DE3854842T2

DE3854842T2 - Verfahren zur steigerung und zur hemmung der wirkung eines insulinähnlichen wachstumfaktors

Info

Publication number: DE3854842T2
Application number: DE3854842T
Authority: DE
Inventors: Michael Brewer; Walker Busby; David Clemmons; Stephen Eisenberg; Robert Thompson
Original assignee: Amgen Boulder Inc
Current assignee: Amgen Boulder Inc
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1988-06-03
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2008-06-04
Also published as: WO1989009792A1; DE3854842D1; EP0418230B1; AU1955388A; EP0418230A1; JPH03504597A; BR8901711A; ATE132164T1; EP0418230A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Steigern der Wirkung des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors. Die Erfindung betrifft auch ein humanes, die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II (IGF I und II) bindendes Protein (stimulierende Form), das diese Wirkung besitzt und Verfahren zum Herstellen dieses Bindungsproteins. Das Bindungsprotein (stimulierende Form) ist nützlich für die Verstärkung der Follikelentwicklung in vivo und in vitro, für die Steigerung der Heilung von Wunden und Brandwunden, für die Heilung von Geschwüren und für die Reepithelialisierung von verletztem Gewebe der Niere, Lunge oder Haut. Das Protein kann auch nützlich sein für die Heilungsverstärkung verletzter Neuronen und Oligodendrozyten.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein humanes, den Insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindendes Protein (hemmende Form). Das IGF-bindende Protein (hemmende Form) kann verwendet werden, um Tumorwachstum, das Fortschreiten oder das Wachstum arteriosklerotischer Plaques, und diabetische Retinopathie und Lungenfibrose zu hemmen.
Der humane Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor I (IGF-I), auch Somatomedin-C genannt, ist ein Wachstumshormon-abhängiger Wachstumsfaktor, der im Blut zirkuliert und in vielen Geweben synthetisiert wird. Der Wachstumsfaktor IGF-I ist als Zusatzstoff zu Zellkulturmedien geeignet, um Zellwachstum in vitro zu erleichtern. Wie andere Wachstumsfaktoren, die im Plasma zirkulieren, wie EGF, sind die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren an ein Bindungsprotein gebunden, das einen Trägerprotein-IGF-I- Komplex bildet und vermutlich eine Transportfunktion ausübt. Es ist früher gezeigt worden, daß partiell gereinigte Formen dieses Bindungsproteins die Insulin-ähnlichen Wirkungen von IGF-I hemmen. Eine säurebeständige Bindungsuntereinheit dieses Komplexes ist aus Blut gereinigt worden, und deren Sezernierung kann durch Wachstumshormon stimuliert werden.
Der humane Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor II ist nur schwach oder überhaupt nicht Wachstumshormon-abhängig und wird in vielen Geweben synthetisiert. Wie IGF-I zirkuliert er an ein Bindungsprotein gebunden, das vermutlich eine Transportfunktion ausübt.
Im Gegensatz zu den vorstehenden Wachstumsfaktor-bindenden Proteinen enthalten extrazelluläre Flüssigkeiten, wie Rückenmark-, Lymph- und Amnionflüssigkeiten, und Gewebeextrakte des Gehirns, der Placenta und der Hypophyse Formen von IGF-bindenden Proteinen, die unterschiedliche Molekulargewichte besitzen und nicht Wachstumshormon-abhängig sind. Sie binden sowohl IGF-I als auch IGF-II mit Affinitäten im Bereich von 10¹&sup0; bis 10&sup9; M&supmin;¹. Es ist auch gezeigt worden, daß ein IGF-bindendes Protein von einigen Zelltypen in Kultur, einschließlich humanen Fibroblasten und MDA-231-Zellen, sezerniert wird. Unreine Präparationen des Proteins aus Amnionflüssigkeit und ein ähnliches Protein, das durch Rattenleberzellen sezerniert wird, hemmen nachweislich die Wirkungen von IGF-I und IGF-II auf die DNA-synthese von Fibroblasten und auf den Sulfateinbau in Knorpel.
Die WO 89/08667 (ein Dokument des Standes der Technik gemäß Art. 54(3) und (4) EPÜ) offenbart ein IGF-bindendes Protein und dessen Aminosäuresequenz. Das Protein ist als "Verstärker" für die Wirkung von IGF-Verbindungen wirksam.
Elgin R.G. et al. beschreiben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 (1987), Seiten 3254-3258 ein, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindendes Protein, welches die biologische Antwort auf IGF-I verstärkt. Diese Veröffentlichung offenbart jedoch nicht die Aminosäuresequenz des Bindungsproteins und stellt keine ausreichende Offenbarung für die Isolierung der reinen verstärkenden Form eines IGF-I-bindendenden Proteins dar.
Baxter R.C. und Martin J.L. offenbaren in Biochem. Biophys. Res. Commun., 147 (1987), Seiten 408-415, aus Serum erwachsener Ratten gereinigte IGF-bindende Proteine einer apparenten Molekularmasse von 50 und 56 kDa (nicht-reduziert). Keine Information über die biologische Aktivität der IGF-bindenden Proteine aus Rattenserum wird bereitgestellt; nur das Binden an IGF-I und IGF-II ist gezeigt.
Jedoch waren alle früheren, humanen Proteine Mischungen von mehr als einem Protein. Zum ersten Mal haben die Erfinder ein Verfahren entwickelt, um diese Bindungsproteine zu trennen. Es ist gefunden worden, daß die Proteinmischung aus Amnionflüssigkeit tatsächlich mindestens zwei Proteinbestandteile enthielt. Es wurde gefunden, daß diese Proteinbestandteile sehr verschiedene Wirkungen ausüben, wobei einer fähig ist, die Wirkung von IGF-I und IGF-II zu stimulieren oder zu verstärken, und der andere fähig ist, die Wachstumsfaktorwirkung von IGF-I und IGF- II zu hemmen. Diese zwei Proteinbestandteile, deren Isolierung bis zu stofflicher Reinheit hierin zum ersten Mal beschrieben ist, werden für die Zwecke dieser Anmeldung als IGF-bindendes Protein (stimulierende Form) bzw. als IGF-bindendes Protein (hemmende Form) bezeichnet. Experimente haben angedeutet, daß sich die Proteine hinsichtlich der Art der post-translationalen Modifizierungen, möglicherweise hinsichtlich der Anordnung von Disulfidbindungen, unterscheiden. Solche Veränderungen können zu Unterschieden des Aggregationsgrads führen, die für die beobachteten Unterschiede hinsichtlich der Zell- oder Matrixbindung der IGFBPs und deren biologischen Aktivität verantwortlich sein können.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten IGF-bindenden Proteinen aus Amnionflüssigkeit ist von den Erfindern ein IGF-bindendes Protein aus mit humanen Fibroblasten konditionierten Medien isoliert worden. Diese Form des IGF-bindenden Proteins verstärkt die Wirkung von IGF wie die stimulierende Form aus Amnionflüssigkeit. Es kreuzreagiert mit polyklonalen Antikörpern gegen IGF (stimulierende Form), kann jedoch nicht dasselbe Protein sein.
Die gereinigten IGF-bindenden Proteine (stimulierende Form) besitzen ein geschätztes Molekulargewicht zwischen 32-38 kDa. Diese gereinigten Proteine verursachen, wenn sie an den Zelloberflächen anhaften, eine Steigerung der IGF-Menge, die an den IGF-Rezeptor und an die Zelloberflächen bindet. Überraschenderweise führt diese erhöhte Menge an gebundenem IGF zu einer synergistischen Verstärkung der IGF-Wirkung.
Das wesentlich gereinigte IGF-bindende Protein (hemmende Form) besitzt ebenfalls ein Molekulargewicht von 32-38 kDa, haftet jedoch nicht an Zelloberflächen an und eluiert später aus DEAE- Zellulosesäulen.
In der nachstehenden Diskussion sollte ein Bezug auf das IGF-Ibindende Protein oder auf das IGF-II-bindende Protein als Bezug auf die jeweilige oder auf beide Arten angesehen werden, wenn nicht der Zusammenhang etwas anderes andeutet. Die Abkürzung IGFBP wird auch zur Bezeichnung eines IGF-bindenden Proteins verwendet.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, welche die Wirkung gewisser Wachstumsfaktoren steigern können. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, welche die Wirkung des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors Typ I und II (IGF-I und IGF-II) steigern können.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, welche die Wirkung von IGF-I und IGF-II verhindern können.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Erhalten der jeweiligen Proteine in im wesentlichen gereinigter Form bereitzustellen. Die Verfahren, die für die Reinigung dieser Verbindungen bereitgestellt werden, führen zu Verbindungen, die ihre relative IGF-beeinflussende Wirkung beibehalten. Die Verfahren umfassen sowohl Verfahren zum Reinigen der natürlich vorkommenden Proteine als auch DNA-Kombinationsverfahren zum Herstellen von IGFBP in anderen Zellen oder in kultivierten Zellen und zum Reinigen dieser Proteine.
Um diese Aufgaben zu lösen und in Übereinstimmung mit den Zwekken der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Steigern der Wirkungen von IGF auf das Zellwachstum bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
(a) Gewinnen eines IGF-bindenden Proteins (stimulierende Form) in einer im wesentlichen gereinigten Form; und
(b) Aussetzen der Zellen, deren Wachstum stimuliert werden soll, dem IGF-bindenden Protein (stimulierende Form) und IGF.
Um die Aufgaben ebenso zu lösen und ebenso in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Vermindern der Wirkungen von IGF auf das Zellwachstum bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt:
(a) Gewinnen eines IGF-bindenden Proteins (hemmende Form) in einer im wesentlich gereinigten Form; und
(b) Aussetzen der Zellen, deren Wachstum gehemmt werden soll, dem IGF-bindenden Protein (hemmende Form).
Um weiterhin die Aufgaben der vorliegenden Erfindung zu lösen und in weiterer Übereinstimmung mit deren Zwecken werden Verfahren zum Reinigen der IGF-bindenden Proteine (stimulierende und hemmende Form) bereitgestellt. Diese Verfahren stellen beide Formen des IGF-bindenden Proteins in einem im wesentlichen gereinigten Zustand bereit, welches seine IGF-beeinflussende Wirkung beibehält.
Es ist klar, daß sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende genaue Beschreibung nur beispielhaft und erklärend sind und nicht beschränkend für die Erfindung, wie sie beansprucht wird. Die begleitenden Zeichnungen, die in diese Beschreibung eingebracht sind und ein Teil von dieser darstellen, veranschaulichen eine erfindungsgemäße Ausführungsform und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figur 1 stellt die Steigerung der DNA-Synthese in Zellen des glatten Aortamuskels vom Schwein (A), Hühner (B)-, Maus (C)-, Embryofibroblasten durch IGF-I und das Bindungsprotein dar. Zellen glatter Muskeln wurden in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen subkultiviert, indem sie zu 8000 Zellen/Vertiefung ausplattiert und 5 Tage stehengelassen wurden, damit sie einen Ruhezustand einnahmen. Vor der Analyse wurden die Kulturen zweimal mit Serum-freiem DMEM gewaschen, worauf die Zugabe der Testsubstanzen in 0,2 ml DMEM, ergänzt mit 0,5 µCi ³H-Thymidin und 1% humanem plättchenarmem Plasma (PPP), folgte. Hühnerembryo-Fibroblasten (zweite Passage) wurden in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon 3004) zu 3000 Zellen/Vertiefung in mit 10% FBS ergänztem DMEM subkultiviert. 5 Tage nach dem Ausplattieren wurden die ruhenden, einschichtig gewachsenen Zellen den aufgelisteten Testfaktoren plus 0,5 µCi³H-Thymidin und 1% PPP ausgesetzt. Mausembryo-Fibroblastenkulturen zwischen der dritten und fünften Passage wurden verwendet, und die Experimente wurden, wie für die Hühnerembryo-Fibroblasten beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Zellen zu 8000 Zellen/Vertiefung ausplattiert wurden. Alle Kulturen, die steigenden Konzentrationen an humanem Serum, Insulin, IGF-I, IGF-I plus IGF-I-bindendem Protein (stimulierende Form) (100 ng/ml) oder Insulin und IGF-I bindendem Protein (stimulierende Form) ausgesetzt wurden, wurden für 36 Stunden kultiviert, und der ³H-Thymidineinbau wurde quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Mittelwert dreifach angelegter Kulturen ausgedrückt.
Die Figur 2 stellt die Stimulierung der DNA-Synthese durch das IGF-I-bindende Protein (stimulierende Form) in kultivierten, humanen Fibroblasten dar. Zwischen der vierten und achten Passage wurden die Zellen in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen in mit 10% Kälberserum ergänztem MEM zu einer Dichte von 8000 Zellen/Vertiefung subkultiviert. 5 Tage nach dem Ausplattieren wurden die Kulturen mit Serum-freiem MEM gewaschen; danach wurden 0,2 ml MEM, enthaltend 0,5 µCi³H-Thymidin, 1% PPP und die angegebenen Konzentrationen an Testsubstanzen, zugefügt. Steigende Konzentrationen an Testsubstanzen wurden zugefügt. Steigende Konzentrationen an humanem Serum, IGF-I, Insulin, IGF-I plus IGF-I-bindendem Protein (stimulierende Form) oder Insulin plus IGF-I-bindendem Protein (stimulierende Form) wurden zu ruhenden, humanen, einschichtig gewachsenen Fibroblasten zugefügt. Nach einer 36-stündigen Inkubation wurde die DNA-Synthese bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert dreifach angelegter Kulturen ausgedrückt.
Die Figur 3 stellt konzentrationsabhängige Steigerungen der DNA-Synthese in glatten Muskelzellen als Antwort auf das IGF-I- bindende Protein (stimulierende Form) dar. Steigende Konzentrationen an reinem IGF-I-bindenden Protein (stimulierende Form) (10-500 ng/ml) wurden mit 10 ng/ml IGF-I und humanem 1% PPP inkubiert. Kulturen glatter Muskelzellen wurden hergestellt und der ³H-Thymidineinbau, wie in Figur 1 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind als mittlerer ³H-Thymidineinbau dreifach angelegter Kulturen ausgedrückt.
Die Figur 4 stellt das Wachstum kultivierter Fibroblasten und glatter Muskelzellen als Antwort auf IGF-I und auf das IGF-I- bindende Protein (stimulierende Form) dar. Glatte Muskelzellen vom Schwein (A) und humane Fibroblasten (B) wurden zu 15000 Zellen/Vertiefung in MEM plus 10% Kälberserum (Fibroblasten) oder DMEM plus 10% fötales Kälberserum (glatte Muskelzellen) auf Platten mit 24 Vertiefungen (Falcon, 3004) ausplattiert. Nach 2 Stunden wurden die Medien ausgetauscht gegen MEM oder DMEM, enthaltend 1% PPP. Nach einer weiteren 12-stündigen Inkubation wurden die Medien entfernt und die Testreagenzien zu 0,5 ml DMEM oder MEM, enthaltend 1% PPP, zugefügt. Nach einer 48- stündigen Inkubation wurde die Zellzahl bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als +1SD (Standardabweichung) 4-fach angelegter Kulturen.
Die Figur 5 zeigt die Konstruktion eines Expressionsvektors für IGFBP in höheren Eukaryontenzellen.
Die Figur 6 stellt die Aminosäure- und Nukleotidsequenz von IGFBP mit einer 24 Aminosäuren langen Signalsequenz dar.
Die Figur 7 stellt die Konstruktion des Plasmids pJU1020, enthaltend die für IGFBP kodierende Sequenz, dar.
Die Figur 8 stellt die Konstruktion des Plasmids pJU1021, enthaltend die für IGFBP kodierende Sequenz, dar.
Die Figur 9 stellt die Konstruktion des Plasmids pJU1022, enthaltend die für IGFBP kodierende Sequenz, dar.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Nachfolgend wird genau Bezug genommen auf die derzeit bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsformen, die zusammen mit den Zeichnungen und den folgenden Beispielen dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Wie vorstehend ausgeführt ist, betrifft die vorliegende Erfindung zum Teil ein, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindendes Protein gemäß Anspruch 1, das die Wirkung des Insulinähnlichen Wachstumsfaktors (IGF) verstärken kann. Es ist bekannt, daß IGF als Wachstumsfaktoren dadurch wirkt, daß die DNA-Syntheserate gesteigert wird. Die Erfinder haben ein Protein in einer wesentlich gereinigten Form erhalten, das die wachstumsbeschleunigenden Wirkungen von IGF-I verstärkt. Dieses Protein ist als IGF-bindendes Protein (stimulierende Form) bezeichnet worden. Die verstärkende Wirkung des IGF-bindenden Proteins (stimulierende Form) auf die Fähigkeit von IGF-I, das Zellwachstum zu beschleunigen, ist in den Figuren 1 bis 4 dargestellt.
Um diese verstärkende Wirkung zu erhalten, wird das IGF- bindende Protein (stimulierende Form) in einer wesentlich gereinigten Form erhalten. In einer Ausführungsform läßt man dieses im wesentlichen gereinigte IGF-bindende Protein (stimulierende Form) zuerst an die Oberflächen der Zielzellen anhaften. Die Zielzellen mit dem angehafteten IGF-bindenden Protein (stimuliernde Form) werden danach IGF-I ausgesetzt. Das Exponieren gegenüber IGF-I zusammen mit der Gegenwart des angehafteten IGF-bindenden Proteins führt zu einer mindestens ungefähr vierfachen Steigerung der zellulären Wachstumsrate, während das Exponieren gegenüber IGF-I allein unter Verwendung von glatten Muskelzellen zu einer ungefähr 25%-igen Steigerung der zellulären Wachstumsrate führte.
In einer zweiten Ausführungsform werden das IGF-bindende Protein (stimulierende Form) und IGF-I vor der Zugabe zu Zielzellen vorgemischt.
Das erfindungsgemäße IGF-bindende Protein (stimulierende Form) wird in einer Ausführungsform in einer wesentlich gereinigten Form dadurch erhalten, daß es aus humanen Geweben isoliert wird. Insbesondere kann ein im wesentlichen gereinigtes IGF- bindendes Protein (stimulierende Form) aus humanen, extrazellulären Flüssigkeiten isoliert werden. Diese extrazellulären Flüssigkeiten umfassen Amnion- und Rückenmarkflüssigkeiten. In einer bevorzugten Form dieser Ausführungsform wird das IGF- bindende Protein (stimulierende Form) aus humaner Amnionflüssigkeit isoliert. Die genaue Technologie für die Isolierung dieses bestimmten IGF-bindenden Proteins (stimulierende Form) aus extrazellulären Flüssigkeiten ist im nachfolgenden Beispiel 1 dargestellt.
In einer alternativen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße, IGF-bindende Protein (stimulierende Form) in einer wesentlich gereinigten Form aus, mit humanen Zellinien konditionierten Medien isoliert werden. Die Zellinien umfassen - sind jedoch nicht beschränkt auf - Fibroblastenzellinien, wie GMIO, und Brustkarzinomzellinien, wie MDA-231. Eine genaue Technologie für die Isolierung dieses bestimmten IGF-bindenden Proteins (stimulierende Form) aus, mit Fibroblasten konditionierten Medien ist im nachstehenden Beispiel 5 dargestellt. Dieses zweite IGF-bindende Protein (stimulierende Form) ist eng verwandt, jedoch nicht identisch mit dem aus extrazellulären Flüssigkeiten isolierbaren Protein.
Für die Isolierung beider Typen des IGF-bindenden Proteins (stimulierende Form) sind eine Reihe von Tests entwickelt worden, die bestimmen helfen, ob das richtige Protein isoliert worden ist. Diese Tests können unabhängig voneinander oder in einigen Kombinationen verwendet werden, um die Isolierung des IGF-bindenden Proteins (stimulierende Form) zu bestätigen.
Der erste dieser Tests ist der Nachweis, ob das isolierte Protein IGF-I binden kann. Ein Verfahren zum Durchführen dieses Nachweises ist von demmons, D. in J. Clin. Invest. 77:1548- 1556 (1986) beschrieben.
Ein zweiter Test ist die Bestimmung der Fähigkeit, die Wirkungen von IGF-I in einer synergistischen Weise zu verstärken. Ein Verfahren zum Ausführen dieses Tests ist in Beispiel 2 dargestellt.
Ein dritter Test ist der Nachweis der Fähigkeit des isolierten Proteins, mit einem Antikörper gegen das IGF-I-bindende Protein (stimulierende Form) zu reagieren. Insbesondere können durch jegliche, Durchschnittsfachleuten bekannte Verfahren, insbesondere anhand der hierin enthaltenen Lehren, polyklonale Antikörper gegen dieses Protein erzeugt und verwendet werden, um die Identität des Bindungsproteins zu bestätigen.
In der vorstehenden Beschreibung ist der Ausdruck "wesentlich gereinigt" verwendet worden. Für die Zwecke dieser Anmeldung soll dieser Ausdruck bedeuten, daß das Protein mindestens ungefähr 50% frei von kontaminierenden Substanzen ist, wie durch SDS-PAGE bestimmt wird. Vorzugsweise ist das Protein mindestens ungefähr 75% frei von kontaminierenden Substanzen und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 90% frei von kontaminierenden Substanzen. Es sollte angemerkt werden, daß das früher isolierte IGF-bindende Protein in der Natur als eine Mischung der hemmenden Form und stimulierenden Form des IGF-bindenden Proteins vorkommt. Während folglich die hierin beschriebenen IGF-bindenden Proteine "im wesentlichen rein" sind, wenn sie mindestens ungefähr 50% frei von kontaminierenden Substanzen sind, sollten diese Bindungsproteine mindestens ungefähr 75% voneinander getrennt sein. Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen IGF-bindenden Proteine sind in Beispiel 1 beschrieben.
Die Sequenz des IGF-bindenden Proteins ist in Beispiel 3 beschrieben. Die Isolierung des für ein IGF-bindendes Protein kodierenden Gens ist im Beispiel 4 beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die DNA-Sequenzen, die für den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindende Proteine kodieren. Diese DNA-Sequenzen können die Herstellung von humanen IGF-bindenden Proteinen in verschiedenen Wirtsmikroorganismen und eukaryontischen Zellen dirigieren. "DNA-Sequenz" in diesem Zusammenhang soll entweder einen DNA-Klon voller Länge oder ein synthetisch hergestelltes Analogon oder jegliche Kombinationen der beiden bezeichnen. Für die Zwecke dieser Beschreibung soll "den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindende Proteine" die Primärstruktur der Proteine bedeuten, wie sie durch die Kodons definiert ist, die in der Desoxyribonuklensäuresequenz vorhanden sind, welche die intrazelluläre Produktion der Aminosäuresequenzen dirigiert und die post-translationale Modifikationen umfassen kann. Die erfindungsgemäß hergestellten humanen, den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor bindenden Proteine sind mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60% und am meisten bevorzugt mindestens 80% identisch mit den natürlich vorkommenden, humanen Proteinen. Der Identitätsanteil, wie er hierin diskutiert wird, wird berechnet als der Prozentsatz an Aminosäureresten, die in der kleineren von zwei Sequenzen gefunden werden, welche mit identischen Aminosäureresten in der Vergleichssequenz ausgerichtet werden, wenn vier Lücken pro 100 Aminosäuren erlaubt sind, um die Ausrichtung zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DNA-Sequenzen dazu fähig, die Herstellung eines IGF-bindenden Proteins zu dirigieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die DNA-Sequenzen dazu fähig, die Herstellung eines IGF-bindenden Proteins, das biologisch äquivalent zu demjenigen ist, welches früher aus humaner Amnionflüssigkeit oder mit Fibroblasten konditioniertem Medium isoliert worden ist, zu dirigieren. "Biologisch äquivalent", wie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, bedeutet, daß das unter Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz hergestellte IGF-bindende Protein zu einer Form aktivierbar ist, die eine verstärkte oder gehemmte Zellwachstumsaktivität induzieren kann, welche qualitativ und quantitativ aquivalent zu derjenigen ist, die von aus humaner Amnionflüssigkeit oder mit Fibroblasten konditionierte Medien isolierten IGF-bindenden Proteinen ausgeübt wird.
Wie vorstehend angeführt, können die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen synthetisch erzeugt werden. Die Mittel für die synthetische Erzeugung dieser Polynukleotidsequenzen sind vermutlich Durchschnittsfachleuten, insbesondere anhand der hierin enthaltenen Lehren, allgemein bekannt. Als Beispiel für den gegenwärtigen Stand der Technik betreffend die Polynukleotidsynthese wird man verwiesen auf Matteucci, M.D. und Caruthers, M.H. in J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981) und Beauchee, S.L. und Caruthers, M.H. in Tetrahedron Lett. 22:1859 (1981).
Weiterhin kann die DNA-Sequenz ein Fragment einer natürlichen Sequenz, d.h. ein Fragment eines Polynukleotids, das in der Natur vorkommt und welches zum ersten Mal durch die Erfinder isoliert und gereinigt worden ist, sein. In einer Ausführungsform ist die DNA-Sequenz ein aus einer cDNA-Bank isoliertes Restriktionsfragment. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist die cDNA-Bank, wie in Beispiel 4 beschrieben, erzeugt.
In einer alternativen Ausführungsform wird die DNA-Sequenz aus einer Bank humaner, genomischer DNA isoliert. Ein Beispiel für eine solche, in dieser Ausführungsform geeigneten Bank ist durch Lawn et al. in Cell 15:1157-1174 (1978) dargestellt.
Wie vorstehend ausgeführt ist, betrifft die vorliegende Erfindung eine Serie von Vektoren, die jeweils mindestens eine der hierin beschriebenen DNA-Sequenzen enthalten. Es wird vorausgesehen, daß zusätzliche Kopien der DNA-Sequenz in einem einzigen Vektor eingebracht werden können, um die Fähigkeiten des Wirtsorganismus oder der eukaryontischen Zelle zu steigern, große Mengen des gewünschten IGF-bindenden Proteins herzustellen. Zusätzlich können die Klonierungsvektoren innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ergänzende Nukleotidsequenzen vor oder hinter der übertragenen DNA-Sequenz enthalten. Die ergänzenden Sequenzen sind solche, die die Transkription der übertragbaren DNA-Sequenz nicht nachteilig beeinflussen werden und unter manchen Umständen, wie nachstehend genauer dargestellt wird, die Transkription, Translation oder die Fähigkeit der primären Aminosäurestruktur des entstehenden IGF-bindenden Proteins, eine funktionelle Tertiärform anzunehmen, verstärken.
Es ist klar, daß zusätzliche Klonierungsvektoren bereits existieren oder entdeckt werden, die die vorstehend erwähnten Eigenschaften besitzen und daher geeignet für die erfindungsgemäße Verwendung sind. Es ist beabsichtigt, daß diese Vektoren innerhalb des Umfangs der offenbarten Serien an Klonierungsvektoren sind, in die die cDNA-Sequenzen zusammen mit allen notwendigen funktionellen Elementen eingebracht werden können, wobei der veränderte Vektor dann innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung ist und geeignet ist, in dem nachstehend genauer dargestellten DNA-Rekombinationsverfahren verwendet zu werden.
Gewisse bevorzugte Vektoren mit diesen Merkmalen werden in den nachstehenden Beispielen beschrieben.

