JP2001523455A - Ｃｄｋ２タンパク質およびｃｄｋ２タンパク質複合体 - Google Patents

Ｃｄｋ２タンパク質およびｃｄｋ２タンパク質複合体

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JP2001523455A JP2000521194A JP2000521194A JP2001523455A JP 2001523455 A JP2001523455 A JP 2001523455A JP 2000521194 A JP2000521194 A JP 2000521194A JP 2000521194 A JP2000521194 A JP 2000521194A JP 2001523455 A JP2001523455 A JP 2001523455A
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メイジア ヤン，
クリシュナン ナンダバラン，
ビンセント ピーター シュルツ，
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キュラゲン コーポレイション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、改変され、改良された酵母ツーハイブリッドアッセイ系によってＣＤＫ２タンパク質と相互作用するとして同定されるタンパク質（ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ）とＣＤＫ２タンパク質の複合体を開示する。同定され、ＣＤＫ２タンパク質と相互作用すると同定され、従って複合体を形成するタンパク質には、以下が挙げられる：サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２ならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよび相同体。本発明はまた、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２ヌクレオチド配列をコードする核酸、ならびにタンパク質およびその誘導体、フラグメントおよびアナログを提供する。種々の疾患および障害、特に新生物およびアテローム性動脈硬化症の処置および／または予防における効力についてこれらの前述の複合体のスクリーニングの方法もまた、本明細書中に開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （助成金の援助） 本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ
ｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって授与された授与番号７０ＮＡＮＢ５
Ｈ１０６６の下で合衆国政府の援助を用いて行われた。合衆国政府は本発明にお
いて一定の権利を有する。
【０００２】 （発明の分野） 本明細書中で開示された本発明は、他のタンパク質とＣＤＫ２タンパク質の複
合体、特に以下のタンパク質とＣＤＫ２タンパク質の複合体に関する：サイクリ
ンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２。さらに、本発明は、上
述のＣＤＫ２タンパク質複合体に対する抗体の産生、およびそれらの使用、特に
スクリーニング、診断、予後および治療に関する。本発明はさらに、ｈｓＲｅｑ * −１およびｈｓＲｅｑ*−２遺伝子およびタンパク質、ならびにその誘導体、フ
ラグメント、アナログおよび相同体に関する。
【０００３】 （発明の背景） 細胞増殖の制御の損失が、重度の疾患および障害（例えば、新生物）を生じ得
ることは分子生物学においてよく確立された見解である。それゆえ、細胞周期の
複雑性の解明および腫瘍形成中のその脱調節は、癌および他の増殖関連疾患の予
防的、診断的および治療的管理における新規の機会を提供する。細胞周期のより
よい理解は、種々のタンパク質複合体の相互作用の解明によって達成され得、こ
の複合体のレベルおよび生物学的な活性は、細胞周期を通して調節される。これ
らのタンパク質複合体の同定および分類は、過剰増殖障害（例えば、腫瘍形成お
よび腫瘍進行）ならびにアテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されな
い種々の病理学的プロセスについての処理様式およびアッセイの開発において有
用である。
【０００４】 本明細書中の参考文献の引用は、本発明に対する先行技術であるという承認と
して解釈されるべきでないことを留意すべきである。
【０００５】 （（１）ＣＤＫ２タンパク質） ヒトサイクリン−依存キナーゼ２または細胞分裂キナーゼ（ＣＤＫ２；Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号Ｘ６１６２２；ＥｌｌｅｄｇｅおよびＳｐｏｔｔｓｗｏｏｄ、
１９９１．ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２６５３−２６５９；Ｎｉｎｏｍｉｙａ−Ｔｓ
ｕｊｉら、１９９１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：
９００６−９０１０を参照のこと）は、第２の重要な細胞周期レギュレーター、
ＣＤＣ２と約６５％のアミノ酸同一性を有する２９８アミノ酸のセリン−スレオ
ニンプロテインキナーゼである。ＣＤＫ２は、ＣＤＣ２のわずかに前、Ｇ１にお
いて後期に、またはＳ期において初期に発現され、そしてＧ１／Ｓ移行に関して
中心的である。この２つのキナーゼは別のステージで細胞周期を調節する。
【０００６】 サイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ）は、サイクリンと複合体を形成し、そして
結果としてそれらは、一般にキナーゼ活性を発現する。これらのＣＤＫの１つで
ある、ＣＤＫ２は、サイクリンと（例えば、サイクリンＡ、Ｅ、Ｄ１およびＨと
）結合することが公知であり、そして標的タンパク質のリン酸化を介して細胞周
期の進行における重要な役割を演じる。ＣＤＫ２活性は、ＣＤＫ２が、細胞周期
レギュレーターである、サイクリンＡおよびＥと複合体化する場合に生じるＣＤ
Ｋ活性化キナーゼによるリン酸化に依存する。逆に、ＣＤＫ２キナーゼ活性は、
ヒトＣＤＫ−関連ホスファターゼによる脱リン酸化によって不活性化される（例
えば、ＰｏｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ、１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：９０
−９３を参照のこと）。ＣＤＫ２は、網膜芽細胞腫の腫瘍抑制遺伝子産物（ｐＲ
ｂ）、ｐ５３、転写因子Ｅ２Ｆ、ヒストンＨ１および細胞周期制御に対して中心
的な他のタンパク質をリン酸化する（例えば、Ｈｉｇａｓｈｉら、１９９６．Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３７：４６０−４６７を参照のこと）。サイクリ
ンＤ１およびｐ２１を含む他のタンパク質はＣＤＫ２と複合体化し、下流の基質
とのその相互作用をブロックし、そしてＣＤＫ２そのもののリン酸化をブロック
する（例えば、Ａｄａｍｓら、１９９６．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：
６６２３−６６３３を参照のこと）。周期特異的サイクリン発現、リン酸化／脱
リン酸化カスケードおよび他のＣＤＫ２相互作用タンパク質の複雑度相互作用は
、究極的にはＣＤＫ２活性を介して表れて、細胞周期の進行を決定する。
【０００７】 ＣＤＫ２の脱調節は、発癌の機構および癌の処置に強く関連している。ＤＮＡ
腫瘍ウイルスは、細胞を転写因子Ｅ２ＦとＣＤＫ２との相互作用を通じて形質転
換する（例えば、Ｎｅｖｉｎｓ、１９９２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：４２４−
４２９を参照のこと）。ＣＤＫ２は、神経膠腫細胞の分化に関連している（例え
ば、Ｋｏｋｕｎａｉら、１９９７．Ｊ．Ｎｅｕｒｏ．Ｏｎｃｏｌ．３２：１２５
−１３３を参照のこと）。ヒト乳癌細胞において、抗癌剤、フラボピリドール（
ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）は、ＣＤＫ２の阻害によってＧ１阻止を誘導する（
例えば、Ｃａｒｌｓｏｎら、１９９６．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２９７３
−２９７８を参照のこと）。従って、抗エストローゲンアップレギュレートＣＤ
Ｋ２インヒビターは、ｐＲｂリン酸化の減少を引き起こし、そしてＳ期への細胞
の進行を減少させる（例えば、Ｗａｔｔｓら、１９９５．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．９：１８０４−１８１３を参照のこと）。
【０００８】 平滑筋細胞増殖は、アテローム性動脈硬化症の発生における鍵となる現象であ
る。脈管平滑筋細胞の血清の除去は、ＣＤＫ２とｐ２７（Ｋｉｐ１）間の複合体
形成に関連し、ＣＤＫ２酵素活性の阻害をもたらす（例えば、Ｃｈｅｎら、１９
９７．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２３３４−２３４１を参照のこと）
。従って、細胞周期のＧ１期におけるＣＤＫ２／サイクリンＥ活性の阻害は、ア
テローム性動脈硬化症中にｐ２７（Ｋｉｐ１）の作用を介する機構であり、内膜
の過形成を阻害する。
【０００９】 概説すると、ＣＤＫ２は、細胞周期進行の制御、転写調節、細胞分化制御、リ
ン酸化の関与する細胞内シグナル伝達、腫瘍形成の機構、腫瘍進行および拡大な
らびにアテローム性動脈硬化症に関連している。
【００１０】 （（２）ＣＤＫ２相互作用タンパク質） （ｉ）サイクリンＩ 他のサイクリンタンパク質とは対照的に、サイクリンＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録
番号Ｄ５０３１０；Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９５．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ
．２１１：５３４−５４２を参照のこと）は、細胞周期を通して一定のレベルで
多くの有糸分裂後の組織で広く発現される。このタンパク質は、アミノ末端近傍
に代表的なサイクリンボックス（このタンパク質と細胞周期進行の制御および転
写制御を結びつける）を含む（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、１９９４．Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：９４６−９５２を参照のこと）。
【００１１】 （ｉｉ）ＥＲＨ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける不完全発育遺伝子
のエンハンサー（ＤＲＯＥＲ）と相同なＥＲＨ（不完全発育遺伝子のヒトエンハ
ンサーについて）と名づけられた１０４のアミノ酸タンパク質をコードするヒト
ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８５７８５；Ｉｓｏｍｕｒａら、１９９６
を参照のこと）は、本発明においてＣＤＫ２と相互作用することが見出された。
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａで、この遺伝子産物は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａ
ｎｏｇａｓｔｅｒにおける不完全発育遺伝子の転写調節に必要である。このタン
パク質は、ピリミジン代謝経路および細胞周期に関与している。従って、ＥＲＨ
は、転写制御、ＤＮＡピリミジン代謝における機能、および細胞周期おける機能
に関与している。
【００１２】 （ｉｉｉ）ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２ ２つの配列が、マウスジンクフィンガータンパク質レクイエム（Ｒｅｑｕｉｅ
ｍ）のヒト相同体内の配列と同一であるＣＤＫ２相互作用体として本発明におい
て同定された（ｈｓＲｅｑ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９４５８５；Ｇａｂｉｇ
ら、１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９５１５−２９５１９を参
照のこと）。マウス骨髄性細胞株におけるアポトーシスは、このレクイエム遺伝
子の発現を必要とする。本発明において同定されたｈｓＲｅｑ領域は、ｈｓＲｅ
ｑ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ
酸を含むｈｓＲｅｑのスプライシング変異体を示す。このような２つのスプライ
シング変異体は、以下に開示され、そして本発明においてｈｓＲｅｑ＊−１およ
びｈｓＲｅｑ＊−２と命名される。
【００１３】 以下に記載されるように、ＣＤＫ２、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*− １およびｈｓＲｅｑ*−２のいずれのタイプの相互作用についての先行技術にお いても以前の開示は存在しないことに留意すべきである。
【００１４】 さらに、本明細書中の参考文献の引用は、本発明に対する先行技術の承認とし
ては解釈されない。
【００１５】 （発明の要旨） 手短には、ＣＤＫ２タンパク質が、以下の細胞タンパク質と、これまで記載さ
れていなかった複合体を形成することが示された：サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓ
Ｒｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２。さらに、ｈｓＲｅｑ*−１タンパク質およ びｈｓＲｅｑ*−２タンパク質をコードする遺伝子はこれまで記載されていない 。
【００１６】 本発明は、本明細書において、ＣＤＫ２タンパク質およびこのＣＤＫ２タンパ
ク質と相互作用（すなわち、結合）する他の種々のタンパク質を含むタンパク質
複合体の産生のための組成物および方法論を開示する。ＣＤＫ２タンパク質と複
合体を形成すると実証されたタンパク質は、本明細書において以後、ＣＤＫ２タ
ンパク質相互作用タンパク質について、「ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ」と命名し ；他方、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複合体は、本明
細書以後、「ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ」と称する。
【００１７】 より詳細には、本発明は、以下の細胞タンパク質との、ＣＤＫ２タンパク質な
らびにその誘導体、フラグメントおよびアナログの複合体に関する：（ｉ）サイ
クリンＩ、（ｉｉ）ＥＲＨ、（ｉｉｉ）ｈｓＲｅｑ*−１；（ｉｖ）ｈｓＲｅｑ* −２、ならびにその誘導体、アナログおよびフラグメント。ｈｓＲｅｑ*−１お よびｈｓＲｅｑ*−２は、ｈｓＲｅｑ遺伝子のｍＲＮＡスプライシング改変体に よってコードされる新規タンパク質である。すなわち、ｈｓＲｅｑ*−１および ｈｓＲｅｑ*−２をコードするｍＲＮＡは、ｈｓＲｅｑをコードするｍＲＮＡを プロセシングするために使用されるスプライシング部位とは異なるスプライシン
グ部位でＲＮＡスプライシングされることによって生成される。従って、本発明
はさらに、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２（ヒトｈｓＲｅｑ*−１およ びｈｓＲｅｑ*−２遺伝子ならびに他の種のホモログ）のヌクレオチド配列、な らびにその誘導体（例えば、フラグメント）およびアナログに関する。
【００１８】 例えば、組換え手段による、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ
複合体、ならびにこれらの上記のタンパク質およびタンパク質複合体の誘導体お
よびアナログの産生の方法が、本明細書において開示される。ＣＤＫ２タンパク
質：ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
Ｐ複合体、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよびアナログに関連する種
々の薬学的組成物もまた、本発明によって開示される。
【００１９】 本発明はさらに、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体（特
に以下の複合体：ＣＤＫ２タンパク質・サイクリンＩ；ＣＤＫ２タンパク質・Ｅ
ＲＨ、ＣＤＫ２タンパク質・ｈｓＲｅｑ*−１およびＣＤＫ２タンパク質・ｈｓ Ｒｅｑ*−２）の活性の調節（すなわち、阻害または増強）のための方法論を提 供する。これら上記の複合体のタンパク質成分は、細胞過程および生理学的過程
の過剰と関係している。これらには以下：（ｉ）細胞周期進行の制御；（ｉｉ）
細胞分化およびアポトーシス；（ｉｉｉ）転写調節；（ｉｖ）過剰増殖障害を含
むがそれらに限定されない病理学的過程（例えば、腫瘍原性および腫瘍進行）；
ならびにアテローム性動脈硬化症が含まれるがこれらに限定されない。
【００２０】 従って、本発明は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体、
特にサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２、ならびに
それらの誘導体、フラグメントおよびアナログとのＣＤＫ２タンパク質の複合体
を、細胞機能を調節または変更する（特に、ＣＤＫ２タンパク質および／または
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰが関連する細胞機能、これらには、以下が含まれるが
それらに限定されない：（ｉ）細胞周期進行の制御；（ｉｉ）細胞分化およびア
ポトーシス；（ｉｉｉ）転写調節；（ｉｖ）過剰増殖障害を含むがそれらに限定
されない病理学的過程（例えば、腫瘍原性および腫瘍進行）；ならびにアテロー
ム性動脈硬化症）能力についてのスクリーニングについての方法論を提供する。
【００２１】 本発明はさらに、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体（お
よびその複合体に関与する個々のタンパク質成分をコードする核酸）に基づいた
、治療的および予防的、ならびに診断的、予後的、およびスクリーニングの方法
論および薬学的組成物に関する。本発明の治療化合物は、以下を含むがそれらに
限定されない：（ｉ）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体、
および複合体であって、その複合体の一方または両方が、ＣＤＫ２タンパク質ま
たはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメントまたはアナログである、
複合体；（ｉｉ）上記に対する抗体およびそれをコードする核酸；ならびに（ｉ
ｉｉ）種々のタンパク質複合体成分をコードするヌクレオチド配列に対するアン
チセンス核酸。診断キット、予後キット、およびスクリーニングキットもまた提
供される。
【００２２】 ＣＤＫ２タンパク質：ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰおよびＣＤＫ２タンパク質・
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の活性の種々の調節因子（すなわち、アゴニス
ト、アンタゴニスト、およびインヒビター）についてのスクリーニングの動物モ
デルおよび方法論もまた本発明によって提供される。
【００２３】 ＣＤＫ２タンパク質：ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ、ならびにＣＤＫ２タンパク質
・ＣＤＫタンパク質ＩＰ複合体の形成／合成を阻害、あるいは増加させる分子の
同定のための方法論もまた本発明によって提供される。
【００２４】 （発明の詳細な説明） 本発明は、酵母ツーハイブリッド系の改良され、改変された形態を用いて、Ｃ
ＤＫ２タンパク質と相互作用することが実証されたタンパク質（本明細書中以降
「ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ」という）の同定に基づく。以下のタンパク質（Ｃ
ＤＫ２タンパク質−ＩＰ）がＣＤＫ２タンパク質と生理的条件下で複合体を形成
することが見出された：（ｉ）サイクリンＩ、（ｉｉ）ＥＲＨ、（ｉｉｉ）ｈｓ
Ｒｅｑ*−１；（ｉｖ）ｈｓＲｅｑ*−２。ＣＤＫ２タンパク質とＣＤＫ２タンパ
ク質−ＩＰとの複合体は、本明細書中以降「ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タン
パク質−ＩＰ」複合体という。ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ
複合体は、ＣＤＫ２タンパク質およびその結合パートナー（ＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰ）の機能活性の調節に関連する。このような機能活性は、以下を含むがそ
れらに限定されない：（ｉ）細胞周期進行の制御；（ｉｉ）細胞分化およびアポ
トーシス；（ｉｉｉ）転写調節；（ｉｖ）過増殖性障害（例えば、腫瘍原性およ
び腫瘍進行）を含むがそれらに限定されない病理プロセス；ならびに粥状硬化症
。
【００２５】 本発明は、改良され、改変された形態の酵母ツーハイブリッド系の利用を介し
て、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２のヌクレオチド配列によってコード
される新規タンパク質を同定した。従って、本発明はさらに，ヌクレオチド配列
ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２（好ましくは、ヒトｈｓＲｅｑ*−１お よびｈｓＲｅｑ*−２遺伝子）および他の種のホモログ、ならびにそれらの誘導 体、フラグメントおよびアナログに関する。上記の配列のヌクレオチド配列にハ
イブリダイズし得るかまたは相補的である核酸（例えば逆向き相補物）もまた提
供される。より詳細には、本発明は、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２ヌ
クレオチド配列の少なくとも５、１０または２５ヌクレオチド領域を含むか、そ
れにハイブリダイズし得るか（例えば、逆向き相補物）、またはそれに相補的で
ある核酸を開示する。
【００２６】 本発明はまた、機能的に活性である（すなわち、それらは、野生型ｈｓＲｅｑ * −１およびｈｓＲｅｑ*−２タンパク質の１以上の公知の機能的活性を提示し得
る）ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２誘導体、フラグメントおよびアナロ
グに関する。そのような機能的活性は以下を含むがそれらに限定されない：（ｉ
）ＣＤＫ２タンパク質に結合、またはそれとの結合に競合する能力；（ｉｉ）抗
原性（それぞれ、抗ｈｓＲｅｑ*−１および抗ｈｓＲｅｑ*−２抗体への結合につ
いてｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２と結合または競合する能力）、なら
びに（ｉｉｉ）免疫原性（それぞれ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２と
結合する抗体を産生する能力）。
【００２７】 本発明はさらに、ＣＤＫ２タンパク質と相互作用（例えば、結合）するタンパ
ク質についてスクリーニングする方法論を開示する。本発明はまた、ＣＤＫ２タ
ンパク質複合体、特に、以下のタンパク質：サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ * −１およびｈｓＲｅｑ*−２の１つと複合体化したＣＤＫ２タンパク質に関する
。本発明はさらに、ＣＤＫ２タンパク質、またはＣＤＫ２タンパク質の誘導体、
アナログおよびフラグメントと、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およ びｈｓＲｅｑ*−２またはそれらの誘導体、アナログおよびフラグメントとの複 合体を開示する。好ましい実施態様において、そのようは複合体は、抗ＣＤＫ２
タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体抗体と結合する。別の特定の実施
態様では、ヒトＣＤＫ２タンパク質とヒトタンパク質との複合体が開示される。
【００２８】 本発明はまた、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の産生
および／または単離のための方法論を提供する。特定の実施態様において、本発
明は、組換えＤＮＡ技術を用いてＣＤＫ２タンパク質およびその結合パートナー
（ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ）の両方、または、その複合体の一方または両方の
メンバーのフラグメント、誘導体またはホモログを発現する方法論を提供する。
ここで、両方の結合パートナーのいずれかが１つの異種プロモーター（すなわち
、特定の複合体成分をコードするネイティブ遺伝子とは天然に随伴しないプロモ
ーター）の制御下にあるか、または各々が、別個の異種プロモーターの制御下に
あるかのいずれかである。
【００２９】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の異常レベルと関連す
る疾患および障害について診断、予後およびスクリーニングする方法論が開示さ
れる。本発明はまた、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の
異常レベル、またはＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の１
つ異常の成分の異常レベルもしくは活性と関連する疾患または障害を、ＣＤＫ２
タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体、またはＣＤＫ２タンパク質・Ｃ
ＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体形成もしくは活性の調節因子（例えば、ＣＤＫ２
タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体、または複合体化していないＣＤ
Ｋ２タンパク質、もしくはその結合パートナー（ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ）、
あるいはそれらのフラグメントに結合する抗体）を投与することによって、処置
および予防するのための方法論を提供する。好ましくは、上記のフラグメントは
、以下を含む：（ｉ）複合体形成に直接関与するＣＤＫ２タンパク質またはＣＤ
Ｋ２タンパク質−ＩＰの部分；（ｉｉ）結合親和性を増加または減少させる、Ｃ
ＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの変異体；（ｉｉｉ）複合体
形成の低分子インヒビター／エンハンサー；（ｉｖ）複合体を安定化かまたは中
和するかのいずれかの抗体、など。
【００３０】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体を、治療剤または診断
剤としての生物学的活性についてアッセイする方法論、ならびにＣＤＫ２タンパ
ク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体またはその調節因子（すなわち、インヒ
ビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）についてスクリーニングする方法も
また、本明細書で開示される。
【００３１】 開示および実施可能性の明確さのために、かつ、限定を意図することなく、本
発明の詳細な説明を、以下の小節に分節する。
【００３２】 （（１）ＣＤＫ２タンパク質、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ、およびＣＤＫ２タ
ンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体） 本発明は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体、および特
定の局面において、ＣＤＫ２タンパク質と、以下：サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓ
Ｒｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２との複合体を開示する。好ましい実施態様で
は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体は、ヒトタンパク質
の複合体である。本発明はまた、以下に関する：（ｉ）ＣＤＫ２タンパク質の誘
導体、フラグメントおよびアナログと、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰとの複合体；
（ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質と、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメ
ントおよびアナログとの複合体、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質および
ＣＤＫ２−ＩＰの誘導体、フラグメントおよびアナログの複合体。本明細書にお
いて使用される場合、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の
フラグメント、誘導体、またはアナログは、その複合体の一方または両方のメン
バーが野生型ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰのフラグメン
ト、誘導体またはアナログである複合体を包含することに注意すべきである。
【００３３】 好ましくは、本発明により開示されるように、その複合体の一方または両方が
野生型タンパク質のフラグメント、誘導体、またはアナログであるＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体は、機能的に活性なＣＤＫ２タンパク
質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体である。特定の局面において、ＣＤＫ２タ
ンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰのネイティブタンパク質、誘
導体またはアナログは、動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ、サ
ル、カエル）；昆虫（例えば、ハエ）；植物、または最も好ましくはヒトのもの
である。本明細書において利用されるように、用語「機能的に活性なＣＤＫ２タ
ンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体」とは、（ｉ）細胞周期進行の制御
；（ｉｉ）細胞分化およびアポトーシス；（ｉｉｉ）転写調節；（ｉｖ）過剰増
殖障害を含むがそれらに限定されない病理学的過程（例えば、腫瘍原性および腫
瘍進行）；ならびにアテローム性動脈硬化症のようなものを含むがそれらに限定
されない細胞プロセスおよび生理プロセスの制御を含むがそれらに限定されない
、全長ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ（例えば、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ * −１およびｈｓＲｅｑ*−２）と複合体化した全長ＣＤＫ２タンパク質の１つ以
上の公知の機能的特性を提示する種をいう。
【００３４】 従って、本発明は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体、
特に、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２、ならび
にその誘導体、フラグメントおよびアナログとＣＤＫ２タンパク質との複合体を
、細胞機能、特にＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ
複合体が関係しているそれらの機能を変更および／または調節する能力について
、スクリーニングするための方法論を提供する。これらの機能は、以下を含むが
それらに限定されない：細胞周期進行の制御；転写調節；細胞内シグナル伝達の
制御；および病理プロセス、ならびに種々の他の生物学的活性（例えば、抗ＣＤ
