KR20020007329A - 신규 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분비성 신규단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염, 이 단백질의 제조법, 이 단백질 등을 함유하여 이루어지는 의약, 이 단백질에 대한 항체, 이 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝방법/스크리닝용 키트, 이 스크리닝에 의해 얻어지는 화합물, 이 화합물을 함유하여 이루어지는 의약 등에 관한 것이다.

본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드 등은 예컨대 질환조직 적출후의 재생제 또는 암의 진단제 등으로 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 항체는 피검액중의 본 발명의 단백질의 정량 등에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하기 위한 시약으로서 유용하다.

Description

신규 단백질 및 그의 용도 {NOVEL PROTEINS AND USES THEREOF}

현재까지, 암관련의 유전자로서는 세포의 증식인자 혹은 수용체의 유전자로서 뇌종양에 관계하는 PDGF (Ross R., Nature 1993, 362:801), 유방암에 관계하는 erb-B, erb-B2(Cell 1983 ; 35,718, Burden S, Neuron 1997;18,847) 등이 발견되고 있는 것 외에, 시그널전달을 촉진시키는 대장암에 관계하는 Ki-ras, 백혈병에 관여하는 N-ras, 세포의 증식촉진유전자를 활성화시키는 전사인자의 백혈병, 유방암, 위암 등에 관여하는 c-myc (Maheswaran, Mol Cell Biol,1994 ; 14(2)1147), 신경아종에 관여하는 N-myc (Schwab, Nature 1983 ; 305.245) 폐암에 관여하는 L-myc (Nau, Nature 1985 ; 318,69) 또한 Bcl-2, Bcl-1, MDM2 등의 여포성 B 세포성 임파종, 유방암, 두경부암, p53 암억제단백질과 길항하는 단백질 등의 단백류의 유전자 (Reed, Nature 1997 ; 387,773, Donehower, Nature 1992 ; 356,215) 등 다수의 유전자가 발견되고 있다. 또, 이들의 유전자와는 달리, 암세포의 증식을 억제하도록 작용하는 유전자인 APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, RB, P53, WT1 등이 다수 발견되고 있다 (Weinberg, Scientific American, 1996, September, 32). 이들의 유전자는 세포, 조직이 암화되었을 때에 발견된 특이적인 단백질을 분석하여, 그아미노산서열의 정보를 근거로 하여 동정된 것으로, 그 발견의 경위는 여러가지이다. 또, 현재 발견되어 있는 이들 유전자만으로는 암의 발생, 치유를 설명할 수 없다.

또, 최근의 인간 유전자의 해석으로부터, 기능이 불명확한 EST (Expressed Sequence Tag) 의 염기서열이 다수 보고되고 있다.

따라서, 암에 특이적인 단백의 유전자를 기능이 알려지지 않은 EST 로부터 발견되는 것에 따른 새로운 암의 예방, 치료제의 개발이 요망되었다.

본 발명은 신규인 분비단백질 등에 관한 것이다.

도 1 은 실시예 1 에서 얻어진 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기서열 및 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산서열을 나타낸다.

도 2 는 실시예 2 에서 실행된 노던블롯의 결과를 나타낸 전기영동도를 나타낸다. 도면의 A. (Normal tissue) 중, 레인 1 은 뇌, 레인 2 는 심장, 레인 3 은 골격근, 레인 4 는 대장, 레인 5 는 흉선, 레인 6 은 비장, 레인 7 은 신장, 레인 8 은 간장, 레인 9 는 소장, 레인 10 은 태반, 레인 11 은 폐, 레인 12 는 말초혈을 나타내고, 도면의 B. (Cancer cell) 중, 레인 1 은 전골추성 백혈병세포 HL60, 레인 2 는 자궁경암 Hela 세포, 레인 3 은 만성골수성 백혈병세포 K-562, 레인 4 는 임파구성 백혈병세포 MOLT4, 레인 5 는 비키트 임파종세포 Raji, 레인 6 은 결장암세포 SW480, 레인 7 은 폐암세포 A549 및 레인 9 는 흑색종세포 G361 을나타낸다.

도 3 은 실시예 2 에서 실행된 노던블롯의 결과를 나타낸 전기영동도를 나타낸다. 도면의 C-1 중, 레인 1 은 인간폐암세포 RERF-LC-A1, 레인 2 는 인간폐암세포 NCI-H345, 레인 3 은 인간폐암세포 NCI-H460, 레인 4 는 인간폐암세포 NCI-H1299, 레인 5 는 인간태아 정상섬유아세포 MRC-5, 레인 6 은 인간태아 정상섬유아세포 WI-38, 레인 7 은 대장암세포 HT-29, 레인 8 은 대장암세포 WiDr, 레인 9 는 유방암세포 MCF-7 을 나타낸다.

도면의 C-2 중, 레인 1 은 신경아종세포 GOTO-P3, 레인 2 는 신경아종세포 IMR-32, 레인 3 은 신경교종세포 U-251, 레인 4 는 신경교종세포 KNS42, 레인 5 는 신경교종세포 KNS81 을 나타낸다.

도면의 C-3 중, 레인 1 은 폐암세포 NC1-H345, 레인 2 는 신경아종세포 IMR-32, 레인 3 은 전립선암세포 LNCap, 레인 4 는 전립선암세포 PC-3, 레인 5 는 신경아종세포 GOTO-P3, 레인 6 은 전골수성 백혈병세포 HL-60, 레인 7 은 흑색종세포 Bowes, 레인 8 은 유방암세포 MCF-7 을 나타낸다.

도 4 는 실시예 4 에서 실행된 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 전기영동도를 나타낸다.

도면중, 레인 1, 2 는 세포용해물 (Cell lysate), 레인 3, 4 는 배양 상등액 (Culture supernatant), 레인 5 는 Mock (COS-7세포만의 배양 상등액) 를 나타낸다.

도 5 는 실시예 5 에서 얻어진 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기서열 및 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산서열을 나타낸다.

도 6 은 실시예 6 에서 실행된 노던블롯의 결과를 나타낸 전기영동도를 나타낸다. 도면중, 레인 9 는 인간위암세포 AGS, 레인 10 은 췌장암세포 PANC-1, 레인 11 은 인간자궁내막종세포 AN3CA, 레인 12 는 인간자궁내막종세포 KLE, 레인 13 및 레인 14 는 인간 연골종세포 SW1353, 레인 15 는 인간자궁내막종세포 SKN, 레인 16 은 신장선암세포 ACHN 을 나타낸다.

도 7 은 실시예 14 에서 실행된 마우스 항혈청중의 항체가의 측정결과를 나타낸다. 도면중, ■는 마우스 1 의 항혈청을, □는 마우스 2 의 항혈청을, ▲는 마우스 3 의 항혈청을, △ 는 마우스 4 의 항혈청을, ●는 마우스 5 의 항혈청을, ○는 마우스 6 의 항혈청을, ┃는 마우스 7 의 항혈청을, ◇ 는 마우스 8 의 항혈청을, 각각 첨가한 웰의 흡광도를 나타낸다.

도 8 은 실시예 17 에서 실행된 경합법-EIA 의 결과를 나타낸다.

도면중, ■는 하이브리도마 No.39-35 가, □는 하이브리도마 No.53-16 이, ▲는 하이브리도마 No.61-2 가, △ 는 하이브리도마 No.76-12 가, ●는 하이브리도마 No.85-16 이, ○는 하이브리도마 No.112-3 이, ◆는 하이브리도마 No.128-18 이, ◇ 는 하이브리도마 No.139-26 이, × 는 하이브리도마 No.151-2 가 각각 산생하는 모노클로날항체의 B/B₀값을 나타낸다.

또, 각 배양 상등액의 희석배율은 이하와 같다.

No.39-35 : 50 배

No.53-16 : 50 배

No.61-2 : 120 배

No.76-12 : 60 배

No.85-16 : 120 배

No.112-3 : 450 배

No.128-18 : 450 배

No.139-26 : 120 배

No.151-2 : 60 배

도 9 는 실시예 24 에서 실행된 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 웨스턴블롯에 의한 해석결과를 나타낸다.

도면중, 레인 1, 3, 5 는 CHO-K1/TGC838N-4 의 배양 상등액을, 레인 2, 4, 6 은 CHO-K1/618/839F6-3 의 배양 상등액을 전기영동한 레인을 나타낸다. 또, 레인1, 2 는 128-18 항체 (실시예 18) 를, 레인 3, 4 는 112-3 항체 (실시예 18) 을, 레인 5, 6 은 토끼항혈청 (실시예 19) 을 각각 1차항체로 사용하였다.

도 10 은 실시예 24 에서 실행된 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 웨스턴블롯에 의한 해석결과를 나타낸다.

도면중, 레인 1, 2 는 pCAN618/H838 DNA 를, 레인 3, 4 는 pCAN618/H838F DNA 를, 레인 5, 6 은 pCAN618/H839F DNA 를, 레인 7, 8 은 pCAN618 DNA 를, 각각 도입한 COS7 의 배양 상등액을 전기영동한 레인을 나타낸다. 1차항체로서 마우스 항혈청 (실시예 12) 을 사용하였다.

도 11 은 실시예 24 에서 실행된 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 웨스턴블롯에 의한 해석결과를 나타낸다.

도면중, 레인 3, 4 는 pCAN618/H838F DNA 를, 레인 5, 6 은 pCAN618/H839F DNA 를, 레인 7, 8 은 pCAN618 DNA 를 각각 도입한 COS7 의 배양 상등액을 전기영동한 레인을 나타낸다. 1차항체로서 항FLAG 마우스 IgG 를 사용하였다.

도 12 는 실시예 25 에서 실행된 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 각 항체를 사용한 면역침강의 결과를 나타낸다.

도면중, 레인 1, 3, 5 는 pCAN618/H838F DNA 를 도입한 COS7 세포의, 레인 2, 4, 6 은 pCAN618/H839F DNA 를 도입한 COS7 세포의 배양 상등액을 나타낸다. 또, 레인 1, 2 는 128-18 항체 (실시예 18), 레인 3, 4 는 토끼 항혈청 (실시예 19) 을 사용하여 면역침강한 것을 나타내고, 레인 5, 6 은 컨트롤 (항체첨가하지 않음) 을 나타낸다.

도 13 은 실시예 26 에서 실행된 당사슬 부가의 확인결과를 나타낸다. 도면중, 레인 1, 2 는 pCAN618/H838 DNA 를, 레인 3, 4 는 pCAN618/H838F DNA 를, 레인 5, 6 은 pCAN618/H839F DNA 를, 레인 7, 8 은 pCAN618 DNA 를 각각 도입한 COS7 의 배양 상등액을 전기영동한 레인을 나타낸다. 레인 1, 3, 5 는 N-Glycosidase 로 처리한 레인을 나타낸다.

도 14 는 실시예 28 에서 얻어진 검사량을 나타낸다. 표 1 에 대응한다.

도 15 는 실시예 28 에서 실행된 TGC838 양의 측정결과를 나타낸다.

도면중, □는 CHO-K1/TGC838N-4 의, ◇ 는 pCAN618/H838 DNA 를 도입한 COS7의, ○는 SW1353-1 의, △ 는 SW1353-2 의 각각 배양 상등액 중의 TGC838 양을 나타낸다.

도 16 은 실시예 28 에서 실행된 TGC838 양의 측정결과를 나타낸다.

도면중, ○는 건강인의, ◇ 는 간장암환자의, △ 는 대장암환자의 각각 혈장중의 TGC838 양을 나타낸다.

도 17 은 실시예 29 에서 실행된 FACS 해석의 결과를 나타낸다.

도면중, 실선은 TGC839 FLAG 단백질첨가세포군을, 파선은 TGC839FLAG 단백질 무첨가세포군을 나타낸다.

도 18 은 실시예 29 에서 실행된 FACS 해석의 결과를 나타낸다.

도면중, +FITC-TGC839F 는 TGC839FLAG 단백질첨가 세포군을 -FITC-TGC839F 는 TGC839FLAG 단백질무첨가 세포군을 나타낸다.

도 19 는 실시예 30 에서 실행된 NK 세포의 세포상해성에 대한 TGC839 단백질의 영향의 측정결과를 나타낸다.

도면중, ○는 0 ng/㎖ 을, □는 50 ng/㎖ 을, △ 는 150 ng/㎖ 을, ◇ 는 500 ng/㎖ 의 TGC839FLAG 농도인 것을 나타낸다.

도 20 은 실시예 31 에서 실행된 NK 세포의 증식에 대한 TGC839 단백질의 영향의 측정결과를 나타낸다.

도면중, □와 ○는 다른 개체 유래의 말초혈인 것을 나타낸다.

도 21 은 실시예 31 에서 실행된 K562 세포의 증식에 대한 TGC839 단백질의 영향의 측정결과를 나타낸다.

도 22 는 실시예 31 에서 실행된 배양 상등액중의 IFN-γ값의 측정결과를 나타낸다.

발명의 실시를 하기 위한 최선의 형태

본 발명의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 동일하거나 혹은 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 단백질 (이하, 본 발명의 단백질이라고 함) 은, 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 세포 (예컨대, 간세포, 비(脾)세포, 신경세포, 글리어세포, 췌장β세포, 골수세포, 메산규윰세포, 랑겔한스세포, 표피세포, 상피세포, 내피세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근세포, 지방세포, 면역세포 (예 : 마크로퍼지, T 세포, B 세포, 내츄럴킬러세포, 비만세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구), 거핵구, 활막세포, 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선세포, 간세포 혹은 간질세포, 또는 이들 세포의 전구세포, 줄기세포 혹은 암세포 등) 혹은 이들의 세포가 존재하는 모든 조직, 예컨대, 뇌, 뇌의 각 부위 (예 ; 후구, 편도핵, 대뇌기저구, 해마, 시상, 시상하부, 대뇌피질, 연수, 소뇌), 척추, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관 (예 ; 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈, 전립선, 고환, 난소, 태반, 자궁, 골, 관절, 골격근 등, 또는 혈구계의 세포 혹은 그 배양세포 (예컨대, MEL, M1, CTLL-2, HT-2, WEH1-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2, KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01 등) 에서 유래하는 단백질이어도 되고, 합성단백질이어도 된다. 본 발명의 단백질은 인간이나 온혈동물 (예컨대, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 태아의 세포 (특히 태아의 뇌세포, 폐세포) 또는 암세포에서 유래하는 것이 바람직하다.

서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열로서는, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는 단백질로서는, 예컨대, 상기의 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖고, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질 등이 바람직하다.

구체적으로는 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질 등을 들 수 있다.

실질적으로 동질의 활성으로서는, 예컨대, 세포증식활성 등을 들 수 있다.

실질적으로 동질이란, 이들의 활성이 성질적으로 (예 : 생리화학적으로, 또는 약리학적으로) 동질인 것을 나타낸다. 따라서, 세포증식 등의 활성이 동등 (예 : 약 0.1 ∼ 100 배, 바람직하게는 약 0.5 ∼ 10 배, 보다 바람직하게는 약 0.5 ∼ 2 배)인 것이 바람직하지만, 이들의 활성의 정도, 단백질의 분자량 등의 양적요소는 달라도 된다.

세포증식의 측정은 자체 공지의 방법에 준하여 실행할 수 있으나, 예컨대 후술하는 스크리닝방법에 따라 측정할 수 있다.

또, 본 발명의 단백질로서는, 예컨대, ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열중의 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 결실된 아미노산서열, ② 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열에 1 ∼ 10 개 (바람직하게는 1 ∼ 5 개 (보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 부가된 아미노산서열, ③ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열에 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 삽입된 아미노산서열, ④ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열중의 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산서열, 또는 ⑤ 이들을 조합한 아미노산서열을 함유하는 단백질 등의 모든 무틴도 함유된다.

상기와 같이 아미노산서열이 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실, 또는 치환의 위치로서는 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에 있어서의 단백질은 펩티드표기의 관례에 따라 좌단이 N 말단 (아미노말단), 우단이 C 말단 (카르복실말단) 이다. 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열을 함유하는 단백질을 비롯한 본 발명의 단백질은 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) 이어도 된다.

여기에서 에스테르에 있어서의 R 로서는, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 혹은 n-부틸 등의 C_1-6알킬기, 예컨대 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8시클로헥실기, 예컨대 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12아릴기, 예컨대 벤질, 펜에틸 등의 페닐-C_1-2알킬기 혹은 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2알킬기 등의 C_7-14아랄킬기 외에, 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등이 사용된다.

본 발명의 단백질이 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 단백질에 함유된다. 이 경우의 에스테르로서는 예컨대 상기의 C 말단의 에스테르 등이 사용된다.

또한, 본 발명의 단백질에는 N 말단의 아미노산잔기 (예 : 메티오닌잔기) 의 아미노기가 보호기 (예컨대 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6알카노일 등의 C_1-6아실기 등) 로 보호되고 있는 것, 생체내에서 절단되어 생성되는 N 말단의 글루타민잔기가 피로글루탐산화된 것, 분자내의 아미노산의 측쇄상의 치환기 (예컨대, -OH, -SH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예컨대 포르밀기, 아세틸기 등의 C_1-6알카노닐기 등의 C_1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 혹은 당사슬이 결합된 당단백질 등의 복합단백질 등도 포함된다.

본 발명의 단백질의 구체예로서는, 예컨대 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 인간유래의 단백질 (도 1) 또는 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 인간유래의 단밸질 (도 5) 등이 사용된다.

또, 본 발명의 단백질은 암세포 또는 태아의 뇌, 태아의 폐 등, 바람직하게는 암세포 등에서 특이적으로 발현되는 특징을 갖는다.

본 발명의 단백질의 부분펩티드로서는 상기의 본 발명의 단밸질의 부분펩티드로, 바람직하게는 상기의 본 발명의 단밸질과 동일한 활성 (예 : 세포증식 등) 을 갖는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 구성아미노산서열중의 적어도 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산서열을 갖고, 세포증식활성을 갖는 펩티드 등이 사용된다.

이들 펩티드 중에서도, 예컨대, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열의 제 22 ∼ 252번째, 제 26 ∼ 252번째 또는 제 26 ∼ 34번째 (특히 제 26 ∼ 252번째 또는 제 26 ∼ 34번째가 바람직하고, 특히 제 26 ∼ 34번째가 바람직하다) 의 아미노산서열을 함유하는 아미노산서열, 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열의 제 22 ∼ 246번째, 제 26 ∼ 246번째, 제 166 ∼ 190번째 (특히 제 26 ∼ 246번째, 제 166 ∼ 190번째가 바람직하고, 특히 제 166 ∼ 190번째가 바람직하다) 의 아미노산서열을 함유하는 아미노산서열 등이 사용된다.

