TW206234B

TW206234B -

Info

Publication number: TW206234B
Application number: TW079105968A
Authority: TW
Inventors: Robert C Thompson; Rebecca W Vanderslice
Original assignee: Synergen Inc
Priority date: 1989-07-18
Filing date: 1990-07-18
Publication date: 1993-05-21
Also published as: IE902608A1; DE69031997T2; KR100230156B1; NO306728B3; US6541620B1; DK0422339T3; IL95031A; ES2116970T3; SG55131A1; EP0790306A3; NO903192D0; NO903192L; AU647397B2; CA2021369A1; NZ234499A; AU5897690A; HK1014539A1; FI114398B; EP0422339A1; PL286089A1

Description

〇δ:34 A6 B6 五、發明説明（1 ) 相關由請案的交叉參考本案為共有的申請案07/479，66 1 (公告於 1 9 9 0年2月7日）之部份缠篇，其依序為申請案〇 7 /381，080 (公告於1989年7月18日）及申請案07/450，329 (公告於1989年12月1 1曰）之部份績篇。經濟部中央橾準局印製發明背景腫瘤壞死因子為一類蛋白質，由許多細胞型式所産製。先前至少已有兩種TNF s被描述，特稱為TNF α及 TNF^S (淋巴毒素）。這些已知的TNF s在涉及發炎反應的許多不同標的細胞上具有重要的生理作用。這些蛋白質可使纖維母細胞及滑液細胞分泌涫在的膠原酶及前列腺素E 2，且使骨胚細胞進行骨質再吸牧。這些蛋白質可增加内皮細胞對嚙中性球之表面粘著特性。其也可使内皮細胞分泌凝血劑活性，且減低其溶解凝塊之能力。此外，其藉著抑制酵素脂蛋白脂肪酶表現而指玄麗細胞自脂屋貯存處出來◊ T N F s可使肝細胞合成一類蛋白質，稱為'、急性期反應物"，且以熱原型式作用於下視丘。經由這些活性可知，TNF S在有機體面對壓力，感.染及傷害下的反應上扮演重要的角色。如見以下文獻：P . J. Selby et al.，Lancet, Feb， 2 7’ 1 9 8 8 ， p 4 8 3 ; Η· F. Starnes， Jr· e t al·， J Clin， Invest 8 2 ·· 1 3 2 1 (1 9 8 8) (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) -装. •打. •線· 甲 4(210X297公角） —3 - £06284 A6 B6 五、發明説明（2 ) ；A. 01 iff et al . Cel 1 . 5 0 ( 1 9 8 7 ) ； R A. Wa- age et al . Larcet* Feb» 14^1987^P355 (請先聞讀背面之注意事項再蜞寫本页)

O 然而，除了其正常有益的作用之外，由循環已嚴出J NFS的作用是有害的。如，將TNFa注入動物體内可造成敗血體克症狀;將細菌或細菌細胞壁注入後，可觀察到内源性TNF水平的增加。TNF s也可造成腸壞死及急性肺傷害，且其可刺激肌肉蛋白質之分解代謝。此外， TNF s增加關節中膠原蛋白酶水平，及指令白血球淋巴細胞之化學趨性及移動，也可說明是此疫病中膠原降解及滑液組織增殖之原因。因此，TNF s於風濕性關節炎中可做為免疫病理急性及慢性階段之調3'物。TNF s經由改變内*皮細胞功能，造成凝血方面某些失調症。1者，已璦知在某些A I D S病人體内TNF有過量産製，且可能是見於此疫及白血病之發熱，急性反應及思病質之原因所 ΙΊ 在0 在TNF具有害作用的這些及其他狀況，可清楚明白 TNF作用抑制劑之臨床用途。於金身性投藥時，TNF 抑劑劑可為拮抗敗血性休克及惡病質之有用治療劑。局部應用時，此種TNF抑制劑可於發光關節及其他他發光位置中預防組織之破壞。確實，此種T N F抑制劑當與間白素-I (IL-1)抑制劑聯合投藥時更為有效。對於治療性介入以拮抗TNF作用的一個可能性在於標的細胞對蛋白質反應之層次上。TNF似乎是經由典型甲 4 (210X297公衮） 206334 A 6 B6 五、發明説明（3) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的受體調介路徑而作用於細胞。因此，任何分子只要是干擾T N F與其受體結合的能力，不論是阻斷受體抑或是担斷TNF均可調控TNF的作用。基於這些理由，可以此方式抑制T N F的蛋白質及小分子均為本發明者研究尋求發明要點如上所述，本發明大體上是有關T N F抑制劑，且更特別地是有關由尿液衍生的T N F抑制劑。此外，本發明是有關此抑制劑之生物活性類似物。本發明的一値主題是提出經純化的T N F抑制劑，其可有效地拮抗TNFa。本發明另一個$是堤』星純型连蓋凰思反狭定甚:胲蓋酸廒列。再一主題是提出某些TN F抑制劑的胺基酸序列。此外提出可指導合成T N F抑制劑之m R N A細胞來源，及含有此抑制劑c D N A之c DNA庫。再者，本發明一個主題是提出可指導合成TNF抑制劑的DNA基因體純糸，及該DNA之编碼序列。鑑定此種TNF抑制劑之生物活性類似物，其具有加強的或相當的特性，此也是本發明的一個主題。經濟部中央橾準局印裝此外，本發明的一値主題是提出一個重組體DNA糸統，用以産製此處所述的TN F抑制劑。再一主題包括提出經純化的TNF抑制劑，在當做藥學製劑呈現拮抗TN F活性上具有價值。另一主題包括提出經純化的TNF抑甲 4(210X 297 公沒） _ 5 一 A6 B6 206234 五、發明說明（4 ) (請先閱碛背面之注意事項再填寫本頁) 制劑及I L - 1抑制劑之組合，其當做藥學製劑呈現拮抗 TNF及IL—1活性上具有價值。本發明者已分離出至少二種具T N F抑制恃性的T N F抑制劑蛋白質。可得呈純化型式的3 0 kDa及4 0 k Da。已得3 0 kDa TNF抑制劑蛋白質之胺基酸序列。也已得4 0 kDa TNF抑制劑蛋白質的胺基酸序列資料。二者均為新穎的且免前未被描述的蛋白質。已得一種人類基因體純条，含有可指導合成3 0 kD a蛋白質之基因◊此蛋白質之細胞來源已鑑知，且已得c DNA純糸，並決定出蛋白質基因之核酸序列。此外，己將基因純条置載體中，且可見其於宿主細胞中可表現該蛋白質，同時也發展出純化蛋白質使呈活性型式之方法。已鑑定出可産生4 0 kDa蛋白質之細胞來源，並得到一個cDNA純糸，且決定該4 0 kDa蛋白質基因之核酸序列。可指導合成3 0 k D a T N F抑制劑前軀體及4 0 kDa TNF抑制劑前軀體之完整cDNA純糸已於哺乳動物細胞中表現，以使細胞表面TNF結合位置增加。可指型丄ϋ. . 〇. L蛋1質的蓋里Β较六- 桿菌中表現。指導合成所有的或〜銀1姐成熟4 J .. k D a蛋 — —— 雉濟部中央揉準局印製自質的三値分離的基.因己:於太腸提嚴▲表現。此三個4 0 kDa抑制劑蛋白質可表現：成熟型4 0 kDa TNF 抑制劑，4〇kDa TNF抑制劑Λ5 1及4 1 kDa TNF抑制劑Λ5 3，各自可呈現TNF抑制活性。成甲 4(210X 297 公簷） -6 - 206234 A6 ___B6_ 五、發明説明（5 ) 熟型4 0 k D a T N F抑制劑（係分離自以人類U 9 3 7細胞調適的培養基），及4 0 k D a T N F抑制劑5 1及40kDa TNF抑制劑53，總稱為40kDa T N F抑制劑。 3 〇 k D a TNF抑制劑已於抑制TNFa上顯出活性。4 0 kDa TNF抑制劑則對TNFa及TNF 々均顯現抑制作用。’ 目前己可進行大規模産製，俗經由重組體D N A技術而産製這些T N F抑制劑。這些抑制劑應適用於藥學調和物，而應用於治療由於TNF所調介的病理狀況。附圖簡要說明圖1描述TNF的細毒性分析，條於TNF抑制劑（ 30kDa)不存在（―-)或存在下（―X — X —)進行。在TNF抑制劑（3 0 kDa)存在或不存在下與各種濃度的T N F共置，再依實例1所述進行胞毒性分析。圖2描述天然凝膠移動分析，其中'' a 〃表示單獨T NF，'' b "表示 TNF + TNF 抑制劑（3 0kDa) Ο 經濟部中央搮準局印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖3描述TNF抑制劑（30kDa)之ConA — 過氣化酶染色。約2 0 0.毫微克的各種蛋白質於1 4%S D S - PAGE上進行，再移轉至硝化纖維濾紙。利用C ο nA -過氣化酶染色鑑定糖蛋白。在此圖中，'' a 〃表示分子量標記，'' b 〃表示卵蛋白，'' c 〃表示牛血清白甲 4(210X 297公沒） -7 - 經濟部中央搮準局印製 206234 A6 B6 五、發明説明（6 ) 蛋白，及〃表示TNF抑制劑（3 0kDa)。圖4描述TNF抑制劑（3 0kDa)之化學脱糖基化作用，約2 0 0亮徹克的TNF抑制劑（3 0 kDa) 如實例1般化學脱糖基化處理（C列）。圖5描述TNF抑制劑（3 0kDa)的N -聚_酶處理。經純化的TNF抑制劑（30kDa) WBolton-H u n t e r試劑碘化，且經變性-确化的T N F抑制劑（3 0 k D a )再以N _聚醏酶在3 7 °C下處理6小時。於此圖中，'、a 〃表示天然的T N F抑制劑（3 0 k D a )，且'、b 〃表示經脱糖基的T N F抑制劑（3 0 k D a )。圖6人描述20升尿液經〇瓦人£ Sepharose C L -6B層析後，OD 2S。圖型。、圖6 B描述相當的天然凝膠移動分析之放射自顯圖，顥示在5 7-6 3流份處有TNF抑制劑（3 0 kDa) 峰，此處約為80taM Naci。圖7描述自TNF親和力管柱以〇. 〇5礎酸鈉p H2. 5溶離之OD28。圔型。圖8 A及8 C描述TNF抑制劑經RP 8純化之層析剖析圖（OD2u及OD2S。）加上RP8管柱流份之1 9 2 9生物檢定法，顯示在2 8 - 3 1流份處（相當於約8 %乙睛）有TNF抑制劑.（30kDa)峰，及在35- 3 6流份處（相當於約2 1%乙腈）也有峰。圖8B描述RP8匯集物1 5%SDS— PAGE之銀染色圖，示出在3 0 k D a處有單一的帶。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. .訂· -綠· 甲 4(210X 297公尨） -8 - A 6 B6 206£34 五、發明説明（7 ) {請先聞讀背面之注竞事項再填寫本頁) 圖9A描述TNF抑制劑（30kDa) Lys - C 水解後之肽純化分析。圖9B描述TNF抑制劑（3 0kDa)烷化 4 L y s - C水解物之肽純化分析。圖1 〇描述T N F抑制劑（3 0 k D a )二値烷化（ ” ASP-N水解物之肽純化分析。圖11A及11B描述經還原且羧甲基化TNF抑制劑（3 0 kDa)肽鐽内切酶V8水解物之肽純化分析。圖1 2描述TNF抑制劑（3 0 kDa)之胺基酸序列。序列中空白處表示尚未以蛋白質定序法明確鑑定之殘基。C"表示藉殘基中之3H確定羧甲基化半胱胺酸。圖13描述基因體純条之DNA序列，可编碼至少一部份的TNF抑制劑（30kDa)。圖1 4描述較佳TNF抑制劑至少7 0%的成熟胺基酸序列。圖1 5描述於凝膠移動分析中偵測U 9 3 7上清液中之T N F抑制劑。圖1 6描述於U9 3 7上清液HPLC流份中偵測T N F抑制劑。圖1 7描述依據實例4之Northerw吸漬。_ 經濟部中央搮準局印裝

圖1 8描述可與TN.F結合的脫糖基化TNF抑制劑 (3 0 kDa) ◊經糖基化及脱糖基化之TNF抑制劑與 TNF親和力凝膠共置，流過之物質與凝膠之溶離物再於 SDS — PAGE上分析。在此圖中，（11)表示TN 甲 4(210X297 公簷） ~ 9 - A6 B6 206234 五、發明説明（8 ) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) F-INH (還原及氧化的）之流過物質，（21)表示脱糖基化TNF-INH (還原及氣化的）之流過物質， (5 1)表示天然TNF - INH之流過物質，（2 2) 表示脱糖基化TNF-INH (還原及氧化的）溶離物，及（5 2)表示天然TNF— INH之溶離物。圖1 9描述3 0 kDa TNF抑制劑完金的胺基酸序列。圖2 0描述编碼示於圖1 9胺基酸序列之cDNA序列。圖2 1描述指導合成3 0 kDa TNF抑制劑前軀體之完整cDNA序列。圖2 2描述質體PTNFIV-I中靠近TNF抑制劑（3 0 kDa)基因起點處之DNA序列。圖23描述質體 PCMVXV β TNFBPst op A °

圖 2 4描述質髏pSVXVTNFBP s t o p A o 圖25描述大腸捍菌中30kDa TNF抑制劑經過RP8管柱後OD2 1 5之層析剖析圖，也示出L9 2 9生物檢定結果（ — X — X)。經濟部中央揉準局印裝圖2 6描述圖2 5中.RP8流份經1 4%SDS-P A G E銀染色圖。圖2 7描述U9 3 7細胞中，TNF抑制劑經RP8 純化後〇D2i5之層析剖析圖。以横條圔也示出L 9 2 9 甲 4(210X297 公楚）一 10 — A6 B6 206334 五、發明説明（9 ) 生物檢定結果。可看出二個有差別的T N F抑制劑峰。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖2 8描述RP8流份經1 4%SDS — PAGE後之銀染色圔。第3 0號流份含3 0 kDa TNF抑制劑，3 5號流份含4 0 k D a T N F抑制劑。圖2 9描述尿中4 0 kDa TNF抑制劑純化後Ο 層析剖析圖。數次RP 8層析後的二個TNF抑制性峰混合，於RP 8管柱上再分> 析。以條圖示出TNF抑制活性。0 D 2 〃峰及活性峰間之差異反應出偵測器及流份收集器間之死體積。圖3 0描述尿RP8流份經1 4%SDS-PAGE 之銀染色圖。第3 2號流份含有4 0 kDa TNF抑制劑。圖3 1描述由U9 3 7衍生之抑制劑（3 0 kDa及 4 0 k D a )，及由尿衍生之40kDa TNF抑制劑之胺基末端序列。圖3 2描述4 0 kDa TNF抑制劑經肽鏈内切酶 V8水解後之肽純化分析。圖33描述40kDa TNF抑制劑經肽鏈内切酶 A r g - c水解後之肽純化分析。經濟部中央搮準局印製圖34描述Arg- (16肽經胰蛋白酶水解後之肽純化分析。 - 圖3 5描述Ar g - （1 0肽經胰凝乳蛋白酶水解後之肽純化分析。圖3 6描述4 0 kDa TI^F抑制劑之一级結構。 1 甲 4(210X297公寿） -11 - f206234 A6 B6 經濟部中央橾準局印製 •δ·、發明説明（l〇圖3 7描述部份的4 0 k D a T N F抑制劑c D N A序列，加上所預測之胺基酸轉譯産物。、/圖3 8描述4 0 1?;〇3 TNF抑制劑之完全胺基酸序列。圖3 9描述指導合成4 0 kDa TNF抑制劑前軀體之完全c D N A序列，加上所推衍出之轉譯産物。圖4 0描述TNF 6 (淋巴毒素）之胞毒性分析’ 像在40kDa TNF抑制劑下（0_〇)，或30k Da T N F抑制劑下（〇 - 〇 )，或無任何抑制劑下（ X - X ) 〇圖41示出於圖21之30kDa TNF抑制劑c DNA序列於COS 7細胞中之表現。質體利用Fergner et al 的脂感步驟（Proc. Natl· Acad，Sci.ii s A 84，7413 - 1987)轉慼於 cos 細胞。3. 4 XI 〇5個細胞與所指示劑量下之〔2251〕TNF a比活性為5 . 6 X 1 〇\4c pm毫微克）共培育，並決定結合至細胞之量。空心符號為經4 °C下培育4小時後和細胞相聯合之總c p m ◊實心符號代表在1 8 0倍過多置冷的未標記TNFa存在下，結合有〔 1 25 I〕之 T N F a。圖4 2描述圖3 9所示之4 0 kDa TNF抑制劑 cDNA序列於COS 7中之表現。分析條件如圖4 1所述。加得之符號表示在1 8 0倍過多量冷的未標記τ N F a存在下，結合有〔i25I〕之TNFa。 (請先閱颉背面之注意事項再填寫本頁) 裝. •訂· •綠· 甲 4(210X297公簷） -12 - 公〇6234 a6 B6 五、發明説明（ll) f請先聞靖背面之注意事項再填寫本頁) •装. .訂. -線· 圖4 3描述人類單核細胞HPLC RPC— 8流份之胞毒性分析，其係經PMA及PHA處理2 4小時。圖44描述40kDa TNF抑制劑Δ5 1之RP C_8層析型式，（B)流份之SDS-聚丙烯醯胺凝膠分析，及於L 9 2 9細胞上之胞毒分析（C) 〇圖45描述和40kDa TNF抑制劑Δ53之R PC-8層析型式，（B)流份之SDS-聚丙烯醯胺凝膠分析，及（C)於L9 2 9細胞上之胞毒分析。較佯具體啻例之説明對於本發明目前較佳之具體實例，將詳細參考説明，其加上以下的實例用以解釋本發明的原則。 1 .抑制商丨自尿中分離如上所示，本發明是有關TNF抑制劑，其已呈純型式被分離。於本發明一個具體實例中，抑„制劑最好_ 七尿/此外，本發明包括大體上純的^ ^ ^ ^ ^ T / NF抑制劑，只要與分離自尿液之抑制劑生物上相當。在 \本案前後文中，任何論及TNF抑制劑或單純的抑制劑應丨該認為是指此處所鑑定及描述的每一抑制劑。 | 所諝''生物上相當的，在本案前後文及申請專利範圍中，我們係指本發明的組成物，其可以相似的方式預防τ \N F作用，但未必要與分離自尿液的天然T N F抑制劑相同的程度^所謂''大體上同源的〃在本說明書全文及申請甲 4(210X297 公发） -13 — A 6 B6 206234 五、發明說明（12) (請先閲碛背面之注意事邛再填寫本頁) 專利範圍中意指與分離自尿液之天然T N F抑制劑同源的程度，較先前所報告的任何TNF抑制劑均高。較好是同源的程度遐，特好是超過8 0%，甚至超過9 0 %，9 5 %或9 9 %。特佳之T N F抑制劑為與天然抑制劑之同源性超過9 5 %以上者。此處所描述的同源性百分率，其計算是二序列中較短者所見之胺基酸殘基百分率，其與序列中相同的胺基酸殘基排列，且比較時可引入1 0 〇個胺基酸長的空隙4個以輔助此排列，如Day ho ff於 Atlas of Protein Sequence and Structure ， V o 1 . 5，d. 124 (1972)中所描述，國立生化研究基金會，華盛頓特區，此書特別列為本案參考用。包括在大體上同源的還有所分離的TNF抗髏實質上可與欲求抑制劑之抗體交叉反應，或是其基因可經由欲求抑制劑之基因或片段潍化而得者。經濟部中央橾準局印製本發明的較佳TNF抑制劑已衍生自尿液，且首次以纯型式分離。在本案目的下，''純型式"或 '' 純化型式〃當使用時是指此處所掲示的T N F抑制劑，應指製劑其大體上不含其他非TN F抑制劑蛋白質的其他蛋白質。最好，本發明的TNF抑制劑至少5 0%純度，較好是7 5% ，更好是8 0%，9 5%或9 9%純度。於本發明一値具體實施中，TNF抑制劑.蛋白質製劑夠純，以致精於此技藝人士可在勿須進一步純化下決定其胺基酸序列。以實例中所示的方法已分離出至少二種T N F抑制劑。此二種抑制劑在SDS-PAGE上約3 O kDa及約甲 4(210X297 公爱） -14 - 206234 A6 ___ B6 五、發明説明（13) 40KPA分子。30kDa抑制劑自DEAE C L b B管柱溶離，於約80毫莫耳濃度NaC5/Tr i s缓衝液，pH7 . 5。3 0 kDa抑制劑的胺基酸序列示於圖1 9，4 0 kDa抑制劑的胺基酸序列示於圖3 8。3 〇 k D a TNF抑制劑已示出可抑制TNFa的活性，但對TNFA活性則作用很少。4 0 kDa TNF抑制劑已示出對TNFa及TNF0 (淋巴毒素）顯著的抑制作用。 2 .抑制劑分離自U9 3 7諏滴培泰基於本發明另一具體實例，TNF抑制劑分離自由人類 U 9 3 7細胞調適的培養基。已鑑定出二個TNF抑制劑蛋白質，並自此調適培養基中分離。此二値T N F抑制劑為3 0 kDa及4 0 kDa蛋白質，其在大體上和分離自尿中30_kDa及4 0 kDa T N F抑制劑同源，且與 .此種蛋白質屬生物上相當的。 3 . 3 0 k D a TNF抑制割的結樣經濟部中央搮準局印裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 分離自尿液的3 0 kDa TNF抑制劑是一種糖蛋白質，含至少一個碩水化合物部份。於本發明一個具體實例，天然的3 0 kDa .TNF抑制劑係脱糖基化。此脱糖基化的TNF抑制劑，仍保有其與TNF結合的活性，也包括在本發明範圍之内。完全及部份脱糖基化的3 0 k Da TNF抑制劑也涵蓋在本發明中。分離自尿液之脱甲 4(210X297 公发）一 15 — A6 B6 206234 五、發明説明（14) 糖基化3 0 kDa TNF抑制劑約為1 8 kDa蛋白質〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 可编碼3 0 kDa蛋白質且經鑑定的基因序列不含有終結密碼子，如1 8 kDa蛋白質胺基酸序列所預期的。本發明者創立理論，但不被此理論限制，即於活體内産生的蛋白質含有額外的胺基酸序列丨比理_，所迫碼^ 蛋白質為T N F受體分子。由c DNA编碼的抑制劑蛋白質具有疏水性序列，其適合細胞膜展延區，及具有TNF 結合部份可自細胞膜向外伸展。依據此假說及實例19所述，cDNA已於COS細胞上表現，並造成細胞上TN F結合位置數目的增加。因此本發明的抑制劑為受體片段或部份受體分子。此結合片段關於其他結合/抑制分子（如IL-2抑制劑）已被鑑定，並被稱為可溶性受體。此理論符合核苔酸序列中缺乏终结密碼子，其相當於蛋白質末端如同經分離TNF抑制劑分子所預期的已知序列。此也符合一値事實，即在可見的終結密碼子上方之核苷酸序列编碼一条列疏水性胺基酸。 ¥因此，本發明所涵蓋的不只是所鑑定及所述的部份T NF抑制剤，而是包括所有蛋白質只要含有由此所鑑定及描述之c DNA序列所编碼的任一部份胺基酸序列經濟部中央揉準局印製 4 . 4 0 k D a TNF抑制割夕結構 40kDa TNF抑制劑分離自由人類U937細胞所調適之培養基中，且經於尿係一種糖蛋白，含甲 4(210X297公沒) 一 16 _ A6 B6 206234 五、發明説明（15) t請先閱讀背面之注意事項再填駕本頁) 有至少一個碩水化合物部份。於本發明一個具體實例，天然的4 0 kDa TNF抑制劑像脱糖基化的。脱糖基化的40kDa TNF抑制劑，其保有與TNFa及厶（淋巴毒素）結合的能力，也包括在本發明範圍之内。完全及部份脱糖基化的4 0 kDa TNF抑制劑包括在本發明範圍。本發明者論到，4 0 kDa TNF抑制劑也可能是一種可溶性受體。编碼4 0 kDa蛋白質的基因序列經鑑定知不含終結密碼子，如脱糖基化的4 0 kDa T NF抑制劑之胺基酸序列所預期的。如實例2 0所述，c DNA已於CO S細胞上表現，且造成細胞上TNF結合位置數目的增加。

本發明包括编碼成熟4 0 kDa蛋白質（分離自由人類U 9 3 7細胞所調適的培養基，並於尿液中鑑定）的基因，及此基因較大及較小部份，所逹的程度為所编碼蛋白質的TNF抑制活性未受影饗。參考圖3 8可知，成熟的 .4 0 kDa TNF在蛋白質預期的靠近羧基末端處具富含脯胺酸區域。4 0 kDa TNF抑制劑，其中不含金部或部份的富含脯胺酸區域，也是有效的TNF抑制劑，二個此種縮短的蛋白質描述於下文中實例1 7及2 2，且稱為40kDa TNF抑制劑Λ51及40kDa T

