CN113444176A

CN113444176A - Ngf的抗体及其应用

Info

Publication number: CN113444176A
Application number: CN202110613320.4A
Authority: CN
Inventors: 龚皓; 任科云; 胡伶俐; 何超军; 王琳琳; 袁宏丽; 陈爱芳; 王飞; 邵杨茜; 龙伊迪; 胡尚杰; 曹旺; 韩强
Original assignee: Humanwell Healthcare Group Co ltd; Wuhan Humanwell Innovative Drug Research and Development Center Ltd Co
Current assignee: Humanwell Healthcare Group Co ltd; Wuhan Humanwell Innovative Drug Research and Development Center Ltd Co
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113444176B

Abstract

本发明提出了一种结合NGF的抗体或抗原结合片段。所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。上述抗体能够特异性的靶向结合NGF，阻断NGF和TrkA结合。

Description

NGF的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及NGF的抗体及其应用，更具体地，本发明涉及NGF的抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途、检测NGF的试剂盒。

背景技术

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是第一个被发现的神经营养因子家族成员，后续发现的同源蛋白还有脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT3)、神经营养因子4(NT4)等。神经营养因子是一种重要的功能性蛋白，在中枢和外周神经系统均有表达。NGF的作用主要和免疫、内分泌相关，除了对神经系统的作用外，目前已确定多种体细胞对NGF都有响应。NGF的主要活性由两种受体介导，酪氨酸受体激酶A(TrkA)和p75神经营养因子受体(p75NTR)，其中TrkA受体主要负责促进细胞的存活和生长，而p75NTR作为肿瘤坏死因子受体家族成员激活凋亡通路。NGF与TrkA的亲和力远高于p75NTR，对细胞存活和功能起正向作用。

NGF已被作为相关疾病或损伤的药用分子进行了一系列研究，包括阿尔兹海默症、脑外伤、皮肤伤口愈合、青光眼等。在NGF作为药品的研发过程中发现，注射这种神经营养因子会引起啮齿动物强烈且持续时间较长的痛觉过敏，在一项早期临床研究中，健康志愿者在皮下注射NGF后出现了注射部位过敏和肌肉疼痛的症状。人类基因突变研究发现先天性无痛无汗症(CIPA)患者由于TrkA缺失而对痛觉不敏感，而TrkA正是NGF的主要受体。对痛觉不敏感人群的基因分析也发现，NGF基因突变和痛觉敏感性有关联。引起剧烈或慢性疼痛的损伤及炎症组织中，NGF表达水平有所升高，这些现象提示NGF与痛觉敏感性有密切联系。已有实验证实用抗体对内源性NGF进行中和可产生止疼效果。在鼠模型研究中发现，抗神经生长因子单抗可抑制鼠肿瘤附近的神经增生和相关疼痛，也可降低鼠自身免疫关节炎疼痛。在针对骨关节炎患者的临床研究中，注射相应抗体可明显降低平均疼痛指数。

疼痛是临床严重影响患者生活质量的常见症状，癌症增加、慢性病增剧、手术量增加、生活方式改变等因素使疼痛患者人数以年增长10％扩大，据估计全球人口的20％都存在不同程度的疼痛困扰。中国慢性疼痛发病率预计达到20％-35％，老年人慢性疼痛发病率可高至65％-85％，随着人口老龄化，疼痛治疗的需求越来越大。现阶段疼痛管理水平仍需提升，主要瓶颈在于新治疗药物的缺乏，疼痛治疗药物仍以小分子尤其是阿片类药物为主，存在治疗局限性和成瘾性，这些药物存在安全及耐受问题。目前需要一种疗效好、效果持久、低耐受、更安全的药物来满足疼痛管理的需要。NGF是具有上述潜力的治疗靶点，以此为靶点的中和性抗体药物可能具有一定应用优势，一方面以更少的给药频次和更优的针对性作用使患者在疗效和安全性上有更多获益，另一方面可避免成瘾性的社会问题，为患者提供一种长效的非成瘾性止疼方式，提高依从性和生活质量，改善疼痛管理现状。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，本发明提供了一种抗人NGF的抗体或其抗原结合片段，能够与人NGF特异性结合，并竞争性抑制NGF与其功能受体TrkA的结合，从而发挥止疼效果。本发明所提供的NGF抗体或抗原结合片段有望用于镇痛治疗，产生长效镇痛效果，延长用药周期，提高依从性和生活质量。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种结合NGF的抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。根据本发明实施例的上述抗体能够特异性的靶向结合NGF，阻断NGF和TrkA结合。

RYAMS(SEQ ID.NO 1)。

TISSGGSYTYYPDSVKG(SEQ ID.NO 2)。

HGEFYGTTFDVHYFDY(SEQ ID.NO 3)。

SYWMH(SEQ ID.NO 4)。

AIYPGNSDTSYTQKFKG(SEQ ID.NO 5)。

PYGYDEDWYFNV(SEQ ID.NO 6)。

RASESVDSYGNSFMH(SEQ ID.NO 7)。

LASNLES(SEQ ID.NO 8)。

QQNNEDPLT(SEQ ID.NO 9)。

KASENVGTYVS(SEQ ID.NO 10)。

GASNRYT(SEQ ID.NO 11)。

GQSYSYPLT(SEQ ID.NO 12)。

根据本发明的实施例，上述结合NGF的抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ IDNO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别NGF。

根据本发明的实施例，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

根据本发明的实施例，所述抗体含有重链框架区序列，所述重链框架区序列包括FR1、FR2、FR3和FR4。

根据本发明的实施例，所述重链框架区序列FR1具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比，具有M3Q、D10G、K13Q、K19R至少之一突变的氨酸序列；和/或所述重链框架区序列FR2具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比，具有T5A、E7G、R9G、E11V、A14S至少之一突变的氨酸序列；和/或所述重链框架区序列FR3具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:15所示的氨基酸序列相比，具有T12S、S18N、S22A、M27V、F28Y至少之一突变的氨酸序列；和/或所述重链框架区序列FR4具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列相比，具有T6L、L7V至少之一突变的氨酸序列。根据本发明实施例的抗体的重链框架区序列具有上述突变，所得抗体的免疫原性可以得到有效降低。

EVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:13)。

WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:14)。

RFTISRDNAKNTLY LQMSSLRSEDTAMFYCAR(SEQ ID NO:15)。

WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:16)。

根据本发明的实施例，所述抗体含有轻链框架区序列，所述轻链框架区序列包括FR1、FR2、FR3和FR4。

根据本发明的实施例，所述轻链框架区序列FR1具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列相比，具有Y1A、Y1E、V3Q、A9S、S10T、A12S、V13A、V13L、L15V、L15P、Q17D、Q17E、A19V、I21L、S22T至少之一突变的氨酸序列；和/或所述轻链框架区序列FR2具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列相比，具有Q8K、P9A、K11R至少之一突变的氨酸序列；和/或所述轻链框架区序列FR3具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列相比，具有V2I、A4S、A4D、R12G、D20S、P21S、P21R、V22L、E23Q、A24P、D25E、A27F、T29V至少之一突变的氨酸序列；和/或所述轻链框架区序列FR4具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:20所示的氨基酸序列相比，具有T3G、L7V、L9I至少之一突变的氨酸序列。根据本发明实施例的抗体的轻链框架区序列具有上述突变，所得抗体的免疫原性可以得到有效降低。

YIVLTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:17)。

WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:18)。

GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:19)。

FGTGTKLELK(SEQ ID NO:20)。

根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：21～25任一项所示氨基酸序列的重链可变区。

EVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMFYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：21)。

EVQLQQSGTVLARPGTSVRMSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYTQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTNEDSAVYYCTTPYGYDEDWYFNVWGAGTTVTVPS(SEQ ID NO：22)。

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：23)。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLVWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：24)。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：25)。

根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：26～30任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。

YIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPLTFGTGTKLELK(SEQ ID NO：26)。

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQPPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGCGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO：27)。

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：28)。

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQNNEDPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：29)。

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNNEDPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：30)。

根据本发明的实施例，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。

根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO:31～35任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:36～40任一项所示氨基酸序列的轻链。

EVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMFYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO：31)

EVQLQQSGTVLARPGTSVRMSCKASGYTFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYTQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTNEDSAVYYCTTPYGYDEDWYFNVWGAGTTVTVPSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQID NO：32)

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：33)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLVWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：34)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGEFYGTTFDVHYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：35)

YIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPLTFGTGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO：36)

NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLSCKASENVGTYVSWYQQKPEQPPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGCGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQSYSYPLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ IDNO：37)

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNNEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：38)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQNNEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：39)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQNNEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：40)

其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:31和36所组成的抗体被称为F3，上述SEQ IDNO:32和37所组成的抗体被称为G9，上述SEQ ID NO:33和38所组成的抗体被称为Ab01，上述SEQ ID NO:34和39所组成的抗体被称为Ab02，上述SEQ ID NO:35和40所组成的抗体被称为Ab03。

根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。

根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体。

根据本发明的实施例，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段可特异性靶向结合NGF，阻断NGF和TrkA结合，且具有免疫原性低的优势。

根据本发明的实施例，所述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。

根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:41～45任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:46～50任一项所示核苷酸序列

GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGGTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTATACCTACAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAAGACACGGCCATGTTTTACTGTGCAAGACATGGGGAATTCTACGGTACTACTTTCGACGTCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCGCAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA(SEQ ID NO：41)。

GAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGACTTCAGTGAGGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTACACTTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAATAGTGATACTAGTTACACCCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCACCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAACCCCTTATGGTTACGACGAGGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCCCCTCAGCTAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCGCAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA(SEQ ID NO：42)。

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGAGGACTGGTGAAACCTGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGTGCTGCTAGTGGGTTCACCTTTTCTAGGTACGCTATGAGCTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGAAAAGGACTGGAGTGGGTGAGCACAATTTCCTCCGGAGGGTCCTACACCTACTACCCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGAGACAACGCTAAAAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGCACGGCGAATTTTACGGCACCACCTTCGACGTGCACTATTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCTGCATCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTTCCAGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGTTGCCTGGTGAAGGATTATTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATAGTGGTGCCCTGACTTCCGGCGTGCATACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGACTGTATTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTTCTTCTCTGGGCACCAAGACTTACACCTGCAATGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGACAAGAGAGTGGAGTCTAAATACGGCCCCCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAATTTCTGGGAGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACAAAACCCAGGGAGGAACAGTTCAACAGTACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCAAGCAGCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAGGGACAGCCAAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAGTCTAACGGCCAGCCAGAAAACAACTACAAAACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGATCTTTCTTCCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAACCATTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCTGGGCAAG(SEQID NO：43)。

GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGAGGATCTCTGAGGCTGTCCTGTGCTGCCAGCGGATTCACTTTTTCTAGGTACGCCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCACCTGGAAAGGGTCTGGTGTGGGTGAGCACCATTTCTTCTGGAGGGTCTTACACCTATTACCCTGATTCTGTGAAGGGCAGGTTTACCATCTCCCGAGACAATGCTAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGCGCCAGGCACGGCGAGTTTTATGGCACCACCTTCGACGTGCACTACTTCGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCTGCCTCTACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTTCCCGCTCCACCTCTGAGTCCACAGCTGCACTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCCGAGCCAGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGAGTGCATACCTTCCCCGCTGTGCTGCAGAGTTCCGGACTGTATTCCCTGTCTTCTGTGGTGACCGTGCCTTCCAGCTCCCTGGGAACTAAAACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGATAAAAGGGTGGAGAGCAAATACGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAATTTCTGGGCGGCCCATCCGTGTTCCTGTTTCCTCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATTTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAAACCAAACCCAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACATACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCAAGCAGCATCGAGAAAACTATCAGCAAAGCCAAGGGACAGCCCAGGGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCCTCCCAGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAGTCAAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAAACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGATGGATCTTTCTTCCTGTACTCTAGACTGACAGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAGAGTCTGAGTCTGTCCCTGGGCAAG(SEQID NO：44)。

