JPWO2007049624A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明は、GDNF(Glial cell derived neurotropic factor)に対する抗体等のGDNFの機能を阻害する物質およびその用途、具体的には、癌(特に、乳癌)の予防・治療剤または診断剤、癌細胞の増殖阻害剤などに関する。
更に、本発明は、GFRα1(GDNF family receptor alpha 1)に対する抗体等のGFRα1の機能を阻害する物質およびその用途、具体的には、癌(特に、乳癌)の予防・治療剤または診断剤、癌細胞の増殖阻害剤などに関する。
また、RET遺伝子は、活性化型変異と多発性内分泌腫瘍2型、失活型変異とヒルシュスプルング病、逆位又は転座による活性化と甲状腺乳頭癌の関連が報告されている(非特許文献1)。Expression sequence tag DNAデータベースLIFESEQ(登録商標)の解析により、RET遺伝子は副腎癌、前立腺癌、乳癌、結合組織癌で遺伝子発現が正常組織に比べて増加していることが報告されている(特許文献1)。
また、GDNF遺伝子は、変異と先天性中枢性肺胞低換気症候群及びヒルシュスプルング病の関連が報告されている(非特許文献2、3)。
また、GFRα1遺伝子は、その変異と甲状腺髄様癌の関連が報告されている(非特許文献5)。
Expression sequence tag DNAデータベースLIFESEQ(登録商標)の解析により、GFRα1遺伝子は乳癌、脳腫瘍で遺伝子発現が正常組織に比べて増加していることが報告されている(特許文献1)。また、乳癌で遺伝子発現が増加している遺伝子群の1つであることが報告されている(特許文献2)。
本発明者らは、この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1]配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
[2]物質が
(1)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である[1]記載の医薬。
[3]配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
[4]抗体がモノクローナル抗体である[2]または[3]記載の医薬。
[5]癌の予防・治療剤である[1]〜[4]記載の医薬。
[6]乳癌の予防・治療剤である[1]〜[4]記載の医薬。
[7]癌細胞の増殖阻害剤である[1]〜[4]記載の医薬。
[8]乳癌細胞の増殖阻害剤である[1]〜[4]記載の医薬。
[9]配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
[10]哺乳動物に対して、配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
[11]哺乳動物に対して、配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
[12]哺乳動物に対して、配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
[13]哺乳動物に対して、配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
[14]物質が
(1)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である[10]〜[13]記載の方法。
[15]物質が配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項10〜13記載の方法。
[16]抗体がモノクローナル抗体である上記[15]記載の方法。
[17]癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[18]乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[19]癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[20]乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[21]物質が配列番号:1(RETタンパク質アイソフォームa)または配列番号:3(RETタンパク質アイソフォームc)で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である[17]〜[20]記載の使用。
[22]抗体がモノクローナル抗体である上記[21]記載の使用。
[24]物質が
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である[23]記載の医薬。
[25]配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
[26]抗体がモノクローナル抗体である[24]または[25]記載の医薬。
[27]癌の予防・治療剤である[23]〜[26]記載の医薬。
[28]乳癌の予防・治療剤である[23]〜[26]記載の医薬。
[29]癌細胞の増殖阻害剤である[23]〜[26]記載の医薬。
[30]乳癌細胞の増殖阻害剤である[23]〜[26]記載の医薬。
[31]配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
[32]配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
[33]哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
[34]哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
[35]哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
[36]哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
[37]物質が
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である[33]〜[36]記載の方法。
[38]物質が配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である[33]〜[36]記載の方法。
[39]抗体がモノクローナル抗体である[38]記載の方法。
[40]癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[41]乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[42]癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[43]乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[44]物質が配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である[40]〜[43]記載の使用。
[45]抗体がモノクローナル抗体である[44]記載の使用。
[47]物質が
(1)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である[46]記載の医薬。
[48]配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
[49]抗体がモノクローナル抗体である[47]または[48]記載の医薬。
[50]癌の予防・治療剤である[46]〜[49]記載の医薬。
[51]乳癌の予防・治療剤である[46]〜[49]記載の医薬。
[52]癌細胞の増殖阻害剤である[46]〜[49]記載の医薬。
[53]乳癌細胞の増殖阻害剤である[46]〜[49]記載の医薬。
[54]配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
[55]配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
[56]哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
[57]哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
[58]哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
[59]哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
[60]物質が
(1)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である[56]〜[59]記載の方法。
[61]物質が配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である[56]〜[59]記載の方法。
[62]抗体がモノクローナル抗体である[61]記載の方法。
[63]癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[64]乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[65]癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[66]乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
[67]物質が配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である[63]〜[66]記載の使用。
[68]抗体がモノクローナル抗体である[67]記載の使用。