N F抑制劑△ 5 3，於本案所有部份，當通稱為4 0 k D a TNF抑制劑時應包括分離自由人類U9 3 7細胞所調適之培養基並於尿液中鑑知的成熟4 0 k D a蛋白質，以及40kDa TNF抑制劑Λ51及40kDa T 甲 4(210X297公尨） -17 A6 B6 206234 五、發明説明（16) NF抑制劑Λ5 3。咸信，至少有一値TNF受體可與TNF α及TNF 厶均結合，而某些TNF受體只可與TNF α結合。此點符合本發明的發現，其中鑑定出二種TNF抑制劑，且推測均為T N F受體位置的活性片段，其一只可有效拮抗Τ NFct，另一則有效地拮抗TNFa及TNF/δ。 5.重組體抑制劑現在掲示製造TNF抑制劑的重組體DNA方法。於本發明一個具體實例中，活性位置作用在生物上相當於由尿液中分離之TNF抑制劑。天然或合成的DNA序列可用來指令此種TNF抑制劑之産製。方法包括： (a)製備一段DNA序列，可指令宿主細胞産製具 TNF抑制劑活性的蛋白質或其前軀體； (I；)將DN A序列選殖入載供中可轉移至且複製於 .宿主細胞中，此載體含有用以表現DNA序列或其前軀體所需的操作性要件： (c) 將含有合成的DNA序列及操作性要件的載體轉移至宿主細胞，後者可表現编碼TN F抑制劑之DNA 或其前軀體； (d) 培養宿主細菌，其所在的條件可擴大載髏且表現抑制或其前軀體； (e )回收抑制劑或其前軀體； (f )令抑制劑呈有活性的三级結構型式，如此其擁 (請先閱讀背面之注意事頊再填寫本頁) •装· ‘打· •緣· 甲 4(210X297 公衮） -18 - 206234 A 6 B6 經濟部中央揉準局印裝五、發明説明（；〇有或可處理修飾成具有TNF抑制活性的蛋白質。於本發明的一値具體實例中，TNF抑制劑由宿主細胞産製而呈前軀體蛋白質型式。此前軀體蛋白質以一個以上的步驟處理修飾成蛋白質，並可正確成形為活性TNF 抑制劑，傜利用一般精於此技藝人士所知的方法而行。 b . D N A序列可用於此方法的DNA序列掲示於實例6，1 4A及 1 7。這些序列有意包括合成的及天然的DNA序列及其組合。天然序列進一步包括c DNA或基因體DNA片段 Ο 合成聚核苷酸序列且其所编碼的蛋白質和c DNA或基因體聚核苷酸序列所编^碼的相同，此合成法對於一般精於此技蓊人士是已知的，特別是按照此處所含之教示。關於聚核替酸合成現'況的一値實例，如Matteucci ，M. D. ，及 Caruthers， Μ. Η.，於 J. Am. Chem. Soc. 1 0 3 :3185 (1981)及 Beaucage， S. L.及 Carut- hers M. H·於 Tetrahedron Lett. 2 2 ： 1 8 5 9 ( 1 981)中所述的，及ABI寡核苷酸合成儀之操作指示，各文獻均等別列為本案之參考。這些合成的序列可能和下文詳述的天然序列相同，或是可含有不同的核苷酸。於一個具體實例，若合成的序列中含有異於本發明天然DNA序列之核苷酸，則也意味這些不同的序列所编碼的多肽仍具有如分離自尿中T N F抑 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) •^· ,打· •綠· 甲 4 (210X297 公簷） -19 - A6 B6 ^06234 五、發明説明（18) {請先M讀背面之注意事項再填寫本页) 制劑相同的一级結構◊於另一具體實例中，含有不同核奋酸的合成序列，其所编碼的多肽仍具有如此處所述TNF 抑制劑相同的生物活性。再者，DNA序列可為天然序列的片段，即聚核苷酸之片段，其係自然生成且由本發明者第一次分離及純化。於一個具體實例中，DNA序列是分離c DNA庫的一個限制片段。另一具體實例中，DNA序列像分離自人類基因體庫。可用於此具體實例中的一個基因庫實例示於Wyman， et . al·，（ 1 9 8 5 ) Proc. Natl- Acad. Sc.i USA ，82，2880-2884° 於此具體實例較佳的說法中，意表該天然DNA序列以下列方法獲得： (a) 自細胞中製備人類CDNA庫，最好是可産生 TNF抑制劑的U 9 3 7細胞，於載體及細胞中，後者可擴大並表現所有的或部份的c DNA ; (b) 探測人類DNA庫，利用至少一個可與TNF 抑制劑基因或其蛋白質産物結合的探針； (c) 鑑定至少一個含有可指導合成抑制劑之基因的經濟部中央搮準局印裂純条，利用純糸基因或具蛋白質可與至少一個探針結合的能力； . (d) 自所選出之純条中分離出可指導合成抑制劑之基因或剖份基因；及 (e) 將基因或其適當片段鍵結至操作要件上，後者肀 4 (210X297公簷） -20 - 206234 A 6 B6 五、發明説明（19) 偽基同於宿主細胞中保持及表現所必要的。可用於以上方法中之天然DNA序列，可經由以下方式鑑定及分離： (a) 製備人類基因庫，最好可於r e c BC, s b c宿主中增殖，最好是CES 2 0 0 ; (b) 探水測人類基因庫，利用至少一個可與TNF 抑制劑基因或其蛋白産物結合的探針； (c )鑑定至少一値含有可指導合成抑制劑之基因的純糸，係利用純糸基因或其蛋白産物與至少一個探針結合的能力； (d) 自所鑑定的純糸中分離可指導合成抑制劑之基因； (e) 將基因或其適當片段鏈結至操作要件，以保持及表現基因於宿主細胞中。可用於以上方法，第三個可鑑定及分離自然DNA序列的有潛力方法包括下列步驟：

(a) 自可産生TNF抑制劑的細胞中製備mRNA

J (b) 由此mRNA合成cDNA (單或雙股）；經濟部中央橾準局印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) '打· •線· (c) 擴大存在於此cDNA序列混物中之TNF抑制劑特特異D N A序列，.利用聚合酶鐽反應（P C R )步驟，且所使用的引子如表5所示的。 (d )利用Southern吸漬分析，鑑定P C R産物其含有存在於表5所示其他寡核苷酸探針中之序列；甲 4(210X297 公簷） -21 - 206234 A6 B6 M濟部中央搞準局印裝五、發明説明（20) (e) 將所鑑定之DNA片段繼代選殖至Ml 3載體，如此可直接定序DNA序列； (f) 使用這些序列自cDNA庫中分離cDNA純糸；及 (g) 將基因或其適當片段鏈結至操作要件，後者於基因保持及於宿主細胞中表現所必要的。於分離適用於上述方法中之DNA序列時，最好在最靠近適當基因或基因部份末端處或之内鑑定二個限定制位置，而該基因俗可编碼天然蛋白質或其Η段。含有適當基因或基因部份的DNAM段，再以適當的核酸内切限制酶自剩下的基因材質中取出。經切下後，DNA序列的3 · 及5 ’端及任何的插入子表現子連接處均要重建，以生成適當的DNA序列可指導合成TNF抑制劑蛋白質之Ν-及C -末端及體部份，且可將DNA序列.融合至其操作要件上。. 如下文實例1 7所述的，被利用以表現4 0 k D a TNF抑制劑的DNA序列可做修飾，即自基因中除去1 5 3個或1 5 9値鹼基對，該基因像可指導合成分離自由人類U 9 3 7細胞的通適之培養基及鑑定於尿液中之成熟的4 0 kDa TNF抑制劑。Λ5 3基因之製得像自全部基因的羧基末端除除去脯胺酸部份，而△51基因則大約是指導合成3 0 kDa TNF抑制劑之基因的梭基末端。依據這些方法，自c DNA庫分離的DNA序列且其 (請先閔讀背面之注意事項再填寫本百) •^. •打. •缘. f 4(210X297 公簷） 22 - A6 B6 206234 五、發明説明（21) 可编碼至少部份的此處所述之3 0 kDa TNF抑制劑，已貯置於美國檫準菌種收集所，Rockville, M. D.貯置號為40645。依據這些方法，自人類基因體DNA庫中分離的DN A序列，且其可编碼至少部份的此處所述之30kDa T N F抑制劑，已貯置於美國標準菌種收集所，Rockvil-le，M. D.貯置號碼為40620。依據這些方法，自c DNA庫中分離的DNA序列，且其可编碼至少部份的此處所述之4 0 kDa TNF抑制劑，已貯置於美國標準菌種收集所，Rockville M. D. 貯置號為6 8 2 0 4。 6 .黻體 (b )撒生物，f其是大矂捍鍤可用於本發明的載體包括任何載體，只要上述的DN .A序列可嵌入，加上任何較佳的或所必須的操作要件，則該載體可再轉移至宿主細胞中並於此細胞中複製。較佳的載體為其所含的限制位置已被證實且所含的操作要件為D NA序列轉錄所適用或必要的。然而，本發明某些具體實例，也應用目前尚未被發現的載體，其中可能含一値以上的上述c D N A序列。待別地，最好所有的載體具有以下某些或全部特性：（1 )擁有最少量的宿主有機體序列； (2)可於欲求宿主中穩定保持及增殖；（3)可以高套數存在於欲求的宿主中；（4 )具有可調控的啓動基因， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. -訂' 線_ 甲 4(210X297 公尨） -23 A 6 B6 206234 五、發明説明（22) 如此可促進重點基因之轉錄作用，· （5)具有至少一個可指導合成可選擇之特徽的標記DNA序列，其存在於質體某部份可與欲嵌入之DNA序列分別；及（6) —段可經錄作用的D N A序列。於各種較佳具體實例中，這些含有本發明DNA序列且可將之表現的選殖載體含有各種操作要件。這些''操作要件"如此處所述，包括至少一個啓動基因，至少一値 Shine-Dalgarno序列及起始密碼子，及至少一個終結密碼子。最好，這些Λ操作要件〃也包括至少一値操作子，至少一値領導序列供蛋白質自細胞内空間蓮出，至少一個可指導合成調控子蛋白質的基因，及其他任何DNA序列為載體DNA適當地錢錄及接下來轉譯所必要或適用的 0 這些操作要件中某些可存在於本發明毎値較佳載體。意表任何額外的操作要件只要是所必須的，均可利用一般 .於此技藝人士所知的方法，尤其是依據此處所教示的方法加至載體中。實際上，構築毎一載體可以易被分離，裝配及互換的方式進行◊如此有助於自這些要件組合及DNA序列的编碼區中裝配無數具官能性的基因。再者，這些要件中有許多可應用一種以上的宿主。如此則額外地表示於某些較佳具體實例中，載體内可含有可作用如同調控子的DNA序列（操縱子〃），及其他可指導合成調控蛋白質的DN A序列。甲 4 (210X 297 公尨) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. •訂· •綵. -24 - 206234 A 6 B6 五、發明説明（23 (i )調擰罕於一個具體實例中，這些調控子可用來避免DNA序列於某些環境條件存在下的DNA序列表現，且於其他的環境條件存在下，可令由DN序列编碼的蛋白質轉錄及接績地表現。特別地，最好可將調控片段嵌入載體中，如此當於異丙硫基- D_半乳糖苷不存在時，DNA序列的表現將無法發生，或即使有其程度也大大地減低。在此種狀況下，經轉形且含該DNA序列的徹生物，於TNF 抑制劑開始表現前可生長至欲求的密度。在此具髏實例中，當欲求的密度達到後，可藉著將受質加至可令DNA序列表現的微生物環境下而誘導欲求蛋白質之表現。 (i i )盤動基因表現載體必須含有啓動基因，其可被宿主有機體利用而表現其本身的蛋白質。雖然最常使用乳耱啓動基因条統，而主他上_被分離及㈣定牧微生塑1動蓋S，也可為精於此技藝人士應用以表現重組T N F抑制劑。 (i i i)轉錄终結芊此處所指的轉錄結子僳用來穩定載體。特別地，被

Rosenbery ，Μ 及 Court，D.，於 Ann· Rev. Gene t . 1 3:319-353 (1979)(特列為本案之參考文獻）中述及的這些序列均可應用於本發明中。 -25 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •打· .綵· 甲 4(210X297 公沒）幺〇62·Μ Α6 Β6 五、發明說明（24) (i v )非驄譯的序列可注意到於較佳的具體實例中，希望可構築编碼區的 3 1或5 ’端，用以將非轉譯序列的3 ’或5 ’納入基因轉錄子中。包括在這些非轉譯序列中的，為可穩定mRNA者 f 如由 Schme i ssner » U· » Mckenney，K·，Rose nberg， M 及 Court， D.於 J. Mol. Biol. 1 7 6 : 3 9—5 3 (1 9 8 4 )所確定的，此文特別列為本案的參考文獻。 (v )核耱體結合位詈外來蛋白質的微生物表現須要某些操作要件，其中包括核糖體結合位置，但亦不限於此。核糖體結合位置是一段於蛋白質合成開始時可為核糖體確認及結合的序列，如 Gold. L· et al·» Ann· Rev. Microbio. 3 5 ' 5 5 7 — 5 8 0 ;或 Ma r.qu is，D. M·, et al.，Gene 4 2 : 1 75-183 (1986)所示的，二文詳列為本案的參考文獻。較佳的核糖體結合位置為 GAGGCGCAAAAA (ATG) (v i )領湛序列及餺讅囿相孑此外，若蛋白質將被分泌至胞質外，則指導合成適當分泌性領導（訊號）序列的D N A最好列於D N A序列的 5 ’端，如' Watson，Μ. E.於 Nucleic Acids Res . 1 2 : 5 1 4 5-5 1 6 3中所示，此文已列為本案的參考 -26 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲4(210Χ 297公尨） A 6 B6 五、發明説明（25) 文獻。領導序列的D N A所在的位置必須可令融合蛋白質産生，其中領導序列與抑制劑緊接著且共價接合，即在二段DNA编碼序列間必須没有轉錄或轉譯終結訊號。領導序列的存在有部份是基於以下一個以上的理由◊首先，領導序列的存在有助於T N F抑制劑的宿主處理修飾。特別地，領導序列可經由領導肽酶將最初的轉譯産物解離，除去領導序列且留下多肽，其所帶的胺基酸序列具有潛力的蛋白質活性。第二，領導序列的存在有助於T N F抑制劑的純化，傜經指令蛋白質自細胞質内放出而成。於某些種類的宿主微生物中，適當領導序列的存在可令完全的蛋白質被蓮送至周質空間，如於某些大腸桿菌。於某些大腸桿藺，酵母屬及某些桿菌及促單胞薗中，適當的領導序列可將蛋白質經由細胞膜蓮送至胞外介質中。在此情況下，蛋白質可自胞外蛋白質中純化而得。第三點，於本發明所製備的某些蛋白質中，領導序列之存在對於將完全的蛋白質定位於環境中是必要的，於此環境下其可重昼而呈其活性結構，該結構具有適當的蛋白質活性。於本發明的一値較佳具體實例中，一段額外的DNA 序列緊接在指導合成T N F抑制劑的D N A序列之前。此額外的DNA序列可作用如轉譯同相子，即這是一段DN A序列其所编碼的HNA.可用來定核糖髏的位置，係接在其所連绩的抑制劑RNA可用來定核糖髏的位置。於本發明一個具體實例中，轉錄同相子可利用DNA序列 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .发. -打· •線. 甲 4 (210X297公尨） -27 - 206234 6 ^ B6 五、發明説明（26) {請先閱讀背面之注素事項再蜞寫本頁) .¾.. •綠.

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAA GACAGCTATCGCGATCTTGGAGGA TGATTAAATG 衍生，且採用精於轉錄同相子相關技藝人士目前所知的方法。 (v i i )轉譯终結芊此處的轉譯終結子用來停止mRN A的轉譯。其可為天然的（如 Kohli, J. Mol· Gen. Genet. 1 8 2 : 4 3 0 — 4 3 9中所述），或合成的（如Pettersson，R. F. Gene 24 :1 5 - 27 (1983)，二者均列為本案參考。 (v i i i )可篩選用標記此外，載體中最好含有可篩選的標記，如抗藥性標記，或其他經由宿主微生物使可篩選特徴表現之標記。於本發明一個具體實例中，將抗氨苄徽素基因包括布載體中，而於其他質髏，則包括抗四環徽素或抗氯霉素基因。此種抗藥性或其他的可筛選標記有部份是用以幫助轉形子之選擇i此外，此種可篩選標記於選殖載體中，用以阻止污染微生物於培養.基中增殖。於此具體實例中，欲得經轉形宿主微生物之純培養，可將微生物在賴誘導的表現型以存活的條件下培養。此處所述的操作要件可由一般精於此技藝人士依據先甲 4 (210X297 公簷） -28 - A6 B6 2〇6234 五、發明說明（27) 前文獻及此處之教示而例常地選擇。這些操作要件的一般 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例不於 B. Lewin，Genes. Wiley & Sons, New Tork (1 9 8 3 )其待別列為本案之參考。各種適合的搡作要件實例可見於上述載體中，且經本案中所討論的上述載體基體基本特性而説明。上述載體的所有必要及欲求部份一旦合成及分離後，載體可以一般精於此技術人士所知的方法裝配。咸信，此種載髏的裝配是在一般精於此技藝人士之本分及作業中的，且如此可在乎不當實驗下進行。例如，相似的DNA序列已鍵結至適當的選殖載體中，如Mania tis et a 1.,於 Molecular Cloning， Cold Spring Harbor Laboratories (1984)，其已列為本案的參考。 •打· •綠· 於構築本發明的選殖載體時，可另外注意到多套數的 DNA序列及其伴隨的操作要件可嵌入每一載體中。在此一具髏實例中，宿主有機體毎載體可産生較多量的欲求T NF抑制劑。可嵌入載體的DNA序列套數及受所得載體的能力限制，即可轉移，複製及轉錄於適當宿主細胞之大小° (b )其他徹生物經濟部中央揉準局印浆適用於大腸捍菌以外.徹生物之載體，也包括在本發明之内。此種載體述於表1。此外，某些較佳的載體也討論於下。甲 4 (210X297公沒） -29 - 2062*34 A6 B6 五、發明説明（28) S— I SJ1

