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062 δ8 A 6 Β 6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五、發明説明（1) 發明範圍 本發哇是有關呈生物活性型式之神經營養性蛋白質人 類NGF/BDNF族中重组體成員之製法。此外，本發 明掲示此族蛋白質中先前未報告成員之鑑定法，及這些蛋 白質接缠之産製。 發明背景 神經營養性因子為自然的蛋白質，見於神經糸統或由 神經糸統剌激活動之非神經組織中，其功能是促進神經及 /或神經膠質細胞之存活及表現型分化之保持（Varon and Bunge 1978 Am· Rev· Neuroscience 1 · 327 i Thoenen and Edgar 1985 Science 229:228)。由於此生理角色， 神經營養性因子可用以治療發生於各種神經退化性疾病， 如阿耳玆海黙爾病或巴金森氏病中，或外傷性傷害，如中 風或脊髓之物理性創傷後之神經細胞退化及分化功能之喪 失（Appel 1981 Ann. Neurol ogy 1 0:4 9 9)。 為了使特別的神經營養性因子可有效地用於治療神經 傷害，受傷之神經細胞種類必須對此因子有所反應。不同 的神經營養因子可具特性地影響明顯不同類之神經細胞。 因此，最好可研究治療每一類受傷害神經元的各種不同的 神經營養性因子，而此受傷害的神經元係可於不同的疾病 或傷害型式中發生的。 一個給是的神經營養性因子，除了要具有正確的神經 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂· •線· 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -3 - ^06258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（2) 單位特異性，也必須有足量的應用而可做藥學治療。同時 由於神經營養性因子是蛋白質，因此其只有以蛋白質之人 類型式才$投予至人類患者，以避免對外來蛋白質之免疫 反應。 由於神經營養性因子以幾乎為零之少量典型地存在於 組織中（如 Hof er and Borde 1988 Nature 331 ： 261 ； Li_ n et al·，1989 Science 246： 1023),且由於人類組織並 非可容易地萃取，因此直接自人類組織中製備等用量之人 類營養性因子將是不方便的。另外，希望可分離出指導合 成神經營養性因子之人類基因，且使用該基因為發展重組 體表現糸統之基礎，以産生可能無限量之人類蛋白質。 \i已描述二種神經營養性因子，其在胺基酸序列上極相 關，但其影饗不同的反應性神經單位相，雖然可能有部份 重昼（Leibrock et al. 1989 Nature 341:149)。此二種 神經營養性因子為：（1)神經生長因子（NGF)及（ 2)由腦衍生之神經營養性因子（BDNF) 。NGF及 BDNF以較大的前軀體型式顯而易見地合成，其再經蛋 白水解解離處理修飾以産生成熟的神經營養性因子（Edward s e t a 1 ， 1986 Nature 319:784 ; Leibrock et a 1 . 19 89 ibid.)。迄今所報告的神經營養性蛋白質所報告之N G F/BDNF族中僅有的基因成員為NG F之人類及各 種動物基因（Scott et al . 1983 Nature 302 ： 538 ； U1 lr-ich et a 1 . 1983 Nature 303:821; Meier et a 1 . 1986 EMBO J. 5:1489)及 B D N F 之豬基因（Leibrock et al . (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -4 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（3) (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 1989 ibid.)。在成熟的NGFs及成熟的BDNF間胺 基酸序列中有顯箸的相似性，包括所有六値半胱胺酸胺基 酸殘基之相對位置，其在所有受檢種類的成熟NGFs及 BDNF 中均相同（Leibrock et al 1989 ibid.)。見圖 7,NGF及BDNF人類型式相似性之比較及重點。由 此暗示，此二蛋白質以雙硫鍵位置決定之三级結構是相似 的。此二成熟的蛋白質也具有共同的鹼性等電點（P I) Ο 訂. .線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 NG F對位於基底前腦之膽鹼能神經元而言至少是一 種神經營養性因子（Heft i and Wi 1 1 1987 J. Neural Tr-ansm. CSuppH (AUSTRIA) 24:309).在阿耳 H 海黙爾氏 疾病過程中，對NGF具反應性之基底前腦膽鹼能神經元 ，其官能性去活化作用及退化作用，被認為是與此疾病有 關之認知及記億缺失之近因（Hefti and Will 1987 ibid. )。已知於和阿耳玆海黙爾氏疾病相關之動物模式中，N GF可避免基底前腦膽鹺能神經元之退化及恢復功能，且 基基此已提出一種治療法，用以避免阿耳茲海黙爾氏疾病 中這些神經元之退化及恢復功能（Williams et al. 1986 Proc· Natl· Acad· Sc i . USA 83:9231; Hefti 1986 J · Neuroscience 6=2155; Kromer 1987 Science 235:214; Fischer et al. 1987 Nature 329:65)〇 BDNF是週邊神經糸統中，感覓神經元之神經營養 性因子（Barde 1989 Neuron 2 : 1525 ) ^在此基礎上，已證 知BDNF可用於治療發生於各種週種神經病變中，和感 甲 4 (210X297公釐）80. 5_ 20,000張（H) -5 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4) 覺神經細胞傷害有開的感覺喪失（Schaumberg et al.，19 83 '、Disorders of Peripheral Nerves 〃 F. A · Davis Co*， Philadelphia， PA·)〇 可産製藥學發展所需之大量的具完全生物活性及結構 上未修飾之天然NGF的重組體表現条统是具高度企求的 。見歐洲專利案EP 891 13709,其中描述於昆 蟲細胞中NGF之重组體表現。當人類或動物NGF基因 於真核細胞表現条中表現時，可産製成熟且具生物活性的 N G F (如Edwards et al. 1988 Molec. Cell. Biol. 8 :2456)。於此種条統中，先合成全長的NGF前軀髏，再 蛋白水解地處理修飾成為成熟的NGF,其正確地以3度 空間方式折叠，且具完全的活性。然而，真核細胞表現条 每克細胞常産生相當低産率的蛋白質，且應用於産製上相 當地昂貴。 相反地，使用原核細胞如細菌之表現糸統，每克細胞 常可産得相當大量的經表現蛋白質，且應用於産製上相當 便宜。然而，可産生具完全生物活性及結構上未修飾之成 熟NGF的適當的細菌表現条统則尚未描述。一種細菌表 現条統掲示於加拿大專利案第1， 220, 736中。然 而，並未有再折叠經表現蛋白質之步驟。此種失敗大體上 可能可迫溯和細菌表現有關之問題，以及與用於細薗中以 産製N G F之特殊技術相關之問題。 細菌無法正確地處理修飾前軀體蛋白質，如NGF之 削軀體蛋白質，僳利用適當的蛋白水解以産生正確且較小 (精先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .裝· tr· •線· 甲 4 (210X297公釐）肌 5. 20,000張（H) -6 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5) 的成熟蛋白質。 因此，欲於細菌中産裂成熟的NGF,則必須只表現 编碼成熟i白質之NGF DNA序列部份，而非較大的 前軀體型式。當此於大腸捍菌中進行時，可産生相當大量 的成熟人類NGF蛋白質（見如Iwai et al. 1986 Chem • Pharm· Bull. 34:4724; D i co u e t a 1 . 1989 J Neur〇-ssci, Res. 22:13; EP 專利案 121, 338)。不幸 地，由細薗表現的蛋白質具極少或甚無生物活性。 折叠由細菌所表現N G F之策略，已述於歐洲專利案 第336,324號中，其可對由細菌所産製之成熟 NGF恢復某些生物活性。然而，此策略具駸重的缺失。 成熟的人類NGF通常無充份量以供藥用，因為許多 的真核細胞表現糸統十分昂貴，且常無法産生足量的成熟 NGF。目前所述的細菌性表現条，尚無法産生足量供藥 用之生物活性及化學未修飾之成熟NGF。由於人類成熟 NGF似乎可用於治療阿耳茲海黙爾氏病，此物質之無法 利用性一直為科學及臨床團體所留意。生物上活性的人類 成熟NGF之無法利用性，為由國立老年研究所組成的領 導科學家群視為進一步發展NG F為治療阿耳茲海黙爾氏 病的一値關鑑性阻礙（Phelps et a.，1989 Science 243 ' 11)0 假設相似的裂造難題可應用至神經營養性蛋白質 NGF/BDNF族各成員，此乃由於此族中目前所述之 各成員具有相同的半胱胺酸胺基酸殘基位置，且因此可形 (請先閱讀背面之注意事項再壤寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -7 - 206258 Α δ B 6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（6 ) 成和NGF相同的分子内雙硫鍵型式（Angeletti et al. 1973 Biochemistry 12:100)。 基於庇種神經營養性蛋白質之明顯價值，及目前産製 大量具生物活性蛋白質之限制，如上所述，希望可提供下 列：（1)確定、分離及鑑定神經營養性蛋白質NGF/ BDNF族之所有成員，即蛋白質以與NGF及BDNF 互相相關之方式而與之在結構上相關；（2)確定、分離 及鑑定NGF/BDNF神經營養性蛋白質族中所有自然 生成的人類成員，包括特異的人類BDNF; (3)分離 及鑑定可指導合成神經營養性蛋白質N G F/B DN F族 中所成員之基因，特別是包括指導合成所有此族成員之人 類基因；（4)利用人類基因發展可於微生物中之重組髏 表現糸統之方法，例如大腸桿菌，其可産生足量成熟型（ 經處理修飾）的這些人類蛋白質；（5)折叠神經營養性 蛋白質NGF/BDNF族成員之方法，以令其獲得生物 比活性；及（6)藥學組成物用以治療神經性疾病，包括 神經營養性蛋白質NGF/BDNF族成員中任一者或其 組合。 發明要點 本發明是有關神經營養性蛋白質NGF/BDNF 族中生物活性成員之産製方法，及指導合成人類BDNF 之基因核酸序列，所所推衍之人類BDNF胺基酸序列， 指導合成神經營養性蛋白質此族中先前未報告成員之基因 甲 4 (2U)X297公釐）80. 5. 20,000張（H) _ 〇 _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（7) 核酸序列，包括NGF—3及此蛋白質之推衍胺基酸序列 〇 示出&有效的細菌表現条，特別是指大腸捍菌中表現 神經營養性蛋白質NGF/BDNF族成員之方法。此外 描述可對由細菌所産生之成熟性但生物不活性人類神經營 養性蛋白質恢復生物活性之方法。 更特異地，描述可表現NGF及有效復性呈生物活性 型人類成熟NGF之方法。已確定神經營養性蛋白質 NGF/BDNF族先前未描述之成員，在此命名為 NGF — 3,且已確定可指導合成NGF — 3人類基因之 核酸序列及NG F _ 3之胺基酸序列。 本發明也包括神經營養性蛋白質NG F/BDN F族 中所有成員純型式之産製，其可珍貴地當做藥學製劑，以 治療發生於各種神經退化性疾病中之神經細胞退化及分化 功能之喪失。本申請案説明及申請專利範圍有關可指導合 成衍生自人類腦神經營養性因子（BDNF)之基因，包 括實質上圖1所示之核酸序列，且此序列中於196及/ 或6 6 8位置上以A取代G。也說明衍生自成熟人類頭腦 之神經營養性因子（BDNF),包括實質上如圖1所示 之胺基酸序列，且此序列中在66位胺基酸上以由硫胺酸 代纈胺酸，及/或223位胺基酸上以賴胺酸取代精胺酸 。人類成熟NGF—3包括圖7所示之胺基酸序列，且指 導合成人類成熟NGF—3之基因，包括圖6所示之胺基 酸序列。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000¾ (H) -9 - A 6 B 6 §§6258 五、發明説明（8 ) (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 一個再折叠及復性神經營養性蛋白質的方法，其中蛋 白質達到實質上完全的生物活性，其中包括造成一値反應 介質，其亩令該神經營養性蛋白質呈各種3度空間構型及 分子内雙硫鍵結型式，其中實質上所有的該蛋白質可呈其 能量上最穩定之形成，且自該反應介質中分離該神經營養 性蛋白質。 一個細菌細胞表現条统，由以産製成熟生物活性型式 之人類神經營養性蛋白質，其中包括：將指導合成該蛋白 質之基因插入載體中，表現該基因以形成該蛋白質之生物 非活性型式；及再折叠及復性該生物非活性型。 用以治療人類神經性疾病之藥學組成物，包括於一値 可接受之藥學載體中含有具生物活性之人類N G F — 3 , 人類BDNF及/或人類NGF。 要了解，前文一般說明及以下的詳細說明僅供示例及 解釋用，且不致如申請專利範圍般限制本發明。所附圖偽 納入本案中且構成本案的一部份，所說明的本發明各種具 髏實例及描述均是用來解釋本發明之原則。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 附圖簡要説明 圔1示出人類B DNF之核酸及所推衍之胺基酸序列 。所推衍的BDNF成熟（經處理修飾）型胺基酸序列以 粗體字示出。 圖2示出人類成熟（經處理修飾）NGF於大腸桿菌 於載體pT5T之表現。詳倩示於實例2内文中。 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -10 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（9) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖3示出成熟人類NGF於真核細胞中産製，分別經 變性及再折疊之生物活性的喪失及再獲得。 圖4示出細菌性表現載髏pT5T的某些特色。待色 只具代表性，未以正確比率劃出。NGF插入子用以代表 神經營養性蛋白質NG F/B DNF族中任一成員。 圖5示出細菌性表現載體ρ Τ3Χ I — 2的某些特色 。恃色只具代表性，未以正確比率劏出。NGF插入子用 以代表神經營養性蛋白質NGF/BDNF族中任一成員 〇 圖6比較NGF—3與NGF及BDNF之核酸序列 。以虛線表示之裂口處，相當於用以排列胺基酸序列之裂 口位置（見圖7)。以PCR所得的部份胺基酸序列也在 底下割線。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 圖7比較NGF—3與NGF及BDNF之胺基酸序 列。所推衍的成熟蛋白質序列以粗字體表示。底下割線的 BDNF或NG F成熟序列中每一胺基酸和NG F — 3中 之相當胺基酸相同。NGF — 3成熟序列中底下劃線的每 一胺基酸，和NGF及BDNF中相當的胺基酸相同。以 虛線表示之裂口安置於序列中以增加排列。見於BDNF ,NGF及NGF—3中的六個半胱胺酸在三個蛋白質中 位於相同位置上，且框出。 圖8示出生物檢定法，係利用C Ο S — 7細胞萃取物 之E10雞脊神經後根神經結神經單位，細胞以有及無人 類BDNF插入子之質髏P SG5轉感之。 甲 4 (210X297公釐）肌 5. 20,000¾ (H) -11 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（l〇 圖9示出由昆蟲細胞中所産製之人類重組體NGF之 劑量一反應曲線，僳利用於E 1 1雞胚交感神經之神經結 神經單位行生物撿定。 圖10示出由大腸桿菌所産生之人類重組體NGF, 最後再折疊混合物連缠稀釋液之生物活性，僳利用於 E 1 1雞胚交變神經之神經結神經單位行生物檢定。 圖1 1示出逆相高性能液相層析分析，傺（A)於圖 10中分析的50徹升终再折昼混合物，其中加入 10 ◦毫微克天然的由昆蟲細胞産製之NGF,及（B) 50撤升之终再折叠混合物，此中不加天然的，由昆蟲細 胞産製之NGF。由昆蟲細胞産生之天然NGF於此管柱 中正常脈動之位置已由經標記NGF以箭號示出。 圔1 2示出终再折昼混合物，於C4管柱逆相 HPLC中層析進一步純化前之蛋白質溶離槪圔（於2 1 4毫微米下之光密度）。經適當再折叠之NGF為最大的 蛋白質蜂，於約37%乙腈下溶離。 圖1 3示出終再折疊混合物經透析及濃縮後但於S-S-，於C4管柱行逆相HPLC層析時之蛋白質 溶離概圖（於2 14毫微米下之光密度）。經適當再折壘 之NGF為最大的蛋白質峰，於約37%乙睛下溶離。 圖1 4示出終再折昼混合物經S-Sepharose純化後， 於C4管柱逆相HPLC層析時蛋白質之溶離概圖（於 2 14毫微米下之光密度）。經適當再折β之NGF為最 大的蛋白質峰，於約37%乙睛下溶離。於主峰後緊接著 (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80· 5. 20,000張（Η) -12 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 五 '發明説明（ID 溶離之小蛋白質峰，為經適當再折叠NGF之單體型式， 其傺於逆相Η P L C層析中所形成的。 龄住县鵲奮例說明 對於本發明目前之較佳具髏實例將詳細說明供參考， 其加上以下實例，用以解釋本發明之原理。 本發明描述神經營養性蛋白質'\族"之鑑定及産製各 方面。NGF及BDNF被認為可界定一族結構相關之神 經營養性蛋白質，其在有機體中之生理角色似乎有異，每 —成員影響不同的反應性神經元組。極希望可分離此 NGF/BDNF族中任一及所有額外成員之基因，以使 得有一套神經營養性蛋白質可應用於治療不同的神經細胞 型式，而其功能於各種神經条統傷害型式中被危及。 希望可利用人類蛋白質治療人類。依據此原則，希望 可獲得BDNF之人類基因以製造人類蛋白質。同時依據 本原則及上示之原則，希望有一套具不同神經單位待異性 之神經營養性蛋白質，以治療各種神經狀況，也希望可獲 得神經營養性蛋白質NG F/B DNF族中任一及所有額 外成員之人類基因。 無法獲得具生物活性之細菌表現之NGF,—直是此 領域的一個主要障礙。缺乏生物活性的可能理由是成熟的 NGF蛋白質，無法自我的呈現正確的3度空間結構及形 成正確的分子内雙硫鍵，二者均為生物活性所必要的。因 此，似乎必須發展出一個再折叠策略，使得於細菌中産生 (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) _ 13 _ 206258 五、發明説明（12 的成熟NG F可恢復完金生物活性所需之3度空間結構及 分子内雙硫鍵結型式。 再折在NGF之策略述於歐洲專利案第 336, 324號，但其不足以解決此問題。策略中使用 曝於高pH下（建議用pH 13) — 一顯然是打破雙硫鍵 ，其於細菌所産製之NGF中被不正確地形成一一接著降 低p Η值--顯然地是使得分子内雙硫鐽有機會正確地形 成。此策略中所使用的曝於高pH下，已知可造成蛋白質 極度的改變，包括穀胺酸及天冬醯胺（其在成熟人類 NGF中有7個）中胺側鐽之消去，及天冬醯胺一甘胺酸 ,天冬醯胺一絲胺酸及天冬醛胺一蘇胺酸相連配對之極度 化學轉變（在成熟人類NGF中有2對）。除了這些化學 改變之外，再折疊步驟似乎只可恢復NGF生物活性的約 1/1 ◦。因此，述於歐洲專利案336, 324號中之 策略，似乎不足以産生具完全生物活性及化學上未改變之 成熟人類NGF。雖然再折叠及復位蛋白質的許多策略， 其中並不渉及駸厲的狀況，但尚未有成功應用至NGF之 此種步驟。針對再折叠步驟之一般總覽，見H. Kohno， Methocds Enzvmol . . Vo 1. 185, pp·187(1990 ) 〇 基於這些考慮，可於細菌中以可大量産生具完全生物 活性及化學上未改變之人類成熟NGF之製造糸統，而用 於産製相似的，大量的呈生物活性且未改變之 NGF/BDNF族中任一成員，而適於供藥用。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. -訂· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -14 A 6 B 6 206258 五、發明説明（13 1 .人類BDNF之分離 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於本發明的一値具體實例中，提出方法以獲得可指導 合成BDkF前軀體及成熟型之人類基因。本發明包括成 熟及前軀髏型式之人類BDNF,及指導合成此蛋白質之 基因。經由本案，成熟型的神經營養性蛋白質，係指此蛋 白質之生物活性型式，如其經蛋白水解後於自然界存在一 般。神經營養性蛋白質，係指由人類基因所编碼之蛋白質 於蛋白水解前之型式。於此具體實例一個較佳的解釋中， 及如下實例1所述的，長約15 — 3 0個驗基之合成的寡 核苷酸：BDNF— 1, BDNF — 2, BDNF-2A ,BDNF—2B, BDNF—4及BDNF—5,係依 據编碼豬^DNF之核酸序列中各値區域所製備的。這些 豬B D N F寡核苷酸以各種組合當引子應用於聚合酶鍵反 應（PCR),以人類基因體DNA為模板以擴大指導合 成BDNF之人類基因的不表現Η段。經擴大的片段再繼 代選殖，且筛選可與額外的寡核苷酸探針雜交之繼代純条 ，而這些探針代表位於P C R中二個引子間之序列。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 以此篩選方式分離出的陽性繼代純糸，可再定序以證 明其確實為BDNF基因之一部份。可使用一個以上的這 些經擴大片段，篩選人類基因體DNA庫，以獲得指導合 成BDNF之人類基因。可定序人類基因體純糸之經繼代 選殖之限制Μ段，以提出核酸及推衍出指導合成前軀體及 成熟型人類BDNF之胺基酸序列。依據這些步驟所得的 人類BDNF之核酸及所推衍的胺基酸序列，均包括在本 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -15 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 五、發明説明（14 發明範圍内，且示於圖1中。 2 ·神猙^泰件蛋白質NG F/B DNF族中先前夫描沭 成員之鑑定 於本發明一値具體實例中，提出一値方法以獲得可指 導合成先前未被報告之神經營養性蛋白質中 NG F/BDNF族新成員前軀髏及成熟型之人類基因。 欲求的人類DNA序列為任何且所有先前未被報告之序列 ，其所指導合成的蛋白質和人類NGF或BDNF不相同 ，但在此族可能的定義特異方面和NGF或BDNF明顯 地有關。此種特性包括下列一種以上：於適當生物檢定中 之神經營養活性；胺基酸序列之顯著同質性，包括胺基酸 本質及保留性置換；半胱胺酸殘基於胺基酸序列中之保留 性位置；供蛋白質分泌之疏水性訊號序列；供蛋白質水解 處理修飾用以成為成熟型式之訊號序列；及/或經處理修 飾蛋白質之鹼性等電點。 A.於本具體實例的一個較佳說明中，可依據编碼動 物及人類NGF s/BDNF s之核酸序列中固有的及可 變區域，製備長約15-4◦値鹼基之許多合成的寡核苷 酸。這些NGF/BDNF寡核苷酸可以各種組合當做 PCR中之引子，而依各種神經条不同區域製成之人類基 因體DNA或人類cDNA庫可當模板，以擴大可指導合 成NGF/BDNF族中成員之人類基因的不表現片段。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80· 5. 20,000張（H) -16 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明（15 利用神經条不同區域之cDNA有好處，因為（1) 不含大量NGF及BDNF傳訊RNA之區域，可減少由 NGF及bDNF本身行PCR時所擴大的Μ段背景；及 (2)可影堪欲求的神經單位族群之神經營養性因子，似 乎位於神經条之可預測區域中。 經擴大的Μ段可被繼代選殖且個別的繼代純糸可選出 再定序，採（a)與簡併性寡核旮酸行陽性雜交，此寡核 苷酸代表位於二個寡核苷酸引子間之D N A序列，或（b )利用限制酶輿圖偵測含插入子之繼代純条，插入子之大 小和自N G F或B D N F中擴大者所預測的相同。 經選出的此繼代純糸可再做定序，以決定其是否代表 可指導合成NGF, BDNF或NGF/BDNF族新成 員之基因部份。若所繼代選殖之經擴大片段似乎可代表N GF/BDNF族之新成員，則此片段可被放射標記並用 來篩選人類基因體DNA庫，以獲得指導合成假想的新穎 的神經營養性蛋白質之人類基因。人類基因可定序，以提 出核酸及所推衍的胺基酸序列，以指導合成新神經營養性 蛋白質之前軀體及成熟型式。 B.於此具體實例第二値較佳說法中，以上述PC R 擴大Η段之繼代純糸，以許多非一簡併性DNAH段中每 一個來篩選，而此DNAH段與NGF或BDNF基因具 有特異性。此篩選的目的有助於分離擴大自 NGF/BDNF族新成員基因之片段，而減少擴大自 NGF及BDNF已經鑑定成員之片段。以此方式鑑定的 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -17 - Αβ Β 6 206258 五、發明説明（10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經擴大片段與NGF和BDNF不同，可採定序方式證實 其本質，且適當時可用來獲得基因，如上所述。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 C.於此具體實例的第三値較佳說法中。可篩選製備 自神經糸統各種不同區域之人類基因庫及人類c DNA庫 ，以定位出可能含有NGF/BDNF族新成員之純糸。 此種基因庫之篩選可利用编碼NG F或B D N F之部份人 類DNA序列，或是採用許多合成寡核苷酸中之一，後者 長約15 — 4 ◦鹼基，係依據编碼動物及人類NGFs及 BDNF s核酸序列的各種固定及可變區而製備的。於這 些基因庫筛選過程中，減低雜交之迫切性，可令探針不僅 與含NGF及BDNF序列之純糸雜交，也會與含有相似 且可能相關之序列的純糸雜交。自不含大量NGF及 BDNF傳訊RNA之神經条統中篩選c DNA庫是明智 的，以減少NGF及BDNF純糸之背景。於這些篩選中 鑑定的純条可再定序，以決定其是否代表 NGF/BDNF族新成員之基因，或其可再進一步被篩 選，如前段中所述，以減少其可能代表NGF及BDNF 已知成員基因之可能性。 本具體實例三個較佳說法中的每一種，均可用來提出 编碼神經營養性蛋白質NGF/BDNF族中新的人類成 員之前軀體及成熟型之核酸及所推衍的胺基酸序列。本發 明包括神經營養性蛋白質NGF/BDNF族中任一及所 有先前未曾報告之成員。