Ｋ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体抗体との結合など）。所望の
免疫原性および／または抗原性を有する誘導体、フラグメントまたはアナログは
、イムノアッセイにおいて、免疫のため、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパ
ク質−ＩＰ複合体活性の阻害のためなどに利用され得る。例えば、目的の所定の
特性（例えば、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体への関与
）を保持、あるいは欠損または阻害する誘導体、フラグメントまたはアナログは
、そのような特性およびその生理的相関の、それぞれ、インデューサーまたはイ
ンヒビターとして利用され得る。特定の実施態様において、抗ＣＤＫ２タンパク
質抗体および／もしくは抗ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ抗体、またはＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体複合体に特異的な抗体によって結合さ
れ得る、ＣＤＫ２タンパク質のフラグメントおよび／またはＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰのフラグメントのＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体
（そのようなフラグメントが、所定のＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰ複合体に含まれる場合）。ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
Ｐ複合体の誘導体、フラグメントおよびアナログは、当該分野で公知の手順によ
って所望の活性について分析され得る。
【００３５】 本発明の特定の実施態様は、その複合体の一方または両方のタンパク質の種の
フラグメントを含むＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体を開
示する。好ましい実施態様において、それら上記のフラグメントは、以下のフラ
グメントを含み得るがそれらに限定されない：本発明における改良され、改変さ
れた酵母ツーハイブリッドアッセイにおいてＣＤＫ２タンパク質と相互作用する
として同定された、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ* −２。例えば、サイクリンＩタンパク質のアミノ酸１６〜３７７（図２に示す；
配列番号４）；ＥＲＨタンパク質のアミノ酸２７〜１０４（図３に示す；配列番
号６）；ｈｓＲｅｑ*−１タンパク質の少なくともアミノ酸残基２５８〜、およ び２６７〜２８０（図に示す；配列番号９）；ｈｓＲｅｑ*−２タンパク質の少 なくともアミノ酸残基１８８〜、および１９７〜２１０（図に示す；配列番号１
１）。さらに、その複合体のいずれかのメンバーの上記の領域のいくつかまたは
すべてを欠き得るフラグメント（またはそのフラグメントを含むタンパク質）、
ならびに上記のタンパク質をコードする核酸もまた、本明細書において開示され
る。
【００３６】 本発明はさらに、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２タンパク質、ならび
にその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログおよびパラログに関する。好
ましい実施態様において、ヒトｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２遺伝子お
よび／またはタンパク質が開示される。特定の実施態様において、この誘導体、
フラグメント、アナログ、ホモログまたはパラログは、以下の特性を有する：（
ｉ）機能的に活性である（すなわち、全長の野生型ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓ Ｒｅｑ*−２に関連する１つ以上の機能的活性を示し得る）；（ｉｉ）ＣＤＫ２ タンパク質に結合する能力を保持する；（ｉｉｉ）免疫原性であるか、あるいは
（ｉｖ）抗原性である。
【００３７】 ヒトＣＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、およびＥＲＨをコードするヌクレオ
チド配列、ならびにその対応アミノ酸配列は公知であり（それぞれ、ＧｅｎＢａ
ｎｋ登録番号Ｘ６１６２２、同Ｕ１１７９１、同Ｄ５０３１０、および同８５７
５８）、それぞれ図１〜４に提供され、そしてそれぞれ配列番号１〜８によって
示す。さらに、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列ｈｓＲｅｑ*−１およびｈ ｓＲｅｑ*−２を、それぞれ図６および図７に提供する（それぞれ、配列番号８ 〜１２）。核酸は、当該分野で公知の任意の方法によって入手され得る（例えば
、その配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズし得る合成プライマーを
用いたＰＣＲ増幅によるか、および／または所定の遺伝子配列について特異的な
オリゴヌクレオチド配列を用いたｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーからのク
ローニングによる）。
【００３８】 ホモログ（すなわち、ヒト以外の種に由来する上記のタンパク質をコードする
核酸）、または他の関連配列（例えば、パラログ）もまた、特定のヒト胚列の全
てまたは一部をプローブとして用いて、核酸ハイブリダイゼーションおよびクロ
ーニングについて当該分野で周知の方法を用いて、低度、中程度、または高度な
ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによって入手され得る。
【００３９】 ＣＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲ ｅｑ*−２タンパク質は、単独または複合体内のいずれかで、タンパク質精製お よび組換えタンパク質発現について当該分野で周知の方法により入手され得る。
このタンパク質の１つ以上の組換え発現について、このタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含む核酸が、適切な発現ベクター（すな
わち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳のために必要なエレメ
ントを含むベクター）に挿入され得る。好ましい実施態様において、調節エレメ
ントは、異種（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターではない）である。あ
るいは、必要な転写および翻訳シグナルもまた、ＣＤＫ２タンパク質または任意
のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子および／またはそれらの隣接領域についての
ネイティブプロモーターによって供給され得る。
【００４０】 種々の宿主ベクター系が、タンパク質コード配列を発現させるために利用され
得る。これらには、以下が含まれるがそれらに限定されない：（ｉ）ワクシニア
ウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳動物細胞系；（ｉｉ）バキュロウ
イルスなどに感染した昆虫細胞系；（ｉｉｉ）酵母ベクターを含む酵母、または
（ｉｖ）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮ
Ａで形質転換した細菌。利用される宿主ベクター系に依存して、多数の適切な転
写エレメントおよび翻訳エレメントの任意の一つが使用され得る。
【００４１】 本発明の好ましい実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク
質−ＩＰ複合体は、同一細胞内で、ＣＤＫ２タンパク質全体をコードする配列お
よびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰをコードする配列を、同一のプロモーターまたは
２つの別個のプロモーターのいずれかの制御下で発現させることにより得られる
。別の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質の誘導体、フラグメントもしくは
ホモログ、および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメントも
しくはホモログが組換え発現される。好ましくは、ＣＤＫ２タンパク質の誘導体
、フラグメントもしくはホモログ、および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰは
、結合アッセイ（例えば、改変された酵母ツーハイブリッド系アッセイ）によっ
て同定された結合パートナーと複合体を形成し、そしてより好ましくは、抗ＣＤ
Ｋ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体抗体と結合する複合体を形成
する。
【００４２】 ベクター中へ核酸フラグメントを挿入することに関して関連する先行技術にお
いて公知である方法論のいずれかを利用して、適切な転写／翻訳制御シグナルお
よびタンパク質コード配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築し得る
。これらの方法論は、以下を含み得るがそれらに限定されない：インビトロ組換
えＤＮＡおよび合成技術、ならびにインビトロ組換え技術（例えば，遺伝子組換
え）。ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ、またはそれらの誘
導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸配列の発現は
、その遺伝子またはそのフラグメントが目的の組換えＤＮＡ分子で同時形質転換
された宿主において発現されるように、第二の核酸配列によって調節され得る。
特定のタンパク質の発現は、以下を含むがそれらに限定されない当該分野で公知
の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る：（ｉ）ＳＶ４０初
期プロモーター（例えば、ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、
Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）；（ｉｉ）ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ；例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７
を参照のこと）の３’末端の長末端反復内に含まれるプロモーター；（ｉｉｉ）
ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１
９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：７８：１４４１−１
４４５を参照のこと）；（ｉｖ）メタロチオネイン遺伝子の調節配列（例えば、
Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２を参照のこ
と）；（ｖ）原核生物発現ベクター（例えば、βラクタマーゼプロモーター（例
えば、Ｖｉｌｌｅ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１を参照のこと））；（ｖｉ）
ｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５を参照のこと）。
【００４３】 さらに、以下を含むがそれらに限定されない植物発現ベクター内の植物プロモ
ーター／エンハンサー配列もまた利用され得る：（ｉ）ノパリンシンセターゼプ
ロモーター（例えば、Ｈｅｒｒａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３０３：２０９−２１３を参照のこと）；（ｉｉ）カリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（例えば、Ｇａｒｄｅｒら、１９８１、Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：２８７１を参照のこと）および（ｉｉｉ）光合
成酵素であるリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（例えば、Ｈｅｒｒｅｒａ
−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５−１２０を参
照のこと）。
【００４４】 酵母および他の真菌からのプロモーター／エンハンサーエレメント（例えば、
Ｇａｌ４プロモーター、アルコールでヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリ
セロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）、なら
びに以下の動物の転写制御領域（これは、組織特性を有し、そしてトランスジェ
ニック動物において使用されている）は、本発明のタンパク質の産生において利
用され得る。動物に由来する転写制御配列は、以下を含むがそれらに限定されな
い：（ｉ）膵臓腺房細胞内で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（例えば
、Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｍｉｔｚら、
１９８６．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂ
ｉｏｌ．５０：３９９−４０９を参照のこと）；（ｉｉ）膵臓β細胞内で活性で
あるインスリン遺伝子制御領域（例えば、Ｈａｎａｈａｎら、１９８５、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１５：１１５−１２２を参照のこと）；（ｉｉｉ）リンパ細胞内で活
性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８
４、Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８を参照のこと）；（ｉｖ）精巣、乳房、リ
ンパ細胞およびマスト細胞内で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（例えば
、Ｌｅｄｅｒら、１９８６ Ｃｅｌｌ ４５：４８４−４９４を参照のこと）；
（ｖ）肝臓内で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Ｐｉｎｃｋｅｒ
ｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６を参照
のこと）；（ｖｉ）肝臓内で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（
例えば、Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１
６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３
−５８を参照のこと）、（ｖｉｉ）肝臓内で活性であるアンチトリプシン遺伝子
制御領域（例えば、Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅ
ｌ．１：１６１−１７１を参照のこと）；（ｖｉｉｉ）骨髄細胞内で活性である
β−グロビン遺伝子制御領域（例えば、Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１５：３３８−３４０を参照のこと）；（ｉｘ）脳稀突起神経膠芽細胞内
で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（例えば、Ｒｅａｄｈｅ
ａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ．４８：７０３−７１２を参照のこと）；（ｘ）骨
格筋内で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（例えば、Ｓａｎｉら、１
９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２８３−２８６を参照のこと）、ならびに（ｘ
ｉ）視床下部内で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子領域（例えば
、Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８を参
照のこと）。
【００４５】 本発明の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰ（例えば、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１および ｈｓＲｅｑ*−２）、あるいはそのフラグメント、誘導体またはホモログをコー ドする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、１つ以上の複製起点およ
び必要に応じて、１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含
むベクターが利用される。好ましい実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質およ
びＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの両方をコードする核酸配列に作動可能に連結され
たプロモーター、１つ以上の複製起点、および必要に応じて１つ以上の選択マー
カーを含むベクターが利用される。
【００４６】 別の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰのコード配列（またはその部分）を一緒にか別々にかのいずれかで含む発
現ベクター。この発現ベクターは、上記の遺伝子配列を、３つの利用可能なｐＧ
ＥＸベクター（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ発現ベクター；例えば、
ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８、Ｇｅｎｅ ７：３１−４０を参照
のこと）の各々のＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングすること、それによっ
て、正確なリーディングフレーム内での産物の発現を可能にすることによって産
生される。目的の配列を含む発現ベクターは、３つの一般的なアプローチによっ
て同定され得る：（ｉ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）「マーカー」遺
伝子機能の存在または非存在、および／または（ｉｉｉ）挿入された配列の発現
。第一のアプローチにおいて、ＣＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈ
ｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２（または他のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ配
列）は、目的の挿入配列と相同なまたは相補的な配列を含むプローブを用いた核
酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第二のアプローチにおいて、
組換えベクター／宿主系は、ベクターへの目的の配列の挿入によって生じた特定
の「マーカー」機能（例えば、ＣＤＫ２タンパク質、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ
、またはＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体について特異的
な抗体との結合、抗生物質に対する耐性、バキュロウイルス内への封入体形成な
ど）の存在または非存在に基づいて同定および選択され得る。第三のアプローチ
において、組換え発現ベクターは、組換えベクターによる上記のＣＤＫ２タンパ
ク質−ＩＰの発現と同時にＣＤＫ２タンパク質の発現についてアッセイすること
によって同定され得る。
【００４７】 一旦組換えＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ分子が同定さ
れ、そしてその複合体または個々のタンパク質が単離され、そして適切な宿主系
および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターが大量に増殖および増幅さ
れ得る。以前に議論したように、使用され得る発現ベクターまたはその誘導体は
以下を含むがそれらに限定されない：ヒトまたは動物のウイルス（例えば、ワク
シニアウイルスまたはアデノウイルス）；昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイ
ルス）；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、λファージ）；
プラスミドベクターおよびコスミドベクター。
【００４８】 次いで、目的の挿入された配列の発現を調節するか、または所望された特定の
様式で発現されたタンパク質を改変／プロセシングする宿主細胞株が選択され得
る。さらに、特定のプロモーターからの発現は、特定のインデューサーの存在下
で増強され得；従って、遺伝子操作されたＣＤＫ２タンパク質および／またはＣ
ＤＫ２タンパク質−ＩＰの発現制御を容易にする。さらに、異なる宿主細胞は、
発現されたタンパク質の、翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変について
の特徴および特定の機構（例えば、グリコシル化、リン酸化など）を有する。従
って、外来タンパク質の所望される改変およびプロセシングの達成を確実にする
に適切な細胞株または宿主系が選択され得る。例えば、細菌系内でのタンパク質
発現は、グリコシル化されていないコアタンパク質を生成するのに使用され得る
が、哺乳動物内での発現は、異種タンパク質の「ネイティブな」グリコシル化を
確実にする。
【００４９】 他の特定の実施態様において，ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タ
ンパク質−ＩＰ（またはその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログ）
は、異なるタンパク質の異種タンパク質配列に対してペプチド結合を介して結合
されたタンパク質を含む融合体またはキメラタンパク質産物として発現され得る
。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を互い
に適切なコードフレームで連結すること、および次いで当該分野で公知の方法に
よって適切な宿主においてそのキメラ産物を発現させることによって産生され得
る。あるいは、このようなキメラ産物は、タンパク質合成技術によって作製され
得る（例えば、ペプチド合成機の使用による）。本発明の特定の実施態様は、Ｃ
ＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰのフラグメントを含
むキメラタンパク質を開示する。別の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパ
ク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰのドメイン（これは、ＣＤＫ２タンパク質
・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の直接的な形成を生じる）、および必要に応
じて、上記の２つのタンパク質を連結すること、およびＣＤＫ２タンパク質およ
びＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの結合ドメインの相互作用を促進することの両方に
役立つ、異種官能性試薬（例えば、ペプチドリンカー）を含む融合タンパク質が
提供される。これらの融合タンパク質は、その相互作用の安定性（すなわち、分
子内反応としてのその複合体の形成に起因する安定性）が所望される場合（例え
ば、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体に特異的な抗体の産
生において）特に有用であり得る。
【００５０】 本発明の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰの少なくとも６つの連続するアミノ酸残基からなる、ＣＤＫ
２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰのフラグメントからなるか、また
はこれらを含有するタンパク質をコードする核酸およびタンパク質が、本明細書
において提供される。別の実施態様において、上記のタンパク質フラグメントは
、ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの少なくとも１０、２０
、３０、４０または５０アミノ酸残基（好ましくは、３５、１００または２００
アミノ酸残基より大きくない）を含む。ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タン
パク質−ＩＰの誘導体またはアナログとしては：（ｉ）同一のサイズのアミノ酸
配列と比較する場合、（ｉｉ）当該分野において公知のコンピュータホモロジー
プログラムによって行われるアラインメントにおいて整列される配列と比較する
場合、あるいは（ｉｉｉ）コードする核酸がストリンジェントか、中程度にスト
リンジェントか、またはストリンジェントではない条件下において、ＣＤＫ２タ
ンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰをコードする配列とハイブリダイズし
得る場合、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０
％または９５％のアミノ酸同一性の、種々の実施態様におけるＣＤＫ２タンパク
質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰに実質的に相同な領域を含む分子が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【００５１】 ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ誘導体は、機能
的等価分子を生じる、置換、付加または欠失によるその配列の改変によって生成
され得る。本発明の特定の実施態様において、ヌクレオチドコード配列の縮重性
は、ＣＤＫ２タンパク質遺伝子またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子と実質的
に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列の使用を可能にする。他の特
定の実施態様において、目的の配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、類似の極性
および全体的な荷電の、別のアミノ酸によって置換し得、従って、非表現型変化
を生じ得る。この配列内のアミノ酸の置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの
他のメンバーから選択され得る。本発明のＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タ
ンパク質−ＩＰの誘導体およびアナログは、当該分野において公知の種々の方法
論によって生成され得る。例えば、クローン化されたＣＤＫ２タンパク質および
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子配列は、当該分野において公知の多くの方法の
いずれかによって改変され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０．Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと。これら
の配列は、インビトロで、制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な部位にて消化
され得、次に、そのように所望される場合、さらに酵素修飾され、そして生じる
フラグメントが単離され連結され得る。さらに、ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤ
Ｋ２タンパク質−ＩＰをコードする核酸は、インビトロまたはインビボにおいて
変異誘発され得：（ｉ）コード領域において改変を生じ得る、（ｉｉ）翻訳配列
、開始配列、および／または終結配列を、生成および／または破壊し得る、なら
びに／あるいは（ｉｉｉ）新規の制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し得るか、
または以前に存在する部位を破壊し得、その結果、さらなるインビトロの改変を
促進し得る。化学変異誘発およびインビトロ部位特異的変異誘発（例えば、Ｈｕ
ｎｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１
〜６５５８を参照のこと）（ＴＡＢＪリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および類
似の方法論の使用による）、を含むが、これらに限定されない、当該分野におい
て公知の変異誘発の任意の技術が使用され得る。
【００５２】 一旦、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ、あるい
は、そのフラグメントまたは誘導体を発現する組換え細胞が同定されると、個々
の遺伝子産物または複合体は、単離されそして分析され得る。このことは、タン
パク質または複合体の物理的および／または機能的特性に基づくアッセイ（産物
の放射性標識後に、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、マーカー標識産物との架橋な
どによる分析を含むがこれに限定されない）によって達成される。ＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体は、当該分野において公知の標準的な
方法によって（天然の供給源またはタンパク質／タンパク質複合体を発現する組
換え宿主細胞のいずれかから）単離および精製され得る。この方法は、カラムク
ロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、ゲル濾過、逆相、高
圧、高速タンパク質液体など）、差示的遠心分離、差示的溶解度、またはタンパ
ク質精製について使用される類似の方法論を含むが、これらに限定されない。あ
るいは、一旦、ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰあるいはそ
の誘導体が同定されると、タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質がコードさ
れるキメラ遺伝子の核酸配列より推定され得る。それゆえ、タンパク質またはそ
の誘導体は、当該分野において公知の標準的な化学的方法論によって合成され得
る。例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、１９８４．Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１
０５〜１１１を参照のこと。
【００５３】 本発明の特定の実施態様において、そのようなＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２
タンパク質−ＩＰ複合体は、組換えＤＮＡ技術か、化学的合成方法によって生成
されるか、あるいは天然の供給源からの精製によって生成されるかにかかわらず
、一次アミノ酸配列として含まれるタンパク質、図１〜４［配列番号２、４、６
、および８］に実質的に示されるアミノ酸配列の全部または一部、ならびにその
フラグメント、アナログ、および誘導体（それに対するタンパク質ホモログを含
む）を含むがこれらに限定されない。
【００５４】 ＣＤＫ２タンパク質配列および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ配列の操作
は、タンパク質レベルにおいて行われ得る。本発明の範囲に包含されるものは、
ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰフラグメント、誘導体、ま