[69]配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
[70]GDNF(配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)、GFRα1(配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)及びRET(配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)の機能を阻害する物質を含有してなる乳癌の予防・治療剤。
[71]GDNF、GFRα1及びRETの機能がGDNF(配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)によるRET(配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)の活性化またはGDNF(配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)による乳癌細胞増殖促進である、[70]記載の予防・治療剤。
[72]物質が、
(1)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
(2)GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
であって、GDNF(配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)によるシグナル伝達阻害活性またはGDNF(配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)による乳癌細胞増殖阻害活性を有しているものである、[70]記載の予防・治療剤。
[73]物質が、
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、[70]記載の予防・治療剤。
[74]抗体がモノクローナル抗体である、[72]または[73]記載の予防・治療剤。
[75]GFRα1タンパク質(配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)及びRETタンパク質(配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)を発現する乳癌の治療に用いられる、[70]記載の予防・治療剤。
[76]GDNFタンパク質(配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)、GFRα1タンパク質(配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)及びRETタンパク質(配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質)を発現する乳癌の治療に用いられる、[70]記載の予防・治療剤。
[77]哺乳動物に対して、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
[78]GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
[79]GDNFタンパク質、GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
[80]物質が、
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、[77]乃至[79]のいずれかに記載の予防・治療方法。
[81]乳癌の予防・治療剤を製造するための、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の使用。
[82]GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の使用。
[83]GDNFタンパク質、GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の使用。
[84]物質が、
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、[81]乃至[83]のいずれかに記載の使用。
などを提供する。
配列番号:1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「RETタンパク質・アイソフォームa」と略記する場合がある)または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「RETタンパク質・アイソフォームc」と略記する場合がある)(以下、両者を併せて「RET」または「本発明のタンパク質I」と称することもある)は、ヒトや温血動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)の細胞(例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞(例、乳癌細胞)など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
RETの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことが可能である。例えば、後記実施例に記載したように、RETとGFRα1を共発現した癌細胞(例、乳癌細胞)をGDNFで刺激したときの細胞増殖を測定することにより、該活性を評価することができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
さらに、RETの部分ペプチドには、前記したRETと同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
(1)RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)RETまたはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)RETまたはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)RETまたはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
などが用いられる。
配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質におけるアミノ酸番号1〜635からなる領域;
配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質におけるアミノ酸番号1〜635からなる領域。
(1)抗原の調製
本発明の抗体Iを調製するために使用される抗原としては、上記RET類(例えば、配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質(RET)もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩)、RETの細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩、もしくはRETと同一の抗原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)ペプチドなど何れのものも使用することができる(以下、これらを単に本発明の抗原Iと称することもある)。
配列番号:2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:2で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号:4で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:4で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=-3)にて計算することができる。
本発明の抗原Iの発現ベクターは、例えば、(イ)本発明の抗原IをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
(d)RETと同一の抗原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはRETを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の(i)〜(v)に記載された方法が挙げられる。
(i)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) (1975年)
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
(v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
(a)ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原Iは、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質Iを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地(例、RPMI1640)または緩衝液(例、Hanks’ Balanced Salt Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。