利用示於上之方法己鑑定出神經營養性蛋白質NG F 甲 4 (210X297公釐）80· 5. 20,000張（H) -18 ~ A 6 B 6 206258 五、發明説明（ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) /BDNF族中一個新的成員。如下文實例4所述及圖6 所見，已鑑定出编碼先前未曾報告蛋白質一NGF—3之 完金的核ή序列。基於圖6所示之核酸序列，已獲得成熟 及前軀體NGF—3完全的經推衍胺基酸序列。參考所定 序之N G F 0 3基因之N G F — 3胺基酸序列示於圖7。 此外，本發明包括任何來源的神經營養性蛋白質，其 與此處所述的神經營養性蛋白質具生物相等性。於一個較 佳具體實例中，本發明包括成熟的人類神經營養性蛋白質 。經由本案，對神經營養性蛋白質的任何參考應加以解釋 ,以使此處所鑑定及説明之蛋白質被稱為神經營養性蛋白 質NGF/BDNF族之成員。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 於本案前後文及申請專利範圍中所使用的''生物上相 當的〃表示本發明的組成物可促進神經或神經膠質細胞存 活及保持表現型分化作用，但未必與此處所述之天然神經 營養性蛋白質具相同的程度。在本案中及申請專利範圍中 所使用的> 質實上同質的〃意指與天然神經營養性蛋白質 之同質程度，與任何先前所報告的神經營養性蛋白質所呈 現的還多。最好，同質程度在70%以上，更好是80% 以上，且甚至在90%, 95%或99%以上。一個特別 較佳的神經營養性蛋白質為與天然蛋白質達9 5%以上同 質性者。此處所述之同質性百分率係如下法由見於二序列 較小者中胺基酸殘基之百分率而估得，此二序列與比較序 列中相同的胺基酸殘基排列，而此比較中可引入四値長1 0 0個胺基酸之裂口以助於排列，如Davhoff所沭於Atla- 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -19 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（1玆 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) s of Protein Sequence and Structure Vo 1 . 5, p.124( 1972).National Biochemical Research Foundation, W-ashington. D.C.,特別為本案參考用。包括在實質上同 質性者有利用與所述蛋白質之抗體行交互反應性而分離之 神經營養性蛋白質，或是其基因可經由與此處所述蛋白之 基因或片段行雜交而分離者。 3 .某因表現 於本發明一個具體實例中，可使用神經營養性蛋白質 NGF/BDNF族中每一成員中之人類基因，包括 NGF, BDNF及NGF-3之人類基因，以發展重組 體表現糸用以製造由每一基因所编碼之成熟人類神經營養 性蛋白質。於此具體實例一個較佳説法中，表現可發生於 微生物，特別是大腸桿菌。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 每一神經營養性蛋白質之基因可做修飾，以助於在大 腸桿菌中之有效表現。此種修飾詳述如下，可包括下列但 亦不限於此二（i )製備D N A序列，其只编碼成熟型（ 經處理修飾）的蛋白質，俗除去可存在於基因中之附加的 编碼及未编碼序列；（ii)將人類密碼子變化成較喜用 於大腸桿菌中者；（i i i)增加轉錄作用偶合子以促進 於大腸桿菌中之有效轉譯作用；（iv)嵌入新的限制位 置以使接續之連接及選殖更方便進行；及（v)將DNA 嵌入一個以上的表現載體中，以促進DNA於大腸桿_中 有效表現。最終之表現構體可轉形至適當的大腸桿菌株内 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -20 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（10 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,並選出可産生成熟神經營養性蛋白質之轉形細胞，以做 大規模的産製。依據本發明一個較佳的具體實例，NGF 於大腸桿Λ中之表現述於下文實例2。 A .滴則 可使用一段自然的或合成的DNA序列以直接産製此 神經營養性蛋白質。於本發明一個具體實例中，可産生另 一型式之神經營養性因子，其中活性位置以相當於此處所 述之神經營養性蛋白質般地作用。一般之表現方法包括： 1. 製備一段DNA序列，其可指令宿主細胞産生具 神經營養活性之蛋白質或其前軀體； 2. 將DNA序列選殖至載體中，其使可被轉移至宿 主細胞中且於其中複製，此種載體含有表現DNA序列或 其前軀髏所需之操作要件； 3. 將含有合成DNA序列及操作要件之載髏轉移至 宿主細胞中，使其可表現编碼神經營養性蛋白質或其前軀 體之D N A ; 經濟部中央標準局貝Η消费合作社印製 4. 在條件下培養宿主細胞，使載體擴大及蛋白質或 其前軀體表現； 5. 回收蛋白質或其前軀體； 6. 令蛋白質呈活性的三级結構，如此令其具有或可 被處理修飾成具生物活性之蛋白質。 B . D N A席列 甲 4 (210X297公釐）80. 5· 20,000張（H) 206258 a 6 ___B_6_ 五、發明説明（2d (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可使用於此方法之DNA序列，有部份於實例1, 2 及4中討論。圖6示出指導合成人類NGF， BDNF及 NGF - 3的完全核酸序列。這些序列包括合成的及天然 的DNA序列及其組合。天然序列進一步包括cDNA或 基因體D N A片段。 合成可编碼和由c DNA或基因髏聚核苷酸序列所编 碼相同蛋白質之方法是精於此技藝人士熟知的，特別是基 於此處之教示。關於聚核《酸合成技藝中目前所陳述的一 値實例，有 Matteucci，M.D.，and Caruthers，M.H.，於 J. Am · Chem· Soc. 103*3185(1981)and Bea ucage, S. L • and Caruthers， M.H.於Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981)，及由A B I寡核苷酸合成儀提供之指示，每一者 均列為本案參考。 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 這些合成序列可與下文中詳述之天然序列相同，或者 其可含有不同的核苷酸。於一値具體實例中，若合成序列 中含有異於本發明自然DNA序列之核苷酸，則仍希望這 些不同的序列所编碼之多肽具有與此處所述神經營養性蛋 白質相同的一级結構。於另一具體實例中，含有不同核苷 酸之合成序列可编碼與此處所述神經營養性蛋白質具相同 生物活性之多肽。 此外，DNA序列可為自然序列的一個Η段，即聚核 苷酸片段，其自然發生，並為本發明者第一次分離及純化 。於一値具體實例中，DNA序列為分離自cDNA庫的 一個限制Η段。 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -22 - A 6 B 6 ^06258 五、發明説明（21) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於另一具體實例中，DNA序列僳分離自人類基因庫 。可應用於此具體實例的此種基因庫實例，由Wyman, ^ al , (1985) Proc. Nat. Acad. Sc i . USA, 82, 2880-28 84〇 指導合成欲求的神經營養性蛋白質之DNA序列，可 以許多不同方法獲得。人類cDNA庫及人類基因體庫， 可以至少一個探針探測，此探針可結合至神經營養性蛋白 質基因或其基因産物。指導合成蛋白質之基因，經其結合 至探針之能力予以鑑定後，則此基因可分離，再鏈結至保 持及表現基因於宿主細胞中所必須之操作要件上。 鑑定及分離基因序列的另一方法是利用聚合酶鍵反應 。如實例1所述，製備許多合成的寡核苷酸以鑑定及分離 指導合成人類BDNF之自然DNA序列，這些寡核苷酸 基於豬B D N F核酸序列而設計，並利用這些引子對於聚 合酶鏈反應中，以鑑定人類BDNF序列之經擴大片段。 以PCR獲得之經擴大片段，再用來選殖人類BDNF之 完全的核酸序列。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 如實例4中所述，製備合成的寡核苷酸以鑑定及分離 指導合成人類NGF—3之天然DNA序列，這些寡核苷 酸是依據人類及動物之NG F及B DNF核酸序列而設計 ,並於聚合酶鐽反應中利用這些引子以鑑定先前未報告之 人類NGF—3序列之經擴大片段。以PCR獲得之經擴 大片段再用來選殖人類NG F — 3完全的核酸序列。 依據這些方法自人類基因體DNA庫中所分離，且编 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -23 - A 6 B 6 206258 五 '發明説明（22 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 碼此處所述至少一部份的人類BDNF蛋白質之一段 DNA序列已嵌入質體PSYN23中。此質體依據布逹 佩斯公約，於1991年3月20日以40992编號貯 置於美國標準菌種收集所，Rockville，MD。此序列示於 下圔1中，除了相當於第223號胺基酸位置之密碼子以 A A A 代 A G A 〇 依據這些方法自人類基因體DNA庫中所分離，且编 碼此處所述至少一部份NG F — 3蛋白質的一段DNA序 列，已嵌入質體PSYN3 ◦中。此質體依據布達佩斯公 約，於1991年3月20日以40991编碼貯置於美 國標準菌種收集所，Rockville. M.D·。此DNA序列進 一步述於下實例4中。 C .載體 (i )撤生物.f其是大賭捍觭 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 可用於本發明中之載體包括任何載體，其中可嵌入上 述的DNA序列，加上任何較佳或所需之操作要件，且此 載體可再轉移至宿主細胞中並於此細胞中複製。特別地， 最好所有的這些載體具某些或所有以下特性：（1)具少 量的宿主一有機體序列；（2)可於欲求宿主中穩定地保 持及增殖；（3)可以高套數存在於欲求宿主中；（4) 具有可調控之啓動基因，其位置可促進重點基因之轉錄作 用；（5)至少一個指導合成可篩選特性之標記DNA序 列，存在於質體上而與可嵌入之DNA序列分開；及（6 甲 4 (210X297公釐〉80. 5. 20,000張（H) -24 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（23 )一段可終結轉錄作用之DNA序列。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的選殖載體含有各種操作要件。這些*操作要 件"包括下列：調控子，啓動基因，轉錄作用終結子，非 轉譯序列，核糖髏結合位置，領導序列及轉錄作用偶合子 ，轉錄終結子，可篩選標誌。實際上，可以令載體被容易 地分離，組合及互換之方式構築之。 此處所述之操作要件，可為一般精於此技藝人士，基 於先前文獻及此處之教示例常地選擇。這些操作要件之一 般實例不於B. Lewin. Genes . Wiley & Sons, New York (1983),其特別被列為本案參考。適當操作要件的各種實 例，可見於上述之載體中，且可基於前述載髏討論基本特 性之公告總覽加以評估。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 上述載體所有必要及欲求組份一旦合成及分離後，載 體可以一般精於此技藝人士所已知之方法組合之。咸信， 此種載體之組合為精於此技藝人士之責任及職務之内，且 如此可操作而不至有不當之實驗。例如，相似的DNA序 列已連接至適當的選殖載體，如Maniatis e t a 1方全Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratories(1984 )中所述，其特別列為本案參考。 於下文實例2中，說明製備二種載體，其含有可指導 合成成熟人類NGF之核酸序列。嵌有適當核酸序列之載 體為大腸桿菌表現載體，稱之為P T 5 T及 PT3XI— 2。載體pT5T : NGF之詳情示於圖4 ,且載體PT3XI—2:NGF之詳情示於圖5。 甲 4 (210X297公釐〉S0. 5. 20,000張（H) -25 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（24 於構築本發明的選殖載體時，要額外注意到dna序 列之多重套數及其伴隨的操作要件，可嵌入每一載髏中。 於此一具i實例中，宿主有機體於每一載體中可産生大量 的欲求的神經營養性蛋白質。可嵌入載體中之DNA多重 套數數目，只受限於所生成載體之能力，由於其大小可決 定是否可轉移、複製及轉錄於適當宿主細胞中。 (i i )其他榭生物 可於非大腸桿菌微生物中應用之載體，也包括在本發 明中。此種載體述於表1。此外，此處所述的這些撒生物 ,基於先前文獻及此處之教示，可為一般精於此技藝人士 例常地應用。咸信，此種載體之組合是在精於此技藝人士 之責任及職務之内，且如此可操作而不至有不當之實驗。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *装， 訂. .線. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 甲 4 (210X297公釐）肌 5. 20,000張（H) -26 - 206258 A 6B 6 五、發明説明（25 娜用的 表 1 贿 艇作用

RS E. coli Lac1 # Tac2 IPTG rrnB* tjnpA* blttM pL increased rrnC7 lambda int! 酿 trp,0 ph〇S 1 加IAA depletion (χορΑ1

%lpha Ε. coil ^mm,K V43,9 spuc-I2e IPTG B. rm BT.T.20 a-mm22 B.subt. 祜？ neutral Kanr 21 B· protease77 B.iuny蛋白薛 y中性蛋白海 (W 2fl B.amy a* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝.

