JP2002335964A - 新規タンパク質およびその用途 - Google Patents
新規タンパク質およびその用途Info
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- JP2002335964A JP2002335964A JP2001131638A JP2001131638A JP2002335964A JP 2002335964 A JP2002335964 A JP 2002335964A JP 2001131638 A JP2001131638 A JP 2001131638A JP 2001131638 A JP2001131638 A JP 2001131638A JP 2002335964 A JP2002335964 A JP 2002335964A
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- Japan
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- salt
- protein
- partial peptide
- ester
- cells
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 癌の発生や進展を抑制する可能性のある新た
な遺伝子を見出し、その用途を開発する。 【解決手段】 配列番号:４で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその塩およびそれをコードするポリヌ
クレオチドを提供する。それらの医薬用等の用途も提供
する。
な遺伝子を見出し、その用途を開発する。 【解決手段】 配列番号:４で表わされるアミノ酸配列
と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する
タンパク質またはその塩およびそれをコードするポリヌ
クレオチドを提供する。それらの医薬用等の用途も提供
する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規分泌タンパク
質およびその用途に関する。
質およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】我々ヒトを含む多くの生物体を構成する
個々の細胞が、細胞外の環境を正確に把握し迅速に対応
していくことは、機能的な細胞活動にとって必要不可欠
である。その中で重要な働きをしているのが細胞表面に
ある種々の分子であり、とりわけ受容体を含む多くのタ
ンパク分子が中心的役割を担っている。例えば、多くの
Tyr kinase 型の受容体は、細胞外のリガンドに対応し
て細胞内の特定のタンパクをリン酸化することによって
機能している。またある種の白血球細胞に発現している
表面タンパクの中には、細胞間相互作用を通して他の細
胞に働きかけることにより体内の免疫反応を担ってい
る。これらのタンパク分子の多くは何らかの形で細胞膜
上に固定された状態で存在している。しかし、酵素的に
あるいは他の機構によって細胞外へ遊離し、分泌型とし
ても機能しているものもある。このような分泌型のタン
パクには、本来の機能を増強あるいは拮抗するものや、
全く異なる機能を持つものなど様々である。例えば、多
くの分泌型の受容体は、膜上の受容体とリガンドをめぐ
って競合する。また、 CD55 や CD59 などの分子は、
分泌型か膜結合型かを問わず補体系の抑制に働く（Immu
nology Today 20, 576-582 (1999)）。一方癌関連の遺
伝子としては、細胞の増殖因子あるいはその受容体、転
写因子やシグナル伝達に関わるタンパクなど多数の遺伝
子が見出だされている。例えば、脳腫瘍に関係する PDG
F（Nature 362, 801 (1997)）や乳癌や胃癌、神経芽腫
に関与する c-mycや N-myc、大腸癌や白血病に関与する
Ki-ras や N-ras などが挙げられる。これらの遺伝子
は特定の細胞や組織が癌化したときに見出された特異的
なタンパクや遺伝子を分析し、その配列の情報をもとに
して同定されたものであり、すべてまたは多くの癌細胞
や組織に普遍的に発現しているものではない。また、ヒ
トを含む哺乳類の免疫系は非常に複雑であり、単一の遺
伝子産物によってすべての癌の発生・進行のメカニズム
を説明することは困難であることが予想される。
個々の細胞が、細胞外の環境を正確に把握し迅速に対応
していくことは、機能的な細胞活動にとって必要不可欠
である。その中で重要な働きをしているのが細胞表面に
ある種々の分子であり、とりわけ受容体を含む多くのタ
ンパク分子が中心的役割を担っている。例えば、多くの
Tyr kinase 型の受容体は、細胞外のリガンドに対応し
て細胞内の特定のタンパクをリン酸化することによって
機能している。またある種の白血球細胞に発現している
表面タンパクの中には、細胞間相互作用を通して他の細
胞に働きかけることにより体内の免疫反応を担ってい
る。これらのタンパク分子の多くは何らかの形で細胞膜
上に固定された状態で存在している。しかし、酵素的に
あるいは他の機構によって細胞外へ遊離し、分泌型とし
ても機能しているものもある。このような分泌型のタン
パクには、本来の機能を増強あるいは拮抗するものや、
全く異なる機能を持つものなど様々である。例えば、多
くの分泌型の受容体は、膜上の受容体とリガンドをめぐ
って競合する。また、 CD55 や CD59 などの分子は、
分泌型か膜結合型かを問わず補体系の抑制に働く（Immu
nology Today 20, 576-582 (1999)）。一方癌関連の遺
伝子としては、細胞の増殖因子あるいはその受容体、転
写因子やシグナル伝達に関わるタンパクなど多数の遺伝
子が見出だされている。例えば、脳腫瘍に関係する PDG
F（Nature 362, 801 (1997)）や乳癌や胃癌、神経芽腫
に関与する c-mycや N-myc、大腸癌や白血病に関与する
Ki-ras や N-ras などが挙げられる。これらの遺伝子
は特定の細胞や組織が癌化したときに見出された特異的
なタンパクや遺伝子を分析し、その配列の情報をもとに
して同定されたものであり、すべてまたは多くの癌細胞
や組織に普遍的に発現しているものではない。また、ヒ
トを含む哺乳類の免疫系は非常に複雑であり、単一の遺
伝子産物によってすべての癌の発生・進行のメカニズム
を説明することは困難であることが予想される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】そこで、癌の発生や進
展に関わるような癌関連遺伝子あるいは癌化に伴なって
発現増強されるようないわゆる癌抗原分子と言われるよ
うな一群のタンパクをコードする遺伝子が近年注目され
ているが、特に免疫系に対して何らかの関与を有するこ
とにより癌の発生や進展を直接あるいは間接的に亢進す
る可能性のある新たな遺伝子の発見が望まれている。
展に関わるような癌関連遺伝子あるいは癌化に伴なって
発現増強されるようないわゆる癌抗原分子と言われるよ
うな一群のタンパクをコードする遺伝子が近年注目され
ているが、特に免疫系に対して何らかの関与を有するこ
とにより癌の発生や進展を直接あるいは間接的に亢進す
る可能性のある新たな遺伝子の発見が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、予想されるア
ミノ酸配列上でＮ末端およびＣ末端の両方に疎水性アミ
ノ酸のクラスターを持つ膜結合型および／または分泌型
のタンパクをコードしている新規遺伝子を見出した。本
発明者らはこれらの知見に基づいて、さらに検討を重ね
た結果、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、予想されるア
ミノ酸配列上でＮ末端およびＣ末端の両方に疎水性アミ
ノ酸のクラスターを持つ膜結合型および／または分泌型
のタンパクをコードしている新規遺伝子を見出した。本
発明者らはこれらの知見に基づいて、さらに検討を重ね
た結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、（１） 配列番号：
４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質
またはその塩、（２） 上記（１）記載のタンパク質の
部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
またはその塩、（３） 上記（１）記載のタンパク質を
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４） 配列番
号：３で表わされる塩基配列を有する上記（３）記載の
ＤＮＡ、（５） 上記（２）記載の部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（６） 上記（３）ま
たは上記（５）記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、（７） 上記（６）記載の組換えベクターで形質転
換された形質転換体、（８） 上記（７）記載の形質転
換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記
（２）記載の部分ペプチドを生成せしめることを特徴と
する上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、また
は上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
しくはそのエステルまたはその塩の製造法、（９） 上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩に対する抗体、（１０） 上
記（３）もしくは上記（５）記載のＤＮＡまたは上記
（９）記載の抗体を含有してなる診断剤、（１１） 上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩あるいは上記（９）記載の抗
体を含有してなる医薬、（１２） 癌の予防・治療剤で
ある上記（１１）記載の医薬、（１３） 上記（１）記
載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩を用いることを特徴とする上記（１）記
載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（１４） 上記（１）
記載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記
載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩を含有してなる上記（１）記載のタン
パク質もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩
のスクリーニング用キット、（１５） 上記（１３）記
載のスクリーニング方法または上記（１４）記載のスク
リーニング用キットを用いて得られる上記（１）記載の
タンパク質もしくはその塩、上記（２）記載の部分ペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩の活性を促進する化合物またはその塩、（１６）
上記（１５）記載の化合物またはその塩を含有してなる
医薬、（１７） 癌の予防・治療剤である上記（１６）
記載の医薬、（１８） 抗癌作用を有する医薬を製造す
るための上記（１）記載のタンパク質もしくはその
塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩、または上記（１
３）記載のスクリーニング方法または上記（１４）記載
のスクリーニング用キットを用いて得られる上記（１）
記載のタンパク質もしくはその塩、上記（２）記載の部
分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使
用、（１９） 上記（１）記載のタンパク質もしくは
その塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（１２）記載のスクリーニング方法または上記（１３）
記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記
（１）記載のタンパク質もしくはその塩、上記（２）記
載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩
を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防・治療
方法、（２０） 上記（１３）記載のスクリーニング方
法または上記（１４）記載のスクリーニング用キットを
用いて得られる上記（１）記載のタンパク質もしくはそ
の塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する
化合物またはその塩、（２１） 上記（２０）記載の化
合物またはその塩を含有してなる医薬、（２２） 免疫
抑制剤または抗炎症剤である上記（２１）記載の医薬、
（２３） 免疫抑制作用または抗炎症作用を有する医薬
を製造するための上記（１３）記載のスクリーニング
方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる上記（１）記載のタンパク質もしくは
その塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害す
る化合物またはその塩、あるいは上記（９）記載の抗体
の使用、（２４） 上記（１３）記載のスクリーニング
方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる上記（１）記載のタンパク質もしくは
その塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害す
る化合物またはその塩、あるいは上記（９）記載の抗体
を哺乳動物に投与することを特徴とする免疫抑制方法ま
たは炎症の治療方法などを提供する。
４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一
のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質
またはその塩、（２） 上記（１）記載のタンパク質の
部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル
またはその塩、（３） 上記（１）記載のタンパク質を
コードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（４） 配列番
号：３で表わされる塩基配列を有する上記（３）記載の
ＤＮＡ、（５） 上記（２）記載の部分ペプチドをコー
ドするＤＮＡを含有するＤＮＡ、（６） 上記（３）ま
たは上記（５）記載のＤＮＡを含有する組換えベクタ
ー、（７） 上記（６）記載の組換えベクターで形質転
換された形質転換体、（８） 上記（７）記載の形質転
換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記
（２）記載の部分ペプチドを生成せしめることを特徴と
する上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、また
は上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドも
しくはそのエステルまたはその塩の製造法、（９） 上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩に対する抗体、（１０） 上
記（３）もしくは上記（５）記載のＤＮＡまたは上記
（９）記載の抗体を含有してなる診断剤、（１１） 上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩あるいは上記（９）記載の抗
体を含有してなる医薬、（１２） 癌の予防・治療剤で
ある上記（１１）記載の医薬、（１３） 上記（１）記
載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩を用いることを特徴とする上記（１）記
載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載
の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ
ルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物また
はその塩のスクリーニング方法、（１４） 上記（１）
記載のタンパク質もしくはその塩、または上記（２）記
載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩を含有してなる上記（１）記載のタン
パク質もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩
のスクリーニング用キット、（１５） 上記（１３）記
載のスクリーニング方法または上記（１４）記載のスク
リーニング用キットを用いて得られる上記（１）記載の
タンパク質もしくはその塩、上記（２）記載の部分ペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩の活性を促進する化合物またはその塩、（１６）
上記（１５）記載の化合物またはその塩を含有してなる
医薬、（１７） 癌の予防・治療剤である上記（１６）
記載の医薬、（１８） 抗癌作用を有する医薬を製造す
るための上記（１）記載のタンパク質もしくはその
塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミド
もしくはそのエステルまたはその塩、または上記（１
３）記載のスクリーニング方法または上記（１４）記載
のスクリーニング用キットを用いて得られる上記（１）
記載のタンパク質もしくはその塩、上記（２）記載の部
分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使
用、（１９） 上記（１）記載のタンパク質もしくは
その塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩、または上記
（１２）記載のスクリーニング方法または上記（１３）
記載のスクリーニング用キットを用いて得られる上記
（１）記載のタンパク質もしくはその塩、上記（２）記
載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス
テルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩
を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防・治療
方法、（２０） 上記（１３）記載のスクリーニング方
法または上記（１４）記載のスクリーニング用キットを
用いて得られる上記（１）記載のタンパク質もしくはそ
の塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する
化合物またはその塩、（２１） 上記（２０）記載の化
合物またはその塩を含有してなる医薬、（２２） 免疫
抑制剤または抗炎症剤である上記（２１）記載の医薬、
（２３） 免疫抑制作用または抗炎症作用を有する医薬
を製造するための上記（１３）記載のスクリーニング
方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる上記（１）記載のタンパク質もしくは
その塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害す
る化合物またはその塩、あるいは上記（９）記載の抗体
の使用、（２４） 上記（１３）記載のスクリーニング
方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キット
を用いて得られる上記（１）記載のタンパク質もしくは
その塩、上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害す
る化合物またはその塩、あるいは上記（９）記載の抗体
を哺乳動物に投与することを特徴とする免疫抑制方法ま
たは炎症の治療方法などを提供する。
【０００６】さらには、本発明は、（２５）配列番号：
４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列が、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と約７０％
以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列である上記（１）記載のタンパク質また
はその塩、（２６）配列番号：４で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：４で
表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは、１〜
３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：４で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（好ましく
は、１〜５個（より好ましくは、１〜３個））のアミノ
酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：４で表される
アミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは、１〜３個）の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ま
たはそれらを組み合わせたアミノ酸配列である上記
（１）記載のタンパク質またはその塩、
４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配
列が、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と約７０％
以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０
％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有す
るアミノ酸配列である上記（１）記載のタンパク質また
はその塩、（２６）配列番号：４で表されるアミノ酸配
列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：４で
表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは、１〜
３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番
号：４で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（好ましく
は、１〜５個（より好ましくは、１〜３個））のアミノ
酸が付加したアミノ酸配列、配列番号：４で表される
アミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは、１〜３個）の
アミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、ま
たはそれらを組み合わせたアミノ酸配列である上記
（１）記載のタンパク質またはその塩、
【０００７】（２７）（ｉ）上記（１）記載のタンパク
質もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチ
ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
塩に基質を接触させた場合と、（ii）上記（１）記載の
タンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載の部
分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
たはその塩に基質および試験化合物を接触させた場合に
おける、上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、
または上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を測定し、
比較することを特徴とする上記（１３）記載のスクリー
ニング方法、
質もしくはその塩、または上記（２）記載の部分ペプチ
ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
塩に基質を接触させた場合と、（ii）上記（１）記載の
タンパク質もしくはその塩、または上記（２）記載の部
分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま
たはその塩に基質および試験化合物を接触させた場合に
おける、上記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、
または上記（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を測定し、
比較することを特徴とする上記（１３）記載のスクリー
ニング方法、
【０００８】（２８）上記（９）記載の抗体と、被検液
および標識化された上記（１）記載のタンパク質もしく
はその塩、または上記（２）記載の部分ペプチドもしく
はそのアミドもしくはそのエステルまたはそれらの塩と
を競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩の割合を測定することを特徴
とする被検液中の上記（１）記載のタンパク質もしくは
上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
（２９）被検液と担体上に不溶化した上記（９）記載の
抗体および標識化された上記（９）記載の抗体とを同時
あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記
（１）記載のタンパク質もしくは上記（２）記載の部分
ペプチドまたはその塩の定量法などを提供する。
および標識化された上記（１）記載のタンパク質もしく
はその塩、または上記（２）記載の部分ペプチドもしく
はそのアミドもしくはそのエステルまたはそれらの塩と
を競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された上
記（１）記載のタンパク質もしくはその塩、または上記
（２）記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩の割合を測定することを特徴
とする被検液中の上記（１）記載のタンパク質もしくは
上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩の定量法、
（２９）被検液と担体上に不溶化した上記（９）記載の
抗体および標識化された上記（９）記載の抗体とを同時
あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識
剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記
（１）記載のタンパク質もしくは上記（２）記載の部分
ペプチドまたはその塩の定量法などを提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の配列番号：４で表わされ
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と
称する）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラ
ット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経
細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウ
ム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内
皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免
疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュ
ラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細
胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組
織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳
基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小
脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関
節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養
細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−
２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６
２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ
−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａ
ｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、
ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨ
Ｐ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、Ｍ
ＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよ
く、合成タンパク質であってもよい。
るアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸
配列を有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質と
称する）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラ
ット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウ
シ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経
細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウ
ム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内
皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免
疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュ
ラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細
胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組
織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳
基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小
脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、
甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管
（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下
腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関
節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養
細胞（例えば、ＭＥＬ、Ｍ１、ＣＴＬＬ−２、ＨＴ−
２、ＷＥＨＩ−３、ＨＬ−６０、ＪＯＳＫ−１、Ｋ５６
２、ＭＬ−１、ＭＯＬＴ−３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ
−１０、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＴＡＬＬ−１、Ｊｕｒｋａ
ｔ、ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２、ＫＥ−３７、ＳＫＷ−３、
ＨＵＴ−７８、ＨＵＴ−１０２、Ｈ９、Ｕ９３７、ＴＨ
Ｐ−１、ＨＥＬ、ＪＫ−１、ＣＭＫ、ＫＯ−８１２、Ｍ
ＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよ
く、合成タンパク質であってもよい。
【００１０】配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で
表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約
８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ま
しくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列など
があげられる。本発明の配列番号：４で表わされるアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質としては、例えば、上記の配列番号：４で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好
ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、ＮＫＧ
２Ｄに対する結合活性、免疫細胞の活性化などがあげら
れる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に
（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であるこ
とを示す。したがって、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性、
免疫細胞の活性化などの活性が同等（例、約０．１〜１
００倍、好ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは
約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活
性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっ
ていてもよい。ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性は、ＥＬＩ
ＳＡ法等の自体公知の方法よって測定すれば良い。ま
た、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って
測定することもできる。免疫細胞の活性化の測定は、自
体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、
免疫細胞活性化の指標として、ひとつは細胞の増殖を調
べる方法がある。これは詳細には細胞内の DNA 合成を
測定するもので、通常 thymidine またはその誘導体の
取込みとして定量できる。すなわち [3H]thymidine の
取込みをその放射活性を指標にして定量する方法や、th
ymidine の誘導体であるbromodeoxiuridine (BrdU) の
取り込みを BrdU に特異的な抗体を用いて定量する方法
などがある。別法として、免疫細胞の活性化に伴なう各
種サイトカイン等の産生を調べてもよい。すなわち詳細
には、活性化に伴なって培地中または血清中に分泌され
てくる interleukin 類 (IL-1、IL-2、IL-3I、L-4 等)
や interferon 類（alpha、beta、gamma）TNF、GM-CS
F、各種ケモカイン類等をそれらに特異的な抗体を用い
て測定する。
実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で
表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約
８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ま
しくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列など
があげられる。本発明の配列番号：４で表わされるアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質としては、例えば、上記の配列番号：４で表わされ
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するタンパ
ク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好
ましい。実質的に同質の活性としては、例えば、ＮＫＧ
２Ｄに対する結合活性、免疫細胞の活性化などがあげら
れる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に
（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であるこ
とを示す。したがって、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性、
免疫細胞の活性化などの活性が同等（例、約０．１〜１
００倍、好ましくは約０．５〜１０倍、より好ましくは
約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活
性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっ
ていてもよい。ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性は、ＥＬＩ
ＳＡ法等の自体公知の方法よって測定すれば良い。ま
た、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って
測定することもできる。免疫細胞の活性化の測定は、自
体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、
免疫細胞活性化の指標として、ひとつは細胞の増殖を調
べる方法がある。これは詳細には細胞内の DNA 合成を
測定するもので、通常 thymidine またはその誘導体の
取込みとして定量できる。すなわち [3H]thymidine の
取込みをその放射活性を指標にして定量する方法や、th
ymidine の誘導体であるbromodeoxiuridine (BrdU) の
取り込みを BrdU に特異的な抗体を用いて定量する方法
などがある。別法として、免疫細胞の活性化に伴なう各
種サイトカイン等の産生を調べてもよい。すなわち詳細
には、活性化に伴なって培地中または血清中に分泌され
てくる interleukin 類 (IL-1、IL-2、IL-3I、L-4 等)
や interferon 類（alpha、beta、gamma）TNF、GM-CS
F、各種ケモカイン類等をそれらに特異的な抗体を用い
て測定する。
【００１１】また、本発明のタンパク質としては、例え
ば、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中の１〜
５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したア
ミノ酸配列、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
に１〜１０個（好ましくは、１〜５個（より好ましく
は、１〜３個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列に１〜５個
（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミ
ノ酸配列、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中
の１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などの
いわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配
列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、
欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