たは翻訳の間または翻訳後に差示的に改変されるフラグメントもしくはアナログ
（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブ
ロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性分解、抗体分子または他の細胞
性リガンドとの連結など）の複合体である。ブロモシアン、トリプシン、キモト
リプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、による特異的化学的切断、ＮａＢＨ4 、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下の代謝合成が
挙げられるが、これらに限定されない当該分野において公知の多くの化学的改変
方法論のいずれかが、使用され得る。特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパ
ク質配列および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ配列が改変され、蛍光標識を
含む。別の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰが、異種機能性試薬の取り込みによって改変され、ここでそ
のような異種機能性試薬を使用して、複合体のメンバーを架橋し得る。
【００５５】 さらに、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰのアナ
ログおよび誘導体の複合体は、化学的に合成され得る。例えば、ＣＤＫ２タンパ
ク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの一部に対応するペプチド（所望
のドメインを含むか、またはインビトロにおいて所望の活性を媒介する（例えば
、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体形成））は、ペプチド
合成機の使用により合成され得る。天然の産物が「変異体」であるまたは新種か
ら単離されたと疑われる場合、ＣＤＫ２タンパク質、天然の供給源から単離され
たＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ、ならびにインビトロで発現されたタンパク質、あ
るいはインビボまたはインビトロにおいて合成された発現ベクターに由来するタ
ンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列の解析よって決定され得るか、あるいは
、単離されたタンパク質の直接配列決定によって決定され得る。ＣＤＫ２タンパ
ク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体はまた、親水性分析によって分析され得
る（例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ７８：３８２４〜３８２８）。この分析は、タンパク
質の領域の疎水性および親水性領域の同定に使用され得、従って、結合実験、抗
体合成などのような実験操作についての基質の設計を補助する。二次構造分析は
また、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの領域の同
定を行い得、これは特定の構造モチーフを推定する。例えば、ＣｈｏｕおよびＦ
ａｓｍａｎ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：２２２〜２２３を参照のこと。
操作、翻訳、二次構造予測、親水性および疎水性プロフィール、オープンリーデ
ィングフレーム予測およびプロッティング、ならびに配列相同性の決定は、当該
分野において利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムの使用により達成
され得る。
【００５６】 Ｘ線結晶解析（例えば、Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、１９７４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘ
ｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７〜１３を参照のこと）；質量分析法およびガスクロマト
グラフィー（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ
、１９９７．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参
照のこと）およびコンピュータモデリング（例えば、Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋおよ
びＺｏｌｌｅｒ編、１９８６．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと）が含まれるがこれらに限定されない他
の構造分析の方法もまた使用され得る。
【００５７】 （（２）ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２をコードする配列） 本発明は、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２をコードする核酸のヌクレ
オチド配列を開示する。特定の実施態様において、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓ Ｒｅｑ*−２核酸の核酸配列が、配列番号１０および１２にそれぞれ記載される ；ここでこれらの核酸の関連する推定アミノ酸配列を、配列番号１１および１３
にそれぞれ示す。本発明はまた、上記の配列にハイブリダイズし得るか、または
相補的な核酸に関する。特定の局面において、ｈｓＲｅｑ*−１またはｈｓＲｅ ｑ*−２遺伝子の少なくとも１０、２５、５０、１００、または２００ヌクレオ チド、あるいはその全コード領域（ｈｓＲｅｑ*−１またはｈｓＲｅｑ*−２の選
択的スプライシング接合部（すなわち、ｈｓＲｅｑ ｍＲＮＡプロセッシングに
おいて形成されるスプライシング接合部ではない）にわたるｈｓＲｅｑ*−１ま たはｈｓＲｅｑ*−２ヌクレオチド配列の部分を含む）において相補的な配列（ 特に逆向き相補的な）を含む核酸が提供される。
【００５８】 本発明の特定の実施態様において、ｈｓＲｅｑ*−１核酸またはｈｓＲｅｑ*−
２核酸（例えば、配列番号１０または１２のそれぞれに対するアンチセンスであ
る配列を有する）、あるいはその誘導体に対して、低ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件においてハイブリダイズし得る核酸が、本明細書において
開示される。限定ではなく例示の目的で、そのような低、中または高ストリンジ
ェンシーのハイブリダイゼーションの条件を使う手順は、当業者にとって公知で
あり得る（ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ７８：６７８９〜６７９２）。当該分野におい
て周知の高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションの他の条件がまた、本
発明の実施において使用され得る。
【００５９】 ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２タンパク質の誘導体、フラグメントお
よびアナログをコードする核酸、ならびにｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−
２アンチセンス核酸が、さらに開示される。ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ* −２のアミノ酸および核酸配列を、上記のように、コンピュータによって（ｉｎ
ｓｉｌｉｃｏ）決定した。同一または異なる種の、他のｈｓＲｅｑ*−１また はｈｓＲｅｑ*−２核酸の間で（ホモロジーをともない）保存されている領域を 含むｈｓＲｅｑ*−１またはｈｓＲｅｑ*−２核酸のフラグメントもまた、提供さ
れる。具体的には、本発明は、ｈｓＲｅｑ*−１またはｈｓＲｅｑ*−２の選択的
スプライシング接合部にわたるｈｓＲｅｑ*−１またはｈｓＲｅｑ*−２のヌクレ
オチド配列の一部を含むｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２の核酸のフラグ
メントに関連する。
【００６０】 ｈｓＲｅｑの公知のタンパク質ｃＤＮＡの３’非翻訳領域内の領域を、改善さ
れたバージョンの酵母ツーハイブリッドシステム（例えば、上記に記載）を使用
して、ＣＤＫ２と相互作用するタンパク質をコードするとして同定した。本発明
は、相互作用するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ヌクレオチド１
７８９〜２４００およびヌクレオチド１８１９〜２４００のｈｓＲｅｑヌクレオ
チド配列の非翻訳部分（図６（配列番号７）において示される）と同一であるこ
とを決定した。
【００６１】 このことは、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２がｈｓＲｅｑ ｍＲＮＡ
のプロセッシングにおいて使用されるスプライシング部位とは異なるスプライシ
ング部位においてプロセッシングされていないｈｓＲｅｑ遺伝子ｍＲＮＡのスプ
ライシングより生じるｍＲＮＡによってコードされることを、示す。これらのｈ
ｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２配列を、ｈｓＲｅｑ配列中の選択的５’お
よび３’スプライシング部位を同定することにより決定した。
【００６２】 タンパク質スプライシング改変体についての５’および３’スプライシング点
の決定は、当該分野において公知の任意の方法によって行われ得る。例えば、限
定する目的ではないが、５’および３’スプライシング点は、以下のように決定
され得る：（ａ）第１に、可能性のある５’スプライシング部位が公知のタンパ
ク質（すなわち、ｈｓＲｅｑ）のコード配列において同定され得る。５’スプラ
イシング部位の配列は、不変のＧＴ配列をイントロンの開始部位に有し、そして
残りの塩基は不変ではないが、好ましいコンセンサス配列は、ＡＧ：ＧＴＡＡＧ
Ｔであり、コロンはスプライシング点を示す（Ｐａｄｇｅｔｔら、１９８４、Ａ
ｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９〜１１５０）。 （ｂ）次に、可能性のあるイントロン：エクソンスプライシング部位はまた、Ｐ
ａｄｇｅｔｔら（１９８４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９
〜１１５０）により記載されるコンセンサス分析に基づいて同定され得る。３’
イントロン：エクソンスプライシング部位は、スプライシング部位の５’にＡＧ
配列を有さなくてはならず（「ＡＧ：」と称する）、そしてＡＧ：配列に対する
５’の（先行する）塩基は、ＣまたはＴでなければならない。イントロンの最後
のＧヌクレオチドの５〜１４ヌクレオチド５’のヌクレオチドは、せいぜい２つ
の非Ｔ、非Ｃ塩基を含み得る（Ｐａｄｇｅｔｔら、１９８４、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５：１１１９〜１１５０）。そのような可能性のある３’イ
ントロン：エクソンスプライシング部位を同定するために、可能性のある５’ス
プライシング部位と検出された相互作用するタンパク質またはタンパク質フラグ
メントをコードするヌクレオチド配列の開始部位との間の配列は、不変のＡＧ：
配列（不変領域に先行する塩基は、ＣまたはＴでなければならない）についてス
キャンされる。 （ｃ）次に、成熟タンパク質の公知の翻訳読み枠および各々の推定５’スプライ
シング部位に基づき、成功するスプライシングのための適合性の翻訳読み枠が、
可能性のある３’スプライシング部位について規定される。ヌクレオチド配列は
、当該分野において利用可能な多数のヌクレオチド配列分析プログラムによって
、分析され得、可能性のあるタンパク質翻訳産物を規定する。３つの正方向翻訳
読み枠における翻訳は、可能性のあるオープンリーディングフレーム（終止コド
ンの存在を伴わない、アミノ酸のコドンの連続する範囲）を規定する。５’プラ
イムスプライシング接合部に必要な翻訳読み枠に適合する３’部位のみが、保持
される。適合しない５’または３’スプライシング部位は、除去される。理想的
な３’スプライシング部位の適合が見出されない場合、スプライシング部位の上
流の３つの非Ｃ、非Ｔ塩基を含む部位が、次に試験される。 （ｄ）各々の可能な５’：３’スプライシング部位の対について、哺乳動物分岐
点コンセンサス配列についての検索が行われる（ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉ
ｓ、１９８８、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２：１２６８〜１２７６）。分岐点を、コ
ンセンサス配列Ｔ／ＣＮＣＴＧＡＣ（規定する６塩基のうちの５塩基が適合しな
くてはならず、そしてコンセンサス配列は、３’スプライシング部位の２０〜６
０ヌクレオチド５’に存在しなくてはならない）によって同定する。プレｍＲＮ
Ａスプライシングのために絶対的に必要なわけではないが、コンセンサス配列の
存在は、スプライシング効率を上昇する。従って、分岐点コンセンサス配列をと
もなう５’；３’スプライシング部位の対は、分岐点コンセンサス配列を有さな
いスプライシング部位の対に対して、保存されている。 （ｅ）最後に、新規のスプライシング改変体タンパク質は、少なくとも６０アミ
ノ酸残基をコードし、存在し得るインビボ産物を構成しなけらばならない。さら
に、スプライシング改変体の３’末端は、規定によって、同定される相互作用配
列中に伸長しなけらばならない。
【００６３】 本発明においてｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２と称し、それぞれ図６
および７において示される、ｈｓＲｅｑの２つのスプライシング改変体のアミノ
酸および核酸配列を、上記の６．３章において例示したように、上記のようにコ
ンピュータにおいて（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）決定した。ｈｓＲｅｑ*−１につい て、５’スプライシング部位を、ｈｓＲｅｑヌクレオチド配列（図４）のヌクレ
オチド５６３〜５７０（第１エクソンの最後の塩基をヌクレオチド番号５６４と
する）において同定し、そして３’スプライシング部位をｈｓＲｅｑヌクレオチ
ド配列のヌクレオチド１５６６〜１５８０に同定した（第２のエキソンの最初の
塩基をヌクレオチド番号１５８０とする）。ｈｓＲｅｑ*−１の翻訳終止コドン を、ｈｓＲｅｑヌクレオチド配列の１８６１〜１８６３ヌクレオチドとして同定
した。ｈｓＲｅｑ*−１スプライシングの分岐点コンセンサス領域は、ｈｓＲｅ ｑヌクレオチド配列のヌクレオチド１５３８〜１５４４において同定された。
【００６４】 ｈｓＲｅｑ*−２について、５’スプライシング部位を、ｈｓＲｅｑ配列のヌ クレオチド５６３〜５７０において同定し（図４）（第１エクソンの最後の塩基
をヌクレオチド番号５６４とする）、そして３’スプライシング部位をｈｓＲｅ
ｑヌクレオチド配列のヌクレオチド１７７６〜１７９０において同定した（第２
エクソンの最後の塩基をヌクレオチド番号１７９０とする）。この３’スプライ
シング部位に関連する分岐点は、ｈｓＲｅｑ配列のヌクレオチド１７５９〜１７
６５に存在し、そしてｈｓＲｅｑ*−２についての翻訳終止コドンは、ｈｓＲｅ ｑヌクレオチド配列のヌクレオチド１８６１〜１８６３である。
【００６５】 当該分野において利用可能な任意の方法論を使用して、ｈｓＲｅｑ*−１およ びｈｓＲｅｑ*−２をコードする全長（すなわち、コード領域全体を含む）ｃＤ ＮＡクローンを取得し得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し
て、ｃＤＮＡライブラリー中の配列を増幅し得る。同様に、オリゴヌクレオチド
プライマーをまた使用して、核酸サンプル（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、好ましくは
適切な供給源（例えば、改変酵母ツーハイブリッドアッセイ融合集団が由来した
最初のｃＤＮＡライブラリーが由来するサンプル）由来のｃＤＮＡライブラリー
由来の配列をＰＣＲによって増幅し得る。
【００６６】 ＰＣＲは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓサーマルサイクラ
ーおよびＴａｑポリメラーゼを使用して、行い得る。増幅されるＤＮＡは、好ま
しくは、任意の真核生物種由来のｃＤＮＡである。いくつかの異なる縮重プライ
マーを、ＰＣＲ反応における使用のために合成し得ることに留意すべきである。
ＰＣＲ反応のプライミングにおいて使用されるハイブリダイゼーション条件のス
トリンジェンシーを変化し、既知のヌクレオチド配列と単離されるべき核酸ホモ
ログとの間のヌクレオチド配列類似性のより大きいか、またはより小さい程度を
許容することにより、核酸ホモログを増幅することもまた可能である。種間ハイ
ブリダイゼーションのために、低ストリンジェンシー条件が好ましい；一方、同
一種ハイブリダイゼーションについて、中程度にストリンジェントな条件が好ま
しい。
【００６７】 任意の真核生物細胞が、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２配列の分子ク
ローニングのための核酸供給源として潜在的に作用し得る。ＤＮＡは、クローン
化ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から当該分野において公知の標準
的な手順によってか、化学合成によってか、ｃＤＮＡクローニングによってか、
またはゲノムＤＮＡもしくは所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡのフラグメ
ントのクローニングによって取得し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８
９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ．第２版、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．ＮＹ）；Ｇｌｏｖ
ｅｒ．１９８５．ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ（ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．第Ｉ、ＩＩ
巻）を参照のこと。ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、エクソン（コード）領域に
加え、調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含み得る；一方、ｃＤＮＡ由来の
クローンは、エクソン配列のみを含有する。
【００６８】 本発明の好ましい実施態様において、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２
核酸は、ｃＤＮＡ供給源に由来する。所望の配列を含有する特定のｃＤＮＡの同
定は、多くの方法によって達成され得る。１つの方法論において、ｈｓＲｅｑ* −１またはｈｓＲｅｑ*−２配列の一部（例えば、上記のように得られたＰＣＲ 増幅産物）、あるいは公知のヌクレオチド配列の一部の配列を保有するオリゴヌ
クレオチド、あるいはその特異的なＲＮＡ、あるいはそのフラグメントは、精製
され、増幅され、標識され得、そして生成された核酸フラグメントは、標識され
たプローブを使用して核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングされ
得る。例えば、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、１９７７．Ｓｃｉｅｎｃｅ １
９６：１８０を参照のこと。第２の方法論において、適切なフラグメントは、制
限酵素消化、そして公知の制限地図（もしそのようなものが利用可能である場合
）との比較から予測されるフラグメントサイズの比較によるか、あるいはＤＮＡ
配列解析およびｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２の公知のヌクレオチド配
列との比較によって、同定される。第３の方法論において、目的の遺伝子は、そ
の発現されたタンパク質の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイ
を用いて検出され得る。例えば、ｃＤＮＡクローン（すなわち、適切なｍＲＮＡ
をハイブリッド選択するＤＮＡクローン）は、例えば、類似かまたは同一の電気
泳動移動特性、等電点挙動特性、タンパク質分解性分解地図の特性、抗原性特性
またはＣＤＫ２タンパク質に結合する能力を有するタンパク質のその生成物の機
能として選択され得る。第４の方法論において、抗ｈｓＲｅｑ*−１または抗ｈ ｓＲｅｑ*−２抗体が利用可能であれば、目的のタンパク質が、酵素結合免疫吸 着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、標識化抗体の推定ｈｓＲｅｑ*−１および ｈｓＲｅｑ*−２クローンに対する結合によって同定され得る。
【００６９】 本発明の特定の実施態様において、単離および同定に続いて、次に、核酸は、
適切なクローニングベクター（バクテリオファージ（例えば、λ誘導体）または
細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
（登録商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を含
むがこれらに限定されない）中に挿入され得る。クローニングベクター中への目
的の核酸の挿入は、例えば、相補的な粘着末端を有するベクター中へのＤＮＡフ
ラグメントの連結によって促進され得るか、または、もしクローニングベクター
中に相補的粘着末端が存在しない場合、そのＤＮＡ挿入物またはベクター分子の
末端が酵素学的に改変され得る。あるいは、任意の制限部位がＤＮＡ末端へのリ
ンカー配列の連結によって生成され得：ここでこれらのリンカー配列は、制限エ
ンドヌクレアーゼ認識配列を有する、特定の化学的合成オリゴヌクレオチドを含
み得る。さらなる実施態様において、切断されたベクターならびにｈｓＲｅｑ* −１およびｈｓＲｅｑ*−２配列の両方は、相補的なホモポリマー性のテーリン グによって改変され得る。組換え分子が、形質転換、感染、エレクトロポーレー
ションなどを介して宿主細胞に導入され得る。さらに別の実施態様において、所
望の遺伝子は、同定され、そして「ショットガン」アプローチにおいて適切なク
ローニングベクター中への挿入後に単離され得る。所望の遺伝子の富化（例えば
、サイズ分画による）を、クローニングベクター中への導入前に行い得る。
【００７０】 本発明によって提供されるｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２配列は、天
然のｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２タンパク質、および機能的に等価な
アミノ酸を有するアミノ酸配列によってコードされるタンパク質において見いだ
されるものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、なら
びに他のｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２誘導体、フラグメントまたはア
ナログをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７１】 （（３）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体に対する抗体の
産生） 本明細書において、本発明により開示されるように、ＣＤＫ２タンパク質・Ｃ
ＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ
もしくはホモログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生
成において免疫原として利用され得る。このような抗体としては、ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆabフラグメントおよび
Ｆab発現ライブラリーが挙げられるが、これに限定されない。特定の実施態様で
は、ヒトＣＤＫ２タンパク質およびヒトＣＤＫ２タンパク質ＩＰの複合体に対す
る抗体が開示される。別の特定の実施態様では、複合体は、ＣＤＫ２タンパク質
およびＣＤＫ２タンパク質ＩＰのフラグメントから形成され；ここでこれらのフ
ラグメントは、複合体の他のメンバーと相互作用するタンパク質ドメインを含み
、そして抗体産生のための免疫原として用いられる。当該分野で公知の種々の手
順は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体、またはそれらの誘
導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナル抗体ま
たはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。
【００７２】 ポリクローナル抗体の産生のため、種々の宿主動物を、天然のＣＤＫ２タンパ
ク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体もしくは合成バージョン、または前記の誘
導体（例えば、架橋されたＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ）を用
いた注射により免疫し得る。種々のアジュバントを用い、免疫学的応答を増加さ
せ得る。このアジュバントとして、フロイント（完全および不完全）、無機塩ゲ
ル（例えば水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プル
ロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェ
ノールなど）ならびにＢａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣ
Ｇ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュ
バントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体またはその誘導体、フラ
グメント、アナログもしくはホモログを指向するモノクローナル抗体の調製のた
めに、連続細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術を利用し得る
。このような技術には、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ，１９７５．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７を参照のこと）；トリ
オーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗
体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５．Ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁）を参照のこと）が挙げ
られるが、これに限定されない。本発明のさらなる実施態様において、モノクロ
ーナル抗体は、現在開発された技術を利用して無菌動物で産生され得る。ＰＣＴ
公開ＵＳ ９０／０２５４５を参照のこと。ヒトモノクローナル抗体は、本発明
の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅら、１
９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２０２６〜２
０３０を参照のこと）により、またはインビトロでのエプスタイン バール ウ
イルス（ＥＢＶ）を用いたヒトＢ細胞の形質転換（Ｃｏｌｅら、１９８５．Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６頁）参照のこと）により
産生され得る。
【００７４】 本発明のさらなる実施態様において、単鎖抗体の産生のための技術が開示され
（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照のこと）、これは、ＣＤＫ２タ
ンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体特異的単鎖抗体の産生に適合され得る
。さらなる別の実施態様において、Ｆab発現ライブラリーの構築のための方法論
が開示され（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７
５〜１２８１を参照のこと）、これは、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク
質ＩＰまたはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対して所
望の特異性を有するモノクローナルＦabフラグメントの迅速かつ有効な同定を可
能にする。さらに、本発明は、当該分野で公知の技術による非ヒト抗体の「ヒト
化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）」のための方法論を開示する。例えば、米国特
許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパ
ク質ＩＰ複合体のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で公知の
技術により産生され得る。このフラグメントには以下が挙げられるがこれらに限
られない：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）2フラ グメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋の還元によ り産生され得るＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いた
抗体分子の処理により生成され得るＦａｂフラグメントならびに（ｉｖ）Ｆvフ ラグメント。
【００７５】 本発明の１つの実施態様において、所望される特異性を有する抗体のスクリー
ニングのための方法論としては、固相酵素免疫検定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋ
ｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｌｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）および当該分
野で公知の他の免疫学の媒介する技術が挙げられるが、これらには限定されない
。特定の実施態様では、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の
特定のドメインに特異的な抗体の選択は、このようなドメインを有するＣＤＫ２
タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体のフラグメントに結合するハイブリ
ドーマの生成により促進される。別の特定の実施態様では、ＣＤＫ２タンパク質
・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体に特異的に結合するが、ＣＤＫ２タンパク質・
ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の個々のタンパク質には特異的に結合しない抗体
の選択のための方法論（個々のＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質Ｉ
Ｐタンパク質への結合を共に欠いた、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質
ＩＰ複合体への陽性の結合に基づいて抗体を選択することにより）が、本明細書
において開示される。従って、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複
合体またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログ内のドメイン
に特異的な抗体もまた、本明細書において提供される。
【００７６】 前記の抗体が、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の位置決
めおよび／または定量に関連する当該分野において公知の方法に用いられ得る（