β調0¾ Trp”(E. coli)加IM Lac(c.a)Ii) SSJSfeS^I depletion Tac(c.coli) IPTG _IS|C28 外隸

Trp(c.coli) 訂· 隣 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Gal V Cycl mm·^ ! Ura 3·77 10.” depletion Uia Leu 2 ·' and tese·^ Aiib Γ1 ,T*gl lactose a®? a®? II.” Giuco&c Sac 2 Tap 1 Pho 5 depletion phosphate depict ion His 3 .線* 甲 4 (210X297公釐）肌 5. 20,000張（H) 一 27 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（20 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1· Backman，K· » Ptashne, Μ - and Gilbert，W. Proc. Natl . Acad. Sc i . USA 73_, 4174 — 4178(1976). 2. d e Boer. H.A.. Comstock , L.J·， and Vasser, M .

Proc. Natl. Acad. Sci. USA M， 21-25(1983). 3. Shimatake，H. and Rosenberg. M. Nature 292, 128-132 (1981). 4. Derom，C. , Gheysen. D. and Fiers，W. Gene 17， 45-54 (1982). 5. Hallewell, R.A· and Emtage. S- Gene 9_, 27~47 (1980). 6. Brosius， J.，Du 1 1，T.J.，S1eeter, D.D. and Noller, H.F. J· Mol. Biol· 148 107-127(1981)· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 7. Normanly， J. , Ogden , R.C· , Horvath » S·J. and Abelson» J· Nature 321，2 13-219 ( 1 986 ). 8. Be 1asco, J.G.，Nilsson, G. , von Gabain，A. and Cohen, S-N- Cell 46., 245-251 ( 1986). 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) - 28 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（ 9. Schmei ssner. U.，McKenney, K. , Rosenberg M. and Court, D- J. Mol. Biol. 176， 39-53 (1984). 10. Mott, J-E·. Galloway. J.L. and Platt, T· EMBO J. 4, 1887-1891 (1985). 11. Ko s h1 and , D· and Botstein, D. Cell 20. 749-760 (190)- 12. Movva. N·R. . Kakamura · K · and Inouye， M · J · Mol . Biol . 143, 317-328 ( 1980). 13. Surin， B.P.， Jans， D.A.， Fimmel， A.L.» Shaw， D·C· . Cox , G.B. and Rosenberg . H. J . Bacteriol. 157, 772-778 (1984). 14. Sutcliffe, J·G· P r o c· Natl. Acad. Sc i · USA 75, 3737-3741 (1978). 15 . Peden , K . W . C - Gene 22., 277-280 (1983) · 16. Alton，N·K. and Va p ne k » D. Nature 282， 864-869 (1979). (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. -訂· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -29 A 6 B 6 206258 五、發明説明（23 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 17· Yang，M.，Galizzi, A*, and Henner， D· Nuc -Acids Res. 11(2)， 237-248 (1983). 18. Wong, S·-L·，Price C·W.，Go 1dfarb，D·S·，and Doi，R·H. Proc . Natl. Acad · Sc i . USA 81， 1184-1188 (1984) · 19. Wang * Ρ·-Ζ. and Do i * R.H- J· Biol· Chem· 251， 8619-8625, (1984) · 20· Lin. C.-K-. Quinn, L.A·. Rodriguez. R.L. J· Cell B i ochem. Supp I . ( 9B ) . p. 198 ( 1985 ). 21· Vasantha» Ν.» Thompson» L.D-, Rhodes. C.* Banner, C·，Nagle， J-，and Filpula， D· J *

Bact . 159(3), 811-819 (1984). 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 22- Plava, I·， Sarvas， M·， Lehtovaara， P·，

Sibazkov， M·， and Kaariainen， L· Proc· Natl. Acad· Sci· USA 79, 5582—5586 (1982)· -30 - 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五'發明説明（2分 23. Wong . S. -L . » Pricee，C-W·· Goldfarb» D-S·* and Doi，R-H- Proc，Natl. Acad · Sc i . USA 81 , 1184-1188 ( 1984) · 24. Sullivan， Μ·Α·, Yasbin， R.E·， Young， F«E. Gene 29, 21-46 ( 1984). 25. Vasantha，N·，Thompson , L*D.， Rhodes， C.， Banner， C· Nagle， J·，and Filula， D · J - Bact· 159(3)，811-819 ( 1984)· 26· Yansura， D.G· and Henner， D. J. PNAS 81， 439-443 (1984). 27. Gray， G-L- » McKeown， K.A.， Jones， A -J·S - * Seeburg » P·H * and Heyneker， H.L· Biotechnology，161-165 ( 1984) · 28· Lory， S.， and Tai， P·C. Gene 22， 95-101 (1983). 29. Liu，P.V - J. Infect · Dis· 130 (s u p p 1 )， 594-599 ( 1974). (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂· •線· 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,_張（H) -31 206：δ8 A 6 Β 6 五、發明説明（30 30. Wood, D.G., Hollinger， M.F.， and Tindol, M.B· J. Bact. 145, 1448-1451 (1981). 31. St . John，T.P. and Davis，R.W. J· Mo 1. Bio 1 . 152， 285-315 (1981). 32· Hopper » J.E.，and Rowe，L.B. J· Biol. Chem . 253， 7566-7569 (1978). 33. Denis， C.L.， Ferguson . J. and Young . E.T. J . Biol . Chem. 258, 1165-1171 ( 1983). 34. Lutsdorf， L. and Megne t, R. Archs· Biochem. Biophys. 126, 933-944 (1968). (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 35. Meyhack » B. , Ba j wa. N· , Rudolph, H. and Hinnen A. EMBO. J. 6, 675-680 (1982). 36 · Watson，M.E. Nucleic Acid Research 12. 5145-5164 ( 1984 ). 37. Gerband， C. and Guerineau. M. Curr. Genet. 1, 219-228 (1980). 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -32 - A 6 B 6 206^53 五、發明説明（31) 38. Hinnen，A.，Hicks, J.B· and Fink, G - R . Proc · Natl . Acad · Sci· USA 75_, 1929-1933 ( 1978)· 39* Jabbar， Μ·Α·， Sivasubramanian» N . and Nayalc， D-P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 * 2019-2023 (1985). (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .装_ •訂· -:線· 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -33 - A 6 B 6 206258_ 五、發明説明（32 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (a )假翬胞菌載體 許多食髏質體，其可自動地於大範圍革蘭氏陰性細菌 中複製者，可當做假單胞菌屬宿主中較佳之選殖載體。其 中某些述於 Tait，R.C.，Close, T.J·，Lundquist，R.C· ，Hag iya，M·，Rodriguez，R.L· , and Kado，C . I . B i-otechnology. May，1983，pp.269-275； Panopoulos » N . J·於Genetic Engineering in the Plant Sciences, P r -a e ge r Publishers，New York, New York* pp. 163-185(1 981);及Sakagucki，K·於Current Topics in Microbiol-ogy» and Immunology 96_： 31-45(1 982 ),以上每一文均持 別列為本案之參考文獻。 其中一値較佳的構體，可應用質體RSF1◦1〇及 其衍生物，如Bagdasarian， N.， Bagdasarian， M*M·， C-oleman，S·，and Timmis，K . N . Plasmids of Medical, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Environmental and Commercial Importance， Timmis， K.N. and Puhler* A. eds.* E 1 sevier/North Holland Biomedical Press ( 1979),待別為本案之參考。RSF 1〇1 0之優點為，其#一値相當小，且具高套數之質體 ，可容易地轉形至大腸桿菌及假單胞菌中共於其中穩定地 保持。於此条統中，最好使用Tac表現条，如於大腸桿 菌中所述，因為似乎大腸捍菌t r p啓動基因可被假單胞 菌RNA聚合酶所容易地確認，如Sakagucki，K.於Curr-ent Topics in Microbiology and Immunology 96:31-45 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -34 ™ A 6 B 6 206258 五、發明説明（33 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (1982)及Gray，G·L · » McKeown » K · A . . Jones A.J.S., Seeburg. P.H.，and Heyneker, H.L.於 Biotechnology,

Feb. 1984, pp.161-165中所述，以上均列為本案之參考 。轉錄作用活性可進一步地加大，即須將啓動基因與大腸 桿菌或銅綠假單胞菌t Γ P啓動基因交換。此外，大腸桿 薗之1 a c I基因也可包括在質體中以達成調控。 轉錄作用可偶合至任一假單胞菌蛋白質之轉錄起始位 置，以及任一可高度表現蛋白質之起始位置上，此型式蛋 白質之選擇可造成神經營養性蛋白質之分子内表現。 於這些例子中，當宿主假單胞菌之限制作用（一）株 未被應用時，以分離自大腸桿菌之質體構體進行轉形作用 ，其效率不佳。因此，希望可於轉形至欲求宿主前，假單 胞菌選殖載體可經另一菌屬之r— m+株傳代，如Bagda-sarian, M., e t a l 於Plasmids of Medical . Environme-nta 1 and Commercial Importance，pp * 411-422. Timmi-s and Puhler eds·， E 1 sev i er/Nor t h Hoddand Biomedi-cal Press(1979)中所述，此文也列為本案之參考。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (b )穿抱捍_載體 再者，於芽孢桿菌宿主中之較佳表現糸統，涉及使用 質體PUB 1 1 0為選殖載體。至於於其他宿主載體糸統 中，有可能於芽孢桿菌中，以分子内或分泌型蛋白質型式 表現本發明的神經營養性蛋白質。本具體實例包括二値糸 統。可於芽孢捍菌及大腸捍菌中複製之注返載體，可用來 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H〉 -35 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（34) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 構築及試驗各種基因，如Dubnau，D.，Gryczan，T.，C〇-ntente. S·.及 Sh i vakumar, A.G.於Genetic Engineering. Vo 1 · 2， Set low and Hoi lander eds., Plenum P r-ess，New York，New York，pp.115-131(1980)所述，特 別為本案之參考。欲自枯草捍菌（B. subtilis)中表現及 分泌神經營養性蛋白質，則最好將α—澱粉酶之訊號序列 偶合至蛋白質之编碼區中。欲合成分子内蛋白質，可搬蓮 之DNA序列可轉譯地偶合至α —澱粉領導序列之核糖體 結合位置上。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 這些構體之轉錄作用.最好以α-澱粉酶啓動基因或其 衍生物指令之。此衍生物含有天然α-澱粉酶啓動基因之 RNA聚合酶確認序列，但也納有1 a c操縱子區域。已 示出構築自青徽素酶基因啓動基因及1 a c操縱子之相似 雜交啓動基因，可以可調控之方式於芽孢桿菌宿主中作用 ,如Yansura，D-G. and Henner於 Genetics and B ί o t ec~ hnology of Bacilli i，Ganesan，A-T. and Hoch，J·A. * eds.，Academic Press，pp. 249-263(1984)中所述，此 文已列為本案之參考。大腸捍菌之1 a c I基因也可包括 在質體中以達成調節作用。 (c )檢蘭載體 欲於梭菌中表現之較佳的構體偽於質體p J u 1 2中 ，由 Squires，C.H. et al.，述於 J. Bacteriol. 159:465 -471 (1984)且特別列為本案參考，再以Heefner，D.L. et 甲 4 (210X297公釐）80· 5. 20,000張（H) -36 - A 6 B 6 206258

五、發明説明（3S (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) al (沭於 J . Bacter i〇l . 159 : 460-464 (1984 )特別為本案 參考）的方法轉形至産氣莢膜梭菌（C. perfringens)。轉 錄作用由四環徽素耐受基因之啓動基因所指令。轉譯作用 偶合至此相同t e t ”基因之Shine-Dalgarno序列，其方 式嚴格類似上述適用於其他宿主載體之步驟。 (d )酵昼載體 •訂· .線. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 外來DNA引入酵母之保持可以許多方式達成，如所 述 Botstein，D.及 Vavis，R.W.,於 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces » Cold Spring Harbo-r Laboratory， Strathern. Jones and Broach . eds.， pp. 607-636( 1982)，特別為本案參考。一個較佳表現糸統 可與酵母宿主有機體合用者帶有位於2微米質體之神經營 養性蛋白質基因。2微米環之優點包括當引入c i r /株 時有相當高的套數及穩定性。這些載髏最好納有來自 PBR322之複製源及至少一種抗生素耐受標誌，以令 其可於大腸桿菌中複製及選擇。此外，質體最好具有2微 米序列及酵母LEU2基因，以可於酵母之LEU2缺失 突變株中有相同的目的。 若希望重組體神經營養性蛋白質，最終可於酵母中表 現，則最好選殖載體先轉移至大腸桿菌，此中可令載體複 製，並令載體於擴大作用後獲得及純化。之後，載體再轉 移至酵母中，以令蛋白質有最終之表現。 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -37 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（3β (i i i )哺乳動物細胞 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 神經營養性蛋白質之cDNA可當做基因，以令蛋白 質可於哺乱動物細胞中表現。其應有一段序列可有效地核 糖體，_ ai Kozaks ^ Nucleic Acids Research 15:8125-81 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 32(1987),其待別列為本案參考，且應有供領導序列之编 碼能力（見第3部份（a) (v i)),以令成熟的蛋白 質以經處理修飾之型式移出細胞。帶有完金cDNA序列 之DNA限制片段，可嵌入表現載體中，其中具有一個轉 錄作用啓動基因及一個轉錄作用加強子，如Guarente，L. 於 Cel 1 52:303-305( 1988)及 Kadonaga，J.T. e t a 1 .，於 Cell 51 :1079-1090 ( 1987)所述，二者均特異地列為本案 參考。若蛋白質之原構性表現對細胞生長是有害的，則啓 基因可為調控的，如於質體PMSG中（Pharmacia Cat. No.2745060 1)。載體應有一個完金的聚腺苷化 作用訊號，如 Ausubel. F.M. e t a 1 方$ Current Protocol-s in Molecular Biology，Wiley(1987)中所述，待別列 為本案參考，如此mRNA可自此載體中以正確處理修飾 方式轉錄。最後，載體應有來自PBR322的複製源及 至少一個抗生素耐受標誌，以令可於大腸桿菌中複裂及選 擇。 為了選擇一個穩定的細胞株，其可産生神經營養性蛋 白質，表現載體可帶有可選擇標記之基因，如藥物耐受標 誌，或帶有缺失細胞株之互補基因，如二氫葉酸還原酶（ d h f r )基因可轉形於d h f r —細胞株，如Ausubel 甲 4 (210X297公釐〉80. 5. 20,000張（H) -38 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（37 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) et al.,上文中所述。此外，帶有可選擇標記之另一質體 也可與表現載髏共同轉形。 D .宿丰細朐/餺形細朐 如此獲得的載體轉移至適當的宿主細胞中。這些宿主 細胞可為撤生物，昆蟲細胞或哺乳動物細胞。於本發明一 個較佳具體實例中，所利用的宿主細胞為微生物，更特別 地是大腸桿菌細胞。 (i )微生物 咸信，具有吸收外來DNA能力，且可表現這些基因 及附隨之操作要件之微生物均可選擇。一旦選擇宿主微生 物後，載體利用一般精於此技藝人士已知之方法轉移至宿 * 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 主有機體中。此種方法之實例可見於Advanced Bacteria-1 Gene tics by R.W· Davis e t a 1 · . Cold Spring H a r b-or Press. Cold Spring Harbor. New York. (1980)其恃 別列為本案之參考。於一個具體實例中，最好轉形作用於 低溫下進行，因為溫度調控是經由上示之處理器操作要件 調控基因表現的一的方法。於另一具體實例中，若滲透調 節子已嵌入載體中，於轉形形成中調控鹽濃度將是必要的 ，以確保外來基因之適當控制。 最好，宿主有機體是可任意厭氣或需氧的。用於此方 法中之較佳特宿主包括酵母及細菌。特殊的酵母舌酵母， 尤其是釀酒酵母。特殊的細菌包括穿孢捍菌，埃希氏菌及 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -39 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（33 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 假單胞菌，尤其是祜草捍菌及大腸捍菌。此外的宿主細胞 列於上文之表I中。 (i i )哺乳動物細胞 載體可以許多技術引入培養中之哺乳動物細胞，如磷 酸鈣，DNA共沈澱作用，電泳脈動，或原生質融合。較 佳的方法為與磷酸0共沈澱作用，如Ausubel et al.，上 文中所述。 存在有許多穩定的細胞型式，其係可轉形的且可轉錄 及轉譯cDNA序列，處理修飾前軀體神經營養性蛋白質 及分泌成熟的蛋白質。然而，細胞型式基於所分泌蛋白質 之糖基化作用及胺基酸殘基之轉譯後處理修飾（若有的話 )是可變化的。因此，理想的細胞型式為可産生和自然分 子相同之重組體神經營養性蛋白質者。 E.培泰猙清傳丁稈夕細朐 經濟部中夬標準局員工消费合作社印製 宿主細胞於適合神經營養性蛋白質表現之條件下培養 。這些條件通常與宿主細胞具特異性，且可由精於此技藝 人士基於此細胞生長條件之已發表的文獻及此處所教示的 而容易地決定。例如，Berggey's Manual of Determinative Bacteriology， 8th Ed.， Williams & Wilkins Co-mpany. Baltimore. Maryland » 其特列為本案參考，含有 關於培養細菌之條件資料。培養酵母及哺乳動物細胞之相 似資料，可得自 Pollack，R· Manmalian Cell Culture. 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -40 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（30 (請先閱讀背面之注意事項再堪寫本頁)

