DD296963A5 - Tumor-nekrose-faktor (tnf)-inhibitor und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-) Inhibitoren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Erfindung wird in der Gentechnik angewendet und die Inhibitoren finden in pharmazeutischen Formulierungen Verwendung. Es wurde ein betraechtlich gereinigter TNF-Inhibitor, der gegen TNF aktiv ist, gefunden. Ein 30 kDa Glycoprotein und ein 40 kDa Glycoprotein wurden in ihrer gereinigten Form erhalten, wobei der 40 kDa TNF-Inhibitor aktiv gegen TNF alpha und TNF beta ist. Die Aminosaeuresequenz dieser Inhibitoren ist offenbart. Angegeben ist auch eine rekombinante DNA-Methode zur Herstellung eines TNF-Inhibitors. Durch die erfindungsgemaeszen neuen TNF-Inhibitoren koennen die schaedlichen Auswirkungen des TNFs verhindert werden.{Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-) Inhibitoren; 30 kDa und 40 kDa Glycoprotein; gereinigte Form; aktiv gegen TNF alpha und beta; Aminosaeuresequenz; rekombinante DNA-Methode; Herstellung TNF-Inhibitor; Gentechnik; pharmazeutische Formulierungen}

Description

Tumor-Nekrose-Faktoren sind eine Klasse von Patienten, die von vielen Zelltypen hergestellt werden, einschließlich Monozyten und Makrophagen Mindestens zwei TNFs sind zuvor beschrieben worden, speziell TNF alpha und TNF beta (Lymphotoxin) Diese bekannten TNFs haben wichtige physiologische Effekte auf eine Anzahl verschiedener Zielzellen, die an Entzundungsantworten beteiligt sind Die Proteine veranlassen Fibrolasten und Synovialzellen, latente Kollagenase und Prostaglandin E 2 auszuschneiden und veranlassen osteoblastische Zellen, die Knochenresorption durchzufuhren Diese Proteine steigern die oberflachenadhasiven Eigenschaften von endothehalen Zellen fur Neutrophile Sie veranlassen auch endothehale Zellen, Gerinnungsmittel auszuscheiden und verringern ihre Fähigkeit, Gennsel aufzulösen Zusätzlich leiten sie die Aktivität von Adipozyten weg von der Speicherung von Lipiden, indem sie die Expression des Enzyms Lipoproteinlipase hemmen TNFs veranlassen Hepatozyten, eine Klasse von Proteinen, bekannt als „akute Phase Reagenzien" zu synthetisieren, und sie wirken auf den Hypothalamus als Pyrogene Auf Grund dieser Aktivitäten wurde gesehen, daß TNFs eine wichtige Rollein der Antwort eines Organismusauf Stress, Infektion und Verletzung spielen Siehez B ArtikelvonP J Selby etal inLancetFebr 27,1988,S 483, H F Starness,Jr etal inJ CIm Invest 82 1321 (1988),A Oliffetal in Cell 50 555(1987), und A Waage et al in Lancet, Febr 14,1987, S 355

Jedoch kamen trotz ihrer normalerweise vorteilhaften Wirkungen Umstände zutage, bei denen die Wirkungen von TNFs schädlich sind Zum Beispiel verursacht in Tiere injiziertes TNF alpha die Symptome des septischen Schockes, es wurde beobachtet, daß endogene TNF Spiegel ansteigen, folgend auf Injektion von Bakterien oder Baktenenzellwanden TNFs verursachen auch Darmnekrose und akute Lungenverletzungen (acute lung injury), und sie stimulieren den Katabolismus von Muskelprotem

Zusätzlich konnte die Fähigkeit von TNFs, die Spiegel an Kollagenase in Gelenken zu erhohen und die Chemotaxis und Wanderung von Leukozyten und Lymphozyten zu leiten, auch den Abbau von Knorpel und die Proliferation von Synovialgewebe bei dieser Krankheit verantwortlich sein Deshalb konnten TNFs als Mediatoren der akuten und chronischen Phasen der Immunpathologie bei rheumatoider Arthritis dienen TNFs konnten auch fur einige Störungen der Blutgerinnung verantwortlich sein durch Andern der Funktion endothehaler Zellen Zudem wurde überschüssige TNF-Produktion in PaUenten mit AIDS gezeigt, und dies konnte verantwortlich sein fur einen Teil des Fiebers, der akuten Phasenantwort und der Cachexie, die bei dieser Krankheit und Leukämien beobachtet wird

Bei diesen und anderen Umstanden, bei denen TNF einen schädlichen Effekt hat, besteht eindeutig ein klinischer Nutzen eines Inhibitors der TNF-Wirkung

Systematisch verabreicht waren TNF-Inhibitoren nützliche Therapeutika gegen septischen Schock und Cachexie Lokal verabreicht wurden solche TNF-Inhibitoren dazu dienen, Gewebezerstorung in entzündeten Gelenken und anderen Entzundungsstellen zu verhindern Tatsächlich konnten solche TNF-Inhibitoren noch wirksamer sein, wenn sie in Verbindung mit Interleukin I (IL-I) Inhibitoren verabreicht wurden

Eine Möglichkeit fur einen therapeutischen Eingriff gegen die Wirkung von TNF besteht auf der Ebene der Antwort der Zielzelle auf das Protein TNF scheint auf Zellen auf einem klassischen rezeptorvermittelten Weg zu wirken Somit wurde jedes Molekül das die Fähigkeit von TNF an seine Rezeptoren zu binden stört, entweder durch Blockieren des Rezeptors oder durch Blockieren des TNF, dieTNF-Wirkung regulieren Aus diesen Gründen wurde nach Proteinen und kleinen Molekülen, die auf diese W°ise in der Lage sind, TNF zu inhibieren, durch die gegenwartigen Erfinder gesucht

Die Aufgabe der Erfindung besteht in folgendem

- gereinigte Formen von TNF-Inhibitor, die gegenüber TNF alpha aktiv sind, zur Verfugung zu stellen und diese Inhibitoren in gereinigter Form zur Verfugung zu stellen, um die Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz zu ermöglichen,

- die Aminosäuresequenz bestimmter TNF-Inhibitoren zur Verfugung zu stellen,

- eine zellulare Quelle fur die mRNA, codierend fur TNF-Inhibitoren und eine cDNA-Bank, enthaltend eine cDNA fur die Inhibitoren, zur Verfugung zu stellen,

- einen genomischen Klon an DNA, codierend fur den TNF-Inhibitoren, und die codierenden Sequenzen dieser DNA, zur Verfugung zu stellen,

- die Identifizierung von biologisch aktiven Analogen solcher TNF-Inhibitoren mit verstärkten oder gleichwertigen Eigenschaften,

- ein rekombmantes DNA-System fur die Herstellung des TNF-Inhibitors zur Verfugung zu stellen,

- gereinigte Formen von TNF zur Verfugung zu stellen, die als pharmazeutische Präparate, die Aktivität gegen TNF entfalten, angewendet werden konnten,

- gereinigte Kombinationen von TNF-Inhibitoren und IL-1-lnhibitoren zur Verfugung zu stellen, die als pharmazeutische Präparate, die Aktivität gegen IL 1 und TNF entfalten, angewendet werden können

Es wurde ein beträchtlich gereinigter Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Inhibitor, der gegen TNF aktiv ist, gefunden Es wurden mindestens zwei TNF-Inhibitorproteine mit TNF-inhibierenden Eigenschaften isoliert Ein 3OkDa Protein und ein 4OkDa Protein wurden in ihrer gereinigten Form erhalten Die Aminosäuresequenz des 3OkDa TNF-Inhibitorprotetns ist erhalten worden Die Aminosauresequenzdaten des 40kDa-lnhibitorproteins sind ebenfalls erhalten worden Beide, der 30kDa TNF-Inhibitor und der 4OkDa TNF-Inhibitor sind neue, zuvor nicht beschriebene Proteine.

Der 30kDa TNF-Inhibitor kann deglycolysiert sein und hat ein Molekulargewicht von ungefähr 18kDa Der TNF-Inhibitor ist durch rekombmante DNA-Methoden hergestellt Der kDa-lnhibitor kann ebenfalls deglycolysiert sein Der 3OkDa TNF-Inhibitor besitzt die in Fig 19 gezeigte Aminosäuresequenz Der 4OkDa TNF-Inhibitor besitzt die in Fig 38 gezeigte Aminosäuresequenz

DerTNF-lnhibitor40kDa istTNF lnhibitorA51 undA53

Das erfmdungsgemaße Verfahren ist eine rekombmante DNA Methode zur Herstellung eines TNF-Inhibitors und umfaßt folgende Verfahrensschritte

(a) Herstellung einer DNA-Sequenz, die eine W rtszelle dahin lenken kann, ein Protein mit TNF-Inhibitoraktivrtaten herzustellen

(b) Klomeren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine ganze Zelle transferiert und dort repliziert werden kann, wobei der Vektor zum Expnmieren der DNA-Sequenz benotigte Funktionselemente enthalt.

-3- 296 96]

(c) Transferieren des Vektors, enthaltend die synthetische DNA-Sequenz und Funktionselemente, in einen Wirt, der die den i] TNF-Inhibitor codierende DNAexprimieren kann; !

(d) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die geeignet sind, den Vektor zu amplifizieren und den Inhibitor zu exprimieren;

(e) Ernten des Inhibitors; und

(f) dem Inhibitor ermöglichen, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wodurch er TNF-Inhibitoraktivität besitzt.

Bei diesem Verfahren ist der TNF-Inhibitor 30 kDa oder der TNF-Inhibitor 4OkDa TNF-Inhibitor. Der TNF-Inhibitor 40 kDa ist TNF-Inhibitor Δ51 und der TNF-Inhibitor 4OkDa ist TNF-Inhibitor Δ53. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Gen, das für Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Inhibitor codiert. Bei diesem Gen ist der TNF-Inhibitor ein 3OkDa TNF-Inhibitor oder ein reifer 40kDa-lnhibitor. Der TNF-Inhibitor 40 kDa ist TNF-Inhibitor Δ51 oder TNF-Inhibitor Δ53.

Ein menschlicher genomischer DNA-Klon, der das Gen für das 3OkDa Protein enthält, ist erhalten worden. Eine Zellquelle für dieses Protein ist identifiziert ein cDNA-Klon erhalten worden, und die Nukleinsäuresequenz des Gens für das Protein ist bestimmt worden.

Zusätzlich ist der Genklon in einen Vektor eingefügt worden, von dem gefunden wurde, daß er das Protein in Wirtszellen exprimiert. Es wurde auch ein Verfahren entwickelt, um das Protein in einer aktiven Form zu reinigen. Eine Zellquelle ist identifiziert worden, die das 4OkDa Protein produziert, und es isteincDNA-Klon erhalten worden, und die Nukleinsäuresequenz des Gens für das 4OkDa Protein ist bestimmt worden. Die vollständigen cDNA-Klone, die für beide, den 30 kDA TNF-Inhibitorvorläuf er und den 40 kDa TNF-Inhibitorvorläufer codieren, sind in Säugerzellen exprimiert worden, um eine Zunahme an TNF-Bindungsstellen auf der Zelloberfläche zu erzielen.

Ein Gen, codierend für die reife Form des 3OkDa Proteins, ist in E. CoIi exprimiert worden. Drei getrennte Gene, codierend für das Ganze oder Teile des reifen 4OkDa Proteins sind auch in E. CoIi exprimiert worden. Die drei exprimierten40kDa Inhibitorproteinereifer 40 kDa TNF-Inhibitor, 4OkDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-lnhibitorA53-besitzen jeweils TNF-inhibierende Aktivität. Reifer TNF-Inhibitor, wie aus dem durch menschliche U937 Zellen konditioniertem Medium isoliert, und 4OkDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 werden gemeinsam als 4OkDa TNF-Inhibitor bezeichnet.

Der 30 kDa TNF-Inhibitor hat TNF alpha-inhibierende Aktivität gezeigt. Der 4OkDa TNF-Inhibitor hat inhibierende Wirkung gegen beide TNF alpha und TNF beta, gezeigt.

Es wird nun möglich sein, die Herstellung dieser TNF-Inhibitoren im großen Maßstab durch rekombinante DNA-Technologie durchzuführen. Diese Inhibitoren sollten zur Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen geeignet sein, die zur Behandlung pathophysiologischer Zustände, welche durch TNF vermittelt sind, nützlich sind. Die Erfindung soll nachstehend an mehreren Beispielen erläutert werden.

Fig. 1: zeigt einen Cytotoxizitätstest für TNF in der Abwesenheit (-.-.) und in der Abwesenheit (-x-x) von TNF-Inhibitor

(30 kDa). Verschiedene Konzentrationen an TNF wurden mit und ohne TNF-Inhibitor (3OkDa) inkubiert, und der

Cytotoxizitätstests wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Fig. 2: zeigt einen nativen Gelshift-Assay, bei dem „a" TNF alleine darstellt, und „b" stellt TNF + TNF-Inhibitor

(3OkDa) dar

Fig. 3: zeigt Con A-Peroxidase-Färbung von TNF-Inhibitor (3OkDa). Ungefähr 200 ng eines jeden Proteins wurden auf

14% SDS-PAGE laufengelassen und auf Nitrozellulosefiltertransferiert.

Glycoproteine wurden unter Verwendung von Con A-Peroxidase-Färbung identifiziert.

In dieser Figur stellt „a" einen Molekulargewichtsmarker dar, „b" stellt Ovalbumin dar, „c" stellt

Rinderserumalbumin dar, und „d" stellt TNF-Inhibitor (3OkDa) dar. Fig. 4: zeigt die chemische Deglycosylierung von TNF-Inhibitor. Ungefähr 200 ng an TNF-Inhibitor 30 kDa wurden

chemisch deglycosyliert (Spur C), wie in Beispiel 1 beschrieben. Fig. 5: zeigt eine N-Gylcanase-Behandlung von TNF-Inhibitor (30 kDa). GereinigterTNF-lnhibitor (3OkDa) wurde

jodiert mit Bolton-Hunterreagenz, und denaturierter-jodierterTNF-lnhibitor (30 kDa) wurde mit N-Glycanase für 6 Stunden bei 37°C behandelt. In dieser Figur stellt „a" nativen TNF-Inhibitor (30 kDa) dar, und „b" stellt deglycosylierten, TNF-Inhibitor (30 kDa) dar.

Fig.6A: zeigt ein OD₂8o-Profil der DEAE-Sepharose CL-6 B Chromatographie von 20I Harn dar.

Fig. 6B: zeigt ein Autoradiogramm des dazugehörigen nativen Gel-Shift-Assays, das einen Peak an

TNF-Inhibitor (30 kDa) in Fraktionen 57-63, was ungefähr bei 8OmM NaCI ist, anzeigt.

Fig. 7; zeigt ein OD₂₈₀-PrOfH der Elution mit 0,05 MNa Phosphat pH 2,5 von der TNF-Affinitätssäule.

Fig. 8Au. 8 B: zeigen Chromatographieprofile (OD₂₁₅ und OD₂₈₀) der RP8-Reinigung des TNF-Inhibitors (30 kDa) mit dem L929-Bioassay der Fraktionen von der RP8-Säule, das einen Peak an TNF-Inhibitor (30 kDa) bei Fraktionen 28—31 zeigt, was ungefähr 18% Acetonitril entspricht und bei Fraktionen 35 und 36, was ungefähr 21 % Acetonitril entspricht.

Fig. 8B: zeigt eine silbergefärbte 15% SDS-PAGE des RP89-Pools, die eine einzelne Bande bei 3OkDa zeigt.

Fig. 9 A: zeigt eine Peptid-Reinigung eines Lys-C-Verdaus von TNF-Inhibitor (30 kDa).

Fig. 9 B: zeigt eine Peptid-Reinigung alkylierter (·) Lys-C-Verdaue von TNF-Inhibitor (30 kDa).

Fig. 10: zeigt eine Peptid-Reinigung zweier alkylierter (·) Asp-N-Verdaue von TNF-Inhibitor (30 kDa).'

Fig. 11 A u. 11 B: zeigen Peptid-Reinigungen eines Endopeptidase V8-Verdaus von reduziertem carboxymethyliertem

TNF-Inhibitor (30 kDa)

Fig. 12: zeigt Aminosäuresequenzen, die in TNF-Inhibitor (30 kDa) vorkommen. Lücken in der Sequenzge"ben an, daß

der Rest nicht eindeutig durch Proteinsequenzierung identifiziert worden ist. C* zeigt die Identifizierung von

Carboxymethylcystein durch die Anwesenheit von ³H in dem Rest an. Fig. 13: zeigt die DNA-Sequenz eines genomischen Klons, codierend für mindestens einen Teil eines

TNF-Inhibitors (30 kDa).

Fig. 14: zeigt mindestens 70% der reifen Aminosäuresequenz eines bevorzugten TNF-Inhibitors.

Fig. 15: zeigt den Nachweis von TNF-Inhibitor in U 937-Überstand durch den Gelshift-Assay.

Fig. 16: zeigt den Nachweis von TNF-Inhibitor in HPLC-Fraktionen von U 937-Überstand.

Fig. 17: zeigt den Northern Blot gemäß Beispiel 4.

Fig. 18: zeigt den deglycosylierten TNF-Inhibitor (30 kDa) bindend an TNF. Glycosylierter und deglycosylierter

TNF-Inhibitor wurde mit TNF-Affigel inkubiert und Durchlaufmaterialien und Eiuate des Gels wurden auf SDS-PAGE analysiert. In dieser Figur gibt (11) den Durchlauf von TNF-INH, reduziert und oxidiert, an, (21) gibt den Durchlauf von deglycosyliertem TNF-INH, reduziert und oxidiert, an, (51) gibt den Durchlauf von nativem TNF-INH an, (12) gibt das Eluat von TNF-INH, reduziert und oxidiert, an, (22) gibt das Eluat von deglycosyliertem

TNF-INH, reduziert und oxidiert, an, und (52) gibt das Eluat von nativem TNF-INH an. Fig. 19: zeigt die komplette Aminosäuresequenz des 30 kDa TNF-Inhibitors.

Fig. 20: zeigt die cDNA-Sequenz, codierend die in Fig. 19 gezeigte Aminosäuresequenz.

Fig. 21: zeigt die gesamte cDNA-Sequenz für den Vorläufer des 30 kDa TNF-Inhibitors.

Fig. 22: zeigt die DNA-Sequenz nahe dem Start des TNF-Inhibitorgens (30 kDa) im Plasmid pTNFIX-1.

Fig. 23: zeigt das Plasmid pCMVXV beta TNFBP stop A.

Fig. 24: zeigt das Plasmid pSVXVTNFBPstop A.

Fig. 25: zeigt ein Chromatographieprofil OD215 der RP 8-Säule des 30 kDa TNF-Inhibitors von E. CoIi. Die

L929-Bioassayergebnisse sind auch gezeigt (-x-x).

Fig. 26: zeigt eine silbergefärbte 14% SDS-PAGE der RP8-Fraktionen in Fig.25.

Fig. 27: zeigt ein Chromatographieprofil OD₂i5 der RP8-Reinigung des TNF-Inhibitors von U937-Zellen. Die

L929-Bioasseyergebnisse sind auch gezeigt als Balkendiagramm. Zwei getrennte TNF-Inhibitorpeaks sind

erkennbar

Fig. 28: zeigt eine silbergefärbte 14% SDS-PAGE der RP8-Fraktionen. Fraktion Nummer 30 enthält den 30 kDa

TNF-Inhibitor, und Fraktion Nummer 35 enthält den 40kDa TNF-Inhibitor. Fig. 29: zeigt ein Chromatographieprofil OD215 der Reinigung von 40 kDa TNF-Inhibitor aus Harn. Der zweite

TNF-Inhibitorpeakvon mehreren RP 8-Chromatographien wurde kombiniert und erneut analysiert auf einer RP8-Säule. TNF-inhibierende Aktivität wird als Balkendiagramm gezeigt. Der Unterschied zwischen dem OD₂is-Peak und dem Aktivitätspeak spiegelt das Totvolumen zwischen dem Detektor und dem

Fraktionssammler wider

Fig. 30: zeigt eine silbergefärbte 14% SDS-PAGE der RP8-Fraktionen aus Harn. Fraktion Nummer 32 enthält den 40 kDa

TNF-Inhibitor

Fig. 31: zeigt die aminoterminalen Sequenzen von Inhibitoren stammend von U 937 (30 kDa und 40 kDa) und 40 kDa

TNF-Inhibitor stammend aus Harn.

Fig. 32: zeigt eine Peptidreinigung von Endopeptidase V8-verdautem 40 kDa TNF-Inhibitor.

Fig. 33: zeigt eine Peptidreinigung von Endopeptidasen Arg-C-verdautem 40 kDa TNF-Inhibitor.