本発明の抗体Iの作製方法は(a)に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物(例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリなど)のBリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる〔Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)〕。ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原Iを高発現した癌の患者や本発明の抗原Iを(a)に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明のモノクローナル抗体Iは、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や(b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996)、Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。
本発明のポリクローナル抗体Iは、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記本発明の抗原Iとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーと抗原との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、KLH等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。
又、抗原とキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
さらに、アンチセンスRETは、RETをコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるRETをコードする遺伝子と結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
また、本発明のアンチセンス核酸Iを上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
(i)本発明の抗体Iと、被検液および標識化されたRETとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたRETの割合を測定することを特徴とする被検液中のRETの定量法、(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体Iおよび標識化された本発明の別の抗体Iとを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のRETの定量法等を挙げることができる。
センスもしくはアンチセンスRETを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
後記実施例において示されるように、癌細胞(例えば乳癌細胞)はRETを発現し、GDNFの作用を受けることにより細胞増殖が促進され、RETに対するsiRNAで処理し、その発現量を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制される。従って、センスもしくはアンチセンスRETを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のRETを検出・定量することにより、癌(例えば乳癌)、特にGDNFに感受性の高い癌(例えば乳癌)を検出し得る。すなわち、センスもしくはアンチセンスRETは、癌(例えば乳癌)の診断剤として有用である。例えば、センスもしくはアンチセンスRETを用いて検体中のRETの発現を定量することによって、RETの発現の増加が検出された場合、対象は、癌(例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌)である、または将来癌に罹患する可能性が高いと診断し得る。更に、癌細胞におけるRETの発現を定量することにより、その癌のGDNF感受性を判定することが出来る。癌細胞におけるRETの発現の増加が検出された場合、その癌はGDNF感受性が高く、GDNFに依存して強く増殖する癌であると判定することが出来る。
配列番号:5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「GDNFタンパク質・アイソフォーム1」と略記する場合がある)、配列番号:7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「GDNFタンパク質・アイソフォーム2」と略記する場合がある)または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「GDNFタンパク質・アイソフォーム3」と略記する場合がある)(以下、三者を併せて「GDNF」または「本発明のタンパク質II」と称することもある)は、ヒトや温血動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)の細胞(例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞(例、乳癌細胞)など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
鎖の小さいアミノ酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない(即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている(例えば、Bowieら,Science,247:1306-1310 (1990)を参照)。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
GDNFの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことが可能である。例えば、後記実施例に記載したように、癌細胞(例、乳癌細胞)をGDNFで刺激したときの細胞増殖を測定することにより、該活性を評価することができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
さらに、GDNFの部分ペプチドには、前記したGDNFと同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
(1)GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)GDNFまたはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)GDNFまたはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)GDNFまたはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
などが用いられる。
(1)抗原の調製
本発明の抗体IIを調製するために使用される抗原としては、上記GDNF類(例えば、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質(GDNF)もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩)、もしくはGDNF類と同一の抗原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)ペプチドなど何れのものも使用することができる(以下、これらを単に本発明の抗原IIと称することもある)。
配列番号:6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:6で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号:8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:8で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号:10で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:10で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(NationalCenter for Biotechnology Information Basic LocalAlignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=-3)にて計算することができる。
本発明の抗原IIの発現ベクターは、例えば、(イ)本発明の抗原IIをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
る。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
(d)GDNFと同一の抗原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはGDNFを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の(i)〜(v)に記載された方法が挙げられる。
(i)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis),Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York(1965年)
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) (1975年)
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
(v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