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If 1 經濟部中央搮準局印裝 i 0 10 ii2 ill m I m i S 〇 1 1 1 i 藤i i w 1 '<W«> a j J 11 =i -§ S 肩 —^ —< οζ . % __ §1 蠢1 iS il& ill \ l1sa Ο ·—« L·. B ^ . 1 O (D N 1¾ L·. U ·— —CO 琴ε ω t- gglli g il|s mM % -d e2 m ύι Ipl! ¢3 φ w ,f· ^ 1 _ o o 古 JS t2 53 Ω t—H 1 L〇 13 !> J 邑 _§ 〇 i—< -¾ »—1 CX 1 1 «si 1 s m 由？駐 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •線. -30 - 甲 4(210X297公沒）經濟部中央揉準局印製 A6 B6 五、發明説明（29) 1. Backman, Κ· , Ptashne, Μ· and Gilbert, W. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 22, 4174-4178 (1976)· 2· de Boer, H.A., Comstock, L.J., and Vasser, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983). 1 3. Shimatake, H· and Rosenberg, M. Nature 292, 128-132 (1981) . 4· Deroxn, C·, Gheysen, D, and Fiers, W· Gene 17 , 45-54 (1982) . 5. Hallewell, R,A. and Emtage, S. Gene 9, 27-47 (1980)· 6. Brosius f J., Dull, T.J., Sleeter, D.D. and Noller, H.F. J. Mol· Biol . 148. 107-12 7 (1981)· 7. Normanly, J·, Ogden, R.C., Horvath, S.J, and Abelsoni J· Nature 321, 213-219 (1986). 8· Belasco, J.G., Nilsson, G., von Gabain, K‘ and Cohen, S.N. Cell 46, 245-251 (1986)· 9· Schmeissner, U., McKenney, K·, Rosenberg M. and Court, D. J. Hoi. Biol. 176, 39-53 (1984). 10. Mott, J.E., Galloway, J. L. and Platt, T. EMBO J. 4./ 1887-1891 (1985)- 11· Koshland, D· And Botstein, D. Cell 20, 749-760 (1980). 一 12. Howa, N.R” Kakamura, K. and Inouye, M. J. Mol. Biol. 143, 317-328 (1980). 13. Surin, B,P., Jans, D·A·, Fimmel, A,L·, Shaw, D.C·, Cox, G.B, and Rosenberg, H. J· Bacteriol· 157· 772-7十 (1984). 14. Sutcliffe, J.G, Proc. Natl. Acad. Sci· USA 75. 37 37-3741 (1978). 15. Peden, K.W.C. Gene 22t 27 7-280 (1983). 16. Alton, N.K. and Vapnek, D. Nature 282, 864-869 (1979) ' 17· Yang, M., Galizzi, A·, and Henner, D. Nuc. Acids Res, 11(2), 237-248 (1983). 18· Wong, S.-L·, Price C.W., Goldfarb, D-S., and Doi, R.H, Proc, Natl. Acad· Sci. USA M, 1184-1188 (1984)· 19. Wang, Ρ·»Ζ· and Doi, R.H· J. Biol. Chem. , 8619- — 8625, (1984). 20· Lin, C.-Κ., Quinn, L·A., Rodriguez, R.L·· J. Cell Biochem· Suppl· (9B), p. 198 (1985). T4(210X297公发） -31 - (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· *訂· •線· 206 ⑸ 4 A6 B6 經濟部中央搮準局印裝五、發明説明（ 21. Vasantha, N., Thompson, L.D·, Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J., and Filpula, D. J* Bact· 159(3), 811-819 (1984). 22. Plava, I·, Sarvas, M., Lehtovaara, P·, Sibazkov, M·, and Kaariainen, L. Proc, Natl. Acad. Sci· USA 79, 5582-5586 (1982) · 23. Wong. S·-L,, Pricee, C.W., Goldfarb, D,S·, and Doi, R.H· Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984). 24. Sullivan, M.A., Yasbin, R.E., Young, F.E. Gene 29, 21-46 (1984). — 25. Vasantha, N., Thompson, L.D., Rhodes, C. , Banner, C. Nagle, J., and Filula, D.J. Bact. 159 门）· 811-819 (1984). 26. Yansura, D.G. and Henner, D. J. PNAS 81, 439-443 (1984). 、 — 27· Gray, G.L., McKeown, Κ·Α·, Jones, A-J.S., Seeburg, P.H. and Heyneker, H.L. Biotechnology, 161-165 (1984) * 28· Lory, S,, and Tai, P.C. Gene 22, 95-101 (1983). 29· Liu, Ρ·ν· J. Infect· Dis. 130 (suppl), 594-599 (1974). 30· Wood, D.G., Hollinger, M.F·, and Tindol, M.B. J. Bact. 145. 1448-1451 (1981), 31· St· John, T-P. and Davis, R.W· J· Mol. Biol· 152 · 285-315 (1981), 32· Hopper, J.E. , and Rowe, L. B. JL. Biol. Chem. 253 · 7566-7569 (1978). 33_ Denis, C.L·, Ferguson, J. and Young, Ε·Τ. J. Biol. Chem. 258, 1165-1171 (1983)· 34· Lutsdorf, L. and Megnetf R, Archs· Biochexn. Biophys. 126, 933-944 (1968). 35· Meyhack, B·, Bajwa, N·, Rudolph, H. and Hinnen, ΛΕΜΒΟ· J· 6, 675-680 (1982)· 36· Watson, Μ·Ε· Nucleic Acid Research 12, 5145-5164 (1984) . 一 — _ _ — . 37. Gerband, C. and Guerineau/ M, Curr. Genet, 1., 219-228 (1980)· 38. Hinnen, A·, Hicks, J.B. and Fink, G.R/ Proc· Natl. Acad. Sci- USA 15, 1929-1933 (1978). 39. Jabbar, M.A., Sivasubramanian, N· and Nayak, D.P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82t 2019-2023 (1985)· 【請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. •打· .綠- 甲 4(210X297 公沒） -32 - 經濟部中央橾準局印皱 206234 A 6 ____B6 五、發明説明（31) (i )假單胞菌載體許多載體質體，其自動於大範圍革蘭瓦陰性細菌中複製，可合宜地於假單胞菌屬宿主中當做選殖載體◊其中某些由 Tait， R. C.， Close, T. J.， Lundquist, R. C.， Hagiya，M，，Rodriguez，R. L.，and Kado，C. I 述於 Biotechnology，May, 1983, p269 — 27 5 ； P~ anopoulos, N. J. in Genetic Engineering in the plant Sciences, Praeger Publishers，New York , New Y-ork， pp. 163—185 (1981);及 Sakgucki ，K · in Current Topics in Microbiology and Immuno- logy 9 6 : 3 1 - 4 5 ( 1 9 8 2 ),其特別列為本案之參考。一個特別佳之構築可採用質髏RS F 1 0 1 0及其衍生物，如 Bagdasar i an，M·，Bagdasar i an * Μ· M·，Co 1 -eman，S·，and Timmis，K - N·述方$ Plasmids of Medical» Environment and Commercial Importance， Timmis ，K· N· and Puhler，A * eds·，Elsevier/ Morth He 1 1 -and Biomedical Press ( 1 9 7 9 )，待別列為本案參考 ◊RSF1010的優點為其相當小的高套數質體，可極易轉形至大腸桿菌及假單胞菌中並穩定地保持◊在此条統中，最好使用供埃希氏菌的τ a c表現条統，因大腸桿菌 t r T)啓動基因極易為促單胞菌RNA聚合酶所確認，如示方$ Sakagnchi，K . in Current Topics in Microbiol-ogy and Immunology 96^31—45 (1982) and 甲 4(210X297公沒） -33 - {請先閲讀背面之注意事頊再填寫本頁) .装· .打· 206234 A6 B6 經濟部中央橾準局印«.. 五、發明説明（32) Gray· G· L * Mckeown，K. A.， Jones A· J * S·，See b u- rg， P· H. * and Heyneker， H· L· in Biotechnology， Feb· 1 9 8 4，p p · 1 6 1 — 1 6 5，二者特別列為本案參考。轉錄作用活性可進丁步擴大，即令啓動基因與如大腸捍菌或線膜桿菌之t r P啓動基因交換。此外，大腸桿菌的1 a C I基因也可包括在質體中以達成調控。轉譯可聯想到供任一促單胞菌蛋白質之轉譯起始作用，以及供任何經選定可造成抑制劑細胞内表現之高度表現蛋白質之起始位置。在這些例子中，假單胞宿主之限制（一）株無法應用，則以分離自大腸桿菌之質體構體所進行之轉形效率很差。因此，有必要於轉形至欲求宿主前，假單胞菌選殖載體先經另一種類之r-m十株傳代，如Bagadsarian，M.， e t a 1 尸/f 不·· Plasmids of Medical , Envi r onmen t a 1 and Commercial Importance, p p· 411 — 422， Timm-i s and Puhler eds.，E1sev i er/North Holland Biomed-ical Press ( 1 9 7 9 )，特別列為本案參考。 (i i )芽孢捍_載髏再者，於芽孢桿菌颶宿主中之較佳表現条統，包括使用質體PUB 1 1 0為蕴殖載體◊如於其他的宿主載體条統中，可能可於芽孢桿菌中表現本發明之T N F抑制劑，呈細胞内或分泌型蛋白質。本具體實例包括此二種条統。可於芽孢桿菌及大腸桿薗中複製的往返基因，可用於構築 (請先聞讀卄面之注意事項再填寫本頁) •装· .打. -綠. 甲 4(210X297 公寒） -34 - i i A 6 B6 206234 五、發明説明（33) 及測試各種基因（如 Dubnau，D.，Gryczan，T·，Conte-nte， S.,及 Shivakumar， A. G. in Genetic Enginecr-ing，Vo 1 2，Set low and Hoi lander eds.，Plenum P r e- ss， New York， New York, pp. 115—131 (19 8 〇 )，特別為本案參考。欲自枯草桿菌中表現及分泌T N F抑制劑，α ~澱粉酶的訊號序列最好偶合至蛋白質的編碼區。欲合成細胞内抑制劑，可攜帶的D Ν Α序列可轉譯地偶合至cx -澱粉酶領導序列之核糖體結合位置。這些構體任一者之轉錄最好是由《-澱粉酶啓動基因或其衍生物所指令。此衍生物含有天然α -澱粉酶啓動基因之RNA聚合酶確認序列，但也納有1 a c操縱子。構築自青徽素酶基因啓動基因及1 a c操縱子的類似的融合啓動基因，已示出可以一種可調控的方式於芽孢桿菌中作用，如 Yansura， D. G. and Henner 於 Genetics and Biotechnology of' Bacilli， Ganesan， A . T. and Hoch .J. A·, eds.. Academic Press,p p 2 4 9 — 2 6 3 ( 1 9 8 4)所示，特列為本案參考。也可將大腸捍菌的1 a c I芏因包括在質體中以達成調控作用。 (i i i)梭蘭戧鵲於梭狀穿孢桿菌中表.現的較佳構築是在質體p J U 1 2 中，由 Squires，C · Η - e t a 1 .,述於 J. Bacteriol. 159:4 65-471 (1984)且特別為本案參考，並轉形至産業莢膜梭菌，採用Heefner D. L. et al 肀 4(210X297i'簷） {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裟. 綠· 經濟部中央搮準局印裝 -35 - A 6 B6 206234 五、發明説明（34) 述於 J. Bacteriol. 1 5 9 : 4 6 0 — 4 6 4 (1 9 8 {請先閲讀背面之注意事項再瑱寫本頁) 4)(特列為本案參考）的方法。轉錄作用由抗四環徽素基因之啓動基因指令。轉錄作用則偶合至此相同t e t 基因之Shine-Dalgarno序列，其方式嚴格類似於上示適用於其他宿主之步驟。 (i v )酵母載體納入酵母中之外來基因的維持可以數種方式達成，如述方$ Botstein，D · and Pacis，R. W. , in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces » Cold Spring Harbor Laboratory , Strathern. Jones and Broach eds, pp. 607-636 (1982)，特列為本案之參考。用於酵母羼宿主有機髏之較佳表現糸，在2微米質體上帶有TNF抑制劑基因。2撒米環的優點及具相當高套數且當引入c i Γ |株時十分穩定。這些載體最好納 .有複製源及來自P BR 3 2 2至少一値抗生素抗性標記，以令其可於大腸捍菌中複製及篩選。此外，質體最好有二個微米序列及酵母LEU 2基因，使於酵母的LEU 2缺失突變株中有相同目的。經濟部中央捸準扃印浆若欲求重組體TNF抑制劑最後可於酵母中表現，則最好先將選殖載體轉移至.大腸桿菌，在此中載體可複製，且由此經擴大作用後可得到載體並純化。載體再轉移至酵母做最終的TN F抑制劑表現。甲4(210X297公;«) - 36 — A 6 B6 2〇6234 五、發明説明（35) (C )哺乳動物細胞 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) TNF抑制劑的c DNA可當做基因而於哺乳動物細胞中表現抑制劑。其中應有一段可以與核糖髏有效結合序歹(J，如 Kozak .述方$ Nacleic Acids Research 1 5 : 8 125-8132 (1987)，特列為本案參考，且應具有编碼領導序列之能力（見3 (a) (v i)段落，以令成熟的蛋白質以經過處理修飾的方式排出細胞外。帶有完全的c DNA序列之DNA限制Η段再嵌入表現載體中，後者帶有轉錄啓動基因及轉錄加強子，如Guarete L. 於 Cell 52:303-305 (1988)及 Kodona- •訂· .線· ga， J.T. et cl 於 Cell. 5 1 : 1 079-1 090 (1987)中所述，二文均列為本茱參考。若抑制劑的組成表現對細胞生長有害，則啓動基因可如質體pMS G (Pharmacia Cat. No. 27450601)般調控。載體應有完全的聚腺苷化作用訊號，如Ausubel. F. Μ. et a 1 於 Current Protocols in Molecular Biolagy， Wiley (1987)中所述，特列為本案參考，如此由該載體轉錄的mRN A可正確地處理修飾。最後，載體應有複製源及至少一、來自PBR3 2 2的抗生素抗性標記，以令其可於大腸桿菌中複製及篩選。經濟部中央採準局印製為了選出可産生TN.F抑制劑的穩定細胞株，表現載體可帶有可篩選標記之基因，如抗藥性標記或帶有供缺失細胞株之互補基因，如轉形於d h f r -細胞株時之二氫葉酸還原酶（dh f r)基因，如Ausubel et al.，上甲 4 (210X297公廣） -37 - A6 B6 206234 五、發明説明（36) 文所述。此外，另一個帶有可篩選標記的質體，可與表現載體共同轉形。 7 .宿主細朐/轉形作用所得的載體再轉移至適當的宿主細胞中。這些宿主細胞可為微生物或哺乳動物細胞。 (c )微生物咸信，任何微生物只要具有吸收外表D N A及可表現這些基因及伴隨的操作要件者均可選用◊宿主微生物一旦經選擇，載體即可利用一般精於此技藝人士已知的方法轉移至宿主有機體◊此種方法的實例見於Advanced Bacte-n i a 1 Genetics，R. W· Pavis e t al·，Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor， New York (198 〇 )其列為本案的參考。於一個具體實例中，最好轉形作用於低溫下發生，因可經由上述操作要件之使用，將溫虔諝控做為諝節基因表現的方法。在另一具體實例中，若滲透調節子已嵌入載體中，則於轉形過程中調節鹽濃度，以確保外來基因有合宜地控制是必要的。最好宿主有機體是一種容許的厭氣生物或好氣生物。於此方法中特佳之宿主包括酵母及細菌。恃別的酵母包括酵母颶，及尤其是釀酒酵母。特別的細菌有芽孢桿菌，埃希氏菌，及假單胞菌*尤其是枯草桿菌及大腸桿菌。其他的宿主細胞列於上文表I。 (請先閱讀背面之注竟事項再填寫本頁) •象. •線· 經濟部中央揉準局印裝甲 4 (210X2971'«) -38 - 206234 A 6 B6 五、發明説明（37) (d )哺乳動物細胞 (請先閲讀背面之注专事項再填寫本页} 載體可以許多技術引入培養中之哺乳動物内’如磷酸鈣，DNA共沈澱作用；電泳脈動，或原生質融合。較佳的方法為以磷酸鈣之共沈澱作用，如Ausubel et al，上文中所述。存在有許多穩定的細胞型式，其係可轉形的且可轉錄及轉譯c D N A序列，處理修飾前軀體T N F抑制劑及分泌成熟的蛋白質。然而，基於分泌蛋白質的糖基化作用及胺基酸殘基之轉譯後修飾（若有的話），細胞型式也有各種變化。因此，理想的細胞型式為所産生的重組體T N F 抑制劑和天然分子相同。 8 .培舂猙请傳工稈，細朐經濟部中央橾準局印裝宿主細胞在適合表現T N F抑制劑的條件下培養。這些條件通常是宿主·細胞特異地，且可由一般精於此技藝人士依據所發表的有關此種細胞之生長條件等文獻，及此處所含的教不很容易地決定。例如，Bergey's Manual of Determinatice Bacteriology，8th Ed. Williams & W i-lkins Company，Baltimore，Maryland，持列為本案之參考，其中有關於培養細菌的條件資料。培養酵母及哺乳動物細胞的相似資料則得良Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (197 5 )。特列為本案參考。供DNA序列表現調控的任何必要條件，依嵌入載體甲 4(210X 297公潑） -39 - A 6 B6 206234 五、發明説明（ (請先聞讀背面之注专事項再填寫本頁) 中的任何操作要件而定，在轉形及培養階段將是有效的。在一具體實例中，細胞先在可抑制DN A序列表現的適當調控條件存在下生長至高密度。當達到最佳細胞密度後，環境條件改變成適合D N A序列表現。因此T N F抑制劑産製的發生將在宿主細胞生長達幾乎最佳密度之後發生，且所得的T N F抑制劑於其表現所必要的調控條件被誘導後某時回收。 9 .純化 (a )自微生物産得的T N F抑制劑。於本發明一個較佳具體實例中，重組體TNF抑制之純化係在回收之後而其活性結構假定之前。此具體實例是較佳的，因本發明者咸信，若蛋白質先被純化則回收高産率的再折疊蛋白質將是容易的。然而，於另一不同的較佳具體實例中，可在純化前令T N F抑制劑再折叠以呈其活性結構◊又另一較佳具體實例中，TNF抑制劑以其再折叠且活狀況態自培養基中回收。經濟部中央揉準局印製在某些環境下，TNF抑制劑可以其正確且活性结構型式表現於宿主微生物且將蛋白質經由細胞壁或細胞膜蓮輸，或蓮至周質空間。若指導合成適當領導序列的DNA 與指導合成重組體蛋白質的DNA鏈結，則此通常是會發生的。若TNF抑制未呈其正確，活性結構，則所形成的任何雙硫鍵及/或所發生的任何非共價交互作用將先被變性劑及還原劑（如氯化脈及颡基乙醇）所瓦解，之後甲 4 (210X297公发） -40 - A6 B6 206234 五、發咧説明（39) (請先«I讀背面之注意事項再填寫本1Γ) 在控制條件下稀釋及氣化這些作用物，TNF抑制劑才呈其活性結構。為了於再折叠前及後純化，最好使用以下步驟之某些組合 •，陰離子交換層析（monoQ或DEAE-Sepharose )，凝膠過滴層析（superore )，色譜焦距法（Monop )及疏水性交互作用層析（辛基或苯基Sepharose )。尤以使用TNF親和力層析（見實例1)最有價值。 (b )産自哺乳動物細胞的T N F抑制劑。産自哺乳動物細胞的T N F抑制劑可純化自調適培養基，所採用的步驟包括離..无彦換屋_折及使用I. Ν. F .2.ΜΜ S層析，如實例1所述。精於此技藝人士應很明瞭，δ本發明的方法及産物中可有各種修飾及變化◊因此，本發明涵蓋此發明之修飾及變化，只要是屬於所附之申請專利範圍及其相當之範圍内即可j .缘· 經濟部中央橾準局印裝如前所述，本發明的T N F抑制劑可供做治療劑使用 .，因此可調和於藥學上可接受之載體中◊於本發明一個具體實例中，可將TNF抑制劑做飽以增進分子的藥物動力特性。例如，可將TNF抑制劑至一個高分子量聚合物質上，如聚乙二醇。此外，間白素-1抑制劑可與T N F抑制劑聯合投藥。此種組合治療於發炎及變性疾病之治療上特別有用。. 以下實例説明此處申請專範圍的本發明各種較佳具髏實例。實例中列出的所有文獻及參考均恃別列為本案之參考文獻。甲 4(210X297公爱） -41 - A6 B6 206234 五、發明説明（40) (請先閲讀背面之注意辜項再填寫本頁) f |丨1 .蒂白皙之製備 A .材料 •訂· .線* 經濟部中央揉準局印梨 TNFa (TNF a)之基因購自 British Biotec-hnology，Limited. Oxford , England . DEAE~Sepharose CL_6B 樹脂及 Mono— Q HR5/5，HHI 〇 / 1 0 FPLC管柱購自Pha rmacia， Inc., Pisca-taway，New Jersey· Affigel — 1 5 樹脂，及 BioRad 蛋白質分析用套組購自 BioRad，Richmond，California·, 吐溫2 0，磺酸氫銨，磷酸鈉，PMSF，碩酸氨銨鈉，二硫異赤絲藻醇結晶紫及放線菌素D均購自Sigma Chemical Company， St· Louis， Missouri· 蛋白鍵内切酶 LY S-C，蛋白鏈内切酶ASP—N及TRIS (三羥甲基胺基甲院）購自 B〇ehringer Mannheim Biochemicals， Indianapolis，Indiana·六氣丙嗣購自ICNBiomedica-ls，Costa Mesa，California♦溴化氰、三氣乙酸，及脈鹽酸鹽購自 Pierce Chemicals，Rockford，Illinois·乙睛及 Η P L C 購自 J* T · Baker Chemical Company， P_ hi 1 i ipsburg* New Jersey ·尿素購自 Bet hesda Research Laboratories，Gaithersburg，Maryland . 〔 3H〕 -碘乙酸購自 New England Nuclear， Boston， Massach-usetts· 〔i25I〕 TNF α購自 Amersham， Arlington Heights, Illinois ·重組體人類 TN Fa 購自 Amgen，甲4(210X 297公沒） —42 - 20623^ A 6 B6 經濟部中央揉準局印製五、發明説明（41) Thousand Oaks，California. C 8 —逆相管柱（2 5 公分 X 4 . 6 毫米）得自 Synchrom， Inc·， Lafayette， I- ndiana. C8_徹球逆相管柱（7微米，2 2公分X2. 1 毫米）gSAppliedBiosystemS.FosterCity.，C-alifornia，Corning 9 6 孔洞微滴定盤購自 VWR Scientific， Batavia, Illinois . McCoys 5 A培養基及牛胚胎血清購自，Gibco，Grand Island，New York. RPMI 1 6 4 0培養基及L —穀胺醯胺購自Mediate-ch， Herndon Virginia 。胰蛋白酶購自 K. C. Biologi-cals，St. Lenexa , Kansas · MEl 80 、119.37及1< 9 2 9細胞株得自美國標準菌種收集所，Rockui lie, Μα rg 1 and 0 B . T N F抑制劑之分析法使用二種分析法以鑑定TN F抑制劑。其一為胞毒性分析，另一則是凝膠移動分析。 1 ·胞羞袢分析胞毒性分析以經放線菌素D處理的ME 1 8 0細胞及 L 9 2 9 細胞進行，如 Ostrove and Gifford 所述（P-r 〇 c. Soc. Eop· Biol Med· 160 » 354 — 358 ( 1 9 7 9 )).及 Aqqarwa 1 及 Es sa 1 u ( J . B i ο 1 . ch-em. 262， 10000-10007 (1987) ) 〇 ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *装· •打· •綠. 甲 4(210X2^7 公爱) -43 - 206234 A6 B6 經濟部中央採準局印製五、發明說明（42) L 9 2 9細胞（CCL I :美國標準_種收集所）保持於含有1 0%牛胚胎血清之McCoy ’s5 A培養基中。融合狀培養物以〇. 25%胰蛋白酶/生理溶液，含5mM E D T A簡略處理，再懸浮於新鮮培養基。以毎孔洞2 X 1 〇 4個經胰蛋白酶化細胞之量塗覆在9 6孔洞之培養盤（ Corn i g )，並於3 7 °C下培育2 4小時。之後加入放線菌素D使終濃度為每毫升0. 25微克。經2小時後，含有T N F及T N F抑制劑之樣品再加至孔洞中，並於相同溫度下繼績境育一夜。經顯微鏡檢後，傾去培養基，孔洞再以P B S潤濕。孔洞接著充填0 . 1 %結晶紫，1 0 % 甲醛及l〇mM磷酸鉀溶液，pH6. 0歴5分鐘。再充份以水洗，乾燥。染料經0.1M檸檬酸鈉/50%乙醇，pH4 . 2举取。存活細胞中所吸收的染料，於5 7 0 毫微米波長下以Kinetic微盤計讀器（Molecular Devices Co>p . CA ) 決定。此分析的一個實例示於圖 1 。於抑制劑存在下，TNF的胞毒作用會減少。 2 .凝膠移動分析凝膠移動分析，涉及使用天然的聚丙烯醛胺凝膠電泳糸。此天然的4 %凝膠電泳依 Hedrick and Smith的方法操作（Arch. Biochem. and Biophysics 1 2 6 ， 1 55-164 (1968))。經C8層析後，碘化的T N F ( Amersham )與T N F抑制劑（得自實例（C )混合培育3 0分至2小時。此混合物及單獨的碘化TNF， (請先閱讀背面之注意事項再滇寫本頁) .装. .打· .線· 甲 4 (210X297 公爱） -44 - 9 9 A6 B6 206234 五、發明説明（43) 填料至1 0%天然凝膠再行電泳。恃凝膠以1 0%乙酸固定後，洗滌，再置底片行放射自顯術。如圖2所示，TN F及TNF抑制劑絡合物移動方式異於TNF本身。此凝膠移動分析可用於決定DEAE CL 6 B管柱層析之溶離物中，那一値流份中含有TNF抑制劑。 C · 3 0 k D a TNF抑制劑之純化將取自腎官能障礙患濃縮至2 0 0毫升，利用Am icon Y Μ 5濾膜。濃縮物再於△ °C下用〇 . 0 2 5 M Tris-Cj? pH3. 5 透析，再於 JA 14轉子以10，000rpm離心30分。上清液填料至4 0父4.5公分〇£人瓦 Sepharose C L - 6 B管柱中，其已預先以 0.025M Tris— C1，t> Η 3 . 5平衡，再以平衡緩衝液充份潤濕（直到溶離物之 ODu。’值回復至基準線。層析之完成利用由0 - 0. 0 5M氯化鈉/0.025M Tris-Cl p Η 7 . 5之直線梯度，並以OD2S。追踪。收集管柱流份，並利用天然凝膠分析法分析TN F抑制劑活性。溶離出之TN F抑制劑溶離物於8 0mm Na CJ2處有一個相當尖銳的峰。圖 6Ατΐί 出 2 0 升尿液經 DEAE Sepharose CL - 6 B層析後之OD 2β。剖析圖。圖6 B為相當的天然凝膠分析放射自顯圖，示出在5 7 - 6 3流份處有TNF抑制劑峰，其約為80mM NaC^。 (請先閔讀背面之注老事項再蜞寫本頁) .装. ，打. •綠. 甲 4 (210X297 公簷） -45 - A6 B6 206234 五、發明說明（44) {請先閱讀卄面之注意事頊再填寫本頁)

T N F抑制劑進一步以T N F親和力管柱純化。重爨T N F表現於B L 2…1 /U 3.，在約1 〇 - 2 0 %總細胞蛋白質。細胞團塊以2 0，〇 0 〇 p s i法蘭西壓縮，可4容性材質再於4°C下以0. 0 2 5M T r i s - C 1 p Η 8 . 〇透析。經透析的溶胞産物以0. 2微米過濾，再填料至已預用0.025M T r i s - C 1 p Η8· 0衡的Mono— Cl FPLC管柱上。採用由

0-0. 5M NaC^/0. 025M Tris-C 9. p Η 8 . 0，並以O D 2 8 〇偵測。收集1毫升流份，以S D S _ PAGE分析純度。接下來的TNF a匯集基於經考馬斯染色之SDS - PAGE有約9 0%純度，基於Bradford蛋白質分析（以溶菌酶為標準）及ME 1 8 〇生物檢定（以Amgen’s TNF a為標準）知具完全活性(Bradford , M. Anna 1. Biochem. 7 2 ， 2 4 8 — 2 5 4 ( 1 9 7 6 ) j 〇 T N F a 以 Am i con Cent r i prep — 1 0 濃縮至約 2 5 毫克/毫升，以 1 〇〇mM NaHCOa，pH8. 5透析，再相接至Affi gel — 1 5樹脂（每毫升樹脂有2 5毫克TNF)。大於80%偶合效率可得高容量樹脂，其用來進一步純化T N F抑制劑。經濟部中央揉準局印製將終濃度為1 — 4 πτΜ的PMSF加至DEAE C L - 6 B匯集液中，再填料至4 X 1公分TNF親和力管柱中，其已於4°C下用0. 025M Tr i s-Cl , Ρ Η 7 . 5平衡，流速為0. 1毫升/分。管柱再以0. 甲4(210X 297公角） -46 - 2〇β234 Α6 Β6

五、發明説明（45) 0 2 5 M Tr i S-C1 ,ρΗ2. 5潤濕，直到溶離液的0D 〃。回復至基準線。之後管柱以0.0 5Μ Ν aPhos，ρΗ2. 5溶離，再以0D2S。偵測。圖7 示出以0.05M NaPhos，pH2.5自TNF 親和力管柱中溶離液之0D2S。剖析圖。 T N F 抑制劑於 Syncropak RP-8 (C8)管柱上以逆相HP L C純化至呈均質。匯集TNF親和力管柱之OD28。峰，且立即填料至已預用0. 1%TFA/H2 0平衡之RP-8管柱，採用直線1%/分之0.1%T FA/乙睛梯度，（由0-50%)再立即以ODu 5及 0 D 2 s。偵測。收集流份，利用L 9 2 9細胞及實例1 B 所述之天然凝膠分析進行生物活性分析。此二種分析法顯示2 8 - 3 2流份之生物活性，其相當於以（8%乙睛溶離的〇D2i5及OD2S。峰◊圖8 A及8 C示出於Syncro-Pak R P' - 8管柱上，T N F親和力匯集液之層析剖析圖具有來自L9 2 9胞毒性分析之相當生物活性。圖8B f 示出RP - 8匯集液1 5%還原性SDS— PAGE之銀染色圖，顯示在3 0 kDa有一單帶。 f請先Kliif背面之注意事邛再蜞寫本頁) / •坎· •打. •線. 經濟部央搮準局印裝 D.鑑宙30kDa TNF抑制割之蛋白皙細份 30kDa TNF抑制劑是一種糖蛋白，僳蛋白質轉移至硝化纖維濾紙後，以刀豆素-過氣化酶偵測。此方法為 W ο o d 及 Sarinana 法之修飾（Anelytical Bi-ochem. 69，320-322 (1975))，其可直甲 4(210X297 公沒） -47 五、發明説明（46) (請先閔讀背面之注意事Jfi再填寫本頁) 接於丙烯醯胺凝膠上鑑知為糖蛋白。糖蛋白的過氧化酶染色俗利用共轭於C ο η A之過氧化酶，或非軛之C ο η A 。當使用非共軛的Co nA，硝化纖維濾膜與含Co nA (0 . 5毫克/毫升，Miles Laboratory ) /碟酸鹽缓