또, 본 발명의 부분펩티드는 그 아미노산서열중의 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 결실되거나, 또는 그 아미노산서열에 1 ∼ 10 개 (바람직하게는 1 ∼ 5 개 (보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 부가되거나, 또는 그 아미노산서열에 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 삽입되거나 또는 그 아미노산서열중의 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있어도 된다.

또, 본 발명의 부분펩티드는 C 말단이 통상 카르복실기 (-COOH) 또는 카르복실레이트 (-COO^-) 이지만, 상기의 본 발명의 단백질과 같이 C 말단이 아미드 (-CONH₂) 또는 에스테르 (-COOR) (R 은 상기와 동의의를 나타냄) 이어도 된다.

또한, 본 발명의 부분펩티드에는, 상기의 본 발명의 단백질과 동일하게, N 말단의 아미노산잔기 (예 : 메티오닌잔기) 의 아미노기가 보호기로 보호되고 있는 것, N 단측이 생체내에서 절단되어 생성된 글루타민잔기가 피로글루탐산화된 것, 분자내의 아미노산의 측쇄상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되고 있는 것, 혹은 당사슬이 결합된 소위 당펩티드 등의 복합펩티드 등도 포함된다.

또, 본 발명의 부분펩티드는 항체작성을 위한 항원으로서 사용할 수 있으므로, 반드시 세포증식활성을 가질 필요는 없다.

본 발명의 단백질 또는 부분펩티드의 염으로서는 생리학적으로 허용되는 산 (예 : 무기산, 유기산) 이나 염기 (예 : 알칼리금속염) 등의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로서는, 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 혹은 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 단백질 또는 그의 염은, 상술한 인간이나 온혈동물의 세포 (특히 암세포 등) 또는 조직 (특히 태아뇌·폐 등) 으로부터 자체공지의 단백질의 정제방법에 의해 제조할 수도 있고, 후술하는 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 형질전환체를 배양함으로써도 제조할 수 있다. 또, 후술하는 펩티드 합성법에 준하여 제조할 수도 있다.

사람이나 포유동물의 조직 또는 세포 (특히 암세포, 태아뇌·폐 등) 으로부터 제조하는 경우, 인간이나 포유동물의 조직 또는 세포를 호모지나이즈 (homogenize) 한 후, 산 등으로 추출하여, 이 추출액을 역상 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제단리할 수 있다.

본 발명의 단백질, 부분펩티드, 혹은 이들의 염, 또는 이들의 아미드체의 합성에는 통상적으로 시판되는 단백질 합성용 수지를 사용할 수 있다. 이와 같은 수지로서는, 예컨대, 클로로메틸수지, 히드록시메틸수지, 벤즈히드릴아민수지, 아미노메틸수지, 4-벤질옥시벤질알코올수지, 4-메틸벤즈히드릴아민수지, PAM수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미드메틸수지, 폴리아크릴아미드수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc아미노에틸)페녹시수지 등을 들 수 있다. 이와 같은 수지를 사용하여, α-아미노기와 측쇄관능기를 적당히 보호한 아미노산을 목적으로 하는 단백질의 서열대로 자체 공지의 각종 축합방법에 따라 수지상에서 축합시킨다. 반응의 마지막에 수지로부터 단백질을 잘라냄과 동시에 각종 보호기를 제거하고, 또한 고희석용액중에서 분자내 디술피드 결합형성반응을 실시하여, 목적의 단백질 또는 이들의 아미드체를 취득한다.

상기의 보호아미드산의 축합에 관해서는 단백질 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화시약을 사용할 수 있지만, 특히 카르보디이미드류가 좋다. 카르보디이미드류로서는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프롤릴)카르보디이미드 등이 사용된다. 이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제첨가제 (예컨대, HOBt, HOOBt) 와 함께 보호아미노산을 직접 수지에 첨가하거나 또는 대칭산무수물 또는 HOBt 에스테르 혹은 HOOBt 에스테르로서 미리 보호아미노산의 활성화를 실행한 후에 수지에 첨가할 수 있다.

보호아미노산의 활성화나 수지의 축합에 사용되는 용매로서는 단백질 축합반응에 사용할 수 있는 것이 알려져 있는 용매로부터 적당히 선택될 수 있다. 예컨대, N,N-디메틸포름아미드, N.N'-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등의 알코올류, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드류, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 혹은 이들의 적당한 혼합물 등이 사용된다. 반응온도는 단백질결합형성반응에 사용될 수 있는 것이 알려져 있는 범위에서 적당히 선택되고, 통상 약 -20℃ ∼ 50℃ 의 범위에서 적당히 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상 1.5 ∼ 4 배 과잉으로 사용된다. 닌히드린 (ninhydrin) 반응을 사용한 테스트 결과, 축합이 불충분한 경우에는 보호기의 탈리를 실행하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 실행할 수 있다. 반응을 반복하여도 충분한 축합을 얻을 수 없을 때에는, 무수아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화함으로써, 나중의 반응에 영향을 주지 않도록 할 수 있다.

원료의 아미노기의 보호기로서는, 예컨대 Z, Boc, t-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프타로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스피노티오일, Fmoc 등이 사용된다.

카르복실기는, 예컨대 알킬에스테르화 (예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 2-아다만틸 등의 직쇄상, 분지상 혹은 고리형상 알킬에스테르화), 아랄킬에스테르화 (예컨대, 벤질에스테르, 4-니트로벤질에스테르, 4-메톡시벤질에스테르, 4-클로로벤질에스테르, 벤즈히드릴에스테르화), 펜아실에스테르화, 벤질옥시카르보닐히드라지드화, t-부톡시카르보닐히드라지드화, 트리틸히드라지드화 등에 의해 보호할 수 있다.

세린의 수산기는, 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 의해 보호할 수 있다. 이 에스테르화에 적합한 기로서는 예컨대 아세틸기 등의 저급 (C_1-6) 알카노일기, 벤조일기 등의 알로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄산으로부터 유도되는 기 등이 사용된다. 또, 에테르화에 적합한 기로서는, 예컨대, 벤질기, 테트라히드로피라닐기, t-부틸기 등이다.

티로신의 페놀성 수산기의 보호기로서는, 예컨대, Bzl, Cl₂-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, t-부틸 등이 사용된다.

히스티딘의 이미다졸의 보호기로서는, 예컨대, Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등이 사용된다.

원료의 카르복실기가 활성화된 것으로서는, 예컨대 대응하는 산무수물, 아지드, 활성에스테르 [알코올 (예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-틀릴클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알코올, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙시미드, N-히드록시프탈이미드, HOBt) 과의 에스테르] 등이 사용된다. 원료의 아미노기가 활성화된 것으로서는 예컨대 대응하는 인산아미드가 사용된다.

보호기의 제거 (탈리) 방법으로서는, 예컨대 Pd-흑 또는 Pd-탄소 등의 촉매의 존재하에서의 수증기류중에서의 접촉환원이나, 무수불화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 혹은 이들의 혼합액 등에 의한 산처리나 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기처리, 또 액체암모니아중 나트륨에 의한 환원 등도 이용된다. 상기 산처리에 의한 탈리반응은 일반적으로 약 -20℃ ∼ 40℃ 의 온도에서 실행되지만, 산처리에 있어서는, 예컨대, 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올 등과 같은 카티온 포착제의 첨가가 유효하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로서 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀처리에 의해 제거되고, 트립토판의 인돌보호기로서 사용되는 포르밀기는 상기의 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등의 존재하의 산처리에 의한 탈보호 이외에 묽은 수산화나트륨용액, 묽은 암모니아 등에 의한 알칼리처리에 의해서도 제거된다.

원료의 반응에 관여해서는 안되는 관능기의 보호 및 보호기, 그리고 그 보호기의 탈리, 반응에 관여하는 관능기의 활성화 등은 공지의 기 또는 공지의 수단으로부터 적당히 선택할 수 있다.

단백질의 아미드체를 얻는 다른 방법으로서는, 예컨대, 먼저, 카르복시말단아미노산의 α-카르복실기를 아미드화하여 보호한 후, 아미노기측에 펩티드 (단백질) 사슬을 원하는 사슬길이까지 신장시킨 후, 이 펩티드사슬의 N 말단의 α-아미노기의 보호기만을 제외한 단백질과 C 말단의 카르복실기의 보호기만을 제거한 단백질을 제조하여, 이 양단백질을 상기와 같은 혼합용매중에서 축합시킨다. 축합반응의 상세한 내용은 상기와 동일하다. 축합에 의해 얻어진 보호단백질을 정제한 후, 상기 방법으로 모든 보호기를 제거하여, 원하는 조단백질을 얻을 수 있다. 이 조단백질은 이미 알려진 각종 정제수단을 구사하여 정제하고, 주요분획을 동결건조함으로써 원하는 단백질의 아미드체를 얻을 수 있다.

단백질의 에스테르체를 얻기 위해서는, 예컨대, 카르복시말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알코올류와 축합하여 아미노산 에스테르로 한 후, 단백질의 아미드체와 동일하게 하여 원하는 단백질의 에스테르체를 얻을 수 있다.

본 발명의 부분펩티드 또는 그의 염은 자체 공지의 펩티드의 합성법에 따라, 혹은 본 발명의 단백질을 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 펩티드의 합성법으로서는, 예컨대, 고상합성법, 액상합성법의 어느 것에 의해서 상관없다. 즉, 본 발명의 부분펩티드를 구성할 수 있는 부분펩티드 혹은 아미노산과 잔여부분을 축합시켜 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 보호기를 탈리함으로써 목적의 펩티드를 제조할 수 있다. 공지의 축합방법이나 보호기의 탈리로서는, 예컨대 이하의 ① ∼ ⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.

① M. Bodanszky 및 M.A. Ondetti, 펩티드·신세시스 (Peptide Synthesis),Interscience Publishers, New York (1966년)

② Schroeder 및 Luebke, 더·펩티드 (The Peptide), Academic Press, New York (1965년)

③ 이즈미야노부 외, 펩티드합성의 기초와 실험, 마루젠(주) (1975년)

④ 야지마하루아끼 및 사카키바라 수운뻬이, 생화학실험강좌1, 단백질의 화학Ⅳ, 205, (1977년)

⑤ 야지마하루아끼 감수, 속의약품의 개발, 제 14 권, 펩티드합성, 히로가와서점

또, 반응후는 통상의 정제법, 예컨대 용매추출·증류·컬럼크로마토그래피·액체크로마토그래피·재결정 등을 조합하여 본 발명의 부분펩티드를 정제단리할 수 있다. 상기 방법으로 얻어지는 부분펩티드가 유리체인 경우에는 공지의 방법 혹은 이것에 준하는 방법으로 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 공지의 방법 혹은 그것에 준하는 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 로서는, 상술한 본 발명의 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈DNA, 게놈DNA 라이브러리, 상기의 세포·조직유래의 cDNA, 상기의 세포·조직유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 의 어느 것이어도 된다.

라이브러리에 사용하는 벡터는, 박테리오퍼지, 플라스미드, 코스미드, 퍼지미드 등 어느 것이어도 된다. 또, 상기의 세포·조직으로부터 totalRNA 또는mRNA 분획을 조제한 것을 사용하여 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (이하, RT-PCR 법이라 약칭함) 에 의해 증폭할 수도 있다.

본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대, ① 서열번호 : 2 로 표시되는 염기서열을 함유하는 DNA, 또는 서열번호 : 2 로 표시되는 염기서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 갖고, 본 발명의 단백질과 실질적으로 동질의 활성 (예 : 세포증식활성 등) 을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA, ② 서열번호 : 6 으로 표시되는 염기서열을 함유하는 DNA, 또는 서열번호 : 6 으로 표시되는 염기서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 갖고, 본 발명의 단백질과 실질적으로 동질의 활성 (예 : 세포증식활성 등) 을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 등이면 어느 것이어도 된다.

보다 구체적으로는, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 로서는, 서열번호 : 2 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이, 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 로서는 서열번호 : 6 으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 부분펩티드를 코딩하는 DNA 로서는, 상기의 본 발명의 부분펩티드를 코딩하는 염기서열을 함유하는 것이면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈DNA 라이브러리, 상기의 세포·조직유래의 cDNA, 상기의 세포·조직유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 의 어느 것이어도 된다.

본 발명의 부분펩티드를 코딩하는 DNA 로서는, 예컨대 ① 서열번호 : 2 로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 의 부분염기서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 : 2 로표시되는 염기서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 갖고, 본 발명의 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 의 부분염기서열을 갖는 DNA, ② 서열번호 : 6 으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 의 부분염기서열을 갖는 DNA, 또는 서열번호 : 6 으로 표시되는 염기서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기서열을 갖고, 본 발명의 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 의 부분염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

본 발명이 단백질 또는 부분펩티드 (이하, 이들 단백질 등을 코딩하는 DNA 의 클로닝 및 발현의 설명에 있어서는, 이들 단백질 등을 간단히 본 발명의 단백질로 약기하는 경우가 있음) 를 완전히 코딩하는 DNA 의 클로닝의 수단으로서는, 본 발명의 단백질의 부분염기서열을 갖는 합성DNA 프라이머를 사용하여 자체공지의 PCR 법으로 증폭하거나, 또는 적당한 벡터에 형성한 DNA 를 본 발명의 단백질의 일부 혹은 전체영역을 코딩하는 DNA 단편 혹은 합성 DNA 를 사용하여 표식한 것과의 하이브리다이제이션에 의해 선별할 수 있다. 하이브리다이제이션의 방법은 예컨대 모레큘러·클로닝 (Molecular Cloning) 2nd (J.Sambrook et al., Cold Spring Harber Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 실행할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우, 첨부의 사용설명서에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

DNA 의 염기서열의 변환은, 공지의 키트, 예컨대, Mutan^TM-G (다카라 주조(주)), Mutan^TM-K (다카라 주조(주)) 등을 사용하여, Gapped duplex 법이나 Kunkel 법 등의 자체공지의 방법 혹은 이들에 준하는 방법에 따라 실행할 수 있다.

클론화된 단백질을 코딩하는 DNA 는 목적에 의해 그대로, 또는 원할 경우 제한효소로 소화하거나, 링커를 부가하여 사용할 수 있다. 이 DNA 는 그 5' 말단측에 번역개시 코돈으로서의 ATG 를 갖고, 또 3' 말단측에는 번역종지 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 갖고 있어도 된다. 이들의 번역개시코돈이나 번역종지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 이용하여 부가할 수도 있다.

본 발명의 단백질의 발현벡터는 예컨대, (가) 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 잘라내고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현벡터중의 프로모터의 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.

벡터로서는, 대장균 유래의 플라스미드 (예 : pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균유래의 플라스미드 (예 : pUB110, pTP5, pC194), 효모유래의 플라스미드 (예 : pSH19, pSH15), γ퍼지 등의 박테리오파아지, 레트로바이러스, 백시니어바이러스, 바클로바이러스 등의 동물바이러스 등 외에, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 이용된다.

본 발명에서 사용되는 프로모터로서는, 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대, 동물세포를 숙주로 사용하는 경우에는, SRα 프로모터, SV40 초기프로모터, HIV·LTR 프로모터, CMV 프로모터, HSV-TK 프로모터 등을 들 수 있다.

이들 중, CMV (사이트메가로바이러스)프로모터, SRα프로모터 등을 사용하는 것이 바람직하다. 숙주가 에쉐리히어 (escherichia) 속균인 경우에는 trp프로모터, lac프로모터, recA 프로모터, γPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우에는 폴리헤드린프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.

발현벡터에는 이상의 것 외에 원하면 엔핸서, 스플라이싱시그널, 폴리A부가시그널, 선택마커, SV40 복제오리진 (이하, SV40ori 로 약칭하는 경우가 있음) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택 마커로서는 예컨대 디히드로엽산환원효소 (이하, dhfr 로 약칭하는 경우가 있음) 유전자 [메소트렉세이트 (MTX) 내성], 암피실린내성유전자 (이하, Amp^r로 약칭하는 경우가 있음), 네오마이신 내성유전자 (이하, Neo^r로 약칭하는 경우가 있음, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, dhfr 유전자 결손 차이니즈 햄스터 세포를 사용하여 dhfr 유전자를 선택마커로서 사용하는 경우, 재조합 세포를 티미딘을 함유하지 않은 배지에 의해서도 선택할 수 있다.

또, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널서열을 본 발명의 단백질의 N 단말측에 부가한다. 숙주가 에쉐리히어속균인 경우에는 PhoA·시그널서열, OmpA·시그널서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라제·시그널서열, 서브틸리신·시그널서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα·시그널서열, SUC2·시그널서열 등, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린·시그널서열, α-인터페론·시그널서열, 항체분자·시그널서열 등이 각각 이용된다.

이와 같이 하여 구축된 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조할 수 있다.

숙주로서는 예컨대 에쉐리히어속균, 바실러스속균, 효모, 곤충세포, 곤충, 동물세포 등이 이용된다.

에쉐리히어속균의 구체예로서는 예컨대 에쉐리히어·콜리 (Escherichia coli) K12·DH1 [프로시딩즈·오브·더·내쇼널·아카데미·오브·사이언시즈·오브·더·유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60권, 160(1968)], JM103[누클레익·애시드·리서치, (Nucleic Acids Research), 9권, 309(1981)], JA221 [저널·오브·모레큘러·바이올로지 (Journal of Molecular Biology)], 120권, 517(1978)], HB101 [저널·오브·모레큘러·바이올로지, 41권, 459(1969)], C600[제네틱스(Genetics), 39권, 440(1954)] 등이 이용된다.

바실러스속균으로서는 예컨대 바실러스·서브틸스 (Bacillus subtilis) MI114[진, 24권, 255(1983)], 207-21 [저널·오브·바이오케미스트리 (Journal of Biochemistry), 95권, 87(1984)] 등이 이용된다.

효모로서는, 예컨대 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)AH22, AH22R^-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913, NCYC2036, 피히어 패스토리스 (Pichia pastoris)KM71 등이 이용된다.

곤충세포로서는 예컨대 바이러스가 AcNPV 인 경우에는, 밤나방의 유충유래의 주화세포 (Spodoptera frugiperda cell ; Sf 세포), 트리코플러시아 니 (Trichoplusia ni)의 중장 (中腸) 유래의 MG1 세포, 트리코플러시아 니의 난 유래의 High FiveTM 세포, 마메스트라 브라시캐 (Mamestra brassicae)유래의 세포 또는 에스티그메나 아크레아 (Estigmena acrea)유래의 세포 등이 이용된다. 바이러스가 BmNPV 인 경우에는 누에유래의 주화세포 (Bombyx moriN 세포 ; BmN 세포) 등이 이용된다. 이 Sf 세포로서는, 예컨대 Sf9 세포 (ATCCCRL1711), Sf21 세포 (이상, Vaughn, J.L.등, 인·비보 (In Vivo), 13,213-217, (1977)) 등이 이용된다.