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCAGGAGGAAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCTCCGGATTCACTTTTAGCAGATACGCCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCACCATCTCCTCCGGCGGCTCCTACACATACTACCCTGATTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGATAATGCCAAGAATAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGATACAGCCGTGTACTACTGTGCCAGACACGGCGAGTTTTACGGCACCACCTTTGATGTGCACTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTGACAGTGTCCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTGTAGCAGAAGCACCTCCGAGAGCACCGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAATAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACATTCCCCGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGTCCAGCGTGGTGACAGTGCCTAGCTCCTCCCTGGGCACCAAGACATACACATGCAACGTGGACCACAAGCCCAGCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCCCCCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCTAAGGACACACTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACATACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCAGCATCGAGAAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACAAAGAATCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAATAATTACAAGACCACACCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTTCTTTCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACACAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAG(SEQID NO：45)。

TACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCCTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCGCTCACGTTCGGTACTGGGACCAAGCTGGAACTGAAAAGGGCTGACGCCGCTCCTACCGTGTCCATCTTCCCTCCTAGCTCCGAGCAGCTGACCAGCGGCGGCGCTAGCGTGGTGTGTTTTCTGAATAACTTTTACCCTAAGGATATCAACGTGAAGTGGAAGATCGATGGCAGCGAGAGGCAGAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACCGATCAGGATTCCAAGGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACACTGACACTGACCAAGGACGAGTACGAGAGACACAATTCCTACACCTGTGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCTCCCCTATCGTGAAGAGCTTTAACAGGAACGAGTGCTGA(SEQ ID NO：46)。

AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGAGCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGGTACTTATGTATCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGCCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCTGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGAGTTACAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAAGGGCTGACGCCGCTCCTACCGTGTCCATCTTCCCTCCTAGCTCCGAGCAGCTGACCAGCGGCGGCGCTAGCGTGGTGTGTTTTCTGAATAACTTTTACCCTAAGGATATCAACGTGAAGTGGAAGATCGATGGCAGCGAGAGGCAGAACGGCGTGCTGAATAGCTGGACCGATCAGGATTCCAAGGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACACTGACACTGACCAAGGACGAGTACGAGAGACACAATTCCTACACCTGTGAGGCCACCCACAAGACCAGCACCTCCCCTATCGTGAAGAGCTTTAACAGGAACGAGTGCTGA(SEQ ID NO：47)。

GCCATCCAGCTGACCCAGTCCCCTTCCTCTCTGTCCGCTTCCGTGGGAGACAGGGTGACAATCACCTGCAGAGCCTCCGAAAGCGTGGACTCCTATGGCAACTCCTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCTCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCATCCAACCTGGAATCCGGCGTGCCTTCCAGGTTCTCCGGATCTGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGAAGACTTCGCCACATACTACTGCCAGCAGAACAACGAGGACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGAACAAAGGTGGAGATCAAAAGAACCGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTTATCTTCCCTCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGAACCGCAAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAATTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAAAGTGTGACCGAGCAGGACTCAAAGGACTCTACTTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCTGATTACGAGAAGCATAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTTCCCCTGTGACCAAGTCATTTAACAGGGGCGAGTGT(SEQ ID NO：48)。

GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTACACTGTCTCTGTCCCCTGGTGAGAGGGCCACACTGTCTTGCCGAGCTTCCGAAAGCGTGGACTCCTACGGTAACTCATTTATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCTCCTAGACTGCTGATCTACCTGGCTAGTAACCTGGAATCCGGCATCCCTGATAGGTTCTCCGGGTCCGGTTCCGGAACCGATTTCACCCTGACTATCTCCAGGCTGGAGCCCGAGGATTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAACAACGAAGACCCCCTGACCTTTGGGGGCGGTACAAAGGTGGAGATCAAAAGAACCGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTCATTTTCCCTCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTATCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCTGTGACCGAACAGGACTCCAAAGACTCCACTTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCAGATTATGAGAAACATAAGGTGTATGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGACTGTCTTCCCCTGTGACCAAGTCCTTTAACAGGGGCGAGTGT(SEQ ID NO：49)。

GAGATCGTGCTGACACAGTCCCCCGCCACACTGTCCCTGTCCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCAGAGCCAGCGAGTCCGTGGATAGCTACGGCAATTCCTTCATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTAGGCTGCTGATCTACCTGGCCTCCAATCTGGAGAGCGGCATCCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGAACCGATTTTACACTGACAATCTCCAGCCTGGAGCCTGAGGACTTTGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAATAACGAGGATCCTCTGACCTTCGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTCATCTTTCCTCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAATAATTTTTACCCTAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGATTCCACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACACTGTCCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTGACAAAGTCCTTTAACAGAGGCGAGTGC(SEQ ID NO：50)。

其中，具有SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的核酸分子编码F3的重链，具有SEQ IDNO:42所示核苷酸序列的核酸分子编码G9的重链，具有SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的核酸分子编码Ab01的重链，具有SEQ ID NO:44所示核苷酸序列的核酸分子编码Ab02的重链，具有SEQ ID NO:45所示核苷酸序列的核酸分子编码Ab03的重链，具有SEQ ID NO:46所示核苷酸序列的核酸分子编码F3的氢链，具有SEQ ID NO:47所示核苷酸序列的核酸分子编码G9的氢链，具有SEQ ID NO:48所示核苷酸序列的核酸分子编码Ab01的氢链，具有SEQ ID NO:49所示核苷酸序列的核酸分子编码Ab02的氢链，具有SEQ ID NO:50所示核苷酸序列的核酸分子编码Ab03的氢链。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别NGF的抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述抗体或抗原结合片段的体外大量获得。