衝液，pH7. 2 (PBS)之溶液共置1小時，再於P BS中洗3X5分鐘。經洗過的濾膜置於璋菜過氧化酶（〇 · 1毫克/毫升，Sigma Chemical )中1小時。經P B S中3 X 1 5分後，濾膜浸於含有3毫克/毫升4 -氯一 1 -某醇（Sigma Chemical )及 1 2 . 5 徹升 / 毫升過氧化氫之溶液中，直到呈色。可看出糖蛋白呈紫色。待濾膜呈色後儘可能立卽照像。如圖3所示。 T N F抑制劑的化學脱糖化作用，偽採£讣^?&1卜 ynek，Hof，Reichert 及 Weber 的方法（Analytical Biochem. 118， 131-137 (1981)) 〇將〇 . 2 5毫升茴香醚（Eastman Kodak )及0 . 5毫升三氣甲烷磺酸（Eastman Kodak )冷卻至4 °C，再將1 - 2 0 0毫微克無水的TNF抑制劑溶於3微升的此混合液中。瓶子充以氮氣，再於室溫下培育3 0分。此經脱糖基化的蛋白質於SDS — PAGE上分析（圖4)。經化學處理的TNF抑制劑分子量約為1 8，0 0 0道耳呑。也可在1 4，0 0 0處具‘一帶狀物，但此可能是脱糖基化 TNF抑制劑的蛋白水解片段。利用N -聚醣酶行酵素性脱糖基化作用係依據廠商之操作指示（Genzyme Corp.)除了 TNF抑制劑與N — 甲 4(210X297公沒） -48 -

A B 206234 五、發明説明（47) 聚醚酶之共置以5 - 6小時取代一夜。經變性之TNF抑制劑脱糖基化型式之分子量約為2 0，0 〇〇道耳呑（圖 5 )。當抑制劑在脱糖基化前未變性，則脫糖基化蛋白質的分子量約為2 6，0 0 0道耳呑。 E · fl兒糖基化之3 0 kDa TNF抑制割ISTNF結合

經放射標記的TNF抑制劑（30kDa)以TFM

SA (三氟甲烷磺酸）處理，以除去磺水化合物，再將T

F M S A-以HPLC自蛋白質中分出。蛋白質流份與TN F - affUel混合於4 eC下1小時，且所有未結合的物質再以離也、除去。TNF — affigel 以5 0mM N a P〇4’PH2. 5充份洗滌。每一流份之放射活性經計數後也於S D S — PAGE上分析。TNF抑制劑之非特

CT 異結合利用叛冰屬凝乳蛋白海親.孤力1_凝_滕偵測。結果示於表2°這些結果顯示，脱糖基化的TNF抑制劑（30 kDa)可與TNF結合。 {請先聞讀背面之注意事項再堪寫本頁) .装. •訂· .綵. 甲 4(210X297 公尨） -49 - A6 B6 五、發明説明（48) 表 2 親和力計數（C P Μ ) 樣品型式流過液體溶離物天然的TNF-INH ANF 49401(55.5%) 40014d0%) 天然的TNF-INH 無水CT 80000(98.0%) 1789(2.0%) 經TFMSA處理的 INF-INH ANF 13369(73%) 4908C2J--0%) 經TFMSA處理的 TNF-INH 無水CT 15682(94.0% )926(6.0%) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· .訂· 在另一實驗中，將經放射標記之TNF抑制劑（3 0 k Da)還原，再用N-聚_酶脱糖基化。經脱糖基化後，物質與1 3mM氣化之穀胱甘肽（GSSG)在室溫下共置1 0分鐘，並以5 OmM Tr i s稀釋5倍。再加人半胱胺酸使終濃度為5 mM。此物質在4 °C下培育1 6小時，再與T N F -親和力凝膠在4 °C下混合1 小時。除去未結合的物質，凝膠以5 OmM T r i s .線· 經濟部中央橾準局印裝甲 4(210X297 公发） 50 -50 - g〇6g34_^_ 五、發明説明（4¾ -He 5，pH7. 5充份洗滌。未結合的物質則以5 0 m M NaP〇4，pH2. 5溶離。分析每一流份之放射活性，再對毎一流份進行SDS- PAGE。如表3及圖1 8所示，脱簠華化及再氳i之T N 劑與1N ζ.結合。表 3 親和力計數（c P Μ ) 樣品型式流過的液體溶離物 {請先聞殘背面之注意事項再填寫本頁} 18281(60.0%) 12603(40.0%) 28589(94.0%) 1964(6-0%) 雉濟部中央棟準局印裂天然的 TNF-INH TNF 天然的 TNF-INH TNF (還原/再氧化的）經TFMSA處理的 (還原/再氧化的）脱糖基化的TNF-INH(還原/再氧化的）脱糖基化的 TNF- 無水的 CT 29619(98.4%) 495(1.6¾) INH(還原/再氧化的）無水的 CT 31371(98.7%) 421(1.3¾)

TNF 25066(85.0¾) 4305 (JJLaiS) 肀4(210Χ 297公尨） -51 - A6 B6 206234 五、發明说明（啻例2 .亩序3 0 k D a T N F抑制劑利用 Applied Biosystems Protein Sequencer (蛋白質定序儀）470及477機型決定胺基末端序列。在定序前，經由各種蛋白水解酶産生的肽先以 Applied B i-osystem C8 —微球式HPLC管柱（22公分X2. 1 毫米）純化。 A . fl安某末端亩序約2 5 0微微莫耳經逆相（RP — 8)純化之TNF 抑制劑，直接加至濾膜上再行自動愛德曼降解。所得的序列資料為分子的前3 0個胺基酸。 B .无然蒂白皙夕蛋白鋪由切酯L y s -C水解將約2 5 0徹微莫耳（5微克）經逆相純化之TNF 抑制劑以1微克的蛋白鐽内切酶Ly s - C水解。2 5 t：下1 2小時之水解係在（Μ尿素，0. 0 1%，肚i 2 0 •及（50mM Ν Η 2 H C Ο 3 ρΗ8. 0 下進行。在肽純化前，水解物與5 0倍莫耳濃度多之二硫異赤絲藻醇培育1小時而還原，或是與2倍莫耳濃度多之〔3Η〕-碘醋酸（較二硫異赤絲藻醇為多於3 7 °C下再培育1小時而還原及烷化。圖9 A示出此水解物之逆相Η P L C型式。圖9 βΛ示出此水解物經烷化作用後之逆相HPLC 型式。甲 4 (210X297 公角） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .蛑. •打. •綵. -52 - A6 B6 206^34 五、發明説明（51) C .无然蒂白皙：>蛋白鍊内切酶A s P _N水解 {請先閱讀背面之注意事項再填穷本页) 將約2 5 0徹徹莫耳（5徹克）經逆相純化的TNF 抑制劑以〇. 5 — 2. 5微克蛋白鐽内切酶Asp - N水解。3 7°C下1 2-1 8小時之水解係在1M脈-HC又，0. 01%吐溫 20 及 150mM NaPhos，p Η 8 . 0下進行。於肽純化前，水解物依實例2. B.般還原及烷化。圖10示出此二種水解物之逆相HPLC型式。 D.番甶皙之澴原羧甲基化作用經逆相Η P L C純化之T N F抑制劑以〔3 Η〕碘乙酸還原及羧甲基化，如 Glazer et al所述，於Chemi-ca1 Modifications of Protein. P103—104 (1 975))，除了在烷化後進行連纊二回的還原作用。蛋白質於蛋白酶水解前再以逆相Η P L C純化。 Ε .經镖展羧甲甚仆.萑白皙夕蛋白鍊內切酶V 8水解將5 5微撤莫耳（約1撤克）經還原羧甲基化的ΤΝ F 抑制劑溶於 150mM NaHC〇3，T)H8. 0 中，再以〇 . 2微克V 8蛋白酶在2 5 °c下進行1 8小時的經濟部中央揉準局印裝分析水解。由逆相HPLC (圖11A)顯示有三個可定序的肽，並顯示依序有較大規模的水解。將約2 2 0徹微莫耳（4. 5微克）經還原羧甲基化的T N F抑制劑，以 1微克V 8蛋白酶在2 5 °C下水解5小時，若再加入〇 . 甲 4(210X 297公沒) -53 - A6 B6 206234 五、發明説明（52) 5微克V8蛋白酶，則再繼續水解16小時。圖11乃示出大規模V8水解物的逆相HPLC。請先KI讀背面之注意事項再填寫本頁) F . 3 0 k D a TNF抑制割的完伞一纽结搆，甚於旺序列及c D N A序列各種肽片段依據實例4所得的c D N A序列排列。此示於圖1 9。經蛋白質定序知不相同的殘基為第1 4，4 2，43，44，96，97，105，107，108 及 1 1 0 - 1 19 號殘基。G1 n-I 1 e - As η 序列很明顯地是3 0 kDa TNF抑制劑的菝基末端。

啻例3 · 3 0 k D a TNF抑制商丨由猙PMA及PHA 刺激^ 0 9 3 7紬_所産靱 •訂* •線. 經濟部中央梯準局印裝類單核單胞之細胞株U 9 3 7於含有1 0 %牛胚胎血清之RPMI培養基中（3 7 t:)培養至細胞密度約IX 1 〇 6細胞/毫升。細胞再以離心除去，並再懸浮於5個不同的1 〇〇公分2培養盤中，以2 X 1 0 s個細胞/晕升於無血清，但加有1〇毫徹克/毫升PMA(大戟二葙醇 1 2 —肉豆蔻酸酯1 3_醋酸鹽）及5微克/毫升PHA -P (植物血球凝集素-P)的RPMI中。一値只經過 1 〇分鐘培育的培養盤，回收其調適培養基當做零時間之對照組。剩餘的培養基相繼於塗盤後2 4，4 8，7 2及 9 6小時後取出。這些檢品中的蛋白質以Centr i prep- . 1 0 ( Am icon Corp )處理自各濃縮至約4 0 0微升。肀4(210X297公发） -54 - A 6 B6 206234 五、發明説明（53) 每4 0 0微升的檢品再與等量的AHigel — 1 5 ( Bi〇r- ad Cor p.)混合，後者含有的χ 〇毫克/毫升經本實驗室純化的人類重組體TNFa。此TNFa於與Affigel -1 5樹脂結合前，已由其對老鼠L9 2 9細胞之毒性示出為具生物活性的。調適培養基在室溫下分枇與T N F a親和力樹脂培育 2小時。離心除去未結合的部份，樹脂再1毫升（5 0 0 微升，2 X )含0 . 1 %明膠的P B S (磷醆鹽緩衝之食鹽水，pH7. 5)洗滌。結合的物質以2 5mM單鹼基磷酸鈉，pH2. 5溶液（4 0 0微升，2X)溶離。各 4 0微升的未結合，經洗滌及溶離出的流份乾燥，再懸浮於10微升的25mm Tris pH7. 5中，並與 2 微升（10〇pci)的 TNFa (400 — 8 0 0居里/毫莫耳，Amersham )混合，於室溫下培育 3 〇分。這些混合物再與5微升4 0%蔗糖及1毫升〇. 1 %溴酚藍混合，如實例1 B般填料至4 %天然的丙烯醛胺凝膠上。來自各樣品的調適培養基，除了零時間對照組之外，其中所含的TNFa結合活性以此分析示於圖1 5 Ο

毎一樣品中剩下的3 0 0微升（第1次低pH溶離液 )填料至C8 HPLC!管柱，再以乙睛直線梯度溶離6 〇分鐘（1%/分鐘，1毫升/分之流速，收集1毫升流份）◊每一流份乾燥，再懸浮於50徹升的PBS+0. 1%明膠。毎一流份取1 〇微升依上述和；251 — TNF Γ4先閑靖背面之这专事項再填寫本頁) ，蛑· •訂· 經濟部中央搮準局印製甲 4(210X 297公沒） -55 - 五、發明説明（54) a混合，再以天然聚丙烯醯胺凝膠分析。於相當於3 3 % 及3 0 %乙腈處可偵測到T N F a結合活性，如圖1 6所示0

啬例4 .於猙PMA/PHA處理的U9 3 7細胞中分析德訊R N A U9 3 7細胞依實例3所述生長至1 X 1 Ο6細胞/ 毫升之密度，再以2 X 1 0 6個細胞/毫懸浮於無血清培養基中，加或不加有ΡΜΑ (10毫微克/毫升）及ΡΗ A (5撒克/毫升）。採樣於1小時+/-PMA/PH A，及1 7小時只+ PMA/PHA。自細胞中以Chom-czynski及Sacci的硫氰酸胍-酚-氯仿方法製備全部的 RNA ( Analytical Biochenistry 1 6 2 : 1 5 6 -1 5 9 (1 987)) 。 PolyA*RNA 藉回冷至寡 d T 纖淦素（Bethesda Research Lahs )製備自總 R N A。每一 P〇 1 y A*RNA取8微克填料至6. 6甲 1. 2%瓊脂糖凝膠。凝膠内之RNA吸漬至Z e t 經濟部中决搞準局印架 a探测膜（BioRad )。膜依實例5,以寡核苷酸探針篩選人類基因體ONA庫所述般處理。加入1 X 1 〇6c p m/毫升經標記的單股DNA探針（聚核苷酸激酶）。此探針的序列為： . 5 ' TTGTGGCACTTGGTACAGCAAAT 3 ’ -56 - {請先閱讀背面之注专事頊再填寫本頁) 甲 4(21〇Χ297 公絮） _B6_ 五、發明說明（55) 且其相當於圖B所示4 1 0 - 4 3 3鹼基之序列。於6 5 °C下經過一夜雜交後，膜洗滌於室溫下以6 X S S C，0 .1 % S P S洗一次，6 5 °C相同溶液下洗一次，再曝於 X光底Η下7 2小時。由圖1 7之放射自顯圖得知，經P M A / Ρ Η Α處理之U 9 3 7細胞於無血清培養基中1小時可清楚地剌激3 0 kDa TNFa抑制劑傳訊RNA 之表現，經1 7小時處理此傳訊R N A則大體上自細胞中消失。此實驗所得的3 0 k D a T N F a抑制劑傳訊R N A之表現，經1 7小時處理此傳訊R N A則大體上自細胞中消失。此實驗所得的3 0 k D a T N F抑制劑傳訊 RNA之分子量約為2. 434鹼基對。奮例5 .製備人類基因體DNA康以得3 0 kDa TN F抑制割人類基因髏DNA以Sau3AI部份水解再做大小選擇。具平均1 5KB大小的DNA再連接至入噬_體起渡神 3 0 之 BamHI 位置 CRimm，P. L.，H〇rness，p.，Ku- cera, J., and Blattner， F. R· Gene 12:301— 309 (1980))。噬菌體於大腸桿菌CES 20 〇中增殖及擴大。經濟部中央橾準局印災* (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A .探針於Applied Biosystems DNA合成儀上合成4段簡併的寡核苷酸雜交探針，如表4所列。每一探針混合物含，指導合成所給之肽序列所有可能的D N A序列。 ' '~ - 57 - —--— 甲 4(210X 297 公藶）五 '發明説明（56} 表 A6 B6 肽名稱 Ly s C 18 LysC 11 LysC 11 LysC 11

肽序列 KEMGQVE QGKYIHP YNDCPG YIHPQNN 探針名稱探針序列請先閲背之注 TNFBP-P20 5' TCNACTCTGNCCCATTCTCTCTT 3 ' TNFBP-P2 ' 5'CAAGGGNAAAGTATCACATCC 3' I ^ TNFBP-P3 ' 5'TATCAATCGATCTGTCCCNGG 31 TNFBP-P4 5'TTAGTTTCTGNGGAGTCAGT 3' N-G，A，Τ，或 C. 裝訂— 寡核甘酸以〔Γ—32Ρ〕AT P ( Amersham Inc.，Arlington Heights， IL ) 及 T 4 聚核轻酸激酶（ Boehr in-ger Mannheim, Indianapolis, IN )標言己，使比活性達 6 - 9 X 1 06c pm/微徹莫耳，依據廠方供應之操作指示。線 B .方法將8. 4X1 05入噬菌體含人類基因體〇ΝΑ,塗經濟部中央搮準局印製再轉移至二層硝化纖維濾紙上。濾紙以1微微莫耳/毫升的TNFBP - P2*探針在5 2。〇下雜交1 6小時，雜交溶液含有1. NaCj，〇. 1M檸樣酸鈉，2 X 登哈瓦溶液（Denhardt, D. T. Biochem. Biophys，甲4(210X297公簷） -58 - A6 B6 五、發明説明（57)

Res. Commun. 23:641—646 (1966))， 0.1%SDS，0. 05%焦磷酸鈉及150微克/毫升的酵母t RNA。此溫度和寡核苷酸匯集中最多AT成員之 Tm 值低 2°C ( Suggs，S. V. in Devlopmental B- iology Using Purified Genes . ( Brown » D. D.，and

Fox， C· F·» eds ) Academic Press， New York， p p · 683-693 (1981))。經雜交後，濾膜在環境溫度下洗45分鐘，共換三次1M NaCl，0. 1 Μ檸檬酸鈉及〇. 5%SDS。在匯集最富含AT成員之 T m估計值下（卽高於雜交溫度2 °C )進行8分鐘迫切的洗滌。濾膜再乾燥，並於加有強化膜下以-7 0 °C放射自顯4 0小時。可測到1 1個呈陽性的雜交噬菌斑，將之分離及擴大 ◊利用相似方法測試這些純糸與T N F B P - 1 2 2 0， TNFBP - P 3’，及 TNFBP-P4 ’雜交的能力。其中有一値純糸（TNFBP-8)可與4個寡核苷酸雜交。此純糸之噬菌斑進行純化及擴大。利用1^〇^£^-3111·-b ( Proncega Corporation，Madison，WI )自此純糸中製備DNA，採用廠方供應之操作方法。取此DNA1微克再以Sau3AI水解，Η段繼代選殖至終BamHI水解之Μ乃定序載體m Ρ 1 8中（YanisA -Perron » C.， Viera. J· » and Messing, J. Gene 3 3 :103-119 (1985)) 〇M13純条再轉移至二層硝化纖維濾膜，並以述的的條件與表4之寡核《酸探 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. ’訂. .線. 經濟部中央搮準局印製甲 4(210X297公沒） -59 - 經濟部中央搮準局印製五、發明説明（58) 針雜交。純化並定序陽性之繼代純糸（Sanger, F., and Coulson，A· R. J. Mo 1 Biol· 94 ： 441 — 448 ( 197 5))其中使用經修飾的T4DNA聚丙酶（Se- quena r e, U· S· Biochemical Co r p. , Cleveland OH ) 依操作指示進行，並使用引子（像用以鑑定純条之簡併探針或以此探針獲得的序列）。在這些所得的序列中為：繼代純条的 TNFBP-Ml 3-Sau3A — P2.-2 及 TNFBP— M13 — Sau3A — Pd ,引子 P3， P3，，P2，，P2及P4。序列資料示於圖1 3。序列中含有除了這些探針特異之外，可指導合成至少4 8個3 0 kDa TNF抑制劑肽胺基酸的序列，且因而證實純条TNFBP 8可指導合成TNF抑制劑。序列中也示出，TNF抑制劑之基因中包括至少一個插入序列（GTA G G G G C A A .................. C C C C A T T C A C A G )。最奋，此序列顯示，30kDa TNF抑制劑以前軀體蛋白質型式合成，且須在A r g - A s p序列處行蛋白水解以産生成熟活性蛋白質。奮例6自猙PMA/PHA刺激之U9 3 7細朐中製備及篩撰mRNA之c DNA瘇由實例4之實驗可知，經PMA/PHA處理1小時的U 9 3 7細胞可含有富含TNF抑制劑（3 0 kDa) 之傳訊RNA匯集。因此，自經PMA/PHA處理的U 9 3 7細胞所得的Po 1 yA*PNA中製備cDNA庫 (請先閱颉背面之注意事項再填寫本頁) •装· •打· 線千 4(210X297公簷） -60 - 經濟部中央搮準局印裝 _ B6__ 五、發明説明（59 (如實例4所述）。自約5微克p〇lyA*RNA可得雙股、平齊端之cDNA，方法基本上如Gubler，U.， and Hof f man，B. J .，所述（1 9 8 3，Gene 2 5:2 6 3 )，使用成組之試驗試劑（Amersham，Arlington Heights，IL )，依據廠商操作指示進行。所製得的雙股 cDNA取約1微克以Ec 〇RI甲基酶處理，而具序列：d (pCCGGAATTCCGG)之EcoRI連接子（New England Biolabs，Beverly，ΜΑ )則利用 T 4 D Ν Α連接酶於E c 〇 R I核酸内切限制酶水解後粘附。此DNA再連接至入噬菌體選殖載體g t 1 0上（Yo-ung，R . A . , and Davis, R. W. ( 1 9 8 3 ) Proc Nat 1 Acad Sci USA，80:1194-1198)，此載體已預先用E c o R I水解，産物再利甩入—DNA包裝萃取物（Gigapack II Gold )(得自 stratagene La Jolla ，CA )，依其操作指示包裝至感染性入一噬g體粒子内。此入溶胞産物（cDNA庫）再用以感染大腸桿菌C6 〇〇 hf1A，且顯示出該基因庫含有約2. 5X10 5個重組體成員。取此基因庫約4X1 0 5成員，塗佈於大腸桿菌C6 〇〇 hflA 株上（5xl04p. f . u./盤）。硝化纖維膜在其上做二次掀起，濾膜再依實例5所述（篩選人類基因庫）處理。濾膜上的DNA再與如實例4所述相同的經3 2 p標記探針雜交，除了其雜交溫度改為4 2 °C 。自所塗佈的4 X 1 〇 5重組噬菌體中，有3個噬菌斑可 (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· *打· -缘. 甲 4(210X297 公爱) -61 - A6 B6 五、發明説明（60 與探針重覆雜交。這些進一步再分離並如上述般探測，且另加具有以下序列的額外合成探針：5’ CCCCGGG CCTGGACAGTCATTGTA 3’。此探針相當於圖1 3所示人類基因體T N F抑制劑6 7 1 _ 6 9 4 鹼基。二種探針均與第一次鑑定的三個噬菌斑雜交。經噬菌斑純化後，DNA製備自此三個純糸，再繼代選殖至Ml 3載體MP 1 8及MP 1 9的E c oR I位置 (如實例5所述）。此三値cDNA均含有二個EcoR 1片段，其一約8 0 0 b p係三個純糸共有的，其二分別為 1300bp，llOObp 或 lOOObp。於 cD ΝΑ第1股合成中，每一純糸單獨的E c o R 2H段源頭以反轉錄酶不完全地加長。因此，這些Ec 〇RI片段很可能成為TNF抑制劑mRNA的5 ’端及3 ·端之8 0 0 b P片段。此可由這些片段之DNA序列證實，如下所述 Ο 經濟部中央採準局印裂 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 自上述cDNA的Ec 〇RI繼代純条中，可完整的 2 1 0 0 b p cDNA序列。使用二脱氧核苷酸鐽終結之 8 定序法（Sanger，F· and Coulson，A· R. ( 1 9 75) J. Mol. Biol 94:441 — 448) 〇使用經修飾的 T7 DNA 聚合酶，Seguenase ( U . S · B i ο -chemical， Cleveland， ΌΗ )為加長用酵毒，並依操作指示進行。定序用引子係合成的寡核苷酸，製備自TNF抑制劑之人類基因髏序列，如圖1 3所示，或以這些引子獲得之序列。圖2 0示出由其中一個cDNA純糸衍生而得甲 4 (210X297公廑) -62 - 經濟部中央橾準局印装 306¾^_^_ 五、發明説明（61) 之經轉譯序列。此序列相當於以蛋白質序列資料所得者，如圖1 9所述。自入—g t 1 〇-7 c t n f bp純糸中所得的人類3 0 kDa TNF抑制劑cDNA完整序列示於圖2 1。

賁例7 .於大腸捍菌上表現3 0 k D a T N F抑制割D N A 可指導合成可溶性TNF a結合活性的TNF抑制劑 (30kDa) cDNA基因部份已可製備而表現於大腸稈菌中，如下文所述。由於界定由尿液衍生之T N F抑制劑羧基末端部份之蛋白質编碼序列，於cDNA序列中並無终結密碼子，（見圖2 0，7 7 1鹼基，序列Q I E N )於是以活體外寡核替酸指令之突變作用加入~個（BioRad，Richmond， CA)。得自純条人- gtl07ctnfbp，長 13 0 0 b p EcoRI片段之M13mpl9純糸與下列之合成寡核《酸雜交： 5' CTACCCCAGATTGAGAATTAAGCTTAAGGGCACTGAGGAC 3’ 待第2股合成且轉感至適當宿主之後，藉著與上述之突變寡核苷酸雜交可鑑定突變株純糸。如此鑑定的純糸，其分子本質由DNA定序（如實例5所述）。其次，一段由Stye (303位置）及Hindi界定的468b (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •訂. _綠· 甲 4(210X297 公芨）一 63 — A 6 B6 五、發明説明（62) P長片段（定義蛋白質的羧基末端）以經突變的純条自R f型中取出，再嵌入含有t a c I啓動基因的大腸桿菌表現質體中（DeBoer，H . A. , et a 1 .， ( 1 9 8 3 ) Proc ，Natl. Acad. Sci, USA 8 0 : 2 1 - 2 5 )。此構築使用以下合成的雙股承接子序列完成：