곤충으로서는, 예컨대 누에의 유충 등이 이용된다 (마에다 외, 네이쳐 (Nature), 315 권, 592(1985)].

동물세포로서는 예컨대 원숭이 세포 COS-7, Vero, 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO 세포로 약기함), dhfr 유전자 결손 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO (dhfr^-) 세포로 약기함), 마우스 L세포, 마우스 AtT-20, 마우스미에로머세포, 래트GH3, 인간 FL 세포 등이 이용된다. 또한, 각종 정상인간세포, 예컨대 간세포, 비세포, 신경세포, 글리어세포, 췌장β세포, 골수세포, 메산규움세포, 랑겔한스세포, 표피세포, 상피세포, 내피세포, 섬유아세포, 섬유세포, 근세포, 지방세포, 면역세포 (예 : 마크로퍼지, T세포, B세포, 내츄럴킬러세포, 비만세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단구), 거핵구, 활막세포, 연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 유선세포, 간세포 혹은 간질세포, 또는 이들 세포의 전구세포, 줄기세포 혹은 암세포 등) 등을 이용할 수도 있다.

에쉐리히어속균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대, 프로시딩즈·오브·더·내쇼널·아카데미·오브·사이언디이즈·오브·더·유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69 권, 2110 (1972) 또는 진 (Gene), 17권, 107 (1982) 등에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

바실러스속균을 형질전환하기 위해서는, 예컨대, 모레큘러·앤드·제네랄·제네틱스 (Molecular & General Genetics), 168권, 111 (1979) 등에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

효모를 형질전환하기 위해서는, 예컨대, 메소드·인·엔자이몰로지 (Methods in Enzymology), 194권, 182-187 (1991), 프로시딩즈·오브·더·내쇼널·아카데미·오브·사이언시즈·오브·더·유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75권, 1929(1978) 등에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

곤충세포 또는 곤충을 형질전환하기 위해서는, 예컨대, 바이오/테크놀로지 (Bio/Technology), 6, 47-55 (1988)) 등에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

동물세포를 형질전환하기 위해서는, 예컨대, 세포공학별책 8 신세포공학실험 프로토콜. 263-267 (1995)(슈쥰사 발행), 바이롤로지 (Virology), 52권, 456 (1973) 에 기재된 방법에 따라 실행할 수 있다.

이와 같이 하여 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유하는 발현벡터로 형질전환된형질전환체를 얻을 수 있다.

숙주가 에쉐리히어속균, 바실러스속균인 형질전환체를 배양할 때, 배양에 사용되는 배지로서는 액체배지가 적당하고, 그 중에는 이 형질전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 그 외의 것이 함유되게 된다. 탄소원으로서는 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성전분, 자당 등, 질소원으로서는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스티프·리카, 펩톤, 카제인, 육엑기스, 대두찌꺼기, 감자추출액 등의 무기 또는 유기물질, 무기물로서는 예컨대 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또, 효모엑기스, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가하여도 된다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 이 바람직하다.

에쉐리히어속균을 배양할 때의 배지로서는, 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유하는 M9 배지 [미러 (Miller), 저널·오브·엑스페리먼트·인·모레큘러·제네틱스 (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작용시키기 위해서는, 예컨대 3β-인돌릴아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다.

숙주가 에쉐리히어속균인 경우, 배양은 통상 약 15 ∼ 43℃ 에서 약 3 ∼ 24 시간 실행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수도 있다.

숙주가 바실러스속균인 경우, 배양은 통상 약 30 ∼ 40℃ 에서 약 6 ∼ 24 시간 실행하여, 필요에 따라 통기나 교반을 추가할 수도 있다.

숙주가 효모인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 예컨대 바크홀더(Burkholder) 최소배지 [Bostian,K.L 외, 프로시딩즈·오브·더·내쇼널·아카데미·오브·사이언시즈·오브·더·유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77권, 4505(1980)] 이나 0.5% 카자미노산을 함유하는 SD 배지 [Bitter, G.A. 외, 프로시딩즈·오브·더·내쇼널·아카데미·오브·사이언시즈·오브·더·유에스에이 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 81권, 5330(1984)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 ∼ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 20℃ ∼ 35℃ 에서 약 24 ∼ 72 시간 실행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.

숙주가 곤충세포 또는 곤충인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는, Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., 네이쳐 (Nature), 195,788 (1962)) 에 비동화 (非動化) 한 10% 소혈청 등의 첨가물을 적당히 첨가한 것 등이 이용된다. 배지의 pH 는 약 6.2 ∼ 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 27℃ 에서 약 3 ∼ 5일간 실행하고 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.

숙주가 동물세포인 형질전환체를 배양할 때, 배지로서는 예컨대 약 5 ∼ 20% 의 태아소혈청을 함유하는 MEM 배지 [사이언스(Science), 122권, 501(1952)], DMEM배지 [바이올로지(Virology), 8권, 396(1959)], RPMI 1640 배지 [저널·오브·더·아메리칸·메디컬·어소시에이션 (The Jounal of the American Medical Association) 199권, 519(1967)], 199 배지 [프로시딩·오브·더·소사이어티·포·더·바이롤로지컬·메디슨 (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), 73권, 1(1950)] 등이 이용된다. pH는 약 6 ∼ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30℃ ∼ 40℃ 에서 약 15 ∼ 60 시간 실행하고 필요에 따라 통기나 교반을 추가한다.

이상과 같이 하여 형질전환체의 세포 외에 본 발명의 단백질을 생성시킬 수 있다.

상기 배양물로부터 본 발명의 단백질을 분리정제하기 위해서는, 예컨대 하기의 방법으로 실행할 수 있다.

본 발명의 단백질을 배양균체 혹은 세포로부터 추출할 때에는 배양후, 공지의 방법으로 균체 또는 세포를 모아 이것을 적당한 완충액에 현탁하여 초음파, 리소자임 및/또는 동결융해 등에 의해 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의해 단백질의 조추출액을 얻는 방법 등을 적절히 이용할 수 있다. 완충액 중에 요소나 염산구아니딘 등의 단백질 변성제나, 트리톤X-100^TM등의 계면활성제가 함유되어 있어도 된다. 배양액중에 단백질이 분비되는 경우에는, 배양종료후, 그 자체 공지의 방법으로 균체 혹은 세포와 상등액을 분리하여 상등액을 모은다.

이와 같이 하여 얻어진 배양 상등액, 혹은 추출액중에 함유되는 단백질의 정제는 자체공지의 분리·정제법을 적당히 조합하여 실행할 수 있다. 이들 공지의 분리·정제법으로서는 염석이나 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피 등의 전하의 차이를 이용하는 방법, 어피너티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상고속액체크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법 등의등전점의 차이를 이용하는 방법 등이 이용된다.

이렇게 하여 얻어지는 단백질이 유리체로 얻어진 경우에는 자체공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법에 의해 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는 자체 공지의 방법 혹은 이에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환할 수 있다.

또한, 재조합체가 생산하는 단백질을 정제전 또는 정제후에 적당한 단백질수식효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 추가하거나 폴리펩티드를 부분적으로 제거할 수도 있다. 단백질수식효소로서는 예컨대, 트립신, 키모트립신, 아르기닐엔도펩티다아제, 프로테인키나아제, 글리코시다아제 등이 이용된다.

이렇게 하여 생성되는 본 발명의 단백질 또는 그의 염의 존재 또는 활성은 표식된 리간드와의 결합실험 및 특이항체를 이용한 엔자임이뮤노어세이 등으로 측정할 수 있다.

본 발명의 단백질 혹은 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체는 본 발명의 단백질 혹은 부분펩티드 또는 그의 염을 인식할 수 있는 항체이면 폴리클로날항체, 모노클로날항체의 어느 것이어도 된다.

본 발명의 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체로서는, 예컨대 ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열의 제 22 ∼ 252번째, 제 26 ∼ 252번째 또는 제 26 ∼ 34번째 (특히 제 26 ∼ 252번째 또는 제 26 ∼ 34번째가 바람직하고, 특히 제 26 ∼ 34번째가 바람직하다) 의 아미노산서열을 함유하는 아미노산서열을 갖는 부분펩티드 또는 그의 염, ② 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열의 제 22 ∼246번째, 제 26 ∼ 246번째, 제 166 ∼ 190번째 (특히, 제 26 ∼ 246번째, 제 166 ∼ 190번째가 바람직하고, 특히 제 166 ∼ 190번째가 바람직하다) 의 아미노산서열을 포함하는 아미노산서열을 갖는 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체 등이 바람직하다.

본 발명의 단백질 혹은 부분펩티드 또는 그의 염 (이하, 항체의 설명에 있어서는, 이들 단백질 등을 단순히 본 발명의 단백질로 약기하는 경우가 있음) 에 대한 항체는 본 발명의 단백질을 항원으로 이용하여 자체 공지의 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다.

[모노클로날항체의 제작]

(a) 모노클로날항체 생산세포의 제작

본 발명의 단백질은 온혈동물에 대하여 투여에 의해 항체생산이 가능한 부위에 그 자체 혹은 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에 항체생산능을 높이기 위해, 완전 프로인트어쥬밴트나 불완전 프로인 어쥬밴트를 투여하여도 된다. 투여는 통상 2 ∼ 6 주마다 1 회씩, 계 2 ∼ 10회 정도 실행된다. 이용되는 온형동물로서는 예컨대 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 양, 염소, 닭 등을 들 수 있으나, 마우스 및 래트가 바람직하게 이용된다.

모노클로날항체 생산세포의 제작에 있어서는, 항원으로 면역된 온혈동물, 예컨대, 마우스로부터 항체가가 확인된 개체를 선택하여 최종면역의 2 ∼ 5 일후에 비장 또는 임파절을 채취하여 이들에 함유되는 항체생산세포를 동종 또는 이종동물의 골수종세포와 융합시킴으로서, 모노클로날항체 생산하이브리도마를 조제할 수있다. 항혈철중의 항체가의 측정은 예컨대 후기의 표식화 단백질과 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합한 표식제의 활성을 측정함으로써 실행할 수 있다. 융합조작은 이미 알려진 방법, 예컨대 쾰러 (kohler) 와 밀스테인 (milstein) 의 방법 [네이쳐 (Nature), 256, 495 (1975)] 에 따라 실시할 수 있다. 융합촉진제로서는 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이나 센다이바이러스 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 PEG 가 이용된다,

골수종세포로서는 예컨대, NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 등의 온혈동물의 골수종세포를 들 수 있으나, P3U1 이 바람직하게 이용된다. 이용되는 항체생산세포 (비장세포) 수와 골수종세포수의 바람직한 비율은 1:1 ∼ 20:1 정도이고, PEG (바람직하게는 PEG1000 ∼ PEG6000) 이 10 ∼ 80% 정도의 농도로 첨가되어, 20 ∼ 40℃, 바람직하게는 30 ∼ 37℃ 에서 1 ∼ 10 분간 인큐베이트함으로써 효율적으로 세포융합을 실시할 수 있다.

모노클로날항체 생산하이브리도마의 스크리닝에는 여러가지의 방법을 사용할 수 있는데, 예컨대, 단백질항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상 (예 : 마이크로플레이트) 에 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고, 다음에 방사성물질이나 효소 등으로 표식한 항면역 글로불린항체 (세포융합에 이용되는 세포가 마우스인 경우, 항마우스면역 글로불린항체가 이용됨) 또는 프로테인A 를 첨가하여, 고상에 결합된 모노클로날항체를 검출하는 방법, 항면역글로불린 항체 또는 프로테인A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고, 방사성물질이나 효소 등으로 표식한 단백질을 첨가하여 고상에 결합된 모노클로날항체를 검출하는 방법 등을들 수 있다.

모노클로날항체의 선별은 자체 공지 혹은 그에 준하는 방법에 따라 실행할 수 있다. 통상 HAT (히폭삭틴, 아미노프텔린, 티미딘) 을 첨가한 동물세포용 배지에서 실행할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는 하이브리도마를 생육할 수 있는 것이면 어떠한 배지를 사용하여도 된다. 예컨대 1 ∼ 20%, 바람직하게는 10 ∼ 20% 의 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지, 1 ∼ 10% 의 소태아혈청을 함유하는 GIT 배지 (와꼬쥰야쿠고교(주)) 혹은 하이브리도마 배양용 무혈청배지 (SFM-101, 닛스이세이야쿠(주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 20 ∼ 40℃, 바람직하게는 37℃ 이다. 배양시간은 통상 5 일 ∼ 3 주일, 바람직하게는 1 주일 ∼ 2 주일이다. 배양은 통상 5% 탄산가스하에서 실행할 수 있다. 하이브리도마 배양 상등액의 항체가는 상기의 항혈청중의 항체가의 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다.

(b) 모노클로날항체의 정제

모노클로날항체의 분리정제는 자체 공지의 방법, 예컨대, 면역 글로불린의 분리정제법 [예 : 염석법, 알코올침전법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환체 (예 : DEAE) 에 의한 흡착탈법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 혹은 프로테인 A 혹은 프로테인 G 등의 활성흡착제에 의해 항체만을 채취하여 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법] 에 따라 실행할 수 있다.

[폴리클로날항체의 제작]

본 발명의 폴리클로날항체는 그 자체 공지 혹은 그에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 예컨대, 면역항원 (단백질항원) 자체, 혹은 그것과 캐리어 단백질의 복합체를 만들어, 상기의 모노클로날항체의 제조법과 동일하게 온혈동물에 면역을 실행하여, 이 면역동물로부터 본 발명의 단백질에 대한 항체함유물을 채취하여 항체의 분리정제를 실행함으로써 제조할 수 있다.

온혈동물을 면역하기 위해 사용되는 면역항원과 케리어 단백질의 복합체에 관하여, 캐리어 단백질의 종류 및 캐리어와 합텐의 혼합비는 캐리어에 가교시켜 면역한 합텐에 대하여 항체가 효율적으로 생기면, 소정의 것을 소정의 비율로 가교시켜도 되지만, 예컨대 소 혈청알부민이나 소 티로글로불린, 헤모시아닌 등을 중량비로 합텐 1 에 대하여 약 0.1 ∼ 20, 바람직하게는 약 1 ∼ 5 의 비율로 커플링하는 방법이 이용된다.

또, 합텐과 캐리어의 커플링에는 여러가지의 축합제를 사용할 수 있으나, 글루타르알데히드나 카르보디이미드, 말레이미드 활성에스테르, 티올기, 디티오피리딜기를 함유하는 활성에스테르 시약 등이 사용된다.

축합생성물은 온혈동물에 대하여 항체생산이 가능한 부위에 그 자체 혹은 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에 항체생산능을 높이기 위해 완전 프로인트 어쥬반트나 불완전 프로인트 어쥬반트를 투여하여도 된다. 투여는 통상적으로 약 2 ∼ 6주마다 1회씩, 합계 약 3 ∼ 10 회 정도 실행된다.

폴리클로날항체는 상기의 방법으로 면역된 온혈동물의 혈액, 복수 등, 바람직하게는 혈액으로부터 채취할 수 있다.

항혈청중의 폴리클로날항체가의 측정은 상기의 항혈청중의 항체가의 측정과동일하게 하여 측정할 수 있다. 폴리클로날항체의 분리정제는 상기의 모노클로날항체의 분리정제와 동일한 면역 글로불린의 분리정제법에 따라 실행할 수 있다.

이하에, 본 발명의 단백질 혹은 부분펩티드 또는 그의 염 (이하, 본 발명의 단백질 등으로 약기하는 경우가 있음) 및 본 발명의 단백질 혹은 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체로 약기하는 경우가 있음) 의 용도를 설명한다.

(1) 본 발명의 단백질을 함유하는 각종 질병의 치료·예방제

본 발명의 단백질 등은 세포증식활성을 갖고 있으므로, 본 발명의 단백질 등은 질환조직 적출 (전체적출·부분적출의 쌍방을 포함하지만, 부분적출이 바람직함) 후의 조직재생제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질 등을 상기의 치료·예방제로서 사용하는 경우에는, 적어도 90%, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상으로 정제된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 단백질 등은 예컨대 필요에 따라 당의를 입힌 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로, 혹은 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용될 수 있는 액과의 무균성용액, 또는 현탁액제 등의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질 등을 생리학적으로 인정되는 담체, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제의 실시에 요구되는 단위용량형태로 혼화함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는것이다.

정제, 캡슐제 등에 혼화할 수 있는 첨가제로서는, 예컨대, 젤라틴, 전분, 트라간트, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 아르긴산 등과 같은 팽화제, 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 아까모노 (gaultheria adenothrix) 오일 또는 체리와 같은 향미제 등을 사용할 수 있다. 조제단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용수와 같은 비히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상적인 제제실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용 수성액으로서는, 예컨대, 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함하는 등장액 (예컨대, D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예컨대, 에탄올 등), 폴리알코올 (예컨대, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 폴리솔베이트80^TM, HCO-50 등) 등과 병용하여도 된다. 유성액으로서는, 예컨대 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용하여도 된다. 또, 완충제 (예컨대, 인산염완충액, 아세트산나트륨 완충액 등), 무통화제 (예컨대, 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대, 인간혈청알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대, 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합하여도 된다. 조제된 주사액은 통상적으로 적당한 앰플에 충전된다.

이와 같이 하여 얻어지는 제제는 안전하고 저독성이므로, 예컨대 사람 또는 온혈동물 (예컨대, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

본 발명의 단백질 등의 투여량은 대상질환, 투여대상 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대, 질환조직 적출후의 조직재생제로서 본 발명의 단백질 등을 투여하는 경우, 일반적으로 성인 (60 ㎏ 으로서) 에 있어서는, 1일에 대하여 이 단백질 등을 약 0.1㎎ ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20㎎ 투여한다.