ば、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中の１〜
５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したア
ミノ酸配列、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
に１〜１０個（好ましくは、１〜５個（より好ましく
は、１〜３個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列に１〜５個
（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミ
ノ酸配列、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列中
の１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他の
アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはそれらを
組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などの
いわゆるムテインも含まれる。上記のようにアミノ酸配
列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、
欠失または置換の位置としては、特に限定されない。
【００１２】本明細書におけるタンパク質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：４で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エス
テルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1
-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用
エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基な
どが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカ
ルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している
場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化され
ているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合
のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、本発明のタンパク質に
は、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基など
のＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護
されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端の
グルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内
のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、
アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ
基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチ
ル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれ
る。本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配
列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来
（好ましくはヒト腎臓由来）のタンパク質などが用いら
れる。
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：４で
表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめ
とする、本発明のタンパク質は、Ｃ末端が通常カルボキ
シル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯ
Ｏ-）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）または
エステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここで、エス
テルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ
−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ
1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキ
シルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニ
ル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベ
ンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基
もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1
-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用
エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基な
どが用いられる。本発明のタンパク質がＣ末端以外にカ
ルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している
場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化され
ているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合
のエステルとしては、例えば、上記したＣ末端のエステ
ルなどが用いられる。さらに、本発明のタンパク質に
は、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のア
ミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基など
のＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護
されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端の
グルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内
のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、
アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ
基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチ
ル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基な
ど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したい
わゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれ
る。本発明のタンパク質の具体例としては、例えば、配
列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来
（好ましくはヒト腎臓由来）のタンパク質などが用いら
れる。
【００１３】本発明のタンパク質の部分ペプチドとして
は、上記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであっ
て、好ましくは、上記した本発明のタンパク質と同様の
活性（例、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性、免疫細胞の活
性化作用など）を有するものであればいかなるものでも
よい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列
中の少なくとも２０％以上、好ましくは５０％以上、さ
らに好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以
上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、
ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性または免疫細胞の活性化作
用を有するペプチドなどが用いられる。また、本発明の
部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１〜５個（好ま
しくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失し、または、その
アミノ酸配列に１〜１０個（好ましくは、１〜５個（よ
り好ましくは、１〜３個））のアミノ酸が付加し、また
は、そのアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは、１〜３
個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列
中の１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されていてもよい。本発明の部分ペプ
チドとしてより具体的には、配列番号：４で表わされる
アミノ酸配列の第２４〜２５５番目の部分アミノ酸配列
を有する部分ペプチド、配列番号：４で表わされるアミ
ノ酸配列の第３１〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有
する部分ペプチド、配列番号：４で表わされるアミノ酸
配列の第２６〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有する
部分ペプチド、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
の第２５〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有する部分
ペプチド、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列の第
２７〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有する部分ペプ
チドなどが挙げられる。
は、上記した本発明のタンパク質の部分ペプチドであっ
て、好ましくは、上記した本発明のタンパク質と同様の
活性（例、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性、免疫細胞の活
性化作用など）を有するものであればいかなるものでも
よい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列
中の少なくとも２０％以上、好ましくは５０％以上、さ
らに好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以
上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列を有し、
ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性または免疫細胞の活性化作
用を有するペプチドなどが用いられる。また、本発明の
部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１〜５個（好ま
しくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失し、または、その
アミノ酸配列に１〜１０個（好ましくは、１〜５個（よ
り好ましくは、１〜３個））のアミノ酸が付加し、また
は、そのアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは、１〜３
個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列
中の１〜５個（好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他
のアミノ酸で置換されていてもよい。本発明の部分ペプ
チドとしてより具体的には、配列番号：４で表わされる
アミノ酸配列の第２４〜２５５番目の部分アミノ酸配列
を有する部分ペプチド、配列番号：４で表わされるアミ
ノ酸配列の第３１〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有
する部分ペプチド、配列番号：４で表わされるアミノ酸
配列の第２６〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有する
部分ペプチド、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
の第２５〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有する部分
ペプチド、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列の第
２７〜２５５番目の部分アミノ酸配列を有する部分ペプ
チドなどが挙げられる。
【００１４】また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト（−ＣＯＯ−）であるが、上記した本発明のタンパク
質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエ
ステル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは上記と同意義を示す）であ
ってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記
した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残
基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護さ
れているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグル
タミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のア
ミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されてい
るもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドな
どの複合ペプチドなども含まれる。また、本発明の部分
ペプチドは抗体作成のための抗原として用いることがで
きるので、必ずしもＮＫＧ２Ｄに対する結合活性または
免疫細胞の活性化作用を有する必要はない。本発明のタ
ンパク質もしくはその部分ペプチドまたは本発明のタン
パク質もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
は、自体公知の方法で標識化されていてもよく、具体的
にはアイソトープ化されたもの、蛍光標識されたもの
（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオ
チン化されたもの、酵素標識されたものなどが挙げられ
る。
常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレー
ト（−ＣＯＯ−）であるが、上記した本発明のタンパク
質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ2）またはエ
ステル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは上記と同意義を示す）であ
ってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、上記
した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残
基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護さ
れているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグル
タミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のア
ミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されてい
るもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドな
どの複合ペプチドなども含まれる。また、本発明の部分
ペプチドは抗体作成のための抗原として用いることがで
きるので、必ずしもＮＫＧ２Ｄに対する結合活性または
免疫細胞の活性化作用を有する必要はない。本発明のタ
ンパク質もしくはその部分ペプチドまたは本発明のタン
パク質もしくはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ
は、自体公知の方法で標識化されていてもよく、具体的
にはアイソトープ化されたもの、蛍光標識されたもの
（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオ
チン化されたもの、酵素標識されたものなどが挙げられ
る。
【００１５】本発明のタンパク質または部分ペプチドの
塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有
機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、
塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有
機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、
マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、
蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質また
はその塩は、上記したヒトや温血動物の細胞または組織
（特に腎臓など）から自体公知のタンパク質の精製方法
によって製造することもできるし、後に記載するタンパ
ク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによっても製造することができる。また、後に記
載するペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞（特に腎臓など）から
製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモ
ジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆
相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。ヒトや哺乳動物の組織または
細胞（特に腎臓など）から製造する場合、ヒトや哺乳動
物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽
出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを
組み合わせることにより精製単離することができる。
塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有
機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用い
られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし
い。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、
塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有
機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、
マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、
蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸）との塩などが用いられる。本発明のタンパク質また
はその塩は、上記したヒトや温血動物の細胞または組織
（特に腎臓など）から自体公知のタンパク質の精製方法
によって製造することもできるし、後に記載するタンパ
ク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養す
ることによっても製造することができる。また、後に記
載するペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞（特に腎臓など）から
製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモ
ジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆
相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。ヒトや哺乳動物の組織または
細胞（特に腎臓など）から製造する場合、ヒトや哺乳動
物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽
出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを
組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１６】本発明のタンパク質、部分ペプチド、もし
くはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質またはそれらのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DC
C、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-
(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用
いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹
脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステ
ルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ
酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。
くはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、
通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ
る。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹
脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹
脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルア
ルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、
ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセ
トアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−
（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェ
ノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocア
ミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができ
る。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基
を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の
配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で
縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出
すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で
分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタン
パク質またはそれらのアミド体を取得する。上記した保
護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用で
きる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カ
ルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DC
C、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-
(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用
いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤
（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹
脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステ
ルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ
酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができ
る。
【００１７】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。
いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しう
ることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例え
ば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチル
アセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド
類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化
水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、
ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ
ン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル
類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル
類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいは
これらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタ
ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られてい
る範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範
囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は
通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応
を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基
の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより
十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても
十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセ
チルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化
することによって、後の反応に影響を与えないようにす
ることができる。
【００１８】原料のアミノ基の保護基としては、例え
ば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボ
ルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、
例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、
シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２
−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アル
キルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベ
ンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メ
トキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステ
ル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル
化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブト
キシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化な
どによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル
基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などが用いられる。また、エーテル化に適する
基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニ
ル基、t-ブチル基などである。チロシンのフェノール性
水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−
ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニ
ル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmoc
などが用いられる。
ば、Ｚ、Boc、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボ
ルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシ
カルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニ
ル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２
−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノ
チオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、
例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、
シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２
−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アル
キルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベ
ンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メ
トキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステ
ル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル
化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブト
キシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化な
どによって保護することができる。セリンの水酸基は、
例えば、エステル化またはエーテル化によって保護する
ことができる。このエステル化に適する基としては、例
えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル
基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などが用いられる。また、エーテル化に適する
基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニ
ル基、t-ブチル基などである。チロシンのフェノール性
水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、２−
ニトロベンジル、Br-Z、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、
Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニ
ル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmoc
などが用いられる。
【００１９】原料のカルボキシル基の活性化されたもの
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ-炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。
としては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エ
ステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノー
ル、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノ
ール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対
応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱
離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ-炭
素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、
また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれら
の混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルア
ミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなど
による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによ
る還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応
は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、
酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、
チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジ
メチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタン
ジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効で
ある。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用
いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理
により除去され、トリプトファンのインドール保護基と
して用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオー
ル、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による
脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア
などによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２０】原料の反応に関与すべきでない官能基の保
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関
与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段
から適宜選択しうる。タンパク質のアミド体を得る別の
方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミ
ノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延
ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護
基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の
保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タ
ンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮
合反応の詳細については上記と同様である。縮合により
得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法により
すべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得るこ
とができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を
駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の
タンパク質のアミド体を得ることができる。タンパク質
のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミ
ノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合
しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と
同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ること
ができる。
【００２１】本発明の部分ペプチドまたはその塩は、自
体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の
タンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによっ
て製造することができる。ペプチドの合成法としては、