Cold Spring Harbor Laboratories (1975)，特別為本案 之參考。依據嵌入或存在於載體中之任何操作性要件，任 何調控DNA序列表現所須之條件，均可於轉形及培養階 段下達成。於一個具體實例中，細胞於適當調控條件下生 長至密度，其可抑制DNA序列之表現。一旦達到最佳細 胞密度，改變環境條件使其適於DNA序列之表現。因此 希望神經營養性蛋白質之産製發生於宿主細胞生長至幾乎 逹最佳密度後，且於表現所須之調控條件被誘導後某時， 可回收所生成之蛋白質。 4 . R寿現重組體蛋白詈之復件 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於本發明一個較佳具體實例中，重組體成熟的神經營 養性蛋白質於回收後及呈現其活性結構前予以純化。此具 體實例為較佳，因為發明者咸信，若蛋白質先被純化，則 有助於回收高産率的再折叠蛋白質。然而，於另一較佳具 體實例中，可於純化前令神經營養性蛋白質再折叠，以圼 現其活性結構。在又一較佳具體實例中，蛋白質於其自培 養基中回收時，係呈其再折叠之活性狀況。 於某些狀況下，成熟的神經營養性蛋白質於宿主微生 物中表現時係呈其正確的活性結構，並將蛋白質經由細胞 壁或膜運送，或到達周質空間。若指導合成適當領導子序 列之DNA已與指導合成重組體蛋白質之DNA鐽結，則 此通常是可發生的。 於本發明一個具體實例中，於微生物中産生之蛋白質 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -41 ~ A 6 B 6 206258 五、發明説明（40 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可能缺乏實質的生物活性，且必須再折叠及復性，以提供 神經營養性蛋白質具NGF/BDNF族成員預期之生物 特殊活性。所預期之特殊活性可為見於在真核細胞中表現 之蛋白質活性，或與純自自然來源之蛋白質相同或相關之 活性（如老鼠的頷下腺NGF及豬腦BDNF)。 通常，於微生物中表現之蛋白質之所以不具生物活性 ，僳與分子内雙硫鍵之不正確形成有關。於此具體實例之 較佳說法中，於大腸桿菌中産生之重組體神經營養性蛋白 質可再折疊及復性，以獲得正確的分子内雙硫鍵構型及預 期的生物待殊活性。 於一値較佳的說法中，重組體蛋白質可利用下列步驟 再折叠及復性： 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (1) 先打斷於成熟神經營養性蛋白質於微生物中産 製時所發生的任何分子内或分子間雙硫鍵及/或任何非共 價交互作用。為了達成此點，蛋白質曝於充份的變性劑（ 如胍鹽酸化物或尿素）及充份的還原劑下（如>3 —镟基乙 醇，二硫異赤絲藻醇或半胱胺酸）以使蛋白質變性，瓦解 非共價交互作用，及還原雙硫鍵。 (2) —旦成熟的神經營養性蛋白質被變性及還原， 存在於經還原蛋白質上之游離硫醇，可加大量含雙硫化物 試劑而予以氣化（如穀胱甘肽或胱胺酸）。此反應可産生 中形成不正確的分子内雙硫鍵。 (3) 變性及氧化劑再稀釋至一定濃度，且加入含硫 醇之試劑（如半胱胺酸）以催化雙硫鍵之互換。此目的是 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -42 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（41) 産生一種環境，可變性劑濃度被充份減少，而令神經營養 性蛋白質可呈各種3度空間構型，且調整其中的氣化/還 原電勢以令雙硫鍵形成及打斷。這是假設，成熱神經營養 性蛋白質之正確3度空間結構及雙硫鍵結型式較其他可能 的構型在工程上更為穩定。因此可令神經營養性蛋白質呈 現各種3度空間構型及分子内雙硫鐽型式之條件，將可令 顯著比率的神經營養性蛋白質再形成正確的分子内雙硫鍵 結型式，正確的3度空間結構，且因此具生物活性。 於一個較佳具體實例中，重組體神經營養性蛋白質， 溶於濃度.1一2毫克/毫升，含尿素之缓衝溶液中。必 要時，加較高p Η值之缓衝溶液（也含尿素）使此溶液呈 鹼性，以促進雙硫鍵交換。還原劑加入之終濃度約 l_lm5M。再加入之氣化劑终濃度約15 — 50mM 。含神經營養性蛋白質溶液之稀釋度約15-20倍，且 加入含硫醇試劑，使溶液中所含的含硫醇試劑較含雙硫化 物試劑多2—3倍。 於重組體神經營養性蛋白質再折叠的一個最佳具體實 例中，將最終之再折叠混合物除去空氣，且令再折叠於厭 氣條件下發生。此外，於本發明一個最佳具髏實例中， NGF溶液於再折曼前自其他蛋白質中實質地純化。於本 内容中實質地純化表示溶液中實質上不含有可干擾NG F 再折叠速度或效力之宿主細胞蛋白質。且最後，於本發明 一個較佳具體實例中，也可將含乙二醇之試劑包括在再折 曼混合物中。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂. :線· 甲 4 (210X297公釐）80· 5. 20,000張（H) -43 - 206258__ 五、發明説明（42 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 這些步驟是缓和的，且不應造成神經營養性蛋白質之 化學變化。若在策略中採用尿素為變性劑，很重要的是除 去任何可形成的氰酸鹽，俗將尿素溶液通過一個陰離子交 換管柱，如DOWEX 1—X8 (BioRad)。若 未除去氰酸鹽，其可改變蛋白質中之胺基（stark 1967 ethods in Enzymology 11:125)。 變性劑，氧化劑，硫醇試劑之最佳濃度及選擇，及其 於最終折疊溶液中之濃度，均由追踪經正確再折叠且具有 生物活性之神經營養性蛋白質比率而實驗地決定。於最终 再折叠溶液中之目的是提供一値經控制之環境，其中可於 神經營養性蛋白質上發生雙硫互換及構型變化，直到達到 較佳之構型及雙硫鍵結型式。示於上之供最佳再折叠之條 件，經預期和神經營養性蛋白質NGF/BDNF族中所 有成員實質上是相同的，因為其在胺基酸序列上極相關， 包括成熟蛋白質中所有六個半胱胺酸殘基之相對位置，且 中形成不正確的分子内雙硫鍵。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (3)變性及氣化劑再稀釋至一定濃度，且加入含硫 醇之試劑（如半胱胺酸）以催化雙硫鍵之互換。此目的是 産生一種環境，可變性劑濃度被充份減少，而令神經營養 性蛋白質可呈各種3度空間構型，且調整其中的氧化/還 原電勢以令雙硫鍵形成及打斷。這是假設，成熟神經營養 性蛋白質之正確3度空間結構及雙硫鍵結型式較其他可能 的構型在工程上更為穩定。因此可令神經營養性蛋白質呈 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) 一 44 一 206258 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43 現各種3度空間構型及分子内雙硫鍵型式之條件，將可令 顯著比率的神經營養性蛋白質再形成正確的分子内雙硫鍵 結型式，正確的3度空間結構，且因此具生物活性。 於一個較佳具體實例中，重組體神經營養性蛋白質， 溶於濃度.1一2毫克/毫升，含尿素之缓衝溶液中。必 要時，加較高pH值之缓衝溶液（也含尿素）使此溶液呈 鹼性，以促進雙硫鍵交換。還原劑加入之終濃度約 1 一 If mM。再加入之氣化劑終濃度約1 5 — 5〇mM 。含神經營養性蛋白質溶液之稀釋度約15—20倍，且 加入含硫醇試劑，使溶液中所含的含硫醇試劑較含雙硫化 物試劑多2 — 3倍。 於重組體神經營養性蛋白質再折畳的一個最佳具體實 例中，將最終之再折叠混合物除去空氣，且令再折叠於厭 氣條件下發生。此外，於本發明一個最佳具體實例中， NGF溶液於再折昼前自其他蛋白質中實質地純化。於本 内容中實質地純化表示溶液中實質上不含有可干擾NGF 再折疊速度或效力之宿主細胞蛋白質。且最後，於本發明 一個較佳具體實例中，也可將含乙二醇之試劑包括在再折 叠混合物中。 這些步驟是缓和的，且不應造成神經營養性蛋白質之 化學變化。若在策略中採用尿素為變性劑，很重要的是除 去任何可形成的氰酸鹽，係將尿素溶液通過一個陰離子交 換管柱，如 DOWEX 1— X8 (BioRad)。若 未除去氰酸鹽，其可改變蛋白質中之胺基（Stark 1967 M- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂. :線_ 甲 4 (2U)X297公釐）肌 5. 20,000¾ (Η) -45 A 6 B 6 20625® 五、發明説明（44 e t hod s in Enzymology 11:125)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 變性劑，氧化劑，硫醇試劑之最佳濃度及選擇，及其 於最終折i溶液中之濃度，均由追踪經正確再折叠且具有 生物活性之神經營養性蛋白質比率而實驗地決定。於最終 再折疊溶液中之目的是提供一個經控制之環境，其中可於 神經營養性蛋白質上發生雙硫互換及構型變化，直到達到 較佳之構型及雙硫鍵結型式。示於上之供最佳再折昼之條 件，經預期和神經營養性蛋白質NGF/BDNF族中所 有成員實質上是相同的，因為其在胺基酸序列上極相關， 包括成熟蛋白質中所有六個半胱胺酸殘基之相對位置，且 混合的雙硫鍵，其中於成熟神經營養性蛋白質中之每一値 半胱胺酸殘基，可與氣化劑之單體型式形成一個雙硫鍵。 此步驟有助於預防神經營養性蛋白質於接下來之處理修飾 中形成不正確的分子内雙硫鍵。 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 (3)變性及氧化劑再稀釋至一定濃度，且加入含硫 醇之試劑（如半胱胺酸）以催化雙硫鍵之互換。此目的是 産生一種璟境，可變性劑濃库被充份減少，而令神經營養 性蛋白質可呈各種3度空間構型，且調整其中的氣化/還 原電勢以令雙硫鍵形成及打斷。這是假設，成熟神經營養 性蛋白質之正確3度空間結構及雙硫鍵結型式較其他可能 的構型在工程上更為穩定。因此可令神經營養性蛋白質呈 現各種3度空間構型及分子内雙硫鍵型式之條件，將可令 顯著比率的神經營養性蛋白質再形成正確的分子内雙硫鍵 結型式，正確的3度空間結構，且因此具生物活性。 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -46 - A 6 B 6 206258

五 '發明説明（4S (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於一個較佳具體實例中，重組體神經營養性蛋白質， 溶於濃度.1一2毫克/毫升，含尿素之缓衝溶液中。必 要時，加較高P Η值之缓衝溶液（也含尿素）使此溶液呈 鹼性，以促進雙硫鍵交換。還原劑加入之終濃度約 l — lm5M。再加入之氣化劑終濃度約15 - 50mM 。含神經營養性蛋白質溶液之稀釋度約1 5_2 0倍，且 加入含硫醇試劑，使溶液中所含的含硫醇試劑較含雙硫化 物試劑多2 — 3倍。 於重組體神經營養性蛋白質再折叠的一個最佳具體實 例中，將最終之再折叠混合物除去空氣，且令再折昼於厭 氣條件下發生。此外，於本發明一個最佳具體實例中， NGF溶液於再折昼前自其他蛋白質中實質地純化。於本 内容中實質地純化表示溶液中實質上不含有可干擾NG F 再折昼速度或效力之宿主細胞蛋白質。且最後，於本發明 一個較佳具體實例中，也可將含乙二醇之試劑包括在再折 叠混合物中。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 這些步驟是缓和的，且不應造成神經營養性蛋白質之 化學變化。若在策略中採用尿素為變性劑，很重要的是除 去任何可形成的氰酸鹽，偽將尿素溶液通過一個陰離子交 換管柱，如DOWEX 1—X8 (BioRad)。若 未除去氡酸鹽，其可改變蛋白質中之胺基（stark 1967 e t hod s in Enzvmology 11:125)。 變性劑，氧化劑，硫醇試劑之最佳濃度及選擇，及其 於最終折叠溶液中之濃度，均由追踪經正確再折疊且具有 甲 4 (2丨0X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -47 - A 6 Β 6 五、發明説明（4Θ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 生物活性之神經營養性蛋白質比率而實驗地決定。於最终 再折叠溶液中之目的是提供一個經控制之環境，其中可於 神經營養性蛋白質上發生雙硫互換及構型變化，直到達到 較佳之構型及雙硫鍵結型式。示於上之供最佳再折叠之條 件，經預期和神經營養性蛋白質NGF/BDNF族中所 有成員實質上是相同的，因為其在胺基酸序列上極相關， 包括成熟蛋白質中所有六個半胱胺酸殘基之相對位置，且 因此假設可呈現相同的雙硫鍵結型式。 本發明之再折叠具體實例，可令神經營養性蛋白質於 欲求之表現糸中表現，其已示出不會生成具生物活性之神 經營養性蛋白質。依、循本發明之步驟，自細菌中表現之重 組體神經營養性蛋白質可達到至少10%生物活性。於一 値佳的具體實例中，神經營養性蛋白質可達到至少30% 生物活性。於一個更佳之具體實例中，蛋白質可具有至少 5 0%的生物活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 下文中實例3說明一値實驗，其示出此再折叠策略可 成功地用於再折叠由細菌中所産製之成熟NGF,如下： (1)經正確折昼及具完全生物活性之成熟NGF,不論 是由真核細胞表現糸産製或是純化自天然來源，如上述地 變性及還原雙硫鍵，造成生物活性之喪失。由於NGF於 變性及還原具生物活性，可説明變性及再折叠由於生物活 性喪失而發生；（2)經變性及還原的NGF依據此處之 策略復性，以決定生物活性已恢復。這是假設生物活性的 恢復是依據已變性及還原蛋白質之正確再折昼及復性而定 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -48 - A 6 B 6 五、發明説明（ (請先閲讀背面之注意事項再堪寫本頁) 時。可斷言，不論來自上述任一來源之成熟NGF,包括 細菌細胞表現条統，於變性及還原後可在結構上不能區別 。因此，將來自真核細胞表現条或來自天然來源的經變性 及還原的成熟NGF成功地再折疊，顯示於細菌細胞中産 生的成熟NGF可被成功地再折叠（見實例3及圖3)。 實例3B說明於細菌表現糸中産生之成熟NGF,其 成功地再折叠，其中採用大腸捍菌及上述之類似方法。再 折叠的NGF具完全的生物活性，且在逆相高性能液相層 析中與天然的，由昆蟲細胞所産裂之NGF於同一位置上 5 .純化重組體神猙螢蕃件蛋白暫 上述再折叠及復性成熟神經營養性蛋白質之策略，可 應用至重組體蛋白質純化中之階段，其最合宜且由經驗已 知可産生高産率之生物活性蛋白質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 於本發明一個具體實例中，NGF/BDNF族之重 組體成員，可以標準的蛋白質化學技術純化自表現宿主細 胞之萃取物，直到重組體蛋白質足夠純可應用於藥學製劑 中。此純度之定義為，製劑中至少90%的所有蛋白質為 神經營養性蛋白質，且最好至少95%的所有蛋白質為神 經營養性蛋白質。於一個較佳具體實例中，可用於純化重 組體蛋白質之步驟可包括下列，但亦不限於此：離子交換 層析（如：Q — , S —，及D E A E - S e p h a r 〇 s e離子交換管柱 ),凝膠過濾層析（如Superose大小區分管柱），色層電 甲 4 (210X297公釐〉肌 5. 20,000張（H) -49 - A b 2〇6 湖_B6_ 五、發明説明（4d 焦法（Mono — P管柱），疏水性交互作用層析（如辛 基一及苯基一 Sepharose HCI管柱），親和力層析（如鋅 ，銅，及汞金屬親和力管柱）。 6 .链皋産物之調和 如先前所示，本發明的神經營養性蛋白質可當治療劑 使用，因此可調和於藥學上可接受之載體中。於本發明的 一個具體實例中，神經營養性蛋白質可被化學修飾以改進 分子之藥物動力特性。一個實例如將高分子聚合物質-如 聚乙二醇粘附至神經營養性蛋白質上。神經營養性蛋白質 可分別投藥，與NGF/BDNF族其他成員組合，或與 其他神經營養性蛋白質或其他治療劑組合，依欲治療之神 經細胞失調症型式而定。 本發明的治療性組成物最好採注射腸外投藥，或自一 個植入泵中採連缋灌注方式鞘内注射。同時，其他有效的 投藥型式，如腸外缓慢釋出調和物，吸入合劑，口服活性 調和物，或栓劑也可考慮。較佳的載體是生理食鹽水溶液 ，但也可使用其他藥學上可接受之載體。於一個較佳具體 實例中，可考慮將載體及神經營養性蛋白質構成生理上可 相容之缓慢釋出調和物。此載體中之主要溶劑可為本質上 水性或非水性的。此外，載體可含有其他藥理上可接受之 賦形劑，以改變或保持調和物之pH、滲透度、粘度、澄 明度、顔色、無菌度、穩定度、溶解速度、或氣味。相似 地，載體中仍可含有其他藥理上可接受之賦形劑，以改變 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 叙· 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -50 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4殳 或保持神經營養性蛋白質之穩定性，溶解速度，釋出或吸 收。此種賦形劑為通常且習知可應用於調和腸外用藥之物 質，或呈單位劑量或多劑量型式，或自植入泵中以連绩或 定期灌注方式鞘内遞送，或採定期鞘内注射。 一旦調和成治療組成物，其可貯存於無菌小瓶中當做 溶液劑、懸液劑、凝膠、乳劑、固體或脱水或經冷凍乾燥 之散劑。此種調和物可呈卽可用型式貯存，或於投藥前須 立卽重組使用。此種調和物之較佳貯存為至少低至4¾之 溫度，且最好在一 7 Ot：。同時最好此種含神經營養性蛋 白質之調和物可於接近生理pH下貯存及投藥。目前咸信 ，調和物之貯存及投藥，在PH5. 5以下及pH8. 0 以上之P Η值下是不良的。 最好，含神經營養性蛋白質之腸外投藥調和物可採皮 下或肌内路徑。欲達到欲求的神經營養性蛋白質劑量，可 採用每天重覆或頻率較少之皮下或肌内注射。咸信，神經 營養性蛋白質之投藥，每天劑量約0. 01毫克/公斤以 下將無效，而大於1毫克/公斤之每天劑量則有不佳之副 作用。也希望某些含神經營養性蛋白質之調和物可採口服 投藥。最好，以此方式投予之神經營養性蛋白質被包膠。 經包膠之神經營養性蛋白質可加或不加習用於固體劑型調 和中之載體。最好，膠囊劑經設計使調和物之活性部份可 在胃腸道釋出，此處生物利用率可達最大且条統前之降解 可減至最小。也可包括額外的賦形劑，以助於神經營養性 蛋白質之吸收。可採用稀釋劑、芳香劑、低熔點的蠟、植 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. 訂- ••線. 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -51 - A 6 B 6 9AR258 五、發明説明（50 物油，潤滑劑、助懸劑、錠劑崩散劑、及粘合劑。 不論投藥方式為何，依據病人之大約體重計算比劑童 。進一步再調整估計以決定涉及上述每一種調和物之處理 劑量，可由一般精於此技藝人士例常地進行，且是在其例 常無不當經驗下工作之範圍權限内的。於生物試驗上，使 用本發明的神經營養性蛋白質觀察不到毒性作用。 奮例1:分離.宙序及砉現RDNF夕人類基因 A.使用聚合醅銪反應以擴大人類BDNF基因部松 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· -訂· •線· 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -52 - A 6 ^062 58-----— 五、發明説明（51) 依據所報告的豬BDNF核酸序列（Leibrocketal. 1989 ibid.)合成以下寡核苷酸： BDNF—1 〔非簡併性，意義股寡物，位豬BDN F第5値编碼鹼基上游，也含有一個5 ·* BamH i位置 〕 5 ^ G G A TCC GGT GAG A A G A G T GAT G A C 3 ^ BDNF—2 〔部份簡併之推測物，意識股寡物，位 豬BDNF起始密碼子下游；此寡物於二値不同匯集中合 成以減少簡併性；一値推測物為一段寡核苷酸，其簡併性 利用較佳的哺乳動物密碼子使用原則予以減少〕