I. Exdression von Genen für IGF-bindende Proteine in Mikroorganismenzellen

Die unmittelbar nachstehenden Abschnitte A, B und C beziehen sich auf die Herstellung übertragbarer DNA-Sequenzen in Wirtsmikroorganismen.

A. Merkmale bevorzugter Vektoren für Mikroorganismen

Gewisse erfindungsgemäße Ausführungsformen werden ins Auge gefaßt, die bekannte oder gegenwärtig unentdeckte Vektoren verwenden, welche eine oder mehrere der hierin beschriebenen cDNA- Sequenzen enthalten können. Insbesondere ist es bevorzugt, daß diese Vektoren einige oder alle der folgenden Merkmale besitzen:
(1) besitzen eine minimale Anzahl an Wirtsorganismensequenzen; (2) werden stabil beibehalten und in dem gewünschten Wirt vermehrt; (3) können in hoher Kopienanzahl in dem gewünschten Wirt vorhanden sein; (4) besitzen einen regulierbaren Promotor, der so positioniert ist, daß er die Transkription des interessierenden Gens verstärkt; (5) besitzen mindestens eine DNA- Sequenz, die für einen Selektionsmarker kodiert, der auf einem Teil des Plasmids vorhanden ist, welcher von demjenigen getrennt ist, an dem die übertragbare DNA-Sequenz inseriert werden wird; und (6) besitzen eine DNA-Sequenz, die die Transkription stoppen kann.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen enthalten diese Klonierungsvektoren, welche die erfindungsgemäßen cDNA- Sequenzen umfassen und exprimieren können, verschiedene funktionelle Elemente. Diese "funktionellen Elemente", wie sie hierin diskutiert werden, umfassen mindestens einen Promotor, mindestens eine Shine-Dalgarno-Sequenz und ein Initiatorkodon und mindestens ein Stopp-Kodon. Vorzugsweise umfassen diese "funktionellen Elemente" ebenso mindestens einen Operator, mindestens eine Leader-Sequenz für Proteine, die aus dem intrazellulären Raum exportiert werden sollen, mindestens ein Gen für ein Regulatorprotein und alle weiteren DNA-Sequenzen, die notwendig oder bevorzugt für eine angemessene Transkription und nachfolgende Translation der Vektor-DNA sind.
Manche dieser funktionellen Elemente können in jedem der bevorzugten, erfindungsgemäßen Vektoren vorhanden sein. Es wird vorausgesehen, daß alle zusätzlichen funktionellen Elemente, die benötigt werden könnten, unter Anwendung von, Durchschnittsfachleuten bekannten Verfahren, insbesondere anhand der hierin enthaltenen Lehren, zu diesen Vektoren zugefügt werden können.
In der Praxis ist es möglich, jeden dieser Vektoren in einer Weise zu konstruieren, die es erlaubt, sie auf einfache Weise zu isolieren, zusammenzubauen und auszutauschen. Dies erleichtert den Zusammenbau zahlreicher funktioneller Gene aus Kombinationen dieser Elemente und der kodierenden Region der cDNA- Sequenzen. Weiterhin werden viele dieser Elemente nicht nur in einem Wirt verwendbar sein. Es wird zusätzlich vorausgesehen, daß die Vektoren in gewissen bevorzugten Ausführungsformen DNA- Sequenzen, die als Regulatoren ("Operatoren") funktionieren können, und weitere DNA-Sequenzen, die für Regulatorproteine kodieren können, enthalten werden.