例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良
い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分
ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生
成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することによ
り目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合
方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の〜に
記載された方法があげられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって適当な塩に変換することができる
し、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。
体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の
タンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによっ
て製造することができる。ペプチドの合成法としては、
例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良
い。すなわち、本発明の部分ペプチドを構成し得る部分
ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生
成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することによ
り目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合
方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の〜に
記載された方法があげられる。 M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シン
セシス (Peptide Synthesis), Interscience Publisher
s, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptid
e), Academic Press, New York (1965年) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株)
（1975年） 矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タン
パク質の化学IV、 205、(1977年) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合
成、広川書店 また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留
・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー
・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精
製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプ
チドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに
準じる方法によって適当な塩に変換することができる
し、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれ
に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換するこ
とができる。
【００２２】本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、上記した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織より
totalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用い
て直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain React
ion（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅す
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、または配列番号：
３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタン
パク質と実質的に同質の活性（例、ＮＫＧ２Ｄに対する
結合活性、免疫細胞の活性化作用など）を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよ
い。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリ
ウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０
ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６
５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ
で、温度が約６５℃の場合が好ましい。
しては、上記した本発明のタンパク質をコードする塩基
配列を含有するものであればいかなるものであってもよ
い。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、
上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組
織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれで
もよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリ
オファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなど
いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織より
totalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用い
て直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain React
ion（以下、ＲＴ-ＰＣＲ法と略称する）によって増幅す
ることもできる。本発明のタンパク質をコードするＤＮ
Ａとしては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配
列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、または配列番号：
３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のタン
パク質と実質的に同質の活性（例、ＮＫＧ２Ｄに対する
結合活性、免疫細胞の活性化作用など）を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよ
い。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリ
ウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０
ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６
５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ
で、温度が約６５℃の場合が好ましい。
【００２３】より具体的には、配列番号：４で表わされ
るアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
としては、配列番号：３で表わされる塩基配列を有する
ＤＮＡなどが用いられる。
るアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
としては、配列番号：３で表わされる塩基配列を有する
ＤＮＡなどが用いられる。
【００２４】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または
配列番号：３で表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本
発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ
などが用いられる。
としては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする
塩基配列を含有するものであればいかなるものであって
もよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリ
ー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞
・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいず
れでもよい。本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡ
としては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配列
を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または
配列番号：３で表わされる塩基配列とハイストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本
発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパ
ク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ
などが用いられる。
【００２５】本発明のタンパク質または部分ペプチド
（以下、これらタンパク質等をコードするＤＮＡのクロ
ーニングおよび発現の説明においては、これらタンパク
質等を単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成Ｄ
ＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増
幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを
本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする
ＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものと
のハイブリダイゼーションによって選別することができ
る。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J.
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 19
89）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡ
の塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-
G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））などを
用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの自体公知の
方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことが
できる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮ
Ａは目的によりそのまま、または、所望により制限酵素
で消化したり、リンカーを付加したりして使用すること
ができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドン
としてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コ
ドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していて
もよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、
適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもで
きる。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。
（以下、これらタンパク質等をコードするＤＮＡのクロ
ーニングおよび発現の説明においては、これらタンパク
質等を単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）
を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段として
は、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成Ｄ
ＮＡプライマーを用いて自体公知のＰＣＲ法によって増
幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを
本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする
ＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものと
のハイブリダイゼーションによって選別することができ
る。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J.
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 19
89）に記載の方法などに従って行なうことができる。ま
た、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説
明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡ
の塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-
G（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））などを
用いて、Gapped duplex法やKunkel法などの自体公知の
方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことが
できる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮ
Ａは目的によりそのまま、または、所望により制限酵素
で消化したり、リンカーを付加したりして使用すること
ができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドン
としてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コ
ドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していて
もよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、
適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもで
きる。本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、
（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的
とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適
当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ
とにより製造することができる。
【００２６】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモータ
ー、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。これ
らのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿
主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
Lプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモータ
ーなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモ
ーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモ
ーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、Ａ
ＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞であ
る場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモー
ターなどが好ましい。
ド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐ
ＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１
０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド
（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバ
クテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイル
ス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐ
Ａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳ
Ｖ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で
用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用い
る宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなる
ものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場
合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモータ
ー、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモータ
ー、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。これ
らのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモータ
ー、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿
主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ
Lプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモータ
ーなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１
プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモ
ーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモ
ーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、Ａ
ＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞であ
る場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモー
ターなどが好ましい。
【００２７】発現ベクターには、以上の他に、所望によ
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、組換え体細胞をチミジンを
含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列な
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラー
ゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、
ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフ
ェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などが
それぞれ利用できる。このようにして構築された本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを
用いて、形質転換体を製造することができる。
りエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加
シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以
下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有
しているものを用いることができる。選択マーカーとし
ては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒ
と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（Ｍ
ＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ
rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子
（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐
性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイ
ニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マ
ーカーとして使用する場合、組換え体細胞をチミジンを
含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じ
て、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質
のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である
場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列な
どが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラー
ゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列など
が、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、
ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場
合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフ
ェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などが
それぞれ利用できる。このようにして構築された本発明
のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを
用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２８】宿主としては、例えば、エシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０
巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９
巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕な
どが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチ
ルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、Ａ
Ｈ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピヒア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１
などが用いられる。
菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞な
どが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、
例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１
２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー
エスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０
巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・
アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９
巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecul
ar Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕な
どが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチ
ルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４
〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１
〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of
Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用
いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２、Ａ
Ｈ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ
−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccha
romyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３
６、ピヒア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１
などが用いられる。
【００２９】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡ
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７（以下、ＣＯＳ−７細胞と略記）、Ｖero，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略
記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マ
ウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細
胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。さ
らに、各種の正常ヒト細胞、例えば肝細胞、脾細胞、神
経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギ
ウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、
内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、
免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチ
ュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細
胞など）などを用いることも可能である。エシェリヒア
属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（G
ene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に
従って行なうことができる。
ｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodop
tera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia ni
の中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のH
igh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞または
Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイル
スがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mor
i N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞
としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ
２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In V
ivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫と
しては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田
ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８
５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−
７（以下、ＣＯＳ−７細胞と略記）、Ｖero，チャイニ
ーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略
記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞
ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マ
ウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細
胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。さ
らに、各種の正常ヒト細胞、例えば肝細胞、脾細胞、神
経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギ
ウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、
内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、
免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチ
ュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸
球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨
芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細
胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細
胞など）などを用いることも可能である。エシェリヒア
属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジ
イズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sc
i. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（G
ene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に
従って行なうことができる。
【００３０】バチルス属菌を形質転換するには、例え
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。
ば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティッ
クス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，
１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうこと
ができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシ
ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Na
tl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７
８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆
虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ
／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）
などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００３１】動物細胞を形質転換するには、例えば、細
胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−
２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Vi
rology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従
って行なうことができる。このようにして、タンパク質
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな
どがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長
促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８
が望ましい。
胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−
２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Vi
rology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従
って行なうことができる。このようにして、タンパク質
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体を得ることができる。宿主がエシェリ
ヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する
際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であ
り、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒
素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源として
は、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、
ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カル
シウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな
どがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長
促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８
が望ましい。
【００３２】エシェリヒア属菌を培養する際の培地とし
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。
ては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journa
l of Experiments in Molecular Genetics），４３１−
４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１
９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを
効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルア
クリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエ
シェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約
３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加える
こともできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常
約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通
気や撹拌を加えることもできる。
【００３３】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkho
lder）最少培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３
３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜
８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５
℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌
を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体
を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium
（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞
外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkho
lder）最少培地〔Bostian, K. L. ら、プロシージング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Aca
d. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や
０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A.
ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３
３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜
８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５
℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌
を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体
を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium
（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(196
2)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加え
たものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．
４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３
〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿
主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ
培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９
５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），
８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地
〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・ア
ソシエーション（The Journal of the American Medica
l Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９
９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フ
ォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding o
fthe Society for the Biological Medicine），７３
巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８
であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約
１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞
外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００３４】上記培養物から本発明のタンパク質を分離
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるい
は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにし
て得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタン
パク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合
わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分
子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆
相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用
する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す
る方法などが用いられる。
精製するには、例えば、下記の方法により行なうことが
できる。本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により
タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場
合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるい
は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにし
て得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタン
パク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適宜組み合
わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分
子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆
相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用
する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す
る方法などが用いられる。
【００３５】かくして得られるタンパク質が遊離体で得
られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られ
た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
より、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の存在または活性は、標識したリガンドとの結合実験
および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなど
により測定することができる。
られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる
方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られ
た場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法に
より、遊離体または他の塩に変換することができる。な
お、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精
製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任
意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去する
こともできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプ
シン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら
れる。かくして生成する本発明のタンパク質またはその
塩の存在または活性は、標識したリガンドとの結合実験
および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなど
により測定することができる。
【００３６】本発明のタンパク質もしくは部分ペプチド
またはその塩に対する抗体は、本発明のタンパク質もし
くは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれ
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れで
あってもよい。本発明のタンパク質もしくは部分ペプチ
ドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これら
タンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する場合
がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原と
して用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。
またはその塩に対する抗体は、本発明のタンパク質もし
くは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれ
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れで
あってもよい。本発明のタンパク質もしくは部分ペプチ
ドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これら
タンパク質等を単に本発明のタンパク質と略記する場合
がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原と
して用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従っ
て製造することができる。
【００３７】〔モノクローナル抗体の作製〕 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後に記載
する標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗
体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なう
ことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、
495 (1975)〕に従い、実施することができる。融合促進
剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましく
はＰＥＧが用いられる。
体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤と
ともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるた
め、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントア
ジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に
１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血
動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげら
れるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モ
ノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免
疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められ
た個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリン
パ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種ま
たは異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することが
できる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後に記載
する標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗
体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なう
ことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、
495 (1975)〕に従い、実施することができる。融合促進
剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましく
はＰＥＧが用いられる。
【００３８】骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいは
それに準じる方法に従って行なうことができる。通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を
添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別お
よび育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できる
ものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１
〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含
むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリ
ドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄
腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられ
る。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細
胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、
ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）
が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベート
することにより効率よく細胞融合を実施できる。モノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには
種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を
直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体
（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス
免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡ
を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する
方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着
させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性
物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結
合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げら
れる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいは
それに準じる方法に従って行なうことができる。通常Ｈ
ＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を
添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別お
よび育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できる
ものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１
〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含む
ＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含
むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリ
ドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬
（株））などを用いることができる。培養温度は、通常
２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間
は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間であ
る。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができ
る。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清
中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３９】（ｂ）モノクロナール抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。
えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アル
コール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換
体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ
過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロ
テインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結
合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行な
うことができる。
【００４０】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポ
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー
蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体
の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物
から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取し
て、抗体の分離精製を行なうことにより製造することが
できる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原
とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白
質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キ
ャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が
効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋
させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサ
イログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１
に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で
カプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャ
リアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることが
できるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレ
イミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を
含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物
は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自
体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際
して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバ
ントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取することができる。抗血清中のポリクロー
ナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と
同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製
は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫
グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
リクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じ
る方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗
原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアー
蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体
の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物
から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取し
て、抗体の分離精製を行なうことにより製造することが
できる。温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原
とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白
質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キ
ャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が
効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋
させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサ
イログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１
に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で
カプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャ
リアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることが
できるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレ
イミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を
含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物
は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自
体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際
して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバ
ントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ
い。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１
０回程度行なわれる。ポリクローナル抗体は、上記の方
法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは
血液から採取することができる。抗血清中のポリクロー
ナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と
同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製
は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫
グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４１】以下に、本発明のタンパク質もしくは部分
ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質等と
略記する場合がある）、および本発明のタンパク質もし
くは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本
発明の抗体と略記する場合がある）の用途を説明する。
ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質等と
略記する場合がある）、および本発明のタンパク質もし
くは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本
発明の抗体と略記する場合がある）の用途を説明する。
【００４２】（１）本発明のタンパク質等を含有する各
種疾病の治療・予防剤 本発明のタンパク質等は免疫細胞等で発現の見られる受
容体であるＮＫＧ２Ｄに対する結合活性を有している。
ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞を中心として一分のＴ細胞でも発
現しており、これらの細胞を活性化する受容体として知
られている。したがって、本発明のタンパク質用はＮＫ
Ｇ２Ｄを介して免疫細胞を活性化する作用が期待でき
る。その用途として、様々な疾患に対して、免疫賦活作
用による治療や予防に使用することができる。すなわち
細菌や新菌、ウイルス感染疾患に対する治療および予防
剤の他、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、
大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、
黒色腫等）などの疾病の治療・予防剤などの疾病の治療
・予防剤などの医薬として使用できる。特に各種癌に対
しては、免疫賦活作用に基いて癌腫摘出後の再発予防お
よび根治のための医薬として有用である。本発明のタン
パク質等を上記の治療・予防剤として使用する場合は、
少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好まし
くは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製さ
れたものを使用するのが好ましい。
種疾病の治療・予防剤 本発明のタンパク質等は免疫細胞等で発現の見られる受
容体であるＮＫＧ２Ｄに対する結合活性を有している。
ＮＫＧ２ＤはＮＫ細胞を中心として一分のＴ細胞でも発
現しており、これらの細胞を活性化する受容体として知
られている。したがって、本発明のタンパク質用はＮＫ
Ｇ２Ｄを介して免疫細胞を活性化する作用が期待でき
る。その用途として、様々な疾患に対して、免疫賦活作
用による治療や予防に使用することができる。すなわち
細菌や新菌、ウイルス感染疾患に対する治療および予防
剤の他、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、
大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、
黒色腫等）などの疾病の治療・予防剤などの疾病の治療
・予防剤などの医薬として使用できる。特に各種癌に対
しては、免疫賦活作用に基いて癌腫摘出後の再発予防お
よび根治のための医薬として有用である。本発明のタン
パク質等を上記の治療・予防剤として使用する場合は、
少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好まし
くは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製さ
れたものを使用するのが好ましい。
【００４３】本発明のタンパク質等は、例えば、必要に
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。
応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、
マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水も
しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶
液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用
できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認
められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安
定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に
要求される単位用量形態で混和することによって製造す
ることができる。これら製剤における有効成分量は指示
された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ
る。
【００４４】錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。
きる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスター
チ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性
セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチ
ン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグ
ネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリ
ンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチ
ェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態
がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに
油脂のような液状担体を含有することができる。注射の
ための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性
物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など
を溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って
処方することができる。注射用の水性液としては、例え
ば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張
液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩
化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助
剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、
ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリ
エチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例
えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）など
と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、
大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベン
ジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。ま
た、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム
緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウ
ム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清
アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤
（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸
化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、
通常、適当なアンプルに充填される。
【００４５】このようにして得られる製剤は、安全で低
毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対
して投与することができる。本発明のタンパク質等の投
与量は、対象疾患、投与対象などにより差異はあるが、
例えば、抗癌剤として本発明のタンパク質等を投与する
場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一
日につき該タンパク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、
好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．
０〜２０ｍｇ投与する。
毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例え
ば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツ
ジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対
して投与することができる。本発明のタンパク質等の投
与量は、対象疾患、投与対象などにより差異はあるが、
例えば、抗癌剤として本発明のタンパク質等を投与する
場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一
日につき該タンパク質等を約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、
好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．
０〜２０ｍｇ投与する。
【００４６】（２）疾病に対する医薬候補化合物のスク
リーニング 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその
塩、すなわち本発明のタンパク質のアンタゴニストは、
免疫細胞を抑制する作用が期待できる。その用途とし
て、自己免疫疾患や感染性の免疫過剰反応等の各種疾患
に対して、さらに臓器や組織の移植後に拒絶反応抑制の
ため、免疫抑制剤や抗炎症剤として使用することができ
る。また、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物
またはその塩、すなわち本発明のタンパク質のアゴニス
トは、本発明のタンパク質同様、様々な疾患に対して、
免疫賦活作用による治療や予防に使用することができ
る。すなわち細菌や新菌、ウイルス感染疾患に対する治
療および予防剤の他、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜
腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽
腫、膀胱癌、黒色腫等）などの疾病の治療・予防剤など
の疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。し
たがって、本発明のタンパク質等は、本発明のタンパク
質等によるＮＫＧ２Ｄに対する結合または免疫細胞の活
性化を促進または阻害する活性を有する化合物またはそ
の塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、 １．本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク
質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のＮＫＧ２Ｄ
に対する結合または免疫細胞の活性化を促進または阻害
する活性を有する化合物（「（２）疾病に対する医薬候
補化合物のスクリーニング」において促進剤または阻害
剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法
（「（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニン
グ」において本発明のスクリーニング方法と称すること
もある）、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩を含有することを特徴とする阻害剤の
スクリーニング用キット（「（２）疾病に対する医薬候
補化合物のスクリーニング」において本発明のスクリー
ニング用キットと称することもある）を提供し、より具
体的には、例えば、 ２．（ｉ）本発明のタンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩に基質を接触させた場合と（ii）本発
明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
に基質および試験化合物を接触させた場合との比較を行
なうことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法、
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ
の塩および基質を含有することを特徴とする阻害剤のス
クリーニング用キットを提供する。具体的には、上記ス
クリーニング方法、スクリーニング用キットにおいて
は、例えば、（ｉ）と（ii）の場合における、本発明の
タンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対する結合または免疫細胞
の活性化などを測定して、比較することを特徴とするも
のである。
リーニング 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその
塩、すなわち本発明のタンパク質のアンタゴニストは、
免疫細胞を抑制する作用が期待できる。その用途とし
て、自己免疫疾患や感染性の免疫過剰反応等の各種疾患
に対して、さらに臓器や組織の移植後に拒絶反応抑制の
ため、免疫抑制剤や抗炎症剤として使用することができ
る。また、本発明のタンパク質の活性を促進する化合物
またはその塩、すなわち本発明のタンパク質のアゴニス
トは、本発明のタンパク質同様、様々な疾患に対して、
免疫賦活作用による治療や予防に使用することができ
る。すなわち細菌や新菌、ウイルス感染疾患に対する治
療および予防剤の他、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜
腫瘍、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽
腫、膀胱癌、黒色腫等）などの疾病の治療・予防剤など
の疾病の治療・予防剤などの医薬として使用できる。し
たがって、本発明のタンパク質等は、本発明のタンパク
質等によるＮＫＧ２Ｄに対する結合または免疫細胞の活
性化を促進または阻害する活性を有する化合物またはそ
の塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、 １．本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドま
たはその塩を用いることを特徴とする本発明のタンパク
質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のＮＫＧ２Ｄ
に対する結合または免疫細胞の活性化を促進または阻害
する活性を有する化合物（「（２）疾病に対する医薬候
補化合物のスクリーニング」において促進剤または阻害
剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法
（「（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニン
グ」において本発明のスクリーニング方法と称すること
もある）、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩を含有することを特徴とする阻害剤の
スクリーニング用キット（「（２）疾病に対する医薬候
補化合物のスクリーニング」において本発明のスクリー
ニング用キットと称することもある）を提供し、より具
体的には、例えば、 ２．（ｉ）本発明のタンパク質もしくはその部分ペプ
チドまたはその塩に基質を接触させた場合と（ii）本発
明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩
に基質および試験化合物を接触させた場合との比較を行
なうことを特徴とする阻害剤のスクリーニング方法、
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそ
の塩および基質を含有することを特徴とする阻害剤のス
クリーニング用キットを提供する。具体的には、上記ス
クリーニング方法、スクリーニング用キットにおいて
は、例えば、（ｉ）と（ii）の場合における、本発明の
タンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対する結合または免疫細胞
の活性化などを測定して、比較することを特徴とするも
のである。
【００４７】本発明のタンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対す
る結合および免疫細胞の活性化は、自体公知の方法ある
いはそれに準じる方法などに従って測定することができ
る。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。基質としては、本発明のタ
ンパク質等の基質となり得るものであれば何れのもので
もよい。
る結合および免疫細胞の活性化は、自体公知の方法ある
いはそれに準じる方法などに従って測定することができ
る。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパ
ク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細
胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげら
れ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公
知の化合物であってもよい。基質としては、本発明のタ
ンパク質等の基質となり得るものであれば何れのもので
もよい。
【００４８】例えば、上記（ii）の場合におけるＮＫＧ
２Ｄに対する結合または免疫細胞の活性化を上記（ｉ）
の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以
上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物
を、本発明のタンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対する結合ま
たは免疫細胞の活性化をそれぞれ阻害する化合物として
選択することができる。また、上記（ii）の場合におけ
るＮＫＧ２Ｄに対する結合または免疫細胞の活性化を上
記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約
３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験
化合物を、本発明のタンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対する
結合または免疫細胞の活性化をそれぞれ促進する化合物
として選択することができる。
２Ｄに対する結合または免疫細胞の活性化を上記（ｉ）
の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約３０％以
上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物
を、本発明のタンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対する結合ま
たは免疫細胞の活性化をそれぞれ阻害する化合物として
選択することができる。また、上記（ii）の場合におけ
るＮＫＧ２Ｄに対する結合または免疫細胞の活性化を上
記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは約
３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験
化合物を、本発明のタンパク質等のＮＫＧ２Ｄに対する
結合または免疫細胞の活性化をそれぞれ促進する化合物
として選択することができる。
【００４９】本発明のスクリーニング用キットは、本発
明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を
含有するものである。本発明のスクリーニング用キット
の例としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 １．測定用緩衝液 FBS（ウシ胎児血清）を含有するリン酸緩衝液 ｐＨ７．５のTris−ＨＣlバッファー（ＭｇＣｌ2、ＥＤ
ＴＡ含有） ２．タンパク質標品 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩とFcとの融合タンパク ３．KG2Dソース KG2D 発現 CHO-K1 細胞 ４．標識化抗体 抗ヒト IgG (Fc)-FITCコンジュゲート ５．検出 フローサイトメーター 〔測定法〕KG2D 発現 CHO-K1 細胞に、上記タンパク質
標品および試験化合物を加え、抗ヒト IgG (Fc)-FITCコ
ンジュゲートで標識を行い、フローサイトメータでKG2D
との結合を測定する。本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また
はその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿な
どから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の
ＮＫＧ２Ｄに対する結合を阻害する活性を有する化合物
である。該化合物の塩としては、上記した本発明のタン
パク質の塩と同様のものが用いられる。
明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を
含有するものである。本発明のスクリーニング用キット
の例としては、次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕 １．測定用緩衝液 FBS（ウシ胎児血清）を含有するリン酸緩衝液 ｐＨ７．５のTris−ＨＣlバッファー（ＭｇＣｌ2、ＥＤ
ＴＡ含有） ２．タンパク質標品 本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの
塩とFcとの融合タンパク ３．KG2Dソース KG2D 発現 CHO-K1 細胞 ４．標識化抗体 抗ヒト IgG (Fc)-FITCコンジュゲート ５．検出 フローサイトメーター 〔測定法〕KG2D 発現 CHO-K1 細胞に、上記タンパク質
標品および試験化合物を加え、抗ヒト IgG (Fc)-FITCコ
ンジュゲートで標識を行い、フローサイトメータでKG2D
との結合を測定する。本発明のスクリーニング方法また
はスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また
はその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、
タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産
物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿な
どから選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質等の
ＮＫＧ２Ｄに対する結合を阻害する活性を有する化合物
である。該化合物の塩としては、上記した本発明のタン
パク質の塩と同様のものが用いられる。
【００５０】本発明のスクリーニング方法またはスクリ
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上記の治療
・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施す
ることができる。例えば、上記した本発明のタンパク質
等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液
剤などとすることができる。このようにして得られる製
剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血
動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て投与することができる。該化合物またはその塩の投与
量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、自己免疫疾患の治療目的
で本発明のタンパク質等の細胞増殖活性を阻害する活性
を有する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体
重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を
約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対
象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、自己免
疫疾患の治療目的で本発明のタンパク質等の細胞増殖活
性を阻害する活性を有する化合物を注射剤の形で通常成
人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化
合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。上記のスクリーニング方法を実施するに
は、本発明のタンパク質等を、スクリーニングに適した
バッファーに懸濁することにより本発明のタンパク質等
の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０
（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ト
リス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク質等と
試験化合物との反応を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。
ーニング用キットを用いて得られる化合物を上記の治療
・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施す
ることができる。例えば、上記した本発明のタンパク質
等を含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エ
リキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液
剤などとすることができる。このようにして得られる製
剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血
動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブ
タ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サルなど）に対し
て投与することができる。該化合物またはその塩の投与
量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなど
により差異はあるが、例えば、自己免疫疾患の治療目的
で本発明のタンパク質等の細胞増殖活性を阻害する活性
を有する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体
重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を
約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍ
ｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経
口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対
象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、自己免
疫疾患の治療目的で本発明のタンパク質等の細胞増殖活
性を阻害する活性を有する化合物を注射剤の形で通常成
人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化
合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１
〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程
度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動
物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与するこ
とができる。上記のスクリーニング方法を実施するに
は、本発明のタンパク質等を、スクリーニングに適した
バッファーに懸濁することにより本発明のタンパク質等
の標品を調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０
（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ト
リス−塩酸バッファーなどの、本発明のタンパク質等と
試験化合物との反応を阻害しないバッファーであればい
ずれでもよい。
【００５１】（３）本発明のタンパク質もしくはその部
分ペプチドまたはその塩の定量 本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質等を
特異的に認識することができるので、被検液中の本発明
のタンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法に
よる定量などに使用することができる。すなわち、本発
明は、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化され
た本発明のタンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体
に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を
測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク
質等の定量法、および（ii）被検液と担体上に不溶化し
た本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体と
を同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の
本発明のタンパク質等の定量法を提供する。上記（ii）
の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質
等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタ
ンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが望まし
い。
分ペプチドまたはその塩の定量 本発明のタンパク質等に対する抗体（以下、本発明の抗
体と略記する場合がある）は、本発明のタンパク質等を
特異的に認識することができるので、被検液中の本発明
のタンパク質等の定量、特にサンドイッチ免疫測定法に
よる定量などに使用することができる。すなわち、本発
明は、（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化され
た本発明のタンパク質等とを競合的に反応させ、該抗体
に結合した標識化された本発明のタンパク質等の割合を
測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク
質等の定量法、および（ii）被検液と担体上に不溶化し
た本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体と
を同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の
本発明のタンパク質等の定量法を提供する。上記（ii）
の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質
等のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタ
ンパク質等のＣ端部に反応する抗体であることが望まし
い。
【００５２】また、本発明のタンパク質等に対するモノ
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定
量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこと
もできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用い
てもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あ
るいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用い
る本発明のタンパク質等の定量法は、特に制限されるべ
きものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパ
ク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合
体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを
既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線よ
り算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いても
よい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリ
ック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後に記載するサンドイッチ法を用い
るのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いら
れる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、
蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素
としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、
〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクト
シダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用
いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。
クローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と
称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質等の定
量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこと
もできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用い
てもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あ
るいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用い
る本発明のタンパク質等の定量法は、特に制限されるべ
きものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパ
ク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合
体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを
既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線よ
り算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いても
よい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリ
ック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感
度、特異性の点で、後に記載するサンドイッチ法を用い
るのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いら
れる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、
蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素
としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、
〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で
比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクト
シダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用
いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミ
ン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられ
る。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノー
ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられ
る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ
チン−アビジン系を用いることもできる。
【００５３】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また、通常、タンパク質あるい
は酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合
を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デ
キストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチ
レン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あ
るいはガラス等があげられる。サンドイッチ法において
は不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反
応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモ
ノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次
反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行
なってもよいし、時間をずらして行なってもよい。標識
化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることが
できる。また、サンドイッチ法による免疫測定法におい
て、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は
必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させ
る等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよ
い。本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質
等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられ
る本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質
等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられ
る。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗
体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の
タンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用い
られる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を
認識する抗体が用いられる。
理吸着を用いてもよく、また、通常、タンパク質あるい
は酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合
を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デ
キストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチ
レン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あ
るいはガラス等があげられる。サンドイッチ法において
は不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反
応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモ
ノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中
の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次
反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行
なってもよいし、時間をずらして行なってもよい。標識
化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることが
できる。また、サンドイッチ法による免疫測定法におい
て、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は
必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させ
る等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよ
い。本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質
等の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられ
る本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質
等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられ
る。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗
体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の
タンパク質等のＣ端部を認識する場合、１次反応で用い
られる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を
認識する抗体が用いられる。
【００５４】本発明のモノクローナル抗体をサンドイッ
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
チ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメト
リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることがで
きる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体
に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原
(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し
（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被
検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として
可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコー
ル、上記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、お
よび、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるい
は、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリ
ック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の
標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離
するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５５】これら個々の免疫学的測定法を本発明の定
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛
編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量
することができる。さらには、本発明の抗体を用いて本
発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、本
発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合、例
えば、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、大
腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、黒
色腫等）などの疾病である、または将来罹患する可能性
が高いと診断することができる。また、本発明の抗体
は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン
パク質等を検出するために使用することができる。ま
た、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗
体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク
質等の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の
挙動の分析などのために使用することができる。
量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の
設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の
条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発
明のタンパク質等の測定系を構築すればよい。これらの
一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを
参照することができる。例えば、入江 寛編「ラジオイ
ムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛
編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭
和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第
２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年
発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochem
ical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochem
ical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochem
ical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochem
ical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、
同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Mono
clonal Antibodies and General Immunoassay Method
s))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part
I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodie
s))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照する
ことができる。以上のようにして、本発明の抗体を用い
ることによって、本発明のタンパク質等を感度良く定量
することができる。さらには、本発明の抗体を用いて本
発明のタンパク質等の濃度を定量することによって、本
発明のタンパク質等の濃度の減少が検出された場合、例
えば、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳癌、大
腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱癌、黒
色腫等）などの疾病である、または将来罹患する可能性
が高いと診断することができる。また、本発明の抗体
は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタン
パク質等を検出するために使用することができる。ま
た、本発明のタンパク質等を精製するために使用する抗
体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク
質等の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の
挙動の分析などのために使用することができる。
【００５６】（４）本発明の抗体を含有する医薬 本発明のタンパク質等の活性を中和する作用を有する本
発明の抗体（中和抗体）は、例えば、自己免疫疾患や感
染性の免疫過剰反応等の各種疾患に対して、さらに臓器
や組織の移植後に拒絶反応抑制のため、免疫抑制剤や抗
炎症剤として使用することができる。以下、「（４）本
発明の抗体を含有する医薬」において、本発明の中和抗
体を本発明の抗体と称する場合がある。本発明の抗体を
含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤とし
て、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは
哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的
に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾
患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例え
ば、成人の自己免疫疾患患者の治療・予防のために使用
する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.
０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１
０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍ
ｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１
日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合で
ある。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準
ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合に
は、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体
は、それ自体または適当な医薬組成物として投与するこ
とができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記
またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤も
しくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経
口または非経口投与に適する剤形として提供される。す
なわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固
体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィル
ムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプ
セル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知
の方法によって製造され、製剤分野において通常用いら
れる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものであ
る。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、で
んぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いら
れる。
発明の抗体（中和抗体）は、例えば、自己免疫疾患や感
染性の免疫過剰反応等の各種疾患に対して、さらに臓器
や組織の移植後に拒絶反応抑制のため、免疫抑制剤や抗
炎症剤として使用することができる。以下、「（４）本
発明の抗体を含有する医薬」において、本発明の中和抗
体を本発明の抗体と称する場合がある。本発明の抗体を
含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤とし
て、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは
哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、
ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的
に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾
患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例え
ば、成人の自己免疫疾患患者の治療・予防のために使用
する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.
０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１
０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍ
ｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１
日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合で
ある。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準
ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合に
は、その症状に応じて増量してもよい。本発明の抗体
は、それ自体または適当な医薬組成物として投与するこ
とができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記
またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤も
しくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経
口または非経口投与に適する剤形として提供される。す
なわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固
体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィル
ムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプ
セル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳
剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知
の方法によって製造され、製剤分野において通常用いら
れる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものであ
る。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、で
んぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いら
れる。
【００５７】非経口投与のための組成物としては、例え
ば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射
剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方
法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射
剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁
または乳化することによって調製する。注射用の水性液
としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補
助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、
例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコー
ル（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、
ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of
hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通
常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられ
る坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に
混合することによって調製される。上記の経口用または
非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよ
うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。
かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル
剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞ
れの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ
注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２
５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお、上記した各組成物は、上記抗体との配合により好
ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有
してもよい。
ば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射
剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤
などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方
法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射
剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁
または乳化することによって調製する。注射用の水性液
としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補
助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、
例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコー
ル（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、
ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of
hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。
油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通
常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられ
る坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に
混合することによって調製される。上記の経口用または
非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するよ
うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。
かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル
剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞ
れの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ
注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２
５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお、上記した各組成物は、上記抗体との配合により好
ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有
してもよい。
【００５８】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｉ ：イノシン Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ） Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ） Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ） Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ） Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｉ ：イノシン Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ） Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ） Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ） Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ） Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ） Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ） ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
【００５９】 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
【００６０】また、本明細書中で繁用される置換基、保
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ2−Bzl ：２，６−ジクロロベンジル ＭＢｚｌ ：メトキシベンジル ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＭＦ ：N、N−ジメチルホルムアミド ＴＥＡ ：トリエチルアミン ＷＳＣＤ ：１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル） −カルボジイミド ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