根据本发明的实施例，所述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。进而实现前面所述的特异性识别NGF的抗体或其抗原结合片段在真核细胞中的表达，如CHO细胞。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，或者表达前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别NGF的抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。

根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。

根据本发明的实施例，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。

根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。

根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的抗体或表达的抗体不仅能够特异性的靶向结合NGF，阻断NGF和TrkA结合，有效的抑制疼痛，而且具有免疫原性低的特点。

在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的抗体，前面所述的核酸分子，前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化、非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌。

在本发明的第七方面，本发明提出了检测NGF的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面任一所述的抗体。前面所述的NGF抗体能够特异性靶向结合NGF，根据本发明实施例的试剂盒可以实现NGF的特异性检测，如当抗体结合有荧光基团时，可以采用荧光检测装置实现对NGF的定位或实时检测。

在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测NGF或者诊断NGF相关的疾病。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是ELISA法测定鼠源抗体活性，包括抗体与NGF的结合；抗体对NGF与TrkA结合的抑制；

图2是测定抗NGF鼠源抗体抑制NGF依赖性细胞增殖的效力；

图3是评价抗NGF鼠源抗体对完全弗氏佐剂诱导小鼠模型的热痛缓解效果；

图4人源化抗NGF抗体Ab01、Ab02、Ab03与鼠源抗体F3重链可变区氨基酸序列比对。下划线为CDR区序列(根据Kabat系统定义)。

图5人源化抗NGF抗体Ab01、Ab02、Ab03与鼠源抗体F3轻链可变区氨基酸序列比对。下划线为CDR区序列(根据Kabat系统定义)。

图6是ELISA法测定不同人源化抗NGF抗体对NGF的亲和力；

图7是ELISA法测定不同人源化抗NGF抗体对NGF与TrkA结合的抑制效力；

图8是测定不同人源化抗NGF抗体抑制NGF依赖性细胞增殖的效力；

图9是ELISA法测定不同人源化抗NGF抗体对NGF的特异性；

图10是评价不同人源化抗NGF抗体对完全弗氏佐剂诱导小鼠模型的热痛缓解效果；

图11是评价不同人源化抗NGF抗体对完全弗氏佐剂诱导小鼠模型的机械痛缓解效果；

图12是评价不同人源化抗NGF抗体对小鼠的体重影响。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。

抗体

本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。

在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。

本发明利用NGF，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗NGF的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与NGF抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗疼痛或肿瘤等疾病。

在一些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性识别NGF的抗体或者抗原结合片段，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。

在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为其中氨基酸残基被替换为的氨基酸取代。具有相似化学结构的另一个氨基酸残基，其对多肽的功能，活性或其他生物学特性几乎没有影响或基本没有影响。这样的保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如，从WO 04/037999，GB-A-2357768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300；和WO 01/09300。可以基于来自WO 04/037999以及WO 98/49185的相关教导以及从其中引用的其他参考文献中选择和/或(优选)这种取代的类型和/或组合。

在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链和轻链相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(ROR2)能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏NGF抗体或者与NGF抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO：21～25任一项所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：26～30任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(Kabat)可得到上述抗重链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:1～6所示)和轻链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:7～12所示)。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:21～25所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:26～30任一项所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。

在一些优选方案中，本发明提供了一种抗NGF抗体，该抗体具有SEQ ID NO:31～35任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:36～40任一项所示氨基酸序列的轻链。

在一些优选方案中，本发明提供了一种抗NGF单链抗体。

核酸分子、表达载体、重组细胞

在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。

为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:41～45任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:46～50任一项所示核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:41～45所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:46～50所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:41～45或者SEQ ID NO:46～50所示核苷酸序列具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:31～35和SEQ ID NO:36～40相似的氨基酸相似的氨基酸序列，从而能够与NGF抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。

在一些优选实施方式中，所述分离的核酸分子具有SEQ ID NO:41～45所示的重链核苷酸序列和SEQ ID NO:46～50所示的轻链核苷酸序列。这些核苷酸序列经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。

本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。

药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。

本文提供的抗NGF抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗NGF抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

当然，本文中的抗NGF抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述NGF抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用NGF抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗NGF抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗NGF抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括NGF相关疾病，例如疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病等等。当然本文提供的抗体也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。

具体地，上述疼痛、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病包括神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化。

这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，可以是非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌等等。

在利用本发明所提供的抗NGF抗体治疗上述疾病时，可以将本发明提供的抗NGF抗体提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的抗体或其抗原结合片段。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1抗人NGF单克隆抗体的制备及筛选

重组人NGF蛋白(购自北京义翘神州)与QuickyAntibody-5W免疫佐剂等体积混合后，对BALB/c小鼠进行注射免疫。第1天进行首次免疫，第21天进行第一次加强免疫，第35天进行第二次加强免疫。第49天测定小鼠血清效价(大于1:128000)合格后进行冲击免疫。冲击免疫后第三天(即第52天)进行小鼠脾细胞与瘤细胞SP2/0的融合实验。小鼠断颈处死后无菌取出脾脏并将其碾碎，经筛网过滤得到脾细胞，用无血清基础培养基洗涤备用。收取预先扩大培养的SP2/0细胞，用无血清基础培养基洗涤后备用。按照脾细胞：SP2/0细胞＝4:1进行细胞混合并离心去除培养基。将混合后的细胞置于37℃水浴预热90s，再在60s内滴加1ml 50％PEG，滴加完毕后37℃水浴静置90s，然后加入完全培养基终止融合反应。离心融合细胞并使用杂交瘤筛选培养基重悬后铺板，置37℃、5％CO₂静置培养。待融合孔克隆形成后采用ELISA检测各孔上清中抗体竞争性抑制NGF结合TrkA(具有如下序列)的能力，以此筛选阳性杂交瘤母克隆株。母克隆株亚克隆后获得若干杂交瘤单克隆株，各单克隆株使用间接ELISA检测杂交瘤上清与固相NGF的结合情况，同时使用竞争ELISA检测杂交瘤上清阻断NGF与TrkA结合的能力。最终获得阳性单克隆细胞株F3、G9、E5、D10、E2，各单克隆株抗原/抗体结合力分析及竞争性阻断结果如图1所示，从中可以看出各阳性杂交瘤上清能够结合固相NGF蛋白且能以不同效力竞争抑制NGF与TrkA的结合，选取活性最佳的两株抗体F3、G9进行后续实验。