1. Regulatoren

Diese Regulatoren werden in einer Ausführungsform dazu dienen, die Expression der cDNA-Sequenzen beim Vorhandensein gewisser Umgebungsbedingungen zu verhindern und beim Vorhandensein anderer Umgebungsbedingungen die Transkription und nachfolgende Expression des Proteins, für das die cDNA-Sequenz kodiert, zu erlauben. Insbesondere ist es bevorzugt, daß regulatorische Segmente in den Vektor inseriert werden, so daß die Expression der cDNA-Sequenz in der Gegenwart von z.B. Isopropylthio-β-D- galactosid nicht oder nur zu einem sehr verminderten Ausmaß stattfinden wird. In dieser Situation kann der, die cDNA- Sequenz enthaltende, transformierte Mikroorganismus vor der Initiation der Expression des IGF-bindenden Proteins zu einer gewünschten Dichte kultiviert werden. In dieser Ausführungsform wird die Expression des gewünschten Proteins durch Zufügen einer Substanz zu der mikrobiellen Umgebung induziert, die die Expression der DNA-Sequenz veranlassen kann, nachdem die gewünschte Dichte erreicht worden ist.

2. Promotoren

Die Expressionsvektoren müssen Promotoren enthalten, die von dem Wirtsorganismus für die Expression dessen eigener Proteine verwendet werden kann. Obwohl das Lactose-Promotorsystem gewöhnlich verwendet wird, sind auch weitere mikrobielle Promotoren isoliert und charakterisiert worden, die es einem Durchschnittsfachmann erlauben, sie für die Expression des rekombinanten IGF-bindenden Proteins zu verwenden.

3. Transkriptionsterminator

Die hierin ins Auge gefaßten Transkriptionsterminatoren dienen dazu, den Vektor zu stabilisieren. Insbesondere werden solche Sequenzen, wie sie von Rosenberg, M. und Court, D. in Ann. Rev. Genet. 13:319-353 (1979) beschrieben sind, für die erfindungsgemäße Verwendung ins Auge gefaßt.

4. Nicht-translatierte Sequenz

Es wird angemerkt, daß es in der bevorzugten Ausführungsform auch wünschenswert sein kann, das 3'- oder 5'-Ende der kodierenden Region zu rekonstruieren, um den Einbau nicht- translatierter 3'- oder 5'-Sequenzen in das Gentranskript zu erlauben. Unter diesen nicht-translatierten Sequenzen sind solche umfaßt, die die mRNA stabilisieren, wie diejenigen, die von Schmeissner, U., Mckenney, K., Rosenberg, M. und Court, D. in J. Mol. Biol. 176:39-53 (1984) identifiziert wurden.

5. Ribosomenbindungsstellen

Die mikrobielle Expression fremder Proteine erfordert gewisse funktionelle Elemente, die Ribosomenbindungsstellen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Dieses bestimmte Element ist eine Sequenz, die ein Ribosom erkennt und woran dieses bei der Initiation der Proteinsynthese bindet, wie in Gold et al., Ann. Rev. Microbio. 35:557-580 oder Marquis, D.M. et al., Gene 42:175-183 (1986) dargestellt ist.
Die hierin diskutierten, funktionellen Elemente können routinemäßig durch Durchschnittsfachleute anhand von Literatur des Standes der Technik und der hierin enthaltenen Lehren ausgewählt werden. Allgemeine Beispiele dieser funktionellen Elemente sind dargestellt in B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983).
Verschiedene Beispiele geeigneter funktioneller Elemente können auf den vorstehend erwähnten Vektoren gefunden und durch einen Einblick in die Veröffentlichungen, die die Grundmerkmale der vorstehend erwähnten Vektoren diskutieren, erkannt werden.

6. Leader-Sequenz und Translationskoppler

Es ist weiterhin bevorzugt, daß eine, für einen geeigneten Sekretions-Leader (Signal)-Sequenz kodierende DNA am 5'-Ende der übertragbaren DNA-Sequenzen vorhanden ist. Die DNA für die Leader-Sequenz muß sich in einer Position befinden, die die Herstelllung eines Fusionsproteins erlaubt, in welchem die Leader- Sequenz sich unmittelbar neben dem Inhibitor befindet und daran kovalent geknüpft ist, d.h. es dürfen keine Transkriptions- oder Translationsterminationssignale zwischen den beiden kodierenden DNA-Sequenzen sein. Das Vorhandensein der Leader-Sequenz ist zum Teil aus einem oder mehreren der folgenden Gründe erwünscht. Erstens kann das Vorhandensein der Leader-Sequenz die Wirts-Prozessierung des IGF-bindenden Proteins erleichtern. Insbesondere kann die Leader-Sequenz die Spaltung des ursprünglichen Translationsprodukts durch eine Leader-Peptidase dirigieren, um die Leader-Sequenz zu entfernen und ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die die potentielle Proteinaktivität besitzt, zu erzeugen. Zweitens kann das Vorhandensein der Leader-Sequenz dadurch die Reinigung des IGF-bindenden Proteins erleichtern, daß das Protein aus dem Zellzytoplasma herausgeleitet wird. Bei einigen Wirtsmikroorganismenarten wird das Vorhandensein der geeigneten Leader-Sequenz den Transport des vervollständigten Proteins in den periplasmatischen Raum erlauben, wie dies der Fall einiger E. coli-Stämme ist. Im Fall gewisser E. coli-, Saccharomyces-, Bacillus- und Pseudomonas- Stämme wird die geeignete Leader-Sequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran hindurch in das extrazelluläre Medium erlauben. In diesem Fall kann das Protein von extrazellulärem Protein gereinigt werden. Drittens kann im Fall einiger der erfindungsgemäß hergestellten Proteine das Vorhandensein der Leader-Sequenz notwendig sein, um das vervollständigte Protein in einer Umgebung zu lokalisieren, wo es in seine aktive Struktur, die die geeignete Proteinaktivität besitzt, gefaltet werden kann.

7. Translationsterminator

Die hierin ins Auge gefaßten Translationsterminatoren dienen dazu, die Translation der mRNA zu stoppen. Sie können entweder natürlichen Ursprungs sein, wie beschrieben von Kohil, J., Mol. Gen. Genet. 182:430-439 (1991) oder synthetisiert werden, wie beschrieben von Pettersson, R.F. in Gene 24:15-27 (1983).

8. Selektionsmarker

Es ist weiterhin bevorzugt, daß der Klonierungsvektor einen Selektionsmarker enthält, wie einen Arzneimittelresistenzmarker oder andere Marker, die die Expression eines selektierbaren Merkmals durch den Wirtsmikroorganismus veranlaßt. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Gen für Ampicillinresistenz in dem Vektor umfaßt, während in anderen Plasmiden das Gen für Tetracyclinresistenz oder das Gen für Chloramphenicolresistenz umfaßt ist.
Solche Arzneimittelresistenz- oder andere Selektionsmarker sollten zum Teil die Selektion von Transformanten erleichtern. Zusätzlich kann das Vorhandensein eines solchen Selektionsmarkers im Klonierungsvektor dazu dienen, kontaminierende Mikroorganismen von einer Vermehrung im Kulturmedium abzuhalten. In dieser Ausführungsform würde eine solche Reinkultur der transformierten Wirtsmikroorganismen dadurch erhalten werden, daß die Mikroorganismen unter Bedingungen kultiviert werden, die für das Überleben den induzierten Phänotyp voraussetzen.

B. Vektorkonstruktion für Mikroorganismen

Nach der Synthese und/oder der Isolierung aller notwendigen und gewünschten Bestandteile der vorstehend erwähnten Klonierungsvektoren werden die Vektoren durch, Durchschnittsfachleuten allgemein bekannten Verfahren zusammengesetzt. Der Zusammenbau solcher Vektoren befindet sich im Pflicht- und Aufgabenbereich von Durchschnittsfachleuten und kann ohne übermäßigen Experimentierungsaufwand durchgeführt werden. Beispielsweise sind ähnliche DNA-Sequenzen in geeignete Klonierungsvektoren ligiert worden, wie in Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982).

C. Wirtsmikroorganismen

Die hierin offenbarten Vektoren und Verfahren sind geeignet für eine Verwendung im Zusammenhang mit Wirtszellen über einen weiten Bereich prokaryontischer und eukaryontischer Organismen. Prokaryonten sind für die Klonierung der DNA-Sequenzen und für die Genexpression bevorzugt. Sowohl die E. coli-Stämme JM105, JM107 und JM109 (erhältlich von Pharmacia) als auch Bacillus- und Pseudomonas-Arten können für die Expression des Gens verwendet werden. Außer Prokaryonten können für die Genexpression eurkaryontische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, verwendet werden.
Gewöhnlich werden Plasmidvektoren, die funktionelle Elemente enthalten, welche von, mit den Wirtszellen kompatiblen Arten stammen, verwendet. Beispielsweise wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, ein Plasmid, das von E. coli abstammt. Die Tabelle I zeigt die Liste der Wirtsorganismen und die kompatiblen Vektoren.

1. Pseudomonas-Vektoren

Zusätzlich zu den in der Tabelle I aufgeführten Vektoren sind mehrere Plasmidvektoren, die in einem breiten Spektrum Gramnegativer Bakterien autonom replizieren, bevorzugt für eine Verwendung als Klonierungsvehikel in Wirten der Gattung Pseudomonas. Diese sind beschrieben von Tait, R.C., Close, T.J., Lundquist, R.C., Hagiya, M., Rodriguez, R.L., und Kado, C.I. in Biotechnology, Mai 1983, S. 169-275; Panopoulos, N.J. in Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, S. 163-185 (1981) und Sakagucki, K. in Current Topic in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982).
Für eine besonders bevorzugte Konstruktion würde das Plasmid RSF1010 und Derivate davon verwendet werden, wie beschrieben von Bagdasarian, M., Bagdasarian, M.M., Coleman, S. und Timmis, K.N. in Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N. und Puhler, A., Herausgeber, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979).
Die Vorteile von RSF1010 sind, daß es relativ klein ist, ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl ist, das auf einfache Weise sowohl E. coli als auch Pseudomonas-Arten transformiert, und stabil vermehrt wird. In diesem System würde es bevorzugt sein, das Tax-Expressionssystem, wie für Escherichia beschrieben, zu verwenden, da der trp-Promotor von E. coli anscheinend leicht von der Pseudomonas-RNA-Polymerase erkannt wird, wie dargestellt ist von Sakagucki, K. in Current Topics in Microbiology and Immunology 96:31-45 (1982) und Gray, G.L., McKeown, K.A., Jones, A.J.S., Seeburg, P.H. und Heyneker, H.L. in Biotechnology, Februar 1984, S. 161-165.
Die Transkriptionsaktivität kann weiter dadurch maximiert werden, daß der Promotor mit beispielsweise einem E. coli- oder P. aeruginosa-trp-Promotor ausgetauscht wird. Weiterhin würde auch das lacI-Gen eines lacIq-Stammes von E. coli in dem Plasmid eingebracht werden, um eine Regulation zu ermöglichen.
Die Translation kann an eine Translationsinitiation für irgendeines der E. coli-Proteine, wie in den Beispielen beschrieben ist, gekoppelt werden, wie auch an Initiationsstellen für irgendeines der hochexprimierten Wirtsproteine, um eine intrazelluläre Expression des Inhibitors zu veranlassen.
In solchen Fällen, in denen Restriktions-Minus-Stämme einer Pseudomonas-Wirtsart nicht verfügbar sind, ist die Transformationseffizienz mit, aus E. coli isolierten Plasmidkonstrukten schlecht. Daher ist eine Passage des Pseudomonas-Klonierungsvektors durch einen r&supmin; m&spplus;-Stamm einer anderen Art vor der Transformation des gewünschten Wirts vorteilhaft, wie dargestellt ist in Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, S. 411-422, Timmis und Puhler, Herausgeber, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979).

2. Bacillus-Vektoren

Ein weiteres bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus verwendet das Plasmid pUB110 als Klonierungsvehikel. Wie in anderen Vektorsystemen ist es möglich, in Bacillus das erfindungsgemäße IGF-bindende Protein entweder als ein intrazelluläres oder als ein sezerniertes Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsformen umfassen beide Systeme. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Bacillus als auch E. coli replizieren, sind für die Konstruktion und das Testen verschiedener Gene verfügbar, wie beschrieben von Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S. und Shivakumar, A.G. in Genetic Engineering, Band 2, Setlow und Hollander, Herausgeber, Plenum Press, New York, New York, S. 115-131 (1980).
Für die Expression und Sekretion des IGF-bindenden Proteins bei B. subtilis wird die Signalsequenz der α-Amylase vorzugsweise mit der, für das Protein kodierenden Region verknüpft. Für die Synthese des intrazellulären Inhibitors wird die übertragbare DNA-Sequenz translational mit der Ribosomenbindungsstelle der Leader-Sequenz der α-Amylase verknüpft werden.
Die Transkription dieser jeweiligen Konstrukte wird vorzugsweise durch den α-Amylase-Promotor oder ein Derivat davon dirigiert. Dieses Derivat enthält die RNA-Polymerase- Erkennungssequenz des nativen α-Amylase-Promotors, umfaßt jedoch auch die lac-Operatorregion. Ähnliche Hybridpromotoren, die ausgehend von dem Penicillinasegen-Promotor und dem lac- Operator konstruiert worden sind, funktionieren nachweislich in Bacillus-Wirten auf eine regulierbare Weise, wie dargestellt ist von Yansura, D.C. und Henner in Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan, A.T. und Hoch J.A., Herausgeber, Academic Press, S. 249-263 (1984).
Das lacI-Gen eines lacIq-Stammes von E. coli würde ebenfalls in die Anordnung eingebracht werden, um eine Regulation zu bewirken.

3. Clostridium-Vektoren

Ein bevorzugtes Konstrukt für eine Expression in Clostridium ist im Plasmid pJU12 verwirklicht, das beschrieben ist von Squires, C.H. et al., in J. Bacteriol. 159:465-471 (1984), und das durch das Verfahren von Heefner, D.L. et al., wie beschrieben in J. Bacteriol. 159:460-464 (1984), in C. perfringens transformiert wird.
Die Transkription wird durch den Promotor des Tetracyclinresistenzgens dirigiert. Die Translation ist an die Shine- Dalgarno-Sequenzen desselben tetr-Gens in einer Weise verknüpft, die streng analog zu den Verfahren sind, die vorstehend für, in anderen Wirten verwendbare Vektoren ausgeführt sind.