(a)ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原IIは、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質IIを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地(例、RPMI1640)または緩衝液(例、Hanks’ Balanced Salt Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。
本発明の抗体IIの作製方法は(a)に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物(例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリなど)のBリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる〔Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)〕。ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原IIを高発現した癌の患者や本発明の抗原IIを(a)に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明のモノクローナル抗体IIは、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や(b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996)、Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。
本発明のポリクローナル抗体IIは、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記本発明の抗原IIとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーと抗原との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、KLH等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。
又、抗原とキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
さらに、アンチセンスGDNFは、GDNFをコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるGDNFをコードする遺伝子と結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
また、本発明のアンチセンス核酸IIを上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
(i)本発明の抗体IIと、被検液および標識化されたGDNFとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたGDNFの割合を測定することを特徴とする被検液中のGDNFの定量法、
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体IIおよび標識化された本発明の別の抗体IIとを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のGDNFの定量法等を挙げることができる。
センスもしくはアンチセンスGDNFを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
後記実施例において示されるように、癌細胞(例えば乳癌細胞)がGDNFの作用を受けることによりその細胞増殖が促進される。従って、センスもしくはアンチセンスGDNFを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のGDNFを検出・定量することにより、癌(例えば乳癌)、特にGDNFに感受性の高い癌(例えば乳癌)が増殖し易い状態に被検体があるか否かを検出し得る。すなわち、センスもしくはアンチセンスGDNFは、癌(例えば乳癌)の診断剤として有用である。例えば、センスもしくはアンチセンスGDNFを用いて検体中のGDNFの発現を定量することによって、GDNFの発現の増加が検出された場合、対象は、癌(例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌)が増殖し易い状態にあると診断し得る。
配列番号:11で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「GFRα1タンパク質・アイソフォームa」と略記する場合がある)または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質(以下、「GFRα1タンパク質・アイソフォームb」と略記する場合がある)(以下、両者を併せて「GFRα1」または「本発明のタンパク質III」と称することもある)は、ヒトや温血動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど)の細胞(例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞(例、乳癌細胞)など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
GFRα1の活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことが可能である。例えば、後記実施例に記載したように、RETとGFRα1を共発現した癌細胞(例、乳癌細胞)をGDNFで刺激したときの細胞増殖を測定することにより、該活性を評価することができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
さらに、GFRα1の部分ペプチドには、前記したGFRα1と同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
(1)GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)GFRα1またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)GFRα1またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)GFRα1またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
などが用いられる。
(1)抗原の調製
本発明の抗体IIIを調製するために使用される抗原としては、上記GFRα1類(例えば、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質(GFRα1)もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩)、GFRα1の細胞外領域タンパク質とその他のタンパク質(ペプチド)との融合タンパク質またはその塩、もしくはGFRα1と同一の抗原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)ペプチドなど何れのものも使用することができる(以下、これらを単に本発明の抗原IIIと称することもある)。
配列番号:12で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:12で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
配列番号:14で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸としては、例えば、配列番号:14で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する核酸などが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=-3)にて計算することができる。
本発明の抗原IIIの発現ベクターは、例えば、(イ)本発明の抗原IIIをコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
(d) GFRα1と同一の抗原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいはGFRα1を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の(i)〜(v)に記載された方法が挙げられる。
(i)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis),Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York(1965年)
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) (1975年)
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
(v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
(a)ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原IIIは、温血動物に対して投与される。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明のタンパク質IIIを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地(例、RPMI1640)または緩衝液(例、Hanks’ Balanced Salt Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。