其中，上述实验所用的TrkA的氨基酸序列如下所示：

AAPCPDACCPHGSSGLRCTRDGALDSLHHLPGAENLTELYIENQQHLQHLELRDLRGLGELRNLTIVKSGLRFVAPDAFHFTPRLSRLNLSFNALESLSWKTVQGLSLQELVLSGNPLHCSCALRWLQRWEEEGLGGVPEQKLQCHGQGPLAHMPNASCGVPTLKVQVPNASVDVGDDVLLRCQVEGRGLEQAGWILTELEQSATVMKSGGLPSLGLTLANVTSDLNRKNVTCWAENDVGRAEVSVQVNVSFPASVQLHTAVEMHHWCIPFSVDGQPAPSLRWLFNGSVLNETSFIFTEFLEPAANETVRHGCLRLNQPTHVNNGNYTLLAANPFGQASASIMAAFMDNPFEFNPEDPIPVSFSPVDTNSTSGDPVEKKDETPFGVSVAVGLAVFACLFLSTLLLVLNKCGRRNKFGINRPAVLAPEDGLAMSLHFMTLGGSSLSPTEGKGSGLQGHIIENPQYFSDACVHHIKRRDIVLKWELGEGAFGKVFLAECHNLLPEQDKMLVAVKALKEASESARQDFQREAELLTMLQHQHIVRFFGVCTEGRPLLMVFEYMRHGDLNRFLRSHGPDAKLLAGGEDVAPGPLGLGQLLAVASQVAAGMVYLAGLHFVHRDLATRNCLVGQGLVVKIGDFGMSRDIYSTDYYRVGGRTMLPIRWMPPESILYRKFTTESDVWSFGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNTEAIDCITQGRELERPRACPPEVYAIMRGCWQREPQQRHSIKDVHARLQALAQAPPVYLDVLGGGGGSHHHHHHHHHH

实施例2抗hNGF鼠源抗体互补决定区测定

将杂交瘤细胞株F3及G9扩大培养并离心收集细胞，Cell Total RNA Isolation试剂盒(FOREGENE)抽提总RNA后PCR扩增各抗体轻、重链可变区。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后委外测序以获得抗体可变区序列，最后采用本领域公知的CDR区序列确定方案(如：Kabat)来确定可变区中的CDR区氨基酸序列。所选阳性杂交瘤F3具有如SEQ ID NO：1、2、3所示重链CDR1、CDR2、CDR3序列及SEQ ID NO：21所示重链可变区完整序列；所选阳性杂交瘤F3具有如SEQ ID NO：7、8、9所示轻链CDR1、CDR2、CDR3序列及SEQ ID NO：26所示轻链可变区完整序列；所选阳性杂交瘤G9具有如SEQ ID NO：4、5、6所示重链CDR1、CDR2、CDR3序列及SEQID NO：22所示重链可变区完整序列；所选阳性杂交瘤G9具有如SEQ ID NO：10、11、12所示轻链CDR1、CDR2、CDR3序列及SEQ ID NO：27所示轻链可变区完整序列；

实施例3抗NGF鼠源抗体制备

将F3、G9两个杂交瘤细胞于37℃、5％CO₂扩大培养至细胞活率达90％以上。对12周龄的BALB/c小鼠腹腔注射福氏不完全佐剂，3天后腹腔注射杂交瘤细胞(注射细胞数达到1×10⁶/只)，每天观察小鼠腹水产生情况，待腹部明显膨大采集腹水，离心去除上层脂肪组织、细胞成分和其他沉淀物，收集上清采用protein A预装柱进行抗体纯化，得到F3、G9两个鼠源抗体纯品。

实施例4抗NGF鼠源抗体亲和力常数测定

F3、G9两个鼠源抗体对NGF的亲和力常数通过表面等离子体共振(SPR)测定，采用偶联有重组NGF蛋白的CM5芯片配合Biacore 8K设备进行检测。将EDC/NHS混合液以流速10μl/min进样，流过仪器持续时间60s。用pH5.0 10mM NaAC溶液将NGF稀释至5ug/ml，并进样60s。将不同浓度抗体以流速30μl/min进样120s后继续监测解离。最后用甘氨酸(pH 1.7)以流速30μl/min流过30s进行芯片再生。利用Bia-evaluation分析软件的1:1Binding模型进行动力学参数计算，亲和力常数以KD表示，由kd/ka(解离速率/结合速率)比值计算得到。F3、G9两个鼠源抗体的亲和力测定结果如表1所示。

表1

鼠源抗体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				F3	3.63e+05	1.21e-04	3.35e-10
G9	2.19e+05	2.83e-04	1.29e-09