B D N F - 2 A

5 ^ A T G A C N ATC/A/T CTG TT/C CTG A C N A T G 3 "

B D N F - 2 B 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂· .線·

5 ^ A T G A C N ATC/A/T CTG TTT/C CTC A C N A T G 3 ^ B D N F — 3 〔非簡併之抗意識股寡物，位豬B D N F終結密碼子下游，也含有一個5 - Sp e I位置〕 5 ^ A C T A G Τ T A A TCT ΑΤΑ C A A CAT AAA GCC 3 ^ 甲 4 (210X297公釐）80_ 5. 20,000張（H) -53 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（52 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) BDNF—4 〔部份簡併之推測物，抗意識股寡物， 位於豬B DN F終結密碼子上游〕

5 A T N GTG/C AGN GTA/G CAN ACA/G C A 3 ^ BDNF — 5〔簡併的，意識股寡物，位於成熟（經 處理修飾）BDNF蛋白質之编碼區中〕 5 — GAT/C AAA/G AAA/G A C N G C N GTN GAT/C ATG 3*" 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 PCR反應利用人類基因髏DNA為模板，及下列合 成的寡核苷酸組合為引子：BDNF—1及BDNF—3 ;BDNF — 2A 及 BDNF — 3 ; BDNF — 2B 及 BDNF-3 ; BDNF-2A 及 BDNF-4 ; BDNF — 2B 及 BDNF — 4 ;及 BDNF — 1 及 BDNF — 4。反應産物電泳之，且DNA(S〇uthern)吸 漬物以經放射標記之B D N F — 5探測之以鑑定經擴大的 片段似乎相當於人類BDNF。見此實例之實驗附錄有詳 述。 利# DNF-l/BDNF-3, BDNF-2A/ BDNF — 3 及 BDNF-2B/BDNF-3 為引子， 在反應中與BDNF — 5雜交所出現之帶約為預期大小。 BDNF—1/BDNF—3反應混合物經電泳後，自凝 甲 4 (210X297公釐〉80. 5· 20,000張（H) -54 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（53 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 膠上切出相當於雜交的Southern帶處DNA,取出部份以 BDNF—1及BDNF—3為定序引子立即定序之，可 得於BDNF编碼區中之部份人類基因序列（圖1)。剩 下的經擴大DNA再繼代選殖至經SmaI切割之噬菌體 MBmp 1 0中，並依據與經放射標記之BDNF — 5雜 交之結果挑出陽性繼代純条。二個位於相反方向的獨立陽 性繼代純糸，BDNF — PCR1&BDNF — PCR2 ，再做定序生成於BDNF编碼區中之人類基因序列（圖 B .使用猙P C R擴大；^DNA夾潠铕BDNF之人額甚 a_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 位於經擴大且雜交之Sou t hern帶位置處之D N A被放 射標記之，並用來於噬菌體入EMBL3中篩選人類基因 體DNA庫，其中6値陽性純糸可做噬_斑純化。來自甘 3純糸之D N A以下列限制酶分別水解：H i n f I ; Alul ;PsaI ;及 NcoI/Sau3AI。之所 以選擇這些酵素，因其可將BDNF编碼序列切成適合選 殖於Μ 13中之許多片段大小。含BDNF编碼序列之限 制片段再繼代選殖至噬菌Ml3mp10中，經定序以證 實人類基因序列位於BDNF之编碼區（圖1)。圖1也 示出所推衍出的前軀體及成熟的（經處理修飾）人類 BDNF蛋白質。於圖1中所推出之解離位置傜依據於 NGF及豬BDNF已知序列中之解離位置相似性，及 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -55 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（54 NG F及豬B DNF之已知胺基酸序列而來。 得自PCR擴大片段之BDNF序列（圖1)與來自 二個人類基因體DNA純糸者差異在第196位置上之核 酸。人類基因體純条在196位置上以A取代G,而使第 66號胺基酸由纈胺酸成為甲硫胺酸。此差異發生於前軀 體中，非成熟的生物活性型BDNF。此單一鹼基對及單 一胺基酸之變化，可代表人類基因體内BDNF序列中的 —値對偶基因差異。 額外純条之定序可得和圖1所示之相同序列，除了第 223位置之胺基酸為賴胺酸（K)取代精胺酸（R)， 且密碼子由AAA變成AGA。此差異發生於成熟且具生 物活性之人類BDNF中。此可代表於此位置上的一個不 同的人類對偶基因。 C .牛物活件B D N F於C Ο S — 了 ig A中之表現 為了證實我們確實獲得可指蓮合成生物活性BDNF 之人類BDNF基因，基因於COS—7細胞中瞬時表現 ,且經表現之物質測試其促進1 〇天大雞胚背根神經結神 經單位（於組織中）存活之能力，此僳純化自豬腦B D N F 的一個已知特性（Barde at a 1 . 1981 The EMBO Jour n- aj_ 1 ： 549) 〇 1.製備DNA構體以表現人類BDNF 含有人類BDNF编碼序列之經凝膠純化NDA,其 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ‘裝· 訂· ,線· 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -56 - 206258___b_6_ 五、發明説明（55 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 依上述B部份所述製備，利用寡核替酸BDNF — 1及 BDNF—3進行PCR而自人類基因體DNA中擴大， 再將之連接至COS細胞表現載體PSG5中。（Green et al- 1988 Nuc. Acids Res. 16:369)。質體 PSG 5 以限制酶EcoRI及BamHI水解，且不齊端以 DNA聚合酶I之Klenow片段，於4種脱氣核糖核苷酸存 在下處理使呈鈍端。之後，含完金BDNF编碼序列之經 凝膠純化之DNA,再連結至平齊端之PSG5内。嵌入 DNA之方向，其中BDNF前軀體蛋白質可於轉感至 COS細胞後，自SV40立卽早期啓動基因處表現，其 方向以限制酶輿圖鑑定之。於欲求的方向時，BDNF嵌 入子可用BamH i及Bg又I水解使之與載體分離。 2 . COS細朐之轉感作用 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 來自PSG5有或無BDNF编碼嵌入子之DNA, 以鹼水解繼而C S C 5密度進心方法製備（Maniatis et al., ibid.)質體DNA轉感至COS — 7細胞，利用廠 商操作指示（BRL)之策略C,以脂感染方式完成。以 無BDNF编碼嵌入子之質體DNA轉感CO S細胞培養 ，當做陰性對照組。 3 . R表現物皙夕生物檢定 經轉感作用24小時後，細胞自皿中刮下再以短暫離 心回收。細胞團塊於冰上之2 0 m Μ磷酸鈉，P Η 6 . 7 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -57 - A 6 β 6 206258 五、發明説明（56 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 含 ImM EDTA, ◦. ImM PMSF 及 〇 · lwM胃蛋白酶抑制素中，以短暫超音波震盪萃取。 毎一培養物中細胞萃液之連缠稀釋液，進行生物活性分析 ，利用雞胚1 0天大之背根神經結神經單位（見實例3之 實驗附錄）。以含BDNF嵌入子之PSG5轉感之細胞 萃液中可偵測到顯著的生物活性，但在以無B D N F嵌入 子之PSG5轉感之細胞萃液中則無（圖8)。這些結果 顯示，我們所選殖之基因可表現具生物活性之BDNF。 D .成孰的人顆RDNF够大瞄捏結由：> 杗珥 人類成熟的BDNF基因，如圖1所述，嵌入大腸桿 菌表現載體中，此載體再引入大腸捍菌宿主细胞中，且依 下文實例2所述之步驟，可完成基因表現産生人類成熟的 BDNF,其中將BDNF基因取代BGF基因。 啻例1 $富驗附錄 1 .分平牛物方法 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 聚合酶鏈反應（PCR)基本上依Saiki et al, 198 8 Science 239 : 487所述進行。P C R産物經2 %瓊脂糖 凝膠電泳，再轉移至Zeta-Bind膜（B i o R a d )做D NA(Southern)吸漬。適當經擴大的帶自原先凝膠中切出 ，再做繼代選殖準備，即以DNA聚合酶之Klen〇w片段（ New England Biolabs)修補末端，之後經選殖之平齊端， 或者若引子中有限制位置，則於以適當酵素水解後選殖之 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) 58 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（57 。此種片段繼代選殖至經適當切割及磷酸酶化之Ml 3m p 1 0載體上（Amersham)。寡核苷酸以激酶放射檫記之（ T · Maniatis，E.D. Fritsch， J. Sambrrok，Molecular Cloning· A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY, 1982))。寡核替 酸之雜交條件為6X SSCP, 2X登哈氏溶液，2m M EDTA, 0. 05%焦磷酸鈉，0. 1% S P S ,100微克/毫升酵母tRNA當做非特異競爭者，p H8. 0。雜交溫度及洗滌已雜交吸漬物及濾膜之迫切條 件，依據毎値寡核苔酸個別的相對GC含量調整之。長且 經放射標記之DNA探針以任意引導方式製備U· P· Feinberg and B· Vogelstein，Anal· B i ochem · 132.6( 1983)〕。利用此種探針之雜交條件為：5X SSCP, 2X登哈氏溶液，2mM EDTA, 0. 05%焦磷酸 鈉，0. 15 SDS, 25 ◦徹克/毫升鯡魚精子DN A, pH8. ◦於65Ό下，洗滌則在65°C下◦. IX SSCP及◦.1% SDS中。以二脱氣鏈終結方法 進行定序〔F. Sanger，S· Nicklen，A· R· Coulson， Proc. Natl· Acad· Sci. U.S.A. 74.5463(1977) ]，pjf 使 用之模板為製備自繼代纯糸，位M13載體二個方向之單 股 D N A 〇 窨例2 :於i腸桿結由産製重組體N G F 一段编碼成熟的（經處理修飾）人類N G F之合成基 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) - 59 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· .訂. -線_ Λ 6 Β 6 206二58 五、發明説明（58 因，購自British Biotech。此基因與所報告的NG F人 類核酸序列相同（Ullrich et al. 1983 ibid.),除了在 人類核酸序列上做一些變化以嵌入各種限制位置，且於質 體BBG26中供應。 質體轉形至大腸桿殼DH5a菌株中，産生足夠做接 續操作之質體量。為了變化此合成基因，使其可嵌入一個 適當表現載體中，於是合成以下二段寡核苷酸。

N G F -A 轉譯作用偶合子 B a m H i

5 ^ - G A Ύ C CGATCTTGGAGGATGAT T A A A T G TCC TCC T C C

C A C CCG A T C TTT C A C CGC GGC G - 3 ^

N G F - B

E c o R I

5 ^ - A A T T C GCC GCG GTG AAA GAT CGG GTG G G A G G A

G G A CAT TTAATCA TCCTCCAAGATCG-3 這些寡核苷酸在5/端含一個BamHI位置，在3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· -線_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -60 - ^06258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（59 /端含一個EcoRI位置。於合成的NGF基因近5 — 端處，有一痼唯一的EcoRI位置。一旦BBG26曝 於限制酶E c o R I後，合成的寡核苔酸可連接至經切割 質體之EcoRI 置上，如此取代NGF编碼序 列之5 /部份。编碼序列5 /端的此取代作用，可用來嵌 入一個上游轉譯作用偶合子（見上文之寡核苷酸序列）， 且密碼子之置換較為大腸捍菌喜用（依據心8〇^&1^1(&-s t e1e i η 於From Gene to Protein： Steps Dictating t-he Maximal Level of Gene Express ion( 1986) Davis a-nd Reznikoff, eds. pp. 225-283， Butterworths， NY) 這些變化經設計可促進NG F序列之有效表現。 寡核苔酸NGF— A及NGF-B激酶化，並回冷在 一起再連接至經E c o R I切割且磷酸酶化之質體 BBG26上，且將混合物磷酸酶化。混合物以限制酶 BamHI處理，含經修飾NGF编碼序列之約 3 9 0 b p BamHI片段再自凝膠中純化。此片段連 接至二値不同的，經凝膠純化及BamHI切割且礤酸酶 化之大腸桿菌表現載體中：（1)一値以T7噬菌體啓動 基因傜為基礎的載體，稱為PT5T ;或（2) —値以衍 自色胺酸及乳糖之雜體'' Tac 〃啓動基因為基礎的載體 ，稱為PT3XI— 2 (見此實例之實驗附錄及圖4&5 有詳述）。如此形成pT5T:NGF或PT3XI — 2 :N G F 〇 pT5T:NGF轉形至大腸桿菌BL21 (DE3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 訂· •線· 甲 4 (210X297公釐）80· 5_ 20,000張（H) -61 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（60 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} )菌株。此株中（述於 Studier and Moffat J . Mo 1 . B i -2J_. (1986) 189: 113-130)含丁 7 RNA 聚合酶基因， 並於一個非可切割之溶原入噬菌體中，及IPTG可誘導 之1 ac啓動基因控制之下。由於pT5T載體中之嵌入 子傜在Τ7噬菌體啓動基因之控制之下，此最好將便所嵌 入之序列表現在1 a c啓動基因之控制下，因此可藉異丙 基泠一 D-硫代半乳糖奋（IPTG)誘導表現。挑出轉 形細胞，培養，再與經P32標記之390bP B a m Η I片段雜交，以決定轉形細胞是否攜帶NGF嵌入子。挑 出8個陽性純条，培養，分離出載體DNA再定序。8値 純糸中每個均在載體中帶有呈正確方向之正確嵌入子。分 別於Luri a肉湯中（含1 5微克/毫升四環徽素）培養2 個純条，使光密度（0. D.)達到約◦. 6,培養物再 加終濃度ImM之IPTG誘導之。經誘導後，自2至 2 1小時之間隔中取出毎一培養物樣品，溶解於S D S — P A G E樣品缓衝液中（0 . 0 2 5 %溴酚藍，1 0 %甘 油，1% /3 —頸基乙醇，2% SDS, 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 0 . 0 6 2 5 M Tris-HCi.pHe.S)。每 一樣品於還原型SDS — PAGE中電泳，NGF之産製 以染有考馬斯音藍之帶於正確分子量處出現，以及利用老 鼠頜下腺NG F抗體（Sigma)進行西方墨點分析而追踪之 。至於陰性對照組，則採用相同培養物但未經誘導之樣品 ，以及以不含NGF嵌入子之pT5T載體轉形於細菌後 之培養物。示於圖2之結果顯示，轉形細胞Ρ Τ 5 Τ 甲 4 (210X297公釐）8ΰ. 5. 20,000張（Η) -62 - A 6 B 6 206258

五、發明説明（6D NGF - 1 8可産生一個蛋白質帶，其分子量位置和經處 理修飾之NGF所預期的相同，且其也可為抗一NGF抗 血清所確認（這些帶標以：以IPTG誘導2, 4, 6, 8, 1 ◦及 21 小時之 PT5T:NGF— 18)。如所 預期的，此帶在以無NGF嵌入子之pT5T所轉形之細 菌中偵測不到，（此帶標以：ρ Τ 5 T u (未誘導的） 及i (誘導的）），或於未用IPTG誘導的pT5T : NGF-18中也測不到（此帶標以：pT5T : NGF 一18，以IPTG誘導0小時）。 ρΤ3Χ I — 2 : NGF轉形至抗噬菌體之大腸桿菌 Κ —菌株，JM107。13値轉形細胞長成pT5T: NGF轉形細胞，且發現有3値可表現人類成熟的NGF 蛋白質，係細胞萃取物經SDS-PAGE後，以考馬斯 亮藍染色並以抗-老鼠NGF抗血清免疫染色，如上述 pT5T : NGF轉形細胞一般而證實。 由PT3XI — 2 :NGF於大腸桿菌JM107中 所産生之重組體NGF之胺基末端胺基酸序列顯示：在表 現中，於所産生的NGF中有至少85%其胺基末端甲硫 胺酸被除去。此點顯示，被生成之NGF具有可處理修飾 成熟人類NG F之正確胺基末端。 此處所述之生成的NGF,經以下文實例3所示步驟 決定後發現，無可測及之生物活性。 以載體 pT5T :NGF 或 pT3XI— 2 :NGF 産生之蛋白質，於昆蟲細胞中進行神經生長剌激活性及重 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝. •線 經濟部中夬標準局員工消費合作杜印¾. 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -63 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（6之 組體h/3NHF産製之試驗，並以桿病毒載體為對照組。 陽性控制組於1.1毫克/毫升濃度時，可造成神經單元 存活最大值;έ 一半。相反的，由二個載體於大腸桿菌中産 生之多肽，經證明均無顯著的生物活性，即使在約 3, 600毫克/毫升濃度下亦然。 官例2之曹駱附錄 1 . Ρ Τ 5 Τ乏説明.傜以'' Τ 7铭動某因"备統為 某礎之表現載體（參看圖4為此戧體之圓） 以T7啓動基因為基礎的表現載體PT5T,基本上 和p J U 1 ◦ 0 3是相同的[Squires， et al.， J. Biol. Chem ♦ (1988) 263: 16297-16302],除了在 T 7 啓動基因 5 z唯一的Bg j I位置及四環徽素耐受基因中C 1 a I 位置之間有一段短的DNA。此DNA序列是： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -装. 訂. c

A G c T A 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2

G A A T G G A A G c G A

A T T T A A G A c T- G c AT

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A G A ACT A c c Η c c Gcj T c AT G T A A T c A G c G G A G A c T A G G T

I 1IX 8 B 啓 c a T / 體 雜 用 利 明 說 之 2 2 2 K K p 之 統 因 基 & 見 參 /IV 化 礬 甲 4 (210X297公釐）80_ 5. 20,000¾ (Η) -64 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（6彡 圖5.為吐黻體之圖） (請先閲讀背面之注意事項再場寫本頁) 此構體之起始質體為質髏PKK223 - 3,購自p-harmacia。質體PKK223 — 3帶有血環徽素抗性之部 份基因。此無功能基因以完金的四環徽素耐受基因取代， 其傜帶於PBR322上。質體PKK223 — 3以 SphI完金水解，以BamHI部份水解。一段4. 4 仟鹼基對Μ段以凝膠純化，再與具以下序列之合成承接子 組合： 5 ^ GATCTAGAATTGTCATGTTTGA CAGCTTATCAT 3 ^