例えば、適切な生理学的サンプル中のタンパク質レベルの測定に用いるために、
診断方法に用いるために、タンパク質のイメージングに用いるために、などのた
めに）ことに注目すべきである。本発明のなお別の実施態様において、タンパク
質結合ドメインを有する抗ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体
またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、薬理学的に活
性な化合物〔本明細書では以降、「治療剤」〕として利用される。
【００７７】 （（４）診断、予後およびスクリーニングにおけるＣＤＫ２タンパク質・ＣＤ
Ｋ２タンパク質ＩＰ複合体の使用） ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体（すなわち、特に、サイ
クリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２と複合体化したＣＤ
Ｋ２タンパク質）は、（ｉ）細胞周期進行の制御；（ｉｉ）細胞の分化およびア
ポトーシス；（ｉｉｉ）転写の調節；（ｉｖ）過増殖障害を含むがこれに制限さ
れない病理学的過程（例えば、腫瘍形および腫瘍進行性）；およびアテローム性
硬化症を含むが、これらに限定されない、生理学的過程の崩壊に関連する特定の
疾患状態について「マーカー」として働き得、従って診断的有用性を有し得る。
従って、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の上昇または欠乏
を有する特定の患者群の識別および分類は、疾患の新しい疾病分類学的な分類を
導き得、従って診断能力を顕著に向上させる。
【００７８】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体レベルもしくはＣＤＫ２
タンパク質との複合体を形成することが示されている個々のタンパク質のレベル
の検出、またはＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の成分をコ
ードするｍＲＮＡのレベルの検出は、疾患経過後の、治療剤投与の有効性につい
ての、疾患状態の、治療応答後の、などの、診断、予後において利用され得る。
同様に、核酸配列（およびそれらに相補的な配列）、ならびに抗ＣＤＫ２タンパ
ク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体抗体およびＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２
タンパク質ＩＰ複合体を形成し得る個々の成分に対する抗体、の両方が、診断に
おける用途を有する。このような分子は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパ
ク質ＩＰ複合体の異常なレベルで特徴付けられる種々の状態、疾患および障害の
検出、予後、診断もしくはモニターのため、またはそれらの処置のモニターのた
めに、アッセイ（例えば、イムノアッセイ）において利用され得る。前記のイム
ノアッセイは、免疫特異的結合が生じ得るような条件下で抗ＣＤＫ２タンパク質
・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体抗体と患者由来のサンプルとを接触させる工程
、そして続いて、抗体により、任意の免疫特異的結合の量を検出または測定する
工程を含む方法論により実行され得る。特定の実施態様では、ＣＤＫ２タンパク
質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体に特異的な抗体は、ＣＤＫ２タンパク質・Ｃ
ＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の存在について、患者からの組織または血清サンプ
ルを分析するために用いられ得る；ここでＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパ
ク質ＩＰ複合体の異常なレベルは、病的な状態の指標である。利用され得るイム
ノアッセイとしては、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈
降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、
補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイおよ
びプロテインＡイムノアッセイなどのような技術を用いる競合的および非競合的
アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の関連タンパク質成分を
コードする本発明の核酸種ならびに関連するヌクレオチド配列およびサブ配列も
また、ハイブリダイゼーションアッセイに用いられ得る。ＣＤＫ２タンパク質お
よびＣＤＫ２タンパク質ＩＰのヌクレオチド配列、または少なくとも８つのヌク
レオチドを含むそれらのサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして用
いられ得る。ハイブリダイゼーションアッセイは、前記のように、ＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の成分をコードするｍＲＮＡの異常なレ
ベルに関連する状態、障害または疾患状態を検出、予想、診断またはモニターす
るために用いられ得る。本発明の特定の実施態様では、ＣＤＫ２タンパク質・Ｃ
ＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の異常なレベルと関連した、もしくはその異常なレ
ベルにより特徴付けられる疾患および障害、またはそのような障害を発生させる
素因は、機能的な活性について、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ
複合体または非複合体化ＣＤＫ２タンパク質および／もしくはＣＤＫ２タンパク
質ＩＰのタンパク質または核酸の異常なレベルを検出することにより診断され得
る。この前記の機能的な活性としては、（ｉ）相互作用パートナー（例えば、Ｃ
ＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ* −２）との結合または（ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質、ＣＤＫ２タンパク質ＩＰま
たはＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の発現または活性の増
加または低下を起こし得る、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパ
ク質ＩＰのＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質における変異（例えば、野生型ＣＤ
Ｋ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質ＩＰに関連するヌクレオチド
配列またはアミノ酸配列における転位、短縮、変化）の検出による、が挙げられ
得るが、これらに限定されない。
【００８０】 当該分野で周知の方法論（例えば、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイ、生物学的活性アッセイなど）は、１つ以上の特定のＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体が、このような疾患もしくは障害または
その素因を有していない被検体からのサンプルにおけるレベルと比較して、特定
の疾患もしくは障害を罹患している、あるいはこのような疾患または障害を発生
させる素因を有している患者由来のサンプル中に、上昇したかもしくは減少した
レベルで存在するか、または存在しないかを決定するために用いられ得る。さら
に、これらのアッセイは、目的の複合体におけるＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２
タンパク質ＩＰ複合体の非複合体化成分（すなわち、ＣＤＫ２タンパク質および
／または特異的ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ）に対する比が、特定の疾患または障害
に罹患しているか、またはこのような疾患または障害を発生させる素因を有して
いる患者からのサンプル中において、このような疾患もしくは障害またはその素
因を有していない被検体からのサンプルにおける比と比較して上昇したかまたは
減少しているかを決定するために利用され得る。
【００８１】 従って、本発明の特定の実施態様では、１つ以上のＣＤＫ２タンパク質・ＣＤ
Ｋ２タンパク質ＩＰ複合体のレベルの上昇／減少に関連する疾患および障害が、
診断され得、もしくはそれらの存在の疑いについてスクリーニングされ得、また
は、以下のレベルの上昇／減少を量的に確認することにより、そのような疾患お
よび障害を発生させる素因が検出され得る：（ｉ）１つ以上のＣＤＫ２タンパク
質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体；（ｉｉ）該複合体の両方のタンパク質メン
バーをコードするｍＲＮＡ；（ｉｉｉ）複合体機能的活性、または（ｉｖ）ＣＤ
Ｋ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の構成を増強／阻害する、また
は安定化／不安定化するＣＤＫ２タンパク質もしくはＣＤＫ２タンパク質ＩＰに
おける変異体（例えば、核酸の転位、遺伝子またはタンパク質の短縮、野生型Ｃ
ＤＫ２タンパク質または野生型ＣＤＫ２タンパク質ＩＰに関連するヌクレオチド
配列またはアミノ酸配列の変化）。
【００８２】 本発明の実施では、検出技術の使用、特にＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タン
パク質ＩＰ複合体に対する抗体に関連する検出技術の使用は、目的のタンパク質
またはタンパク質複合体を発現する特定の細胞の検出のための方法を提供する。
このようなアッセイを用いて、１つ以上の特定のＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２
タンパク質ＩＰ複合体が発現される特定の細胞タイプが、量的に特徴付けられ得
、そしてタンパク質またはタンパク質複合体の存在が、当該分野で周知の技術（
例えば、蛍光活性化セルソーティング）により細胞生存能力と相関し得る。ＣＤ
Ｋ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の特徴づけおよび／または単離
の目的のために、特定のＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体ま
たはそれらの誘導体を発現するインビトロ細胞培養モデルにおけるＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の検出のための方法論もまた、本明細書
中に具体化される。これらの検出技術としては以下が挙げられるが、これらに限
定されない：原核細胞の細胞ソーティング（例えば、ＤａｖｅｙおよびＫｅｌｌ
，１９９６．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：６４１−６９６参照のこと）
；ヒトのような哺乳動物種を含む真核生物からの初代培養および組織標品（例え
ば、Ｓｔｅｅｌｅら、１９９６．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．３
９：８０１−８１３を参照のこと）および連続細胞培養（例えば、Ｏｒｆａｏお
よびＲｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｅｓ，１９９６．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
９：５−９を参照のこと）。
【００８３】 本発明は、抗ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体抗体、およ
び必要に応じて、該抗体に対する標識化結合パートナーを含む１つ以上のコンテ
ナーで構成される診断的使用のためのキットをさらに提供する。抗ＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体抗体へ組み込まれる標識としては、化学
発光部分、酵素的部分、蛍光部分、色素測定部分、または放射性部分が挙げられ
るが、これらに限定されない。代わりの特定の実施態様では、このキットは、１
つ以上のコンテナーに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Ｉｎｎｉｓら
，１９９０．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を参照のこと）；リガーゼ連鎖反応；サイ
クリックプローブ反応、または当該分野で公知の他の方法のための増幅プライマ
ーとして作用し得るオリゴヌクレオチドプライマーの対（例えば、各６〜３０ヌ
クレオチド長）を含み得る。このキットは、必要に応じて、前記のアッセイにお
ける標準またはコントロールとしての使用のために、精製したＣＤＫ２タンパク
質、ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ、もしくはＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク
質ＩＰ複合体、またはそれらの核酸の所定の量をさらに含み得る。
【００８４】 （（５）ＣＤＫ２タンパク質、ＣＤＫ２タンパク質ＩＰおよびＣＤＫ２タンパ
ク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の治療的使用） 本発明は、生物学的に活性な治療剤化合物（本明細書では以降、「治療剤」）
の投与による種々の疾患および障害の処置または予防を提供する。このような治
療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）種々のＣＤ
Ｋ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体（例えば、サイクリンＩ、ＥＲ
Ｈ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２と複合体化したＣＤＫ２タンパク質
）ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログ；（ｉｉ）
前記のタンパク質およびそれらのタンパク質複合体に対する抗体；（ｉｉｉ）Ｃ
ＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質ＩＰならびにそれらの誘導体、フラ
グメント、アナログおよびホモログをコードする核酸；（ｉｖ）ＣＤＫ２タンパ
ク質をコードするアンチセンス核酸、ならびに（ｖ）ＣＤＫ２タンパク質ＩＰお
よびＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体ならびにそのモジュレ
ーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）。
【００８５】 以前に議論したように、ＣＤＫ２タンパク質は、癌ならびに腫瘍形成および腫
瘍進行を含む、細胞周期進行、細胞分化および転写制御の障害において重要な役
割を果たすことが示されている。アテローム性硬化症もまた、ＣＤＫ２タンパク
質および／またはＣＤＫ２タンパク質ＩＰに関連し得る。
【００８６】 （ｉ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質Ｉ
Ｐ複合体レベルの上昇を有する障害 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰレベルまたは生物学的活性の上
昇（該疾患または障害に罹患していない被検体に比べて）により特徴付けられる
疾患および障害は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体形成ま
たは活性を拮抗する（すなわち、減少または阻害する）治療剤で処置され得る。
ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体形成または活性を拮抗する
治療剤は、治療的なまたは予防的な様式で投与され得る。利用され得る治療剤と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤＫ２タンパク質もし
くはＣＤＫ２タンパク質ＩＰ、またはそれらのアナログ、誘導体、フラグメント
もしくはホモログ；（ｉｉ）抗ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複
合体抗体；（ｉｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質ＩＰをコー
ドする核酸；（ｉｖ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質ＩＰアンチ
センス核酸ならびに「機能不全」である（すなわち、ＣＤＫ２タンパク質のコー
ド配列およびＣＤＫ２タンパク質ＩＰのコード配列中への異種〔非ＣＤＫ２タン
パク質および／または非ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ〕挿入による）ＣＤＫ２タンパ
ク質および／またはＣＤＫ２タンパク質ＩＰ核酸の同時投与は、相同組み換えに
より内因性のＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質ＩＰ機能を
「ノックアウト」するために利用される（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９
．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２参照のこと）。本発明のさらな
る実施態様では、野生型の第一のＣＤＫ２タンパク質ＩＰよりも、ＣＤＫ２タン
パク質についてより大きい親和性を有する第一のＣＤＫ２タンパク質ＩＰの変異
体または誘導体が、ＣＤＫ２タンパク質への結合について第二のＣＤＫ２タンパ
ク質ＩＰと競合し、それによりＣＤＫ２タンパク質と第二のＣＤＫ２タンパク質
ＩＰとの間の複合体のレベルを低下させするように投与され得る。
【００８７】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体のレベルの上昇は、患者
の組織サンプルを得（例えば、生検組織から）、そしてインビトロにおいて発現
されたＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体（またはＣＤＫ２タ
ンパク質およびＣＤＫ２タンパク質ＩＰ ｍＲＮＡ）のＲＮＡまたはタンパク質
のレベル、構造および／もしくは活性についてアッセイすることにより、タンパ
ク質および／またはＲＮＡを定量することにより、容易に検出され得る。当該分
野において周知の方法として、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複
合体を検出するためのイムノアッセイ（例えば、ウエスタンブロット分析、免疫
沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
免疫細胞化学測定など）および／またはＣＤＫ２タンパク質 ｍＲＮＡおよびＣ
ＤＫ２タンパク質ＩＰ ｍＲＮＡの同時発現を検出するためのハイブリダイゼー
ションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハ
イブリダイゼーションなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】 （ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質
ＩＰ複合体のレベルの上昇を伴う障害 本発明の特定の実施態様は、タンパク質部分を発現するｍＲＮＡの標的化によ
るＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体発現（すなわち、複合体
の２つのタンパク質成分の発現および／または複合体の形成）の減少のための方
法を開示する。ＲＮＡ治療剤は、現在、３つのクラスに区別される：（ｉ）アン
チセンス種；（ｉｉ）リボザイムまたは（ｉｉｉ）ＲＮＡアプタマー。例えば、
Ｇｏｏｄら，１９９７．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４５〜５４を参照のこ
と。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、最も広範囲に利用されており、そして
これを以下に議論する。リボザイム治療は、特定のＲＮＡを切断、結合または他
の不活化し、これにより特定のタンパク質発現を減少または排除する酵素的能力
を有するＲＮＡ小分子の投与（すなわち、発現誘導）を含む。例えば、Ｇｒａｓ
ｓｉおよびＭａｒｉｎｉ．１９９６．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２８：４９９〜５１０を
参照のこと。現在、「ヘアピン」および／または「ハンマーヘッド」ＲＮＡリボ
ザイムの設計は、特定のｍＲＮＡ（例えば、ＣＤＫ２タンパク質ｍＲＮＡ）を特
異的に標的化するために必要である。ＲＮＡアプタマーは、ＴａｔおよびＲｅｖ
ＲＮＡ（例えば、Ｇｏｏｄら，１９９７．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４
５〜５４参照のこと）のような、それらの翻訳を特異的に阻害し得るタンパク質
についての特異的なＲＮＡリガンドである。
【００８９】 本発明の好ましい実施態様では、ＣＤＫ２タンパク質の活性またはレベルは、
ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ、ＣＤＫ２タンパク質ＩＰをコードする核酸、またはＣ
ＤＫ２タンパク質ＩＰに免疫特異的に結合する抗体（またはそれらの結合ドメイ
ンを有する抗体の誘導体もしくはフラグメント）の投与により減少させられ得る
。同様に、ＣＤＫ２タンパク質ＩＰのレベルまたは活性は、ＣＤＫ２タンパク質
、ＣＤＫ２タンパク質をコードする核酸、またはＣＤＫ２タンパク質に免疫特異
的に結合する抗体（またはそれらの結合ドメインを有する抗体の誘導体もしくは
フラグメント）の投与により減少させられ得る。本発明の別の実施態様では、Ｃ
ＤＫ２タンパク質または特定のＣＤＫ２タンパク質ＩＰのレベルの上昇と関連す
る疾患または障害は、該複合体形成が、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク
質ＩＰ複合体形成を介して、ＣＤＫ２タンパク質または特定のＣＤＫ２タンパク
質ＩＰを減少または不活化させるように作用する場合、ＣＤＫ２タンパク質・Ｃ
ＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体形成を増加させる治療剤の投与により処置または予
防され得る。このような疾患または障害は、以下により処置または予防され得る
：（ｉ）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の１つのメンバー
の投与（ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質ＩＰ複合体の他のメンバーに
ついての上昇した親和性を有するタンパク質の１つまたは両方の変異体（複合体
形成の増加を生じるような）を含む）または（ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤ
Ｋ２タンパク質ＩＰ複合体を安定化させるように働く抗体または他の分子の投与
など。
【００９０】 （（６）治療剤の生物学的効果の決定） 本発明の好ましい実施態様において、適切なインビトロおよびインビボアッセ
イは、特定の治療剤の効果を決定するために、そしてその投与が罹患した組織の
処置のために適応するかどうかを決定するために利用される。
【００９１】 種々の特定の実施態様において、インビトロアッセイは、所定の治療剤が患者
の障害に関与する代表的な細胞型への所望の効果を発揮するかどうかを決定する
ために、これらの細胞型とともに行われ得る。治療に使用するための化合物は、
ヒト被験体における試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、
ウサギなどを含むがこれらに限定されない適切な動物モデル系において試験され
得る。同様に、インビボ試験について、任意の当該分野において公知の動物モデ
ル系がヒト被験体への投与に先立って使用され得る。
【００９２】 （ｉ）悪性腫瘍 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の成分（すなわち、Ｃ
ＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、ＥＲＢ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ* −２）は、細胞増殖の調節に関与する。従って、本発明の治療剤は、細胞の過剰
増殖および／または細胞増殖の制御の喪失に関連する疾患または障害（例えば、
癌、悪性腫瘍および腫瘍）の治療的または予防的処置に有用であり得る。このよ
うな過剰増殖障害の概説として、例えば、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ、第２版（Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅ
ｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと。
【００９３】 本発明の治療剤は、悪性腫瘍および関連する障害の処置または予防における有
効性について、当該分野において公知の任意の方法によってアッセイされ得る。
このようなアッセイは、形質転換された細胞または患者の腫瘍由来の細胞を利用
するインビトロアッセイ、ならびに癌または悪性腫瘍の動物モデルを使用するイ
ンビボアッセイを含むがそれらに限定されない。潜在的に効果的な治療剤は、対
照と比較して、例えば、培養中の腫瘍由来の細胞または形質転換した細胞の増殖
を阻害するか、あるいは動物モデルにおける腫瘍の後退を引き起こす。
【００９４】 本発明の実施において、一旦悪性腫瘍または癌がＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰ複合体活性を調節すること（すなわち、阻害すること、拮抗
すること、またはアゴナイズすること）による処置を受け入れることが示された
ならば、次にはその癌または悪性腫瘍は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパ
ク質−ＩＰ複合体形成および機能を調節するために働く治療剤の投与によって処
置または予防され得る。この投与は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰ複合体およびこのタンパク質複合体の個々の結合パートナー（すなわち、
ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質タンパク質−ＩＰ）を供
給する工程を含む。
【００９５】 （ｉｉ）前悪性腫瘍状態 癌または悪性腫瘍の治療的または予防的処置に効果的な本発明の治療剤はまた
、前悪性腫瘍状態の処置のために投与され得るか、および／または前悪性腫瘍か
ら新生物もしくは悪性状態への進行を予防するために投与され得る。このような
予防的または治療的使用は、特に、新形成的ではない、過形成からなる細胞増殖
、化生、または、最も特別には、形成異常が起こる、先行する新形成または癌へ
の進行が分かっているかまたは疑わしい状態に適応される。このような異常な細
胞増殖の概説については、例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ、１９７
６、Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第２版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃ
ｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと。過形成は、その構造ま
たは機能の有意な変化なしで、組織または器官における細胞数の増加を含む制御
された細胞増殖の形態である。例えば、子宮内膜の過形成は、しばしば子宮内膜
癌に先だって発生することが示されている。
【００９６】 化生は、成熟細胞または完全に分化した細胞の１つの型が成熟細胞の別の型に
換わっている、制御された細胞増殖の形態である。化生は、上皮または結合組織
細胞に存在し得る；一方、異型化生はいくぶん障害を有する化生上皮を含む。形
成異常は、一般的には癌の前駆体と考えられており、そして主に上皮において見
いだされる。形成異常は、非新生物的な細胞増殖の最も障害を有する形態であり
、そして個々の細胞の均一性および細胞の構造的な方向付けの損失を含む。形成
異常細胞は、しばしば異常に大きく、深く染色された核を有し、そして多形態性
を示す。形成異常は、特徴的に慢性的な刺激または炎症が存在する場所に生じ、
そしてしばしば子宮頸部、呼吸気道、口腔、および胆嚢において見い出される。
【００９７】 あるいは、または過形成、化生、もしくは形成異常として特徴付けられる異常
な細胞増殖の存在に加えて、患者由来の細胞サンプル中でインビボまたはインビ
トロのいずれかで示される、形質転換されたかまたは悪性の表現型の１つ以上の
特徴の存在は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体活性を調
節する能力を有する本発明の治療剤の予防的／治療的投与の望ましさの指標であ
る。形質転換された表現型の特徴は、（ｉ）形態学的変化；（ｉｉ）よりゆるい
下層の付着；（ｉｉｉ）細胞−細胞接触阻害の損失；（ｉｖ）足場依存性の損失
；（ｖ）プロテアーゼ放出；（ｖｉ）糖類輸送の増加；（ｖｉｉ）血清要求性の
減少；（ｖｉｉｉ）胎児抗原の発現；（ｉｘ）２５０Ｋｄａｌ細胞表面タンパク
質の消失などを含むがこれらに限定されない。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１
９８６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ
Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を参照のこと。
【００９８】 本発明の特定の実施態様において、白斑症（上皮の、良性の外見の過形成のま
たは形成異常の損傷）またはボーエン病（インサイチュの癌）は、全くの悪性表
現型への形質転換を妨害するための予防的介入の望ましさを示す、前新生物損傷
である。別の特定の実施態様において、本発明の治療剤は、線維嚢胞症（嚢胞性
増殖症、乳房形成異常、および特に腺疾患（良性の上皮過形成）を含むがこれら
に限定されない）の治療的および予防的処置において有用であり得る。
【００９９】 他の実施態様において、悪性腫瘍についての以下の１つ以上の素因を示す患者
は、治療剤の有効量の投与によって処置される：（ｉ）悪性腫瘍に関連する染色
体の転座（慢性骨髄性白血病についてのフィラデルフィア染色体（ｂｃｒ／ａｂ
ｌ）および濾胞性リンパ腫についてのｔ（１４；１８）など）；（ｉｉ）家族性
ポリポーシスまたはガードナー症候群（結腸癌の可能性のある前兆）；（ｉｉｉ
）意義が未決定の単一クローン性高癌マグロブリン血症（ＭＧＵＳ；多発性骨髄
腫の可能性のある前駆体）および（ｉｖ）メンデル（遺伝的）遺伝パターンを示
す癌または前癌性疾患（例えば、結腸の家族性ポリポーシス、ガードナー症候群
、遺伝性外骨腫症、多発性内分泌腺腫症、アミロイド産生および褐色細胞腫を伴
う髄質の甲状腺癌、ポイツ‐ジェガーズ症候群、フォン・レックリングハウゼン
の神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚黒色癌、眼内黒色癌、色
素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調、チェディアック‐東症候群、白皮症、フ
ァンコーニ形成不全性貧血、およびブルーム症候群）を有する人の一親等。
【０１００】 別の好ましい実施態様において、本発明の治療剤は、乳癌、結腸癌、肺癌、膵
臓癌、もしくは子宮癌、または黒色腫または肉腫への進行を予防するために、ヒ
ト患者に投与される。
【０１０１】 （ｉｉｉ）過剰増殖および異常増殖障害 本発明の好ましい実施態様において、治療剤は過剰増殖または良性の異常増殖
障害の治療的または予防的処置において投与される。本発明の治療剤の、過剰増
殖性疾患または障害を処置または予防することにおける有効性は、当該分野にお
いて公知の任意の方法によってアッセイされ得る。このようなアッセイは、イン
ビトロ細胞増殖アッセイ、過剰増殖疾患または障害の動物モデルを使用するイン