本発明の抗体IIIの作製方法は(a)に記載の方法に限定されるものではなく、例えばヒトや温血動物(例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリなど)のBリンパ球を材料として公知の方法により作製された抗体遺伝子ライブラリーを、バクテリオファージ、大腸菌、酵母、動物細胞等の細胞表面やリボソーム上等に提示させた、いわゆる抗体ディスプレー技術を用いる事ができる〔Nature Biotechnology 23, 1105 (2005)〕。ヒトや温血動物はナイーブなものであっても良いし、本発明の抗原IIIを高発現した癌の患者や本発明の抗原IIIを(a)に記載の方法で免疫された温血動物であっても良い。細胞表面に提示させる抗体の形態としてはIgG分子、IgM分子、Fabフラグメント、一本鎖Fv(scFv)フラグメント等が挙げられるがこれに限定されるものではない。
本発明のモノクローナル抗体IIIは、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマや、(a)で得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから公知の方法で単離された抗体遺伝子や(b)で得られたモノクローナル抗体遺伝子を人為的に発現させた組換え細胞株を培養することにより製造する事ができる。また該抗体遺伝子を公知の方法により温血動物や植物の染色体に組み込み、温血動物の血液、乳汁、卵や植物体、カビ等に生産させることにより製造する事もできる〔Curr. Opin. Biotevhnol. 7, 536 (1996)、Nature Rev. Genet 4, 794 (2003)、Appl. Environ. Microbiol. 70, 2567 (2004)〕。温血動物としては例えばウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、マウス、ウサギ等が用いられる。また植物体としてはタバコ、トウモロコシ、ジャガイモ、ウキクサ等が用いられる。
本発明のポリクローナル抗体IIIは、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、上記本発明の抗原IIIとキャリアータンパク質との複合体を作り、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から該抗原に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
温血動物を免疫するために用いられる抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類及びキャリアーと抗原との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫した抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、KLH等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合で結合させる方法が用いられる。
又、抗原とキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水、母乳、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
さらに、アンチセンスGFRα1は、GFRα1をコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるGFRα1をコードする遺伝子と結合して三重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
また、本発明のアンチセンス核酸IIIを上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
(i)本発明の抗体IIIと、被検液および標識化されたGFRα1とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたGFRα1の割合を測定することを特徴とする被検液中のGFRα1の定量法、
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体IIIおよび標識化された本発明の別の抗体IIIとを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のGFRα1の定量法等を挙げることができる。
センスもしくはアンチセンスGFRα1を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
後記実施例において示されるように、癌細胞(例えば乳癌細胞)はGFRα1を発現し、GDNFの作用を受けることにより細胞増殖が促進され、GFRα1に対するsiRNAで処理し、その発現量を抑制することにより癌細胞の増殖が抑制される。従って、本発明の抗体IIIを用いて細胞、組織、体液等の被検体中のGFRα1を検出・定量することにより、癌(例えば乳癌)、特にGDNFに感受性の高い癌(例えば乳癌)を検出し得る。すなわち、センスもしくはアンチセンスGFRα1は、癌(例えば乳癌)の診断剤として有用である。例えば、センスもしくはアンチセンスGFRα1を用いて検体中のGFRα1の発現を定量することによって、GFRα1の発現の増加が検出された場合、対象が例えば癌(例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など、特に乳癌)である、または将来癌に罹患する可能性が高いと診断し得る。更に、癌細胞におけるGFRα1の発現を定量することにより、その癌のGDNF感受性を判定することが出来る。癌細胞におけるGFRα1の発現の増加が検出された場合、その癌はGDNF感受性が高く、GDNFに依存して強く増殖する癌であると判定することが出来る。
本発明は、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質を含有してなる癌(例えば乳癌)の予防・治療剤を提供するものである。
(1)RETもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、GDNFもしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、GFRα1もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
(配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体)、
(2)低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするRNAに対するsiRNA
であって、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する活性(GDNFによるシグナル伝達阻害活性、GDNFによる癌(例えば乳癌)細胞等の細胞増殖阻害活性)を有しているものを挙げることができる。
また、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質として、(3)のアンチセンス核酸を上記予防・治療剤等として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu :ピログルタミン酸
Sec :セレノシステイン(selenocysteine)
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン-4(R)-カルボキサミド基
Tos :p-トルエンスルフォニル
CHO :ホルミル
Bzl :ベンジル
Cl2-Bzl :2,6-ジクロロベンジル
Bom :ベンジルオキシメチル
Z :ベンジルオキシカルボニル
Cl−Z :2-クロロベンジルオキシカルボニル
Br−Z :2-ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc :t-ブトキシカルボニル
DNP :ジニトロフェニル
Trt :トリチル
Bum :t-ブトキシメチル
Fmoc :N-9-フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt :1-ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt :3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾ
トリアジン
HONB :1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
DCC :N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド
〔配列番号:1〕
RETタンパク質・アイソフォームaのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有するRETタンパク質・アイソフォームaをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:3〕
RETタンパク質・アイソフォームcのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:4〕
配列番号:3で表されるアミノ酸配列を有するRETタンパク質・アイソフォームcをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:5〕
GDNFタンパク質・アイソフォーム1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:6〕