4. Hefe-Vektoren

Die stabile Vermehrung fremder, in Hefe eingebrachter DNA kann auf mehrere Art und Weisen bewirkt werden, wie beschrieben von Botstein, D. und Davis, R.W. in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones and Broach, Herausgeber, S. 607-636 (1982).
Ein bevorzugtes Expressionssystem für eine Verwendung mit Wirtsorganismen der Gattung Saccharomyces stellt das 2 µ- Plasmid dar, welches das für das IGF-bindende Protein kodierende Gen trägt. Die Vorteile des 2 µ-Plasmids umfassen eine relativ hohe Kopienanzahl und Stabilität, wenn dieses in ciro-- Stämme eingebracht wird. Diese Vektoren umfassen vorzugsweise den Replikatonsursprung und mindestens einen Antibiotikumresistenzmarker von pBR322, um die Replikation und Selektion in E. coli zu erlauben. Zusätzlich wird das Plasmid vorzugsweise 2 µ- Sequenzen und das LEU2-Hefegen besitzen, damit es dieselben Zwecke in LEU2-defekten Hefemutanten erfüllt.
Die Erfindung betrifft auch ein DNA-Rekombinationsverfahren für die Herstellung des IGF-bindenden Proteins. Allgemein umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
(a) Transformieren eines einzelligen Wirts mit einem Vektor, welcher für ein Insulin-ähnlicher Wachstumfaktor-bindendes Protein nach Anspruch 1 kodiert, worin der besagte Vektor auch einen für den besagten einzelligen Wirt geeigneten Replikationsursprung enthält;
(b) Kultivieren des transformierten Wirts unter Bedingungen, die für die Herstellung des Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindenden Proteins geeignet sind.
In diesem Verfahren enthält der Vektor die vorstehend beschriebenen, synthetischen oder natürlich vorkommenden Polynukleotide.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält der Vektor die Nukleotidsequenz, wie sie durch die cDNA definiert ist, deren Isolierung im Beispiel 4 beschrieben ist.
Die Vektoren, die als geeignet für das vorliegende Verfahren angesehen werden, sind diejenigen, die vorstehend beschrieben wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Klonierungsvektor, welcher den Replikationsursprung von E. coli, einen T7-Promotor eines Coliphagen und einen Marker für Tetracyclinresistenz enthält, verwendet. Das Gen für das IGF- bindende Protein ist translational mit einem Fragment des T7 (phi)10-Proteins verknüpft.
Der so erhaltene Vektor wird danach in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus, beispielsweise E. coli, welcher eine chromosomale Kopie des Gens 1 vom Coliphagen T7 enthält, transferiert und ausgehend vom lac-Promotor transkribiert. Vermutlich kann jeder Mikroorganismus, der die Fähigkeit besitzt, exogene DNA aufzunehmen und solche Gene und begleitende funktionelle Elemente zu exprimieren, ausgewählt werden. Es ist bevorzugt, daß der Wirtsmikroorganismus anaerob, fakultativ anaerob oder aerob ist. Bestimmte Wirte, die für eine Verwendung in diesem Verfahren bevorzugt sein können, umfassen Hefen und Bakterien. Spezielle Hefen umfassen solche der Gattung Saccharomyces und speziell Saccharomyces cerevisiae.
Spezielle Bakterien umfassen solche der Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas. Verschiedene weitere bevorzugte Wirte sind in der Tabelle I dargestellt, s.o. In weiteren, alternativ bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa als Wirtsmikroorganismen ausgewählt.
Nachdem ein Wirtsorganismus und Vektor ausgewählt worden ist, wird der Vektor unter Anwendung, Durchschnittsfachleuten allgemein bekannter Verfahren in den Wirtsorganismus transferiert. Beispiele für solche Verfahren können gefunden werden in Advanced Bacterial Genetics von R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980).
Es ist in einer Ausführungsform bevorzugt, daß die Transformation bei niedrigen Temperaturen stattfindet, da die Temperaturregulation als ein Mittel zum Regulieren der Genexpression unter Verwendung der nachstehend dargestellten, funktionellen Elemente angesehen wird. In einer weiteren Ausführungsform wäre, wenn Osmoregulatoren in den Vektor inseriert worden sind, die Regulation der Salzkonzentrationen während der Transformation eine Voraussetzung dafür, die geeignete Kontrolle der synthetischen Gene sicherzustellen.
Wenn ins Auge gefaßt wird, daß das rekombinante IGF-bindende Protein letztendlich in Hefe exprimiert werden wird, ist es bevorzugt, daß der Klonierungsvektor zuerst in Escherichia coli transferiert wird, worin der Vektor erhalten werden würde und woraus dieser nach der Amplifizierung gereinigt werden könnte. Der Vektor würde danach zum Zweck einer letztendlichen Expression des IGF-bindenden Proteins in Hefe transferiert werden.
Die Wirtsmikroorganismen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression des IGF-bindenden Proteins geeignet sind. Diese Bedingungen sind gewöhnlich spezifisch für den Wirtsorganismus und können auf einfache Weise durch Durchschnittsfachleute anhand der, die Wachstumsbedingungen solcher Mikroorganismen betreffenden, veröffentlichten Literatur, beispielsweise Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, bestimmt werden.
Jegliche Bedingungen, die für die Regulation der Expression der DNA-Sequenz benötigt werden, und die von den funktionellen Elementen abhangig sind, die in den Vektor inseriert werden oder in diesem vorhanden sind, würden bei den Transformations- und Kultivierungsstadien eingehalten werden. In einer Ausführungsform werden die Zellen bei geeigneten Regulationsbedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz hemmen, zu einer hohen Dichte kultiviert. Wenn die optimale Zelldichte erreicht ist, werden die Umgebungsbedingungen verändert, so daß sie für die Expression der übertragbaren DNA-Sequenz geeignet sind. Folglich wird vorausgesehen, daß die Herstellung des IGF-bindenden Proteins während einer Zeitdauer nach dem Wachstum der Wirtszellen zu einer nahezu optimalen Dichte stattfinden wird und daß das erzeugte IGF-bindende Protein einige Zeit, nachdem die für dessen Expression notwendigen Regulationsbedingungen geschaffen worden sind, geerntet werden wird.
In einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das rekombinante IGF-bindende Protein nach dem Ernten und vor dem Einnehmen der aktiven Struktur gereinigt. Diese Ausführungform ist bevorzugt, da die Erfinder glauben, daß die Gewinnung einer hohen Ausbeute des rückgefalteten Proteins erleichtert wird, wenn das Protein zuerst gereinigt wird. Jedoch läßt man in einer bevorzugten, alternativen Ausführungsform das IGF- bindende Protein vor der Reinigung rückfalten, damit es die native Struktur annimmt. In einer noch zusätzlichen, bevorzugten, alternativen Ausführungsform läßt man das IGF-bindende Protein nach der Gewinnung aus dem Kulturmedium dessen rückgefalteten Zustand einnehmen.
Unter gewissen Umständen wird das IGF-bindende Protein nach der Expression in dem Wirtsmikroorganismus und dem Transport des Proteins durch die Zellwand oder Membran oder in den periplasmatischen Raum seine korrekte, aktive Struktur einnehmen. Dies wird sich gewöhnlich ereignen, wenn die für eine geeignete Leader-Sequenz kodierende DNA mit der, für das rekombinante Protein kodierenden DNA verknüpft worden ist. Das bevorzugte, erfindungsgemäße IGF-bindende Protein wird nach der Translokation durch die innere Zellmembran seine reife, aktive Form einnehmen. Die Strukturen zahlreicher Signalpeptide sind veröffentlicht worden, beispielsweise von Marion E.E. Watson in Nuc. Acid Res., 12:515?-5164 (1984).
Es ist beabsichtigt, daß diese Leader-Sequenzen zusammen mit der übertragbaren DNA die intrazelluläre Produktion eines Fusionsproteins dirigieren wird, welches durch die Zellmembran transportiert und von welchem der Leader-Sequenzanteil nach dem Freisetzen aus der Zelle abgespalten werden wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Signalpeptid des Ompa-Proteins von E. coli als Leader-Sequenz verwendet und in eine Position benachbart zu der, für das IGF-bindende Strukturprotein kodierenden, übertragbaren DNA-Sequenz gebracht.
Weiterhin umfassen bevorzugte Leader-Sequenzen solche der β- Lactamase, der Carboxypeptidase G2 und des humanen Signalproteins. Diese und weitere Leader-Sequenzen sind beschrieben.
Wenn das IGF-bindende Protein nicht seine korrekte Struktur einnimmt, werden zuerst jegliche Disulfidbindungen, die sich gebildet haben, und/oder jegliche nicht-kovalenten Wechselwirkungen, die stattgefunden haben, mittels Denaturierungs- und Reduktionsmitteln, wie beispielsweise Guanidiniumchlorid und β-Mercaptoethanol, zerstört werden, bevor man das IGF-bindende Protein nach einer Verdünnung und Oxidation dieser Mittel unter kontrollierten Bedingungen seine aktive Struktur einnehmen läßt.
Die hierin ins Auge gefaßten Transkriptionsterminatoren dienen dazu, den Vektor zu stabilisieren. Insbesondere werden fur eine erfindunsgemäße Verwendung solche Sequenzen ins Auge gefaßt, wie sie von Gentz et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4936-4940 (1981) beschrieben sind.

II. Expression von Genen für das IGF-bindende Protein in tierischen Zellen

Verfahren für die Expression des IGF-bindenden Proteins in höheren Eukaryontenzellen, die vergleichbar mit den vorstehend erwähnten Verfahren sind, werden in Beispiel 6 dargestellt.
Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene, gegenwärtig bevorzugte, erfindungsgemäße Ausführungsformen.

BEISPIELE

BEISPIEL 1 - Proteinpräparation

A. Materialien

Humane Amnionflüssigkeit wurde von nicht mehr gebrauchten Amniozentese-Proben erhalten. Ammoniumsulfat und Natriumchlorid wurden von EM Sciences, Cherry Hill, NJ, gekauft. DEAE- Zellulose, Ammoniumpersulfat, Natriumthiocyanat, Sephadex G- 100, Polyethylenglykol (MG 8000) und Ammoniumcarbonat wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., gekauft. Phenylsepharose CL-4-B wurde von Pharmacia, Piscataway, NJ, gekauft. DEAE- Zellulose wurde von Whatman und die C-4-Umkehrphasen-HPLC-Säule von Vydac, Hesperia, CA, erhalten. Acetonitril, Gel Code - Silberfärbungskit und Trifluoressigsäure wurden von Pierce Chemical Co., Rockville, IL, gekauft. Tris, SDS und TEMED wurden von Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, erhalten. Glycin, Bromphenolblau, Servalyt isolelektrische Fokussierung Precotes und Glycerin wurden von Serva, Heidelberg, Deutschland, erhalten. Gewebekulturplatten wurden von Falcon Labware Division, Becton Dickinson, Oxnard, CA, gekauft.

B. Reinigung des stimulierenden und hemmenden IGF- bindenden Proteins aus Amnionflüssigkeit

Unbehandelte Amnionflüssigkeit (230 ml) wurde mit Ammoniumsulfat (33% Gew./VOL.) durch die Zugabe von 45 g equilibriert, und die Lösung wurde für 30 min bei 8ºC gerührt. Die Mischung wurde bei 27000 x g für 20 min zentrifugiert; danach wurde das Pellet in 50 ml 0,05 M Tris-HCl pH 7,4 rekonstituiert. Diese Lösung wurde auf 50% Ammoniumsulfat eingestellt, für 30 min gerührt, und der Zentrifugationsschritt wurde wiederholt. Das Pellet wurde in 50 ml 0,05 M Tris pH 7,4 resuspendiert, und 1,2 ml gesättigtes Ammoniumsulfat wurde zugefügt, um eine Endkonzentration von 0,14 M zu erreichen. Diese Lösung wurde auf eine Phenylsepharosesäule (2,2 x 15,0 cm), die zuvor mit 0,05 M Tris pH 7,4 in 10% Ammoniumsulfat equilibriert worden war, aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit dem Auftragungspuffer so lange gewaschen, bis die Absorption (280 nm) wieder die Grundlinie erreichte. Die Säule wurde mit Salz- Stufengradienten eluiert, enthaltend (1) 0,05 M Tris, pH 7,4, 0,5 M Natriumthiocyanat, pH 7,4; (2) 0,05 M Tris, pH 7,4; (3) 0,02 M Tris, pH 9,0; und (4) HO. Jede Fraktion wurde auf IGF- I-Bindungsaktivität, wie nachstehend in Beispiel I.F. beschrieben, getestet. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, der pH auf 7,2 mit 1,0 M Essigsäure eingestellt, und die Lösung direkt auf eine DEAE-Zellulosesäule aufgetragen, die mit 0,01 M (NH&sub4;)CO&sub3;, 0,01 M NaCl, pH 7,2, equilibriert worden war. Nachdem die Probe aufgetragen worden war, wurde die Säule ausgiebig mit dem Equilibrierungspuffer gewaschen, bis die Absorption (280 nm) wieder die Grundlinie erreichte. Die Säule wurde mit Salz-Stufengradienten eluiert, enthaltend 0,1, 0,25 und 0,5 und 1,0 M NaCl im Auftragungspuffer. Die Fraktionen wurden, wie beschrieben, auf IGF-Bindungsaktivität getestet. Mehr als 80% der Aktivität eluierte mit 100 oder 250 mM NaCl. Diese beiden Peaks, genannt B und C, wurden getrennt gereinigt. 1,5 ml des Peak B-Pools wurden auf eine C-4-Vydac-Umkehrphasen-HPLC-Säule (0,46 x 25 cm), die mit 0,04% TFA equilibriert worden war, aufgetragen. Die mobile Phase wurde für 5 Minuten isokratisch laufengelassen; danach wurde ein linearer Gradient von 0-100% Acetonitril plus 0,04% TFA über 25 Minuten laufengelassen. Die IGF-Bindungsproteinaktivität jeder Fraktion wurde bestimmt, und die aktiven Fraktionen vereinigt und bei -20ºC gelagert.
Der Pool C von der Ionenaustauschsäule wurde zuerst durch Sephadex G-100-Säulenchromatographie gereinigt. 10 ml vom Pool C wurden auf eine 2,2 x 90 cm-Säule, die mit 0,01 M (NH&sub4;)CO&sub3;, 0,05 M NaCl, pH 7,2 equlibriert worden war, aufgetragen, und ungefähr 9 ml enthaltende Fraktionen wurden gesammelt. Die IGF- I-Bindungsaktivität wurde bestimmt, und der aktive Fraktionspool direkt auf die C-4-Umkehrphasensäule, wie vorher ausgeführt, aufgetragen.

C. Physikochemische Analysen

Die Reinheit der beiden Peaks B und C wurde durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Das Trennungsgel enthielt 12% Acrylamid, enthaltend 0,375 M Tris, pH 8,8, und das Sammelgel enthielt 4% Acrylamid in 0,125 M Tris, pH 6,8. 0,1-10 µg der Probe wurden zu 75 µl in 0,1 M Tris, pH 6,8, 10% Glycerin, 5% SDS und 0,02% Bromphenolblau verdünnt, und die Proben wurden für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt. Die Überstände wurden von Feststoffen befreit, die Gelspuren geladen, und die Proteine wurden bei 65 Volt für 14 Stunden getrennt. Eine Silberfärbung wurde unter Verwendung des Gelcode -Silberfärbungskits durchgeführt. Die untere Nachweisgrenze dieser Technik war 25 ng, wie unter Verwendung bekannter Proteinstandards bestimmt wurde. Die Gele wurden für 5 Stunden in 50% Ethanol, 5% Eisessig fixiert und danach über eine Zeitdauer von 4 Stunden dadurch gewaschen, daß entionisiertes Wasser viermal gewechselt wurde. Das Wasser vom letzten Waschschritt wurde für 60 Minuten unter sanftem Schütteln durch die Silberlösung (20 ml Silberkonzentrat plus 280 ml Wasser) ersetzt. Nach einer kurzen Spülung mit HO wurde die Reduktionslösung, enthaltend Reduktionsaldehyd plus Reduktionsbase (unmittelbar vor der Verwendung gemischt), zugefügt und für 8-10 Minuten sanft schüttelngelassen, bis Proteinbanden einer ausreichenden Intensität beobachtet wurden. Die Reduktionslösung wurde ersetzt durch drei aufeinanderfol-gende 30-minütige Waschschritte mit der Stabilisatorlösung, enthaltend 20 ml Stabilisatorbase plus 880 ml HO.

D. Aminosäurezusammensetzung und Sequenzanalyse

500 ng eines jeden Proteins wurden unter 6N HCl, enthaltend 0,1% Phenol, für eine Stunde bei 150ºC im Vakuum lyophilisiert. Die Aminosäuren wurden mit Phenylisothiocyanat derivatisiert, und die markierten Aminosäuren unter Verwendung einer NovaPak- C18-Umkehrphasensäule getrennt. Die Bestimmung der Aminosäuresequenz ist in Beispiel 3 beschrieben.