Fig. 34: zeigt eine Peptidreinigung von Trypsin verdautem Arg-C 16-Peptid.

Fig. 35: zeigt eine Peptidreinigung von Chymotrypsin verdautem Arg-C 10-Peptid.

Fig. 36: zeigt eine Primärstruktur des 40 kDa TNF-Inhibitors.

Fig. 37: zeigt einen Teil der 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA-Sequenz zusammen mit dem vorhergesagten Aminosäure-

Translationsprodukt.

Fig. 38: zeigt die komplette Aminosäuresequenz des 40 kDa TNF-Inhibitors.

Fig. 39: zeigt die gesamte cDNA-Sequenz für den Vorläufer des 40 kDa TNF-Inhibitors zusammen mit seinem zu

folgernden Translationsprodukt

Fig.40: zeigt einen Cytotoxizitätstest für TNF beta (Lymphotoxin) bei Anwesenheit (0-0) von 4OkDa TNF-Inhibitor bei

Anwesenheit (·—·) von 30 kDa TNF-Inhibitor und ohne jeglichen Inhibitor (x-x). Fig. 41: zeigt die Expression der in Fig. 21 gezeigten 30 kDa TNF-Inhibitor cDNA-Sequenz in COS7-Zellen. COS-Zellen

wurden mit Plasmiden transfiziert unter Verwendung der Lipofectionmethode von Feigner et al. (Proc. Natl.

Acad. Sei. [USA] 84,7413-1987). 3,4 x 10⁵-Zellen wurden mit der angegebenen Menge an (¹²⁵I) TNFa mit einer spezifischen Aktivität von 5,6 χ 10⁴ cpm/ng inkubiert und die an die Zellen gebundene Menge bestimmt.

Offene Zeichen sind die gesamten cpm, die mit Zellen nach 4 Stunden Inkubation bei 4°C assoziiert sind.

Ausgefüllte Zeichen stellen gebundenen (¹²⁵I) TNFa bei Anwesenheit eines 180fachen Überschusses an kaltem

unmarkiertem TNFa dar

Fig. 42: zeigt die Expression der in Fig. 39 gezeigten 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA-Sequenz in COS7. Assaybedingungen

waren wie in Fig. 41 beschrieben. Die ausgefüllten Zeichen stellen gebundenen (¹²⁵I I) TNFa in Anwesenheit

eines 180fachen Überschusses an kaltem unmarkiertem TNFa dar. Fig. 43: zeigt den Cytotoxizitäts-Test einer HPLC RPC-8-Fraktion menschlicher Monozyten, die mit PMA und PHA für

24 Stunden behandelt wurden

Fig.44: zeigt das RPC-8 chromatographischer Muster von 4OkDa TNF-Inhibitor Δ 51 (17), die

SDS-Polyacrylamidgelanalyse der Fraktionen (B) und den Cytotoxizitäts-Test auf L929-Zellen (C). Fig. 45: zeigt das RPC-8 chromatographische Muster von 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 (A), die

SDS-Polyacrylamidgelanalyse der Fraktionen (B) und den Cytotoxizitäts-Test auf L929-Zellen (C).

Im folgenden werden ausführlich gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung erwähnt, die zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären. ·

-5- 296 96

1 Inhibitor, isoliert aus Harn

Wie oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung TNF Inhibitoren, die in gereinigter Form isoliert worden sind Bei einer ' Ausfuhrungsform dieser Erfindung stammen die TNF-Inhibitoren vorzugsweise aus Harn Zusatzlich umfaßt die Erfindung ^: betrachtlich gereinigte TNF-Inhibitoren jeglichen Ursprungs, die biologisch äquivalent zu den Inhibitoren isoliert aus Harn sind. Überall in dieser Beschreibung sollte jede Bezugnahme auf einen TNF-Inhibitor oder einfach einen Inhibitor aufgefaßt werden als Bezug auf jeden der identifizierten Inhibitoren und hierin beschrieben

Unter , biologisch äquivalent", wie es überall in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, verstehen wir ^;

Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, TNF-Wirkungen in einer ahnlichen Weise, aber nicht notwendigerweise in gleichem Ausmaß wie der native aus Urin isolierte TNF-Inhibitor, zu verhindern Unter .beträchtlich homolog", wie es überall in der folgenden Beschreibung und Ansprüchen verwendet wird, wird ein Grad an Homologie zu dem nativen aus Harn isolierten TNF-Inhibitor verstanden, der den von jedem zuvor berichteten TNF-Inhibitor gezeigten Grad übersteigt Vorzugsweise übersteigt der Grad an Homologie 70%, besonders bevorzugt übersteigt er 80%, und ganz besonders bevorzugt übersteigt er 90%, 95% oder 99% Eine speziell bevorzugte Gruppe von TNF-Inhibitoren sind über 95% homolog mit dem nativen Inhibitor Der Prozentsatz an Homologie, wie hierin beschrieben, wird berechnet als der Prozentsatz an Aminosaureresten, die in der kleineren der zwei Sequenzen gefunden werden, die ausgerichtet sind auf identische Aminosaurereste in der zu vergleichenden Sequenz, wenn vier Lucken in einer Lange von 100 Aminosäuren eingefugt werden können, um die Ausrichtung (alignment) zu unterstutzen, wie von Dayhoff dargelegt, in Atlas of Protein Sequence and Structure, VoI 5, S 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D C , was ausdrucklich durch den Verweis hierin aufgenommen wird Auch als betrachtlich homolog eingeschlossen sind solche TNF Inhibitoren, die vielleicht aufgrund von Kreuzreaktivitat mit Antikörpern gegen die beschriebenen Inhibitoren isoliert werden, oder deren Gene vielleicht durch Hybridisierung mit den Genen oder mit Segmenten der beschriebenen Inhibitoren isoliert werden Die bevorzugten TNF-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung wurden aus Harn erhalten und zum erstenmal in einer gereinigten Form isoliert Fur die Zwecke der vorliegenden Anmeldung soll „reine Form" oder „gereinigte Form" bedeuten, wenn damit auf hierin offenbarte TNF-Inhibitoren hingewiesen wird, eine Präparation, die im wesentlichen frei von Proteinen ist, die nicht TNF-Inhibitorproteine sind Vorzugsweise sind die TNF-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung zu mindestens 50% rein, vorzugsweise 75% rein und besonders bevorzugt 80%, 95% oder 99% rein In einer Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung ist die TNF-Inhibitorproteinpraparation ausreichend rein, um es einem Fachmann zu ermöglichen, dessen Aminosäuresequenz zu bestimmen, ohne vorher weitere Reinigungsschritte auszufuhren

Mindestens zwei Inhibitoren sind mit den in den Beispielen dargelegten Methoden isoliert worden Die zwei Inhibitoren sind ungefähr 30 kDa und ungefähr 4OkDa Moleküle auf SDS-PAGE Der 30kDa-lnhibitor eluiert von einer DEAE CL6B-Saule bei ungefähr 8OmM NaCI in Tris-Puffer, pH 7,5 Die Aminosäuresequenz des 3OkDa Inhibitors ist in Fig 19 dargelegt, und die Aminosäuresequenz des 4OkDa Inhibitors ist in Fig 38 dargelegt Von dem 3OkDa TNF-Inhibitor ist gezeigt worden, daß er die Aktivität von TNF alpha inhibiert, und daß er keinen Effekt auf die Aktivität von TNF beta hat Von dem 4OkDa TNF-Inhibitor ist gezeigt worden, daß er einen bedeutenden inhibierenden Effekt gegen beide, TNF alpha und TNF beta (Lymphotoxin), besitzt

2 Inhibitor, isoliert aus U 937konditioniertem Medium

Bei einer alternativen Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung sindTNF-lnhibitoren aus einem Medium, konditioniert mit menschlichen U 937 Zellen, isoliert worden Zwei TNF-Inhibitorproteine sind identifiziert und aus diesem konditionierten Medium isoliert worden DiezweiTNF-lnhibitoren sind 3OkDa und 4OkDa Proteine, die betrachtlich homolog zu den 3OkDa und 4OkDa TNF-Inhibitoren isoliert aus Harn sind, und sind biologisch äquivalent zu solchen Proteinen

3 Struktur des 3OkDa TNF-Inhibitors

Der aus Harn isolierte 3OkDa TNF-Inhibitor ist ein Glycoprotein, das mindestens einen Kohlenhydratanteil enthalt In einer Ausfuhrungsform dieser Erfindung ist der natürliche 30 kDa TNF-Inhibitor deglycosyliert Der deglycosylierte TNF-Inhibitor, der seine Fähigkeit, TNF zu binden, beibehalt, liegt im Bereich der vorliegenden Erfindung Vollständig und partiell deglycosylierter 30 kDa TNF-Inhibitor wird von dieser Erfindung umfaßt Der aus Harn isolierte deglycosylierte 30 kDa TNF-Inhibitor ist ein ungefähr 18 kDa Protein

Die identifizierte Gensequenz, die das 30 kDa Protein codiert, enthalt kein Terminationscodon, wie das fur die Aminosäuresequenz des 18 kDa Proteins zu erwarten ware Die Erfinder theoretisieren, aber sind keinesfalls durch diese Theorie limitiert, daß die in vivo produzierten Proteine zusätzliche Aminosauresequenzen enthalten Gemäß dieser Theorie ist das codierte Protein ein TNF-Rezeptormolekul Das durch die cDNA codierte Inhibitorprotein hat eine hydrophobe Sequenz, die mit der sich durch die Zellmembran erstreckende Region verei nbar ware, und einen TN F binden den Anteil, der sich extrazellular von der Zellmembran erstrecken wurde In Einklang mit dieser Hypothese und wie in Beispiel 19 beschrieben, istdiecDNA in COS-Zellen exprimiert worden und fuhrt zu einer Zunahme in der Anzahl an TNF-Bindungsstellen auf der Zelle DieTNF-lnhibitoren der vorliegenden Erfindung sind deshalb die Rezeptorfragmente oder Anteile des Rezeptormolekuls Solche bindenden Fragmente sind in bezug auf andere Bindungs-/Inhibitor-Molekule (z B IL-2-lnhibitor) identifiziert worden und werden als lösliche Rezeptoren bezeichnet

Diese Theorie stimmt mit dem Fehlen eines Terminationscodons uberein, das dem Ende des Proteins, wie aus der bekannten Sequenz des isolierten TNF-Inhibitorfaktors angenommen, entsprechend wurde Sie stimmt auch mit der Tatsache uberein, daß die Nukleotidsequenz an der Stelle, wo das Terminationscodon zu finden sein mußte, eine Reihe von hydrophoben Aminosäuren codiert

Die vorliegende Erfindung umfaßt deshalb nicht nur den identifizierten und beschriebenen Anteil der TNF-Inhibitoren, sondern alle Proteine, die irgendeinen Anteil der Aminosäuresequenz, die durch die identifizierten und hierin beschrieben cDNA-Sequenzen codiert werden, enthalten. .

4 Struktur des 4OkDa TNF-lnhibitors

Der aus mit menschlichen U937-Zellen konditioniertem Medium isolierte 4OkDa TNF-Inhibitor und in Harn identifiziert ist ein Glycoprotein, das mindestens einen Kohlenhydratanteil enthalt In einer Ausfuhrungsform dieser Erfindung ist der natürliche 4OkDa TNF-Inhibitor deglycosyliert Der deglycosylierte 4OkDa TNF-Inhibitor, der seine Fähigkeit, an beide, TNF alpha und TNF beta (Lymphotoxin), zu binden, beibehalt, liegt im Bereich der vorliegenden Erfindung Vollständig und teilweise deglycosylierter 40 kDa TNF-Inhibitor wird von dieser Erfindung umfaßt Die Erfinder theoretisieren, daß der 4OkDa Inhibitor auch ein löslicher Rezeptor sein konnte Die identifizierte Gensequenz, die das 4OkDa Protein codiert, enthalt kein Terminationscodon, wie das von der Aminosäuresequenz des deglycosylierten40kDa TNF-Inhibitorszu erwarten gewesen ware Wie in Beispiel 20 beschrieben, ist die cDNA in COS-ZeI len exprimiert worden und fuhrt zu einer Zunahme in der Anzahl an TNF Bindungsstellen auf derZelle

Die vorliegende Erfindung umfaßt das Gen, das das aus mit menschlichen U 937 Zellen konditioniertem Medium isolierte 40 kDa Protein und in Harn identifiziert codiert, und größere und kleinere Anteile eines solchen Gens bis zu dem Ausmaß, das die TNF inhibierende Aktivität des codierten Proteins nicht beeinflußt wird Wie aus Fig 38 ersichtlich, besitzt der reife 40 kDa TNF Inhibitor eine prolinreiche Region nahe des zu erwartenden C-Terminus des Proteins 4OkDa TNF-Inhibitoren, bei denen das ganze oder Teile des prolinreichen Musters nicht in dem Protein enthalten sind, sind als TNF-Inhibitoren aktiv und liegen im Bereich der vorliegenden Erfindung Zwei solcher verkürzten Proteine sind unten in den Beispielen 17 und 22 beschrieben und werden als 4OkDa TNF-lnhibitorA51 und 4OkDa TNF-lnhibitorA53 bezeichnet Alle Teile dieser Anmeldung, die sich allgemein auf 4OkDa TNF-Inhibitor beziehen, sollen das aus mit menschlichen U937-Zellen konditiertem Medium isolierte und in Harn identifizierte reife 40 kDa Protein, wie auch den 40kDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa Inhibitor Δ53 umfassen Es wird allgemein angenommen, daß mindestens ein TNF-Rezeptor in der Lage ist, beide, TNF alpha und TNF beta, zu binden, wahrend einige TN F-Rezeptoren nur ι η der Lage sind, TNF alpha zu binden Dies ist in Übereinstimmung mit den Befunden in der vorliegenden Erfindung, in der zwei TNF-Inhibitoren identifiziert worden sind, fur die beide vorgeschlagen wird, daß sie aktive Fragmente von TNF-Rezeptorstellen sind, und daß einer nur aktiv gegen TNF alpha und der andere aktiv gegen beide, TNF alpha und TNF beta, ist

5 Rekombinanter Inhibitor (a) Allgemein

Es wird nun eine rekombinante DNA-Methode zur Herstellung eines TNF-lnhibitors offenbart In einer Ausfuhrungsform der Erfindung funktioniert die aktive Stelle in einer biologisch äquivalenten Weise zu der des aus Harn isolierten TNF-lnhibitors Eine naturliche oder synthetische DNA-Sequenz kann zur Herstellung solcherTNF-lnhibitoren verwendet werden Diese Methode umfaßt

(a) Herstellung einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Wirtszelle dahinzuleiten, ein Protein mit TNF-Inhibitoraktivitat oder einen Vorlaufer davon herzustellen,

(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine Wirtszelle transferiert und repliziert werden kann, wobei der Vektor Funktionselemente enthalt, die zum Exprimieren der DNA-Sequenz oder eines Vorlaufers, davon benotigt werden,

(c) Transferieren des Vektors, enthaltend die synthetische DNA-Sequenz und Funktionselemente, in eine Wirtszelle, die die fur den TNF-Inhibitor oder einen Vorlaufer davon codierende DNA exprimieren kann,

(d) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen zur Amplifikation des Vektors und Expression des Inhibitors oder eines Vorlaufers davon,

(e) Ernten des Inhibitors oder eines Vorlaufers davon, und

(f) dem Inhibitor erlauben, eine aktive Tertiarstruktur anzunehmen, wodurch er TNF-inhibierende Aktivität besitzt, oder er zu einem Protein mit TNF-inhibierender Aktivität prozessiert werden kann

In einer Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wird der TNF-Inhibitor durch die Wirtszelle in der Form eines Vorlauferproteins hergestellt Dieses Vorlauferprotein wird in einem oder mehreren Schritten zu einem Protein prozessiert, und es wird ihm erlaubt, zu einem aktiven Inhibitor korrekt zu falten, unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Methoden

(b) DNA-Sequenzen

Zur Verwendung in diesen Methoden in Betracht gezogene DNA-Sequenzen werden teilweise in Beispielen 6,14a und 17 diskutiert Es wird betrachtet, daß diese Sequenzen synthetische und natürliche DNA-Sequenzen und Kombinationen davon einschließen Die naturlichen Sequenzen schließen weiterhin cDNA oder genomische DNA-Segmente ein Die Mittel zur synthetischen Erzeugung von Polynucleotidsequenzen, codierend ein Protein identisch zu cDNA oder genomischen Polynucleotidsequenzen codiertem Protein, sind dem Fachmann allgemein bekannt, besonders anbetracht der hierin enthaltenen Lehren Als Beispiel fur den gegenwartigen Stand der Technik, betreffend Polynucleotidsynthese, wird auf Matteucci, M D , und Caruthers, M H, in J Am Chem Soc 103 3185 (1981) und Beaucage, S L , und Caruthers, M H , in Tetrahedron Lett 12 1859 (1981) und auf die Anleitungen, die mit einem ABI Oligonucleotid-Synthesizer mitgeliefert werden, hingewiesen, die alle durch darauf hinweisen ausdrücklich hierin eingebaut werden Diese synthetischen Sequenzen können identisch zu den unten ausführlicher beschriebenen natürlichen Sequenzen sein, oder sie können verschiedene Nucleotide enthalten In einer Ausfuhrungsform, wenn die synthetischen Nucleotidsequenzen andere Nucleotide von denen, die in den natürlichen DNA-Sequenzen dieser Erfindung gefunden wurden, enthalten, wird es angesehen, daß diese verschiedenen Sequenzen noch fur ein Polypeptid codieren, das dieselbe Primarstruktur wie der aus Harn isolierte TNF-Inhibitor besitzt Bei einer alternativen Ausfuhrungsform codieren die synthetischen Sequenzen, enthaltend andere Nucleotide, ein Polypeptid, das dieselbe biologische Aktivität wie der hierin beschriebene TNF-Inhibitor besitzt· Zusätzlich kann die DNA-Sequenz ein Fragment einer natürlichen Sequenz sein, d h ein Fragment eines Polynucleotide, das in der Natur vorkam und das zum erstenmal von den gegenwartigen Erfindern isoliert und gereinigt worden ist In einer Ausfuhrungsform ist die DNA-Sequenz ein aus einer cDNA-Bank isoliertes Restriktionsfragment

Bei einer alternativen Ausführungsform wird die DNA-Sequenz aus einer menschlichen genomischen Bank isoliert. Ein Beispiel für eine solche Bank, die bei dieser Ausführungsform nützlich ist, ist von Wyman, et al., (1985) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 82, 2880-2884 dargelegt.

Bei einer bevorzugten Version dieser Ausführungsform wird in Erwägung gezogen, daß die natürliche DNA-Sequenz durch eine Methode erhalten wird, umfassend:

(a) Herstellung einer menschlichen cDNA-Bank aus Zellen, vorzugsweise U937-Zellen, die einen TNF-Inhibitor herstellen können, in einem Vektor und einer Zelle, die die gesamte oder Teile der cDNA amplifizieren und exprimieren können;

(b) Absuchen (probing) der menschlichen DNA-Bank mit mindestens einer Probe (probe), die an das TNF-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt binden kann,

.(c) Identifizieren mindestens eines Klons, der das für den Inhibitor codierende Gen enthält, aufgrund der Fähigkeit des Klons, zumindest eine Probe für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden;

(d) Isolieren des Gens oder Teilen des Gens, das für den Inhibitor codiert, von dem ausgewählten Klon oder Klonen; und

(e) Verknüpfen des Gens oder geeigneter Fragmente davon mit Funktionselementen, die nötig sind, um das Gen in einer Wirtszelle zu behalten und zu exprimieren.

Die natürlichen DNA-Sequenzen, die in dem vorgenannten Verfahren nützlich sind, können auch durch eine Methode identifiziert und isoliert werden, umfassend:

(a) Herstellung einer menschlichen genomischen Bank, vorzugsweise in einem recBC, sbc Wirt, vorzugsweise CES 200, vermehrt;

(b) Absuchen der menschlichen genomischen Bank mit mindestens einer Probe, die an ein TNF-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt binden kann;

(c) Identifizieren von mindestens einem Klon, der das für den Inhibitor codierende Gen enthält, aufgrund der Fähigkeit des Klons, zumindest eine Probe für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden;

(d) isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert, aus dem identifizierten Klon oder Klonen; und

(e) Verknüpfen des Gens oder geeigneter Fragmente davon mit Funktionselementen, um das Gen in einer Wirtszelle zu behalten und zu exprimieren.