(2) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝

내츄럴킬러 (NK) 세포는 암세포의 증식을 저해한다. 본 발명의 단백질 등은 정상세포의 증식에 양향을 주지않지만, NK 세포의 증식을 저해하기 때문에, 본 발명의 단백질 등에 의한 NK 세포증식저해를 저해하는 활성을 갖는 화합물 또는 그의 염은, 예컨대 각종 암 (예 : 자궁체암, 자궁내막종양, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경아종, 방광암, 흑색종 등) 등의 질병의 치료·예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 단백질 등은 본 발명의 단백질 등에 의한 NK 세포증식저해를 저해하는 활성을 갖는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명은,

(1) ① 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염의 NK 세포증식저해를 저해하는 활성을 갖는 화합물 (「(2) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝」 에 있어서 저해제로 약기하는 경우가 있음) 의 스크리닝방법 (「(2) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝」 에 있어서 본 발명의 스크리닝방법으로 칭하는 경우도 있음), ② 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 저해제의 스크리닝용 키트 (「(2) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝」 에 있어서 본 발명의 스크리닝용 키트로 칭하는 경우도 있음) 를 제공하고, 보다 구체적으로는 예컨대,

(2) ①(i) 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염에 NK 세포를 접촉시킨 경우와 (ii) 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염에 NK 세포 및 시험화합물을 접촉시킨 경우와의 비교를 실행하는 것을 특징으로 하는 저해제의 스크리닝방법, ② 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염 및 NK 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 저해제의 스크리닝용 키트를 제공한다.

구체적으로는 상기 스크리닝방법, 스크리닝용 키트에 있어서는, 예컨대, (i) 와 (ii) 의 경우에서의 본 발명의 단백질 등의 NK 세포증식 저해활성 등을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 단백질 등의 NK 세포증식저해활성은 자체 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법 등에 따라 측정할 수 있어 후술하는 실시예에 기재된 방법으로 실행하는 것이 바람직하다.

시험화합물로서는 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규인 화합물이어도 되고, 공지의 화합물이어도 된다.

예컨대, 상기 (ii) 경우에서의 NK 세포증식저해활성이 상기 (i) 의 경우에 비하여, 약 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 저해하는 시험화합물을 본 발명의 단백질 등의 NK 세포증식저해활성을 저해하는 화합물로서 선택할 수 있다.

본 발명의 스크리닝방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 화합물 또는 그의 염은 상기의 시험화합물, 예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액, 혈장 등에서 선택된 화합물로, 본 발명의 단백질 등의 NK 세포증식저해를 저해하는 활성을 갖는 화합물이다.

이 화합물의 염으로서는 상기의 본 발명의 단백질의 염과 동일한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 스크리닝방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 화합물을 상술의 치료·예방제로서 사용하는 경우, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 상기의 본 발명의 단백질 등을 함유하는 의약과 동일하게 하여, 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제, 무균성용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 제제는 안전하고 저독성이므로, 예컨대, 사람 또는 온혈동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 새, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은, 그 작용, 대상질환, 투여대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대, 자궁내막종양의 치료목적으로 본 발명의 단백질 등의 NK 세포증식저해를 저해하는 활성을 갖는 화합물을 경구투여할 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏ 으로서) 에 있어서는 1일에 대하여 이 화합물을 약 0.1 ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50㎎, 보다 바람직하게는 약 10 ∼ 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우에는, 이 화합물의 1 회 투여량은 투여대상, 대상질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대, 자궁내막종양의 치료목적에서 본 발명의 단백질 등의 NK 세포증식저해활성을 저해하는 활성을 갖는 화합물을 주사제의 형태로 통상적으로 성인 (60㎏ 으로서) 에 투여하는 경우, 1 일에 대하여 이 화합물을 약 0.01 ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도, 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(3) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝

본 발명의 단백질 등은 세포증식활성을 갖기 때문에, 본 발명의 단백질 등의 기능 (예 : 세포증식활성 등) 을 촉진하는 화합물 또는 그의 염은 예컨대 질환조직 적출후의 조직재생제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 등의 기능을 저해하는 화합물 또는 그의 염은 예컨대 각종 암 (예 : 자궁체암, 자궁내막종양, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경아종, 방광암, 흑색종 등) 등의 질병의 치료·예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 단백질 등은, 본 발명의 단백질 등의 기능을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하다.

즉, 본 발명은,

(1) ① 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염의 기능 (예컨대, 세포증식활성 등) 을 촉진하는 화합물 혹은 그의 염 (「(3) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝」 에 있어서 촉진제로 약기하는 경우가 있음), 또는 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염의 기능 (예컨대, 세포증식활성 등) 을 저해하는 화합물 「(3) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝」 에 있어서 촉진제로 약기하는 경우가 있음) 의 스크리닝방법, ② 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 촉진제 또는 저해제의 스크리닝용 키트 「(3) 질병에 대한 의약후보화합물의 스크리닝」에 있어서 본 발명의 스크리닝용 키트로 칭하는 경우도 있음) 를 제공하고, 보다 구체적으로는, 예컨대,

(2) ① (i) 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염에 세포 (예 : 상기의 각종 조직 (바람직하게는 인간 등) 유래의 정상세포 또는 상기의 암세포 등) 를 접촉시킨 경우와, (ii) 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염에 세포 (예 : 상기의 각종 조직 (바람직하게는 인간 등) 유래의 정상세포 또는 상기의 암세포 등) 및 시험화합물을 접촉시킨 경우의 비교를 실행하는 것을 특징으로 하는 촉진제 또는 저해제의 스크리닝방법, ② 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염 및 세포 (예 : 상기의 각종 조직 (바람직하게는 인간 등) 유래의 정상세포 또는 상기의 암세포 등) 를 함유하는 것을 특징으로 하는 촉진제 또는 저해제의 스크리닝용 키트를 제공한다.

구체적으로는 상기 스크리닝방법에 있어서는, 예컨대, (i) 와 (ii) 의 경우에서의 본 발명의 단백질 등의 세포증식활성 등을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명의 단백질 등의 세포증식활성은 자체 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법 등에 따라 측정할 수 있다.

세포로서는 예컨대, 상기의 각종 조직 (바람직하게는 인간 등) 유래의 정상세포 또는 상기의 암세포 등을 사용할 수 있다.

시험화합물로서는, 예컨대 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지의 화합물이어도 된다.

상기의 스크리닝방법을 실시하기 위해서는, 본 발명의 단백질 등을 스크리닝에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 본 발명의 단백질 등의 표품을 조제한다. 버퍼에는 pH 약 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 약 6 ∼ 8) 의 인산버퍼, 트리스-염산버퍼 등의 본 발명의 단백질 등과 시험화합물의 반응을 저해하지 않는 버퍼이면 어느 것이어도 된다.

예컨대, 상기 (ii) 의 경우에서의 세포증식활성이 상기 (i) 의 경우에 비하여, 약 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 상승시키는 시험화합물을 본 발명의 단백질 등의 세포증식활성을 촉진하는 화합물로서, 또한, 상기 (ii) 의 경우에서의 세포증식활성이 상기 (i) 의 경우에 비하여 약 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 50% 이상 저해하는 시험화합물을 본 발명의 단백질 등의 세포증식활성을 저해하는 화합물로서 선택할 수 있다.

본 발명의 스크리닝방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 화합물 또는 그의 염은 상기의 시험화합물, 예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액, 혈장 등에서 선택된 화합물로, 본 발명의 단백질 등의 기능 (예 : 세포증식활성 등) 을 촉진 또는 저해하는 화합물이다.

이 화합물의 염으로서는 상기의 본 발명의 단백질의 염과 동일한 것이 이용된다.

본 발명의 스크리닝방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 화합물을 상술의 치료·예방제로서 사용하는 경우, 통상적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 상기의 본 발명의 단백질 등을 함유하는 의약과 동일하게 하여, 정제, 캡슐제, 엘릭실제, 마이크로캡슐제, 무균성용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 제제는 안전하고 저독성이므로, 예컨대, 사람 또는 온혈동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 말, 새, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.

이 화합물 또는 그의 염의 투여량은 그 작용, 대상질환, 투여대상, 투여 루트 등에 따라 차이는 있지만, 예컨대, 질환조직 적출후의 조직재생제로서 본 발명의 단백질 등의 기능을 촉진하는 화합물을 경구투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏ 으로서) 에 있어서는, 1일에 대하여 이 화합물을 약 0.1 ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20㎎ 투여한다. 다른 동물의 경우도, 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

또한, 자궁내막종양의 치료목적으로 본 발명의 단백질 등의 기능을 저해하는 화합물을 경구투여하는 경우, 일반적으로 성인 (체중 60㎏ 으로서) 에 있어서는, 1일에 대하여 이 화합물이 약 0.1 ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20㎎ 투여한다. 비경구적으로 투여하는 경우는, 이 화합물의 1 회투여량은 투여대상, 대상질환 등에 따라서도 다르지만, 예컨대 자궁내막종양의 치료목적으로 본 발명의 단백질 등의 기능을 저해하는 화합물을 주사제의 형태로 통상적으로 성인 (60㎏ 으로서) 에게 투여할 경우, 1일에 대하여 이 화합물을 약 0.01 ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우도, 60㎏당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.

(4) 본 발명의 단백질 혹은 그 부분펩티드 또는 그의 염의 정량

본 발명의 단백질 등에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체로 약기하는 경우가 있음) 는 본 발명의 단백질 등을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 피검액중의 본발명의 단백질 등의 정량, 특히 샌드위치 면역 측정법에 의한 정량 등에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명은

(i) 본 발명의 항체와 피검액 및 표식화된 본 발명의 단백질을 경합적으로 반응시켜, 이 항체에 결합한 표식화된 본 발명의 단백질 등의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 본 발명의 단백질 등의 정량법 및,

(ii) 피검액과 담체상에 불용화된 본 발명의 항체 및 표식화된 본 발명의 다른 항체를 동시 혹은 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표식제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 본 발명의 단백질 등의 정량법을 제공한다.

상기 (ii) 의 정량법에 있어서는, 한쪽의 항체가 본 발명의 단백질 등의 N 단부를 인식하는 항체이고, 다른 한쪽의 항체가 본 발명의 단백질 등의 C 단부에 반응하는 항체인 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 단백질 등에 대한 모노클로날항체 (이하, 본 발명의 모노클로날항체로 칭하는 경우가 있음) 를 이용하여 본 발명의 단백질 등의 정량을 실행할 수 있는 것 외에, 조직염색 등에 의한 검출을 실행할 수도 있다. 이들의 목적에는 항체분자 그 자체를 이용하여도 되고, 또, 항체분자의 F(ab')₂, Fab', 혹은 Fab 분획을 이용하여도 된다.

본 발명의 항체를 이용하는 본 발명의 단백질 등의 정량법은 특별히 제한되지 않고, 피측정액중의 항원량 (예컨대, 단백질량) 에 대응한 항체, 항원 혹은 항체-항원 복합체의 양을 화학적 또는 물리학적수단에 의해 검출하여, 이것을 이미 알려진 양의 항원을 함유하는 표준액을 사용하여 제작한 표준곡선으로부터 산출하는 측정법이면 어느 측정법을 사용하여도 된다. 예컨대, 네프로메트리, 경합법, 이뮤노메트릭법 및 샌드위치법이 적합하게 사용되지만, 감도, 특이성의 점에서 후술하는 샌드위치법을 이용하는 것이 특히 바람직하다.

표식물질을 이용하는 측정법에 사용되는 표식제로서는, 예컨대 방사성동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용된다. 방사성동위원소로서는 예컨대 〔¹²⁵I〕, 〔¹³¹I〕, 〔³I〕, 〔¹⁴C〕 등이 사용된다. 상기 효소로서는 안정되고 비활성이 큰 것이 바람직하고, 예컨대 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산탈수소효소 등이 이용된다. 형광물질로서는 예컨대 플루오레스카민, 플루오레센이소티오시아네이트 등이 이용된다. 발광물질로서는 예컨대, 루미놀, 루미놀유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 이용된다. 또한, 항체 혹은 항원과 표식제의 결합에 비오틴-아비딘계를 이용할 수도 있다.

항원 혹은 항체의 불용화에 있어서는 물리흡착을 사용하여도 되고, 또 통상적으로 단백질 혹은 효소 등을 불용화, 고정화하는데 사용되는 화학결합을 이용하는 방법이어도 된다. 담체로서는, 아가로스, 덱스트린, 셀룰로스 등의 불용성 다당류, 폴리스틸렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지, 혹은 유리 등을 들수 있다.

샌드위치법에 있어서는 불용화된 본 발명의 모노클로날항체에 피검액을 반응시켜 (1차 반응), 다시 표식화된 다른 본 발명의 모노클로날항체를 반응시킨 (2차 반응) 후, 불용화담체상의 표식제의 활성을 측정함으로써 피검액중의 본 발명의 단백질양을 정량할 수 있다. 1차 반응과 2차 반응은 반대의 순서로 실행하여도, 또, 동시에 실행하여도 되고 시간을 어긋나게 하여 실행하여도 된다. 표식화제 및 불용화의 방법은 상기의 이들의 방법에 준하여 실행할 수 있다. 또, 샌드위치법에 의한 면역측정법에 있어서, 고상용 항체 혹은 표식용 항체에 사용되는 항체는 반드시 1 종류일 필요는 없고, 측정감도를 향상시키는 등의 목적으로 2 종류 이상의 항체의 혼합물을 이용하여도 된다.

본 발명의 샌드위치법에 의한 본 발명의 단백질 등의 측정법에 있어서는, 1차 반응과 2차 반응에 사용되는 본 발명의 모노클로날항체는 본 발명의 단백질 등이 결합하는 부위가 상이한 항체가 바람직하게 이용된다. 즉, 1차 반응 및 2차 반응에 이용되는 항체는, 예컨대 2차 반응에서 이용되는 항체가 본 발명의 단백질 등의 C 말단부를 인식하는 경우, 1차 반응에서 이용되는 항체는 바람직하게는 C말단부 이외, 예컨대 N 말단부를 인식하는 항체가 이용된다.

본 발명의 모노클로날 항체를 샌드위치법 이외의 측정시스템, 예컨대, 경합법, 이뮤노메트릭법 혹은 네프로메트리 등에 이용할 수 있다.

경합법에서는 피검액중의 항원과 표식항원을 항체에 대하여 경합적으로 반응시킨 후, 미반응의 표식항원 (F) 과, 항체와 결합한 표식항원 (B) 을 분리하여(B/F 분리), B,F 중 어느 하나의 표식량을 측정하고, 피검액중의 항원량을 정량한다. 본 반응법에는 항체로서 가용성항체를 이용하고, B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한 제 2 항체 등을 이용하는 액상법 및 제 1 항체로서 고상화항체를 이용하거나, 혹은, 제 1 항체는 가용성의 것을 사용하고 제 2 항체로서 고상화항체를 사용하는 고상화법이 이용된다.

이뮤노메트릭법에서는 피검액중의 항원과 고상화항원을 일정량의 표식화 항체에 대하여 경합반응시킨 후 고상과 액상을 분리하거나, 혹은 피검액중의 항원과 과잉량의 표식화항체를 반응시키고, 다음에 고상화항원을 첨가하여 미반응의 표식화항체를 고상에 결합시킨 후, 고상과 액상을 분리한다. 다음에, 어느 하나의 상의 표식량을 측정하여 피검액중의 항원량을 정량한다.

또, 네프로메트리에서는, 겔내 혹은 용액중에서 항원항체반응의 결과 발생한 불용성의 침강물의 양을 측정한다. 피검액중의 항원량이 약간으로, 소량의 침강물밖에 얻을 수 없는 경우에도 레이저의 산란을 이용하는 레이저 네프로메트리 등이 바람직하게 이용된다.

이들 각각의 면역학적 측정법을 본 발명의 정량방법에 적용하는데 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요하지 않다. 각각의 방법에서의 통상적인 조건, 조작법에 당업자의 통상적인 기술적배려를 추가하여 본 발명의 단백질 등의 측정계를 구축하면 된다. 이들의 일반적인 기술수단의 상세에 대해서는 총설, 성서 (成書) 등을 참조할 수 있다.

예컨대, 이리에 칸 편저 「라디오이뮤노어세이〕 (고우단샤, 1974년 발행),이리에 칸 편저 「속 라디오이뮤노어세이〕(고우단샤, 1979년 발행), 이시카와 에이지 외 편저 「효소면역측정법」(이가쿠쇼잉, 1978년 발행), 이시카와 에이지 외 편저 「효소면역측정법」(제 2 판) (이가쿠쇼잉, 1982년 발행), 이시카와 에이지 외 편저 「효소면역측정법」(제 3 판) (이가쿠쇼잉, 1987년 발행), 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 (Immunochemical Techniques (Part A)), 동서 Vol.73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 동서 Vol.74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 동서 Vol.84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)), 동서 Vol.92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동서 Vol.121 (Immunochemical Techniques (Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상, 아카데믹 프레스사 발행) 등을 참조할 수 있다.

이상과 같이 하여, 본 발명의 항체를 이용함으로써, 본 발명의 단백질 등을 양호한 감도로 정량할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체를 사용하여 본 발명의 단백질 등의 농도를 정량함으로써, 본 발명의 단백질 등의 농도가 증가된 것으로 검출된 경우, 예컨대, 각종 암 (예 : 자궁체암, 자궁내막종양, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경아종, 방광암, 흑색종 등) 등의 질병이나 또는 장래 걸릴 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.

또, 본 발명의 항체는 체액이나 조직 등의 피검체중에 존재하는 본 발명의 단백질 등을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 단백질 등을 정제하기 위해 사용하는 항체컬럼의 제작, 정제시의 각 분획 중의 본 발명의 단백질 등의 검출, 피검세포내에서의 본 발명의 단백질의 거동 분석 등을 위해 사용할 수 있다.

(5) 본 발명의 항체를 함유하는 의약

본 발명의 단백질 등의 활성을 중화하는 작용을 갖는 본 발명의 항체 (중화항체) 는, 예컨대 각종 암 (예 : 자궁체암, 자궁내막종양, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경아종, 방광암, 흑색종 등) 등의 질병의 치료·예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질 등에 대한 본 발명의 인간화 항체는, 예컨대 각종 암 (예 : 자궁체암, 자궁내막종양, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경아종, 방광암, 흑색종 등) 등의 질병의 치료·예방제 등의 의약으로서 사용할 수 있다.

이 인간화항체는, Nat Biotechnol, 14, 845-851.(1996), Nat Genet. 15,146-156. (1997), PNAS, 97(2), 722-727 (2000) 등에 기재된 방법에 준하여 제작할 수 있다.

이하, 「(5) 본 발명의 항체를 함유하는 의약」에 있어서 본 발명의 중화항체 및 인간화 항체를 본 발명의 항체로 총칭한다.