E. Bestimmung des Kohlenhydratgehalts

Um zu bestimmen, ob entweder der Peak B oder C Kohlenhydrate enthielt, wurden 5,0 µg von jedem Peak auf ein 12% SDS- Polyacrylamidgel geladen und für 14 Stunden, wie früher beschrieben, aufgetrennt. Fetuin wurde als Standard parallel laufengelassen. Das Gel wurde mit 10% Essigsäure/25% Isopropanol fixiert. Das Gel wurde danach aufeinanderfolgend gewaschen mit (1) 0,5% Perjodsäure; (2) 0,5% Natriumarsenit; (3) 0,1% Natriumarsenit, 5% Essigsäure; (4) 5% Essigsäure; (5) Schiff'sches Reagenz; und (6) 0,6% Natriummetabisulfit/0,01 M HCl, und für 2 Stunden gefärbt.
Um weiterhin zu bestimmen, ob entweder der Peak B oder der Peak C Kohlenhydrate enthielt, wurden 2,0 µg von jedem Protein auf eine Concanavalin-A-Sepharose-Säule, die in 0,02 M Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl und 2 mM MgCl equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde langsam über 2 Stunden hinweg geladen und für 45 Minuten bei 22ºC stehengelassen. Die Säule wurde weiterhin mit 20 ml Ausgangspuffer gewaschen, und danach wurden die Glykoproteine mit 10 ml 0,02 M Tris, pH 7,5, enthaltend 0,5 M Methyl-D-Mannosid und 0,1 M NaCl, eluiert. Nach einer Stunde wurde die Säule eluiert. Die Säule wurde danach mit derselben Lösung wieder gefüllt und über Nacht bei 8ºC stehengelassen und danach eluiert. Die Säule wurde mit 0,02 M Tris, pH 7,5, enthaltend 0,5 M Methyl-D-Mannosid und 1 M NaCl, weiter eluiert, und die Fraktionen wurden, wie früher beschrieben, auf IGF- Bindungsaktivität getestet.

F. ¹²&sup5;I-IGF-I-Bindungskapazität

Die IGF-I-Bindungsaktivität der Säulenfraktionen wurde wie folgt bestimmt: 10 µl von jeder Fraktion wurden mit 40000 cpm ¹²&sup5;I-IGF-I (150 µCi/µg) für 60 Minuten bei 22ºC in 0,1 M Hepes, 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100, 44 mM NaHCO&sub3;, 0,02% NaN&sub3;, pH 6,0 (250 µl Gesamtvolumen) inkubiert. Das IGF-I wurde jodiert, wie beschrieben von E'Ercole, A.J., Underwood, L. E., Van Wyk, J.J., Decedue, C.J., und Foushee, D.B. (1976) in Growth Hormone and Related Peptides (Pecili, A., und Mueller, E.E., Herausgeber) S. 190-201, Excerpta Medica, Amsterdam.
Gebundenes und ¹²&sup5;I-IGF-I wurden durch Zugabe von 1% Immunserumglobulin und 500 µl 25%-iges Polyethylenglykol (MG 8000) zu einer Endkonzentration von 12,5% getrennt. Die Mischung wurde bei 8000 x g für 10 Minuten zentrifugiert; danach wurde das Pellet mit 6,25% gewaschen und das letzte Pellet in einem Gamma-Spektrometer gezählt. Jeder Pool aktiver Fraktionen wurde bei mehreren Konzentrationen nochmals untersucht und die Bindungskapazität mit einem Standard einer humanen Amnionflüssigkeit verglichen. Die Daten wurden verwendet, um jedem Pool einen Einheitenwert zuzuordnen. Eine Einheit war die Menge an Material, die notwendig war, um eine halbmaximale IGF-I-Bindung zu erreichen.
Um die Bindungskapazität und die Affinität von reinem IGF- Bindungsprotein für IGF-I zu bestimmen, wurde radioaktiv markiertes IGF-I (40000 cpm/Röhrchen) mit 10 ng/ml von jedem Bindungsprotein und ansteigenden Konzentrationen an unmarkiertem IGF-I in 0,5 ml 0,02 M Phosphatpuffer, pH 7,4, inkubiert. Nach 48 Stunden bei 4ºC wurden das gebundene und freie ¹²&sup5;I-IGF-I durch Zufügen einer 1:1000-Verdünnung eines Kaninchenantikörpers gegen das Bindungsprotein getrennt, und die Inkubation wurde für 12 Stunden vorgesetzt. Zu dieser Zeit wurden 2 µl Ziege-anti-Kaninchen-Serum zugefügt, und die Mischung für eine Stunde bei 22ºC inkubiert; danach wurden 2 µl normales Kaninchenserum zugefügt, und die Mischung für eine weitere Stunde inkubiert. Der gebundene und freie Wachstumsfaktor wurde durch Zentrifugation bei 8000 x g für 10 Minuten getrennt.

G. Bestimmung des ³H-Thymidineinbaus in DNA

Die biologische Aktivität von reinem Peak B- und C-Material wurde dadurch bewertet, daß die Fähigkeit von beiden bestimmt wurde, die DNA-Synthese in glatten Aortamuskelzellen vom Schwein zu stimulieren. Die glatten Muskelzellen wurden isoliert und in Stammkulturen gehalten, wie beschrieben von Ross, R. (1971) J. Cell. Biol. 50; 172-186.
Zellen von den Stammkulturen wurden in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon 3004) dadurch subkultiviert, daß sie zu 3000 Zellen/Vertiefung in DMEM (Gibco), enthaltend 10% fötales Rinderserum, ausplattiert wurden. 5 Tage nach dem Ausplattieren wurden die Wände einmal mit Serum-freiem DMEM gewaschen; danach wurde der Testfaktor zu jeder Vertiefung in 0,2 ml DMEM, ergänzt mit 1% plättchenarmem Plasma (PPP) und 0,5 µCi ³H- Thymidin zugefügt. PPP wurde, wie von Clemmons, D.R. (1983) J. Cell. Physiol. 114, 61-67 beschrieben, hergestellt.
Nach 36-stündiger Inkubation wurden die Vertiefungen zweimal mit Ringer's Bicarbonat, zweimal mit 5% TCA (4ºC) gewaschen; danach wurde die DNA zweimal mit 0,4 ml 0,3 N NaOH extrahiert, und der ³H-Thymidineinbau durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.

H. Isoelektrische Fokussierung

Um ihre isoelektrischen Punkte zu bestimmen, wurden 2,5 µg der Peak B- und C-Proteine auf vorgefertigte Platten für eine isoelektrische Fokussierung, pH 3-10, (Servalyt Precotes ) aufgetragen, und 20 µg eines bekannten Standards wurden in einer parallelen Spur laufengelassen. Die Proteine wurden für 1 1/2 Stunden bei 200 Volt, danach 1 1/2 Stunden bei 1000 Volt elektrofokussiert. Die Gele wurden in zwei Abschnitte geteilt und die eine Hälfte mit 10% TCA fixiert und danach mit Coumassie-Blau gefärbt. Die andere Hälfte wurde in 0,5 cm- Abschnitte geschnitten und mit 0,04% TFA eluiert. Die Eluate wurden auf IGF-Bindungsaktivität, wie früher beschrieben, getestet.

I. Merkmale des IGF-bindenden Proteins

Eine Ammoniumsulfatpräzipitation von 230 ml Amnionflüssigkeit führte zu einer Gewinnung von IGF-Bindungsaktivität sowohl in den 33- als auch 50%-Pellets. Der Großteil der Aktivität war im 50%-Pellet vorhanden, weshalb dieses für eine weitere Reinigung ausgewählt wurde. Während der Phenylsepharose-Chromatographie eluierte der größte Anteil an kontaminierenden Proteinen mit 0,05 M Natriumthiocyanat. Der das IGF-bindende Protein enthaltende Peak eluierte mit 0,02 M Tris, pH 9,0 und ist 9,5-fach gereinigt worden. Die weitere Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie führte zur Trennung zweier Haupt- Bindungsaktivitätspeaks, die bei 100 und 250 mM Salz eluierten. Diese Peaks (genannt Peaks B und C) wurden getrennt weiter gereinigt. Peak C-Material wurde durch Sephadex G-100- Chromatographie gereinigt. Die Bindungsproteinaktivität eluierte über einen breiten Peak, wurde jedoch von Kontaminanten mit größerem Molekulargewicht getrennt. 60 µg G-100-gereinigtes Material wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C-4-Säule gereinigt. Das aktive Material wurde als ein einzelner Peak bei 50% Acetonitril eluiert und war in diesem Puffer bis zu 3 Monate lang während der Lagerung stabil. Der Peak B wurde durch dasselbe Verfahren wie C unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC gereinigt, und dieser Schritt führte zu einer 9,4-fachen Reinigung.
Um die Reinheit zu bestimmen und das Molekulargewicht von beiden Proteinen abzuschätzen, wurde das Peak C-Protein bei jeder Reinigungsstufe einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen und nachfolgender Silberfärbung ausgesetzt. Das reine Produkt besitzt ein Molekulargewicht von 34 Kd und erscheint als einzelne Bande nach dem letzten Reinigungsschritt. Der Phenylsepharoseschritt schien das wirksamste Verfahren zum Entfernen der kontaminierenden Proteine zu sein. Ein Vergleich des Peaks B und des Peaks C zeigte, daß beide identische Rf-Werte bei der SDS-PAGE besaßen. Die Schätzungen für die Molekulargewichte ergaben 36 kd unter nicht- reduzierenden Bedingungen, jedoch stiegen diese auf 38 kd an, wenn die Proteine vor der Elektrophorese reduziert wurden. Bei der Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung des Peaks B und C wurden fast identische Aminosäureverhältnisse, wie in Tabelle II dargestellt, erhalten. Tabelle II Aminosäurezusammensetzung des IGF-I-bindenden Proteins Aminosäure Mol-% Peak Asparaginsäure und Asparagin Glutaminsäure und Glutamin Serin Glycin Histidin Arginin Threonin Manin Prolin Tyrosin Valin Methionin Cystein Isoleucin Leucin Phenylalanin Lysin Tryptophanb a. auf der Grundlage der Gewinnung des Cysteinstandards nach Hydrolyse. b. Tryptophan ist nach Hydrolyse nicht nachweisbar.
Die Reduktion und Alkylierung des Peaks B bei der Aminosäuresequenzierung zeigte die folgende N-terminale, in Beispiel 3 dargestellte Sequenz. Beide Proteine waren nach 10-minütigem Erhitzen auf 100ºC und gegenüber pH 2,5 stabil, jedoch wurde die IGF-Bindungsaktivität bei pH 2,0 zerstört.
Weitere physikochemische Analysen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Kohlenhydratseitenketten vorhanden waren, weil bemerkt worden war, daß reine Präparationen des Peaks B oder C an Concanavalin A anhafteten. Wenn 2 µg des jeweilige Proteins auf eine con A-Säule aufgetragen wurde, adhärierten 51% des Peaks C und eluierten mit 0,5 M α-Methylmannosid, während nur 24% des Peaks B adhärent waren. Wenn hingegen 20 µg von entweder Peak B oder C mit Schiff'scher Base gefärbt wurden, konnte kein Kohlenhydrat bei beiden Proteinen nachgewiesen werden. Auf der Grundlage der Färbungsintensität eines Fetuinstandards enthielten die Proteine weniger als 0,8% ihres Gewichts als Kohlenhydrat.
Um die Affinität der jeweiligen Proteine für IGF-I zu bestimmen, wurden steigende Konzentrationen an unmarkiertem IGF-I und ¹²&sup5;I-IGF-I mit dem Peak B oder C inkubiert, und die gebundenen Komplexe wurden immunpräzipitiert. Die Daten wurden unter Anwendung von Scatchard-Plots analysiert. Beide Proteine besitzen Bindungsmerkmale, die mit entweder einem Zwei-Bindungsstellen- Modell mit Bindungsstellen hoher und niedriger Affinität oder mit einem Ein-Bindungsstellen-Modell mit negativer Kooperativität übereinstimmen. Die relativen Affinitäten der Stellen mit hoher Affinität der Peak B- und C-Proteine waren sehr ähnlich: 1,06 bzw. 1,1 x 10¹&sup0; L/M.
Es wurde gefunden, daß die Peak B- und C-Materialien trotz ihrer physikochemischen Ähnlichkeit bemerkenswert verschiedene, biologische Eigenschaften aufweisen. Reines Peak B-Material verstärkte sehr die DNA-Syntheseantwort glatter Muskelzellen auf IGF-I, übte jedoch allein oder mit einer äquivalenten Konzentration an humanem Insulin keine Wirkung aus. Dagegen hemmte das Peak C-Material den basalen und IGF-I-stimulierten ³H-Thymidineinbau und hemmte deutlich die Antwort auf Peak B plus IGF-I. Diese Wirkung war bei so geringen Konzentrationen, wie 1,0 ng/ml Peak C, nachweisbar und maximal bei 20 ng/ml. Daher sind anscheinend zwei Formen des IGF-bindenden Proteins in humaner Amnionflüssigkeit vorhanden, die beträchtlich unterschiedliche, biologische Eigenschaften aufweisen, wenn sie in einem biologischen System getestet werden.