5’ GATCCGATCTTGGAGGATGATTAAATGGACAGCGTTTGCCCC 3’ GCTAGAACCTCCTACTAATTTACCTGTCGCAAACGGGGGTTC 此承接子轉譯地偶合TNF抑制劑基因（如上述之經截斷型式）至噬菌體T7基因10的前12個密碼子。此構體之D N A序列，由基因1 0轉譯起始點至承擔子序列示於圖2 2。有必要加甲硫胺酸密碼子（ATG)至TNF抑制劑基因序列，以可於大腸桿菌中表現。此質體稱p T N FiX-1。此蛋白質之預測分子量為約..1,7 .，6 α 〇 k a a，此分子量與脱糖基化的天然τ N F抑制劑（3 0 k D a )極相近。經濟部中央揉準局印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 奮例8 .自大隄捍_中純化活件的T N F抑制劑（3 0 k Da) · 將1升生長於經誘導條件下2小時的大腸桿薗培養物細胞（PTNFIX-1 JM1 07 1 on·)再懸浮於 10 毫升 50mM Tris-HCj? pH7. 5 (含甲 4(210X 297公沒） —64 — ^__ 五、發明説明（63) 2 m M EDTA) (ΤΕ缓衝液），並法蘭西式以2 Ο ，OOOpsi (4°C 下）壓縮。物質以 20，000g 離心1 〇分鐘。所得的團塊再以T E -缓衝液洗一次。經洗過的圍塊再懸浮於2毫升6M胍-HCJ?，並於室溫下培育1 〇分鐘。培育後，加入8 0微升5 0 OmM DT T，混合物再於室溫下培育3 0分鐘。經此處理後，仍未溶的物質則以2 0，0 0 0 g離心1 5分而除去。對上清

液加1 2 0微升5 0 OmM氣化的穀胱甘肽，混合物於室溫下再培育1 〇分。物質再稀釋於2 0毫升的0 . 6%T r i s鹼溶液，並加入2 2 0微升5 0 0 m Μ半胱胺酸。培育於4 °C再繼續1 6小時。經1 6小時後可看到某些不溶的殘留物◊此不溶物以2 0，0 0 0 g離心2 0分而除

去。所得的上清液以5 OmM T r i s - H C 5 pH 7. 5在4 t：下透析1 6小時，之後再以2 0，0 0 0 g 離心1 0分鐘。上清液中加入终濃度4mM的PMSF，再將此物質填料至了-N F -親和力管柱（〇. 7X2公分 )，流速為0. 1毫升/分。此管柱以5 OmM T r i 經濟部中央橾準局印裝 (請先閣讀背面之注竟事項再填寫本頁)

s - H C 5 dH7. 5充份洗滌。結合的蛋白質再以5 OmM N a P 0 4 HC 又 pH2.5 溶離。此 PH 2. 5溶離物再填料至已預用〇. 1% T F A / Η 20 平衡的RP8管柱。TNF抑制劑以〇.1%TFA/乙腈直線梯度，以1%/分溶離（圖2 5)。流份於SDS —PAGE上分析（圖2 6)，再進行胞毒分析（圖2 5 )。以定位出TNF抑制劑。由大腸桿菌中産生的TNF 甲 4(210X 297公爱） -65 - 經濟部中央搮準局印裝 A 6 B6 五、發明説明（64) 抑制劑（3 0 kDa)移動至約2 0 kDa ,因其尚未糖基化。第3 0至3 5號流份含有T N F抑制劑。此物質的胺基末端序列示出，以大腸桿菌産生的T N F抑制劑具有以下序列：

Met — Asp — Ser — V a L — ( ) _ Pro — Gin _ GLy _ L Y s —Tyr — ILe — His — Pro— Gln_ Asn — Asn — Ser — 利用此方法，自1升培養中可得約4 0微克的TNF 抑制劑（3 0 k D a )。産率為2至3 %。於再折叠前純化T N F抑制劑可使産率增至5 0 %以上。啻例9 .於動物細朐中表現编碼3 0 k D a T N F抑制割之某因動物細胞表現T N F抑制劑需以下步驟·· a. 構築表現載體。 b. 選擇宿主細胞株。 c. 將表現載體引入宿主細胞中。 d. 操作重組體宿主細胞以增加TNF- Bp之表現水平。 1 .設計以於動物細胞中使用的τ N F抑制劑表現載體，可有許多型式，包括強組成表現構體，可誘導的基因構件，以及為特別細胞型式表現而設計的構體。在所有例子中，啓動基因及其他的基因調控區，如加強子（可誘導或否）及聚腺替化作用訊號，以相對於c D N A序列適當甲 4(210X297公廣）一 66 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装. •線. A 6 B6 經濟部中央採準局印製五、發明説明（65) 地置於以質體為基礎的載體中。此種構體的二個實例列於下。使用強組成啓動基因區的構體，可以巨細胞病毒（C MV)立即早期基因控制訊號製成。此質體之構築採用標準分子生物技術（Maniatis，et al.，Molecular Cion-ing a Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Labor- atory，1982)，如此生成的質體示於圖23。（ p C Μ V X V β TNF BPstopA)。將 SV4 0的複製源納入此質體中，以有助於其於CO S細胞中之使用以做瞬時表現分析。此特別構體含有CMV立即早期啓動基因及加強子，如Boshart，et al所述（Cell 4 1 : 52 1 - 530，1985)，其後接上兔子/3 —球蛋白第二値插入子（見Van Ooyen et al.，Science 2 06:337-344，1979)，其二側接有 Ba mH I及E c o RI限制位置。此插入子之所以包括在其中因已示出在某些表現載體當將插入子包括在轉錄區可使表現水平增加。（Buckman and Bery，Mol. Cell，Biol ,8:4395-4405，1988)。聚腺苷化訊號由猿猴病毒4 0 (SV4 0)序列提供（輿圖同位）2 5 8 9 — 2 4 5 2 ;見 Reddy . et a 1 .< Science 2 0 0 ： 494-502 ^197-8) 〇30kDa TNF 抑制劑c DNA序列可如下般修飾：純化自人類尿液的TNF 抑制劑羧基末端3 ·外延區己被刪除，並將停止密碼子遣傳操作於羧基末端天冬醯胺之後。於類似載體中之未修飾 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· •訂· •線. 甲 4 (210X297父沒） -67 - 經濟部中央捸準局印裂 A6 〇nfi23^___^_ 五、發明説明（66) 3 0 k D a TNF抑制劑cDNA序列已嵌入COS細胞中，且已示出可增加此細胞之TN F結合活性。使用來自S V 4 0早期基因之強組成啓動基因區之第二個構體（見圖 24) (pSVXVTNFBP s t ο ρΑ)見於質體 pSV2CAT 中（Gormamet al.，Μ-ol. Cell, Biol 2:1 044-1 0 5 1 ， 1 982) ° 此質體可以此種方式操作，以利用榡準分子生物技術將T N F抑制劑c D N A換成氣霉素乙醯轉移酶编碼序列。同樣地，TNF抑制劑cDNA可如上般修飾成為CMV啓動基因構體。SV4 0早期啓動基因區，包括由H i η d I至BaraHI位置之序列（輿圖相當於5 0 9 0 - 1 8 8 :見 Reddy et al.， Science 2 0 0 : 4 9 4 — 5 0 2，1 9 7 8)及SV4 0聚腺苷化作用訊號如上述可為 C Μ V構體。 2」二種動物細胞株在使用上述載體下可用來表現Τ N F抑制劑以産生活性蛋白質。細胞株，其促進此外來基因表現之能力已被確定者有：猴腎細胞，COS- 7，及中國倉鼠卵（CWO)二氫葉酸還原酶缺失（d h r f -)細胞。 3.為了開發衍生自CHO之連缠細胞株，且可分泌 3 0 k D a TNF抑制劑至細胞培養基，於是將TNF 抑制劑表現質體引入這些d h f r 細胞中，並將可指令二氫葉酸還原酶合成的質體一起以磷酸鈣-DN A沈澱技術引入^此方法像由Graham and Van der Eb所述（V- (請先W讀背面之注意事颅再填寫本頁) .装. 線_ 甲 4(210X 297公沒） -68 - A 6 B6 五、發明説明（67) irology 52:456—467，1973) 0 依 Ring- old et al所述選出可吸入DNA並表現DHFR之細胞 (J. Mol. A p p1 , Genet . 1 : 1 6 5 — 1 7 5 ， 1 9 8 1 ) ° 4.可表現TNF抑制劑基因構體的細胞，可經操作增加T N F抑制劑産裂之水平◊含有T N F抑制劑表現載體及d h f r表現載體的細胞可經由基因擴大作用取出，係依 Ringold et al 所述之方法（J. Mol· Appl. Genet. 1:165 -175，1981)使用胺甲碟昤，即d li f r之競爭性拮抗劑。基因擴大作用可使細胞中有更多套數的d h f r及TNF抑制劑基因，同時可增加T NF抑制劑mRNA水平，其依序造成更多的TNF抑制劑蛋白質而被細胞産製。奮例10.自U93 7調滴培泰基中分離二種TNF -抑制勘丨，#存人類尿液中##有第二種TNF抑制劑人類U 9 3 7細胞於1 5 0公分2二角瓶中生長至密度為毎毫升1 X 1 〇5値細胞，利用RPMI 1640 培養基，含有2 0 0單位/毫升的青徽素，2 0 0單位/ 毫升的鍵徽素，1 〇%牛胚胎血清。經3 7 °C下培育3天後，細胞以1 5 0 0G離心7分鐘而回收。細胞再以2 X 1 〇6/毫升之密度再懸浮於無血清之RpMZ 1 6 4 〇培養基。細胞於5微克/毫升PHA-P (植物血球凝集素）及1 〇毫徹克/毫升(大戟二萜醇1 2 -肉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 叙· .線. 經濟部中央橾準局印裂 T4(210X297 公沒） -69 - A6 B6 五、發明説明（68) 豆蔻酸酯1 3 -乙酸鹽）中生長2 4小時。以離心收集2 4小時之培養基（4 4 2 5毫升）再以 Am i con Y Μ 5濾膜濃縮至約1 0 0毫升。此物質以〇 . 1毫升/分之流速通過.X N F -親和力凝膠（0 . 7 X 2 公分），凝膠再以50mM T r i s - H C p Η 7 .5充份洗滌。結合的蛋白質以5 0 m Μ N a Ρ Ο ,-Η C $，ρ Η 2 . 5溶離，且Τ Ν F抑制劑與其他摻雜的蛋白質以HPLC-RPC8分出。如圖2 7所見，可觀察到二値TNF-抑制劑峰。RPC 8流份之S D S — Ρ AGE分析顯示，此二峰的分子量引為3 0 kDa及4 0 kDa (圖 28)。此 30kDa 蛋白質（TNF-IN Η I )接受睽棊末端序趾it抵，且發現和上述尿液3 0 k Da ΤΝΓ —抑制劑為相同序列。然而4 0 kDa蛋白質的序列顯示，此和3 0 kDa蛋白質不同（見實例1 1 )。再次純化尿液中第二個T N F抑制劑峰，其見於圖8 之3 5流份處，顯示也是4 0 kDa TNF抑制劑蛋白質（圖2 9及3 0 )。 4 〇 k D a TNF抑亂mjL是一種糖蛋白。此偵測产 ~ -1--- 傜於蛋白質轉移至硝化纖維濾膜後以刀豆素A -過氧化酶進行，如實例1 D所示。4 0 k D a T N F抑制劑經N -聚醣酶處理後之分子量，於S D S - P AGE示出為約 ^3__6_JUD_a_〇 (見實例1 D之步驟）。依循上述實例1 . E的步驟後，可決定此脱糖基化的 4 0 kDa TNF抑制劑也可與TNFa結合。此外， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •策. -訂· •線. 經濟部中央搮準局印裂甲4(210X 297公沒） -70 - ⑽4 五、發明説明（69) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 脫糖基化的4 0 kDa蛋白質也可與TNF/3 (淋巴毒素 )結合。奮例11.由U937衍生乏30kDa TNF抑制劑，40kDa TNF抑制割，及尿液40kDa TN F抑制割之蛋白曹定序利用Applied Biosystem蛋白質定序儀，4 7 0機型迭定蛋白質的胺基末端序列。天然的及經還原且羧甲基化的蛋白質均定序。將約2 0 0微微莫耳的逆相（RP-8)純化之TNF抑制劑填至濾膜上，再做自動愛德曼峰降解作用。所得的序列示於圖3 1。可看出於ϋ 9 3 7衍生之3 0 kDa蛋白質和於尿液中形成及鑑定的相同，4 0 k D a TNF抑制劑蛋白質則與30kDa TNF 抑制劑蛋白質不同。尿液之40kDa TNF抑制劑蛋白質不含2個胺基'末端殘基；否則其與由U9 3 7衍生物。之4 0 kDa蛋白質相同。曹例12. 4 0 k D a TNF抑制劑的一級結構約4 0微克的經還原及羧甲基化之TNF抑制劑（4 0 kDa)以蛋白鍵内切酶V8水解（如上述），所得的肽再以RPC 18管柱分離（圖3 2) ◊肽之純化及定序利用Applied Biosystem蛋白質定序儀，4 7 0機型。約9 0微克的經還原及羧甲基化之T N F抑制劑，以 5微克的肽鐽内切酶Arg-C/0. 2M磺酸氫銨，在甲 4 (210X297 公 «) —71 - 經濟部中央揉準局印裴五、發明説明（70) 3 7 °C下處理經2 4小時水解後，A r g - C水解物填料至11?1>(3-11?8管柱中以分出各肽（圖3 3)。純化的肽依前述定序。某些肽再進一步以T P CK_胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶水解。約5 0 0微微莫耳的Ag Γ - C1 6肽以3微克的TPCK -胰蛋白酶（8(^[11*111代1·-!^-nnhein )/0. 2M磺酸氫銨，於3 7°C下水解7小時，再以RP8分出各肽（圖3 4)。約2 0 0微徹莫耳的肽Ar g — C1 0以1微克的胰凝乳蛋白酶（Boehring-er Mannheim )在3 7 °C下水解3値半小時，所得的肽再以RP18分出（圖35)。決定TNF抑制劑（4 0kDa)部份結構，傜將各値重叠的肽排列（圔3 6 ) 。4 0 k D a T N F抑制劑完全的一级結構示於圖3 8。以蛋白質定序仍未確定之殘基，則總覽cDNA純条之序列（其编碼4 0 kDa T N F抑制劑，及實例14 A及3 9圖所討論的而推衍。啻例1 3鑑定4 OkDa TNFa抑制割クCDNA紳

I 由實例9所示之資料可知，U 9 3 7細胞經PMA及 PHA處理後可産生分子量約為4 0 kDa之TNFa抑制劑。此蛋白質已純化，‘且其胺基酸序列已大體上決定，如實例12所述。表5示出衍自此蛋白質許多肽之序列，且示出混合的寡核苷探針序列，此探針是用來分離指導合成40kDa TNF抑制劑之基因。 .................................{................裝..............................打…：.............線 -:、 -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4(210X 297公沒） -72 - A6 B6 五、發明説明（71) 含有4 0 kDa抑制劑的基因编碼序列，可分離自人類基因體庫（如實例5所述），或得自由mRNA構築之 c DNA庫，此mRNA則得自己用PMA及PHA處理 9小時之U937細胞（見賁例14)。每一基因庫應含有約1 . 0 X 1 0 6個重組子。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局印装甲 4(210X297公沒） —73 - 五、發明説明（72) 表 A 6 B6 肽序列揲針名稱揲針序列

EYYDQTA 40KD-P2'

C 51GAaTATTATGATCAAACAGC 3' G C C C G GT

AQUAFT 40KD-P1

C C . C 5'GTAAAACGAACTTGAGC 3' G G G C G T T T (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

KQEGCR

40KD-PG

C 5'AAACAAGAAGGATGTCG 3' G G G G CAC T .故·

QMCCSKC 40KD-P5

DQTAQMC 40KD-P6'

PGWYCA 40KDP7

C 5'CATTTAGAACAACACATTTG 3' C GCTG G C TC C 5'GATCAAACAGCACAAATGTG 3' C G G G G T Tc c c c 5' CCAGGATGGTATTGTGC 3'_ G G T T •線· 經濟部中央橾準局印製甲 4(210X297公沒） -74 - 206234 A 6 B6 經濟部中央搮準局印製五、發明説明（73) 奮例1 4 .自猙PMA/PHA誘導的U9 3 7細朐中分離4 0 k D a T N F抑制劑c D N A序列 U 9 3 7 mRNA分離自己用PMA/PHA誘導 9小時的細胞。再於寡-d T管柱上篩選，且聚腺苷化之 mRNA經分離後，先以大腸捍菌聚合酶I/RNaSe Η繼以逆轉錄酶使成d s cDNA。d s cDNA接受聚合酶鐽反應，使用表5之簡併探針（4 0 kD-P 1 1及 4 0 kD — P7)為引子。由此反應所得的DNA産物再於Southern吸漬上以40kD — P6’（見表5)探測，可得含於此序列中之單帶。此帶自瓊脂糖凝膠中分離，再選殖於Ml 3噬菌體DNA中（mp 18株），經轉形至大腸桿菌Ml 0 9後，塗佈於含X— g a 1及I PTG 培養基中，鑑定澄明狀噬菌斑因其中含有正確的c DNA 嵌入子。於此純条中之DNA序列示於圖3 7，並附帶由此序列預測之轉譯産物。此胺基酸序列和圖3 6 (12 - 1 0 4殘基）及圖3 8所示之肽序列符合。奮例14A.自猙PMA/PHA誘瀵之U937細朐中分離40kDa TNF抑制劑cDNA純备 mRNA自己與PHA及PMA接觸9小時的人類U 9 3 7 細胞中分離（chirgnin，J. M. et ai.，Bioche-mistry 1 8，5 2 9 4-5 2 9 9) 〇mRNA 利用寡 dT 纖維素純化自此 RNA ( Aviv，H. and Led er, P. ，1 9 7 2 ，Proc» Natl· Aced > Sc i - USA 69， {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •訂. •綠· 甲 4 (210X 297 公楚） -75 - 經濟部中央搮準局印製 A6 B6 五、發明説明（74) 1408-1412)。此mRNA取5徹克合成3微克平齊端雙股 cDN A ( Gubler，U. and Hoffman, B. J. ，1 9 8 3，Gene 25，263-269)。加入 Ec oR I 連接子後，cDNA 以 SephacrylS— 4 0 0 (

Pharmacia )自旋管柱層析及乙醇沈澱純化。此cDNA 取1 〇〇毫微克連接至1微克已經E c 〇 R I水解及鹼性礎酸酶處理的入g t — 1 0，再使用gigapack gold ( St rat agene )活髏外包裝。經包裝的cDNA當塗佈在大腸桿菌〇60011£1時可得2.5\106個重組子。此基因庫1. 2X106個成員以經32P標記的探針4

OkD-9 6 + 7 (5*GGG CGT ATG T G C TGT CCT C A C A G G 3 )重覆篩選，依所述的方法進彳 ΊΓ ( Benton，W. D. and Davis，R. W .1 9 7 7，Science 196，180 — 182)。可分離出1 2個陽性雜交純条，並以探針4 0 kD- 9 6，及 4 0kD-P7再篩選（見實例13中之表5)。其中4 個純条可與三値探針雜交。其中之一，C4 0DK#6以 EcoRI水解，分離出2. 2K6的嵌入子再繼代選殖 (以二種方向）至噬菌體Ml 3載體，mp 1 9中（丫&-rrish-Perron， C·， et al.， 1 9 8 5 ， Gene 3 3 ， 1 03 - 1 1 9)。二股序列之決定使用鏈終結方法（Sa- nger，F. and Coulson，A· R· . 1 9 7 5 » J. Mol. B i -ol.9 4，44 1- 4 4 8)及應用 Ta q DNA 聚合酶（U . S . B i ochem i ca 1 )。圔3 9示出此序列並加上 .................................~ .................装..............................ίτ…：、：：r ................線 -:-'·- (請先閔讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 甲 4(210X297 公寒） -76 - 經濟部中央橾準局印裝 A 6 B6 五、發明説明（75) 其所推演的轉譯産物。序列含有一個單獨的開放讀譯架構，由第9 3鹼基的ATG三聯體伸展至4 0 kDa蛋白質第8 6 3鹼基GAC三聯體之羧基末端、营例15. 40kDa TNF抑制割WT抑制TNF B 好 T N F a 檢査40kDa及30kDa TNF抑制劑，以決定其是否抑制TNF >5 (淋巴毒素）之能力。各種濃度

的TNF — 0 (購自Endogen )與每種抑制劑在室溫下共置1小時。所得的混合物利用實例1 . B . 1所述的L 9 2 9細胞分析法進行TNF α之分析◊這些實驗顯示 3 0 k D a TNF抑制劑對TNF Θ少有抑制作用。然而，4 0 kDa TNF抑制劑則顯示出顯著的TNF 石抑制作用。這些實驗的結果可見於圖4 0。奮例1 6.製備人類基因體DNA康以得4 0 kDa抑制

可依實例5為3 0 kDa TNF抑制劑所述進行為 4 0 kDa TNF抑制劑之適當人類基因體DNA庫製備。窨例1 7.製備某因以於大瞞捍舖中宪琚4 0 kDa T N F抑制劑c D N A