表1结果显示了两株杂交瘤单抗F3和G9均与重组NGF抗原具有较强的亲和力。相较而言，抗体F3具有比抗体G9更强的抗原亲和力。

实施例5抗NGF鼠源抗体对NGF依赖性细胞增殖的抑制分析

将TF-1细胞用含有重组NGF蛋白的培养基于37℃、5％CO₂复苏并传代培养。实验前24h离心细胞并100％换液至不含NGF蛋白的培养基中，调整细胞终密度为1×10⁵/ml，置37℃、5％CO₂培养。次日将细胞转入96孔细胞培养板，然后各孔分别加入固定量的重组NGF蛋白(5ng/ml)及梯度稀释的F3或G9抗体溶液。与此同时采用一种已知能够结合NGF并阻断NGF与相应受体结合的抗体作为阳性对照(如Tanezumab(Pfizer公司)，其具有如下重链氨基酸序列及轻链氨基酸序列，其由HEK293细胞瞬时表达并纯化而得)。将上述各条件组细胞于37℃、5％CO2继续培养48h，随后用Cell titer glo化学发光试剂盒检测细胞活力。如图2所示，鼠源抗体F3和G9均能抑制NGF依赖性TF-1细胞的增殖，而且抑制效率与抗体加入量呈反比。

对照抗体的重链：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

对照抗体的轻链：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

实施例6抗NGF鼠源抗体对炎性疼痛的抑制分析(热痛阈值分析)

将5～7周龄雄性BALB/c小鼠适应培养一周，随机分组。消毒小鼠左侧后肢及足底，造模采用足底皮下注射完全弗氏佐剂15μl(浓度为1mg/ml)，正常对照组小鼠(空白对照组)用同样方法注射15μl的生理盐水。造模1.5h后按10mg/kg的量经后腿皮下注射给药(F3、G9及对照抗体)，造模当天定义为D1。热痛阈值检测前将动物放入玻璃小格间内适应环境，动物安静后用全自动热辐射刺激足底测试仪检测，辐射热光源经底部玻璃板聚焦足底，检测辐射热痛阈值(在辐射热光源刺激下小鼠出现疼痛反应的最短时间，时间越短代表痛觉越敏感)。NGF鼠源抗体对完全弗氏佐剂诱导小鼠模型的热痛缓解效果如图3所示，完全弗氏佐剂造模后(模型对照组)辐射热痛阈值相对于正常对照组(空白对照组)动物显著降低，注射F3和G9抗体后受试小鼠在第1、3、5天检测的辐射热痛阈值相对于模型对照组有显著升高趋势，代表所用抗体产生疼痛缓解效果。

实施例7抗NGF鼠源抗体的人源化

抗体根据Kabat编号方案，抗体F3分子具有如SEQ ID NO：13、14、15、16所示重链骨架区FR1、FR2、FR3、FR4氨基酸序列；具有如SEQ ID NO：17、18、19、20所示轻链骨架区FR1、FR2、FR3、FR4氨基酸序列。优选抗体F3分子进行人源化设计，F3抗体重链恒定区优选humanImmunoglobulin heavy constant gamma 4(具有S228P突变)(P01861)进行替换，F3抗体轻链恒定区优选human Immunoglobulin kappa constant(P01834)进行替换。而F3抗体可变区借助Chemical Computing Group(CCG)公司的分子操作环境系统(Molecular OperatingEnvironment，MOE)进行人源化设计。通过分析抗体结构数据库中的抗体可变区结构，将来自杂交瘤细胞的鼠源抗体氨基酸序列与人抗体氨基酸序列进行比对，分析可变区及其临近氨基酸序列，根据序列一致性和结构质量打分选用合适的结构框架实现抗体建模。综合考虑相似度、经典残基、结构等因素，选择合适的人胚胎系抗体序列进行CDR移植(即将鼠抗体CDR区移植到人抗体框架序列中)，同时稳定性、粘度等理化性质，预测潜在的脱酰胺、氧化、糖基化等翻译后修饰位点，为进一步优化提供参考。经同源建模、CDR移植和优化突变，设计并挑选出3个人源化抗体序列(抗体代号Ab01、Ab02和Ab03)。人源化抗体Ab01具有如SEQ IDNO：23所示重链可变区序列及如SEQ ID NO：28所示轻链可变区序列；人源化抗体Ab02具有如SEQ ID NO：24所示重链可变区序列及如SEQ ID NO：29所示轻链可变区序列；人源化抗体Ab03具有如SEQ ID NO：25所示重链可变区序列及如SEQ ID NO：30所示轻链可变区序列；图4显示人源化抗NGF抗体Ab01、Ab02、Ab03与鼠源抗体F3重链可变区氨基酸序列比对。图5显示人源化抗NGF抗体Ab01、Ab02、Ab03与鼠源抗体F3轻链可变区氨基酸序列比对。

实施例8人源化抗NGF抗体亲和力分析

抗体Ab01具有SEQ ID NO:33和38所示重轻链全长氨基酸序列；Ab02具有SEQ IDNO:34和39所示重轻链全长氨基酸序列；Ab03具有SEQ ID NO:35和40所示重轻链全长氨基酸序列。全基因合成上述人源化抗体Ab01、Ab02、Ab03之重、轻链基因序列至合适哺乳表达载体，经CHO细胞表达并纯化，采用ELISA法检测亲和力。具体如下：用1μg/ml重组NGF抗原包被96孔酶标板并用牛血清白蛋白封闭，将梯度稀释的抗体样品(Ab01、Ab02、Ab03及对照抗体)加入96孔板，空白对照组加入同体积缓冲液，37℃恒温孵育使抗原/抗体结合并用鼠抗人Fc酶标二抗进行指示。450nm吸收值检测结果如图6所示，人源化抗体Ab01、Ab02和Ab03均有效结合NGF并表现出浓度梯度效应，结合曲线与抗体对照一致，具有高亲和力。

实施例9人源化抗NGF抗体对NGF与TrkA结合的抑制分析

采用ELISA法检测人源化抗NGF抗体对NGF与TrkA结合的抑制效力。1μg/ml重组TrkA包被96孔酶标板并用牛血清白蛋白封闭，将固定量的NGF-Fc蛋白与梯度稀释的抗体样品(Ab01、Ab02、Ab03及对照抗体)预混并37℃孵育30min，随后将其加入酶标各孔继续孵育1h，此时游离的NGF-Fc蛋白与板条固相TrkA结合，经鼠抗人Fc酶标二抗指示并显色，于450nm处读取结果并分析。如图7所示，人源化抗体Ab01、Ab02和Ab03均浓度依赖性抑制NGF与TrkA的结合，具有高抑制活性。