3 " ATCTTAACAGTACAAACT GTCGAATAGTAGC 5 " 以及與一段539b ρ之DNA片段混合，後者是 PBR322四環徽素耐受基因之Clal, SphI水 解物（PL Biochomicals，Cetalog humber 27-4891-01 ) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 。生成之質體命名為PCJ1。 接著，購自New England Biolab之Xh Ο I鐽結子， 嵌入質體pCJl的Pviil位置，以形成質體pCJX 一 1。此嵌入瓦解r ο ρ基因，其係控制質體之套數。含 1 ac I基因之EcoRlH段純化自質體口^匚9〔〇&-los» et al*> Proc· Natl· Acad· Sci· USA(1983)j 80· 3015-3019〕，再嵌入 Xh ο I 位置，而 Xh ο I 至 E c o 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -65 - 206258 Λ 0 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（64» RI承接子具有以下序列： 5 ^ TCGAGTCTAGA 3 3 ^ CAGATCTTTAA 5 ^ 質體pCJX— 1中位於EcoRi及Pst I位置 間之聚連接子序列再以下示之聚連接子序列取代： 5 ^ AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3 " 3 ^ GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5 ** 所得之質體載體命名為PCJX I _ 1。 最後，四璟擞素耐受基因以相似的基因取代，其中限 制酶H i n d Μ , B a m Η I及S a 1 I之確認位置被亞 硫酸氫鹽突變作用所破壞。使用以下步驟使P B B 3 2 2 之四環徽素耐受基因突變。質體PBR322以H i nd 皿切割，再以亞硫酸氫鈉突變之〔Shortle and Nathans， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 5:2170-2174〕。經 突變的DNA連接形成環狀DNA,再以H i nd HI切割 ，以線化任何躲過突變作用之質體。大腸捍菌JM1 09 〔Yanisch-Perron, et al.， Gene(1985) 33:103-119〕以 質體轉形之，再塗佈於篩選培養基中。自四環徽素耐受集 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .¾. •訂· " 甲 4 (210X297公釐〉80. 5. 20,000張（H) -66 - -- 五、發明説明（6彡 (靖先閲讀背面之注意事項再堪寫本頁) 落中分離質體，並於四環徽素耐受基因中檢査H i n d HI 是否喪失。經成功突變之質體命名為PTI。依循相似的 步驟以突變PT1中之BamHI位置，生成pT2。 ΡΤ2再做突變除去Sa 1 I位置，形成質體ρΤ3。帶 有經突變四環徽素耐受基因之ΡΤ3 C 1 a I / BsmI片段分離出來，以取代pCJXI — 1中同質之 片段形成P T 3X I — 2。經突變之四環徽素耐受基因仍 可编碼一個具功能之蛋白質。 3 . τ>Τ3ΧΙ — 2 — ^10TC3FGFsyn 之 訂. 經濟部中央標準局員工消费合作杜印製 形成（媒I備供NGF用夕t a η铭動某闵戧髅 最初，合成指導合成鹼性纖維母細胞生長因子（bF GF)之〜基因"。此a基因"指導合成的序列和由Som-mer et al所報告的 bFGF 相同（1987，Biochem.Biop-hys· Res. Commun. 141: 67)但所使用之密碼子為於大腸 桿菌中高度表現基因所喜用的。此基因之結構如此，以致 编碼部份接有一個轉譯作用偁合子序列（見Squires, et al.，1988,上文），以確保轉譯作用可有效地啓始。 bFGF合成基因先嵌入Ml3mp18載體之 EcoRI及Hi ndlll位置之間，再定序之。此基因之 結構如下： 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -67 - 206258 A 6 B 6 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（ AATTCAGGA TCCGATCGTG GAGGATGATT AAATGGGTAC CATGGCTGCT GGCTCCATCA _GTCCT AGGCTAGCAC CTCCTACTAA TTTACCCATG GTACCGACGA CCGAGGTAGT EcoRI BamHI_RBS_FGF開始 轉譯作用偶合子3 CTACCCTGCC GGCACTGCCG GAAGACGGTG GCTCCGGTGC TTTCCCGCCG GGCCACTTCA GATGGGACGG CCGTGACGGC CTTCTGCCAC CGAGGCCACG AAAGGGCGGC CCGGTGAAGT AAGACCCGAA ACGTCTGTAC TGTAAAAACG GTGGCTTCTT CCTGCGTATC CACCCGGATG TTCTGGGCTT TGCAGACATG ACATTTTTGC CACCGAAGAA GGACGCATAG GTGGGCCTAC GTCGTGTCGA CGGCGTACGT GAAAAAAGCG ACCCGCACA TCAAACTGCA GCTGCAGGCTG CAGCACAGCT TGCCGCATGC ACTTTTTTCC TGGGCGTGT AGTTTGACGT CGACGTCCGAC AAGAACGTG GTGTTGTATC TATCAAAGGC GTTTGCGCAA ACCGTTACCT GGCTATGAAAG TTCTTGCAC CACAACATAG ATAGTTTCCG CAAACGCGTT TGGCAATGGA CCGATACTTTC AAGACGGTC GTCTGCTGGC TAGCAAATGT GTAACTGACG AATGTTTCTT CTTCGAACGTC TTCTGCCAG CAGACGACCG ATCGTTTACA CATTGACTGC TTACAAAGAA GAAGCTTGCAG TGGAAAGCA ACAACTACAA CACCTACCGT TCTCGTAAAT ACACTTCTTG GTACGTTGCTC ACCTTTCGT TGTTGATGTT GTGGATGGCA AGAGCATTTA TGTGAAGAAC CATGCAACGAG TGAAACGTA CCGGCCAGTA CAAACTGGGT TCCAAAACTG GCCCGGGTCA GAAAGCAATCC ACTTTGCAT GGCCGGTCAT GTTTGACCCA AGGTTTTGAC CGGGCCCAGT CTTTCGTTAGG TGTTCCTGC CGATGAGCGC TAAATCTTAA ACTAGTA ACAAGGACG GCTACTCGCG ATTTAGAATT TGATCATTCGA FGFstop Hindlll (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. 訂. .線· 曱 4 (210X297公釐〉80_ 5. 20,000張（H) -68 - A6 B 6. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 此基因的某些特色特別指出來。 其接著以BamH I及H i nd Μ水解而分離，再嵌 入經 BamHI/Hi ndltt 切割之 PJU1003 中（ Squires, et al., 1988上文）生成 pJU1 003~sy nFGF。此質塍以Xba I及H i ndM切割，再分離 出帶有bFGF基因之Xba I/H i ndlDH段。此片 段連接至以Ec oR I及H i nd IK切割之pT3X I — 2中，利用EcoRI—Xbal連接子： 5 ^ A A T. TCC A C A A C G GTT T C C C T 3 ^ 3 ^ G G T G A TGC C A A AG G GAG A T C 5 ^ 新的質髏命名為PR3XI — 2 — 0 10T3FGFsy η 〇 4 . 將NGF耒現構體嵌人Ta c稗動基因載體 pR3XI-2-01〇T3FGFsyn 以 Bam I切割，其可生成線化的7. 4b p表現載體，且 釋出約0. 5kb之bFGF DNA片段。含有經修飾 之NGF编碼序列的390bp BamHlM段，連接 至以凝膠純化及MamHI片段之載體DNA片段上，生 成質體PT3XI—2:NGF。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐〉80. 5. 20,000張（H) -69 - A 6 B 6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 ^06^.8_ 五、發明説明（6d 奮例3:神猙營養件蛋白質NGF/RDNF旌中成昌之 苒析麝及梅袢作用 八1_産自真核動物細胞或純化自天然夾源之成勃NG F夕 再析麝 本發明的一具具體實例涉及，再折叠及恢復生物活性 至由細菌所産製之非活性成熟型重組體NGF之能力。為 說明此點，首先確立由真核細胞表現条所産製的或純化自 天然來源的具完金生物活性之成熟NGF,於變性及雙硫 鍵被還原所造成之生物活性破壊後可被成功地再折叠。此 證明基於二値理由是重要的： (1) 可合理的推論，於細菌中所産製的（原先非活 性）或純化自天然來源（原先具活性）之成熟的NGF, 經過完金變性及還原後，將是非活性的，且結構上無法區 則。因為其俗結構上無法區別的，因此得自真核細胞或天 然來源之經變性及還原的成熟NGF,其成功的再折叠顯 示表現自細菌之成熟NGF,經變性及還原後，也可被成 功地再折疊。 (2) 金長的NG疋前軀體無法在細菌中被蛋白水解 地處理修飾産生正確的成熟NGF,因其像於真核細胞表 現条中。因此，在細菌中其必須直接地表現成熟NGF之 编碼序列，而非全長的前軀體。其在理論上是可能的，即 成熟NGF正確的折叠及呈現生物活性只有當其先以全長 前軀體型式被合成時才發生，就如同於真核細胞及於天然 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80. 5· 20,000張（H) -70 - 2 8 ¾ a 經濟部中央標準局員Η消費合作社印製 五、發明説明（6d 來源一般。此點可消除於細菌中所産製之成熟蛋白質成功 地再折β之任何可能性。然而，如此中所明的，經受性及 還原之成熟NGF之成功地再折β證明，正確的再折叠不 依賴全長之前軀體。 二種原先具生物活性之成熟NGF型式，可於被變性 及還原後成功地再折叠：（1)純化自公老鼠頜下腺（ SIGMA)之成熟（/3) NGF,及（2)依據歐洲專 利案EP 891 13709所述，於真核細胞中所産製 之重組體人類成熟NGF。圖2說明，如上所産製之重組 髏人類成熟的NGF,可於NGF之預期濃度下促進雞胚 交慼神經結神經單位之存活（Greene 1977 Develop. Biol .58:96-113)。圖3也說明，此生物活性於變性作用及雙 硫鍵被還原後會喪失。圖3進一步説明，經變性及還原之 蛋白質，經此處所述之步驟再折疊後可恢復其完全的生物 活性。利用純化自老鼠頜下腺之成熟— NGF,基本上 可得到相似的結果。這些成功的再折叠強烈地顯示，於細 菌中産製之成熟NGF,其再折昼之可行性。 1 .亩枳UN G F夕镫璐 NGF以0· 5毫克/毫升濃度溶於PBS中（ 0 . 1 5 Μ N a C 父，0 . 0 4 K 2 Η P O 4 , 0 . 0 2 Μ K H ^ P 0 4 , pH 7 . 2 ),再加胍鹽酸 化物至3M的終濃度以變性之。經25Ό下30分鐘後， 加入终濃度為5. 6mM之二硫異赤絲藻醇（DTT), .............................................f ·裝...........................訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4 (210X297公釐）80, 5· 20,000張（H) -71 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（7() (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁)

並於251C下繼續再培育2小時，（也曾用5〇mM DTT而有相等之成功）。再加入氣化的穀胱甘肽至終 濃度50mM,並於25Ό下培育1◦分鐘。此溶液以 0 . G 96 T r i s (Boehringer/Mannheim 604-205)未做 pH調整且含◦. 2%人類血清蛋白，稀釋7倍。加入L 一半胱胺酸使終濃度逹20或3◦mΜ (二者有同等之成 功）。此再折β混合物於25¾下培育16—20小時， 之後物質以Centr icon-10濃縮器（Am icon)濃縮，缓衝液以 P B S交換。 2 .經再析耱後分析NG F生物活件 •線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將未處理之起始NGF, NGF置於含有3M胍及 5 . 6 m M DTT之變性缓衝液中，且經變性及之後再 折昼之NGF進行其促進已解離之E11難胚腰交感神經 鏈神經節神經單位存活之能力分析，此如實驗附錄中所述 進行。圖3示出此生物撿定之結果。經變性及還原的 NGF於45 0毫微克/毫升時可呈現最大生物活性之一 半，而起始的NGF及再折S之NGF,分別於0. 5及 1. 0毫微克/毫升時呈現最大生物活性之一半。這些結 果顯示，變性及化學還原作用，可使重組體人類成熟 NGF之生物活性減低約1, 000倍，而再折昼步驟使 此物質之生物活性恢復至起始N G F程度，在約2倍的實 驗誤差之内。 甲 4 (210X297公贊）80. 5. 20,000張（H) -72 - 206258 五、發明説明（7l B .於大腸捍菌細朐中産剪^成勃人類NG F夕再析蜃 如實例2所述，由大腸桿菌中所表現之成熟NGF是 不具生物活性的。此種NGF依據以下所述步驟再折®可 産生具生物活性之NGF。 1 .製備再祈麝之轺始物皙 將10克來自JM107, pT3XI-2:NGF 之大腸捍菌細胞糊（如實例2所述）懸浮於5 0毫升 1 0 m M EDTA， ρΗ7. 0 中，再以 16, 0〇Ops i通過French壓力裝置2次。細胞萃 取物以1 600〇xg離心20分，再丢棄上清液。圃塊 勻漿化於10◦毫升 10mM EDTA pH7.0 中。再懸浮之圍塊如上述般離心，並丢棄上清液。圍塊再 次勻漿化於100毫升 10mM EDTA, pH7. 0中。再懸浮之團塊如上述般離心並再次丢棄上 清液。圍塊以含有8Μ尿素之30毫升2OmM檸樣酸鈉 p Η 3 . 0勻漿化。再懸浮之圍塊如上述離心，且上清液 置冰上。園塊勻漿化於含8Μ尿素之3◦毫升2OmM檸 檬酸鈉PH3. 0中，如上述般離心，上清液再置冰上。 上清液可貯存於一 8 0 t下。 2.士瞄捍閡窣取物之再折叠 對上述最後的上清液萃取物，加入1/4體積之 T r i s ( 1 Μ) ρΗ8. 5,其中含有8Μ尿素。加入 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· *訂. 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 甲 4 (210X297公釐）80_ 5. 20,000張（Η) -73 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（72 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 二硫異赤絲藻醇，使終濃度在5 — 15mM,溶液於25 Ό下放置1小時。之後加入胱胺酸（或經氧化之穀胱甘狀 )使終濃度為150 - 50mM,溶液置於251C下10 一 1 5分。再於胱胺酸加入後，加9倍體積之1 OOmM N a 2 Η Ρ Ο 4 , ρΗ8. 3，其中含 3. 2-4. 2 Μ 尿素，且使其終濃度為胱胺酸（或毅胱甘肽）之2 — 3倍 。溶液保持在4C下一夜。這些條件不會使活性NGF還 原或變性。 以上條件所提供之濃度範圍及不同的試劑，經發現是 可接受的。以下提出一個代表性再折叠實驗實例： 上述的大腸桿菌萃取物4 0毫升（經考馬斯亮藍染 SDS-聚丙烯醯胺凝膠後，以雷射光密度計估計含有約 650微克/毫升的NGF),接受10毫升 1M Tr i s, pH8. 5,内含有8M尿素。加入2毫升 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 4 0 0 m Μ 的二硫異赤絲藻醇，溶液置2 5 t：下1小時 。加入4毫升 60〇mM之經氣化的穀胱甘肽，且溶液 置25Ϊ：下1 5分，此時加入45 ◦毫升 1 OOmM的 Na2 HP〇4 , pH8. 3,含 3. 2M尿素，再加 6毫升 1 Μ的半胱胺酸。溶液置4 1C下1 6小時。此溶 液在下文中稱為再折叠混合物。 2a.赛取及再祈《自大腸捍菌中所産生之成熟人類 NGF之另一方法 以下方法較己陳述者為佳，因其可造成明顯較具效率 甲 4 (210X297公釐）80_ 5. 20,000張（H) -74 - A 6 B 6 五、發明説明（73 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 及速率之再折疊，且使經正確再折叠及具生物活性之成熟 人類NGF有更高之産率。 Ν Π F夕萃取 •訂_ 大腸桿薗細胞（其可産製NGF,如實例2所述）以 French壓力器或Gaulin磨於10倍髏積/wt (如1升/ 100克細胞糊）之10mM EDTA, pH7. 0中 打破。溶胞産物以16， OOOxg離心20分，以自圍 塊中分出上清液。圍塊於1 〇倍體積之1 〇mM EDTA， PH7. 0中勻漿化並如上述般離心以再萃取 二次以上。圍塊如上再萃取一次。經洗過之圍塊以5倍體 積/wt 的 20mM Tr i s, pH8. ◦，含 2M尿 素萃取，並如上述般離心。上清液丟棄。 -線. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 NGF自圍塊中萃取，以10倍體積/wt的 20mM檸檬酸鹽，PH3. 0含尿素進行，再如上述般 離心。上清液保留於冰卜，而圍塊以4倍體積之2 0 m Μ 檸檬酸鹽，ρΗ3. 0含8Μ尿素如上述般做最後一次萃 取。於C0 (檸檬酸鹽一尿素）萃取物中，NGF約在總 蛋白質的5 0%。