본 발명의 항체를 함유하는 상기 질환의 치료·예방제는, 그대로 액제로서 또는 적당한 제형의 의약조성물로서 사람 또는 포유동물 (예 : 래트, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 투여량은 투여대상, 대상질환, 증상, 투여 루트 등에 따라서도 다르지만, 예컨대, 성인의 자궁내막종양 환자의 치료·예방을 위해 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체를 1 회량으로서 통상적으로 0.01 ∼ 20 ㎎/㎏ 체중 정도, 바람직하게는 0.1 ∼ 10㎎/㎏ 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 5 ㎎/㎏ 체중 정도를 1일 ∼ 5회 정도, 바람직하게는 1일 ∼ 3회 정도, 정맥주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 다른 비경구투여 및 경구투여의 경우도 이것에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 무거운 경우에는 그 증상에 따라 증량하여도 된다.

본 발명의 항체는 그 자체 또는 적당한 의약조성물로서 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 의약조성물은 상기 또는 그의 염과 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 혹은 부형제를 함유하는 것이다. 이와 같은 조성물은 경구 또는 비경구투여에 적합한 제형으로 제공된다.

즉, 예컨대, 경구투여를 위한 조성물로서는 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제 (당의정, 필름코팅정을 포함), 환제, 과립제, 산제. 캡슐제 (소프트캡슐제를 포함), 시럽제, 유제 (乳劑), 현탁제 등을 들 수 있다. 이와 같은 조성물은 자체 공지의 방법에 의해 제조되고, 제제분야에서 통상 사용되는 담체, 희석제 혹은 부형제를 함유하는 것이다. 예컨대, 정제용의 담체, 부형제로서는 젖당, 전분, 자당, 스테아린산마그네슘 등을 사용할 수 있다.

비경구투여를 위한 조성물로서는, 예컨대, 주사제, 좌제 등이 이용되고, 주사제는 정맥주사제, 피하주사제, 피내주사제, 근육주사제, 점적주사제 등의 제형을 포함한다. 이와 같은 주사제는 자체 공지의 방법에 따라 예컨대 상기 항체 또는 그의 염을 통상적으로 주사제에 사용되는 무균의 수성 혹은 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제한다. 주사용의 수성액으로서는, 예컨대 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 함유하는 등장액 등이 이용되고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예 : 에탄올), 폴리알코올 (예 : 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제 〔예 : 폴리솔베이트80, HCO-50 (polyoxyethylene(50㏖) adduct of hydrogenated castor oil)〕 등과 병용하여도 된다. 유성액으로서는 예컨대 참기름, 대두유 등이 이용되고, 용해보조제로서 벤조산벤질, 벤질알코올 등을 병용하여도 된다. 조제된 주사액은 통상적으로 적당한 앰플에 충전된다. 직장투여에 사용되는 좌제는 상기 항체 또는 그의 염을 통상적인 좌약용 기제에 혼합함으로써 조제된다.

상기의 경구용 또는 비경구용 의약조성물은 활성성분의 투여량에 적합한 투약단위의 제형으로 조제되는 것이 바람직하다. 이와 같은 투약단위의 제형으로서는, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제 (앰플), 좌제 등이 예시되어, 각각의 투약단위제형당 통상적으로 5 ∼ 500㎎, 특히 주사제로는 5 ∼ 100㎎, 그 외의 제형에서는 10 ∼ 250㎎ 의 상기 항체에 함유되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 상기의 각 조성물은 상기 항체와의 배합에 의해 바람직하지 않은 상호작용을 발생하지 않는 한 다른 활성작용을 함유하여도 된다.

본 명세서 및 도면에 있어서 염기나 아미노산 등을 약호로 표시하는 경우, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 에 의한 약호 혹은 당해분야에서의 관용약호에 의거하는 것으로, 그 예를 아래에 나타낸다. 또, 아미노산에 관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우에는 특별히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.

DNA : 데옥시리보핵산

cDNA : 상보적 데옥시리보 핵산

A : 아데닌

T : 티민

G : 구아닌

C : 시토신

I : 이노신

R : 아데닌 (A) 또는 구아닌 (G)

Y : 티민 (T) 또는 시토신 (C)

M : 아데닌 (A) 또는 시토신 (C)

K : 구아닌 (G) 또는 티민 (T)

S : 구아닌 (G) 또는 시토신 (C)

W : 아데닌 (A) 또는 티민 (T)

B : 구아닌 (G), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)

D : 아데닌 (A), 구아닌 (G) 또는 티민 (T)

V : 아데닌 (A), 구아닌 (G) 또는 시토신 (C)

RNA : 리보핵산

mRNA : 메신저리보핵산

dATP : 데옥시아데노신삼인산

dTTP : 데옥시티미딘삼인산

dGTP : 데옥시구아노신삼인산

dCTP : 데옥시시티딘삼인산

ATP : 아데노신삼인산

Gly : 글리신

Ala : 알라닌

Val : 발린

Leu : 루이신

Ile : 이소루이신

Ser : 세린

Thr : 트레오닌

Cys : 시스테인

Met : 메티오닌

Glu : 글루탐산

Asp : 아스파라긴산

Lys : 리신

Arg : 아르기닌

His : 히스티딘

Phe : 페닐알라닌

Tyr : 티로신

Trp : 트립토판

Pro : 프롤린

Asn : 아스파라긴

Gln : 글루타민

pGlu : 피로글루탐산

또, 본 명세서중에서 자주 인용되는 치환기, 보호기 및 시약을 하기의 기호로 표기한다.

Me : 메틸기

Et : 에틸기

Bu : 부틸기

Ph : 페닐기

TC : 티아졸리딘-4(R)-카르복사미드기

Tos : p-톨루엔술포닐

CHO : 포르밀

Bzl : 벤질

Cl₂-Bzl : 2,6-디클로로벤질

MBzl : 메톡시벤질

MeBzl : 4-메틸벤질

OcHex : 시클로헥실에스테르

OBzl : 벤질에스테르

Bom : 벤질옥시메틸

Z : 벤질옥시카르보닐

Cl - Z : 2-클로로벤질옥시카르보닐

Br - Z : 2-브로모벤질옥시카르보닐

Boc : t-부톡시카르보닐

DNP : 디니트로페닐

Trt : 트리틸

Bum : t-부톡시메틸

Fmoc : N-9-플루오레닐메톡시카르보닐

HOBt : 1-히드록시벤즈트리아졸

HOOBt : 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진

HONB : 1-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드

DCC : N,N'-디시클로헥실카르보디이미드

DMF : N,N'-디메틸포름아미드

TEA : 트리에틸아민

WSCD : 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드

EDTA : 에틸렌디아민사아세트산

SDS : 도데실황산나트륨

본원 명세서의 서열표의 서열번호는 이하의 서열을 나타낸다.

[서열번호 : 1]

본 발명의 인간유래 단백질 (TGC839단백질) 의 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호 : 2]

서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 본 발명의 인간유래 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 : 3]

실시예 3 에서 사용된 프라이머 (합성) DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 : 4]

실시예 3 에서 사용된 프라이머 (합성) DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 : 5]

본 발명의 인간유래 단백질 (TGC838 단백질) 의 아미노산서열을 나타낸다.

[서열번호 : 6]

서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열을 갖는 본 발명의 인간유래 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 : 7]

실시예 7 및 실시예 20 에서 사용된 프라이머 (합성) DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 : 8]

실시예 7 에서 사용된 프라이머 (합성) DNA 의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호 : 9]

실시예 20 에서 사용된 프라이머 (합성) DNA 의 염기서열을 나타낸다.

후술하는 실시예 3 에서 얻어진 형질변환체 에쉐리히어 콜리 (Escherichia coli) SURE/pCAN618/H839F 는 1999년 3월 10 일부터 일본국 이바라기껭 츠꾸바시 히가시 1-1-3 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6677 로서, 1999년 2월 25일부터 일본국 오오사카후 오오사카시 요도가와쿠 쥬삼본마찌 2-17-85 재단법인·발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16259 로 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 7 에서 얻어진 형질전환체 에쉐리히어 콜리 (Escherichia coli) XL10-Gold/pCAN618/H838F 는 1999년 8월 2일부터 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6809 로서 1999년 7월 21일부터 재단법인·발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16297 로서 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 15 에서 얻어진 하이브리도마 (hybridoma) 클론 No.112-3 은 839N-112 로서 평성 12 년 3월 2일부터 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7068 로서 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 15 에서 얻어진 하이브리도마 (hybridoma) 클론 No.128-18 은 839N-128 로서 평성 12 년 3월 2일부터 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7069 로서 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 22 에서 얻어진 CHO-K1/TGC838N-4 는 2000 년 3월 10일부터 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7088 로서 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 23 에서 얻어진 CHO-K1/618/839F6-3 은 2000 년 3월 10일부터 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7089 로서 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 28 에서 얻어진 하이브리도마 (hybridoma) 839-01 은 2000 년 3월 10일부터 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7086 으로 기탁되어 있다.

또, 후술하는 실시예 28 에서 얻어진 하이브리도마 (hybridoma) 839-02 는 2000 년 3월 10일부터 통산산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-7087 로서 기탁되어 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 대장균을 사용한 유전자조작법은 모레큘러·클로닝 (Molecular Cloning) 에 기재되어 있는 방법에 따랐다.

실시예 1 데이터베이스로부터의 클론선택

스미스크라인비참 (SB) 사로부터 공급되고 있는 데이터베이스 중에서 단백의 분비서열에 특유한 아미노산서열을 갖는 클론을 선택하였다.

즉 각 EST 의 염기서열을 아미노산의 서열로 번역한 후에, 5' 단에 Met 가 존재하고 5' 단측에는 소수성의 아미노산서열을 볼 수 있고, 또한 하류에는 친수성, 소수성의 아미노산서열이 존재하고, 최초의 Met 로부터 10-30 아미노산이 단백의 분비에 필요한 시그널서열을 갖는 EST 클론을 선택하였다. 그 중의 하나를HGS : 2772893 으로 발견하였다. 이 클론을 SB 사로부터 받아 TGC839 로 하였다. 이 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환한 E.coli 를 정법대로 배양하여 플라스미드를 정제하고, 제한효소의 EcoRI 와 XhoI 로 이 유전자를 잘라낸 결과, 약 0.9kb 와 약 0.5kb 의 2 개의 유전자단편이 발견된 점에서, 이 유전자의 크기는 약 1.4kb 인 것이 명확해졌다.

다음에 이 유전자의 염기서열을 T7 과 T3 프라이머를 사용하여 ABI 377 Prism 형광 DNA sequencer 로 해석하였다. 이 염기서열과 아미노산서열을 도 1 에 나타낸다.

이 유전자는 252 의 아미노산잔기를 갖는 단백질을 코드하고 있고, N 말단으로부터 25번째의 아미노산잔기 (Ala) 와 26번째의 아미노산잔기 (Gly) 의 사이에서 시그널서열로서 절단되는 것으로 추정되었다.

실시예 2 유전자의 발현확인

실시예 1 에서 얻어진 유전자의 기능을 예측하기 위해 인간의 각 조직과 암세포주에서의 발현을 검토하였다.

먼저, 유전자를 EcoRI 와 Xhol 로 절단한 약 900 염기의 DNA 단편을 프로브로 사용하여, 각각의 조직, 세포로부터 추출한 mRNA 의 노던블롯해석을 실행하였다. 클론테크사의 인간의 multi tissue northern (MTN) Blot, 인간암세포 (Human Cancer cell line) 의 mRNA Blot, 혹은 각종 인간암 세포의 mRNA 를 나일론 필터에 블롯한 필터와 아이소도프 표식의 DNA 프로브를 정법대로 반응시켜 필터를 세정후에 오토라디오그래프를 취하여 이 유전자의 발현조직, 세포를 검토하였다.

이 유전자는 정상적인 성인의 조직에서는 거의 발현은 볼 수 없고, 암세포, 태아의 뇌, 폐에서만 특이적인 발현을 볼 수 있었다 (도 2, 도 3).

실시예 3 인간TGC839 단백질의 동물세포중에서의 발현벡터의 구축

인간 TGC839 단백질을 동물세포중에서 발현시키기 위한 발현벡터를 구축하였다. 이 때, 나중에 실행하는 발현산물의 검출을 용이하게 하기 위해, TGC839 단백질의 C 말단측에 8 아미노산으로 이루어지는 FLAG 서열 (DYKDDDDK) 을 도입하였다.

이하, FLAG 서열이 부가된 TGC839 단백질을 특히 TGC839FLAG 단백질로 부르는 경우가 있다.

먼저, TGC839 단백질을 코드하고 있는 cDNA 단편을 주형으로 하여 번역개시코돈의 ATG 의 직전에 EcoRI 제한효소부위가 오도록 설계한 합성 DNA [5' GCGCTCGAATTCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAG 3' : (서열번호 :3)] 와 TGC839 단백질의 C 말단에 DYKDDDDK로 표시되는 아미노산서열, 이어서 종결코돈, NotI 제한효소부위가 오도록 설계한 합성 DNA [5' GCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCTCTAAAGGACTCTCCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAG 3, : (서열번호 : 4)] 를 사용하여 PCR 을 실행하여, TGC839 의 ORF 를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소 EcoRI (다카라 주조사 제조), EagI (New England Biolabs 사 제조) 로 이중소화한 후, pCAN618 의 EcoRI, NotI 부위에 도입하여 인간 TGC839 단백질의 C 말단측에 FLAG 서열을 갖는 TGC839FLAG 의 동물세포발현 벡터 pCAN618/H839F 를 얻었다. 이 pCAN618/H839F 를 사용하여 대장균 (Escherichia coli) SURE 체를 자체 공지의 방법으로 형질전환하여, Escherichia coli SURE/pCAN618/H839F 를 얻었다.

실시예 4 인간TGC839 단백질의 COS-7 배양 상등액중으로의 분비발현

인간 TGC839 단백질이 분비단백질인 것을 확인하기 위해, COS-7 세포를 사용하여 TGC839FLAG 단백질을 발현시켜, 배지중에서 분비되는지의 여부를 검증하였다. 실시예 3 에서 제작한 발현벡터를 트랜스펙션하기 전날에, COS-7 세포를 4 ×10⁵세포/웰 로 되도록 감아, 10% FBS (Hyclone사 제조) 를 포함하는 DMEM배지 (Gibco-BRL사 제조) 에서 24시간 CO₂incubator 중에서 배양하였다. pCAN618/H839F DNA 와 Effectene (Qiagen 사 제조) 를 이용하여 트렌스펙션을 실행한 후, 24 시간 후에 1㎖ 의 0.1mM ABSF (4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐플루오라이드 (히드로클로라이드)) (와꼬쥰야쿠사 제조) 와 0.05% CHAPS(3-[콜라미도프로필) 디메틸-암모니오]프로판술폰산 propanesul fonic acid) (도진화학사 제조) 를 포함하는 Opti-MEM 배지 (Bibco-BRL사 제조) 에 배지교환을 실행하고, 다시 36 시간 배양을 계속하였다. 배양 상등액은 eppendorf 샘플튜브로 옮겨 원심하여 부상한 세포를 제거한 후, centricon-10(Amicon사 제조) 를 사용하여 1/10 로 까지 농축하고, 동량의 DTT 를 함유하는 SDS-PAGE 샘플 완충액 를 첨가하여 SDS-PAGE 를 분리시켰다. Western blotting 은 일차항체에 항FLAG 마우스 IgG 모노클로날 항체 (M12 : 5㎎/㎖, Sigma사 제조), 이차항체에 HRP (horseraddish peroxidase) 표식항 마우스 IgG 항체 (1/2000, Amersham사 제조) 를 이용하고, 발색은 ECL western blotting kit(Amersham사 제조) 를 이용하여 실행하였다.

그 결과, TGC839FLAG 단백질은 세포내에서 약 34 kDa 의 1 개의 밴드로서 배양 상등액에서는 세포내에서 보인 동일한 밴드와 그것보다 크고 넓은 밴드로서 검출되었다 (도 4). 이것으로 보아 TGC839 단백질은 단백질 중에 2 개소 존재하는 N형 당사슬 부가부위에 당사슬이 부가되어 배지중에 분비되어 있는 것으로 생각되었다.

실시예 5 데이터베이스로부터의 클론선택

스미스크라인비참 (SB) 사로부터 공급되고 있는 데이터베이스 중에서 단백의 분비서열에 특유한 아미노산서열을 갖는 클론을 선택하였다.

즉 각 EST 의 염기서열을 아미노산의 서열로 번역한 후에, 5' 단에 Met 가 존재하고 5' 단측에는 소수성의 아미노산서열을 볼 수 있고, 또한 하류에는 친수성, 소수성의 아미노산서열이 존재하고, 최초의 Met 로부터 10-30 아미노산이 단백의 분비에 필요한 시그널서열을 갖는 EDT 클론을 선택하였다. 그 중의 하나를 HSG : 951123 으로 발견하였다. 이 클론을 SB 사로부터 받아 TGC838 로 하였다. 이 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환한 E.coli 를 정법대로 배양하여 플라스미드를 정제하고, 제한효소의 EcoRI 와 XhoI 로 이 유전자를 잘라낸 결과, 약 1.0kb 과 약 0.4kb 의 2 개의 유전자단편이 발견된 점에서, 이 유전자의 크기는 약 1.4kb 인 것이 명확해졌다.

다음에 이 유전자의 염기서열을 T7 과 T3 프라이머를 사용하여 ABI 377 Prism 형광 DNA sequencer 로 해석하였다. 이 염기서열과 아미노산서열을 도 5에 나타낸다.

이 유전자는 246 의 아미노산잔기를 갖는 단백질을 코드하고 있어, N 말단으로부터 25번째의 아미노산잔기 (Ala) 와 26번째의 아미노산잔기 (Gly) 의 사이에서 시그널서열로 절단되는 것으로 추정되었다.

실시예 6 유전자의 발현확인

실시예 5 에서 얻어진 유전자의 기능을 예측하기 위해 인간의 각 조직과 암세포주에서의 발현을 검토하였다.

먼저, 유전자를 EcoRI 와 Xhol 로 절단한 약 1.0kb 의 DNA 단편을 프로브로 사용하여, 각각의 조직, 세포로부터 추출한 mRNA 의 노던블롯해석을 실행하였다. 클론테크사의 인간의 multi tissue northern (MTN) Blot, 인간암세포 (Human Cancer cell line) 의 mRNA Blot, 혹은 각종 인간암유래의 mRNA 를 나일론 필터에 블롯한 필터와 아이소도프 표식의 DNA 프로브를 정법대로 반응시켜 필터를 세정후, 오토라디오그래프를 취하여 이 유전자의 발현조직, 세포를 검토하였다.

이 유전자는 정상적인 성인의 조직에서는 거의 발현은 볼 수 없고, 암세포, 태아의 뇌, 폐에서만 특이적인 발현을 볼 수 있었다 (도 6).