Eine dritte potentielle Methode zur Identifizierung und Isolierung natürlicher DNA-Sequenzen, die in dem vorgenannten Verfahren nützlich sind, umfaßt die folgenden Schritte:

(a) Herstellung von mRNA aus Zellen, die den TNF-Inhibitor produzieren;

(b) Synthetisieren von cDNA (einzel- oder doppelsträngig) von dieser mRNA;

(c) Amplifizieren der in dieser Mischung von cDNA vorhandenen TNF-Inhibitor spezifischen DNA-Sequenzen unter Verwendung des Polymerase-Kettenreaktion-Verfahrens (polymerase chain reaction; PCR) mit solchen Primer, wie in Tabelle 5 gezeigt;

(d) Identifizieren der PCR-Produkte, die die in den anderen Oligonucleotidproben vorhandenen Sequenzen, wie in Tabelle 5 gezeigt, enthalten, unter Verwendung der Southern-Blot-Analyse;

(e) Subklonieren der so identifizierten DNA-Fragmente in M13-Vektoren, die das direkte Sequenzieren der DNA-Sequenzen erlauben;

(f) Verwenden dieser Sequenzen zum Isolieren eines cDNA-Klons von einer cDNA-Bank; und

(g) Verknüpfen des Gens oder geeigneter Fragmente davon mit Funktionselementen, die nötig sind, um das Gen in Wirtszellen zu behalten und zu exprimieren.

Zum Isolieren einer DNA-Sequenz, die zum Verwenden in obiger Methode geeignet ist, ist es bevorzugt, die zwei Restriktionsspaltstellen zu erkennen, die innerhalb und am nächsten zu dem Endteil des geeigneten Gens oder Abschnitt des Gens, das für das native Protein oder Fragmente davon codiert, lokalisiert sind. Das DNA-Segment, das das geeignete Gen oder Abschnitte des Gens enthält, wird dann von dem Rest des genomischen Materials entfernt unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonucleasen. Nach dem Herausschneiden werden die 3'- und 5'-Enden der DNA-Sequenz und alle Intron-Exon-Verknüpfungen rekonstruiert, um geeignete DNA-Sequenzen zur Verfügung zu stellen, die für die N- und C-Termini und den Körper des TNF-Inhibitorproteins codieren können und die an ihre Funktionselemente fusioniert werden können.

Wie unten in Beispiel 17 beschrieben, kann die zur Expression des 40 kDa TNF-Inhibitors verwendete DNA-Sequenz modifiziert werden, durch die Entfernung von entweder 153 oder 159 Basenpaaren aus dem Gen, das codiert für den reifen 40-kDa-TNF-Inhibitor, der aus mit menschlichen U 937-Zellen konditioniertem Medium isoliert und im Harn identifiziert wurde. Das A53-Gen wurde hergestellt, um das Prolin-Mustervon dem C-Terminus des vollständigen Gens zu entfernen, und das A51-Gen wurde hergestellt, um dem C-Terminus des Gens, das für den 3OkDa TNF-Inhibitor codiert, in etwa zu entsprechen.

Eine cDNA-Sequenz, die gemäß dieser Methode aus einer cDNA-Bank isoliert wurde und die zumindest einen Teil des hierin beschriebenen 3OkDa TNF-Inhibitors codiert, ist bei der American Type Cutter Collection, Rockville, M. D., unter der Accession No.40645 hinterlegt worden.

Eine DNA-Sequenz, die gemäß dieser Methoden aus einer menschlichen genomischen DNA-Bank isoliert wurde und die für mindestens einen Teil des hierin beschriebenen 3OkDa TNF-Inhibitors codiert, ist bei der American Type Cultur Collection, Rockville, M. D., unter der Accession No40620 hinterlegt worden.

Eine DNA-Sequenz, die gemäß dieser Methoden aus einer cDNA-Bank isoliert wurde und die für mindestens einen Teil des hierin beschriebenen 4OkDa TNF-Inhibitors codiert, ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, M.D.vunter der Accession No. 68204 hinterlegt worden.

6. Vektoren

(b) Mikroorganismen, speziell E. coli

Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Erwägung zu ziehenden Vektoren umfassen alle Vektoren, in die eine DNA-Sequenz, wie oben diskutiert, inseriert werden kann, zusammen mit allen bevorzugten oder benötigten Funktionselementen, und ein solcher Vektor dann anschließend in eine Wirtszelle transferiert werden kann und in einer solchen

Zelle replizieren kann. Bevorzugte Vektoren sind solche, deren Restriktionsspaltstellen gut dokumentiert worden sind, und die für die Transkription der DNA-Sequenz bevorzugte oder benötigte Funktionselemente enthalten. Jedoch werden auch bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßt, die gegenwärtig nicht entdeckte Vektoren verwenden, die eine oder mehrere der hierin beschriebenen cDNA-Sequenzen enthalten wurden. Besonders ist es bevorzugt, daß alle diese Vektoren einige oder alle der folgenden Eigenschaften besitzen: (1) besitzt eine minimale Anzahl von Sequenzen des Wirtsorganismus; (2) wird in dem gewünschten Wirt stabil beibehalten und vermehrt; (3) kann in einer hohen Kopienzahl in dem gewünschten Wirt vorkommen; (4) besitzt einen regulierbaren Promotor, der so positioniert ist, damit er die Transkription des Gens des Interesses fördert; (5) hat mindestens eine Marker DNA-Sequenz, die für eine selektierbare Eigenschaft codiert und die in einem Teil des Plasmids vorhanden ist, der von der Stelle, an der die DNA-Sequenz inseriert wird, getrennt ist; und (6) eine DNA-Sequenz, die die Transkription beenden kann.

In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen enthalten diese Klonierungsvektoren, die die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung enthalten und exprimieren können, verschiedene Funktionselemente. Diese „Funktionselemente" (operational elements), wie hierin erörtert, enthalten mindestens einen Promotor, mindestens eine Shine-Dalgarno-Sequenz, ein Startcodon und mindestens ein Terminationscodon. Vorzugsweise enthalten diese „Funktionselemente" auch mindestens einen Operator, mindestens eine Leadersequenz für aus dem intrazellulären Raum zu exportierende Proteine, mindestens ein Gen für ein Regulatorprotein und jegliche anderen DNA-Sequenzen, die für angemessene Transkription und anschließende Translation der Vektor-DNA notwendig oder bevorzugt sind.

Bestimmte dieser Funktionselemente können in jedem der bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Es wird in Erwägung gezogen, daß jegliche zusätzlichen Funktionselemente, die vielleicht benötigt werden, diesen Vektoren zugefügt werden können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden, besonders in Anbetracht der Lehren hierin.

In der Praxis ist es möglich, jeden dieser Vektoren auf solche Weise zu konstruieren, die es erlaubt, sie einfach zu isolieren, zusammenzusetzen und auszutauschen. Dies ermöglicht den Zusammenbau zahlreicher funktioneller Gene aus Kombinationen dieser Elemente und der codierenden Region der DNA-Sequenzen. Zusätzlich sind viele dieser Elemente in mehr als einem Wirt anwendbar. Es ist zusätzlich vorauszusehen, daß die Vektoren bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen D";.^£v Sequenzen enthalten werden, die als Regulatoren („Operatoren") funktionieren und andere DNA-Sequenzen, die für Regulatorproteine codieren können.

(i) Regulatoren

Diese Regulatoren werden in einer Ausführungsform dazu dienen, die Expression von DNA-Sequenzen in der Anwesenheit von bestimmten Umweltbedingungen zu verhindern und bei der Anwesenheit von anderen Umweltbedingungen, die Transkription und anschließende Expression des durch die DNA-Sequenz codierten Proteins zu erlauben. Es ist besonders bevorzugt, daß regulierende Segmente in den Vektor so inseriert werden, daß die Expression der DNA-Sequenz oder zu einem stark verringerten Umfang erfolgen wird, in der Abwesenheit von z.B. Isopropylthio-beta-D-galactosid. In dieser Situation wird der Mikroorganismus, enthaltend die DNA-Sequenz, vielleicht bis zu einer gewünschten Dichte wachsen gelassen vor der Initiation der Expression des TNF-Inhibitors. Bei dieser Ausführungsform wird die die Expression des gewünschten Proteins induzic , durch Zusatz einer Substanz zu der mikrowellen Umgebung, die die Expression der DNA-Sequenz veranlassen kann, nachdem die gewünschte Dichte erreicht worden ist.

(ii) Promotoren

Die Expressionsvektoren müssen Promotoren enthalten, die von dem Wirtsorganismus zur Expression seines eigenen Proteins verwendet werden können. Während das Lactose-Promotorsystem allgemein verwendet wird, sind andere mikrobielle Promotoren isoliert und charakterisiert worden, die dem Fachmann ermöglichen, sie zur Expression von rekombinantem TNF-Inhibitorzu verwenden.

(iii) Transkriptionsterminatoi-

Die hierin vorgesehenen Transkriptionsterminatoren dienen dazu, den Vektor zu stabilisieren. Speziell solche Sequenzen, wie bei Rosenberg, M., und Court, D., in Ann. Rev. Genet. 13:319-353 (1979) beschrieben, werden ausdrücklich hierin durch Hinweise eingebaut, und werden als in der vorliegenden Erfindung als zu verwenden angesehen.

(iv) Nicht-translatierte Sequenzen

Es wird angemerkt, daß es in der bevorzugten Ausführungsform auch erwünscht sein kann, die 3'- oder 5'-Enden der codierenden Region zu rekonstruieren, um den Einbau von 3'- oder 5'-nicht-translatierten Sequenzen in das Gentranskript zu erlauben. Zu solchen nicht-translatierten Sequenzen zählen solche, die die mRNA stabilisieren, wie sie von Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg, M., und Court, D., in J. Mol. Biol. 176: 39-53(1984) identifiziert wurden, und werden hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut.

(v) Ribosomenbindungsstellen

Die mikrobielle Expression von fremden Proteinen benötigt bestimmte Funktionselemente, welche Ribosomenbindungsstellen umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Eine Ribosomenbindungsstelle ist eine Sequenz, die ein Ribosom erkennt und daran bindet bei der Initiation der Proteinsynthese, wie dargelegt in Gold, L, et al., Ann. Rev. Microbio. 35: 557-580; oder Marquis, D.M., et al., Gene 42:175-183(1986), welche beide ausdrücklich hierin durch Hinweis eingebaut werden. Eine bevorzugte Ribosomenbindungsstelle ist GAGGCGCAAAAAIATG):

(vi) Leader-Sequenz und Translationskuppler

Weiterhin ist es bevorzugt, das DNA, die für eine geeignete Sekretions-Leader (Signal)-Sequenz codiert, am 5'-Ende der DNA-Sequenz vorhanden ist, wie dargelegt von Watson, M.E., in Nucleic Acids Res. 12: 5145:5163, was ausdrücklich hierin durch Hinweis eingebaut wird, wenn das Protein von dem Zytoplasma ausgeschieden werden soll. Die DNA für die Leader-Sequenz

muß sich in einer Position befinden, welche die Herstellung eines Fusionsproteins erlaubt, bei dem die Leader-Sequenz j

unmittelbar zu und kovalent an den Inhibitor geknüpft ist, d.h. es müssen keine Transkriptions- oder Translations- ^:

Terminationssignale zwischen den zwei codierenden DNA-Sequenzen sein. Die Anwesenheit der Leader-Sequenz ist teilweise aus einem oder mehreren der folgenden Gründe erwünscht. Erstens, die Anwesenheit der Leader-Sequenz könnte das Prozessieren des TNF-Inhibitors durch den Wirt erleichtern. Insbesondere könnte die Leader-Sequenz die Spaltung des anfänglichen Translationsprodukts durch eine Leader-Peptidase lenken, um die Leader-Sequenz zu entfernen, und ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die potentiell Proteinaktivität besitzt, zurückzulassen. Zweitens, die Anwesenheit der Leader-Sequenz könnte die Reinigung des TNF-Inhibitors erleichtern, indem sie das Protein aus dem Zellplasma leitet. Bei einigen Spezies von Wirtsmikroorganismen wird die Anwesenheit einer geeigneten Leader-Sequenz den Transport des vervollständigten Proteins in den periplasmatischen Raum erlauben, wie das bei einigen der E.coli der Fall ist. Im Falle von Ceratin (ceratin) E.coli, Saccharomyces und Stämmen von Bacillus und Pseudomonas wird die geeignete Leader-Sequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran in das extrazelluläre Medium erlauben. In dieser Situation kann das Protein aus extrazellulärem Protein gereinigt werden. Drittens, im Falle einiger der Proteine, die durch die vorliegende Erfindung hergestellt werden, könnte die Anwesenheit der Leader-Sequenz notwendig sein, um das vervollständigte Protein in einer Umgebung zu lokalisieren, wo es gefaltet werden kann, um seine aktive Struktur anzunehmen, wobei diese Struktur die geeignete Proteinaktivität besitzt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine zusätzliche DNA-Sequenz unmittelbar vorhergehend der DNA-Sequenz vorhanden, welche für den TNF-Inhibitor codiert. Die zusätzliche DNA-Sequenz kann als ein Translationskuppler funktionieren, d.h. es ist eine DNA-Sequenz, die eine RNA codiert, die dazu dient, Ribosomen unmittelbar benachbart zu der Ribosomenbindungsstelle der Inhibitor-RNA zu positionieren, mit der sie aneinandergrenzt. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung konnte der Translationskuppler erhalten werden, unter Verwendung der DNA-Sequenz TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG und Methoden, die gegenwärtig dem Fachmann, der sich mit Translationskupplern beschäftigt, bekannt sind.

(vii) Translationsterminator

Die hierin in Erwägung zu ziehenden Translationsterminatoren dienen dazu, die Translation von mRNA zu stoppen. Sie können entweder natürlich sein, wie beschrieben bei Kohli, J., Mol. Gen Genet. 182:430-439; oder synthetisiert werden, wie beschrieben bei Pettersson, R. F., Gene 24: 15-27 (1983). Beide der Referenzen werden hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut.

(viii) Selektierbare Marker

Außerdem ist bevorzugt, daß der Klonierungsvektor einen selektierbaren Marker enthält, sowie einen Medikament-Resistenzmarker oder andere Marker, der die Expression einer selektierbaren Eigenschaft durch den Wirtsmikroorganismus verursacht. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Gen für Ampicillinresistenz in dem Vektor enthalten, während in anderen Plasmiden das Gen für Tetracyclinresistenz oder das Gen für Chloramphenicolresistenz enthalten ist. Solch eine Medikamentenresistenz oder andere selektierbare Marker sind teilweise geplant, um die Selektion von Transformanden zu erleichtern. Außerdem könnte die Anwesenheit eines solchen selektierbaren Markers'in dem Klonierungsvektor von Nutzen sein, um kontaminierende Mikroorganismen von der Vermehrung in dem Kulturmedium abzuhalten. Bei dieser Ausführungsform würde eine reine Kultur des transformierten Wirtsmikroorganismus erhalten werden, indem der Mikroorganismus unter Bedingungen kultiviert wird, die den induzierten Phänotyp zum Überleben verlangen. Die Funktionselemente, wie hierin erörtert, werden routinemäßig vom Fachmann ausgewählt in Anbetracht früherer Literatur und den hierin enthaltenen Lehren. Allgemeine Beispiele dieser Funktionselemente sind dargelegt, in B.Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983), was ausdrücklich hierin durch Hinweis eingebaut wird. Verschiedene Beispiele geeigneter Funktionselemente können in den oben erörterten Vektoren gefunden werden und könnten erklärt werden durch erneutes Überprüfen der Veröffentlichungen, die die grundlegenden Eigenschaften der zuvor erwähnten Vektoren erörtern. Durch Synthese und Isolierung aller benötigten und gewünschten Bestandteile des oben erwähnten Vektors, wird der Vektor durch Methoden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, zusammengesetzt. Es wird geglaubt, daß das Zusammensetzen solcher Vektoren zu den Pflichten und Aufgaben gehört, die von einem Fachmann ausgeführt werden, und somit kann dies ausgeführt werden ohne übermäßiges Experimentieren. Zum Beispiel sind ähnliche DNA-Sequenzen in geeignete Klonierungsvektoren legiert worden, wie dargelegt bei Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984), was hiermit ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird.

Bei der Konstruktion der Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung sollte außerdem erwähnt werden, daß mehrere Kopien der DNA-Sequenz und ihrer zugehörigen Funktionselemente in jeden Vektor inseriert werden können. Bei einer solchen Ausführungsform würde der Wirtsorganismus größere Mengen des gewünschten TNF-Inhibitors pro Vektor produzieren. Die Anzahl an mehreren Kopien der DNA, die in den Vektor inseriert werden kann, ist nur begrenzt durch die Fähigkeit des resultierenden Vektors, aufgrund seiner Größe, in eine geeignete Wirtszelle transferiert und dort repliziert und transkribiert zu werden.

(b) Andere Mikroorganismen

Vektoren, die für die Verwendung in anderen Mikroorganismen als E.coli geeignet sind, werden für diese Erfindung auch in Erwägung gezogen. Solche Vektoren sind in der Tabelle 1 beschrieben. Zusätzlich sind bestimmte bevorzugte Vektoren unten erörtert.

Tabelle 1

Wirt

regulierte Promotoren

Induktor

Transkriptions-Terminator

E.coli

Bacillus

Pseudomonas

Hefe

E.coli

Bacillus

Lac¹,Tac² lambda pL Trp^s

*alpha-

Amylase¹⁷

•Subtilisin¹⁸

•p-43¹⁹

spac-l²⁶

Trp²⁷ (E.coli)

Lac (E.coli)

Tac (E. coli)

GaM³¹

10³²

Adh!³³

„34

Pho 5

mRNA Stabilisierung ompA⁸ lambda int⁹ trp¹⁰

gesteigerte Temperatur IAA-Zusatz oderTryptophan-Erschöpfung

rrnB⁶ rrnC⁷

	E. CoIi rrn
	rrnBT.T20
IPTG
IAA Zusatz
oderTryptophan-
Erschöpfung
IPTG
Glucose-	Cyc1
Erschöpfung	Una
und
Galactose-	Alpha-Faktor
Glucose-	Sac 2
Erschöpfung
Phosphat-
Erschöpfung
Transkriptions	RS
startstelle &	Marker Bindungsstelle
Leader-Peptid
bla11	Ampicillin14
ompA12	Tetracyclin14·15
phoS	Chloramphenicol10
B. amy neutral	Kanr24 B. amy neural-
Protease21	Cam'25 Protease 8,-my
B. amy alpha- '	alpha-Amylase22
Amylase22
B.subt.
Subtilisin23
Phospholiphase C 28	Sulfonamid30Trp
	(E.coli)
Exotoxin A28	Streptomycin30
Invertase36	Ura337
saure Phosphatase36	Leu238
Alpha-Faktor	His 3
	Tap1

Pseudomonas

Hefe

* nicht-reguliert

Literatur

1. Backman, K., Ptashne, M., and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sei. USA73,4174-4178 (1976).

2. de Boer, H.A.. Comstock, L. J., and Vasser, M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80,21-25 (1983).

3. Shimatake, H., and Rosenberg, M., Nature 292,128-132 (1981).

4. Derom, C, Gheysen, D., and Fiers, W., Gene 17,45-54 (1982).

5. Hallewell, R.Α., and Emtage, S., Gene 9,27-47 (1980).

6. Brosius.J., Dull.T.J., Sleeter, D.D.,and Noller, H.F., J. MoI. Biol. 148 107-127(1981).

7. Normanly, J., Ogden, R.C, Horvath, S. J., and Abelson, J. Nature 321,213-219 (1986).

8. Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, Α., and Cohen, S. N., Cell 46, 245-251 (1986).

9. Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg M., and Court, D. J., Mol. Biol. 176,39-53 (1984).

10. Mott, J.E., Galloway, J.L-, and Platt, T., EMBO J. 4, 1887-1891 (1985).

11. Koshland, D., and Botstein, D., Cell 20,749-760 (1980).

12. Movva, N.R., Kakamura, K., and Inouye, M. J., Mol. Biol. 143,317-328 (1980).

13. Surin, B.P., Jans, D.A.. Fimmel, A.L., Shaw. D.C., Cox, G.B.. and Rosenberg, H. J., Bacteriol. 157,772-778 (1984).

14. Sutcliffe, J.G., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75. 3737-3741 (1978).

15. Peden, K. W. C, Gene 22,277-280 (1983).

16. Alton, N.K., and Vapnek, D., Nature 282,864-869 (1979).

17. Yang, M.. Galizzi, A.. and Henner, D„ Nuc. Acids Res. 11 (2), 237-248 (1983).

18. Wong, S.-L., Price C. W., Goldfarb, D. S., and Doi, R. H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81,1184-1188 (1964).

19. Wang, P.-Z.,and Doi.R.H., J.Biol.Chem.251,8619-e625,(1984).

20. Lin, C-K., Ouinn, L. A., Rodriguez, R. L, J. Cell Biochem. Suppl. (9 B), p. 198 (1985).

21. Vasantha, N., Thompson, L. 0., Rhodes, C, Banner, C, Nagle, J., and Filpula, D., J. Bad. 159 (3), 811-819 (1984).

22. Plava, I., Sarvas. M.. Lehtovaara, P., Sibazkov, M., and Kaariainen, L, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79. 5582-5586 (1982).