典型的再折叠如下進行：將20毫升 1Μ T r i s, pH8. 5,含8M尿素加至含有2毫克/毫升 NGF之80毫升C0萃取物中。加二硫異赤絲藻醇或2 一頸基乙醇至5mM終濃度，混合物於25¾下保持30 一60分。之後加入氧化的毅胱甘肽或胱胺酸至2OmM 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H〉 - 75 - -A 6 B 6 206258 五、發明説明（74 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 終濃度，且反應混合物於2 51〇下保持1〇 — 15分。接 下去加19倍體積之稀釋缓衝液（i〇〇mM N a 2 HP〇4 ,l〇mM乙醇胺，pH8. 3, 4. 6M尿素 及15. 8%聚乙二醇300)。加半胱胺酸或2 —镟基 乙胺至3mM终濃度。最終之再折疊混合物於真空下除去 空氣，並以純的氬氣經3 — 5痼脱氣循環沖洗再充入氬氣 。混合物熔封防止氣體進入，再保持於9υ之氬氣下1一 7天。 經濟部中夬標準局貝Η消費合作社印製 於最後之再折叠混合物中，最好使半胱胺酸（或2 — 巯基乙胺）對經氣化穀胱甘肽（或胱胺）之比率為最大。 最大的比率（典型偽介於2 — 10之間）依許多因素而定 ,包括終反應混合物所保持之溫度。0 — 25Ϊ：之溫度可 生成再折叠的NGF ;然而，較佳的溫度為4_9t：。於 終稀釋倍數3 X至8 Οχ時，稀釋步驟可生成再折簦的Ν GF ;然而，以20χ以上之稀釋倍數可> 最高比率之總 NGF,其即再折叠。聚乙二醇200， 3◦◦及 100 ◦當使用之終濃度高達25%,可生成再折叠的 NGF ;然而，以終濃度15%時之聚乙二醇2 ◦◦或 300可得較大産率。乙二醇、甘醇、丙二醇可取代聚乙 二醇，然而當與聚乙二醇比較時，再折昼效應減少約2/ 3。尿素於終再折疊混合物中之濃度可介於4 一 6Μ之間 ，而以4. 5—6. 0Μ可得最高的再折昼NGF産率。 再折叠發生於ρ Η8 — 1 0之終再折叠混合物中，以 pH 1 0有最快之再折壘速率。磷酸鹽缓衝液濃度於最终 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -76 - 2〇62δ® A 6 Β 6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（7彡 再折叠混合物内最好保持在1 00 — 300mM之間，同 時使磷酸鹽缓衝液對乙醇胺之比率保持在10:1。 如上所進行之再折叠，通常可造成最初量30%以上 之NGF可達到正確再折叠且具生物活性之型式。若萃取 自大腸捍菌的NGF,如上述般於尿素及魏基乙醇中變性 及還原，之後再於RP — HPLC中純化（於約43%乙 睛處現出一個單峰），則再折昼效率增加至起始NGF的 6 0%以上。比顯示，於大腸桿菌萃取物中之滲雜物可部 份干擾再折《效率。NGF於再折叠前利用RP-HPL C以外的方法純化，如利用離子交換層析，也可增加再折 叠之效率。 3 .再析麝效率決亩 於終再折叠混合物中之NGF總量可如下決定之：在 還原條件下行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，其中某些行 列含不同濃度的N G F校正標準品（桿病毒，由昆蟲細胞 産生之物質，述於實例3 ),而某些行列含部份终再折叠 混合物，之後以考馬斯亮藍染色，再進行雷射光密度掃描 。藉著在雷射光密度及NGF標準蛋白質量之間確立定量 關係，我們可決定於未知樣品中NGF之量。 經正確再折疊的NGF,其在終再折叠混合物中之含 量可如下決定之：終再折叠混合物之連續稀釋液，進行其 於活體外促進雞胚交感神經鍵神經單位存活之能力測試， 利用實例3實驗附錄中所述之方法。於相同的分析中，對 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .装* 訂- ,31·. 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) _ 77 — A 6 B 6 ^06258 五、發明説明（76 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一値濃度範圍下的標準，由昆蟲細胞産製之NGF，也進 行促進神經單位存活之能力測試。將可於生物檢定中，造 成最大存活一半值之終再折畳混合物之稀釋倍數，當定標 準NGF生成最大存活一半值所須之濃度時，則可考慮其 中含有相同濃度的經正確折叠之NG F。 這些方法可用來決定，於上述之實驗性再折昼中，被 正確折叠的NGF量。於生物檢定中，為達最大存活一半 值須有3. 7毫微克/毫升的由昆蟲細胞所産生之NGF 。由於終再折叠混合物之1:150◦稀釋液可造成最大 存活的一半值，因此估計終再折叠混合物中含有（ 1500X3. 7=) 5550毫微克/毫升之活性 NGF。NGF於終再折叠混合物中之總量由雷射光密度 計估計為52000毫微克/毫升，顯示再折叠效率約為 1 1 96 〇 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 圖9說明標準，由昆蟲細胞所産製之NGF之生物檢 定結果，其於3. 7毫微克/毫升時可得最大存活的一半 值。圖1 ◦說明終再折叠混合物之生物檢定結果，其於1 :1 5 0 0稀釋倍數下生成最大存活一半值。 4 .於大鸱捍閡中産製之再折叠NG F之純化及鑑定 使用逆相高性能液相層析（RP - HPLC)純化及 鑑於終再折叠混合物中之具生物活性且再折昼的N G F。 RP-HPLC之條件如下：溶劑A=〇.1%三氟醋酸 (TFG)於水；溶劑B = 〇. 1%TFG於乙睛（均屬 甲 4 (210X297公釐）80. 5_ 20,000張（H) -78 - 206258 Α ό B 6 五、發明説明（7*? HPLC 级試劑）；管柱=VyDec C 4 U 2 1 4 TP54 ;流速=1毫升/分。樣品於〇時間時注入，並 以下列程式展開梯度： m m % Β ο 5-10 10-40 4 0-50 5 % 5 - 2 〇 ％ 2 Ο - 5 Ο % 5 Ο - 8 Ο % (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 決定天然NG F及經還原NG F之位置以校正管柱做 進一步再折β樣品之分析。為溶劑Β於管柱溶離液中 之量。由昆蟲細胞産生之天然NGF樣品，於約34%Β 處被溶離。經變性及還原之昆蟲細胞産製之NGF樣品， 於約43%Β處被溶離。NGF之變性及還原偽曝於6Μ 胍鹽酸化物及5OmM二硫異赤絲藻醇，而於20OmM Tris, pH8. 5中。個別的RP — HPLC管柱 須分別以這些標準品校正，以決定這些樣品被溶離之確實 % B 〇 由上述實驗性再折簦中之5 0微升终再折叠混合物内 ，一値蛋白質峰出現在天然NGF位置處（圖11B)。 於再折疊前此位置不見蛋白質。當加1〇〇毫徼克天然的 ，昆蟲細胞所産製之NGF至第二份5 ◦微升樣品中，則 NGF位置處之峰大小約增加2倍（圖1 1A)。此點證 甲 4 (210X297公釐）80_ 5. 20,000張（H) 79 A 6 B 6 206258 五、發明説明（7d (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實，於再折疊後出現之蛋白質與天然NGF位於相同位置 ，且也顯示於50微升之終再折叠混合物中含有此物質約 100毫微克。當經過RP—HPLC梯度而收集之流分 ,以交感神經神經單位存活分析法測試生物活性時，只有 此峰會呈現可偵測之生物活性。此進一步證實，於終再折 疊混合物中之此蛋白質本質為NGF。此峰之比活性在天 然的，由昆蟲細胞産製之NGF所觀察到之範圍内（在不 同天之個別分析中，於〇. 5—5毫微克/毫升時有最大 存活之一半值）。因此，得自大腸桿菌之再折叠NGF, 確與天然的，由昆蟲細胞所産製之NGF抱在同一位置上 ，且具有完全的生物活性。 訂. •線· 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 當如上述實例3. B. 2a般進行再折叠時，再折叠 NGF之純化可如下地完成。終再折昼混合物以濃縮裝置 濃縮約20倍，如中空纖維濾器/濃縮器。濃縮物再以 1 0 — 2 0倍體積之含尿素缓衝液透析之。所使用之缓衝 液為50mM醋酸鈉，PH5.◦,因為再折叠NGF可 溶於此缓衝液中且十分穩定，且pH值適合接續的陽離子 交換層析。透析缓衝溶液包括足量的尿素，如此經透析後 之最終尿素濃度為1. 5—2M。如此可令大腸桿菌蛋白 質及未正確折叠之NGF沈澱，由逆相HPLC判斷之。 經透析之樣品離心，以使沈澱物呈圍塊，再於 5〇mM醋酸鈉，PH5. 0中填料至S-Sepharose。管 柱以◦. 05—1. 5M NaCi?之線性鹽梯度洗條及 溶離。NGF以逆相HPLC純化至均質。 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) —80 - A 6 B 6 2〇62b8 五、發明説明（7$ 圖12說明最終再折疊混合物之逆相一 HPLC ( RP—HPLC)蛋白質槪圖。經正確再折β之NGF為 主要的蛋白質峰，於約37%乙腈處被溶離。圔13說明 終再折壘混合物經濃縮及透析後之R Ρ — Η P L C蛋白質 概圖，但傜在S-Sephar〇se層析之前。與其他蛋白質之摻 雜可見於圖12,包括於約47%乙腈處被溶離之未折疊 NGF (圖12)，已被顯著地減少，且經正確再折《之 NGF實質上很純。圖14說明物質於S-Sepharose層析 後之RP—HPLC蛋白質概圔。幾乎所有摻雜的蛋白質 已被除去。於再折疊NGF主峰後被溶離出之小峰為再折 疊NGF之單體型式。於約37%乙睛處所溶離的主峰， 為再折叠NGF之雙體型式。 逆相純化之N G F ,於雞胚交感神經神經細胞存活生 物檢定中之比活性為E. D. 5。=0. 17 土 0. 01毫微克/毫升。供比較起見，於毘蟲細胞中所産 生的人類重組體NGF之tb活性（如實例3所述）為 E. D. 5〇=〇. 26 土 0. 02毫徹克/毫升。此說明 ，由大腸桿菌産生之再折^NGF，且以上述之方法再折 曼及純化具有完全的生物活性。 C .成孰人額BDNF：>再析麝 由大腸捍薗中重組地産製之成熟人類BDNF,如上 實例1 D所述，藉著實例3所述之步驟再折蠱可使之具 生物活性。 .........................................·(…^...........................玎.....................{ ά,· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（Η) -81 - A ο B 6 206258 五、發明説明（80

D .成孰NGF_3：>再析II 成熟人類NGF—3,如下實例4所述，藉著實例3 所述之步驟再折叠可使之具生物活性。 奮例3之富駱附錄 1 . NGF^RDNF：>^ 物檢亩 如前所述準備雞胚交感神經鏈及背根神經節之培養（ Collins and Lile 1989 Brain Research 502 ： 99) 〇 簡言 之，自具繁殖力、無熱原之雞蛋中取出交感神經或背根神 經節，其中此雞蛋已在38¾之潮濕大氣中培育8—11 天。神經結化學解離，首先曝於371C下，含10mM HEPES緩衝液pH7, 2,無二價陽離子之Hank s /平衡鹽溶液中10分鐘，之後曝於〇. 125%細菌 膜蛋白酶 1 : 2 5 0 溶液中（Difco，Detroit，Michigan) ，於H a n k s /平衡鹽溶液中（如上述變化之），以 371C進行1 2分。加入牛胚胎血清，使终濃度為1 ◦% 而停止胰蛋白酶化作用。經此處理後，神經結轉移至含有 Delbeccos’高葡萄糖經修飾Eagle培養基，無重碳酸鹽， 含10%胚牛血清及10mM HEPES, pH7. 2 之溶液中，經玻璃Pas tear管來回1 〇次以研究方式機械 地解離之，此管之開口被火琢且限制其直徑，如此欲充填 此管要花2秒。經解離的神經結再塗佈於培養基上（Dulb-ecco ’ S經修飾之伊耳格培養基，添加1 ◦ %胚牛血清， ..........................................f :…裝...........................tr.....................f •緣 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -82 - A 6 B 6 206258 五、發明説明（8i 4mM穀胺醯胺，6 ◦毫克/升青徽素一 G, 25mM HEPES, pH7. 2),於10 ◦毫米直徑之組織培 養皿中（每個皿中有40値經分離之神經結）歴3小時。 進行預塗佈，以分離非神經單位細胞，其粘附至皿中與不 粘附之神經細胞有別。經3小時後，未粘附之神經細胞以 離心收集，再懸浮於培養基中，並以每値孔洞5 0微升之 量加至96孔洞微滴定組織培養盤的一半區域，密度為毎 個孔洞有（5 0 0個神經細胞。微滴定孔洞先前已曝於 Poly—L—鳥胺酸於l〇mM硼酸鈉，PH8. 4之 1毫克/毫升溶液中，4Ό下一夜。再以蒸餾水洗及風乾 Ο 欲做神經營養活分析之此樣品連鑛稀釋液，取10微 升每至每一孔洞中，培養皿再於37Ό，含7. 5% C〇2之潮濕大氣下培育20小時。經1 8小時後，每個 孔洞中加入15微升，1. 5毫克/毫升之四唑染料 Μ T T於Dulbeccos'高葡萄糖經修飾之伊耳格培養基之 溶液，其無重碩酸鹽但含l〇mM HEPES, PH7. 2,且培養物置回37t之培育箱中4小時。之 後，加入75微升 6. 7毫升 12M HCP/升異 丙醇之溶液，且每一孔洞之内容物研磨3 0次，以打開細 胞且懸浮染料。對每一孔同決定相對於690毫微米參考 值下之570毫微米吸光度，利用自動式微滴定盤計謓器 (Dynatech. Chantilly，Virginic)。未接受任何神經營 養性作用物孔洞之吸光度（陰性對照組）自含樣品孔洞之 ..........................................(::裝............................玎.....................f ·線. (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 甲 4 (210X297公釐）80. 5_ 20,000張（H) —83 - A 6 B 6 206^8 五、發明説明（82 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 吸光度減去。所得之吸光度與每一孔洞中活細胞數目成比 率，表明這些神經細胞可減少染料。將每毫升營養單位（ TU)中之營養活性濃度定義為使神經細胞達最大存活 5 0%時之稀釋倍數。例如，若樣品做 1 : 100, ◦◦0稀釋可得50%最大存活，則將效價 定義為100, 000TU/毫升。比活性之決定是將每 毫升之營養單位數目除以未稀釋樣品中，毎毫升之蛋白質 濃度而得。 奮例4:潠铕NGF-3.其為神猙螢蕃件蛋白質NGF /BDNF族中的一個新成冒 A.使用聚合醅鋪反應（PCR)以搪大NGF_3：>D N A片段 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 合成二個部份簡併的寡核苷酸：NNF-1及NNF 一 3,係依據编碼各種種類成熟的（經處理修飾）NGF s及豬及人類B DN F核酸序列的高度保持性區域而合成 。這些寡核苷酸序列，及供繼代選殖之經擴大片段可易於 嵌入之5~限制位置示於下。（1=肌胺酸） 甲 4 (210X297公釐）肌 5. 20,000張（H) -84 - Α ό B 6 ?,〇6的8 五、發明說明（83 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) N N F — 1 (意識股）

Hindi 5 ^ - GGAAGCTTG T G T G ( C / T ) GAC AG (C/T) (A/G) T (C/T)

AG (C/T) (A/G) (A/T) G TGG G T 3 " NNF — 3 (抗意識股）

B a m Η I 5 ^ - CCGGATCC TTC CA (A/G) T G ( C / T ) (C/T ) T I (A/G) (A/C) (A/G) TCI AT (G/C) CC (C/T) C (G/T) G C A - 3 ^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 NNF—l及NNF — 3當做PCR中之引子（見實 例1之實驗附錄）而以人類基因體DNA為模板。PCR 産物於3%瓊脂糖凝膠上電泳，切出團在150— 2 0 0 b p預期大小之螢光DNA帶，經平齊端連接至經 SmaI切割之噬菌體Ml3mp1〇中而選殖之。所生 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -85 - A 6 B 6 2〇6^58 五、發明説明（84 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 成之連接反應物塗侑在大腸捍菌TGI株上，並取出重覆 的掀片。第一片在高迫切度下與得自PCR之任意標記之 人類BDlSiF编碼序列雜交（見實例1)。第二片在高迫 切度下與得自British Biotech之任意檫記之人類N G F 成熟蛋白質编碼序列雜交（見實例1)。可與任一探針雜 交之噬菌斑，未再進一步追蹤。其中含有嵌入子之所有剩 下的噬菌斑，可由無法産生/3 —半乳糖苷酶而示出，則 再做定序。於其中一個此種噬菌斑中之噬菌體，稱為 NNF — 18在寡核苷酸，NNF— 1及NNF — 3間含 有一個136bp之經擴大的DNA片段，其所指導合成 之蛋白質片段，與人類NGF有53%相同，與人類 BDNF有44%相同（圖7)。某些胺基酸同質性是針 對NGF及BDNF，而某些則是NGF或BDNF待有 的（圖7)。此NGF — 3片段大約帶有與NGF或 BDNF相同的同質性，因此二種蛋白質互相具同質性（ 圖7)。此片段之DBA序列割於圖6,其中並與NGF 及BDNF做比較。基於這些同質性，可結論道，此片段 已自指導合成神經營養性蛋白質NG F/B DNF族中一 個新成員之基因中被擴大。此新的基因及蛋白質命名為 N G F - 3 〇 B .使用猙PCR擴大之DNA夾潠殯NGF — 3之人額 基因 如上述以PCR擴大的NGF—3 DNA片段，於 甲 4 (210X297公釐）80. 5. 20,000張（H) -86 - A b B 6 五、發明説明（85 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 32P — d C T P存在下藉著進行P c R擴大作用而放射標 記之，並用於 AF IX ϋ 中（StratageneCat. No. 9 46203)篩選一値人類基因體庫。藉重覆選殖，自 1. 2X10β個噬菌斑中純化出6個陽性純糸。來自其 中一値陽性純条之DNA,利用限制酶H i mC I所得之 部份水解物再繼代選殖至載體Ml 3中。可與經放射標記 之PCR片段雜交的許多Ml 3繼代純条，依據實例1£_ 所述步驟，進行二個方向之定序，以獲得人類NGF—3 完全的核酸（圖6)及所推衍之胺基酸（圖7)序列。 C .成熟的人類NG F — 3於太腸捏蘭中之表現 以上文實例4 £_獲得的人類成熟NGF — 3基因，嵌 入大腸桿菌表現載體中，此載體再引入大腸桿菌宿主細胞 ,並依上文實例2所述之步驟，以NGF—3基因取代 NGF基因，完成基因産生成熟BDNF之表現。經重組 地表現之蛋白質，再依上述實例3屋_所述步驟，以再折叠 使具生物活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 以上之說明及實例用以描述本發明及其較佳之具體實 例。此處所述方法的許多變化，對於一般精於此技藝人士 而言是十分明白的，且在下文之申請專利範圍之内。 甲 4 (210X297公釐）80_ 5. 20,000¾ (H) -87 -

Claims (1)