ビトロまたはインビボアッセイなどを含む。潜在的に有効な治療剤は、例えば、
コントロールと比較して、培養における細胞増殖を促進し得るか、または動物モ
デルにおける細胞増殖を引き起こし得る。
【０１０２】 従って、一旦過剰増殖障害がＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ
複合体活性の調節による処置を受け入れることが示されたならば、過剰増殖性疾
患または過剰増殖性疾患は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複
合体形成を調節する治療剤の投与（ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−
ＩＰ複合体およびＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の個々
の結合パートナー（例えば、ＣＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓ
Ｒｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２）の供給を含む）によって処置または予防さ
れ得る。
【０１０３】 本発明の特定の実施態様は、肝硬変（瘢痕化が正常な肝臓の再生プロセスを追
い越した状態）の処置または予防；瘢痕プロセスが正常な再生のプロセスを妨害
する、皮膚の外観を損なうことを引き起こすケロイド（肥大生の瘢痕）形成の処
置；乾癬（過度の皮膚の増殖および正しい細胞運命の決定の遅延によって特徴付
けられる一般的な皮膚の状態）；良性腫瘍；線維性嚢胞性の状態および組織肥大
（良性前立腺肥大）に関する。
【０１０４】 （ｉｖ）アテローム性動脈硬化症 ＣＤＫ２タンパク質は、アテローム性動脈硬化症の調節に役割を演ずる。従っ
て、本発明の治療剤は、アテローム性動脈硬化症性の疾患または障害の治療的ま
たは予防的処置において有用であり得る。本発明の治療剤は、アテローム性動脈
硬化症および関連する障害を処置または妨害することにおける有効性について当
該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。このようなアッセイには
、形質転換した細胞またはアテローム性動脈硬化症性プラーク由来の細胞を利用
するインビトロアッセイ、ならびにアテローム性動脈硬化症の動物モデルを使用
するインビトロアッセイが含まれるがこれらに限定されない。潜在的に有効な治
療剤は、例えば、コントロールと比較して、ヒトアテローム性動脈硬化症プラー
クにおける炎症活性を阻害する。
【０１０５】 本発明の実施において、一旦アテローム性動脈硬化症がＣＤＫ２タンパク質・
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体活性を調節すること（すなわち、阻害すること
、拮抗すること、またはアゴナイズすること）による処置を受け入れることが示
されたならば、次にはそのアテローム性動脈硬化症は、ＣＤＫ２タンパク質・Ｃ
ＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体形成および機能を調節するために働く治療剤の投
与によって処置または予防され得る。この投与は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰ複合体およびこのタンパク質複合体の個々の結合パートナー
（すなわち、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ）を
供給する工程を含む。
【０１０６】 （（７）遺伝子治療） 本発明の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰ、あるいはそれらの機能的な誘導体をコードする配列を含む
核酸は、遺伝子治療のためにＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複
合体機能を調節するために投与される。より特定の実施態様において、ＣＤＫ２
タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ（例えば、サイクリンＩ、ＥＲＨ、
ｈｓＲｅｑ*−１、およびｈｓＲｅｑ*−２）の両方、またはそれらの機能的な誘
導体をコードする核酸（単数または複数）が、遺伝子治療のために投与される。
遺伝子治療とは、被験体への特定の核酸の投与によって行われる治療をいう。本
発明のこの実施態様において、その核酸はそれがコードするタンパク質を産生し
、次いでＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体機能を調節する
ことによって治療効果を発揮することを提供する。当該分野で利用可能な遺伝子
治療に関連する任意の方法論が本発明の実施において使用され得る。例えば、Ｇ
ｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３ Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．１２：４８８−５０５
を参照のこと。
【０１０７】 好ましい実施態様において、その治療剤は、適切な宿主中で前述のタンパク質
の両方、またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質を発現する発現ベク
ターの一部である、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ核酸を
含む。特定の実施態様において、このような核酸は、ＣＤＫ２タンパク質および
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有
し、または、より好ましくない場合には、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タ
ンパク質−ＩＰコード領域に別々に連結された２つの別個のプロモーターを有す
る；ここでこのプロモーターは、誘導性であるか、または構成的であり、そして
、必要に応じて組織特異的である。別の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質
およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰコード配列（および任意の他の所望の配列）が
ゲノム中の所望の部位で相同組換えを促進する領域に隣接し、従ってＣＤＫ２タ
ンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ核酸の染色体内発現を提供する。例え
ば、ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５を参照のこと。
【０１０８】 治療剤核酸の患者への送達は、直接的（すなわち、患者は直接的に核酸または
核酸含有ベクターに暴露される）または間接的（すなわち、インビトロで細胞が
最初に核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。
これらの２つのアプローチは、それぞれインビボまたはエキソビボ遺伝子治療と
して知られる。本発明の特定の実施態様において、その核酸はインビボで直接的
に投与され、ここでこの核酸はコードされた産物を産生するために発現される。
これは以下を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の多数の方法のいず
れかによって達成され得る：（ｉ）適切な核酸発現ベクターの一部としてこれを
構築し、そしてこれが細胞内に存在するようにする様式（例えば、欠損している
かもしくは弱毒化したレトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターを使
用する感染による；米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）で投与する
こと、または（ｉｉ）裸のＤＮＡの直接的な注入、または微粒子ボンバードメン
トの使用を通して（例えば、「Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ（登録商標）」；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）、または脂質、細胞表面レセプター／トランスフェクト
薬剤でＤＮＡをコートすることによって、またはリポソーム、微粒子、もしくは
マイクロカプセル中にカプセル化することを通して、または核に入ることが公知
であるペプチドに連結してそれを投与することによって、またはレセプター媒介
エンドサイトーシスであらかじめ処置されるリガンドにそれを連結して投与する
ことによって（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）（これは、目的のレセプターを特異
的に発現する細胞型を「標的化する」ために使用され得る）、など。
【０１０９】 本発明の別の特定の実施態様において、リガンドがエンドソームを崩壊させ、
従って核酸が続くリソソーム性の分解を避けることを可能にするように設計され
た融合原性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチドを含む、核酸リガンド複合
体が産生され得る。なお別の特定の実施態様において、その核酸は、特定のレセ
プターを標的化することによって、細胞特異的なエンドサイトーシスおよび発現
についてインビボで標的化され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１８０
；ＷＯ９３／１４１８８およびＷＯ９３／２０２２１を参照のこと。あるいは、
核酸は細胞内に導入され得るか、そして相同組換えによる発現のために宿主細胞
ゲノム中に組込まれ得る。例えば、Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４２：４３５−４３８を参照のこと。
【０１１０】 さらに別の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タ
ンパク質−ＩＰ核酸を含むウイルスベクターが利用される。例えば、ウイルスゲ
ノムのパッケージングおよび続いて起こる宿主細胞ＤＮＡへのその組込みに必要
ではないこれらのレトロウイルス特異的配列を欠失するように改変されたレトロ
ウイルスベクターが利用され得る（例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３、Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９）。ＣＤＫ２タンパク質および／
またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ（好ましくは両方のタンパク質種）核酸は、患
者への遺伝子の送達を容易にするベクター中へクローニングされる。例えば、Ｂ
ｏｅｓｅｎら、１９９４ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２；Ｋｉｅ
ｍら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３を参照のこと。さらに
、アデノウイルスが、呼吸上皮への特に有効な「ビヒクル」である。アデノウイ
ルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉で
ある。アデノウイルスはまた、非分裂細胞に感染する能力という利点を有する。
概説として、例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒ
ｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：４９９−５０３を参照のこと。ア
デノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療における使用が提案さ
れてきた。例えば、Ｗａｌｓｈら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００を参照のこと。
【０１１１】 本発明の実施における遺伝子治療に対するさらなるアプローチは、エレクトロ
ポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション
、またはウイルス感染のような方法によるインビトロ組織培養中の細胞への遺伝
子の移入を含む。一般的には、移入の方法論は、細胞への選択マーカーの移入を
含む。次いで、取り上げられ、そして移入した遺伝子を発現するこれらの細胞の
単離を容易にするために、細胞は選択圧（例えば、抗生物質耐性）の下に置かれ
る。次いで、これらの細胞は患者に送達される。特定の実施態様において、この
核酸は、当該分野で公知の任意の方法（トランスフェクション、エレクトロポレ
ーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含むウイルスベクター
またはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子
移入、マイクロセル媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合、および移入によっ
てレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないことを確
実にする同様の方法論を含むがこれらに限定されない）によって生じる組換え細
胞のインビボ投与に先立って、細胞内に導入される。例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ
およびＢｅｈｒ、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１
８を参照のこと。この技術は細胞への核酸の安定な移入を提供するべきであり、
その結果核酸は細胞によって発現可能であり、そして好ましくはその細胞の子孫
に遺伝可能であり、そしてそれによって発現可能である。
【０１１２】 本発明の好ましい実施態様において、生じる組換え細胞は、以下を含むが、こ
れらに限定されない種々の公知の方法によって患者に送達され得る：上皮細胞へ
の注射（例えば、皮下）；患者への皮膚移植片としての組換え皮膚細胞の適用お
よび組換え血球（例えば、造血幹細胞および前駆細胞）の静脈内注射。使用のた
めに企図される細胞の総量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして当
業者によって決定され得る。
【０１１３】 核酸が遺伝子治療の目的のために導入され得る細胞は、所望される、任意の利
用可能な細胞型を含み得、そして上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽
細胞、筋肉細胞、肝細胞および血球（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓
などから得られたＴ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、好中球
、好酸球、巨核球、顆粒球、および造血幹細胞または前駆細胞）を含むがこれら
に限定されない。本発明の好ましい実施態様において、遺伝子治療に利用される
細胞は、患者に対して自己由来であり得る。
【０１１４】 組換え細胞が遺伝子治療に使用される特定の実施態様において、インビトロで
単離され得、維持され得る幹細胞または前駆細胞が利用され得る。このような幹
細胞には、造血幹細胞（ＨＳＣ）、上皮組織（例えば、皮膚、腸の内層、胚の心
筋細胞、肝臓の幹細胞）の幹細胞、および神経の幹細胞が含まれるが、これらに
限定されない（例えば、ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９２、Ｃ
ｅｌｌ ７１：９７３−９８５）。造血幹細胞（ＨＳＣ）に関しては、ＨＳＣの
インビトロでの単離、増殖、および維持を提供する任意の技術が、本発明のこの
特定の実施態様において使用され得る。以前に議論したように、遺伝子治療のた
めに利用されるＨＳＣは、好ましくは、患者に対して自己由来である。従って、
非自己由来ＨＳＣは、好ましくは、未来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する
方法と共に利用される。例えば、Ｋｏｄｏら、１９８４．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４を参照のこと。本発明の別の好ましい実施態
様において、ＨＳＣは、患者への投与の前に、当該分野で公知の任意の技法によ
って高度に富化され得る（または、実質的に純粋な形態で産生される）。例えば
、ＷｉｔｌｏｃｋおよびＷｉｔｔｅ、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３６０８−３６１２を参照のこと。
【０１１５】 （（８）アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用） 本発明の特定の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰ複合体形成および機能は、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タ
ンパク質−ＩＰ（例えば、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓ Ｒｅｑ*−２）についてのアンチセンス核酸の使用によって阻害され得、そして 好ましくはＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの両方からなる
。さらに、本発明は、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タンパク質−
ＩＰあるいはその一部をコードするゲノム配列（遺伝子）またはｃＤＮＡに対し
てアンチセンスである核酸（少なくとも６ヌクレオチド長）の治療的または予防
的使用を開示する。このようなアンチセンス核酸は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤ
Ｋ２タンパク質−ＩＰ複合体形成または活性を阻害する治療剤としての有用性を
有し、そして治療的または予防的様式において使用され得る。
【０１１６】 本発明の別の特定の実施態様は、原核生物細胞または真核生物細胞中でのＣＤ
Ｋ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの核酸配列の発現の阻害につい
ての方法論を開示する。これは、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰのアンチセンス核酸またはその誘導体の治療的有効量をその細胞に提供す
る工程からなる。
【０１１７】 本発明のアンチセンス核酸は、細胞に直接的に投与され得るか、または、外来
性の、導入された配列の転写によってインビボで産生され得るかのいずれかであ
り得るオリゴヌクレオチドであり得る。さらに、そのアンチセンス核酸は、ＣＤ
Ｋ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ ｍＲＮＡのコード領域（すな
わち、エキソン性）および／または非コード領域（すなわち、イントロン性）の
いずれかに相補性であり得る。ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−
ＩＰアンチセンス核酸は、少なくとも、６ヌクレオチド長であり、そして好まし
くは、６〜２００ヌクレオチド長の範囲である。特定の実施態様において、アン
チセンスヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレ
オチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチド
である。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（または
、そのキメラ混合物、誘導体または改変したバージョン）であり得、一本鎖また
は二本鎖のいずれかであり得、そして塩基、糖、もしくはリン酸バックボーン部
分において改変され得る。
【０１１８】 さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の付随する官能基（
例えば、ペプチド、細胞膜を横切るオリゴヌクレオチドの輸送を容易にする部分
、ハイブリダイゼーショントリガー架橋試薬、ハイブリダイゼーショントリガー
切断試薬など）を含み得る。例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｐ
ＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと。特定の実施態様において、Ｃ
ＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、触媒ＲＮＡすなわちリボザイムを含む。例えば、Ｓａｒｖｅｒら、１９
９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５を参照のこと。
【０１１９】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法
論（以下を含むがこれらに限定されない）：（ｉ）自動化ホスホロチオエート媒
介オリゴヌクレオチド合成（例えば、Ｓｔｅｉｎら、１９８８．Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９を参照のこと）、または（ｉｉ）メチルホスホネ
ートオリゴヌクレオチドは、制御化細孔ガラスポリマー支持体を使用することに
よって調製され得る（例えば、Ｓａｒｉｎら、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１を参照のこと））に
よって合成され得る。
【０１２０】 代替の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
Ｐアンチセンス核酸は、外因性の配列の転写によって細胞内で産生される。例え
ば、ベクター（（細胞によってエキソサイトーシスされる際に）インビボで転写
される）が、作成され得、そのようにしてアンチセンス核酸（ＲＮＡ）種を産生
し得る。前述のベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写さ
れ得る限り、エピソームのままであるか、または染色体に組み込まれるかのいず
れかであり得る。本発明の実施において利用されるベクターは、細菌、ウイルス
、酵母、または、当該分野で公知であって、哺乳動物細胞における複製および発
現のために利用される他の供給源に由来し得る。ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤ
Ｋ２タンパク質−ＩＰアンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物
、好ましくは、ヒト細胞において機能することが当該分野で公知である任意のプ
ロモーターによって促進され得る。このようなプロモーターは、誘導性であるか
または構成性であり得、そして以下を含むがこれらに限定されない：（ｉ）ＳＶ
４０初期プロモーター領域；（ｉｉ）Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末
端長末端反復配列に含まれるプロモーター；（ｉｉｉ）ヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーター、および（ｉｖ）メタロチオネイン遺伝子の調節配列。
【０１２１】 ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセンス核酸は、Ｃ
ＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体を発現（好ましくは、過剰
発現）する細胞型の障害の処置または予防において、予防的にまたは治療的に利
用され得る。ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ ＲＮＡ、ま
たはｈｓＲｅｑ*−１ ＲＮＡおよびｈｓＲｅｑ*−２ ＲＮＡを発現または過剰
発現する細胞型は、以下を含むがこれらに限定されない当該分野で公知の種々の
方法によって同定され得る：ＣＤＫ２タンパク質特異的核酸、およびＣＤＫ２タ
ンパク質−ＩＰ特異的核酸とのハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンハイ
ブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハ
イブリダイゼーションによる）、または特定の細胞型由来のＲＮＡのインビトロ
でＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰへと翻訳される能力を免
疫組織化学によって観察することによって。好ましい局面において、患者由来の
初代組織は、例えば、免疫組織化学またはインサイチュハイブリダイゼーション
によって実際に処置する前に、ＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ２タン
パク質−ＩＰ発現についてアッセイされ得る。
【０１２２】 薬学的に受容可能なキャリア中に含まれた有効量のＣＤＫ２タンパク質および
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセンス核酸を含む本発明の薬学的組成物は、Ｃ
ＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体ＲＮＡまたはタンパク質を
発現または過剰発現する型である疾患または障害を有する患者に投与され得る。
特定の障害または状態の処置において有効であるＣＤＫ２タンパク質および／ま
たはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセンス核酸の量は、障害または状態の性質
に依存し、そして標準的な臨床的技術によって決定され得る。可能であれば、ヒ
トにおいて試験および使用する前に、インビトロで、次いで、有用な動物モデル
系において、アンチセンス細胞傷害性を決定することが所望される。特定の実施
態様において、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセン
ス核酸を含む薬学的組成物は、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルを介し
て投与され得る。例えば、Ｌｅｏｎｅｔｔｉら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２４４８−２４５１を参照のこと。
【０１２３】 （（９）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体アッセイ） ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体（およびその誘導体、
フラグメント、アナログ、および相同体）の機能的活性は、当該分野で公知の多
数の方法によってアッセイされ得る。例えば、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タ
ンパク質複合体活性（例えば、抗ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
Ｐ複合体抗体、およびＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアン
チセンス核酸）の推定のモジュレーター（例えば、インヒビター、アゴニスト、
およびアンタゴニスト）は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複
合体形成および／または活性を調節するそれらの能力についてアッセイされ得る
。
【０１２４】 （ｉ）イムノアッセイ 本発明の特定の実施態様において、イムノアッセイに基づく方法論が開示され
、そこでは（ｉ）野生型ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体
またはｈｓＲｅｑ*−１もしくはｈｓＲｅｑ*−２に結合するか、またはそれらと
競合する能力、あるいは（ｉｉ）抗ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−
ＩＰ複合体抗体に結合する能力についてアッセイする。これらのイムノアッセイ
には、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サ
ンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降
反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド状金
、酵素またはラジオアイソトープ標識を使用する）、ウェスタンブロット、ノー
ザンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝
集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、
および免疫電気泳動アッセイなどのような技術を利用する競合アッセイ系および
非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つの特定の
実施態様において、抗体結合は、一次抗体上の標識についてアッセイすることに
よって検出される。別の特定の実施態様において、一次抗体の結合は、一次抗体
に特異的な二次抗体（または試薬）の結合の検出によって確認される。さらなる
実施態様において、二次抗体は、標識されている。
【０１２５】 （ｉｉ）遺伝子発現アッセイ ＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子（両方とも内因性
の遺伝子であり、そして組換えＤＮＡから発現される）の発現は、当該分野で公
知の技術を使用して検出され得、これらには、種々の細胞型におけるＣＤＫ２タ
ンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子に特異的なプローブを用いる、
サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、制限エンド
ヌクレアーゼマッピング、ＤＮＡ配列分析、ならびにポリメラーゼ連鎖反応増幅
（ＰＣＲ）およびその後のサザンハイブリダイゼーションまたはＲＮａｓｅプロ
テクション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９７．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと）が含まれるが、これらに限定さ
れない。
【０１２６】 本発明の１つの特定の実施態様において、サザンハイブリダイゼーションが、
生理学的または病理学的状態に対するＣＤＫ２タンパク質および／またはＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰ遺伝子の変異の遺伝連鎖を検出するために使用され得る。発
生の種々の段階での多数の細胞型は、それらのＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰの発現（特に、同一の細胞内でのＣＤＫ２タンパク質および
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの同時発現）について特徴付けされ得る。ノーザンブ
ロット分析またはサザンブロット分析のハイブリダイゼーション条件のストリン
ジェンシーは、使用される特定のプローブに対する所望の程度の関連性を有する
核酸を検出することを確実にするために操作され得る。これらの前述の方法の改
変および当該分野で周知の他の方法は、本発明の実施において利用され得る。
【０１２７】 （ｉｉｉ）結合アッセイ ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体
は、以下を含むが、これらに限定されない当該分野で公知の任意の方法によって
ＣＤＫ２タンパク質への結合についてアッセイされ得る：（ｉ）改変された酵母
２ハイブリッドアッセイ系；（ｉｉ）複合体内でＣＤＫ２タンパク質に結合する
抗体との免疫沈降およびその後の免疫沈降したタンパク質のサイズ分画による分
析（例えば、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）；（ｉ
ｉｉ）ウェスタン分析；（ｖ）非変性ゲル電気泳動など。
【０１２８】 （ｉｖ）生物学的活性についてのアッセイ 本発明の特定の実施態様は、ＣＤＫ２タンパク質の誘導体、フラグメント、ア
ナログ、または相同体の生物学的活性についてのスクリーニングのための方法論
を提供し、その方法論は、ＣＤＫ２タンパク質の誘導体、フラグメント、アナロ
グ、または相同体をＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの１つ（例えば、サイクリンＩ、
ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１、およびｈｓＲｅｑ*−２）と接触させる工程、および
上記ＣＤＫ２タンパク質の誘導体、フラグメント、アナログ、または相同体と、
特定のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰとの間の複合体の形成を検出する工程、を包含
し；ここで、その複合体の形成の検出は、ＣＤＫ２タンパク質の誘導体、フラグ
メント、アナログ、または相同体が、生物学的（例えば、結合）活性を保持する
ことを示す。同様に、さらなる実施態様は、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体
、フラグメント、アナログ、または相同体を、生物学的活性についてスクリーニ
ングするための方法論を開示し、この方法論は、上記のタンパク質の誘導体、フ
ラグメント、アナログ、または相同体を、ＣＤＫ２タンパク質と接触させる工程
；および上記のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体、フラグメント、アナログ、
または相同体と、ＣＤＫ２タンパク質との間の複合体の形成を検出する工程を包
含し；ここで、上記の複合体の形成の検出が、上記のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ
の誘導体、フラグメント、アナログ、または相同体が生物学的活性を保持するこ
とを示す。
【０１２９】 （（１０）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体活性の調節
） 本発明は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体に参加する
能力を保持するタンパク質部分（例えば、ＣＤＫ２タンパク質、サイクリンＩ、
ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１、およびｈｓＲｅｑ*−２）の活性の、そのタンパク質
（またはその誘導体、フラグメント、アナログ、または相同体）の結合パートナ
ーの投与による調節に関連する方法論を開示する。ＣＤＫ２タンパク質（および
その誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体）は、ＣＤＫ２タンパク質
−ＩＰの活性またはレベルを調節する能力について、細胞を、ＣＤＫ２タンパク
質、あるいはＣＤＫ２タンパク質、もしくはＣＤＫ２タンパク質に免疫特異的に
結合する抗体、またはその結合ドメインを含むその抗体の誘導体、フラグメント
、アナログ、もしくは相同体をコードする核酸と接触させるか、あるいはＣＤＫ
２タンパク質−ＩＰ遺伝子を発現する動物に、ＣＤＫ２タンパク質、あるいはＣ
ＤＫ２タンパク質、もしくはＣＤＫ２タンパク質に免疫特異的に結合する抗体、
またはその結合ドメインを含む上記抗体の誘導体、フラグメント、アナログ、も
しくは相同体をコードする核酸を投与して、そしてＣＤＫ２タンパク質−ＩＰレ
ベルまたは活性における変化を測定することにより、アッセイされ得；ここで、
ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰレベルまたは活性における変化は、ＣＤＫ２タンパク
質が、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰレベルまたは活性を調節する能力を保持するこ
とを示す。別の実施態様において、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰは、類似の様式で
ＣＤＫ２タンパク質の活性またはレベルを調節する能力についてアッセイされ得
る。
【０１３０】 （（１１）ＣＤＫ２関連処置アッセイ） （ｉ）腫瘍形成 ＣＤＫ２タンパク質、およびＣＤＫ２タンパク質の同定された結合パートナー
（すなわち、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ）のうちのいくつかは、細胞増殖の制御
、そしてそれゆえ細胞の形質転換、および腫瘍形成の制御における役割を有する
。従って、本発明は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体お
よびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ（およびその誘導体、フラグメント、アナログ、
および相同体）を、細胞増殖、細胞形質転換、および／または腫瘍形成をインビ
トロおよびインビボで変更するその能力について、スクリーニングするための方
法論を開示する。例えば（しかし限定するためではなく）、細胞増殖は、3Ｈチ ミジン取り込みを測定すること、直接的に細胞を計数すること、プロトオンコジ
ーン（例えば、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｍｙｃ）細胞周期マーカーのような公知の遺伝
子の転写活性の変化を検出することなどによって、アッセイされ得る。
【０１３１】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体およびＣＤＫ２タンパ
ク質−ＩＰ（およびその誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体）はま
た、インビトロで細胞の形質転換（すなわち、悪性表現型への進行）を誘導する
か、または阻害することにおける活性についてスクリーニングされ得る。本発明
のタンパク質およびタンパク質複合体は、正常な表現型（細胞の形質転換につい
てアッセイするため）または形質転換した細胞の表現型（細胞の形質転換の阻害
についてアッセイするため）のいずれかを有する細胞を、本発明のタンパク質ま
たはタンパク質複合体と接触させ、そしてその細胞を、形質転換した表現型と関
連する特徴（インビボでの腫瘍形成能力と関連する１組のインビトロの特徴）（
軟寒天におけるコロニー形成、より円形の細胞形態、より緩やかな下層の付着、
接触阻害の損失、足場依存性の損失、プラスミノーゲンアクチベーターのような
プロテアーゼの放出、糖輸送の増大、血清要求の減少、胎児抗原の発現、２５０
Ｋｄａｌの細胞表面タンパク質の消失などを含むが、これらに限定されない）の
獲得または損失について検査することによって、スクリーニングされ得る。例え
ば、Ｌｕｒｉａら、１９７８．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと。
【０１３２】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体（ならびにその誘導体
、フラグメント、アナログ、および相同体）はまた、インビボで非ヒト試験動物
において腫瘍形成を促進または阻害する活性についてスクリーニングされ得る。
過剰増殖障害（例えば、腫瘍形成および転移伝播）の大多数の動物モデルが当該
分野で公知である。例えば、Ｌｏｖｅｊｏｙら、１９９７．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．
１８１：１３０−１３５を参照のこと。本発明の特定の実施態様において、タン
パク質およびタンパク質複合体は、非ヒト試験動物（好ましくは、ある型の腫瘍
を発症するような素因を与えた試験動物）に投与され得、そしてその非ヒト試験
動物は、引き続いて、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体を投与されな
かったコントロール動物と比較して、腫瘍形成の発生数の増大について試験され
る。あるいは、タンパク質およびタンパク質複合体は、腫瘍を保持する非ヒト試
験動物（例えば、腫瘍が、悪性、新生物、もしくは形質転換細胞の導入によって
、または発癌物質を投与することによって誘導されている動物）に投与され得、
そして引き続いて、その試験動物内のその腫瘍を、コントロールと比較して、腫
瘍の後退について試験する。従って、過剰増殖した疾患または障害が、ＣＤＫ２
タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体活性の調節による処置に感受性で
あることが一旦示されると、その疾患または障害は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤ
Ｋ２タンパク質−ＩＰ複合体形成を調節する治療薬の投与によって処置または予
防され得る。
【０１３３】 （ｉｉ）アテローム性動脈硬化症 ＣＤＫ２タンパク質は、アテローム性動脈硬化症の調節において役割を果たす
。従って、本発明は、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体お
よびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ（ならびにその誘導体、フラグメント、アナログ
、および相同体）を、インビトロおよびインビボでアテローム性動脈硬化症を改
変する能力についてスクリーニングするための方法論を開示する。
【０１３４】 広範な一連の動物および細胞培養モデルが、アテローム性動脈硬化症に関与す
るプロセスについて存在する。動物モデルの限定的かつ非包括的なリストは、早
発性アテローム性動脈硬化症についてのノックアウトマウス（例えば、Ｋｕｒａ
ｂａｙａｓｈｉおよびＹａｚａｋｉ，１９９６．Ｉｎｔ．Ａｎｇｉｏｌ．１５：
１８７−１９４を参照のこと）；アテローム性動脈硬化症のトランスジェニック
マウスモデル（例えば、Ｋａｐｐｅｌら、１９９４．ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：５８
３−５９２を参照のこと）；動物モデルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処置
（例えば、Ｃａｌｌｏｗ，１９９５．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１
０：５６９−５７６を参照のこと）、およびアテローム性動脈硬化症のトランス
ジェニックウサギモデル（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，１９９７．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１：１４６−１５２を参照のこと）を含む。
【０１３５】 さらに、インビトロ細胞モデルには、低密度リポタンパク質に曝露された単球
（例えば、Ｆｒｏｓｔｅｇａｒｄら、１９９６．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉ
ｓ １２１：９３−１０３を参照のこと）；培養されたヒト大動脈内皮細胞（例
えば、Ｆａｒｂｅｒら、１９９２．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６２：１０８
８−１０８５を参照のこと）、および泡沫細胞培養物（例えば、Ｌｉｂｂｙら、
１９９６．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ．７：３３０−３３５を参照の
こと）が含まれるが、これらに限定されない。潜在的に効果的な治療剤は、例え
ば（しかし、限定するためではない）、細胞培養モデルにおける泡沫細胞形成を
低減するか、またはアテローム性動脈硬化症の高コレステロール血症のマウスモ
デルにおけるアテローム性動脈硬化症プラーク形成を低減する。
【０１３６】 （（１２）タンパク質間相互作用アッセイ） 本発明は、ＣＤＫ２タンパク質相互作用タンパク質（ＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
Ｐ）の誘導体、フラグメント、アナログ、および相同体を、ＣＤＫ２タンパク質
への結合についてアッセイおよびスクリーニングするための方法論を開示する。
ＣＤＫ２タンパク質と相互作用するＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体、フラグ
メント、アナログ、および相同体は、酵母２ハイブリッドアッセイシステム（例
えば、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９．Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５
−２４６を参照のこと）、または好ましくは、その改変および改善（米国特許出
願第０８／６６３，８２４号（１９９６年６月１４日出願）および同第０８／８
７４，８２５号（１９９７年６月１３日出願）（これらの両方が、「Ｉｄｅｎｔ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ Ｏｃｃｕｒ ｉｎ Ｐ
ｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｈ
ｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｈｅｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｓ．」と題され、Ｎ
ａｎｄａｂａｌａｎらに対するものであり、そしてこれらはその全体が本明細書
中で参考として援用される）に開示される）によって同定され得る。
【０１３７】 改善された酵母２ハイブリッドシステムによる相互作用するタンパク質の同定
は、レポーター遺伝子（本明細書以下で「レポーター遺伝子」）の発現の検出に
基づき、その転写は、２つのタンパク質相互作用による転写調節因子の再構築に
依存し、その各々は、転写調節因子の半分に融合されている。ベイトＣＤＫ２タ
ンパク質（または誘導体、フラグメント、アナログ、もしくは相同体）およびプ
レイタンパク質（ベイトタンパク質と相互作用する能力について試験されるタン
パク質）は、それぞれ、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節ドメインに対する、
またはその逆に対する融合タンパク質として発現される。本発明の特定の実施態
様において、そのプレイ集団は、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの変異体（例えば、
部位特異的変異誘発によって、またはヌクレオチド配列における変異を生成する
別の方法によって生成されるような）をコードする１つ以上の核酸であり得る。
好ましくは、そのプレイ集団は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ま
たは合成的に生成されたＤＮＡ）によってコードされるタンパク質である。例え
ば、その集団は、哺乳動物ＲＮＡ由来のｃＤＮＡの集団の特徴付けされていない
サンプルに由来するｃＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子から発現され得る。別の特
定の実施態様において、ランダムペプチドを発現する組換え体生物学的ライブラ
リーは、プレイ核酸の供給源として使用され得る。
【０１３８】 本発明は、相互作用するタンパク質（ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ）のインヒビ
ターについてスクリーニングするための方法を開示する。簡単には、タンパク質
間相互作用アッセイは、１つ以上の候補分子の存在下で行われる以外は、本明細
書中で先に記載したように行われ得る。レポーター遺伝子活性における得られる
増加または減少は、１つ以上の候補分子が不在である場合に存在していたものと
関連して、その候補分子が、相互作用する対に対して効果を発揮することを示す
。好ましい実施態様において、タンパク質相互作用の阻害は、例えば、減弱され
ていないタンパク質相互作用がＵＲＡ３遺伝子の活性化を引き起こし、酵母を化
学的５−フルオロオロチン酸を含有する培地において死滅させる場合、酵母細胞
が生存するために必要とされる。例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ．１９８３．Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１６７−１８０を参照のこと。
【０１３９】 一般に、ベイトおよびプレイ集団を含むタンパク質は、好ましくは、各タンパ
ク質を予備選択された配列と隣接して含有するキメラコード配列の組換え発現に
よる、融合（キメラ）タンパク質として提供される。１つの集団について、予備
選択された配列は、それがプロモーター内のＤＮＡ配列（例えば、転写アクチベ
ーターまたはインヒビター）を特異的に認識する限り、任意のＤＮＡ結合ドメイ
ンであり得るＤＮＡ結合ドメインである。他の集団について、予備選択された配
列は、それぞれ、転写アクチベーターまたはインヒビターの、アクチベーターま
たはインヒビタードメインである。調節ドメイン単独（タンパク質配列への融合
物としてではなく）およびＤＮＡ結合ドメイン単独（タンパク質配列に対する融
合物としてではなく）は、好ましくは、アッセイにおいて擬陽性を回避するため
に、検出可能に相互作用しない。そのアッセイ系は、さらに、転写アクチベータ
ー（またはインヒビター）のＤＮＡ結合ドメインについての結合部位を含有する
プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。従って、本発明
の実施において、ＣＤＫ２タンパク質融合タンパク質のプレイ融合タンパク質へ
の結合は、転写アクチベーター（またはインヒビター）の再構築を導き、これは
、同時にレポーター遺伝子の発現を活性化（または阻害）する。
【０１４０】 特定の実施態様において、本発明は、以下の工程を含む１つ以上のタンパク質
間相互作用を検出するための方法論を開示する：（ｉ）第１の交配型の酵母細胞
の第１の集団においてＣＤＫ２タンパク質（またはその誘導体、フラグメント、
アナログ、または相同体）を組換え発現し、そしてＣＤＫ２タンパク質配列およ
びＤＮＡ結合ドメインを含有する第１の融合タンパク質を得る工程であって；こ
こで、その第１の酵母細胞の集団が、上記第１の融合タンパク質と第２の融合タ
ンパク質（転写活性化ドメインを含む）との相互作用が、上記第１のヌクレオチ
ド配列の転写の増大を生じるように、上記ＤＮＡ結合ドメインによって認識され
る１つ以上のＤＮＡ結合部位によって「駆動」されるプロモーターに作動可能に
連結した第１のヌクレオチド配列を含有する、工程；（ｉｉ）ネガティブ選択し
て、上記第１のヌクレオチド配列の上記増大した転写が、上記第２の融合タンパ
ク質の非存在下で起こる、上記第１の集団における酵母細胞を排除する工程；（
ｉｉｉ）上記第１の交配型とは異なる第２の交配型の酵母細胞の第２の集団にお
いて、複数の上記第２の融合タンパク質を組換え発現する工程であって；ここで
、上記第２の融合タンパク質は、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰおよび転写アクチベ
ーターの活性化ドメイン（そこでは、その活性化ドメインが上記第２の融合タン
パク質の各々において同一である）の誘導体、フラグメント、アナログ、または
相同体の配列から構成される、工程；（ｉｖ）酵母細胞の上記第１の集団を、酵
母細胞の上記第２の集団と交配させて、二倍体酵母細胞の第３の集団を形成する
工程であって、ここで上記二倍体酵母細胞の第３の集団が、上記ＤＮＡ結合ドメ
インによって認識されるＤＮＡ結合部位によって「駆動される」プロモーターに
作動可能に連結した第２のヌクレオチド配列を含み、その結果、第１の融合タン
パク質と第２の融合タンパク質との相互作用が、上記第２のヌクレオチド配列の
転写の増大をもたらし、そこでは上記第１および第２のヌクレオチド配列が、同
一である得るか、または異なり得る、工程、および（ｖ）上記第１および／また
は第２のヌクレオチド配列の増大した転写を検出し、それによって第１の融合タ
ンパク質と第２の融合タンパク質との間の相互作用を検出する工程。
【０１４１】 好ましい実施態様において、ベイト（ＣＤＫ２タンパク質配列）およびプレイ
（キメラ遺伝子のライブラリー）は、２つの酵母株を固形培地上で約６〜８時間
の期間、交配させることによって混合される。より好ましくない実施態様におい
て、交配は、液体培地において行われる。得られる二倍体は、キメラ遺伝子（す
なわち、ＤＮＡ結合ドメイン融合物および活性化ドメイン融合物）の両方の型を
含有する。相互作用的集団が得られた後、相互作用的タンパク質の対をコードす
るＤＮＡ配列は、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドまたは活性化ドメインハイブ
リッドのいずれかが、別々の反応において増幅される方法によって単離される。
好ましくは、その増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Ｉｎｎｉｓ
ら、１９９０．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）によって、ＤＮＡ結合ドメ
インハイブリッドまたは活性化ドメインハイブリッドのいずれかに特異的なオリ
ゴヌクレオチドプライマーの対を利用して行われる。ＰＣＲ増幅反応はまた、相
互作用するタンパク質対を発現するプールされた細胞、好ましくは、相互作用物
質のプールされたアレイにおいて行われ得る。当該分野で公知の他の増幅方法（
リガーゼ連鎖反応；Ｑβレプリカーゼなどを含むが、これらに限定されない）が
また使用され得る。例えば、Ｋｒｉｃｋａら、１９９５．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと。
【０１４２】 本発明のさらなる実施態様において、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドタンパ
ク質および活性化ドメインハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドはま
た、当該分野で周知のいずれかの方法により単離されそしてクローン化され得る
。例えば、限定はしないが、シャトル（酵母からＥ．ｃｏｌｉ）ベクターが、融
合タンパク質の発現のために使用される場合、遺伝子は、後に、Ｅ．ｃｏｌｉに
酵母ＤＮＡを形質転換し、そして細菌からプラスミドを回収することにより回収
され得る。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５７：２６７〜２
７２を参照のこと。
【０１４３】 （（１３）薬学的組成物） 本発明は、本発明の治療剤の薬学的有効量の被験体への投与による処置および
予防の方法を開示する。好ましい実施態様において、治療剤は、実質的に精製さ
れ、そして被験体は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【０１４４】 治療剤が核酸を含む場合に使用され得る処方および投与方法は、前出の６（ｉ
）章および６（ｉｉ）章に記載される。種々の送達系は公知であり、そして本発
明の治療剤を投与するために使用され得る送達系は、（ｉ）リポソーム、微粒子
、マイクロカプセルに封入；（ｉｉ）治療剤を発現し得る組換え細胞；（ｉｉｉ
）レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと）；（ｉｖ）
レトロウイルスまたは他のベクターの部分としての治療剤核酸の構築などを含む
がこれらに限定されない 投与方法は皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経
口経路を含むがこれらに限定されない。本発明の治療剤は、任意の好都合な経路
によって、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（
例えば、口粘膜、直腸および腸の粘膜など）を介する吸収により投与され得、そ
して他の生物学的に活性な薬剤と共に投与され得る。全身または局所に投与され
得る。さらに、脳室内およびくも膜下腔内注入を含む任意の適切な経路により、
中枢神経系に治療剤を投与することが有利であり得る。脳室内注入は、貯蔵器（
例えば、Ｏｍｍａｙａ貯蔵器）に取り付けられた脳室内カテーテルにより容易に
され得る。肺投与もまた、吸入器または噴霧器の使用により、およびエアロゾル
化薬剤を有する処方物により利用され得る。処置を必要とする領域への局所的な
治療剤の投与もまた望ましくあり得る；これは、外科手術の間の局所的な注入、
局所適用注射、カテーテル、坐剤、または移植（例であり、限定ではない）によ
り達成され得る。特定の実施態様において、投与は、悪性腫瘍あるいは新生物ま
たは前新生物組織の部位（または、過去にそうであった部位）での直接注入によ
り成され得る。
【０１４５】 本発明の他の実施態様において、治療剤は、ベシクルで、特にリポソームで送
達され得る。例えば、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５
２７〜１５３３を参照のこと。なお別の実施態様において、治療剤は、送達ポン
プ（例えば、Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２
１：５７４を参照のこと）および半透性のポリマー物質（例えば、Ｈｏｗａｒｄ
ら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照のこと）を含むが
これらに限定されない制御された放出系で送達され得る。さらに、制御された放
出系は、治療標的（例えば、脳）の近くに配置され得、従って、全身用量の一部
分だけが必要とされる。例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １９８４（Ｃ
ＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）を参照のこと。
【０１４６】 本発明の特定の実施態様において、治療剤が、タンパク質をコードする核酸で
ある場合、治療剤核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部分として構築され、そ
して細胞内になるように投与（レトロウイルスベクターの使用により、直接注入
により、微粒子ボンバードメントの使用により、脂質もしくは細胞表面レセプタ
ーまたはトランスフェクト試薬でコートすることにより、あるいは核へ侵入する
ことが公知であるホメオボックス様ペプチドに結合して投与することにより（例
えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８８：１８６４〜１８６８を参照のこと）など）することにより、そのコ
ードされたタンパク質の発現を促進するためにインビボで投与され得る。あるい
は、核酸治療剤は、細胞内に導入され得、そして相同組換えにより発現のために
宿主細胞ＤＮＡに取り込まれ得る。
【０１４７】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療剤の薬学
的有効量および薬学的に受容可能なキャリアーを含む。本明細書で使用される場
合、用語「薬学的に受容可能な」は、動物、より詳細にはヒトにおいて使用する
ために、連邦または州政府の監督官庁により認可されるか、あるいは米国薬局方
または他の一般に認識された薬局方に列挙されることを意味する。用語「キャリ
アー」は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または治療剤を投与することに用い
るビヒクルをいい、そして水および油のような滅菌液体を含むがこれに限定され
ない。
【０１４８】 特定の障害または状態の処置において有効である本発明の治療剤の量は、その
障害または状態の性質に依存し、そして当業者によって標準的な臨床技術により
決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、最適な投与範囲を同定するため
の補助に必要に応じて使用され得る。処方において使用される正確な用量はまた
、投与の経路、および疾患または障害の全体的な重篤度に依存し、そして臨床医
および各患者の状況の判断に従って決定されるべきである。しかし、本発明の治
療剤の静脈内投与に関する適切な用量範囲は、一般に体重ｋｇあたり約２０〜５
００μｇの活性化合物である。鼻腔内投与に関する適切な用量範囲は、一般に、
約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効量は、インビトロ
試験系または動物モデル試験系から導かれる用量−応答曲線から外挿され得る。
坐剤は、一般に０．５重量％〜１０重量％の範囲の活性成分を含み；経口処方物
は、好ましくは１０％〜９５％の活性成分を含む。
【０１４９】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物および治療剤の１つ以上の成分で満たさ
れた１つ以上の容器を含む、薬学的パックまたはキットを提供する。必要に応じ
て、このような容器には、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売を
規制する政府機関により規定された形態の告知が添付され得る。この告知は、政
府機関によるヒト投与についての製造、使用または販売の認可を反映する。
【０１５０】 （（１４）具体的な実施例） （ｉ）ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の同定 改変され改善された酵母ツーハイブリッド系を使用し、本発明のタンパク質相
互作用を同定した。酵母は真核生物であり、従って、このタイプの系において検
出される任意の分子間タンパク質相互作用は、生理的条件下で生じるタンパク質
相互作用を示す。例えば、Ｃｈｉｅｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：９５７８〜９５８１を参照のこと。２つのハイブ
リッドタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。「正方向」のスクリー
ニングのために、一方のハイブリッドは、ＣＤＫ２の部分に融合した酵母転写ア
クティベーターＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインから構成された。他方のハイブリ
ッドは、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーによりコードされた「プレイ」タンパク
質配列に融合されたＧａｌ４アクティベータードメインから構成された。次いで
、それぞれの生じたベクターを、当該分野で周知の技術の使用により、相補接合
タイプの酵母（接合タイプおよびα接合タイプ）に挿入した。例えば、Ｃｈｉｅ
ｎら、１９９１、前出を参照のこと。同じ酵母細胞内で両方のベクター構築物を
発現させ、従って、タンパク質−タンパク質相互作用が生じることを可能にする
ために、接合を実行した。ベイトとプレイドメインの間の相互作用は、Ｇａｌ４
に対するｃｉｓ結合エレメントを含むレポーター遺伝子の転写活性化を導いた。
指標タンパク質βガラクトシダーゼをコードするレポーター遺伝子、およびウラ
シルおよびヒスチジン栄養要求性のための代謝マーカーを、接合に利用される酵
母株の一方または他方に特定の様式で含ませた。この方法において、接合の成功
、両方の融合構築物の発現（すなわちＣＤＫ２およびＣＤＫ２−ＩＰ融合タンパ
ク質）に対して、酵母を選択した。相互作用領域を含むことが見出された酵母ク
ローンを選択し、そして９６穴マイクロタイタープレートの個々の穴で増殖させ
た。次いで、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ配列を含むプラスミドを単離し、そして
特徴付けた。
【０１５１】 ３．５×１０6の独立な単離体の胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅ ｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から、プレイｃＤＮＡを得た。ロイシン生合
成欠損酵母の選択のためのＬＥＵ２遺伝子を含む、酵母Ｇａｌ４活性化ドメイン
クローニングベクターであるｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ、ＣＡ）に直接クローニングされた、ＸｈｏＩ消化されかつｄＴ１５でプライ
ムされた胎児脳ｍＲＮＡ（１９〜２２週胎児の５つの雄／雌に由来）から、ライ
ブラリーを合成した。
【０１５２】 ベイトタンパク質のアレイに対するプレイｃＤＮＡ産物の相互作用を試験する
ために、スクリーニングを行なった。ベイトは、図１［配列番号１］および［配
列番号２］にそれぞれ記載したヌクレオチド１〜８９７（アミノ酸１〜２９８）
から構成されるＣＤＫ２タンパク質ヌクレオチド配列によりコードされた。
【０１５３】 次いで、酵母株ＹＵＬＨ（接合タイプａ、ｕｒａ３、ｈｉｓ３、ｌｙｓ２、Ａ
ｄｅ２，ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｇａｌ４、ｇａｌ８０、ＧＡＬ１−ＵＲＡ３、Ｇ
ＡＬ１−ｌａｃＺ）に、酢酸リチウム−ポリエチレングリコール媒介形質転換（
例えば、Ｉｔｏら、１９８３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３〜１６