실시예 7 인간 TGC838 단백질의 동물세포중에서의 발현벡터의 구축

인간 TGC838 단백질을 동물세포중에서 발현시키기 위한 발현벡터를 구축하였다. 이 때, 나중에 실행하는 발현산물의 검출을 용이하게 하기 위해, TGC838 단백질의 C 말단측에 8 아미노산으로 이루어지는 FLAG 서열 (DYKDDDDK) 을 도입하였다.

이하, FLAG 서열이 부가된 TGC838 단백질을 특히 TGC838FLAG 단백질로 부르는 경우가 있다.

먼저, TGC838 단백질을 코드하고 있는 cDNA 단편을 주형으로 하여 번역개시코돈의 ATG의 직전에 EcoRI 제한효소부위가 오도록 설계한 합성 DNA [5' GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT 3' : (서열번호 :7)] 과 TGC838 단백질의 C 말단에 DYKDDDDK로 표시되는 아미노산서열, 이어서 종결코돈, NotI 제한효소부위가 오도록 설계한 합성 DNA [5' TTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG 3' : (서열번호 : 8)] 를 사용하여 PCR 을 실행하여, TGC838 의 ORF 를 포함하는 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소 EcoRI, Notl로 이중소화하고, pCAN618의 EcoRI, NotI 부위에 도입하여 인간 TGC838 단백질의 C 말단측에 FLAG 서열을 갖는 TGC838FLAG 단백질의 동물세포발현 벡터 pCAN618/H838F 를 얻었다.

본 발명의 플라스미드 pCAN618/H838F 를 대장균 (Escherichia coli) XL10-Gold주에 도입하여 형질전환체 대장균 (Escherichia coli) XL10-Gold/pCAN618/H838F 를 얻었다.

실시예 8 인간TGC839 단백질의 COS-7 세포 배양 상등액중으로부터의 정제

실시예 4 에 있어서, 인간 TGC839 단백질이 COS-7 세포 배양 상등액중으로 분비되는 것이 확인되었으므로, 인간 TGC839FLAG 단백질을 COS-7 세포 배양 상등액중으로부터 정제하였다. 실시예 3 에서 제작한 발현벡터를 트랜스펙션하기 전날에, 10 ㎝ 샬레 10 장에, COS-7 세포를 2×10⁶세포/plate 로 되도록 뿌려, 10% FBS (Hyclone사 제조) 를 포함하는 DMEM 배지 (Gibco-BRL사 제조) 에서 24 시간 CO₂incubator 중에서 배양하였다. pCAN618/H839F DNA 와 Effectene (Qiagen사 제조) 를 사용하여 트랜스펙션을 실행한 후, 24 시간 후에 4 ㎖ 의 0.1 mM ABSF (와꼬쥰야쿠사 제조) 와 0.05% CHAPS (도진화학사 제조) 를 포함하는 Opti-MEM 배지 (Gibco-BRL사 제조) 에 배지교환을 실행하고 다시 36 시간 배양을 계속하였다. 10㎝ 샬레 10 장분의 배양 상등액을 50㎖ 원심관에 모아 원심하여 부상한 세포를 제거한 후, 0.2 ㎛ 의 한외여과막으로 여과하였다. 20배 농도의 TBS 를 종농도가 1배 농도로 되도록 여액에 첨가하여, ANTI FLAG M2-Agarose Affinity Gel (Sigma사 제조) 에 2회 흡착시킨 후, Glycine-HCl 버퍼 (pH3.5) 로 목적단백질을 용출하였다. 이 용출액을 탈염컬럼 (PD-10, Amershampharmacia사 제조) 으로 PBS 에 버퍼교환한 후, Centriplus-10, Centricon-10 (Amicon사 제조) 를 이용하여 약 60㎕ 로까지 농축하여 정제표품을 얻었다. 이 정제표품을 SDS-PAGE 를 이용하여, CBB 염색을 실행한 결과, 약 45 kDa 의 브로드한 밴드가 1개 관찰되었다.

실시예 9 정제 인간 TGC839FLAG 단백질의 N 말단 아미노산서열의 결정

실시예 8 에서 얻어진 정제표품 중 2㎕을 기상아미노산 시퀀서 LF3000 protein sequencer (벡만콜사 제조) 를 이용하여 N 말단 아미노산서열을 결정하였다. 그 결과, N 말단으로부터 순서대로 1. 글리신 (5.10 pmol), 2. 아르기닌 (6.53 pmol), 3. 알라닌 (3.97 pmol), 4. 아스파라긴산 (6.92 pmol) 의 각 아미노산잔기가 검출되었다.

이것으로부터 인간 TGC839 단백질은 인간 TGC839 전구단백질의 N말단의 25 아미노산잔기의 시그널서열이 절단되고, 26 잔기째의 글리신잔기로부터 시작되는 인간 TGC839 성숙단백질로서 배지중에 분비되는 것을 알 수 있었다.

실시예 10 Gly-Arg-Ala-Asp-Pro-His-Ser-Leu-Cys : TGC-839 펩티드 (26-34) 의 제조

Boc-Cys(MBzL)-OBzl 2.27g 을 출발물질로 하여 Boc 기를 4N-HCl·아세트산에틸로 제거, HCl염을 몰당의 TEA 로 중화하고, Boc-Leu·H₂O 를 HONB/WSCD·HCl 로 축합하였다. 반응액을 아세트산에틸로 추출하고, 0.1N-HCl, 5%-중조수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조후, 용매를 제거하여 잔류물을 아세트산에틸과 헥산으로부터 결정으로서 여과채취하였다 (2.3g (80.3%)). 이 Boc-Leu-Cys(MBzl)-OBzl 을 사용하여 동일하게 Boc-Ser(Bzl), Boc-His(Bom) 을 축합하고, Boc-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzL)-OBzl:(Ⅰ) 1.23g 을 얻었다. Pro-OBzl 을 출발물질로서 Boc-Asp(OcHex)-Pro-OBzL 을 합성하고, 이것을 접촉환원처리로 벤질에스테르를 제거하여, 오일상의 Boc-Asp(OcHex)-Pro-OH:(Ⅱ) 를 얻었다. Ala-OBzl 을 출발물질로서 Boc-Arg(Tos), Boc-Gly 를 축합하여, Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OBzl 을 얻고, 이것을 접촉환원하여, Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-OH:(Ⅲ) 을 아세토니트릴과 디에틸에테르로부터 분말로서 여과채취하였다. (Ⅰ) 0.407g 을 4N-HCl·아세트산에틸로 처리하여 Boc 기를 제거한 후 DMF에 용해하고, TEA 62㎕ 로 중화한후, (Ⅱ) 0.23g, HOBt 225㎎, WSCD·HCl 160㎎ 으로 축합하였다. 반응액을 아세트산에틸에 추출하고, 5%-중조수로 세정하고, 무수황산나트륨으로 건조후, 용매를 제거하여 잔류물을 아세토니트릴과 디에틸에테르로부터 분말로 여과채취하여, Boc-Asp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl:(Ⅳ) 338㎎ (63.8%) 를 얻었다. (Ⅳ) 187㎎ 을 4N-HCl·아세트산에틸로 처리하여 Boc 기를 제거한 후 DMF 에 용해하고, TEA 22㎕ 로 중화한 후, (Ⅲ) 90g, HOBt 79㎎, WSCD·HCl 56㎎ 으로 축합하였다. 용매를 증류제거하고, 아세트산에틸로부터 겔상의 Boc-Gly-Arg(Tos)-Ala-Asp(OcHex)-Pro-His(Bom)-Ser(Bzl)-Leu-Cys(MBzl)-OBzl 228㎎ 을 얻었다. 117.8㎎ 을 p-크레졸 974㎎ 공존하 무수불화수소 10㎖ 와 함께 0℃, 60분 처리하여, 전보호기를 제거하였다. 펩티드분획을 50% 아세트산수로 충전한 세파덱스^TMG-25 컬럼 (2.0×80㎝) 로 분획하고, 주요분획을 다시 LiChroprep^TMRP-18을 충전한 역상크로마토컬럼 (2.6×8.0㎝) 을 사용하여 주요분획을 동결건조하여 백색분말 30㎎ 을 얻었다.

질량분석에 의한 (M＋H)⁺955.4 (계산값 955.4)

HPLC 용출시간 10.5분

컬럼조건

컬럼 Wakosil 5C18T 4.6×100㎜

용출액 : A 액-0.1% TFA수, B액-0.1% TFA 함유 아세토니트릴을 사용하여

A/B : 95/5 ∼ 45/55 로 직선형농도균배용출 (25 분)

유속 : 1.0㎖/분

실시예 11 TGC-839 펩티드 (26-34) 를 포함하는 면역원의 제작

상기 실시예 10 에서 얻어진 TGC-839 펩티드 (26-34) 와 소 티로글로불린 (BTG) 의 복합체를 제작하여 면역원으로 하였다. 즉, BTG 10.5㎎ 을, 0.1M 인산완충액 (PH6.7) 0.9㎖ 에 용해시켜, N-(γ-말레이미드부틸록시)사크시니미드 (GMBS) 1.2㎎ 을 포함하는 DMF 용액 100㎕ 과 혼합하여 실온에서 30 분 반응시켰다. 2mM EDTA 를 포함하는 0.1M 인산완충액 (PH6.5) 으로 평형화된 세파텍스 G-25 컬럼으로 과잉의 GMBS 시약을 제거한 후, 말레이미드기가 도입된 BTG 7.5㎎ 과 0.2㎖의 DMF 에 용해시킨 TGC-839 펩티드 (26-34) 1.5㎎ 을 혼합하고, 4℃ 에서 2 일간 반응시켰다. 반응후, 생리식염수에 대하여 4℃ 에서 2일간 투석하였다.

실시예 12 면역

생후 7주된 BALB/C 수컷마우스에, 상기 실시예 1 에 기재된 면역원 TGC-839 펩티드 (26-34)-BTG 복합체, 약 120㎍/마리를 완전 프로인드 어쥬밴트와 함께 피하면역하였다. 6주간후 동량의 면역원을 불완전 프로인드 어쥬밴트와 함께 추가면역하여, 그 1주일후에 채혈하였다.

실시예 13 효소표식화항원의 제작

서양겨자의 퍼옥시다아제 (HRP) 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 의 제작

상기 실시예 10 에서 얻어진 TGC-839 펩티드 (26-34) 와 HRP (효소면역측정법용, 베링거만하임사 제조) 를 가교하여, 효소면역측정법 (EIA) 의 표식체로 하였다. 즉, HRP 11.6㎎ 을 0.95㎖ 의 0.1M 인산완충액, pH6.7 에 용해시켜, GMBS1.2㎎ 을 함유하는 DMF 용액 50㎕ 과 혼합하고, 실온에서 30 분간 반응시킨 후, 0.1M 인산완충액, pH6.5 로 평형화시킨 세파덱스 G-25 컬럼으로 분획하였다. 이와 같이 하여 제작한 말레이미드기가 도입된 HRP 2.7㎎ 과 실시예 1 에서 제작된 TGC-839 펩티드 (26-34) 0.38㎎ 을 혼합하여, 4℃ 에서 1일 반응시켰다. 반응후, 0.1M 인산완충액, pH6.5 로 평형화시킨 울트로겔 AcA54 (팔마시아사 제조) 컬럼으로 분획하고, HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 를 얻었다.

실시예 14 TGC-839 펩티드 (26-34) 를 면역된 마우스의 항혈청중의 항체가의 측정

마우스 항혈청중의 항체가를 이하의 방법으로 측정하였다. 항마우스 이뮤노글로불린 항체결합 마이크로플레이트를 제작하기 위해, 먼저 염소의 항마우스 이뮤노글로불린항체 (IgG분획, 카펠사 제조) 를 100㎍/㎖ 포함하는 0.1M 탄산완충액, pH9.6 용액을 96 웰 마이크로플레이트에 100㎕ 씩 분리주입하여, 4℃ 에서 24 시간 방치하였다. 다음에, 플레이트를 인산완충 생리식염수 (PBS, pH7.4) 로 세정한 후, 웰의 과잉의 결합부위를 막기 위해 25% 블록에이스 (유끼지루시 유업사 제조) 및 0.1% NaN₃을 포함하는 PBS, pH7.2 를 300㎕ 씩 분리주입하여 4℃ 에서 적어도 24 시간 처리하였다.

상기, 항마우스이뮤노글로불린 항체결합 마이크로플레이트의 각 웰에 버퍼 EC [0.2% BSA, 0.4M NaCl, 0.4% 블록에이스, 0.05% CHAPS 〔3-〔(콜라미드프로필)디메틸암모니오]프로판술폰산〕, 2mM EDTA 및 0.1% NaN₃을 함유하는 0.02M 인산완충액, pH7.0] 로 희석한 마우스혈청 100㎖ 을 첨가하여 4℃ 에서 16 시간 반응시켰다. 다음에, 이 플레이트를 PBS, pH7.4 로 세정한 후, 버퍼 C[1% BSA, 0.4M NaCl 및 2mM EDTA 를 포함하는 0.02M 인산완충액, pH7.0] 로 120배 희석한 상기 실시예 13 에서 제작한 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 100㎕ 를 첨가하여 실온에서 7 시간 반응시켰다. 다음에, 이 플레이트를 PBS, pH7.4 로 세정한 후, 고상상의 효소활성을 TMB 마이크로 웰 페로옥시다아제 기질 시스템 (KIRKEGAARD & PERRY LAB. 후나코시야쿠힝 취급) 100㎕ 을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킴으로써 측정하였다. 반응을 1M 인산 100㎕ 을 첨가하여 정지시킨 후, 450㎚ 의 흡광도 (Abs.450) 를 플레이트리더 (MTP-120, 코로나사 제조) 로 측정하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다. 면역된 8 마리의 마우스 전체에 TGC-839 펩티드 (26-34) 에 대한 항체가의 상승이 확인되었다.

실시예 15 모노클로날 TGC-839 펩티드 (26-34) 항체의 제작

비교적 높은 항체가를 보인 마우스 No.3 및 No.8 에 대하여 240㎍ 의 면역원 TGC-839 펩티드 (26-34)-BTG 를 정맥내에 투여함으로써 최종면역을 실행하였다. 최종면역 4 일후의 마우스로부터 비장을 적출하여 스텐레스 메시로 압박여과하고, 이글즈·미니엄·엣센셜 미디움 (MEM) 에 부유시켜 췌장세포 부유액을 얻었다. 세포융합에 사용하는 세포로서, BALB/C 마우스유래 미엘로머 세포 P3-X63. Ag 8.U1(P3U1) 을 이용한 [커렌트 토픽스 인 마이크로바이올로지 앤드 이무놀로지, 81,1(1978)]. 세포융합은 원법 [네이쳐, 256, 495(1975)] 에 준하여 실행하였다. 즉, 비장세포 및 P3U1 을 각각 혈청을 함유하지 않은 MEM 으로 3번 세정하고, 비장세포와 P3U1 수의 비율을 6:6:1 이 되도록 혼합하여, 750 회전으로 15분간 원심을 실행하여 세포를 침전시켰다. 상등액를 충분히 제거한 후, 침전을 가볍게 풀어, 45% 폴리에틸렌·글리콜 (PEG) 6000 (콧호라이트사 제조) 를 0.3㎖ 첨가하고, 37℃ 온수조 중에서 7분간 가만히 놓고 융합을 실행하였다. 융합후 세포에 서서히 MEM 을 첨가하고, 합계 15㎖ 의 MEM 을 첨가한 후 750 회전 15분간 원심하여 상등액을 제거하였다. 이 세포침전물을 10% 소태아혈청을 함유하는 GIT 메듐 (와꼬쥰야쿠) (GIT-10% FCS) 에 P3U1 이 1㎖ 당 2×10⁵개로 되도록 부유시켜, 24 구멍 멀티 디시 (린블로사 제조) 에 1웰 1㎖ 씩 168웰에 파종하였다. 파종후, 세포를 37℃ 에서 5% 탄산가스 인큐베이터 속에서 배양하였다. 24 시간후 HAT (히폭산틴 1×10^-4M, 아미노프텔린 4×10^-7M, 티미딘 1.6×10^-3M) 을 함유한 GIT-10% FCS 배지 (HAT 배지) 를 1웰당 1㎖ 씩 첨가함으로써, HAT 선택배양을 개시하였다. HAT 선택배양은 배양개시 4, 7 일후에 오래된 액을 1㎖ 버린 후, 1㎖의 HAT 배지를 첨가함으로써 계속하였다. 하이브리도마의 증식은 세포융합후 9일째에 확인되고 상등액을 채취하였다.

배양 상등액중의 항체가는 실시예 14 에 기재된 방법을 개변하여 실시하였다. 즉, 항마우스 이뮤노글로불린 항체결합 마이크로플레이트의 각 웰에 배양 상등액 100㎕ 및 버퍼C 로 200배에 희석한 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 100㎕ 을 첨가하여 4℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 이 플레이트를 PBS 로 세정한 후, 실시예 14 에 기재된 방법에 따라 고상상의 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 168 웰 중에서 항체가가 확인된 60 웰을 선택하여 하이브리도마를 동결보존하였다. 또한, 9 웰의 하이브리도마, No.39, No.53, No.61, No.76, No.85, No.112, No.128, No.139 및 No.151 에 대해서는 희석법에 의한 클로닝에 사용하였다. 클로닝시에는, 피더세포로서 BALB/C 마우스의 흉선세포를 웰당 5×10⁵개로 되도록 첨가하였다. 클로닝한 후, 배양 상등액 중의 항체가를 동일한 방법에 따라 측정하였다. 양성 클론은 No.39 부터는 20 웰중 6 웰에, No.53 부터는 20 웰중 2 웰에, No.61 부터는 20 웰중 5 웰에, No.76 부터는 20 웰중 9 웰에, No.85 부터는 20 웰중 8 웰에, No.112 부터는 40 웰중 3 웰에, No.128 부터는 50 웰중 13 웰에, No.139 부터는 30 웰중 2 웰에, 그리고 No.151 부터는 20 웰중에 4 웰에 검출되었다.

이들의 클론 중에서, 모노클로날 TGC-839 펩티드 (26-34) 항체 생산 하이브리도마로서 No.39-35, No.53-16, No.61-2, No.76-12, No.85-16, No.112-3, No.128-18, No.139-26, No.151-2 를 선택하였다.