護基および試薬を下記の記号で表記する。 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基 Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ2−Bzl ：２，６−ジクロロベンジル ＭＢｚｌ ：メトキシベンジル ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェニル Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＭＦ ：N、N−ジメチルホルムアミド ＴＥＡ ：トリエチルアミン ＷＳＣＤ ：１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル） −カルボジイミド ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００６１】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 配列番号：１ 実施例１で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：２ 実施例１で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：３ 配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 配列番号：４ 本発明のヒト由来タンパク質（ＣＳＰ２タンパク質）の
アミノ酸配列を示す。 配列番号：５ 実施例２で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：６ 実施例２で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：７ FLAG 配列を示す。 配列番号：８ 実施例６で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：９ 実施例６で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：１０ 実施例６で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：１１ 実施例７で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：１２ 実施例７で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。
配列を示す。 配列番号：１ 実施例１で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：２ 実施例１で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：３ 配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有する本発明
のヒト由来タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を
示す。 配列番号：４ 本発明のヒト由来タンパク質（ＣＳＰ２タンパク質）の
アミノ酸配列を示す。 配列番号：５ 実施例２で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：６ 実施例２で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：７ FLAG 配列を示す。 配列番号：８ 実施例６で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：９ 実施例６で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：１０ 実施例６で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：１１ 実施例７で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。 配列番号：１２ 実施例７で用いられたプライマー（合成）ＤＮＡの塩基
配列を示す。
【００６２】以下の実施例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐＣ
Ｒ２．１−ＣＳＰ２は、平成１２年３月１６日から茨城
県つくば市東１−１−１ 中央第６の独立行政法人産業
技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に
寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９１として、平成１２年
２月１６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−
８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６３６３として寄託されている。
ェリヒア・コリ（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐＣ
Ｒ２．１−ＣＳＰ２は、平成１２年３月１６日から茨城
県つくば市東１−１−１ 中央第６の独立行政法人産業
技術総合研究所 特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に
寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９１として、平成１２年
２月１６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−
８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６３６３として寄託されている。
【００６３】
【実施例】以下に、実施例をあげて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）に記載され
ている方法に従った。 実施例１ ＣＳＰ２ｃＤＮＡのクローニング ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Marathon-ReadyTM cDNA；Clontech
社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配
列番号：１）およびプライマー２（配列番号：２）を用
いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応には Advantage 2 P
olymerase Mixture（ Clontech 社）を用い、９５
℃、１分の後、９５℃、３０秒、６２℃、３０秒、６
８℃、２分を３０回の後、６８℃、５分の伸長反応を
行なった。反応後、反応産物をＴＡクローニングキット
（Invitrogen 社）の処方に従い、プラスミドベクター
ｐＣＲ２．１（ Invitrogen 社）へクローニングした。
個々のクローンの配列を解析した結果、新規分泌タンパ
クをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３）を得た。
このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列配列番号：
４）をＣＳＰ２と命名した。配列番号：３で表わされる
ｃＤＮＡを含有する形質転換体をエシェリヒア・コリ
（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ＣＳ
Ｐ２と命名した。
的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではな
い。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）に記載され
ている方法に従った。 実施例１ ＣＳＰ２ｃＤＮＡのクローニング ヒト腎臓ｃＤＮＡ（Marathon-ReadyTM cDNA；Clontech
社）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配
列番号：１）およびプライマー２（配列番号：２）を用
いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応には Advantage 2 P
olymerase Mixture（ Clontech 社）を用い、９５
℃、１分の後、９５℃、３０秒、６２℃、３０秒、６
８℃、２分を３０回の後、６８℃、５分の伸長反応を
行なった。反応後、反応産物をＴＡクローニングキット
（Invitrogen 社）の処方に従い、プラスミドベクター
ｐＣＲ２．１（ Invitrogen 社）へクローニングした。
個々のクローンの配列を解析した結果、新規分泌タンパ
クをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３）を得た。
このｃＤＮＡより導き出されるアミノ酸配列配列番号：
４）をＣＳＰ２と命名した。配列番号：３で表わされる
ｃＤＮＡを含有する形質転換体をエシェリヒア・コリ
（Escherichia coli)ＪＭ１０９／ｐＣＲ２．１−ＣＳ
Ｐ２と命名した。
【００６４】実施例２ ＣＳＰ２の動物細胞での発現ベクターの構築 ＣＳＰ２を動物細胞中で発現させるための発現ベクター
は、ＣＳＰ２をコードするオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ断片を、動物細胞用発現ベク
ター pCAN618FLAG に挿入することによって得た。pCAN6
18FLAG はプラスミドベクター pCAN618（国際出願；Ｐ
ＣＴ ＪＰ００／０５６８５号）に由来し、Sal I 部位
直後に存在する８アミノ酸の FLAG 配列（配列番号：
７；Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）をコードする
塩基配列と終止コドンにＯＲＦを合わせることで、該目
的タンパクを FLAG 融合タンパクとして発現させること
が可能である。まずＣＳＰ２タンパクをコードしている
cDNA を鋳型にして、翻訳開始コドンの直前に制限酵素
Mfe I 認識部位がくるように設計した合成 DNA（配列
番号：５）と、ＣＳＰ２タンパクの 222 番目のアミノ
酸の後に制限酵素 SalI 認識部位がくるように設計した
合成 DNA（配列番号：６）を用いてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ反応には Advantage 2 Polymerase Mixture（ Cl
ontech 社）を用い、 94℃ 1 分の後、 98℃ 10
秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分を 30 回の後、 72℃
10 分の伸長反応を行なってＣＳＰ２のＯＲＦを含むＤ
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を TA Cloning Kit（
Invitrogen 社）の処方に従い、プラスミドベクター pV
R2.1-TOPO（ Invitrogen 社）へクローニングした。得
られたプラスミドを制限酵素 Mfe I 及び Sal I で切断
して挿入断片を回収し、pCAN618FLAG の Eco RI／Sal I
部位に挿入してヒトＣＳＰ２タンパクの動物細胞での
発現ベクター pCAN618／CSP2-FLAG を得た。
は、ＣＳＰ２をコードするオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ断片を、動物細胞用発現ベク
ター pCAN618FLAG に挿入することによって得た。pCAN6
18FLAG はプラスミドベクター pCAN618（国際出願；Ｐ
ＣＴ ＪＰ００／０５６８５号）に由来し、Sal I 部位
直後に存在する８アミノ酸の FLAG 配列（配列番号：
７；Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）をコードする
塩基配列と終止コドンにＯＲＦを合わせることで、該目
的タンパクを FLAG 融合タンパクとして発現させること
が可能である。まずＣＳＰ２タンパクをコードしている
cDNA を鋳型にして、翻訳開始コドンの直前に制限酵素
Mfe I 認識部位がくるように設計した合成 DNA（配列
番号：５）と、ＣＳＰ２タンパクの 222 番目のアミノ
酸の後に制限酵素 SalI 認識部位がくるように設計した
合成 DNA（配列番号：６）を用いてＰＣＲを行なった。
ＰＣＲ反応には Advantage 2 Polymerase Mixture（ Cl
ontech 社）を用い、 94℃ 1 分の後、 98℃ 10
秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分を 30 回の後、 72℃
10 分の伸長反応を行なってＣＳＰ２のＯＲＦを含むＤ
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を TA Cloning Kit（
Invitrogen 社）の処方に従い、プラスミドベクター pV
R2.1-TOPO（ Invitrogen 社）へクローニングした。得
られたプラスミドを制限酵素 Mfe I 及び Sal I で切断
して挿入断片を回収し、pCAN618FLAG の Eco RI／Sal I
部位に挿入してヒトＣＳＰ２タンパクの動物細胞での
発現ベクター pCAN618／CSP2-FLAG を得た。
【００６５】実施例３ ＣＳＰ２のＣＯＳ−７細胞での
発現 ＣＯＳ−７細胞 2×106 を、10％ の FBS（ウシ胎児血
清）を含む DMEM（培地； GibcoBRL ）中、10 cm シャ
ーレで 24 時間培養した。これに、実施例２で得た発現
ベクター pCAN618／CSP2-FLAG または対照ベクターpCAN
618を、LipofectAMINE（ GibcoBRL ）を用いて細胞に導
入し、さらに 18 時間培養した。次に培地を 0.05％ CH
APS を含む Opti-MEM（培地；GibcoBRL ）に換えてさら
に 24 時間培養し、培養上清を回収した。遠心によって
浮いている細胞を除いた後、上清１μｌに2-メルカプト
エタノールを含む同量の SDS-Sample Buffer を加えて
16%Peptide-PAGE（ TEFCO ）で電気泳動し、これを PVD
F 膜（ Amersham ）に電気的に移した。一次抗体として
抗 FLAG 抗体（マウス IgG；Sigma ）を用い、二次抗体
にはHRP（Horseraddish peroxidase；西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）標識抗マウス IgG 抗体（ Amersham ）を
用いた。発色は、ECLplus ウエスタンブロット検出シス
テム（Western Blot Detection System）（ Amersham
）を用いて５分間露光して行なった。結果は図１に示
す。図１中、レーン２は発現ベクター（pCAN618／CSP2-
FLAG）であり、レーン１は対照プラスミド（pCAN618）
である。図１から明らかなように、抗 FLAG 抗体で認識
される産物を培養上清中に確認した。
発現 ＣＯＳ−７細胞 2×106 を、10％ の FBS（ウシ胎児血
清）を含む DMEM（培地； GibcoBRL ）中、10 cm シャ
ーレで 24 時間培養した。これに、実施例２で得た発現
ベクター pCAN618／CSP2-FLAG または対照ベクターpCAN
618を、LipofectAMINE（ GibcoBRL ）を用いて細胞に導
入し、さらに 18 時間培養した。次に培地を 0.05％ CH
APS を含む Opti-MEM（培地；GibcoBRL ）に換えてさら
に 24 時間培養し、培養上清を回収した。遠心によって
浮いている細胞を除いた後、上清１μｌに2-メルカプト
エタノールを含む同量の SDS-Sample Buffer を加えて
16%Peptide-PAGE（ TEFCO ）で電気泳動し、これを PVD
F 膜（ Amersham ）に電気的に移した。一次抗体として
抗 FLAG 抗体（マウス IgG；Sigma ）を用い、二次抗体
にはHRP（Horseraddish peroxidase；西洋ワサビペルオ
キシダーゼ）標識抗マウス IgG 抗体（ Amersham ）を
用いた。発色は、ECLplus ウエスタンブロット検出シス
テム（Western Blot Detection System）（ Amersham
）を用いて５分間露光して行なった。結果は図１に示
す。図１中、レーン２は発現ベクター（pCAN618／CSP2-
FLAG）であり、レーン１は対照プラスミド（pCAN618）
である。図１から明らかなように、抗 FLAG 抗体で認識
される産物を培養上清中に確認した。
【００６６】実施例４ CSP2 タンパクの COS7 細胞培
養上清からの精製 実施例３において CSP2 タンパクが COS7 細胞培養上清
中に分泌されることが確認されたので、CSP2-FLAG タン
パクを COS7 細胞培養上清中から精製した。実施例２で
得た発現ベクターを実施例３の方法に従って 10 cm シ
ャーレ 30 枚のCOS7 細胞に導入し、培養上清を回収し
た。回収した培養上清は遠心によって細胞等を除いた
後、anti-FLAG M2-agarose affinity gel（ SIGMA 社）
に吸着させ、FLAG peptide（配列番号：７；Asp-Tyr-Ly
s-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys ）で目的タンパクを溶出し
た。この溶出液を TBS 緩衝液（ pH 7.2 ）に対して透
析し、Centricon-10（ Amicon 社）を用いて 500μl に
まで濃縮し、精製標品を得た。これを SDS-PAGE にかけ
て銀染色を行なったところ、約 40 kDa の位置にブロー
ドなバンドが検出された。またこれを Micro BCA Prote
in Assay Kit（ Piercr社）を用いてタンパク定量した
ところ、15μg のタンパクが得られた。
養上清からの精製 実施例３において CSP2 タンパクが COS7 細胞培養上清
中に分泌されることが確認されたので、CSP2-FLAG タン
パクを COS7 細胞培養上清中から精製した。実施例２で
得た発現ベクターを実施例３の方法に従って 10 cm シ
ャーレ 30 枚のCOS7 細胞に導入し、培養上清を回収し
た。回収した培養上清は遠心によって細胞等を除いた
後、anti-FLAG M2-agarose affinity gel（ SIGMA 社）
に吸着させ、FLAG peptide（配列番号：７；Asp-Tyr-Ly
s-Asp-Asp- Asp-Asp-Lys ）で目的タンパクを溶出し
た。この溶出液を TBS 緩衝液（ pH 7.2 ）に対して透
析し、Centricon-10（ Amicon 社）を用いて 500μl に
まで濃縮し、精製標品を得た。これを SDS-PAGE にかけ
て銀染色を行なったところ、約 40 kDa の位置にブロー
ドなバンドが検出された。またこれを Micro BCA Prote
in Assay Kit（ Piercr社）を用いてタンパク定量した
ところ、15μg のタンパクが得られた。
【００６７】実施例５ 精製 CSP2-FLAG タンパクの N
末端アミノ酸配列の決定 実施例４で得られた精製標品のうち、２０μｌについて
０．１％ ＴＦＡで希釈した後、ＰＶＤＦ膜に吸着して
低分子夾雑物を除去した。これをプロテインシーケンサ
ー Procice 491 cLC (Applied Biosystems社）を用い
てPL-Prosorbサイクルで分析した。その結果、主要産物
としてＮ末端から順に、１．ヒスチジン（０．９２ｐｍ
ｏｌ）、２．セリン（１．００ｐｍｏｌ）、３．ロイシ
ン（１．８７ｐｍｏｌ）の各アミノ酸残基が得られた
他、２番目の成分としてＮ末端から順に１．グリシン
（０．７０ｐｍｏｌ）、２．ヒスチジン（０．４３ｐｍ
ｏｌ）、３．セリン（０．６４ｐｍｏｌ）、４．ロイシ
ン（１．１１ｐｍｏｌ）の各アミノ酸残基が検出され
た。このことからＣＳＰ２タンパクはその前駆タンパク
のＮ末端の３０アミノ酸もしくは２９アミノ酸残基のシ
グナル配列が切断され、３１残基目のヒスチジン残基ま
たは３０残基目のグリシン残基から始まるＣＳＰ２成熟
タンパクとして培地中に分泌されることが分った。
末端アミノ酸配列の決定 実施例４で得られた精製標品のうち、２０μｌについて
０．１％ ＴＦＡで希釈した後、ＰＶＤＦ膜に吸着して
低分子夾雑物を除去した。これをプロテインシーケンサ
ー Procice 491 cLC (Applied Biosystems社）を用い
てPL-Prosorbサイクルで分析した。その結果、主要産物
としてＮ末端から順に、１．ヒスチジン（０．９２ｐｍ
ｏｌ）、２．セリン（１．００ｐｍｏｌ）、３．ロイシ
ン（１．８７ｐｍｏｌ）の各アミノ酸残基が得られた
他、２番目の成分としてＮ末端から順に１．グリシン
（０．７０ｐｍｏｌ）、２．ヒスチジン（０．４３ｐｍ
ｏｌ）、３．セリン（０．６４ｐｍｏｌ）、４．ロイシ
ン（１．１１ｐｍｏｌ）の各アミノ酸残基が検出され
た。このことからＣＳＰ２タンパクはその前駆タンパク
のＮ末端の３０アミノ酸もしくは２９アミノ酸残基のシ
グナル配列が切断され、３１残基目のヒスチジン残基ま
たは３０残基目のグリシン残基から始まるＣＳＰ２成熟
タンパクとして培地中に分泌されることが分った。
【００６８】実施例６ CSP2 タンパクのヒト IgG Fc
領域との融合タンパクの発現 CSP2 をヒト IgG Fc 領域との融合タンパクとして発現
させるための発現ベクターの構築は、以下の手順で行な
った。まずヒト脾臓 IgG Fc cDNA（ Clontech社）を鋳
型として、制限酵素 Xho I または Not I 部位をアンカ
ーとして持つ合成 DNA（配列番号：８及び９）を用いて
PCR を行なった。PCR 反応には Advantage 2 Polymera
se Mixture（ Clontech 社）を用い、 94℃ 1 分の
後、 96℃ 10 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分を 35
回の後、 72℃ 10 分の伸長反応を行なってヒト IgG
Fc 領域をコードする DNA 断片を得た。この DNA 断片
を TA Cloning Kit（Invitrogen 社）の処方に従い、プ
ラスミドベクターpCR2.1-TOPO（ Invitrogen 社）へク
ローニングした。得られたプラスミドを制限酵素 XhoI
及び Not I で切断して挿入断片を回収し、pCAN618 の
Xho I／Not I 部位に挿入して pCAN618Fc を得た。
次に CSP2 タンパクをコードしている cDNA を鋳型にし
て、先の合成 DNA（配列番号：５）と、CSP2 タンパク
の 221 番目のアミノ酸の後に制限酵素 Xho I 認識部位
がくるように設計した合成 DNA（配列番号：１０）を用
いて PCR を行なった。PCR 反応には Advantage 2 Poly
merase Mixture（ Clontech 社）を用い、 94℃ 1
分の後、 98℃ 10 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分を
25 回の後、 72℃ 10 分の伸長反応を行なってCSP2
のORF を含む DNA 断片を得た。この DNA 断片を制限酵
素 Mfe I 及び Xho I で切断して回収し、pCAN618Fc
の Eco RI／Xho I 部位に挿入してヒト CSP2 タンパク
の動物細胞での発現ベクター pCAN618／CSP2-Fc を得
た。得られた発現ベクター pCAN618／CSP2-Fc は、実施
例４と同様の方法で 10 cmシャーレ 2 枚分の COS7 細
胞に導入して培養上清を回収した。回収した培養上清は
遠心によって細胞等を除いた後、Centricon-10（ Amico
n 社）を用いて 100倍に濃縮した。タンパク発現の確認
は、実施例３と同様の方法で、電気泳動し、これをPVDF
膜に移し、発色させて行なった（結果は図示せず）。
領域との融合タンパクの発現 CSP2 をヒト IgG Fc 領域との融合タンパクとして発現
させるための発現ベクターの構築は、以下の手順で行な
った。まずヒト脾臓 IgG Fc cDNA（ Clontech社）を鋳
型として、制限酵素 Xho I または Not I 部位をアンカ
ーとして持つ合成 DNA（配列番号：８及び９）を用いて
PCR を行なった。PCR 反応には Advantage 2 Polymera
se Mixture（ Clontech 社）を用い、 94℃ 1 分の
後、 96℃ 10 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分を 35
回の後、 72℃ 10 分の伸長反応を行なってヒト IgG
Fc 領域をコードする DNA 断片を得た。この DNA 断片
を TA Cloning Kit（Invitrogen 社）の処方に従い、プ
ラスミドベクターpCR2.1-TOPO（ Invitrogen 社）へク
ローニングした。得られたプラスミドを制限酵素 XhoI
及び Not I で切断して挿入断片を回収し、pCAN618 の
Xho I／Not I 部位に挿入して pCAN618Fc を得た。
次に CSP2 タンパクをコードしている cDNA を鋳型にし
て、先の合成 DNA（配列番号：５）と、CSP2 タンパク
の 221 番目のアミノ酸の後に制限酵素 Xho I 認識部位
がくるように設計した合成 DNA（配列番号：１０）を用
いて PCR を行なった。PCR 反応には Advantage 2 Poly
merase Mixture（ Clontech 社）を用い、 94℃ 1
分の後、 98℃ 10 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分を
25 回の後、 72℃ 10 分の伸長反応を行なってCSP2
のORF を含む DNA 断片を得た。この DNA 断片を制限酵
素 Mfe I 及び Xho I で切断して回収し、pCAN618Fc
の Eco RI／Xho I 部位に挿入してヒト CSP2 タンパク
の動物細胞での発現ベクター pCAN618／CSP2-Fc を得
た。得られた発現ベクター pCAN618／CSP2-Fc は、実施
例４と同様の方法で 10 cmシャーレ 2 枚分の COS7 細
胞に導入して培養上清を回収した。回収した培養上清は
遠心によって細胞等を除いた後、Centricon-10（ Amico
n 社）を用いて 100倍に濃縮した。タンパク発現の確認
は、実施例３と同様の方法で、電気泳動し、これをPVDF
膜に移し、発色させて行なった（結果は図示せず）。
【００６９】実施例７ ヒト NKG2D 発現 CHO-K1 細胞
株の樹立 ヒト NKG2D を発現させるための発現ベクターは以下の
方法で構築した。まずヒト脾臓 NKG2D cDNA（ Clontech
社）を鋳型として、制限酵素 Eco RI またはNot I 部
位をアンカーとして持つ合成 DNA（配列番号：１１及び
１２）を用いてPCR を行なった。PCR 反応には Advanta
ge 2 Polymerase Mixture（ Clontech社）を用い、 9
5℃ 1 分の後、 95℃ 20 秒、72℃ 4 分を 5 回、
95℃20 秒、68℃ 4 分を 5 回、95℃ 20 秒、64
℃ 20 秒、68℃ 4 分を 30回の後、 68℃ 3 分の
伸長反応を行なってヒト NKG2D をコードする DNA 断片
を得た。この DNA 断片を TA Cloning Kit（Invitrogen
社）の処方に従い、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO
（ Invitrogen 社）へクローニングした。得られたプラ
スミドを制限酵素 Eco RI 及び Not I で切断して挿入
断片を回収し、pCAN618 の Eco RI／Not I 部位に挿
入して pCAN618／hNKG2D を得た。得られた発現ベクタ
ー pCAN618／hNKG2D は、LipofectAMINE（ GibcoBRL ）
を用いて CHO-K1 細胞に導入した。導入後 0.5 mg／ml
の Geneticin（和光純薬）で発現ベクターの導入された
細胞を選択し、ヒト NKG2D 発現 CHO-K1 細胞株 CHO-K1
／hNKG2D-11 を得た。
株の樹立 ヒト NKG2D を発現させるための発現ベクターは以下の
方法で構築した。まずヒト脾臓 NKG2D cDNA（ Clontech
社）を鋳型として、制限酵素 Eco RI またはNot I 部
位をアンカーとして持つ合成 DNA（配列番号：１１及び
１２）を用いてPCR を行なった。PCR 反応には Advanta
ge 2 Polymerase Mixture（ Clontech社）を用い、 9
5℃ 1 分の後、 95℃ 20 秒、72℃ 4 分を 5 回、
95℃20 秒、68℃ 4 分を 5 回、95℃ 20 秒、64
℃ 20 秒、68℃ 4 分を 30回の後、 68℃ 3 分の
伸長反応を行なってヒト NKG2D をコードする DNA 断片
を得た。この DNA 断片を TA Cloning Kit（Invitrogen
社）の処方に従い、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO
（ Invitrogen 社）へクローニングした。得られたプラ
スミドを制限酵素 Eco RI 及び Not I で切断して挿入
断片を回収し、pCAN618 の Eco RI／Not I 部位に挿
入して pCAN618／hNKG2D を得た。得られた発現ベクタ
ー pCAN618／hNKG2D は、LipofectAMINE（ GibcoBRL ）
を用いて CHO-K1 細胞に導入した。導入後 0.5 mg／ml
の Geneticin（和光純薬）で発現ベクターの導入された
細胞を選択し、ヒト NKG2D 発現 CHO-K1 細胞株 CHO-K1
／hNKG2D-11 を得た。
【００７０】実施例８ CSP2-Fc タンパクのヒト NKG2D
発現 CHO-K1 細胞への結合 実施例７で得たヒト NKG2D 発現 CHO-K1 細胞株 CHO-K1
／hNKG2D-11 を、 PBS／1% FBS で 2 回洗浄後、実施例
６で得た CSP2-Fc 発現 COS7 細胞の培養上清濃縮物 10
μl を含む 50μl の PBS／1% FBS に懸濁した。これを
0℃ 60 分反応させて結合させた後、200μl の PBS／
1% FBS で 2 回洗浄後、1μl の anti-human IgG (Fc)-
FITC conjugate（ Caltag 社）を含む 50μl の PBS／1
% FBSに懸濁した。これを 0℃ 60 分反応させて標識し
た後、200μl の PBS／1% FBSで 2 回洗浄後、 600μl