已製備可指導合成可溶性T N F結合活性的部份T N {請先聞讀背面之注意事項再蜞寫本頁) .裝· •打· •綵· 甲 4(210X297公沒） -77 - A6 B6 20¾¾¾4— 五、發明説明（76) F抑制劑（4 0kDa) 〇0\人基因（圖3 9)以依下述於大腸桿菌中表現。由於難以明確決定衍生自尿液或U 9 3 7細胞之成熟 4 0 k D a T N F抑制劑之羧基末端序列，於是基於c DNA純糸之序列分析，構築3個c DNA编碼序列衍生物。第一個伸展至此蛋白質鹼基對8 6 3之假想穿膜序列 (圖 39)並以……GLy Ser Thr G L y Asp之肽序列結尾。下二個為5 1 (△5 1)及5 3 ( △ 5 3)個胺基酸，較此純糸短並分別結束於7 1 0鹼基對… …S e r P r ο T hr ，及7 0 4 鹼基對…… e r T h r S e r ° 此三個羧基末端均以4 0 k Da T N F a抑制劑 D N A Ml 3純条之活體外突變作用 (、、 MutaGene ’ B i oRad » Richmond， CA )生成。最長的純糸首先製成，使用以下的合成寡核苷酸： 1 . 5， CAC TGG CGA CTA AGC TTC GCT CTT C 3 ' 2 . 5 ' GCG GCG CAC GCC GGA TCC GAT CTT GGA GGA TGA TTA AAT GTT GCC CCA G 3 ' 1號寡核Μ酸嵌人一個轉譯終結密碼子於第2 3 5號胺基酸（As ρ)之後，‘並於此生成H i n d I限制酶確認位置。2號寡核替酸承接成熟蛋白質的胺基末端序列， Leu Pro Ala……159號鹼基（圖39)以表現於大腸捍菌，藉著17在1號胺基酸位置嵌入一個Μ (請先閔讀卄面之注意事項再填寫本頁) •装. •線. 經濟部中央搮準局印裝千 4(210X297公潑） -78 - 經濟部中央搮準局印裝公〇抑Μ_^__ 五、發明説明（77) e t，ATG密碼子，及2 7嵌入一個轉譯同相子序列及 5， BamHI限制酶確認位置。以BanHI/Hi ndII水解突變子\113純条的11£ DNA以除去突變片段，再依實例7所述嵌入大腸桿菌表現質體中。帶有此基因構體之純条稱為TNF4 0。以上二個縮短的純条，利用上述分離的4 0 k D a TNF a抑制劑純糸經突變的Μ 1 3衍生物，及以下的寡核苔酸： 5' GTCCCCCACCTAAGCTTCGGAGTATGG 3’ △ 51 5’ GTCCACGTCCTAAGCTTCCCACCCGGA 3’ △ 53 此二個寡核苷酸分別將轉譯終結密碼子引入第710 及7 0 4 bp處（圖3 9)。帶有此基因構體之純糸稱為 TNF : 4 0Λ5 1 及 TNF : 4 0Δ5 3 ° 奮例1 8 .於動物細朐中耒現绾碼4 0 k D a T N F抑制劑之基因於動物細胞中表現4 0 kDa TNF抑制劑純糸，可依實例9進行。可刪去4 0 k D a T N F抑制劑座落在3 ’羧基末端的外延區域，並將停止密碼子遣傳工程至羧基末端天冬胺酸之後。啻例1 9 .於哺乳動物細朐中表琨编碼3 0 k D a T Ν 甲 4(210X297公簷） -79 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *裝. •打· A 6 B6 五、發明説明（78) F抑制割：> 宗f c D N A以增加T N F夸體位詈製成一個表現載體，其中納有圖2 1所示的完全3 0 k D a TNF 抑制劑 cDNA (2. 1Kb)-稱為 p 3 0 KXVA，以及和圖2 3所示之載體相同的其他各方面（即在圖中之TNF — BP序列以質體中單一的Ec 〇 RI位置換上2. 1Kb c D N A )。實例9對於表現載體有更詳晝的説明。此質體利用Feigner et al所述的脂感步驟（Pr〇c. Nati. Acad. Sci. USA，8 4 7 413 (1987))引入COS7細胞中。經轉感的細胞分析其與〔i25I〕TNFa結合的能力。圖4 1示出細胞結合分析之結果，細胞係空白轉感或以P 3 0 KXV A表現載體轉感。於經質體轉感細胞上之結合位置數目明顯地高於對照組細胞上之數目。事實上，完金的c DNA 純条（即编碼較30kDa衍自尿液抑制劑還大的蛋白質的開放讀譯架構）代表TNF受體的c DNA純糸。奮例2 0.於晡乳動物細朐中表現缠碼4 0 kDa TN F抑制劑之c DNA以增加TNF受體位詈利用由入噬菌體#6 (述於實例14A)分離的2. 4Kb c DNA片段製成一値表現載體。此質體和實例 9所述的相同（圖2 3)·，除了在質髏中以4 0 kDa TNF抑制劑cDNA序列取代3 0 kDa TNF抑制劑cDNA序列。分離出質體，其中2. 4kb的Eco R I cDNA片段有二種方向，稱為P4 0KXVA ( (請先聞讀背面之注意事項再瑱寫本页) .裝. •線. 經濟部中央搮準局印裂甲 4 (210X297公尨) -80 - A6 B6 五、發明説明（79) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 意識股方向）及P40KXVB (抗意識股方向）。這些質體在以PBR3 2 2為基礎之質體中含有：SV4 0複製源，巨細胞病毒立即早期啓動基因及加強子，兔子B球蛋白第二値插入子，4 0 kDa TNF抑制劑cDNA ，及S V 4 0早期聚腺苷化作用訊號（此載體之詳細說明，見實例9)。這些質體轉感至COS 7細胞，再做TN F結合分析（見圖4 2)。以P4 0KXVA轉感的細胞在細胞表現呈現的TNF結合位置較單獨的COS 7細胞，或以p 4 0 K X V B轉感的C 0 S 7細胞還多，推測此 c D N A编碼T N F受體。其他的哺乳動物細胞，如C Η 〇細胞可發展而過産此受體，或將4 0 kDa TNF抑制劑分泌至組織培養基中，方式如實例9所述。奮例21.分離自人額蜇菘細朐之抑制割經濟部中央搮準局印製人_單核細胞製備自5 5 0毫升的血液（如Hannum， C. H. et al·. Nature 3 4 3 » 3 3 6—3 4 0 r 1 9 9 0中所述）。新鮮的單核細胞（2X1 07細胞）種入 5 0 0毫升無血清的RPMI (6 4 0培養基中，再以1 〇毫微克/毫升PMA及5微克/毫升PHA — P於3 7 •C下處理2 4，4 8及7 2小時。經培育後，離心收集培養基再濃縮至5 0毫升。·經濃縮的培養基填料至TNF -親和力管柱（2毫升之床體積），一次一樣品，並以酸溶離如實例1所述◊經溶離的物質再以HPL e RPC -8管柱進一步純化，條件和實例1相同，且各個流份再做肀 4(210X297 公簷） -81 - 經濟部中央橾準局印裂 _ 五、發明説明（80) L 9 2 9胞毒分析。圖4 3示出2個TNF抑制作用活性峰。此二峰相當於3 0 k D a及4 0 k D a T N F抑制劑，其也見於經PMA及PHA處理之U 9 3 7細胞培養基，且於尿液中鑑知。奮例2 2 .較短型式之4 0 k D a T N F抑制劑（△ 5 1及△ 5 3 )白士瞄捍蘭中之表現及純化 3 0 0毫升的大腸桿菌培養物（4 0 kDa TNF 抑制劑Λ5 1及40kDa TNF抑制劑Λ5 3)，在誘導條件下分別培養2小時，再懸浮於1 〇毫升5 0 m Μ Tris dH7. 5 及 2mM EDTA 中（TE 缓衝液），並以法蘭西式壓縮於20，000下歷10分鐘。所得的園塊以T E緩衝液洗一次。經洗過的團塊懸浮於2 毫升 6M胍一He 艾 /1 OmM T r i s - H c ^ » p Η 8 . 6/4mM PMSF，再於室溫下培育1小時。經培養後，加5 0 〇mM DTT使终濃度為4mM，且混合物於室溫下再培育1小時。不溶物質以2 0，0 0 0 G離心1 5分鐘除去。加5 0 OmM氧化的穀胱甘肽至上清液中，使終濃度為2 OmM，混合物再置室溫下1 〇分鐘。此物質再稀釋於2 0毫升加有5 mM半胱胺酸之〇 . 6%Tr i s鹸基溶液。·加PMSF使終濃度為2mM。經4 °C下1 6小時之培育，此物質再以3 〇〇倍體積的5 OmM Tr i s— HCi , pH7. 5 於 4°C 下透析，再以2 Ο，Ο 0 OG離心1 5分。上清液填料至TNF - (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· •線. 甲 4(210X297 公爱） -82 - A 6 B6 經濟部中央揉準局印架五、發明説明（81) 親和力管柱（0. 7X2公分，13毫克rhTNF/毫升affigel—10)，流連為每分鐘0. 09毫升。此管柱以 5〇niM Tris-HCi?，pH7.5 充份洗滌。經結合的蛋白質以5 OmM N a Η 2Ρ 〇 4- Η Cj?,pH2. 5溶離。酸性溶離物再填料至RP8管柱 (2 X 2 0 〇毫米，Spelco )，且T N F抑制劑以乙睛 /0.1%TFA之直線梯度溶離，流速為每分鐘梯度1 毫升（圖4 4A及4 5A)。自大腸桿薗中産生之TNF 抑制劑（40kDa TNF抑制劑Δ53及40kDa TNF抑制劑Λ51)在SPS-PAGE上移動至預期位置（圖4 4B及4 5B)。由這些物質的胺基末端序列顯示，由大腸桿菌産生的TNF具有以下序列： Met-Leu-Pro,Ala-Gin，VaL-Ala-Phe-Thr-Pro_Tyr-Ala-P-r ο - G 1 u 使用此方法，約1 5 0微克的各個4 OkDa TN F抑制劑（Λ5 1及Δ5 3)可得自3 0毫升培養基。雖然産率只有幾百分率，但改進此純化的每一步驟可將産率增至3 0 %以上。此二種4 0 kDa -TNF抑制劑（Δ5 1及Δ5 3 )所抑制的不只有TNFa還有TNF-/5。官例2 3.伞長的4 0 kDa TNF抑制劑之表現及純 t請先閏讀背面之注奇事項再填寫本頁) .裝. •訂. •線. 甲 4 (210X297 公簷） -83 - A6 B6 五、發明説明（8¾

1L 一個具活性的4 0 kDa TNF抑制劑可純化自帶有質體的大腸桿菌，此質體中具有可指導合成全長成熟4 0 k D a T N F抑制劑之基因（如實例1 2中所見）。用來分離活性抑制劑的方法和實例2 2相同。此活性抑制劑可抑制TNF-α及TNF- /5，且胺基末端序列和實例2 2所示的相同。奮例2 4. 4 0 k D a TNF抑制酬之胺基酴組成由U9 3 7産製的成熟4 0 kDa TNF抑制劑，以P T C -胺基酸分析糸統做全部胺基酸組成的分析。全長成熟的4 0 kDa TNF抑制劑之確實及預測的組成資料，如圖3 8所示金列表6 ◊ 奩例2 έ .化學修飾的TNF抑制割夕産靱經濟部中央搮準局印製 (請先«!讀背面之注意事項再填寫本頁) 為了增加TNF抑制劑於血漿中之半衰期，可以聚乙二醇（P E G )化學修飾T N F抑制劑。修飾的進行是將 P EG半胱胺酸殘基與TNF抑制劑分子交聯。因於ΤΝ F抑制劑中所有的半胱胺酸殘基均形成雙硫鍵，因此可在毎一抑制劑胺基末端，糖基化位置及羧基末端構築含額外半胱胺酸殘基之突變T NF抑制劑。此突變作用可以含欲求突變作用之寡核替酸以PCR進行。至於3 0 kDa TNF抑制劑，可在第1，1 4或1 0 5號殘基處加上一個額外的半胱胺酸殘基，這些突變株蛋白質可以如實例7 肀 4 (210X297 公爱） -84 - A 6 B6 五、發明説明（83) ，2 2及2 3所述的相同糸統，表現於大腸桿菌。突變株蛋白質和非突變蛋白質一樣有活性◊進行這些蛋白質的 Pegylation ，並評估活性。可依上述構築4 0kDa突變株，並進行Pegylat ion以得活性蛋白質，且可增加T N F抑制劑的能力。 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. •打· .線· 經濟部中央抹準局印浆甲 4 (210X297 公尨） -85 - * A6 B6 五、發明説明（84) 表 6 由D N A序列# 計算之値數實驗個數# 經濟部中央搮準局印敢 A G S e r G 1 y Hi s T h r Ala A r g Pro V a 1 lie Leu P h e L y s T y r T r p Met C y s

X 1 4 2 3 2 5 1 4 4 2 6 17 1 4 2 6 5 6 5 3 3 2 2 13.0 2 2.6 2 3.2 17.8 4 . 5 2 3.9

2 2.3 8 . 7 3 . 4 8 . 6 4 . 6 5 . 4 5 . 0 N D N D N D (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. .線. N D :未決定甲 4 (210X297公沒） -86 - A 6 B6 20623^ 五、發明説明（85) 要了解，應用本發明的教示至特殊的表現糸，將是一般精於此技藝人士依據此處教示之能力範圍内的。因此’ 很明顯地，在本發明方法及産物中一般精於此技藝人士可做修飾及變化。也因此本發明涵蓋這些修飾及變化，只要其屬於所附之申請專利範圍及其相當的範圍内即可。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. •緣· 經濟部中先搮準局印裝甲 4 (210X 297 公潑） -87 -

Claims

號利甲谤气中文申請專利範圍修正本. 楠充 '民固82年3月修正六、申請專利範固 1 . 一種本質上經純化由重組DNA方法所産製之腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑，其俗為可有效地拮抗 TNF且選自如下之（a)經糖基化之40kDa T N F抑制劑，（b )脫糖基化4 0 k D a T N F抑制劑，(c ) Δ 5 1 TNF 抑制劑，及（ά)Δ53 TNF抑制劑，其中該TNF抑制劑具有如下所示之胺基酸序列， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 烴濟部中央標準工消费合作社印製 Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cy s Arg Leu Arg Glu Ty r Tyr. Asp Gin Thr Ala Gin Met Cys Cys S eir hys :.Cys Ser Pro Gly Gin His Ala hys Val. Phe cys Thr Lys Thr Ser Asp thr Val Cys Asp Ser cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Λ s n Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Tiir : Arg Glu Gin Asn Arg lie cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Ly s Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Ly s Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Vc\l Cys Lys Pro cys Alev Pro Gly Thr Phe Ser As n Thr Thr Ser Ser Thr Asp lie Cys Arg Pro His Gin He cys As n val Val AJLa lie Pro Gly As n Ala Ser Arg Asp Ala va 1 Cys Thr Ssjt TJi r Ser Pro Thr Arg Ser MeU Λ1 g Pro Gly A1 a Vel His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser GJLn His Thr Gin Pro Thr Pro GlU Pro Ser Thi: Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met G.ly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr G.ly Asp 本紙張尺度適用中國國家標準（CN.S)甲4规格（210 X 297公釐） T

65. 6.

jj. M； M. 64 ( 3iL· -裝I 訂 Asd Gin 號專利申請案ψ文申請專利範圍1_正本 ..彳衫印今杳1¾¾免） P十':V民國85年6月考 1 · 一種本質上經純化由重組DNA方法所產製之腫瘤壞死因子（TNF )抑制劑，其係爲可有效地捨抗 TNF且選自如下之（a )經糖基化之4 0 kDa T N F抑制劑，（b )脫糖基化4 0 k D a T N F抑制劑，（c)A51 TNF 抑制劑，及（d)A53 T N F抑制劑，其中該T N F抑制劑具有如下所示之胺基酸序列， Lau Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Sar Thr cys Arg I-eu Arg Glu Tyr Tyr. Asp Gin Thr Ala Gin Hst Cys Cys Ser Lys.Cys ser Pro Gly Gin His Ala Lys Val Ph* Cys Thr Lys Thr Sar Aso:Thr Val cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Asn Tro Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Sar Vai Glu Thr Gin Ala Cys Th:· Arg Glu Gin Α5Π Arg 工丄会 cys Thr Cys Arg Pro Gly Tr? Τγχ Cys Ala Leu Ser Lys Gin Gla Oly Cys 112 Arg Lau Cys Ala Pro Leu Arg L/s Cys Ar*g Pro Gly Phe Gly Val Ala JL23- ( Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Vai Val Cys 乙ys Pro Cys Ala Pro l±/ Gly Thr Phe Sar Asn TUr Thr Ser Ser Thr Asp Ila Cys Arg Pro His Gin He Cys Asn Val Val Ala lie Pro Gly* Asn A丄a Ser Acg Asp Ala 176_ 峰 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Sar MeC Ala Pro Gly Ala Val 192 His Leu Pro Cln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gin His Thr Gin Pro Thr 2S2S. Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Sar Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Sec Pro, Pro A丄a Glu Gly Ser Thr Gly Asp 本紙張尺度適用中國國家棣準（CNS ) A4规格（210X297公釐）· _ f (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印装 235 A7 B7 C7 D7 2062S4 六、申請專利範圍 2. 根據申請專利範圍第1項之TNF抑制劑，其中該TNF抑制劑可有效地拮抗tnF α及TNF/3。 3. 根據申請專利範圍第2項之TNF抑制劑，其中該T N F抑制劑被脱糖基化。 4. 根據申請專利範圍第1項之TNF抑制劑，其中該抑制劑是經糖基化的4 0 k D a抑制劑。 5 .根據申請專利範圍第1項之τ N F抑制劑，其中該抑制劑是4 0 k D a抑制劑之脱糖基化型式。 6 .根據申請專利範圍第1項之T N F抑制劑，其中該T N F抑制劑是△ 5 1 T N F抑制劑。 7 .根據申請專利範圍第1項之T N F抑制劑，其中該T N F抑制劑是△ 5 3 T N F抑制劑。 8 . —種用以産製如申請專利範圍第1項之T N F抑制劑的重組D N A方法，其係包括： (a)製備一段具有如下所示之DNA序列或其片段 ----------------一-------裝------訂-----^ ^ (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 經濟部中央標準局S工消費合作社印製衣紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐〉一 2 — B8 C8 D8 六、申請專利範圍經濟部中夹梂準局負工消费合作杜印装 2 • 根據申請專利範圍第1 項之T N F抑制劑，其中該τ n F 抑制劑可有效地拮抗T N F a 及 Τ N F ° 3 * 根擄申請專利範圍第2 項之T N F抑制劑，其中該Τ Ν F 抑制劑被脫糖基化。 4 • 根據申請專利範圍第1 項之T N F抑制劑，其中該抑制劑是經糖基化的4 0 kD a抑制劑 ’且界定爲胺基酸殘基 1 至 2 3 5 〇 5 • 根據申請專利範園第1 項之T N F抑制劑，其中該抑制劑是4 0 k D a抑制劑之脫糖基化型式，且界定爲胺基酸殘基1至2 3 5。 6 * 根捸申請專利範圍第1 項之T N F抑制劑..，其中該τ ν F 抑制劑是Δ 5 1 τ N F '抑制劑，且界定爲胺基酸殘基 1 至 1 8 4。 7 * 根據申請專利範圍第1 項之T N F抑制劑，其中該Τ Ν F 抑制劑是△ 5 3 Τ N F '抑制劑，且界定爲胺基酸殘基 1 至 1 8 2。 8 * —種用以產製如申請專利範圍第 1項之Τ N F抑制劑的重組D Ν Α方法，其係包括：. ( a )製備一段具有如下所: 承之D N A序列或其片段 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 -丁 . 、·» 本紙浪尺度逋用tUB家橾窣（CNS)A4«l格（ 210X297公釐）-2 - 206234 AT B7 C7 D7 六、申請專利範SI i〇 20 30 40 50 60 70 GAATTCGGCG CAGCQGAQCC TGGAGAGAAG GCGC了GGGCT GCGAGGGCGC GACGGCGOJA GCGCACGGGQ 曰 *:> 90 101 110 119 CAACCGGACC CCGCCCGCAC CC ATG GCG CCC GTC GCC 6TC TGG GCQ GCG CTG GCC M£T Ala Fro Val AIa V/al Trp A1a Ala Leu Ala 12Θ 137 146 155 164 173 GTC 6GA CTG GAG CTC TGG GCT GCG GCG CAC GCC TTG CCC GCC CAO (3丁(3 6CA 丁丁了 Gly Leu GXu Leu Trp Ala Ala Ala His Ala Ueu Pro Ala Gin Val Ala Phe 1Θ2 191 200 209 21Θ 227 ACA CCC TAG GCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TGC CGG C丁C AGA GAA TAC TAT GAC Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg leu Arg Glu Tyr· Tyr Asp 236 245 254 263 272 281 CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC AGC AAG TGC TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC Gin Thr Ala Gin ΠΕΤ Cys Cya Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys V占i 290 299 308 317 326 335 TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC Phe Cya Thr Uy^ Thr Ser Asp Thr- Val Cya Asp Ser Cys Glu Asp Ser 了hr* Tyf T.44 353 - 362 371 3Θ0 :·3? ACC CAG CTC TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pra Glu Cys Leu Ser Cya Gly Ser Arg Cys Ser 37 曰 407 416 425 434 443 TCT GAC CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CSG GAA CAG AAC CGC A>C TGC ACC Ser Aap Gin Va I Glu Thr Gin Ala Cys Thr- Arg Glu Gin Asn Arg lie Cys Thr· 452 461 470 479 4ΘΘ 497 TGC AGG CCC GGC TGG TAd TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC CGG CTG TGC Cys Arg Pra Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ger Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys 506 515 524 333 '542 531 GCG CCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC STG GCC AGA CCA GGA ACT GAA Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pra Gly Thr Glu 56<：» 569 57曰 5S7 596 605 ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT Thr Ser Asp V^l Va i Cy3 Uys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Thr Thr 614 62Z 632 641 650 659 TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC CAG ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT Ser* Ser* Thr* Asp lie Cys Arg Pro His Gin lie Cys Asn Val Va 1 Ala lie Pro 668 677 &8ώ 695 704 713 GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA GTC TGC ACG TCC ACG TCC CCC ACC CGG 丁 ΑΤΟ Gly Aen Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser MET 722 ·· 7ZI 740 749 758 767 5cccc?G^GMGT^c^TTACCcc^cciGTiTcc^Ei^T5c5^c^cSEG Ala pro Gly Ala Val His Leu Pro Gin Pro V*1 Ser 丁hr Arg Ser Gin His Thr 本紙诅尺度適川1i，W :?：栺準（CHS) Ψ4规格(210x297公垃） (請先閗磧背面之注意事項再填寫本頁). ·-♦ 計· 經濟部中夬標準局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 10 20 30 40 50 60 7ι GAATTGGGCG CAGCGGAGCC TGGAGAGAAG GCGCTGGGCT GCGAGGGCGC GAGGGCGCGA GCGCAGGGG* 8〇 go y___101___110___119 CAACCGGACC CCGCCCGCAC CC ATG*GCG "cCC GTC GCC GTC TGG GCC GCG CTG GCC MET Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala 128___ 137 146 155 _ ^164 — _ 173 — _ GTC GGA CTG GAG CTC TGG GCT GCG GCG CAC GCC TTG CCC GCC CAG GTG GCA TTT Val Gly Leu Glu Leu Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe 182 191 200 209 218 227 ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TGC CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr A3p 236 __2A5 254 263 272 281 CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC AGC AAG YgC TCG CCG GGC CAA *CAT GCA AAA GTC Gin Thr Ala Gin MET Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys Val (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 290 299 308 317 326 335 TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser cys Glu Asp Ser Thr Tyr 344 353 362 371 380 389 ACC CAG CTC TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser 398 407 416 425 434 443 TCT GAC. CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC ACC Ser Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg He Cys Thr 452 461 470 479 488 All 經濟部中央揉準 β 工消费合作社印製 TGC AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC CGG CTG TGC Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu 〇ys 506 515 524 533 542 551 GCG CCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CCA GGA ACT GAA Aid Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala ΑΓ9 Gly Thr Glu 560 569 578 587 596 605 ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr 614 623 632 641 _ _ 650 659 TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC CAG ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT Ser Ser Thr Asp He Cys Arg Pro His Gin lie Cys Asn Val Val Ala lie Pro 本紙張尺度遑用中國H豕稞竿t ，如礼价 3 206234 六、申請專利範圊 776 785 794 803 812 821 CAG CCA ACT CCA GAA CCC AGC ACT GC了 CCA AGC ACC TCC TTC CTG C丁C GCA ATG Gin Pro Thr* Pra Gin Pro Se广丁hr Ala Pro Se广 Thr* Ser Phe Ueu Ueu Pro MET Q30 Θ39 8Λ8 Θ57 366 873 (3GC CCC AGC CCC CCA C3匚丁 GAA GGS AGC AC丁 GGC GAC TTC GCT CTT CCA GTT GGA Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Ukl-4 U9： V«.»2 v2».» V2V CTG. Λ1 Γ ΟΓϋ GO? C7G ACA GCC ΓΤ5 ϋΟΤ CTA CTA ATA ATft SGA CTG GTU AAC TGT Leu 1 Le Va 1 131 y 1 Thr Ala Leu Gly Leu Leu lie I 19 Gly Va 1 V*I Ai»n C/* 938 947 936 969 974 9β·5 GTC ATC AfG ACC CAG GIG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AGA GAA GCC AAG Val lie MET Thr Gin Vai Uya Lys Lys Pro Leu Cy* Leu Bln Arg Glu A1a Lys 992 1001 1010 1019 1037 GTG CCT CAC TTG CCT GCC GAT AAG GCC CGG GGT ACA CAG G13C CCC GAG CAG CAG Val Pro His Leu Pro Ala Asp Ly« Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin 1046 105S 1004 107Z 10Q2 1091 CAC CTG CTG ATC* ACA GCG CCG AGC TCC AGC AGC AGC TCC CTG GAG AGC TCG GCC His Leu Leu I 1 q Thr Ala Pro Ser* Ser S*r Ser* Ser Ser* Uou Glu Ser Ser A l a 丄 1<X* il〇9 ma 1127 1134» 1143 A6T GCG TTG GAC AGA AGG GCG CCC ACT Ci5G AAC CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Aan Gin Pro Gin ΑΙλ Pro Gly Val JL154 XX6Z H72 1181 1X90 119? GAG SCC ACT GGG GCC GGG SAG GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC Glu Ala Stfr Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala S*sr Thr Gly Ser* Ser* Aep Se广 Sei- 120Θ 1217 1226 1235 1244 1253 CCT ,GGT GGC CAT GGG ACC CAG GTC AAT GTC ACC 丁GC ATC GTG AAC GTC TGT. AGC Pro #Gly Gly Hia Gly Thr Gin Val Aen Val Thr Cys lie Val Asn VaI Cys Ser 1262 127 JL 12Θ0 1289 129Θ 1307 AGC TCT GAC CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGC TCC ACA ATG GGA GAC Ser Ser Asp His Sor Ser Gin Cy% S«*r S*r Gin Ale Ser* Ser Thr- fi£T Gly Aap 經濟部中夬樣準局員工消费合作社印設 1316 1323 1334 1343 X332 13-61 ACA GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG 6AC GAG CAG GTC CCC TTC TCC AAG Thr Aap Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pra Lys Asp Giu Gin Val Pro Phe Ser Uys 1370 1379 13ΘΘ 1397 1A06 丄 3 SAG GAA TGT GCC TTt CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA GAG ACC CTG CTG GGG AGC Glu Glu Cys Ala Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Ueu- Gly Ser X424 143ο 1442 1431 1460 f^CC GAA GAI3 AAG CCX CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GCT GGG ATG AAG LXC AGT Thr Glu Glu Uys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Aia Giy πεΤ Lys 户广〇 5癸广 147Q χ4ΰθ +498 1303 131Θ 1528 1338, ΤΑΑ CCA6GCCGGT GTGGGCT6TG TCGTAGCCAA GGTGGGCTGA GCCCTGGCAG 6ATGACCCTG 木紙張尺度通川中W闽家標^(CNs) 规格(2】0Χ297公茇）