23. Wong, S.-L., Pricee, CW., Goldfarb, D.S., and Doi, R.H., Proc. Natl. Acad. Sei. USA81,1184-1188 (1984).

24. Sullivan, M.Α., Yasbin, R.E., Young, F.E., Gene 29, 21-46 (1984).

25. Vasantha. N., Thompson, L. D., Rhodes, C, Banner, C, Nagle, J., and FiIuIa, D. J., Bact. 159(3), 811-819 (1984).

26. Yansura, D. G., and Henner, D. J., PNAS 81,439-443 (1984).

27. Gray, G. L, McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H.,and Heyneker, H.L., Biotechnology, 161-165(1984).

28. Lory, S., and Tai. P.C., Gene 22, 95-101 (1983).

29. Liu, P.V., J. Infect. Dis. 130 (suppl), 594-599 (1974).

30. Wood, D.G., Hollinger, M. F., and Tindol, M.B., J. Bact. 145,1448-1451 (1981).

31. St. John, T. P., and Davis, R. W.. J. Mol. Biol. 152,285-315 (1981).

32. Hopper, J. E., and Rowe, L.B., J. Biol. Chem. 253,7566-7569 (1978).

33. Denis, C. L., Ferguson, J., and Young, E.T., J. Biol. Chem. 258,1165-1171 (1983).

34. Lutsdorf, L., and Megnet, R., Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944 (1968).

35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, H., and Hinnen, Α., EMBO. J. 6,675-680 (1982).

36. Watson, M. E., Nucleic Acid Research 12,5145-5164(1984).

37. Gerband, C, and Guerineau, M., Curr. Genet. 1, 219-228 (1980).

38. Hinnen, Α., Hicks, J. B., and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75,1929-1933 (1978).

39. Jabbar, M. A., Sivasubramanian, N., and Nayak, D. P., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 2019-2023 (1985).

(i) Pseudomonas-Vektoren

Mehrere Vektorplasmide, die in einem weiten Bereich gramnegativer Bakterien autonom replizieren, sind bevorzugt zum Verwenden als Klonierungsvehikel in Wirten der Gattung Pseudomonas. Bestimmte von diesen sind beschrieben bei Tait, R. C, Close, T. J., Lundquist, R. C, Hagiya, M., Rodriguez, R. L, und Kado, C.I., in Biotechnology, Mai 1983, S. 269-275; Panopoulos, N.J., in Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, S. 163-185 (1981); und Sakagucki, K., in Current Topics in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982), von denen jede hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird.

Eine besonders bevorzugte Konstruktion würde das Plasmid RSF1010 und Derivate davon verwenden, wie beschrieben bei Bagdasarian, M., Bagdasarina, M. M., Coleman, S., und Timmis, K. N. in Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K. N., und Puhler, Α., eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird. Die Vorteile von RSF1010 sind, daß es ein relativ kleines, High-Copy-Number-Plasmid ist, das leicht in E.coli und Pseudomonas Spezies transformiert wird und stabil beibehalten wird. Bei diesem System wäre es bevorzugt, das Tac-Expressionssystem zu verwenden, wie für Escherichia beschrieben, da es erscheint, daß der E. coli trp Promotor leicht durch Pseudomonas RNA Polymerase erkannt wird, wie dargelegt von Sakagucki, K., in Current Topics in Microbiology and Immunology 96: 31—45(1982) und Gray, G. L., McKeown, K. Α., Jones A. J. S., Seeburg, P. H., und Heyneker, H. L., in Biotechnology, Febr. 1984, S. 161-165, welche beide hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut werden. Transkriptionsaktivität kann weiter maximiert werden, was den Austausch des Promotors verlangt, durch z. B. einen E.coli der P.aeruginosa trp Promotor. Außerdem würde das Lacl-Gen von E.coli in das Plasmid eingefügt werden, um die Regulation zu beeinflussen.

Die Translation kann an die Translationsinitiation eines jeden Pseudomonas Proteins gekoppelt sein, wie auch an Initiationsstellen für jedes der stark exprimierten Proteine der Art, die ausgewählt wurden, um die intrazelluläre Expression des Inhibitors zu bewirken.

In solchen Fällen, wo keine restriktionsnegativen Stämme von einer Wirts-Pseudomonas-Spezies zur Verfugung stehen, sind die Transformationseffizienz mit Plasmidkonstrukten, isoliert aus E.coli, schlecht. Deshalb ist die Passage des Pseudomonas Klonierungsvektors durch einen r~ m⁺ Stamm einer anderen Spezies vor der Transformation des gewünschten Wirts, wünschenswert, wie dargelegt in Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical, Environmental and Commerical Importance, S.411-422, Timmis und Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird.

(ii) Bacillusvektoren

Weiterhin umfaßt ein bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus die Verwendung des Plasmids pUB 110 als das Klonierungsvehikel. Wie bei anderen Wirts-Vektorsystemen ist es in Bacillus möglich, den TNF-Inhibitor der vorliegenden Erfindung entweder als intrazelluläres oder als sekretiertes Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsformen umfassen beide Systeme. Shuttle-Vektoren, die in beiden. Bacillus und E.coli, replizieren, stehen zur Konstruktion und dem Testen verschiedener Gene zur Verfugung, wie beschrieben bei Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., und Shivakumar, A. G., in Geneticc Engineering, Vol. 2, Setlow und Hollaner eds., Plenum Press, New York, New York, S. 115-131 (1980), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird. Für die Expression und Sekretion des TNF-Inhibitors von B.subtilis ist die Signalsequenz von Alpha-Amylase vorzugsweise gekoppelt an die codierende Region für das Protein. Zur Synthese intrazellulären Inhibitors wird die bewegliche DNA-Sequenz translational gekoppelt an die Ribosomenbindungsstelle der Alpha-Amylase-Leader-Sequenz. Die Transkription jedes dieser zwei Konstrukte wird vorzugsweise durch den Alpha-Amylase-Promotor oder ein Derivat davon gesteuert. Dieses Derivat enthält die RNA-Polymerase-Erkennungssequenz des nativen Alpha-Amylase-Promotors aber hat die Lac-Operatorregion ebenfalls eingebaut. Ähnliche Hybrid-Promotoren, die aus dem Penicillinase-Gen-Promotor und dem Lac-Operator konstruiert wurden, haben gezeigt, daß sie in Bacillus-Wirten in einer regulierbaren Weise arbeiten, wie dargelegt von Yansura, D.g. und Henner in Genetics and Biotechnology of Bacilii, Ganesan, A. T., und Hokch, J. A., eds., Academic Press, S. 249-263 (1984), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird. Das Lacl-Gen von E.coli wäre ebenfalls in dem Plasmid enthalten, um die Regulation zu beeinflussen.

(iii) Clostridium-Vektoren

Eine bevorzugte Konstruktion zur Expression in Clostridium ist im Plasmid pJU 12, beschrieben bei Squires, C. H., et al., in J. Bacteriol. 159: 465-471 (1984) und wird hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut, was in C. perfringens transformiert wird nach der Methode von Heefner, D. L., et al, wie beschrieben in J. Bacteriol. 159:460-464 (1984), was hierin ausdrücklich durch

Hinweis eingebaut wird. Die Transkription wird durch den Promotor des Tetracyclinresistenzgens gesteuert. Die Translation ist an Shine-Dalgarno-Sequenzen dieses tet-Gens gekoppelt in einer Art, strikt analog zu den oben ausgeführten Verfahren für Vektoren, die zur Verwendung in anderen Wirten geeignet sind.

(iv) Hefe-Vektoren

Beibehalten von fremder DNA, die in Hefe eingeführt wurde, kann auf mehreren Wegen bewirkt werden, wie beschrieben bei Botstein, D., und Davis, R. W., in the Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jonesand Broach, eds., S. 607-636 (1982), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird. Ein bevorzugtes Expressionssystem zur Verwendung mit Wirtsorganismen der Gattung Saccharomyces enthält das TNF-Inhibitorgen auf dem 2-Mikron-Plasmid. Die Vorteile des 2-Mikron-Plasmids umfassen eine relativ hohe Kopienzahl und Stabilität, wenn es in cir'-Stämme eingeführt wird. Diese Vektoren haben vorzugsweise den Replikationsursprung und mindestens einen Antibiotika-Resistenzmakervon pBR322 eingebaut, um die Replikation und Selektion in E.colizu erlauben. Zusätzlich wird das Plasmid vorzugsweise die 2-Mikro-Sequenz und das Hefe LU 2 Gen haben, um den denselben Zweck in LEU 2-Mangelmutanten von Hefe zu dienen.

Wenn es in Erwägung gezogen wird, daß der rekombinanate TNF-Inhibitor letztendlich in Hefe exprimiert werden wird, ist es bevorzugt, daß der Klonierungsvektor zunächst in Escherichia coli transferiert wird, wo es dem Vektor erlaubt wäre zu replizieren, und von wo der Vektor nach Amplifikation erhalten und gereinigt werden würde. Der Vektor würde dann in die Hefe transferiert werden zur endgültigen Expression des TNF-Inhibitors.

(c) Säugerzellen

Die cDNA für den TNF-Inhibitor wird als Gen zur Expression des Inhibitors in Säugerzellen dienen. Sie sollte eine Sequenz haben, die effizient Ribosomen bindet, wie diejenigen von Kozak beschrieben in Nucleic Acids Research 15: 8125-8132 (1987), was ausdrücklich hierin durch Hinweis eingebaut wird, und sollte eine Codierungskapazität für eine Leader-Sequenz haben (siehe Abschnitt 3 [a] [vi]), um das reife Protein aus der Zelle in einer prozessierten Form zu leiten. Das DNA-Restriktionsfragment, das die komplette cDNA-Sequenz trägt, kann in einen Expressionsvektor inseriert werden, der einen Transkriptions-Promotor und einen Transkriptions-Enhancer besitzt, wie beschrieben durch Guarente, L., in Cell 52: 303-305 (1988) und Kadonaga, J.T., et al., in Cell 51:1079—1090 (1987) f, welche beide ausdrücklich durch Hinweis hierin eingebaut werden. Der Promotor kann regulierbar sein wie in dem Plasmid pMSG (Pharmacia Kat. No. 27450601), wenn die konstitutive Expression des Inhibitors für das Zeil wachstum schädlich ist. Der Vektor sollte ein vollständiges Polyadenylierungssignal enthalten, wie beschrieben bei Ausubel,

F. M., et al. in Current Protocols in Molecular Biology Wiley (1987), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird, so daß die von diesem Vektor transkribierte mRNA richtig prozessiert wird.

Schließlich wird der Vektor den Replikationsursprung und mindestens einen Antibiotika-Resistenzmarker von pBR322 enthalten, um die Replikation und Selektion in E.colizu erlauben.

Um eine stabile Zellinie zu selektieren, die den TNF-Inhibitor produziert, kann der Expressionsvektor das Gen für einen selektierbaren Marker, wie einen Medikamenten-Resistenzmarker, tragen oder ein komplementäres Gen für eine Mangel-Zellinie tragen, wie das Dihydrofolatreduktasegen (dhfr), um dhfr"-Zellinien zu transformieren, wie von Ausubel et al., supra beschrieben. Alternativ kann ein getrenntes Plasmid, das einen selektierbaren Marker trägt, mit dem Expressionsvektor cotransformiert werden.

7. Wirtszellen/Transformation

Der so erhaltene Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle transferiert. Diese Wirtszellen können Mikroorganismen oder Säugerzellen sein.

(c) Mikroorganismen

Es wird geglaubt, daß jeder Mikroorganismus gewählt werden kann, der die Fähigkeit besitzt, exogene DNA aufzunehmen, und diese Gene und dazugehörige Funktionselemente zu exprimieren. Nachdem ein Wirtsorganismus gewählt worden ist, wird der Vektor in den Wirtsorganismus transferiert unter Verwendung von Methoden, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Beispiele solcher Methoden können gefunden werden in Advanced Bacterial Genetics by R.W. Davis et al.. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980), was ausdrücklich hierin durch Hinweis eingebaut wird. Es ist bei einer Ausführungsform bevorzugt, daß die Transformation bei niedriger Temperatur erfolgt, da Temperaturregulation in Erwägung gezogen wird als Mittel, die Genexpression zu regulieren durch die Verwendung von Funktionselementen, wie oben dargelegt. Bei einer anderen Ausführungsform, wenn osmolare Regulatoren in den Vektor inseriert worden sind, wäre die Regulation der Salzkonzentration während derTransformation erforderlich, um angemessene Kontrollen der fremden Gene zu gewährleisten. Es ist bevorzugt, daß die Wirtsmikroorganismen fakultativ anaerob oder aerob sind. Besonders bevorzugte Wirte zur Verwendung in dieser Methode umfassen Hefen und Bakterien. Spezielle Hefen umfassen solche der Gattung Saccharomyces und ganz besonders Saccharomyces cerevisiae. Spezielle Bakterien umfassen solche der Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas, ganz besonders Bacillus subtilis und Escherichia coli. Weitere Wirtszellen sind in Tabelle 1, supra aufgelistet.

(d) Säugerzellen

Der Vektor kann in Säugerzellen in Kultur eingebracht werden durch verschiedene Techniken, wie Kalziumphosphat: DNA-Copräzipitation, Elektroporation oder Protoplastfusion. Die bevorzugte Methode ist Copräzipitation mit Kalziumphosphat, wie beschrieben bei Ausubel et al., supra.

Viele stabile Zelltypen existieren, die transformierbar sind und die cDNA transkribieren und translatieren können, den TNF-Inhibitorvorläufer prozessieren und das reife Protein ausscheiden können. Jedoch können die Zelltypen vetschieden sein mit Hinsicht auf die Glycosylierung ausgeschiedener Proteine und post-translationale Modifikationen von Aminosäurenresten, wenn überhaupt. Somit sind die idealen Zelltypen solche, die einen rekombinanten TNF-Inhibitor, identisch zu dem natürlichen Molekül, produzieren.

-13- 296 9651

8. Kultivieren gentechnologisch veränderter (engineered) Zellen

Die Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die geeignet sind für die Expression des TNF-Inhibitors. Diese Bedingungen sind üblicherweise spezifisch für die Wirtszelle und können von einem Fachmann leicht ermittelt werden in Anbetracht der I veröffentlichten Literatur betreffend Wachstumsbedingungen für solche Zellen und die hierin enthaltenen Lehren. Zum Beispiel' enthält Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed.,, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, das hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird, Informationen über Bedingungen zum Kultivieren von Bakterien. Ähnliche Informationen zum Kultivieren von Hefe und Säugerzellen können erhalten werden aus Pollack, R., Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harborg Laboratories (1975), was hierin ausdrücklich durch Hinweis eingebaut wird.

Jegliche Bedingungen, die zur Regulation der Expression der DNA-Sequenz notig sind, abhangig von allen in den Vektor inserierten oder vorhandenen Funktionselementen, werden in der Transformations- und Kultivierungsphase wirksam. Bei einer Ausführungsform werden Zellen in Anwesenheit von geeigneten regulierenden Bedingungen bis zu einer hohen Dichte wachsen gelassen, welche die Expression der DNA-Sequenz inhibieren. Wenn eine optimale Zelldichte erreicht ist, werden die Umgebungsbedingungen zu solchen verändert, die zur Expression der DNA-Frequenz geeignet sind. Es ist somit vorauszusehen, daß die Produktion des TNF-Inhibitors in einer Zeitspanne erfolgen wird, anschließend an das Wachstum der Wirtszellen bis zur annähernd optimalen Dichte, und daß der resultierende TNF-Inhibitor einige Zeit, nachdem die regulierenden Bedingungen, die für seine Expression notig sind, induziert wurden, geerntet wird.

9. Reinigung

(a) TNF-Inhibitor, hergestellt von Mikroorganismen

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekombinante TNF-Inhibitor gereinigt im Anschluß^ an seine Ernte und vor der Annahme seiner aktiven Struktur. Diese Ausführungsform ist bevorzugt, da die Erfinder glauben, daß \ die Wiedergewinnung einer hohen Ausbeute an zurückgefaltetem (re-folded) Protein erleichtert ist, wenn das Protein zuerst i gereinigt ist. Jedoch wird bei einer bevorzugten, alternativen Ausführungsform dem TNF-Inhibitor erlaubt, vor der Reinigung rückzufalten, um seine aktive Struktur einzunehmen. In einer weiteren bevorzugten, alternativen Ausfüh'rungsform ist der TNF-Inhibitor in seinem rückgefalteten, aktiven Zustand bei seiner Wiedergewinnung aus dem Kulturmedium vorhanden. Bei bestimmten Umständen wird der TNF-Inhibitor seine richtige, aktive Struktur bei der Expression in dem Wirtsmikroorganismus und dem Transport des Proteins durch die Zellwand oder Membran in den periplasmatischen Raum annehmen. Dies wird üblicherweise erfolgen, wenn DNA, die für eine geeignete Leader-Sequenz codiert, an die DNA, die für das rekombinante Protein codiert, geknüpft worden ist. Wenn der TNF-Inhibitor seine richtige, aktive Struktur nicht annimmt, werden" zuerst alle die Sulfidbindungen, die gebildet wurden, und/oder jede nicht kovalente Interaktionen, die erfolgt sind, zuerst durch denaturierende und reduzierende Reagenzien zerstört, z.B. Guanidin-Chlorid und Beta-Mercaptoethanol, bevor dem TNF-Inhibitor erlaubt wird, seine aktive Struktur anzunehmen, im Anschluß an das Verdünnen und Oxidieren dieser Reagenzien unter kontrollierten Bedingungen.

Für Reinigungen vor und nach dem Rückfalten werden einige Kombinationen der folgenden Schritte vorzugsweise verwendet; Anionaustausch-Chromatographie (monoQ oder DEAE-Sepharose), Gelfiltrations-Chromatographie (superose), Chromatofocussierung (MonoP) und hydrophobe Wechselwirkung-Chromatographie (Octyl- oder Phenylsepharose). Von besonderem Wert wird Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von TNF sein (beschrieben in Beispiel 1).

(b) TNF-Inhibitor, hergestellt von Säugerzellen

TNF-Inhibitor, hergestellt von Säugerzellen, wird aus konditioniertem Medium gereinigt durch Schritte, die lonenaustausch-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von TNF, wie in Beispiel 1 beschrieben, einschließen. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen und Variationen bei den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können. Somit ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung Modifikationen und Variationen dieser Erfindung abdeckt, vorausgesetzt sie fallen unter den Bereichen der angefügten Ansprüche und ihren Äquivalenten.

Wie zuvor angegeben, werden die TNF-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als therapeutische Reagenzien in Erwägung gezogen und müssen somit in pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen formuliert werden. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die TNF-Inhibitoren chemisch modifiziert werden, um die pharmakokinetischen Eigenschaften der Moleküle zu verbessern. Ein Beispiel wäre die Anheftung derTNF-lnhibitoren an hochmolekulares Polymermaterial, wie Polyethylenglycol. Zusätzlich können lnterleukin-1-Inhibitoren in Verbindung mit den TNF-Inhibitoren verabreicht werden. Diese therapeutische Kombination wird besonders nützlich sein bei der Behandlung von Entzündungs- und degenerativen Krankheiten.

Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene, gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der hierin beanspruchten Erfindung. Alle Unterlagen und Referenzen, die in den folgenden Beispielen zitiert werden, werden ausdrücklich hierin durch Hinweis eingebaut.

Beispiel 1

Protein-Herstellung A. Materialien

Das Gen fürTNF alpha (TNFa) wurde von British Biotechnology, Limited, Oxford, England, bezogen. DEAE-Sepharose CL-6B Harz und Mono-Q HR5/5, HR10/10 FPLC Säulen wurden von Pharmacia, Inc. Piscataway, New Jersey, bezogen. Affigel-15 Harz und BioRad Protein-Assay-Kit wurden von Biorad, Richmond, California, bezogen. Tween 20, Ammoniumbicarbonat, Natriumphosphat, PMSF, Natriumbicarbonat, Dithiothreitol, Crystal Violet und Actinomycin D wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, bezogen. Endoproteinase Lys-C, Endoproteinase Asp-N und TRIS wurden vonJ3oehringer Mannheim, Biochemicals, Indianapolis, Indiana, bezogen. Hexafluoraceton wurde von ICN Biomedicals, Costa Mesa, California, bezogen. Cyanbromid, Trifluoressigsäure und Guanidinhydrochlorid wurden von Pierce Chemicals, Rockford, Illinois, bezogen. Acetonitril und HPLC-Wasser wurden von J.T.Baker Chemical Company, Phillipsburg, New Jersey, bezogen. Harnstoff wurde von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, bezogen. (³H)-Jodessigsäure wurde von New England Nuclear, Boston, Massachusetts, bezogen. (¹²⁵J)-TNFa wurde von Amersham Arlington, Heights, Illinois, bezogen.