BEISPIEL 2 - Verstärkung von IGF-I durch das IGF-bindende Protein

1. Zellkulturtechniken

Glatte Aortamuskelzellen vom Schwein wurden isoliert, wie von Ross (1971), vorstehend zitiert, beschrieben. Stammkulturen wurden zu 8000 Zellen/cm² in 10 cm-Plastikschalen (Falcon Labware Division, Becton Dickinson, Oxnard, CA 3001) ausplattiert. Die Stammkulturen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagles- Medium (DMEM) (Grand Island Biological Co., Grand Island, NY) (Gibco) gehalten, das ergänzt wurde mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Hydone Labs, Ogden, UT). Sie wurden alle 10 bis 12 Tage dadurch passagiert, daß die Zellen mit Trypsin 0,03%, EDTA 0,02% (Gibco) entfernt und zu einer 1:5-Verdünnung wieder ausplattiert wurden.
Alle Experimente wurden unter Verwendung von Zellen zwischen der 4. und 7. Passage durchgeführt. Die einzelnen Experimente wurden unter Verwendung von Kulturen durchgeführt, die zu 8000 Zellen/Vertiefung in Mikrotestplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon Nr. 3004) in 0,2 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS, ausplattiert und für 5 Tage kultiviert worden waren. Das Serumenthaltende Medium wurde dann entfernt, und die Testsubstanzen wurden zu 0,2 ml DMEM, ergänzt mit 1% humanem plättchenarmen Plasma (PPP) und 0,5 µCi ³H-Thymidin (15 Ci/mmol) (Schwartz- Mann, Orangeburg, NY) zugefügt. Kontrolivertiefungen erhielten DMEM, enthaltend entweder 1% PPP oder verschiedene Konzentrationen an humanem Serum 1-10%. Das PPP und Serum wurden, wie von Clemmons, D.R. (1983) J. Cell Physiol. 114:61-67 beschrieben, hergestellt. Es wurde durch RIA bestimmt, daß das PPP ungefähr 20 pg/ml Plättchenfaktor 4 enthielt. Nach einer 36- stündigen Inkubation wurde die Reaktion gestoppt, und die Menge an ³H-Tyhmidin, das in die DNA eingebaut worden war, durch das Verfahren von Clemmons, D.R. (1983) J. Cell Physiol. 114:61-67 bestimmt.
Hühnerembryo-Fibroblasten wurden von 14-16 Tage alter Hühnerembryohaut isoliert. Die primären Explantate wurden in Medium 199 (Gibco), ergänzt mit 4% FBS (Hyclone), 10% Hühnerserum, Penicillin 100 Einheiten/ml und Streptomycin 100 µg/ml (Gibco), ausplattiert. Die Zellen, die aus den Explantaten wuchsen, wurden einmal passagiert und danach auf Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon Nr. 3004) zu 3000 Zellen/Vertiefung in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, subkultiviert. Nach fünf Tagen wurden die einschichtig gewachsenen Zellen gewaschen, und die Testfaktoren mit 0,2 ml DMEM, enthaltend 0,5 µCi ³H-Thymidin und 1% PPP, zugefügt; danach wurde der ³H-Thymidineinbau nach einer 36- stündigen Inkubation, wie früher beschrieben, bestimmt. Mausembryo-Fibroblasten wurden von 18 Tage alten fötalen Balb/c- Mäusen (Haut) erhalten und in DMEM, ergänzt mit 10% FBS, 10 mM Glutamin (Sigma, St. Louis, MO) und Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 100 µg/ml (Gibco), kultiviert. Kulturen zwischen der 3. und 5. Passage wurden für alle Experimente verwendet.
Humane Fibroblasten wurden vom Human Mutant Genetic Cell Repository (Camden, NJ) gekauft. Sie wurden in Stammkulturen in essentiellem Minimalmedium (MEM) (Gibco), ergänzt mit 1000 Einheiten/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 10% Rinderserum (Colorado Serum Co., Denver, CO) gehalten. Sie wurden alle sieben Tage unter Anwendung eines Passagenverdünnungsverhältnisses von 1:4 passagiert. Kulturen zwischen der 4. und 5. Passage wurden zu einer Dichte von 8000 Zellen/Vertiefung auf Mikrotestplatten zur Verwendung in den einzelnen Experimenten ausplattiert. Nach fünf Tagen wurden die Kulturen zweimal mit MEM gewaschen; danach wurden 0,2 ml MEM, enthaltend 1% PPP, 0,5 µCi ³H-Thymidin und die Testsubstanzen zugefügt; dann wurde der ³H-Thymidineinbau nach 36 Stunden, wie früher beschrieben, bestimmt.
Um zu bestimmen, ob das Bindungsprotein die Zellwachstumsantwort auf IGF-I verstärken konnte, wurden humane Fibroblasten oder glatte Muskelzellen zu Dichten von 15000 Zellen/cm² in Platten mit 24 Vertiefungen (Falcon Nr. 3003), enthaltend 1,0 ml DMEM plus 10% FBS (glatter Muskel) oder MEM plus 10% Kälberserum (Fibroblasten) ausplattiert. Nach 2 Stunden, in denen man die Zellen anhaften ließ, wurde das Medium abgesaugt und 1,0 ml Medium, enthaltend 1% PPP, zugefügt. Nach 12- stündiger Inkubation, während der die Zellen in den Ruhezustand übergingen, wurde das Medium entfernt und durch 1,0 ml MEM, enthaltend 1% PPP und die Testsubstanzen, ersetzt. Nach einer 48-stündigen Inkubation wurden die Kulturen 1,0 ml 0,5% Trypsin, 0,03% EDTA für 10 Minuten bei 37ºC ausgesetzt. Dies wurde entfernt und zu 9,0 ml 0,15 mM NaCl zugefügt, und die Zellzahl wurde unter Verwendung eines Partikelzählers (Coulter, Modell ZBI) bestimmt.
Das Bindungsprotein, das in Beispiel 1 aus humaner Amnionflüssigkeit gereinigt worden war, wurde mit ruhenden Kulturen von glatten Aortamuskelzellen des Schweins inkubiert. Dieser Zelltyp wurde ausgewählt, weil er kein IGF-bindendes Protein besitzt, das an die Zelloberfläche adhäriert. Die Zugabe des IGF- bindenden Proteins allein führte zu einer minimalen Stimulierung des ³H-Thymidineinbaus (Figur 1A). Die Zugabe von IGF-I (20 ng/ml) oder Insulin (10 µg/ml) führte nur zu einer 15- bzw. 38%-igen Steigerung des ³H-Thymidineinbaus. Dagegen führte die Zugabe von IGF-I (20 ng/ml) plus reines Bindungsprotein (100 ng/ml) zu einer 4,4-fachen Stimulierung, die die zelluläre Antwort auf 10% fötales Rinderserum überstieg. Bei Konzentrationen von 10 µg/ml bindet Insulin an den IGF-Rezeptor vom Typ 1, jedoch nicht an das Bindungsprotein. Wenn diese Insulinkonzentrationen zusammen mit dem Bindungsprotein zugefügt wurden, gab es keine Verstärkung der zellulären Replikationsantwort, was andeutet, daß die Aktivierung der Bindungsproteinwirkung spezifisch für IGF war.
Um zu bestimmen, ob Zelltypen verschiedener Arten auf das IGF- bindende Protein in einer ähnlichen Weise antworten können, wurde die Wirkung dieses Proteins plus IGF-I unter Verwendung von Hühner- und Mausembryo-Fibroblastenkulturen getestet. Diese Zelltypen wurden ausgewählt, da Hühnerzellen kein IGF-bindendes Protein synthetisieren, jedoch IGF-Rezeptoren vom Typ I besitzen. Die Mauszellen sezernieren eine unterschiedliche Form des IGF-bindenden Proteins (geschätztes MG 22 kd), und keiner der Zelltypen besitzt ein IGF-bindendes Protein, was nur zu minimalen Veränderungen des ³H-Thymidineinbaus in jedem Zelltyp führt (Figuren 1B und C). Dagegen zeigte die Zugabe von 100 ng/ml des Bindungsproteins plus IGF-I eine beträchtliche Steigerung der zellulären Antwort auf IGF-I. Die Hühnerfibroblasten waren besonders empfindlich und erreichen 81% der maximalen Antwort, die durch 10% humanes Serum mit nur 5 ng/ml IGF-I induziert wird (Figur 1B). Die Mausfibroblasten waren ebenso empfindlich gegenüber den Wirkungen der Coinkubation des IGF-bindenden Proteins und IGF-I (Figur 1C). Keiner der Zelltypen reagierte auf Insulin plus IGF-bindendes Protein, was anzeigt, daß der Komplex aus Bindungsprotein und IGF-I sich ausbilden mußte, um die maximale Stimulierung des ³H-Thymidineinbaus zu erreichen.
Um zu bestimmen, ob humane Fibroblasten, ein Zelltyp, der das IGF-bindende Protein synthetisiert, auch auf exogen zugegebenes Peptid reagieren konnte, wurden ruhende, humane Fibroblastenkulturen, wie in Figur 2 beschrieben, hergestellt. Die Zugabe steigender Konzentrationen an IGF-I führte zu einem Anstieg des ³H-Thymidineinbaus in die DNA, der bei 20 ng/ml maximal und um 82% höher im Vergleich zu Kontrollkulturen, die nur 1% PPP ausgesetzt waren, war. Die verstärkte Antwort auf IGF-I allein, verglichen mit Hühner- oder Mausfibroblasten, kann begründet sein durch endogen sezerniertes IGF-bindendes Protein. Die Zugabe von IGF-bindendem Protein allein führte zu keinem Anstieg der DNA-Synthese. Wenn jedoch 100 ng/ml dieses Proteins mit ansteigenden Konzentrationen an IGF-I zugefügt wurden, wurde die DNA-Synthese zu einer Rate erhöht, die vergleichbar war mit einer Rate, die mit 10% humanem Serum erhalten wird. Die Erfinder haben auch bestimmt, daß diese Zellen das IGF-bindende Protein synthetisieren und ins Medium sezernieren, und daß dieses Protein an die Zelloberfläche adhärieren kann, wie beschrieben in Clemmons, D.R.J. Clin. Invest. 77:1548-1556 (1986). Jedoch sezernieren Fibroblasten nur eine Menge an Bindungsprotein, die ausreichend ist, um Medienkonzentrationen von 2-5 ng/ml zu erreichen, und da 50 ng/ml zu diesen Kulturen zugefügt wurden, ist dieser Unterschied wahrscheinlich für den zusätzlichen Anstieg des beobachteten ³H-Thymidineinbaus verantwortlich.
Um zu bestimmen, ob diese Antworten von der Konzentration des Bindungsproteins abhängig waren, wurden ansteigende Konzentrationen (1-100 ng/ml) des Bindungsproteins plus eine konstante Konzentration an IGF-I (10 ng/ml) mit Kulturen glatter Muskelzellen inkubiert. Die Kulturen reagierten auf 2 ng/ml Bindungsprotein mit einem signifikanten Anstieg des ³H-Thymidineinbaus, jedoch wurde die maximale Wirkung so lange nicht erhalten, bis 100 ng/ml verwendet wurden (Figur 2). Da kultivierte Fibroblasten Konzentrationen des IGF-bindenden Proteins im Bereich von 2-5 ng/ml sezernieren, deutet dieses Ergebnis an, daß die Fibroblasten wahrscheinlich keine ausreichende Menge des Bindungsproteins sezernieren, um die maximale DNA-Syntheseantwort zu erreichen.
Um zu bestimmen, ob die Zellen, die durch IGF-I plus Bindungsprotein stimuliert wurden, den gesamten Zellzyklus durchlaufen konnten, wurden glatte Muskelzellen und humane Fibroblasten zu einer niedrigen Dichte ausplattiert und durch Serumentzug in die Ruhephase überführt. Nach 12 Stunden wurden das Bindungsprotein und IGF-I oder Insulin zu den Testkulturen zugefügt und für 48 Stunden inkubiert, bevor die Zellzahl bestimmt wurde. Die Zugabe von IGF-I oder Insulin allein führte zu 3%- und 11%- igen Anstiegen der Anzahl glatter Muskelzellen, während das Bindungsprotein plus IGF-I (10 ng/ml) einen 2,4-fachen Anstieg bewirkte. Dieser Anstieg war größer als ein Anstieg, der durch 10% humanes Serum induziert werden kann (Figur 4A). Ähnliche Ergebnisse wurden mit humanen Fibroblasten erhalten, obwohl die Wirkung von IGF-I allein größer war (Figur 48). IGF-I allein führte zu einem 31%-igen Anstieg, während die Kombination des Bindungsproteins plus IGF-I einen 2,1-fachen Anstieg der Zellzahl nach 48 Stunden ergab.

BEISPIEL 3 - Sequenz des IGF-I-bindenden Proteins

1. Zwei Verfahren sind angewendet worden, um die Aminosäuresequenzen des aus Amnionflüssigkeit gereinigten, stimulierenden IGFBP zu bestimmen. Das Protein wurde bei 37ºC für eine Stunde in 0,01 M DTT reduziert und mit 0,11 M Jodessigsäure alkyliert. Das Produkt wurde unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC- Säule nochmals gereinigt. Im Verfahren 1 wurde das Protein von der Umkehrphasen-HPLC-Säule konzentriert und direkt auf das Filter des Gasphasensequenziergeräts 470A von Applied Biosystems aufgetragen. Im Verfahren 2 wurde das Protein für 12 Stunden einem Trypsinverdau (1/50 der Gewichtsmenge des Proteins) in 0,1 M Ammoniumcarbonat pH 8,0 ausgesetzt. Die tryptischen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC an C8- und C4- Säulen unter Verwendung von 0,1% TFA und Acetonitrilgradienten getrennt. Nach einer Konzentrierung in einer Speedvac wurden die Peptide auf Sequenziergeräte aufgetragen und gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert.
Die folgenden Sequenzen sind erhalten worden:
1. APWCAPCSAEKLAL (E oder S) PPVSASESCVTR (dies ist die N-terminale Sequenz)
2. WKEPCCIELYR
3. ALPGEQQPLHALTR
4. NGFYHSR
5. FYLPNCNK
6. GQGATVQESDASAP
7. VVESLAK
8. IPGSPEIR
9. ALHVTNIKK
Um diese Peptide überlappend aneinanderreihen zu können und um weitere Peptide zu erhalten, sollte das Protein mit anderen Proteasen, umfassend die Submaxilliarprotease (Arg-spezifisch), die Lys-C-Protease (Lys-spezifisch) und die V8-Protease (Glu- spezifisch), gespalten und die Peptide durch Umkehrphasen-HPLC fraktioniert und, wie vorstehend beschrieben, sequenziert werden.
2. Die Aminosäuresequenz des gereinigten, hemmenden IGFBP aus Amnionflüssigkeit (siehe Reinigung im vorstehenden Beispiel 1) und gereinigtes, stimulierendes IGFBP von GM10-Fibroblasten (siehe Reinigung im nachstehenden Beispiel 5) und weiteren Zell-konditionierten Medien können auf Art und Weisen erhalten werden, die analog zu denjenigen sind, die vorstehend für das stimulierende IGFBP aus Amnionflüssigkeit beschrieben worden sind.

