38和39或者與SEQ ID NO: 37、38和39具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 40、41和42或者與SEQ ID NO: 40、41和42具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 43、44和45或者與SEQ ID NO: 43、44和45具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 46、47和48或者與SEQ ID NO: 46、47和48具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 49、50和51或者與SEQ ID NO: 49、50和51具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列；或者 分別如SEQ ID NO: 52、53和54或者與SEQ ID NO: 52、53和54具有至少95%同一性的氨基酸序列所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2、CDR3序列。
  4. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體或其抗原結合片段特異性識別TrkA的胞外區。
  5. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體含有重鏈框架區序列和輕鏈框架區序列的至少之一，所述重鏈框架區序列和輕鏈框架區序列的至少之一的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
  6. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體具有如SEQ ID NO：55~63任一項所示氨基酸序列的重鏈可變區。
  7. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體具有如SEQ ID NO：64~72任一項所示氨基酸序列的輕鏈可變區。
  8. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體含有重鏈恒定區和輕鏈恒定區的至少之一，所述重鏈恒定區和輕鏈恒定區的至少之一的至少一部分來自於鼠源抗體、人源抗體、靈長目源抗體或其突變體的至少之一。
  9. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體的輕鏈恒定區和重鏈恒定區均來自於人源IgG抗體或其突變體。
  10. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體的輕鏈恒定區和重鏈恒定區均來自於人源IgG4。
  11. 如請求項10所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體的Fc區域與野生型相比具有S10P，F16A，L17A，R191K突變以及229 K缺失突變。
  12. 如請求項10所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體恒定區的全長序列如SEQ ID NO:74或75所示。
  13. 如請求項10所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體具有SEQ ID NO:76~84任一項所示氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO:85~93任一項所示氨基酸序列的輕鏈。
  14. 如請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體為單鏈抗體、多聚體抗體、CDR移植抗體或小分子抗體。
  15. 如請求項14所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述抗體為單鏈抗體，所述抗體具有SEQ ID NO:94~111所示的氨基酸序列。
  16. 如請求項14所述的抗體或其抗原結合片段，其特徵在於，所述小分子抗體包括Fab抗體、Fv抗體、單域抗體以及最小識別單位的至少之一。
  17. 一種核酸分子，其特徵在於，所述核酸分子編碼為請求項1至16任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  18. 如請求項17所述的核酸分子，其特徵在於，所述核酸分子為DNA。
  19. 如請求項18所述的核酸分子，其特徵在於，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:112~120任一項所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:121~129任一項所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:130~147任一項所示核苷酸序列。
  20. 一種表達載體，其特徵在於，攜帶請求項17至19任一項所述的核酸分子。
  21. 如請求項20所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體為真核表達載體。
  22. 一種重組細胞，其特徵在於，所述重組細胞攜帶請求項17至19任一項所述的核酸分子，或者表達請求項1至16任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  23. 如請求項22所述的重組細胞，其特徵在於，所述重組細胞是通過將請求項20或21所述的表達載體引入至宿主細胞中而獲得的。
  24. 如請求項23所述的重組細胞，其特徵在於，通過電轉導的方法將所述表達載體引入所述宿主細胞中。
  25. 如請求項22所述的重組細胞，其特徵在於，所述重組細胞為真核細胞。
  26. 如請求項22所述的重組細胞，其特徵在於，所述重組細胞為哺乳動物細胞。
  27. 一種藥物組合物，其特徵在於，含有請求項1至16任一項所述的抗體，請求項17至19任一項所述的核酸分子，請求項20至21任一項所述的表達載體或請求項22至26任一項所述的重組細胞。
  28. 請求項1至16任一項所述的抗體、請求項17至19任一項所述的核酸分子、請求項20至21任一項所述的表達載體或請求項22至26任一項所述的重組細胞、根據請求項27所述的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或者預防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神經變性疾病、舍葛籣氏綜合征、子宮內膜異位、糖尿病性周圍神經病變、前列腺炎、盆腔疼痛綜合征、與骨重塑調節失衡相關的疾病以及由結締組織生長因數異常信號傳導引起的疾病。
  29. 如請求項28所述的用途，其特徵在於，所述藥物用於治療或預防神經性疼痛、炎性疼痛、與癌症有關的疼痛、與骨折有關的疼痛、與手術有關的疼痛、炎性肺病、間質性膀胱炎、痛性膀胱綜合征、炎性腸疾病、炎性皮膚病、雷諾氏綜合征、特發性肺纖維化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心內膜心肌纖維化、心房纖維化、骨髓纖維化、進行性塊狀纖維化(肺)、腎源性系統性纖維化、硬皮病、系統性硬化、關節纖維化、眼部纖維化、非小細胞肺癌、乳頭狀甲狀腺癌、多形性成膠質細胞瘤、結腸直腸癌、黑色素瘤、膽管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大細胞神經內分泌癌、成神經細胞瘤、前列腺癌、成神經細胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌或胃癌。
  30. 一種檢測TrkA的試劑盒，其特徵在於，包含請求項1至16任一項所述的抗體。
  31. 如請求項1至16任一項所述的抗體、如請求項17至19任一項所述的核酸分子、請求項20至21任一項所述的表達載體或請求項22至26任一項所述的重組細胞在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測TrkA或者診斷TrkA相關的疾病。
  32. 一種小鼠B細胞，其特徵在於，所述B細胞的基因組中攜帶編碼恒定區的序列，所述恒定區序列與人IgG4的恒定區相比，存在S108P，F114A，L115A，R289K突變以及327 K缺失突變。
  33. 請求項32所述的小鼠B細胞在製備單克隆抗體中的用途。
TW109118203A 2019-05-30 2020-05-29 TrkA的抗體及其應用 TW202110888A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910464016 2019-05-30
CN201910464016.0 2019-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202110888A true TW202110888A (zh) 2021-03-16