Rekombinanter menschlicher TNFa wurde von Amgen, Thousand Oaks, California, bezogen. Ce-Reversed-Phase-Säulen (7 Mikron, 22cm χ 2,1 mm) wurden von Applied Biosystems, Foster City, California,bezogen. Corning 96-Loch-Mikrotiterplatten wurden von VWR Scientific, Batavia, Illinois, bezogen. McCoys 5 Α-Medien und fötales Rinderserum wurden von Gibco, Grand Island, New York, bezogen. RPM-11 640 Medien und L-Glutamin wurden von Mediatech, Herndon, Virginia, bezogen. Trypsin wurde von K. C. Biologicals, St. Lenexa, Kansas, bezogen. ME180, U 937 und L929 Zellinien wurden von American Type Culture Cellection, Rockville, Maryland, bezogen.

B. Assays für den TNF-Inhibitor

Zwei Arten von Assays wurden zur Identifizierung des TNF-Inhibitors verwendet Einer davon ist ein Cytotoxizitäts-Assay. Der andere ist ein Gel-Shift-Assay.

1. Cytotoxizitäts-Assay

Der Cytotoxizitäts-Assay wurde durchgeführt mit Actinomycin D behandelten ME 180-Zellen und L929-Zellen, wie beschrieben von Ostrove and Gifford (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 160, 354-358 [1979]) und Aggarwal and Essalu (J. Biol. Chem. 262,10000 bis 10007 [1987]). L929-Zellen (CCLI: American Type Culture collection) wurden in McCoy's 5A Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum, gehalten. Konfluente Kulturen wurden kurz mit 0,25% Trypsin in physiologischer Lösung, enthaltend 5mM EDTA behandelt und in einem frischen Medium resuspendiert. Ungefähr 2 x 10⁴trypsinisierte Zellen pro Loch wurden in96-Loch-Platten (Corning) plattiert und für 24 Stunden bei 27°C inkubiert. Dann wurde Actinomycin D zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 0,25 μg pro ml. Nach 2 Stunden wurden Proben, enthaltend TNF und TNF-Inhibitor, zu den Löchern zugesetzt, und die Inkubation wurde über Nacht bei derselben Temperatur fortgesetzt. Nach mikroskopischer Auswertung wurde das Medium dekantiert, und die Löcher wurden mit PBS gewaschen. Die Löcher wurden dann mit einer Lösung von 0,1 % Kristall violett, 10% Formaldehyd und 1OmM Kalium phosphat, pH 6,0 für 5 min gefüllt, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Farbe wurde mit0,1 M Natriumeitrat in 50% Ethanol pH4,2 extrahiert. Die Absorption der Farbe in lebenden Zellen wurde bei 570 nm bestimmt unter Verwendung eines kinetischen Mikroplattenlesers (Kinetic micr'oplate reader. Molecular Devices Corp. CA). Ein Beispiel dieses Assays ist in Fig. 1 gezeigt. In der Anwesenheit von TNF-Inhibitor war der cytotoxische Effekt von TNF verringert.

2. Gel-Shift-Assay

Der Gel-Shift-Assay umfaßt die Verwendung eines nativen Polyacrylamidgelelektrophoresesystems. Diese native 4% Gelelektrophorese wurde ausgeführt nach Hendrick and Smith (Arch. Biochem. and Biophysics 126,155-16411968]). Der joderte TNF (Amersham) wurde mit dem TNF-Inhibitor aus Beispiel 1.C. nach Ce-Chromatographie gemischt und für30 Minuten bis 2 Stunden inkubiert. Diese Mischung wurde gemeinsam mit dem jodierten TNF alleine auf ein 4% natives Gel geladen und elektrophoretisiert. Nachdem das Gel mit 10% Essigsäure fixiert und gewaschen war, wurde ein Film zur Autoradiographie angebracht. Wie in Fig.2 gezeigt, wandert der Komplex aus TNF und TNF-Inhibitor unterschiedlich zu dem TNF alleine. Dieser Gel-Shift-Assay wurde verwendet, um zu bestimmen, welche Fraktionen des Eluats von der DEAE CL6 B Säulenchromatographie TNF-Inhibitor enthalten.

C. Reinigung des 3OkDa TNF-Inhibitors

Zwanzig Liter Harn eines Patienten, bei dem Nierenfehlfunktion diagnostiziert worden war, wurden mit einer Amicon YM 5-Membran auf 200 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde bei 4°C gegen 0,025 M Tris-Cl, pH7,5, dialysiert und anschließend zentrifugiert in einem JA 14 Rotor bei lOOOOUpm für 30 Minuten. Der Überstand wurde auf eine 40 χ 4,5cm DAEA-Sepharos'i CL-6B Säule geladen, die mit 0,025M Tris-Cl, pH7,5 äquilibriert war, und ausgiebig mitÄquilibrierpuffer gewaschen, bis die OD₂SO des Durchlaufs auf die Basislinie zurückging. Die Chromatographie wurde durchgeführt unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 0,05M Natriumchlorid in 0.025M Tris-Cl, pH7,5 und bei OD₂₈O registriert. Säulenfraktionen wurden gesammelt und auf TNF-Inhibitoraktivität getestet unter Verwendung des nativen Gel-Assays. Der eluierte TNF-Inhibitor eluiert in einen ziemlich scharfen Peak bei 8OmM NaCI.

Fig. 6 Azeigt das OD₂₈O-PiOfH der DEARESepharose CL-6 B Chromatographie von 201 Harn. Fig. 6 B zeigt die Autoradiographie und den dazugehörigen nativen Gel-Assay, der einen Peak des TNF-Inhibitors bei Fraktionen 57-63 anzeigt, was ungefähr bei 8OmM NaCI ist.

Der TNF-Inhibitor wurde weiter gereinigt unter Verwendung einer TNF-Affinitätssäule. Rekombinanter TNF wurde in PL27/DE 3 exprimiert bei ungefähr 10-20% des gesamten Zellproteins. Das Zellpellet wurde mit einer French-Press gepreßt bei ungefähr 20000pst und das lösliche Material bei 4°C gegen 0,025M Tris-Cl, pH8,0, dialysiert. Das dialysierte Lysat wurde 0,2 mikrongefiltert und auf eine Mono-Q FPLC Säule, equilibriert mit 0,025 M Tris-Cl, pH 8,0, geladen. Ein linearer Gradient von 0 bis 0,5 M NaCI in 0,025M Tris-Cl, pH 8,0 wurde angelegt und registriert bei OD₂8o- Ein ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf Reinheit mit SDS-PAGE analysiert. Der anschließende TNFa-Pool war zu ungefähr 90% rein, basierend auf Coomassie-gefärbtem SDS-PAGE und war voll aktiv, basierend auf einem Bradford-Protein-Assay, unter Verwendung von Lysozym als einem Standard, und einem ME180 Bio-Assay, unter Verwendung von Amgens TNFa als Standard (Bradford, M„ Annal. Biochem. 72,248-254, [1976]). TNFa wurde in einem Amicon Centriprep-10 auf ungefähr 25 mg/ml konzentriert, dialysiert gegen 10OmM NaHCO₃, pH 8,5 und an Affigel-15 Harz gekuppelt bei 25mg TNF/ml Harz. Eine Kupplungseffizienz von größer als 80% erzeugte ein Harz hoher Kapazität, das zur weiteren Reinigung des TNF-Inhibitors verwendet wurde.

PMSF, mit einer Endkonzentration von 1-4 mM, wurde dem DEAE CL-6 B-Pool zugesetzt und auf eine 4x 1 cm TNF-Affinitätssäule gegeben, die bei 4°C mit 0,025M Tris-Cl, pH7,5, bei einer Flußrate von 0,1 ml/min äquilibriert war. Die Säule wurde dann mit 0,025M Tris-Cl, pH7,5 gewaschen, bis die OD₂₈₀ des Durchlaufs auf die Basislinie zurückging. Die Säule wurde anschließend eluiert mit 0,05 M Natriumphosphat, pH 2,5, und bei OD₂₈₀ registriert. Fig. 7 zeigt das OD₂₈₀-Profil der 0,05 M .Natriumphosphat, pH2,5-Elution von der TNF-Affinitätssäule.

Der TNF-Inhibitor wurde bis zur Homogenität durch Reverse-Phase-HPLC auf einer Syncropak RP-8 (C8)-Säule gereinigt. Der OD₂₈₀-Peak von der TNF-Affinitätssäule wurde gepoolt und sofort auf eine RP-8-Säule geladen, die mit 0,1 %TFA/H₂O äquilibriert war, ein linearer 1 %/min Gradient von 0,1 % TFA/Acetonitril wurde angelegt von 0-50% und bei OD₂₁₅ und OD₂₈₀ registriert.

-is- 296

Fraktionen wurden gesammelt und auf Bioaktivität getestet unter Verwendung von L929-Zellen und dem nativen Gel-Assay, \ in Beispiel 1 .B. beschrieben. Beide Assays zeigen Bioaktivität bei Fraktionen 28-32 an, was einem Peak von OD₂is und OD₂eo · entspricht, der bei 18% Acetonitril eluiert

Fig. 8 A und 8 B zeigen das Chromatographieprofil des TNF-Affinitätspools auf einer Synchropak RP-8-Säule mit der dazugehörigen Bioaktivität aus dem L929 Cytotoxizitäts-Assay. Fig.8B zeigt ein silbergefärbtes 15% reduzierendes SDS-PAGg des RP-8 Pools, welches eine einzelne Bande bei 3OkDa anzeigt.

D. Charakterisierung der Proteinkomponente des 30 kDa TNF-Inhibitors

30 kDa TNF-Inhibitor ist ein Glycoprotein, was festgestellt wurde unter Verwendung von Concavalin A-Peroxidase, nachdem daiü Protein auf einen Nitrozellulosefilter transferiert worden war. Diese Methode ist eine Modifikation von Wood und Sarinana j (Analytical Biochem. 69,320-322 [1975)), die Glycoproteine direkt auf einem Acrylamidgel identifizierten. Die Peroxidasefa rburij von Glycoprotein wurde ausgeführt unter Verwendung von peroxidasekonjugiertem Con-A oder nicht-konjugiertem Con-A. Wenn nicht-konjugiertes Con-A verwendet wurde, wurde der Nitrozellulosefilter für eine Stunde in eine Lösung, enthaltend Con-A (0,5 mg/ml. Miles Laboratory) in Phosphatpuffer, pH 7,2 (PBS) inkubiert; dann in PBS 3x 5min gewaschen. Der gewaschene Filter wurde in Meerrettich Peroxidase (0,1 mg/ml. Sigma Chemical) für eine Stunde inkubiert. Nachdem der Filtern 3x15 min in PBS war, wurde der Filter eingelegt in eine Lösung, enthaltend 3 mg/ml 4-ChIoM -naphthol (Sigma Chemical) und*! 12,5μΙ/ηιΙ Wasserstoffperoxid, bis die Farbe entwickelt war. Glycoprotein wurde als purpurne Farbe sichtbar. Sobald der Filter?! entwickelt war, wurde ein Photo gemacht, wie in Fig. 3 gezeigt.

Chemische Deglycosylierung von TNF-Inhibitor wurde ausgeführt nach der Methode von Edge, Faltynek, Hof, Reichert and Weber (Analytical Biochem. 118,131-137 [1981]). Eine Mischung von 0,25ml Anisol (Eastman Kodak) und 0,5ml von j

Trifluormethansulfonsäure (Eastman Kodak) wurde auf 4°C abgekühlt und dann wurde 1—200ng des trockenen TNF-Inhibitors gelöst in 3μΙ dieser Mischung. Das Gefäß wurde gefüllt (flashed) mit Stickstoff und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses deglycosylierte Protein wurde auf SDS-PAGE analysiert (Fig.4). Das Molekulargewicht von chemisch

behandeltem TNF-Inhibitor beträgt ungefähr 18000 Dalton. Eine Bande bei 14000 wurde auch beobachtet, aber dies kann ein j proteolytisches Fragment von deglycoliertem TNF-Inhibitor sein.

Die enzymatische Deglycosylierung unter Verwendung von N-Glycanase wurde dem Protokoll des Herstellers folgend (Genzyme'l Corp.) durchgeführt, außer daß TNF-Inhibitor mit N-Glycanase für 5-6 Stunden inkubiert wurde anstelle von über Nacht. Das Molekulargewicht der deglycosylierten Form von denaturiertem TNF-Inhibitor ist ungefähr 20000 Dalton (Fig. 5). Wenn der Inhibitor vor der Deglycosylierung nicht denaturiert ist, beträgt das Molekulargewicht des deglycosylierten Proteins ungefähr 26000 Dalton.

E. Deglycosylierter 30 kDa TNF-Inhibitor bindet an TNF

Radiomarkierter TNF-Inhibitor (3OkDa) wurde mit TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) behandelt, um Kohlenhydratreste zu entfernen, und die TFMSA wurde von dem Protein durch HPLC getrennt. Die Proteinfraktion wurde mit TNF-Affigel für eine Stunde bei 4°C gemischt, und das gesamte ungebundene Material wurde durch Zentrifugation entfernt. Das TNF-Affigel wurde ausgiebig mit 5OmM NaPO₄, pH2,5 gewaschen. Die Radioaktivität in jeder Fraktion wurde gezählt und auch auf SDS-PAGE analysiert. Nichtspezifische Bindung von TNF-Inhibitor wurde gemessen unter Verwendung von Anhydrochymotrypsin-Aftigel. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß deglycosylierter TNF-Inhibitor (30 kDa) an TNF bindet.

Tabelle 2	Art der Affinität	gemessene Zerfälle	Eluat
Probe		(CPM)	40014(45,0%)
		Durchlauf	1789 (2,0%)
	TNF	49401(55,0%)
NativerTNF-INH	AnhyCT	80000(98,0%)	4908(27,0%)
Nativer TNF-INH
TFMSA-behandel-	TNF	13 369(73,0%)	926 (6,0%)
terTNF-INH
TFMSA-behandel-	AnhyCT	15 682(94,0%)
ter TNF-INH

In einem anderen Experiment wurde radiomarkierter TNF-Inhibitor (30 kDa) reduziert und dann mit N-Glycanase deglycosyliert. Nach der Deglycosylierung wurde das Material mit 13mM oxidiertem Glutathion (GSSG) für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 5fach verdünnt mit 5OmM Tris. Cystein wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 5mM zugesetzt. Das Material wurde bei 4°C für 16 Stunden inkubiert, dann mit einem TNF-Affigel für eine Stunde bei 4°C gemischt. Nicht gebundenes Material wurde entfernt und das Gel wurde ausgiebig mit 5OmM Tris-HCI, pH7,5 gewaschen. Das gebundene Material wurde eluiert mit 5OmM NaPO₄, pH 2,5. Die Radioaktivität in jeder Fraktion wurde analysiert und ein SDS-PAGE für jede Fraktion wurde durchgeführt. Wie aus Tabelle 3 und Fig. 18 ersichtlich, bindet auch der deglycosiylierte und reoxidierte TNF-Inhibitor an TNF.

Tabelle 3	Art der Affinität	gemessene Zerfälle	Eluat
Probe		(CPM)	12 603(40,0%)
		Durchlauf
	TNF	18281(60,0%)	1964 (6,0%)
Nativer TNF-INH
N ativer TNF-INH	TNF	28589(94,0%)
(reduziert/			421 (1,3%)
reoxidiert)
TFMSA-behandelt	AnhyCT	31371(98,7%)
(reduziert/			4305(15,0%)
reoxidiert)
Deglycosylier-	TNF	25066(85,0%)
ter TNF-INH
(reduziert/			495 (1,6%)
reoxidiert)
Deglycosylier-	AnhyCT	29619(98,4%)
ter TNF-INH
(reduziert/
reoxidiert)

Beispiel 2

Sequenzieren des 30 kDa TNF-Inhibitors

N-terminale Sequenzen wurden bestimmt unter Verwendung des Applied Biosystems Protein Sequencers, Modell 470 und 477. Vor dem Sequenzieren wurden Peptide, die durch eine Vielzahl von proteolytischen Enzymen gebildet wurden, gereinigt auf einer Applied Biosystems C8-Microbore HPLC Säule (22cm x 2,1 mM).

A. Sequenzieren des Aminoterminus

Ungefähr 250 pmole von reverse-phase (RP-8)-gereinigtemTNF-lnhibitor wurde direkt auf einen Polybren-Filter gegeben und automatisiertem Edman-Abbau unterworfen. Die resultierende Sequenzinformation ergab die ersten 30 Aminosäuren des Moleküls.

B. Endoproteinase Lys-C Verdau von nativem Protein

Ungefähr 250pmole (5μg) von reverse-phase-gereinigtem TNF-Inhibitor wurde mit 1 μg Endoproteinase Lys-C verdaut. Die 12 Stunden Verdau bei 25°C wurden in der Anwesenheit von 1 M Harnstoff, 0,01 % Tween 20 und 15OmM NH₂HCO₃, pH8,0, durchgeführt. Vorder Peptidreinigung wurtde der Verdau reduziert durch Inkubation für eine Stunde im Anschluß an die Zugabe eines 50fachen molaren Überschusses von Dithiothreitol, oder reduziert und alkyliert durch eine weitere Stunde Inkubation bei 37⁰C unter Verwendung eines 2fachen molaren Überschusses an (³H)-Jodessigsäure über Dithiothreitol. Fig. 9 A zeigt das Reverse-Phase-HPLC-Muster dieses Verdaus. Fig. 9 B zeigt das Reverse-Phase-HPLC-Muster dieses Verdaus im Anschluß an die Alkylierung.

C. Endoproteinase Asp-N Verdau von nativem Protein

Ungefähr 250 pmol (5 pg) von reverse-phase-gereinigtem TNF-Inhibitor wurde mit 0,5 bis 2,5 μg Endoproteinase Asp-N verdaut. Der 12-18stündige Verdau bei 37°C wurde durchgeführt in der Anwesenheit von 1 M Guanidin-HCl, 0,01 % Tween 20 und 150 mM NaPhos, pH 8,0.

Vor der Peptidreinigung wurde der Verdau reduziert und alkyliert, wie in Beispiel 2.B. Fig. 10 zeigt das Reverse-Phase-HPLC-Muster von zwei solchen Verdaus.

D. Reduktion Carboxymethylierung von Protein

Der Reverse-Phase-HPLC gereinigte TNF-Inhibitor wurde reduziert und carboxymethyliert mit (³H)-Jodessigsäure wie beschrieben bei Glazer et al., in Chemical Modifications of Proteins, S. 103-104 (1975), außer daß zwei aufeinanderfolgende Runden der Reduktion gefolgt von Alkylierung verwendet wurden. Das Protein wurde wieder gereinigt durch Reverse-Phase-HPLC vor dem proteolytischen Verdau.

E. Endoproteinase V8 Verdau von reduziertem carboxymethyliertem Protein

Ein analytischer Verdau wurde durchgeführt, indem 55 pmol (ungefähr 1 μg) von reduziertem carboxymethyliertem TNF-Inhibitor in 150 mM NaHCO₃, pH 8,0 gelöst wurden und durch Verdauen mit 0,2 μg V8-Protease für 18 Stunden bei 25°C. Reverse-Phase-HPLC (Fig. 11 A) brachte drei sequenzierbare Peptide zutage und zeigte, daß ein Verdau in größerem Maßstab in Ordnung war. Ungefähr 220pmol (4,5μg) von reduziertem carboxymethyliertem TNF-Inhibitor wurde mit 1 μg V8-Protease für 5 Stunden bei 25°C verdaut, als weitere 0,5 μg einer V8-Protease zugesetzt wurden, und der Verdau für 16 Stunden fortgesetzt wurde. Fig. 11 B zeigt die Reverse-Phase-HPLC des V8-Verdaus im großen Maßstab.

F. Komplette Primärstruktur von 30 kDa TNF-Inhibitor, basierend auf Peptidsequenzen und cDNA-Sequenzen Verschiedene Peptidfragmente wurden gegeneinander ausgerichtet (aligned), entsprechend der in Beispiel 4 erhaltenen cDNA-Sequenz. Dies wird in Fig. 19 gezeigt. Reste, die durch Protein-Sequenzierung nicht identifiziert wurden, sind Reste Nummern 14, 42,43,44,96,97,105,107,108 und 110 bis 119. Die Sequenz von Gln-Ile-Glu-Asn ist anscheinend der Carboxylterminus des 3OkDa TNF-Inhibitors.

-17- 296!