配列番号:5で表されるアミノ酸配列を有するGDNFタンパク質・アイソフォーム1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:7〕
GDNFタンパク質・アイソフォーム2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:8〕
配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するGDNFタンパク質・アイソフォーム2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:9〕
GDNFタンパク質・アイソフォーム3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:10〕
配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するGDNFタンパク質・アイソフォーム3をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:11〕
GFRα1タンパク質・アイソフォームaのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:12〕
配列番号:11で表されるアミノ酸配列を有するGFRα1タンパク質・アイソフォームaをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:13〕
GFRα1タンパク質・アイソフォームbのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:14〕
配列番号:13で表されるアミノ酸配列を有するGFRα1タンパク質・アイソフォームbをコードするDNAの塩基配列を示す
アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より購入したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を、10 %ウシ胎児血清(Hyclone社)、1× MEM用非必須アミノ酸(大日本製薬)、1 mM MEM ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen社)、100 units/mLペニシリンG(和光純薬)、100 μg/mL硫酸ストレプトマイシン(和光純薬)を含むMEM(Invitrogen社)で懸濁し、1ウェル100 μLあたり3千個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した。5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、ヒト組換え型GDNF(R&Dシステムズ社)を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液(和光純薬)を1ウェルあたり10 μL添加し、5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、GDNFを投与した細胞は非投与細胞に比べて約40 %吸光度が増加した(図1)。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7においてGDNFが細胞増殖を誘発することが示唆された。
アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より購入したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を、10 %ウシ胎児血清(Hyclone社)、1× MEM用非必須アミノ酸(大日本製薬)、1 mM MEM ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen社)、100 units/mLペニシリンG(和光純薬)、100 μg/mL硫酸ストレプトマイシン(和光純薬)を含むMEM(Invitrogen社)で懸濁し、5%炭酸ガス気流中、37℃で培養した後、siRNAをトランスフェクションした。
具体的には、RET遺伝子のmRNAを切断する活性を持つ下記の3種のsiRNA(B-Bridge社)を混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なRNAi効果を示さないことが保証されている下記の3種のsiRNA(B-Bridge社、以下non-silencing dsRNAと略する)の混合物を用いた。
<RETに対するsiRNA>
(SHF27A-0609-1)
Sense鎖 :gaccauagcuccugggagaTT(配列番号:15)
Antisense鎖:ucucccaggagcuauggucTT(配列番号:16)
(SHF27A-0609-2)
Sense鎖 :gaacuugguucuuggaaaaTT(配列番号:17)
Antisense鎖:uuuuccaagaaccaaguucTT(配列番号:18)
(SHF27A-0609-3)
Sense鎖 :ccacauggauugaaaacaaTT(配列番号:19)
Antisense鎖:uuguuuucaauccauguggTT(配列番号:20)
<non-silencing dsRNA>
(C6A-0126-1)
Sense鎖 :auccgcgcgauaguacguaTT(配列番号:21)
Antisense鎖:uacguacuaucgcgcggauTT(配列番号:22)
(C6A-0126-2)
Sense鎖 :uuacgcguagcguaauacgTT(配列番号:23)
Antisense鎖:cguauuacgcuacgcguaaTT(配列番号:24)
(C6A-0126-3)
Sense鎖 :uauucgcgcguauagcgguTT(配列番号:25)
Antisense鎖:accgcuauacgcgcgaauaTT(配列番号:26)
300pmolのRET遺伝子に対するsiRNA、または300pmolのnon-silensing dsRNAを含む3μLの溶液 を、MCF 7細胞100万個を懸濁したNucleofector Solution V(Amaxa biosystems社)100μLと混合した後、Nucleofector program P-020によりトランスフェクションした。この混合液をMCF 7細胞培養液4mLに全量添加し、24時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を1ウェル当たり3500個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した後、ヒト組換え型GDNF(R&Dシステムズ社)を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液(和光純薬)を1ウェルあたり10μL添加し、5%炭酸ガス気流中、37℃で、さらに3時間放置した後、450nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。
その結果、RET遺伝子に対するsiRNAを投与した細胞はnon-silensing dsRNA投与細胞に比べて、GDNF投与による吸光度の増加が抑制された(図2)。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7において該siRNA非存在下ではGDNFにより活性化されたRETタンパク質が細胞増殖を誘発し、siRNA等によりRETの機能を阻害することにより癌細胞の増殖を抑制し得ることが示唆された。
アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より購入したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を、10 %ウシ胎児血清(Hyclone社)、1× MEM用非必須アミノ酸(大日本製薬)、1 mM MEM ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen社)、100 units/mLペニシリンG(和光純薬)、100 μg/mL硫酸ストレプトマイシン(和光純薬)を含むMEM(Invitrogen社)で懸濁し、5%炭酸ガス気流中、37℃で培養した後、siRNAをトランスフェクションした。
具体的には、GFRα1遺伝子のmRNAを切断する活性を持つ下記の3種のsiRNA(B-Bridge社)を混和し、トランスフェクションに供した。コントロールとしては、細胞に対し非特異的なRNAi効果を示さないことが保証されている下記の3種のsiRNA(B-Bridge社、以下non-silencing dsRNAと略する)の混合物を用いた。
<GFRα1に対するsiRNA>
(SHF27A-0610-1)
Sense鎖 :gagcagagcugcagcaccaTT(配列番号:27)
Antisense鎖:uggugcugcagcucugcucTT(配列番号:28)
(SHF27A-0610-2)
Sense鎖 :gcagcugucuaaaggaaaaTT(配列番号:29)
Antisense鎖:uuuuccuuuagacagcugcTT(配列番号:30)
(SHF27A-0610-3)
Sense鎖 :cucagaaggcuuugggauaTT(配列番号:31)
Antisense鎖:uaucccaaagccuucugagTT(配列番号:32)
<non-silencing dsRNA>
(C6A-0126-1)
Sense鎖 :auccgcgcgauaguacguaTT(配列番号:21)
Antisense鎖:uacguacuaucgcgcggauTT(配列番号:22)
(C6A-0126-2)
Sense鎖 :uuacgcguagcguaauacgTT(配列番号:23)
Antisense鎖:cguauuacgcuacgcguaaTT(配列番号:24)
(C6A-0126-3)