(請先聞讀背面之注意事項再填荈本頁 k. ,打—- 六、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 經濟部中央梂举局真工消费合作社印轚 668 677 686 695 704 713 GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA GTC TGC ACG TCC ACG TCC CCC ACC "CGG AGT "atg Gly Asn Ala Ser Arg ASp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser MET 722 740 749 758 767 GCC CCA GGG GCA GTA CAC TTA ccc CAG CCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser Gin His Thr 776 785 794 803 812 821 CAG CCA ACT CCA GAA CCC AGC ACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG Gin Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro MET 830 839 848 857 866 875 GGC ccc AGO CCC CCA GOT GAA GGG AGC ACT GGC GAC TTC GCT CTT CCA GTT GGA Gly Pro Ser Pro Pro A工a Glu = GIy Ser Thr Gly Asp Pile Ala Leu Pro Val Gly 884 893 902 911 920 929 CTG ATT GTG GGT CTG ACA GCC TTG GGT CTA CTA ATA ATA GGA CTG GTG AAC TGT Leu IJLe Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu lie lie Gly Val Val Asn Cys 938 947 956 965 974 983 GTC ATC ATG ACC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AGA GAA GCC AAG Val lie MET Thr Gin Val Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Arg Glu Ala Lys 992 1001 1010 1019 1028 1037 GTG CCT CAC TTG CCT GCC GAT AAG GCC CGG GGT ACA CAC GGC CCC GAG CAG CAG Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin 1046 1055 1064 1073 1082 1091 GCC CAC CTG CTG ATC ACA GCG CCG AGC TCC AGC AGC AGC TCC CTG GAG AGC TCG His Leu leu lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala 1100 1109 1118 1127 1136 1145 AGT GCC TTG GAC AGA AGG GCG CCC ACT CGG AAC, CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG Ser Ala Leu Asp Arg Arg A丄3 Pro Thr' Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly Val 1154 1163 1172 1181 1190 1199 GAG GCC AGT GGG GCC GGG GAG GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg A丄a Ser Thr Gly Ser Ser A3P Ser Ser 1208 1217 1226 *· 1235 1244 1253 CCT GGT GGC CAT GGG ACC CAG GTC AAT GTC ACC TGC ATC GTG AAC GTC TGT AGC Pro Gly Gly His Gly Thr Gin Val Asn Val Thr cys lie Val Asn Val Cys Ser (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝' 訂涑成》•尺度遑用t國國家棣率（CNS〉A4^ ( 210X297公釐〉 —4 — 206234 ATB7Cl

經濟部中央標準局S工消费合作Tt印驭六'申請專利範園 • 一· -：*- - ：：： .1348 13S8 1968 157Θ 13 曰曰 1S9 曰 i6〇S 丨. CGAAGGSGCC CTGGTCCTTC CAGGCCCCCA CCACTASGAC TCTGAGGCTC TTTCTGGGCC AAGTTCCTCT ；丄 6JLS 162 曰 163 曰 164B 163 曰丄678 AGTUCCC「CC ACAGCD3CAG CCTCCCTC了G ACCTGCAGGC CAAGAGCAGA GGCAGCGG13T TGTGGAAACC . 丄 6Θ 曰丄6«?曰 · 171Θ I72S 1733 1748 CTCTGCTGCC ATGQTSTGTC CCTCTCGGAA SBCTGGCTGG GCATGGACGT TCGGGGCATG C了GGGGCAAG 17?8 176Q 1778 17ΘΘ JL79 曰 1Θ18 TCICCnSACTC TCTGTGACCT GCCCCGCCCA GCTGCACCTG CCAGCCTGGC TTCTGGAGCC CTTGGGTTTT 1S2 曰 1Θ3Β 184Θ lBSa iS 厶 3 1Θ7Β 1 日 QQ TTGTTTGTTT OTTTGTTTGT TTGTTTGTTT CTCCCCCTGG GCTCTGCCCC AGCTCTGGCT TCCAGAAAAC 190Θ +i91 曰 19二曰 19^8 19·♦曰 195Θ CCCAGCATCC TTTTCrGCAG AUGGGCTTTC TGGAGAi3t5AU C5GATGC丁GCC 丁GAGTCAUCC ATGAAGACAG X96B 1973 i*?8B 199Θ ’ 200Θ 2018 202Θ GrtCAl3Tt3L：TT CAGCCTtSAGG CrOrtGACTGC GGGATGGTCC TGGGGC了CTG TGCAGGGAGG AGGTGGCAGC 203Θ 204β 2038 20όΒ 207Θ 2^QQ 2υ9β CCTGTAGGGA ACG15C513TCCT TCAAGTTAGC TCAGGAGGCT TGGAAAGCAT CACCTCAGGC CAGGTGCAGT 210β · 21ia 2JL 二 β 213B 2148 215Θ 2169 CCCTCACGCC TAT(3ArCCCA GCACTTTGGG AGGCTGAGGC GGGTGGATCA CCTGAGGTTA GGAGT_TCGAG 2178 218S 219Θ 2200 221Θ 2228 2230 ACCAGCCTGG CCArtCATGGT AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAGAAA TTAGCCGGGC GTGGTGGCGG ^248 2258 226Θ 2278 22QB 2298 230Θ GCACCTATAG TCCCAGCTAC TCA6AA6CCT 6AGGCTGGGA AATCGTTTGA ACCCGGGAAG CGGAGGTTGC 23X0 23ΞΘ 2338 2348 233Θ Ξ3ώθ 237Θ gatcacgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagcgaga gtctgtctca aaagaaaaaa. 2Ζ8Θ aaaaaaaacc gaattc ， (請先聞磧背*之注意事項再填驚本百 K. •打· ： · .線. 木纸瓜尺度適川屮田闽宋揣準（CNS)^M规格（210x29?公垃）申請專利範圍 A8B8 C8 D8 1262 1271 1280 1289 1298 1307 AGC TCT GAC CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGC TCC ACA ATG GGA GAC Ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cys Ser Ser Gin Ala Ser Ser Thr MET Gly Asp 1316 1325 1334 1343 1352 1361 ACA GAT TCC AGC ccc TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TCC AAG Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gin Val Pro Phe Ser Lys 1370 1379 1388 1397 1406 1415 GAG GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA GAG ACC CTG CTG GGG AGC | Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser 1424 1433 1442 1451 1460 1469 ACC GAA GAG AAG CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GOT GGG ATG AAG CCC AGT Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly MET Lys Pro Ser 1il!> ΤΑΑ ΊΓΟΑ' 1488 1498 1508 · 1518 1528 1538 GGCCGGT GTGGGCTGTG TCGTAGCCAA GGTGGGCTGA GCCCTGGCAG GATGACCCTG (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 1548 1558 J568 1578 1S88 1598 1608 CGAAGGGGCC CTGGTCCTTC CAGGCCCCCA CCACTAGGAC TCTGAGGCTC TTTCTGGGCC AAGTTCCTCT 1618 1628 1638 1648 1658 1668 1678 AGTGCCCTCC ACAGCCGCAG CCTCCCTCTG ACCTGCAGGC CAAGAGCAGA GGCAGCGGGT TGTGGAAAGC 1688 1698 1708 1718 1728 1738 1748 CTCTGCTGCC ATGGTGTGTC CCTCTCGGAA GGCTGGCTGG GCATGGACGT TCGGGGCATG CTGGGGCAAG 1758 1768 1778 1788 1798 1308 1818 TCCCTGACTC TCTGTGACCT GCCCCGCCCA GCTGCACCTG CCAGCCTGGC TTCTGGAGCC CTTGGGTTTT 1828 1838 1848 1858 1868 1878 1888 TTGTTTGTTT GTTTGTTTGT TTGTTTGTTT CTCCCCCTGG GCTCTGCCCC AGCTCTGGCT TCCAGAAAAC 1898 1908 1918 1928 1938 1948 1958 CCCAGCATCC TTTTCTGCAG AGGGGCTTTC TGGAGAGGAG GGATGCTGCC TGAGTCACCC ATGAAGACAG 1968 1978 1988 1998 2008 2018 2028 GACAGTGCTT CAGCCTGAGG CTGAGACTGC GGGATGGTCC TGGGGCTCTG TGCAGGGACG AGGTGGCAGC 2038 2048 2058 2068 2078 2088 2098 CCTGTAGGGA ACGGGGTCCT TCAAGTTAGC TCAGGAGGCT TGGAAAGCAT CACCTCAGGC CAGGTGCAGT 2108 2118 2128 2138 2148 2158 2168 CCCTCACGCC TATGATCCCA GCACTTTGGG AGGCTGAGGC GGGTGGATCA CCTGAGGTTA GGAGTTCGAG 2178 2188 2198 2208 2218 2228 2238 ACCAGCCTGG CCAACATGGT AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAGAAA TTAGCCGGGC GTGGTGGCGG丨 2248 2258 2268 2278 2288 2298 2308 GCACCTATAG TCCCAGCTAC TCAGAAGCCT GAGGCTGGGA AATCGTTTGA ACCCGGGAAG CGGAGGTTGC 2318 2328 2338 2348 2358 2368 2378 AGGGAGCCGA GATCACGCCA CTGCACTCCA GCCTGGGCGA CAGAGCGAGA GTCTGTCTCA AAAGAAAAAA2388AAAAAAAACC GAATTC, 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐）缦濟部中夹標準局员工消費合作社印$ 206234 B7 - C7 _；_ D7_ 六、申請專利範圍其可指令大腸桿菌或哺乳動物宿主細胞産生具有τ N F抑制活性之蛋白質； (b)選殖DNA序列至一載體中，其可轉移至該宿主細胞中並於此複製，此種載體含有表現DNA序列所需之操作要件； (c )將含有合成D N A序列及操作要件之載體轉移至該所生成之宿主細胞中，後者可表現編碼TNF抑制劑之 D N A ; (d )培養該轉形宿主細胞，其所在之條件適於載體擴大及抑制劑表現之用； (e )回收抑制劑；及 (f )令抑制劑呈活性三级結構，如此其具有T N F 抑制活性。 9.根據申請專利範圍第8項之方法，其中該TNF 抑制劑是4 0 k D a T N F抑制劑。 1 Ο .根據申請專利範圍第9項之方法，其中該 T N F抑制劑是T N F抑制劑△ 5 1。 1 1 .根據申請專利範圍第9項之方法，其中該 T N F抑制劑是T N F抑制劑△ 5 3。 1 2 . —種编碼腫瘤壞死因子（T N F )抑制劑之基因，該T N F抑制劑偽自人類U 9 3 7細胞培養基質中分離而得，其具有如下所示之核苷酸序列或其Η段： ----------------(-------裝------、玎-----^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公货） A7 87 C7 D7 六、申锖專利範团其可指令大腸桿菌或晡乳勤物宿主細胞産生具有τ N F*抑制活性之蛋白質； (b) 選殖DNA序列至一載鳗中，其可轉移至該宿主细胞中並於此復製，此種載體含有表現DNA序列所裔之操作要件； (c) 將含有合成DNA序列及操作要件之載饅鞞移至該所生成之宿主細胞中，後者可表現缠碼TNF抑制劑之 D N A ; (d) 培養該轉形宿主细胞，其所在之條件適於載體擴大及抑制劑表現之用； (e )回收抑制劑；及 (f)令抑制劑呈活性三级结構•如此其具有TNF 抑制活性。 9.根據申請專利範圍第8項之方法，其中該丁NF 抑制劑是40kDa TNF抑制劑。 1〇.根據申請專利範圍第9項之方法，其中該 TNF抑制劑是TNF抑制劑Λ51。 11. 根據申諳專利範面第9項之方法，其中該 TNF抑制劑是TNF抑制劑Λ53。 12. —種编碼腫癃顔死因子（TNF)抑制剤之基因，該TNF抑制劑偽自人類U 9 3 7细胞培餐基質中分. 離而得，其具有如下所示之核苷酸序列或其片段： {燴先《讀背面之注.*葶項鼻填X本IFf 丨装. 訂. 1 遴硒 t家樣準 <CNS> 洗榕（210 X 297 V* ) Ο 06234 A 7 B7 C7 D7 六、申請專利範® . 10 ， C0 10 40 Ϊ0 60 70 GAATTCGGCG CAGCGGAaCC TCQAtSAGAAG GCGCTGGCCT CCGACGuCGC GAGGGCCCUA GCGCAGGGGQ θ>：» 90 101 110 119 CAACCSGACC CCGCCCGCAC CC ATQ GCG CCC GTC SCC STC TGG 6CC GCG CTG GCC MET A1a Pro V*1 AIa Trp A1a Ala U«u Ala X28 137 146 133 164 173 冗 CTG GAG CTC TGG GCT SCG GCG CAC GCC TTB CCC SCC CAG GTS SCA TTT Vai Gly l_eu Giti *_eu Τι-ρ Ala His AiJi l-eu Pr*〇 Ala Gin Ala Ph· X62 I9i 200 209 218 227 ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TGC CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly S«r Thr Cya Arg L»u Arg Glu Tyr· Tyr Asp 243 234 263 272 281 5^5 ^5? SH7 CAG ATG TGC TGC AGC AAG TEE TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC Gin Thr Ala Gin MET Cye Cya Ser Lya Cys Ser Pro Gly Gin Hia Ala Lys Val 290 299 soa 317 526 33S TTC TGT ^ ^ ^ ^ ^ STG TGT GAC TCC TGT GAG GAC A6C ACA TAC Phe Cys Thr Lya Thr Ser Asp Thr Val Cya Asp Ser Cys Glu Aap Ser Thr Tyr 344 333 362 371 3Θ0 ^89 TS7 GGC TCC CGC TG丁 AGC Thr Gin Leu Trp Aan Trp Val Pro Glu Cya Leu Ser Cya Gly Ser· Ar*g Cya Ser 39Θ 407 416 423 434 443 TCT GAC CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC A了C TGC ACC Ser Asp Gin Val Giu Thr Gin Ala Cya Thr Arg Glu Gin Asn Arg He Cy* Thr 432 461 470 479 488 497 ΜΙΜμμηΜ ，产午产产 TGC AGG CCC GSC TGG TAC' TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC CGG CTG TGC Cys Arg Pro Giy Trp Tyr C/3 Ala Leu Ser* Lys Gin Glu G1 y Cya Arg Leu Cys 324 333 .342 531 506 513 5CG CCG CTG CGC AA6 TGC CSC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CCA GCA 了 gAA Al* Pro L*u Arg Lye Cys Arg Pro Gly Phe Gly V*1 Ala Arg Pro Gly· Thr Glu 603 ^60 569 37a 396 {訢先聞請背面之注意事項再填荈本百) •打· 經濟部中央慄孕局員工消費合作社印皱 ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT Thr Ser Asp VaI Vai Cys Uys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr hr 614 66Q ’線. 623 677 厶32 64 L 650 厶59 6B6 695 704 713 GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA GTC TGC ACG TCC ACG TCC CCC ACC CGG AGT ATG Gly Aen Ala Ser Arg Aap Al* Vai Cy» Thr* Ser Thr Ser Fro Thr" Arg ser ntj 767 722 7Zi 740 749 73Θ Ala Pro Gly A1a V*l Hio Ueu Pro Gin Pro Val Ser Thr Ar*g Ser Gin 13 木紙浓尺皮ii川中W W家捃爭（CHS)以規is (2丨0 X 297公犮） ABCD 六、申請專利範圍 10 2〇 30 40 50 6〇 GAATTGGGCG CAGCGGAGCC TGGAGAGAAG GCGCTGGGCT GCGAGGGCGC GAGGGCGCGA' GCGCAGGGGG 80 90 y_ 101 110 119 CAACCGGACC CCGCCCGCAC CC ATG GCG CCC GTC GCC GTC TGG GCC GCG CTG GCC 經濟部中央標窣局員工消費合作社印製 MET Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala 12 8 137 146 155 164 173 GTC GGA CTG GAG CTC TGG GCT GCG GCG CAC GCC TTG CCC GCC CAG GTG GCA TTT Val Gly Leu Glu Leu Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe 182 191 200 209 218 227 ACA CCC TAG GCC CCG GAG qcc GGG AGO ACA "tgc CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr A3p 236 245 254 263 272 281 CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC AGO AAG TGC TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC Gin Thr Ala Gin MET Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys Val 290 299 308 317 326 335 TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr 344 353 362 371 380 389 ACC CAG CTC TGG AAC TGG GTT "ccc GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser 398 407 416 425 434 443 TCT GAC. CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC ACC Ser Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg lie Cys Thr 452 461 470 Λ2± AGC 497 CGG TGC AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AAG CAG gag" GGG Ygc CTG TGC Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys 506 515 524 533 542 551 GCG CCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CCA GGA ACT GAA Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu 560 569 578 587 596 605 ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG ccc TGT GCC CCG GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr 614 623 632 641 650 659 TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC CAG ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT Ser Ser Thr Asp lie Cys Arg Pro His Gin lie Cys Asn V3丄 Val Ala lie Pro 本紙張尺度適用令國國家梯準（〇阳）戍4規格（210)<297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 206234 AT B7 C7