Beispiel 3

30 kDa TNF-Inhibitor wird von U 937-ZelIen hergestellt, die mit PMA und PHA stimuliert sind.

Die monocyten-ähnliche Zellinie U937 wuchs bei 37°C in RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, bis zu einer Zelldichte von 1 χ 10⁶ Zellen/ml. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt und auf fünf verschiedenen 100 cm² Petriplatten resuspendiert bei 2 x 10⁶ Zellen/ml in RPMI ohne Serum, enthaltend 10 ng/ml PMA (Phorbol-12-myristat-13-aceta und 5pg/ml PHA-P (Phytohemagglutinin-P). Das konditionierte Medium von einer Platte wurde nach nur 10 Minuten der Inkubation geerntet und als Nullzeitkontrolle verwendet. Das Medium der restlichen Platten wurde nacheinander bei 24 Stunde 48 Stunden, 72 Stunden und 76 Stunden nach Plattieren entfernt. Das in diesen Proben enthaltene Protein wurde je auf ungefäh 400μΙ konzentriert durch eine Centriprep-10 (Amicon Corp.!-Behandlung. Jede 400-pl-Probe wurde dann gemischt mit einem! gleichen Volumen an einer Affigel-15 (Biorad Corp.) Präparation, enthaltend ungefähr 10mg/ml von gereinigtem menschlich rekombinantem TNFa, das in unserem Labor hergestellt worden war. Von diesem TNFa war vor dem Binden an das Affigel-15 Harz gezeigt worden, daß es bioaktiv ist, durch eine Toxizität auf Mäuse L929-Zellen.

Das konditionierte Medium wurde batch-weise mit TNFa-Affinitätsharz für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die ungebundene Fraktion wurde nach Zentrifugation des Harzes entfernt, und das Harz wurde anschließend mit 1 ml (500 μΙ, 2x)J von PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5, enthaltend 0,1 % Gelatine, gewaschen. Gebundenes Material wurde eluie mit einer 25mM Lösung von monobasischem Natriumphosphat, pH2,5 (400μΙ, 2x). 40 μΙ einer jeden der ungebundenen, gewaschenen und eluierten Fraktionen wurden getrocknet, resuspendiert in 10μΙ 25 mM Tris, pH 7,5, gemischt mit 2 μΙ (100pcjjj von ¹²⁵I-TNFa (400-800ci/mmol, Amersham) und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischungen wurden gemischt mit 5 μΙ 40 % Saccharose und 1 ml 0,1 % Bromphenolblau und auf ein 4% natives Acrylamidgel gegeben, wie in Beispiel} 1 .B. beschrieben. Das konditionierte Medium von allen Proben, außer der Nullkontrolle, enthielt nach diesem Assay TNFa-Bindungsaktivität, wie in Fig. 15 gezeigt.

Die restlichen 300 ml von jeder Probe (1. Elution bei niedrigem pH) wurden auf eine C 8 HPLC-Säule gegeben und eluiert mit einem linearen Gradienten von Acetonitril für 60 Minuten (1 %/min, 1 ml/min Flußrate, 1 ml Fraktionen wurden gesammelt). Jede Fraktion wurde getrocknet und resuspendiert in 50 μΙ PBS + 0,1% Gelatine. 10μΙ von jeder dieser Proben wurde mit ¹²⁵I-TNFa wie oben gemischt und analysiert durch ein natives Polyacrylamidgel. TNFa-Bindungsaktivitäten werden in Fraktionen^! festgestellt entsprechend 33% und 36% Acetonitril, wie in Fig. 16 gezeigt.

Beispiel 4

Analyse von Messenger-RNA von PMA/PHA-behandelten U937-Zellen

U937-Zellen wuchsen, wie in Beispiel 3 beschrieben, zu einer Dichte von 1 χ 10^s Zellen/ml und wurden dann resuspendiert in serumfreiem Medium bei 2 χ 10^β Zellen/ml ohne oder mit PMA (10ng/ml) und PHA (5μg/ml). Proben wurden genommen bei, einer Stunde +/- PMA/PHAund 17 Stunden nur + PMA/PHA. Gesamte RNA wurde von diesen Zellen hergestellt nach der Guanidin-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode von Chomczynski and Sacci (Analytical Biochemistry 162:156-159 [1987]). PoIyA^-RNA wurde von Gesamt-RNA hergestellt durch Hybridisieren an Oligo dT-Zellulose (Bethesda Research Labs). 8 Mikrogramm einer jeden PoIyA⁺-RNA wurden auf ein 6,6% Formaldehyd, 1,2% Agarosegel gegeben. Die RNA in dem Gel wurde dann auf eine Zeta-Probe-Membran (BioRad) geplottet. Die Membran wurde behandelt, wie im Beispiel 5 für das Absuchen von menschlichen genomischen DNA-Banken mit Oligonucleotidproben beschrieben. 1 χ 10⁶cpm/ml einer markierten einzelstrangigen DNA-Probe (Polynuceleotidkinase) wurde zugesetzt. Die Sequenz dieser Probe ist:

5' TTGTG G CACTTGGTACAGCAAAT 3' !

und entspricht den Basen 410—433 der Sequenz, wie in Fig. 13 dargelegt. Folgend auf die Hybridisierung bei 65"C über Nacht wurde die Membran einmal bei Raumtemperatur in 6x SSC 0,1 % SDS und einmal bei 65°C in derselben Lösung gewaschen und dann exponiert mit einem Röntgenfilm für 72 Stunden. Das in Fig. 17 gezeigte Autoradiogramm zeigt, daß MPA:PHA-Behandlung von U937-Zellen in serumfreiem Medium für 1 Stunde die Expression der 3OkDa TNFa-lnhibitor Messenger-RNA deutlich stimuliert und daß nach 17 Stunden der Behandlung diese RNA praktisch in den Zellen nicht mehr vorhanden ist. Das ' Molekulargewicht der 30 kDa TNFa-lnhibitor Messenger-RNA, basierend auf diesem Experiment, beträgt ungefähr 2,4 Kilobasen.

Beispiel5 ]

Herstellung einer menschlichen genomischen DNA-Bank für den 3OkDa TNF-Inhibitor Menschliche genomische DNA wurde partiell verdaut m'rt Sau3 Al und größenselektiert. DNA mit einer mittleren Größe von 15 KB wurde in die BAMHI Stelle des Bacteriophagen Lambda Charon 30 ligiert (Rimm, D.L., Horness, D., Kucera, J., und Blattner,

F.R.Gene 12:301-309 [1980]). Phagen wurden vermehrt und amplifiziert auf E.coli CES200. !

A. Proben

Die vier degenerierten Oligonucleotidhybridisierungsproben, die in Tabelle 4 aufgelistet sind, wurden auf einem Applied \

Biosystems DNA-Synthesizer synthetisiert. Jede Probenmischung bestand aus allen möglichen DNA-Sequenzen, die für die gegebene Peptid-Sequenz codierten.

Tabelle 4

Peptid Name

Peptid Sequenz

Probe Name

Probe Sequenz

LysC18 LysC11 LysC 11 LysC11

KEMGQVE QGKYIHP YNDCPG YIHPQNN

TNFBP-P20

TNFBP-P2'

TNFBP-P3'

TNFBP-P4

N = G, A, T, oder C

5'TCNACTCTGNCCCATTCTCTCTT 3' 5'CAAGGGNAAAGTATCACATCC 3' 5'TATCAATCGATCTGTCCCNGG 3' 5'TTAGTTTCTGNGGAGTCAGtS'

Oligonucleotide wurden markiert mit (gamma-³²P) ATP (Amersham Inc., Arlington Heights, IL) und T4 Polynucleotidkinase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) bis zu einer spezifischen Aktivität von 6-9 x 10^ecpm/picomol nach Anleitung des Herstellers.

B. Methoden

8,4 χ 10⁵ Lambda Phagen, enthaltend menschliche genomische DNA, wurden plattiert und auf duplikate Nitrozellulosefilter transferiert. Diese Filter wurden mit 1 pMol/ml der Probe TNFBP-P2' für 16 Stunden hybridisiert in einer Lösung, enthaltend 1,OM NaCI, 0,1 M Natriumeitrat, 2x Denhardtslösung (Denhardt, D.T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 23: 641-646 [1966]), 0,1 % SDS, 0,05% Natriumpyrophosphat und 150pg/ml Hefe tRNA, bei einer Temperatur von 52 "C. Diese Temperatur ist 2 ⁰C unterhalb der berechneten Tm für den AT-reichsten Bestandteil des Oligonucleotidpools (Suggs, S. V. in Developmental Biology Using Purified Genes, [Brown, D. D., and Fox, C. F., eds.] Academic Press, New York, S.683-693 [19811). Nach dem Hybridisieren wurden die Filter für 45 Minuten bei Umgebungstemperatur dreimal gewaschen mit 1 M NaCI, 0,1 M Natriumeitrat und 0,5% SDS. Ein stringentes Waschen für acht Minuten wurde bei der berechneten Tm (d. h. 2 ⁰C oberhalb der Hybridisierungstemperatur) für das AT-reichste Mitglied des Pools durchgeführt. Die Filter wurden dann getrocknet und autoradiographiert für 40 Stunden mit einem Verstärkungsschirm bei —70⁰C.

Elf positive hybridisierende Plaques wurden festgestellt, und diese wurden isoliert und amplifiziert. Die Fähigkeit dieser Klone, mit TNFBP-P20, TNFBP-P3' und TNFBP-P4 zu hybridisieren, wurde getestet unter Verwendung ähnlicher Methoden. Ein Klon (TNFBP-8) hybridisierte mit allen vier Oligonucleotiden. Dieser Klon wurde plaque-gereinigt und amplifiziert. DNA wurde von diesem Klon hergestellt unter Verwendung von Lambda-Sorb (Promega Corporation, Madison, Wl) und einer vom Hersteller beschriebenen Methode.

Ein Mikrogramm dieser DNA wurde verdaut mit Sau3AI, und die Fragmente wurden subkloniert in BAMHI verdautem M 13-Sequenziervektor mp18(Yanish-Perron, CViera, J., and Messing, J. Gene 33: 103-119 [1985)). M13-Klone wurden dann auf duplikate Nitrozellulosefilter transferiert und mit den Oligonucleotidproben aus Tabelle 4 hybridisiert unter Verwendung von zuvor beschriebenen Bedingungen. Positive Subklone wurden gereinigt und sequenziert (Sanger, F., and Coulson, A. R. J. Mol. Biol. 94: 441—448 [1975]) unter Verwendung einer modifizierten T4 DNA-Polymerase (Sequenase, US-Biochemical Corp., Cleveland OH), wie vom Hersteller beschrieben, und unter Verwendung eines Primers, entweder den degenerierten Proben, die zur Identifizierung der Klone verwendet wurden, oder Sequenzen, die unter Verwendung dieser Proben erhalten wurden. Unter den erhaltenen Sequenzen sind diejenigen der Subklone TNFBP-M 13-Sau3A-P2'-2 und TNFBP-M13-Sau3A-P4 Primer P3, P3', P2', P2 und P4. Die Sequenz enthält DNA, die für mindestens 48 Aminosäuren des 3OkDa TNF-Inhibitor Peptide codiert, die anders sind als diejenigen, die durch die Proben spezifiziert sind, und bestätigt deshalb, daß der Klon TNFBP8fürTNF-lnhibitor codiert. Die Sequenz zeigt auch, daß das Gen für TNF-Inhibitor mindestens ein Intron einschließt (GTAGGGGCAA... CCCCATTCACAG). Schließlich zeigt diese Sequenz, daß der 30 kDa TNF-Inhibitor als Vorläuferprotein synthetisiert wird, und daß eine proteolytische Spaltung an der Arg-Asp-Sequenz notwendig ist, um das reife, aktive Protein zu bilden.

Beispiele

Herstellung und Absuchen einer cDNA-Bank aus mRNA mit PMA/PHA-stimulierten U937-Zellen Das in Beispiel 4 beschriebene Experiment zeigt, daß mit PMA/PHA für eine Stunde behandelte U 937-Zellen einen Pool an Messenger-RNA enthalten sollten, der mit dem TNF-Inhibitor (3OkDa) angereichert ist. Demzufolge wurde eine cDNA-Bank aus PoIyA⁺-RNA hergestellt, die aus mit PMA/PHA behandelten U 937-Zellen erhalten wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben. Doppelsträngige DNA mit glatten Enden wurde aus annähernd 5 pg Poly A~-RNA erhalten, im wesentlichen wie beschrieben bei Gubler, U., and Hoffman, B. J., Gene, 25: 263(1983) unter Verwendung postengetesteter Reagenzien (Amhersham, Arlington Heights, IL) nach dem von Hersteller empfohlenen Verfahren. Ungefähr 1 pg erhaltener doppelsträngiger cDNA wurde behandelt mit dem Enzym EcoRI-Methylase, und EcoRI-Linker mit der Sequenz: d(pCCGGAATTCCGG) (New England Biolabs, Beverly, MA) wurden mittels T4 DNA Ligase im Anschluß an den Verdau mit Endonuclease EcoRI angehängt. Dieses DNA wurde dann in einem Lambda-Bakteriophagen KlonierungsvektorgtiOligiert (Young, R. Α.,and Davis, R.W. [1983] ProcNatl. AcadSei USA, 80: 1194—1198), der mit EcoRI verdaut worden war, und das Produkt wurde in infektiöse Lambda-Bakteriophagen-Partikel verpackt unter Verwendung eines Lambda-DNA-Verpackungs-Extrakts (Gigapack Il Gold), der von Stratagene (La JoIIa, CA) erhalten wurde, nach deren Protokoll. Dieses Lambda-Lysat (cDNA-Bank) wurde dann verwendet, um E. coli Stamm C600hflAzu infizieren, und es wurde gezeigt, daß die Bank annähernd 2,5 χ 10^β rekombinierte Mitglieder enthielt.

Annähernd4 χ 10⁵ Mitglieder dieser Bank wurden auf E. coliStamm C600HflA(5 x 10⁴p.f.u./Platte) plattiert. Duplikate Abzüge auf Nitrozellulose wurden hergestellt, und die Filter wurden behandelt, wie es in Beispiel 5 zum Absuchen der menschlichen genomischen Bank beschrieben ist. Die DNA auf den Filtern wurde dann mit derselben ³²P-markierten Probe hybridisiert, wie in Beispiel 4 beschrieben, außer daß die Inkubationstemperatur 42°C betrug. Von 4 x 10⁵ plattierten rekombinanten Phagen hybridisierten drei Plaquesduplikate mit dieser Probe. Diese wurden weiter isoliert und wie oben mit Proben analysiert und mit einer zusätzlichen synthetischen Probe mit der Sequenz: 5' CCCCGGGCCTGGACAGTCATTGTA 3' hybridisiert. Diese Probe entspricht den Basen 671-694 des menschlichen genomischen TNF-Inhibitorklons, der in Fig. 13 gezeigt ist. Beide Proben hybridisierten mit allen drei Plaques, die mit der ersten Probe identifiziert wurden.

Nach der Piaquereinigung wurde von diesen drei Klonen DNA hergestellt und in die EcoRI-Stelle des M13-Vektors mp18und mp 19 subkloniert, wie in Beispiel 5 beschrieben. Jede dieser cDNAs besteht aus zwei EcoRI-Fragmenten, eines von ungefähr 800bp, das allen drei Klonen gemeinsam ist, und ein anderes von 1300bp, 1100bp oder 1 000bp, abhängig von dem jeweiligen Klon. Der wahrscheinliche Ursprung des einzigarten EcoRI-Fragments in jedem Klon ist unvollständige Verlängerung durch das Enzym-Reverse Transkriptase während der Erststrang-Synthese der cDNA. Deshalb stellen diese EcoRI-Fragmente wahrscheinlich die 5'-Enden der TNF-Inhibitor mRNA dar und das 800-bp-Fragment das 3'-Ende. Dies wird durch die von diesen Fragmenten erhaltenen DNA-Sequenz bestätigt, wie unten beschrieben.

Von den EcoRI-Subklonen der obenbeschriebenen cDNA wurde die gesamte Sequenz der 2100 bp cDNA erhalten. Die Dideoxynucleotidkettenabbruchmethode zum Sequenzieren wurde verwendet (Sanger, F. and Coulson, A. R. [1975] J. MoI. Biol. 94: 441-448). Die modifizierte T7 DNA-Polymerase, Sequenase (U. S. Biochemical, Cleveland, OH) wurde als Verlängerungsenzym verwendet, wie vom Lieferanten beschrieben. Sequenzierprimer waren synthetische Oligonucleotide, die

von der menschlichen genomischen Sequenz des TNF-lnhibitors, wie in Fig. 13 gezeigt, hergestellt wurden, oder Sequenzen, die unter Verwendung dieser Primer erhalten wurden. Fig. 20 zeigt die von einem der cDNA-Kione erhaltene translatierte Sequenz. Diese Sequenz entspricht derjenigen, die aus den Proteinsequenzdaten, wie in Fig. 19 beschrieben, erhalten wurden. Die gesamte Sequenz der menschlichen 3OkDa TNF-lnhibitorcDNA von Klon Lambda-gt10-7ctnfbpist in Fig. 21 gezeigt.

Beispiel 7

Expression der 30 kDa TIMF-Inhibitor cDIMA in Escherichia coli Der Anteil des TNF-Inhibitor (30 kDa) cDNA-Gens, der für die lösliche TNFa-Bindungsaktivität codiert, ist zur Expression in E. coli | hergestellt worden wie unten beschrieben. _t

Da der proteincodierenden Sequenz, die den C-terminalen Anteil des aus Harn stammenden TNF-lnhibitors codiert (Sequenz f QIEN, Base 771, Fig. 20), kein Terminationscodon in der cDNA-Sequenz folgt, wurde eins zugefugt durch Oligonucleotid gelenkte ' in vitro Mutagenese (Biorad, Richmond, CA). Ein M13mp19-Klon des 1300 bp EcoRI-Fragments aus dem Klon Lambda- |

gt107ctnfbp wurde hybridisiert mit dem synthetischen Oligonucleotid: I

5' CTACCCCAGATTGAGAATTAAGCTTAAGGGCACTGAGGAC 3' J

Nach der zweiten Strangsynthese und Transfektion in einen geeigneten Wirt wurden Mutantenklone durch Hybridisierung mit i| dem obenbeschriebenen mutagenisierten Oligonucieotid identifiziert. Die molekulare Identität der so identifizierten Klone '

wurde durch DNA-Sequenzierung wie beschrieben (Beispiel 5) bestätigt. Als nächstes wurde ein 468-bp-Fragment, definiert durch Styl (Position 303) und Hind III, das den C-Terminus des Proteins definiert, entfernt von der Rf-Form als ein mutagenisierter Klon und in das E. coli-Expressionsplasmid enthaltend den tacl Promotor (DeBoer, H.A., et al. [1983] Proc. Natl. Acad. Sei, USA 80: 21—25) inseriert. Diese Konstruktion wurde vervollständigt unter Verwendung der synthetischen doppelsträngigen Adaptersequenz:

5' GATCCGATCTTGGAGGATGATTAAATGGACAGCGTTTGCCCC 3'

GCTAGAACCTCCTACTAATTTACCTGTCGCAAACGGGGGTTC

Dieser Adapter kuppelt translational das TNF-Inhibitorgen (verkürzte Form, wie oben beschrieben) an die ersten 12 Codons des BakteriphagenT7Gens 10. Die DNA-Sequenz dieses Konstrukts von dem Punkt der Translationsinitiation bei Gen 10 einschließlich der Adaptersequenz ist in Fig. 22 gezeigt. Ein Methionincodon (ATG) ist notwendigerweise an die TNF-Inhibitorgensequenz zur Expression in E. coli angefügt. Dieses Plasmid wird pTNFiX-1 genannt.

Das vorhergesagte Molekulargewicht dieses Proteins ist ungefähr 17600Da, das sehr nahe dem des deglycosylierten nativen TNF- Inhibitors (3OkDa) ist.