BEISPIEL 4 - Isolierung der Gene für IGFBPSs

Unter Verwendung der Antikörper, die gegen das stimulierende IGFBP aus Amnionflüssigkeit hergestellt worden waren, sind eine Anzahl von Zellinien identifiziert worden, die IGFBPs herstellen. Diese Zellen umfassen die Linien GM10 und GM498 (Human Mutant Genetic Cell Repository, Camden, NJ), die Linie MDA 231 (American Type Culture Collection, 123012 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852-1776) und die Linie HEC-1B (A.T.C.C.). Um das Gen bzw. die Gene für IGFBPs von diesen Zellen zu isolieren, sollten diese zuerst in 10 150 mm-Platten in den von den Bezugsstellen vorgeschriebenen Medien bis zur Konfluenz kultiviert werden, und RNA sollte aus diesen Zellen unter Anwendung des NP-40-Lyseverfahrens isoliert werden (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrock, J. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 191-193). PolyA&spplus;-RNA kann durch Chromatographie an oligo dT-Zellulose gereinigt werden (Aviv, H. und Leder, P. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 1408-1412). 5 µg dieser DNA sollten verwendet werden, um doppelsträngige cDNA mit glatten Enden unter Anwendung des von Gubler und Hoffman beschrieben Verfahrens zu synthetisieren (Gubler, U. und Hoffman, B.J. (1983) Gene 25, 263- 269). EcoRI-Linker sollten angehängt, und die erhaltene cDNA in lambda gt11 kloniert werden (Young R.A. und Davis, R.W. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 80, 1194-1198.
Die erhaltene Bank, die mehr als 10&sup6; unabhängige Klone enthalten sollte, kann bei Verwendung von E. coli Y1090 mit einem geeigneten, polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen das, wie im Beispiel 1 beschrieben, gereinigte stimulierende IGFBP aus Amnionflüssigkeit unter Anwendung der von Young und Davis beschriebenen Screening-Bedingungen durchmustert werden. Positive Signale werden unter Verwendung eines alkalische Phosphatasekonjugierten zweiten Antikörpers (Ziege-anti-Kaninchen ProMega Biotec), wie vom Hersteller beschrieben, detektiert werden. Die Klone, die mit diesem Antikörper positiv reagieren, sollten danach mit drei gemischten Oligonukleotid-Sequenzproben auf der Grundlage der IGFBP-Aminosäuresequenz (vorstehend beschrieben) getestet werden. Die Probe Nr. 1 (ein 23-mer) ist eine Mischung aus 192 Sequenzen, die aus allen möglichen DNA-Sequenzen für die Aminosäuresequenz W K E P C C I E bestehen. Die Probe Nr. 2 (ein 17-mer) ist eine Mischung aus 64 Sequenzen, die aus allen möglichen DNA-Sequenzen für die Aminosäuresequenz W O C A P C bestehen. Die Probe Nr. 3 (ein 17-mer) ist eine Mischung aus 64 Sequenzen, die aus allen möglichen DNA-Sequenzen für die Aminosäuresequenz P G E Q Q P bestehen. Diese Sonden können mit einem DNA-Synthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert werden und sollten am 5'-Ende zu einer spezifischen Aktivität von 4-6 x 10&sup6; cpm/pmol unter Verwendung von [gamma-³²P]-ATP und T4-Polynukleotidkinase markiert werden. Die Klone, die mit dem Antikörper positiv reagieren, sollten ausplattiert und E. coli Y1088 und die DNA, wie beschrieben, auf Nitrozellulose überführt werden (Benton, W.D. und Davis, R.W. (1977) Science 196, 180-182.
Die Hybridisierung sollte in einem Hybridisierungspuffer durchgeführt werden, der 1,0 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat, 2X Denhardts-Lösung (Denhardt, D.T. (1966) Biochem. Biophs. Res. Commun. 23, 641-646), 0,1% SDS, 0,05% Natriumpyrophosphat und 150 mg/nl Hefe-tRNA enthält. Diese Filter sollten für 12-16 Stunden unter Verwendung von 0,4 pmol/ml Oligonukleotid bei einer Temperatur, die um 2ºC niedriger als der berechnete Tm für das am meisten AT-reiche Mitglied des jeweiligen Oligonukleotid-Pools ist, hybridisiert werden (Suggs, S.V. (1981) in Brown, D.D. und Fox, C.F. (Herausgeber), Developmental Biology Using Purified Genes, Academic Press, New York, S. 683-693). Diese Temperaturen sind wie folgt: Probe Nr. 1, 60ºC; Probe Nr. 2, 50ºC; Probe Nr. 3, 50ºC. Nach der Hybridisierung sollten die Filter für 45 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen werden, wobei eine Lösung aus 1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat und 0,1% SDS dreimal gewechselt werden sollte. Ein stringenter Waschschritt von 5 Minuten sollte beim berechneten Tm (d.h. 2ºC über der Hybridisierungstemperatur) für das am meisten AT-reiche Mitglied des jeweiligen Sondenpools durchgeführt werden. Die Filter sollten getrocknet und positive Signale durch Autoradiographie detektiert werden. Die Klone, die mit dem Antikörper positiv reagieren, und beide Sonden sollten in die M13-Sequenzierungsvektoren mp18 und mp19 (Yanisch-Perron, C., Vierira, J. und Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119 subkloniert und, wie beschrieben, sequenziert werden (Sanger, F. und Coulson, A.R. (1975) J. Mol. Biol. 94, 441-448).
Im Fall, daß beim ersten Teil des Bankendurchmusterns keine Antikörper-positiven Klone erhalten werden, sollte die gesamte Bank den vorstehend beschriebenen Oligonukleotid- Durchmusterungsverfahren ausgesetzt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Oligonukleotiden sollten weitere Oligonukleotide, die durch die anhand der gereinigten Proteine bestimmten Proteinsequenz angezeigt sind, verwendet werden (siehe Beispiele 1 und 5). Der Entwurf und die Synthese dieser Oligonukleotidsonden ist Durchschnittsfachleuten bekannt.
Außer Zellinien sollten natürliche, humane Gewebe als Quellen für die RNA, mit der eine cDNA-Bank hergestellt wird, in Betracht gezogen werden. Eine geeignete Gewebequelle ist die Dezidua des Uterus.
Ein Klon voller Länge wird dadurch charakterisiert sein, daß er ein offenes Leseraster, das für die Proteinsequenzen, die bekanntermaßen im IGFBP vorhanden sind, kodiert und Start- und Stoppkodons enthält. Wenn kein Klon voller Länge isoliert wird, kann dieser aus einem vollständigen Satz partieller Klone und geeigneten synthetischen DNAs durch Verfahren, die Durchschnittsfachleuten vertraut sind, zusammengebaut werden. Das Insert eines Klons mit voller Länge sollte in einen Expressionsvektor, wie in Beispiel 6 beschrieben, transferiert werden.

BEISPIEL 5 - Reinigung von IGFBP aus Fibroblasten

Konditioniertes Medium von den humanen Hautfibroblastenzellinien GM10 oder GM498 (Human Mutant Genetic Cell Repository, Camden, NJ) wird für 20 Minuten bei 20000 x g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Ammoniumsulfat wird zu dem Überstand zu einer Endkonzentration von 65% zugefügt und die Lösung für 30 Minuten bei 4ºC langsam gerührt. Das Pellet, das durch die 30-minütige Zentrifugation bei 20000 x g entsteht, wird mit 10 mM Ammoniumcarbonat, pH 7,2, enthaltend 0,5 M NaCl, extrahiert. Die Extrakte werden durch Chromatographie an im Extraktionspuffer equilibriertem Sephadex G-100 fraktioniert. Die IGF-I-Bindungsaktivität enthaltenden Fraktionen werden vereint und mit 65% Ammoniumsulfat nochmals präzipitiert.
Das Pellet, das bei der 30-minütigen Zentrifugation bei 20000 x g entsteht, wird mit 10 mM Ammoniumcarbonat, pH 6,5 extrahiert und mit destilliertem Wasser zu einer Leitfähigkeit, die 50 mM NaCl entspricht, verdünnt. Die Lösung wird zu einer Rate von 15 ml/Stunde auf eine Heparin-Sepharose-Säule, die zuvor mit 10 mM Ammoniumcarbonat, pH 6,5, und 50 mM NaCl equilibriert wurde, aufgetragen. Die Säule wird mit 3 Volumina Equilibrierungspuffer, enthaltend 1 M NaCl, und danach mit 3 Volumina Puffer, enthaltend 2 M NaCl, gewaschen. Die den Puffer mit 2 M NaCl enthaltende Säule wird über Nacht bei 4ºC stehengelassen und am Morgen noch einmal mit einem Volumen an 2 M NaCl eluiert. Die beiden 2 M NaCl-Waschlösungen werden vereinigt und gegen 10 mM Ammoniumcarbonat, pH 6,5, und 50 mM NaCl revers dialysiert.
Das Dialysat wird bei einer Fließrate von 15 ml/Stunde auf eine IGF-I-Affinitätssäule aufgetragen, die gemäß den Anweisungen des Herstellers aus 2 mg IGF-I und 3 ml Reactigel X (Pierce Chemical) hergestellt und mit 10 mM Ammoniumcarbonat, pH 6,5, 50 mM NaCl vorequilibriert worden war. Die Säule wird mit 5 Volumina Equilibrierungspuffer und danach mit 5 Volumina 10 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, 50 mM NaCl gewaschen. Die IGFBP- Aktivität wird danach mit 1 M Essigsäure eluiert.
Die aktiven Fraktionen werden auf eine Vydac C-4-Umkehrphasen- HPLC-Säule aufgetragen und mit 0,04%-iger wäßriger TFA für 5 Minuten bei einer Fließrate von 1 ml/min und danach durch einen linearen Acetonitrilgradienten bis 25% über eine Zeitdauer von 3 Minuten eluiert. Das Protein wird danach mit einem linearen Gradienten von 25% bis 100% Acetonitril über eine Zeitdauer von 30 Minuten eluiert, wobei es in der Nähe von 30% Acetonitril eluiert. Wenn das Protein in diesem Stadium nicht rein genug zum Sequenzieren ist, wird es in Wasser verdünnt und nochmals auf eine Vydac C-8-Säule aufgetragen. Es wird mit demselben Gradienten, der bei der C-4-Säule angewendet wurde, eluiert, wobei es bei ungefähr 50% Acetonitril eluiert.

BEISPIEL 6 Expression von Genen für IGFBP in tierischen Zellen

Um IGFBP in tierischen Zellen zu exprimieren, sollten die folgenden Schritte durchgeführt werden:
1. Konstruktion eines Expressionsvektors
2. Wahl einer Wirtszellinie
3. Einführung des Expressionsvektors in die Zellen
4. Expression von IGFBP.
1. Um einen IGFBP-Expressionsvektor zu konstruieren, der in vielen verschiedenen Zelltypen funktioniert, sollte folgendermaßen ein Plasmid konstruiert werden. pBR322 sollte mit EcoRI und EcoRV gespalten werden, und aus den überhängenden EcoRI- Enden sollten durch Behandlung mit Klenow-DNA-Polymerase in der Gegenwart von dATP und dTTP glatte Enden hergestellt werden. Das große Fragment sollte isoliert und an das 4 kb EcoRI- Fragment von pMK (Brinster et al. Cell 27, 223-231, 1981), welcher den MT1-Promotor und das Strukturgen für die Herpes simplex Typ 1-Thymidinkinase (HSV-1 tk) trägt und, wie vorstehend beschrieben, mit glatten Enden versehen wurde, ligiert werden. E. coli JM109 sollte mit der Ligierungsmischung transformiert werden, und Plasmid-DNA sollte von Ampicillin-resistenten, Tetracyclin-empfindlichen Transformanten hergestellt werden. Die DNA sollte durch Restriktionskartierung charakterisiert und ein Plasmid, das zu der in Figur 5 gezeichneten Struktur paßt, für die weitere Arbeit ausgewählt werden.
Die Bgl II-Stelle dieses Plasmids sollte dadurch in eine EcoRI- Stelle umgewandelt werden, daß die DNA mit Bgl II gespalten und ein geeignetes Stück synthetischer DNA, die eine EcoRI-Stelle enthält, unter Anwendung von Standardverfahren in die linearisierte DNA kloniert wird. Das entstehende Plasmid, pMK-SGE, sollte in E. coli amplifiziert, durch Standardverfahren wieder isoliert und mit EcoRI linearisiert werden.
IGFBP-cDNA voller Länge, die aus DNA von lambda gt11-Klonen durch Standardverfahren, welche die Spaltung der DNA mit EcoRI und Gelreinigung umfassen, isoliert wurde, sollte in die EcoRI- Stelle des vorstehend beschriebenen Plasmids pMK-SGE mit MT-1- Promotor ligiert werden. Nach dieser Ligierung und der Transformation von E. coli sollte ein Klon selektiert werden, in welchem die IGFBP-cDNA in derselben Orientierung wie der MT-1- Promotor vorliegt, wie durch Restriktionskartierung bestimmt werden kann. Plasmid-DNA sollte für die Transformation der tierischen Zellen hergestellt werden.
2. Da die aktiven IGFBPs bisher nicht charakterisierte, posttranslationale Modifikationen besitzen können, sollten die Gene in Zellen, die deren natürlichen Ursprungszellen so ähnlich wie möglich sind, exprimiert werden. Das durchzuführende Verfahren wird hier anhand des Gens für das stimulierende IGFBP aus Fibroblasten dargestellt. Ähnliche Verfahren sollten mit Genen für die anderen Proteine verfolgt werden, wenn einmal eine geeignete Produktionszellinie identifiziert worden ist. Bis zu diesem Zeitpunkt werden Fibroblasten genausogut als Produktionszellen für solche IGFBPs dienen.
3. Um den Expressionsvektor in Ltk-Zellen oder andere TK&supmin;- Fbroblastenlinien einzuführen, sollte der Expressionsvektor mit pHSV-106 Plasmid-DNA (Bethesda Research Labs) gemischt werden, welche das HSV-1 TK-Gen trägt. Die gemischten DNAs sollten unter Anwendung der Calciumphosphat-DNA-Standardpräzipitationstechniken (Graham, S.L. und von der Eb, A.J.(1973) Virology, Band 52:456-467) auf die Zellen aufgebracht werden. Stabile Transformanten können durch deren Fähigkeit, in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Medium zu wachsen, selektiert werden (M. Wigler et al. (1979) Cell 16:777- 785.
Um die IGFBP-Expressionsvektor-DNA in Fibroblasten, die nicht TK&supmin; sind, einzubringen, sollte diese mit einem Selektionsvektor, der dadurch hergestellt wird, daß der SV40-Promotor in pKSV-10 mit dem Neomycinresistenz (Aminoglykosid-3'- phosphotransferase)-Gen (Pharmacia) fusioniert wird, gemischt und in die Zellen, wie vorstehend beschrieben, cotransformiert wird. Stabile Transformanten können durch deren Fähigkeit, in der Gegenwart des Antibiotikums G418 zu wachsen, selektiert werden.
Ein drittes Verfahren zum Einführen des Expressionsvektors in Säugerzellen ist, den Expressionsvektor mit einem Plasmid, das ein funktionelles Dehydrofolatreduktase(DHFR)-Gen trägt, zu cotransformieren. Stabile Transformanten können dadurch selektiert werden, daß die Zellen in Methotrexat kultiviert werden. Dieses Verfahren ist besonders geeignet für eine stabile Transfektion von DHFR&supmin;-CHO-Zellen (F. McCormick et al., (1984) Mol. Cell. Biol. 4:166-172).
Um die Expression der IGFBP-Gene in den vorstehend erwähnten, stabil transformierten,tierischen Zellen zu induzieren, sollten die Zellen 10 mM Cadmiumsulfat im Wachstumsmedium ausgesetzt werden. Der MT-1-Promotor wird durch diese Behandlung induziert und sollte einen ungefähr 7-fachen Anstieg der Expression des IGFBP-Gens ergeben (Mayo, K.E., R. Warre und R.D. Palmiter 1982, Cell 29:99-108).
Um die Expression von IGFBP noch weiter zu steigern, sollte die Kopienanzahl der DNA für das stimulierende IGFBP durch eines der folgenden Verfahren amplifiziert werden. In dem Fall, in dem der Expressionsvektor mit dem TK-Gen cotransformiert wurde, sollte eine Amplifizierung dadurch erreicht werden, daß die Thymidinkonzentration im Medium vermindert oder Thymidin vollständig weggelassen wird. In dem Fall, in dem der Expressionsvektor durch Cotransformation mit dem DHFR-Gen in Zellen eingeführt wurde, solle die Amplifizierung des Gens dadurch erreicht werden, daß die Konzentration an Methotrexat im Medium erhöht wird (F. McCormick et al., (1984) Mol. Cell. Biol. 4:166-172.

BEISPIEL 7 - Reinigung von IGFBPs aus rekombinanten, tierischen Zellen

Da erwartet wird, daß die IGFBPs von den Zellen wie natürliches Material sezerniert wird, wird vorausgesehen, daß die vorstehend für die Reinigung des natürlichen Proteins beschriebenen Verfahren eine ähnliche Reinigung und Charakterisierung des rekombinanten Proteins erlauben werden.

BEISPIEL 8

Eine lambda gt11-cDNA-Bank wurde, wie vorstehend beschrieben, ausgehend von RNA aus humaner Uterus-Dezidua hergestellt und mit einem polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen das stimulierende Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-bindende Protein (IGFBP) durch das Verfahren von Young und Davis, wie im Beispiel 4 beschrieben, durchmustert. Der polyklonale Kaninchen-Antikörper war derjenige, der im Beispiel 1 beschrieben ist. Positive Signale wurden unter Verwendung eines alkalische Phosphatasekonjugierten, zweiten Antikörpers (Ziege-anti-Kaninchen, Pro Mega Biotec), wie vom Hersteller beschrieben, detektiert. Ungefähr 0,12% der Klone in der Bank erwiesen sich als positiv gegenüber dem Antikörper. Zwölf unabhängige Klone wurden gereinigt, und die Inserts wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese verglichen. Ein Klon mit einem Insert von ungefähr 1500 bp Länge wurde in beiden Orientierungen in den M13-Sequenzierungsvektor mp 18 subkloniert, und die Sequenz wurde durch das Verfahren von Sanger et al. bestimmt. Dieser Klon enthielt ein einzelnes offenes Leseraster von 776 bp, welcher für eine 24 Aminosäure lange Signalsequenz kodiert, worauf ein 233 Aminosäure langes Polypeptid folgt, das alle vorstehend beschriebenen Peptidsequenzen umfaßt. Die Sequenz ist bestimmt worden und in Figur 6 dargestellt.
Diese Sequenz enthält ein Tripeptid ArgGlyAsp. Dieses Tripeptid oder Peptide, die dieses Tripeptid und flankierende Reste der IGFBP-Sequenz enthalten, können dazu dienen, die Anhaftung des IGFBP an die Zelle oder Matrix und dadurch dessen stimulierende Wirkung auf das IGF-I-induzierte Zellwachstum zu verhindern.