Sense鎖 :uauucgcgcguauagcgguTT(配列番号:25)
Antisense鎖:accgcuauacgcgcgaauaTT(配列番号:26)
25pmolのGFRα1遺伝子に対するsiRNA、または25pmolのnon-silensing dsRNAを含む4μLの溶液 を、MCF 7細胞100万個を懸濁したNucleofector Solution V(Amaxa biosystems社)100μLと混合した後、Nucleofector program P-020によりトランスフェクションした。この混合液をMCF 7細胞培養液4mLに全量添加し、24時間培養した後、細胞を回収した。回収した細胞を1ウェル当たり3500個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した後、ヒト組換え型GDNF(R&Dシステムズ社)を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液(和光純薬)を1ウェルあたり10μL添加し、5%炭酸ガス気流中、37℃で、さらに3時間放置した後、450nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。
その結果、GFRα1遺伝子に対するsiRNAを投与した細胞はnon-silensing dsRNA投与細胞に比べて、GDNF投与による吸光度の増加が抑制された(図3)。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7において該siRNA非存在下ではGDNFにより活性化されたGFRα1タンパク質が細胞増殖を誘発し、siRNA等によりGFRα1の機能を阻害することにより癌細胞の増殖を抑制し得ることが示唆された。
実施例1の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7のライゼートを調製し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により展開後、PVDF膜に転写し、抗RETヤギポリクローナル抗体(R&Dシステムズ社)を一次抗体、HRP(Horse Radish Peroxidase)付加抗ヤギIgG抗体(SIGMA社)を二次抗体として用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、分子量170kDa付近にバンドが検出された(図4a)。分子量の大きさより、このバンドはRETタンパク質に由来すると考えられ、MCF 7においてRETタンパク質が発現していることが示唆された。またMCF 7の生細胞を用いて、同じ抗体を一次抗体、AlexaFluor488付加抗ヤギIgG抗体(Invitrogen社)を二次抗体としてフローサイトメトリー解析を行った。その結果、抗RET抗体を用いた際にピークシフトが観察された(図4b)。先のウェスタンブロット解析の結果を含め、RETタンパク質はMCF7の細胞膜表面上に発現していることが示唆された。
実施例1の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7のライゼートを調製し、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により展開後、PVDF膜に転写し、抗GFRα1ヤギポリクローナル抗体(R&Dシステムズ社)を一次抗体、HRP付加抗ヤギIgG抗体(SIGMA社)を二次抗体として用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果、分子量55kDa付近にバンドが検出された(図5a)。分子量の大きさより、このバンドはGFRα1タンパク質に由来すると考えられ、MCF 7においてGFRα1タンパク質が発現していることが示唆された。またMCF 7の生細胞を用いて、同じ抗体を一次抗体、AlexaFluor488付加抗ヤギIgG抗体(Invitrogen社)を二次抗体としてMCF 7のフローサイトメトリー解析を行った。その結果、抗GFRα1抗体を用いた際にピークシフトが観察された(図5b)。先のウェスタンブロット解析の結果を含め、GFRα1タンパク質はMCF7の細胞膜表面上に発現していることが示唆された。
実施例1の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を1ウェル100 μLあたり150万個の細胞密度で6穴平底組織培養プレートに播種した。5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、ヒト組換え型GDNF(R&Dシステムズ社)を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して終濃度 10 ug/mLで投与し、0、10、20、30分間培養後にライゼートを調製した。そのライゼートの一部を、PathScan Sandwich ELISAキット(セルシグナリング社)により解析した。その結果GDNF添加によりERK1/2、Akt、MEK1/2のリン酸化が誘導されることが検出された(図6a)。またライゼートの一部をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により展開後、PVDF膜に転写し、抗リン酸化ERK1/2抗体、抗リン酸化JNK抗体、抗リン酸化p38-MAPK抗体、抗リン酸化Akt抗体、抗Akt抗体(セルシグナリング社)を一次抗体、HRP付加抗ウサギIgG抗体(セルシグナリング社)二次抗体として用いてウェスタンブロット解析を行った。その結果GDNF添加によりERK1/2、Aktのリン酸化が誘導されることが観察された(図6b)。これらの実験より、MCF 7はGDNF添加に反応し、細胞内シグナル伝達経路にあるタンパク質を活性化させることが確認された。
実施例1の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を1ウェル100 μLあたり3千個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した。5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、ラット組換え型GDNF(R&Dシステムズ社)を0.1 %ウシ血清アルブミンに懸濁して投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液(和光純薬)を1ウェルあたり10 μL添加し、5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、GDNFを投与した細胞は非投与細胞に比べて約40 %吸光度が増加した(図7)。この結果より、ラットなどのげっ歯類のGDNFがヒト乳癌由来細胞株MCF 7の細胞増殖を誘発し、げっ歯類を用いた担癌実験を行える可能性があることが示された。
ヒト乳癌組織切片(SuperBioChip社)を10 mM クエン酸緩衝液(ph6.0)中で15分間煮沸処理することにより、抗原を賦活化し、実施例4で用いた抗RET抗体(R&Dシステムズ社)を一次抗体、抗ヤギIg・ビオチン標識ウサギポリクローナル抗体を二次抗体(DAKO社)、HRP標識ストレプトアビジン(DAKO社)を三次反応物として用いてDABで発色させて免疫組織染色解析を行った。その結果、乳癌組織で染色像が検出された。乳癌組織においてRETタンパク質が発現していることが示唆された(図8)。また、連続切片を用いて行った実施例9の結果より、RETタンパク質とGFRα1タンパク質は同じ細胞でも発現している可能性が示された。
ヒト乳癌組織切片(SuperBioChip社)を10 mM クエン酸緩衝液(ph6.0)中で15分間煮沸処理することにより、抗原を賦活化し、実施例5で用いた抗GFRα1抗体(R&Dシステムズ社)を一次抗体、抗ヤギIg・ビオチン標識ウサギポリクローナル抗体を二次抗体(DAKO社)、HRP標識ストレプトアビジン(DAKO社)を三次反応物として用いてDABで発色させて免疫組織染色解析を行った。その結果、乳癌組織で染色像が検出された。乳癌組織においてGFRα1タンパク質が発現していることが示唆された(図9)。また、連続切片を用いて行った実施例8の結果より、RETタンパク質とGFRα1タンパク質は同じ細胞でも発現している可能性が示された。
実施例1の方法で培養したヒト乳癌由来細胞株MCF 7を1ウェル100 μLあたり3千個の細胞密度で96穴平底組織培養プレートに播種した。5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、1日間培養した後、抗GDNFポリクローナル抗体(R&Dシステムズ社)もしくは、抗GDNFモノクローナル抗体(R&Dシステムズ社)をPBSに懸濁して投与し、更に、ヒト組換え型GDNF(R&Dシステムズ社)を終濃度1 ng/mLとなるように投与した。さらに3日間培養した後、Cell-Counting Kit-8溶液(和光純薬)を1ウェルあたり10 μL添加し、5 %炭酸ガス気流中、37 ℃で、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を計測することにより、細胞数を測定した。その結果、抗GDNF抗体を投与した細胞は非投与細胞に比べて約30 %吸光度が減少した(図10)。この結果より、ヒト乳癌由来細胞株MCF 7において該抗体非存在下ではGDNFが細胞増殖を誘発し、抗体等によりGDNFの機能を阻害することにより癌細胞の増殖を抑制し得ることが示唆された。
Claims (84)
- 配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
- 物質が
(1)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である請求項1記載の医薬。 - 配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項2または3記載の医薬。