Beispiel 8

Reinigung von aktivem TNF-Inhibitor (3OkDa) von Escherichia coli

Zellen von 11 E. coli Kultur (pTNFIX-1JM1071on-), die für 2 Stunden unter induzierenden Bedingungen wuchsen, wurden resuspendiert in 10 ml von 5OmM Tris-HCI, pH7,5, enthaltend 2mM EDTA (TE-Puffer), und wurden mit einer Frenchpress behandelt bei 20000psi bei 4°C. Das Material wurde bei 20000g für 10 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde einmal mit TE-Puffer gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde in 2 ml 6M Guanidin-HCI Nach der Inkubation wurden 80 μΙ von 50OmM DTT zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für weitere 30 Minuten inkubiert. Das Material, das nach dieser Behandlung unlöslich blieb, wurde durch Zentrifugation bei 20000g für 15 Minuten entfernt. 120μΙ 50OmM oxidiertes Glutathion wurde dem Überstand zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Das Material wurde dann in 20 ml 0,6%Tribasenlösung verdünnt und 220μΙ 50OmM Cystein wurde zugesetzt. Die Inkubation wurde für weitere 16 Stunden bei 4°C fortgesetzt. Nach 16 Stunden Inkubation wurde etwas unlöslicher Rest beobachtet. Dieses unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 20000g für 20 Minuten entfernt. Der resultierende Überstand wurde gegen 5OmM Tris-HCI, pH7,5 für 16 Stunden bei 4°C dialiysiert, dann bei 20000g für 10 Minuten zentrifugiert. PMSF mit einer Endkonzentration von 4mM wurde diesem Überstand zugesetzt, und dieses Material wurde auf eine TNF-Affinitätssäule (7x 2 cm) bei einer Flußrate von 0,1 ml pro Minute geladen. Diese Säule wurde ausgiebig mit 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, gewaschen, und gebundene Proteine wurden mit 5OmM NaPO₄-HCI, pH 2,5, eluiert. Das pH 2,5-Elu at wurde auf eine RP8-Säule geladen, die zuvor mit 0,1 % TFA/H₂O äquilibriert worden war. TNF-Inhibitor wurde mit einem linearen Gradienten von 0,1 % TNF/Acetonitril bei 1 %/min eluiert (Fig.25). Fraktionen wurden auf SDS-PAGE (Fig.26) analysiert, und ein Cytotoxizitäts-Assay wurde durchgeführt (Fig. 25), um den TNF-Inhibitor zu lokalisieren. Der E. coli-hergestellte TNF-Inhibitor (3OkDa) wandert bei ungefähr 2OkDa, da er nicht glycosyliert ist. Fraktionen Nummer 30 bis 35 enthalten TNF-Inhibitor. Die aminoterminale Sequenz dieses Materials zeigt, daß der von E. coli produzierte TNF-Inhibitor die folgende Sequenz besitzt:

Met-Asp-Ser-Val-O-Pro-Gln-Gly-Lys-Tyr-Ile-His-Pro-Gln-Asn-Asn-Ser-

Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden ungefähr 40 pg TNF-Inhibitor (30Da) aus einem Liter Kulturmedium erhalten. Die Ausbeute betrug ungefähr 2 bis 3%. Die Ausbeute kann auf über 50% gesteigert werden, indem der TNF-Inhibitor vor dem Rückfalten gereinigt wird.

Beispiel 9

Expression von Genen, die den 3OkDa TNF-Inhibitor codieren, in tierischen Zellen.

Die Expression von TNF-Inhibitor in tierischen Zellen verlangt die folgenden Schritte:

a. Konstruktion eines Expressionsvektors

b. Wahl einer Wirts-Zellinie

c. Einführen des Expressionsvektors in Wirtszellen

d. Manipulation rekombinanter Wirtszellen, um die exprimierten Spiegel an TNF-BP zu steigern.

1 TNF-lnhibitor-Expressionsvektoren, die zur Verwendung in tierischen Zellen entworfen wurden, können verschiedener Art sein, umfassend stark konstitutive Expressionskonstrukte, induzierbare Genkonstrukte, wie auch solche, die zur Expression in speziellen Zelltypen entworfen wurden In allen Fallen werden Promotoren und andere genregulierende Regionen, wie Enhancer (induzierbar oder nicht) und Polyadenylierungssignale, an der geeigneten Stelle in bezug auf die cDNA-Sequenzen in den auf Plasmiden basierenden Vektoren angebracht Zwei Beispiele solcher Konstrukte folgen Ein Konstrukt, das eine stark konstruktive Promotorregion verwendet, kann unter Verwendung der Kontrollsignale der sehr frühen Gene (immediate early genes) des Cytomegalovirus (CMV) hergestellt werden Dieses Plasmid kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken (Mamatis, et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) konstruiert werden, und zu dem in Fig 23 gezeigten Plasmid fuhren (pCMVXV beta TNFBPstopA) Der Replikationsursprung von SV40 ist in diesem Plasmid enthalten um seine Verwendung in COS Zellen furtransiente Expressions Assays zu erleichtern Dieses spezielle Konstrukt enthalt den CMV-Immediate Early Promotor und Enhancer, wie beschrieben bei Boshart, et al , (Cell 41 521-530,1985), gefolgt von dem zweiten Intron des B-Globins (siehe van Oyen et al, Science 206 337-344,1979), das vom BamHi und EcoRI Restriktionsspaltsteilen flankiert wird Dieses Intron ist enthalten, da gezeigt worden ist daß die Expressionsspiegel gesteigert werden, wenn Introns in den transkribierten Regionen einiger Expressionsvektoren enthalten sind (Buchman and Berg, Mol Cell Biol 8 4395—4405,1988) DasPolyadenylisierungssignal wird von der Simian Virus 40 (SV 40) Sequenz zur Verfugung gestellt (Kartenkoordinaten 2589-2452, siehe Reddy at al , Science 200 494-502,1978) Die 3OkDa TNF Inhibitor cDNA Sequenzen sind wie folgt modifiziert worden die ausgedehnte Region, die 3' des C-Terminus des aus menschlichem Harn gereinigten TNF-Inhibitors lokalisiert ist, ist deletiert worden, und ein Stopcodon ist in die Position unmittelbar folgend auf das C-terminale Asparagin eingebaut worden Die nichtmodifizierten 30 kDa TNF-Inhibitor cDNA-Sequenzen in einem analogen Vektor sind in COS-Zellen eingeführt worden und haben gezeigt, daß sie die TNF-Bindungsaktivitat solcher Zellen steigern

Das zweite Konstrukt (siehe Fig 24) (pSVXVTNFBP stop A) verwendet die stark konstitutive Promotorregion von SV40 frühem Gen (early gene) in einer Anordnung, wie sie in dem Plasmid pSV2CAT (Gorman, et al, Mol Cell Biol 2 1044-1051,1982) gefunden wurde Dieses Plasmid sollte auf solche Weise manipuliert werden, daß die TNF-lnhibitor-cDNA die codierenden Sequenzen fur Chloramphenicol Acetyltransferase ersetzt unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken Wieder einmal wurde die TNF-lnhibitorcDNA modifiziert, wie oben fur das CMV-Promotorkonstrukt beschrieben Die SV40 frühe Promotor Region (early promoter) umfaßt Sequenzen von der Hindlll Stelle bis zur BamHI Stelle (Kartenkoordinaten 5090—188 siehe Reddy et al, Science 200 494-502,1978) und das SV40 Polyadenylierungssignal wie oben fur das CMV-Konstrukt beschrieben

2 Zwei tierische Zellinien sind verwendet worden, um unter Verwendung der obenbeschriebenen Vektoren TNF-Inhibitor zu exprimieren, um aktives Protein herzustellen Zellinien, die fur ihre Fähigkeit, die Expression dieser fremden Gene zu fordern, charakterisiert worden sind, umfassen Affennierenzellen, COS-7 und Dihydrofolatreduktasemangelzellen (dhrf-) der Ovarten df>a chinesischen Hamsters (CHO)

3 Ur- eine von CHO abstammende permanente Zellime zu etablieren, die 30 kDa TNF-Inhibitor in dasZellkulturmedium ausscheidet, ist ein TNF-Inhibitor-Expressionsplasmid in diesen dhfr-Zellen zusammen mit einem Plasmid, das die Synthese von Dihydrofolatreduktase steuert, eingebracht worden unter Verwendung der Kalzium Phosphat-DNA-Prazipitationstechnik, wie beschrieben von Graham und van der Eb (Virology 52 456-467,1973) Die Zellen, die DNA aufgenommen haben und DHFR exprimieren, wurden selektioniert, wie durch Ringold et al, (J Mol Appl Genet 1 165-175,1981) beschrieben

4 Zellen, die das TNF-Inhibitor-Genkonstrukt exprimieren, können manipuliert werden, um die Spiegel der Produktion an TNF-Inhibitor zu steigern Zellen, die TNF-Inhibitor-Expressionsvektoren zusammen mit einem DHFR-Expressionsvektor enthalten, sollten das Protokoll zur Genamplifikation durchlaufen, wie beschrieben von Ringold et al (J. Mol. Appl Genet 1 165-175,1981), unter Verwendung von Methotrexat als kompetitiver Antagonist von DHFR Genamplifikation fuhrt zu mehr Kopien der DHFR- und TNF-Inhibitor-Gene, die in den Zellen vorhanden sind, und begleitend zu gesteigerten Spiegeln an TNF-Inhibitor mRNA, die ihrerseits zu mehr von den Zellen produziertem TNF-Inhibitor-Protein fuhrt

Beispiel 10

Isolierung von zwei Arten von TNF-Inhibitoren aus U937-konditioniertem Medium und Existenz des zweiten TNF-Inhibitors in menschlichem Harn

Die menschlichen U 937-Zellen wuchsen bis zur Dichte von 1 χ 10⁵ Zellen pro ml in 150-cm² Flaschen unter Verwendung von RPMI1640-Medium, enthaltend 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 Einheiten/ml Streptomycin, 10% fötales Kalberserum Nach drei Tagen der Inkubation bei 37°C wurden die Zellen durch Zentnfugation bei 1 500g fur 7 Minuten geerntet Die Zellen wurden bei einer Dichte von 2x 10⁶/ml RPMI1640 Medium ohne Serum resuspendiert Die Zellen wuchsen in der Anwesenheit von 5ug/ml PHA-P (Phytohemagglutinin) und 10ng/ml PMA(Phobol-12-myristat-13-acetat) fur 24 Stunden Das 24-Stunden-Medium (4425ml) wurde durch Zentnfugation gesammelt und durch Amicon YM5-Filter auf ungefähr 100ml konzentriert Dieses Material wurde durch ein TNF-Affinitatsgel (0,7x 2cm) laufengelassen bei einer Flußrate von 0,1 ml/min, und das Gel wurde ausgiebig mit 5OmM Tns-HCI,pH7,5, gewaschen Die gebundenen Proteine wurden mit 5OmM NaPO₄-HCI, pH 2,5 eluiert, und der TNF-Inhibitor wurde von anderen kontaminierenden Proteinen durch HPLC-RPC8 abgetrennt Wie aus Fig 27 ersichtlich, wurden zwei TNF-Inhibitorpeaks beobachtet SDS-PAGE-Analyse der RPC8-Fraktionen zeigt, daß die Molekulargewichte der zwei Peaks grob 3OkDa und40kDa Proteinen entsprechen (Fig 28) Das 30 kDa Protein (TNF-INH1) wurde amino terminaler Sequenzanalyse unterzogen, und es wurde gefunden, daß es die gleiche Sequenz hat wie der obenbeschriebene 30 kDa TNF-Inhibitor aus Harn Jedoch zeigt die Proteinsequenz des 4OkDa Proteins, daß-es nicht das gleiche ist wie das 30 kDa Protein (siehe Beispiel 11) Weitere Reinigung des zweiten TNF-Inhibitorpeaks in dem menschlichen Harn, der um Fraktion 35 in Fig 8 zu sehen ist, zeigt, daß es auch das 4OkDa TNF-Inhibitorprotein ist (Fig 29 und 30)

-21- 296 96!

Der 4OkDa TNF-Inhibitor ist auch ein Glycoprotein. Dies wurde festgestellt unter Verwendung von Concavalin A-Peroxidase, j nachdem das Protein auf einen Nitrozellulosefilter transferiert worden war, wie in Beispiel 1 .D. beschrieben. Es wurde gezeigt,' daß das Molekulargewicht des N-Glycanase behandelten 4OkDa TNF-Inhibitors auf SDS-PAGE ungefähr 36kDa beträgt (siehe . Verfahren wie in Beispiel 1.D. beschrieben).

Folgend den Verfahren, wie oben in Beispiel 1 .E. beschrieben, könnte ermittelt werden, daß der deglycosylierte 40 kDa TNF-Inhibitor auch an TNF alpha bindet. Zusätzlich könnte auch vielleicht gezeigt werden, daß das deglycosylierte 4OkDa Protein an TNF beta (Lymphotoxin) bindet.

Beispiel 11 '

Proteinsequenzierung von U937-stammenden 30 kDa TNF-Inhibitor, 4OkDa TNF-Inhibitor und 40 kDa TNF-Inhibitor aus Harn Aminoterminale Sequenzen der Proteine wurden ermittelt unter Verwendung eines Applied Biosystem Protein Sequencer, Model 470. Beide, native und reduzierte, carboxymethylierte Proteine, wurden sequenziert. Ungefähr 300pmole von reversephase (RP-8)-gereinigten TNF-lnhibitoren wurden auf einen Polybrenf ilter gegeben und automatisiertem Edman-Abbau unterworfen. Die resultierende Sequenz ist in Fig. 31 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß das von U 937 stammende 30 kDa Protein das gleiche ist wie dasjenige, das in Harn gebildet und identifiziert wurde. Das 4OkDa TNF-Inhibitorprotein ist nicht das gleiche wie das 3OkDa TNF-Inhibitorprotein. Das 40 kDa TNF-Inhibitorprotein aus Harn enthält keine zwei aminoterminalen Reste. Ansonsten ist es das gleiche wie das aus U 937 stammende 4OkDa Protein.

Beispiel 12

Primärstruktur des 40kDa TNF-Inhibitors "<

Ungefähr 40 μg des reduzierten und carboxymethylierten TNF-Inhibitors (40 kDa) wurde verdaut mit Endoprotease V8, wie oben beschrieben, und die resultierenden Peptide wurden auf einer RPC 18-Säule getrennt. (Fig. 33). Die gereinigten Peptide wurden sequenziert unter Verwendung eines Applied Biosystem Protein Sequencers, Model 47.

Ungefähr 90 pg des reduzierten und carboxymethylierten TNF-Inhibitors wurde mit 5pg Endopeptidase Arg-C in 0,2 M Ammoniumbicarbonat bei 37⁰C behandelt. Nach 24 Stunden Verdau wurde das Arg-C-verdaute Material auf eine HPLC-RP8-Säule geladen, um die Peptide zu trennen (Fig. 32). Gereinigte Peptide wurden wie zuvor sequenziert. Einige der Peptide wurden weiter verdaut mit PTCK-Trypsin oder Chymotrypsin. Ungefähr 500 pmole von arg-C16-Peptid wurden mit 3 pg TPCK-Trypsin (Boehringer Mannheim) in 0,2 M Ammoniumbicarbonat bei 37°Cfür7 Stunden behandelt, und die Peptide wurden unter Verwendung von RP8 getrennt (Fig.34). Ungefähr 200pmole des Peptids arg-C 10 wurde mit 1 μς Chymotrypsin (Boehringer Mannheim) bei 37°C für dreieinhalb Stunden verdaut, und die resultierenden Peptide wurden auf einer PRC18 getrennt (Fig. 35). Eine partielle Struktur des TNF-Inhibitors (40 kDa) wurde bestimmt durch Aufeinanderausrichten verschiedener überlappender Peptide (Fig.36). Eine komplette Primärstruktur des 40 kDa TNF-Inhibitors ist in Fig. 38 gezeigt. Auf nicht durch Proteinsequenzierung identifizierte Reste wurde geschlossen durch erneutes Überprüfen der Sequenz des cDNA-Klons, der den 4OkDa TNF-Inhibitor codiert und der in Beispiel 14 A diskutiert und in Fig. 39 beschrieben wird.

Beispiel 13

Identifizierung von cDNA-Klonen für den 4OkDa TNFa-lnhibitor

Die in Beispiel 9 dargestellte Information zeigt, daß mit PMA und PHA behandelte U 937-Zellen einen TNFa-lnhibitor produzieren mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4OkDa. Dieses Protein ist gereinigt worden, und anschließend ist seine Aminosäuresequenz bestimmt worden, wie in Beispiel 12 beschrieben. Tabelle 5 zeigt die Sequenzen mehrerer Peptide, die von diesem Protein stammen, und gibt die Sequenzen gemischter Sequenzen von Oligonucleotidproben an, die zum Isolieren von für den hierin beschriebenen 4OkDa TNF-Inhibitor codierenden Genen verwendet wurden.

Das Gen, das für Sequenzen codiert, die den 40 kDa Inhibitor umfassen, kann aus menschlichen genomischen Banken, wie in Beispiel 5 beschrieben, isoliert werden, oder aus einer cDNA-Bank, die aus von U 937-Zellen, die mit PMA und PHA für ungefähr 9 Stunden behandelt worden waren (siehe Beispiel 14), erhalten wurden, konstruiert ist. Jede Bank sollte ungefähr 1,0 χ 10⁶ Rekombinanten enthalten.

Tabelle 5

Peptid-

Sequenz Probenname Probensequenz

EYYDQTA 40KD-P2¹ S'GAATATTATGATCAAACAGC 3¹

GCCCGG T

CC C

AQUAFT 40KD-P1 5'GTAAAACGAACTTGAGC 3¹

GGGCG TT T

KQEGCR	40KD-PG	C 5'AAACAAGAAGGATGTCT 31	C
		GGGG CAC	51CATTTAGAACAACACATTTg
		T	C GCTG G C
QMCCSKC	40KD-P5	5'GATCAAACAGCACAAATGTG 3
		CGGGG
		T T
OQTAQMC	40KD-P6'	cc cc
		5'CCAGGATGGTATTGTGC 31
		G G
		T T
PGWYCA	40KD-P7

Beispiel 14

Isolierung von 40kDa TIMF-Inhibitor cDNA-Sequenzen von PMA/PHA-induzierten U937-Zellen U 937 mRNA wurde aus Zellen isoliert, die durch PMA/PHAfür 9 Stunden induziert worden waren. Sie wurde dann auf einor Oligo-dT-Säule selektioniert, und die so isolierte polyadenylierte mRNA wurde verwendet, um dscDNA !lerzustellen, unter Verwendung von reverser Transkriptase, gefolgt von E. coli-Polymerase l/RNase H. Die dscDNA wui de öinei Polymerasekettenreaktion unterworfen unter Verwendung der in Tabelle 5 gezeigten degenerierten Proben (40KÜ-P1'und 40KD-P7) als Primer. Ein die DNA-Produkte dieser Reaktion enthaltender Southern Blot wurde mit der Probe 40KD-P6' (siehe Tabelle 5) hybridisiert, wobei eine einzige Bande, die diese Sequenz enthielt, identifiziert wurde. Diese Bande wurde aus einem Agarosegel isoliert und in M13Phagen DNA (Stamm mp18) kloniert. Nach der Transformation in E. coli Stamm JM109 und Ausplattieren auf einem Medium, enthaltend X-GaI und IPTG, wurden deutliche Plaques identifiziert, die das korrekte cDNA-Insert enthielten. Die Sequenz der DNA in diesem Klon ist in Fig. 37 zusammen mit dem von dieser Sequenz vorhergesagten Translationsprodukt gezeigt. Diese Aminosäuresequenz paßt zu der in Fig. 36 (Reste 12-104) und Fig. 38 gezeigten Sequenz.

Beispiel 14A

Isolierung eines 40kDa TNF-Inhibitor cDNA-Klons von PMA/PHA-induzierten U937-Zellen mRNA wurde isoliert (Chirgwin, J. M. et al.. Biochemistry 18, 5294-5299) aus menschlichen U 937-Zellen, die PHA und PMA für 9 Stunden ausgesetzt waren. mRNA wurde von dieser RNA gereinigt unter Verwendung von Oligo-dT-Zellulose (Aviv, H. and Leder, P., 172, Proc.Natl.Acad. Sei. [USA] 69,1408-1412). 5μρ dieser mRNA wurden verwendet, um 3Mg doppelsträngigercDNA mit glatten Enden zu synthetisieren (Gubler, U., and Hoffman, B. J., 1983, Gene 25,263-269). Nach Zusatz von EcoRi-Linker wurde die cDNA gereinigt durch Säulenchromatographie mittels Zentrifugieren durch Sephacryl S-400 (Pharmacia) und Ethanol präzipitiert. 100 ng dieser cDNA wurde in 1 iig EcoRI-verdautem und alkalischer Phosphatase behandeltem Lambda gt-10 ligiert und verpackt in vitro unter Verwendung von Gigapackgold (Stratagene). Die verpackte cDNA ergab 2,5 χ 10⁶Rekombinanten beim Plattieren auf E. coli C600 hfl. 1,2 χ 10⁶ Mitglieder dieser Bank wurden in Duplikaten abgesucht mit ³²P-markierter Probe 40KD-P6 + 7 (5' GGG CGT ATG TGC TGT CCT CAC AGG 3') wie beschrieben (Benton, W. D., and Davie, R. W., 1977, Science 196, 180-182). Zwölf positive hybridisierende Klone wurden isoliert und erneut abgesucht mit Proben 40KO-P6' und 40KD-P7 (siehe (abelle E im ZeispielACüK-ier dieser 8lone hybridisierten mit allen drei :robenK2iner dieser 8loneLcDJ18#6, wurde verdaut mit EcoRI, und ein 2,2 kb-lnsert wurde isoliert und subkloniert in beiden Orientierungen in dem Bakteriophagen M13-Vektor mp 19 (Yarrish-Perron, C, et al., 1985, Gene 33,103-119). Die Sequenz wurde von beiden Strängen bestimmt unter Verwendung der Kettenabbruchmethode (Sanger, F. and Coulson, A. R., 1975, J. Mol. Biol. 94,441-448) mit Taq DNA-Polymerase (US-Biochemical). Diese Sequenz ist in Fig.39 zusammen mit seinem daraus geschlossenen Translationsprodukt gezeigt. Die Sequenz enthält einen einzigen offenen Laseraster, der sich von dem ATG-Triplet bei Base 93, das sich deutlich hinter der C-terminalen Sequenz des 4OkDa Proteins bei dem GAC-Triplet bei Base 863 befindet, erstreckt.