1. 2062&8 Α7 Β7 C7 D7 绶瀆部中央«準局S工消費合作社印《 公 α 本 Ρ舍件也嗜笋利範圍 L__ 第80102624號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國82年4月呈 1. 一種再折疊及復性選自NGF、 BDNF和 NGF—3神經營養性蛋白質的方法，其中蛋白質實質上 獲得完全的生物活性，此方法包括： 製造反應介質，使該神經營養性蛋白質可呈各種3度 空間構型及分子内雙硫鍵結型式，其中實質上所有的該蛋 白質可呈其能量上最穩定之形成；及 自該反應介質中分離該神經營養性蛋白質， 其中該反應介質由下列步驟製成： 於該神經營養性蛋白質之溶液中加入變性劑或還原劑 來瓦解所有的分子内及分子間雙硫鍵，並形成游離的硫醇 ，其中該變性劑為胍鹽酸化物或尿酸； 以含雙硫化物之化合物氧化該游離的硫醇，形成混合 的雙硫鍵，其中該雙硫化物為經氧化之穀胱甘肽，胱胺酸 或胱胺；及 於含硫醇化合物存在下稀釋該溶液，其中該含硫醇化 合物為半胱胺酸或二硫異赤絲藻醇；且反應介質保持在厭 氣條件下；且該反應介質含有聚乙二醇之試劑。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該神經營 養性蛋白質像為人類腦衍生之神經營養性因子（ B D N F ),其係由如下圖所示之核酸序列所编碼 (請先閲讀背面之注意事項再塥寫本頁) 丄 訂. - 各紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 206258 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 ATG ACC ATC CTT TTC CTT ACT ATG GTT ATT ΤΟΛ TAC TTT GGT TGC ATG AAG GCT GC^ MTILFLTMVISYFGCMKAA CCC ATG AAA GAA GCA AAC ATC CGA GGA CKX GGT GGC TTG GCC TAC CCA GGT GTG CGG PMKEANIRGQGGLAYPGVR ACC CAT GGG ACT CTG GAG AGC GTG AAT GGG CCC AAG GCA GGT TCA AGA GGC TTG ACA T H G T L E S V U G.P K A G S R G L T TCA TTG GCT GAC ACT TTC GAA CAC GTG ATA GAA GAG CTG TTG GAT GAG GAC CAG AAA S L λ ； D T F E H . V . I E - E L L D E D Q K GTT CGG CCC AAT GAA GAA AAT AAG GAC GCA GAC TTG TAC ACG TCC AGG GTG ATG VRPNEEHNKDADLYT S R V M CTC AGT AGT CAA GTG CCT TTG GAG CCT CCT CTT CTC TTT CTG CTG GAG GAA TAC AAA lssqvpleppLlflleeyk AAT TAC CTA GAT GCT GCA AAC ATG TCC ATG AGG GTC CGG CGC CAC TCT GAC CCT GCC N Y L D A A N M S.M RVR R H S D P A CGC CGA GGG GAG CTG AGC GTG TGT GAC ?vGT ATT AGT GAG TGG GTA ACG C-CG GCA GAC' rrgelsvgdsxsswvtaad AAA AAG ACT GCA GTG GAC ATG TCG GGC GGG ACG GTC ACA GTC CTT GAA AAG GTC CCT KKTAVDMSGGTVTVLEKVt GTA TCA AAA GGC CAA CTG AAG CAA TAC TTC TAC GAG ACC AAG TGC AAT CCC ATG GG' VS KGQLKQY?YETKCNPMG TAC ACA AAA ’.GAA GGC TGC AGG GGC ATA GAC AAA ACG CAT TGG AAC TCC CAG TGC CGA vt kegcrgxd':krhwnsqcr ACT ACC CAG .TCG TAC GTG CGG GCC CTT ACC ATG GAT AGC AGA AAG AGA ATT GGC TGG TTQSYVRALTKD6RKK XGW CGA TTC ATA AGG ATA GAC ACT TCT TGT GTA TGT ACA TTG ACC ATT ΑΑΛ AGG GGA AGA R F . I R I D T S CVCT L T 工 K:.RG R TAG stop ' . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨裝· 經濟部中央標準扃8工消费合作杜印製 3 ♦根據申請專利範圍第2項之方法，其中编碼人類 衍生之神經營養性因子（BDNF)之核酸序列在196 位置上以A置換G。 4.根據申請專利範圍第2項之方法，其编碼人類腦 衍生之神經營養性因子（BDNF)之核酸序列在6 6 8 位置上以A置換G。 5 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該神經營 養性蛋白質係為成熟的人類腦衍生之神經營養性因子（ BDNF)或其前軀體，其具有如下圖所示之胺基酸序列 ,va. 本紙张又度適用中國國家樣準（CNS〉甲4规格（wo X 2耵公釐） 206258 A7B7 C7 D7 六、申請專利範圍 •ATG ACC ATC CTT TTC CTT ACT ATG GTT ATT TCA TAC TTT GGT TGC ATG AAG GCT GCC Μ T I h F L T M V I S Y F G c M K A A CCC ATG AAA GAA GCA λΑΟ ATC CGA GG A CAA GGT GGC TTG GCC TAC CCA GGT GTG CGG Ρ M K E A N I R G Q G G L A Y P G V R ACC CAT GGG ACT CTG GAG AGC GTG AAT GGG CCC MG GCA GGT TCA AGA GGC TTG ACA T H G T L E 5 V U G P K A G s R G L T TCA TTC GCT GAC ACT TTC GAA CAC GTG ATA GAA GAG CTG TTG GAT GAG GAC CAG % « % S L A D T Γ £ H V I E E L L D E D Q K GTT CGG CCC AAT GAA GAA AAC AAT AAG GAC GCA GAC TTG TAC ACG TCC AGG GTG ATG V R P H E E K N K D A D h V T s R V M CTC ACT AGT CM GTG CCT TTG GAG CCT CCT CTT CTC TTT CTG CTG GAG GAA TAC ΛΛΑ L S s Q V P L E P P L L F •L L E E Y K ΧλΤ TAC CTA GAT GCT GCA λΑΟ ATG TCC ATG AGG GTC CGG CGC CAC TCT GAC CCT GCC N Y L D A A H K s H R V R R .H S D P A CGC CGA GGG GAG CTG AGO GTG TGT GAC -AGT ATT ACT CAG TGG GTA ACG GCG GCA GAC R R G E L 6 V c D B I B E W V T > D ΑΛΑ AAG ACT GCA GTG GAC ATG TCG GGC GGG ACG GTC ACA GTC CTT GAA AAG GTC CCT K K T λ V D .K s G C T V T V E X V P GTA TCA AAA GGC CAA CTG AAG CAA TAC TTC TAC GAG ACC AAG TGC ΛΑΤ CCC ATG GGT V 5 K G 0 b X Q Y 一^__ Y E T K c N P M G TAC ACA λΛΑ GAA GGC TGC AGG GGC ATA GAC ΛΑΑ AGG CAT TGG AAC TCC CAG TGC CGA Y T K K r. P V n T D K R H V w —S_- o c R ACT ACC CAG TCG TAC GTG CGG GCC CTT ACC ATG CAT AGC AGA AAG AGA ATT GGC TGG T T 9 S γ ..^Z...... R λ h T H D 8 K K R X G w CGA TTC ΛΤλ AGG λΤλ GAC ACT TCT TGT GTA "TGT ACA TTG ACC ATT AAA AGG CGA AGA n F I P I D T s c Y C T L T X K R G R TAG ， stop ' (請先閲讀背面之注意事喟再填寫本頁) 缦濟部中央摞準肩A工消費合作社印製 6 .根據申請專利範圍第5項之方法，其中成熟的人 類腦衍生之神經營養性因子（B D N F )或其前軀體之位 於第6 6號胺基酸處以甲硫胺酸置換纈胺酸。 7 ·根據申請專利範圍第5項之方法，其中成熟的人 類腦衍生之神經營養性因子（B 〇 N F )或其前軀體之位 於第2 2 3號胺基酸處以賴胺酸置換精胺酸。 8 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該神經營 養性蛋白質係為人類成熟NGF - 3，其偽由如下圔所示 之核酸序列所編碼 夂紙張尺度適用中固國家標準甲4規格（210 X 297公坌） 206258 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 bdnf ATG CATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGA ngf-3 ATGTCCATCTTGTTTTATGTGATATTTCTCGCTTATCTCCGTGGCATCCAAGGTAACAACATGGATCA r.gr ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGA AGCAAACATCCGAGGAOJ^GGT------GGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGG---ACC------CATGGGACTCT >^GGAGTTTGCCAGAAGACTCGCTCAATTCCCTCATTATTAAGCTGATCCAGGCAGATATTTTGAAAAACAAGCT GAGCAATGTCCCTGCA---GGA---CAC------ACCATCCCCCAAGTCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCT GGAGAGC------GTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCG.^ACACGT CTCCAAGCAGATGGTGGACGTTAAGGAAAATTACCAGAGCACCCTGCCCAAAGCTGAGGCTCCCCGAGAGCCGGA TGAC------ACTGCC CTTCGCAGAGCC ——CGCAGCGCC ——CCG---GCAGCGGCGATAGCTGCACGCGT GATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGAC ——CAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAAC------AATAAGGACGCAGA GCGGGGAGGGCCCGCCAAGTCAGCATTCCAGCCAGTGATTGCAATGGACACCGAACTGCTGCGACAACAGAGACG GGCGGGG——CAGACCCGC ——AACATT---ACTGTG---------GACCCCAGGCTGTTT——AAAAAGCGGCG CTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATA CTACAACTCACCGCGGGTCCTGCTGAGCGACAGCACCCCCTTGGAGCCCCCGCCCTTGTATCTCATGGAGGATTA ACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAGGATCTGGACTTCGA CAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGC------CACTCTGACCCTGCCCGCCGAGG CGTGGGCAGCCCCGTGGTGGCGAACAGAACATCACGGCGGAAACGG---TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGG GGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCCCATCTTCCACAGGGG GGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGG GGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGGGTGACC------GACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGG CGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGG------GATAAGACCACCGCCACAGACATCAAGGG CGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTG ACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAGATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAACAATATTTTTATGAAACGCGATG CAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAGTG CAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTAC taaggaagccaggccggtcaaaaacggttgcaggggtattgatgataaacactggaactctcagtgcaaaacatc trCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGAC CCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAGAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTC CCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGGTGGATACGGATAGACACGTC TCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGC---AAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGC TTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG bdnf CTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGXAGAACATGA ngf-3 CTGTGTGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA ngf (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局0工消费合作社印*''农 9 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該神經營 養性蛋白質俗為人類成熟之NGF—3或其前軀體，具有 如下圖所示之胺基酸序列中底下割線者； 本纸張又度適用中國國家標準（CN’S)甲4規格（2i0 X 297公釐） 4 206258 A7B7C7D7 六、申請專利範圍 bcnf ngf-3 nci LiL I G s J 1 N Η tLf G s G Q D 1 G E λ R p°夂 ILV H s N A R s E Q E K D s WQM H ? N ? A N E aca K Qoi MIX c Gc G R X .L^ X Y F s ΔΔ ILT V F 1 MIL T V T L y vs £££ iLL-I I M T s c-wawaw H ? R EE A F κ λ T ? I D Avn λ z λ L A Λ s K » T ? p ll - G T A K s s s QR G Y .-λ N λ K E R p K R G V L ND -vlv A -MT -Q -s K -s s D PTMTM TKS G Η H Η X Q ILL -X K T D T -Aw R QH vlv G L Q PK ? Y I T< Q s Q s D T s s LL FML L VIVIVI BBS s p £ T s s V Η H LyL DRE λ R B D QK K QK NRI ilf ILL· N E R E T p KD β N M -p A -_K I -V5VI KPT QQ -1FI dan E s ID K K L A T L p Q r-G -Γ- G s X β λ V E V BBB R K K V K s EBB M sw: s τ Ϊ MRS HHH toA F A V p D V A p A V s G H G £ K V V-ϊγ E E D F E E D L H L LL D F Y Q rML· T L p D 2P A £p λ 2 E s LL R CMEiM VI T 0 s s H D Y λ- T X E β λ λ τ V V Ε 8 1 6_ .β ΓΟΊ VI β L Ει -雜 Η 〇 D A ^ P g -Y A s Η K S Kg G S Ts K P I fTT^ χνχ,ΣκνΡνεχ (請先閲讀背面之注意事項再增寫本頁) E Ϊ § Y gTg g."TT L V V"^STifJ i & v~.w v g 15$ S6&ICIR5HQVTYif<3EIXTGNΰΤ T τΤ^^ΙΓΰ X X s K~£ Y H V ί s ^ΓΤΤΓν E g I B x R a Η H£ Ω fcl δ 6 £ X Μ£ί^ p ^ p-8 filg ΰ a I b~itx ΪΊΓΐβ S £ T0TF1 ΤΤΊ Έ^5™ΧΠξϊ33ΖΗ3"S^rfS： ^ 2 ^ri\ s X u H -2 μ D S Τΐ X R I g 式一 4 厂3 士—^t-亡-----—~>·iiv « -r·rf ft y τ x> *t rs ^ mrxr 2 T L Τ X .S - R λ 公 a κ S~ V i δ E iT a G B'.~<ΓΤτ. ·Τ^ΤΓ Λ 經濟部t央標準局員工消费合作社印製 1〇.根據申請 ，其中該神經營養性 之具生物非活性之型 11.—種方法 人類成熟N G F ,其 包括： 將由大腸桿菌中 鈉，p Η 約 3 . ◦， 0. 6毫克/毫升之 提高該溶液之Ρ ρ Η約8 . 5，含有 還原該N G F , 專利範圍第1至9項中任一項之方法 蛋白質係由大腸桿菌表現糸統所産生 式。 ,用以折昼於大腸桿菌中重組表現之 中的蛋白質可獲得生物活性，此方法 表現之NG F溶解於2 OmM檸樣酸 含8莫耳濃度尿素中，至約 濃度； Η值，俗加入1 Μ T r i s溶液， 8莫耳濃度尿素； 係加入二硫異赤絲藻醇使濃度至約 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 x 297公釐） A7 B7 C7 D7 206258 ί % W f 氣化該NGF,俗加入經氣化之穀胱甘肽或胱胺酸至 約15—50mM濃度； 將該NGF溶液稀釋約9倍，利用l〇〇mM NaHP〇4 ，ρΗ 約 8.〇，含約 3. 2 — 4. 2Μ 尿 素之溶液； 催化該N G F之雙硫化物互換，偽加入相對於穀胱甘 肽或胱胺酸濃度之約2至3倍的半胱胺酸；及 自該反應混合物中分離NG F 〇 1 2.根據申請專利範圍第1 1項之方法，其中該人 類成熟N G F具有如下所不之胺基酸序列： (請先閲讀背面之注意事項再蜞寫本頁) bdnf ngf-3 ngf LL | G S --N Η LI G s G QDI G E A Η p £·· I L V s·....;*·- H s H λ R 5 • r . E QE K D s MMH p N p A N E A G A K QQ MIX c o Q GRI F Lh Y-y Γ s ΔΛ ILT V Γ I MIL T VT L y X ££I L-LL- II M Ts£ wo wo MM HP R £Ελ FRA τ p I D ΑΔ λ E λ LAA SK t TP p LL -G T A R s s QK CY -λΗ λ κε H PK K G V L ND -yv A -Η T -Q -SK ^ BSD T K s GM H HK Q -LL--X K TD T -Aw R QH V I V G L Q PK p γ X X AIT Qs Q s D T LL F HLL v-yy EBE s p £ TS& Y K R LYa DRB λκΒ· D QK K QK Η K --L F -p L HER E T p £ D D* HK -p λ IRI -yv-y K p T Qo - * F X D AH ESI D K R L A T L p Q EGI E G Oi IRA V B V ΒβΒ K K K V R s BBB M s H ST1 MR B HHH λΑ F λ V p D V A Lp λ Ϋ s G N G fi KVY HYE ED F £ED lhl LL D F Y Q LaT L p D £p λ £p Λ £££ LL R £££ £ V M V fi £ £l s T 2YX KKM a HflDPXRRG - Y λ £ Η κ S κ η G S β Β Η Ρ I F Κ β G X Ϊ h ε κ V Ρ V 6 Κ i u T λ» T.XT £ ΡΟΐ^ΚΩϊΣϊΕτχΓζ flHPXOYTiESli ilESICKRUHlifiS s]n I T Q jiPV^Q^rVEIRc 'κ·ΕλΚ1»νΛΚ'ίΓί Γ ϋ Si A if U—Ν fl Κ ti i[飞Γ id Κ Ϊ b Q ί ^ i Q I Ζ F £ I Κ £ r-R-D_P'>, JE ϊ 〇 Β fl 5 T aj T H *8^YBXLTKDSRi C R ι <3 Η Β y I Ε I β I fifi ;ίϊ Γί ϊ]τ t Τ Ϊ JS R C E > Τ^ΤΤΓΛ ALTflBNNKL· V 〇 Κ ^ Κ i Β.1 ϋ X » 2 乂 i t A > w κ 五丄 l·· * 《 [VL'fiEJSAVBKA . 經濟部中央標準局典工消費合作社印製 13.—種方法，用以折叠由細菌表現糸統中重組表 現之人類成熟NGF,其中的蛋白質可獲得生物活性，此 方法包括： 加二硫異赤絲藻醇或/3 —魏基乙醇至含該細菌性表現 冬紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A7 B7 六、申請專利範圍 之N G F溶液中； 加經氧化之穀胱甘肽或胱胺至該溶液中； 以含有含甘醇試劑之缓衝溶液稀釋該溶液，該含甘醇 試劑係選自聚乙二醇、乙二醇、甘油或丙二醇所組成之類 群，其中甘醇濃度介於15%— 25%之間，較佳為15 % ； 加半胱胺酸或2 —颡基乙胺以生成最終之再折叠混合 物； 將該最終再折®混合物除去空氣；及 自該最終再折昼混合物中分離NG F。 1 4 .根據申請專利範圍第1 3項之方法，其中該人 類成熟N G F具有如下所示之胺基酸序列： (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 裝_ -V5 . bdnfngf-3 ngf LL I G s - -N H I L I G s c Q p -gea· Rp'.£ I L V *.··.*···· N s N • A R s EQE K D s MM H p N p A K E A G A K QQ Mil c G s G R I F L L xy F s △厶 IL T V F I MIL T V T L Y1 ΣΠ L-LL-I I M T s s Mu MM MM K p R ££ A FRA τ p I D ΑΔ ASA L A Δ SKI Tpp LLI G T A R s s s QR G Yi AHA KER PKH c V L H D -y V A -Μ T *ol-SKI BSD LTVL T K s G Η H HK Q -L L" II K T D T -Aw R QK VI V G L Q p K p γ I z AIT Qs Q s D T s-ss- LL F ML L V5y bbb s p £ Ts s Y w R L V L D R B A.R B DQK K QK NR - ILF ILL N E R ETP £ D β NM -p A -R I -yyy KPT QQ -· lFI dan ESI D K R L A T L p Q EG1 E G s IRA V E V 經濟部中央摞準局員工消费合作社印踅 R- H- F I p H 8 8 I-J BEER K K . V R s EBB M s H s T H HR B HUH &A F A V p D V A L p A Y s GN G s K V Y ϊγ E E D F MED L M L rML D F Ϊ Q L-L T L p D £p λ p p A EEE llr EE£ I Y- Rl 1 H s K H H L 互 V s β 互 I fi E H 2 I A A L K T 厶 V p H s Q o τ· v r, y, K V P V R K E1 V V C Β 旦 t g L K V ΐ — • k L· A 丄 丄 K a u Q Ί1 v G K Ϊ K G N t F δ ΐ ΐ 旦 V fi V H 5 a _ ·· L· X1 1丄丨· Δ ΐ Ιΐ X X k Λ k \ ir Y It y 妇 V K ϊ N Q Q h h V κ Q Λ X V ζ X γ Z V X Ψ K R rs1 r H γ P K λ σ K Y P T V £ E H a π <2] Π E ΤΓ S u λ Ώ, K Λ K H u s. Q D n T T Q 巨 V ir' Δ 1S y Q X Λ £ 7 H L· JL I K R D P N JE X D s a £ c. ti U ϋ k U ϊ 4 K ΐτ Ϊ T H B y Y Λ l T K D e R f R X Q H E P I E 1 ϊ 8. Ϊ [si T V V K h L T & E N H JK h V Q k U JL L· λ ϋ y 1 Γ y K L· h I il Γ) - £ 0 λ 人 a ϋ l1 Jt B 丄 ϋ ϋ! 入 w y <? ? Ii Τ Ϊ £ R G B ·.. 'ΠΓ1ΠΓΈ~^Γ1Π^ a 張紙本 a公 / y X 10 2 c格規 4 甲 \y s Nc yc準標家 西 國 中 用適 /