(請先w讀背面之注意事項再填荈本百} •R. 經濟部中央標_局員工消费合作杜印^ AGT GCG TTG GAC AGA AGG GCG CCC ACT CGG AAC CAG CCA CAG GCA CCA GGC GT6 Ser Ala Lea Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Aan Gin Pra Gin Ala Pro Gly Val 1154 上丄 <b：3 1172 丄181 丄 1X^9 GAG GCC AGT GGG GCC G6G GAG GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC GXu Ala Sc*r Gly Ala Gly GLu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser A»p S«r Ser 12C*9 1217 1226 1235 1244 125-3 CCT ,GGT GGC CAT GGG ACC CAI3 GTC AAT GTC ACC TGC ATC GTG AAC GTC TGT AGC Pra^Gly Gly His Gly Thr Gin Val Asn Val Thr* Cys lie Val Asn VaI Cys Ser 1262 1271 1280 · 12Θ9 丄二 93 l-T-07 AGC TCT GAC CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGC TCC ACA ATG GCA GAC Ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cy» Ser Ser- Gin Ala Ser Ser Thr ΠΕΤ Gly Asp 1316 1325 1334 1343 1352 136J. ACA GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TCC AAG Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gin Val Pro Phe Ser Lys 1370 1379 13ΘΘ 1397 1406 GAG GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA GAG ACC CTG CTG GGG AGC Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Ueu Glu Thr Pra Gla Thr Leu Leix. Gly Ser 1424 14^3 144- I45X 丄 4ώ0 丄407 ACC GAA GAG AAG CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GCT GGG ATG AAG CCC AGT Th疒 Glu Glu Uys Pro Leu Pro Leu Gly V/al Pro Asp Ala Gly Uys Pro Ser 1478 14S日 149Θ 1509 151Θ 152Θ 15*Τ·8. s TAA CCAGGCCGGT GTGGGCTGTG TCGTAGCCAA GGTGGGCTGA GCCCTGGCAG GATGACCCTG 木纸張尺度適)IH，田W X標芈（CMS) <P4规格（2丨0父297公货）六、申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 666 677 686 695 704 713 ' 1 _ ' _ 1 » — __ 1 — _ • — ___ _ GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA GTC TGC ACG TCC ACG TCC CCC ACC CGG AGT ATG Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser MET 722 731 740 749 758 767 GCC CCA GGG GCA GTA CAC TTA CCC CAG CCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG Ala Pro Gly Ala val His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser Gin His Thr 776 785 794 803 812 821 CAG CCA ACT CCA GAA CCC AGC ACT GOT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG Gin Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro MET 830 839 848 857 866 875 GGC CCC AGC CCC CCA GOT GAA GGG AGC ACT GCC GAC TTC GCT CTT CCA GTT GGA Gly Pro Ser Pro ΡΓΟ Ala Glu=Gly Ser Thr Gly Asp Phe A丄a Leu Pro Val Gly 884 893 902 911 920 929 --------「裝--(請先Η·讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部t央標隼局員工消费合作社印装 CTG ATT GTG GGT CTG ACA GCC TTG GGT CTA CTA ATA ATA GGA CTG GTG AAC TGT Leu lie Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu lie He Gly Vaa Val Asn cys 938 947 956 965 974 983 GTC ATC ATG ACC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AGA GAA GCC AAG Val lie MET Thr Gin Val Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Arg Glu Ala Lys 992 1001 1010 1019 1028 1037 GTG CCT CAC TTG "CCT GCC "gat AAG GCC CGG GGT ACA CAG GGC CCC GAG CAG CAG Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin 1046 1055 1064 1073 1082 1091 CAC CTG CTG ATC ACA GCG CCG AGC TCC AGC AGC AGC TCC CTG GAG AGC TCG GCC His Leu leu lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser A丄a 1100 1109 1118 1127 1136 1145 AGT GCG TTG GAC AGA AGG GCG ccc. ACT CGG AAC CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG Ser A丄a Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr’ Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly Val 1154 1163 1172 1181 1190 1199 GAG GCC AGT GGG GCC GGG GAG GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser 1206 1217 1226 - 1235 1244 1253 CCT GGT GGC CAT GGG ACC CAG GTC AAT GTC ACC TGC ATC GTG AAC GTC TGT AGC Pro Gly Gly His Gly Thr Gin Val Asn Val Thr Cys lie Val Aan Val Cys Ser 本紙浪尺度遴用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 8 訂 0.1 6 3 A B c D 六'申請專利範ffl .1548 135Θ 156Θ i37S 13Θ8 1S9B ΧώΟΘ CGAAGGGGCC CTGGTCCTTC CAGGCCCCCA CCACTAGGAC TCTGAGGCTC TTTCTGGGCC AAGTTCCTCT 丄 6X8 162Θ 163Θ 164Θ Ιόόθ 1673 AGTGC匚CTCC ACAGCCGCAG CCTCCCTCTG ACCTGCAGGC CAAGAGCAGA GGCAGCGGGT TGTGGAAAGC 16ΘΘ 169Θ 1708 1718 172Θ 1748 CTCTGCTGCC ATGGTGTGTC CCTCTCGGAA GGCTCGCTGG GCATGGACGT TCGGGGCATG CTGGGGCAAG 1733 丄 7ώ 曰 177Θ 173Θ 179 曰 ΙΘΟϋ 1Θ1 曰 n：D：ri3ACTC TCTGTGACCT GCCCCGCCCA GCTGCACCTG C(i：AGCCTGGC TTCTGGAGCC C丁TGGGTTTT 1928 1838 1Θ6Θ 107曰 XBQQ 經濟部中央標準局員工消费合作社印裂 TTGTTTGTTT GTTTGTTTGT TTGTTTGTT丁 CTCCCCCTGIS GCTCTGCCCC AGCTCTGGCT TCCAGAAAAC 1ϋ9θ 190Q 191 曰 192Q 丄933 194曰 —193Θ CCCAGCATCC 丁TTTCrGCAG AliGGGCTTTC TGGAGAeUAG GGATGCTGCl： TGAGTCACCC ATC3AAGACAG 196Θ 197Θ 1988 199Θ 200Θ 2CU8 202a GACAi3Tt5L：TT CAG匚CT13AGG C：n3rtGACTGC GGGATGGTCC TGGGGCTCTG Tt3CAi3GGAt36 AGGTGGCAGC 203B 204B 20 3Θ 20&Q 207 曰 2〇0日 2098 CCTGTAGGGA ACGGGGTCCT TCAAGTTAGC TCA6GAGGCT T6GAAAGCAT CACCTCAGGC CAGGTGCAGT 2 丄 OS e 211 曰 2·12β 2J.38 2148 2JL58 2ΐώθ CCCTCACGCC TATGA了CCCA GCACTTTGGG AGGCTGAGGC GGGTGGATCA CCTGAGGTTA GGAGTTCGAG 2178 21Θ8 2198 220Θ 221Θ 2228 223Θ ACCAGCCTGG CCAACATGGT AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAGAAA TTAGCCGGGC 6TGGTGGCGG 224Θ 223Θ 226曰 2278 22θβ 229β 230Θ GCACCTATAG TCCCAGCTAC TCAGAAGCCT GAGGCTGGGA AATCGTTTGA ACCCGGGAAG CGGAGGTTGC 23ΧΘ 232Θ 2338 234Θ 2358 2Z6Q 237Θ AUGGAGCCGA GATCACGCCA CTGCAC丁CCA GCCTGGGCGA CAGAGCGAGA GTCTGTCTCA AAAGAAAAAA ^AAAAAAACC BAATTC 〇 13. 根據申請專利範圍第12項之基因，其中該 T N F抑制劑是4 0 k D a T N F抑制劑△ 5 1。 14. 根據申請專利範圍第12項之基因，其中該 T N F抑制劑是4 ◦ k D a T N F抑制劑△ 5 3。 (請先聞請背面之注意事項再填寫本頁) 9 申請專利範園 1262 1271 1280 ABCD 1289 1298 1307 _ _ A GCC AGC TCC ACA ATG GGA GAC AGC TCT GAC CAC AGC TCA CAG TGC TCC TCC C Ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cys ser Ser Gin A丄a Ser Ser Thr MET Gly Asp 1316 1325 1334 1343 1352 1361 wosmM ，丨_丨丨 _丨丨一 ww· _ 丨 ir 卿 _丨 _ 丨· - » •mmimmm» mmimmmmm —ι—» 1_丨丨一1 " ~· ACA GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TCC AAG Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gin Val Pro Phe Ser Lys 1370 1379 1388 1397 1406 1415 GAG GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA CAG ACC CTG CTG GGG AGC Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser 1424 ACC 1433 1442 1451 1460 1469 G ATG AAG CCC AGT A GAG AAG CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GCT G Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly MET Lys Pro Ser 1478 TAA 《CAG I 1488 1498. 1508 1518 1528 1538 GCCGGT GTGGGCTGTG TCGTAGCCAA GGTGGGCTGA GCCCTGGCAG GATGACCCTG 1548 CGAAGGGGCC 1558 B68 1578 1588 1598 1608 | CTGGTCCTTC CAGGCCCCCA CCACTAGGAC TCTGAGGCTC TTTCTGGGCC AAGTTCCTCTi 經濟部中夬輮率扃負工消費合作杜印裝 1618 1628 1638 1648 1658 1668 1678 AGTGCCCTCC ACAGCCGCAG CCTCCCTCTG ACCTGCAGGC CAAGAGCAGA GGCAGCGGGT TGTGGAAAGC 1688 1698 1708 1718 1728 .1738 1748 CTCTGCTGCC ATGGTGTGTC CCTCTCGGAA GGCTGGCTGG GCATGGACGT TCGGGGCATG CTGGGGCAAG 1758 1763 1778 1788 1798 1308 1818 TCCCTGACTC TCTGTGACCT GCCCCGCCCA GCTGCACCTG CCAGCCTGGC TTCTGGAGCC CTTGGGTTTT 、 · - — * .... .、 1828 1838 1848 1858 1868 1878 1888 TTGTTTGTTT GTTTGTTTGT TTGTTTGTTT CTCCCCCTGG GCTCTGCCCC AGCTCTGGCT TCCAGAAAAC 1898 1908 JL_918 1928 1938 1948 1958 CCCAGCATCC TTTTCTGCAG AGGGGCrTTC TGGAGAGGAG GGATGCTGCC TGAGTCACCC ATGAAGACAG 1968 1978 1988 1993 2008 2018 2028 GACAGTGCTT CAGCCTGAGG CTGAGACTGC GGGATGGTCC TGGGGCTCTG TGCAGGGACG AGGTGGCAGC 2038 2043 2053 2063 2078 2088 2098 CCTGTAGGGA ACGGGGTCCT TCAAGTTAGC TCAGGAGGCT TGGAAAGCAT CACCTCAGGC CAGGTGCAGT 2108 2113 2128 2138 2148 2158 2168 CCCTCACGCC TATGATCCCA GCACTTTGGG AGGCTGAGGC GGGTGGATCA CCTGAGGTTA GGAGTTCGAG 2178 2183 2198 2208 2218 2228 2238 ACCAGCCTGG CCAACATGGT AAAACCCCAT CTCTACTAAA AATACAGAAA TTAGCCGGGC GXGGTGGCGG 2248 2253 2263 2278 2288 2298 2308 ； GCACCTATAG TCCCAGCTAC TCAGAAGCCT GAGGCTGGGA AATCGTTTGA ACCCGGGAAG CGGAGGTTGCj 2318 2328 2338 2348 2358 2368 2378 I AGGGAGCCGA GATCACGCCA CTGCACTCCA GCCTGGGCGA CAGAGCGAGA GTCTGTCTCA AAAGAAAAAAl 2388 AAAAAAAACC GAATTC二本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210X297公釐） -9 - A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 1 5 . —種编碼如申請專利範圍第1項之腫瘤壞死因子（TNF)抑制劑之基因，該TNF抑制劑傜自人類 U 9 3 7細胞培養基質中分離而得，其具有如下所示之核苷酸序列或其片段。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 、v6 烴濟部中央標準局貝工消費合作社印3取 -10 - 本纸張尺渡適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） ABCD 六、申請專利範圍 13. 根據申請專利範圍第12項之基因，其中該 TNF抑制剤是40kDa TNF抑制劑Δ51β I 14. 根據申請專利範团第12項之基因，其中該 TNF抑制劑是40kDa TNF抑制劑Δ53。一 I 1 5 .—種绾碼如申請專利範圍第i項之腫靥壞死因子（TNF)抑制剤之基因，該丁1^17抑制劑僳自人類 U937细胞培養基質中分離而得，其具有如下所示之核苷酸序列或其片段。 10 20 30 40 50 60 7〇 GAATTGGGCG CAGCGGAGCC TGGAGAGAAG GCGCTGGGCT GCGAGGGCGC GAGGGCGCGA ' GCGCAGGGGG 80 90 )___101__110_ 119 CAACCGGACC CCGCCCGCAC CC ATG GCG CCC GTC GCC GTC TGG GCC ~GCG CTG GCC MET Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala 128 137 146 155 164 173 GTC GGA CTG GAG CTC TGG GCT GCG GCG CAC GCC TTG CCC GCC CAG GTG GCA TTT j ' Val Gly Leu Glu Leu Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe ..-- ； 132 191 200 209 218 227 ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC ACA TGC CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr A3p 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印装 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 236 245 254 263 272 281 CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC AGC AAG TGC TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC Gin Thr Ala Gin MET Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gin His Ala Lys Val 290 __ 299 308 _ 317 326 335 j TTC TGT ACC AAG ACC TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC XgC ACA TAC I Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser cys Glu Asp Ser Thr Tyr 344 353 362 371 380 389 ACC CAG CTC TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TCT AGC Thr Gin Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser 本紙張尺度逋用中國Bl家橾率（CNS) A4规格（ 210X297公釐）-· 206234 A7B7C7D7 六、申請專利範 70 OA^TTCGiiCQ CAGCGGAGCC TQOAti内GAAG GCGCTGtiGCT GCGftGUOCCiC GAOGGCGClM G00CAGGGG3 Θ0 90 101 CAACCGGACC CCGCCCOCAC CC AT6 GCQ pee GTC CiCC GTC TGG OCC GC3 CTG GCC h£T 内1· Pro V«1 V«1 Trp ΛΙι A1a L«u Ala \2β 137 14b. 144 173 GTi: cm ΞΤΕ 5Tc τΰό gct SCO 5cg cm: cS gcc cag gtq 〇c« frr Vtl Qly L*u QJu Lau Trp AU AJa AU Mi· Ala (Leu/ro AU Bln Vil Al« Ph€ 1Θ2 m 200 227 aca Efcc QCC CCfl GAQ CCC GOG AOC ACA TGC CGG CTC AtiA QAA TAG TAT GAC 7hr Pro Tyi* Ala ^ra Glu Pro Oly Bur Thr Cy· Arg L*u Arg CIu Tyr Tyr A»p 24d 263 272 291 CAO ACA QCT CAQ ΑΤβ TGC 〒5E ΛΪ TGC ICG CCO QGC CAA CAT OCA AAA OTC Oln Thr Al· (Jin n€T Cy亀 Cy» 9«r Lyn Pr· S«r Pro Qiy 〇in Hi» Al« Ly% ΥλΙ 2,〇 299 317 326 ZOQ 75〒 STc5 益5 7H5 品δ ^ Ph« Cy· Thr Ly« Thr β·Γ Amp Thr VaI Cy« A亀p Cy* Olu Α·ρ Β·γ Thr Tyr U44 3S3 362 3V1 3S0 38f ftCC CAO CTC T〇a Knc TOO CCC G^S TQC TTG ^GC TGT 3WC TCC CBC 1ΘΤ AOC Thf* Oln U»u Trp A»o Trp VaI Pro Olu Cy· L«u Smr Cy* (3iy β·ι- Ar〇 C)<« M爾r 39a 407 434 443 rc'f GAC CAO GTQ QAA Λ5τ CAA OCC TQC ^CT CGO ΒΛΛ CAQ iv^C C9C ftTC TQC ACC 8er Λ·ρ 91n V«1 Olu Thr Girt Λ1 遶 Cy» Πιγ Arg Glu ϋΐη A»n Arg II· Cy· Thr· 470 AQQ 497 • __ _·_ _ _ _ — _· ,— — _ —— jj 丄· aimm m TGC AGQ CCC Q(3C JOQ TAG TGC OCQ CTG AUC ΑΛΰ CAQ GAG GOO TOC COO CTG TOC Cy» Ary Pro QJy Trp Tyr Cy* ΑΙλ L*u S*r U>* Clin GVu Bly Cy« Arg Cy* »19 »24 &33 542 53A cue AAO- TOC CGC CCO GOC TTC goc era ecc ACA CCA eeS ACT 0aS Arg Lv* Cr· Arg pro Gly Pn· Uly V«1 ^1* Are Pro Oty Thr Qlu d〇6 GCQ CCO Al« Pro 5A9 97Θ 3β*； 59A 60S ACA 7CA GAC eiti GTG TGC AAG CCC TC3T GCC CCQ &GQ ACQ TTC TCC AAC ΛΟΟ ΛΟΤ Tnr 6«r Α·ρ V·! V«1 Cy* Ly· Pro Cy* AU P*ro Gly Thr Ph· C«r Λ*η Thr Thr <»Ai 450 TCA TCC ACO GAT ATT TUC A〇G CCC CAC CttQ ίΓΐΈ TOT GTQ GTG OCC ATC CCT G*r l»«ir Ihr Anp Π_ Cf* Λγ〇 l^ro HI· Gin 1 1* Cy* A*n V*1 V*l Al* U· fro 〇*GG AAT (TCA AGC AOO GAT QCA GTC TOC Λ〇3 ICC illy Ann S«r Arg Α·ρ Al應 V屬 1 Cy· Thr Umr 722 731 740 749 OCC CCA QUO QCA fiTA CAC TTA CCC CAG CCA CTG Al* Γγο Gly. Al* VaI Hi.» Leu Pro Q) Π Pro V»1 77Λ 7fl3 ' 79Λ B03 a^<—--- -- , - _i i·· _ ^ CAG CCA ACT CCA 〇AA CCC AGC ACT GC7 CCA «GC Gin ^re Thr Pro Olu Pro 0«r Tnr Al« Pro Umr 704 713 - -— — — — — *.^Μ· · ·Ι I _ _ I I ACQ TCC CCC ACC CCo AOT ATG Tnr H«r Pro Thr B«r r\KT 7Λ7 - - mmm _ · · _ — TCC ACA COM TCC CAA CAC ACCI S«r Thr Arg 8·Γ Qln HI* Thr θΐΐ 82X m P· _M ·ι _| _ ·— ecc TCC TTC CTQ CTC CCA ΛΤ8 Thr* 6«r PK· L»u L«u Pro HtT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) β4θ Θ37 Θ&6 975 經濟部中央標準局印裂 GGC CCC Qly Pro Θϋ4 CTQ ATT L»u I 1· 9^8 GTC AT? VaI 11« gto ccr Pro ίΰΕ όΞΞ ΞΞί δόΐ S0c S*cTf 55S tur Pra Γγο Al 4 0 lu Gly Ser Thr* Qly » ——— —« — — » ———* CAC TTC QCT CTT CCA 6TT «5Λ A«p Ph· At« Leu Γγο V«| Uly 693 V〇2 ?U 920 ϋΤ〇 GGT ore ?CA OCC TTQ GtTr CTA C7A V*1 Qly Val Thr Al« Lau Uly Li»u L·着u ΑΤΛ ATA G6A QT8 GTG AAC TGT η· I lo 01V Vfti V*1 Asn Cy· 9Λ7 963 974 983 5t〇 ice ΟΛΟ OTIS SaA AAG ftAQ CCC TTQ he r Thr Gin Va 1 Lys Ly* Ly» Pro L·詹u iOOl 1010 10i9 cHE ttg ccT acc 〇a*7 ^ao occ eba ogt ^ “j pre 〜A? H5 fe* TUC CTQ CAG AOA GAA OCC AAG Cy* \-»u Olrt Arg Glu ΛΙ暴 Uy镰 1028 1037 _ 一，—· —" AL'^ C^a r-ac CCC GAG CAG CAO TV ein prff 6lw 0/n ΟΪΠ f 4(210X297 公沒） 78. 8. 3,000 申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 398 407 416 425 434 443 TCT GAC. CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC ACC Ser Asp Gin Val Glu Thr Gin Ala Cys Thr Arg Glu Gin Asn Arg He Cys Thr 452 4.61 470 479 AGC 488 Λ31 CGG TGC AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AAG CAG GAG GGG "tgc οτδ'TGC Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys 506 515 524 533 542 551 GCG CCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC AGA CCA GGA ACT GAA Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu 560 569 578 587 596 605 ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr 614 623 632 641 650 659 TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC CAG ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT Ser Ser Thr Asp He Cys Arg Pro His Gin lie Cys Asn Val Val Ala lie Pro 668 677 686 695 704 713 GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA GTC TGC ACG TCC ACG TCC ' CCC ACC CGG AGT ATG Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr ： Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser MET 722 731 740 749 758 767 GCC CCA GGG GCA GTA CAC TTA CCC CAG CCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser Gin His Thr 776 785 794 803 812 821 CAG CCA ACT CCA GAA CCC AGC ACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG Gin Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro MET 830 839 848 857 866 875 GGC CCC AGC CCC CCA GCT GAA GGG AGC ACT GGC GAC TTC GCT CTT CCA GTT GGA Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu rGly Ser Thr Gly Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly 884 893 902 911 920 929 CTG ATT GTG GGT CTG ACA GCC TTG GGT CTA CTA ATA ATA GGA CTG GTG AAC TGT Leu lie Val Gly Val Thr Ala Leu Gly Leu Leu He lie Gly Val Val Asn Cys 938 947 956 965 974 983 GTC ATC ATG ACC CAG GTG AAA AAG AAG CCC TTG TGC CTG CAG AGA GAA GCC AAG Val lie MET Thr Gin Val Lys Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Arg Glu Ala Lys 私紙張尺度逋用中國國家橾率（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

206234 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圊 1064 i〇73 1082 1091 ···_· ,.· · 一 ^"•一 _ 一 ···, ·_ι _ · I ~~* ·—^ *·— Μ II — « CAC C1G CTO ATC ACA GCG CCO AGC TCC AGC AGC «GC TCC CTG GAO AGC TtQ GCC Mi· Utu L«u Π* Thr Ala Pro s*r 8·ίΓ S〇r ier S«r S«r Ltu Qlu fiyr 6*r Al4 U〇0 no4? uxe U27 L136 X143 5c'J ίτά ΓαΪ ίοϊ «gg 5cg ccc aE7 cc'a mc cwi EEi cSq ici cm ooc 5Tg S«r Al* L_u A*p Arq Arg AU Pro Thr πβ A镳n Gin Pro ain Ai* Pro QW V鼻 1 IX^A 4163 1172 li8i Ai" «Λ0 Qi：C agT sgg occ GGO OAO GCX CUli ucc AGC ACC 5άα ^ic TCA GAT Tci TCC aiu AIa 3gr (JJy ΑΪλ Uly Qlw Al« Arg Al· S*r Thr Qly β«Γ S«r Amp 8·^ S#r 1244 A253 11>〇θ i2!7 1226 123» CC7 GOT GGC CAT GGO ACC CAC3 QTC AAT 57^ 叉£0 ATC GT(J 糾5 BTC TGT AGC Pro Qly Gly HA· Gly Thr Gin V*l A«n V*1 Thr Cy· Π« V·! Α*λ VaX Cy# S»r 1262 )271 12U0 12Θ9 4307 AGC 7CT QAC CAC ftOC TCA CAO TGC TCC TCC CAA GCC ABC ?CC ACA ATtt GGA 6AC Ser e_r Α·ρ Ki« Bmr S«r Oln Cy· 6«r S«r Uln Al« S«r 8«r Thr hCT CUy Α·ρ \zik 1^34 1343 i3*2 «Μ 輪· pill m — III l_ «VMM 讀 III I l_ _ I I ΛΟΑ GAT TCC AQC CCC TCQ GAG TCC CCO ΑΛ6 QAC 0A6 CAO QTC CCC TTC TCC AA6 Thr* A»p 6«r War Pro 0«r U1 u fl»r Pro Ly· Aep Glu Oln V*1 pro Ph· 6«r Ly· 1J70 i 579 1397 1406 1413 ····· · Μ—«ΙΗΜ «MW» · _ _ — — II *! _ _ _ GAQ GAA TOT GCC T7T CG8 TCA CAO CTO GAG ACS CCA Qf\Q ACC CTO CT8 GGQ Qiu Oiu Cy« A1 雇 l*h« Arg Serr Qln U«u Giu Thr Pro Qlu Thr U«u L«u Oly 内GC &«r (請先閲讀背面之注意事項再凑寫本頁) 144, 1425 1433 1442 1431 1440 ACC GAA GAQ AAQ CCC CTQ CCC CTT QQA GT"6 tfiTF 6*AT OCf Gu5 ATQ AAO CCC AGT Tnr Glu Olu Lr* Prp L«u Pro keu Oly V*1 Pro A*p Al* Oly r€T Uy· Pro 8_r “7β 1，QS Χ49Θ 1^08 16i 日 132β 1ΜΘ ΤΑΛ CCA0CK：CG<3T STUGOCTUTQ TCGTAGCCftP GGTSGGCTGA 6CCXTGGCAG ®ATGACCCTG 13Λ8 i办 όβ 1S7B 13ββ 15*ϊθ ik〇B CCAA〇(Ji3〇CC CIUQTCCTTC CAGGCCCCCA CCACTAGQAC TCTGASGCTC TTTCTSeOCC AAOTTCCTCT 161B iA2d 163β 164Θ 163Θ 166B 1678 ftQTaCCCrcC ACAGCClK：Ai3 CCVCCCTCT6 ACCTUCAGOC CAWGAOCAQA W3CAGCCK><3T TGrtiUAAAOC 16ΘΘ li>?e 170B 1716 172· 173β 174S CTCTCiCT&CC ATGGTUTQrC CCTCTCOUAA fV,；CTt：UCTGl5 OCATGGACQT TCOUGOCATO CT£WiCK*CAAG 17B日 176S 1V7B 上780 X7V8 1β〇& ΙβΙΗ TCCCTUACTC TCrQTDACCT GCCCCQCCCA aCTGCftCCTQ CCAQCCrGOC .TTCTQOAGCC CTTGGUTTTT 1ΘΓΒ Χ〇3β 1β4θ 183Θ ΧβΑΒ 1878 Ιβββ I fQTTTGTTT aTrTCITTTGT TTUTTTQTTT CTCCtCCTGa gctctgcccc aoctctooct tccag^aaac 109Q 1908 LniQ 192fl 1?3β &9$Q CCCAOCATO： ΤΤΊTCTOCAa AGGUOCTTTC TQOeGAOOAO OGATOCTGCC TOAOTC^CXC ATGAAGAC^Q 1<?4β Χ97β 19ΘΘ 199β 2008 2018 202Θ QACAOTOCTT CAOCCTG^GO CTOAO^CTCC OGGATGOTCC TCOGQCTCTQ TGCAOQCAGQ AOOTGOCA6C 經濟部中央標準局印裝 204Θ · 2CVS6 206Θ 207« 2νθβ 209a CXTOTAOCiGA AC咖GTCCT TCAAQTTAGC TCftOliACXJCT TQGAAAiiCAT CACCTCAGGC CACTGTGCCX 16Θ a^t 210Θ 2116 2128 213Θ 214Θ 21S6 ACCCCUATTT ^CTCTTTp TCTCCCAAAT GaG^rtlATAfl CWACCTCiTCC TTTCT^TCrtC 217B 2iea 219Θ 2206 2219 TOfUAOCAAC AOUUCAATTA ΑΤΑΑΤΜΑΤΰϋ CCAAATAATT AAAAAAACCQ AA了TC 甲 4 (210X297 公廣) 丨二 78. 8. 3,000 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 992 1001 1010 1019 1028 1037 GTG CCT CAC TTG CCT GCC GAT Tag GCC CGG GGT ACA CAG ~GGC CCC GAG CAG CAG Val Pro His Leu Pro Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin 1046 __1055__1064 __1073 _ 1082 __1091__ CAC CTG CTG ATC ACA GCG CCG AGC TCC AGC AGC AGO TCC CTG GAG AGC TCG GCC His Leu leu lie Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala HOP__1109___1113__1127__1136__1145__ AGT GCG TTG GAC AGA AGG *GCG CCC ACT CGG AAC. CAG CCA CAG GCA CCA GGC GTG Ser Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly Val 1154__1163___1172__1181 1190__1199 __^ — GAG GCC AGT GGG GCC GGG GAG GCC CGG GCC AGC ACC GGG AGC TCA GAT TCT TCC Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ser Ser 1208 1217 1226 .. 1235 1244 1253 :, * CCT GGT GGC CAT GGG ACC CAG GTC AAT GTC ACC TGC ATC GTG AAC GTC TGT AGC Pro Gly Gly His Gly Thr Gin Val Asn Val Thr Cys lie Val Asn Val Cys Ser 1262 1271 1280 1289 1298 __ 1307 — _ AGC TCT GAC CAC AGO TCA CAG TGC TCC TCC CAA GCC AGO TCC ACA ATG GGA GAC Ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cys ser Ser pin Ala Ser Ser Thr MET Giy Asp 1316 1325 1334 1343 1352 1361__ - —— I . - 瞧 __ . — —- _ — 1 — ' "" ACA GAT TCC AGC CCC TCG GAG TCC CCG AAG GAC GAG CAG GTC CCC TTC TCC AAG Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro Lys Asp Glu Gin Val Pro Phe Ser Lys 1370 1379 __1388 __1397 __1406 __1415 — _ GAG GAA TGT GCC TTT CGG TCA CAG CTG GAG ACG CCA GAG ACC CTG CTG GGG AGC Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser 1424 1433 1442 1451 1460 1469 ACC GAA GAG AAG CCC CTG CCC CTT GGA GTG CCT GAT GCT GGG ATG AAG CCC AGT Thr Glu Glu Lys Pro Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly MET Lys Pro Ser 1478^ 1488 1498 1508 1518 1528 1538 I 〉 TAA XCCAGGCCGGT GTGGGCTGTG TCGTAGCCAA GGTGGGCTGA GCCCTGGCAG GATGACCCTG 1548 1558 1563 1578 1588 1598 1608 CGAAGGGGCC CTGGTCCTTC CAGGCCCCCA CCACTAGGAC TCTGAGGCTC TTTCTGGGCC AAGTTCCTCT 1*613 1628 1638 1648 L658 1668 1678 AGTGCCCTCC ACAGCCGCAG CCTCCCTCTG ACCTGCAGGC CAAGAGCAGA GGCAGCGGGT TGTGGAAAGC 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS〉A4規格（210X297公釐）· 12 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂 t..... 申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 1688 1698 1708 1718 1728 L738 1748 CTCTGCTGCC ATGGTGTGTC CCTCTCGGAA GGCTGGCTGG GCATGGACGT TCGGGGCATG CTGGGGCAAG 1758 1768 1778 1788 L798 1308 18L8 TCCCTGACTC XCTGTGACCT GCCCCGCCCA GCTGCACCTG CCAGCCTGGC TTCTGGAGCC CTTGGGTTTT 1823 1838 1_8.48· 1358. 1868 1878 1888 , TTGTTTGTTT 'GTTTGTTTGT' tTGTTTGTTT CTCCCCCTGG GCTCTGCCCC AGCTCTGGCT TCCAGAAAAC 1898 1908 1913 1923 1938 1948 1958 CCCAGCATCC TTTTCTGCAG AGGGGCTTTC TGGAGAGGAG GGATGCTGCC TGAGTCACCC ATGAAGACAG 1968 1973 1988 1998 2008 2018 2028 GACAGTGCTT CAGCCTGAGG CTGAGACTGC G<3GATGGTCC TGGGGCTCTG TGCAGGGACG AGGTGGCAGC 2038 2048 2053 2068 2078 2088 2098 CCTGTAGGGA ACGGGGTCCT TCAAGTTAGC TCAGGAGGCT TGGAAAGCAT CACCTCAGGC CAGGTGCAGT 2108 2118 2128 2138 2148 2158 2168 CCCTCACGCC TATGATCCCA GCACTTTGGG AGGCTGAGGC GGGTGGATCA CCTGAGGTTA GGAGTTCGAG 2178 2188 2198 2208 2218 ACCAGCCTGG CCAACATGGT AAAACCCCAT CTCTACTAAA ATTACAGAAA AATTC (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -装· 訂經濟部中央棣準局負工消费合作社印装 at. 一紙本準 I棣 I家 « 一國-t 用適公· 7 9 2