-23- 296

Beispiel 15

Oer 4OkDa TNF-Inhibitor inhibiert TNF beta wie auch TNF alpha i

Beide, der 3OkDa TNF-Inibitor und der 4OkDa TNF-Inhibitor wurden untersucht, um zu bestimmen, ob sie auch die Aktivität vo3 TNF beta (Lymphotoxin) hemmen können. Verschiedene Konzentrationen von TNF beta (bezogen von Endogen) wurden mit I jedem der Inhibitoren für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierenden Mischungen wurden mittels des J L929-Zellassaysystems, wie in Beispiel 1.B.1. fur TNFalpha beschrieben, analysiert. Diese Experimente ergaben, daß der 30 kDaJ TNF-Inhibitor einen geringen inhibitorischen Effekt auf TNF beta besitzt. Jedoch zeigte der 4OkDa TNF-Inhibitor eine deutliche! TNF beta Inhibition. Die Ergebnisse dieser Experimente können aus Fig.40 entnommen werden.

Beispiel 16

Herstellung einer menschlichen genomischen DNA-Bank für den 40 kDa Inhibitor '

Eine geeignete menschliche genomische DNA-Bank für den 4OkDa TNF-Inhibitor kann hergestellt werden, wie in Beispiel 5 für den 30 kDa TNF-Inhibitor beschrieben.

Beispiel 17

Herstellung von Genen für die Expression der 40 kDa TNF-Inhibitor cDNA in Escherichia coli Teile des TNF-Inhibitors (4OkDa) cDNA-Gens, das für die löslichen TNF-Bindungsaktivitäten (Fig.39) codiert, sind für die Expression in E. coli hergestellt worden, wie unten beschrieben.

Da es schwierig gewesen ist, die C-terminale Sequenz des aus Harn oderU-937 stammenden reifen 4OkDa TNF-Inhibitors definitiv zu bestimmen, konstruierten wir drei Derivate seiner cDNA-codierenden Sequenz, basierend auf Sequenzanalysen der||

cDNA-Klone. Das erste reicht bis zur vermuteten Transmembransequenz dieses Proteins, Basenpaar 863 (Fig. 39) und endet mitf I

der Peptidsequenz (... GIy Ser Thr GIy Asp). Die nächsten beiden sind 51 (Δ51) und 53 (Δ53) Aminosäuren kürzer als dieser Klon *i und enden beim Basenpaar 710... Ser Pro Thr bzw. Basenpar 704 ... Ser Thr Ser.

Jede dieser drei C-Termini wurde hergestellt durch In-vitro-Mutagenese („Mutagene", BioRad, Richmond, CA) von M 13-Klonen · der cDNA des 40 kDa TNFa-lnhibitors. Der längste Klon wurde zuerst hergestellt unter Verwendung der folgenden synthetischen Oligonucleotide:

1. 5' CAC TGG CGA CTA AGC TTC GCT CTT C 3'

2. 5' GCG GCG CAC GCC GGA TCC GAT CTT GGA GGA TGA TTA

AAT GTT GCC CGC CCA G 3'

Oligonucleotid 1 fügt ein Translationsterminationscodon nach Aminosäure 235, Asp, ein und erzeugt eine Hind III Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle an diesem Punkt. Oligonucleotid 2 paßt die endterminale Sequenz des reifen Proteins an, Leu Pro AIa ... bp 159 (Fig.39) zur Expression in E. coli durch 1) Einfügen eines Met, ATG-Condons bei Aminosäure; Position 1,und 2) Einfügen einer Translationskupplersequenz und einer5'BamHI Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle. t Das mutagenisierte Fragment wurde durch BamHI/Hindlll-Verdau von der Rf DNA des mutierten M13-Klons entfernt und eingebaut in ein E. coli-Expressionspiasmid, wie in Beispiel 7 beschrieben. Dieses Genkonstrukt tragende Klone werden TNF.40 genannt. ,

Die zwei verkürzten Klone wurden wie oben konstruiert unter Verwendung der mutagenisierten M13-Derivate des oben isolierten 4OkDa TNFa-lnhibitorklons und den folgenden Oligonucleotiden:

5' GTCCCCCACCTAAGCTTCGGAGTATGG 3' Δ51 5' GTCCACGTCCTAAGCTTCCCACCCGGA 3' Δ53

Diese zwei Oligonucleotide führen Translations-Terminations-Kodons bei bp710 bzw. 704 ein (Fig.39). Diese Genkonstrukte tragen Klone werden TNF:40 Δ51 bzw. TNF:40 Δ53 genannt.

Beispiel 18

Expression von 4OkDa TNF-Inhibitor codierenden Genen in tierischen Zellen Die Expression des 4OkDa TNF-Inhibitorklons in tierischen Zellen kann, wie in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt werden. Die ausgedehnte Region, die 3' des C-Terminus des 4OkDa TNF-Inhibitors gelegen ist, kann deletiert werden, und ein Stopkodon kann in die Position unmittelbar folgend der C-terminalen Asparaginsäure eingebaut werden.

Beispiel 19

Expression der kompletten cDNA-Sequenz, die den 30 kDa TNF-Inhibitor codiert, in Säugerzellen steigert die TNF-Rezeptorstellen.

Es wurde ein Expressionsvektor hergestellt, der die gesamte 3OkDa TNF-Inhibitor cDNA (2,1 kb), wie in Fig. 21 gezeigt, enthielt, genannt p30KXVA, und war in jeder anderen Hinsicht identisch zu dem in Fig. 23 gezeigten Vektor (d. h., die in dieser Figur gezeigten TNF-BP-Sequenzen wurden ersetzt durch die 2,1 kb cDNA unter Verwendung der einzigen EcoRI-Stelle in dem Plasmid). Siehe Beispiel 9 für eine vollständigere Beschreibung dieses Expressionsvektors. Dieses Plasmid wurde in Cos7-Zellen unter Verwendung der Lipofektinmethode eingeführt, wie beschrieben durch Feigner et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,7413 (1987]). Transferierte Zellen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, (¹²⁵I) TNFa zu binden. Fig. 41 zeigt die Ergebnisse des Bindungstests dieser Zellen, die scheintransfektiert oder mit dem Expressionsvektor p30KXVA transferiert waren. Die Zahl der Bindungsstellen auf plasmid-transfektierten Zellen ist drastisch höher als die Zahl auf den Kontrollzellen. Der komplette cDNA-Klon (d.h. das offene Leseraster, das ein viel größeres Protein codiert als der aus Harn stammende 3OkDa Inhibitor) stellt tatsächlich einen cDNA-Klon eines TNF-Rezeptors dar.

Beispiel 20

Expression von cDNA, die den 40 kDa INF-Inhibitor codiert, in Säugerzellen steigert die TNF-Rezeptorstellen Es wurde ein Expressionsvektor hergestellt unter Verwendung des 2,4kb cDNA-Fragments, isoliert aus den in Beispiel 14 A beschriebenen Lambda-Phagen page #6. Dieses Plasmid war identisch zu dem in Beispiel 9 beschriebenen (Fig. 23), außer daß die 40 kDa TNF-lnhibitor-cDNΑ-Sequenz die 30 kDa TNF-lnhibitor-cDNA-Sequenz in diesem Plasmid ersetzte. Es wurden Plasmide isoliert mit dem 2,4kb EcoRI cDNA-Fragment in beiden Orientierungen, genannt p40KXVA (Sinnorientierung) und p40KXVB (Anti-Sinnorientierung). Diese Plasmide enthalten den Replikationsursprung von SV40, den Cytomegalovirus Immediate Early Promotor und Enhancer, das zweite Iniron des Hasen B-Globins, die 4OkDa TNF-Inhibitor cDNA und das SV40 frühe Polyadenylierungssignal in einem auf pBR322 basierenden Plasmid (für eine vollständigere Beschreibung dieses Vektors, siehe Beispiel 9). Diese Plasmide wurden in COS7-Zellen transferiert, die dann auf TNF-Bindung getestet wurden (siehe Fig. 42). Zellen, die mit p40KXVA transferiert waren, zeigten eine höhere Anzahl an TNF-Bindungsstellen auf der Zelloberfläche als entweder COS7-Zellen alleine oder COS7-Zellen transferiert mit p40KXVB, was nahelegt, daß diese cDNA einen TNF-Rezeptor codiert. Andere solcher Zellen, wie CHO-Zellen, konnten entwickelt werden, die diesen Rezeptor überproduzieren konnten oder die den 4OkDa TNF-Inhibitor in das Gewebekulturmedium ausscheiden, wie in Beispiel 9 beschrieben.

Beispiel 21

Inhibitor, isoliert aus menschlichen Monozyten

Menschliche Monozyten wurden aus 550ml Blut hergestellt (wie beschrieben durch Hannum, CH. et al.. Nature 343, 336-340, 1990). Die frischen Monozyten (2 x 10⁷ Zellen) wurden in 500ml serumfreies RPMH640-Medium gegeben und mit 10ng/ml PMA und 5ug/ml PHA-P für 24,48 und 72 Stunden bei 37°C behandelt. Nach der Inkubation wurden die Medien durch Zentrifugation gesammelt und auf 50 ml konzentriert. Die konzentrierten Medien wurden auf eine TNF-Affinitätssäule (2 ml Bettvolumen) als eine Probe bei einer Zeit geladen und wie in Beispiel 1 mit Säure eluiert. Das eluierte Material wurde weiter gereinigt unter Verwendung einer HPLC RPC-8-Säule unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1, und jede Fraktion wurde mit dem L929-Cytotoxizitätsassay getestet. Fig.43 zeigt die zwei Peaks derTNF-inhibierenden Aktivität. Diese zwei Peaks entsprechen den 3OkDa und 40 kDa TNF-Inhibitoren, die auch in dem Kulturmedium von U937-Zellen, die mit PMA und PHA behandelt wurden, gefunden wurden und in Harn identifiziert wurden.

Beispiel 22

Expression und Reinigung von kürzeren Formen des 40kDa TNF-Inhibitors (Δ51 and Δ53) von E.coli Zellen von 300 ml E.coli-Kulturen (4OkDa TNF-Inhibitor Δ51 und 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53), die getrennt unter induzierten Bedingungen für zwei Stunden wuchsen, wurden in 10ml von 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, enthaltend 2mM EDTA (TE-Puffer), resuspendiert und mit einer French Press behandelt bei 20000g für 10 Minuten. Die resultierenden Pellets wurden einmal mit TE-Puffer gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden in 2ml 6M Guanidin-HCI/100mM Tris-HCI, pH 8,5/4mM PMSF resuspendiert und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 50OmM DTT zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 4mM, und die Mischung wurde für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 20000g für 15 Minuten entfernt. 50OmM oxidiertes Glutathion wurde dem Überstand bis zu einer Endkonzentration von 2OmM zugesetzt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Dieses Material wurde in 20ml 0,6%Tris-Basenlösung mitömM Cystein verdünnt. PMSF wurde bis zu einer Endkonzentration von 2mM zugesetzt. Nach 16 Stunden Inkubation bei 4°C wurde dieses Material gegen 300 Volumen 5OmM Tris-HCI, pH 7,5 für 3 Stunden bei 4°C dialysiert, dann zentrifugiert bei 20000g dialysiert, dann zentrifugiert bei 20000g für 15 Minuten. Der Überstand wurde auf eine TNF-Affinitätssäule (0,7 χ 2cm, 13 mg rhTNF/ml Affigel-10) bei einer Flußrate von 0,09 ml/min geladen. Diese Säure wurde ausgiebig mit 5OmM Tris-HCI, pH 7,5, gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit 5OmM NaH₂PO«,HCI, pH 2,5, eluiert. Die sauren Eluate wurden auf eine RP8-Säule (2 χ 200mm, Spelco) geladen, und die TNF-Inhibitoren wurden mit einem linearen Gradienten von Acetonitril in 0,1% TFA bei einer Flußrate von 1ml pro Gradient pro Minute eluiert (Fig.44Aund45A).

Fraktionen wurden mit dem L929-Cytotoxizitätsassay untersucht, um die TNF-Inhibitoren zu lokalisieren. Der Hauptpeak in jedem RP8-Profil enthält die TNF-inhibierende Aktivität (Fig.44b und 45B). Die von E.coli hergestellten TNF-Inhibitoren (4OkDa TNF-Inhibitor Δ53 und 4OkDa TNF-Inhibitor Δ51) wandern zu der erwarteten Position auf SDS-PAGE (Fig.44B und 45 B). Die aminoterminale Sequenz dieser Materialien zeigt, daß die von E.coli hergestellten TNF-Inhibitoren die folgende Sequenz besitzen:

Met-Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-Phe-Thr-Pro-Tyr-Ala-Pro-Glu

Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden ungefähr 150pg eines jeden 4OkDa TNF-Inhibitors (Δ51 und Δ53) aus 30ml der Kultur erhalten. Die Ausbeute betrug ein paar Prozent, jedoch kann die Ausbeute auf über 30% gesteigert werden, indem jeder Reinigungsschritt verbessert wird

Beide dieser 4OkDa TNF-Inhibitoren (Δ51 und Δ53) inhibieren nicht nur TNF alpha, sondern auch TNF beta.

Beispiel 23

Expression und Reinigung von vollständigem 4OkDa TNF-Inhibitor

Ein aktiver 40kDa TNF-Inhibitor wurde aus einem E.coli-Stamm gereinigt, der Plasmide enthielt, die ein Gen für den vollständigen, reifen 4OkDa TNF-Inhibitor (wie in Beispiel 12) enthalten. Die Methode, die zum Isolieren eines aktiven Inhibitors verwendet wurde, war dieselbe wie in Beispiel 22. Dieser aktive Inhibitor inhibiert beide, TNF alpha und TNF beta, und die aminoterminale Sequenz ist die gleiche wie in Beispiel 22 gezeigt.

Beispiel 24 k

Aminosäurezusammensetzung des 4OkDa TNF-Inhibitors j

Die komplette Aminosäurezusammensetzung des U937-hergestellten, reifen 4OkDa TNF-Inhibitors wurde analysiert durch das ή PTC-Aminosäureanalysesystem. Die tatsächlichen und vorhergesagten Daten der Zusammensetzung fur den vollständigen reifen 40 kDa TNF-Inhibitor, wie in Fig. 38 gezeigt, sind in Tabelle 6 gezeigt.

Beispiel 25

Herstellung von chemisch modifizierten TNF-Inhibitoren

Um die Halbwertszeit der TNF-Inhibitoren in Plasma zu erhöhen, können TNF-Inhibitoren, die mit Polyethylenglycol (PEG) chemisch modifiziert sind, hergestellt werden. Die Modifikation kann durch Verknüpfen von PEG mit einem Cystseinrest des TNF-Inhibitormoleküls erfolgen. Da alle Cysteinreste der TNF-Inhibitoren Disulfid bilden, können mutierte TNF-Inhibitoren konstruiert werden, die einen zusätzlichen Cysteinrest an dem Aminoterminus, Glycosylierungsstellen und den Carboxylterminus eines jeden Inhibitors enthalten. Die Mutagenisierung kann mittels PCR ausgeführt werden unter Verwendung von Oligonucleotiden, die die gewünschte Mutation enthalten. Wie für den 3OkDa TNF-Inhibitor wurde ein zusätzlicher Cysteinrest bei dem Rest Nr. 1,14 oder 105 zugefügt. Diese mutierten Proteine wurden in E. coli exprimiert unter Verwendung der gleichen Systeme, wie in Beispielen 7,22 und 23 beschrieben, zu aktivem TNF-Inhibitor rückgefaltet. Die mutierten Proteine sind so aktiv wie die nicht mutierten Proteine. Die Verknüpfung mit PEG (pegylation) dieser Proteine wird durchgeführt, und die Aktivität wird beurteilt. Die 4OkDa Mutanten werden wie oben konstruiert, und die Verknüpfung mit PEG wird durchgeführt, um aktive Proteine zu erhalten und die Stabilität des TNF-Inhibitors zu steigern.

Tabelle 6	Asx	Berechnet aus	Experimentell #
	GIx	der DNA-Sequenz
	Ser	14	13,0
GIy	23	22,6
His	25	23,2
Thr	14	17,8
AIa	4	4,5
Arg	26	23,9
Pro	17	17
VaI	14	15,1
He	26	22,3
Leu	13	8,7
Phe	4	3,4
Lys	10	8.6
Tyr	5	4,6
Trp	6	5,4
Met	5	5,0
Cys	3	NO
ND: nicht bestimmt	3	ND
	22	NO

Es versteht sich, daß die Anwendung der Lehren in dieser Erfindung auf ein spezielles Expressionssystem innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns liegt angesichts der hierin enthaltenen Lehren. Somit ist es für einen Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Modifikationen und Variationen bei den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung gemacht werden können. Es ist beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung diese Modifikation und Variationen umfaßt, vorausgesetzt sie fallen in den Bereich der anhängenden Ansprüche und ihrer Äquivalente.

Claims (21)

1. Ein beträchtlich gereinigter, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Inhibitor, der gegen TNF aktiv ist.

2. TNF-Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 3OkPa ist.

3. TNF-Inhibitor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor deglycosyliert ist und ein Molekulargewicht von ungefähr 18kDa hat.

4. TNF-Inhibitor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor durch
rekombinante DNA-Methoden hergestellt ist.

5. TNF-Inhibitor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40 kDa ist.

6. TNF-Inhibitor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor aktiv ist gegen
beide, TNF alpha und TNF beta.

7. TNF-Inhibitor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor deglycosyliert ist.

8. TNF-Inhibitor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor die
Aminosäuresequenz wie in Fig. 19 gezeigt besitzt.

9. TNF-Inhibitor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor die
Aminosäuresequenz wie in Fig.38 gezeigt hat.

10. TNF-Inhibitor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor 4OkDa TNF-lnhibitorA51 ist.

11. TNF-Inhibitor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 4OkDa TNF-Inhibitor Δ53 ist.

12. Eine rekombinante DNA-Methode zur Herstellung eines TNF-Inhibitors, umfassend:

(a) Herstellung einer DNA-Sequenz, die eine Wirtszelle dahin lenken kann, ein Protein mit TNF-Inhibitortaktivitäten herzustellen;

(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine ganze Zelle transferiert und dort
repliziert werden kann, wobei der Vektor zum Exprimieren der DNA-Sequenz benötigte
Funktionselemente enthält;

(c) Transferieren des Vektors, enthaltend die synthetische DNA-Sequenz und Funktionselemente, in einen Wirt, der die den TNF-Inhibitor codierende DNA exprimieren kann;

(d) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die geeignet sind, den Vektor zu amplifizieren und den Inhibitor zu exprimieren;

(e) Ernten des Inhibitors; und

(f) dem Inhibitor ermöglichen, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wodurch er TNF-Inhibitoraktivität besitzt.

13. Verfahrennach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 30 kDa TNF-Inhibitor ist.

14. Verfahrennach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 40 kDa TNF-Inhibitor ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 ist.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 ist.

17. Ein Gen, das für Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Inhibitor codiert.

18. Gen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor 3OkDa TNF-Inhibitor ist.

19. Gen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß derTNF-lnhibitor reifer40 kDa TNF-Inhibitor ist.

20. Gen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 ist.

21. Gen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der TNF-Inhibitor 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53 ist.

Hierzu 61 Seiten Zeichnungen

Die Erfindung betrifft Tumor-Nekrose (TNF)-Inhibitoren und Verfahren zu ihrer Herstellung, allgemein TNF-Inhibitor und speziell einen TNF-Inhibitor aus Harn stammend sowie biologisch aktive Analoga dieses Inhibitors. Die Erfindung wird in der Gentechnik angewendet, und die Inhibitoren finden in pharmazeutischen Formulierungen Verwendung.