８を参照のこと）により、導入されたベイトをコードする核酸を発現させ、他方
、酵母株Ｎ１０６ｒ（接合タイプａ’、ｕｒａ３、ｈｉｓ３、ａｄｅ２、ｔｒｐ
１、ｌｅｕ２、ｇａｌ４、ｇａｌ８０、ｃｙｈr、Ｌｙｓ２：：ＧＡＬ１UAS−Ｈ
ＩＳ３TATA−ＨＩＳ３、ｕｒａ３：：ＧＡＬ１UAS−ＧＡＬTATA−ｌａｃＺ）に 形質転換することにより、プレイ配列を導入した。次いで、形質転換された酵母
集団を、当該分野において標準の方法を用いて接合した。例えば、Ｓｈｅｒｍａ
ｎら、１９９１、Ｇｅｔｔｉｎｇ Ｓｔａｒｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｙｅａｓｔ（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を参照のこと。手短に
言えば、適切なプラスミドの存在について選択した培地で、中期対数期から後期
対数期まで酵母細胞を増殖させた。次いで、２つの接合株（αおよびａ）をＹＡ
ＰＤ培地で希釈し、ニトロセルロース膜で濾過し、６〜８時間３０℃でインキュ
ベートし、次いで所望の二倍体（すなわちβガラクトシダーゼ、ウラシル栄養要
求性、およびヒスチジン栄養要求性のためのレポーター遺伝子、ならびにベイト
およびプレイをコードしているベクターの発現を保持している酵母）についての
選択培地に移した。次いで、アデニンおよびリシン欠損（接合成功の選択を容易
にするため）、ロイシンおよびトリプトファン欠損（ベイトおよびプレイプラス
ミドの両方によりコードされる遺伝子の発現についての選択を容易にするために
）、ならびにウラシルおよびヒスチジン欠損（タンパク質相互作用についての選
択を容易にするために）の合成完全（ＳＣ）培地（例えば、Ｋａｉｓｅｒら、１
９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照のこと）上に、接合産物をプレーティ
ングした。上述の化合物を含むこの培地は、ＳＣ選択培地（以下「ＳＣＳ培地」
）と呼ばれる。
【０１５４】 選択されたクローンをβガラクトシダーゼの発現について調べ、ＣＤＫ２タン
パク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ相互作用の形成を確認した。次いで、フィル
ターリフトβガラクトシダーゼアッセイをＢｒｅｅｄｅｎおよびＮａｓｍｙｔｈ
（１９８５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．
５０：６４３〜６５０）のプロトコルの変法によって実行した。コロニーをＳＣ
Ｓプレート上にパッチし、一晩増殖させ、そしてＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１フィ
ルター上でレプリカプレートした。その後、レプリカフィルターを、βガラクト
シダーゼ活性についてアッセイした（すなわち、陽性であるコロニーは、可視の
青に変化した）。
【０１５５】 タンパク質相互作用について陽性であるコロニー中に含まれた細胞は、ＤＮＡ
結合ドメインプラスミドおよび活性化ドメインプラスミドの混合物を含んた。そ
してこれらの細胞を、個々にプレーティングし、そして９６穴マイクロタイター
プレートの個々の穴において単一の単離体として再び増殖させた。１０μｌの各
単離体を溶解し、それぞれのベクターの隣接配列に対して特異的なプライマーを
用いて、インサートをＰＣＲにより増幅し、そして各インサート配列の約２００
のアミノ末端ヌクレオチドをＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３７７シークエンサーを用い
て決定した。公知の配列との比較をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公に利用可能な
「ＢＬＡＳＴ」コンピュータープログラムを用いて行なった。
【０１５６】 ＣＤＫ２タンパク質のフラグメントを利用する引き続いてのスクリーニング手
順の間、同定された配列は、図２（配列番号３）に記載したヌクレオチド４６で
始まるサイクリンＩ配列と同一である１つの単離体、図３（配列番号５）に記載
したヌクレオチド１５３から始まるＥＲＨ配列と同一じである１つの単離体、お
よび図４（配列番号７）に記載したヌクレオチド１７８９および１８１９から始
まるｈｓＲｅｑ配列と同一である２つの単離体を含んでいた。決定された核酸配
列そしてサイクリンＩ、ＥＲＨ、ならびにスプライシング改変体ｈｓＲｅｑ*− １およびｈｓＲｅｑ*−２の対応するアミノ酸配列を図２〜４、６、および７に それぞれ示す。ＣＤＫ２およびＣＤＫ２−ＩＰ相互作用ドメインの要約を図７に
示す。
【０１５７】 （ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質相互作用の特異性の確認 ベイト：プレイ相互作用に対する特異性の全体の程度を決定するために、２つ
の一般的なアッセイを行なった。最初のアッセイでは、ＣＤＫ２タンパク質をコ
ードする個々のプラスミドを発現するＮ１０６ｒ酵母細胞を作製した。これらの
酵母細胞をＳＣＳプレート上にプレーティングし、一晩増殖させ、そして増殖に
ついて調べた。５つ全ての反応体について増殖を見出せず、従って、これらが「
自己活性化」タンパク質ではない（すなわち、これらのタンパク質は、機能的な
活性化複合体のために第２のタンパク質ドメインとの相互作用を必要とする）こ
とを確認した。
【０１５８】 ２番目のアッセイでは、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓ Ｒｅｑ*−２インサートを含むプラスミドを株Ｎ１０６ｒ（接合型α）に形質転 換し、そしてＣＤＫ２タンパク質以外のタンパク質を発現する酵母株ＹＵＬＨ酵
母（接合型ａ）と接合させた。無差別結合体（すなわち、非特異的な様式で多く
の他のタンパク質と結合し得るインサート）は、非特異的な様式で非ＣＤＫ２タ
ンパク質ドメインと相互作用し、そして続いて非特異的相互作用体として破棄す
る。本発明の相互作用体はいずれも、以下の段落で記載されたもの以外のタンパ
ク質への結合を示さないことに注意すべきである。
【０１５９】 上述の検出された相互作用を概括するために、そしてさらにそれらの特異性を
立証するために、ヒトベイトタンパク質１（Ｂ１）をコードするプラスミドと共
にＣＤＫ２タンパク質に対する単離されたベイトプラスミドを、酵母ＹＵＬＨ（
接合タイプａ）を形質転換するために使用した。サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲ
ｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からの相互作用ドメインを株Ｎ１０６ｒ（接合
タイプα）に形質転換した。形質転換体を再び増幅し、そして接合を行ない、同
定されたＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ相互作用を概括した。
図８に示すように、ＣＤＫ２は、ＥＲＨ（ボックスＢ）、およびｈｓＲｅｑ*− １および／またはｈｓＲｅｑ*−２（ボックスＥ）、ならびに公知の相互作用体 サイクリンＨ（ボックスＡ）、ｐ２７（ボックスＣ）およびｐ２１（ボックスＤ
）と特異的に複合体化した。それはプレイＰ１と非特異的に反応しなかった。図
８に図示したように、ＣＤＫ２列（上段）のＥＲＨ、ｐ２１、ｐ２７、およびｈ
ｓＲｅｑ*−１および／またはｈｓＲｅｑ*−２欄との相互作用は、増殖を示す（
すなわち、陽性相互作用）が、ＣＤＫ２列のＰ１に関する欄との相互作用は、増
殖を示さない（すなわち、タンパク質相互作用はない）。
【０１６０】 （ｉｉｉ）ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２をコードする配列の分析 ｈｓＲｅｑに対する公知のタンパク質ｃＤＮＡの３’非翻訳領域内の領域は、
改変酵母ツーハイブリッド系を用いて、ＣＤＫ２と相互作用するタンパク質をコ
ードすると同定した。本発明は、図４（配列番号７）に記載したヌクレオチド塩
基１７８８から末端まで、および１８１８から末端までのｈｓＲｅｑのヌクレオ
チド配列と同一な相互作用核酸配列を開示する。
【０１６１】 これらの領域は、タンパク質をコードするために十分なオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）をコードしていなかった。「ＢＬＡＳＴ」分析を行い、３つ
の可能な正方向のリーディングフレームにおける翻訳を決定することにより決定
した。検出された領域内には、開始メチオニンで始まる６０アミノ酸以上のＯＲ
Ｆ、および６０アミノ酸以上のタンパク質のカルボキシ末端を示し得る５’末端
から始まるＯＲＦは、３つの検出されたインサートのいずれについても検出され
なかった。従って、配列を調べて、それらが、検出された相互作用配列を含む公
知のｈｓＲｅｑタンパク質のスプライシング改変体をコードし得るかどうか決定
した。
【０１６２】 タンパク質スプライシング改変体について５’および３’スプライシング部位
の決定を上記のように行なった。潜在的な３’イントロン：エキソンスプライシ
ング部位を、Ｐａｄｇｅｔｔら、１９８４（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
５５：１１１９〜１１５０）および前出により記載されたコンセンサス分析に基
づいて同定した。成熟タンパク質の公知の翻訳フレームおよびそれぞれの予測さ
れた５’スプライシング部位に基づいて、スプライシングを成功させるための適
合性翻訳フレームを、潜在的な３’スプライシング部位について定義した。当該
分野で利用可能な多数のヌクレオチド配列分析プログラムにより、核酸配列を分
析し、可能なタンパク質翻訳産物を定義した。３つの正方向の翻訳フレームにお
ける翻訳を使用して、可能なオープンリーディングフレーム（停止コドンのない
、アミノ酸配列に対するコドンの連続）を定義した。５’スプライシング結合の
必要な翻訳フレームに一致した３’部位だけを保持した。不一致の５’または３
’スプライシング部位を排除した。従って、スプライシング部位の上流の３つの
非Ｃ，非Ｔ塩基を含む部位を含み、それぞれスプライシング改変体ｈｓＲｅｑ* −１およびｈｓＲｅｑ*−２のための結果として、２つの可能なｈｓＲｅｑのた めの３’スプライシング部位を生じた。
【０１６３】 結局、それぞれの可能な５’：３’スプライシング部位対について、哺乳動物
分岐点コンセンサス配列（Ｔ／Ｃ Ｎ ＣＴＧＡＣ）についての調査を行なった
（例えば、ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、１９８８、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．
２：１２６８〜１２７６を参照のこと）。ｈｓＲｅｑ（についてのそれぞれのス
プライシング改変体すなわち、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２）は、分
岐点コンセンサス配列を有していた（図４）。
【０１６４】 スプライシング改変体タンパク質は、生存可能なインビボ産物を構成するため
に少なくとも６０アミノ酸残基をコードしていなければならない。さらに、スプ
ライシング改変体の３’末端は、定義上、同定された相互作用配列に伸びていな
ければならない。スプライシング改変体ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２
についてのスプライシング部位は、これらの要件を満たした。詳細には、ｈｓＲ
ｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２の両方について、５’スプライシング部位を図
４（配列番号７）に記載したようなｈｓＲｅｑ配列のヌクレオチド５６３〜５７
０に同定し、この５’スプライシング部位を図４のＢに示した。ｈｓＲｅｑ*− １について、３’スプライシング部位をヌクレオチド１５６６〜１５８０で同定
し、そして図４に記載したｈｓＲｅｑヌクレオチド配列のヌクレオチド１５３３
〜１５４４での分岐点コンセンサス配列は、図４の「Ｅ」および「Ｄ」としてそ
れぞれ示した。ｈｓＲｅｑ*−２について、別の３’スプライシング部位をヌク レオチド１７７６〜１７９０に同定し、そして図４（配列番号７）に記載したｈ
ｓＲｅｑヌクレオチド配列のヌクレオチド１７５９〜１７６５での関連した分岐
点コンセンサス配列は、図４に「Ｇ」および「Ｆ」としてそれぞれ示した。
【０１６５】 スプライシング改変体配列をＮＲＤＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＰＤＢ
＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ配列の非冗長編集）のさら
なる調査に供し、公知のタンパク質配列の全長にわたって検出されない、その公
知のタンパク質との相同性を検出した。公知のタンパク質との有意な相同性は、
この分析を利用してｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２について検出されな
かった。
【０１６６】 本発明は、本明細書に記載された特定の実施態様によって範囲を限定されない
。実際は、本発明の種々の改変は本明細書に記載された改変に加えて、前述の説
明および添付の図面から、当業者にとって明白となる。このような改変は、特許
請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０１６７】 種々の刊行物は、本明細書中で引用され、そしてその刊行物の開示は、その全
体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
本明細書中で開示された本発明がよりよく理解され、そして評価されるように
、以下の詳細な記述が示される。
【図１】 ＣＤＫ２のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６１６２２（配列番
号１））および推定アミノ酸配列（配列番号２）である。その全体におけるコー
ド配列は、下記の第６章に記載されるアッセイにおいてベイトとして使用される
。
【図２】 サイクリンＩタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号３）および対応するア
ミノ酸配列（配列番号４）である（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ５０３１０）。下
記、第６章に記載されるアッセイにおいて同定されるプレイ配列は、塩基４６（
アミノ酸４６）で始まり、そして矢印「Ａ」で示される。
【図３】 ＥＲＨのヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）
である（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８５７５８）。下記、第６章で記載されるア
ッセイにおいて同定されるプレイ配列は、塩基１５３（アミノ酸２７）で始まり
、そして矢印「Ａ」で示される。
【図４】 ｈｓＲｅｑのヌクレオチド配列である（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９４５８５
；配列番号７）。下記、第６章で同定され、そして塩基１７８９で始まるプレイ
配列は、下線を付される。下記、第６章で同定され、そして塩基１８１９で始ま
る第２のプレイ配列は上線を付される。ｈｓＲｅｑの開始メチオニンコドンＡＴ
Ｇは、「Ａ」として印付けられ、そしてｈｓＲｅｑの終止コドンＴＧＡは、「Ｃ
」として印付けられる。５’スプライシング部位の公知のコンセンサス配列と同
一の塩基を有する５’スプライシング部位は太字で示され、そしてこのエクソン
（エクソンＩ）の最後の塩基が、矢印「Ｂ」で印付けられる。３’スプライシン
グ部位の公知のコンセンサス配列と同一な塩基を有する３’スプライシング部位
が太字で示され、そしてこのエクソン（エクソン２）の最初の塩基が矢印「Ｅ」
で印付けられ、そしてｈｓＲｅｑ*−１の終止コドンＴＧＡが、「Ｈ」で印付け られる。太字で示されるコンセンサス塩基とマッチする塩基を有するこのエクソ
ンの分岐点コンセンサス配列は、「Ｄ」として印付けられる。「Ｆ」として印付
けられる関連した分岐スプライシング点を有する別の３’スプライシング部位は
、「Ｇ」として印付けられる。ｈｓＲｅｑ*−２のこのエクソンにおける終止コ ドンＴＧＡは、「Ｈ」として示される。この配列の末端近傍のＡＡＵＡＡＡ転写
終結シグナルは、「Ｉ」として印付けられる。
【図５】 ｈｓＲｅｑ*−１核酸配列（配列番号８）およびアミノ酸配列（配列番号９） である。選択的スプライシングのためｈｓＲｅｑとは異なるアミノ酸配列のアミ
ノ末端アミノ酸残基は、矢印「Ａ」で印付けられる。下記、第６章で記載される
アッセイにおいて同定される１つのプレイ配列は、ｈｓＲｅｑ配列の塩基１７８
９で始まり（図４）、そして矢印「Ｂ」で示される。下記、第６章で記載される
アッセイにおいて同定される第２のプレイ配列は、ｈｓＲｅｑ配列（図４）の塩
基１８１９で始まり、そして矢印「Ｃ」で示される。
【図６】 ｈｓＲｅｑ*−２核酸配列（配列番号１０）およびアミノ酸配列（配列番号１ １）である。矢印「Ａ」で印付けられるアミノ酸配列に対するカルボキシル末端
のアミノ酸配列は、選択的スプライシングのためにｈｓＲｅｑのアミノ酸配列か
ら逸脱する。下記、第６章に記載されるアッセイにおいて同定される１つのプレ
イ配列は、ｈｓＲｅｑ配列（図４）の塩基１７８９で始まり、そして矢印「Ａ」
で示される。下記、第６章で記載されるアッセイにおいて同定される第２のプレ
イ配列は、ｈｓＲｅｑ配列（図４）の塩基１８１９で始まり、そして矢印「Ｂ」
で示される。
【図７】 改変された酵母ツーハイブリッドアッセイ系においてＣＤＫ２：ＣＤＫ２−Ｉ
Ｐ複合体を形成するＣＤＫ２、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１および ｈｓＲｅｑ*−２の一部の模式図である。ＣＤＫ２、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈ ｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２タンパク質のアミノ酸配列を棒で示し、棒
上に示される開始および終止アミノ酸番号を伴う（図１〜３および５〜６（それ
ぞれ配列番号２、４、６、１１および１３）における各タンパク質について示さ
れるように）。ベイトとして使用されるＣＤＫ２の一部、またはサイクリンＩ、
ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２の場合にこのアッセイにおける
相互作用として同定された最も短い配列（「プレイ配列」）は、黒塗りされ、そ
してそのプレイ配列の最初のアミノ酸番号は、各棒上に示される。１より多い独
立したプレイ単離物が同定された場合（すなわち、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓ Ｒｅｑ*−２について）、より長いプレイ配列の開始部位は、アミノ末端に向か って伸びる棒によって（一定の比例で）示される。
【図８】 改変された酵母ツーハイブリッド系アッセイの結果のマトリックスである。ベ
イトタンパク質Ｂ１およびＣＤＫ２を使用するアッセイの結果は、この列の左に
示され、そしてプレイタンパク質、サイクリンＨ（Ｃｙｃ．Ｈ）、ＥＲＨ、ｐ２
７kip、Ｐ１、ｐ２１wafおよびｈｓＲｅｑは、カラム上に示される。ベイトおよ
びプレイタンパク質の陽性相互作用は、特定のベイトとプレイタンパク質の間の
交差点を形成するボックス中で「＋」として示される；相互作用の欠如は、空の
ボックスで示される。Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと表示されたボックスは、ＣＤＫ
２およびサイクリンＨ（Ｃｙｃ．Ｈ）、ＥＲＨ、ｐ２７kip、ｐ２１wafならびに
ｈｓＲｅｑをそれぞれ発現する酵母の接合および増殖を示す。Ｆと表示されたボ
ックスは、Ｂ１およびＰ１を発現している酵母の接合および増殖を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ ４Ｃ０８５ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 9/10 １０１ 19/00 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/19 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/02 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ナンダバラン， クリシュナン アメリカ合衆国 コネチカット 06437， ギルフォード， ビレッジ ポンド ロ ード 228 (72)発明者 シュルツ， ビンセント ピーター アメリカ合衆国 コネチカット 06443， マディソン， オールド ファームズ ロード 21 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 BA41 BA80 CA04 CA07 DA12 EA04 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ52 QR08 QR33 QR42 QR55 QR59 QR76 QR80 QS05 QS34 QS36 QS38 QX02 4B064 AG01 AG27 CA06 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA72X AA90X AB01 AB04 BA02 BA08 CA24 CA25 CA27 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 BA44 CA18 NA14 ZA452 ZB262 4C085 AA13 AA14 AA19 BB11 CC02 CC21 EE01 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA45 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA10 BA41 CA40 DA76 DA89 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (78)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパ
    ク質の精製された複合体であって、ここで該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク
    質が、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる
    群より選択される、複合体。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の精製された複合体であって、ここで前記タ
    ンパク質が、ヒトタンパク質である、複合体。
  3. 【請求項３】 ＣＤＫ２タンパク質の誘導体およびＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
    Ｐタンパク質の複合体、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの
    誘導体の複合体、ならびにＣＤＫ２タンパク質の誘導体およびＣＤＫ２タンパク
    質−ＩＰの誘導体の複合体からなる群より選択される精製された複合体であって
    、ここで該ＣＤＫ２タンパク質の誘導体が、野生型ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタ
    ンパク質との複合体を形成し得、そして該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体が
    、野生型ＣＤＫ２タンパク質との複合体を形成し得、ここで該ＣＤＫ２タンパク
    質−ＩＰタンパク質が、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲ ｅｑ*−２からなる群より選択される、複合体。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の精製された複合体であって、ここで前記Ｃ
    ＤＫ２タンパク質および／または前記ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質の誘
    導体が、放射活性部分、蛍光部分、化学発光部分、比色部分または酵素的部分か
    らなる群より選択された標識で検出可能に標識された、複合体。
  5. 【請求項５】 少なくとも６アミノ酸残基からなるＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
    Ｐタンパク質のフラグメントに対して共有結合を介して結合した、少なくとも６
    アミノ酸残基からなるＣＤＫ２タンパク質のフラグメントを含有する、キメラタ
    ンパク質。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載のキメラタンパク質であって、ここで前記Ｃ
    ＤＫ２タンパク質のフラグメントが、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質を結
    合し得るフラグメントであり、そしてここで、該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタン
    パク質のフラグメントが、ＣＤＫ２タンパク質を結合し得るフラグメントである
    、タンパク質。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のキメラタンパク質であって、ここで前記Ｃ
    ＤＫ２タンパク質のフラグメントおよび前記ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク
    質のフラグメントが相互作用して、ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−
    ＩＰ複合体を形成する、タンパク質。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の複合体に免疫特異的に結合する抗体または
    該抗体の結合ドメインを含む該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
  9. 【請求項９】 ＣＤＫ２タンパク質・ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ複合体の一
    部でないＣＤＫ２タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質に免疫
    特異的に結合しない、請求項８に記載の抗体。
  10. 【請求項１０】 ＣＤＫ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列、なら
    びにサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群
    より選択されるＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質をコードするヌクレオチド
    配列を包含する、単離された核酸または単離された複数の核酸。
  11. 【請求項１１】 核酸ベクターを含む、請求項１０に記載の単離された核酸
    または単離された複数の核酸。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の単離された核酸または単離された複数
    の核酸であって、ここでＣＤＫ２タンパク質コード配列およびＣＤＫ２タンパク
    質−ＩＰタンパク質コード配列が、作動可能にプロモーターと連結された、核酸
    。
  13. 【請求項１３】 請求項７に記載のキメラタンパク質をコードするヌクレオ
    チド配列を包含する、単離された核酸。
  14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の核酸を含む細胞であって、ここで前記
    核酸が組換え分子である、細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の核酸を含む細胞であって、ここで前記
    核酸が組換え分子である、細胞。
  16. 【請求項１６】 請求項１３に記載の核酸を含む組換え細胞であって、ここ
    で前記核酸が組換え分子である、細胞。
  17. 【請求項１７】 ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２タンパク質からな
    る群より選択される、精製されたタンパク質。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載のタンパク質であって、ここで前記タン
    パク質が、ヒトタンパク質である、タンパク質。
  19. 【請求項１９】 配列番号１１および配列番号１３からなる群より選択され
    るアミノ酸配列を含有する、請求項１８に記載のタンパク質。
  20. 【請求項２０】 配列番号８および配列番号１０からなる群より選択される
    ヌクレオチド配列の部分からなるヌクレオチド配列を有するＤＮＡの逆向き相補
    物とハイブリダイズし得る核酸によってコードされる、精製されたタンパク質で
    あって、該部分は非プロセス化ｈｓＲｅｑ ｍＲＮＡのスプライシングから生じ
    るスプライシング部位接合部を含み、該核酸は、該スプライシング部位接合部に
    わたる少なくとも１０ヌクレオチドの配列と完全に相補的な配列を含有する、タ
    ンパク質。
  21. 【請求項２１】 請求項１７に記載のタンパク質の精製された誘導体または
    アナログであって、該誘導体またはアナログが、ＣＤＫ２を結合し得、ここで該
    誘導体またはアナログが、配列番号９のアミノ酸１８７〜２８０の少なくとも１
    ０アミノ酸部分または配列番号１１のアミノ酸１８８〜２１０の少なくとも１０
    アミノ酸部分を包含する、タンパク質の精製した誘導体またはアナログ。
  22. 【請求項２２】 ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ−*２タンパク質からな
    る群より選択されるタンパク質に特異的な抗体によって結合され得、ここで該抗
    体が、ｈｓＲｅｑに結合しない、請求項２１に記載の誘導体またはアナログ。
  23. 【請求項２３】 請求項１７に記載のタンパク質の精製されたフラグメント
    であって、ここで該フラグメントは、該タンパク質の少なくとも６アミノ酸残基
    部分を含み、該タンパク質の配列がｈｓＲｅｑにおいて含まれない、フラグメン
    ト。
  24. 【請求項２４】 請求項１７に記載のタンパク質に対して少なくとも６０％
    の同一性を有するアミノ酸配列を包含する、精製されたタンパク質であって、こ
    こで同一性のパーセントが、請求項１７に記載のタンパク質に対して同一のサイ
    ズのアミノ酸配列にわたって決定され、ここで該タンパク質が、ｈｓＲｅｑでは
    ない、タンパク質。
  25. 【請求項２５】 請求項１７に記載のタンパク質のフラグメントを含有する
    キメラタンパク質であって、ここで該フラグメントが、第２のタンパク質のアミ
    ノ酸配列と共有結合を介して結合されるｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２
    の少なくとも６アミノ酸残基からなり、ここで該第２のタンパク質が請求項１７
    に記載のタンパク質ではなく、そしてｈｓＲｅｑでない、タンパク質。
  26. 【請求項２６】 請求項１７に記載のタンパク質に免疫特異的に結合し得る
    抗体または該抗体の結合ドメインを含む該抗体のフラグメントもしくは誘導体。
  27. 【請求項２７】 請求項１８に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド
    配列を含有する、単離された核酸。
  28. 【請求項２８】 配列番号１０および配列番号１２のヌクレオチド配列を含
    有する、単離された核酸。
  29. 【請求項２９】 配列番号１０および配列番号１２のヌクレオチド配列の部
    分からなるヌクレオチド配列を有する核酸の逆向き相補物とハイブリダイズし得
    る、単離された核酸であって、該部分は、非プロセス化ｈｓＲｅｑ ｍＲＮＡの
    スプライシングから生じるスプライシング部位接合部を含み、そして該核酸は、
    該スプライシング部位接合部にわたる少なくとも１０ヌクレオチド配列に対して
    完全に相補的な配列を包含する、核酸。
  30. 【請求項３０】 配列番号１０および配列番号１２のヌクレオチド配列の部
    分を包含する単離された核酸であって、ここで該核酸配列が非プロセス化ｈｓＲ
    ｅｑ ｍＲＮＡのスプライシングから生じるスプライシング部位接合部にわたる