실시예 16 모노클로날항체의 클래스·서브클래스의 결정

실시예 14 에 기재된 방법에 따라, 항토끼 IgG 항체결합 마이크로플레이트를 제작하였다. 즉, 염소항토끼 이뮤노글로불린항체 (IgG 분획, 카펠사 제조) 를 100 ㎍/㎖ 포함하는 0.1M 탄산완충액, pH9.6 용액을 96웰 마이크로플레이트에 100㎕ 씩 분리주입하여 4℃ 에서 24시간 방치하였다. 다음에, 플레이트를 인산완충 생리식염수 (PBS, pH7.4) 로 세정한 후, 웰의 과잉의 결합부위를 막기 위해 25%블록에이스 (유끼지루시 유업사 제조) 및 0.1% NaN₃을 함유하는 PBS, pH7.2 를 300㎕씩 분리주입하여 4℃ 에서 적어도 24 시간 처리하였다. 다음에 항토끼 IgG 항체결합 마이크로플레이트에 버퍼 EC 50㎕ 및 바이오라트사 제조의 아이소타입타이핑키트에 함유되는 서브타입의 특이적 항체 100㎕ 를 첨가하여, 4℃ 에서 1일간 반응시켰다. 플레이트를 PBS, pH7.4 로 세정후, 상기 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고 4℃ 에서 1일 반응시켰다. 플레이트를 PBS pH7.4 로 세정후, 버퍼C 로 400배로 희석한 상기 실시예 13 에서 제작한 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 100㎕ 을 첨가하여 실온에서 6 시간 반응시켰다. 이 플레이트를 PBS, pH7.4 로 세정한 후, 실시예 14 에 기재된 방법에 따라 고상상의 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 이들의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날항체의 클래스·서브클래스는 No.39-35(IgG3), No.53-16(IgG3), No.61-2(IgG2a,γ), No.76-12(IgG3), No.85-16(IgG2b,κ), No.112-3(IgG1), No.128-18(IgG1,κ), No.139-26(IgG1) 및 No.151-2(IgG2a) 이었다.

실시예 17 경합법-EIA

선택된 각 모노클로날 항TGC-839 펩티드 (26-34) 항체의 TGC839 펩티드 (26-34) 에 대한 반응성을 경합법-EIA 에 의해 조사하였다. 먼저, 각 모노클로날항체를 함유하는 배양 상등액의 항체가를 실시예 14 에 기재된 방법에 의해 조사하고, 경합법-EIA 에 이용하는 항체농도를 결정하였다. 다음에, 항마우스이뮤노글로불린항체 결합 마이크로플레이트에 결정된 농도로 버퍼C 로 희석된 항체용액50㎕, 단계적 (0, 0.156, 0.625, 2.5, 10, 40ng/㎖) 에 희석된 TGC-839 펩티드 (26-34) 의 버퍼C 용액 50㎕ 및 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) (버퍼C 로 1500 배 희석) 을 50㎕ 첨가하여, 4℃ 에서 1일 반응시켰다. 반응후, PBS, pH7.4 로 세정한 후 고상상의 효소활성을 상기 실시예 14 에 기재된 방법으로 측정하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다. 이들의 모노클로날항체와 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 와의 결합은 40ng/㎖ 의 TGC-839 펩티드 (26-34) 에 의해 33-92% 저해된 점에서, 이들의 항체가 TGC-839 펩티드 (26-34) 와 반응하는 것을 알 수 있었다. 특히, No.128-18 및 No.112-3 은 B/Bo 의 50% 결합저해가 각각 2ng/㎖ 및 7ng/㎖ 로, 높은 친화성을 나타냈다. 또한, B/Bo 는 [TGC-839 펩티드 (26-34) 존재하에서의 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 의 각 항체로의 결합량/TGC-839 펩티드 (26-34) 비존재하에서의 HRP 표식화 TGC-839 펩티드 (26-34) 의 각 항체로의 결합량] 을 나타낸다.

실시예 18 하이브리도마의 마우스복수화 (腹水化)

하이브리도마, No.128-18 및 No.112-3 에 대하여 마우스 복수화를 실시하였다. 미리 미네랄오일 0.5㎖ 를 복강내 투여된 마우스 (BALB/C, 수컷) 에 1 ∼ 3×10⁶셀/마리의 상기 하이브리도마를 복강내 투여한 후, 6 ∼ 20일 후에 항체함유복수를 채취하였다. 모노클로날항체는 얻어진 복수로부터 프로테인-A 컬럼에 의해 정제하였다. 즉, 복수 약 25㎖ 를 등량의 결합완충액 (3.5M NaCl, 0.05% NaN₃을 함유하는 1.5M 글리신, pH9.0) 으로 희석한 후, 미리 결합완충액으로 평형화한 재조합 프로테인-A-아가로스 (Repligen사 제조) 컬럼에 사용하여, 특이항체를 용리완충액 (0.05%, NaN₃) 을 함유하는 0.1M 시트르산 완충액, pH3.0) 으로 용출하였다. 용출액은 PBS, pH7.4 에 대하여 4℃, 2일간 투석한 후, 0.22㎛ 의 필터 (미리포아사 제조) 에 의해 제균여과하여 4℃ 혹은 -80℃ 에서 보존하였다. 얻어진 모노클로날항체를 128-18 항체, 112-3 항체로 명명하였다.

실시예 19 TGC838의 부분펩티드를 인식하는 토끼항혈청의 작출

실시예 10 과 동일한 방법으로 TGC838 단백질의 Tyr₁₆₆-Cys₁₉₀(번역개시코돈의 Met 를 1번째로서) 에 상당하는 25 아미노산잔기로 이루어지는 펩티드를 합성하였다. 이 펩티드 8.2㎎ 에 대하여 N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide 및 Keyhoke Lympet Hemocyanin 19.7㎎ 을 이용하여, 8M 요소 및 0.9% NaCl 을 함유하는 인산완충액 (20mM, pH7.4) 중 실온에서 15 시간 반응시켜 콘쥬게이트를 제작하였다. 얻어진 콘쥬게이트 10㎎ 을 몇회로 나누어 어쥬밴트와 혼합하여 토끼의 피하에 면역하였다. 면역후 채혈한 혈액은 원심에 의해 혈구성분을 제거하고 항혈청을 얻었다.

실시예 20 TGC838 발현벡터의 구축

인간 TGC838 단백질을 동물세포중에서 발현시키기 위한 발현벡터를 구축하였다. 먼저, TGC838 단백질을 코드하고 있는 cDNA 단편을 주형으로 하여 번역개시코돈의 직전에 제한효소 Eco RI 인식부위가 오도록 설계한 합성DNA[5'GCGCTGAATTCCCACCATGGCAGCAGCCGCCGCTACCAAGATCCTTCTGTGCCTCCCGCTTCT-3':(서열번호:7)] 와 종결코돈의 직후에 제한효소 NotI 인식부위가 오도록 설계한 합성 DNA [5'-TTGCGGCCGCTCAGATGCCAGGGAGGATGAAGCAGGGGAGGATGATG-3' : 서열번호:9)] 를 이용하여 PCR 을 실행하고, TGC838 의 ORF 를 포함하는 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 제한효소 Eco RI 및 NotI 로 절단하고, pCAN618 의 Eco RI, Not I 부위에 삽입하여 인간 TGC838 단백질의 동물세포에서의 발현벡터 pCAN618/H838 을 얻었다.

실시예 21 TGC838 및 TGC839 단백질의 COS7 세포에서의 발현

COS7 세포 4 ×10⁵개를 10% 의 FBS (소태아혈청) 을 포함하는 DMEM (배지 ; GibcoBRL) 중, 6-웰 플레이트에서 24 시간 배양하였다. 이 세포에 실시예 20, 실시예 3 또는 실시예 7 에서 얻은 발현벡터 pCAN618/H838 DNA, pCAN618/H838F DNA 또는 pCAN618/H839F DNA 를 LipofectAMINE (GibcoBRL) 을 이용하여 도입하고, 다시 18 시간 배양하였다. 다음에 배지를 0.05% CHAPS 를 포함하는 Opti-MEM (배지;GibcoBRL) 으로 바꾸어 다시 24 시간 배양하여 배양 상등액을 회수하였다. 상등액은 원심에 의해 떠 있는 세포를 제거한 후, 그대로 또는 한외여과 (Centricon-10;Amicon) 로 농축하여 발현산물을 조사하였다.

실시예 22 TGC838 단백질의 CHO-K1 세포에서의 발현

TGC838 단백질 발현 벡터의 CHO-K1 세포로의 도입은 인산칼슘 공침법을 이용하여 실행하였다. 먼저, CHO-K1 세포 1×10⁵을 10% 의 FBS 를 포함하는 Ham'S F12 배지 (GibcoBRL) 중 10㎝ 샬레에서 24 시간 배양하였다. 한편 실시예 20에서 얻은 pCAN618/H838 DNA 를 CellPhect Transformation Kit (Pharmacia) 를 이용하여 인산칼슘과의 침전으로 하고, 앞의 CHO-K1 세포에 첨가하였다. 이것을 12 시간 배양후, 5㎖ 의 Ham's F12 배지 (FBA 를 함유하지 않음) 에서 2 회 세정하고, 3㎖ 의 글리세롤용액 (15% glycerol, 150mM NaCl, 20 mM HEPES (pH7.4)) 을 첨가하여 3 분 방치하였다. 다시 5㎖ 의 Ham's F12 배지 (FBS 를 함유하지 않음) 에서 1 회 세정하고, 10% 의 FBS 를 포함하는 Ham's F12 배지를 첨가하여 36 시간 배양하였다. 배지를 500㎍/㎖ 의 Geneticin (와고우쥰야쿠) 및 10% 의 FBS 를 포함하는 Ham's F12 배지로 바꾸어 다시 24 시간 배양하였다. 다음에 한계희석에 의해 단일세포로부터의 발현세포 클론을 얻기 위해, 500㎍/㎖ 의 Geneticin 및 10% 의 FBS 를 포함하는 Ham's F12 배지중 96-웰 플레이트에서 여러가지 희석배율로 세포를 배양하였다. 이와 같이 하여, 단일세포유래의 TGC838 단백질발현 CHO-K1 세포주 CHO-K1/TGC838N-4 를 얻었다. CHO-K1/TGC838N-4 로부터의 배양 상등액의 회수는 대수증폭기의 세포의 배지를 0.05% CHAPS 를 포함하는 Opti-MEM 으로 바꾸어 24 시간 배양후에 실행하였다. 상등액은 원심에 의해 떠 있는 세포를 제거한 후 발현산물을 조사하였다.

실시예 23 TGC839 단백질의 CHO-K1 세포에서의 발현

TGC839 단백질발현 벡터의 CH0-K1 세포로의 도입은 인산칼슘 공침법을 이용하여 실시예 22 와 동일한 방법으로 실행하였다. 10㎝ 샬레에서 배양한 CHO-K1 세포에 실시예 3 에서 얻은 pCAN618/H839F DNA 를 도입하여, Geneticin 으로 선택하였다. 육성해 온 세포는, 먼저 콜로니 선택에 의해 발현세포를 선택한 후,한계희석에 의해 단일세포유래의 TGC839 단백질 발현 CHO-K1 세포주 CHO-K1/618/839F6-3 을 얻었다. CHO-K1/618/839F6-3 으로부터의 배양 상등액의 회수는 실시예 22 와 동일한 방법으로 실행하였다.

실시예 24 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 웨스턴블롯에 의한 해석

실시예 21-23 에서 얻은 배양 상등액 (발현벡터 pCAN618/H838 DNA 또는 pCAN618/H838F DNA 또는 발현벡터 pCAN618/H839F DNA 를 도입한 COS7 세포 혹은 CHO-K1 세포의 배양 상등액) 에 2-머캅토에탄올을 함유하는 SDS-샘플 완충액을 첨가하여 Peptide-PAGE (TEFCO) 로 전기영동하여, 이것을 PVDF 막 (Amersham) 에 전기적으로 옮겼다, 1차항체로서 실시예 19 에서 얻은 토끼항혈청 (2000배 희석), 또는 실시예 12 에서 얻은 마우스 항혈청 (5000 배 희석), 또는 실시예 18 에서 얻은 마우스 IgG (2㎍/㎖), 또는 항FLAG 마우스 IgG (10㎍/㎖;Sigma) 를 이용하고, 2차항체에는 HRP (Horseradish peroxidase) 표식 항마우스 IgG 항체 (2000 배 희석 ; Amersham) 또는 HRP 표식 항토끼 IgG 항체 (2000 배 희석 ; Amersham) 를 이용하였다. 발색은 ECLplus Western Blot Detection System(Amersham) 을 이용하여 실행하였다. 그 결과, TGC838 단백질 및 TGC839 단백질은 배양 상등액 중에 분비되는 것을 알 수 있었다 (도 9). 또, pCAN618/H838 DNA 또는 pCAN618/H838F DNA 를 도입한 COS7 세포의 배양 상등액에 있어서, 분비산물은 전기영동상은 동일 이동도이고, 또한 이들이 항FLAG 펩티드에 대한 항체로 검출될 수 없는 점에서, TGC838 단백질은 C 말단이 프로세싱된 형태로 분비되어 있는 것을 알 수 있었다 (도 10 및 도 11).

실시예 25 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 각 항체를 이용한 면역침강

10㎕ 의 Protein G Sepharose (Pharmacia) 를 TBS-T/BSA (25mM Tris-Hcl (pH7.2), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.01% BSA) 로 30분 처리한 후, TBS-T/BSA 로 희석한 마우스 IgG 10㎍ 또는 토끼 항혈청 5㎕ 를 첨가하여 2 시간 반응시켰다. TBS-T/BSA 로 3회 세정후, 실시예 21 에서 얻은 배양 상등액 (발현백터 pCAN618/H838F DNA 또는 발현벡터 pCAN618/H839F DNA 를 도입한 COS7 세포의 배양 상등액을 한외여과로 농축한 것) 을 첨가하여 2 시간 반응시켰다. TBS-T/BSA 로 4 회 세정후, SDS-샘플 완충액 를 첨가하여 90℃, 2분간 결합되어 있는 단백질을 용출하였다. 이것에, 2-머캅토에탄올을 동일 양의 SDS-샘플 완충액을 첨가하여 Peptide-PAGE (TEFCO) 로 전기영동하고, 이것을 PVDF 막 (Amersham) 에 전기적으로 옮겨 웨스턴블롯 해석을 실행하였다 (도 12). 1차항체로서 마우스항혈청 (No.8 마우스 ; 실시예 14 에 기재) 을 이용하고, 2차항체에는 HRP 표식 항마우스 IgG 항체 (2000배 희석) 를 이용하였다. 발색은 ECLplus Western Blot Detection System (Amersham) 을 이용하여 실행하였다.

실시예 26 TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 당사슬 부가의 확인

TGC838 단백질 및 TGC839 단백질의 아미노산서열로부터 예측되는 2개소의 N형 당사슬 부가부위에 실제로 당사슬이 붙어 있는 것을 확인하기 위해, 이들의 당사슬의 효소처리에 의한 제거를 실행하였다. 실시예 21 에서 얻은 COS7 세포의 배양 상등액을 한외여과로 10배로 농축하고, N-Glycosidase F Deglycosylation Kit (Boehringer) 를 이용하여 당사슬을 제거하였다. 반응산물은 한외여과로 농축한 후, 실시예 24 와 동일한 방법으로 웨스턴블롯해석을 실행하였다. 그 결과, TGC838 단백질 및 TGC839 단백질 모두 약 10 kDa 분자량이 작을수록 이동되어, 이들 단백질에 명확하게 N형 당사슬이 부가되어 있는 것이 실증되었다 (도 13).

실시예 27 인간 콘드로사르코마 세포주 (SW1353) 의 배양과 배양 상등액의 회수

SW1353 세포는 10% FBS 를 포함하는 L15 배지 (ICN Biochemicals) 에서 대수증식기 후반까지 배양하고, 그 배양 상등액을 회수하였다. 원심에 의해 부상된 세포를 제거한 후, 상등액중의 발현산물을 조사하였다.

실시예 28 항TGC839FLAG 모노클로날항체를 이용한 EIA 의 설정

TGC839FLAG 는 이하의 방법으로 조제하였다. 즉, 실시예 23 에서 얻어진 TGC839FLAG 생산세포 CHO-K1/618-839 F 6-3 의 배양 상등액 1000㎖ 를 홀로파이버를 이용하여 20㎖ 로 농축하였다. 이 농축액에 1.5M NaCl 함유 500mM MOPS 완충액 (pH7.5) 을 1/10 양을 첨가하고, 이것을 150mM NaCl 함유 50mM MOPS 완충액 (pH7.5) 으로 평형화한 Anti-FLAG M2 Affinity GEL (SIGMA사) 5㎖ 에 넣어 TGC839FLAG 를 흡착시켰다. 동 겔을 150mM NaCl 함유 50mM MOPS 완충액 (pH7.5) 으로 충분히 세정한 후, TGC839FLAG 는 100mM Glycine-HCl 완충액 (pH3.5) 으로 용출시켰다. 이 TGC839FLAG 용액은 다시 1M Tris-HCl 완층액 (pH9.0) 으로 중화한 후, Centricon30 (Amicon사) 으로 1㎖ 로까지 농축하였다. 정제표품의 단백질농도는 BCA Protein Assay Reagent (PIERCE사) 를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 배양 상등액 1000㎖ 로부터 약 500㎍ 의 TGC839FLAG 를 얻을 수 있었다.

항TGC839FLAG 모노클로날항체 생산세포의 제작은, 실시예 15 에 준하여 실행하였다. 즉, 상기의 방법으로 정제한 TGC839FLAG 를 마우스에 면역한 후, 동 마우스로부터 비세포를 단리하고, 이것을 마우스 미엘로마세포 P3X63 Ag8U.1 과 융합시킴으로써 하이브리도마를 제작하였다. 그 후 TGC839FLAG 에 대한 항체가를 갖는 클론 중에서, 항TGC839FLAG 모노클로날항체 생산 하이브리도마로서 모노클로날항체 No.839-01 를 생산하는 하이브리도마 839-01 및 모노클로날항체 No.839-02 를 생산하는 하이브리도마 839-02 를 선택하였다.

항TGC839FLAG 모노클로날항체를 이용한 EIA 계는 하기의 방법으로 조제하였다. 즉, 항TGC839FLAG 모노클로날항체 No.839-01 (20㎍/㎖) 함유 50mM MOPS 완충액 (pH7.5) 에 1/8 인티폴리스틸렌비즈 (이뮤노케미컬사) 를 침지하여 4℃ 에서 하룻밤 가만히 놓아둔 후, 이것을 1% BSA 함유 50mM MOPS 완충액 (p7.5) 으로 3회 세정하였다. 이어서, 이 비즈를 1% BSA 함유 50mM MPOS 완충액 (pH7.5) 에 침지하고, 다시 4℃ 에서 하룻밤 가만히 놓아둠으로써 항TGC839FLAG 모노클로날항체 비즈를 제작하였다. 또한, 항TGC839FLAG 모노클로날항체 No.839-02 는 통상적인 방법 (이시카와에이지 저서, 「효소표식법」, 학회출판센터, 1991년, p62 의 방법) 에 따라 퍼옥시다아제 (POD, Roche사) 표식하였다.