の PBS／1% FBS に再懸濁した。これを フローサイトメ
ーター FACSVantage（ Becton Dickinson 社）を用い
て解析したところ、FITC 蛍光強度の強い細胞が認めら
れ、CHO-K1 細胞表面に発現したヒト NKG2D に対して C
SP2-Fc タンパクの明らかな結合が観察された（図２の
Ａ）。また、同様にして、CHO-K1 細胞（コントロー
ル）に対する、実施例６で得られた CSP2-Fc 発現 COS7
細胞の培養上清濃縮物の結合（図２のＢ）、ならびに
上記CHO-K1／hNKG2D-11に対する、実施例６と同様の方
法でMock プラスミドを導入して得られた Mock プラス
ミド導入 COS7 細胞の培養上清濃縮物の結合を調べた
（図２のＣ）。なお、細胞に結合した CSP2-Fc は、FIT
C 標識した anti-human IgG (Fc) 抗血清で染色した
後、FACS を用いて検出した。ヒト NKG2D 発現 CHO-K1
細胞に対しては、 CSP2-Fc 発現 COS7 細胞の培養上清
濃縮物を加えた時に（図２のＡ）、 Mock プラスミド導
入 COS7 細胞の培養上清濃縮物（図２のＢ）に比べて
明らかに蛍光強度の増強が観察された。また NKG2D を
発現していないコントロールの CHO-K1 細胞に対しては
CSP2-Fc による蛍光強度の増強は見られなかった（図
２のＣ）。これらＡ〜Ｃの図を重ねたのが図２のＤであ
る。これらのことから、CSP2-Fc が CHO-K1 の細胞表面
に発現した NKG2D に結合することが示され、NKG2D が
CSP2 タンパクの特異的な受容体であることが分った。
発現 CHO-K1 細胞への結合 実施例７で得たヒト NKG2D 発現 CHO-K1 細胞株 CHO-K1
／hNKG2D-11 を、 PBS／1% FBS で 2 回洗浄後、実施例
６で得た CSP2-Fc 発現 COS7 細胞の培養上清濃縮物 10
μl を含む 50μl の PBS／1% FBS に懸濁した。これを
0℃ 60 分反応させて結合させた後、200μl の PBS／
1% FBS で 2 回洗浄後、1μl の anti-human IgG (Fc)-
FITC conjugate（ Caltag 社）を含む 50μl の PBS／1
% FBSに懸濁した。これを 0℃ 60 分反応させて標識し
た後、200μl の PBS／1% FBSで 2 回洗浄後、 600μl
の PBS／1% FBS に再懸濁した。これを フローサイトメ
ーター FACSVantage（ Becton Dickinson 社）を用い
て解析したところ、FITC 蛍光強度の強い細胞が認めら
れ、CHO-K1 細胞表面に発現したヒト NKG2D に対して C
SP2-Fc タンパクの明らかな結合が観察された（図２の
Ａ）。また、同様にして、CHO-K1 細胞（コントロー
ル）に対する、実施例６で得られた CSP2-Fc 発現 COS7
細胞の培養上清濃縮物の結合（図２のＢ）、ならびに
上記CHO-K1／hNKG2D-11に対する、実施例６と同様の方
法でMock プラスミドを導入して得られた Mock プラス
ミド導入 COS7 細胞の培養上清濃縮物の結合を調べた
（図２のＣ）。なお、細胞に結合した CSP2-Fc は、FIT
C 標識した anti-human IgG (Fc) 抗血清で染色した
後、FACS を用いて検出した。ヒト NKG2D 発現 CHO-K1
細胞に対しては、 CSP2-Fc 発現 COS7 細胞の培養上清
濃縮物を加えた時に（図２のＡ）、 Mock プラスミド導
入 COS7 細胞の培養上清濃縮物（図２のＢ）に比べて
明らかに蛍光強度の増強が観察された。また NKG2D を
発現していないコントロールの CHO-K1 細胞に対しては
CSP2-Fc による蛍光強度の増強は見られなかった（図
２のＣ）。これらＡ〜Ｃの図を重ねたのが図２のＤであ
る。これらのことから、CSP2-Fc が CHO-K1 の細胞表面
に発現した NKG2D に結合することが示され、NKG2D が
CSP2 タンパクの特異的な受容体であることが分った。
【００７１】
【発明の効果】本発明のタンパク質等は、例えば、ＮＫ
Ｇ２Ｄに対する結合活性、免疫細胞の活性化作用などを
有するため、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳
癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱
癌、黒色腫等）の予防・治療剤。また、本発明のタンパ
ク質は、本発明のタンパク質の活性を促進もしくは阻害
する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬
として有用であり、スクリーニングによって得られる阻
害剤は免疫抑制剤や抗炎症剤として期待される。さら
に、本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタン
パク質を特異的に認識することができるので、被検液中
の本発明のタンパク質の定量などに使用することがで
き、上記各種癌の診断剤として利用することができる。
また、本発明のタンパク質に対するヒト化抗体は、免疫
抑制剤や抗炎症剤として用いることができる。
Ｇ２Ｄに対する結合活性、免疫細胞の活性化作用などを
有するため、各種癌（例、子宮体癌、子宮内膜腫瘍、乳
癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、膀胱
癌、黒色腫等）の予防・治療剤。また、本発明のタンパ
ク質は、本発明のタンパク質の活性を促進もしくは阻害
する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬
として有用であり、スクリーニングによって得られる阻
害剤は免疫抑制剤や抗炎症剤として期待される。さら
に、本発明のタンパク質に対する抗体は、本発明のタン
パク質を特異的に認識することができるので、被検液中
の本発明のタンパク質の定量などに使用することがで
き、上記各種癌の診断剤として利用することができる。
また、本発明のタンパク質に対するヒト化抗体は、免疫
抑制剤や抗炎症剤として用いることができる。
【００７２】
配列番号：１ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：２ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：５ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：６ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：７ FLAG sequence of pCAN618FLAG 配列番号：８ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding IgG Fc 配列番号：９ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding IgG Fc 配列番号：１０ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：１１ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding NKG2D 配列番号：１２ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding NKG2D
oding CSP2 配列番号：２ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：５ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：６ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：７ FLAG sequence of pCAN618FLAG 配列番号：８ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding IgG Fc 配列番号：９ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding IgG Fc 配列番号：１０ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding CSP2 配列番号：１１ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding NKG2D 配列番号：１２ Designed oligonucleotide primer to amplify DNA enc
oding NKG2D
【００７３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Novel Protein and Its Use <130> 177120 <150> JP 2000-127547 <150> 2000-04-27 <150> JP 2001-64862 <150> 2001-03-08 <160> 12 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding CSP2 <400> 1 ctcgagacgc ccagcttcct gcctgttact 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding CSP2 <400> 2 CTCGAGGTGG GAGCCAAGGC TGTCAGCGAT 30 <210> 3 <211> 765 <212> DNA <213> Human <400> 3 atgcgaagaa tatccctgac ttctagccct gtgcgccttc ttttgtttct gctgttgcta 60 ctaatagcct tggagatcat ggttggtggt cactctcttt gcttcaactt cactataaaa 120 tcattgtcca gacctggaca gccctggtgt gaagcgcagg tcttcttgaa taaaaatctt 180 ttccttcagt acaacagtga caacaacatg gtcaaacctc tgggcctcct ggggaagaag 240 gtaaatgcca ccagcacttg gggagaattg acccaaacgc tgggagaagt ggggcgagac 300 ctcaggatgc tcctttgtga catcaaaccc cagataaaga ccagtgatcc ttccactctg 360 caagtcgaga tgttttgtca acgtgaagca gaacggtgca ctggtgcatc ctggcagttc 420 gccatcaatg gagagaaatc cctcctcttt gacgcaatga acatgacctg gacagtaatt 480 aatcatgaag ccagtaagat caaggagaca tggaagaaag acagagggct ggaaaagtat 540 ttcaggaagc tctcaaaggg agactgcgat cactggctca gggaattctt agggcactgg 600 gaggcaatgc cagaaccgac agtgtcacca gtaaatgctt cagatatcca ctggtcttct 660 tctagtctac cagatagatg gatcatcctg ggggcattca tcctgttact tttaatggga 720 attgttctca tctgtgtctg gtggcaaaat ggcagaagat ccacc 765 <210> 4 <211> 255 <212> PRT <213> Human <400> 4 Met Arg Arg Ile Ser Leu Thr Ser Ser Pro Val Arg Leu Leu Leu Phe 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ala Leu Glu Ile Met Val Gly Gly His Ser 20 25 30 Leu Cys Phe Asn Phe Thr Ile Lys Ser Leu Ser Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Trp Cys Glu Ala Gln Val Phe Leu Asn Lys Asn Leu Phe Leu Gln Tyr 50 55 60 Asn Ser Asp Asn Asn Met Val Lys Pro Leu Gly Leu Leu Gly Lys Lys 65 70 75 80 Val Asn Ala Thr Ser Thr Trp Gly Glu Leu Thr Gln Thr Leu Gly Glu 85 90 95 Val Gly Arg Asp Leu Arg Met Leu Leu Cys Asp Ile Lys Pro Gln Ile 100 105 110 Lys Thr Ser Asp Pro Ser Thr Leu Gln Val Glu Met Phe Cys Gln Arg 115 120 125 Glu Ala Glu Arg Cys Thr Gly Ala Ser Trp Gln Phe Ala Ile Asn Gly 130 135 140 Glu Lys Ser Leu Leu Phe Asp Ala Met Asn Met Thr Trp Thr Val Ile 145 150 155 160 Asn His Glu Ala Ser Lys Ile Lys Glu Thr Trp Lys Lys Asp Arg Gly 165 170 175 Leu Glu Lys Tyr Phe Arg Lys Leu Ser Lys Gly Asp Cys Asp His Trp 180 185 190 Leu Arg Glu Phe Leu Gly His Trp Glu Ala Met Pro Glu Pro Thr Val 195 200 205 Ser Pro Val Asn Ala Ser Asp Ile His Trp Ser Ser Ser Ser Leu Pro 210 215 220 Asp Arg Trp Ile Ile Leu Gly Ala Phe Ile Leu Leu Leu Leu Met Gly 225 230 235 240 Ile Val Leu Ile Cys Val Trp Trp Gln Asn Gly Arg Arg Ser Thr 245 250 255 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding CSP2 <400> 5 caattgccac catgcgaaga atatccctga cttct 35 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding CSP2 <400> 6 gtcgacacta gaagaagacc agtggatatc t 31 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG sequence of pCAN618FLAG <400> 7 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 8 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding IgG Fc <400> 8 ctcgagatct tgtgacaaaa ctcacacatg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding IgG Fc <400> 9 gcggccgctc atttacccgg agacagggag 30 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding CSP2 <400> 10 gtagactcga ggaagaccag tggatatctg aagca 35 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding NKG2D <400> 11 atgaattcca ccatggggtg gattcgtggt cggaggtctc ga 42 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer to amplify DNA encoding NKG2D <400> 12 aagcggccgc ttacacagtc ctttgcatgc agatgtag 38
【図１】 ＣＳＰ−ＦＬＡＧのＣＯＳ−７細胞での発現
を示すウエスタンブロットである。
を示すウエスタンブロットである。
【図２】 Ａは、CHO-K1／hNKG2D-11細胞に対してCSP2-
Fc 発現 COS7 細胞の培養上清濃縮物を加えた場合のFIT
Cのヒストグラムであり、Ｂは、CHO-K1 細胞（コントロ
ール）に対して実施例６で得られた CSP2-Fc 発現 COS7
細胞の培養上清濃縮物を加えた場合のFITCのヒストグ
ラムであり、Ｃは、CHO-K1／hNKG2D-11細胞に対してMoc
k プラスミド導入 COS7 細胞の培養上清濃縮物を加えた
場合のFITCのヒストグラムであり、ＤはＡ〜Ｃを重ね合
わせたヒストグラムである。
Fc 発現 COS7 細胞の培養上清濃縮物を加えた場合のFIT
Cのヒストグラムであり、Ｂは、CHO-K1 細胞（コントロ
ール）に対して実施例６で得られた CSP2-Fc 発現 COS7
細胞の培養上清濃縮物を加えた場合のFITCのヒストグ
ラムであり、Ｃは、CHO-K1／hNKG2D-11細胞に対してMoc
k プラスミド導入 COS7 細胞の培養上清濃縮物を加えた
場合のFITCのヒストグラムであり、ＤはＡ〜Ｃを重ね合
わせたヒストグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 29/00 ４Ｃ０８４ 45/00 35/00 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 29/00 37/06 ４Ｈ０４５ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/06 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 菊地 久仁子 茨城県取手市新町五丁目８−18−101号 (72)発明者 新谷 靖 茨城県つくば市春日１丁目７番地９ 武田 春日ハイツ703号 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 EA04 GA13 HA03 HA11 4B063 QA05 QA19 QQ21 QQ41 QQ61 QQ79 QR08 QR32 QR35 QR40 QR48 QR55 QR62 QR77 QR80 QS16 QS25 QS34 QS36 QX02 4B064 AG01 CA10 CA19 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA05 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA17 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZB082 ZB112 ZB262 4C085 AA13 AA14 AA19 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 EA20 EA51 FA71 FA74 GA26
Claims (24)
- 【請求項１】 配列番号：４で表されるアミノ酸配列と
同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するこ
とを特徴とするタンパク質またはその塩。 - 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質の部分ペプチ
ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
塩。 - 【請求項３】 請求項１記載のタンパク質をコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列番号：３で表わされる塩基配列を有
する請求項３記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項２記載の部分ペプチドをコードす
るＤＮＡを含有するＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項３または請求項５記載のＤＮＡを
含有する組換えベクター。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換えベクターで形質転
換された形質転換体。 - 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培養し、請
求項１記載のタンパク質または請求項２記載の部分ペプ
チドを生成せしめることを特徴とする請求項１記載のタ
ンパク質もしくはその塩、または請求項２記載の部分ペ
プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは
その塩の製造法。 - 【請求項９】 請求項１記載のタンパク質もしくはその
塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。 - 【請求項１０】 請求項３もしくは請求項５記載のＤＮ
Ａまたは請求項９記載の抗体を含有してなる診断剤。 - 【請求項１１】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩あるいは請求
項９記載の抗体を含有してなる医薬。 - 【請求項１２】 癌の予防・治療剤である請求項１１記
載の医薬。 - 【請求項１３】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いること
を特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくはその
塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのア
ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進ま
たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方
法。 - 【請求項１４】 請求項１記載のタンパク質もしくはそ
の塩、または請求項２記載の部分ペプチドもしくはその
アミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してな
る請求項１記載のタンパク質もしくはその塩、または請
求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは
そのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する
化合物またはその塩のスクリーニング用キット。 - 【請求項１５】 請求項１３記載のスクリーニング方法
または請求項１４記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる請求項１記載のタンパク質もしくはその塩、
請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく
はそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物ま
たはその塩。 - 【請求項１６】 請求項１５記載の化合物またはその塩
を含有してなる医薬。 - 【請求項１７】 癌の予防・治療剤である請求項１６記
載の医薬。 - 【請求項１８】 抗癌作用を有する医薬を製造するため
の請求項１記載のタンパク質もしくはその塩、請求項
２記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはその
エステルまたはその塩、または請求項１３記載のスク
リーニング方法または請求項１４記載のスクリーニング
用キットを用いて得られる請求項１記載のタンパク質も
しくはその塩、請求項２記載の部分ペプチドもしくはそ
のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促
進する化合物またはその塩の使用。 - 【請求項１９】 請求項１記載のタンパク質もしくは
その塩、請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩、または請求項
１２記載のスクリーニング方法または請求項１３記載の
スクリーニング用キットを用いて得られる請求項１記載
のタンパク質もしくはその塩、請求項２記載の部分ペプ
チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ
の塩の活性を促進する化合物またはその塩を哺乳動物に
投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。 - 【請求項２０】 請求項１３記載のスクリーニング方法
または請求項１４記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる請求項１記載のタンパク質もしくはその塩、
請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく
はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物ま
たはその塩。 - 【請求項２１】 請求項２０記載の化合物またはその塩
を含有してなる医薬。 - 【請求項２２】 免疫抑制剤または抗炎症剤である請求
項２１記載の医薬。 - 【請求項２３】 免疫抑制作用または抗炎症作用を有す
る医薬を製造するための請求項１３記載のスクリーニ
ング方法または請求項１４記載のスクリーニング用キッ
トを用いて得られる請求項１記載のタンパク質もしくは
その塩、請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミ
ドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する
化合物またはその塩、あるいは請求項９記載の抗体の使
用。 - 【請求項２４】 請求項１３記載のスクリーニング方法
または請求項１４記載のスクリーニング用キットを用い
て得られる請求項１記載のタンパク質もしくはその塩、
請求項２記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしく
はそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物ま
たはその塩、あるいは請求項９記載の抗体を哺乳動物に
投与することを特徴とする免疫抑制方法または炎症の治
療方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001131638A JP2002335964A (ja) | 2000-04-27 | 2001-04-27 | 新規タンパク質およびその用途 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000127547 | 2000-04-27 | ||
| JP2000-127547 | 2000-04-27 | ||
| JP2001-64862 | 2001-03-08 | ||
| JP2001064862 | 2001-03-08 | ||
| JP2001131638A JP2002335964A (ja) | 2000-04-27 | 2001-04-27 | 新規タンパク質およびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002335964A true JP2002335964A (ja) | 2002-11-26 |
| JP2002335964A5 JP2002335964A5 (ja) | 2008-06-05 |
Family
ID=27343222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001131638A Pending JP2002335964A (ja) | 2000-04-27 | 2001-04-27 | 新規タンパク質およびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002335964A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999006554A2 (en) * | 1997-08-01 | 1999-02-11 | Genset | 5' ESTs FOR SECRETED PROTEINS EXPRESSED IN MUSCLE AND OTHER MESODERMAL TISSUES |
| WO1999031236A2 (en) * | 1997-12-17 | 1999-06-24 | Genset | EXTENDED cDNAs FOR SECRETED PROTEINS |
| EP1033401A2 (en) * | 1999-02-26 | 2000-09-06 | Genset | Expressed sequence tags and encoded human proteins |
| WO2001040466A2 (en) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
-
2001
- 2001-04-27 JP JP2001131638A patent/JP2002335964A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999006554A2 (en) * | 1997-08-01 | 1999-02-11 | Genset | 5' ESTs FOR SECRETED PROTEINS EXPRESSED IN MUSCLE AND OTHER MESODERMAL TISSUES |
| WO1999031236A2 (en) * | 1997-12-17 | 1999-06-24 | Genset | EXTENDED cDNAs FOR SECRETED PROTEINS |
| EP1033401A2 (en) * | 1999-02-26 | 2000-09-06 | Genset | Expressed sequence tags and encoded human proteins |
| WO2001040466A2 (en) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080417 |
|
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