    少なくとも１０ヌクレオチドから構成される、核酸。
  31. 【請求項３１】 請求項２７に記載の核酸を含む細胞であって、ここで前記
    核酸が、組換え分子である、細胞。
  32. 【請求項３２】 請求項１に記載の複合体の治療的または予防的有効量およ
    び薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の薬学的組成物であって、ここで前記タ
    ンパク質が、ヒトタンパク質である、組成物。
  34. 【請求項３４】 請求項３に記載の複合体の治療的または予防的有効量およ
    び薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  35. 【請求項３５】 請求項５に記載のキメラタンパク質の治療的または予防的
    有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  36. 【請求項３６】 請求項６に記載のキメラタンパク質の治療的または予防的
    有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  37. 【請求項３７】 請求項８に記載の抗体またはその結合ドメインを含む該抗
    体のフラグメントもしくは誘導体の治療的もしくは予防的有効量、および薬学的
    に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  38. 【請求項３８】 請求項９に記載の抗体またはその結合ドメインを含む該抗
    体のフラグメントもしくは誘導体の治療的もしくは予防的有効量、および薬学的
    に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  39. 【請求項３９】 請求項１０に記載の核酸もしくは複数の核酸の治療的また
    は予防的有効量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物
    。
  40. 【請求項４０】 請求項１３に記載の単離された核酸の治療的または予防的
    有効量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  41. 【請求項４１】 請求項１４に記載の組換え細胞の治療的または予防的有効
    量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  42. 【請求項４２】 請求項１５に記載のタンパク質の治療的または予防的有効
    量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  43. 【請求項４３】 請求項４１に記載の薬学的組成物であって、ここで前記タ
    ンパク質が配列番号１１および配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含有する
    、組成物。
  44. 【請求項４４】 請求項２６に記載の抗体またはその結合ドメインを含む該
    抗体のフラグメントもしくは誘導体の治療的もしくは予防的有効量、および薬学
    的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  45. 【請求項４５】 請求項１７に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド
    配列を含有する核酸の治療的または予防的有効量、および薬学的に受容可能なキ
    ャリアを含有する、薬学的組成物。
  46. 【請求項４６】 請求項２７に記載の組換え核酸を含む細胞の治療的または
    予防的有効量、および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  47. 【請求項４７】 ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタン
    パク質の複合体を産生するための方法であって、以下： （ｉ）請求項１０に記載の核酸を含む組換え細胞を増殖する工程であって、そ
    の結果コードされたＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパ
    ク質が発現され、そしてお互いに結合する工程、ならびに、 （ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質の発
    現された複合体を回収する工程、 を含む、方法。
  48. 【請求項４８】 ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選
    択されるタンパク質を産生するための方法であって、以下： （ｉ）該タンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞を増殖させる工程であ
    って、その結果コードされたタンパク質が発現される工程、および、 （ｉｉ）該発現タンパク質を回収する工程、 を含む、方法。
  49. 【請求項４９】 ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタン
    パク質の複合体の異常なレベルによって特徴付けられる疾患もしくは障害の発生
    の存在または発生についての素因のための診断あるいはスクリーニングの方法で
    あって、ここで該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰが、該被検体内におけるサイクリン
    Ｉ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択され、
    該方法は、該被検体由来のサンプル中の該複合体、該ＣＤＫ２タンパク質および
    ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質をコードするＲＮＡ、または該複合体の機
    能的活性のレベルを測定する工程を含み、ここで該疾患もしくは障害または該疾
    患もしくは障害の発生に関する素因を有さない被検体由来の類似サンプル中で見
    出される該複合体、該ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタン
    パク質をコードする該ＲＮＡまたは該複合体の機能的活性のレベルと比較して該
    サンプル内における該複合体、該ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質
    −ＩＰタンパク質をコードする該ＲＮＡもしくは該複合体の機能的活性のレベル
    における増加または減少が、該疾患もしくは障害の存在または該疾患もしくは障
    害の発生についての素因を示す、方法。
  50. 【請求項５０】 被検体内におけるｈｓＲｅｑ−*１およびｈｓＲｅｑ*−２
    タンパク質もしくはＲＮＡからなる群より選択されるタンパク質もしくはＲＮＡ
    の異常なレベルによって特徴付けられる疾患もしくは障害の発生の存在または発
    生のための素因についての診断あるいはスクリーニングの方法であって、該方法
    は、該被検体由来のサンプル内の該タンパク質、該ＲＮＡもしくは該タンパク質
    の機能的活性のレベルを測定する工程を含み、ここで該疾患もしくは障害または
    該疾患もしくは障害の発生の素因を有さない被検体由来の類似のサンプル内で見
    出される該タンパク質、該ＲＮＡまたは該機能的活性のレベルと比較して、該サ
    ンプル内の該タンパク質、該ＲＮＡもしくは該機能的活性のレベルにおける増加
    または減少が、該疾患もしくは障害の存在または該疾患もしくは障害の発生の素
    因を示す、方法。
  51. 【請求項５１】 １以上の容器において、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ
    ２タンパク質−ＩＰの複合体、該複合体に対する抗体、ＣＤＫ２タンパク質をコ
    ードするＲＮＡおよびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰをコードするＲＮＡとハイブリ
    ダイズし得る核酸プローブ、またはＣＤＫ２タンパク質をコードする遺伝子およ
    びＣＤＫ２タンパク質−ＩＰをコードする遺伝子の少なくとも一部の増幅をプラ
    イムし得る核酸プライマーの対からなる群より選択される物質を含有する、キッ
    トであって、ここで該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰが、サイクリンＩ、ＥＲＢ、ｈ
    ｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択される、キット。
  52. 【請求項５２】 ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複
    合体の異常なレベルに関連する疾患もしくは障害の処置または予防の方法であっ
    て、ここで該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰが、被検体内のサイクリンＩ、ＥＲＨ、
    ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択され、このような処
    置または予防が所望される被検体に対して、該複合体の機能を調節し得る治療的
    有効量の分子（単数または複数）を投与する工程から構成される、方法。
  53. 【請求項５３】 請求項５２に記載の方法であって、ここで前記疾患または
    障害が前記複合体の減少したレベルに関連し、そして前記分子（単数または複数
    ）が、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複合体の機能を促
    進し得、そしてここで該分子（単数または複数）が、以下： （ｉ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複合体； （ｉｉ）野生型複合体より安定もしくはより活性であるＣＤＫ２タンパク質お
    よびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複合体の誘導体またはアナログ； （ｉｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫタンパク質−ＩＰをコードする核
    酸、ならびに、 （ｉｖ）野生型複合体より安定もしくはより活性である複合体を形成し得るＣ
    ＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体またはアナログをコ
    ードする核酸、 からなる群より選択される、方法。
  54. 【請求項５４】 請求項５２に記載の方法であって、ここで前記疾患または
    障害が、前記複合体の増加したレベルに関連し、そして前記分子（単数または複
    数）がＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複合体の機能を阻
    害し得、そしてここで該分子（単数または複数）が、以下： （ｉ）該複合体に対する抗体またはその結合領域を含むフラグメントもしくは
    誘導体； （ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセンス核
    酸、ならびに、 （ｉｉｉ）異種ヌクレオチド配列が、ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タン
    パク質−ＩＰ遺伝子の少なくとも一部の生物学的活性を不活性化するように該異
    種ヌクレオチド配列が挿入されているＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパ
    ク質−ＩＰ遺伝子の少なくとも一部を含有する核酸であって、そしてここで該Ｃ
    ＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子の一部が、ゲノムのＣ
    ＤＫ２タンパク質遺伝子およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子との相同的組換
    えを促進するように前記異種配列と隣接する、核酸 からなる群より選択される、方法。
  55. 【請求項５５】 被検体内のｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からな
    る群より選択される異常なレベルのＣＤＫ２タンパク質−ＩＰに関連する疾患も
    しくは障害の処置または予防の方法であって、該方法が該ＣＤＫ２タンパク質−
    ＩＰの機能を調節する治療的有効量の分子（単数または複数）をこのような処置
    もしくは予防が所望される該被検体に対して投与する工程から構成される、方法
    。
  56. 【請求項５６】 請求項５５に記載の方法であって、ここで前記疾患または
    障害が、減少したレベルのＣＤＫ２タンパク質−ＩＰに関連し、そして前記分子
    （単数または複数）が、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの機能を促進し、そしてここ
    で該分子（単数または複数）が、以下： （ｉ）ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質； （ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質と結合し得るＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体
    またはアナログ； （ｉｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰタンパク質をコードする核酸、および、 （ｉｖ）ＣＤＫ２タンパク質と結合し得るＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの誘導体
    またはアナログをコードする核酸 からなる群より選択される、方法。
  57. 【請求項５７】 請求項５５に記載の方法であって、ここで前記疾患または
    障害が、増加したレベルのＣＤＫ２タンパク質−ＩＰに関連し、そして前記分子
    （単数または複数）が、ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの機能を阻害し、そしてここ
    で該分子（単数または複数）が、以下： （ｉ）抗ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ抗体またはその結合領域を含むそのフラグ
    メントもしくは誘導体； （ｉｉ）ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰアンチセンス核酸、および、 （ｉｉｉ）異種ヌクレオチド配列が少なくともＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝
    子の一部の生物学的活性を不活性化するように該異種ヌクレオチド配列が挿入さ
    れているＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子の少なくとも一部を含有する核酸であ
    って、ここで該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子の一部が、ゲノムのＣＤＫ２タ
    ンパク質−ＩＰ遺伝子との相同的組換えを促進するように該異種配列と隣接する
    、核酸、 からなる群より選択される、方法。
  58. 【請求項５８】 抗新生物活性について、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅ
    ｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２またはＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパ
    ク質−ＩＰの複合体の誘導体または該複合体の活性のモジュレーターからなる群
    より選択される該ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの精製さ
    れた複合体をスクリーニングするための方法であって、ここで該方法が、悪性障
    害に由来するか、もしくは悪性障害に関連した特徴を提示する細胞株由来の細胞
    の生存または増殖を測定する工程を含み、ここで該細胞が、該複合体、誘導体ま
    たはモジュレーターと接触されて、接触されていない細胞において測定された該
    インジケーターのレベルと比較され、そしてここで該接触された細胞におけるよ
    り低いレベルが、該複合体、誘導体またはモジュレーターが、抗新生物活性を有
    することを示す、方法。
  59. 【請求項５９】 抗新生物活性について、サイクリンＩ、ＥＲＢ、ｈｓＲｅ
    ｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２またはＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパ
    ク質−ＩＰの複合体の誘導体または該複合体の活性のモジュレーターからなる群
    より選択される該ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの精製さ
    れた複合体をスクリーニングするための方法論であって、ここで該方法が、腫瘍
    を有するか、または腫瘍を有さないが、後に腫瘍細胞もしくは腫瘍形成剤でチャ
    レンジされる試験動物に対して該複合体、誘導体またはモジュレーターを投与す
    る工程、および該試験動物において腫瘍増殖または後退を測定する工程を含み、
    ここで投与されない該試験動物と比較して、該複合体、誘導体またはモジュレー
    ターを投与される該試験動物内での減少した腫瘍増殖もしくは増加した腫瘍後退
    または腫瘍増殖の防止が、該複合体、誘導体またはモジュレーターが、抗新生物
    活性を有することを示す、方法。
  60. 【請求項６０】 アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関
    連疾患の処置あるいは予防における活性についてサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲ
    ｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２あるいはＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タ
    ンパク質−ＩＰの複合体の誘導体、または該複合体の活性のモジュレーターから
    なる群より選択される該ＣＤＫ２およびＣＤＫ２−ＩＰの精製された複合体をス
    クリーニングするための方法であって、該方法は、該複合体、誘導体またはモジ
    ュレーターと、インビトロでアテローム動脈硬化症反応のインジケーターを示す
    培養細胞と接触する工程、および該複合体、誘導体またはモジュレーターと接触
    された細胞における該インジケーターのレベルを、接触されない細胞における該
    インジケーターの該レベルと比較する工程を包含し、ここで該接触された細胞に
    おけるより低いレベルは、該複合体、誘導体またはモジュレーターがアテローム
    性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の処置または予防における
    活性を有することを示す、方法。
  61. 【請求項６１】 アテローム性動脈硬化症もしくはアテローム性動脈硬化症
    関連疾患の処置または予防における活性についてサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲ
    ｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２またはＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タン
    パク質−ＩＰの複合体の誘導体あるいは該複合体の活性のモジュレーターからな
    る群より選択される該ＣＤＫ２およびＣＤＫ２−ＩＰの精製された複合体をスク
    リーニングするための方法であって、該方法は、アテローム性動脈硬化症反応を
    示す試験動物か、またはアテローム性動脈硬化症反応を示さず、そして後にアテ
    ローム性動脈硬化症反応を誘起する薬剤でチャレンジされる試験動物に対して該
    複合体、誘導体もしくはモジュレーターを投与する工程；ならびに該複合体、誘
    導体またはモジュレーターの投与後、アテローム性動脈硬化症反応における変化
    を測定する工程を包含し、ここで該アテローム性動脈硬化症反応における減少ま
    たは該アテローム性動脈硬化症反応の予防が、該複合体、誘導体もしくはモジュ
    レーターが、アテローム性動脈硬化症もしくはアテローム性動脈硬化症関連疾患
    の処置または予防における活性を有することを示す、方法。
  62. 【請求項６２】 ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの複
    合体の形成を、直接的または間接的に調節する分子（単数または複数）について
    のスクリーニング方法であって、ここで該ＣＤＫ２タンパク質−ＩＰが、サイク
    リンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択さ
    れ、ここで該方法は、該複合体の形成をもたらす条件下で該分子（単数または複
    数）の存在下においてＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰから
    形成される該複合体のレベルを測定する工程、ならびに該複合体のレベルと該分
    子（単数または複数）の非存在下で形成される該複合体のレベルを比較する工程
    を含み、ここで該分子の存在下における該複合体のより低いまたはより高いレベ
    ルが、該分子（単数または複数）が該複合体の形成を調節する能力を有すること
    を示す、方法。
  63. 【請求項６３】 組換え体、非ヒト動物またはその祖先であって、ここでサ
    イクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選
    択される内因性ＣＤＫ２タンパク質遺伝子および内因性ＣＤＫ２タンパク質−Ｉ
    Ｐ遺伝子の両方が欠失されているか、または相同組換えもしくは挿入的な変異誘
    発によって不活性化されている、組換え体、非ヒト動物またはその祖先。
  64. 【請求項６４】 サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅ ｑ*−２からなる群より選択されるＣＤＫ２タンパク質遺伝子およびＣＤＫ２タ ンパク質−ＩＰ遺伝子の両方を含む組換え体、非ヒト動物またはその祖先であっ
    て、ここで該ＣＤＫ２タンパク質遺伝子が、ネイティブなＣＤＫ２タンパク質遺
    伝子のプロモーターではないプロモーターの制御下にあり、そして該ＣＤＫ２タ
    ンパク質−ＩＰ遺伝子が、ネイティブなＣＤＫ２タンパク質−ＩＰ遺伝子のプロ
    モーターでないプロモーターの制御下にある、組換え体、非ヒト動物またはその
    祖先。
  65. 【請求項６５】 請求項７に記載のキメラタンパク質をコードする核酸配列
    を含有する導入遺伝子を含む、組換え体、非ヒト動物またはその祖先。
  66. 【請求項６６】 配列番号１０および配列番号１０のヌクレオチド配列を含
    有する導入遺伝子を含む、組換え体、非ヒト動物またはその祖先。
  67. 【請求項６７】 ＣＤＫ２タンパク質の活性またはレベルの調節方法であっ
    て、ここで該方法は、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅ ｑ*−２からなる群より選択されるタンパク質、または該タンパク質をコードす る核酸、または該タンパク質と免疫特異的に結合する抗体、またはその結合ドメ
    インを含む該抗体のフラグメントもしくは誘導体と、細胞を接触させる工程、あ
    るいはサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる
    群より選択されるタンパク質、または該タンパク質をコードする核酸、または該
    タンパク質と免疫特異的に結合する抗体、またはその結合ドメインを含む該抗体
    のフラグメントもしくは誘導体をＣＤＫ２タンパク質遺伝子を、発現する動物に
    投与する工程を含む、方法。
  68. 【請求項６８】 サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅ ｑ*−２からなる群より選択されるタンパク質の活性またはレベルの調節方法で あって、ここで該方法は、ＣＤＫ２タンパク質、ＣＤＫ２タンパク質をコードす
    る核酸、またはＣＤＫ２タンパク質に免疫特異的に結合する抗体またはその結合
    ドメインを含む該抗体のフラグメントもしくは誘導体と細胞を接触させる工程、
    あるいはサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からな
    る群より選択されるタンパク質をコードする遺伝子を発現する動物に、ＣＤＫ２
    タンパク質、ＣＤＫ２タンパク質をコードする核酸、またはＣＤＫ２タンパク質
    に免疫特異的に結合する抗体またはその結合ドメインを含む該抗体のフラグメン
    トもしくは誘導体を投与する工程を含む、方法。
  69. 【請求項６９】 ＣＤＫ２タンパク質ならびに、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈ
    ｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択されるタンパク質の複
    合体の活性またはレベルの調節方法であって、ここで該方法は、該複合体の形成
    を調節する能力を有する分子を、細胞に接触させる工程、または該複合体を発現
    および形成する動物に該分子を投与する工程を含む、方法。
  70. 【請求項７０】 ＣＤＫ２タンパク質、またはサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓ
    Ｒｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択されるタンパク質、また
    はＣＤＫ２タンパク質と該タンパク質の複合体の活性を調節する能力を有する分
    子を同定するための方法であって、ここで該方法が、１以上の候補分子を該タン
    パク質の存在下でＣＤＫ２タンパク質と接触させる工程、および該ＣＤＫ２タン
    パク質と該タンパク質の間に形成される複合体の量を測定する工程を含み、そし
    てここで候補分子（単数または複数）の非存在下において形成される複合体の量
    と比較して、形成する複合体の量における増加または減少は、該分子（単数また
    は複数）が、ＣＤＫ２タンパク質、該タンパク質またはＣＤＫ２タンパク質と該
    タンパク質の複合体の活性を調節する能力を有することを示す、方法。
  71. 【請求項７１】 請求項７０に記載の方法であって、ここで前記接触工程が
    請求項６５に記載の組換え体、非ヒト動物またはその祖先に前記候補分子（単数
    または複数）を投与することによって行われる、方法。
  72. 【請求項７２】 請求項７０に記載の方法であって、ここで前記接触工程が
    インビトロで行われ、そして前記ＣＤＫ２タンパク質、前記タンパク質および前
    記候補分子（単数または複数）が精製される、方法。
  73. 【請求項７３】 生物学的活性についてＣＤＫ２タンパク質の誘導体または
    アナログをスクリーニングするための方法であって、ここで該方法は、サイクリ
    ンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択され
    るタンパク質と該ＣＤＫ２タンパク質の該誘導体またはアナログを接触させる工
    程、ならびに該ＣＤＫ２タンパク質の誘導体またはアナログと該タンパク質の間
    の複合体の形成を検出する工程を含み、そしてここで該複合体の形成を検出する
    ことは、該ＣＤＫ２タンパク質の誘導体またはアナログが、生物学的活性を有す
    ることを示す、方法。
  74. 【請求項７４】 生物学的活性について、サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅ
    ｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択されるタンパク質の誘導体ま
    たはアナログをスクリーニングするための方法であって、ここで該方法が、該タ
    ンパク質の該誘導体またはアナログを該ＣＤＫ２タンパク質と接触させる工程、
    ならびに該タンパク質の該誘導体またはアナログと該ＣＤＫ２タンパク質の間の
    複合体の形成を検出する工程を含み、そしてここで該複合体の形成を検出するこ
    とは、該タンパク質の誘導体またはアナログが、生物学的活性を有することを示
    す、方法。
  75. 【請求項７５】 ＣＤＫ２タンパク質とＣＤＫ２タンパク質−ＩＰとの複合
    体の異常なレベルによって特徴付けられる疾患または障害の処置を投与される被
    検体において該疾患もしくは障害の該処置の効力をモニターする方法であって、
    ここで該方法は、該被検体由来サンプル内の、該複合体、該ＣＤＫ２タンパク質
    およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰをコードするＲＮＡ、または該複合体の機能的
    活性のレベルを測定する工程を含み、ここで該サンプルは、該処置の投与後、該
    被検体から採取され、そして（ｉ）該処置の該投与前に該被検体から採取された
    サンプル内における該レベル、または（ｉｉ）該疾患もしくは障害の前処置段階
    と関連する標準レベル、と比較され、そしてここで該処置の投与前に採取された
    該サンプル内の、該複合体、該ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−
    ＩＰをコードする該ＲＮＡまたは該複合体の機能的活性のレベル、あるいは該標
    準レベルと比較した、該処置の投与後採取された該サンプル内の、該複合体、該
    ＣＤＫ２タンパク質およびＣＤＫ２タンパク質−ＩＰをコードするＲＮＡまたは
    該複合体の機能的活性のレベルにおける変化または変化の欠如は、該投与が該疾
    患または障害の処置において有効かどうかを示す、方法。
  76. 【請求項７６】 被検体内の癌もしくは過剰増殖障害の処置または予防の方
    法であって、該方法が、ＣＤＫ２タンパク質とサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅ
    ｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択されるＣＤＫ２タンパク質−
    ＩＰの複合体または１つ以上の上述のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの組み合わせの
    複合体の機能を調節する能力を有する治療的有効量の分子（単数または複数）を
    、このような処置または予防が所望される被検体に投与する工程を含む、方法。
  77. 【請求項７７】 被検体内のアテローム性動脈硬化症の処置または予防の方
    法であって、ここで該方法は、ＣＤＫ２タンパク質とサイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈ
    ｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅｑ*−２からなる群より選択されるＣＤＫ２タンパ
    ク質−ＩＰの複合体または上述のＣＤＫ２タンパク質−ＩＰの１以上の組み合わ
    せの複合体の機能を調節する能力を有する治療的に有効量の分子（単数または複
    数）を、このような処置または予防が所望される被検体に投与する工程を含む、
    方法。
  78. 【請求項７８】 サイクリンＩ、ＥＲＨ、ｈｓＲｅｑ*−１およびｈｓＲｅ ｑ*−２からなる群より選択されるタンパク質の精製されたフラグメントであっ て、ここで該フラグメントは、ＣＤＫ２タンパク質を結合する能力を有する、フ
    ラグメント。
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