Family

ID=73506735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109118203A TW202110888A (zh) 2019-05-30 2020-05-29 TrkA的抗體及其應用

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220204630A1 (zh)
EP (1) EP3976657A4 (zh)
JP (1) JP2022533855A (zh)
CN (2) CN114230663B (zh)
AU (1) AU2020281378A1 (zh)
TW (1) TW202110888A (zh)
WO (1) WO2020238998A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022105814A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Humanized anti-trka antibodies and uses thereof
CN112961244B (zh) * 2021-02-28 2023-08-29 熙源安健医药（上海）有限公司 抗TrkA抗体或其抗原结合片段、其制备方法和应用
WO2023125490A1 (en) * 2021-12-28 2023-07-06 4B Technologies (Suzhou) Limited TrkA ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF
CN115611985A (zh) * 2022-10-27 2023-01-17 合肥天港免疫药物有限公司 抗cd3的抗体及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0326780D0 (en) * 2003-11-18 2003-12-24 Imp College Innovations Ltd Biological materials and uses thereof
EP1810979B1 (en) * 2004-09-22 2012-06-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. STABILIZED HUMAN IgG4 ANTIBODIES
ITRM20050290A1 (it) * 2005-06-07 2006-12-08 Lay Line Genomics Spa Uso di molecole in grado di inibire il legame tra ngf e il suo recettore trka come analgesici ad effetto prolungato.
NZ587701A (en) * 2008-02-04 2013-03-28 Lay Line Genomics Spa Anti-trka antibodies and derivatives thereof
US8183346B2 (en) * 2008-12-05 2012-05-22 Eli Lilly And Company Anti-ferroportin 1 monoclonal antibodies and uses thereof
CA3182462A1 (en) * 2011-10-10 2013-04-18 Xencor, Inc. A method for purifying antibodies
CA2875703A1 (en) * 2012-06-08 2013-12-12 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-trka antibodies with enhanced inhibitory properties and derivatives thereof
EP2674439B1 (en) * 2012-06-13 2017-02-01 Rottapharm Biotech S.r.l. Anti-TrkA antibodies, derivatives and uses thereof
MA41097A (fr) * 2014-12-05 2017-10-10 Glenmark Pharmaceuticals Sa Anticorps anti-trka à propriétés inhibitrices améliorées et dérivés desdits anticorps destinés à être utilisés pour traiter les douleurs osseuses
US20190184015A1 (en) * 2016-09-02 2019-06-20 European Molecular Biology Laboratory Irradiation treatment of neurological sensations by photoablation
WO2018166461A1 (en) * 2017-03-14 2018-09-20 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Dual-target fusion proteins comprising the fc portion of an immunoglobulin

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020281378A1 (en) 2021-10-28
EP3976657A1 (en) 2022-04-06
CN114230663B (zh) 2022-09-27
US20220204630A1 (en) 2022-06-30
CN114230663A (zh) 2022-03-25
EP3976657A4 (en) 2023-07-05
CN112010978B (zh) 2022-04-08
WO2020238998A1 (en) 2020-12-03
CN112010978A (zh) 2020-12-01
JP2022533855A (ja) 2022-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10040847B2 (en) Methods of treating a tauopathy
TW202110888A (zh) TrkA的抗體及其應用
US10479830B2 (en) Anti eotaxin-2 antibodies that recognize additional CCR3-binding chemokines
EP3007726B1 (en) Methods of treating a tauopathy
EP3315515A1 (en) Fusion protein containing bdnf
JP2022110056A (ja) Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質
TW201333034A (zh) 新穎抗人類ｃｔｇｆ抗體
US20160122421A1 (en) Methods of treating a tauopathy
CN113444176A (zh) Ngf的抗体及其应用
WO2022105814A1 (en) Humanized anti-trka antibodies and uses thereof
KR20150014077A (ko) 항 Ang2 항체
KR20190132616A (ko) Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체