BEISPIEL 9

Expression des IGFBP-Gens in prokaryontischen (E. coli)- Zellen und Isolierung des biologisch aktiven IGFBP aus diesen

A. Herstellung des Expressionsvektors für IGFBP

Die IGFBP-cDNA ist in den T7-RNA-Polymerase-abhängigen E. coli- Expressionsvektor pJU1003 durch die folgenden Schritte, wie in Figur 7 dargestellt, kloniert worden.
1. Das Plasmid pJU1003 wurde mit den Restriktionsenzymen Bam-HI und EcoRI gespalten und das große, lineare Vektorfragment durch Standardgelverfahren gereinigt.
2. Der lambda gt11-Klon, der die kodierende Sequenz der IGFBP-cDNA enthält, wurde mit den Enzymen EcoRI und BstEII gespalten, wodurch ein Fragment von 1225 bp freigesetzt wird, das die für reifes IGFBP kodierende Sequenz vom Kodon 26 an bis zum C-Terminus und zusätzlich 600 bp der 3'- nicht-translatierten Sequenz enthält. Dieses Fragment wurde ebenso durch Standardgelverfahren gereinigt.
3. Das synthetische, doppeisträngige, 102 bp lange Oligonukleotid, das in Figur 7 gezeigt ist und für die ersten 25 Aminosäuren des IGFBP und ein N-terminales Methionin (ATG)-Kodon kodiert, wurde präpariert. Die gewählten Kodons spiegeln die Präferenz von E. coli für gewisse Kodons in hochexprimierten Genen wieder. Zusätzlich enthält das 5'-Ende dieses Oligonukleotids DNA-Sequenzen, die eine translationale Kupplung des Vektor-kodierten T7 010-Gens mit dem IGFBP-Gens ergeben, wie beschrieben ist von Rosenberg, A.H., Lade, B.N., Chui, D., Lin, S., Dunn, J.J., Studier, F.W. in Gene 56:125-135 (1987). Die Oligonukleotide besitzen BamHI und BstEII-kohäsive Enden.
4. Die drei vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen wurden zusammenligiert, und diese Mischung wurde verwendet, um den E. coli-Stamm BL21/DE3, beschrieben von Studier, F.W. und Moffatt, B. in J. Mol. Biol. 189:113-130, 1986, zu transformieren. Kolonien, die gegenüber 15 µg/ml Tetracyclin resistent waren, wurden selektiert und nach Induktion mit 1 mM Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG) unter Verwendung des anti-IGFBP-Antikörpers, wie im vorstehenden Beispiel 4 beschrieben, auf die Produktion von IGFBP getestet.
5. Plasmid-DNA wurde aus einem positiven Klon präpariert, und derjenige Teil, der sich aus dem synthetischen Oligonukleotid ergibt, wurde gemäß dem Verfahren von Sanger und Coulson, beschrieben in J. Mol. Biol. 94:441-448, 1975, sequenziert.
Eine pJU1020 bezeichnete Transformante wurde, wie vorstehend beschrieben, isoliert und in Flüssigmedium kultiviert. Die Menge an IGFBP, die nach Induktion mit 1 mM IPTG hergestellt wurde, wurde durch SDS-PAGE des gesamten zellulären Proteins unter Verwendung von gereinigtem, nativem (Amnionflüssigkeit) IGFBP als Standard abgeschätzt. Es wurde geschätzt, daß ungefähr 1 µg IGFBP/ml der Kultur/A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheit hergestellt wurde. Es ist wichtig anzumerken, daß dieses Material in dem Gel mit demselben apparenten Molekulargewicht wie das native Protein, 31 kD, wanderte. Diese Beobachtung zeigt das Material, das nach diesem Kriterium identisch mit nativem IGFBP ist, in E. coli hergestellt werden kann.
Um einen noch effizienteren IGFBP-Produzenten herzustellen, wurde der 3'-nicht-translatierte Teil des cDNA-Klons auf die folgende, in Figur 8 gezeigte Weise vom Plasmid pJU1020 entfernt.
1. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII gespalten.
2. Das synthetische, doppelsträngige, 74 bp lange Oligonukleotid, das in Figur 8 gezeigt ist, wurde hergestellt. Dieses Oligonukleotid umfaßt (a) die kodierende Sequenz für die C-terminalen 21 Kodons von IGFBP unter Verwendung der von E. coli favorisierten Kodons; (b) ein Translationsterminationskodon für IGFBP; (c) zusätzliche Translatonsterminationskodons in den anderen Translationsleserastern; (d) terminale HindIII und BamHI-Restriktionsstellen.
3. Das synthetische Oligonukleotid wird danach mit der gespaltenen, unter (1) beschriebenen DNA gemischt und zusammenligiert. Nach der Ligierung wurde die Mischung mit dem Enzym EcoRI gespalten. Dieses Verfahren linearisiert nur solche Moleküle, die die 3'-nicht-translatierte DNA enthalten, da diese Stelle nur einmal in dieser DNA in diesem Experiment vorkommt.
4. Diese Mischung wird danach verwendet, um den E. coli-Stamm BL21/DE3 zu transformieren, worauf eine Selektion auf Tetracyclin-resistente (15 µg/ml) Klone folgte. Die Transformanten wurden auf IGFBP-Produktion und die Korrektheit der DNA-Sequenz des synthetischen Oligonukleotidanteils des Klons, wie im Zusammenhang mit der pJU1020- Konstruktion vorstehend beschrieben, getestet.
Ein positiver und korrekter Klon (pJU1021) wurde kultiviert und die Produktion an IGFBP nach Induktion der Genexpression gemessen, wie vorstehend für das pJU1021-Konstrukt beschrieben wurde. Dieser Klon produziert ungefähr 20 µg IGFBP/µl der Kultur/A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheit.
Die vorstehend beschriebene, mit dem T7-Gen 10 verknüpfte IGFBP-Sequenz wurde durch die folgenden, in Figur 9 dargestellten Schritte in einen Plasmidvektor überführt, der den tacI- Promotor enthält, wie beschrieben von deBoer, H.A., Comstock, L. J. und Vassar, M. in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80:21-25, 1983.
1. Das Plasmid pT3XI-2, ein den tac-Promotor enthaltendes E. coli-Expressionsplasmid wurde mit den Enzymen EcoRI und HindIII gespalten, und das große Fragement, welches den Promotor, Antibiotika-Resistenzgene und den Replikationsursprung enthält, wurde isoliert.
2. Das Plasmid pJU1021 wurde mit den Enzymen XbaI und HindIII gespalten, und das die IGFBP-kodierende Sequenz enthaltende Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment enthält auch die T7-Gen10-Sequenzen und den Translationskoppler, wie im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen pJU1021-Konstruktion beschrieben ist.
3. Ein 20 bp langes, synthetisches Oligonukleotid wurde hergestellt. Dieses Fragment enthält die DNA-Sequenz, die sich unmittelbar stromaufwärts (5') von der XbaI- Stelle des Plasmids pJU1021 befindet. Diese DNA wird verwendet, um die IGFBP-kodierende Sequenz an das den tac-Promotor enthaltende Expressionsplasmid anzupassen.
4. Diese drei DNA-Sequenzen wurden miteinander ligiert, und die Mischung wurde verwendet, um den E. coli-Stamm JM107 zu transformieren und Tetracyclin-resistente Klone zu selektieren. Klone, die nach der Geninduktion mit 1 mM IPTG IGFBP exprimieren und die korrekte DNA-Sequenz des synthetischen Oligonukleotids enthalten, wurden wie vorstehend beschrieben, identifiziert. Ein positiver und korrekter Klon wurde pJU1022 genannt. Dieser Klon wurde kultiviert, und die IGFBP-Produktion nach Induktion der Genexpression wurde gemessen, wie im Zusammenhang mit der pJU1020-Konstruktion beschrieben ist. Dieser Klon produzierte ungefähr 10 µg IGFBP/ml Kultur/A&sub6;&sub0;&sub0;-Einheit.

B. Herstellung von IGFBP von E. coli

Die Herstellung von biologisch aktivem IGFBP von E. coli wurde auf die folgende Weise durchgeführt. Der das Plasmid pJU1021 enthaltende E. coli-Stamm BL21/DE3 wurde in Luria-Medium, enthaltend 15 µg/ml Tetracyclin, bei 37ºC bis zu einer A&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 kultiviert. Danach wurde 1 mM IPTG zugefügt, um die IGFBP- Genexpression zu induzieren, und die Kultivierung wurde für zwei Stunden fortgesetzt. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in 1/20 des ursprünglichen Kulturvolumens in 50 mM Tris, pH 7,5, resuspendiert und in einer French- Druckzelle lysiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 15000 x g wurden das Pellet (unlösliches Protein) und der Überstand (lösliches Protein) durch SDS-PAGE und Western-Blotting unter Verwendung von Kaninchen-anti-IGFBP-Antikörpern auf das Vorhandensein von IGFBP getestet. Ungefähr 80% des gesamten IGFBP wurden in der unlöslichen Fraktion gefunden.
Biologisch aktives IGFBP ist aus dieser Fraktion durch drei verschiedene Verfahren erhalten worden.
1. Das Pellet kann mit 50 mM Tris, pH 7,5 (1/20 des ursprünglichen Kulturvolumens) gewaschen werden. Ungefähr 5% IGFBP werden danach in Lösung gebracht werden und verbleiben nach Zentrifugation im Überstand. Dieses Material enthält Monomere, Dimere und IGFBP-Varianten mit höherem Molekulargewicht und verstärkt nachweislich die Aktivität von IGF-I im vorstehend beschriebenen Bioassay mit Aortamuskelzellen vom Schwein.
2. Das, wie vorstehend beschrieben, hergestellte Pellet aus unlöslichem Protein kann in 6 M Guanidin-HCl (1 ml/50 ml der ursprünglichen Zellkultur) resuspendiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen werden. Dithiothreitol wird zu einer Endkonzentration von 20 mM zugefügt, und die Mischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Diese Mischung wird für 15 Minuten bei 13000 x g zentrifugiert, und der Überstand wird mit oxidiertem Glutathion zu einer Endkonzentration von 20 mM gemischt, und die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
4,5 ml 50 mM Tris, pH 10,7 pro 50 ml der Ausgangskultur und Cystein zu 1 mM Endkonzentration werden zu der Mischung zugegeben, die über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Die Mischung wird danach gegen 50 mM Tris, pH 7,5 dialysiert und für 15 Minuten bei 13000 x g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen.
Das durch dieses Vefahren erhaltene IGFBP wird als "rückgefaltetes IGFBP" bezeichnet. Wenn dieses ohne vorherige Reduktion durch SDS-PAGE analysiert wird, kann gezeigt werden, daß es sowohl eine dimere IGFBP-Form (apparentes Molekulargewicht 50 kDa) als auch die monomere Form (apparentes Molekulargewicht 24 kDa) enthält. Beide Formen binden IGF-I, wie durch einen in vitro-Assay gezeigt wurde, der die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem IGF-I an IGFBP, welches nach nicht-reduzierender SDS-PAGE auf Nitrozellulosefilter überführt wurde, zeigt. Das rückgefaltete Material verstärkt die Aktivität von IGF-I im Mitogenitäts-Assay unter Verwendung von glatten Aortamuskelzellen vom Schwein.
Monomeres IGFBP kann frei von Dimeren durch FPLC (Mono Q) gereinigt werden, wobei die Monomere bei 0,28 M NaCl eluieren. Diese nur Monomere enthaltende Fraktion verstärkt nicht die Aktivität von IGF-I im Mitogenitäts-Assay unter Verwendung von glatten Aortamuskelzellen vom Schwein.
3. Das Pellet aus unlöslichem Protein kann mit 6 M Guanidinhydrochlond, wie vorstehend beschrieben, jedoch ohne die Zugabe von Dithiothreitol in Lösung gebracht und zentrifugiert werden. Wenn dieses Material danach gegen 50 mM Tris, pH 7,5 dialysiert wird, bildet sich ein Präzipitat. Wenn jedoch dieses Prazipitat und das lösliche Protein durch SDS-PAGE verglichen werden, wird gefunden, daß mindestens 50% des durch 6 M Guanidin-HCl in Lösung gebrachten IGFBP nach der Dialyse in Lösung bleibt. Dieses in Lösung gebrachte Material enthält nachweislich monomere und dimere IGFBP-Formen, die wie vorstehend beschrieben, IGF-I binden.
Dieses Guanidin-solubilisierte und dialysierte IGFBP verstärkt auch nachweislich die Aktivität von IGF-I im Mitogenitäts-Assay unter Verwendung von glatten Aortamuskelzellen vom Schwein.

Claims

1. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein, welches fähig ist, die Aktivität des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors zu verstärken und welches das Oligopeptid ALPGEQQPLHALTR umfaßt, worin die Aminosäuresequenz des Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindenden Proteins ein Isoleucin an der siebten Position vom Ende der Aminosäuresequenz enthält.

2. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein nach Anspruch 1, welches zusätzlich die Oligopeptide NGFYHSR, FYLPNCNK, VVESLAK, IPGSPEIR oder ALHVTNIKK umfaßt.

3. DNA-Sequenz, welche fähig ist, mit einer Mischung zu hybridisieren, die aus allen möglichen DNA-Sequenzen besteht, die für die Aminosäuresequenz PGEQQP kodieren, wobei die besagte DNA-Sequenz für ein Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein nach Anspruch 1 kodiert.

4. DNA-Sequenz, wie in Figur 6 dargestellt.

5. Vektor, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 3.

6. DNA-Rekombinationsverfahren für die Herstellung eines Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindenden Proteins, umfassend:

a) Transformieren eines einzelligen Wirts mit einem Vektor, welcher für ein Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktorbindendes Protein nach Anspruch 1 kodiert, worin der besagte Vektor auch einen für den besagten einzelligen Wirt geeigneten Replikationsursprung enthält,

b) Kultivieren des transformierten Wirts unter Bedingungen, die für die Herstellung des Insulin-ähnlicher Wachstumfaktor-bindenden Proteins geeignet sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der besagte einzellige Wirt E. coli ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin der besagte Vektor die DNA-Sequenz nach Anspruch 3 enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin der besagte Vektor pJU1020 ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, worin der besagte Vektor pJU1021 ist.

11. Verfahren nach Anspruch 6, worin der besagte Vektor pJU1022 ist.

12. Vektor pJU1010.

13. Vektor pJU1021.

14. Vektor pJU1022.

15. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 6.

16. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein, welches fähig ist, die Aktivität des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors zu hemmen, erhältlich durch das Verfahren gemäß Beispiel 1 als Peak C, welcher später als die verstärkende Form von einer DEAE-Cellulosesäule in dem besagten Verfahren eluiert.

17. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein, umfassend das Oligopeptid ALPGEQQPLHALTR, worin das Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-bindende Protein ein Isoleucin an der siebten Position vom Ende der Aminosäuresequenz enthält, wobei das Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-bindende Protein durch DNA-Rekombinationsverfahren erhältlich ist.