- 癌の予防・治療剤である請求項1〜4記載の医薬。
- 乳癌の予防・治療剤である請求項1〜4記載の医薬。
- 癌細胞の増殖阻害剤である請求項1〜4記載の医薬。
- 乳癌細胞の増殖阻害剤である請求項1〜4記載の医薬。
- 配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
- 哺乳動物に対して、配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
- 物質が
(1)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である請求項10〜13記載の方法。 - 物質が配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項10〜13記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項15記載の方法。
- 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 物質が配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項17〜20記載の使用。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項21記載の使用。
- 配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
- 物質が
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である請求項23記載の医薬。 - 配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項24または25記載の医薬。
- 癌の予防・治療剤である請求項23〜26記載の医薬。
- 乳癌の予防・治療剤である請求項23〜26記載の医薬。
- 癌細胞の増殖阻害剤である請求項23〜26記載の医薬。
- 乳癌細胞の増殖阻害剤である請求項23〜26記載の医薬。
- 配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
- 配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
- 哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
- 物質が
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である請求項33〜36記載の方法。 - 物質が配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項33〜36記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項38記載の方法。
- 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 物質が配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項40〜43記載の使用。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項44記載の使用。
- 配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質を含有してなる医薬。
- 物質が
(1)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である請求項46記載の医薬。 - 配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる医薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項47または48記載の医薬。
- 癌の予防・治療剤である請求項46〜49記載の医薬。
- 乳癌の予防・治療剤である請求項46〜49記載の医薬。
- 癌細胞の増殖阻害剤である請求項46〜49記載の医薬。
- 乳癌細胞の増殖阻害剤である請求項46〜49記載の医薬。
- 配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる乳癌の診断剤。
- 配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
- 哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
- 哺乳動物に対して、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌細胞の増殖阻害方法。
- 物質が
(1)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
である請求項56〜59記載の方法。 - 物質が配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項56〜59記載の方法。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項61記載の方法。
- 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 乳癌の予防・治療剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 乳癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の機能を阻害する物質の使用。
- 物質が配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項63〜66記載の使用。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項67記載の使用。
- 配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸を含有してなる乳癌の診断剤。
- GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質を含有してなる乳癌の予防・治療剤。
- GDNF、GFRα1及びRETの機能がGDNFによるRETの活性化またはGDNFによる乳癌細胞増殖促進である、請求項70記載の予防・治療剤。
- 物質が、
(1)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
(2)GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する低分子化合物またはその塩、
(3)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする核酸に対するアンチセンス核酸、または
(4)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするRNAに対するsiRNA
であって、GDNFによるシグナル伝達阻害活性またはGDNFによる乳癌細胞増殖阻害活性を有しているものである、請求項70記載の予防・治療剤。 - 物質が、
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、請求項70記載の予防・治療剤。 - 抗体がモノクローナル抗体である、請求項72または73記載の予防・治療剤。
- GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の治療に用いられる、請求項70記載の予防・治療剤。
- GDNFタンパク質、GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の治療に用いられる、請求項70記載の予防・治療剤。
- 哺乳動物に対して、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
- GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
- GDNFタンパク質、GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対して、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする乳癌の予防・治療方法。
- 物質が、
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、請求項77乃至79のいずれかに記載の予防・治療方法。 - 乳癌の予防・治療剤を製造するための、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の使用。
- GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の使用。
- GDNFタンパク質、GFRα1タンパク質及びRETタンパク質を発現する乳癌の患者に対する乳癌の予防・治療剤を製造するための、GDNF、GFRα1及びRETの機能を阻害する物質の使用。
- 物質が、
(1)配列番号:5、配列番号:7または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(2)配列番号:11または配列番号:13で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、または
(3)配列番号:1または配列番号:3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体
である、請求項81乃至83のいずれかに記載の使用。
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