实施例10人源化抗NGF抗体对NGF依赖性细胞增殖的抑制分析

同实施例5测定人源化抗NGF抗体(Ab01、Ab02、Ab03)抑制NGF依赖性TF-1细胞的增殖，结果如图8所示。从中可以看出，人源化抗体Ab01、Ab02、Ab03同对照抗体一样，具有抑制NGF依赖性TF-1细胞的增殖且抑制作用具有抗体浓度依赖性。

实施例11人源化抗NGF抗体亲和力常数测定

人源化抗体对NGF的亲和力常数通过表面等离子体共振(SPR)测定，采用偶联有NGF蛋白的CM5芯片配合Biacore 8K设备进行检测。将EDC/NHS混合液以将流速10ul/min进样,流过仪器持续时间60s。用pH5.0 10mM NaAC溶液将NGF稀释至5ug/ml,并进样60s。将不同浓度抗体(检测抗体为Ab01、Ab02或Ab03抗体)以流速30μl/min进样120s后继续监测解离。最后用甘氨酸(pH1.7)以流速30ul/min流过30s进行芯片再生。利用Bia-evaluation分析软件的1:1Binding模型进行动力学参数计算，亲和力常数以KD表示，由kd/ka(解离速率/结合速率)比值计算得到。Ab01、Ab02和Ab03抗体的亲和力常数测定结果如表2所示。

表2

人源化抗体	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
				Ab01	2.87E+05	4.35E-05	1.51E-10
Ab02	2.94E+05	4.02E-05	1.37E-10
				Ab03	3.03E+05	2.78E-05	9.18E-11

表2结果显示：鼠源抗体F3经人源化后得到的三株抗体(Ab01、Ab02、Ab03)具有比原始亲本抗体F3更高的抗原亲和力。

实施例12人源化抗NGF抗体特异性分析

NGF作为神经营养家族一员，其与BDNF、NT3、NT4具有一定的同源性，为了避免不必要的毒副作用，有必要对候选抗体分子的特异性进行检测。本实施例采用竞争ELISA的方法施行，具体如下：包被重组NGF蛋白于96孔酶标板并用牛血清白蛋白封闭，针对每种抗体(Ab01或Ab02或Ab03或对照抗体)，将其与适量重组BDNF、NT3或NT4(具有如下氨基酸序列)混合并于37℃孵育30min，然后加入酶标板各孔中继续反应1h，最后施以鼠抗人Fc酶标二抗指示并显色，于450nm处读取结果并分析。检测结果如图9所示，在NGF同源因子BDNF、NT3或NT4存在的情况下，均不影响各人源化抗体Ab01、Ab02、Ab03与固相NGF蛋白的结合，说明人源化抗体Ab01、Ab02、Ab03对NGF具有高度特异性，而对同源因子(BDNF或NT3或NT4)弱结合或不结合。

上述实验中所用到的NT3因子的氨基酸序列为：

YAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT

上述实验中所用到的NT4因子的氨基酸序列为：

GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA

因子的氨基酸序列为BDNF因子的氨基酸序列为：

HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR

实施例13人源化抗NGF抗体对BDNF、NT3、NT4的亲和力常数测定

人源化抗体Ab01、Ab02和Ab03对BDNF或NT3或NT4的亲和力常数通过表面等离子体共振(SPR)测定，采用偶联有NGF蛋白的CM5芯片配合Biacore 8K设备进行检测。将EDC/NHS混合液以将流速10ul/min进样，流过仪器持续时间60s。用pH5.0 10mM NaAC溶液将BDNF或NT3或NT4稀释至5ug/ml，并进样60s。将不同浓度抗体以流速30μl/min进样120s后继续监测解离。最后用甘氨酸(pH1.7)以流速30μl/min流过30s进行芯片再生。利用Bia-evaluation分析软件的1:1Binding模型进行动力学参数计算，亲和力常数以KD表示，由kd/ka(解离速率/结合速率)比值计算得到。Ab01、Ab02和Ab03抗体对BDNF、NT3、NT4的表面等离子共振分析均未出现典型结合曲线，说明上述抗体对NGF同源因子的亲和力极低或不具有亲和力，进一步证明所述人源化抗体对NGF具有高特异性。

实施例14人源化抗NGF抗体对炎性疼痛的抑制分析(热痛阈值分析)

将5～7周龄雄性BalB/C小鼠适应培养一周，随机分组。消毒小鼠左侧后肢及足底，造模采用足底皮下注射完全弗氏佐剂15μl(浓度为1mg/ml)，正常对照组小鼠用同样方法注射15μl的生理盐水。造模1.5h后经后腿皮下注射给药(Ab01、Ab02、Ab03及对照抗体)10mg/kg，造模当天定义为D1。热痛阈值检测前将动物放入玻璃小格间内适应环境，动物安静后用全自动热辐射刺激足底测试仪检测，辐射热光源经底部玻璃板聚焦足底，检测辐射热痛阈值(在辐射热光源刺激下小鼠出现疼痛反应的最短时间，时间越短代表痛觉越敏感)。人源化抗NGF抗体对完全弗氏佐剂诱导小鼠模型的热痛缓解效果如图10所示，完全弗氏佐剂造模后(模型对照)辐射热痛阈值相对于正常对照组动物显著降低，注射Ab01、Ab02和Ab03抗体后，受试小鼠自第2天起在整个2周观察期所检测的辐射热痛阈值均显著高于模型对照组，代表所用人源化抗体产生持续疼痛缓解效果。

实施例14人源化抗NGF抗体对炎性疼痛的抑制分析(机械痛阈值分析)