TGC839FLAG 의 측정은 상기와 같이 조제한 시약을 이용하여 전자동 화학발광효소 면역측정장치·스피아라이트 180 (올림푸스 광학공업) 을 이용하여 실행하였다. 즉, 상기의 항TGC839FLAG 모노클로날항체 비즈 1 개를 이 측정장치내에서 각 농도로 조제한 표준 TGC839FLAG액 50㎕ 과 2% BSA 함유 50mM MOPS 완충액(pH7.5) 90㎕과 함께 37℃, 7분간 반응시킨 후, 이 볼을 꺼내 생리식염액으로 세정하였다. 이것을 2% BSA 함유 50mM MES 완충액 (pH6.5) 으로 5㎍ 항체/㎖ 농도로 희석한 POD 표식 항 TGC839FLAG 모노클로날항체 용액 140㎕ 와 37℃, 7분간 반응시켰다. 반응후에 이 볼을 생리식염액으로 세정후, 5mM 루미놀 및 0.02% 과산화수소함유 50mM Tris-HCl 완충액 (pH8.5) 140㎕ 와 반응시킴으로써 발광량 (cps) 을 측정하였다 (표 1). 얻어진 검출선의 결과를 도 14 에 나타낸다.

다음에 설정한 EIA 계를 이용하여, 각종 세포주의 배양 상등액중, 건강인 및 암환자로부터 채취한 혈장중의 TGC838 의 양을 측정하였다. CHO-K1/TGC838N-4 및 COS7/TGC838 세포의 배양 상등액은 하기의 방법을 이용하여 채취하였다. 즉, 실시예 22 에서 얻어진 CHO-K1/TGC838N-4 세포를 6 구멍 플레이트에 서브콘플루엔트에 배양한 후, 배양액을 0.05% CHAPS 를 함유한 Opti-MEM 배지 (라이프테크 오리엔탈(주)) 로 교환하여 2 일간 배양하였다. 또한 COS7/TGC838 세포의 배양 상등액은 실시예 21 의 방법에 준하여 채취하였다. SW1353 세포의 배양 상등액은 10% 소태아혈청을 함유한 MEM 배지에서 서브콘플루엔트에 배양한 후 채취하였다. 또 실제로 건강인(남(M) 5예, 여(F) 3예) 및 암환자 (간장암환자 (HCC) 5예, 대장암환자 (Large intestine) 3예) 로부터 채취한 혈장중에 있어서의 TGC838의 양에 대하여 측정하였다. 각각의 결과를 표 2, 표 3 및 표 4, 도 15 및 도 16 에 나타내지만, 여기에서 건강인 및 암환자로부터 채취한 혈장중에 있어서의 TGC838 량은 490㎚ 에서의 흡광량으로 나타냈다. 또, 각종 배양세포로부터 얻은 상등액중의 TGC838 량은 정제 재조합 TGC838 단백질량을 컨트롤로 하여 검량선으로부터 산출한 값을 나타냈다.

실시예 29 FACS 를 이용한 TGC839 단백질결합세포의 동정

(1) 혈구세포의 조제

안체말초혈에서 비중원심법으로 혈구세포를 조제하였다. EDTA 2나트륨염을 0.1% 첨가한 인간말초혈 40㎖ 를 등량의 PBS 로 희석하였다. Ficoll-Paque PLUS [Amersham Pharmacia Biotech AB사 (Uppsala, Sweden) 17-1440-02] 를 3.5㎖씩 15㎖ 원심튜브에 넣고, 그 위에 희석한 혈액을 7㎖ 씩 중층하였다. 400xg 로 30 분간 원심하여, 임파구와 단구로 이루어지는 혈구층을 분리·회수하였다. 회수한 혈구세포에 3 배 용량의 PBS 를 첨가한 후 원심하고, 세정한 세포를 회수하여 다시 PBS 로 3회 세정하여 혈구세포를 회수하였다.

(2) 얻어진 혈구세포의 염색

2×10⁶개씩 혈구세포에 대하여 TGC839-FLAG 단백질 10ng/㎕ 을 함유하는 세정액 (PBS/0.1% NaN₃/1% FBS) 또는 세정액만 (음성대조) 을 100㎕ 첨가하여 현탁하고, 4℃에서 1시간 반응시켰다. 반응시킨 후, 원심하여 반응액을 제외하고, 반응후의 혈구세포를 세정액 500㎕ 로 2회 세정하였다. 다음에 세정액을 제거하고, 항FLAG M2 항체 [시그마사 (MO, USA) F-3165] 10 ng/㎕ 을 함유하는 세정액을 100㎕ 첨가하여 현탁하고, 4℃ 에서 40분간 반응시킨 후, 세정액 500㎕ 로 2회 세정하였다. 그 후, FITC 표식 - 염소항마우스면역 글로불린항체 [Pharmingen (CA, USA)12064D] 10ng/㎕ 을 함유하는 세정액을 100㎕ 첨가하여 현탁하고, 어두운 곳에서 4℃ 에서 40분간 반응시켜, 세정액 500㎕ 로 2회 세정하였다. 세정액 100㎕ 로 재현탁한 후, PE(Phycoerythrin) 표식-항인간 CD56 항체 (B159) 액 [PharMingen (CA, USA) 31665X] 를 20㎕ 첨가하여 혼합하고, 어두운 곳에서 실온에서 25분간 반응시켜, 세정액 1000㎕ 로 2회 세정하였다. 다시 세정액 500㎕ 로 현탁하고, 셀스트레이너로 세포덩어리 등을 제거한 후 FACS 에 사용하였다.

(3) FACS 해석

FACS 는 BECTON DICKINSON사 (NJ, USA) 의 FACScan 을 이용하여, 해석소프트는 BECTON DICKINSON 의 CellQuest version 1.2.2 를 사용하였다. 측정데이터에 대해서는, 각 샘플 1×10⁵씩의 세포에 대하여 해석하였다.

그 결과, 측정한 모든 세포에 대하여 x축을 FITC 강도, y축을 세포수로 하여 TGC839-FLAG 단백질에 결합한 세포수에 대하여 해석한 결과, TGC839-FLAG 단백질을 첨가한 샘플에서는 TGC839-FLAG 단백질을 첨가하지 않았던 음성대조보다 FITC 로 염색된 세포가 많이 확인된 점에서, TGC839 단백질에 결합하는 임파구가 존재하는것이 확인되었다 (도 17). 또한, 이 점에서 임파구에 TGC838 단백질과 결합하는 세포가 포함되어 있는 것이 시사되었다.

또한 측정한 모든 세포에 대하여 x축을 FITC 강도, y축을 SSC (측방산란광) 로 하여 세포분획을 조사하고, TGC839-FLAG 에 결합된 세포군에 게이트를 곱하였다 (R1). 다음에 R1 세포군에 대하여 FITC 강도, y축을 PE 강도로 하여 세포분포를 조사하고, TGC839-FLAG 에 결합한 CD56 을 발현하는 세포군 (R2) 와 TGC839-FLAG 에 결합하여 CD56 을 발현하고 있지 않은 세포군 (R3) 으로 나눈 결과, TGC839-FLAG 에 결합하는 세포의 대부분이 CD56 을 발현하고 있는 것이 나타나고, NK 세포에 TGC839 에 대한 수용체가 발현되고 있는 것이 판명되었다 (도 18 및 표 5). 또한, 이것으로부터 NK 세포에 TGC838 의 수용체가 발현되고 있는 것이 시사되었다.

		R1	R2	R3
TGC839FLAG 단백질첨가세포군	측정한 세포 105개중의 양성세포수 양성율(%)	1190.12	1170.12	20.00
TGC839FLAG 단백질무첨가세포군(음성대조)	측정한 세포 105개중의 양성세포수 양성율(%)	610.06	610.06	00.00

실시예 30 NK 세포의 세포상해성에 대한 TGC839 단백질의 영향

신선한 인간의 말초혈로부터 Ficoll-Paque (Pharmacia) 를 이용하여 백혈구를 분리하고, 이것을 MACS 및 NK cell Isolation kit (모두 Miltenyi Biotec) 를 이용하여 NK 세포를 얻었다. 얻어진 세포를 10% FBS 및 IL15 (50ng/㎖ ; R&DSystems) 를 포함하는 RPMI1640 Medium 중에서 14 시간 배양하였다. 세포를 세정한 후, 10% BS 및 IL12 (1 ng/㎖ ; R&D Systems) 및 TGC839FLAG (0-500 ng/㎖) 을 포함하는 RPMI1640 Medium (GibcoBRL) 중에서 16 시간 배양하고, 다시 세포를 세정한 후 Effector 세포로서 세포상해성을 조사하였다. 한편 표적세포로서 인간 백혈병 세포주 K562 (ATCC) 를⁵¹Cr 로 표식하여 이용하였다. 5×10⁶세포의 K562 세포를 RPMI1640 Medium 으로 세정후, [⁵¹Cr] Na₂Cr0₄(NEN) 을 100μCi 를 첨가하여 37℃ 에서 1 시간 표식하였다. 세포를 세정후, 10% FBS 를 포함하는 RPMI1640 Medium 중에서 1시간 배양하였다. 세포를 세정하고 10⁴/웰 로 96-웰 플레이트에 뿌렸다. 이것에 1-12 배의 비율로 앞의 이펙터(Effector)세포를 첨가하여 7 시간 배양하였다. 세포상해성은 유리된 배양 상등액중의 방사활성을 γ-카운터 (Beckman) 으로 측정하여 다음의 식으로 구하였다 (도 19).

세포상해성 ={(유리방사활성 - 자연유리방사활성)/(최대유리방사활성-자연유리방사활성)} × 100(%)

실시예 31 NK 세포 및 K562 세포의 증식에 대한 TGC839 단백질의 영향

인간의 말초혈로부터 실시예 1 과 동일한 방법으로 NK 세포를 얻었다. 얻어진 세포는 10% FBS 및 IL15 (50 ng/㎖) 을 포함하는 RPMI1640 Medium 중에서 24 시간 배양한 후 세포를 세정하였다. 이 NK 세포 (10⁵/웰) 및 K562 세포 (2×10⁴/웰) 을 96-웰 플레이트 에 뿌려, 10% FBS 및 IL12 (1ng/㎖) 및 TGC839FLAG(0-500 ng/㎖) 을 포함하는 RPMI1640 Medium 중에서 40 시간 배양하였다. 마지막 12 시간은 BrdU 에서의 표식을 실행하여 Cell Proliferation ELISA (Boehringer) 를 사용하여 세포의 증식을 조사하였다. 검출은 450㎚ 의 흡광 (A₄₅₀) 에서 조사하였다 (도 20, 도 21).

또, 원심으로 세포를 제거한 후, Quantokine IFN-γImmunoassay (R&D Systems) 를 이용하여 배양 상등액중의 IFN-γ의 값을 조사하였다 (도 22).

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의연구를 거듭한 결과, EST 의 염기서열을 근거로 신규인 염기서열을 갖는 분비형 단백질 유전자를 발견하고, 이것에 코딩되는 분비형 단백질이 암세포로 특이적으로 발현되는 것 등을 발견하였다.

본 발명자들은 이들의 지견을 근거로 더욱 검토를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

(1) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 동일하거나 혹은 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그의 염,

(2) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열이 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열인 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그의 염,

(3) 암세포로 생성되는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그의 염,

(4) 상기 (1) 에 기재된 단백질의 부분펩티드 또는 그의 염,

(5) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열의 26번째부터 34번째의 아미노산서열을 갖는 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염,

(6) 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열의 166번째부터 190번째의 아미노산서열을 갖는 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염,

(7) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이 단백질 또는 이 부분펩티드를 생성시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 제조법,

(8) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체,

(9) 모노클로날항체인 상기 (8) 에 기재된 항체,

(10) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열의 26번째부터 34번째의 아미노산서열을 갖는 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체,

(11) 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열의 166번째부터 190번째의 아미노산서열을 갖는 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체인 상기 (8) 기재의 항체,

(12) 상기 (8) 에 기재된 항체를 함유하여 이루어지는 진단제,

(13) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염 또는 상기 (8) 에 기재된 항체를 함유하여 이루어지는 의약,

(14) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝방법,

(15) 활성이 세포증식활성인 상기 (14) 에 기재된 스크리닝방법,

(16) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트,

(17) 상기 (14) 에 기재된 스크리닝방법 또는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염,

(18) 상기 (14) 에 기재된 스크리닝방법 또는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 의약,

(19) 암의 예방·치료제인 상기 (18) 에 기재된 의약 등을 제공한다.

또한, 본 발명은,

(19) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열이 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산서열인 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그의 염,

(21) 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열이 ① 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열 중의 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 결실된 아미노산서열, ② 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열에 1 ∼ 10 개 (바람직하게는 1 ∼ 5 개 (보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산서열, ③ 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열 중의 1 ∼ 5 개 (바람직하게는 1 ∼ 3 개) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산서열, 또는 ④ 이들을 조합한 아미노산서열인 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그의 염,

(22) (i) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 기질을 접촉시킨 경우와, (ii) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 기질 및 시험화합물을 접촉시킨 경우에 있어서의 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 의 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 상기 (14) 에 기재된 스크리닝방법,

(23) 상기 (14) 에 기재된 스크리닝방법 또는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진시키는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 의약,

(24) 질환조직 적출후의 재생제인 상기 (23) 에 기재된 의약,

(25) 상기 (14) 기재의 스크리닝방법 또는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 이들 염의 활성을 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 의약,

(26) 암의 치료·예방제인 상기 (25) 에 기재된 의약,

(27) 상기 (8) 에 기재된 항체와, 피검액 및 표식화된 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 이들의 염을 경합적으로 반응시켜, 이 항체에 결합한 표식화된 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 정량법, 및

(28) 피검액과 담체상에 불용화된 상기 (8) 에 기재된 항체 및 표식화된 상기 (8) 에 기재된 항체를 동시 혹은 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표식제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액중의 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 정량법 등을 제공한다.

또, 본 발명은,

(29) 상기 (9) 에 기재된 모노클로날항체를 산생하는 능력을 갖는 하이브리도마,

(30) 중화항체인 상기 (8) 에 기재된 항체,

(31) 인간화 항체인 상기 (8) 에 기재된 항체,

(32) 상기 (31) 에 기재된 항체를 함유하는 의약,

(33) 암의 예방·치료제인 상기 (32) 에 기재된 의약,

(34) 상기 (1) 에 기재된 단백질 혹은 그의 염 또는 상기 (4) 에 기재된 부분펩티드 혹은 그의 염에 의한 내츄럴킬러세포의 세포증식저해를 저해하는 활성을 갖는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 의약,

(35) 암의 예방·치료제인 상기 (34) 에 기재된 의약 등을 제공한다.

본 발명의 단백질 등은 예컨대 세포증식활성 등을 갖기 때문에, 질환조직 적출후의 조직재생제 등으로 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질의 활성을 촉진 혹은 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝을 위한 시약으로서 유용하고, 스크리닝에 의해 얻어지는 저해제는 각종 암 (예 : 자궁체암, 자궁내막종양, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암, 신장암, 신경아종, 방광암, 흑색종 등) 의 예방·치료제로 기대된다.

또한, 본 발명의 단백질에 대한 항체는 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식할 수 있으므로, 피검액중의 본 발명의 단백질의 정량 등에 사용할 수 있어, 상기 각종 암의 진단제로서 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 단백질에 대한 인간화 항체는 상기 각종 암의 예방·치료제로서 이용할 수 있다.

Claims (26)

1. 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 동일하거나 혹은 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그의 염,
2. 제 1 항에 있어서, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열과 실질적으로 동일한 아미노산서열이 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열인 단백질 또는 그의 염.
3. 제 1 항에 있어서, 암세포로 생성되는 단백질 또는 그의 염.
4. 제 1 항 기재된 단백질의 부분펩티드 또는 그의 염.
5. 제 4 항에 있어서, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열의 26번째부터 34번째의 아미노산서열을 갖는 부분펩티드 또는 그의 염.
6. 제 4 항에 있어서, 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열의 166번째부터 190번째의 아미노산서열을 갖는 부분펩티드 또는 그의 염.
7. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 제 4 항에 기재된 부분펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하고, 이 단백질 또는 이 부분펩티드를 생성시키는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 제조법.
8. 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체.
9. 제 8 항에 있어서, 모노클로날항체인 항체.
10. 제 8 항에 있어서, 서열번호 : 1 로 표시되는 아미노산서열의 26번째부터 34번째의 아미노산서열을 갖는 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체인 항체.
11. 제 8 항에 있어서, 서열번호 : 5 로 표시되는 아미노산서열의 166번째부터 190번째의 아미노산서열을 갖는 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염에 대한 항체인 항체.
12. 제 8 항에 기재된 항체를 함유하여 이루어지는 진단제.
13. 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염또는 제 8 항에 기재된 항체를 함유하여 이루어지는 의약.
14. 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝방법.
15. 제 14 항에 있어서, 활성이 세포증식활성인 스크리닝방법.
16. 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는, 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염의 스크리닝용 키트.
17. 제 4 항에 기재된 스크리닝방법 또는 제 16 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는, 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드 또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염.
18. 제 14 항에 기재된 스크리닝방법 또는 제 16 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻어지는, 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 제 4 항에 기재된 부분펩티드또는 그의 염의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물 또는 그의 염을 함유하여 이루어지는 의약.
19. 제 18 항에 있어서, 암의 예방·치료제인 의약.
20. 제 9 항에 기재된 모노클로날항체를 생산하는 능력을 갖는 하이브리도마.
21. 제 8 항에 있어서, 중화 항체인 항체.
22. 제 8 항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
23. 제 22 항에 기재된 항체를 함유하는 의약.
24. 제 23 항에 있어서, 암의 예방·치료제인 의약.
25. 제 1 항에 기재된 단백질 혹은 그의 염 또는 제 4 항에 기재된 부분펩티드 혹은 그의 염에 의한 내츄럴킬러세포의 세포증식을 저해하는 활성을 갖는 화합물 또는 그의 염을 함유하는 의약.
26. 제 25 항에 있어서, 암의 예방·치료제인 의약.