将5～7周龄雄性BalB/C小鼠适应培养一周，随机分组。消毒小鼠左侧后肢及足底，造模采用足底皮下注射完全弗氏佐剂15μl(浓度为1mg/ml)，正常对照组小鼠(正常对照组)用同样方法注射15μl的生理盐水。造模1.5h后经后腿皮下注射给药(Ab01、Ab02、Ab03及对照抗体)10mg/kg，模型对照组注射痛体积生理盐水，造模当天定义为D1。检测前一天把小鼠放入测试房，实验当天进行检测前将小鼠放入有机玻璃格中适应环境15分钟，待动物安静后通过底部金属筛网应用纤毛刺激小鼠右后肢足底中部，出现抬足、躲避或舔足时记录传感器终端显示的机械痛阈值，取3次监测平均值作为小鼠的机械痛阈值(在机械刺激下小鼠出现疼痛反应的最短时间，时间越短代表痛觉越敏感)。人源化抗NGF抗体对完全弗氏佐剂诱导小鼠模型的机械痛缓解效果如图11所示，完全弗氏佐剂造模后(模型对照)机械痛阈值相对于正常对照组(正常对照)动物显著降低，注射Ab01、Ab02和Ab03抗体后，受试小鼠自第4天起在整个2周观察期所检测的辐射热痛阈值均显著高于模型对照组，并在第15天恢复至与正常对照组相当，代表所用人源化抗体产生持续疼痛缓解效果。

在整个观察期间监测小鼠的体重。各组小鼠的体重全部增加，与对照组相比，未观察到注射Ab01、Ab02和Ab03的实验组小鼠体重变化出现显著差异。结果如图12所示，显示出受试动物对上述抗体耐受良好，抗体对小鼠无毒。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种结合NGF的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：

重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，

轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：

分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者

分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：

分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者

分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别NGF。

5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

6.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链框架区序列，所述重链框架区序列包括FR1、FR2、FR3和FR4。

7.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述FR1具有SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列相比，具有M3Q、D10G、K13Q、K19R至少之一突变的氨酸序列；和/或

所述FR2具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列相比，具有T5A、E7G、R9G、E11V、A14S至少之一突变的氨酸序列；和/或

所述FR3具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列相比，具有T12S、S18N、S22A、M27V、F28Y至少之一突变的氨酸序列；和/或

所述FR4具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列相比，具有T6L、L7V至少之一突变的氨酸序列。

8.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有轻链框架区序列，所述轻链框架区序列包括FR1、FR2、FR3和FR4。

9.根据权利要求8所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述FR1具有SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列相比，具有Y1A、Y1E、V3Q、A9S、S10T、A12S、V13A、V13L、L15V、L15P、Q17D、Q17E、A19V、I21L、S22T至少之一突变的氨酸序列；和/或

所述FR2具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列相比，具有Q8K、P9A、K11R至少之一突变的氨酸序列；和/或

所述FR3具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列相比，具有V2I、A4S、A4D、R12G、D20S、P21S、P21R、V22L、E23Q、A24P、D25E、A27F、T29V至少之一突变的氨酸序列；和/或

所述FR4具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列相比，具有T3G、L7V、L9I至少之一突变的氨酸序列。

10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQIDNO：21～25任一项所示氨基酸序列的重链可变区。

11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQIDNO：26～30任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。

12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。

13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。

14.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有SEQIDNO:31～35任一项所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:36～40任一项所示氨基酸序列的轻链。

15.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。

16.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体。

17.根据权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。

18.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～17任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

19.根据权利要求18所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA。

20.根据权利要求18所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ IDNO:41-45任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:46-50任一项所示核苷酸序列。

21.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求18～20任一项所述的核酸分子。

22.根据权利要求21所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。

23.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求18～20任一项所述的核酸分子，或者表达权利要求1～17任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

24.根据权利要求23所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求21或22所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。

25.根据权利要求24所述的重组细胞，其特征在于，通过电转导的方法将所述表达载体引入所述宿主细胞中。

26.根据权利要求23所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为真核细胞。

27.根据权利要求26所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为哺乳动物细胞。

28.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～17任一项所述的抗体，权利要求18～20任一项所述的核酸分子，权利要求21～22任一项所述的表达载体或权利要求23～27任一项所述的重组细胞。

29.权利要求1～17任一项所述的抗体，权利要求18～20任一项所述的核酸分子，权利要求21～22任一项所述的表达载体或权利要求23～27任一项所述的重组细胞、权利要求28所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防疼痛、癌症、炎症或炎性疾病、神经变性疾病、舍格伦氏综合征、子宫内膜异位、糖尿病性周围神经病变、前列腺炎、盆腔疼痛综合征、与骨重塑调节失衡相关的疾病以及由结缔组织生长因子异常信号传导引起的疾病。

30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于，所述药物用于治疗或预防神经性疼痛、炎性疼痛、与癌症有关的疼痛、与骨折有关的疼痛、与手术有关的疼痛、炎性肺病、间质性膀胱炎、痛性膀胱综合征、炎性肠疾病、炎性皮肤病、雷诺氏综合征、特发性肺纤维化、瘢痕(肥大型、瘢痕瘤型和其他形式)、硬化、心内膜心肌纤维化、心房纤维化、骨髓纤维化、进行性块状纤维化(肺)、肾源性系统性纤维化、硬皮病、系统性硬化、关节纤维化、眼部纤维化、非小细胞肺癌、乳头状甲状腺癌、多形性成胶质细胞瘤、结肠直肠癌、黑色素瘤、胆管癌或肉瘤、急性骨髓性白血病、大细胞神经内分泌癌、成神经细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、黑色素瘤、头颈鳞状细胞癌或胃癌。

31.一种检测NGF的试剂盒，其特征在于，包括权利要求利要求1～17任一项所述的抗体。

32.权利要求1～17任一项所述的抗体，权利要求18～20任一项所述的核酸分子，权利要求21～22任一项所述的表达载体或权利要求23～27任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测NGF或者诊断NGF相关的疾病。